JP7457153B2 - 細胞ベースのアッセイのための方法および装置 - Google Patents

Description

細胞ベースのアッセイは、細胞生物学、医学、薬理学、毒物学などの分野において広く使用されている。それらは、通常、マルチウェル細胞培養プレート中で行われる。細胞は、アッセイによれば、懸濁液、２Ｄ単層、または３Ｄオルガノイド／スフェロイドの形態とすることができる。いくつかの特別なニーズを満たすために、多くの新たなシステムが導入されている。これらは、マイクロ流体細胞培養装置、３Ｄ膜ベースの灌流バイオリアクタ、３Ｄ細胞培養ピラーシステムなどを含む。いくつかの利点をもたらすが、これらのシステムは、複雑さ、堅牢性、柔軟性、取り扱いの容易さ、および費用効果の点で多かれ少なかれ欠点を示す。例えば、マイクロ流体システムの流路は、気泡、ヒドロゲルおよび細胞クラスタによって遮断される傾向がある。３Ｄ細胞培養ピラーシステムは、細胞をピラーに固定化するためにヒドロゲルを使用しなければならないため、増殖細胞からマルチスフェロイドを調製するのに適しているにすぎない。ヒト肝細胞のような非増殖細胞は、ヒドロゲル中でスフェロイドを形成することができない。ヒドロゲルは、特に大分子拡散およびアッセイ結果に影響を及ぼすことがあるため、ヒドロゲルの使用はまた、このピラーシステムの用途を制限する。さらに、小体積の蒸発を回避するためにヒドロゲルを非常に短時間で凝固させる必要があるため、細胞を微小柱に固定することは困難であり得る。

これらのシステムの欠点を考慮して、本発明は、細胞ベースのアッセイのための可動ピン細胞培養システムを導入する。このシステムは、２Ｄ単層および３Ｄ細胞培養に適しているだけでなく、２Ｄ単層、３Ｄ足場および３Ｄ非足場において培養される異なる種類の細胞を同時に試験することもできる。このシステムは、細胞ベースのアッセイを実行するためにより柔軟であり、取り扱いがより容易であり、堅牢である。

第１の態様では、本発明は、細胞ベースのアッセイ装置において使用するためのピンであって、ピンヘッドおよびピン先端を備えるピン本体を備え、ピン先端が、細胞播種のための表面を含む、ピンに関する。

本発明のピンの実施形態では、ピン本体は、少なくともテーパ状セグメントを備え、ピン本体は、ピンヘッドとともにＴ字形を形成する。

本発明のピンの実施形態では、ピン本体およびピン先端は、円筒形状を有する。

本発明のピンの実施形態では、ピン本体およびピン先端は、非円形クロスカット形状を有する。

本発明のピンの実施形態では、ピンヘッドは、溝を備える階段状ピンヘッドである。

本発明のピンの実施形態では、表面は、平坦面、縁部に隆起リムを有する平坦面、内向き構造化表面、多溝表面、マルチマイクロウェル表面、マルチマイクロピラー表面、粗面、透過膜、多孔質セグメントまたは磁気セグメントからなる群から選択され、好ましくは、層は、細胞接着を促進する層、より好ましくはヒドロゲルから選択される細胞接着促進層を含む。

第２の態様では、本発明は、本発明にかかるピンを受け入れるための複数の開口部を備えるピン支持体であって、ピン支持体が、円筒形部品に接続されてＴ字形ピン支持体を形成するリング状部品を備え、リング状部品の直径が円筒形部品の直径よりも大きく、リング状部品が、ピンを受け入れるための複数の開口部を備える、ピン支持体に関する。

実施形態では、ピン支持体は、プラスチック、好ましくはポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ポリエステルおよびポリカーボネートで作られている。

実施形態では、ピン支持体は、マルチウェルプレートのウェルに嵌合するようなサイズである。

第３の態様では、本発明は、細胞ベースのアッセイを実行するための装置であって、
本発明にかかるピンを受け入れるための複数の開口部を備えるピン支持体と、溝チャネルを備えるベースと、を備える、装置に関する。

細胞ベースのアッセイを実行するための装置の実施形態では、ピン支持体およびベースは、一致した形状を有し、ピンを受け入れるための開口部は、それらがベースの溝チャネルと位置合わせされるように配置される。

細胞ベースのアッセイを実行するための装置の実施形態では、ピン支持体は、細胞培養インサートを受け入れるための開口部をさらに備え、ベースは、液体を受け入れるためのリザーバをさらに備え、リザーバは、細胞培養インサートを受け入れるためにピン支持体の開口部と位置合わせされるようにベース内に配置される。

細胞ベースのアッセイを実行するための装置の実施形態では、装置は、リザーバ、溝チャネルおよび細胞培養インサートに流体接続しているポンプをさらに備える。

細胞ベースのアッセイを実行するための装置の実施形態では、ピン支持体は、
ピンを受け入れるための複数の開口部と、
少なくとも２つの細胞培養インサートを受け入れるための少なくとも２つの開口部と、
ポンプのシャフトを受け入れるための少なくとも１つの開口部と
を備え、かつ
ベースは、
少なくとも２つのリザーバと、
ポンプ、特にポンプインペラを受け入れるための少なくとも１つの開口部と、
入口チャネルと、
出口チャネルと
を備え、
ポンプの入口チャネルおよび出口チャネルは、リザーバおよび溝チャネルに接続されている。

細胞ベースのアッセイを実行するための装置の実施形態では、装置は、本発明にかかるピンを受け入れるための複数の開口部を備えるピン支持体と、溝チャネルおよびリザーバを備えるベースと、を備え、溝チャネルが、ピン支持体の開口部に固定されているピンのピン先端を受け入れるようなサイズであり、溝チャネルが、リザーバに接続されている。

細胞ベースのアッセイを実行するための装置の実施形態では、ピン支持体およびベースは、装置の分離可能な部分である。

細胞ベースのアッセイを実行するための装置の実施形態では、ピン支持体およびベースは、単一部品として一体化される。

細胞ベースのアッセイを実行するための装置の実施形態では、ベースは、２つ以上の溝チャネルを備える。

細胞ベースのアッセイを実行するための装置の実施形態では、溝チャネルは、上部、段差および下部を備える階段形状を有し、上部が、下部よりも大きい寸法を有する。

細胞ベースのアッセイを実行するための装置の実施形態では、溝チャネルは、ベース内に直線状または円形状に配置されている。

細胞ベースのアッセイを実行するための装置の実施形態では、リザーバは、液体を収容する。

細胞ベースのアッセイを実行するための装置の実施形態では、ピン支持体、ピンおよびベースは、プラスチック、好ましくはポリスチレン、ポリエステルおよびポリカーボネートで作られている。

第４の態様では、本発明は、本明細書で定義されるピンのピン表面に細胞を播種するための細胞播種装置であって、そのような細胞播種装置が、組み立てられたときに複数の漏斗状空洞を形成する第１の部分および第２の部分を備え、漏斗状空洞が、開口部を有する上部空洞部と、開口部を有する下部空洞部とを備え、漏斗状空洞の下部空洞部が、ピンの先端を受け入れるようなサイズである、
細胞播種装置に関する。

細胞播種装置の実施形態では、漏斗状空洞は、マトリックスに配列されている。

細胞播種装置の実施形態では、マトリックスは、８、１２、１６、２４、９６個の漏斗のフォーマットである。

細胞播種装置の実施形態では、漏斗状空洞の下部およびピンの挿入された先端は、液密シールを形成する。

細胞播種装置の実施形態では、細胞播種装置は、プラスチック、好ましくはポリプロピレン、ゴム、ポリスチレン、ポリエステルおよびポリカーボネートで作られている。

細胞播種装置の実施形態では、漏斗状空洞は、単一部品として形成される。

細胞播種装置の実施形態では、細胞播種装置は、上部空洞部内に取り外し可能な縮小スリーブを備え、スリーブが、両端に開口部を有するチャンバを備え、下部空洞部に隣接するスリーブの端部が、ピン先端の直径よりも小さいサイズの開口部を有する。

