JP7464525B2 - 標的療法のためのチェックポイント遮断を組み合わせる二官能性タンパク質 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、抗体に関する。より詳細には、本発明は、癌療法のための抗体に関する。

（関連分野の説明）
ヒトにおけるリンパ球の２つの主要なタイプは、Ｔ（胸腺由来）およびＢ（骨髄由来）である。これらの細胞は、リンパ球発達経路のために関与した骨髄および胎児肝臓の造血幹細胞に由来する。これらの幹細胞の後代は、Ｂリンパ球またはＴリンパ球に成熟するための分岐経路に従う。ヒトＢリンパ球発達は、完全に骨髄内において生じる。その一方で、Ｔ細胞は、骨髄を去って血流によって胸腺まで移動する未成熟前駆体から発達し、そこで、それらは、増殖し、成熟Ｔリンパ球へと分化する。

（Ｔ細胞）
Ｔ細胞は、最も豊富に存在し（血液リンパ球の約７５％）、強力な免疫キラー細胞である。抗腫瘍性免疫応答におけるエフェクターＴ細胞の役割は、インビトロ研究および、腫瘍のいくつかのタイプにおけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の高浸潤が好ましい臨床予後と相関関係を有するという観察（Ｆｒｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）によって強く支持される。エフェクターナイーブＴ細胞の活性化は、少なくとも３つの相補シグナル：（ｉ）共受容体（ＣＤ４またはＣＤ８）の支援によるＴＣＲ－ＣＤ３／Ａｇ－ＭＨＣ相互作用；（ｉｉ）ＣＤ８０またはＣＤ８６などの共刺激性分子のＣＤ２８、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌへの結合；（ｉｉｉ）サイトカインなどのアクセサリ分子を必要とする。

Ｔ細胞への共刺激または２つの異なるシグナルの提供は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による静止Ｔリンパ球のリンパ球活性化の、広く受け入れられたモデルである（Ｌａｆｆｅｒｔｙ ａｎｄ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，１９７５）。このモデルは、さらに、自己と非自己との区別および免疫寛容性を提供する（Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｃｏｈｎ，１９７０；Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ，１９９９；Ｊｅｎｋｉｎｓ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｔｚ，１９８７）。一次シグナル、または抗原特異的シグナルは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）との関連において提示される外来抗原ペプチドの認識に従ってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して変換される。二次または共刺激シグナルが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現した共刺激性分子によってＴ細胞に届けられ、Ｔ細胞に、クローン増殖、サイトカイン分泌、およびエフェクター機能を促進するように仕向ける（Ｌｅｎｓｃｈｏｗら，１９９６）。共刺激の不在下において、Ｔ細胞は、抗原刺激に対して抵抗性となり得、有効な免疫応答を開始せず、さらに、結果として、外来抗原に対して疲弊または寛容性を生じ得る。

（免疫チェックポイントタンパク質：ＰＤ－Ｌ１）
免疫チェックポイントは、通常、付随的な組織損傷を最小限に抑えるため、自己寛容性を維持し、末梢組織における生理学的応答の持続期間および振幅を調節するために、免疫系、具体的にはＴ細胞媒介性免疫を張り巡らせるリガンド－受容体相互作用によって開始される、阻害性および刺激性経路のグループを意味する（Ｐａｒｄｏｌｌ，２０１２）。腫瘍細胞は、免疫抵抗性の主要メカニズムとして、ある特定のチェックポイント経路を選出する。例えば、プログラム細胞死タンパク質１リガンドのＰＤ－Ｌ１は、一般的に、ヒト癌の腫瘍細胞表面において上方制御される。ＰＤ－Ｌ１と、腫瘍浸透リンパ球（ＴＩＬ）、特にＴ細胞、において発現される、その受容体であるＰＤ－１との相互作用は、局所的Ｔ細胞媒介性応答を阻害することにより、免疫監視から逃れる（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｓｚｎｏｌ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，２０１３）。したがって、癌細胞での免疫抑制性シグナルの阻害、またはＴ細胞の直接的アゴニスト刺激は、強い持続性の抗腫瘍免疫応答を生じるおよび／または誘導する。最近の臨床研究は、抗体を介した、または可溶性リガンドまたは受容体によって調節される、免疫チェックポイントタンパク質の遮断が、治療的抗腫瘍免疫の活性化に対する最も有望なアプローチであることを強く示唆した（Ｔｏｐａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。現在、抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原－４）抗体が、黒色腫などの疾患を治療するために、ＦＤＡによって承認されている。

（血管新生およびＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ））
血管新生、すなわち、既存の血管からの新しい血管の形成は、胎児発達および組織修復にかかわる正常で不可欠なプロセスである。当該プロセスは、血管新生因子および抗血管新生因子の両方によって高度に制御され、ならびに、それは、内皮細胞の遊走および増殖、血管の成熟化および再構成、ならびに細胞外マトリクスの分解を伴う。それは、正常な増殖および発達において重要なプロセスであるが、血管新生は、腫瘍増殖においても重要な役割を果たす。腫瘍は、増殖するために血管供給を必要とし、リガンドの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバーを含む血管新生促進増殖因子の発現を介してこれを達成することができる（Ｈｉｃｋｌｉｎ ａｎｄ Ｅｌｌｉｓ，２００５）。ＶＥＧＦおよび他の内皮増殖因子が、内皮細胞上のそれらの受容体に結合する場合、これらの細胞内のシグナルが開始され、それは、新しい血管の成長および生存を促進する。ＶＥＧＦ特異抗体（アバスチン）、可溶性ＶＥＧＦ受容体（アフリベルセプト）、またはＶＥＧＦチロシンキナーゼ活性の阻害剤（スニチニブ）によるＶＥＧＦ活性の阻害は、腫瘍または血管新生タイプの障害（例えば、ＡＭＤなど）を治療するために使用されてきた戦略である。

（二重特異性／二官能性抗体）
エフェクター免疫細胞に腫瘍細胞を効果的に再標的化させるために二重特異性抗体を使用するアイデアは、１９８０年代に現れた（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｓｔａｅｒｚ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。二重特異性の足場は、一般的に、Ｆｃ断片、ＩｇＧ様分子、および小さい組換え二重特異性形式（それらの大部分は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に由来する）の有無に基づいて、異なる薬物動力学特性を有する２つの主要な群に分類される。抗体断片は、それらのコンパクトなサイズにより、通常、ＩｇＧ様分子より効率的に腫瘍に浸透するが、この利点は、それらの全体的腫瘍取り込みおよび滞留時間を制限する短い血清半減期（数時間）によって緩和される（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）。対照的に、新生児Ｆｃ受容体に結合するＦｃ断片の存在は、ＩｇＧ様形式に対して長い血清半減期（＞１０日）を提供し、これは、腫瘍取り込みおよび滞留に有利に働くが、腫瘍浸透を制限する。

最近の研究は、癌細胞を破壊するために患者自身の免疫系を利用する癌治療の類である免疫療法の治療効力を強調している。腫瘍内において、まとめて「チェックポイント阻害因子」として知られるネガティブ調節分子のファミリーの存在は、抗腫瘍免疫を抑制するＴ細胞の機能を阻害することができる。ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１などのチェックポイント阻害因子は、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を減少させる。アンタゴニストモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１の標的化された遮断は、抗腫瘍免疫を高めるために、Ｔ細胞上に「ブレーキ」を放出する。さらに、最近の研究は、いくつかの悪性腫瘍（例えば、古典的なホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）（Ｋｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７）および神経膠腫（Ｘｕｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７）など）における、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１経路と、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む血管新生促進遺伝子との間の関係を報告した。Ｋｏｈらは、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、またはＭＶＤの間に正の相関関係を確認した。彼らの見解は、ｃＨＬに対する現在の標準的な治療計画に加えて、抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１および抗ＶＥＧＦ療法の組み合わせを含む新規の治療アプローチを支持する証拠を提供した（Ｋｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ＶＥＧＦは、癌免疫サイクルにおける重要なステップ：腫瘍中へのＴ細胞浸潤、を妨害する能力も証明した（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，２０１６；Ｔｅｒｍｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＶＥＧＦの標的化は、腫瘍内微小環境中へのＴ細胞浸潤を増加させることによって、癌免疫サイクルの一部を回復するのに役立ち得る（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｔｅｒｍｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｗａｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＶＥＧＦ経路の阻害は、内皮細胞上での細胞接着分子の発現増加を引き起こし得、腫瘍内Ｔ細胞を増加させて、免疫炎症を起こした腫瘍内微小環境を作り出し得る。

本開示は、前立腺癌、肺癌、ＮＳＣＬＣ、黒色腫、リンパ腫、乳癌、頭頚部癌、ＲＣＣ、または卵巣癌などの癌を患う患者の治療を目的とする免疫調節およびそのための血管新生阻害を有する二重特異性抗体を調査するために設定された。

