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JP6980383B2 - デヒドロゲナーゼ活性の向上したアマドリアーゼ - Google Patents

デヒドロゲナーゼ活性の向上したアマドリアーゼ Download PDF

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JP6980383B2 JP2016555413A JP2016555413A JP6980383B2 JP 6980383 B2 JP6980383 B2 JP 6980383B2 JP 2016555413 A JP2016555413 A JP 2016555413A JP 2016555413 A JP2016555413 A JP 2016555413A JP 6980383 B2 JP6980383 B2 JP 6980383B2
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Description

本発明は、デヒドロゲナーゼ活性が向上したアマドリアーゼ、オキシダーゼ活性が低減されたアマドリアーゼ、デヒドロゲナーゼ活性が向上しオキシダーゼ活性が低減されたアマドリアーゼ、その遺伝子および組換え体ＤＮＡならびに該アマドリアーゼの製造法に関する。また本発明は、糖尿病の診断用酵素として、センサーとして、また、糖尿病マーカーの測定キットに有利に利用され得るアマドリアーゼに関する。
糖化タンパク質は、グルコースなどのアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）のアルデヒド基と、タンパク質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。タンパク質のアミノ基としてはアミノ末端のαアミノ基、タンパク質中のリジン残基側鎖のεアミノ基が挙げられる。生体内で生じる糖化タンパク質としては血液中のヘモグロビンが糖化された糖化ヘモグロビン、アルブミンが糖化された糖化アルブミンなどが知られている。
これら生体内で生じる糖化タンパク質の中でも、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。
このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、アマドリアーゼを用いる酵素的方法、すなわち、ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端より遊離させたα−フルクトシルバリルヒスチジン（以降「αＦＶＨ」と表す。）もしくはα−フルクトシルバリン（以降「αＦＶ」と表す。）を定量する方法が提案されている（例えば、特許文献１〜７参照。）。実際には、ＨｂＡ１ｃからαＦＶを切り出す方法では、夾雑物等による影響が大きく、正確な測定値が得られないという課題があり、より正確な測定値を得る目的から、特に現在ではαＦＶＨを測る方法が主流となっている。
アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸もしくはその誘導体（「アマドリ化合物」ともいう）を酸化して、グリオキシル酸またはα−ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する。
アマドリアーゼは、細菌、酵母、真菌から見出されているが、特にＨｂＡ１ｃの測定に有用である、αＦＶＨおよび／またはαＦＶに対する酵素活性を有するアマドリアーゼとしては、例えば、コニオカエタ（Coniochaeta）属、ユーペニシリウム（Eupenicillium）属、ピレノケータ（Pyrenochaeta）属、アルスリニウム（Arthrinium）属、カーブラリア（Curvularia）属、ネオコスモスポラ（Neocosmospora）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、フェオスフェリア（Phaeosphaeria）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、エメリセラ（Emericella）属、ウロクラディウム（Ulocladium）属、ペニシリウム（Penicillium）属、フザリウム（Fusarium）属、アカエトミエラ（Achaetomiella）属、アカエトミウム（Achaetomium）属、シエラビア（Thielavia）属、カエトミウム（Chaetomium）属、ゲラシノスポラ（Gelasinospora）属、ミクロアスカス（Microascus）属、レプトスフェリア（Leptosphaeria）属、オフィオボラス（Ophiobolus）属、プレオスポラ（Pleospora）属、コニオケチジウム（Coniochaetidium）属、ピチア（Pichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属由来のアマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１、６〜１５、非特許文献１〜１１参照。）。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。
アマドリアーゼはペルオキシダーゼと共役させ、発色基質を利用することにより、試料中の糖化基質の測定に利用することができる。従来のアマドリアーゼは糖化基質を酸化する際に、酸素分子に電子を伝達することができる。この活性をオキシダーゼ活性という。酵素のオキシダーゼ活性を低減しデヒドロゲナーゼ活性を増大させると、酸素分子の代わりに電子アクセプター（電子メディエーター）を電子アクセプターとして使用することができる。酸素分子の代わりに電子アクセプターを使用することで、酸素の影響を受けることなく測定を行うことできる。
公知の文献中にアマドリアーゼのデヒドロゲナーゼ活性の向上に関する開示がみられる：例えば、Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの５６位のアスパラギンをアラニンに置換することにより、デヒドロゲナーゼ活性におけるαＦＶに対するＶｍａｘ／Ｋｍが２．３倍向上することが示されている（特許文献１６参照）。しかしながら、開示されている変異体はオキシダーゼ活性におけるαＦＶに対するＶｍａｘ／Ｋｍも野生型と比較して１．２倍向上しているため、酸素の影響を依然として受けてしまうと考えられる。
国際公開第２００４／１０４２０３号 国際公開第２００５／４９８５７号 特開２００１−９５５９８号公報 特公平０５−３３９９７号公報 特開平１１−１２７８９５号公報 国際公開第９７／１３８７２号 特開２０１１−２２９５２６号公報 特開２００３−２３５５８５号公報 特開２００４−２７５０１３号公報 特開２００４−２７５０６３号公報 特開２０１０−３５４６９号公報 特開２０１０−５７４７４号公報 国際公開第２０１０／４１７１５号 国際公開第２０１０／４１４１９号 国際公開第２０１１／１５３２５号 特表２０１３−５００７２９号公報
Biochem. Biophys. Res. Commun. 311, 104-11, 2003 Biotechnol. Bioeng. 106, 358-66, 2010 J. Biosci. Bioeng. 102, 241-3, 2006 Eur. J. Biochem. 242, 499-505, 1996 Arch.Microbiol.178,344-50,2002 Mar.Biotechnol.6,625-32,2004 Biosci. Biotechnol. Biochem.59, 487-91,1995 Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 813-819, 2007 Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 1256-61, 2002 Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 2323-29, 2002 Biotechnol. Letters 27, 27-32,2005
本発明は、オキシダーゼ活性が低下し、デヒドロゲナーゼ活性が増大したアマドリアーゼを提供することを目的とする。また本発明は、活性が溶存酸素レベルの影響をほとんど受けないアマドリアーゼを提供することを目的とする。
酵素のオキシダーゼ活性の低下およびデヒドロゲナーゼ活性を付与するための情報はほとんど開示されていない現状の中で、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、Coniochaeta属由来のアマドリアーゼに対して、特定のアミノ酸残基の置換を導入することにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下を包含する。
[１] デヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合（ＯＸ／ＤＨ）が、改変前のアマドリアーゼと比較して低減している改変アマドリアーゼであって、
(i) アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位、２６７位、２６９位、５４位及び２４１位からなる群より選択される位置に対応する位置の１以上のアミノ酸が置換されており、かつデヒドロゲナーゼ活性を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位、２６７位、２６９位、５４位及び２４１位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつデヒドロゲナーゼ活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号４４、配列番号５３又は配列番号６７のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有するアマドリアーゼ、或いは
(iv) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号４４、配列番号５３又は配列番号６７のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有するアマドリアーゼ。
[２] 配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、セリン、トレオニン及びアスパラギンからなる群より選択される極性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群より選択される荷電アミノ酸、又はメチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン、トリプトファン、バリン又はアラニンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン、トリプトファン、バリン又はアラニンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における５４位に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン、アラニン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン又はバリンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における２４１位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸又はヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、１に記載のアマドリアーゼ。
[３] 配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、セリン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン又はメチオニンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン又はトリプトファンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン又はトリプトファンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における５４位に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン又はアラニンに置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における２４１位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸又はリシンに置換されている、２に記載のアマドリアーゼ。
[４] 配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、セリン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン又はメチオニンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における５４位に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン又はアラニンに置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における２４１位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸又はリシンに置換されている、３に記載のアマドリアーゼ。
