JP6992200B2 - 新規甲状腺ペルオキシダーゼ自己抗体イムノアッセイ - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月２日出願の米国仮出願第６２／６９３，４３４号の優先権を主張し、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。

本明細書で開示するのは、対象の生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体を検出する方法および対象の甲状腺疾患を診断する方法である。

甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）は、甲状腺濾胞細胞の頂端膜に見いだされる膜結合型糖タンパク質である。ＴＰＯは、重要な甲状腺ホルモンＴ_３およびＴ_４を産生するために、ヨウ素イオンを酸化してサイログロブリンチロシン残基に付加する。ＴＰＯは、例えば、橋本病、グレーブス病、萎縮性甲状腺炎、原発性粘液水腫および女性における出産後甲状腺炎を含む甲状腺疾患における自己抗原でもある。抗ＴＰＯ自己抗体のレベル上昇は、甲状腺疾患の危険因子である。

患者の抗ＴＰＯ自己抗体を検出するための現在のイムノアッセイは、ヒトの遺体甲状腺組織から得られるヒト由来ＴＰＯを利用する。しかし、ヒト由来ＴＰＯは、費用がかかり、精製が難しくて収率が低く、ロット毎に著しく変動する可能性がある。現在のイムノアッセイは、複数の非ヒト二次抗体をさらに必要とする。

本明細書で開示するのは、対象の生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体を検出する方法である。この方法は、対象の生物学的サンプルを固体支持体、非標識組換えカニクイザル甲状腺ペルオキシダーゼ（ｒＴＰＯ）および標識カニクイザルｒＴＰＯとインキュベートすることを含んでいてもよい。抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在下で、標識カニクイザルｒＴＰＯ、非標識カニクイザルｒＴＰＯおよび固体支持体を含む複合体が形成される。この方法は、複合体を検出することをさらに含み、複合体の存在が生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在を示す。一部の実施形態では、この方法は本明細書で記載したような「抗原架橋」アッセイであってもよい。

対象の生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体を検出する方法であって、対象の生物学的サンプルを固体支持体、カニクイザルｒＴＰＯおよび抗ヒト二次抗体とインキュベートすることを含む方法も提供する。抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在下で、固体支持体、カニクイザルｒＴＰＯおよび抗ヒト二次抗体を含む複合体が形成される。この方法は、複合体を検出することをさらに含み、複合体の存在が生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在を示す。一部の実施形態では、この方法は本明細書で記載したような「ｒＴＰＯ捕捉」アッセイであってもよい。一部の実施形態では、この方法は本明細書で記載したような「ＩｇＧクラス捕捉」アッセイであってもよい。

対象の生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体を検出する方法であって、対象の生物学的サンプルを固体支持体、非標識抗ＴＰＯ抗体、カニクイザルｒＴＰＯおよび標識抗ＴＰＯ抗体とインキュベートする工程、および抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体を検出する工程であって、この検出が、固体支持体、非標識抗ＴＰＯ抗体、カニクイザルｒＴＰＯおよび標識抗ＴＰＯ抗体を含む複合体の形成の減少を分析することを含む、工程を含む方法もさらに提供する。生物学的サンプル中に抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体が存在すると、固体支持体、非標識抗ＴＰＯ抗体、カニクイザルｒＴＰＯおよび標識抗ＴＰＯ抗体を含む複合体の形成が減少する。複合体の存在は、生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在に反比例する。一部の実施形態では、この方法は本明細書で記載したような「競合」アッセイまたは「阻害」アッセイであってもよい。

本明細書でさらに開示するのは、対象の甲状腺疾患を診断する方法である。この方法は、対象の生物学的サンプルを固体支持体、非標識組換えカニクイザル甲状腺ペルオキシダーゼ（ｒＴＰＯ）および標識カニクイザルｒＴＰＯとインキュベートすることを含んでいてもよい。生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在下で、標識カニクイザルｒＴＰＯ、非標識カニクイザルｒＴＰＯおよび固体支持体を含む複合体が形成される。この方法は、複合体が形成されている場合、対象を甲状腺疾患と診断することをさらに含む。

対象の生物学的サンプルを固体支持体、カニクイザルｒＴＰＯおよび抗ヒト二次抗体とインキュベートすることを含む、対象の甲状腺疾患を診断する方法も提供する。生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在下で、固体支持体、カニクイザルｒＴＰＯおよび抗ヒト二次抗体を含む複合体が形成される。この方法は、複合体が形成されている場合、対象を甲状腺疾患と診断することをさらに含む。

対象の甲状腺疾患を診断する方法であって、対象の生物学的サンプルを固体支持体、非標識抗ＴＰＯ抗体、カニクイザルｒＴＰＯおよび標識抗ＴＰＯ抗体とインキュベートする工程、および固体支持体、非標識抗ＴＰＯ抗体、カニクイザルｒＴＰＯおよび標識抗ＴＰＯ抗体を含む複合体の形成が減少している場合、患者を甲状腺疾患と診断する工程を含む、方法もさらに提供する。生物学的サンプル中に抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体が存在すると、固体支持体、非標識抗ＴＰＯ抗体、カニクイザルｒＴＰＯおよび標識抗ＴＰＯ抗体を含む複合体の形成が減少する。

組換えによって生成された甲状腺ペルオキシダーゼ（ｒＴＰＯ）をコードするｃＤＮＡ分子のように、配列番号１のアミノ酸配列を含む組換えによって生成されたｒＴＰＯも開示する。

本明細書でさらに開示するのはキットである。一部の実施形態では、キットは、固体支持体、非標識カニクイザルｒＴＰＯおよび標識カニクイザルｒＴＰＯを含む。

あるいは、キットは、固体支持体、カニクイザルｒＴＰＯおよび抗ヒト二次抗体を含んでいてもよい。

一部の実施形態では、キットは、固体支持体、カニクイザルｒＴＰＯおよび抗ＴＰＯ抗体を含む。

添付の図面と併せて読むと、要約ならびに以下の詳細な説明はさらに理解される。開示された方法およびキットを例示する目的で、方法およびキットの実施形態例が図面に示されているが；方法およびキットは、開示した特定の実施形態に限定はされない。

本明細書では抗原架橋イムノアッセイと呼ばれる、開示された方法の一実施形態のための反応スキーム例を示した図である。 本明細書ではＩｇＧクラス捕捉イムノアッセイと呼ばれる、開示された方法の一実施形態のための反応スキーム例を示した図である。 本明細書ではｒＴＰＯ捕捉イムノアッセイと呼ばれる、開示された方法の一実施形態のための反応スキーム例を示した図である。 本明細書では競合／阻害イムノアッセイと呼ばれる、開示された方法の一実施形態のための反応スキーム例を示した図である。 ｒＴＰＯのロット毎の例示的な純度および免疫反応性の評価の結果を示した図である。パネルＡは、Ｇｅｌ Ｃｏｄｅ Ｂｌｕｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ２５５９０）で染色されたゲルを示している；パネルＢは、マウス抗ＴＰＯモノクローナル抗体とそれに続くヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ二次抗体で探索したニトロセルロース膜を示している。ブロットを発色させるために、４－クロロ－１－ナフトール（Ｓｉｇｍａ）を使用した。 ４つのｒＴＰＯ抗原ロットの例示的ｒＴＰＯ等電点評価の結果を示した図である。 脱グリコシル化されたｒＴＰＯに対するイムノアッセイ感度の例示的評価の結果を示した図である。図７ＡはｒＴＰＯ抗原架橋アッセイを示し、図７Ｂは様々な脱グリコシル化された成分を使用して構成されたヒトＩｇＧクラス捕捉アッセイを示す。「フック比」とは、２０，０００ＩＵ／ｍＬサンプルの相対発光単位（ＲＬＵ）を６２５ＩＵ／ｍＬの最高標準物のＲＬＵで除したものである。「ＢＫＧＤ」は、ａＴＰＯ陰性血清患者プールのバックグラウンドＲＬＵ、すなわち最低標準値を示す。「Ｓ０８／Ｓ０１」は、６２５ＩＵ／ｍＬの最高標準物のＲＬＵを最低標準値のＲＬＵで除したものを示す。「ＳＰ」は「固相」を意味し、「ＬＲ」は「Ｌｉｔｅ試薬」を意味し；「ｄｅ」は「脱グリコシル化」を指す。 脱グリコシル化されたｒＴＰＯに対するイムノアッセイ感度の例示的評価の結果を示した図である。図７ＡはｒＴＰＯ抗原架橋アッセイを示し、図７Ｂは様々な脱グリコシル化された成分を使用して構成されたヒトＩｇＧクラス捕捉アッセイを示す。「フック比」とは、２０，０００ＩＵ／ｍＬサンプルの相対発光単位（ＲＬＵ）を６２５ＩＵ／ｍＬの最高標準物のＲＬＵで除したものである。「ＢＫＧＤ」は、ａＴＰＯ陰性血清患者プールのバックグラウンドＲＬＵ、すなわち最低標準値を示す。「Ｓ０８／Ｓ０１」は、６２５ＩＵ／ｍＬの最高標準物のＲＬＵを最低標準値のＲＬＵで除したものを示す。「ＳＰ」は「固相」を意味し、「ＬＲ」は「Ｌｉｔｅ試薬」を意味し；「ｄｅ」は「脱グリコシル化」を指す。 抗ＴＰＯ抗体陽性疾患の患者サンプルの自己抗体と複合体を形成したｒＴＰＯの例示的特徴付けの結果を示しており、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）画分のクロマトグラムにプロットした相対発光単位（ＲＬＵ）である。 図８において長方形で示した画分からプールされた画分のＳＥＣ分析例のクロマトグラムを示した図である。 図９の単離画分Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦスペクトル例を示した図である。 図９の単離画分Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦスペクトル例を示した図である。 図９の単離画分Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦスペクトル例を示した図である。 図９の単離画分Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦスペクトル例を示した図である。 ネイティブＴＰＯおよび組換えＴＰＯ（「ｒＴＰＯ」）を使用したイムノアッセイ性能の分析結果を示した図である。 開示されたイムノアッセイを使用して実行された例示的実験の結果を示した図である：図１２Ａ）抗原架橋、図１２Ｂ）ＩｇＧクラス捕捉、図１２Ｃ）ｒＴＰＯ捕捉および図１２Ｄ）競合／阻害形式。各アッセイはＡＤＶＩＡ ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）システムを使用して実行された。標準物質の値に関連したＲＬＵ出力は、ＷＨＯ６６／３８７ヒト抗甲状腺ミクロソーム血清から指定した。 開示されたイムノアッセイを使用して実行された例示的実験の結果を示した図である：図１２Ａ）抗原架橋、図１２Ｂ）ＩｇＧクラス捕捉、図１２Ｃ）ｒＴＰＯ捕捉および図１２Ｄ）競合／阻害形式。各アッセイはＡＤＶＩＡ ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）システムを使用して実行された。標準物質の値に関連したＲＬＵ出力は、ＷＨＯ６６／３８７ヒト抗甲状腺ミクロソーム血清から指定した。 開示されたイムノアッセイを使用して実行された例示的実験の結果を示した図である：図１２Ａ）抗原架橋、図１２Ｂ）ＩｇＧクラス捕捉、図１２Ｃ）ｒＴＰＯ捕捉および図１２Ｄ）競合／阻害形式。各アッセイはＡＤＶＩＡ ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）システムを使用して実行された。標準物質の値に関連したＲＬＵ出力は、ＷＨＯ６６／３８７ヒト抗甲状腺ミクロソーム血清から指定した。 開示されたイムノアッセイを使用して実行された例示的実験の結果を示した図である：図１２Ａ）抗原架橋、図１２Ｂ）ＩｇＧクラス捕捉、図１２Ｃ）ｒＴＰＯ捕捉および図１２Ｄ）競合／阻害形式。各アッセイはＡＤＶＩＡ ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）システムを使用して実行された。標準物質の値に関連したＲＬＵ出力は、ＷＨＯ６６／３８７ヒト抗甲状腺ミクロソーム血清から指定した。