細胞播種装置の実施形態では、下部空洞部に隣接するスリーブの端部は、複数の微細開口部を含む。

細胞播種装置の実施形態では、スリーブは、スリーブの内側にマルチチャンバを形成するためのセパレータを含み、各チャンバが、下部空洞部に隣接するスリーブの端部に少なくとも１つのマイクロ開口部を含む。

細胞播種装置の実施形態では、上部空洞は、下部空洞部と同じ直径を有する。

細胞播種装置の実施形態では、縮小スリーブは、細胞が設計された形状またはパターンでピン先端に付着することを可能にするために、細胞播種装置の上部空洞内に配置される。

第５の態様では、本発明は、細胞ベースのアッセイを実行するためのキットであって、
本明細書で定義される複数のピンと、
本発明にかかる細胞アッセイを実行するための少なくとも１つの装置と、
本発明にかかる少なくとも１つの細胞播種装置と、
細胞ベースのアッセイおよび細胞播種を実行するためのマニュアルと
を備える、キットに関する。

キットの実施形態では、キットは、細胞ベースのアッセイを実行するための試薬をさらに含む。

第６の態様では、本発明は、細胞ベースのアッセイを実行するための方法であって、
ピン表面に細胞を付着させ、細胞を培養して、ピン表面６ａ上に２Ｄ単層細胞または３Ｄ構造化細胞を形成することによって、ピンを調製することと、
ベースのリザーバに試験培地を充填し、ピン支持体およびベースを組み立てて、細胞ベースのアッセイを実行するための装置を形成することと、
ピン表面を試験培地に埋め込むようにピンを固定するためにピン支持体の開口部に細胞ピンを挿入することと、
細胞を試験培地中で規定時間インキュベートすることであって、試験培地が溝チャネルを流れ、インキュベートすることと、インキュベーションの完了後、試験培地中の物質および／または細胞ピンのそれぞれの細胞を分析することと
を含む、方法に関する。

本発明の細胞ベースのアッセイを実行するための方法の実施形態では、細胞は、細胞の剥離を防止するためにヒドロゲルの薄層によってピン表面の最外面において被覆される。

本発明の細胞ベースのアッセイを実行するための方法の実施形態では、細胞ピンは、標的細胞のセットから調製され、細胞ピンのそれぞれは、２Ｄまたは３Ｄ形態で培養された１種類の標的細胞を含む。

第７の態様では、本発明は、ピンのピン表面に細胞を播種する方法であって、
本発明にかかる細胞播種装置の下部空洞部の開口部に、本明細書で定義されるピンを挿入して液密シールを形成することと、
細胞播種装置の上部空洞の各開口部に細胞懸濁液を添加し、細胞を規定時間培養して細胞をピン表面に付着させることを可能にすることと、
装置を分解し、ピンを装置に移して、本明細書で定義される細胞ベースのアッセイを実行することと
を含む、方法に関する。

ピンのピン表面に細胞を播種するための方法の実施形態では、ピンは、下部空洞部に沿って移動されて、下部空洞部内に液体を引き込む。

ピンのピン表面に細胞を播種するための方法の実施形態では、スリーブは、ピンの表面に第１のタイプの細胞を播種するために使用され、スリーブは、第１のタイプの細胞がピン表面に付着された後に除去され、第２のタイプの細胞が上部空洞に添加され、第２のタイプの細胞が培養されて、第１のタイプの細胞の細胞層の上部に第２の細胞層が形成される。