本開示は、少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体またはその抗原結合性タンパク質であって、当該ポリペプチド鎖は、細胞表面タンパク質に結合する結合性ドメインと；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害性ドメインと、を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合性タンパク質を提供する。

一実施形態において、当該細胞表面タンパク質は、プログラム細胞死タンパク質１リガンド（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、細胞傷害性Ｔリンパ細胞関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、ＯＸ４０（分化クラスター１３４、ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９またはＣＤ１３７）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳまたはＣＤ２７８）、ＣＤ４０、またはこれらの組み合わせを含む。

一実施形態において、当該結合性ドメインは当該ＰＤ－Ｌ１に結合し、ならびに、配列番号４および６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号３のアミノ酸１～１１１および配列番号５のアミノ酸１～１１０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む。

一実施形態において、当該ＶＥＧＦ阻害性ドメインは、ヒトＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ－１）またはヒトＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ－２）由来である。

一実施形態において、当該ＶＥＧＦ阻害性ドメインは、配列番号１、２、９、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、およびその組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む。

一実施形態において、当該二重特異性抗体またはその抗原結合性タンパク質は、さらに、Ｆｃドメインと；当該ＦｃドメインのＮ末端に接続されているＦａｂ断片であって、当該結合性ドメインを含むＦａｂ断片とを含み、当該ＶＥＧＦ阻害性ドメインは、当該ＦｃドメインのＣ末端に接続されている。

一実施形態において、当該二重特異性抗体またはその抗原結合性タンパク質は、さらに、当該ＦｃドメインとＶＥＧＦ阻害性ドメインとの間にリンカーを含む。

一実施形態において、当該二重特異性抗体は、配列番号１２または１３に記述されるアミノ酸配列を含む。

一実施形態において、当該二重特異性抗体またはその抗原結合性タンパク質は、１対のポリペプチド鎖を含む。

一実施形態において、当該二重特異性抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＹ抗体である。

一実施形態において、当該二重特異性抗体は、ＩｇＧ抗体である。

一実施形態において、当該ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。

一実施形態において、当該ＩｇＧ１抗体は、ＩｇＧ１抗体の抗体依存性細胞媒介型細胞傷害の低下型（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）である。

一実施形態において、当該二重特異性抗体は、ヒト抗体である。

本開示は、上記において言及される二重特異性抗体またはその抗原結合性部分と、少なくとも１種の薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物も提供する。

本開示は、治療薬と、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦ阻害性ドメインに結合する二重特異性抗体またはその抗原結合性部分とを含む抗体－薬物コンジュゲートであって、当該治療薬は、リンカーによって、該抗体または当該抗原結合性部分に共有結合的にコンジュゲートされている、抗体－薬物コンジュゲートも提供する。

一実施形態において、当該二重特異性抗体または抗原結合性部分は、上記において言及される二重特異性抗体または抗原結合性部分から選択される。

本開示は、癌を治療する方法であって、上記において言及される二重特異性抗体または抗原結合性部分の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法も提供する。

一実施形態において、当該癌は、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、リンパ腫、乳癌、頭頚部癌、腎細胞腫（ＲＣＣ）、および卵巣癌からなる群より選択される。

一実施形態において、当該有効量は、０．００１μｇ／ｋｇから２５０ｍｇ／ｋｇである。

本開示は、上記において言及される抗体または抗原結合性部分をコードする核酸分子も提供する。

本開示は、（ａ）対象から体液試料または細胞試料を得ることと、（ｂ）ＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦからなる群より選択される癌マーカのパネルの発現を検出することができる１種または複数種の抗体に当該体液試料または細胞試料を接触させることと、（ｃ）当該細胞または当該試料に対する当該１種または複数種の抗体の結合を検査することと、（ｄ）当該対象における癌の存在を特定するために、抗体結合のレベルを測定して正常なコントロールと比較することによって、アッセイにおいて当該対象の当該癌の状態を評価することと、を含む、対象における癌診断の方法も提供する。

本開示は、癌を患う対象のリスクを評価する方法、または対象において癌をスクリーニングする方法であって、（ａ）対象から体液試料または細胞試料を得ることと、（ｂ）ＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦからなる群より選択される癌マーカのパネルの発現を検出することができる１種または複数種の抗体に当該体液試料または細胞試料を接触させることと、（ｃ）当該細胞または当該体液試料に対する当該１種または複数種の抗体の結合を検査することと、（ｄ）対象が癌を患うリスクを有するか否かを特定するために、抗体結合のレベルを測定して正常なコントロールと比較することによって、アッセイにおいて当該対象の癌の状態を評価することと、を含む方法も提供する。

本発明は、以下の添付の図面に対する言及と共に、実施形態についての以下の詳細な説明を読むことによって、より完全に理解することができる。

図１は、Ｔ細胞媒介性免疫を調節する免疫チェックポイントを示す図である。当該チェックポイントに対してアゴニスト的またはアンタゴニスト的である抗体（例えば、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ２８、抗ＯＸ４０、および抗ＣＤ２７、または抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３、抗ＢＴＬＡなど）は、用途に応じて二官能性融合タンパク質を構築するために使用することができた。 図２Ａは、組換えＰＤ－Ｌ１に対する直接的ＥＬＩＳＡによるファージクローンのスクリーニングを示す図である。 図２Ｂは、組換えＰＤ－Ｌ１に対する直接的ＥＬＩＳＡによるファージクローンのスクリーニングを示す図である。 図３は、完全性および純度を明らかにするための、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる、ＰＤ－Ｌ１に対して特異的な精製した抗体リードを示す図である。 図４は、精製した抗免疫チェックポイントタンパク質およびＰＤ－Ｌ１に対する抗ＰＤ－Ｌ１抗体リードの直接的リガンド結合活性の実施例を示す図である。最初に、リガンドで予めコーティングされたウェルを、示されるような様々な濃度の抗体リードと共にインキュベートした。次いで、結合したタンパク質を、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧＦａｂ特異的抗体で検出し、ＯＤ_４５０の読み取り値をプロットした。 図５は、ＰＤ－Ｌ１発現２９３細胞を使用したフロー解析を示す図である。最初に、ＰＤ－Ｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞を、精製した抗体リードと共にインキュベートし、結合した当該抗体を、Ａｌｅｘａ－４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いて検出し、その後、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）分析を行った。 図６は、精製した抗ＰＤ－Ｌ１抗体によるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断を示す図である。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の阻害活性を評価するために、示された精製した抗体をビオチン化ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃと９６ウェルプレートに予めコーティングしたＰＤ－１／Ｈｉｓと共に適用した。組換えＰＤ－１上に結合している組換えＰＤ－Ｌ１－Ｆｃをストレプトアビジン－ＨＲＰによって検出し、ＥＬＩＳＡによって分析した。 図７Ａは、抗体処理の３日後の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬの抗ＰＤ－Ｌ１抗体リードが、ＩＬ－２および／またはＩＦＮ－γ産生を刺激することを示す図である。 図７Ｂは、抗体処理の５日後の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬの抗ＰＤ－Ｌ１抗体リードが、ＩＬ－２および／またはＩＦＮ－γ産生を刺激することを示す図である。 図８は、ＶＥＧＦ受容体由来のＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）と融合した抗体重鎖Ｆｃの構造を示す図である。 図９は、抗免疫チェックポイント抗体－ＶＩＤ二重特異性抗体のＰＡＧＥ－ゲル分析の例を示す図である。精製した融合タンパク質である抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ二重特異性抗体が、分子量約２２０ｋＤａ（非還元）を有することが示されており、両方の抗体融合物において、重鎖融合物は、約８５ｋＤａを有し、軽鎖は約２５ｋＤａ（還元）である。Ｍはマーカであり、レーン１は、非還元抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１であり、レーン２は、還元抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１であり、レーン３は、非還元抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ＩｇＧ４であり、ならびにレーン２は、還元抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ＩｇＧ４である。レーンのそれぞれは、３μｇをロードする。 図１０Ａは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析による、ＨＥＫ２９３細胞由来の精製された抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ＩｇＧ４二重特異性抗体の純度を示す図である。 図１０Ｂは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析による、ＨＥＫ２９３細胞由来の精製された抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１二重特異性抗体の純度を示す図である。 図１１Ａは、直接的ＥＬＩＳＡによる、精製された抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１結合活性の例を示す図である。最初に、リガンドで予めコーティングしたウェルを、示される様々な濃度の試験試料と共にインキュベートした。次いで、結合したＡｂを、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃまたはＦ（ａｂ’）_２特異抗体によって検出し、ＯＤ_４５０読み取り値をプロットした。 図１１Ｂは、直接的ＥＬＩＳＡによる、精製された抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ二重特異性抗体のＶＥＧＦ_１６５結合活性の例を示す図である。最初に、リガンドで予めコーティングしたウェルを、示される様々な濃度の試験試料と共にインキュベートした。次いで、結合したＡｂを、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃまたはＦ（ａｂ’）_２特異抗体によって検出し、ＯＤ_４５０読み取り値をプロットした。 図１２は、精製された抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ二重特異性抗体による、ＶＥＧＦ_１６５刺激ＨＵＶＥＣ増殖の阻害を示す図である。ＶＥＧＦ_１６５を、示される試験試料と共に１日間、予めインキュベートし、次いで、ＨＵＶＥＣ細胞に適用して、ＶＥＧＦ_１６５刺激ＨＵＶＥＣ細胞増殖をモニターした。３日間の培養後、当該細胞増殖を、ＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって特定した。吸光度を、試験試料のＡｂ濃度に対してプロットし、当該細胞増殖が５０％阻害される濃度（ＩＣ_５０）を特定した。 図１３Ａは、二重特異性抗体が、アイソタイプＩｇＧ、基準抗体（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、または抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１二重特異性抗体処理の３日後または５日後の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＩＬ－２産生に対するＴ細胞活性化を相乗作用的に刺激することを示す図である。 図１３Ｂは、二重特異性抗体が、アイソタイプＩｇＧ、基準抗体（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、または抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１二重特異性抗体処理の３日後または５日後の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＩＦＮ－γ産生に対するＴ細胞活性化を相乗作用的に刺激することを示す図である。 図１４Ａは、異なる種（ヒト血清）由来の抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１二重特異性抗体のインビトロ血清安定性を示す図である。精製された抗体を、示された異なる種由来の血清（１５μｇ／ｍＬ）中において３７℃で１日間、２日間、３日間、５日間、７日間、および１４日間インキュベートした。インキュベーション後、収集した試料をサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイに適用して、ＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦ_１６５に対する相対的結合活性を特定した。半減期を、血清中での二重特異性抗体の濃度に基づいてプロットした。 図１４Ｂは、異なる種（マウス血清）由来の抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１二重特異性抗体のインビトロ血清安定性を示す図である。精製された抗体を、示された異なる種由来の血清（１５μｇ／ｍＬ）中において３７℃で１日間、２日間、３日間、５日間、７日間、および１４日間インキュベートした。インキュベーション後、収集した試料をサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイに適用して、ＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦ_１６５に対する相対的結合活性を特定した。半減期を、血清中での二重特異性抗体の濃度に基づいてプロットした。 図１４Ｃは、異なる種（カニクイザル血清）由来の抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１二重特異性抗体のインビトロ血清安定性を示す図である。精製された抗体を、示された異なる種由来の血清（１５μｇ／ｍＬ）中において３７℃で１日間、２日間、３日間、５日間、７日間、および１４日間インキュベートした。インキュベーション後、収集した試料をサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイに適用して、ＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦ_１６５に対する相対的結合活性を特定した。半減期を、血清中での二重特異性抗体の濃度に基づいてプロットした。 図１５Ａは、Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤ（登録商標）ＢｅｉｇｅマウスにおけるＰＣ－３腫瘍の増殖に対する抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１二重特異性抗体処理およびモノクローナル抗体処理の効果を示す図である。 図１５Ｂは、接種の３５日後に、二重特異性抗体処理の腫瘍サイズが、アイソタイプまたは基準抗体処理より著しく小さいことを示す図である。 図１６Ａは、ＩＦＮ－γ刺激Ａ５４９において、抗ＰＤ－Ｌ１単独と比較して、抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ Ａｂがその抗原結合特異性を保持することを示す図である；ＭＦＩ：平均蛍光強度。 図１６Ｂは、ＮＣＩ－Ｈ２９２において、抗ＰＤ－Ｌ１単独と比較して、抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ Ａｂがその抗原結合特異性を保持することを示す図である；ＭＦＩ：平均蛍光強度。 図１６Ｃは、安定ＰＤ－Ｌ１発現２９３細胞において、抗ＰＤ－Ｌ１単独と比較して、抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ Ａｂがその抗原結合特異性を保持することを示す図である；ＭＦＩ：平均蛍光強度。