[５] 配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、又はセリンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における２４１位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミンに置換されている、３に記載のアマドリアーゼ。
[６] 配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン又はヒスチジンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、３に記載のアマドリアーゼ。
[７] 配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、３に記載のアマドリアーゼ。
[８] デヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合（ＯＸ／ＤＨ）が、改変前のアマドリアーゼ（１００％）と比較して８０％未満に低減されている、１〜７のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[９] 前記アマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、又はアルスロバクター(Arthrobacter)属由来である、１〜８のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[１０] 配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号４４、配列番号５３又は配列番号６７に示すアミノ酸配列を有し、１〜７のいずれかに規定したアミノ酸置換を有する、１〜９のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[１１] さらに、アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下からなる群より選択される位置に対応する位置にアミノ酸置換又は欠失を１以上有し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有する、１〜１０のいずれかに記載のアマドリアーゼ、
（Ａ）６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９位、６８位及び３５６位、
（Ｂ）２６２位、２５７位、２４９位、２５３位、３３７位、３４０位、２３２位、１２９位、１３２位、１３３位、４４位、２５６位、２３１位及び８１位、並びに
（Ｃ）カルボキシル末端の４３５位、４３６位及び４３７位の３アミノ酸残基の欠失。
[１２] さらに、アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸の１以上が、以下からなる群より選択されるアミノ酸に置換されており又は欠失しており、かつデヒドロゲナーゼ活性を有する、１１に記載のアマドリアーゼ、
（Ａ）６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸の、アラニン、アスパラギン又はアスパラギン酸への置換、
６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸の、ヒスチジン又はアラニンへの置換、
１０２位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の、リジンへの置換
１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸の、アラニン、リジン、又はアルギニンへの置換、
１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のロイシン又はチロシンへの置換、
１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のリジン又はアルギニンへの置換、
３５５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換、
４１９位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、
６８位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、
３５６位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のトレオニンへの置換、
（Ｂ）２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、
２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステイン、セリン、トレオニンへの置換、
２４９位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
２５３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
３３７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、
２３２位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
１２９位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
１３２位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
１３３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンへの置換、
４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、
２５６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
２３１位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
８１位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、並びに
（Ｃ）４３５位のプロリン、４３６位のリジン及び４３７位のロイシンに対応する位置のカルボキシル末端３アミノ酸の欠失。
[１３] １〜１２のいずれかに記載のアマドリアーゼを含むＨｂＡ１ｃ測定試薬キット。
[１４] １〜１２のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む酵素電極。
[１５] １４に記載の酵素電極を作用電極として有する酵素センサー。
[１６] １〜１２のいずれかに記載のアマドリアーゼ又は１４に記載の酵素電極若しくは１５に記載の酵素センサー及び電子メディエーターを用いる、ＨｂＡ１ｃの測定方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2014-217405号の開示内容を包含する。
本発明によれば、酸素の影響を受けにくく、さらに高感度測定が可能な糖尿病の診断用酵素として、また、糖尿病マーカー測定用センサーに用いることができる優れたアマドリアーゼ、およびそれをコードする遺伝子等を提供することができる。このアマドリアーゼを用いると、酸素存在下でもより正確に糖化ヘモグロビンの測定を行うことができる。
各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列における同一性及び類似アミノ酸を例示する図である。Co、Et、Py、Ar、Cc、Nvのほか、Cn、Pn、An、En、Ul及びPjをアライメントした。 図１−２は、図１−１の続きである。 図１−３は、図１−２の続きである。 図１−４は、図１−３の続きである。 図１−５は、図１−４の続きである。 アマドリアーゼのオキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性を示す。図２は酵素反応を説明するための模式図であって、酵素の基質特異性等の特性を限定するものではない。 ＣＦＰ―Ｔ７アマドリアーゼを用いたαＦＶＨの電気化学的測定結果を示す。 図３−１の続きである。 ＣＦＰ−Ｔ７―２８０Ｑアマドリアーゼを用いたαＦＶＨの電気化学的測定結果を示す。 図４−１の続きである。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のアマドリアーゼは糖化タンパク質や糖化ペプチドを基質としうる。
（糖化タンパク質、ヘモグロビンA1c）
本発明における糖化タンパク質とは、非酵素的に糖化されたタンパク質を指す。糖化タンパク質は生体内、外を問わず存在し、生体内に存在する例としては、血液中の糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンなどがあり、糖化ヘモグロビンの中でもヘモグロビンのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化された糖化ヘモグロビンを特にヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）と言う。生体外に存在する例としては、タンパク質やペプチドと糖が共存する液状調味料などの飲食品や輸液などがある。
（糖化ペプチド、フルクトシルペプチド）
本発明における糖化ペプチドとは、糖化タンパク質由来の非酵素的に糖化されたペプチドを指し、ペプチドが直接非酵素的に糖化されたものや、プロテアーゼ等により糖化タンパク質が分解された結果生じたものや糖化タンパク質を構成する（ポリ）ペプチドが糖化されたものが含まれる。糖化ペプチドをフルクトシルペプチドと表記することもある。糖化タンパク質において、糖化を受けるペプチド側のアミノ基としては、アミノ末端のα−アミノ基、ペプチド内部のリジン残基側鎖のε−アミノ基などが挙げられるが、本発明における糖化ペプチドとは、より具体的には、α−糖化ペプチド（α−フルクトシルペプチド）である。α−糖化ペプチドは、Ｎ末端のα−アミノ酸が糖化された糖化タンパク質から何らかの手段、例えば、プロテアーゼによる限定分解などにより遊離させて形成される。例えば、対象の糖化タンパク質がヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）である場合、該当するα−糖化ペプチドは、Ｎ末端が糖化されているＨｂＡ１ｃのβ鎖から切り出される糖化されたペプチドを指す。１４６残基のアミノ酸により構成されているＨｂＡ１ｃのβ鎖もまたα−糖化ペプチドに該当する（αＦ１４６Ｐ）。
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質（基質）は、ＨｂＡ１ｃ、より具体的にはＨｂＡ１ｃのβ鎖である。別の実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質はＨｂＡ１ｃのβ鎖から切り出されるα−糖化ペプチド、例えばαＦＶ〜αＦ１２８Ｐ、αＦＶ〜αＦ６４Ｐ、αＦＶ〜αＦ３２Ｐ、αＦＶ〜αＦ１６Ｐ、例えばαＦ６Ｐ（α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸）である。別の実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質はαＦＶＨ（α−フルクトシルバリルヒスチジン）又はαＦＶ（α−フルクトシルバリン）である。
（アマドリアーゼ）
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等とも称され、酸素の存在下で、イミノ２酢酸またはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸またはα−ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物または植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母または細菌等から得ることができる。
本発明のアマドリアーゼの一態様は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するConiochaeta属由来のアマドリアーゼまたは配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するCurvularia clavata由来のアマドリアーゼに基づき作製された、デヒドロゲナーゼ活性が向上したアマドリアーゼの変異体である。
本発明のアマドリアーゼの一態様は、配列番号３または配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有するEupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼに基づき作製された、デヒドロゲナーゼ活性が向上したアマドリアーゼの変異体である。
本発明のアマドリアーゼの一態様は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するPhaeosphaeria nodorum由来のアマドリアーゼに基づき作製された、デヒドロゲナーゼ活性が向上したアマドリアーゼの変異体である。
本発明のアマドリアーゼの一態様は、配列番号１０又は配列番号配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有するAspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼに基づき作製された、デヒドロゲナーゼ活性が向上したアマドリアーゼの変異体である。
