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JP7328261B2 - セリンプロテアーゼ阻害剤カザル（ｓｐｉｋ）組成物および方法 - Google Patents

セリンプロテアーゼ阻害剤カザル（ｓｐｉｋ）組成物および方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月６日に出願された米国仮出願第６２／６３９，３４５号だけでなく、２０１８年３月７日に出願された米国仮出願第６２／６３９，８５０号の出願日に対する優先権の利益も主張し、これらの出願の開示は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
政府の権利
本発明は、Ｓｍａｌｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＳＢＩＲ）プログラムの下で米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与された助成金番号２Ｒ４４ＣＡ１６５３１４－０２Ａ１およびＦＡＩＮ番号Ｒ４４ＣＡ１６５３１４の下での政府の支援により為された。政府は本発明においてある特定の権利を有する。
発明の分野
抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体が、そのような抗体を作製する方法、そのような抗体を含む、医薬組成物を含む組成物、およびＡＳ－ＳＰＩＫの発現により特徴付けられる障害（例えば、肝臓がん）を診断するためのその使用と共に開示される。診断方法および抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体を含むキットもまた開示される。
肝臓は、身体中の最大の臓器の１つである。肝臓は、食物の消化のために必要とされる酵素および胆汁の産生、グリコーゲン貯蔵の調節、血漿タンパク質合成、ホルモン産生、ならびに様々な代謝物の解毒を含む多くの機能を有する。肝臓障害としては、肝細胞がん（ＨＣＣ）および肝内胆管がん（ＩＣＣ）などの肝臓がん、ウイルス感染症、硬変、ならびに肝臓の他の炎症性障害が挙げられ、これらは世界中で何百万もの人々に影響している。例えば、米国において５００万人より多くの個体および世界中で４億５千万人より多くの個体がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を患っており、これらの感染個体の３０％より多くが肝臓がんを発生する高いリスクがある。Ｋｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ－ｂｉｏｌｏｇｉｅ ２０１０；５８（４）：２７３－２７７；Ｓａｒａｓｗａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．２０１５；２２ Ｓｕｐｐｌ １：６－２５；Ｅｌ－Ｓｅｒａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１４；６０（５）：１７６７－１７７５；Ｋａｎｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１５；１３（４）：８０５－８０７。診断および処置の進歩にもかかわらず、肝臓がんは依然として罹病率および死亡率の両方の重要な原因である。Ｅｌ－Ｓｅｒａｇ，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１；３６５（１２）：１１１８－１１２７。原発性肝臓がん、または肝臓を起源とするがんは、１０％未満の５年生存率を有する。しかしながら、肝臓がんが早期かつその最も処置可能なステージの間に検出された場合、生存率はほぼ４０％まで増加する。Ｅｌ－Ｓｅｒａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０１１；４（１）：５－１０。早期ステージの肝臓がんを有する患者は、ほとんどまたは全く症状を有しないことがある。血清学的方法、超音波、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、および血管造影などの現行の検出方法は、低い感度および操作者によるエラーの可能性に起因して信頼できないものである可能性がある。コストのかかる画像化技法は、より小さい早期ステージの腫瘍の検出のためには正確性がより低い場合がある。Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１１；９（２）：１６１－１６７；Ｂｒｕｉｘ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１１；５３（３）：１０２０－１０２２。良性腫瘍を悪性腫瘍から区別するための最も信頼できる方法であると依然として考えられている肝臓生検は、侵襲性であり手術を必要とする。Ｌｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００１；１２２（７）：２０９２－２０９３。特に、肝硬変、ウイルス感染症、および肝臓の炎症性障害に罹患した者のための、肝臓がんを診断および処置する新たな方法に対する継続的な必要性が存在する。
本発明の態様は、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的に結合し、かつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない、単離された抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体、またはその抗原結合断片であって、（ａ）（ｉ）配列番号：１５～１８のアミノ酸配列のいずれかの中にて２つもしくはより少ない置換を有するＣＤＲＨ１配列；および／または（ｉｉ）配列番号：１９～２２のアミノ酸配列のいずれかの中に２つもしくはより少ない置換を有するＣＤＲＨ２配列；および／または（ｉｉｉ）配列番号：２３～２６のアミノ酸配列のいずれかの中に２つもしくはより少ない置換を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメイン；ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号：２７～３０のアミノ酸配列のいずれかの中に２つもしくはより少ない置換を有するＣＤＲＬ１配列；および／または（ｉｉ）配列番号：３１～３４のアミノ酸配列のいずれかの中に２つもしくはより少ない置換を有するＣＤＲＬ２配列；および／または（ｉｉｉ）配列番号：３５～３８のアミノ酸配列のいずれかの中に２つもしくはより少ない置換を有するＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、抗体または抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列はフレームワーク配列内に存在する。一部の実施形態では、フレームワーク配列の少なくとも一部分はヒトコンセンサスフレームワーク配列を含む。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、（ａ）配列番号：１５～１８からなる群から選択されるＣＤＲＨ１配列；および／または（ｂ）配列番号：１９～２２からなる群から選択されるＣＤＲＨ２配列；および／または（ｃ）配列番号：２３～２６からなる群から選択されるＣＤＲＨ３配列；および／または（ｄ）配列番号：２７～３０からなる群から選択されるＣＤＲＬ１配列；および／または（ｅ）配列番号：３１～３４からなる群から選択されるＣＤＲＬ２配列；および／または（ｆ）配列番号：３５～３８からなる群から選択されるＣＤＲＬ３配列を含む。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、（ａ）配列番号：１５～１８からなる群から選択されるＣＤＲＨ１配列；（ｂ）配列番号：１９～２２からなる群から選択されるＣＤＲＨ２配列；（ｃ）配列番号：２３～２６からなる群から選択されるＣＤＲＨ３配列；（ｄ）配列番号：２７～３０からなる群から選択されるＣＤＲＬ１配列；（ｅ）配列番号：３１～３４からなる群から選択されるＣＤＲＬ２配列；および（ｆ）配列番号：３５～３８からなる群から選択されるＣＤＲＬ３配列を含む。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、（ａ）配列番号：１５のＣＤＲＨ１配列、配列番号：１９のＣＤＲＨ２配列、配列番号：２３のＣＤＲＨ３配列、配列番号：２７のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３１のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３５のＣＤＲＬ３配列；または（ｂ）配列番号：１６のＣＤＲＨ１配列、配列番号：２０のＣＤＲＨ２配列、配列番号：２４のＣＤＲＨ３配列、配列番号：２８のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３２のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３６のＣＤＲＬ３配列；または（ｃ）配列番号：１７のＣＤＲＨ１配列、配列番号：２１のＣＤＲＨ２配列、配列番号：２５のＣＤＲＨ３配列、配列番号：２９のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３３のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３７のＣＤＲＬ３配列；または（ｄ）配列番号：１８のＣＤＲＨ１配列、配列番号：２２のＣＤＲＨ２配列、配列番号：２６のＣＤＲＨ３配列、配列番号：３０のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３４のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３８のＣＤＲＬ３配列を含む。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号：７～１０の配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域および／または配列番号：１１～１４の配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号：７～１０からなる群から選択される重鎖可変領域配列および／または配列番号：１１～１４からなる群から選択される軽鎖可変領域配列を含む。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、（ａ）配列番号：７の重鎖可変領域配列および配列番号：１１の軽鎖可変領域配列；または（ｂ）配列番号：８の重鎖可変領域配列および配列番号：１２の軽鎖可変領域配列；または（ｃ）配列番号：９の重鎖可変領域配列および配列番号：１３の軽鎖可変領域配列；または（ｄ）配列番号：１０の重鎖可変領域配列および配列番号：１４の軽鎖可変領域配列を含む。
本発明の態様は、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的に結合し、かつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない、単離された抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体であって、（ａ）ヒトＶＨフレームワーク中にＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域であって、ＣＤＲＨ配列が、配列番号：１５～２６からなる群から選択されるＣＤＲ配列中の２つまたはより少ない置換を有する配列である、重鎖可変領域；ならびに（ｂ）ヒトＶＬフレームワーク中にＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域であって、ＣＤＲＬ配列が、配列番号：２７～３８からなる群から選択されるＣＤＲ配列中の２つまたはより少ない置換を有する配列である、軽鎖可変領域を含む、抗体を含む。
一部の実施形態では、抗体は、（ａ）ヒトＶＨフレームワーク中にＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域であって、ＣＤＲＨ配列が配列番号：１５～２６からなる群から選択される、重鎖可変領域；ならびに（ｂ）ヒトＶＬフレームワーク中にＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域であって、ＣＤＲＬ配列が配列番号：２７～３８からなる群から選択される、軽鎖可変領域を含む。
本発明の態様は、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的に結合し、かつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない、単離された抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体であって、（ａ）ヒトＶＨフレームワーク中に、配列番号：１５のＣＤＲＨ１配列、配列番号：１９のＣＤＲＨ２配列、および配列番号：２３のＣＤＲＨ３配列、ならびにヒトＶＬフレームワーク中に、配列番号：２７のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３１のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３５のＣＤＲＬ３配列；または（ｂ）ヒトＶＨフレームワーク中に、配列番号：１６のＣＤＲＨ１配列、配列番号：２０のＣＤＲＨ２配列、および配列番号：２４のＣＤＲＨ３配列、ならびにヒトＶＬフレームワーク中に、配列番号：２８のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３２のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３６のＣＤＲＬ３配列；または（ｃ）ヒトＶＨフレームワーク中に、配列番号：１７のＣＤＲＨ１配列、配列番号：２１のＣＤＲＨ２配列、および配列番号：２５のＣＤＲＨ３配列、ならびにヒトＶＬフレームワーク中に、配列番号：２９のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３３のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３７のＣＤＲＬ３配列；または（ｄ）ヒトＶＨフレームワーク中に、配列番号：１８のＣＤＲＨ１配列、配列番号：２２のＣＤＲＨ２配列、および配列番号：２６のＣＤＲＨ３配列、ならびにヒトＶＬフレームワーク中に、配列番号：３０のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３４のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３８のＣＤＲＬ３配列を含む、抗体を含む。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は多重特異的である。一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は二重特異的である。一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片はエフェクター細胞に対して結合親和性を有する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片はＴ細胞抗原に対して結合親和性を有する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片はＣＤ３に対して結合親和性を有する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片はモノクローナルである。一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片はＣＡＲ－Ｔフォーマットである。
本発明の態様は、本明細書に記載されるような抗体または抗原結合断片を含む医薬組成物を含む。
本発明の態様は、ＡＳ－ＳＰＩＫの発現により特徴付けられる障害の処置方法であって、前記障害を有する対象に本明細書に記載されるような抗体もしくは抗原結合断片、または本明細書に記載されるような医薬組成物を投与することを含む、方法を含む。
本発明の態様は、ＡＳ－ＳＰＩＫの発現により特徴付けられる障害の処置用の医薬の調製における、本明細書に記載されるような抗体または抗原結合断片の使用を含む。
本発明の態様は、ＡＳ－ＳＰＩＫの発現により特徴付けられる障害の処置において使用するための、本明細書に記載されるような抗体または抗原結合断片を含む。
一部の実施形態では、障害は肝臓障害である。一部の実施形態では、肝臓障害は肝細胞がんである。一部の実施形態では、肝臓障害は肝内胆管がんである。一部の実施形態では、肝臓障害はウイルス感染症である。一部の実施形態では、肝臓障害は炎症性肝臓障害である。一部の実施形態では、炎症性肝臓障害は肝臓の硬変である。
本発明の態様は、本明細書に記載されるような抗体または抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明の態様は、本明細書に記載されるようなポリヌクレオチドを含むベクターを含む。本発明の態様は、本明細書に記載されるようなベクターを含む宿主細胞を含む。
本発明の態様は、本明細書に記載されるような抗体または抗原結合断片を産生する方法であって、抗体または抗原結合断片の発現を許容する条件下で宿主細胞を生育すること、および細胞から抗体または抗原結合断片を単離することを含む、方法を含む。
本発明の態様は、対象がＡＳ－ＳＰＩＫの発現により特徴付けられる障害を有する、またはその障害を発生するリスクがあるかどうかを決定する診断方法であって、（ａ）対象からの生物学的試験試料を本明細書に記載されるようなＡＳ－ＳＰＩＫ抗体または抗原結合断片と接触させてＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体を生成すること；（ｂ）生物学的試験試料中のＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の濃度を検出すること；および（ｃ）ＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の濃度を参照値と比較して、対象が障害を有するまたはその障害を発生するリスクがあるかどうかを決定することを含む、方法を含む。
本発明の態様は、対象がＡＳ－ＳＰＩＫの発現により特徴付けられる障害を有するまたはその障害を発生するリスクがあるかどうかを決定する診断方法であって、（ａ）対象からの生物学的試験試料をＳＰＩＫに特異的に結合する第１の抗体または抗原結合断片と接触させてＳＰＩＫ－抗体複合体を形成すること；（ｂ）ＳＰＩＫ－抗体複合体を本明細書に記載されるようなＡＳ－ＳＰＩＫ抗体または抗原結合断片と接触させてＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体を生成すること；（ｃ）生物学的試験試料中のＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の濃度を検出すること；および（ｄ）ＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の濃度を参照値と比較して、対象が障害を有するまたはその障害を発生するリスクがあるかどうかを決定することを含む、方法を含む。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、検出可能な標識を含む。
一部の実施形態では、障害は肝臓障害である。一部の実施形態では、肝臓障害は、肝細胞がん、肝内胆管がん、肝臓のウイルス感染症、肝臓の炎症性障害、および肝臓の硬変からなる群から選択される。
本発明の態様は、本明細書に記載されるような抗体または抗原結合断片を含むキットを含む。一部の実施形態では、キットは、ＳＰＩＫに特異的に結合する抗体または抗原結合断片をさらに含む。
ＮＳ－ＳＰＩＫおよびＡＳ－ＳＰＩＫのサイズを示すＳＤＳ ＰＡＧＥである。 ＡＳ－ＳＰＩＫのエドマンＮ末端解析の結果を描写する。図２は、配列番号：３９を開示する。 ＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＳ－ＳＰＩＫの構造を比較するダイアグラムである。図３は、出現順に、配列番号：２および４をそれぞれ開示する。 ＮＳ－ＳＰＩＫにおけるモノクローナル抗体ＩＭ－ＢＡ１の結合部位の位置を描写するダイアグラムである。図４は、配列番号：４を開示する。 ＩＭ－ＢＡ１の結合活性を解析する実験の結果を描写するグラフである。 ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合する抗体を生成するための免疫化のために使用した組換えタンパク質の配列である。「共通の領域」は、ＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＳ－ＳＰＩＫの両方において見出されるアミノ酸を示す。図６は、配列番号：６を開示する。 ＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＳ－ＳＰＩＫへの様々なモノクローナル抗体の相対的な結合活性を示すＥＬＩＳＡの結果を示す。 ＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＳ－ＳＰＩＫの両方に結合する対照抗体であるＭＡ８６と比較したＡＳ－ＳＰＩＫへのモノクローナル抗体ＩＭ－ＣＡ２２の結合特異性を示すイムノブロットである。 モノクローナル抗体ＩＭ－ＣＡ２２およびＡＳ－ＳＰＩＫからなる複合体の形成を解析する免疫沈殿実験の結果を示す。 ＡＳ－ＳＰＩＫ複合体を検出するために使用したＥＬＩＳＡの結果を描写するグラフである。 ＡＳ－ＳＰＩＫ複合体形成の定量的解析の結果を描写するグラフである。 ＩＭ－ＣＡ２２モノクローナル抗体を使用するＡＳ－ＳＰＩＫイムノアッセイの感度の解析の結果を描写するグラフである。 ＳＰＩＫ活性に対する抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体の効果を解析する実験の結果を描写するグラフである。 肝細胞がん（ＨＣＣ）患者からの血清中のＡＳ－ＳＰＩＫレベルの解析の結果を描写するグラフである。 ＨＣＣ患者におけるＬＣ－ＳＰＩＫのＲＯＣ解析の結果を描写するグラフである。 早期ステージＨＣＣ患者からの血清中のＡＳ－ＳＰＩＫレベルの解析の結果を描写するグラフである。 図１７（表１）は、モノクローナル抗体の配列相同性とＡＳ－ＳＰＩＫに結合する能力との関係性を示す。 図１８（表２）は、ＡＳ－ＳＰＩＫ血清レベルとＩＣＣの存在との関係性を示す。 ４つの抗体（ＣＡ１８、ＣＡ２２、ＣＡ４６およびＣＢ７７）のＣＤＲ（ＶＬおよびＶＨ）のアライメントを提供する。本明細書において提供されるような抗体は、ＩＭ－ＣＡ１８、およびＩＭ－ＣＡ２２などの文字「ＩＭ」を含む長い名称により呼ばれることがあり、またはＣＡ１８もしくはＣＡ２２などのように「ＩＭ」を取り去った略記形態で称されることがある。相同性パーセンテージは、抗体ＣＡ２２に対する比較として提供される。図１７における表１もまた、相同性パーセントの情報を提供する。抗体ＢＡ１、Ｓ１４および抗ビタミンＤ受容体抗体（抗ＶＤ受容体抗体）のＶＨおよびＶＬ領域のＣＤＲ配列もまた提供される。図１９は、出現順に、配列番号：１６、１５、１７－１８、４０－４２、２０、１９、２１、４３－４６、２４、２３、２５－２６、４７－４９、２８、２７、２９－３０、５０－５２、３２、３１、３３－３４、５３－５４、３６、３５、３７－３８および５５－５７をそれぞれ開示する。 本発明の４つの抗体（ＣＡ１８、ＣＡ２２、ＣＡ４６およびＣＢ７７）のＶＨ領域のアライメントを提供する。相同性パーセンテージは、抗体ＣＡ２２に対する比較として提供される。図１７における表１もまた、相同性パーセントの情報を提供する。ＣＤＲに下線を引いている。第１の領域はＣＤＲ１であり、第２の領域はＣＤＲ２であり、第３の領域はＣＤＲ３である。図２０は、出現順に、配列番号：８、７、９および１０をそれぞれ開示する。 ４つの抗体（ＣＡ１８、ＣＡ２２、ＣＡ４６およびＣＢ７７）のＶＨ領域のアライメントを提供する。抗体ＢＡ１、Ｓ１４および抗ＶＤ受容体抗体のＶＨ領域の配列もまた提供される。ＣＤＲに下線を引いている。第１の領域はＣＤＲ１であり、第２の領域はＣＤＲ２であり、第３の領域はＣＤＲ３である。図２１は、出現順に、配列番号：８、７、９－１０および５８－６０をそれぞれ開示する。 ４つの抗体（ＣＡ１８、ＣＡ２２、ＣＡ４６およびＣＢ７７）のＶＬ領域のアライメントを提供する。相同性パーセンテージは、抗体ＣＡ２２に対する比較として提供される。図１６における表１もまた、相同性パーセントの情報を提供する。ＣＤＲに下線を引いている。第１の領域はＣＤＲ１であり、第２の領域はＣＤＲ２であり、第３の領域はＣＤＲ３である。図２２は、出現順に、配列番号：１２、１１および１３－１４をそれぞれ開示する。 ４つの抗体（ＣＡ１８、ＣＡ２２、ＣＡ４６およびＣＢ７７）のＶＬ領域のアライメントを提供する。抗体ＢＡ１、Ｓ１４および抗ＶＤ受容体抗体のＶＬ領域の配列もまた提供される。ＣＤＲに下線を引いている。第１の領域はＣＤＲ１であり、第２の領域はＣＤＲ２であり、第３の領域はＣＤＲ３である。図２３は、出現順に、配列番号：１２、１１、１３－１４および６１－６３をそれぞれ開示する。 本発明の実施形態による様々なポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列を図示する表である。 同上。 同上。
本発明の実施は、他に指し示さない限り、当業者の技術的範囲内である、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技法を用いる。そのような技法は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７および定期的な改訂）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１９９４）；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．，１９８８）；“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）；Ｈａｒｌｏｗ，Ｌａｎｅ ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ．Ｉ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８）；ならびにＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；（１９８８）などの文献内に充分に説明されている。
値の範囲が提供される場合、文脈が明確に他に規定しない限り、下限の単位の１０分の１までのその範囲の上限と下限との間の各介在する値およびその記載される範囲中の任意の他の記載されるまたは介在する値が本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立して、記載される範囲における任意の特に除外される限度を受けて、これもまた本発明に包含されるより小さい範囲に含められてもよい。記載される範囲が限度の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限度のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。