（詳細な説明）
実施例が添付の図面に示されている本発明の本実施形態について、以下において詳細に言及されるであろう。同じまたは同様の部分を参照するために、図面および説明において、可能な限り、同じ参照番号が使用される。

本発明は、抗免疫チェックポイントタンパク質抗体のＦｃドメインのＣ末端への単離された機能性ＶＥＧＦ阻害ドメインを用いた二官能性タンパク質の発現、精製、およびキャラクタリゼーションについて説明する。これらのタンパク質は、その対応するチェックポイント標的と相互作用し、Ｔ細胞関与免疫を調節するために阻害性シグナルを伝達し、同時に、ＶＥＧＦ誘導性血管新生を中和する。本発明におけるＦｃ融合タンパク質の成分は、全てヒト起源であり、したがって、非免疫原性であることが予想され、ならびにヒトの治療に使用することができる。

二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）などの二重特異性分子は、単一の治療薬によって同じ分子標的または異なる標的上の複数のエピトープを同時に標的化する手段を提供する。癌治療として、それらは、２種のｍＡｂの混合物とは対照的に、新規のまたはより強力な活性を付与し、商品コストを下げ、かつ新規の治療計画の開発を促進する可能性を有する（Ｃｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｂａｔｙ，２００９；Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，２００９；Ｔｈａｋｕｒ ａｎｄ Ｌｕｍ，２０１０）。最近、ヒト上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）およびＣＤ３を標的とする三官能性二重特異性抗体であるカツマキソマブが、上皮癌の腹膜癌症を患う患者において明確な臨床的有益性を示し（Ｈｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、ＣＤ１９およびＣＤ３に対する二重特異性を有する二重特性Ｔ細胞誘導（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｉｎｇ：ＢｉＴＥ）抗体も、ＣＤ１９を発現する血液悪性腫瘍を患う患者において、臨床的活性を高めることを実証した（Ｂａｒｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）。癌治療としての二重特異性分子の開発に対する強い関心にもかかわらず、安定で活性な二重特異性分子の製造における技術的チャレンジは、過去において、ほとんどの二重特異性形式の臨床評価を妨げてきた。ＩｇＧ様二重特異性抗体を含む多くの遺伝子改変抗体形式は、安定性または溶解性を損なってきた（Ｂａｒｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｄｅｍａｒｅｓｔ ａｎｄ Ｇｌａｓｅｒ，２００８；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００５）。その上、製造物品質および二重特異性分子のインビボ安定性を増加させるために、ペグ化、ヒト血清アルブミンとのコンジュゲート化、およびＦｃ遺伝子改変を含む、いくつかの戦略が取られてきた（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。上記において説明される一般的な形式の二重特異性単鎖抗体は、２つのＶドメイン、単一のリンカー、または１つのスペーサーをコードするヌクレオチド配列を、単一のプロモータの制御下において、好適な宿主発現生物に組み込むことができるという利点を有する。このことは、作製の際の実験者による制御の度合いと同様に、これらの構築物を設計する際のフレキシビリティーを増加させる。さらに、ＩｇＧのＦｃは、結合能力を除く全ての抗体の機能を含むため、新規の治療法を設計するための非常に魅力的な別の足場である。Ｆｃ遺伝子改変は、当該二重特異性抗体の効力を向上させるために重要である。したがって、本発明では、癌療法における免疫細胞上の２つの非依存性標的または血管新生促進タンパク質に対して、ＩｇＧベースの立体配座を使用している。

免疫チェックポイントタンパク質の標的化は、抗腫瘍免疫を活性化するための、有望なアプローチである。抗チェックポイントタンパク質（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３など）は、現在、臨床的に評価されている（図１）。免疫チェックポイントタンパク質の遮断剤による予備的データは、持続性の臨床反応を生じさせる可能性を有する抗腫瘍免疫を増加させることができることを示していた。しかしながら、いくつかの悪性腫瘍におけるこれらの薬剤の顕著な臨床有効性にもかかわらず、それらが、多くの患者にとって十分に有効ではないことが明らかになった。多数の追加の免疫調節経路、ならびに腫瘍内微小環境において骨髄細胞または間質細胞によって発現または分泌される阻害因子は、免疫チェックポイント遮断との相乗作用のための潜在的標的である。したがって、抗癌療法または二重特異性抗体療法を組み合わせることは、癌を患う患者に対して完全な寛解および回復を達成するために不可欠であった。その一方で、ＶＥＧＦの標的化は、腫瘍による血管新生を減少させることが既に知られており（Ｈｉｃｋｌｉｎ ａｎｄ Ｅｌｌｉｓ，２００５）、腫瘍内微小環境中へのＴ細胞湿潤を増加させることによって癌免疫サイクルの一部を回復させるのに役立ち得る（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｔｅｒｍｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｗａｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

ヒトＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合性ドメイン（配列番号１および２）は、ＶＥＧＦリガンドに結合することができ、ならびに、１つまたは複数のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインＤ１～Ｄ７（表１）の１つまたは複数を含む。好ましくは、当該ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合性ドメインは、第１のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインＤ２と、第２のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインＤ３とを含み、この場合、当該第１および第２のＶＥＧＦ受容体は、同じまたは異なるＶＥＧＦ受容体である。本発明において、ＶＥＧＦ受容体の細胞外リガンド結合性ドメインであるＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）は、ＶＥＧＦを遮断し、血管新生を減少させるために、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメインＤ２とＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインＤ３とを含む。

いくつかの実施形態において、当該ＶＥＧＦ阻害性ドメインは、配列番号１、２、９、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、およびその組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、当該ＶＥＧＦ阻害性ドメインは、上記において言及したアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、または９５％の配列相同性のアミノ酸配列を含む。

本発明は、ヒトＶＥＧＦ受容体由来のＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）と融合した抗免疫チェックポイントタンパク質抗体Ｆｃの構築、発現、およびキャラクタリゼーションについて説明する。融合構築物中におけるＮ末端に位置された抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、融合の相手が、他の免疫チェックポイント（例えば、抗ＣＴＬＡ－４、ＣＤ３、ＯＸ４０抗体）、または細胞表面標的化分子（例えば、抗ＥＧＦＲ、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ４０抗体など）によって置き換えられる場合、免疫増強剤を越えて融合タンパク質のパワーを拡大させることを可能にする。

本開示は、細胞表面タンパク質に結合する結合性ドメインと、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害性ドメインと、を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合性タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１に結合する当該結合性ドメインは、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。当該重鎖可変ドメインは、配列番号４および６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸を含む。いくつかの実施例において、当該重鎖可変領域は、上記において言及したアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、または９５％の配列相同性のアミノ酸配列を含む。当該軽鎖可変ドメインは、配列番号３のアミノ酸１～１１１および配列番号５のアミノ酸１～１１０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、当該軽鎖可変領域は、上記において言及したアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、または９５％の配列相同性のアミノ酸配列を含む。

（ＯｍｎｉＭａｂライブラリからの抗体の生成）
ＰＤ－Ｌ１に対する治療抗体の生成のために、ＯｍｎｉＭａｂファージミドライブラリによる選択を実施した。当該ファージミドライブラリは、百を超える健康なドナーのＢ細胞のコレクションからＡＰ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（ＡＰＢｉｏ Ｉｎｃ．）によって生成される。パンニングの第一ラウンドのためのファージを、Ｈｙｐｅｒｐｈａｇｅ（Μ１３Κ０７ΔρΙΙΙ、Ｐｒｏｇｅｎ、ハイデルベルク、ドイツ）によって調製した。ＰＤ－Ｌ１特異的バインダー選択およびＯｍｎｉＭａｂライブラリからの単離に対して、ＰＤ－Ｌ１に対する固相パンニングおよび細胞パンニングを適用した。固相パンニングは、第一ラウンド選択において組換えヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ（ＡＰＢｉｏ Ｉｎｃ．）を使用して実施し、次いで、追加の第二ラウンドの濃縮に対して、ＰＤ－Ｌ１を発現したＨＥＫ２９３細胞を使用した。３つのラウンド選択の後、当該特異的ＰＤ－Ｌ１バインダーをスクリーニングし、対応する組換えタンパク質を用いた直接的ＥＬＩＳＡによって単離した（図２Ａおよび２Ｂ）。予めコーティングしたＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ組換えタンパク質を、レスキューされたファージを含有する上清を用いて１時間ブロットし、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した。結合したファージを、ＨＲＰ標識抗Ｍ１３抗体（Ｒｏｃｈｅ）によって検出し、シグナル発生のために、ＴＭＢ基質を使用した。ＯＤ_４５０読み取り値を記録した。ポジティブバインダーを単離し、重鎖および軽鎖の配列および多様性を確認するために配列決定を行った。ＰＤ－Ｌ１に対して特異的な重鎖および軽鎖の可変領域は、配列番号３から配列番号６で記述され、この場合、配列番号３は、ＰＤ－Ｌ１クローン６の軽鎖であり、配列番号４は、ＰＤ－Ｌ１クローン６の重鎖の可変領域であり、配列番号５は、ＰＤ－Ｌ１クローン３２の軽鎖であり、配列番号６は、ＰＤ－Ｌ１クローン３２の重鎖の可変領域である。図２Ａおよび２Ｂに示されるように、いくつかのクローンを単離し、それらは、ネガティブコントロールと比較して、対応する抗原に対して特異的に認識されることが知られている。

（ＩｇＧ形式としての選択されたＰＤ－Ｌ１特異的バインダーのサブクローニングおよび発現／精製）
Ｔ細胞活性化における機能性を有する特異的バインダーの迅速なスクリーニングを容易にするために、ＥＬＩＳＡによるＰＤ－Ｌ１に対するポジティブバインダーの重鎖および軽鎖を増幅し、消化し、ＩｇＧ４定常領域（配列番号７）を保持するＡＰＢｉｏ専用ＩｇＧ発現ベクター中へサブクローニングした。配列検証後、プラスミドを調製し、抗体発現のために、２９３フェクチントランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってＨＥＫ２９３細胞中へとトランスフェクトした。４日間の培養後、無血清培地中に分泌された抗体を、タンパク質Ｇクロマトグラフィーによって、培養上清からアフィニティー精製した。次いで、精製された抗体を濃縮し、その後、ＰＢＳ緩衝液において透析した。透析したタンパク質の最終濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計によって特定し、図３に示されるように、還元試薬を用いずに、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって純度および完全性を特定した。精製された様々な抗体リードの完全性は、基準抗体ＭＰＤＬ３２８０Ａと同様に、ＨＥＫ２９３細胞において正常である。

（直接的ＥＬＩＳＡによるＰＤ－Ｌ１特異的ＩｇＧリードの結合活性の特定）
直接的コーティングされた設定でのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃに対するＥＬＩＳＡ結合キャラクタリゼーションのために、ＰＤ－Ｌ１に対する精製された抗体リード（抗ＰＤ－Ｌ１抗体リード）を適用した。図４は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体に対するＥＬＩＳＡ結合結果を示した。ＰＤ－Ｌ１特異的抗体の場合、ほとんどのリードは、基準抗体（Ｒｅｆ Ａｂ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、Ｒｏｃｈｅ）に対して、同様のまたはより良い結合活性を示した。

精製されたヒトＰＤ－Ｌ１ＩｇＧ１Ｆｃキメラ（ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ、ＡＰＢｉｏ）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において透析し、１ｍｇ／ｍＬに調節して、次いで、ＰＢＳによって１μｇ／ｍＬの最終濃度へと希釈した。Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレートを、ウェルあたり０．１ｍＬにおいて組換えＰＤ－Ｌ１－Ｆｃキメラでコーティングし、非特異的結合コントロールに対しては空のウェルのままで、４℃で一晩インキュベートした。当該ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃキメラ溶液を除去し、当該プレートを０．４ｍＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中における０．１％のＴｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄した。０．４ｍＬブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中における５％の低脂肪ミルク粉末）を全てのウェルに加え、混合しながら室温で１時間インキュベートした。当該ブロッキング緩衝液を除去し、プレートを０．４ｍＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＰＢＳにおいて当該ＰＤ－Ｌ１試験抗体の段階希釈を調製し、０．１ｍＬの希釈されたＡｂを各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。抗体溶液を除去し、当該プレートを、ウェルあたり０．４ｍＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧであるＦ（ａｂ’）_２特異的Ｆ（ａｂ’）_２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９－０３６－０９７）を、ＰＢＳで１：２０００に希釈し、各ウェルに０．１ｍＬを加えた。当該プレートを室温で１時間インキュベートし、ウェルあたり０．４ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄した。０．１ｍＬのＴＭＢ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、室温で１～５分間インキュベートした。０．０５ｍＬの１ＮのＨＣｌを加えることによって反応を止め、Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｓｐｅｃｔｒａにおいて、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。ＰＤ－Ｌ１に対する抗ＰＤ－Ｌ１抗体リードの計算されたＥＣ５０は、直接的ＥＬＩＳＡにより、ほとんどのリードが、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｅｆ Ａｂ）と同様に、良好な結合活性を有することを示した（図４）。

（ＦＡＣＳによるＰＤ－Ｌ１特異的ＩｇＧリードに対する結合活性の特定）
結合活性を特定して、ＰＤ－Ｌ１を発現したＨＥＫ２９３細胞を用いて結合活性を特定、比較するために、フローサイトメトリに対しても、精製された抗体リード（抗ＰＤ－Ｌ１抗体リード）を適用した。図５は、安定発現されたＰＤ－Ｌ１のＨＥＫ２９３細胞を用いたＦＡＣＳによって示される、対応する抗体リードの結合活性を示している。