本発明のアマドリアーゼの一態様は、配列番号１１または配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するEmericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼに基づき作製された、デヒドロゲナーゼ活性が向上したアマドリアーゼの変異体である。
このような変異体の例としては、配列番号１、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号４４、配列番号５３又は配列番号６７と高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するアミノ酸配列を有するアマドリアーゼおよび配列番号１、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号４４、配列番号５３又は配列番号６７のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼを挙げることができる。
なお、本発明のアマドリアーゼは例えば、Eupenicillium属、Pyrenochaeta属、Arthrinium属、Curvularia属、Neocosmospora属、Cryptococcus属、Phaeosphaeria属、Aspergillus属、Emericella属、Ulocladium属、Penicillium属、Fusarium属、Achaetomiella属、Achaetomium属、Thielavia属、Chaetomium属、Gelasinospora属、Microascus属、Leptosphaeria属、Ophiobolus属、Pleospora属、Coniochaetidium属、Pichia属、Corynebacterium属、Agrobacterium属、Arthrobacter属などの生物種に由来するアマドリアーゼに基づき作製されたものでもよい。これらの中でもデヒドロゲナーゼ活性を有し、かつ／又はアミノ酸配列が上記のように配列番号１と高い配列同一性を有するものが好ましい。
オキシダーゼ活性が低減し、デヒドロゲナーゼ活性が向上したアマドリアーゼの変異体（改変体）は、アマドリアーゼのアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基を置換する、または付加する、または欠失させることによって得ることができる。
（デヒドロゲナーゼ活性の向上／オキシダーゼ活性の低減をもたらす置換）
デヒドロゲナーゼ活性の向上及び／又はオキシダーゼ活性の低減をもたらすアミノ酸の置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。
（１）２８０位のシステインの置換、例えば、グルタミン、セリン、トレオニン及びアスパラギンからなる群より選択される極性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群より選択される荷電アミノ酸、又はメチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸への置換。
（２）２６７位のフェニルアラニンの置換、例えばチロシン、ロイシン、メチオニン、トリプトファン、イソロイシン、バリン又はアラニンからなる群より選択される疎水性アミノ酸残基への置換。
（３）２６９位のフェニルアラニンの置換、例えばチロシン、ロイシン、メチオニン、トリプトファン、イソロイシン、バリン又はアラニンからなる群より選択される疎水性アミノ酸残基への置換。
（４）５４位のアスパラギン酸の置換、例えばアスパラギン、アラニン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン又はバリンへの置換。
（５）２４１位のチロシンの置換、例えばグルタミン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン又はヒスチジンへの置換。
本明細書では便宜上、グルタミン、セリン、トレオニン及びアスパラギンを極性アミノ酸ということがある。またアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、及びヒスチジンを荷電アミノ酸ということがある。またアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンを疎水性アミノ酸ということがある。またメチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリンを嵩高いアミノ酸ということがある。
本発明のデヒドロゲナーゼ活性が向上／オキシダーゼ活性が低減したアマドリアーゼの変異体は、上記アミノ酸置換を少なくとも１つ有していればよく、複数のアミノ酸置換を有していてもよい。例えば、上記アミノ酸置換の１、２、３、４、又は５を有している。
その中でも、以下のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸の置換を有しているデヒドロゲナーゼ活性が向上し、かつ、オキシダーゼ活性が低減した変異体が好ましい。
（１）２８０位のシステインの置換、例えば、グルタミン、セリン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、メチオニン、リシン、アルギニン、又はアスパラギンへの置換。
（２）２６７位のフェニルアラニンの置換、例えばチロシン、ロイシン又はメチオニンへの置換。
（３）２６９位のフェニルアラニンの置換、例えばチロシン、ロイシン又はメチオニンへの置換。
（４）５４位のアスパラギン酸の置換、例えばアスパラギン、アラニンへの置換。
（５）２４１位のチロシンの置換、例えばグルタミン、リシン、又はグルタミン酸への置換。
本発明のアマドリアーゼ変異体は、配列番号１に示すアミノ酸配列において、上記のデヒドロゲナーゼ活性の向上及び／又はオキシダーゼ活性の低減をもたらすアミノ酸の置換を有し得る。さらに、本発明のアマドリアーゼ変異体は、それらの置換アミノ酸以外の位置で、さらに１または数個（例えば１〜１５個、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、挿入、付加および／または置換されていてもよい。さらに本発明は、上記のデヒドロゲナーゼ活性の向上及び／又はオキシダーゼ活性の低減をもたらすアミノ酸の置換変異、基質特異性等、デヒドロゲナーゼ活性向上以外の性質を向上させるアミノ酸の置換変異を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列における前記置換したアミノ酸以外のアミノ酸を除いた部分のアミノ酸配列に対して、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上のアミノ酸配列同一性を有し、アマドリアーゼ活性を有し、デヒドロゲナーゼ活性が改変されたアマドリアーゼ変異体を包含する。
なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼは、国際公開２００７／１２５７７９号においてｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７と称する組換え体プラスミド（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５９３）を保持する大腸菌が生産するConiochaeta属由来のアマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７）であり、先に出願人が見出した熱安定性の優れた改変型アマドリアーゼである。このＣＦＰ−Ｔ７は、天然型のConiochaeta属由来のアマドリアーゼに対し、２７２位、３０２位および３８８位に人為的な変異を順次導入することにより獲得した３重変異体である。
上記のアミノ酸置換において、アミノ酸の位置は配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を表しているが、他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列においては、配列番号１に示されるアミノ酸配列における位置に対応する位置のアミノ酸が置換されている。「対応する位置」の意味については後述する。
（さらなる置換）
（アマドリアーゼの基質特異性を変化させるアミノ酸置換について）
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりその基質特異性を変化させることができることを以前に報告した（例えば国際公開２０１３／１６２０３５号を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。本発明のアマドリアーゼは、場合により、さらにこのようなアミノ酸置換を有してもよい。
アマドリアーゼの基質特異性を変化させるアミノ酸の置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のグルタミン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４１９位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアラニン
場合により６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸は、アラニン、アスパラギン又はアスパラギン酸へと置換されてもよい。
場合により（ｂ）６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸は、ヒスチジン又はアラニンへと置換されてもよい。
場合により（ｃ）１０２位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸は、リジンへと置換されてもよい。
場合により（ｄ）１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸は、アラニン、リジン、又はアルギニンへと置換されてもよい。
場合により（ｅ）１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸はロイシン又はチロシンへと置換されてもよい。
場合により（ｆ）１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はリジン又はアルギニンへと置換されてもよい。
場合により（ｇ）３５５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はセリンへと置換されてもよい。
場合により（ｈ）４１９位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はリジンへと置換されてもよい。
場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸はアスパラギンへと置換されてもよい。
場合により（ｊ）３５６位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はトレオニンへと置換されてもよい。
（アマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸置換について）
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりその界面活性剤耐性を向上させることができることを確認している。例えば特願２０１３−２２１５１５号及びＰＣＴ／ＪＰ２０１４／０７１０３６号明細書を参照のこと。これらの文献は参照によりその全内容を本明細書に組み入れるものとする。
アマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸の置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。
（i）２６２位のアスパラギン、
（ii）２５７位のバリン、
（iii）２４９位のグルタミン酸
（iv）２５３位のグルタミン酸、
（v）３３７位のグルタミン、
（vi）３４０位のグルタミン酸、
（vii）２３２位のアスパラギン酸、
（viii）１２９位のアスパラギン酸、
（ix）１３２位のアスパラギン酸、
（x）１３３位のグルタミン酸、
（xi）４４位のグルタミン酸、
（xii）２５６位のグリシン、
（xiii）２３１位のグルタミン酸、及び
（xiv）８１位のグルタミン酸、
場合により２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸はヒスチジンへと置換されてもよい。
場合により２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸はシステイン、セリン、トレオニンへと置換されてもよい。
場合により２４９位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により２５３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により３３７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はプロリンへと置換されてもよい。
場合により２３２位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により１２９位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により１３２位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により１３３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はプロリンへと置換されてもよい。