他に指し示さない限り、本明細書における抗体残基は、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムにしたがってナンバリングされる（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。
以下の記載において、本発明のより徹底的な理解を提供するために多数の特定の詳細が示される。しかしながら、本発明はこれらの特定の詳細の１つまたは複数を有しないで実施されてもよいことは当業者に明らかである。他の事例では、周知の特徴および当業者に周知の手順は、本発明が曖昧になるのを回避するために記載されない。
特許出願および刊行物を含む、本開示を通じて参照される全ての参考文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
定義
本明細書を解釈する目的のために、以下の定義が適用され、適切な場合、単数形において使用される用語はまた複数を含むことになる、逆もまた然りである。示される任意の定義が、参照により本明細書に組み込まれるいずれかの文献と矛盾する場合、以下に示す定義が優先される。
「エピトープ」は、単一の抗体分子が結合する抗原分子の表面上の部位である。一般に、抗原はいくつかのまたは多くの異なるエピトープを有し、多くの異なる抗体と反応する。該用語は、リニアエピトープおよびコンホメーショナルエピトープを特に含む。該用語は、抗体に特異的に結合する能力を有する任意の分子決定因子を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定因子は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的に活性の表面グループ分けを含み、ある特定の実施形態では、特定の三次元構造的特徴、および／または特定の電荷的特徴を有してもよい。エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。「結合領域」は、結合分子が結合する結合標的上の領域である。
「エピトープマッピング」は、標的抗原上の、抗体の結合部位、またはエピトープを特定するプロセスである。抗体エピトープはリニアエピトープまたはコンホメーショナルエピトープであってもよい。リニアエピトープは、タンパク質中のアミノ酸の連続的な配列により形成される。コンホメーショナルエピトープは、タンパク質配列中で不連続であるがその三次元構造へのタンパク質のフォールディングにより一緒になるアミノ酸から形成される。
「エピトープビニング」は、本明細書において定義される場合、抗体を認識するエピトープに基づいてグループ分けするプロセスである。より特異的には、エピトープビニングは、そのエピトープ認識特性に基づいて抗体をクラスター化し、かつ独特の結合特異性を有する抗体を特定するコンピュータによるプロセスと組み合わせて、異なる抗体のエピトープ認識特性を識別するための方法およびシステムを含む。
２つの抗体が同一のまたは立体的に重なり合うエピトープを認識する場合に、抗体は参照抗体と「本質的に同じエピトープ」を結合する。２つのエピトープが同一のまたは立体的に重なり合うエピトープに結合するかどうかを決定するための最も広く使用されている迅速な方法は競合アッセイであり、これは、標識された抗原または標識された抗体のいずれかを使用して、任意の数の異なるフォーマットで構成することができる。通常、抗原は９６ウェルプレート上に固定化され、標識された抗体の結合を遮断する非標識抗体の能力が放射性または酵素標識を使用して測定される。
アミノ酸残基／位置の「改変」は、本明細書において使用される場合、出発アミノ酸配列と比較した一次アミノ酸配列の変化であって、該変化が前記アミノ酸残基／位置に関与する配列変化の結果としてもたらされるものを指す。例えば、典型的な改変としては、別のアミノ酸による（または前記位置における）残基の置換（例えば、保存的または非保存的置換）、前記残基／位置に隣接する１つまたは複数の（一般的に５つまたは３つより少ない）アミノ酸の挿入、および前記残基／位置の欠失が挙げられる。「アミノ酸置換」またはその変形は、異なるアミノ酸残基による予め決定された（出発）アミノ酸配列中の既存のアミノ酸残基の置換を指す。一般に、かつ好ましくは、改変は、出発（または「野生型」）アミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してバリアントポリペプチドの少なくとも１つの物理的または生化学的活性における変化を結果としてもたらす。例えば、抗体の場合、変化する物理的または生化学的活性は、標的分子に対する結合親和性、結合能力および／または結合効果とすることができる。
「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）、一本鎖分子だけでなく、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）も含む。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書において「抗体」と交換可能に使用される。基本的な４鎖抗体単位は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロ４量体糖タンパク質である。他に記載されない限り、「抗体」という用語は、本明細書において最も広い意味において使用され、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体ならびにその断片、好ましくは抗原結合断片を含む、抗体の全てのアイソタイプ、サブクラスおよび形態を特異的に含む。
他に記載されない限り、「抗体」という用語は、天然に存在する変異体を含む、天然のヒトおよび非ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ）、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＭ抗体を特異的に含む。
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在する場合がある天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を標的とする。さらに、異なる決定因子（エピトープ）を標的とする異なる抗体を典型的には含む従来（ポリクローナル）の抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定因子を標的とする。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質な集団から得られるという抗体の特徴を指し示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解されるべきではない。例えば、本発明にしたがって使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製されてもよく、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照のこと）により作製されてもよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７において記載されている技法を使用してファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
本明細書におけるモノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖の部分が特定の種に由来する抗体中の対応する配列と同一または相同的であり、一方で鎖の残余が別の種に由来する抗体中の対応する配列と同一または相同的である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）だけでなく、所望の生物学的活性を呈する限り、そのような抗体の断片も特異的に含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５）。
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有する抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長動物などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基により置換されている。一部の事例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基もまた、対応する非ヒト残基により置換されている。さらには、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体性能をさらに精密化するために為される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、かつＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部分を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６を参照のこと。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、いかなる保存的置換も配列同一の部分とは考えずに、配列のアライメントおよび必要な場合にはギャップの導入により最大の配列同一性パーセントを達成した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のアライメントは、当該技術分野の技術的範囲内である様々な方法を使用して達成することができ、該方法は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピューターソフトウェアを使用する。当業者は、比較されている配列の全長にわたり最大のアライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントするための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。
本明細書において使用される場合、「配列相同性パーセント」という用語は、任意の所与のクエリ配列と対象配列との間の相同性の程度を指す。例えば、天然に存在するＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドをクエリ配列とすることができ、かつＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドの断片を対象配列とすることができる。同様に、ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドの断片をクエリ配列とすることができ、かつその生物学的に活性なバリアントを対象配列とすることができる。
本明細書における「単離された」抗体は、特定され、かつ組換え宿主細胞中のその天然の環境の成分から分離および／または回収された抗体である。その天然の環境の夾雑物成分は、抗体の診断または治療的使用に干渉することになる材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質だけでなく、産生の望ましくない副産物も含む場合がある。好ましい実施形態では、本明細書における単離された抗体は、（１）ＳＤＳ－ＰＡＧＥもしくはＳＥＣ－ＨＰＬＣ法によって決定されるとき、９５重量％より高く、もしくは９８重量％より高く、もしくは９９重量％より高くまで、（２）アミノ酸シークエンサーの使用によりＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために充分な程度まで、または（３）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色剤を使用する還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによる均質状態まで、精製される。通常、単離された抗体は少なくとも１つの精製ステップにより調製される。
ＩｇＧの場合、４鎖単位は一般的に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は１つの共有結合性ジスルフィド結合によりＨ鎖に連結されており、一方で２つのＨ鎖はＨ鎖アイソタイプに依存して１つまたは複数のジスルフィド結合により互いに連結されている。各ＨおよびＬ鎖はまた、定期的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖はＮ末端において、可変ドメイン（ＶＨ）ならびにそれに続いてα鎖およびγ鎖のそれぞれについて３つの定常ドメイン（ＣＨ）、μおよびεアイソタイプについて４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖はＮ末端において、可変ドメイン（ＶＬ）ならびにそれに続いてその他の末端において定常ドメインを有する。ＶＬはＶＨとアライメントされ、ＣＬは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とアライメントされる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメインの間の境界を形成すると考えられる。ＶＨおよびＶＬのペア形成は、一緒になって単一の抗原結合部位を形成する。
「ポリペプチド」という用語は最も広い意味において本明細書において使用され、ペプチド配列を含む。「ペプチド」という用語は、一般的にペプチド結合により共有結合的に連結した約６０個まで、好ましくは約３０個までのアミノ酸を含有するアミノ酸の直鎖状分子鎖を記載する。
「特異的結合」または「特異的に結合する」または「特異的である」という用語は、標的抗原、例えば、特定のポリペプチド、ペプチド、または他の標的（例えば、糖タンパク質標的）上のエピトープへの抗体の結合を指し、非特異的相互作用とは測定できる程度に異なる結合を意味する（例えば、非特異的相互作用はウシ血清アルブミンまたはカゼインに結合してもよい）。特異的結合を、例えば、対照分子への結合と比較して標的分子への抗体の結合を決定することにより、測定することができる。例えば、特異的結合は、標的と類似の対照分子、例えば、過剰な非標識化標的との競合により決定することができる。この場合、特異的結合は、プローブへの標識化標的の結合が過剰な非標識化標的により競合的に阻害される場合に指し示される。本明細書において使用されるような特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープへの「特異的結合」またはそれに「特異的に結合する」またはそれが「特異的である」という用語は、例えば、分子が標的に対して少なくとも約２００ｎＭ、代替的に少なくとも約１５０ｎＭ、代替的に少なくとも約１００ｎＭ、代替的に少なくとも約６０ｎＭ、代替的に少なくとも約５０ｎＭ、代替的に少なくとも約４０ｎＭ、代替的に少なくとも約３０ｎＭ、代替的に少なくとも約２０ｎＭ、代替的に少なくとも約１０ｎＭ、代替的に少なくとも約８ｎＭ、代替的に少なくとも約６ｎＭ、代替的に少なくとも約４ｎＭ、代替的に少なくとも約２ｎＭ、代替的に少なくとも約１ｎＭ、またはより大きいＫｄを有することにより呈することができる。ある特定の事例では、「特異的結合」という用語は、分子が、任意の他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する場合の結合を指す。
「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の総計の強度を指す。他に指し示さない限り、本明細書において使用される場合、「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば、抗体および抗原）間の１：１の相互作用を反映した固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。例えば、Ｋｄは、約２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、またはより強いものとすることができる。親和性は、本明細書に記載の方法を含む、当該技術分野において公知の一般的な方法により測定することができる。低親和性抗体は、一般的に抗原に緩徐に結合して容易に解離する傾向がある一方、高親和性抗体は、一般的に抗原に迅速に結合してより長く結合したままとなる傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当該技術分野において公知である。
本明細書において使用される場合、「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、例えば、約１０応答単位（ＲＵ）での固定化抗原ＣＭ５チップと共に２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用して、例えば表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、抗体および標的ペアのために適切な技法により測定される解離定数を指す。
本明細書において使用される「価」（ｖａｌｅｎｔ）という用語は、抗体中の指定された数の結合部位の存在を表す。そのため、「二価」という用語は２つの結合部位の存在を表す。
「ポリエピトープ特異性」は、同じまたは異なる標的上の２つまたはより多くの異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。「単一特異的」は１つのエピトープのみに結合する能力を指す。一部の実施形態では、抗体は、少なくとも１０－７Ｍ、または１０－８Ｍまたはより良好な親和性で各エピトープに結合する。
「標的」または「結合標的」という用語は最も広い意味において使用され、天然に存在する場合の生物学的機能を有するまたは有しないポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、細胞、および他の分子を特異的に含むがそれに限定されない。
「抗原」という用語は、抗体に結合することまたは細胞性免疫応答をトリガすることができる実体またはその断片を指す。免疫原は、生物、特に動物、より特異的にはヒトを含む哺乳動物において免疫応答を誘発することができる抗原を指す。抗原という用語は、上記に定義されるような抗原決定基またはエピトープとして公知の領域を含む。
本明細書において使用される場合、「免疫原性」という用語は、抗体の産生を誘発し、かつ／またはＴ細胞および／もしくは免疫原の抗原を標的とする他の反応性免疫細胞を活性化させる物質を指す。
本発明の抗体の「抗原結合部位」または「抗原結合領域」は、典型的には、異なる程度において抗原に対する結合部位の親和性に寄与する６つの超可変領域（ＨＶＲ）を含有する。「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語と本明細書において交換可能に使用される。３つの重鎖可変ドメインＨＶＲ（ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２およびＨＶＲ－Ｈ３）ならびに３つの軽鎖可変ドメインＨＶＲ（ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２およびＨＶＲ－Ｌ３）がある。ＨＶＲおよびフレームワーク領域（ＦＲ）の広がりは、それらの領域が抗体／抗原複合体からの配列および／または構造情報の間の可変性にしたがって定義されているアミノ酸配列のコンパイルされたデータベースとの比較により決定される。より少ないＨＶＲを含む機能的な抗原結合部位もまた本発明の範囲内に含まれる（すなわち、結合特異性が３つ、４つまたは５つのＨＶＲにより決定される場合）。６つのＨＶＲの完全なセットに満たないものでも、一部の結合標的への結合のために充分なことがある。したがって、一部の事例では、ＶＨまたはＶＬドメインのＨＶＲは単独で充分である。さらには、ある特定の抗体は、抗原に対して非ＨＶＲ関連の結合部位を有する場合がある。そのような結合部位は本発明の定義内に特異的に含まれる。
本明細書において使用される「宿主細胞」という用語は、本発明にしたがって抗体を生成するために操作することができる任意の種類の細胞系を表す。一実施形態では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が宿主細胞として使用される。
本明細書において使用される場合、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という表現は交換可能に使用され、全てのそのような記載は子孫を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、初代対象細胞および移入の回数によらずにそれに由来する培養物を含む。意図的なまたは意図しない突然変異に起因して、全ての子孫はＤＮＡ内容が精密に同一でなくてもよいこともまた理解される。元々の形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する多様体子孫が含まれる。
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係性に置かれている場合に「作動可能に連結されている」。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合にポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており、プロモーターもしくはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合にコーディング配列に作動可能に連結されており、またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合にコーディング配列に作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結されている」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合、連続しかつリーディングフレームになっていることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、簡便な制限部位におけるライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の実施にしたがって使用される。
「抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体」、「ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体」、または「ＡＳ－ＳＰＩＫに結合する抗体」という用語は全て、ＡＳ－ＳＰＩＫの標的化において診断剤および／または治療剤として有用であるような充分な親和性でＡＳ－ＳＰＩＫに結合できる抗体を指す。
一実施形態では、「ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体」は、（ｉ）配列番号：７～１０のいずれか１つにおいて提供されるような重鎖可変ドメイン配列、および／もしくは配列番号：１１～１４のいずれか１つにおいて提供されるような軽鎖可変ドメイン配列を含む；または（ｉｉ）配列番号：１５～３８において提供されるＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つを含む、抗ＡＳ－ＳＰＩＫモノクローナル抗体を特異的に指すために本明細書において使用される。
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定のセグメントの配列が抗体間で大規模に異なるという事実を指す。「可変」または「Ｖ」ドメインは、抗原結合を媒介し、かつその特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸スパンにわたり均等に分布しているわけではない。その代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９～１２アミノ酸の長さの「超可変領域」と呼ばれる極度に可変性のより短い領域により分離された１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチからなる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ４つのＦＲを含み、これは概ねβ－シート配置をとり、３つの超可変領域により接続され、３つの超可変領域は、β－シート構造を接続し、一部の場合にはその部分を形成するループを形成する。各鎖中の超可変領域は、ＦＲにより近接されて一緒に、かつ他の鎖からの超可変領域と共に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照のこと）。
「インタクト」な抗体は、抗原結合部位だけでなく、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および特定の抗体クラスの少なくとも重鎖定常ドメインも含む抗体である。例えば、インタクトなＩｇＧ抗体は、抗原結合部位、軽鎖定常ドメインＣＬ、ならびに少なくとも重鎖定常ドメインＣＨ１（Ｃγ１）、ＣＨ２（Ｃγ２）およびＣＨ３（Ｃγ３）を含む。インタクトなＩｇＭ抗体は、抗原結合部位、軽鎖定常ドメインＣＬ、ならびに少なくとも重鎖定常ドメインＣＭ１（Ｃμ１）、ＣＭ２（Ｃμ２）、ＣＭ３（Ｃμ３）およびＣＭ４（Ｃμ４）を含む。インタクトなＩｇＡ抗体は、抗原結合部位、軽鎖定常ドメインＣＬ、ならびに少なくとも重鎖定常ドメインＣＡ１（Ｃα１）、ＣＡ２（Ｃα２）およびＣＡ３（Ｃα３）を含む。インタクトなＩｇＤ抗体は、抗原結合部位、軽鎖定常ドメインＣＬ、ならびに少なくとも重鎖定常ドメインＣＤ１（Ｃδ１）、ＣＤ２（Ｃδ２）およびＣＤ３（Ｃδ３）を含む。インタクトなＩｇＥ抗体は、抗原結合部位、軽鎖定常ドメインＣＬ、ならびに少なくとも重鎖定常ドメインＣＥ１（Ｃε１）、ＣＥ２（Ｃε２）、ＣＥ３（Ｃε３）およびＣＥ４（Ｃε４）を含む。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントとすることができる。好ましくは、インタクトな抗体は１つまたは複数のエフェクター機能を有する。
「抗体断片」または抗体の「抗原結合断片」は、インタクトな抗体の部分、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号明細書、実施例２；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５）を参照のこと）；単鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。一実施形態では、抗体断片は、インタクトな抗体の抗原結合部位を含み、したがって抗原に結合する能力を保持する。当業者は、抗体断片は、抗体の少なくとも抗原結合部分をその軽鎖および重鎖の残余から分離して抗原結合断片を作製することにより、任意のインタクトな抗体から、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体から生成することができることを理解するであろう。ある特定の実施形態では、抗体断片は、抗体の抗原結合領域だけでなく、抗体の軽鎖および／または重鎖の１つまたは複数の追加のドメインも含むことができる。例えば、一部の実施形態では、抗体断片は、ＶＨおよびＶＬドメインを含む抗原結合領域、軽鎖定常ドメインＣＬ、ならびに１つまたは複数の重鎖定常ドメイン、例えば、ＣＨ１（Ｃγ１）ドメイン、ＣＭ１（Ｃμ１）ドメイン、ＣＡ１（Ｃα１）ドメイン、ＣＤ１（Ｃδ１）ドメイン、またはＣＥ１（Ｃε１）ドメインを含むことができる。