ピンのピン表面に細胞を播種するための方法の実施形態では、ピン先端は、ステップａ）の前に細胞の層を含んでいた。
[本発明1001]
細胞ベースのアッセイ装置（1ａ）において使用するためのピン（1）であって、
ピンヘッド（4ａ）とピン先端（6）とを備えるピン本体（4）であって、前記ピン先端（6）が細胞播種のための表面（6ａ）を備える、ピン本体（4）
を備える、ピン（1）。
[本発明1002]
前記ピン本体（4）が少なくともテーパ状セグメントを備え、前記ピン本体（4）が前記ピンヘッド（4ａ）とともにＴ字形を形成する、本発明1001のピン。
[本発明1003]
前記ピン本体（4）および前記ピン先端（6）が、円筒形状を有する、本発明1001のピン。
[本発明1004]
前記ピン本体（4）および前記ピン先端（6）が、非円形クロスカット形状を有する、本発明1001のピン。
[本発明1005]
前記ピンヘッド（4ａ）が、溝（5）を備える段付きピンヘッドである、本発明1001～1004のいずれかのピン。
[本発明1006]
前記表面（6ａ）が、平坦面、縁部に隆起リムを有する平坦面、内向き構造化表面、多溝表面、マルチマイクロウェル表面、マルチマイクロピラー表面、（本明細書に追加される）粗面、透過膜、多孔質セグメントまたは磁気セグメントからなる群から選択され、好ましくは、層が、細胞接着を促進する層、より好ましくはヒドロゲルから選択される細胞接着促進層を含む、本発明1001～1005のいずれかのピン。
[本発明1007]
本発明1001～1006のいずれかのピン（1）を受け入れるための複数の開口部（103）を備えるピン支持体（101）であって、前記ピン支持体（101）が、Ｔ字形のピン支持体（101）を形成するように円筒形部品（104）に接続されたリング形部品（102）を備え、前記リング形部品（102）の直径が、前記円筒形部品（104）の直径よりも大きく、前記リング形部品（102）が、前記ピン（1）を受け入れるための前記複数の開口部（103）を備える、ピン支持体（101）。
[本発明1008]
プラスチック、好ましくはポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ポリエステル、およびポリカーボネートで作られている、本発明1007のピン支持体（101）。
[本発明1009]
マルチウェルプレートのウェルに嵌合するようなサイズである、本発明1007または1008のピン支持体（101）。
[本発明1010]
細胞ベースのアッセイを実行するための装置（1ａ）であって、
本発明1001～1006のいずれかのピン（1）を受け入れるための複数の開口部（7ａ、1314）を備えるピン支持体（2、1307）と、
溝チャネル（7、1302）を備えるベース（3、1301）と
を備える、装置（1ａ）。
[本発明1011]
前記ピン支持体（2、1307）および前記ベース（3、1301）が、一致した形状を有し、ピン（1）を受け入れるための前記開口部（7ａ、1314）が、前記開口部（7ａ、1314）が前記ベース（3、1301）の前記溝チャネル（7、1302）と位置合わせされるように配置される、本発明1010の細胞ベースのアッセイを実行するための装置（1ａ）。
[本発明1012]
前記ピン支持体（1307）が、細胞培養インサート（1312）を受け入れるための開口部（1312ａ）をさらに備え、前記ベース（1301）が、液体を受け入れるためのリザーバ（1303）をさらに備え、前記リザーバ（1303）が、細胞培養インサート（1312）を受け入れるために前記ピン支持体（1307）の前記開口部（1312ａ）と位置合わせされるように前記ベース（1301）内に配置される、本発明1011の細胞ベースのアッセイを実行するための装置（1ａ）。
[本発明1013]
前記装置（1ａ）が、前記リザーバ（1303）に、前記溝チャネル（1302）に、および前記細胞培養インサート（1312）に流体接続しているポンプ（1311）をさらに備える、本発明1010～1012のいずれかの細胞ベースのアッセイを実行するための装置（1ａ）。
[本発明1014]
前記ピン支持体（1307）が、
ピン（1）を受け入れるための複数の開口部（1314）と、
少なくとも2つの細胞培養インサート（1312）を受け入れるための少なくとも2つの開口部（1312ａ）と、
前記ポンプ（1313）のインペラシャフトを受け入れるための少なくとも1つの開口部（1309）と
を備え、かつ
前記ベース（3、1301）が、
液体、特に細胞培養培地を受け入れるための少なくとも2つのリザーバ（1303）と、
前記ポンプ（1311）、特にポンプインペラ（1311）を受け入れるための少なくとも1つの開口部（1304）と、
入口チャネル（1305）と、
出口チャネル（1306）と
を備え、
前記ポンプ（1313）の前記入口チャネル（1305）および前記出口チャネル（1306）が、前記リザーバ（1303）および前記溝チャネル（1302）に接続されている、
本発明1010～1013のいずれかの細胞ベースのアッセイを実行するための装置（1ａ）。
[本発明1015]
本発明1001～1006のいずれかのピン（1）を受け入れるための複数の開口部（7ａ）を備えるピン支持体（2）と、溝チャネル（7）およびリザーバ（8）を備えるベース（3）とを備え、
前記溝チャネル（7）が、前記ピン支持体（2）の前記開口部（7ａ）内に固定されている前記ピン（1）の前記ピン先端（6）を受け入れるようなサイズであり、前記溝チャネル（7）が、前記リザーバ（8）に接続されている、
本発明1010の細胞ベースのアッセイを実行するための装置（1ａ）。
[本発明1016]
前記ピン支持体（2）および前記ベース（3）が、前記装置の分離可能な部分である、本発明1015の細胞ベースのアッセイを実行するための装置（1ａ）。
[本発明1017]
前記ピン支持体（2）および前記ベース（3）が、単一部品として一体化される、本発明1015の細胞ベースのアッセイを実行するための装置（1ａ）。
[本発明1018]
前記ベース（2）が、1を超える溝チャネル（7）を備える、本発明1015～1017のいずれかの細胞ベースのアッセイを実行するための装置（1ａ）。
[本発明1019]
前記溝チャネル（7）が、上部（11）、段部（10）、および下部（9）を備える階段形状を有し、前記上部（11）が、前記下部（9）よりも大きい寸法を有する、本発明1015～1018のいずれかの細胞ベースのアッセイを実行するための装置（1ａ）。
[本発明1020]
前記溝チャネル（7）が、前記ベース（3）内に直線状または円形状に配置されている、本発明1015～1019のいずれかの細胞ベースのアッセイを実行するための装置（1ａ）。
[本発明1021]
前記リザーバ（8）が前記液体を含む、本発明1015～1020のいずれかの細胞ベースのアッセイを実行するための装置（1ａ）。
[本発明1022]
前記ピン支持体（2）、前記ピン（1）、および前記ベース（3）が、プラスチック、好ましくはポリスチレン、ポリエステル、およびポリカーボネートで作られている、本発明1015～1021のいずれかの細胞ベースのアッセイを実行するための装置（1ａ）。
[本発明1023]
本発明1001～1006のいずれかのピン（1）のピン表面（6ａ）に細胞を播種するための細胞播種装置（40）であって、
組み立てられたときに複数の漏斗状空洞（44）を形成する第1の部分（41）および第2の部分（43）を備え、
前記漏斗状空洞（44）が、開口部を有する上部空洞部（44ａ）および開口部を有する下部空洞部（44ｂ）を備え、前記漏斗状空洞（44）の前記下部空洞部（44ｂ）が、前記ピン（1）の前記先端（6）を受け入れるようなサイズである、
細胞播種装置（40）。
[本発明1024]
前記漏斗状空洞（44）がマトリックスに配列されている、本発明1023の細胞播種装置（40）。
[本発明1025]
前記マトリックスが、8、12、16、24、96個の漏斗のフォーマットである、本発明1023または1024の細胞播種装置（40）。
[本発明1026]
前記漏斗状空洞（44ｂ）の下部および前記ピン（1）の挿入された前記先端（6）が液密シールを形成する、本発明1023～1025のいずれかの細胞播種装置（40）。
[本発明1027]
プラスチック、好ましくはポリプロピレン、ゴム、ポリスチレン、ポリエステル、およびポリカーボネートで作られている、本発明1023～1026のいずれかの細胞播種装置（40）。
[本発明1028]
前記漏斗状空洞（44）が単一部品として形成される、本発明1023の細胞播種装置（40）。
[本発明1029]
前記細胞播種装置（40）が、前記上部空洞部（44ａ）内に取り外し可能な縮小スリーブ（470）を備え、前記スリーブ（470）が、両端に開口部を有するチャンバを備え、前記下部空洞部（44ｂ）に隣接する前記スリーブの端部が、前記ピン先端1の直径よりも小さいサイズの開口部（47）を有する、本発明1023～1028のいずれかの細胞播種装置（40）。
[本発明1030]
前記下部空洞部（44ｂ）に隣接する前記スリーブの前記端部が、複数のマイクロ開口部（48）を含む、本発明1023～1029のいずれかの細胞播種装置（40）。
[本発明1031]
前記スリーブ（470）が、前記スリーブの内側にマルチチャンバを形成するためのセパレータ（49）を含み、各チャンバが、前記下部空洞部（44ｂ）に隣接する前記スリーブの前記端部に少なくとも1つのマイクロ開口部（48）を含む、本発明1030の細胞播種装置（40）。
[本発明1032]
前記上部空洞（44ａ）が前記下部空洞部（44ｂ）と同じ直径を有する、本発明1030の細胞播種装置（40）。
[本発明1033]
縮小スリーブ（470）が、設計された形状またはパターンで前記ピン先端6に細胞が付着することを可能にするために、前記細胞播種装置（40）の前記上部空洞（44ａ）内に配置される、本発明1030の細胞播種装置（40）。
[本発明1034]
細胞ベースのアッセイを実行するためのキットであって、
本発明1001～1006のいずれかの複数のピン（1）と、
本発明1006～1022のいずれかの細胞アッセイを実行するための少なくとも1つの装置（1ａ）と、
本発明1023～1033のいずれかの少なくとも1つの細胞播種装置（40）と、
前記細胞ベースのアッセイおよび前記細胞播種を実行するためのマニュアルと
を備える、キット。
[本発明1035]
前記細胞ベースのアッセイを実行するための試薬をさらに含む、本発明1034の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
[本発明1036]
細胞ベースのアッセイを実行するための方法であって、
ａ）前記ピン表面（6ａ）に細胞を付着させかつ前記細胞を培養することによって、ピン（1）を調製し、前記ピン表面（6ａ）上に2Ｄ単層細胞または3Ｄ構造化細胞を形成することと、
ｂ）前記ベース（3、1301）の前記リザーバ（8、1303）に試験培地を充填し、前記ピン支持体（2、1307）および前記ベース（3、1301）を組み立て、前記ピン支持体（2、1314）の前記開口部に前記細胞ピン（1）を挿入して、前記ピン表面（6ａ）を前記試験培地に没入させるように前記ピン（1）を固定することによって、前記アッセイ装置（1ａ）を調製することと、
ｃ）前記細胞を前記試験培地中で規定時間インキュベートすることであって、前記試験培地が前記溝チャネル（7、1302）を流れる、規定時間インキュベートすることと、前記試験培地中の物質および／または前記細胞ピン（1）のそれぞれの前記細胞を分析することと
を含む、方法。
[本発明1037]
前記細胞が、細胞の剥離を防止するためにヒドロゲルの薄層によって前記ピン表面（6ａ）の最外面において被覆される、本発明1036の方法。
[本発明1038]
前記細胞ピン（1）が標的細胞のセットから調製され、前記細胞ピン（1）のそれぞれが2Ｄ形態または3Ｄ形態で培養された1種類の前記標的細胞を含む、本発明1036または1037の方法。
[本発明1039]
ピン（1）のピン表面（6ａ）に細胞を播種する方法であって、
ａ）本発明1023～1033のいずれかの細胞播種装置（40）の前記下部空洞部（44ｂ）の前記開口部に、本発明1001～1006のいずれかのピン（1）を挿入して液密シールを形成することと、
ｂ）前記細胞播種装置（40）の前記上部空洞（44ａ）の各開口部に細胞懸濁液をピペッティングし、前記細胞を規定時間培養して前記細胞を前記ピン表面（6ａ）に付着させることと、
ｃ）前記装置を分解し、前記ピン（1）を、本発明1036～1038のいずれかの細胞ベースのアッセイを実行するための装置（1ａ）に移すことと
を含む、方法。
[本発明1040]
前記ピン（1）が前記下部空洞部（44ｂ）に沿って移動して、少なくとも前記下部空洞部（44ｂ）内に液体を引き込む、本発明1039のピン（1）のピン表面（6ａ）に細胞を播種するための方法。
[本発明1041]
前記スリーブ（470）が、前記細胞がピン先に付着された後に除去され、第2のタイプの細胞が前記上部空洞（44ａ）に追加され、前記細胞を培養して前記第2のタイプの細胞の上部細胞層を形成する、本発明1039または1040のピン（1）のピン表面（6ａ）に細胞を播種するための方法。
[本発明1042]
前記ピン先端6が、ステップａ）の前に細胞の層を含んでいた、本発明1039～1041のいずれかのピン（1）のピン表面（6ａ）に細胞を播種するための方法。