場合により２５６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により２３１位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により８１位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
（アマドリアーゼの熱安定性を向上させるアミノ酸欠失について）
本発明者らは以前に、アマドリアーゼのカルボキシル末端から、３アミノ酸残基を欠失させることにより、その熱安定性を向上させうることを報告した（国際公開第２０１３／１００００６号明細書を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは上記の置換に加え、さらにカルボキシル末端からの３アミノ酸残基を欠失していてもよい。本明細書においてカルボキシル末端からの３アミノ酸残基の欠失を、熱安定性を向上させる欠失と呼ぶことがある。
（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）
これらのアマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子（以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう。）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷＩＬＥＹ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
次いで、上記アマドリアーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからアマドリアーゼ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、アマドリアーゼをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のアマドリアーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
このようにして得られたアマドリアーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、Coniochaeta属由来のアマドリアーゼ遺伝子（特開２００３−２３５５８５号公報）の例などが挙げられる。
これらのアマドリアーゼ遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。例えば、Coniochaeta sp. NISL 9330株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡがｐＫＫ２２３−３ Ｖｅｃｔｏｒ（ＧＥヘルスケア社製）に挿入された組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ（特開２００３−２３５５８５号公報）が挙げられる。
（ベクター）
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなくそれ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等が好ましい。
（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；またはタンパク質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸または５−ブロモウラシル等を挙げることができる。
上記接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件をとることが可能であり、現実に所望の変異をアマドリアーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、ｐ２４〜３０、１９８９年６月号）。
タンパク質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）：Ｇｅｎｅ，３７，７３（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，８７４９（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，８７６５（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１４，９６７９（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，４８８（１９８５）：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））等が挙げられる。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社， ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製， Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の利用が挙げられる。
また、一般的なＰＣＲ法（ポリメラーゼチェインリアクション、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１（１９８９））。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変アマドリアーゼ遺伝子を合成することもできる。
上記方法により得られるアマドリアーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定もしくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いることにより行うことができる。
（形質転換・形質導入）
上述の如くして得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞もしくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、得られた組換え体ＤＮＡを用いて、任意の宿主、例えば、エッシェリシア属に属する微生物、具体例としては大腸菌Ｋ−１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ社製）や大腸菌Ｂ株、好ましくは大腸菌ＢＬ２１株（ニッポンジーン社製）等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得ることができる。
（アミノ酸配列の同一性又は類似性）
アミノ酸配列の同一性又は類似性は、ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１１（ゼネティックス社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソリューションズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、該２以上のアマドリアーゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。
また、２以上のアマドリアーゼにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばCLUSTALWを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴリズムとしてBlosum62を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似と判断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本発明の変異体において、アミノ酸置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメントにより、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の相同性領域（保存領域）を決定できる。
本明細書において「相同性領域」とは、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、ある基準となるアマドリアーゼと比較対象のアマドリアーゼの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似アミノ酸からなる領域であって、連続する３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上のアミノ酸からなる領域をいう。例えば、図１では全長アミノ酸配列の配列同一性が７４％以上であるアマドリアーゼをアライメントした。このうち、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第１０位〜３２位は同一又は類似アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位は相同性領域に該当しうる。
好ましくは、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として、第１１位〜３２位、３６〜４１位、５０〜５２位、５４〜５８位、８４〜８６位、８８〜９０位、１４５〜１５０位、１５７〜１６８位、２０２〜２０５位、２０７〜２１２位、２１５〜２２５位、２３６〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、３４７〜３５４位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、及び４０５〜４１０位のアミノ酸配列からなる領域である。
さらに好ましくは、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第１１〜１８位、２０〜３２位、５０〜５２位、５４〜５８位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７７〜２８６位、及び３７０〜３８３位のアミノ酸配列からなる領域である。
本発明のアマドリアーゼ変異体は、配列番号１、配列番号３、配列番号６
、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号４４、配列番号５３又は配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼとアライメントしたときに５０％以上、例えば６０％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、デヒドロゲナーゼ活性を有する。さらに、本発明のアマドリアーゼ変異体の相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号１における相同性領域のアミノ酸配列と７５％以上、例えば８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有する。
（アミノ酸に対応する位置の特定）
「アミノ酸に対応する位置」とは、配列番号１に示すConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
「アミノ酸に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
図１−１、１−２、１−３、１−４、１−５に種々の公知の生物種由来のアマドリアーゼの配列を例示する。配列番号１で示されるアミノ酸配列を最上段に示す。図１に示される各種配列は、いずれも配列番号１の配列と７０％以上の同一性を有し、公知のアルゴリズムを用いて整列させた。図中に、本発明の変異体における変異点を示す。図１−１、１−２、１−３、１−４、１−５からConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を知ることができる。図１−１、１−２、１−３、１−４、１−５には、Coniochaeta属由来のアマドリアーゼ（配列番号１）、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号３）、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号４）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号６）、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号７）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号９）、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１０）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２）およびPenicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１３）のアミノ酸配列を示してある。
（置換箇所に対応する位置）