ＩｇＧ抗体断片の場合、パパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、および容易に結晶化する能力を反映した呼称の残余の「Ｆｃ」断片を生じさせる。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）、および１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と共にＬ鎖全体からなる。各Ｆａｂ断片は抗原結合に関して一価であり、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。ＩｇＧ抗体のペプシン処理は単一の大きいＦ（ａｂ’）２断片をもたらし、これは概ね、二価抗原結合活性を有する２つのジスルフィド連結Ｆａｂ断片に対応し、依然として抗原を架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における追加の数個の残基を有することによりＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書における呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元々、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片のペアとして産生された。抗体断片の他の化学的なカップリングもまた公知である。
ＩｇＧ抗体のＦｃ断片は、ジスルフィドにより一緒に保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域中の配列により決定され、該領域はまた、ある特定の種類の細胞上に見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）により認識される部分である。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小の抗体断片である。この断片は、緊密な非共有結合性の会合をした１つの重鎖および１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１つの重鎖および１つの軽鎖可変領域ドメインは、軽鎖および重鎖が２鎖Ｆｖ種におけるものと類似の「二量体」構造において会合できるように柔軟なペプチドリンカーにより共有結合的に連結することができる。これらの２つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与して抗原結合特異性を抗体に付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖およびＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が出る。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体より低い親和性であるが、抗原を認識してそれに結合する能力を有する。
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略記される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖となるように接続されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能とする。ｓＦｖのレビューについては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ １９９５（下記）を参照のこと。
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、所望の結合特異性（例えば、モノクローナル抗体または他のリガンドの抗原結合領域）を膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメインにグラフトする、操作された受容体を指すために最も広い意味において本明細書において使用される。典型的には、受容体は、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞にグラフトしてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作製するために使用される（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，２０１６；１０８（７）：ｄｊｖ４３９；およびＪａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１６；１３：３７０－３８３）。
本明細書において使用される場合、「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認知および活性化相ではなく、免疫応答のエフェクター相に関与する免疫細胞を指す。一部のエフェクター細胞は、特定のＦｃ受容体を発現し、特定の免疫機能を実行する。一部の実施形態では、ナチュラルキラー細胞などのエフェクター細胞は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導する能力を有する。例えば、ＦｃＲを発現する単球およびマクロファージは、標的細胞の特異的殺傷および免疫系の他の成分への抗原の提示、または抗原を提示する細胞への結合に関与する。一部の実施形態では、エフェクター細胞は、標的抗原または標的細胞を貪食してもよい。
「ヒトエフェクター細胞」は、Ｔ細胞受容体またはＦｃＲなどの受容体を発現し、かつエフェクター機能を行う白血球である。好ましくは、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、かつＡＤＣＣエフェクター機能を行う。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が挙げられ、ＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その天然の供給源から、例えば、本明細書に記載されるような血液またはＰＢＭＣから単離されてもよい。
「免疫細胞」という用語は、最も広い意味において本明細書において使用され、骨髄またはリンパ起源の細胞、例えば、リンパ球（例えば、Ｂ細胞および細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好酸球、多形核細胞、例えば、好中球、顆粒球、肥満細胞、および好塩基球が挙げられるがそれに限定されない。
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列バリアントＦｃ領域）に帰せられる生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方調節などが挙げられる。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上の結合した抗体を認識しかつその後に標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性の反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）の第４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号明細書または同第５，８２１，３３７号明細書において記載されるものなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイが行われてもよい。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的に、または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２－６５６（１９９８）において開示されるものなどの動物モデルにおいて、評価されてもよい。
「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を指す。補体活性化経路は、コグネイト抗原と複合体化した分子（例えば、抗体）への補体システム（Ｃ１ｑ）の第１の成分の結合により開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）において記載されるようなＣＤＣアッセイが行われてもよい。
「遮断」抗体または「アンタゴニスト」（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）もしくは「アンタゴニスト」（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ）抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減する抗体である。好ましい遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する能力を有する。
目的の抗原、例えば、ＡＳ－ＳＰＩＫまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドに「結合する」抗体は、抗原を発現する細胞または組織の標的化において治療剤として有用であるような充分な親和性で抗原に結合し、かつ他のタンパク質と顕著に交差反応しない抗体である。標的分子への抗体の結合に関して、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープへの「特異的結合」またはそれに「特異的に結合する」もしくは「特異的である」という用語は、非特異的相互作用から測定できる程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、対照分子の結合と比較して分子の結合を決定することにより測定することができ、対照分子は、一般的に結合活性を有しない類似の構造の分子である。例えば、特異的結合は、標的と類似の対照分子、例えば、過剰な非標識化標的との競合により決定することができる。この場合、特異的結合は、プローブへの標識化標的の結合が過剰な非標識化標的により競合的に阻害される場合に指し示される。一実施形態では、「特異的結合」という用語は、分子が、いかなる他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープにも実質的に結合することなく特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する結合を指す。
「がん」および「がん性」という用語は、典型的には調節されない細胞増殖により特徴付けられる、哺乳動物中の生理的条件を指すまたは記載する。「腫瘍」は１つまたは複数のがん性細胞を含む。がんの例としては、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性腫瘍が挙げられるがそれに限定されない。そのようながんのより具体的な例としては、扁平細胞がん（例えば、上皮扁平細胞がん）、皮膚がん、黒色腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（「ＮＳＣＬＣ」）、肺の腺がんおよび肺の扁平がんを含む肺がん、腹膜のがん、胃腸がんを含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ）または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん、膵臓がん（例えば、膵管腺がん）、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん（例えば、高グレード漿液性卵巣がん）、肝臓がん（例えば、肝細胞がん（ＨＣＣ）、肝内胆管がん（ＩＣＣ））、膀胱がん（例えば、尿路上皮膀胱がん）、精巣（生殖細胞腫瘍）がん、ヘパトーマ、乳がん、脳のがん（例えば、星状細胞腫）、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮がん、唾液腺がん、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）または腎臓（ｒｅｎａｌ）がん（例えば、腎細胞がん、腎芽腫またはウィルムス腫瘍）、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝臓がん、肛門がん、陰茎がん腫だけでなく、頭頸部がんも挙げられる。がんの追加の例としては、網膜芽腫、莢膜細胞腫、男化腫瘍、ヘパトーマ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫および急性血液学的悪性腫瘍を含む血液学的悪性腫瘍、子宮内膜または子宮がん、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、食道がん、肝臓がん、肛門がん、陰茎がん腫、鼻咽頭がん、喉頭がん、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚がん、神経鞘腫、乏突起膠腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、および尿路がんが挙げられるがそれに限定されない。
「転移がん」という用語は、起源となる組織のがん細胞が、血管またはリンパ管により、元々の部位から身体中の１つまたは複数の他の部位に伝達されて、起源となる組織の他に１つまたは複数の臓器において１つまたは複数の二次腫瘍を形成するがんの状態を意味する。
本明細書において使用される場合、「ＡＳ－ＳＰＩＫの発現により特徴付けられる障害」の「ＡＳ－ＳＰＩＫ関連障害」は、ＡＳ－ＳＰＩＫ遺伝子または遺伝子産物（ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチド）の発現または過剰発現と関連付けられる障害であり、好適な対照細胞と比べて、正常なまたは上昇したレベルのＡＳ－ＳＰＩＫを発現する細胞により特徴付けられる任意の障害とすることができる。好適な対照細胞は、ＡＳ－ＳＰＩＫ発現もしくは過剰発現がんに罹患していない個体からの細胞とすることができ、またはそれは、必要とするいずれかの対象からの非がん性細胞であってもよく、またはそれは、ＡＳ－ＳＰＩＫ発現もしくは過剰発現がんに罹患した別の個体からの非がん性細胞であってもよい。ＡＳ－ＳＰＩＫ関連障害の１つの顕著な例は肝臓がんである。
「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」という用語は、何らかの程度の異常な細胞増殖と関連付けられる障害を指す。一実施形態では、細胞増殖性障害はがんである。
「腫瘍」は、本明細書において使用される場合、悪性であれ良性であれ、全ての新生物性の細胞成長および増殖、ならびに全ての前がん性およびがん性の細胞および組織を指す。
本明細書において使用される「予測的」（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ）および「予後的」（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ）という用語もまた、予測または予後のための方法は、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体を含む抗がん剤を用いる処置に応答する可能性がより高いとみなされる（必ずしもそうではないが、通常は処置に先立って）患者を選択する方法の実施を可能とするという意味において、交換可能である。
本明細書において使用される「処置する」、「処置」または「処置すること」という用語は、治療的処置および予防的手段の予防の両方を指し、その目的は、標的化された病的状態または障害を予防しまたは減速（減少）させることである。処置を必要とする対象には、特定の状態または障害を既に有する対象だけでなく、障害を有する傾向がある対象または障害を予防すべき対象も含まれる。
詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的に、ある特定の障害が特有の形態またはセリンプロテアーゼ阻害剤カザル（ＳＰＩＫ）の発現により特徴付けられるという発見に基づく。１つの（ｏｎｃｅ）顕著な例は、肝細胞がん（ＨＣＣ）および肝内胆管がん（ＩＣＣ）が挙げられるがそれに限定されない肝臓がんである。より詳細には、本発明者らは、肝臓がんなどのある特定のがんは、分泌されるＳＰＩＫポリペプチドのＮ末端において追加の２３アミノ酸を含む形態のＳＰＩＫを発現することを見出した。この２３アミノ酸セグメント（配列番号：６）は、膵臓細胞などの正常細胞から分泌されるＳＰＩＫポリペプチド中には見出されない。これは、この２３アミノ酸セグメントの最初の９アミノ酸は肝臓がん細胞株により分泌されるプロセシングされていないＳＰＩＫ中に存在する場合があるという我々の以前の報告と合致する。Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１；１３４（４）：３９８－４０８。我々は、より長い形態のＳＰＩＫをＡＳ－ＳＰＩＫ、すなわちＡｂｎｏｒｍａｌ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ＳＰＩＫと称する場合がある。我々はまた、肝臓がん細胞により産生されるＡＳ－ＳＰＩＫをＬＣ－ＳＰＩＫ、すなわちＬｉｖｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ＳＰＩＫと称する場合がある。ＡＳ－ＳＰＩＫおよびＬＣ－ＳＰＩＫという用語は、本明細書において交換可能に使用される。例示的なＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドは配列番号：２のアミノ酸配列を有することができる。我々は、膵臓細胞などの正常細胞により分泌される形態のＳＰＩＫをＮＳ－ＳＰＩＫ、すなわちＮｏｒｍａｌ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ＳＰＩＫと称する場合がある。例示的なＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドは配列番号：４のアミノ酸配列を有することができる。我々はまた、ＡＳ－ＳＰＩＫのコンホメーション（例えば、３Ｄ構造）がＮＳ－ＳＰＩＫのものとは異なることを見出した。
したがって、本発明の態様は、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合し、かつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない、抗体などの組成物を含む。ＡＳ－ＳＰＩＫ複合体もまた提供される。本発明の実施形態によるＡＳ－ＳＰＩＫ複合体は、ＡＳ－ＳＰＩＫ、およびＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチド、またはその断片に特異的または優先的に結合する抗体を含む。本発明の態様はまた、ＡＳ－ＳＰＩＫの発現により特徴付けられる障害、例えば、肝臓障害、例えば、肝臓がん、例えば、ＨＣＣまたはＩＣＣの検出のために対象の抗体を使用する方法も含む。
我々はＡＳ－ＳＰＩＫの発現の間に起こるある特定の事象を理解していると考えるが、本発明の組成物および方法は、任意の特定の細胞機構に影響することにより機能するものに限定されない。理論に縛られないが、本発明者らは、ＳＰＩＫはプロテアーゼ阻害剤であるので、がん細胞におけるＳＰＩＫの過剰発現はプロテアーゼの一種であるシグナルペプチドペプチダーゼの活性を抑制して、非減弱型の全長タンパク質ががん細胞から分泌されることを結果としてもたらすという仮説を立てる。
組成物
本明細書において提供される組成物は、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない抗体を含む。
ＳＰＩＮＫ１、ＰＳＴＩ、およびＴＡＴＩとしても公知のセリンプロテアーゼ阻害剤カザル（ＳＰＩＫ）は、トリプシン様プロテアーゼおよびキモトリプシン様プロテアーゼなどの多くの細胞プロテアーゼの活性を広く調節することが示されている小タンパク質である。Ｇｒｅｅｎｅ，ＬＪ，Ｊ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ．１９７５；７（２）：１５１－１５４；Ｈｏｒｉｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １９８７；１４９（２）：６３５－６４１；Ｓｔｅｎｍａｎ，ＵＨ，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２００２；４８（８）：１２０６－１２０９(1)。ＳＰＩＫはまた、アポトーシスの阻害において役割を果たすことがある。Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１；１３４（４）：３９８－４０８。例示的なヒトＳＰＩＫアミノ酸配列としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ１１９４９、ＧＩ番号：１９０６８７；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ００３１２２、ＧＩ：６５７９４０８８７；およびＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号：ＢＣ０２５７９０、ＧＩ：１９３４３６０７が挙げられる。
抗体
本明細書において提供される抗体は、配列番号：２のアミノ酸１～２３内のエピトープ、またはこの領域内の少なくとも１つのアミノ酸を含有するエピトープに特異的または優先的に結合する抗体を含むことができる。エピトープはコンホメーショナルエピトープ（コンホメーション特異的エピトープ）またはリニアエピトープとすることができる。一部の実施形態では、抗体は、配列番号：６に示されるＡＳ－ＳＰＩＫタンパク質配列中のエピトープに特異的または優先的に結合する。一部の実施形態では、抗体は、配列番号：６の少なくとも１つのアミノ酸を含むコンホメーション特異的エピトープに特異的または優先的に結合する。
本発明の実施形態による抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル、特にモノクローナルであってもよく、ヒト、マウス、ウサギ、ヒツジもしくはヤギ細胞により、またはこれらの細胞に由来するハイブリドーマにより産生されてもよい。一部の実施形態では、抗体は、ヒト化、またはキメラ抗体とすることができる。
本発明の実施形態による抗体は様々な構成をとることができ、また免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を包含する。インタクトな抗体、抗体多量体、または機能的な抗体の抗原結合領域を含む抗体断片もしくはその他のバリアントを含む様々な抗体構造のいずれか１つを使用することができる。「免疫グロブリン」という用語は「抗体」と同義に使用される場合がある。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルの起源であってもよい。抗体の供給源にかかわらず、好適な抗体としては、インタクトな抗体、例えば、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を有するＩｇＧ四量体、単鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）決定領域（ＣＤＲ）グラフト抗体だけでなく、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、およびそのような断片に由来する組換え抗体、例えば、キャメルボディ（ｃａｍｅｌｂｏｄｉｅｓ）、マイクロ抗体、ダイアボディおよび二重特異性抗体も挙げられる。
インタクトな抗体は、抗原結合可変領域（ＶＨおよびＶＬ）だけでなく、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）ならびに重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３も含む抗体である。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであってもよい。当該技術分野において周知のように、ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と共に散在された、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに分割される。抗体のＣＤＲは、典型的には、天然の免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を一緒になって定義するアミノ酸配列を含む。
抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体は、免疫グロブリンの任意のクラス、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびにそのサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４））からのものとすることができ、また免疫グロブリンの軽鎖はカッパまたはラムダの種類のものであってもよい。認識されるヒト免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン、ならびにミュー定常領域遺伝子だけでなく、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子も挙げられる。
免疫グロブリンまたは抗体の「抗原結合部分」という用語は、一般的に、標的、この場合は、ＡＳ－ＳＰＩＫ上のアミノ酸残基（配列番号：６）を含むエピトープに特異的または優先的に結合するがＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない免疫グロブリンの部分を指す。免疫グロブリンの抗原結合部分は、したがって、分子中の１つまたは複数の免疫グロブリン鎖が全長ではないが、細胞標的に特異的または優先的に結合する分子である。抗原結合部分または断片の例としては、（ｉ）ＶＬＣ、ＶＨＣ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）抗体の単一アームのＶＬＣおよびＶＨＣドメインからなるＦｖ断片、ならびに（ｖ）例えば可変領域の抗原結合部分に特異的または優先的に結合するために充分なフレームワークを有する単離されたＣＤＲが挙げられる。軽鎖可変領域の抗原結合部分および重鎖可変領域の抗原結合部分、例えば、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬＣおよびＶＨＣは、ＶＬＣおよびＶＨＣ領域がペア形成して一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知）を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらが作製されることを可能とする合成リンカーにより、組換え法を使用して、連結することができる。そのようなｓｃＦｖは抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される。