可動ピン細胞培養システムを示している。図１Ａは、可動ピン細胞培養システムの正面図である。図１Ｂは、可動ピン細胞培養システムの側面図である。図１Ｃは、可動ピン細胞培養システムの平面図である。図１Ｄは、リザーバおよび階段状溝チャネルを示すベースの線ＡＡに沿った断面図である。 ピン先が上になるように配置されたピンである。 内側表面を有するピン先に向かうピンのセグメントを示している。 マルチユニット細胞播種装置の（Ａ）正面図、（Ｂ）側面図、（Ｃ）装置の平面図、および（Ｄ）漏斗の上部によって形成されたリザーバを示す装置のＢＢ線断面図、（Ｅ）漏斗の狭管内のピン１を示す装置のＣＣ線断面図、および（Ｆ）漏斗の上部の接続部分を示すＦＦ線断面図である。 円形溝チャネル正面図（Ａ）、システムの平面図（Ｂ）、および（Ｃ）ピン６および溝チャネルを示すベースのＤＤ線断面図を有する可動ピン細胞培養システムを示している。 図６Ａ～図６Ｃは、本発明の分析システムにおいて使用されることができる溝チャネルの変形例のいくつかの平面図を示している。 中空ピンおよび取り外し可能な磁気インサートの正面図および平面図である。 ピンおよび漏斗状細胞播種ストリップの例である。 Ｔ字形インサートの例である。 １２ウェルプレート内のＴ字形インサートの例である。 ウェル内にピンを有するＴ字形インサートの例である。 漏斗状空洞の上部空洞部のための縮小スリーブを示している。図１２Ａは、正面図を示している。図１２Ｂは、単一開口部を有する平面図を示している。図１２Ｃは、複数開口部を有する平面図を示している。図１２Ｄは、スリーブのセパレータを有する平面図を示している。図１２Ｅは、細胞播種装置におけるスリーブの正面図を示している。 細胞培養インサートおよび一体型遠心ポンプを有する可動ピン細胞培養システム１ａの例である。図１３Ａは、細胞培養システムの斜視図を示している。図１３Ｂは、ピンおよび細胞培養インサートを有する組み立てられたシステムの平面図を示している。図１３Ｃは、ピンおよび細胞培養インサートを有する組み立てられたシステムの底面図を示している。 図１３Ａの説明を参照のこと。 図１３Ａの説明を参照のこと。

発明の詳細な説明
図１は、例示的な可動ピン細胞培養システム１ａを示している。細胞培養システム１ａは、個々の可動ピン１と、ピン支持体２と、ベース３とを備える。ピン１は、溝５を有する階段状ピンヘッド４ａと、その表面６ａが２Ｄまたは３Ｄ細胞培養のためのものであるピン先端６とを有する。ピン支持体２は、ベース３上に配置され、ピン支持体２は、ピン１を可動ピン細胞培養システム１ａ内に固定するために、ピン１を受け入れるための開口部７ａを備える。ピン支持体２は、ベース３のカバーとしても使用される。ベース３は、階段状溝チャネル７と、２つの台形リザーバ８とを含む。チャネル７の各側面は、Ｓ字形配置において底部狭溝９によって接続されたリザーバのうちの１つを有する。使用時に、試験培地（図中の赤色ドット）がリザーバ８の１つに添加され、培地は、狭溝９を通って別のリザーバに流れる。ピン支持体２は、ベース３上に配置され、次いで細胞ピン１は、ピン１を溝５で保持することができるピンセット、（例えばクラブチップ(crab tip)を有する）によってピン支持体３上の受け入れ開口部７ａに挿入される。階段状ピンヘッド４ａは、ピン先が狭溝９内の培地に没入するように溝チャネル７によって固定される。ロッカーシェーカーが使用されて、インキュベーション中に１つのリザーバ７から別のリザーバに狭溝９を通して培地を前後に循環させる。シーソー運動のシャフト軸は、チャネルに平行である。したがって、アッセイに応じて、試験培地および／または細胞ピン１上の細胞の分析によって結果が読み取られることができる。例えば、このシステムは、薬物代謝アッセイにおける肝細胞を、２Ｄ単層または３Ｄ非足場形態のいずれかを用いて細胞ピン１を試験することができる。培地中の試験化合物およびその代謝産物は、インキュベーション後に分析されることになる。細胞毒性アッセイのために、標的細胞のセットが使用されて、それらを同じ環境において試験されることができるように細胞ピンを調製することができる。したがって、結果は、インビボ状況により関連する可能性がある。細胞に対する毒性効果、例えば細胞形態の変化、細胞内の着色または蛍光物質の形成または蓄積の能力などは、顕微鏡または分光光度計を使用して検査されることができる。状況によっては、個々の細胞ピンは、マルチウェルプレートに移されてさらなるアッセイを行うことができる。

図２は、平坦ピン先６および階段状の丸い円柱ピンヘッド５を備える例示的なピン１を示している。フラットピン先端６の表面６ａは、細胞付着および細胞増殖のためのものである。場合によっては、ピン１の表面６ａは、アッセイシステムの組み立て中の乾燥を回避するために先端点においてより多くの培地を保持することができるように、エッジにおいて僅かに隆起したリムを含むことができる。本発明にかかる２Ｄおよび３Ｄ細胞培養の双方に様々な形状のピン１が使用されることができるが、細胞の単層を調製するには大きな円形表面が好ましく、細胞クラスタの中心への栄養素のより良好な拡散を得るために多細胞３Ｄ細胞を調製するには狭い長方形表面が好ましく、細胞の深層への栄養素の到達を確実にするために多層大細胞シートを調製するには透過性膜表面が好ましい。平坦な表面に加えて、表面６ａは、内側に構造化された表面、例えば凹面（図３Ａ）、円錐、角錐、または半円筒形（図３Ｂ）、多溝、マルチマイクロウェル、ピン先の複数のマイクロピラー表面とすることができ、ピン先の粗面はまた、特にハイドロゲルを使用した３Ｄ細胞培養にも使用されることができる。別の実施形態では、３Ｄ足場細胞培養用のピン１は、ピン先に向かって多孔質セグメントを含む。ピン１のサイズは特に限定されないが、観察しやすいように、ピン表面６ａのサイズは、顕微鏡視野内であることが好ましい。好ましいピン表面サイズは、０．１から２．５ｍｍの直径を有する円形領域である。