なお、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２８０位のシステインに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２８０位のシステインに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基（相当する位置のアミノ酸残基）」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１−３より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２８０位のシステイン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２７８位のシステイン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２８０位のシステイン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２７８位のシステイン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２８０位のシステイン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８０位のシステイン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２７６位のシステイン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８０位のシステイン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２８０位のシステイン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２７８位のシステイン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２８０位のシステインである。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２６７位のフェニルアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２６７位のフェニルアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１−３より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２６５位のフェニルアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２６５位のフェニルアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２６３位のフェニルアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６５位のフェニルアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニンである。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２６９位のフェニルアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６９位のフェニルアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１−３より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２６９位のフェニルアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２６９位のフェニルアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２６９位のフェニルアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６９位のフェニルアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２６５位のフェニルアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６９位のフェニルアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２６９位のイソロイシン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６７位のフェニルアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６９位のフェニルアラニンである。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の５４位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の５４位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１−１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは５４位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは５４位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは５４位のアスパラギン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは５４位のアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは５４位のアスパラギン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは５４位のアスパラギン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは５４位のアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは５３位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは５３位のアスパラギン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは５４位のアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは５４位のアスパラギン酸である。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２４１位のチロシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２４１位のチロシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１−３より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２４１位のフェニルアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２３９位のチロシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２４１位のチロシン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２３９位のチロシン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２４１位のチロシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４１位のチロシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２３７位のチロシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４１位のフェニルアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４１位のフェニルアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３９位のチロシン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４１位のフェニルアラニンである。
（基質特異性改変変異の対応位置）
なお、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６２位のアルギニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６２位のアルギニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは６２位のセリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは６１位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６１位のアルギニンである。
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６３位のロイシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６３位のロイシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６３位のイソロイシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは６２位のロイシンである。
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０２位のグルタミン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１０２位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０２位のグルタミン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０２位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０２位のリジン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０１位のグルタミン酸である。
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１０６位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１０６位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０６位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１０６位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１０６位のグリシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０６位のセリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１０５位のリジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０５位のグリシンである。
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１１０位のグルタミンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１０位のリジン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１０位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１１０位のグルタミン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１１０位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１０位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１１０位のグリシン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１０９位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは、１０９位のリジンである。
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１３位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１１３位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１３位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１１３位のトレオニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１３位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１１３位のリジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１１２位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１３位のアスパラギン酸である。