ＰＤ－Ｌ１結合活性を調べるために抗ＰＤ－Ｌ１抗体リードで染色したＰＤ－Ｌ１安定発現２９３細胞のＦＡＣＳ分析のために、安定発現細胞を、１μｇ／ｍＬの精製した抗ＰＤ－Ｌ１抗体リード、基準抗体（Ｒｅｆ Ａｂ ＭＰＤＬ３２８０Ａ）と共に、またはネガティブコントロールとしてのアイソタイプ抗体と共に、氷上で１時間インキュベートした。当該細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、Ａｌｅｘａ－４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）と共に、氷上でさらに１時間インキュベートした。染色後、当該細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳに再懸濁させ、その後、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）およびＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ、ＬＬＣ）によって分析した。図５に示されるように、ほとんどの抗ＰＤ－Ｌ１抗体リードは、基準抗体と同様に、良好な結合活性を有する。このことは、ＯｍｎｉＭａｂライブラリから選択されたファージクローンが、実際に、当該細胞におけるネイティブなＰＤ－Ｌ１を認識することを示した。

（リガンド競合結合（ＥＬＩＳＡアッセイ））
抗体リードは、結合選択性を示し、ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合を遮断する能力について本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体リードを評価するために親和性アッセイを使用した。

組換えヒトＰＤ－１／Ｈｉｓ（ｈＰＤ－１／Ｈｉｓ）へのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃキメラ（ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ）の結合を遮断する能力について、ＥＬＩＳＡによって抗体を試験した。精製された組換えｈＰＤ－１／Ｈｉｓ（ＡＰＢｉｏ）を、ＰＢＳ中における１ｍｇ／ｍｌへと透析し、次いで、ビオチン（Ａｂｃａｍ）とコンジュゲートした。Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレートを、ウェルあたりＰＢＳ中における２５０ｎｇのｈＰＤ－１／Ｈｉｓで一晩かけてコーティングした。当該ｈＰＤ－１／Ｈｉｓ溶液を除去し、当該プレートを０．４ｍＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中における０．１％のＴｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄した。０．４ｍＬブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中における５％の低脂肪ミルク粉末）を全てのウェルに加え、混合しながら室温で１時間インキュベートした。ブロッキングステップの際、当該抗体ストックを、２倍の段階希釈によって、ＰＢＳ中における２００ｎＭから０ｎＭの範囲で希釈した。精製したビオチン化組換えＰＤ－Ｌ１－Ｆｃキメラを、ＰＢＳ中における４μｇ／ｍＬに希釈した。ＰＤ－１／Ｈｉｓでコーティングしたプレートを、０．２ｍＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中における０．１％のＴｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄した。６０μＬの抗体希釈物（抗ＰＤ－Ｌ１抗体リードまたはＲｅｆ Ａｂ ＭＰＤＬ３２８０Ａ）を６０μＬのビオチン化ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃキメラと一緒に加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを、前に説明したように洗浄した。ストレプトアビジン－ＨＲＰを、ＰＢＳにおいて１：２０００に希釈し、結果として得られる溶液の１００μＬを、洗浄したプレートのウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを、前に説明したように洗浄し、１００μＬのＴＭＢ基質溶液を各ウェルに加え、１０分間インキュベートした。５０μＬの１ＮのＨＣｌによって反応を止め、Ｂｉｏ－Ｔｅｋ読み取り機を使用して４５０ｎｍの吸光度を読み取り、図６に示した。部分抗体リードは、競合ＥＬＩＳＡによって、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１の間の相互作用を阻害することが示された。ほとんどの抗体リードは、基準抗体（Ｒｅｆ Ａｂ ＭＰＤＬ３２８０Ａ）と比較した場合、同様のブロッキング活性を示した。

（抗ＰＤ－Ｌ１抗体に対するＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１リガンド相互作用の阻害によるＴ細胞活性化の刺激増強）
当該ＰＤ－１シグナル伝達経路は、中程度のＴＣＲ／ＣＤ２８共刺激シグナルを阻害し、その場合、Ｔ細胞増殖を減少することなく、サイトカイン産生がまず減少する。当該ＴＣＲ／ＣＤ２８共刺激シグナルが弱まると、当該ＰＤ－１経路が支配的となり、増殖の減少に伴い、サイトカイン産生が著しく減少する。したがって、本発明のヒト抗体のＰＤ－Ｌ１との相互作用の阻害を介した当該ＰＤ－１の阻害がＴ細胞活性化を高めることを検証するために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を実施する。

ヒト全血液由来の単球を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｃａｔ． Ｎｏ．１５０６８）によって濃縮し、１０％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬ（１０００Ｕ／ｍＬ）のＧＭ－ＣＳＦ、１００ｎｇ／ｍＬ（５００Ｕ／ｍＬ）を含む分化培地ＲＰＭＩ １６４０において６日間培養した。分化を検証するために、単球由来の当該分化樹状細胞（ＤＣ）を、ＤＣ－ＳＩＧＮ－ＰＥ、ＦＩＴＣ Ａｂとコンジュゲートした抗ＣＤ１４、ＰＥ Ａｂとコンジュゲートした抗ＣＤ８３、またはＦＩＴＣ Ａｂとコンジュゲートした抗ＣＤ８０によって点検し、ＭＬＲにおいてＡＰＣとして使用した。

ヒト全血液由来の同種異系ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ４^＋Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｃａｔ． ＮＯ． １５０６２）によって単離した。純度が９５％超であることを確実にするために、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の純度を抗ＣＤ４コンジュゲート化ＡＰＣ Ａｂによって確認し、Ｔ細胞増殖アッセイのために、１μＭのＣＦＳＥ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標） ＣＦＳＥ細胞増殖キット、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ． ＮＯ． Ｃ３４５５４）によって標識した。当該抗体リードが、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断することによってＴ細胞活性化を回復できるかどうかを見るため、標識したＣＤ４^＋Ｔ細胞を使用して、３日間および５日間において、示されるような異なる抗体リードを伴う未成熟ＤＣと共に共培養した。３日間および５日間のインキュベート後、ＥＬＩＳＡによるＩＬ－２およびＩＦＮ－γ定量化など、サイトカインのために上清を収集した。未成熟樹状細胞と同種異系Ｔ細胞とによる培養物への抗ＰＤ－Ｌ１抗体リード（クローン６、３２、２８、５１、６４、２７、および３７）の添加は、結果として、アイソタイプＩｇＧ（イソ＃１、＃２）で処理した培養物と比較して、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生における増加を生じることが予想され、それは、図７Ａおよび７Ｂに示した。当該ＩＬ－２およびＩＦＮ－γ産生は、特に抗ＰＤ－Ｌ１抗体クローン６の場合、抗体処理の３日後（図７Ａ）または５日後（図７Ｂ）に、アイソタイプの抗体処理と比較して、ＭＬＲにおいて著しく増加する。サイトカインの増分は、抗体処理の５日後においても、依然として明らかであり、基準抗体（ｒｅｆ）であるＭＰＤＬ３２８０Ａと同様である。このことは、当該抗ＰＤ－Ｌ１抗体クローン６が、二重特異性抗体複合物のための潜在的リードの１つであることを示した。

（抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ抗体の構築、発現、および精製）
二重特異性は、ＶＥＧＦ阻害ドメインと融合させたＩｇＧベースとして設計されるため、当該抗ＰＤ－Ｌ１抗体クローン６は、ＩｇＧ形式であるように割り当てられ、その一方で、ＶＥＧＦ受容体におけるＶＥＧＦ結合性ドメインＤ１およびＤ２は、抗ＰＤ－Ｌ１クローン６抗体におけるＦｃ領域のＣ末端において融合される。Ｆｃアイソタイプまたは遺伝子改変Ｆｃは、哺乳動物細胞における当該二重特異性抗体の有効性または産生を向上させるために重要であるため、結果として、２つの異なるＦｃアイソタイプであるＩｇＧ４（配列番号７）および遺伝子改変ＩｇＧ１（ｅＩｇＧ１、抗体依存性細胞媒介型細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下型（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）、配列番号８）を、二重特異性構築に使用した。ＶＩＤ（配列番号９）と融合した二重特異性抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｆｃの構築を図８に表した。正確な折り畳みを確実にし、立体障害を最小にするために、短いフレキシブルなペプチドリンカー（（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号１０）を、例えば、Ｆｃ領域（配列番号４）の抗ＰＤ－Ｌ１抗体重鎖Ｃ末端と、ＶＩＤのＮ末端モジュールとの間に位置した。ＩｇＧ４およびｅＩＧｇ１に対する抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ重鎖のコード配列を、配列番号１２および１３に示した。構築された抗体Ｆｃ融合タンパク質を、シグナルペプチド（配列番号１１）によってリードし、哺乳動物細胞によって発現させ、ならびにトランスフェクトされた細胞培養上清から一段階タンパク質Ｇクロマトグラフィーによって精製した。図９に示されるように、一段階精製プロセスにおいて９５％を超える純度を得ることができ、それは、精製された融合タンパク質が正しい分子量（Ｍｗ＝２２０ｋＤａ）を有することを示す。低い純度または回収率は、化学、製造、および品質管理（ＣＭＣ）生産における当該二重特異性抗体または融合タンパク質の製造にとって主要な問題であるため、したがって、二重特異性抗体の純度を評価するために、両方の精製された二重特異性抗体を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるサイズ溶離カラム（ＳＥＣ）にも適用した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。両方の二重特異性抗体抗、ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ＩｇＧ４（図１０Ａ）または抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１（図１０Ｂ）のどちらかは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析において、９９％純度より高い純度であることが明らかとなった。それは、当該形式が、ＣＭＣ開発において容易に処理することができ、ならびに、さらなる開発において上出来の率を提供することを意味する。