開示された方法およびキットは、本開示の一部を形成する添付の図面に関連して記載された以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができよう。開示された方法およびキットは、本明細書に記載および／または提示した特定の方法およびキットに限定されず、本明細書で使用した用語は、例として特定の実施形態を説明することを目的としているだけであり、主張した方法およびキットを限定することは意図していないことを理解されたい。

特に明記しない限り、可能性のある機構または作用機序または改善の理由に関する説明は例示のみを意味しており、開示された方法およびキットはそのような提案された機構または作用機序または改善の理由の正誤によって制約されるべきではない。

この文書全体を通して、説明は抗体を検出する方法および甲状腺疾患を診断する方法を意味している。本開示が抗体を検出する方法に関連する構成または実施形態を説明または主張する場合、このような構成または実施形態は甲状腺疾患を診断する方法に等しく適用可能である。同様に、本開示が甲状腺疾患を診断する方法に関連する構成または実施形態を説明または主張する場合、このような構成または実施形態は抗体を検出する方法に等しく適用可能である。

数値の範囲が本明細書に列挙または規定されている場合、その範囲はその終点ならびに範囲内の個々の整数および分数全てを含み、記載した範囲内の値の大きなグループの中の部分グループを同程度で形成するために、それらの終点ならびに内部の整数および分数の様々な可能性のある全組み合わせによって形成されるより狭い範囲の各も、より狭い範囲の各が明示的に列挙されているかのように含む。数値の範囲が記載された値よりも大きいと本明細書に記載されている場合であっても、範囲は有限であり、本明細書に記載されているような本発明の文脈内で操作可能な値によってその上限が制限される。数値の範囲が記載された値よりも小さいと本明細書に記載されている場合であっても、その範囲はゼロ以外の値によってその下限が制限される。本発明の範囲は、範囲を定義するときに列挙された特定の値に限定されることを意図するものではない。範囲は全て、包括的で組み合わせ可能である。

値を近似値として表している場合、先行詞「約」を使用することによって特定の値が別の実施形態を形成しているものと理解されたい。特定の数値については、文脈で明確に指示されていない限り、少なくともその特定の値を含む。

明確にするために本明細書では別個の実施形態の文脈で記載されている開示された方法およびキットのある種の機能は、単一の実施形態で組み合わせて提供することもできることを理解されたい。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明されている開示された方法およびキットの様々な構成は、別々にまたは任意の部分的組み合わせで提供することもできる。

本明細書で使用したように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には複数形が含まれる。

記載の態様に関連した様々な用語が、明細書および特許請求の範囲全体で使用されている。このような用語には、特に明記しない限り、当技術分野におけるそれらの通常の意味を与えられるべきである。その他の詳細に定義された用語は、本明細書で提供されている定義と一致する方法で解釈されるべきである。

「含む」という用語は、「本質的になる」および「からなる」という用語に包含される例を含むことを意図しており；同様に、「本質的になる」という用語は、「からなる」という用語に包含される例を含むことを意図している。

本明細書で開示するのは、対象の生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ（抗ＴＰＯ）抗体を検出する、および／または対象の甲状腺疾患を診断するイムノアッセイおよび方法である。

対象の生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体を検出する方法は：
ａ）対象の生物学的サンプルを：
固体支持体、
非標識組換えカニクイザル甲状腺ペルオキシダーゼ（ｒＴＰＯ）、および
標識カニクイザルｒＴＰＯ
とインキュベートする工程であって、
抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在下で、標識カニクイザルｒＴＰＯ、非標識カニクイザルｒＴＰＯおよび固体支持体を含む複合体が形成される、工程；および
ｂ）複合体を検出する工程であって、複合体の存在は、生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在を示す、工程
を含んでいてもよい。

一部の実施形態では、方法は「抗原架橋」イムノアッセイを含んでいてもよく、そのための反応スキーム例を図１に示す。抗ＴＰＯ抗体１０を有することが知られている、または有することが疑われる生物学的サンプルを、標識ｒＴＰＯ２０および非標識ｒＴＰＯが結合した固体支持体３０とインキュベートする。抗ＴＰＯ抗体１０が存在していない場合、標識ｒＴＰＯ２０は固体支持体に結合したり、その他の方法で相互作用したりしない。したがって、抗ＴＰＯ抗体が存在していない場合、標識ｒＴＰＯは溶液中に残存し、固体支持体を単離しても標識ｒＴＰＯの単離を引き起こさないであろう。抗ＴＰＯ抗体１０が生物学的サンプル中に存在している場合、抗ＴＰＯ抗体１０は固体支持体３０に結合した非標識ｒＴＰＯおよび標識ｒＴＰＯ２０に同時に結合し、それによって標識ｒＴＰＯ２０および固体支持体３０を連結し、固体支持体／標識ｒＴＰＯ複合体４０の形成を引き起こす。インキュベーションが行われる順番は、図１に例示した順番とは異なっていてもよいことを理解されたい。例えば、抗ＴＰＯ抗体１０を有することが知られている、または有することが疑われる生物学的サンプルを、最初に非標識ｒＴＰＯが結合した固体支持体３０とインキュベートし、続いて標識ｒＴＰＯ２０とインキュベートすることができる。あるいは、抗ＴＰＯ抗体１０を有することが知られている、または有することが疑われる生物学的サンプルを、非標識ｒＴＰＯが結合した固体支持体３０および標識ｒＴＰＯ２０と同時にインキュベートすることができる。

抗ＴＰＯ抗体１０を有することが知られている、または有することが疑われる生物学的サンプルは、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分または約１０分未満のような、反応が平衡に達することなく部分的な反応を達成するのに十分な時間、反応混合物中でインキュベートすることができる。標識ｒＴＰＯ２０を添加して、生物学的サンプルと約１分、約２分、約３分、約４分または約５分未満インキュベートすることができる。非標識ｒＴＰＯが結合した固体支持体３０を生物学的サンプルおよび標識ｒＴＰＯ２０の混合物に添加し、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分または約１０分未満のような、反応が平衡に達することなく部分的な反応を達成するのに十分な時間インキュベートすることができる。一部の実施形態では、インキュベーション工程は、合計で約１０分から約２０分で実行する。その後の検出は、約５分未満で実行することができる。アッセイに必要な時間の長さは、生物学的サンプル中の抗ＴＰＯ抗体（複数可）のレベルおよびｒＴＰＯに対する抗ＴＰＯ抗体（複数可）の親和性を含むいくつかの要因に基づいて変動し得ることを理解されたい。一部の実施形態では、生物学的サンプルと反応混合物とのインキュベーションは、１時間またはそれ以上のオーダーのような反応が平衡に達するのに十分な時間実行することができる。したがって、開示した方法は、任意の適切な時間の長さで実行することができる。

非標識ｒＴＰＯは、固体支持体に直接的または間接的に連結していてもよい。非標識ｒＴＰＯを固体支持体に直接的に連結するために適切な技術には、例えば、共有結合、吸着、非共有結合性相互作用またはそれらの組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、非標識ｒＴＰＯは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学物質または１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）ＮＨＳ化学物質によって、固体支持体に直接的に連結していてもよい。ｒＴＰＯを固体支持体に間接的に連結するための適切な技術には、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、リンカーまたはそれらの組み合わせを介した連結が含まれる。一部の実施形態では、非標識ｒＴＰＯは、ストレプトアビジンおよびビオチンを介して固体支持体に間接的に連結していてもよい。例えば、非標識ｒＴＰＯは、ビオチン化することができ、固体支持体はストレプトアビジンを含んでいてもよい。

固体支持体例には、カラムマトリックス材料、培養プレート、試験管、皿、フラスコ、マイクロタイタープレート、ビーズ／粒子、熱殺菌ホルマリンで（もしくはその他の化学的方法で）固定された原核もしくは真核細胞、顕微鏡スライド、ＡＣＬＡＲ（登録商標）フィルムもしくは任意のその他の光学的に透明なポリマーまたはそれらの組み合わせが含まれるが、限定はされない。固体支持体は、プラスチック、セルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、ガラス、ガラス繊維、ラテックスまたはそれらの組み合わせから、完全にまたは部分的に構成される。一部の実施形態では、固体支持体には磁性ビーズ／粒子が含まれる。一部の実施形態では、磁性ビーズ／粒子は常磁性粒子（ＰＭＰ）である。一部の実施形態では、磁性ビーズ／粒子はラテックス磁性粒子（ＬＭＰ）である。

標識は、検出可能なシグナルを生じるのに有用な、当業者に公知の任意の適切な標識であってもよい。適切な検出可能な標識には、酵素コンジュゲート（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼおよびβ－ガラクトシダーゼ）、蛍光プローブ、放射性同位元素、化学発光化合物、生物発光化合物またはそれらの組み合わせが含まれるが、限定はされない。一部の実施形態では、標識はアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）またはその類似体である。適切なＡＥ類似体には：ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、Ｎ－スルホプロピルジメチルアクリジニウムエステル（ＮＳＰ－ＤＭＡＥ）、高量子収率アクリジニウムエステル（ＨＱＹＡＥ、アクリジニウム、９－［［４－［［［６－［（２，５－ジオキソ－１－ピロリジニル）オキシ］－６－オキソヘキシル］アミノ］カルボニル］－２，６－ジメチルフェノキシ］カルボニル－２，７－ビス（３，６，９，１２，１５，１８－ヘキサオキサノナデカ－１－イルオキシ）－１０－（３－スルホプロピル）－，内部塩）、双性イオンアクリジニウムエステル（ＺＡＥ、アクリジニウム、９－［［４－［［［３－［［３－［［５－［（２，５－ジオキソ－１－ピロリジニル）オキシ］－１，５－ジオキソペンチル］アミノ］プロピル］メチル（３－スルホプロピル）アンモニオ］プロピル］アミノ］カルボニル－２，６－ジメチルフェノキシ］カルボニル－１０－（３－スルホプロピル）－，ビス（内部塩））、Ｎ－スルホプロピル－２－イソプロポキシジメチルアクリジニウムエステル（Ｉｓｏ－Ｄｉ－ＺＡＥ）、トリスルホプロピルアクリジニウムエステル（ＴＳＰ－ＡＥ）またはヘキサ（エチレン）グリコールリンカーを有するＮ－スルホプロピルジメチルアクリジニウムエステル（ＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥ）が含まれる。一部の実施形態では、標識カニクイザルｒＴＰＯにはｒＴＰＯ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥが含まれる。ｒＴＰＯ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥは約５０ｎｇ／ｍｌから約２μｇ／ｍｌで存在し得る。一部の実施形態では、ｒＴＰＯ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥは約２２０ｎｇ／ｍｌで存在し得る。