「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小の抗体断片である。この領域は、緊密な非共有結合性（ｃｏｎ－ｃｏｖａｌｅｎｔ）の会合をした１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用してＶＨ－ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を定義するのはこの構成においてである。６つの超可変領域は抗原結合特異性を付与するが、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体より低い親和性であるが、抗原を認識してそれに結合する能力を有する。安定性を向上させるために、ＶＨ－ＶＬドメインは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ （配列番号：６４）などの柔軟なペプチドリンカーにより接続されて単鎖ＦｖもしくはｓｃＦＶ抗体断片を形成してもよく、またはフレームワーク領域に２つのシステイン残基を導入することによりジスルフィド結合を形成するように操作してジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）をもたらしてもよい。
抗体の断片は、全長抗体の所望の特異性および／またはＡＳ－ＳＰＩＫに結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない充分な特異性を保持する限り、提供される方法において使用するために好適である。
本明細書に記載の抗体の抗原結合ドメインは、Ｔ細胞エンゲージャー分子（例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、別名ＢｉＴＥ分子）だけでなく、ＣＡＲ－Ｔ構造物の産生においても利用することができる。Ｔ細胞エンゲージャー分子は、例えば、Ｈｕｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１５ Ｍａｒ；９３（３）：２９０－２９６に記載されている。結合（標的化）ドメインとして単一ドメイン抗体を含むＣＡＲ－Ｔ構造物は、例えば、Ｉｒｉ－Ｓｏｆｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１７：２６３０－２６４１およびＪａｍｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１８４０：３７８－３８６に記載されている。
抗体断片を調製する方法は、生化学的方法（例えば、化学的架橋が後続してもよい、インタクトな抗体のタンパク質消化分解）および所望の断片の合成を指令するように免疫グロブリン配列が遺伝子操作される組換えＤＮＡベースの方法の両方を包含する。抗体断片は、非特異的チオールプロテアーゼ、パパインによる全体免疫グロブリンのタンパク質加水分解により得られ得る。パパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を有する、「Ｆａｂ断片」と称される２つの同一の抗原結合断片、および残余の「Ｆｃ断片」をもたらす。様々な画分は、プロテインＡ－セファロースまたはイオン交換クロマトグラフィーにより分離することができる。ウサギおよびヒト起源のＩｇＧからのＦ（ａｂ’）２断片の調製のための通常の手順は、酵素ペプシンによる制限されたタンパク質加水分解である。インタクトな抗体のペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有しかつ依然として抗原を架橋する能力を有するＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個の残基の付加によりＦａｂ断片とは異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元々、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片のペアとして産生された。
抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体を作製する方法もまた本発明の範囲内である。例えば、可変領域は、ＰＣＲ突然変異誘発方法を使用して免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡ配列を変化させることにより構築することができる（例えば、ヒト化免疫グロブリンを生成するために用いられる方法を使用する）。
モノクローナル抗体は、抗体産生細胞の単一のクローンにより産生される同一の抗原特異性の均質な抗体であり、またポリクローナル抗体は、一般的に同じ抗原上の異なるエピトープを認識し、抗体産生細胞の１つより多くのクローンにより産生される。各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子を目的とする。モノクローナルという修飾語は、抗体の実質的に均質な集団から得られるという抗体の特徴を指し示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解されるべきではない。
本明細書におけるモノクローナル抗体は、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一のまたはそれに相同的な重鎖および／または軽鎖の部分を典型的には有すると同時に、鎖の残余が、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列だけでなく、所望の生物学的活性を呈する限り、そのような抗体の断片と同一またはそれに相同的であるキメラ抗体も含むことができる。目的のキメラ抗体としては、非ヒト霊長動物（例えば、類人猿、旧世界ザル、新世界ザル、原猿類）に由来する可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む霊長動物化抗体が挙げられる。
マウスおよびラットモノクローナル抗体は、ＮＳ－ＳＰＩＫおよびＡＳ－ＳＰＩＫの両方において見出されるアミノ酸配列である共通の領域（配列番号：４）に加えて、ＮＳ－ＳＰＩＫ中に見出されないＡＳ－ＳＰＩＫ中に見出される追加の２３アミノ酸配列（配列番号６）を有する特に設計された組換えタンパク質を用いてマウスまたはラットを免疫化することを通じて生成された。一部の実施形態では、組換えタンパク質は、ＡＳ－ＳＰＩＫのみに結合し、ＮＳ－ＳＰＩＫに結合しないことにおいて効果的な抗体を生成するために２３アミノ酸配列（配列番号：６）の全体を有することは必要とされないことがある。ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合する抗体をスクリーニングおよび選択する方法は実施例４に記載される。
図７においてモノクローナル抗体の試験結果が提供され、これは、本発明の抗体はＡＳ－ＳＰＩＫを特異的または優先的に認識できるがＮＳ－ＳＰＩＫを認識しないことを示し、これらには、ＩＭ－ＣＡ１８、ＩＭ－ＣＡ２２、ＩＭ－ＣＡ２９、ＩＭ－ＣＡ３４、ＩＭ－ＣＡ４６およびＩＭ－ＣＡ７１が含まれるがそれに限定されない。試験の記載について実施例４を参照のこと。
ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合する（かつＮＳ－ＳＰＩＫに対してはそうではない）モノクローナル抗体の軽鎖の可変領域（ＶＬ）および重鎖の可変領域（ＶＨ）の配列を決定した（配列番号７～１４）。これらの抗体の全てのＣＤＲもまた決定した（配列番号１５～３８）。図１９～２３は、これらの領域のアライメントを提供する。以下の表は、本発明の４つの例示的な抗体の様々なＶＨおよびＶＬ領域についての配列番号を提供する。
例えば、ＣＡ－１８抗体は、配列番号：７に示されるＶＨ領域を有し、かつ配列番号：１１に示されるＶＬ領域を有する。ＶＨ領域は、配列番号：１５、１９および２３を有する３つのＣＤＲを有する。ＶＬ領域は、配列番号：２７、３１および３５を有する３つのＣＤＲを有する。
ＣＡ２２抗体は、配列番号：８に示されるＶＨ領域を有し、かつ配列番号：１２に示されるＶＬ領域を有する。ＶＨ領域は、配列番号：１６、２０および２４を有する３つのＣＤＲを有する。ＶＬ領域は、配列番号：２８、３２および３６を有する３つのＣＤＲを有する。
ＣＡ－４６抗体は、配列番号：９に示されるＶＨ領域を有し、かつ配列番号：１３に示されるＶＬ領域を有する。ＶＨ領域は、配列番号：１７、２１および２５を有する３つのＣＤＲを有する。ＶＬ領域は、配列番号：２９、３３および３７を有する３つのＣＤＲを有する。
ＣＢ７７抗体は、配列番号：１０に示されるＶＨ領域を有し、かつ配列番号：１４に示されるＶＬ領域を有する。ＶＨ領域は、配列番号：１８、２２および２６を有する３つのＣＤＲを有する。ＶＬ領域は、配列番号：３０、３４および３８を有する３つのＣＤＲを有する。
Figure 0007328261000001
Figure 0007328261000002
Figure 0007328261000003
加えて、本発明の実施形態による抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない任意の天然に存在しない（人工の）抗体とすることができる。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号：７、８、９もしくは１０において提供される配列を有するＶＨ領域を含み、または抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的もしくは優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、配列番号：８に対して少なくとも約５０％、６５％、６８％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相同的な（もしくは記載された同一性パーセンテージを有する）ＶＨ領域を有する。ＶＨ領域は、抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、配列番号：８に対して少なくとも５０～６８％、５０～９５％、６５～９５％、または７８％～９５％相同的（または記載された同一性パーセンテージを有する）であってもよい。本発明の抗体は、抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合し、かつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、このパラグラフにおいて本明細書において使用されない任意のＶＨ領域を含んでもよく、かつ任意のＶＬ領域を含んでもよい。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号：１１、１２、１３もしくは１４において提供される配列を有するＶＬ領域を含み、または、抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的もしくは優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、配列番号：１２に対して少なくとも６９％相同的な（もしくは少なくとも６９％同一の）ＶＬ領域を有する。ＶＬ領域は、抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、配列番号：１２に対して少なくとも６９％～９５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同的（または記載された同一性パーセンテージを有する）であってもよい。本発明の抗体は、抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、本明細書に記載のＶＬ領域のいずれかを含んでもよく、かつ本明細書に記載の任意のＶＨ領域を含んでもよい。
一部の実施形態では、抗体は、抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、配列番号：１５、１６、１７または１８において提供される配列を有するＶＨ ＣＤＲ１領域を有する。ＶＨ ＣＤＲ１領域は、抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、配列番号：１５、１６、１７または１８に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、４０～９５％、５０～９５％、６０～９５％、４０～６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同的であってもよい。
一部の実施形態では、抗体は、抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、配列番号：１９、２０、２１または２２において提供される配列を有するＶＨ ＣＤＲ２領域を含む。ＶＨ ＣＤＲ２領域は、抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、配列番号：１９、２０、２１または２２に対して少なくとも４４％、５０％、４４～５０％、４４～９５％、５０～９５％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同的であってもよい。
一部の実施形態では、抗体は、抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、配列番号：２３、２４、２５または２６において提供される配列を有するＶＨ ＣＤＲ３領域を含む。ＶＨ ＣＤＲ３領域は、抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、配列番号：２３、２４、２５または２６に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９５～９９％相同的であってもよい。
一部の実施形態では、抗体は、抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、配列番号：２７、２８、２９または３０において提供される配列を有するＶＬ ＣＤＲ１領域を含む。ＶＬ ＣＤＲ１領域は、抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、配列番号：２７、２８、２９または３０に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９５～９９％相同的であってもよい。
一部の実施形態では、抗体は、抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、配列番号：３１、３２、３３または３４において提供される配列を有するＶＬ ＣＤＲ２領域を含む。ＶＬ ＣＤＲ２領域は、抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、配列番号：３１、３２、３３または３４に対して少なくとも４３％、５７％、４３～５７％、４３～９５％、５７～９５％、または９５～９９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同的であってもよい。
一部の実施形態では、抗体は、抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、配列番号：３５、３６、３７または３８において提供される配列を有するＶＬ ＣＤＲ３領域を含む。ＶＬ ＣＤＲ３領域は、抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、配列番号：３５、３６、３７または３８に対して少なくとも４４％、４４～９５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同的であってもよい。
本発明の実施形態による抗体は、抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない限り、上記に提供される記載される相同性または同一性パーセントを有する配列を含めて、本明細書に記載のＶＨ、ＶＬ、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２もしくはＶＨ ＣＤＲ３、またはＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、もしくはＶＬ ＣＤＲ３領域のいずれか、またはこれらの領域の任意の組合せを含むことができる。
これらの抗体の配列相同性は、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより開発されたソフトウェアプログラム「ＢｉｏＥｄｉｔ」を使用して決定された。
抗体の相同性およびＡＳ－ＳＰＩＫへの結合活性もまた研究された。結果は実施例６および７に記載される。
モノクローナル抗体を産生する方法は精製ステップを含むことができる。例えば、抗体は一般的に、例えば、濾過、遠心分離および様々なクロマトグラフィー法、例えば、ＨＰＬＣまたはアフィニティークロマトグラフィー（これらの全ては当業者に周知の技法である）を使用してさらに精製することができる。これらの精製技法はそれぞれ、混合物の他の成分から所望の抗体を分離するための分画に関与する。抗体の調製に特に適した分析方法としては、例えば、プロテインＡ－セファロースおよび／またはプロテインＧ－セファロースクロマトグラフィーが挙げられる。
本発明の抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体は、ヒトまたは非ヒト供給源からのＣＤＲを含んでもよい。「ヒト化」抗体は、一般的にヒト定常および／もしくは可変領域ドメインまたは特定の変化を有する、マウス、ラット、ハムスター、ウサギまたは他の種からのキメラまたは突然変異体モノクローナル抗体である。免疫グロブリンのフレームワークは、ヒト、ヒト化、または非ヒト（例えば、ヒトにおいて抗原性を減少させるように改変されたマウスフレームワーク）、または合成フレームワーク（例えば、コンセンサス配列）とすることができる。ヒト化免疫グロブリンは、フレームワーク残基がヒト生殖細胞系列配列に対応しかつＣＤＲがＶ（Ｄ）Ｊ組換えおよび体細胞突然変異の結果としてもたらされるものである。しかしながら、ヒト化免疫グロブリンはまた、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン核酸配列においてコードされないアミノ酸残基（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発により導入された突然変異）も含んでもよい。生殖細胞系列配列に基づくが、例えばｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞突然変異プロセスにより導入された、フレームワーク突然変異を有する抗体可変ドメイン遺伝子は、「ヒト」と称される。
ヒト化抗体は、当該技術分野において公知の様々な方法により操作されてもよく、該方法としては、例えば、（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワークおよび定常領域にグラフトすること（当該技術分野においてヒト化と称されるプロセス）、または、代替的に、（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によりそれらにヒト様表面を提供すること（当該技術分野においてベニア化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）と称されるプロセス）が挙げられる。ヒト化抗体は、ヒト化抗体およびベニア化抗体の両方を含むことができる。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されているマウスに導入することにより作製することができる。チャレンジにより、遺伝子再構成、アセンブリー、および抗体レパートリーを含む全ての点においてヒトにおいて見られるものと密接に似ているヒト抗体産生が観察される。
キメラおよびヒト化抗体に加えて、完全ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスに由来する可能性がある。一部の実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖ－ファージディスプレイライブラリーにより産生および特定されてもよい。
抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体は、その抗原結合親和性、そのエフェクター機能、またはその薬物動態をモジュレ―トするように改変されてもよい。特に、ランダム突然変異をＣＤＲにおいて行うことができ、産物は、より高い親和性および／またはより高い特異性を有する抗体を特定するためにスクリーニングすることができる。典型的には、ＣＤＲは、１つまたは２つのアミノ酸において異なってもよい。
例えば、ＣＤＲシャッフリングおよび移植技術は、本明細書において提供される抗体と共に使用することができる。ＣＤＲシャッフリングは、ＣＤＲ配列を特定のフレームワーク領域の中へと挿入する。ＣＤＲ移植技法は、単一のマスターフレームワークへのＣＤＲ配列のランダムな組合せを可能とする。そのような技法を使用して、例えば、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体のＣＤＲ配列は、複数の異なる配列を作製するために突然変異誘発することができ、該複数の異なる配列をスキャフォールド配列へと組み込み、そして結果として生じる抗体バリアントを所望の特徴、例えば、より高い親和性についてスクリーニングすることができる。
ＳＰＩＫの機能の我々の研究は、ＳＰＩＫはグランザイムＡ（ＧｚｍＡ）に結合してそれがアポトーシスを誘導することを阻害できることを示す。Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１；１３４（４）：３９８－４０８。ＧｚｍＡは、免疫サーベイランスの間に標的細胞を殺傷するために活性化ＣＴＬおよびＮＫ細胞により分泌される細胞傷害性セリンプロテアーゼである。腫瘍前駆体／腫瘍生殖細胞などの悪性細胞の除去におけるＧｚｍＡ誘導性アポトーシスの役割が確認されている。Ｐａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２；３２（１０）：２８８１－２８８７。したがって、肝臓がん細胞におけるＡＳ－ＳＰＩＫの過剰発現が、細胞を免疫クリアランスの間にＧｚｍＡにより誘導されるアポトーシスに対して耐性にすることが可能である。これは、免疫経路による殺傷からのこれらのがん細胞の回避を結果としてもたらす。Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１；１３４（４）：３９８－４０８。この仮説に基づき、かつ理論に縛られることなく、ＡＳ－ＳＰＩＫの過剰発現の抑制、または過剰発現されるＡＳ－ＳＰＩＫの活性の阻害が、ヒトの身体の免疫クリアランスの間にＧｚｍＡにより誘導されるがん細胞の免疫殺傷を回復させる場合があると我々は結論する。
実施例１１において、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体がＡＳ－ＳＰＩＫの活性を阻害できることが実証される。したがって、ＧｚｍＡとのＡＳ－ＳＰＩＫの結合を遮断し、ＧｚｍＡを遊離させ、かつ免疫クリアランスを介してこれらのがん細胞のアポトーシス性殺傷を回復させるために抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体を使用することができる。この目的のために、抗ＳＰＩＫ抗体は、がん、ウイルス感染症、および炎症が挙げられるがそれに限定されないＡＳ－ＳＰＩＫの過剰発現により引き起こされる障害の処置において使用されてもよい。
抗体の１つの治療的使用はヒト化を通じたものである。ヒト化モノクローナル抗体を用いる療法は急速に開発されている分野であり、その特異性および効率はよく研究されている。Ｒｏｔｈｅｒｎｂｅｒｇ，ＭＥ，Ｃｅｌｌ ２０１６；１６５（３）：５０９。ＩＭ－ＣＡ１８、ＩＭ－ＣＡ２２、ＩＭ－ＣＡ４６およびＩＭ－ＣＢ７７、ならびにＳＰＩＫの活性を阻害できる本発明の他の抗体が挙げられるがそれに限定されない対象抗ＡＳ－ＳＰＩＫモノクローナル抗体もまた、ヒト化されて疾患の処置のために使用することができる。
例えばファージミド技術を使用する組換え技術は、広範な抗体をコードする組換え遺伝子からの所望の特異性を有する抗体の調製を可能とする。ある特定の組換え技法は、免疫化動物の脾臓から単離されたＲＮＡから調製されたコンビナトリアル免疫グロブリンファージ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングによる抗体遺伝子の単離に関与する。そのような方法のために、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーは、免疫化動物の脾臓から単離されたＲＮＡから調製することができ、かつ適切な抗体を発現するファージミドは、抗原を発現する細胞および対照細胞を使用してパニングにより選択することができる。
上記に開示されるコンビナトリアル免疫グロブリンファージ発現ライブラリーに加えて、１つの分子クローニングアプローチは、ヒト抗体ライブラリーを含有するトランスジェニックマウスから抗体を調製することである。そのようなトランスジェニック動物を、単一のアイソタイプ、より特異的には、ＩｇＭおよび場合によりＩｇＤなどの、Ｂ細胞成熟のために必須のアイソタイプのヒト抗体を産生するために用いることができる。
抗ＡＳ－ＳＰＩＫ免疫グロブリンは、グリコシル化を低減または無化するように改変されてもよい。グリコシル化を欠いた免疫グロブリンは、全くグリコシル化されていない、完全にはグリコシル化されていない、または変則的にグリコシル化されている（すなわち、突然変異体のグリコシル化パターンが対応する野生型免疫グロブリンのグリコシル化パターンとは異なる）免疫グロブリンであってもよい。ＩｇＧポリペプチドは、グリコシル化を減弱する１つまたは複数（例えば、１、２、または３またはより多く）の突然変異、すなわち、グリコシル化を欠いた、または完全にはグリコシル化されていない、または変則的にグリコシル化されているＩｇＧ ＣＨ２ドメインを結果としてもたらす突然変異を含む。オリゴ糖構造もまた、例えば、Ｎ結合型グリカンからフコース部分を除去することにより、改変することができる。
抗体はまた、非タンパク質ポリマー、例えば、ポリエチレングリコールへの結合によりｉｎ ｖｉｖｏでの安定性およびまたは溶解性を増加させるように改変することができる。抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに選択的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない能力を保持する限り、任意のＰＥＧ化方法を使用することができる。
結果として生じるポリペプチドが標的、すなわち、ＡＳ－ＳＰＩＫに対して特異的な少なくとも１つの結合領域を含む限り、多様な抗体／免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドを用いることができる。そのようなフレームワークまたはスキャフォールドは、ヒト免疫グロブリンの５つの主なイディオタイプ、またはその断片（例えば、本明細書の他の箇所に開示されるもの）を含み、好ましくはヒト化された態様を有する、他の動物種の免疫グロブリンを含む。ラクダ科動物において特定されたものなどの単一の重鎖抗体は、これに関して特に興味深いものである。
本発明の抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫ上のエピトープに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫ上のエピトープに結合しない。エピトープは、パラトープが特異的に結合する標的上の抗原決定基、すなわち、抗体の結合部位を指す。エピトープ決定因子は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性の表面グループ分けからなり、典型的には、特定の三次元構造的特徴だけでなく、特定の電荷的特徴も有する。エピトープは、一般的に約４～約１０、好ましくは４～８の、連続するアミノ酸（直鎖状のもしくは連続的なエピトープ）を有し、または代替的に、特定の構造（例えば、コンホメーショナルエピトープ）を定義する不連続のアミノ酸のセットであり得る。したがって、エピトープは、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、および少なくとも１２のそのようなアミノ酸から成ることができる。アミノ酸の空間的コンホメーションを決定する方法は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴が挙げられる。