ピン表面６ａの表面への直接的な細胞の付着は、ピン１が上向きに配置された細胞播種装置４０を使用することによって行われる。したがって、細胞懸濁液中の細胞は沈殿し、重力によってピン１の表面６ａに付着し、単層または多細胞３Ｄ細胞クラスタを形成する。本発明の実施形態によれば、細胞播種装置４０は、双方とも半漏斗状空洞を含む第１の部分４１および第２の部分４３の２つの区画を備える。２つの区画４１および４３を合わせると、ピン１を受け入れるための漏斗状空洞を形成する。各漏斗状空洞４４は、開口部を有する上部空洞部４４ａと、開口部を有する下部空洞部４４ｂとを備え、漏斗状空洞４４の下部空洞部４４ｂは、ピン１の先端６を受け入れるようなサイズである。本発明の実施形態では、下部空洞部４４ｂの直径は、好ましくはピン先端６の直径に対応する。ピン１が下部空洞部４４ｂ内に配置されると、２つの区画４１および４３が互いに締め付けられて間隙をシールし、培地の漏れを防止する。本発明の実施形態では、培地の漏れを防止するために、ガスケット、例えばゴムリングまたはゴムシートが接触面の周りに配置されることができる。細胞播種装置４０が弾性材料、例えばシリコーンで作られている場合、ガスケットは、省略することができる。ピン先端６は、特に３Ｄ細胞培養のために空洞４４内に突出しないことが好ましい。したがって、全ての細胞がピン先端６の表面６ａに付着して、ピン間の細胞数のばらつきを低減することができる。一端が閉鎖された小さなサイズの管では非常に頻繁に発生する、下部空洞部４４ｂ内に気泡が形成されることを回避するために、ピン１は、閉じ込められた空気を除去するために数回上下に移動されることができる。別の実施形態では、細胞播種装置は、２つではなく単一の区画として作製されることもできる。適切なサイズの管およびピンは、管がバレルとして機能し、ピンがピストンとして機能するシリンジのような装置を形成することができるため、管のセグメントはまた、細胞の播種に使用されることも可能である。したがって、細胞懸濁液は、バレル内に引き込まれることができる。ピンのサイズが十分に大きい場合、ピペットが使用されて、ピン先が管の内側開口部の下方に設定される管に細胞懸濁液を添加することさえもできる。３Ｄ細胞培養のために、漏斗状空洞の表面は、適切な化学物質またはポリマーをコーティングまたはグラフトすることによって形成されることができる細胞忌避層を有することが好ましい。

図４は、２つの異なる構造化空洞区画を備える多漏斗細胞播種装置４０を示している。一方の区画４１は、いくつかの半円形チャネル４２を有し、第２の区画４３は、漏斗の上部幅広部分が接続された一致する数の半漏斗構造空洞４４を有する（図４Ｆ）。組み立てられると、漏斗４４の半円形チャネル４２および対応する狭半管４５は、ピン１を収容するための狭管を形成する（図４Ｅ）。漏斗の接続された上部幅広部分は、リザーバ４６となる（図４Ｄ）。したがって、細胞懸濁液は、リザーバ４６に注がれることができる。そのレベルがリザーバ内に上昇すると、細胞懸濁液は、漏斗の上部において自由に流れることができる。多漏斗急速細胞播種装置４０を水平に配置した後、細胞は、漏斗に均一に分配され、重力によってピンチップ６の表面６ａ上に沈殿する。ピン１のそれぞれは、増殖のために同じ量の細胞を受け取る。細胞の増殖状態は、半円形チャネルの薄い区画から観察されることができる。多漏斗急速細胞播種装置４０の使用は、取り扱いを容易にするだけでなく、細胞の急速な沈殿に起因して細胞懸濁液が急速に不均一になるため、細胞懸濁液を各漏斗に移送するための多数回のピペッティングによって引き起こされる変動も低減する。

多漏斗細胞播種装置の原理は、スフェロイドを調製するための例えば９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートまたは１５３６ウェルプレートなどの細胞忌避性表面マルチウェルプレートを作製するために適用されることもでき、マルチウェルプレートのウェルは、円錐形または丸底の正方形ウェルである。全ての正方形のウェルは、プレートの周りの隆起したバンクによって形成されるリザーバに開口している。バンクと最も外側のウェルとの間には溝があり、バンクの周りの液体上昇によって引き起こされる細胞の不均一な分布を最小限に抑える。ウェルと溝との間の壁の上部は、互いに接続され、細胞の着地を防止し、細胞を隣接するウェルに等しく誘導するために、角度のある屋根頂部構造を形成する。したがって、ウェルの開口部を覆うのに十分な体積で細胞懸濁液がリザーバに添加されると、細胞は、ウェルにシームレスに分配されることができる。細胞が各ウェルの底部に沈殿すると、リザーバ内の培養培地が除去されることができ、その後、通常のマルチウェルプレートのように取り扱うことができる。細胞は、インキュベータ内で培養された後、各ウェルにおいて単一のスフェロイドを形成する。

可動ピン細胞培養システム１ａおよび細胞播種装置４０を作製するために、細胞に対して非毒性の材料が使用されることができる。ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリオキシメチレンなどのプラスチックが好ましい。細胞付着の様々な条件のために、ピン先６の表面６ａは、例えばガスプラズマ処理、ポリマーグラフトおよび細胞外マトリックスコーティングなどの異なる手段によって処理される必要があり得る。ポリテトラフルオロエチレンが使用されて、細胞播種装置４０ならびにピン１を作製して、培地の漏れおよび気泡の発生も回避することができる。ピン１と細管との間の狭い疎水性間隙は、空気が自由に通過することを可能にするが培地の漏れを防止するため、選択的バリアとして機能することができる。疎水性間隙は、ピンと細胞播種装置との接触面に疎水性材料を塗布することによって形成されることもできる。

細胞播種装置４０により、単一細胞懸濁物、生検微小組織および３Ｄ細胞培養物で産生されたオルガノイド／スフェロイドがピン表面６ａに直接播種されることができる。細胞がピン先端６の表面６ａにしっかりと付着すると、ピン１は、増殖のためにマルチウェル細胞培養プレートに移されることができる。例えば肺癌細胞株からの細胞の場合、細胞ピン１がマルチウェルプレート内で下向きに配置されるため、表面細胞の一部は、細胞培養中に細胞クラスタから脱落する。表面細胞の脱落を防止するために、付着した細胞は、ヒドロゲルの薄層によって被覆されることができる。適切なヒドロゲルは、アガロース、アルギネートおよびコラーゲンである。薄いヒドロゲルコーティング層は、最初にピン先端６をヒドロゲル溶液に浸漬し、次いでピン先端６を適切な溶液に浸漬してヒドロゲルを固化させることによって形成されることができる。例えば、アガロースは、冷培地によって固化されることができる。アルギン酸塩溶液は、ＢａＣｌ_２またはＣａＣｌ_２溶液によって固化されることができ、コラーゲンは、温アルカリ溶液によって固化されることができる。

薄いヒドロゲルコーティング層に加えて、ピン先端６に磁気セグメントを含むピン１もまた、ピン上での細胞培養中に磁化された細胞または細胞クラスタになるように細胞が常磁性ナノ粒子で処理されるときに、細胞をピン先端表面６ａに閉じ込めるために使用されることができる。図７は、先端に磁気ブロック７３のピースを含む取り外し可能な磁気インサート７２を有する中空ピン７１の例である。ピンのヘッドは、インサートのヘッド７５を収容するように成形された溝７４を有する。インサートが中空ピン内に配置されると、ピン先７６において強磁性および常磁性材料を引き付けることができる磁気ピンが形成される。磁気ピンはまた、ピン先に磁気ブロックを埋め込むことによって作製されることができ、磁気ブロックは、硬質または軟質磁性材料のいずれかとすることができる。軟磁性材料は、磁化状態および減磁状態の双方を有することができるために好ましい。細胞が先端点に直接磁化されて減磁洗浄ステップを導入すると、未結合の常磁性ナノ粒子を除去するために好ましい。さらに、磁化された細胞を使用することによって、磁気ピンは、細胞を細胞懸濁液からピン先に直接固定することができる。したがって、可動ピン細胞培養システムの用途は、非接着性細胞アッセイ、頂端膜または基底膜のいずれかに特異的に結合する常磁性ナノ粒子を使用することによる、定義された頂端－基底極性配向を有する極性細胞アッセイ、および特定の常磁性ナノ粒子を使用することにより、標的細胞がいくつかの細胞型を有する細胞混合物から標的細胞に直接取り出されるアッセイに拡張されることができる。さらに、磁気ビーズイムノアッセイ、特に、磁気ピンによるビーズの容易且つ完全な移動のために異なる標的化ビーズを試料溶液と１つずつ反応させることができるマルチプレックスアッセイへの適用がさらに広げられることができる。