非標識ｒＴＰＯが結合した固体支持体および／または標識ｒＴＰＯは、例えば、リン酸緩衝液、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム、ソルビトール、スルフヒドリル修飾ウシ血清、またはそれらの任意の組み合わせ、変種もしくは同等物を含む緩衝液中に存在し得る。一実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液約１００ｍＭ、ＮａＣｌ約４００ｍＭ、ＥＤＴＡ約１．９ｇ／Ｌ、約０．２％（ｖ／ｖ）プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム約０．９ｇ／Ｌ、約１０％ソルビトールおよびスルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミン約１０ｇ／Ｌを含む。

対象の生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体を検出する方法であって：
ａ）対象の生物学的サンプルを：
固体支持体、
標識カニクイザルｒＴＰＯ、および
抗ヒト二次抗体
とインキュベートする工程であって、
抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在下で、固体支持体、カニクイザルｒＴＰＯおよび抗ヒト二次抗体を含む複合体が形成される、工程；および
ｂ）複合体を検出する工程であって、複合体の存在は、生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在を示す、工程
を含む方法も提供する。

抗ヒト二次抗体は、固体支持体に直接的または間接的に連結していてもよく、カニクイザルｒＴＰＯは標識を含んでいてもよい。一部の実施形態では、抗ヒト二次抗体は、グルタルアルデヒド固定によって固体支持体に直接的に連結していてもよい。

一部の実施形態では、方法は「ＩｇＧクラス捕捉」イムノアッセイを含んでいてもよく、そのための反応スキーム例を図２に示す。抗ＴＰＯ抗体１０を有することが知られている、または有することが疑われる生物学的サンプルを、標識ｒＴＰＯ２０および非標識抗ヒト二次抗体が結合した固体支持体５０とインキュベートする。抗ＴＰＯ抗体１０が存在していない場合、標識ｒＴＰＯ２０は固体支持体に結合したり、その他の方法で相互作用したりしない。したがって、抗ＴＰＯ抗体が存在していない場合、標識ｒＴＰＯは溶液中に残存し、固体支持体を単離しても標識ｒＴＰＯの単離を引き起こさないであろう。抗ＴＰＯ抗体１０が生物学的サンプル中に存在している場合、抗ＴＰＯ抗体１０は、固体支持体５０に結合した非標識抗ヒト二次抗体および標識ｒＴＰＯ２０に同時に結合し、それによって標識ｒＴＰＯ２０および固体支持体５０を連結し、固体支持体／標識ｒＴＰＯ複合体６０の形成を引き起こす。インキュベーションが行われる順番は、図２に例示した順番とは異なっていてもよいことを理解されたい。例えば、抗ＴＰＯ抗体１０を有することが知られている、または有することが疑われる生物学的サンプルを、最初に非標識抗ヒト二次抗体が結合した固体支持体５０とインキュベートし、続いて標識ｒＴＰＯ２０とインキュベートすることができる。あるいは、抗ＴＰＯ抗体１０を有することが知られている、または有することが疑われる生物学的サンプルを、非標識抗ヒト二次抗体が結合した固体支持体５０および標識ｒＴＰＯ２０と同時にインキュベートすることができる。

抗ＴＰＯ抗体１０を有することが知られている、または有することが疑われる生物学的サンプルは、反応混合物中で約１分、約２分、約３分、約４分、約５分または約１０分未満インキュベートすることができる。標識ｒＴＰＯ２０を添加して、生物学的サンプルと約１分、約２分、約３分、約４分または約５分未満インキュベートすることができる。非標識抗ヒト二次抗体が結合した固体支持体５０を生物学的サンプルおよび標識ｒＴＰＯ２０の混合物に添加し、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分または約１０分未満インキュベートすることができる。一部の実施形態では、インキュベーション工程は、合計で約１０分から約２０分で実行する。その後の検出は、約５分未満で実行することができる。アッセイに必要な時間の長さは、生物学的サンプル中の抗ＴＰＯ抗体（複数可）のレベルおよびｒＴＰＯに対する抗ＴＰＯ抗体（複数可）の親和性を含むいくつかの要因に基づいて変動し得ることを理解されたい。したがって、開示された方法は、任意の適切な時間の長さで実行することができる。

カニクイザルｒＴＰＯは、固体支持体に直接的または間接的に連結していてもよく、抗ヒト二次抗体は標識を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ｒＴＰＯは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学物質または１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）ＮＨＳ化学物質によって固体支持体に直接連結し得る。

一部の実施形態では、方法は「ｒＴＰＯ捕捉」イムノアッセイを含んでいてもよく、そのための反応スキーム例を図３に示す。抗ＴＰＯ抗体１０を有することが知られている、または有することが疑われる生物学的サンプルを、標識抗ヒト二次抗体７０および非標識ｒＴＰＯが結合した固体支持体３０とインキュベートする。抗ＴＰＯ抗体１０が存在していない場合、標識抗ヒト二次抗体７０は固体支持体に結合したり、その他の方法で相互作用したりしない。したがって、抗ＴＰＯ抗体が存在していない場合、標識抗ヒト二次抗体は溶液中に残存し、固体支持体を単離しても標識抗ヒト二次抗体の単離を引き起こさないであろう。抗ＴＰＯ抗体１０が生物学的サンプル中に存在している場合、抗ＴＰＯ抗体１０は、固体支持体３０に結合した非標識ｒＴＰＯおよび標識抗ヒト二次抗体７０に同時に結合し、それによって標識抗ヒト二次抗体７０および固体支持体３０を連結し、固体支持体／標識抗ヒト二次抗体複合体８０の形成を引き起こす。インキュベーションが行われる順番は、図３に例示した順番とは異なっていてもよいことを理解されたい。例えば、抗ＴＰＯ抗体１０を有することが知られている、または有することが疑われる生物学的サンプルは、最初に非標識ｒＴＰＯが結合した固体支持体３０とインキュベートし、続いて標識抗ヒト二次抗体７０とインキュベートすることができる。あるいは、抗ＴＰＯ抗体１０を有することが知られている、または有することが疑われる生物学的サンプルを、非標識ｒＴＰＯが結合した固体支持体３０および標識抗ヒト二次抗体７０と同時にインキュベートすることができる。

抗ＴＰＯ抗体１０を有することが知られている、または有することが疑われる生物学的サンプルは、反応混合物中で約１分、約２分、約３分、約４分、約５分または約１０分未満インキュベートすることができる。標識抗ヒト二次抗体７０を添加して、生物学的サンプルと約１分、約２分、約３分、約４分または約５分未満インキュベートすることができる。非標識ｒＴＰＯが結合した固体支持体３０を生物学的サンプルおよび標識抗ヒト二次抗体７０の混合物に添加し、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分または約１０分未満インキュベートすることができる。一部の実施形態では、インキュベーション工程は、合計で約１０分から約２０分で実行する。その後の検出は、約５分未満で実行することができる。アッセイに必要な時間の長さは、生物学的サンプル中の抗ＴＰＯ抗体（複数可）のレベルおよびｒＴＰＯに対する抗ＴＰＯ抗体（複数可）の親和性を含むいくつかの要因に基づいて変動し得ることを理解されたい。したがって、開示された方法は、任意の適切な時間の長さで実行することができる。

抗ヒト二次抗体またはカニクイザルｒＴＰＯは、当業者に公知の任意の適切な手段によって固体支持体に直接的または間接的に連結していてもよい。直接的連結のために適切な技術には、例えば、共有結合、吸着、非共有結合性相互作用またはそれらの組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、抗ヒト二次抗体は、グルタルアルデヒド固定によって固体支持体に直接的に連結していてもよい。間接的連結のための適切な手段には、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、リンカーまたはそれらの組み合わせを介した連結が含まれる。一部の実施形態では、抗ヒト二次抗体またはカニクイザルｒＴＰＯは、ストレプトアビジンおよびビオチンを介して固体支持体に間接的に連結していてもよい。例えば、非標識抗ヒト二次抗体または非標識ｒＴＰＯはビオチン化することができ、固体支持体はストレプトアビジンを含んでいてもよい。

固体支持体例には、カラムマトリックス材料、培養プレート、試験管、皿、フラスコ、マイクロタイタープレート、ビーズ／粒子、熱殺菌ホルマリンで（もしくはその他の化学的方法で）固定された原核もしくは真核細胞、顕微鏡スライド、ＡＣＬＡＲ（登録商標）フィルムもしくは任意のその他の光学的に透明なポリマーまたはそれらの組み合わせが含まれるが、限定はされない。固体支持体は、プラスチック、セルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、ガラス、ガラス繊維、ラテックスまたはそれらの組み合わせから、完全にまたは部分的に構成することができる。一部の実施形態では、固体支持体には磁性ビーズ／粒子が含まれる。一部の実施形態では、磁性ビーズ／粒子は常磁性粒子（ＰＭＰ）である。一部の実施形態では、磁性ビーズ／粒子はラテックス磁性粒子（ＬＭＰ）である。

抗ヒト二次抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥもしくはＩｇＭアイソタイプ、またはラクダ科の単一ドメイン抗体のような単一ドメイン形式であってもよい。一部の実施形態では、抗ヒト二次抗体は抗ヒトＩｇＧである。一部の実施形態では、抗ヒト二次抗体は、市販の抗ヒト二次抗体である。抗ＴＰＯ抗体に特異的なアプタマーも使用することができる。

標識は、検出可能なシグナルを生じるのに有用であることが当業者に公知の任意の適切な標識であってもよい。適切な検出可能な標識には、酵素コンジュゲート（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼおよびβ－ガラクトシダーゼ）、蛍光プローブ、放射性同位元素、化学発光化合物、生物発光化合物またはそれらの組み合わせが含まれるが、限定はされない。一部の実施形態では、標識はＡＥまたはその類似体である。適切なＡＥ類似体には、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、Ｎ－スルホプロピルジメチルアクリジニウムエステル（ＮＳＰ－ＤＭＡＥ）、高量子収率アクリジニウムエステル（ＨＱＹＡＥ）、双性イオンアクリジニウムエステル（ＺＡＥ）、Ｎ－スルホプロピル－２－イソプロポキシジメチルアクリジニウムエステル（Ｉｓｏ－Ｄｉ－ＺＡＥ）、トリスルホプロピルアクリジニウムエステル（ＴＳＰ－ＡＥ）またはヘキサ（エチレン）グリコールリンカーを含むＮ－スルホプロピルジメチルアクリジニウムエステル（ＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥ）が含まれる。一部の実施形態では、標識カニクイザルｒＴＰＯにはｒＴＰＯ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥが含まれる。ｒＴＰＯ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥは約５０ｎｇ／ｍｌから約２μｇ／ｍｌで存在し得る。一部の実施形態では、ｒＴＰＯ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥは約２２０ｎｇ／ｍｌで存在し得る。

非標識抗ヒト二次抗体または非標識ｒＴＰＯが結合した固体支持体および／または標識ｒＴＰＯまたは標識抗ヒト二次抗体は、例えば、リン酸緩衝液、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム、ソルビトール、スルフヒドリル修飾ウシ血清、またはそれらの任意の組み合わせ、変種もしくは同等物を含む緩衝液中に存在し得る。一実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液約１００ｍＭ、ＮａＣｌ約４００ｍＭ、ＥＤＴＡ約１．９ｇ／Ｌ、約０．２％（ｖ／ｖ）プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム約０．９ｇ／Ｌ、約１０％ソルビトールおよびスルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミン約１０ｇ／Ｌを含む。