抗体が結合することができる他の潜在的なエピトープを予測する方法としては、カイト－ドーリトル解析（Ｋｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３２（１９８２））、ホップ－ウッド解析（Ｈｏｐｐ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｈｏｐｐ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３８２４－３８２８（１９８１）；Ｈｏｐｐ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４８３－４８９（１９８３）；Ｈｏｐｐ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８８：１－１８（１９８６））、ジェームソン－ウォルフ解析（Ｊａｍｅｓｏｎ－Ｗｏｌｆ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｊａｍｅｓｏｎ ａｎｄ Ｗｏｌｆ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１８１－１８６（１９８８））、およびエミニ解析（Ｅｍｉｎｉ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｅｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４０：１３－２０（１９８５））、チョウ－ファスマン解析（Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｆａｓｍａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｐｏｎｏｍａｒｅｎｋｏ ＆ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９）、カープラス－シュルツ解析（Ｋａｒｐｌｕｓ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｚ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｋｏｌａｓｋａｒ ａｎｄ Ｔｏｎｇａｏｎｋａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｋｏｌａｓｋａｒ ＆ Ｔｏｎｇａｏｎｋａｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１７２－１７４（１９９０））、およびパーカー解析（Ｐａｒｋｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）を挙げることができるがそれに限定されない。一部の実施形態では、潜在的なエピトープは、他の研究から既知の抗原部位との相関を通じて決定され、これらの予測技法は、Ｘ線結晶学的データなどの構造データと組み合わせることができる。エピトープ予測はまた、連続的なエピトープおよび不連続のエピトープの両方を予測する技法を含んでもよい。不連続のエピトープを予測する方法としては、以下が挙げられるがそれに限定されない：ＤｉｓｃｏＴｏｐｅ、ＢＥｐｒｏ、ＥｌｌｉＰｒｏ、ＳＥＰＰＡ、ＥＰＩＴＯＰＩＡ、ＥＰＣＥＳ、Ｂｐｒｅｄｉｃｔｏｒ、およびＥＰＭｅｔａ（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ ＯＮＥ，（２０１３））。一部の実施形態では、潜在的なエピトープは、理論的な細胞外ドメインを決定することにより特定される。そのような予測を行うためにＴＭｐｒｅｄ（Ｈｏｆｍａｎｎ ａｎｄ Ｓｔｏｆｆｅｌ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７４：１６６（１９９３）を参照のこと）またはＴＭＨＭＭ（Ｋｒｏｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０５（３）：５６７－５８０（２００１））などの解析アルゴリズムを使用することができる。シグナルペプチドの存在を予測するため、およびそれらのペプチドが全長タンパク質からどこで切断されるかを予測するためにＳｉｇｎａｌＰ ３．０（Ｂｅｄｎｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（４）：７８３－７９５（２００４））などの他のアルゴリズムを使用することができる。細胞の外側上のタンパク質の部分は、抗体相互作用のための標的として機能を果たすことができる。
本発明の組成物は、（１）閾値レベルの結合活性を呈し、（２）既知の関連するポリペプチド分子と有意に交差反応せず、（３）ＡＳ－ＳＰＩＫに結合しかつ（４）ＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない本明細書に記載の抗体を含む。抗体の結合親和性は、例えばスキャッチャード解析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．５１：６６０－６７２（１９４９））により、当業者により容易に決定され得る。
一部の実施形態では、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫに対してある程度の相同性を有することが予測される他のタンパク質、例えば、ＮＳ－ＳＰＩＫに対してよりも標的ＡＳ－ＳＰＩＫについて少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍またはより強くその標的エピトープまたは模倣的デコイに結合することができる。
一部の実施形態では、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体は、１０－４Ｍもしくはそれ未満、１０－７Ｍもしくはそれ未満、１０－９Ｍもしくはそれ未満の高親和性またはサブナノモル濃度の親和性（０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｎＭもしくはそれ未満）で結合する。一部の実施形態では、各々の標的に対する抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体の結合親和性は少なくとも１×１０６Ｋａである。一部の実施形態では、ＡＳ－ＳＰＩＫに対する抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体の結合親和性は、少なくとも５×１０６Ｋａ、少なくとも１×１０７Ｋａ、少なくとも２×１０７Ｋａ、少なくとも１×１０８Ｋａ、またはより高い。抗体はまた、ＡＳ－ＳＰＩＫに対する結合親和性の点で記載または指定されてもよい。一部の実施形態では、結合親和性としては、５×１０－２Ｍ、１０－２Ｍ、５×１０－３Ｍ、１０－３Ｍ、５×１０－３Ｍ、１０－４Ｍ、５×１０－５Ｍ、１０－５Ｍ、５×１０－６Ｍ、１０－６Ｍ、５×１０－７Ｍ、１０－７Ｍ、５×１０－８Ｍ、１０－８Ｍ、５×１０－９Ｍ、１０－９Ｍ、５×１０－１０Ｍ、１０－１０Ｍ、５×１０－１１Ｍ、１０－１１Ｍ、５×１０－１２Ｍ、１０－１２Ｍ、５×１０－１３Ｍ、１０－１３Ｍ、５×１０－１４Ｍ、１０－１４Ｍ、５×１０－１５Ｍ、もしくは１０－１５Ｍ未満またはより低いＫｄを有するものが挙げられる。すなわち、本明細書において使用される例えばＡＳ－ＳＰＩＫに対する「特異的結合」、それに「特異的に結合すること」、または「特異的に結合する」という用語は、ＡＳ－ＳＰＩＫに結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない抗体を指す。理論により縛られるものではないが、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的に結合する本発明の抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫ中に存在する最初の１～２３アミノ酸（配列番号：６を参照のこと）内のみにありＮＳ－ＳＰＩＫ中に存在しないエピトープに結合すると考えられる。本発明の抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫの１～２３アミノ酸にわたるが共通の領域中の一部のアミノ酸（ＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＳ－ＳＰＩＫの両方に存在するアミノ酸）も含むエピトープに結合するものである可能性がある。または、抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫの最初の１～２３アミノ酸中の少なくとも１つのアミノ酸に結合するが共通の領域中の少なくとも１つのアミノ酸にも結合するものである可能性がある。これらの事例では、抗体はまたＮＳ－ＳＰＩＫに結合してもよいが、結合のレベルはバックグラウンドレベルであるかまたはそれより低い。これは本明細書において「優先的に結合する」または「優先的な結合」と称される。ＡＳ－ＳＰＩＫに優先的に結合する抗体は診断方法において依然として有用であり、その理由は、結合のバックグラウンドレベルを「ノイズ」として割り引くようにアッセイを開発することができるためである。そのため、アッセイは、ＡＳ－ＳＰＩＫの発現により特徴付けられる障害、例えば、肝臓がんなどの肝臓障害を有する患者の診断を結果としてもたらすために結合のある特定のレベル（ある特定の閾値レベルより高い、およびバックグラウンドノイズより高い）のみが許容されることを指し示すことになる。
本発明の抗体は、１０－４Ｍもしくはそれ未満、１０－７Ｍもしくはそれ未満、１０－９Ｍもしくはそれ未満の親和性またはサブナノモル濃度の親和性（０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｎＭもしくはさらにそれ未満）で結合してもよい。一部の実施形態では、各々の標的に対する抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体の結合親和性は少なくとも１×１０６Ｋａである。一部の実施形態では、ＡＳ－ＳＰＩＫに対する抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体の結合親和性は、少なくとも５×１０６Ｋａ、少なくとも１×１０７Ｋａ、少なくとも２×１０７Ｋａ、少なくとも１×１０８Ｋａ、またはより高い。一部の実施形態では、結合親和性としては、５×１０－２Ｍ、１０－２Ｍ、５×１０－３Ｍ、１０－３Ｍ、５×１０－３Ｍ、１０－４Ｍ、５×１０－５Ｍ、１０－５Ｍ、５×１０－６Ｍ、１０－６Ｍ、５×１０－７Ｍ、１０－７Ｍ、５×１０－８Ｍ、１０－８Ｍ、５×１０．－９Ｍ、５×１０－１０Ｍ、１０－１０Ｍ、５×１０－１１Ｍ、１０－１１Ｍ、５×１０－１２Ｍ、１０－１２Ｍ、５×１０－１３Ｍ、１０－１３Ｍ、５×１０－１４Ｍ、１０－１４Ｍ、５×１０－１５Ｍ、もしくは１０－１５Ｍ未満またはより低いＫｄを有するものが挙げられる。それと対照的に、本明細書において使用される例えばＮＳ－ＳＰＩＫに「非特異的に結合する」という用語は、例えばＡＳ－ＳＰＩＫに対する「特異的結合」について決定されるものより少なくとも１．５、２、５、１０、１００、１０３、１０４、１０５、１０６またはより大きい率だけ低い結合親和性を指す。Ｋｄなどの親和性は、Ｆａｂ型の目的の抗体およびその抗原を用いて行われる放射性標識抗原結合アッセイ（ラジオイムノアッセイ、ＲＩＡ）により測定されてもよい。別の実施形態によれば、Ｋｄは、固定化された抗原を用いて表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定されてもよい。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合し、かつＮＳ－ＳＰＩＫには特異的に結合せず、ＡＳ－ＳＰＩＫに対する抗体の親和性は、ＮＳ－ＳＰＩＫに対してより少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍または１０６倍大きい。
一部の実施形態では、抗体は既知の関連するポリペプチド分子に結合せず、例えば、それらはＡＳ－ＳＰＩＫに結合するが既知の関連するポリペプチド、例えば、ＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない。抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合する抗体集団を単離するために既知の関連するポリペプチドに対してスクリーニングされてもよい。例えば、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的な抗体は、適切な緩衝液条件下で不溶性のマトリックスに接着したＮＳ－ＳＰＩＫを含むカラムを通過する。そのようなスクリーニングは、密接に関連するポリペプチドに非交差反応性のポリクローナルおよびモノクローナル抗体の単離を可能とする。特異的な抗体のスクリーニングおよび単離の他の方法としては、例えば、同時免疫電気泳動（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、放射性免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットまたはウエスタンブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイが挙げられるがそれに限定されない。
本発明の実施形態による抗体は、レポーター（例えば、検出可能なレポーター）とも称されることがある、検出可能な標識を含むことができる。一部の実施形態では、検出可能な標識は、タグ化ペプチドの発現または活性の定性的および／または定量的な評価を可能とする抗体（例えば、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体）またはその生物学的活性断片に共有結合的に連結される任意の分子とすることができる。活性は、生物学的活性、物理化学的活性、またはその組合せを含むことができる。標識された抗体が生物学的活性を保持する限り、検出可能な標識の形態および位置の両方を変動させることができる。多くの異なる標識を使用することができ、また特定の標識の選択は所望の応用に依存することになる。標識された抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体は、例えば、生物学的試料、例えば、尿、唾液、脳脊髄液、血液または生検試料中のＡＳ－ＳＰＩＫのレベルを評価するために使用することができる。
検出可能な標識としては、酵素、光親和性リガンド、放射性同位体、および蛍光または化学発光化合物を挙げることができる。例示的な酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、およびウレアーゼを挙げることができる。酵素への抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体の共有結合連結は、異なる方法、例えば、遊離アミノ基を介するグルタルアルデヒドとの連結により行われてもよい。代替的に、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体は、糖残基を介して酵素に連結することができる。炭水化物を含有する他の酵素もまたこの方式で抗体に連結することができる。酵素連結はまた、スクシンイミジル６－（Ｎ－マレイミド）ヘキサノエートなどのヘテロ二官能性リンカーを使用して、β－ガラクトシダーゼなどの酵素の遊離チオール基と抗体のアミノ基を相互連結することにより行われてもよい。西洋ワサビペルオキシダーゼ検出システムを、例えば、発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と共に使用することができ、これは過酸化水素の存在下で４５０ｎｍにおいて検出可能な可溶性の産物をもたらす。アルカリホスファターゼ検出システムは、例えば、発色基質ｐ－ニトロフェニルホスフェートと共に使用することができ、これは４０５ｎｍにおいて容易に検出可能な可溶性の産物をもたらす。同様に、β－ガラクトシダーゼ検出システムは、発色基質ｏ－ニトロフェニル－Ｐ－Ｄ－ガラクトピラノシド（ｏ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－Ｐ－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｘｉｄｅ）（ＯＮＰＧ）と共に使用することができ、これは、４１０ｎｍにおいて検出可能な可溶性の産物をもたらす。ウレアーゼ検出システムは、尿素－ブロモクレゾールパープルなどの基質と共に使用することができる。
検出可能な標識はフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｅｒｉｎ）、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタルアルデヒド（ｏ－ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）およびフルオレスカミンが挙げられるがそれに限定されない蛍光標識；ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルからなる群から選択される化学発光化合物；リポソームもしくはデキストラン；またはルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンなどの生物発光化合物とすることができる。代替的または追加的に、検出可能な標識としては、放射線不透過または造影剤、例えば、バリウム、ジアトリゾ酸塩、エチオダイズド油、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、ヨーセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、ヨーグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパノ酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメチン酸（ｉｏｓｅｍｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、イオタスル、イオテトル酸、イオタラム酸、イオトロクス酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾ酸塩、プロピリオドン、および塩化タリウムなどが挙げられるがそれに限定されない。
標識は、合成の間または合成後に付加することができる。組換え抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体またはその生物学的に活性なバリアントはまた、形質転換細胞が生育される培養培地への標識された前駆体（例えば、放射性標識されたアミノ酸）の添加により標識され得る。一部の実施形態では、検出可能なマーカーの組込みを容易にするためにペプチドのアナログまたはバリアントを使用することができる。例えば、任意のＮ末端フェニルアラニン残基は、１２５Ｉを用いて簡単に標識することができるチロシンなどの密接に関連する芳香族アミノ酸により置換することができる。一部の実施形態では、効果的な標識化をサポートする追加の官能基を、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体またはその生物学的に活性なバリアントの断片に付加することができる。例えば、３－トリブチルスズベンゾイル（３－ｔｒｉｂｕｔｙｌｔｉｎｂｅｎｚｏｙｌ）基を天然の構造のＮ末端に付加することができ、１２５Ｉを用いたトリブチルスズ基のその後の置換は、放射性標識されたヨードベンゾイル基を生成することになる。
ポリペプチド
一部の実施形態では、本発明の組成物は、ＳＰＩＫポリペプチド、例えば、上記の任意の核酸配列によりコードされるＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドを含むことができる。「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は本明細書において交換可能に使用されるが、典型的にはそれらは異なるサイズのペプチド配列を指す。それらがアミノ酸残基の直鎖状ポリマーであることを伝えるため、および全長タンパク質からそれらを区別することを助けるために、本発明のアミノ酸ベースの組成物を「ポリペプチド」と呼ぶことがある。本発明の実施形態によるポリペプチドは、ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドの断片を「構成」すること、または「含む」ことができ、また本発明は、ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドの生物学的に活性なバリアントを構成する、または含むポリペプチドを包含する。ポリペプチドは、したがって、ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチド（またはその生物学的に活性なバリアント）の断片のみを含むことができるが、追加の残基もまた含んでもよいことが理解されるであろう。生物学的に活性なバリアントは、プロテアーゼを阻害するために充分な活性を保持する。
アミノ酸残基間の結合は、従来のペプチド結合または別の共有結合（例えば、エステルもしくはエーテル結合）とすることができ、ポリペプチドは、アミド化、リン酸化またはグリコシル化により修飾することができる。修飾は、ポリペプチド骨格および／または１つもしくは複数の側鎖に影響する可能性がある。化学修飾は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳後にｉｎ ｖｉｖｏで為される天然に存在する修飾（例えば、細菌宿主中でのグリコシル化）またはｉｎ ｖｉｔｒｏで為される合成修飾とすることができる。ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドの生物学的に活性なバリアントは、天然に存在する（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏで天然に為される）修飾および合成修飾（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏで為される天然に存在するもしくは天然に存在しない修飾）の任意の組合せの結果としてもたらされる１つまたは複数の構造修飾を含むことができる。修飾の例としては、アミド化（例えば、アミノ基によるＣ末端の遊離カルボキシル基の置換）；ビオチン化（例えば、ビオチン分子によるリジンまたは他の反応性アミノ酸残基のアシル化）；グリコシル化（例えば、糖タンパク質または糖ペプチドを生成するためのアスパラギン、ヒドロキシリジン、セリンまたはスレオニン残基のいずれかへのグリコシル基の付加）；アセチル化（例えば、典型的にはポリペプチドのＮ末端における、アセチル基の付加）；アルキル化（例えば、アルキル基の付加）；イソプレニル化（例えば、イソプレノイド基の付加）；リポイル化（例えば、リポエート部分の取付け）；およびリン酸化（例えば、セリン、チロシン、スレオニンまたはヒスチジンへのリン酸基の付加）が挙げられるがそれに限定されない。
生物学的に活性なバリアント中のアミノ酸残基の１つまたは複数は、天然に存在しないアミノ酸残基であってもよい。天然に存在するアミノ酸残基としては、遺伝コードにより天然にコードされるものだけでなく、非標準アミノ酸（例えば、Ｌ配置の代わりにＤ配置を有するアミノ酸）も挙げられる。本発明のペプチドはまた、修飾型の標準的な残基であるアミノ酸残基も含むことができる（例えば、ピロールリジンをリジンの代わりに使用することができ、セレノシステインをシステインの代わりに使用することができる）。天然に存在しないアミノ酸残基は、天然に見出されないが、アミノ酸の基本的な式に合致し、かつペプチドの中へと組み込むことができるものである。これらとしては、Ｄ－アロイソロイシン（２Ｒ，３Ｓ）－２－アミノ－３－メチルペンタン酸およびＬ－シクロペンチルグリシン（Ｓ）－２－アミノ－２－シクロペンチル酢酸が挙げられる。他の例のために、参考書またはワールドワイドウェブを参照することができる（サイトは現在、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより維持されており、機能的タンパク質への組込みが成功した非天然アミノ酸の構造を示す）。
代替的に、または加えて、生物学的に活性なバリアント中のアミノ酸残基の１つまたは複数は、野生型配列中の対応する位置において見出される天然に存在する残基とは異なる天然に存在する残基とすることができり。換言すれば、生物学的に活性なバリアントは、１つまたは複数の、特に１つまたは２つの、アミノ酸置換を含むことができる。アミノ酸残基の置換、付加、または欠失を野生型配列の突然変異と称する場合がある。記載されるように、置換は、天然に存在するアミノ酸残基を、天然に存在しない残基または単に異なる天然に存在する残基で置き換えることができる。さらには、置換は保存的または非保存的置換を構成することができる。保存的アミノ酸置換としては、典型的には、以下の群内の置換が挙げられる：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリンおよびスレオニン；リジン、ヒスチジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。
ＡＳ－ＳＰＩＫの生物学的に活性なバリアントであるポリペプチドは、その配列が、対応する野生型ポリペプチドに類似または相同的である程度の点で特徴付けることができる。例えば、生物学的に活性なバリアントの配列は、野生型ポリペプチド中の対応する残基に対して少なくともまたは約８０％相同的（または同一）とすることができる。例えば、ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドの生物学的に活性なバリアントは、ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチド（配列番号：２、４もしくは６）またはそのホモログもしくはオルソログに対して少なくともまたは約８０％の配列相同性（例えば、少なくともまたは約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性）（または記載される同一性パーセンテージ）を有するアミノ酸配列を有することができる。
ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドの生物学的に活性なバリアントは、本発明の方法において有用であるために充分な生物学的活性を保持することになる。生物学的に活性なバリアントは、プロテアーゼ活性の阻害剤として機能するために充分な活性を保持することになる。生物学的活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの切断アッセイまたは機能アッセイが挙げられるがそれに限定されない当業者に公知の方法において評価することができる。