図８に示されるように、抗免疫チェックポイント抗体の構造は、Ｆｃ末端においてＶＩＤと融合した。いくつかの実施形態において、抗体は、阻害性抗免疫チェックポイント抗体（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３など）、あるいは刺激性抗体（例えば、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ２７、抗ＩＣＯＳなど）、あるいは細胞表面受容体／抗原（例えば、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲなど）であり得る。二重特異性抗体を生成するために、リンカーが、抗体ＦｃとＶＩＤとの間に位置される。

（ＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦ_１６５に対する融合タンパク質の結合親和性）
ＰＤ－Ｌ１、またはＶＥＧＦ－ＡのスプライシングバリアントであるＶＥＧＦ_１６５に対する当該二重特異性抗体の結合親和性を測定するために、直接結合酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用した。組換えＶＥＧＦ捕捉タンパク質（ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ）および親抗ＰＤ－Ｌ１抗体クローン６を、それぞれ、ＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦに対するポジティブコントロール１として使用した。ＶＥＧＦＲ－Ｆｃであるアフリベルセプトは、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）を治療するための治療用途のために遺伝子改変された可溶性ＶＥＧＦ受容体であり、現在、食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。ＶＥＧＦＲ－Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合されたＶＥＧＦＲ２の第３のＩｇ様ドメイン（Ｄ３）に融合されたＶＥＧＦＲ１の第２のＩｇ様ドメイン（Ｄ２）を含む（Ｈｏｌａｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００２）。

１００μＬのコーティング溶液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中における１μｇ／ｍＬのＶＥＧＦ_１６５、ｐＨ７．２）を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加え、当該プレートを４℃で一晩インキュベートした。当該ウェルを４００μＬのＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、余分な液体をペーパータオルで注意深く除去した。４００μＬのブロッキング溶液（ＰＢＳ中における５％の無脂肪スキムミルク）を各ウェルに加え、当該プレートを室温で１時間インキュベートした。当該ウェルを、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。二重特異性抗体およびコントロールの試料を、最も高いタンパク質濃度が１００ｎＭとなるように、ブロッキング溶液において３倍に段階希釈した。１００μＬの当該段階希釈した試料を各ウェルに加えた。当該プレートを覆い、プレートシェーカー（約１００ｒｐｍ）上において室温で１時間インキュベートした。当該ウェルを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ中における０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄した。ブロッキング溶液中における１：２５００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ特異抗体の１００μＬを、各ウェルに加えた。当該プレートを密封し、プレートシェーカー上において室温で１時間インキュベートした。当該プレートを、洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μＬのＴＭＢ基質を各ウェルに加え、反応を起こさせるために、当該ウェルを３分間から５分間インキュベートした。当該反応を止めるため、１００μＬの停止液（１ＮのＨＣｌ）を各ウェルに加えた。各ウェルの光学濃度（ＯＤ）を、ＥＬＩＳＡプレートリーダ（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ）を使用して、４５０ｎｍの吸収波長において測定した。当該吸光度を、当該融合タンパク質またはコントロールのタンパク質濃度に対してプロットし、シグナルが最大有効濃度の半分になる濃度（ＥＣ５０）を特定した。その一方で、両方の二重特異性抗体に対するＰＤ－Ｌ１の結合親和性も、結合した二重特異性抗体をホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧであるＦ（ａｂ’）_２特異的Ｆ（ａｂ’）_２抗体によって検出したことを除いて、上記において説明されるのと同様のシナリオとして実施した。

図１１Ａに示されたデータのように、ＥＣ５０値として表現された結合親和性は、組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質に対して、抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ＩｇＧ４および抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１抗体の両方において０．０７５であった。両方の二重特異性抗体は、ポジティブコントロールである抗ＰＤ－Ｌ１クローン６抗体（０．１ｎＭ）と同様に、結合活性を有する。その一方で、当該結果も、ＶＥＧＦ結合活性試験のために記録した。図１１Ｂに示されるデータのように、両方の二重特異性抗体は、ポジティブコントロールであるＶＥＧＦＲ－Ｆｃ（アフリベルセプト）と比較して、同様のＶＥＧＦ結合活性を示した。結合活性は、ＰＤ－Ｌ１結合活性またはＶＥＧＦ結合活性のどちらかに対して、両方の二重特異性抗体において影響されない。

（抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ二重特異性抗体によるＨＵＶＥＣ増殖の阻害）
本発明における二重特異性抗体の機能性を試験するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖アッセイを実施した。ポジティブコントロールとして、上記において説明したＶＥＧＦＲ－Ｆｃを使用した。１００μＬのコーティング溶液（再蒸留水中における１％のゼラチン）を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加え、当該プレートを、３７℃で２時間または一晩インキュベートした。当該ウェルを、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。内皮細胞増殖培地における３５００のＨＵＶＥＣ細胞を各ウェルに加え、当該プレートを３７℃で一晩インキュベートした。示された試料を、３０ｎＭの最高タンパク質濃度となるように、アッセイ緩衝液（培地－１９９ １×アール塩、１０％のウシ胎仔血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１×抗生物質／抗真菌薬）で希釈した。当該試料を、ＶＥＧＦ_１６５（８ｎｇ／ｍＬ）と混合し、当該混合物を、室温で一晩インキュベートした。次いで、当該ウェルを２００μＬのＰＢＳで洗浄した。１００μＬのＶＥＧＦ_１６５／試料混合物を各ウェルに加え、当該プレートを、５％のＣＯ_２において３７℃で７２時間インキュベートした。インキュベーション後、１０μＬのＭＴＳ検出試薬（蒸留したＰＢＳ中における３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム）＋フェナジンメトサルフェート）を各ウェルに加え、当該プレートを３７℃で２．５時間インキュベートした。各ウェルのＯＤを、ＥＬＩＳＡプレートリーダ（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ）を使用して、４９０ｎｍの吸収波長において測定した。吸光度を、試験試料のタンパク質濃度に対してプロットし、当該細胞増殖が５０％阻害される濃度（ＩＣ５０）を特定した。細胞増殖の阻害（ＩＣ５０）が、試験された本発明の融合タンパク質に対して０．１０７０ｎＭから０．１２３３ｎＭの間であることを特定した。二重特異性抗体の１つである抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１は、別の二重特異性抗体である抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ＩｇＧ４よりも良好に阻害することが明らかとなった（図１２、０．１０７０ｎＭ対０．１２３３ｎＭ）。抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１のＩＣ５０は、ポジティブコントロールであるＶＥＧＦＲ－Ｆｃと同様に良好である（０．１０７２ｎＭ）。

（ＭＬＲにおける抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１二重特異性抗体リードに対するＴ細胞活性化の刺激の増強）
ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間の相互作用の阻害による、Ｔ細胞活性化の増強における二重特異性抗体のアンタゴニスト機能性を特定するため。二重特異性抗体リードである抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１抗体を、上記において説明したＭＬＲに適用した。次いで、抗体処理の３日後または５日後に、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γ産生を記録した。Ｔ細胞活性化増進におけるアンタゴニスト機能性を比較するために、単一または二重特異性抗体を等しいモルにおいて適用し、アイソタイプＩｇＧをネガティブコントロールとして使用した。図１３Ａおよび１３Ｂに示されたデータのように、当該抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１抗体は、処理の３日後に著しいＩＬ２誘導を示し、処理の５日後に低下した。サイトカイン産生のプロファイルは、基準抗体であるＭＰＤＬ３２８０Ａと非常に類似性が高い。その一方で、ＩＦＮ－γ産生も、処理の３日後または５日後に、当該二重特異性抗体リード処理において上方調節され、蓄積される。この示された当該抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１二重特異性抗体は、本発明におけるいかなる活性の損失もなく、基準抗体と同様に、Ｔ細胞活性化におけるアンタゴニスト機能性も有する。

（抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１二重特異性抗体のインビトロ血清安定性）
精製した抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１を、示された異なる種に由来する血清（１５μｇ／ｍＬ）と共に、水浴において３７でインキュベートした。当該精製した二重特異性抗体を含有する血清試料を、１４日目まで、異なる時点において採取した。当該血清試料中の当該二重特異性抗体の濃度は、下記のようなサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して特定されるであろう。ＶＥＧＦ_１６５（１μｇ／ｍＬ）で予めコーティングしたウェルを、滴定した濃度の精製した抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１二重特異性抗体と共にインキュベートして、当該血清（新鮮な調製物、０日）中のＡｂ濃度を計算するための標準曲線とした。検出のため、異なる時点から採取した試料を、予めコーティングしたＶＥＧＦ_１６５ウェルにも適用した。ＰＢＳ中における０．１％のＴｗｅｅｎ－２０で洗浄した後、インタクトであり、かつ結合したＡｂを、ビオチン化ＰＤ－Ｌ１－ＦｃおよびＨＲＰ標識ストレプトアビジンで検出し、その後、顕色処理した。外挿法によって当該血清中のＡｂの濃度を計算し、次いで、Ａｂの半減期を、図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃに示されるようにプロットした。抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１の半減期は、カニクイザル（８．６日）、マウス（９．２日）、またはヒト血清（１１．９日）のいずれも、８日よりも長い。当該長い半減期は、将来、動物研究または臨床試験での少ない投与頻度における二重特異性抗体の使用の融通性を提供することが可能であろう。

（二重特異性抗体の抗腫瘍活性（インビボモデル））
二重特異性抗体における当該ＰＤ－Ｌ１の齧歯動物交差反応性の欠如は、当該抗体の抗ヒト腫瘍効力の評価に対する標準的なマウス同系またはヒト異種移植腫瘍モデルの使用を妨げた。したがって、ベージュ（Ｂｇ）変異欠如マウスのＴおよびＢリンパ球および機能性ＮＫ細胞を有するＳＣＩＤ－Ｂｇマウス（ＣＢ．１７／Ｉｃｒ．Ｃｇ Ｐｋｒｄｃ^ｓｃｉｄＬｙｓｔ^ｂｇ／ＣｒＩ）を使用して、新規のｈｕＰＢＬ－ＳＣＩＤ－Ｂｇ異種腫瘍マウスモデルを作製した。当該二重特異性抗体の抗ヒト腫瘍効力を、下記において説明するようにこのモデルを使用して評価した。

ＰＣ－３ヒト前立腺をアメリカンタイプカルチャーコレクションから得て、Ｌ－グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、および１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ． Ｎｏ． １０４３７）を含むＲＰＭＩ－１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。細胞を、Ｔ－１５０ファルコンフラスコにおいてコンフルエントに増殖させた。続いて、細胞を、トリプシン処理し（トリプシン０．２５％－ＥＤＴＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、接種に十分な細胞数に、増殖をスケールアップした。製造元のプロトコル（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）に従って、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）を使用して、末梢血液リンパ球（ＰＢＭＣ）をヘパリン処理血液から単離した。各マウスが、ＰＢＳ中における０．１ｍＬの単一ボーラス注入において０．７５×１０^６のＰＢＭＣおよび３×１０^６腫瘍細胞の注入を受けるように、カウントした細胞懸濁液を組み合わせた。当該マウスにおける腫瘍細胞の増殖を促進するために、別の０．１ｍＬのマトリゲルを、当該組み合わせた細胞懸濁液と混合し、すぐに調製マウスに注入した。

各マウスに対して、０．２ｍＬ量の当該組み合わせた細胞懸濁液を、当該動物の右脇腹の皮下に注入した。接種７日後、固形腫瘍が形成され、約～１００ｍｍ^３に達し、当該二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）またはコントロール抗体を、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって３週間から４週間にわたり毎週２回与えた。毎週２回、Ｐｒｅｓｓｉｅｒキャリパーによる腫瘍測定、ならびに実験期間における試験試料投与を行い、ならびに体重も記録した。以下の計算：長さ×幅^２×０．４４＝容量（ｍｍ^３）を用いて腫瘍容量を計算し、図１５Ａにプロットした。腫瘍容量が２０００ｍｍ^３に達するか、実験の終了前に体重が２０％減少したマウスを研究から除去した。接種７日後に腫瘍を測定したところ、同様の結果が観察され、腫瘍容量に従って動物をランダマイズした。動物研究のため、各グループは、６匹のマウスを含んでいた。図１５Ａに示されたデータのように、当該二重特異性抗体は、ＰＣ－３異種移植マウスモデルにおいて、著しい抗腫瘍効力を示した。ＰＤ－Ｌ１基準抗体と同様に、腫瘍サイズは、腫瘍接種の１８日後に縮小し、２００ｍｍ^３未満に減少し続けた。図１５Ｂは、接種の３５日後において、二重特異性抗体処理による腫瘍サイズが、アイソタイプまたは基準抗体処理よりも著しく小さいことを示している。それは、抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１Ａｂが、動物において抗腫瘍性活性の相乗効果を有することを示した。当該ＰＣ－３異種移植マウスモデルは、二重特異性抗体の抗腫瘍について予め実証され、将来における治療薬リードである可能性が明らかである。

まとめると、これらの結果は、二重特異性抗体が、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達におけるその免疫チェックポイント遮断性を維持し、血管新生促進タンパク質であるＶＥＧＦを中和することを示した。適切な動物モデル（例えば、ヒト化ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍＩｗｊＩ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ）モデルにおけるＰＣ－３腫瘍など）を使用してこれらのタンパク質の二重特異的活性をさらに調査するために、研究が進められている。

本発明におけるＦｃ領域は、任意の免疫グロブリンアイソタイプ、サブクラス、アロタイプ、遺伝子改変変異体（例えば、ノブおよびホール（ｋｎｏｂ ａｎｄ ｈｏｌｅ）Ｆｃ断片など）に由来し得る。

（実施例）
下記の実施例は、ヒトＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦを標的とする治療目的にとって好適なモノクローナル抗体の作製について説明するものである。複合体、ヒト抗ヒトＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦ中和ドメインは、それぞれ、抗ＰＤ－Ｌ１抗体クローン６および、ヒトＶＥＧＦ受容体由来のＶＥＧＦ捕捉ドメインから作製した。ヒトＶ領域配列のセグメントは、無関係のヒト抗体（生殖系列および非生殖系列）配列データベースを供給源とした。

実施例１ ＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦに結合するＩｇＧ抗体の作製
本発明によって提供されるある特定の抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合するＦａｂから独自に作製した。当該Ｆａｂは、対応するＦｃ融合タンパク質（ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ）および対応するヒトタンパク質（ＰＤ－Ｌ１）を発現する細胞における交互パンニング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｐａｎｎｉｎｇ）に従って、ファージディスプレイライブラリであるＯｍｎｉＭａｂファージミドライブラリから選択した。直接的ＥＬＩＳＡスクリーニング後、当該ポジティブクローンを、重鎖および軽鎖に対して配列決定した。これらのＦａｂは、ＰＤ－Ｌ１に対して、「ＯＭ－ＰＤ－Ｌ１－６」および「ＯＭ－ＰＤ－Ｌ１－３２」などと命名されるものを含んでいた。本出願において開示されるＰＤ－Ｌ１抗体ＰＤ－Ｌ１－クローン６、およびＰＤ－Ｌ１－クローン３２は、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ－Ｓ細胞における「ＯＭ－ＰＤ－Ｌ１－６」および「ＯＭ－ＰＤ－Ｌ１－３２」から作製した。ならびに二重特異性抗体標的化ＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦを、同時に、抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ（ＶＥＧＦ阻害ドメイン）抗体として設計した。所定のＦａｂの軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ、当該軽鎖可変領域および重鎖可変領域の当該アミノ酸配列と同一である。

実施例２ 抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ二重特異性抗体の、その対応する標的へのインビトロ結合
抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ二重特異性抗体を、図８に示されるように構築し、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ－Ｓ細胞において発現させた。二重特異性抗体を含む培地を、プロテインＧクロマトグラフィーによって、培養上清からアフィニティー精製した。精製された抗体を濃縮し、その後、ＰＢＳ緩衝液において透析し、図９に示されるようにＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ＰＤ－Ｌ１またはＶＥＧＦ_１６５への精製された融合タンパク質の直接結合をＥＬＩＳＡにおいて試験するために、１００ｎｇ／ウェルの組換えＰＤ－Ｌ１を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにおいてコーティングした。様々な濃度の精製された抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ Ａｂを各ウェルに加え、１時間インキュベートした。洗浄後、抗Ｆａｂまたは抗ＦｃＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の１：５０００希釈を各ウェルに加え、さらに１時間インキュベートした。最終洗浄後、ＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）を加え、４５０ｎｍにおけるＯＤ吸光度を測定した。当該データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を使用してＳ字形曲線フィッティングによって解析し、ＥＣ５０を計算した。