対象の生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体を検出する方法であって、
ａ）対象の生物学的サンプルを固体支持体、非標識抗ＴＰＯ抗体、カニクイザルｒＴＰＯおよび標識抗ＴＰＯ抗体とインキュベートする工程；および
ｂ）生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体を検出する工程であって、この検出が、固体支持体、非標識抗ＴＰＯ抗体、カニクイザルｒＴＰＯおよび標識抗ＴＰＯ抗体を含む複合体の形成の減少を分析することを含む、工程
を含む方法も提供する。

複合体形成の減少の分析は、例えば、生物学的サンプルを含む反応混合物中の標識抗ＴＰＯ抗体からのシグナルの読み出しを、生物学的サンプルを含まない反応混合物中の標識抗ＴＰＯ抗体からのシグナルの読み出しと比較することによって実行することができる。生物学的サンプルを含む反応混合物からのシグナルの読み出しが、生物学的サンプルを含まない反応混合物からの読み出しよりも小さい場合、複合体の形成は減少している。形成される複合体の量は、生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在に反比例する。

一部の実施形態では、方法は「競合」イムノアッセイまたは「阻害」イムノアッセイを含んでいてもよく、そのための反応スキーム例を図４に示す。本明細書で使用したように、「競合」イムノアッセイとは、２つまたはそれ以上の結合分子が標的分子への結合について競合するイムノアッセイを意味する。結合分子は抗体であってもよく、例えば、標的分子は抗原であってもよい。結合分子は、例えば、抗原の同じエピトープ（複数可）への結合について競合し得る。「阻害」イムノアッセイとは、１つまたはそれ以上の結合分子が標的分子への１つまたはそれ以上のその他の結合分子の結合を阻害するイムノアッセイを意味する。結合分子は抗体であってもよく、例えば、標的分子は抗原であってもよい。阻害は、立体障害またはその他の公知の結合阻害機構によって引き起こされる可能性がある。特許請求するアッセイが「競合」または「阻害」イムノアッセイとして分類されるかどうかは、例えば、生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体および標識抗ＴＰＯ抗体によって認識されるｒＴＰＯエピトープに左右されるだろう。特許請求する方法は競争および阻害イムノアッセイの両方を包含し、したがって、「競争」および「阻害」という用語は特許請求する方法の範囲を限定するものではない。

競合／阻害イムノアッセイの一部の実施形態では、標識抗ＴＰＯ抗体およびｒＴＰＯは、反応混合物に添加する前に、予め形成された免疫複合体にすることができる。一部の実施形態では、非標識抗ＴＰＯ抗体および固体支持体は、反応混合物に添加する前に、予め形成された複合体にすることができる。一部の実施形態では、標識抗ＴＰＯ抗体、ｒＴＰＯ、非標識抗ＴＰＯ抗体、および固体支持体は、反応混合物に添加する前に、予め形成された複合体にしない。さらに他の実施形態では、標識抗ＴＰＯ抗体、ｒＴＰＯ、非標識抗ＴＰＯ抗体および固体支持体は全て、反応混合物に添加する前に、予め形成された複合体中に存在する。様々な成分が反応混合物に添加する前に１つまたはそれ以上の予め形成された複合体中にあるかどうかは、標識および非標識抗体ならびにｒＴＰＯの解離定数（Ｋ_Ｄ）に部分的に左右される。開示した方法は、反応混合物に添加された複合体形成の種類または程度に限定されない。生物学的サンプル、標識抗ＴＰＯ抗体、ｒＴＰＯ、非標識抗ＴＰＯ抗体および固体支持体は、任意の順番で反応混合物に添加することができることを理解されたい。

図４は、本明細書に記載された競合／阻害イムノアッセイの一実施形態例を開示しており、標識抗ＴＰＯ抗体１１０およびｒＴＰＯ１２０を非標識抗ＴＰＯ抗体が結合した固体支持体１３０とインキュベートする。生物学的サンプルの抗ＴＰＯ抗体１０が存在していない場合、標識抗ＴＰＯ抗体１１０はｒＴＰＯ１２０に結合し、次に、非標識抗ＴＰＯ抗体が結合した固体支持体１３０に結合するかまたは相互作用し、それによって、標識抗ＴＰＯ抗体１１０、ｒＴＰＯ１２０および固体支持体を含む複合体１４０を形成する。したがって、生物学的サンプルの抗ＴＰＯ抗体１０が存在していない場合、標識抗ＴＰＯ抗体１１０は固体支持体にカップリングされ、その単離は標識抗ＴＰＯ抗体１１０の単離を引き起こす。抗ＴＰＯ抗体１０が生物学的サンプル中に存在している場合、抗ＴＰＯ抗体１０はｒＴＰＯ１２０への結合について標識抗ＴＰＯ抗体１１０と競合するか、そうでなければ阻害し、またはｒＴＰＯ１２０への結合について固体支持体１３０に結合した非標識抗ＴＰＯ抗体と競合するか、そうでなければ阻害し、それによって、複合体が形成するのを妨害するか、または複合体１４０から標識抗ＴＰＯ抗体を変位させる。したがって、生物学的サンプルの抗ＴＰＯ抗体１０の存在下では、標識抗ＴＰＯ抗体１１０、ｒＴＰＯ１２０および固体支持体を含む複合体１４０の存在が減少する。

標識抗ＴＰＯ抗体１１０、非標識ｒＴＰＯ１２０および固体支持体１３０に結合した非標識抗ＴＰＯ抗体は、反応混合物中で約１分、約２分、約３分、約４分、約５分または約１０分未満インキュベートすることができる。抗ＴＰＯ抗体１０を有することが知られている、または有することが疑われる生物学的サンプルを添加して、反応混合物中で約１分、約２分、約３分、約４分、約５分または約１０分未満インキュベートすることができる。一部の実施形態では、インキュベーション工程は、合計で約１０分から約２０分で実行する。その後の検出は、約５分未満で実行することができる。アッセイに必要な時間の長さは、生物学的サンプル中の抗ＴＰＯ抗体（複数可）のレベルおよびｒＴＰＯに対する抗ＴＰＯ抗体（複数可）の親和性を含むいくつかの要因に基づいて変動し得ることを理解されたい。したがって、開示された方法は、任意の適切な時間の長さで実行することができる。

非標識抗ＴＰＯ抗体は、固体支持体に直接的または間接的にカップリングしていてもよい。非標識抗ＴＰＯ抗体を固体支持体に直接的にカップリングするために適切な技術には、例えば、共有結合、吸着、非共有結合性相互作用またはそれらの組み合わせが含まれる。非標識抗ＴＰＯ抗体を固体支持体に間接的にカップリングするための適切な手段には、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、リンカーまたはそれらの組み合わせを介した連結が含まれる。一部の実施形態では、非標識抗ＴＰＯ抗体は、ストレプトアビジンおよびビオチンを介して固体支持体に間接的にカップリングすることができる。例えば、非標識抗ＴＰＯ抗体はビオチン化することができ、固体支持体はストレプトアビジンを含んでいてもよい。標識および／または非標識抗ＴＰＯ抗体は、任意の公知の市販の抗ＴＰＯ抗体であってもよい。

固体支持体例には、カラムマトリックス材料、培養プレート、試験管、皿、フラスコ、マイクロタイタープレート、ビーズ／粒子、熱殺菌ホルマリンで（もしくはその他の化学的方法で）固定された原核もしくは真核細胞、顕微鏡スライド、ＡＣＬＡＲ（登録商標）フィルムもしくは任意のその他の光学的に透明なポリマーまたはそれらの組み合わせが含まれるが、限定はされない。固体支持体は、プラスチック、セルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、ガラス、ガラス繊維、ラテックスまたはそれらの組み合わせから、完全にまたは部分的に構成される。一部の実施形態では、固体支持体は磁性ビーズ／粒子を含む。一部の実施形態では、磁性ビーズ／粒子は常磁性粒子（ＰＭＰ）である。一部の実施形態では、磁性ビーズ／粒子はラテックス磁性粒子（ＬＭＰ）である。

標識は、検出可能なシグナルを生じるのに有用な、当業者に公知の任意の適切な標識であってもよい。適切な検出可能な標識には、酵素コンジュゲート（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼおよびβ－ガラクトシダーゼ）、蛍光プローブ、放射性同位元素、化学発光化合物、生物発光化合物またはそれらの組み合わせが含まれるが、限定はされない。一部の実施形態では、標識は、ＡＥまたはその類似体である。適切なＡＥ類似体には、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、Ｎ－スルホプロピルジメチルアクリジニウムエステル（ＮＳＰ－ＤＭＡＥ）、高量子収率アクリジニウムエステル（ＨＱＹＡＥ）、双性イオンアクリジニウムエステル（ＺＡＥ）、Ｎ－スルホプロピル－２－イソプロポキシジメチルアクリジニウムエステル（Ｉｓｏ－Ｄｉ－ＺＡＥ）、トリスルホプロピルアクリジニウムエステル（ＴＳＰ－ＡＥ）またはヘキサ（エチレン）グリコールリンカーを含むＮ－スルホプロピルジメチルアクリジニウムエステル（ＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥ）が含まれる。一部の実施形態では、標識抗ＴＰＯ抗体は、抗ＴＰＯ ＩｇＧ ＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥである。抗ｒＴＰＯ ＩｇＧ ＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥは約５０ｎｇ／ｍｌから約２μｇ／ｍｌで存在し得る。一部の実施形態では、抗ｒＴＰＯ ＩｇＧ ＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥは約４２０ｎｇ／ｍｌで存在し得る。

非標識抗ＴＰＯ抗体が結合した固体支持体および／または非標識ｒＴＰＯおよび／または標識抗ＴＰＯ抗体は、例えば、リン酸緩衝液、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム、ソルビトール、スルフヒドリル修飾ウシ血清、またはそれらの任意の組み合わせ、変種もしくは同等物を含む緩衝液中に存在し得る。一実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液約１００ｍＭ、ＮａＣｌ約４００ｍＭ、ＥＤＴＡ約１．９ｇ／Ｌ、約０．２％（ｖ／ｖ）プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム約０．９ｇ／Ｌ、ソルビトール約１０％およびスルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミン約１０ｇ／Ｌを含む。

対象の甲状腺疾患を診断する方法であって、対象の生物学的サンプルを固体支持体、非標識組換えカニクイザル甲状腺ペルオキシダーゼ（ｒＴＰＯ）および標識カニクイザルｒＴＰＯとインキュベートすることを含む方法もさらに開示する。生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在下で、標識カニクイザルｒＴＰＯ、非標識カニクイザルｒＴＰＯおよび固体支持体を含む複合体が形成される。この方法は、複合体が形成されている場合、対象を甲状腺疾患と診断することをさらに含む。

対象の生物学的サンプルを固体支持体、カニクイザルｒＴＰＯおよび抗ヒト二次抗体とインキュベートすることを含む、対象の甲状腺疾患を診断する方法も提供する。生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在下で、固体支持体、カニクイザルｒＴＰＯおよび抗ヒト二次抗体を含む複合体が形成される。この方法は、複合体が形成されている場合、対象を甲状腺疾患と診断することをさらに含む。