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３５５位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５５位のアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５３位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３５６位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３５５位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３５１位のアラニンである。
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４１９位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの４１９位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４１９位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは４１９位のグリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４１８位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは４２１位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４２０位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４１６位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４１９位のセリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４２０位のアラニンである。
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６８位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６８位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ及びAspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６７位のアスパラギン酸である。
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５６位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３５６位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５６位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは３５６位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３５４位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３５７位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは３５４位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３５６位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５６位のアスパラギン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３５２位のアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５６位のアスパラギン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３５６位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５４位のアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５６位のアスパラギンである。
（界面活性剤耐性向上変異の対応位置）
なお、本明細書において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４４位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの４４位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１により特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは４４位のリジン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４４位のロイシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４４位のプロリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４３位のプロリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４３位のプロリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４４位のプロリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４４位のプロリンである。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の８１位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの８１位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは８１位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のヒスチジン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のアスパラギン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８１位のアスパラギン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８０位のアスパラギン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは８０位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８１位のアスパラギンである。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１３３位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の１３３位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１３３位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３３位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３１位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３２位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３３位のリジン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３３位のアスパラギン酸である。
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２５３位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５３位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２５３位のアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５１位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５３位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２５１位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２５３位のバリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５３位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４９位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５３位のアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５３位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５１位のグルタミン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５３位のグルタミンである。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２５６位のグリシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２５６位のグリシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２５６位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５４位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５６位のグリシン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２５４位のアスパラギン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２５６位のグリシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５６位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５２位のアスパラギン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５６位のアスパラギン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５６位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５４位のアスパラギン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５６位のアスパラギン酸である。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２５７位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２５７位のバリンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２５７位のバリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５５位のトレオニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５７位のシステイン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２５５位のバリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２５７位のシステイン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のシステイン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５３位のセリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のトレオニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５７位のトレオニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５５位のバリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のバリンである。