細胞播種装置４０は、凝固のために長時間のインキュベーションを必要とするヒドロゲルを用いたマルチスフェロイドの調製にも使用されることができる。例えば、低濃度のコラーゲン溶液において細胞を調製するために、コラーゲン溶液に懸濁されたごく少量の細胞が細胞播種装置４０内のピン先端６の表面６ａに添加され、細胞溶液が適切なｐＨの低密度アルカリ溶液によって被覆される。３７℃で一定時間インキュベートした後、コラーゲン溶液は、埋め込まれた細胞とともにピンチップ６の表面６ａに付着するヒドロゲルをゆっくりと形成する。ヒドロゲル中の各細胞は、増殖して球状体を形成する。

本発明の実施形態によれば、可動ピン細胞培養システム１ａは、ロッカーシェーカー（図１Ｄ）によるシーソー運動中のチャネル内の培養培地の体積変化を最小限に抑えるために、階段状溝チャネル７を使用する。階段状溝チャネルにおいて、段差１０は、培地が上部幅広溝１１に乗り上げるのを防止するためのものである。一方、狭溝９の毛細管力は、ピン先端６の表面６ａ上の細胞が常に培地内にあることを確実にするために、培地を狭溝内に保つ。狭溝は、その毛細管力によって培地を段差よりも高い高さまで上昇させることができる間隙サイズを有することが好ましい。したがって、最大浮上高さよりも低い段差を導入して培地のさらなる浮上を停止させることにより、階段状溝チャネルは、同じ体積を保持することができる。

別の実施形態では、可動ピン細胞培養システムのベース（図５）は、細胞ピン６用の受け入れ開口部７ａを有する円形溝チャネル７を有するベースを含む。受け入れ開口部７ａは、流路７の上部に位置している。使用時には、ピン１が円形溝チャネル７に沿って１つずつ挿入され、Ｔ字形ピンヘッド４ａが受け入れ開口部７ａ内に固定され、それにより、ピン先端６の表面６ａに付着された細胞が培地内にインマージされる。垂直および水平軌道運動シェーカーが使用されて、溝チャネル７内を時計回りまたは反時計回りに流れる培養培地を駆動することができる。円形チャネルを有する可動ピン細胞培養システムは、インキュベーション体積に対する細胞数の高い比を必要とするアッセイに好ましい。円形チャネル７ａはまた、チャネル７がマルチウェルプレートのマッチングウェル内にＴ字形インサート１０１を配置することによって形成される別の方法によっても作製されることができる（図９および図１０を参照）。Ｔ字形インサートの上部突出構造１０２は、細胞ピン１用の孔１０３を含み、そのサイズは、ウェルのサイズと同じであることが好ましく、その結果、Ｔ字形インサート１０１がウェルの中央に固定されることができ、円形溝チャネル７ａが形成される。いくつかの例では、細胞が培地の流れに感受性である場合、階段状溝チャネルが好ましい場合がある。この場合、段差は、培地によって覆われるため、上部幅広溝は、ピン先端６の表面６ａ上の細胞が影響を受けにくくなるように、狭い溝内の培地の流量を減少させるための流路としても機能する。溝チャネルのいくつかの変形例を図６に示す。例えば、溝チャネルの間隙サイズは、アッセイがいくつかの細胞タイプから異なる量の細胞を必要とする場合、小さいサイズのピン１と大きいサイズのピン１の双方に適合するように、溝チャネルに沿って異なっていてもよい（図６Ａ）。狭いチャネルに沿ったウェルの設計（図６Ｂ）は、大きなサイズのピン１が使用される場合に総体積を最小にすることができる。ウェルの底部が狭いチャネルの底部よりも低い場合、ウェルは、細胞培養にも使用されることができる。したがって、ピン１と組み合わせると、培地に対する細胞の比率がさらに増加されることができる。スネーク形状（図６Ｃ）に配置された溝は、より多くの細胞ピンを収容することができるが、ベースの長さを増加させることはできない。

可動ピンアッセイシステム１ａは、溝チャネル７だけでなく、受け入れ開口部が管に沿って配置されている管チャネルにも適用されることができる。液密シールのためにピンを受け入れ開口部に締結するために、ねじおよびナット構造が使用される。管内の培地の循環は、チュービングポンプによって駆動されることができる。管の密閉空間のために、ピン１は、ピン先を下向きにして設置される必要はない。管の周囲の全ての方向が使用されて細胞ピン１を設置することができるため、可動ピンアッセイシステム１ａでは細胞量が劇的に増加されることができ、高い細胞数対体積比を必要とするアッセイに適合することができる。

図８Ａおよび図８Ｂは、ピン１および対応する細胞播種装置４０を示している。

図９は、本発明にかかるピン１を受け入れるための複数の開口部１０３を有する例示的なピン支持体１０１を示している。ピン支持体１０１は、円筒状部分１０４に接続されてＴ字形インサート１０１を形成するリング状部分１０２を備える。リング状部分１０２の直径は、円筒状部分１０４の直径よりも大きく、リング状部分１０２は、ピン１を受け入れるための複数の開口部１０３を備える。ピン支持体１０１は、マルチウェルプレートのウェルに嵌合するようなサイズである。

図１０は、ピン支持体１０１が挿入されたマルチウェルプレート１１０を示している。そのようなアセンブリは、本発明にかかる細胞ベースのアッセイを実行するための機能システムである。本発明にかかるそのようなアセンブリを使用する例示的な細胞ベースのアッセイは、以下のステップを含む：マルチウェルプレートのウェルが細胞培養培地によって満たされ、各ウェルに異なる試験化合物が添加される。次に、ピン支持体１０１がマルチウェルプレート１１０のウェルに置かれ、ピン先端表面６ａに細胞が播種されたピン１が開口部１０３に挿入される。ピン先端表面６ａに播種された細胞は、試験化合物を含む細胞培地と接触する。ピン先端表面６ａには、同じ細胞種が播種されることができるか、または異なる細胞種が播種されることができる。マルチウェルプレート１１０が規定時間インキュベータ内に置かれ、インキュベーション終了後に、ピン先端表面６ａに播種された細胞培地および／または細胞が分析される。図１１は、図１０に示すマルチウェルアセンブリの底面図を示している。

図１３は、磁気ミキサによって駆動されることができる遠心ポンプ１３１１を組み込んだ細胞ベースのアッセイを実行するための装置（１ａ）の別の実施形態を示している。細胞ベースのアッセイを実行するための装置１ａは、ベース１３０１と、磁気駆動ポンプ１３１１と、ピン支持体１３０７とを備える。ベース１３０１は、溝チャネル１３０２と、２つの細胞培養インサート１３１２を受け入れるための２つのリザーバ１３０３と、ポンプ１３１１、特に遠心ポンプインペラ１３１１を受け入れるための開口部１３０４とを有し、これらは、ポンプ入口チャネル１３０５およびポンプ出口チャネル１３０６によって接続されて、組み立てられたときに液体、例えば細胞培養培地がこれらの空洞を通って循環することを可能にする。ピン支持体１３０７は、細胞培養インサート１３１２用の開口部およびピン１を受け入れるための開口部１３１４、ならびにサンプリング開口部１３０８およびポンプシャフト支持開口部１３０９を備える。ねじ１３１０は、ベース１３０１をピン支持体１３０７に固定する役割を果たす。

使用前に、ピン支持体１３０７およびベース１３０１を備える細胞ベースのアッセイシステム１ａが組み立てられる。細胞ベースのアッセイシステム１ａのアセンブリは、以下のステップを含む：
１）ベース１３０１をペトリ皿に置く、
２）ポンプインペラ１３１１をポンプハウス１３０４内に配置する、
３）ピン支持体１３０７をベース上に置く、および
４）ねじ１３１０を締結して、ベース１３０１をピン支持体１３０７に締結する。