対象の甲状腺疾患を診断する方法であって、対象の生物学的サンプルを固体支持体、非標識抗ＴＰＯ抗体、カニクイザルＴＰＯおよび標識抗ＴＰＯ抗体とインキュベートする工程、および固体支持体、非標識抗ＴＰＯ抗体、カニクイザルｒＴＰＯおよび標識抗ＴＰＯ抗体を含む複合体の形成が減少している場合、甲状腺疾患と診断する工程を含む方法も開示する。生物学的サンプル中に抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体が存在すると、固体支持体、非標識抗ＴＰＯ抗体、カニクイザルｒＴＰＯおよび標識抗ＴＰＯ抗体を含む複合体の形成が減少する。標識および／または非標識抗ＴＰＯ抗体は、任意の公知のまたは市販の抗ＴＰＯ抗体であってもよい。

診断の方法は、複合体を検出する工程をさらに含んでいてもよい。例えば、複合体の検出は、標識からのシグナルの読み出しの取得を含んでいてもよく、ここで、標識からのシグナルの強度はアッセイ中に存在する標識の量を示す。

甲状腺疾患は自己免疫障害であってもよい。一部の実施形態では、自己免疫障害は橋本病またはグレーブス病であってもよい。

前述の検出方法と同様に、診断方法において、非標識ｒＴＰＯ、非標識抗ヒト二次抗体または非標識抗ＴＰＯ抗体は、固体支持体に直接的または間接的に連結／カップリングすることができる。直接的に連結／カップリングするために適切な技術には、例えば、共有結合、吸着、非共有結合性相互作用またはそれらの組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、直接的連結／カップリングは、グルタルアルデヒド固定、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学物質または１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）ＮＨＳ化学物質によって達成することができる。間接的連結／カップリングのための適切な手段には、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、リンカーまたはそれらの組み合わせを介した連結／カップリングが含まれる。一部の実施形態では、固体支持体への間接的連結／カップリングは、ストレプトアビジンおよびビオチンを介する。例えば、非標識ｒＴＰＯ、非標識抗ヒト二次抗体または非標識抗ＴＰＯ抗体はビオチン化することができ、固体支持体はストレプトアビジンを含んでいてもよい。

固体支持体例には、カラムマトリックス材料、培養プレート、試験管、皿、フラスコ、マイクロタイタープレート、ビーズ／粒子、熱殺菌ホルマリンで（もしくはその他の化学的方法で）固定された原核もしくは真核細胞、顕微鏡スライド、ＡＣＬＡＲ（登録商標）フィルムもしくは任意のその他の光学的に透明なポリマーまたはそれらの組み合わせが含まれるが、限定はされない。固体支持体は、プラスチック、セルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、ガラス、ガラス繊維、ラテックスまたはそれらの組み合わせから、完全にまたは部分的に構成することができる。一部の実施形態では、固体支持体は磁性ビーズ／粒子を含む。一部の実施形態では、磁性ビーズ／粒子は常磁性粒子（ＰＭＰ）である。一部の実施形態では、磁性ビーズ／粒子はラテックス磁性粒子（ＬＭＰ）である。

標識は、検出可能なシグナルを生じるのに有用な、当業者に公知の任意の適切な標識であってもよい。適切な検出可能な標識には、酵素コンジュゲート（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼおよびβ－ガラクトシダーゼ）、蛍光プローブ、放射性同位元素、化学発光化合物、生物発光化合物またはそれらの組み合わせが含まれるが、限定はされない。一部の実施形態では、標識はＡＥまたはその類似体である。適切なＡＥ類似体には、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、Ｎ－スルホプロピルジメチルアクリジニウムエステル（ＮＳＰ－ＤＭＡＥ）、高量子収率アクリジニウムエステル（ＨＱＹＡＥ）、双性イオンアクリジニウムエステル（ＺＡＥ）、Ｎ－スルホプロピル－２－イソプロポキシジメチルアクリジニウムエステル（Ｉｓｏ－Ｄｉ－ＺＡＥ）、トリスルホプロピルアクリジニウムエステル（ＴＳＰ－ＡＥ）またはヘキサ（エチレン）グリコールリンカーを含むＮ－スルホプロピルジメチルアクリジニウムエステル（ＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥ）が含まれる。一部の実施形態では、標識カニクイザルｒＴＰＯはｒＴＰＯ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥを含む。ｒＴＰＯ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥは約５０ｎｇ／ｍｌから約２μｇ／ｍｌで存在し得る。一部の実施形態では、ｒＴＰＯ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥは約２２０ｎｇ／ｍｌで存在し得る。一部の実施形態では、標識抗ＴＰＯ抗体は抗ｒＴＰＯ ＩｇＧ ＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥである。抗ｒＴＰＯ ＩｇＧ ＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥは約５０ｎｇ／ｍｌから約２μｇ／ｍｌで存在し得る。一部の実施形態では、抗ｒＴＰＯ ＩｇＧ ＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥは約４２０ｎｇ／ｍｌで存在し得る。

自己免疫疾患を診断する方法を実行するのに適した時間には、抗体の様々な検出方法について上で挙げた時間が含まれる。

方法は、対象の生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体のレベルを決定することをさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、対象の生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体のレベルは、検出された複合体のレベルに正比例する。したがって、抗ＴＰＯ抗体のレベルは、標識成分（すなわち、標識ｒＴＰＯまたは抗体）とカップリングした、または複合体形成した固体支持体のレベルを決定することによって決定することができる。標識成分とカップリングした、または複合体形成した固体支持体のレベルの決定は、例えば、複合体からのシグナルを測定することによって実行することができる。同様に、対象の甲状腺疾患を診断するためにこの方法を使用する実施形態では、標識成分とカップリングした、または複合体形成した固体支持体は、固体支持体に連結した標識成分からのシグナルまたはシグナルがないことを測定することによって検出する。

開示した方法は手動で実行するか、または自動化することができる。例えば、開示された方法は、ＡＤＶＩＡ ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）イムノアッセイシステムまたはＡＴＥＬＬＩＣＡ（商標）システムを使用して実行することができる。

一部の実施形態では、抗ＴＰＯ抗体は患者の抗ＴＰＯ抗体である。一部の実施形態では、抗ＴＰＯ抗体は自己抗体である。

抗ＴＰＯ抗体を検出するために適切な生物学的サンプルには、血清、血漿、全血、唾液、尿、精液、汗、涙、および体組織を含むが、限定はされない、抗ＴＰＯ抗体を含有する、または含有することが疑われる対象の任意の生物学的サンプルが含まれる。

本明細書で開示したイムノアッセイは、組換え甲状腺ペルオキシダーゼ（ｒＴＰＯ）を使用する。一部の実施形態では、ｒＴＰＯはカニクイザル由来である。一部の実施形態では、ｒＴＰＯは、配列番号１（表１）に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｒＴＰＯはエピトープタグをさらに含む。エピトープタグは、ｒＴＰＯのＮ末端またはＣ末端にあってもよい。エピトープタグは、６－ヒスチジンタグ、血球凝集素タグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質またはキチン結合タンパク質を含むがそれらに限定はされない、当業者に公知の任意の適切なタグであってもよい。一部の実施形態では、ｒＴＰＯはＣ末端６－ヒスチジンタグを含む。

本明細書ではキットをさらに開示する。一部の実施形態では、キットは、固体支持体、非標識カニクイザルｒＴＰＯおよび標識カニクイザルｒＴＰＯを含んでいてもよい。

キットは、固体支持体、標識カニクイザルｒＴＰＯおよび抗ヒト二次抗体を含んでいてもよい。一部の実施形態では、カニクイザルｒＴＰＯが標識を含むか、または抗ヒト二次抗体が標識を含む。

キットは、固体支持体、カニクイザルｒＴＰＯおよび抗ＴＰＯ抗体を含んでいてもよい。一部の実施形態では、抗ＴＰＯ抗体の一部は標識されておらず、抗ＴＰＯ抗体の一部は標識されている。

本明細書で開示したキットのいずれかに適した固体支持体および標識には、上記の方法について開示したそれらの固体支持体および標識が含まれる。

以下の実施例は、本明細書で開示した実施形態のいくつかをさらに説明するために提供されている。実施例は、開示された実施形態を例示するものであって、限定するものではない。

ｒＴＰＯクローニング
サルの甲状腺組織はカニクイザルから入手し、ｍＲＮＡはトリゾール／クロロホルム抽出（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５９６０２６）を使用して単離し精製した。ｃＤＮＡライブラリーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ－ＰＣＲキットを使用して調製した。

ＰＣＲを使用して可溶型のＴＰＯをｃＤＮＡライブラリーから増幅し、ＰＣＲ産物はＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット、カタログ番号２８１０４）を使用して精製した。精製したＰＣＲ産物は、ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｒ０１４５Ｓ）およびＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｒ０１８９Ｓ）制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲル抽出した。ゲル抽出したＴＰＯは、バキュロウイルス発現ベクターにライゲーションした。ベクターでコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン選択プレートに播種した。

得られたコロニーをＰＣＲでスクリーニングし、プラスミドの生成および精製のために陽性クローンを増殖させた。いくつかのプラスミドクローンは、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣＥＱ８０００配列決定装置を使用して配列決定し；ＴＰＯを含有するクローンを検証した。ＰＣＲおよび配列決定プライマーは全て、ＡＢＩ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９ ＤＮＡ合成機を使用して合成した。このｃＤＮＡは、配列番号１のアミノ酸配列を有するカニクイザルｒＴＰＯをコードしている（表１）。

ｒＴＰＯ バキュロウイルスを生じさせるための一過性トランスフェクション
ｒＴＰＯ配列を含むトランスファープラスミドとバキュロウイルスＤＮＡを組み合わせ、グレース培地およびトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂａｃ－Ｎ－Ｂｌｕｅトランスフェクションキット、カタログ番号Ｋ８５５－０１）とインキュベートした。スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）細胞のトランスフェクション後、引き続いて細胞培養上清を組換えウイルスについてスクリーニングし、選択した組換え体を精製し、増幅し、配列決定して、ｒＴＰＯの同一性を確認した。

ｒＴＰＯ精製
ｒＴＰＯを含有する精製組換えバキュロウイルスを使用して、ＥＳＦ９２１細胞培養培地中でトリコプルシア・ニＰＲＯ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ＰＲＯ）（ＴｎｉＰＲＯ）の培養物に感染させた。形質導入されたｒＴＰＯは細胞培養上清中に分泌された。

キレーティングセファロースファストフロー固定化金属（ニッケル）アフィニティークロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、上清からｒＴＰＯを単離した。簡単に説明すると、キレーティングセファロースゲル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１７－０５７５－０１）にＮｉＳＯ_４１００ｍＭを加えた。培養上清中のｒＴＰＯを１．５時間ゲルに結合させた。非特異的タンパク質は、ゲルを塩化ナトリウム０．５Ｍ、０．０５ＭトリスｐＨ８．０、イミダゾール１０ｍＭで洗浄することによって除去した。次に、ｒＴＰＯを塩化ナトリウム０．５Ｍ、０．０５ＭトリスｐＨ８．０、イミダゾール０．１Ｍで溶出した。次に、溶出画分についてＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ Ｐｌｕｓ液体クロマトグラフィーシステムでＳ－２００サイズ排除クロマトグラフィーを行い、ｒＴＰＯを含有する画分をプールした。

純粋なｒＴＰＯを含有する最終プールをＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分析し、続いてクーマシーブルー染色（図５、パネルＡ）またはウエスタンブロット（図５、パネルＢ）を行った。４～２０％トリス－グリシンゲルで、非還元条件下で、２００Ｖで約３０～４０分間、ｒＴＰＯを電気泳動した。ウエスタンブロット分析では、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、マウス抗ＴＰＯモノクローナル抗体で１時間、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ロット１７０１１２７１）で３０分間で探索し；ブロットを基質（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ ＢＣＩＢ）で約５分間発色させた。