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２６２位のアスパラギンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２６２位のアスパラギンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２６２位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２６０位のアスパラギン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２６２位のヒスチジン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２６０位のアスパラギン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２６２位のヒスチジン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６２位のアスパラギン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５８位のアスパラギン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６２位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２６２位のアスパラギン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６０位のアスパラギン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６２位のアスパラギン酸である。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３３７位のグルタミンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３３７位のグルタミンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわちEupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは３３７位のリジン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３３５位のリジン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のグルタミン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは３３５位のトレオニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３３７位のリジン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３７位のリジン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３３位のリジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３７位のアスパラギン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３７位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３５位のトレオニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３７位のリジンである。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３４０位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３４０位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは３４０位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３４１位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３４０位のプロリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３６位のリジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸である。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１２９位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１２９位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１２９位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２９位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１２７位のアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２８位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１２８位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２９位のグルタミン酸である。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１３２位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１３２位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３０位のアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３１位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３１位のアスパラギン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸である。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２３１位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２３１位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２３１位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２２９位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２２９位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２２７位のヒスチジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２２９位のグルタミン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸である。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２３２位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２３２位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２３２位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２３０位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２３０位のアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３２位のグリシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２２８位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３０位のアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３２位のアスパラギン酸である。
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２４９位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２４９位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２４９位のリジン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２４７位のリジン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２４９位のヒスチジン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２４７位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２４９位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４９位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４５位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４９位のアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４９位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４７位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４９位のグルタミンである。
（熱安定性向上欠失の対応位置）
本明細書において「配列番号１記載のアマドリアーゼのカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置」とは、アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列のカルボキシル末端からの３アミノ酸残基を意味する。Coniochaeta属由来のアマドリアーゼにおける、この位置の３残基の配列は、４３５位のプロリン、４３６位のリジン及び４３７位のロイシンからなり、これらに対応する位置のアミノ酸配列も、上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
すなわちEupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のヒスチジン及び４３７位のロイシンからなり、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３８位のアラニン、４３９位のリジン及び４４０位のロイシンからなり、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４５０位のヒスチジン、４５１位のリジン及び４５２位のロイシンからなり、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３８位のセリン、４３９位のリジン及び４４０位のロイシンからなり、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のアスパラギン及び４３７位のロイシンからなり、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３６位のアラニン、４３７位のリジン及び４３８位のメチオニンからなり、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３６位のアラニン、４３７位のリジン及び４３８位のメチオニンからなり、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３９位のアラニン、４４０位のリジン及び４４１位のロイシンからなり、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のリジン及び４３７位のロイシンからなる。
（本発明のアマドリアーゼの生産）
上記のようにして得られたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーまたは大豆もしくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
なお、培地の初発ｐＨは、ｐＨ７〜９に調整するのが適当である。
また、培養は任意の条件を用いることができるが、例えば、２０〜４２℃の培養温度、好ましくは３０℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは３０℃前後の培養温度で８〜１６時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施することができる。
培養終了後、該培養物よりアマドリアーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪もしくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩または硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、アマドリアーゼの粗酵素を得る。
上記アマドリアーゼの粗酵素よりさらにアマドリアーゼ精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたアマドリアーゼ酵素標品を得ることができる。このようにして、所望のデヒドロゲナーゼ活性が向上したアマドリアーゼを得ることができる。