実施例３ ＦＡＣＳ分析による抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤの抗原結合特異性

抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ Ａｂ抗体結合特異性を試験するために、安定ＰＤ－Ｌ１発現２９３細胞（ヒト胎児腎臓細胞）、ＩＦＮ－γ刺激Ａ５４９（肺癌）、またはＮＣＩ－Ｈ２９２（粘膜表皮肺癌）を、氷上で１時間かけて、３０ｎＭ 抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ Ａｂ抗体の３倍段階希釈物で染色し、その後、１×ＰＢＳで３回洗浄した。結合した抗体融合タンパク質を、Ａｌｅｘａ－４８８標識ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で検出し、その後、ＦＡＣＳ分析を行った。当該試験のネガティブコントロールとして、アイソタイプ抗体を使用した。結果は、抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ Ａｂが、抗ＰＤ－Ｌ１単独と比較して、その抗原結合特異性を維持していることを示した（図１６Ａ、１６Ｂ、および１６Ｃ）。

実施例４ 抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ二重特異性抗体のインビトロ免疫調節効果
Ｔ細胞応答性を調節する当該抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ Ａｂの能力を測定するために、精製されたＴ細胞が、数日間かけて、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４において単球を培養することによって調製した同種異系樹状細胞と共に培養されるであろう。市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、それぞれ、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γを測定するために、３日目および５日目での上清の収集を可能にするように、平行プレートを準備した。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅのヒト化抗ＰＤ－Ｌ１であるＭＰＤＬ３２８０Ａが、自前で作製され、ポジティブコントロールとして使用されるであろう。図１３Ａおよび１３Ｂに示されたデータのように、当該ＩＬ－２およびＩＦＮ－γ産生は、抗体処理の３日後または５日後に、基準抗体と同様に、二重特異性抗体処理において高度に上方調節される。それは、当該二重特異性抗体が、依然として、Ｔ細胞活性化を促進するために、Ｔ細胞と樹状細胞との間のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を阻害する能力を有することを明らかにした。

実施例５ インビボでの二重特異性抗体によって誘導されるヒト白血球増殖
マウスＰＤ－Ｌ１との当該ＰＤ－Ｌ１抗体における検出可能な交差反応の欠如、およびヒト免疫細胞の存在に対する要件は、当該二重特異性抗体のインビボ機能性評価のためのモデルの開発を必要とした。重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）変異およびＩＬ－２受容体共通ガンマ鎖（一般的に、ＮＳＧと呼ばれる）における欠損を有するＮＯＤ遺伝的背景のマウスは、多くのヒト末梢血白血球（ｈｕＰＢＬ）の移植を支持することができ、少なくとも３０日間、移植を維持することができる（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）。ｈｕＰＢＬ－ＮＳＧモデルとしても知られるこのマウスモデルを、ヒト免疫細胞に対する当該抗体のインビボ全身性投与の機能効果を評価するために使用した。

詳細には、新たに単離した６００万のヒトＰＢＭＣを、静脈内注入によってｈｕＰＢＬ－ＮＳＧマウスへと養子移入した。ＰＢＭＣ注入の９日間後、当該動物に、腹腔内注入によって、単回１ｍｇ／ｋｇのモノ抗体、二重特異性抗体、またはアイソタイプコントロール抗体を投与した。ＰＢＭＣ移植の２４日から２８日後に、フローサイトメトリによって評価したヒトおよびマウスＣＤ４５に対する抗体でＰＢＭＣを染色した。リンパ球ゲートを特定するために、前方および側方散乱プロファイルを使用した。移植されたマウスの末梢血におけるヒトＣＤ４５^＋細胞の割合の増加によって証明されるように、二重特異性抗体は、ヒト白血球の増殖を高めることができた。各群に対して、ｎ≧６匹のマウス。

実施例６ 抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１抗体によるｈｕＰＢＬ－ＮＳＧにおけるＰＣ－３またはＡ４９８腫瘍細胞増殖の阻害
ｈｕＰＢＬ－ＮＳＧマウスにおいて異種移植モデルを確立するために、ＰＤ－Ｌ１ポジティブヒト前立腺癌細胞株ＰＣ－３（ＡＴＣＣ^＃ＣＲＬ－１４３５）または腎癌細胞株Ａ４９８（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－４４（商標））を使用することができる。腫瘍形成のために、３×１０^６のＰＣ－３細胞（またはＡ４９８細胞）／マウスが、上記において説明したｈｕＰＢＬ－ＮＳＧマウスに、皮下において注入されるであろう。腫瘍増殖に対する阻害効果を評価するために、腫瘍細胞移植の１４日後に、０．１～３ｍｇ／ｋｇの異なる濃度の抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１抗体、基準抗体、またはアイソタイプ抗体が、毎週２回、４週間にわたってマウスに静脈内投与されるであろう。腫瘍増殖は、Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤ（登録商標）Ｂｅｉｇｅマウスモデルにおいて説明したように、最長５週間にわたって毎週２回測定されるであろう。

実施例７ マウスおよびサルにおける抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１の薬物動態評価
１０ｍｇ／ｋｇから４０ｍｇ／ｋｇの二官能性タンパク質である抗ＰＤ－Ｌ１－ＶＩＤ／ｅＩｇＧ１が、皮下注入または静脈内注入によってマウスまたはサルに投与されるであろう。注入後、最長１５日間まで、異なる時点において、血清試料が採取されるであろう。当該血清試料中のＦｃ融合タンパク質の濃度が、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して特定されるであろう。

本開示について、実施例により、および好ましい実施形態の観点から説明してきたが、本開示はそれらに限定されるわけではないことは理解されるべきである。それに対して、様々な変更および同様の配置および手順を網羅することが意図され、したがって、添付の特許請求の範囲は、全てのそのような変更および同様の配置および手順を包含するような最も広い解釈が認められるべきである。

Claims (16)

1. プログラム細胞死タンパク質１リガンド（ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分からなる細胞表面タンパク質結合ドメインのＣ末端に、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害性ドメインを結合させた二官能性融合タンパク質であって、
   （１）ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体は、
   ア 配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号３のアミノ酸１～１１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含むか、または、
   イ 配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号５のアミノ酸１～１１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含み、
   （２）ＶＥＧＦ阻害性ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性のアミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦに特異的に結合し、
   前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列に対する配列同一性は、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を除く、
   前記二官能性融合タンパク質。
2. 前記二官能性融合タンパク質がさらに、
   Ｆｃドメインと、
   該ＦｃドメインのＮ末端に接続されているＦａｂ断片であって、前記細胞表面タンパク質結合ドメインを含むＦａｂ断片と
   を含み、
   前記ＶＥＧＦ阻害性ドメインは、該ＦｃドメインのＣ末端に接続されている、請求項１に記載の二官能性融合タンパク質。
3. さらに、前記Ｆｃドメインと前記ＶＥＧＦ阻害性ドメインとの間にリンカーを含む、請求項２に記載の二官能性融合タンパク質。
4. 前記抗体は、配列番号１２または１３に記述されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の二官能性融合タンパク質。
5. 前記抗体は、１対のポリペプチド鎖を含む、請求項１に記載の二官能性融合タンパク質。
6. 前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＹ抗体である、請求項５に記載の二官能性融合タンパク質。
7. 前記抗体は、ＩｇＧ抗体である、請求項６に記載の二官能性融合タンパク質。
8. 前記ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である、請求項７に記載の二官能性融合タンパク質。
9. 前記ＩｇＧ１抗体は、ＩｇＧ１抗体の抗体依存性細胞媒介型細胞傷害の低下型である、請求項８に記載の二官能性融合タンパク質。
10. 前記二官能性融合タンパク質は、ヒト抗体である、請求項１に記載の二官能性融合タンパク質。
11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の二官能性融合タンパク質と、少なくとも１種の薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
12. 治療薬と、
    請求項１～１０のいずれか一項に記載の二官能性融合タンパク質と、
    を含む抗体－薬物コンジュゲートであって、
    該治療薬は、リンカーによって、該二官能性融合タンパク質に共有結合的にコンジュゲートされている、抗体－薬物コンジュゲート。
13. 癌の治療における使用のためである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の二官能性融合タンパク質。
14. 前記癌が、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、リンパ腫、乳癌、頭頚部癌、腎細胞腫（ＲＣＣ）、および卵巣癌からなる群より選択される、請求項１３に記載の二官能性融合タンパク質。
15. 前記有効量が、０．００１μｇ／ｋｇから２５０ｍｇ／ｋｇである、請求項１３に記載の二官能性融合タンパク質。
16. 請求項１に記載の二官能性融合タンパク質をコードする核酸分子。

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