グリコシル化
ｒＴＰＯグリコシル化の範囲は、イオン交換クロマトグラフィー、マトリックス支援ＬＡＳＥＲ脱離飛行時間型（「ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ」）質量分析および等電点電気泳動によって決定した。イオン交換クロマトグラフィー、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦおよび等電点電気泳動実験の各々において、２つのタンパク質種が同定され、グリコシル化の結果であるものと考えられた。図６に示したように、主要なバンドの平均ｐＩは６．２であり、小さいバンドの平均ｐＩは５．２であった。

ｒＴＰＯの潜在的なロット間のグリカンの多様性をさらに特徴づけるために、ｒＴＰＯの３つの異なるロットを以下の酵素の１つで各々消化した：タンパク質脱グリコシル化ミックスＩＩ（ＰＮＧアーゼＦ、Ｏ－グリコシダーゼ、α２－３，６，８，９ノイラミニダーゼＡ、β１－４ガラクトシダーゼＳおよびβ－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼを含む）、ＥｎｄｏＨ、α２－３、６、８、９ノイラミニダーゼ、Ｏ－グリコシダーゼまたはＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。消化したｒＴＰＯは、続いてＳｈｉｍａｄｚｕ ＡＸＩＭＡ Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析機を使用してＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析によって分析した。各反応の酵素消化条件を以下の表２にまとめて示す。３７℃で一晩インキュベートした後、サンプルを収集し、室温まで冷却し、脱塩した。１０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；参照番号ＵＦＣ５０１０２４）をｄｉＨ_２Ｏ ２５０μｌで洗浄し、１４，０００ｒｐｍで１０分間回転させた。消化したサンプルを洗浄した遠心分離フィルターに添加し、１４，０００ｒｐｍで１０分間回転させ、通過画分を傾瀉することによってサンプルを脱塩した。各回転の後、ｄｉＨ_２Ｏ ２５０μｌを遠心分離フィルターに分注し、再度１４，０００ｒｐｍで１０分間回転させ、全部で３回洗浄した。

３７℃で一晩インキュベートした後、サンプルを収集し、室温まで冷却し、脱塩した。１０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；参照番号ＵＦＣ５０１０２４）をｄｉＨ_２Ｏ ２５０μｌで洗浄し、１４，０００ｒｐｍで１０分間回転させた。消化したサンプルを洗浄した遠心分離フィルターに添加し、１４，０００ｒｐｍで１０分間回転させ、通過画分を傾瀉することによってサンプルを脱塩した。各回転の後、ｄｉＨ_２Ｏ ２５０μｌを遠心分離フィルターに分注し、再度１４，０００ｒｐｍで１０分間回転させ、全部で３回洗浄した。

サンプルは全て脱塩し、シナピン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ４９５０８）トリフルオロ酢酸（Ａｌｆａ－Ａｅｓａｒ ４４６３０）マトリックス溶液で直接再構成した。マトリックスに対するサンプルの比は、表３に挙げた最適比を用いて各サンプルについて最適化した。各サンプルの一定分量２μｌをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦサンプルプレートに３連でブロットした。サンプルを徹底的に空気乾燥し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦサンプルチャンバーに入れ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ａｘｉｍａ Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦでレーザー出力を６５に設定して測定した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析機は、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓアルブミン標準物（Ｓｉｇｍａ；部品番号Ａ８４７１）を使用して較正した。

ｒＴＰＯの３つのロットのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析では、グリコシル化にわずかなロット毎の差が示された（データは示さず）。脱グリコシル化ミックスによる消化は、最も顕著な分子量シフトを示した；この酵素は、ＡＤＶＩＡ ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）ＸＰイムノアッセイ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での機能試験のための脱グリコシル化およびその後のコンジュゲートのために選択された。

ｒＴＰＯイムノアッセイの特徴づけ
Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学物質を使用して、ＮＳＰ－ＤＭＡＥで標識した天然のヒトＴＰＯ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ８０－１３８２）およびＮＳＰ－ＤＭＡＥで標識した組換えカニクイザルＴＰＯを調製した。これらの標識タンパク質は、リン酸緩衝液１００ｍＭ、ＮａＣｌ４００ｍＭ、ＥＤＴＡ１．９ｇ／Ｌ、０．２％（ｖ／ｖ）プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム０．９ｇ／Ｌ、１０％ソルビトールおよびスルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミン１０ｇ／Ｌ中で、ストレプトアビジンラテックスまたは常磁性粒子にカップリングしたビオチン化抗ヒトＩｇＧと対になり、ＡＤＶＩＡ ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、７．５分のワンパス（最初の結果出力までの時間（ＴＴＦＲ））：１８分）および／または２０／２０分のツーパス（ＴＴＦＲ：６０分）形式で試験した。７．５分のワンパスイムノアッセイでは、サンプルはゼロ時点で添加した。ヒトＴＰＯ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥまたはｒＴＰＯ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥは４．７５分で添加し、続いてラテックス磁性ビーズを含有する試薬を７．５分で添加した。ラテックス磁性粒子を単離するために磁気分離を１３．０分で開始した。２０／２０ツーパスイムノアッセイでは、サンプルはゼロ時点で添加し、ファーストパスヒトＴＰＯ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥまたはｒＴＰＯ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥは６分で添加し、続いてファーストパス磁気分離は２４．０分で行った。セカンドパスヒトＴＰＯ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥまたはｒＴＰＯ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥは３５．０分で添加し、セカンドパス磁気分離は５２．７５分で開始した。ワンパスおよびツーパス形式の両方で、磁性粒子はリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、リン酸緩衝液１００ｍＭ、ＮａＣｌ４００ｍＭ、ＥＤＴＡ１．９ｇ／Ｌ、０．２％（ｖ／ｖ）プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム０．９ｇ／Ｌ、１０％ソルビトールおよびスルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミン１０ｇ／Ｌに再懸濁することによって調製した。キュベット内で、Ｃｅｎｔａｕｒプラットフォームサイクルパラメータに従って粒子は磁気的に分離され、水またはｔｗｅｅｎ－２０ＰＢＳのいずれかに再懸濁した。Ｓｉｅｍｅｎｓ ａＴＰＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｃｕｒｖｅ Ｍａｔｅｒｉａｌ（Ｓｉｅｍｅｎｓ １０６３０８９０）をサンプルとして、実施した。図１１に示したように、ＡＤＶＩＡ ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）ＸＰにおいて７．５分ワンパスおよび２０／２０分ツーパス形式の両方を使用して、組換えＴＰＯは天然ＴＰＯと比較して高いシグナル対ノイズ比をもたらした。

抗ＴＰＯ抗体イムノアッセイ
抗原架橋形式
ｒＴＰＯ抗原架橋イムノアッセイは、リン酸緩衝液１００ｍＭ、ＮａＣｌ４００ｍＭ、ＥＤＴＡ１．９ｇ／Ｌ、０．２％（ｖ／ｖ）プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム０．９ｇ／Ｌ、１０％ソルビトールおよびスルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミン１０ｇ／Ｌにストレプトアビジンコーティングラテックス磁性粒子に直接的にカップリングしたビオチン化ｒＴＰＯ０．６ｍｇ／ｍＬならびにＴＳＰ－ＡＥにカップリングしたｒＴＰＯ（リン酸緩衝液１００ｍＭ、ＮａＣｌ４００ｍＭ、ＥＤＴＡ１．９ｇ／Ｌ、０．２％（ｖ／ｖ）プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム０．９ｇ／Ｌ、１０％ソルビトールおよびスルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミン１０ｇ／Ｌに３０ｎｇ／ｍＬｒＴＰＯ－ＴＳＰ－ＡＥ）を使用した。ｒＴＰＯ抗原架橋形式は、７．５分ワンパス（ＴＴＦＲ：１８分）アッセイとして実施し、１：６のオンボードサンプル予備希釈を必要とした。ＡＤＶＩＡ ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）ＸＰでは、希釈したサンプル２０μＬを第２のキュベットに添加し、４．７５分間インキュベートした。ｒＴＰＯ－ＴＳＰ－ＡＥ１００μＬを添加し、２．７５分間インキュベートした。次に、ｒＴＰＯ／ラテックス磁性粒子１００μＬを添加し、２．７５分間インキュベートした。磁気分離を１３．０分で開始した。磁性粒子はリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、リン酸緩衝液１００ｍＭ、ＮａＣｌ４００ｍＭ、ＥＤＴＡ１．９ｇ／Ｌ、０．２％（ｖ／ｖ）プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム０．９ｇ／Ｌ、１０％ソルビトールおよびスルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミン１０ｇ／Ｌで最終的に元の濃度に再懸濁した。キュベット内で、Ｃｅｎｔａｕｒプラットフォームサイクルパラメータに従って、粒子は磁気的に分離され、水またはｔｗｅｅｎ－２０ＰＢＳのいずれかに再懸濁された。抗原架橋アッセイ形式の概略例を図１に示す。最適化したｒＴＰＯ抗原架橋イムノアッセイ（バックグラウンドを最小限に抑え、シグナル対ノイズを増強し、いかなるプロゾーン現象も制限するために最適化した）の性能を図１２Ａに挙げる。

ＩｇＧクラス捕捉形式
ヒトＩｇＧクラス捕捉イムノアッセイは、グルタルアルデヒド固定によって常磁性粒子に直接的にカップリングした抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体およびＮＳＰ－ＤＭＡＥにカップリングしたｒＴＰＯ（抗ヒトＩｇＧ／常磁性粒子０．３４ｍｇ／ｍｌおよびｒＴＰＯ－ＮＰＳ－ＤＭＡＥ２２０ｎｇ／ｍｌに、いずれもリン酸緩衝液１００ｍＭ、ＮａＣｌ４００ｍＭ、ＥＤＴＡ１．９ｇ／Ｌ、０．２％（ｖ／ｖ）プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム０．９ｇ／Ｌ、１０％ソルビトールおよびスルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミン１０ｇ／Ｌ）を使用した。ヒトＩｇＧクラス捕捉形式は、７．５分ワンパス（ＴＴＦＲ：１８分）アッセイとして実施し、１：１０オンボードサンプル予備希釈を必要とした。ＡＤＶＩＡ ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）ＸＰでは、希釈したサンプル２０μＬを第２のキュベットに添加し、４．７５分間インキュベートした。ｒＴＰＯ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥ１００μＬを添加し、２．７５分間インキュベートした。抗ヒトＩｇＧ／常磁性粒子２００μＬを添加し、２．７５分間インキュベートした。磁性粒子は前述のように分離して洗浄した。ＩｇＧクラス捕捉アッセイ形式の概略例を図２に示す。最適化したヒトＩｇＧクラス捕捉イムノアッセイ（バックグラウンドを最小限に抑え、シグナル対ノイズを増強し、いかなるプロゾーン現象も制限するために最適化した）の性能を図１２Ｂに挙げる。