次いで、細胞培養培地が組み立てられた細胞ベースのアッセイシステムに充填され、細胞培養インサート１３１２および細胞ピン１がそれらの対応する位置に配置され、組み立てられたシステムがペトリ皿蓋によって被覆される。その後、細胞培養インキュベータ内の磁気ミキサ上にシステムを配置する。ミキサの適切な回転速度を設定すると、インペラ１３１１は、それに応じた速度で回転し、空洞を流れる培養培地を規定流量で駆動する。サンプリング開口部１３０８は、化合物の添加ならびに分析のための試験培地のサンプリングに使用されることができる。ミキサの回転方向は、異なる供給元とは異なる可能性があるため、ブレードレスインペラなどの双方向インペラがシステムに使用される。

細胞培養インサートは、足場依存性および独立性細胞株の研究のためのツールとして機能する透過性支持体である。細胞培養インサートは、細胞を増殖させることができる膜を含む。好ましい細胞培養インサートは、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｒ）細胞培養インサートである。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｒ）細胞培養インサートは、足場依存性細胞株および足場非依存性細胞株の双方の研究のための便利で滅菌された使いやすい透過性支持装置である。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｒ）は、例えばＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃまたはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈなどの細胞培養装置製造業者から市販されている。

さらなる実施形態では、可動ピン細胞培養システム１ａはまた、細胞培養インサート１３１２ａ用の受け入れ開口部を備えてもよい。細胞培養インサート１３１２のための受け入れ開口部は、好ましくはリザーバ１３０３の上方に位置する。細胞培養インサート１３１２は、細胞シートを調製し、化合物のバリアとして機能するために使用されることができる。したがって、より複雑なアッセイが実行されて、化合物の吸着、代謝および分泌を同時に研究することができる。例えば、組み立てられたシステム１ａは、１つのリザーバ１３０３内の腸細胞シートインサート１３１２と、別の細胞シートインサート１３１２内の腎臓細胞シートと、チャネル１３０２内のピン１の表面６ａに播種された肝細胞細胞とを含む。試験化合物が腸細胞シートインサート１３１２の内側チャンバに添加されると、腸細胞は、化合物を吸収し、チャネル１３０２に輸送される。ピン１の表面６ａに播種された肝細胞は化合物を代謝し、次いで腎臓細胞は、化合物を腎臓細胞シートインサート１３１２の内部チャンバに排出する。有用なデータは、異なる区画からの培地中の化合物および代謝産物の分析によって取得されることができる。

実施例：薬物代謝研究における細胞系システムの使用
ステップ１：ピン１を０．０２ｍｇ／ｍＬのコラーゲンによって３時間コーティングし、ピンを室温で一晩乾燥させる。

ステップ２：本発明の播種装置を使用して８０万～１００万個／ｍＬの濃度で肝細胞に播種し、一晩のインキュベーション後にピンを除去し、図９に示すようにピンをピン支持体１０１内に配置する。

ステップ３：０．８～０．９ｍＬの細胞培養培地および試験化合物を含む１２ウェル細胞培養プレート内に、細胞コーティングされたピン１を有するピン支持体１０１を上下逆さまの位置に置く（図１０を参照）。

ステップ３：１２ウェル細胞培養プレートを、細胞培養インキュベータ内で１０ｒｐｍの速度で振盪するように設定したロッカーシェーカーに置く。

ステップ４：アセトニトリルを含むプレートのウェルに２０μＬの培養培地を移すことによって規定時点でサンプリングする。

ステップ５：薬物代謝産物についてＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用することによって試料を分析する。

Claims (37)