ポリペプチドは、例えば、組換え技法または化学合成を含む様々な方法により生成することができる。ポリペプチドが生成されると、それは、任意の所望の程度まで単離および精製することができる。例えば、逆相（好ましい）もしくは順相ＨＰＬＣ、またはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５などの多糖ゲル媒体でのサイズ排除もしくは分配クロマトグラフィーの後に、例えば凍結乾燥を使用することができる。最終ポリペプチドの組成は、標準的な手段によるペプチドの分解後のアミノ酸解析、アミノ酸シークエンシング、またはＦＡＢ－ＭＳ技法により確認されてもよい。ポリペプチドの酸塩を含む塩、エステル、アミド、およびアミノ基のＮ－アシル誘導体は当該技術分野において公知の方法を使用して調製されてもよく、そのようなペプチドは本発明の文脈において有用である。
ＡＳ－ＳＰＩＫ複合体もまた提供される。本発明の実施形態によるＡＳ－ＳＰＩＫ複合体は、ＡＳ－ＳＰＩＫ、およびＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはその断片に特異的または優先的に結合する、本明細書に記載されるような本発明の抗体を含む。断片は、特に、少なくとも２３アミノ酸（配列番号：６）、好ましくは少なくとも１０アミノ酸の長さを有し、より好ましくは、配列番号：６の少なくとも７番目（それを含む）から２３番目のアミノ酸を有し、よりいっそう好ましくは、配列番号：６の少なくとも８番目（それを含む）から１７番目のアミノ酸を有する。抗体は、上記の抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体のいずれかとすることができる。ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはその断片は、上記のＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはその断片とすることができる。一部の実施形態では、抗体は、抗ＡＳ－ＳＰＩＫモノクローナル抗体、ＩＭＣＡ１８、ＩＭ－ＣＡ２２、ＩＭ－ＣＡ４６またはＩＭＣＢ－７７（ＶＬおよびＶＨ配列は配列データに列記される）である。一部の実施形態では、ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドは、配列番号：２または配列番号：６のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の相同性（または同一性）を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
ＩＭ－ＣＡ１８、ＩＭ－ＣＡ２２、ＩＭ－ＣＡ４６またはＩＭ－ＣＢ７７などの抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体の特異的結合は、ある特定の条件下でＡＳ－ＳＰＩＫまたはＡＳ－ＳＰＩＫペプチドとの免疫複合体を形成することができる。複合体は、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ試験を使用する、さらなる分析のために溶液から沈殿させることができる。キャリアとして第２の抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体を固定化した９６ウェルプレートを使用して、免疫複合体をプレートによって捕捉することができる。複合体中の抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）などのレポーターを用いて標識される場合、形成されたＡＳ－ＳＰＩＫ免疫複合体の量を次に決定することができる。図１０は、試験溶液中の抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体／ＡＳ－ＳＰＩＫ複合体の量を決定するために使用したＥＬＩＳＡの結果を提供する。ＡＳ－ＳＰＩＫ免疫複合体を、ウエスタンブロット解析のために第２の抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体と連結したアガロースビーズにより捕捉することもでき、図９はＡＳ－ＳＰＩＫ複合体のウエスタンブロット解析の結果を示す。
核酸
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および核酸アナログを含有するＤＮＡ（またはＲＮＡ）を含む、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を指すために本明細書において交換可能に使用され、これらのいずれも本発明のポリペプチドをコードする場合があり、またこれらの全ては本発明により包含される。ポリヌクレオチドは本質的に任意の三次元構造を有することができる。核酸は、二本鎖または一本鎖（すなわち、センス鎖もしくはアンチセンス鎖）とすることができる。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびその部分、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、ならびにプライマーだけでなく、核酸アナログも挙げられる。本発明の文脈において、核酸は、天然に存在するＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはその生物学的に活性なバリアントの断片をコードすることができる。核酸の非限定的な例としては、配列番号：１またはその生物学的活性断片、および配列番号：３または配列番号：５またはその生物学的活性断片がそれぞれ挙げられる。断片は、少なくとも６６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５４ヌクレオチドの長さを有してもよく、より好ましくは、配列番号：３の２８番目から１０５番目（それを含む）のヌクレオチドを有し、よりいっそう好ましくは、配列番号：３の４９番目から１０５番目（それを含む）のヌクレオチドを有する。Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１；１３４（４）：３９８－４０８。
「単離された」核酸は、天然に存在するゲノム中で通常そのＤＮＡ分子のすぐ脇に見出される核酸配列の少なくとも１つが除去されている、または存在しないならば、例えば、天然に存在するＤＮＡ分子またはその断片とすることができる。したがって、単離された核酸としては、他の配列から独立した別々の分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、化学合成された核酸、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により産生されたｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片）が挙げられるがそれに限定されない。単離された核酸はまた、ベクター、自律複製プラスミド、ウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を指す。加えて、単離された核酸は、ハイブリッドまたは融合核酸の部分であるＤＮＡ分子などの操作された核酸を含むことができる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー、またはゲノムＤＮＡ制限消化物を含有するゲルスライス内で多く（例えば、数十、または数百～数百万）の他の核酸の中に存在する核酸は単離された核酸ではない。
単離された核酸分子は、本明細書に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含有する単離された核酸を得るために使用することができる、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法により産生することができる。ＰＣＲは、トータルゲノムＤＮＡまたはトータル細胞ＲＮＡからの配列を含む、ＤＮＡだけでなくＲＮＡから特定の配列を増幅するためにも使用することができる。一般的に、目的の領域の末端からまたはそれを越えた配列情報が、増幅される鋳型の反対鎖に対して配列が同一または類似のオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために用いられる。部位特異的なヌクレオチド配列改変を鋳型核酸に導入することができる様々なＰＣＲ戦略もまた利用可能である。
単離された核酸はまた、単一の核酸分子（例えば、ホスホロアミダイト技術を使用する３’→５’方向の自動化されたＤＮＡ合成を使用して）または一連のオリゴヌクレオチドのいずれかとして化学合成することができる。例えば、所望の配列を含有する長いオリゴヌクレオチド（例えば、＞５０～１００ヌクレオチド）の１つまたは複数のペアを合成することができ、各ペアは、オリゴヌクレオチドペアがアニールされた場合にデュプレックスが形成されるような相補性の短いセグメント（例えば、約１５ヌクレオチド）を含有する。ＤＮＡポリメラーゼを使用してオリゴヌクレオチドが伸長されて、オリゴヌクレオチドペア当たり単一の二本鎖核酸分子が結果としてもたらされ、それを次にベクターにライゲートすることができる。本発明の単離された核酸はまた、例えば、ＤＮＡをコードするＡＳ－ＳＰＩＫまたはＮＳ－ＳＰＩＫ（例えば、上記の式による）の天然に存在する部分の突然変異誘発によっても得ることができる。
２つの核酸またはそれらがコードするポリペプチドは、互いにある特定の程度の相同性または同一性を有するとして記載されることがある。例えば、ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドおよびその生物学的に活性なバリアントは、ある特定の程度の相同性または同一性を呈するとして記載されることがある。アライメントは、短いＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチド配列をＰｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＰＩＲ）サイト（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｒ．ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ．ｅｄｕ）に入れた後に、ＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）上の「ｓｈｏｒｔ ｎｅａｒｌｙ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムを用いた解析を行うことによりアセンブルされてもよい。
配列相同性または同一性を決定するために、例えば、全長にわたる核酸またはタンパク質配列のアライメント（グローバルアライメント）の実行を可能とするＢｉｏＥｄｉｔ（バージョン４．８．５、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、または上記のＡＬＩＧＮ－２などのコンピュータープログラムを使用して、クエリ核酸またはアミノ酸配列を１つまたは複数のそれぞれ対象核酸またはアミノ酸配列にアライメントすることができる。
ＢｉｏＥｄｉｔは、同一性、類似性および差異を決定することができるように、クエリと１つまたは複数の対象配列との最良の一致を算出し、そしてそれらをアライメントする。１つまたは複数の残基のギャップをクエリ配列、対象配列、または両方に挿入して配列アライメントを最大化することができる。核酸配列の迅速なペアワイズアライメントのために、以下のデフォルトのパラメーターが使用される：ワードサイズ：２；ウインドウサイズ：４；スコアリング方法：パーセンテージ；トップダイアゴナルの数：４；およびギャップペナルティ：５。核酸配列の多重アライメントのために、以下のパラメーターが使用される：ギャップオープニングペナルティ：１０．０；ギャップエクステンションペナルティ：５．０；およびウェイトトランジション：イエス。タンパク質配列の迅速なペアワイズアライメントのために、以下のパラメーターが使用される：ワードサイズ：１；ウインドウサイズ：５；スコアリング方法：パーセンテージ；トップダイアゴナルの数：５；ギャップペナルティ：３。タンパク質配列の多重アライメントのために、以下のパラメーターが使用される：ウェイトマトリックス：ｂｌｏｓｕｍ；ギャップオープニングペナルティ：１０．０；ギャップエクステンションペナルティ：０．０５；親水性ギャップ：オン；親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；残基特異的ギャップペナルティ：オン。出力は、配列間の関係性を反映する配列アライメントである。
クエリ配列と対象配列との相同性パーセントを決定するために、ＢｉｏＥｄｉｔは、最良アライメント中の同一性の数を比較される残基の数（ギャップ位置は除外される）で割り、結果に１００を掛ける。出力は、クエリ配列に対する対象配列の相同性パーセントである。相同性パーセント値は小数点以下第１位へと四捨五入される可能性があることが留意される。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、および７８．１４は７８．１に四捨五入されるが、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、および７８．１９は７８．２に四捨五入される。
本明細書に記載の核酸およびポリペプチドは「外因性」と称されることがある。「外因性」という用語は、核酸またはポリペプチドが組換え核酸構築物の部分である、もしくはそれによりコードされること、またはその天然の環境にないことを指し示す。例えば、外因性核酸は、別の種に導入された１つの種からの配列、すなわち、異種核酸である可能性がある。典型的には、そのような外因性核酸は、組換え核酸構築物を介して他の種へと導入される。外因性核酸はまた、生物にとって天然でありかつその生物の細胞に再導入された配列である可能性もある。天然配列を含む外因性核酸は、多くの場合、外因性核酸に連結された非天然配列、例えば、組換え核酸構築物中の天然配列の脇にある非天然の調節配列の存在により天然に存在する配列から区別される可能性がある。加えて、安定的に形質転換された外因性核酸は、典型的には、天然配列が見出される位置以外の位置において組み込まれる。
組換え構築物もまた本明細書において提供され、ＡＳ－ＳＰＩＫを発現させるためにそれを使用して細胞を形質転換することができる。組換え核酸構築物は、特定の細胞中でＡＳ－ＳＰＩＫまたはＮＳ－ＳＰＩＫを発現するために好適な調節領域に作動可能に連結されたＡＳ－ＳＰＩＫまたはＮＳ－ＳＰＩＫ配列をコードする核酸を含む。多数の核酸が特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができることが理解される。遺伝コードの縮重は当該技術分野において周知である。多くのアミノ酸について、アミノ酸のコドンとして機能を果たす１つより多くのヌクレオチドトリプレットがある。例えば、ＡＳ－ＳＰＩＫまたはＮＳ－ＳＰＩＫのコーディング配列におけるコドンは、特定の生物のための適切なコドンバイアス表を使用して、その生物において最適な発現が得られるように改変することができる。
本明細書に記載の核酸などの核酸を含有するベクターもまた提供される。「ベクター」は、挿入されたセグメントの複製をもたらすように別のＤＮＡセグメントが挿入される場合があるプラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンである。一般的に、ベクターは、適切な制御エレメントと関連付けられた場合に複製する能力を有する。好適なベクター骨格としては、例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、ＢＡＣ、ＹＡＣ、またはＰＡＣなどの当該技術分野においてルーチンに使用されるものが挙げられる。「ベクター」という用語は、クローニングおよび発現ベクターだけでなく、ウイルスベクターおよび組込みベクターも含む。「発現ベクター」は、調節領域を含むベクターである。本明細書に記載の核酸配列を発現するために多様な宿主／発現ベクターの組合せを使用してもよい。好適な発現ベクターとしては、プラスミド、ならびに、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、およびレトロウイルスに由来するウイルスベクターが挙げられるがそれに限定されない。
本明細書において提供されるベクターはまた、例えば、複製起点、スキャフォールド取付け領域（ｓｃａｆｆｏｌｄ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ；ＳＡＲ）、および／またはマーカーも含むことができる。マーカー遺伝子は、宿主細胞に選択可能な表現型を付与することができる。例えば、マーカーは、殺傷剤抵抗性、例えば、抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、またはハイグロマイシン）への抵抗性を付与することができる。上述したように、発現ベクターは、発現されるポリペプチドのマニピュレーションまたは検出（例えば、精製または局在性）を促進するために設計されたタグ配列を含むことができる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ－ｍｙｃ、ヘマグルチニン、またはＦｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）配列などのタグ配列は、典型的には、コードされるポリペプチドとの融合物として発現される。そのようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかを含む、ポリペプチド内の任意の位置に挿入することができる。
追加の発現ベクターとしてはまた、例えば、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントを挙げることができる。好適なベクターとしては、ＳＶ４０および公知の細菌プラスミドの誘導体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ－Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＭＢ９およびその誘導体、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ファージ１の多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３および線維状一本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、例えば、２μプラスミドまたはその誘導体、真核細胞において有用なベクター、例えば、昆虫または哺乳動物細胞において有用なベクター；プラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクター、例えば、ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を用いるように改変されたプラスミドなどが挙げられる。
ベクターはまた、調節領域も含むことができる。「調節領域」という用語は、転写または翻訳の開始および速度、ならびに転写または翻訳産物の安定性および／またはモビリティに影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節領域としては、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、核局在シグナル、ならびにイントロンが挙げられるがそれに限定されない。
本明細書において使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、核酸中の調節領域および転写される配列の位置付けであって、そのような配列の転写または翻訳に影響を及ぼすようなものを指す。例えば、コーディング配列をプロモーターの制御下とするために、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、典型的には、プロモーターの１～約５０ヌクレオチド下流に位置付けられる。プロモーターは、しかしながら、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチドほど上流または転写開始部位の約２，０００ヌクレオチドほど上流に位置付けることができる。プロモーターは、典型的には、少なくともコア（基底）プロモーターを含む。プロモーターはまた、エンハンサー配列、上流エレメントまたは上流活性化領域（ＵＡＲ）などの少なくとも１つの制御エレメントも含んでもよい。含まれるプロモーターの選択はいくつかの要因に依存し、該要因としては、効率、選択可能性、誘導可能性、所望の発現レベル、および細胞または組織優先的発現が挙げられるがそれに限定されない。プロモーターおよび他の調節領域をコーディング配列に対して適切に選択し、かつ適切に位置付けることによりコーディング配列の発現をモジュレ―トすることは当業者にとってルーチンである。
ＡＳ－ＳＰＩＫまたはＮＳ－ＳＰＩＫ核酸配列を含むベクターは、細胞、すなわち、原核または真核細胞、例えば、哺乳動物細胞による取込みを促進するような方法で配合することができる。有用なベクターシステムおよび配合物は上記されている。一部の実施形態では、ベクターは、特定の細胞種に組成物を送達することができる。しかしながら、本発明はそのように限定されず、また例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、リポソーム、リポプレックス、界面活性剤、およびパーフルオロ化学液を使用する、化学的トランスフェクションなどのＤＮＡ送達の他の方法もまた想定され、エレクトロポレーション、マイクロ注入、弾道粒子、および「遺伝子銃」システムなどの物理的送達方法もまた想定される。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドはまた、陽イオン性リポソーム、他の脂質含有複合体、および宿主細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介することができる他の高分子複合体などのマイクロ送達ビヒクルと共に使用されてもよい。別の送達方法は、発現された産物を細胞内に産生することができる一本鎖ＤＮＡ産生ベクターを使用する。
使用方法
本明細書に開示される組成物は、ＡＳ－ＳＰＩＫの発現により特徴付けられる障害の診断および／または処置のために一般的に、かつ様々に有用である。そのような障害としては、がん、ウイルス感染症、および炎症性障害が挙げられるがそれに限定されない。１つの顕著な例は肝臓がんである。他の非限定的な例としては、「がん」という用語の定義との関連で本明細書に記載したがんが挙げられる。したがって、本発明の態様は、前記がん（例えば、肝臓がん）を有する対象、または前記がんを発生するリスクがある対象においてがんを診断および／または処置する方法に関与する。「対象」、「患者」、および「個体」という用語は本明細書において交換可能に使用される。
一部の実施形態では、方法は、対象からの生物学的試験試料をＡＳ－ＳＰＩＫ抗体または抗原結合断片と接触させてＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体を生成すること；生物学的試験試料中のＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の濃度を検出すること；およびＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の濃度を参照値と比較して、対象が障害を有するまたはその障害を発生するリスクがあるかどうかを決定することに関与する。ある特定の実施形態では、方法は、生物学的試験試料をＳＰＩＫに結合する第１の抗体または抗原結合断片と接触させてＳＰＩＫ－抗体複合体を生成すること；ＳＰＩＫ－抗体複合体をＡＳ－ＳＰＩＫ抗体または抗原結合断片と接触させて生物学的試験試料中にＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体を生成すること；およびＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の濃度を参照値と比較して、対象が障害を有するまたはその障害を発生するリスクがあるかどうかを決定することを含む。そのような方法において利用することができる抗体のいくつかの非限定的な例は本明細書に記載されている。
肝臓がん
ＡＳ－ＳＰＩＫの発現により特徴付けられる障害の１つの顕著な例は肝臓がんである。肝臓がんは、肝臓への損傷または肝臓機能不全を結果としてもたらす広範な状態を包含する。肝臓がんは、例えば、感染性因子、疾患、外傷、もしくは遺伝学的条件、または感染性因子、疾患、外傷、および遺伝学的条件の組合せの結果としてもたらされる可能性がある。
肝臓がんは、原発性肝臓がん、例えば、肝細胞がん、胆管がん、血管肉腫、および肝芽腫などの異常な細胞増殖に関与する疾患を含む可能性がある。そのようながんは、疾患進行のあらゆるステージにおけるがん、例えば、非常に早期ステージ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ Ｃｌｉｎｉｃ Ｌｉｖｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（ＢＣＬＣ）ステージ０で、かつ腫瘍サイズ＜２ｃｍ）、早期ステージ（ＢＣＬＣステージＡ、腫瘍サイズ：２ｃｍ～５ｃｍ）、中期ステージ（ＢＣＬＣステージＢ、中間の腫瘍サイズ＞５ｃｍ）、後期ステージ（ＢＣＬＣステージＣおよびＤ、進行したステージ）、または転移ステージ（Ｐｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，ＨＰＢ ２００５；７（１）：３５－４１のＨＣＣ、ならびにＩＣＣ早期ステージ（ステージＩ、ＩＩおよびＩＩＩａ、腫瘍サイズ＜２ｃｍ）、中期ステージ（ステージＩＩＩｂおよびＩＩＩｃ、腫瘍サイズ≧２ｃｍ）、および後期ステージ（ステージＩＶ）のＩＣＣ（Ｆａｒｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ２０１１；１１７（１０）：２１７０－２１７７）を含む可能性がある。
肝臓がんはまた、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、およびＤ型肝炎などのウイルスにより引き起こされる感染性疾患により誘導される可能性がある。特定の肝炎ウイルスにかかわらず、そのような感染症は急性または慢性のいずれかである可能性がある。
肝臓がんはまた、肝臓損傷、例えば、肝硬変からも生じる可能性がある。肝臓の後期ステージ瘢痕化または線維症である硬変は、多くの形態の肝臓疾患および状態により引き起こされる可能性がある。硬変は、遺伝学的状態、例えば、ヘモクロマトーシス、嚢胞性線維症、ウィルソン病、および自己免疫障害の結果として起こる可能性がある。硬変はまた、肝炎ウイルス感染症およびアルコール摂取からも生じる可能性がある。
肝臓がんはまた、アルコール性肝臓疾患、脂肪肝などの肝臓における異常な脂肪含有量に関する障害、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪症、および肝臓線維症が挙げられるがそれに限定されない他の疾患により引き起こされる可能性がある。
生物学的試料
「生物学的試料」、「試験試料」または「試料」は、患者から得られるまたは患者に由来する試料を指す。試料は例えば体液試料とすることができる。例示的な体液試料としては、血液、血清、血漿、尿、唾液、精液、糞便、痰、脳脊髄液、涙液、粘液、羊水、またはその任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、生物学的試料は組織試料とすることができる。例示的な組織試料としては、肝臓生検検体などの生検検体、または患者の細胞から調製された初代細胞培養検体、または初代培養物からの上清が挙げられる。