ｒＴＰＯ捕捉形式
ｒＴＰＯ捕捉イムノアッセイは、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）ＮＨＳ化学物質を使用してラテックス磁性粒子に直接的にカップリングしたｒＴＰＯおよびＮＳＰ－ＤＭＡＥにカップリングしたモノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（ｒＴＰＯ／ラテックス磁性粒子０．４ｍｇ／ｍｌおよび抗ヒトＩｇＧ抗体－ＮＳＰ－ＤＭＡＥ１．６μｇ／ｍｌに、いずれもリン酸緩衝液１００ｍＭ、ＮａＣｌ４００ｍＭ、ＥＤＴＡ１．９ｇ／Ｌ、０．２％（ｖ／ｖ）プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム０．９ｇ／Ｌ、１０％ソルビトールおよびスルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミン１０ｇ／Ｌ）を使用した。ｒＴＰＯ捕捉形式は、７．５分ワンパス（ＴＴＦＲ：１８分）アッセイとして実施し、１：１０オンボードサンプル予備希釈を必要とした。ＡＤＶＩＡ ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）ＸＰでは、希釈したサンプル２０μＬを第２のキュベットに添加した。抗ヒトＩｇＧ抗体－ＮＳＰ－ＤＭＡＥ１００μＬを添加し、２．７５分間インキュベートした。ｒＴＰＯ／ラテックス磁性粒子１００μＬを添加し、２．７５分間インキュベートした。磁性粒子は前述のように分離して洗浄した。ｒＴＰＯ捕捉アッセイ形式の概略例を図３に示す。最適化したｒＴＰＯ捕捉イムノアッセイ（バックグラウンドを最小限に抑え、シグナル対ノイズを増強し、いかなるプロゾーン現象も制限するために最適化した）の性能を図１２Ｃに挙げる。

競合／阻害形式
競合／阻害イムノアッセイは、ストレプトアビジンコーティングラテックス磁性粒子にカップリングしたビオチン化マウスモノクローナル抗ｒＴＰＯＩｇＧ抗体および非標識ｒＴＰＯとの免疫複合体中でＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥにカップリングしたマウスモノクローナル抗ｒＴＰＯＩｇＧ抗体（それぞれ、マウス抗ｒＴＰＯ／ラテックス磁性粒子０．３ｍｇ／ｍｌおよびｒＴＰＯ：抗ｒＴＰＯ ＩｇＧ ＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥ４２０ｎｇ／ｍｌに、いずれもリン酸緩衝液１００ｍＭ、ＮａＣｌ４００ｍＭ、ＥＤＴＡ１．９ｇ／Ｌ、０．２％（ｖ／ｖ）プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム０．９ｇ／Ｌ、１０％ソルビトールおよびスルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミン１０ｇ／Ｌ）を使用した。競合／阻害形式は、７．５分ワンパス（ＴＴＦＲ：１８分）アッセイとして実施した。ＡＤＶＩＡ ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）ＸＰでは、未希釈サンプル２０μＬをキュベットに添加し、４．７５分間インキュベートした。ｒＴＰＯ：抗ｒＴＰＯ ＩｇＧ ＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥ７５μＬおよびマウス抗ｒＴＰＯ／ラテックス磁性粒子１５０μｌを添加し、各２．７５分間インキュベートした。磁性粒子は前述のように分離して洗浄した。競合／阻害アッセイ形式の概略例を図４に示す。最適化した競合／阻害イムノアッセイ（バックグラウンドを最小限に抑え、シグナル対ノイズを増強し、いかなるプロゾーン現象も制限するために最適化した）の性能を図１２Ｄに挙げる。

イムノアッセイの性能に対するｒＴＰＯグリコシル化の影響
イムノアッセイの性能に対する組換えｒＴＰＯグリコシル化の影響を分析するために、抗原架橋およびＩｇＧクラス捕捉（標識ｒＴＰＯ検出を含む）形式を使用して、イムノアッセイを実施した。表４は、各形式のためのイムノアッセイ調製物の概略を示す。イムノアッセイは、ＡＤＶＩＡ ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）ＸＰで３連で実施した。サンプルはＰＢＳ緩衝液に混ぜた抗ＴＰＯ抗体陽性血漿を使用して調製し、以下の用量：０、１２．５、２５、５０、１００、２００、３００、４００、６２５、２０，０００ＩＵ／ｍＬを標的化した。

抗原架橋アッセイ形式では、サンプル３０μＬ、続いて希釈液（リン酸緩衝液１００ｍＭ、ＮａＣｌ約４００ｍＭ、ＥＤＴＡ約１．９ｇ／Ｌ、約０．２％（ｖ／ｖ）プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム約０．９ｇ／Ｌ、ソルビトール約１０％およびスルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミン約１０ｇ／Ｌ）１８０μＬをキュベットに添加し、希釈したサンプルを４．７５分間インキュベートした。希釈したサンプル３０μＬを、常磁性粒子を含有する希釈液１００μＬに添加し、２．７５分間インキュベートした。標識ｒＴＰＯを含有する希釈液１００μＬを反応物に添加し、６．５分間インキュベートした。イムノアッセイは、脱グリコシル化無し（「対照」）、脱グリコシル化された標識ｒＴＰＯ（「グリコシル化ＳＰ／脱グリコシル化ＬＲ」）、固体支持体に結合した脱グリコシル化非標識ｒＴＰＯ（「脱グリコシル化ＳＰ／グリコシル化ＬＲ」）ならびにいずれも脱グリコシル化された標識ｒＴＰＯおよび固体支持体に結合した非標識ｒＴＰＯ（「脱グリコシル化ＳＰ＆ＬＲ」）で試験した（結果は図７Ａに示す）。

ＩｇＧクラス捕捉アッセイ形式では、サンプル３０μＬ、続いて希釈液（リン酸緩衝液１００ｍＭ、ＮａＣｌ約４００ｍＭ、ＥＤＴＡ約１．９ｇ／Ｌ、約０．２％（ｖ／ｖ）プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム約０．９ｇ／Ｌ、ソルビトール約１０％およびスルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミン約１０ｇ／Ｌ）１８０μＬをキュベットに添加し、希釈したサンプルを４．７５分間インキュベートした。希釈したサンプル３０μＬを、標識ｒＴＰＯを含有する希釈液１００μＬに添加し、２．７５分間インキュベートした。常磁性粒子にカップリングした抗ヒトＩｇＧＦｃモノクローナル抗体を含有する希釈液１００μＬを反応物に添加し、６．５分間インキュベートした。イムノアッセイは、脱グリコシル化されていない標識ｒＴＰＯ（対照）および脱グリコシル化された標識ｒＴＰＯで試験した（図７Ｂ）。

グリコシル化に基づいたｒＴＰＯの機能評価によって、ｒＴＰＯグリコシル化の違いにより、抗ＴＰＯ抗体陽性患者プールに対する免疫反応性（ＡＤＶＩＡ ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）ＸＰによって測定）に微妙な変動が生じることが明らかになった（図７Ａおよび図７Ｂ）。

イムノアッセイは、効果的なａＴＰＯの検出と定量化のための低いバックグラウンドおよび広いダイナミックレンジを示した。

ｒＴＰＯ免疫複合体の特徴づけ
ＦＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、組換えＴＰＯ－抗ＴＰＯ自己抗体複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける形成を検証し、患者サンプル内の何らかのその他の成分ではなく抗ＴＰＯ自己抗体が組換えＴＰＯと相互作用していることを確認した。

ｒＴＰＯＡＥベースラインクロマトグラム：Ｎ－スルホプロピルジメチルアクリジニウムエステル（ＮＳＰ－ＤＭＡＥ）で標識したｒＴＰＯ（５モル過剰）は、分画緩衝液；リン酸ナトリウム５０ｍＭ、塩化ナトリウム１５０ｍＭ、０．５％ｔｗｅｅｎ２０および０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．４を使用して約５００万ＲＬＵ（１：６００希釈）になるように希釈した。このサンプルは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＨｉＬｏａｄ １６／６００カラムを用いたＡＫＴＡピュアシステムによって、分画緩衝液、注入５００μＬおよび溶出１ｍｌ／分を使用して分析し；１８０個の画分（各１ｍｌ）を収集し、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ＡｕｔｏＬｕｍａｔシステムを実施して、ベースラインＲＬＵクロマトグラムを生成した。標識ｒＴＰＯは、図８のＲＬＵクロマトグラムのＭＷ９０～１００ＫＤａ（画分６６～７６）の単一ピークによって表された（注：「ｒＴＰＯＡＥ」は、アクリジニウムエステル類似体または変種、例えば、本実施例ではＮＳＰ－ＤＭＡＥで標識されたｒＴＰＯを意味する）。

ｉｎｖｉｔｒｏ免疫複合体クロマトグラム：高抗ＴＰＯ抗体患者サンプルプール（濃度約６０，０００Ｕ／ｍＬ）を分画緩衝液で約１，５００Ｕ／ｍＬまで希釈した。希釈サンプルの一部を、ジメチルアクリジニウムエステル（ＮＳＰ－ＤＭＡＥ）で標識した希釈（１：６００）ｒＴＰＯの１９部と混合した。上記と同じカラムおよび条件を使用してサンプル混合物を分析した。図８のベースラインクロマトグラムに重ねた混合物のＲＬＵクロマトグラム（「ｒＴＰＯＡＥ＿ｓｐｉｋｅｒ」）は、結合してない標識ｒＴＰＯピーク（画分６６～７６）とともに高分子量の免疫複合体ピーク（画分４５～５５）を示している。

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを使用して、免疫複合体の成分を評価した。

サンプル調製：高抗ＴＰＯ抗体患者プール（濃度約２０，０００Ｕ／ｍＬ）を分画緩衝液で約２，７００Ｕ／ｍＬまで希釈した。希釈したサンプルをｒＴＰＯと１：１比で混合した。サンプル混合物は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＨｉＬｏａｄ１６／６０カラムを用いたＡＫＴＡピュアシステムによって分析し、１８０個（各１ｍｌ）の画分を収集した。

Ａ２８０クロマトグラム（図９）は３つの別個のピーク；高分子量のピークＡ（保持容量５２．０５ｍＬ）、ピークＢ（保持容量６６．８７ｍＬ）およびピークＣ（保持容量７５．４３ｍＬ）を示している。ピーク領域画分の各は別々にプールし；高分子量ピーク領域は２つのサンプルにプールした。プールしたサンプル：Ｓ１（画分４６～４９）、Ｓ２（画分５１～５４）、Ｓ３（画分６５～６８）およびＳ４（画分７４～７７）は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４遠心分離フィルター（Ｕｌｔｒａｃｅｌ ３０Ｋ ３０，０００ＮＭＷＬ ｒｅｆ ＵＦＣ８０３０２４）を使用して濃縮した。

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ手順：洗浄済みのＰａｌｌ ＮａｎｏＳｅｐフィルターに脱イオン水（「ｄｉＨ２Ｏ」）（５００μＬ）、続いて上記の様々な量のＳ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４サンプルを添加した。次に、サンプルを１２，０００×ｇで７分間遠心分離し、もう一度水で洗浄し、シナピン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ４９５０８）トリフルオロ酢酸（Ａｌｆａ－Ａｅｓａｒ４４６３０）マトリックス溶液で直接再構成して、タンパク質濃度２ｍｇ／ｍＬを達成した。各サンプル２マイクロリットルをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦプレートに直接プロットし、乾燥させた。感度を高めるために第２のスポット形成を実行した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ａｘｉｍａ Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦで、ＭＡＬＤＩグレードＢＳＡ標準物を使用して較正し、レーザー出力を６５に設定した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの結果（図１０）は、サンプルＳ１およびＳ２が主に約９０ＫＤａタンパク質種（ｒＴＰＯ）およびヒトＴＰＯ自己抗体を表す約１５０ＫＤａタンパク質で構成されていることを示した。