1. 細胞ベースのアッセイを実行するための装置（１ａ）であって、
   ピン（１）を受け入れるための複数の開口部（１３１４）を備えるピン支持体（１３０７）と、
   溝チャネル（１３０２）を備えるベース（１３０１）と
   を備え、
   前記ピン（１）がピンヘッド（４ａ）とピン先端（６）とを備えるピン本体（４）を備え、
   前記ピン先端（６）が細胞播種のための表面（６ａ）を備え、
   前記ピン支持体（１３０７）および前記ベース（１３０１）が、一致した形状を有し、前記ピン（１）を受け入れるための前記開口部（１３１４）が、前記開口部（１３１４）が前記ベース（１３０１）の前記溝チャネル（１３０２）と位置合わせされるように配置され、
   前記ピン支持体（１３０７）が、細胞培養インサート（１３１２）を受け入れるための開口部（１３１２ａ）をさらに備え、前記ベース（１３０１）が、液体を受け入れるためのリザーバ（１３０３）をさらに備え、前記リザーバ（１３０３）が、細胞培養インサート（１３１２）を受け入れるために前記ピン支持体（１３０７）の前記開口部（１３１２ａ）と位置合わせされるように前記ベース（１３０１）内に配置され、
   前記装置（１ａ）が、前記リザーバ（１３０３）に、前記溝チャネル（１３０２）に、および前記細胞培養インサート（１３１２）に流体接続しているポンプ（１３１１）をさらに備える、
   装置（１ａ）。
2. 前記ピン支持体（１３０７）が、
   ピン（１）を受け入れるための複数の開口部（１３１４）と、
   少なくとも２つの細胞培養インサート（１３１２）を受け入れるための少なくとも２つの開口部（１３１２ａ）と、
   前記ポンプ（１３１１）のインペラシャフトを受け入れるための少なくとも１つの開口部（１３０９）と
   を備え、かつ
   前記ベース（１３０１）が、
   液体を受け入れるための少なくとも２つのリザーバ（１３０３）と、
   前記ポンプ（１３１１）を受け入れるための少なくとも１つの開口部（１３０４）と、
   入口チャネル（１３０５）と、
   出口チャネル（１３０６）と
   を備え、
   前記ポンプ（１３１１）の前記入口チャネル（１３０５）および前記出口チャネル（１３０６）が、前記リザーバ（１３０３）および前記溝チャネル（１３０２）に接続されている、
   請求項１に記載の細胞ベースのアッセイを実行するための装置（１ａ）。
3. 前記液体が、細胞培養培地を含む、請求項２に記載の細胞ベースのアッセイを実行するための装置（１ａ）。
4. 前記少なくとも１つの開口部（１３０４）が、前記ポンプ（１３１１）のポンプインペラを受け入れる、請求項２に記載の細胞ベースのアッセイを実行するための装置（１ａ）。
5. 前記ピン支持体（１３０７）および前記ベース（１３０１）が、プラスチックで作られている、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞ベースのアッセイを実行するための装置（１ａ）。
6. 前記ピン支持体（１３０７）および前記ベース（１３０１）が、ポリスチレン、ポリエステル、および／またはポリカーボネートで作られている、請求項５に記載の細胞ベースのアッセイを実行するための装置（１ａ）。
7. 細胞ベースのアッセイを実行するためのキットであって、
   複数のピン（１）と、
   請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞ベースのアッセイを実行するための装置（１ａ）を少なくとも１つと、
   少なくとも１つの細胞播種装置（４０）と
   を備え、
   前記ピン（１）が、ピンヘッド（４ａ）とピン先端（６）とを備えるピン本体（４）を備え、
   前記ピン先端（６）が、細胞播種のための表面（６ａ）を備え、
   前記少なくとも１つの細胞播種装置（４０）が、前記ピン（１）の前記表面（６ａ）に細胞を播種するように構成されている、
   キット。
8. 前記ピン（１）の前記ピン本体（４）が少なくともテーパ状セグメントを備え、前記ピン（１）の前記ピン本体（４）が前記ピン（１）の前記ピンヘッド（４ａ）とともにＴ字形を形成する、請求項７に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
9. 前記ピン（１）の前記ピン本体（４）および前記ピン先端（６）が、円筒形状を有する、請求項７に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
10. 前記ピン（１）の前記ピン本体（４）および前記ピン先端（６）が、非円形クロスカット形状を有する、請求項７に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
11. 前記ピン（１）の前記ピンヘッド（４ａ）が、溝（５）を備える段付きピンヘッドである、請求項７～１０のいずれか一項に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
12. 前記ピン（１）の前記表面（６ａ）が、平坦面、縁部に隆起リムを有する平坦面、内向き構造化表面、多溝表面、マルチマイクロウェル表面、マルチマイクロピラー表面、粗面、透過膜、多孔質セグメントまたは磁気セグメントからなる群から選択される、請求項７～１１のいずれか一項に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
13. 前記ピン（１）の前記表面（６ａ）が、細胞接着を促進する層を含む、請求項７～１２のいずれか一項に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
14. 前記ピン（１）の前記表面（６ａ）が、ヒドロゲルから選択される細胞接着促進層を含む、請求項１３に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
15. 前記ピン（１）が、プラスチックで作られている、請求項７～１４のいずれか一項に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
16. 前記ピン（１）が、ポリスチレン、ポリエステル、および／またはポリカーボネートで作られている、請求項１５に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
17. 前記少なくとも１つの細胞播種装置（４０）が、組み立てられたときに複数の漏斗状空洞（４４）を形成する第１の部分（４１）および第２の部分（４３）を備え、
    前記漏斗状空洞（４４）が、開口部を有する上部空洞部（４４ａ）および開口部を有する下部空洞部（４４ｂ）を備え、前記漏斗状空洞（４４）の前記下部空洞部（４４ｂ）が、前記ピン（１）の前記ピン先端（６）を受け入れるようなサイズである、
    請求項７～１６のいずれか一項に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
18. 前記少なくとも１つの細胞播種装置（４０）において、前記漏斗状空洞（４４）がマトリックスに配列されている、請求項１７に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
19. 前記少なくとも１つの細胞播種装置（４０）の前記マトリックスが、８、１２、１６、２４、または９６個の漏斗のフォーマットである、請求項１８に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
20. 前記少なくとも１つの細胞播種装置（４０）において、前記漏斗状空洞（４４）の前記下部空洞部（４４ｂ）および前記ピン（１）の挿入された前記ピン先端（６）が液密シールを形成する、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
21. 前記少なくとも１つの細胞播種装置（４０）がプラスチックで作られている、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
22. 前記少なくとも１つの細胞播種装置（４０）がポリプロピレン、ゴム、ポリスチレン、ポリエステル、および／またはポリカーボネートで作られている、請求項１７～２１に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
23. 前記少なくとも１つの細胞播種装置（４０）において、前記漏斗状空洞（４４）が単一部品として形成される、請求項１７に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
24. 前記少なくとも１つの細胞播種装置（４０）が、前記上部空洞部（４４ａ）内に取り外し可能な縮小スリーブ（４７０）を備え、前記スリーブ（４７０）が、両端に開口部を有するチャンバを備え、前記下部空洞部（４４ｂ）に隣接する前記スリーブの端部が、前記ピン先端（６）の直径よりも小さいサイズの開口部（４７）を有する、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
25. 前記少なくとも１つの細胞播種装置（４０）において、前記下部空洞部（４４ｂ）に隣接する前記スリーブの前記端部が、複数のマイクロ開口部（４８）を含む、請求項２４に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
26. 前記少なくとも１つの細胞播種装置（４０）において、前記スリーブ（４７０）が、前記スリーブの内側にマルチチャンバを形成するためのセパレータ（４９）を含み、各チャンバが、前記下部空洞部（４４ｂ）に隣接する前記スリーブの前記端部に少なくとも１つのマイクロ開口部（４８）を含む、請求項２５に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
27. 前記少なくとも１つの細胞播種装置（４０）において、前記上部空洞部（４４ａ）が前記下部空洞部（４４ｂ）と同じ直径を有する、請求項２５に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
28. 前記少なくとも１つの細胞播種装置（４０）において、縮小スリーブ（４７０）が、設計された形状またはパターンで前記ピン先端（６）に細胞が付着することを可能にするために、前記細胞播種装置（４０）の前記上部空洞部（４４ａ）内に配置される、請求項２５に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
29. 前記細胞ベースのアッセイを実行するための試薬をさらに含む、請求項７～２８のいずれか一項に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキット。
30. 請求項７～２９のいずれか一項に記載の細胞ベースのアッセイを実行するためのキットを用いて細胞ベースのアッセイを実行するための方法であって、
    ａ）各ピン（１）の表面（６ａ）に細胞を付着させかつ前記細胞を培養することによって、前記複数のピン（１）を調製し、各ピン（１）の表面（６ａ）上に２Ｄ単層細胞または３Ｄ構造化細胞を形成することと、
    ｂ）前記ベース（１３０１）の前記リザーバ（１３０３）に試験培地を充填し、前記ピン支持体（１３０７）および前記ベース（１３０１）を組み立て、前記ピン支持体（１３０７）の前記複数の開口部（１３１４）に前記複数のピン（１）を挿入して、各ピン（１）の表面（６ａ）を前記試験培地に没入させるように前記複数のピン（１）を固定することによって、前記細胞ベースのアッセイを実行するための装置（１ａ）を調製することと、
    ｃ）前記溝チャネル（１３０２）を流れる前記試験培地中で、前記細胞を規定時間インキュベートすることと、前記試験培地中の物質および／または各ピン（１）の前記細胞を分析することと
    を含む、方法。
31. 前記細胞が、細胞の剥離を防止するためにヒドロゲルの薄層によって前記ピン（１）の前記表面（６ａ）の最外面において被覆される、請求項３０に記載の方法。
32. 前記複数のピン（１）が標的細胞のセットから調製され、前記複数のピン（１）のそれぞれが２Ｄ形態または３Ｄ形態で培養された１種類の前記標的細胞を含む、請求項３０または３１に記載の方法。
33. 前記少なくとも１つの細胞播種装置（４０）が、組み立てられたときに複数の漏斗状空洞（４４）を形成する第１の部分（４１）および第２の部分（４３）を備え、
    前記漏斗状空洞（４４）が、開口部を有する上部空洞部（４４ａ）および開口部を有する下部空洞部（４４ｂ）を備え、前記漏斗状空洞（４４）の前記下部空洞部（４４ｂ）が、前記ピン（１）の前記ピン先端（６）を受け入れるようなサイズであり、
    前記ａ）各ピン（１）の表面（６ａ）に細胞を付着させかつ前記細胞を培養することによって、前記複数のピン（１）を調製し、各ピン（１）の表面（６ａ）上に２Ｄ単層細胞または３Ｄ構造化細胞を形成することが、
    ａ’）前記少なくとも１つの細胞播種装置（４０）の前記下部空洞部（４４ｂ）の前記開口部に、ピン（１）を挿入して液密シールを形成することと、
    ｂ’）前記少なくとも１つの細胞播種装置（４０）の前記上部空洞部（４４ａ）の各開口部に細胞懸濁液をピペッティングし、前記細胞を規定時間培養して前記細胞を前記ピン（１）の前記表面（６ａ）に付着させることと
    を含む、請求項３０に記載の方法。
34. 前記細胞を前記ピン（１）の前記表面（６ａ）に付着させた後に、前記少なくとも１つの細胞播種装置（４０）を分解し、前記ピン（１）を取り外すことをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
35. 前記ピン（１）が前記下部空洞部（４４ｂ）に沿って移動して、少なくとも前記下部空洞部（４４ｂ）内に液体を引き込む、請求項３３または３４に記載の方法。
36. 前記少なくとも１つの細胞播種装置（４０）が、前記上部空洞部（４４ａ）内に取り外し可能な縮小スリーブ（４７０）を備え、前記スリーブ（４７０）が、両端に開口部を有するチャンバを備え、前記下部空洞部（４４ｂ）に隣接する前記スリーブの端部が、前記ピン先端（６）の直径よりも小さいサイズの開口部（４７）を有しており、前記スリーブ（４７０）が、前記細胞がピン先に付着された後に除去され、第２のタイプの細胞が前記上部空洞部（４４ａ）に追加され、前記細胞を培養して前記第２のタイプの細胞の上部細胞層を形成する、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記ピン先端（６）が、ステップａ’）の前に細胞の層を含んでいた、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。

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