イムノアッセイ
本発明の態様は、試験試料中のＡＳ－ＳＰＩＫの存在または非存在を検出するために使用することができる診断アッセイ方法、例えば、診断イムノアッセイを含む。ＡＳ－ＳＰＩＫの検出のために使用されるイムノアッセイフォーマットは、様々な方法において構成することができる。イムノアッセイは、均質および不均質アッセイ、競合および非競合アッセイ、直接および間接アッセイ、ならびに「サンドイッチ」アッセイを含むことができる。有用なフォーマットとしては、酵素イムノアッセイ、例えば、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫アッセイ（ＣＬＩＡ）、電気化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光、蛍光異方性、免疫沈降、平衡透析、免疫拡散、イムノブロッティング、凝集、発光近接アッセイ、および比濁分析が挙げられるがそれに限定されない。
フォーマットにかかわらず、生物学的試料は、本発明の抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体と接触させられる。一部の実施形態では、生物学的試料は、固体支持体に固定化され得る。一部の実施形態では、生物学的試料は、固体支持体に固定化された本発明の抗ＳＰＩＫ抗体と接触させられる。固体支持体は、例えば、プラスチック表面、ガラス表面、紙もしくは繊維表面、または粒子の表面とすることができる。より特異的には、支持体は、マイクロプレート、ビーズ、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、多孔性膜、非多孔性膜を含むことができる。基材の組成は変更することができる。例えば、基材または支持体は、ガラス、セルロース系の材料、熱可塑性ポリマー（ポリエチレン、ポリプロピレン、もしくはポリエステルなど）、粒子状物質（例えば、ガラスもしくは様々な熱可塑性ポリマー）から構成される焼結構造物、またはニトロセルロース、ナイロン、もしくはポリスルホンから構成されるキャストされた膜フィルムを含んでもよい。全般的な実施形態では、基材は、抗体またはポリペプチドを固定化することができる任意の表面または支持体であってもよく、これには、固体支持体（例えば、ガラス（ガラススライドもしくはコーティングされたプレートなど）、シリカ、プラスチックもしくは誘導化プラスチック、常磁性もしくは非磁性金属）、半固体支持体（例えば、ポリマー材料、ゲル、アガロース、もしくは他のマトリックス）、および／または多孔性支持体（例えば、フィルター、ナイロンもしくはニトロセルロース膜もしくは他の膜）のうちの１つまたは複数が含まれる。一部の実施形態では、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリグリシジルメタクリレート、アミノ化またはカルボキシル化ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリアミド、およびポリ塩化ビニルを含む合成ポリマーを基材として使用することができる。
一部の実施形態では、イムノアッセイフォーマットは２抗体「サンドイッチ」アッセイとすることができる。生物学的試料は、固体支持体、例えば、マイクロタイタープレートに固定化された本発明の抗ＳＰＩＫ抗体と接触させられる。試料および第１の抗体は、特異的結合およびＳＰＩＫ－抗体複合体の形成に有利に働く条件下でインキュベートされる。接触ステップ後に、生物学的試料の未結合の構成要素は除去される。次に、複合体は、第２の抗ＳＰＩＫ抗体と接触させられる。第２の抗体は、第１の抗体が結合したエピトープとは異なるＳＰＩＫエピトープに結合する。したがって、第１および第２の抗体は、ＳＰＩＫへの結合について互いに競合的に阻害しない。一部の実施形態では、第１の抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＳ－ＳＰＩＫの両方に存在するエピトープ、すなわち、抗原決定基を認識することができる。我々はそのような抗体を「汎ＳＰＩＫ」（ｐａｎ－ＳＰＩＫ）抗体と称することがある。代替的に、第１の抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫにのみ存在するエピトープを認識することができる。一部の実施形態では、第２の抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＳ－ＳＰＩＫの両方に存在するエピトープ、すなわち、抗原決定基を認識することができる。代替的に、第２の抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫまたはＮＳ－ＳＰＩＫのみに存在するエピトープを認識することができる。したがって、サンドイッチアッセイは、第１の抗体が汎ＳＰＩＫ抗体であり、かつ第２の抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに特異的に結合しないように構成することができる。代替的に、サンドイッチアッセイは、第１および第２の抗体の両方がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合しかつＮＳ－ＳＰＩＫに特異的に結合しないように構成することができる。
抗体結合は、様々な方法で測定することができる。例えば検出可能な標識により生成されたシグナルは、複合体形成と関連付けられるシグナル、例えば、蛍光シグナル、発光シグナル、またはリン光シグナル、または放射性シグナルの測定を可能とする光学スキャナーまたは他の画像取得デバイスおよびソフトウェアを使用して解析および適用可能な場合には定量化することができる。検出可能なシグナルを測定するための例示的な計測装置としては、マイクロプレートリーダー、蛍光高度計、分光光度計、およびガンマカウンターを挙げることができるがそれに限定されない。
参照試料
生物学的試料中のＡＳ－ＳＰＩＫのレベルは、参照試料のそれと比較することができる。標準的な参照レベルは、典型的には、個体の集団に由来する平均ＡＳ－ＳＰＩＫレベルを表す。参照集団は、類似の年齢、身体サイズ、民族的背景または対象とする個体としての一般的健康状態の個体を含んでもよい。したがって、患者の試料中のＡＳ－ＳＰＩＫレベルは、１）肝臓がんを有することが既知であり、かつＡＳ－ＳＰＩＫを発現し、またその体液がＡＳ－ＳＰＩＫを含有する個体；２）肝臓がんを有さずかつその体液が低いレベルのＡＳ－ＳＰＩＫを含有する個体に由来する値と比較することができる。
一般に、ＡＳ－ＳＰＩＫの上昇したレベルは、対照試料において見出されるＡＳ－ＳＰＩＫのレベルまたは肝臓がんを有しない通常の健常個体の集団からの試料中に見出されるＡＳ－ＳＰＩＫの平均レベル（参照値）のいずれかより高い、好ましくは少なくとも１、２、３、４または５％高い、より好ましくは少なくとも５％高いＡＳ－ＳＰＩＫの任意のレベルである可能性がある。ＡＳ－ＳＰＩＫの低減したレベルは、対照試料中に見出されるＡＳ－ＳＰＩＫのレベルまたは肝臓がんを有する個体の集団からの試料中に見出されるＡＳ－ＳＰＩＫの平均レベルのいずれかより低いＡＳ－ＳＰＩＫの任意のレベルである可能性がある。通常の健常個体の集団からの試料中に見出されるＡＳ－ＳＰＩＫの平均レベルを決定するために任意の集団サイズを使用することができる。例えば、通常の健常個体の集団からの試料中のＡＳ－ＳＰＩＫの平均レベルを決定するために２～２５０、例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０またはより多くの個体の集団を使用することができ、より大きい試料集団からの測定では正確性はより高くなる。
一部の実施形態では、試料中のＡＳ－ＳＰＩＫの特定のレベルが対照試料またはより大きい集団と比べて上昇しているか否かを決定するために参照チャートを使用することができる。例えば、参照チャートは、対象とする個体として同じ年齢、民族的背景または全般的健康状態の健常個体において見出されるＡＳ－ＳＰＩＫの正常範囲を含有することができる。この参照チャートを使用して、試料中で測定されたＡＳ－ＳＰＩＫの任意のレベルは、対照試料と比べて、またはより大きい集団に由来する平均値と比べて低い、正常、または上昇しているとして分類することができる。「上昇したレベル」という用語は、参照レベルより高い、好ましくは少なくとも２％高い、より好ましくは少なくとも５％高いレベルとして定義される。
代替的に、または加えて、生物学的試料中のＡＳ－ＳＰＩＫのレベルは、１つまたは複数の追加の生物学的マーカー、例えば、その発現がＡＳ－ＳＰＩＫ発現から独立している別のマーカーのレベルに対して「正規化」することができる。すなわち、追加のマーカーのレベルは、同時または別々の機会のいずれかにおいて、ＡＳ－ＳＰＩＫのレベルと並行して評価することができる。追加のマーカーは、試料の調製、取扱いおよび貯蔵だけでなく、日毎のアッセイのばらつきに対しても内部対照として機能を果たすことができる。ＡＳ－ＳＰＩＫおよび追加のマーカーのレベルの値は比として表されてもよく、比は、参照試料または集団について得られた類似の比と比較されてもよい。有用な第２のマーカーはアルファ－フェトプロテインとすることができる。
対照試料
一部の実施形態では、方法は、標準的な参照セットの使用を含むことができる。参照セットは、精製されたＳＰＩＫポリペプチドまたはその断片の１つまたは複数の試料を含むことができる。複数の試料が使用される場合、これらは異なる濃度とすることができる。一実施形態では、参照セットは、５０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌおよび０ｎｇ／ｍｌの濃度のＡＳ－ＳＰＩＫである組換えＡＳ－ＳＰＩＫの６つの試料を含むことができる。組換えＡＳ－ＳＰＩＫは、ＩＭ－ＣＡ２２などの抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体または抗タグ抗体のいずれかを使用してアフィニティークロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製することができる。血液または他の体液中の参照値は変動し得る。しかしながら、当業者は、各々の集団の異なる体液中のＡＳ－ＳＰＩＫの平均レベルを決定し、かつ決定すべき肝臓がんを有する患者におけるＡＳ－ＳＰＩＫのレベルが参照値より充分に高い一方、検出すべき肝臓がんを患っていない患者または健常個体のレベルが各々の参照値より充分に低いことを確実にする各々の参照値を決定することができる。好ましい実施形態では、参照値は、通常の健常個体の集団からの試料中に見出されるＡＳ－ＳＰＩＫの平均レベルより約５％、より好ましくは約７％、よりいっそう好ましくは約１０％高い。生物学的試料中および対照試料中のＡＳ－ＳＰＩＫのレベルは同じ方法を介して決定され、それにより比較可能性が与えられることが留意される。例えばＡＳ－ＳＰＩＫレベルの絶対値は、上記のような組換えＡＳ－ＳＰＩＫを使用してキャリブレーション曲線を介して決定することができる。
一部の実施形態では、陽性対照は、真核細胞または細胞株により産生されたＡＳ－ＳＰＩＫの試料を含むことができる。例えば、有用な対照は、安定な細胞株Ｓ２－３からの１００ｎｇ／ｍｌのＡＳ－ＳＰＩＫを含有する培地とすることができる。これは、ＡＳ－ＳＰＩＫのＤＮＡ配列を、ＡＳ－ＳＰＩＫを過剰発現する人工的なプロモーターの制御下でＨＣＣ細胞の染色体の中へと挿入することにより本発明者らにより作製された。
本明細書に開示される方法は、肝臓がんを有することが疑われるまたはそのリスクがある患者における肝臓がんの検出において有用である。方法はまた、患者が肝細胞がんの寛解を経験するリスクがあるかどうかを決定するために、肝臓がん、例えば、肝細胞がんについて処置された患者からの試料の分析において使用することができる。方法はまた、処置、例えば、小分子薬物もしくは治療的抗体などの治療剤、化学療法、放射線療法または手術を用いる処置の過程をモニターして、処置の有効性を決定し、そして必要な場合には臨床医が処置を変更することを管理することを可能とするためにも使用することができる。方法はまた、患者から得られた生物学的試料、例えば、血液または血清試料中のＡＳ－ＳＰＩＫのレベルの調整、例えば増加と関連付けられる任意の障害を患っているまたはそのリスクがある患者の検出、モニタリング、または分析においても使用されてもよい。
本明細書に開示される方法は、他の標準的な診断方法、例えば、肝臓酵素もしくはアルファ－フェトプロテインの血清学的分析、超音波（超音波検査法）、コンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、血管造影、腹腔鏡検査法、または生検と組み合わせて使用することができる。
製品
本明細書に記載の組成物は、例えば、生物学的試料中のＡＳ－ＳＰＩＫの検出、特定、および定量化において使用するために、ラベルを付けた好適な容器中に包装することができる。「キット」とも称される製品は、本発明の抗体、培地、陽性対照として使用するための抗原の精製された試料、またはその任意の組合せを含んでもよい。キットに含まれる容器は、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的または優先的に結合するがＮＳ－ＳＰＩＫに対してはそうではない本発明の抗体を含む組成物を含むことができる。キットはまた、ＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＳ－ＳＰＩＫの両方に結合する抗体も含むことができる。試験試料および抗体を希釈または再構成するための好適な緩衝液もまた提供されてもよい。成分の一部は乾燥形態で提供されてもよく、また再構成を必要としてもよい。抗ＳＰＩＫ抗体は、アッセイデバイス、例えば、マイクロプレートにあらかじめ結合することができる。したがって、一実施形態では、ＡＳ－ＳＰＩＫの検出、特定および定量化のためのキットは、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体および汎ＳＰＩＫ抗体を含む。キットは、検出可能な標識を任意選択的に備えてもよい。
したがって、本発明の少なくとも１つの組成物、例えば抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体を含む、包装された製品（例えば、本明細書に記載の組成物の１つまたは複数を収容し、かつ貯蔵、輸送、または濃縮もしくは使用準備済みの濃度での販売のために包装された無菌の容器）およびキットもまた本発明の範囲内である。製品は、１つまたは複数の本発明の組成物を収容する容器（例えば、バイアル、ジャー、ボトル、またはバッグなど）を含むことができる。加えて、製品は、例えば、包装材料、使用説明書、シリンジ、送達デバイス、緩衝液、または診断もしくは処置が必要とされる状態を処置もしくはモニターするための他の対照試薬をさらに含んでもよい。
特定の種類のアッセイ用の試薬もまた本発明のキット中に提供することができる。したがって、キットは、ビーズの集団（例えば、凝集アッセイもしくはラテラルフローアッセイのために好適なもの）、またはプレート（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイのために好適なプレート）を含むことができる。他の実施形態では、キットは、ラテラルフローイムノアッセイデバイス、解析ローター（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｒｏｔｏｒ）、または電気化学的、光学的、もしくは光電子的センサーなどのデバイスを含む。ビーズの集団、プレート、およびデバイスは、イムノアッセイを行うために有用である。例えば、それらは、第１の剤－被解析物－第２の剤の複合体の形成を検出するために有用である可能性がある。
加えて、キットは、様々な希釈剤および緩衝液、標識されたコンジュゲートまたは特異的に結合した抗原もしくは抗体の検出のための他の剤、ならびに他のシグナル生成試薬（酵素基質など）、補因子および色原体を含むことができる。キットは、様々な濃度の１つまたは複数の参照試料、例えば、精製された組換えＡＳ－ＳＰＩＫを含むことができる。キットはまた、陽性対照、例えば、ＡＳ－ＳＰＩＫを過剰発現する細胞株からの細胞上清も含むことができる。キットの他の成分は、コーティング試薬、試験される抗原または被解析物に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル捕捉抗体、または抗体の２つもしくはより多くのカクテル、標準物質としてのこれらの抗原の精製または半精製された抽出物、モノクローナル抗体検出抗体、インジケーター分子が結合された抗マウス、抗イヌ、抗ニワトリ、または抗ヒト抗体、比色法による比較のためのインジケーターチャート、使い捨て用手袋、夾雑物除去の指示、アプリケータースティックまたは容器、試料準備用カップなどを含むことができる。一実施形態では、キットは、ペプチド－抗体複合体の形成を可能とする反応媒体を構成するために適切な緩衝液または他の試薬を含む。
そのようなキットは、対象が肝臓がんを有するまたはそのリスクがあるかどうかを臨床医が決定するための簡便で効率的な方法を提供する。したがって、ある特定の実施形態では、キットは、使用説明書をさらに含む。製品はまた、説明文（例えば、印刷されたラベルまたは挿入物または製品の使用を記載する他の媒体（例えば、オーディオテープもしくはビデオテープ））を含んでもよい。説明文は、容器に付属（例えば、容器に貼付）されていてもよく、アッセイを行うべき方式、そのための指示、および他の使用を記載することができる。
以下の実施例は、実例的な目的のためにのみ与えられ、いかなる意味でも本発明の範囲を限定することは意図されない。いくつかの実施形態が本開示において提供されるが、当然のことながら、開示される組成物および方法は本開示の趣旨または範囲から離れることなく多くの他の特定の形態で具現化されてもよい。本実施例は、実例的なものとして考えられるべきであり、限定的なものとして考えられるべきではなく、本発明は本明細書において与えられる詳細に限定されることは意図されない。変更、置換、および改変の様々な例が当業者により確認可能であり、それは本明細書に開示される趣旨および範囲から逸脱することなく為すことが可能である。
実施例１：ＡＳ－ＳＰＩＫとＮＳ－ＳＰＩＫとの構造的差異
ＨＰＬＣを使用してＡＳ－ＳＰＩＫをＳ２－３細胞の培地から精製し、ＮＳ－ＳＰＩＫを膵臓細胞の培地から精製した。１μｇの各タンパク質を５～１５％の勾配のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に流した。ＰＶＤＦ膜に転写した後、タンパク質をクマシーブルー染色により可視化した。図１は、膵臓細胞により産生されたＮＳ－ＳＰＩＫのサイズは約６．５ＫＤであることを示し、これは刊行された配列データと合致しており、ＮＳ－ＳＰＩＫ内の最初の２３アミノ酸が分泌の間に除去されることを示唆する（図２、下線を引いた配列）。Ｈｏｒｉｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １９８７；１４９（２）：６３５－６４１；Ｂａｒｔｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９７７；１７９（１）：１８９－１９９。対照的に、ＡＳ－ＳＰＩＫのサイズはＮＳ－ＳＰＩＫより大きく、約１０～１５ＫＤである。
ＡＳ－ＳＰＩＫの配列を決定するために、ＡＳ－ＳＰＩＫのバンドを膜から切断した。Ａｌｐｈａｌｙｓｅ Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）がエドマンＮ末端解析を行った。Ｓ２－３細胞分泌ＳＰＩＫのＮ末端におけるエドマン分解により予測される配列に下線を引いている。エドマン分解のデータは、ＡＳ－ＳＰＩＫのＮ末端がＳＰＩＫの残基２～６の配列（開始コドンの最初のメチオニンを除く）と一致することを示唆し（図２を参照のこと）、（Ｍ）Ｋ（リジン）で開始するＳＰＩＫのＮ末端における２３アミノ酸が分泌後のＡＳ－ＳＰＩＫにおいて保持されることを示唆した。ＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＳ－ＳＰＩＫの構造を図３において比較している。
実施例２：ＡＳ－ＳＰＩＫとＮＳ－ＳＰＩＫとのコンホメーションの差異
ＮＳ－ＳＰＩＫおよびＡＳ－ＳＰＩＫは共通の配列（残基２４～７９）を共有する（図３を参照のこと）。ＡＳ－ＳＰＩＫにおける追加のアミノ酸がタンパク質コンホメーションに効果を有するかどうかを解析した。抗体ＩＭ－ＢＡ１に対するＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＳ－ＳＰＩＫの結合活性を測定した。ＩＭ－ＢＡ１は本発明者らが開発したモノクローナル抗体であり、ＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＳ－ＳＰＩＫの両方に見出されるＣ１－Ｃ２領域に結合する（図３および図４）。９６ウェルプレートを、それぞれＳ２－３および膵臓細胞培地から部分的に精製されたＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＳ－ＳＰＩＫでコーティングした後、モノクローナル抗体ＩＭ－ＢＡ１と共にインキュベートした。３７℃で１時間のインキュベーション後、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．５％のＴｗｅｅｎ ２０を含む）を用いてプレートを３回洗浄した後、ウマペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いて標識された抗マウス抗体と共にインキュベートした。ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ｌＬ）とのインキュベーション後に顕色し、それをＯＤ４５０ｎｍ（光学密度）においてプレートリーダーにより測定した。図５に示すように、ＩＭ－ＢＡ１はＮＳ－ＳＰＩＫに強く結合したが、ＡＳ－ＳＰＩＫには弱く結合したかまたは全く結合しなかった。ＡＳ－ＳＰＩＫに結合するＩＭ－ＢＡ１の能力の強度はバックグラウンドレベルに類似しており（図５、バックグラウンド）、ＩＭ－ＢＡ１とＡＳ－ＳＰＩＫとの非常に弱い相互作用を示唆した。これらのデータは、ＡＳ－ＳＰＩＫのＮ末端の追加的長さは、タンパク質のコンホメーションの変化を引き起こし、またはＩＭ－ＢＡ１の標的エピトープへのアクセスを遮断することを示唆した。
実施例３：ＡＳ－ＳＰＩＫのみを認識しＮＳ－ＳＰＩＫを認識しない抗体を生成するための組換えタンパク質の設計
ＡＳ－ＳＰＩＫは、そのＮ末端において２３個の追加のアミノ酸を有するという点でＮＳ－ＳＰＩＫとは異なる（図３）。したがって、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体はこの領域を特異的または優先的に認識するはずである。そのような抗体を生成するために、この領域の異なるサブセットを含有する一連の組換えタンパク質を設計し、それを使用してマウスを免疫化した。組換えタンパク質は、１）ＧＳＴおよびＨｉｓなどのタグ、２）トロンビン切断部位（アミノ酸ＶＰＲＧＳ（配列番号：６６））を含むアミノ酸配列ＶＰＲＧＳＰＧＩＨＲＡ（配列番号：６５）だけでなく、配列番号：６のサブセットである２２アミノ酸までの異なる長さの配列などのリンカー、ならびに３）ＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＳ－ＳＰＩＫの共通の領域（配列番号：４）からなる（図６を参照のこと）。我々の研究は、ＡＳ－ＳＰＩＫの追加の２３ＡＡ断片におけるアミノ酸の一部は、ＡＳ－ＳＰＩＫのみを認識できる抗体の生成において不可欠であることを示唆する。
実施例４：ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的なモノクローナル抗体の産生
周知かつ標準的な手順によりモノクローナル抗体を生成した。簡潔に述べれば、以前に記載された組換えタンパク質を用いてマウスを免疫化した。血液を３または４回のインバースメント（ｉｍｂｕｒｓｅｍｅｎｔｓ）後にＥＬＩＳＡにより試験した。Ｓ２－３細胞からの部分的に精製されたＡＳ－ＳＰＩＫおよび膵臓細胞からのＮＳ－ＳＰＩＫを９６ウェルプレートを使用して捕捉した。血液をプレートと反応させ、ＨＲＰを用いて標識された抗マウス抗体とのプレートのインキュベーションにより顕色させ、基質ＴＭＢとの反応後に光学密度を測定した。ＡＳ－ＳＰＩＫのみに結合することができる（かつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない）抗体を産生したマウスを屠殺した。脾臓を次に骨髄腫細胞と融合させた。融合後、クローンをスクリーニングし、ＡＳ－ＳＰＩＫに結合する抗体を産生した陽性クローンを以前のようにＥＬＩＳＡにより評価および選択した。最後に、ＡＳ－ＳＰＩＫに対する高い親和性を有する最良のハイブリドーマを選んだ。この技術を使用して、２２個より多くのモノクローナル抗体を選択した。図７は、ＩＭ－Ｃ１８、ＩＭ－ＣＡ２２、ＩＭ－ＣＡ２９、ＩＭ－ＣＡ３４、ＩＭＣＡ４６およびＩＭ－ＣＡ７１と命名した６つのクローンを示し、これらは、ＡＳ－ＳＰＩＫへの高い結合活性を示したが、これらのＮＳ－ＳＰＩＫへの結合活性は陰性対照としてのバックグラウンドレベルに過ぎない（図７、陰性対照）。対照的に、ＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＳ－ＳＰＩＫの共通の区画に結合できる陽性対照、モノクローナル抗ＳＰＩＫ抗体ＭＡ８６は、両方のＳＰＩＫに対して高い結合活性を示した（図７、陽性対照）。
ＡＳ－ＳＰＩＫのみを認識するＩＭ－ＣＡ系列モノクローナル抗体の能力をイムノブロッティングによりさらに実証した。ここおよび後に提示するデータはＩＭ－ＣＡ２２からのものである。簡潔に述べれば、ＡＳ－ＳＰＩＫを分泌するＳ２－３細胞、およびＮＳ－ＳＰＩＫを分泌する膵臓細胞からの１５μｌ／ウェルの培養培地を５～１５％の勾配のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に流した。タンパク質を次にＰＶＤＦ膜に転写した。複製膜を次にモノクローナル抗ＳＰＩＫ抗体ＩＭ－ＣＡ２２またはＭＡ８６のいずれかとインキュベートした。３７℃で１時間のインキュベーション後、抗マウスＨＲＰ二次抗体を用いて膜を染色した。ＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅ ｋｉｔを使用して画像を可視化した。図８は、ＩＭ－ＣＡ２２はＳ２－３細胞により分泌されたＡＳ－ＳＰＩＫに結合したが、膵臓細胞により分泌されたＮＳ－ＳＰＩＫには結合しなかったことを示す（図８、ＩＭ－ＣＡ２２）。対照的に、ＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＡ－ＳＰＩＫの共通の領域を認識する抗体ＭＡ８６はＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＳ－ＳＰＩＫの両方に結合した（図８、Ｍ８６）。これらのデータは、モノクローナル抗体ＩＭ－ＣＡ２２はＡＳ－ＳＰＩＫに特異的に結合するがＮＳ－ＳＰＩＫに対してはそうではないことを示した。
実施例５：抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体の配列およびそれらの相同性