結果は、標識ｒＴＰＯと患者サンプルとの相互作用が患者の抗ＴＰＯ抗体に特異的であることを示した。

当業者であれば、本発明の好ましい実施形態に対して多数の改変および修正を行うことができ、そのような改変および修正は、本発明の趣旨から逸脱することなく行うことができることを理解するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨および範囲内にあるこのような同等の変更全てを包含することを意図している。

Claims (55)

1. 対象の生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体を検出する方法であって：
   ａ）対象の生物学的サンプルを：
   固体支持体、
   非標識カニクイザル組換え甲状腺ペルオキシダーゼ（ｒＴＰＯ）、および
   標識カニクイザルｒＴＰＯ
   とインキュベートする工程であって、
   該抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在下で、該標識カニクイザルｒＴＰＯ、該非標識カニクイザルｒＴＰＯおよび該固体支持体を含む複合体が形成される、工程；および
   ｂ）該複合体を検出する工程であって、該複合体の存在は、生物学的サンプル中の該抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在を示す、工程
   を含む前記方法。
2. 標識は、酵素コンジュゲート、蛍光プローブ、放射性同位元素、化学発光化合物、生物発光化合物またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
3. 標識は、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）またはその類似体を含む、請求項２に記載の方法。
4. 非標識カニクイザルｒＴＰＯは、固体支持体に間接的に連結されている、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 非標識カニクイザルｒＴＰＯは、ビオチン化されており、固体支持体は、ストレプトアビジンを含む、請求項４に記載の方法。
6. 対象の生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体を検出する方法であって：
   ａ）対象の生物学的サンプルを：
   固体支持体、
   カニクイザルｒＴＰＯ、および
   抗ヒト二次抗体
   とインキュベートする工程であって、
   該抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在下で、該固体支持体、該カニクイザルｒＴＰＯおよび該抗ヒト二次抗体を含む複合体が形成される、工程；および
   ｂ）該複合体を検出する工程であって、該複合体の存在は、生物学的サンプル中の該抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在を示す、工程
   を含む前記方法。
7. 抗ヒト二次抗体は、固体支持体に直接的または間接的に連結されている、請求項６に記載の方法。
8. カニクイザルｒＴＰＯは、標識を含む、請求項７に記載の方法。
9. 標識は、酵素コンジュゲート、蛍光プローブ、放射性同位元素、化学発光化合物、生物発光化合物またはそれらの組み合わせを含む、請求項８に記載の方法。
10. 標識は、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）またはその類似体である、請求項９に記載の方法。
11. アクリジニウムエステル（ＡＥ）類似体は、ＤＭＡＥ、ＮＳＰ－ＤＭＡＥ、ＨＱＹＡＥ、ＺＡＥ、Ｉｓｏ－Ｄｉ－ＺＡＥ、ＴＳＰ－ＡＥまたはＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥである、請求項３または１０に記載の方法。
12. 標識を含むカニクイザルｒＴＰＯは、ｒＴＰＯ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥである、請求項１１に記載の方法。
13. ｒＴＰＯ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥは、約５０ｎｇ／ｍｌから約２μｇ／ｍｌで存在する、請求項１２に記載の方法。
14. カニクイザルｒＴＰＯおよび標識は、リン酸緩衝液、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム、ソルビトールおよびスルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中に存在する、請求項３または１０に記載の方法。
15. カニクイザルｒＴＰＯは、固体支持体に直接的または間接的に連結されている、請求項６に記載の方法。
16. 抗ヒト二次抗体は、標識を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 標識は、酵素コンジュゲート、蛍光プローブ、放射性同位元素、化学発光化合物、生物発光化合物またはそれらの組み合わせを含む、請求項１６に記載の方法。
18. 標識は、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）またはその類似体である、請求項１７に記載の方法。
19. アクリジニウムエステル類似体は、ＤＭＡＥ、ＮＳＰ－ＤＭＡＥ、ＨＱＹＡＥ、ＺＡＥ、Ｉｓｏ－Ｄｉ－ＺＡＥ、ＴＳＰ－ＡＥまたはＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥである、請求項１８に記載の方法。
20. カニクイザルｒＴＰＯは、固体支持体に間接的に連結している、請求項６、１５、１６、１７または１８のいずれか１項に記載の方法。
21. カニクイザルｒＴＰＯは、ビオチン化されており、固体支持体は、ストレプトアビジンを含む、請求項２０に記載の方法。
22. カニクイザルｒＴＰＯおよび固体支持体は、リン酸緩衝液、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム、ソルビトールおよびスルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中に存在する、請求項２０に記載の方法。
23. 対象の生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体を検出する方法であって：
    ａ）対象の生物学的サンプルを固体支持体、非標識抗ＴＰＯ抗体、カニクイザルｒＴＰＯおよび標識抗ＴＰＯ抗体とインキュベートする工程；および
    ｂ）生物学的サンプル中の該抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体を検出する工程であって、該検出は、該固体支持体、該非標識抗ＴＰＯ抗体、該カニクイザルｒＴＰＯおよび該標識抗ＴＰＯ抗体を含む複合体の形成の減少を分析することを含む、工程
    を含む前記方法。
24. 標識は、酵素コンジュゲート、蛍光プローブ、放射性同位元素、化学発光化合物、生物発光化合物またはそれらの組み合わせを含む、請求項２３に記載の方法。
25. 標識は、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）またはその類似体を含む、請求項２４に記載の方法。
26. アクリジニウムエステル類似体は、ＤＭＡＥ、ＮＳＰ－ＤＭＡＥ、ＨＱＹＡＥ、ＺＡＥ、Ｉｓｏ－Ｄｉ－ＺＡＥ、ＴＳＰ－ＡＥまたはＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥである、請求項２４に記載の方法。
27. 標識抗ＴＰＯ抗体は、抗ｒＴＰＯ ＩｇＧ ＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥである、請求項２３に記載の方法。
28. 抗ｒＴＰＯ ＩｇＧ ＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥは、約５０ｎｇ／ｍｌから約２μｇ／ｍｌで存在する、請求項２７に記載の方法。
29. 複合体は、リン酸緩衝液、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、プルロニックＦ－１２７、アジ化ナトリウム、ソルビトールおよびスルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中にある、請求項２３に記載の方法。
30. 対象の甲状腺疾患を診断する方法であって：
    ａ）対象の生物学的サンプルを：
    固体支持体、
    非標識カニクイザル組換え甲状腺ペルオキシダーゼ（ｒＴＰＯ）、および
    標識カニクイザルｒＴＰＯ
    とインキュベートする工程であって、
    生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在下で、該標識カニクイザルｒＴＰＯ、該非標識カニクイザルｒＴＰＯおよび該固体支持体を含む複合体が形成される、工程；および
    ｂ）該複合体が形成された場合、対象を甲状腺疾患と診断する工程
    を含む前記方法。
31. 対象の甲状腺疾患を診断する方法であって：
    ａ）対象の生物学的サンプルを：
    固体支持体、
    カニクイザルｒＴＰＯ、および
    抗ヒト二次抗体
    とインキュベートする工程であって、
    生物学的サンプル中の抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体の存在下で、該固体支持体、該カニクイザルｒＴＰＯおよび該抗ヒト二次抗体を含む複合体が形成される、工程；および
    ｂ）該複合体が形成された場合、対象を甲状腺疾患と診断する工程
    を含む前記方法。
32. 対象の甲状腺疾患を診断する方法であって：
    ａ）対象の生物学的サンプルを固体支持体、非標識抗ＴＰＯ抗体、カニクイザルｒＴＰＯおよび標識抗ＴＰＯ抗体とインキュベートする工程；および
    ｂ）該固体支持体、該非標識抗ＴＰＯ抗体、該カニクイザルｒＴＰＯおよび該標識抗ＴＰＯ抗体を含む複合体の形成が減少している場合、対象を甲状腺疾患と診断する工程
    を含む前記方法。
33. 甲状腺疾患は、自己免疫障害である、請求項３０～３２のいずれか１項に記載の方法。
34. 自己免疫障害は、橋本病またはグレーブス病である、請求項３３に記載の方法。
35. 組換えによって生成された甲状腺ペルオキシダーゼ（ｒＴＰＯ）であって、配列番号１のアミノ酸配列を含む、ｒＴＰＯ。
36. ｒＴＰＯは、標識を含む、請求項３５に記載のｒＴＰＯ。
37. 標識は、酵素コンジュゲート、蛍光プローブ、放射性同位元素、化学発光化合物、生物発光化合物またはそれらの組み合わせを含む、請求項３６に記載のｒＴＰＯ。
38. 標識は、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）またはその類似体を含む、請求項３７に記載のｒＴＰＯ。
39. アクリジニウムエステル類似体は、ＤＭＡＥ、ＮＳＰ－ＤＭＡＥ、ＨＱＹＡＥ、ＺＡＥ、Ｉｓｏ－Ｄｉ－ＺＡＥ、ＴＳＰ－ＡＥまたはＨＥＧ－ＧＬＵ－ＡＥである、請求項３８に記載のｒＴＰＯ。
40. 抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体と複合体化した請求項３６のｒＴＰＯ。
41. 請求項３６のｒＴＰＯをコードするｃＤＮＡ。
42. 固体支持体、
    非標識カニクイザルｒＴＰＯ、および
    標識カニクイザルｒＴＰＯ
    を含むキット。
43. 標識は、酵素コンジュゲート、蛍光プローブ、放射性同位元素、化学発光化合物、生物発光化合物またはそれらの組み合わせを含む、請求項４２に記載のキット。
44. 固体支持体は、カラムマトリックス材料、培養プレート、試験管、皿、フラスコ、マイクロタイタープレート、ビーズまたはそれらの組み合わせを含む、請求項４２に記載のキット。
45. 標識は、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）またはその類似体である、請求項４２に記載のキット。
46. 固体支持体、
    カニクイザルｒＴＰＯ、および
    抗ヒト二次抗体
    を含むキット。
47. 固体支持体は、カラムマトリックス材料、培養プレート、試験管、皿、フラスコ、マイクロタイタープレート、ビーズまたはそれらの組み合わせを含む、請求項４６に記載のキット。
48. カニクイザルｒＴＰＯが標識を含むか、または抗ヒト二次抗体が標識を含む、請求項４６に記載のキット。
49. 標識が酵素コンジュゲート、蛍光プローブ、放射性同位元素、化学発光化合物、生物発光化合物またはそれらの組み合わせを含む、請求項４８に記載のキット。
50. 標識は、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）またはその類似体である、請求項４９に記載のキット。
51. 固体支持体、
    カニクイザルｒＴＰＯ、および
    抗ＴＰＯ抗体
    を含むキット。
52. 固体支持体は、カラムマトリックス材料、培養プレート、試験管、皿、フラスコ、マイクロタイタープレート、ビーズまたはそれらの組み合わせを含む、請求項５１に記載のキット。
53. 抗ＴＰＯ抗体の一部は標識されておらず、抗ＴＰＯ抗体の一部は標識されている、請求項５１に記載のキット。
54. 標識は、酵素コンジュゲート、蛍光プローブ、放射性同位元素、化学発光化合物、生物発光化合物またはそれらの組み合わせを含む、請求項５３に記載のキット。
55. 標識は、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）またはその類似体である、請求項５４に記載のキット。

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