ＩＭ－ＣＡ系列の抗体（配列番号７～１４）などのＡＳ－ＳＰＩＫに特異的なモノクローナル抗体だけでなく、ＩＭ－ＢＡ１、ＩＭ－Ｓ１４などのＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＳ－ＳＰＩＫの共通の領域に結合する他の抗体の軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の可変領域の配列も決定した。さらに、ＣＢ７７などの、ＡＳ－ＳＰＩＫに対してはるかに弱い結合親和性を有するがＮＳ－ＳＰＩＫに対してはそうではない抗体の配列もまた決定した。上記の抗体の全てのＣＤＲのシークエンシングも行った。全ての記載した抗体の配列を、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより開発されたソフトウェアプログラム「ＢｉｏＥｄｉｔ」を使用して比較した。配列が少なくとも５０％相同的である場合、それらは顕著な類似性を有すると考えられる。ＩＭ－ＣＡ４６、ＩＭ－ＣＡ２９、ＩＭ－ＣＡ３４およびＩＭ－ＣＡ７１は同一の配列を有するので（多くは同じ親クローンからのものであり得る）、さらなる研究のためにＩＭ－ＣＡ４６を使用することのみを選択した。
可変領域のＣＤＲは抗体の特異性をほぼ決定し、したがって、研究用抗体のＣＤＲの相同性を研究した。結果は、ＡＳ－ＳＰＩＫのみに結合する抗体は、顕著な類似性を有するＶＨまたはＶＬのいずれかにおける少なくとも１つのＣＤＲを有することを示す。我々のデータはほぼＣＡ２２により生成されたので、比較用の参照としてＣＡ２２を使用した。結果は、ＣＡ１８はＣＡ２２とＣＤＲＬ２の５７％の相同性および６９％のＶＬフレーム相同性を有し、ＣＡ４６はＣＡ２２とそれぞれ６０％および５０％の相同性を有する２つのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２）ならびに６８％のＶＨフレーム相同性を有することを示す。これもまたＡＳ－ＳＰＩＫに結合するがＣＡ２２よりはるかに弱いＣＢ７７は、ＣＡ２２と５０％および４４％の相同性を有する２つのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２）ならびに６５％のＶＨフレーム相同性を有する（図１７、表１を参照のこと）。ＡＳ－ＳＰＩＫに結合しない抗体は、ＢＡ１およびＳ１４などのようにＳＰＩＫの共通の領域に結合するのか、それとも抗ＶＤ受容体などのようにＳＰＩＫに完全に無関連であるのかにかかわらず、ＣＤＲまたは可変領域のいずれにおいてもＣＡ２２と顕著な類似性を有しない（表１）。ＢＡ１、Ｓ１４はＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＳ－ＳＰＩＫの共通の領域に結合する結合する。抗ＶＤ受容体抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫまたはＮＳ－ＳＰＩＫのいずれにも結合せず、陰性対照として使用した。
実施例６：結合活性との抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体の相同性の関係性
可変領域中のＣＤＲは抗体の特異性を決定するので、研究用抗体のＣＤＲとＡＳ－ＳＰＩＫへの結合活性との関係性を研究した。ＣＡ２２と５７％の相同性のＣＤＲＬ２および６９％のＶＬフレーム相同性を有するＣＡ１８は、ＬＳ－ＳＰＩＫに対してほぼ同じ結合親和性を有し、ＣＡ２２と顕著な類似性（それぞれ６０％および５０％の相同性）を有する２つのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２）ならびに６８％のＶＨフレーム相同性を有するＣＡ４６はＡＳ－ＳＰＩＫに対して顕著な結合親和性を有する（ＣＡ２２の７０％）ことを見出した。ＣＤＲおよび可変鎖の相同性が低くなるとＡＳ－ＳＰＩＫに結合する親和性はより弱くなる。ＣＡ１８およびＣＡ４６と比較して、ＣＢ７７はＡＳ－ＳＰＩＫに対してＣＡ２２の２０％の親和性を有するに過ぎない。より重要なことに、ＣＡ２２とＣＤＲまたは可変領域の両方においていかなる顕著な類似性も有しない抗体は、ＢＡ１およびＳ１４などのようにＳＰＩＫの共通の領域に結合するか、または抗ＶＤ受容体などのようにＳＰＩＫに完全に無関連であるのかにかかわらず、ＡＳ－ＳＰＩＫに全く結合しない（表１）。これらの結果は、抗体のＣＤＲ相同性、恐らくは可変領域の相同性がＡＳ－ＳＰＩＫへの抗体の結合活性に高度に関係することを暗示する。
実施例７：ＡＳ－ＳＰＩＫの免疫沈降
免疫沈降アッセイは、ＩＭ－ＣＡ２２だけでなく、他の抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体もＡＳ－ＳＰＩＫと免疫複合体を特異的に形成することができることを示した。ＩＭ－ＣＡ２２をアガロースビーズに共有結合的に連結させた後、ビーズをＳ２－３細胞の培地からのＡＳ－ＳＰＩＫと共にインキュベートした。洗浄して非特異的なタンパク質を除去した後、アガロースビーズを遠心分離により収集した。ビーズに結合したタンパク質をｐＨ２．５の緩衝液処理によりビーズから解放させ、ＳＤＳ ＰＡＧＥにおいて分離した。沈殿したタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＳＰＩＫコンジュゲートを用いて膜を染色した。図８に示すように、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体ＩＭ－ＣＡ２２およびＡＳ－ＳＰＩＫの両方の存在下でＡＳ－ＳＰＩＫを沈殿させた（図９の３および４を参照のこと、重複）。ＡＳ－ＳＰＩＫまたはＩＭ－ＣＡ２２が省略された対照試料中ではＡＳ－ＳＰＩＫは検出されなかった（図９の１および２を参照のこと）。これらのデータは、ＩＭ－ＣＡ２２はＡＳ－ＳＰＩＫと複合体を形成することができ、該複合体を溶液から沈殿させることができることを指し示す。
実施例８：ＡＳ－ＳＰＩＫ複合体を検出するためのイムノアッセイ
ＡＳ－ＳＰＩＫを特異的に検出するためのＥＬＩＳＡアッセイを確立した。９６ウェルプレートを１００μｌ／ウェル（１μｇ／ｍｌ）のポリクローナル抗ＳＰＩＫ抗体でコーティングした。非特異的結合を１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて遮断した。プレートを次にＳ２－３細胞または膵臓細胞の１００μｌ／ウェルの培養培地と３７℃で２時間反応させて、ＡＳ－ＳＰＩＫまたはＮＳ－ＳＰＩＫが捕捉されることを確実にした。洗浄後、ＨＲＰを用いて標識されたモノクローナル抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体ＩＭ－ＣＡ２２と共にプレートを３７℃で１時間インキュベートして、抗体－抗原複合体（ＡＳ－ＳＰＩＫ複合体）を形成させた。洗浄して未結合のＩＭ－ＣＡ２２を除去した後、形成されたＡＳ－ＳＰＩＫ複合体を定量化するために使用した基質ＴＭＢを加えることにより、光学密度（ＯＤ４５０ｎｍ）で顕色させた。図１０は、ＩＭ－ＣＡ２２のみがＳ２－３の培地中でＡＳ－ＳＰＩＫとＡＳ－ＳＰＩＫ複合体を形成したことを示す（図１０、Ｓ２－３）。膵臓細胞培地中のＳＰＩＫの存在がウエスタンブロットにより確認されたが（図７、ＭＡ８６）、バックグラウンドレベルのみの光学密度（陰性対照と同じ）がＩＭ－ＣＡ２２を使用して膵臓細胞培地中に検出された（図１０、ＰａｎＣ１および対照）。
実施例９：ＡＳ－ＳＰＩＫ複合体の定量的検出
実施例８に記載の免疫アッセイを使用して、ＡＳ－ＳＰＩＫ複合体の濃度を定量的に決定した。簡潔に述べれば、９６ウェルプレートをポリクローナル抗ＳＰＩＫ抗体でコーティングした。非特異的結合を１％のＢＳＡを用いて遮断した。ＰＭＶプロモーターの制御下のＳＰＩＫ遺伝子全体をコードするベクターから生成され、親和性カラムにより精製された一連の組換えＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドを１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍの濃度範囲でプレートに加えた。ＨＲＰ標識されたＩＭ－ＣＡ２２抗体を加えることによりＡＳ－ＳＰＩＫ複合体を形成させ、基質ＴＭＢを加えることにより顕色させた。プレートリーダーを用いて光学密度を測定した。図１１に示すように、形成されたＡＳ－ＳＰＩＫ複合体の濃度はＡＳ－ＳＰＩＫの濃度に正比例した。この直線状の関係性は６０ｎｇ／ｍｌまでのＡＳ－ＳＰＩＫ濃度において維持された。グラフの直線部分における最良適合線のＲ値は０．９４であり、ＡＳ－ＳＰＩＫとＡＳ－ＳＰＩＫ複合体形成との相関を指し示した。
実施例１０：ＡＳ－ＳＰＩＫ複合体の定量的検出の感度および特異性
ＡＳ－ＳＰＩＫ複合体を検出するためのアッセイを開発した。アッセイは、１）ＨＰＲを用いて標識されたＩＭ－ＣＡ２２抗体（本発明の任意のＡＳ－ＳＰＩＫ抗体は、ＩＭ－ＣＡ２２の代わりにまたはＩＭ－ＣＡ２２に加えて使用することができる；アッセイは、本発明のＡＳ－ＳＰＩＫ抗体の混合物を含むことが可能である）；２）ＩＭ－ＣＡ２２との一致したペアの一部として作用する（異なる領域に結合し、ＩＭ－ＣＡ２２結合に干渉しない）ポリクローナルまたはモノクローナル抗ＳＰＩＫ抗体で固定化された９６ウェルプレート；３）６つの異なる濃度の精製された組換えＡＳ－ＳＰＩＫからなる標準的な参照セット；ならびに４）陽性対照としての１００μｌのＳ２－３細胞培地および陰性対照としての１００μｌの膵臓細胞培地を含んだ。我々のアッセイの感度を決定するために、精製された組換えＡＳ－ＳＰＩＫを、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの範囲に及ぶ一連の濃度において、固定化されたポリクローナル抗ＳＰＩＫ抗体を含有するプレートを用いてインキュベートした後、ＩＭ－ＣＡ２２コンジュゲートと反応させてＡＳ－ＳＰＩＫ複合体を形成させた。ＴＭＢを加えた後、光学密度を測定した。結果は、このアッセイを使用してＡＳ－ＳＰＩＫ複合体の推定される最小の検出可能な濃度が１．０ｎｇ／ｍｌであることを示した。線形曲線が回帰分析を用いて生成された（図１２）。試験の直線範囲はおおよそ１ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌであり、これは６つの独立した試験により確認され、図１２に示される。ＩＢＭソフトウェアＳＰＳＳ ２２（ＩＢＭ、Ａｒｍｏｎｋ，ＮＹ）を使用して信頼性を解析し、試験についてのクロンバックのアルファ値は０．９９８であり、優れた一貫性を示唆した。標準参照曲線の式は、ＡＳ－ＳＰＩＫ複合体（ｎｇ／ｍｌ）＝３１．５×ＯＤ４５０ｎｍ－６．８０、Ｒ＝０．９５である。
実施例１１：ＳＰＩＫ活性に対する抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体の効果
トリプシン基質ＢＭＬ（Ｂｏｃ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＭＣ、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を使用してＳＰＩＫ活性に対する本発明のＡＳ－ＳＰＩＫ抗体の効果を測定した。合成基質のトリプシン消化は蛍光色素（ＡＭＣ）を生成し、これは蛍光分光計により検出可能である。蛍光の強度はトリプシン活性のレベルと直接的に相関し、定量的に測定することができる。ＢＭＬのトリプシン消化へのＡＳ－ＳＰＩＫの添加は、トリプシン活性を遮断し、結果として生じる蛍光を低減する。図１３に示すように、２ｎｇ／ｍｌのトリプシン（Ｓｉｇｍａ、ＳＴ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）へのＳ２－３細胞の培地から精製された３ｎＭのＡＳ－ＳＰＩＫの添加は、６０分後に１μＭのＢＭＬのトリプシン消化を７０％阻害した（図１３、トリプシン単独およびＡＳ－ＳＰＩＫ）。トリプシン活性を回復させる抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体の能力を評価するために、３ｎＭのＡＳ－ＳＰＩＫを最初に１μｇ／ｍｌのＩＭ－ＣＡ２２と２０分間インキュベートした後、２ｎｇ／ｍｌのヒトトリプシンと室温で３０分インキュベートした。１μＭのＢＭＬを次に加え、３８０ｎｍでの励起および４４０ｎｍでの発光と共に０、２０、４０、６０、８０および１００分後に蛍光分光計により蛍光を測定した。式：ＡＳ－ＳＰＩＫ活性の阻害％＝（ΔＤ－ΔＳ）／（ΔＧ－ΔＳ）×１００を使用して、トリプシン消化が最大に達する６０分時にＡＳ－ＳＰＩＫ活性の阻害を算出した。ここで、ΔＧは、０分時および６０分時のトリプシン処理単独の間の吸光度の差異を表し、ΔＳは、０分時および６０分時のＡＳ－ＳＰＩＫの添加の間の吸光度の差異を表し、ΔＤは、０分時または６０分時のいずれかにおける、最初に抗ＡＳ－ＳＰＩＫとインキュベートされた後にトリプシンとインキュベートされたＡＳ－ＳＰＩＫの間の吸光度の差異を表す。図１３は、ＩＭ－ＣＡ２２は６０％より多くのトリプシン活性を回復させることができたことを示す。この結果は、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体がＡＳ－ＳＰＩＫ活性を阻害できることを暗示する。
実施例１２：ＨＣＣを有する患者におけるＡＳ－ＳＰＩＫの解析
ＨＣＣ患者からの合計で５８の血清検体ならびに健常個体、Ｂ型／Ｃ型肝炎患者、肝硬変患者、および膵炎患者からの８８の血清検体を実施例９に記載のアッセイ系を使用して試験し、２０μｌの各血清検体を希釈緩衝液で１００μｌに希釈し、解析のために使用した。各試料を３回ずつ試験した。各試料についてのＯＤ４５０ｎｍ値の平均および標準偏差（ＳＤ）を算出し、標準的な参照セットにより生成された標準曲線との比較によりＡＳ－ＳＰＩＫ複合体レベルを決定した。ＩＢＭソフトウェアＳＰＳＳ ２２を使用して統計解析を行った。ＡＳ－ＳＰＩＫレベルが対照対象と比較してＨＣＣ患者において有意に異なるかどうかを決定するために、一元配置分散分析を使用し、多重ペアワイズ比較を行った。ＨＣＣ患者の血清中のＡＳ－ＳＰＩＫの平均濃度は４３ｎｇ／ｍｌであり、対照においてはわずか２～１１ｎｇ／ｍｌであった。より特異的には、ＨＣＣ患者におけるＡＳ－ＳＰＩＫの平均レベル（４３ｎｇ／ｍｌ）は、肝炎、肝硬変、膵炎を有する患者および健常対象（それぞれ１１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２．３ｎｇ／ｍｌおよび３．２ｎｇ／ｍｌ）におけるより有意に高かった（Ｐ＜０．００１）。２２ｎｇ／ｍｌのカットオフ値を使用して、ＨＣＣについてのアッセイの感度および特異性はそれぞれ７９％および９４％であった（図１５）。患者の年齢、性別、およびＡＬＴなどの肝臓機能の亜群の間でＡＳ－ＳＰＩＫレベルの有意差はなかった（全てＰ＞０．０５）。これらの結果は、ＡＳ－ＳＰＩＫはＨＣＣの診断のための有用なバイオマーカーであることを示した。膵炎を有する患者の血清中のＮＳ－ＳＰＩＫの存在はＡＳ－ＳＰＩＫの検出を妨げなかった。これは、高レベルのＮＳ－ＳＰＩＫ（平均３７ｎｇ／ｍｌ、９５％ ＣＩ：２８．８～４４．２、ｔ検定）が膵炎を有する患者において観察されたが健常対照においては観察されなかったとはいえ、膵炎を有する患者および健常対象の血清中のＡＳ－ＳＰＩＫ複合体レベルは有意に異ならないという観察（Ｐ＞０．０５）によりサポートされた（図１４、膵炎および健常）。
実施例１３：非常に早期ステージのＨＣＣを有する患者におけるＡＳ－ＳＰＩＫの解析
我々のシステムがその非常に最初期のステージの肝細胞がん（ＢＣＬＣステージ０；サイズ＜２ｃｍ）を検出できるかどうかを解析した。非常に早期ステージのＨＣＣを有する患者からの１５の血清検体を実施例９に記載の方法を使用し、対照と比較した。実施例９に記載したものと同じ分散分析方法を使用して結果を解析した。図１６に示すように、非常に早期ステージのＨＣＣを有する患者の血清中のＡＳ－ＳＰＩＫのレベルの平均は３６ｎｇ／ｍｌ（９５％ ＣＩ：２３．４９～４８．３７）であった。このレベルは、対照群におけるレベルより有意に高かった（Ｐ＜０．００１）。これらの結果は、ＡＳ－ＳＰＩＫは非常に早期ステージのＨＣＣの診断のための有用なバイオマーカーであることを指し示す。
実施例１４：ＩＣＣを有する患者におけるＡＳ－ＳＰＩＫの解析
ＨＣＣおよびＩＣＣは共に肝臓がんの種類であり、ＳＰＩＫ ｍＲＮＡの過剰発現がＨＣＣおよびＩＣＣの両方において実証されたので（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００８；１０３（７）：１７１６－１７２０）、我々のシステムがＩＣＣを有する患者の血清中のＡＳ－ＳＰＩＫの増加を検出できるか否かの研究を開始した。表２は、定量的解析が、異なるステージのＩＣＣを有する５人全ての患者は血液中のＡＳ－ＳＰＩＫのレベルの有意な増加を有することを示唆することを示した。ＨＣＣ検出（実施例９）におけるようにカットオフ値として２２ｎｇ／ｍｌを使用する場合、５人全ての患者は陽性の結果を有する。試験した患者におけるＡＳ－ＳＰＩＫの平均値は６４ｎｇ／ｍｌ（９５％ ＣＩ、２４．８～１０４．１）であり、これは全ての対照群：Ｂ型／Ｃ型肝炎の１１ｎｇ／ｍｌ（９５％ ＣＩ：２．１４～１９．９８）（ｐ＜０．００１）、肝硬変の１０ｎｇ／ｍｌ（９５％ ＣＩ：４．１５～１６．１９）（Ｐ＜０．００１）、および健常対象の３．２ｎｇ／ｍｌ（９５％ ＣＩ：１．２２～５．２３）（ｐ＜０．００１）から有意に異なる。

Claims (20)

  1. ＡＳ－ＳＰＩＫ（配列番号：２）に特異的に結合し、かつＮＳ－ＳＰＩＫ（配列番号：４）に結合しない、単離された抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体、またはその抗原結合断片であって、
    （ａ）配列番号：１５のＣＤＲＨ１配列、配列番号：１９のＣＤＲＨ２配列、配列番号：２３のＣＤＲＨ３配列、配列番号：２７のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３１のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３５のＣＤＲＬ３配列；または、
    （ｂ）配列番号：１６のＣＤＲＨ１配列、配列番号：２０のＣＤＲＨ２配列、配列番号：２４のＣＤＲＨ３配列、配列番号：２８のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３２のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３６のＣＤＲＬ３配列；または、
    （ｃ）配列番号：１７のＣＤＲＨ１配列、配列番号：２１のＣＤＲＨ２配列、配列番号：２５のＣＤＲＨ３配列、配列番号：２９のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３３のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３７のＣＤＲＬ３配列；または、
    （ｄ）配列番号：１８のＣＤＲＨ１配列、配列番号：２２のＣＤＲＨ２配列、配列番号：２６のＣＤＲＨ３配列、配列番号：３０のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３４のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３８のＣＤＲＬ３配列
    を含む、
    抗体または抗原結合断片。
  2. 前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列がフレームワーク配列内に存在する、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
  3. 前記フレームワーク配列の少なくとも一部分がヒトコンセンサスフレームワーク配列を含む、請求項２に記載の抗体または抗原結合断片。
  4. （ａ）配列番号：７の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列および配列番号：１１の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列、又は、
    （ｂ）配列番号：８の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列および配列番号：１２の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列、又は、
    （ｃ）配列番号：９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列および配列番号：１３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列、又は、
    （ｄ）配列番号：１０の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列および配列番号：１４の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列
    を含む、請求項３に記載の抗体または抗原結合断片。
  5. （ａ）配列番号：７の配列重鎖可変領域配列および配列番号：１１の配列軽鎖可変領域配列、又は、
    （ｂ）配列番号：８の配列重鎖可変領域配列および配列番号：１２の配列軽鎖可変領域配列、又は、
    （ｃ）配列番号：９の配列重鎖可変領域配列および配列番号：１３の配列軽鎖可変領域配列、又は、
    （ｄ）配列番号：１０の配列重鎖可変領域配列および配列番号：１４の配列軽鎖可変領域配列を含む、請求項４に記載の抗体または抗原結合断片。
  6. 多重特異的である、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
  7. 二重特異的である、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
  8. モノクローナルである、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
  9. 対象がＡＳ－ＳＰＩＫの発現により特徴付けられる障害を有するまたはその障害を発生するリスクがあるかどうかを決定するための診断キットであって、診断キットは、
    （ａ）前記対象からの生物学的試験試料を、ＡＳ－ＳＰＩＫ（配列番号：２）に特異的に結合し、かつＮＳ－ＳＰＩＫ（配列番号：４）に結合しない、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体または抗原結合断片と接触させて、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体を生成することであって、
    抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体または抗原結合断片は、
    （ｉ）配列番号：１５のＣＤＲＨ１配列、配列番号：１９のＣＤＲＨ２配列、配列番号：２３のＣＤＲＨ３配列、配列番号：２７のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３１のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３５のＣＤＲＬ３配列；または、
    （ｉｉ）配列番号：１６のＣＤＲＨ１配列、配列番号：２０のＣＤＲＨ２配列、配列番号：２４のＣＤＲＨ３配列、配列番号：２８のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３２のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３６のＣＤＲＬ３配列；または、
    （ｉｉｉ）配列番号：１７のＣＤＲＨ１配列、配列番号：２１のＣＤＲＨ２配列、配列番号：２５のＣＤＲＨ３配列、配列番号：２９のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３３のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３７のＣＤＲＬ３配列；または、
    （ｉｖ）配列番号：１８のＣＤＲＨ１配列、配列番号：２２のＣＤＲＨ２配列、配列番号：２６のＣＤＲＨ３配列、配列番号：３０のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３４のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３８のＣＤＲＬ３配列
    を含む、
    生成すること；
    （ｂ）前記生物学的試験試料中の前記ＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の濃度を検出すること；および
    （ｃ）前記ＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の前記濃度を参照値と比較して、前記対象が前記障害を有するまたはその障害を発生するリスクがあるかどうかを決定すること
    のための指示書を含む、診断キット。
  10. 前記抗体または抗原結合断片が、検出可能な標識を含む、請求項９に記載の診断キット。
  11. 前記障害が肝臓障害である、請求項９に記載の診断キット。
  12. 前記肝臓障害が、肝細胞がんである、請求項１１に記載の診断キット。
  13. 前記肝臓障害が、肝内胆管がんである、請求項１１に記載の診断キット。
  14. 前記肝臓障害が、肝臓のウイルス感染症である、請求項１１に記載の診断キット。
  15. 前記肝臓障害が、炎症性肝臓障害である、請求項１１に記載の診断キット。
  16. 前記炎症性肝臓障害が、肝臓の硬変である、請求項１５に記載の診断キット。
  17. ＡＳ－ＳＰＩＫ（配列番号：２）に特異的に結合し、かつＮＳ－ＳＰＩＫ（配列番号：４）に結合せず、
    （ａ）配列番号：１５のＣＤＲＨ１配列、配列番号：１９のＣＤＲＨ２配列、配列番号：２３のＣＤＲＨ３配列、配列番号：２７のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３１のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３５のＣＤＲＬ３配列；または、
    （ｂ）配列番号：１６のＣＤＲＨ１配列、配列番号：２０のＣＤＲＨ２配列、配列番号：２４のＣＤＲＨ３配列、配列番号：２８のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３２のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３６のＣＤＲＬ３配列；または、
    （ｃ）配列番号：１７のＣＤＲＨ１配列、配列番号：２１のＣＤＲＨ２配列、配列番号：２５のＣＤＲＨ３配列、配列番号：２９のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３３のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３７のＣＤＲＬ３配列；または、
    （ｄ）配列番号：１８のＣＤＲＨ１配列、配列番号：２２のＣＤＲＨ２配列、配列番号：２６のＣＤＲＨ３配列、配列番号：３０のＣＤＲＬ１配列、配列番号：３４のＣＤＲＬ２配列、および配列番号：３８のＣＤＲＬ３配列
    を含む、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体、または抗原結合断片を含むキット。
  18. ＳＰＩＫに特異的に結合する抗体または抗原結合断片をさらに含む、請求項１７に記載のキット。
  19. ＡＳ－ＳＰＩＫ及びＮＳ－ＳＰＩＫの両方に特異的に結合する抗体または抗原結合断片をさらに含む、請求項１７に記載のキット。
  20. ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的に結合し、かつＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体、または抗原結合断片は、アッセイデバイスにあらかじめ結合されている、請求項１７に記載のキット。
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