本発明のキットに含まれるアマドリアーゼは、Eupenicillium属、Pyrenochaeta属、Arthrinium属、Curvularia属、Neocosmospora属、Cryptococcus属、Phaeosphaeria属、Aspergillus属、Emericella属、Ulocladium属、Penicillium属、Fusarium属、Achaetomiella属、Achaetomium属、Thielavia属、Chaetomium属、Gelasinospora属、Microascus属、Leptosphaeria属、Ophiobolus属、Pleospora属、Coniochaetidium属、Pichia属、Corynebacterium属、Agrobacterium属、Arthrobacter属などに由来する天然のアマドリアーゼ又はそれらの変異体であり得る。こうした変異体は、配列番号１に示すアミノ酸配列の２８０位のシステイン、２６７位のフェニルアラニン、２６９位のフェニルアラニン、５４位のアスパラギン酸、２４１位のチロシンよりなる群から選択される位置のアミノ酸に対応する位置で１またはそれ以上のアミノ酸置換を有する。当業者であれば、例えば後述する試験法等により、あるアマドリアーゼ又はその変異体が本発明のキットに使用可能か、すなわち所望のデヒドロゲナーゼ活性を有するか容易に調べることができる。
（本発明のアマドリアーゼにおけるデヒドロゲナーゼ活性の向上）
上記のような手段で得られる本発明のアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較してオキシダーゼ活性が低下し、かつ／又はデヒドロゲナーゼ活性が向上していることを特徴とする。具体的には、改変前のものと比較して、「デヒドロゲナーゼ活性」に対する「オキシダーゼ活性」の割合が低減していることを特徴とする。オキシダーゼ活性とは、基質を酸化する際、酸素分子に電子を受け渡す活性をいう。デヒドロゲナーゼ活性とは、基質を酸化する際、ヒドリド（H-）を電子アクセプターに受け渡す活性をいう。
センサーを用いた糖化ヘモグロビンの測定において、酸素の影響を低減するには、オキシダーゼ活性が低いことが望まれる。一方で、基質との反応性の観点からは、デヒドロゲナーゼ活性が高いことが好ましい。この両者を考慮すると、電子メディエーターを使用する糖化ヘモグロビン測定では、アマドリアーゼのオキシダーゼ活性（ＯＸ）とデヒドロゲナーゼ活性（ＤＨ）の比ＯＸ／ＤＨが低いことが好ましく、また、アマドリアーゼのオキシダーゼ活性（ＯＸ）が低く、かつ、デヒドロゲナーゼ活性（ＤＨ）が高いことが好ましい。そこで本明細書では便宜上、アマドリアーゼの特性を、オキシダーゼ活性に対するデヒドロゲナーゼ活性の割合を示すＤＨ／ＯＸ、又はデヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合ＯＸ／ＤＨを用いて表現することがある。ある実施形態において本発明の改変アマドリアーゼは、改変前のものと比較してデヒドロゲナーゼ活性が増大している。ある実施形態において本発明の改変アマドリアーゼは、改変前のものと比較してオキシダーゼ活性が低減されている。ある実施形態において本発明の改変アマドリアーゼは、改変前のものと比較してデヒドロゲナーゼ活性とオキシダーゼ活性の比ＯＸ／ＤＨ比が低い（ＤＨ／ＯＸ比が高い）。ある実施形態において本発明の改変アマドリアーゼは、改変前のものと比較してデヒドロゲナーゼ活性が増大しているのみならず、さらにオキシダーゼ活性が低減されている。具体的には、本発明の改変アマドリアーゼにおける、オキシダーゼ活性に対するデヒドロゲナーゼ活性の割合を示すＤＨ／ＯＸは、改変前（１．０倍）に対して１．３倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、２００倍以上、３００倍以上、４００倍以上、例えば４５０倍以上増大していることが好ましい。また、本発明の改変アマドリアーゼにおける、デヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合を示すＯＸ／ＤＨは改変前（１００％）と比較して、９０％未満、８０％未満、７５％未満、５０%未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５%未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、例えば０．２％未満に低減していることが好ましい。
デヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合は、公知のアマドリアーゼの測定法を用いて、任意の条件下で測定し、改変前のものと比較することができる。例えば、ｐＨ７．０において、１ｍＭのある糖化基質、例えばαＦＶを添加して測定したオキシダーゼ活性を、１ｍＭの該糖化基質、例えばαＦＶを添加して測定したデヒドロゲナーゼ活性で割った比率として求めることにより、デヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合を算出し、これを改変前のものと改変後のもので比較することができる。
（ハイスループットスクリーニング）
アマドリアーゼはさらに、機能性アマドリアーゼ変異体を取得するためにハイスループットスクリーニングに供することができる。例えば変異導入したアマドリアーゼ遺伝子を有する形質転換又は形質導入株のライブラリーを作製し、これをマイクロタイタープレートに基づくハイスループットスクリーニングに供してもよく、または液滴型マイクロ流体に基づく超ハイスループットスクリーニングに供してもよい。例としてはバリアントをコードする変異遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築し、次いでファージディスプレイ(例えばChem. Rev. 105 (11): 4056-72, 2005)、イーストディスプレイ(例えばComb Chem High Throughput Screen. 2008;11(2): 127-34)、バクテリアルディスプレイ(例えばCurr Opin Struct Biol 17: 474-80, 2007)等を用いて、変異アマドリアーゼの大きな集団をスクリーニングする方法が挙げられる。またAgresti et al, "Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution" Proceedings of the National Academy of Sciences 107 (9): 4004-4009 (Mar, 2010)を参照のこと。アマドリアーゼバリアントのスクリーニングに使用しうる超ハイスループットスクリーニング手法についての同文献の記載を参照により本明細書に組み入れる。例えばエラープローンPCR法によりライブラリーを構築することができる。また飽和突然変異誘発を用いて、本明細書に記載の位置又はそれに対応する位置を標的として変異導入しライブラリーを構築してもよい。ライブラリーを用いて電気コンピテントEBY-100細胞等の適当な細胞を形質転換し、約１０の７乗の変異体を取得しうる。該ライブラリーで形質転換した酵母細胞を次いでセルソーティングに供しうる。標準ソフトリトグラフィー法を用いて作製したポリジメトキシルシロキサン(PDMS)マイクロ流体デバイスを用いてもよい。フローフォーカスデバイスを用いて単分散の液滴を形成することができる。個別の変異体を含有する形成された液滴を適当なソーティングデバイスに供しうる。細胞を選別する際にはデヒドロゲナーゼ活性の有無を利用しうる。変異導入と選別は複数回反復してもよい。
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
アマドリアーゼの活性は、オキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性があり、種々の方法を用いることにより測定できる。一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
（アマドリアーゼのオキシダーゼ活性の測定方法）
本発明におけるアマドリアーゼのオキシダーゼ活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。
以下、本発明におけるアマドリアーゼのオキシダーゼ活性測定には、断りのない限り、フルクトシルバリンを基質として用いる。なお、ある実施形態において、酵素力価は、フルクトシルバリンを基質として測定したとき、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義することができる。フルクトシルバリン等の糖化アミノ酸、およびフルクトシルバリルヒスチジン等の糖化ペプチドは、阪上らの方法に基づき合成、精製することができる（特開２００１−９５５９８号参照）。なお、これは測定方法の説明のための便宜であって、本発明に用いるアマドリアーゼの基質特異性はフルクトシルバリンに何ら限定されるものではない。
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：ＰＯＤ−４−ＡＡ溶液
４．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１００ｍｇの４−アミノアンチピリン（東京化成工業社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１Ｌに定容する。
（２）試薬２：ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム、同仁化学社製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（３）試薬３：基質溶液（３０ｍＭ；終濃度 １ｍＭ）
フルクトシルバリン８３ｍｇをイオン交換水に溶解して１０ｍｌに定容する。
Ｂ．測定法
２．７ｍｌの試薬１，１００μｌの試薬２、および１００μｌの試薬３を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、酵素液を１００μｌ加えてよく混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値は、５５５ｎｍにおける１分後から３分後の１分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様に調製する。３７℃、１分当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位（Ｕ）とし、下記の式に従って算出する。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝ ｛（ΔＡｓ−ΔＡ０）×３．０×ｄｆ｝÷（３９．２×０．５×０．１）
ΔＡｓ ： 反応液の１分間あたりの吸光度変化
ΔＡ０ ： 対照液の１分間あたりの吸光度変化
３９．２： 反応により生成されるキノンイミン色素のミリモル吸光係数（ｍＭ−１・ｃｍ−１）
０．５ ： １ｍｏｌの過酸化水素による生成されるキノンイミン色素のｍｏｌ数
ｄｆ ： 希釈係数。
（アマドリアーゼのデヒドロゲナーゼ活性の測定方法）
本発明におけるアマドリアーゼのデヒドロゲナーゼ活性の測定方法としては、酸素以外の電子メディエーターを電子アクセプターとして利用し、酸化型電子メディエーターの消費量を測定する方法や酵素反応により得られたホルマザン色素の生成量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、ホルマザン色素の生成量を測定する方法について示す。
以下、本発明におけるアマドリアーゼのデヒドロゲナーゼ活性測定には、断りのない限り、フルクトシルバリンを基質として用いる。なお、酵素力価は、フルクトシルバリンを基質として測定したとき、１分間に１μｍｏｌのホルマザン色素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。
Ｃ．試薬の調製
（４）試薬４：ＷＳＴ−３溶液
７００ｍｇのＷＳＴ−３（２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ， ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、同仁化学社製）をイオン交換水（ｐＨ７．０）に溶解し、１００ｍＬに定容する。
（５）試薬５：メトキシＰＭＳ（ｍＰＭＳ）溶液
５０ｍｇのｍＰＭＳ（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ、同仁化学社製）をイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。
Ｄ．測定法
５４１μｌの９５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に１５０μｌの試薬４，９μｌの試薬５、および２５μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を２５μｌ加えてよく混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０、日立ハイテクノロジーズ社製）により、４３３ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値は、４３３ｎｍにおける１分後から２分後の１分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液は、２５μｌの試薬３の代わりに２５μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様に調製する。３７℃、１分当たりに生成されるＷＳＴ−３のホルマザン色素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位（Ｕ）とし、下記の式に従って算出する。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝ ｛（ΔＡｓ−ΔＡ０）×０．７５×ｄｆ｝÷（３１×０．０２５）
ΔＡｓ ： 反応液の１分間あたりの吸光度変化
ΔＡ０ ： 対照液の１分間あたりの吸光度変化
３１： 反応により生成されるＷＳＴ−３のホルマザン色素のミリモル吸光係数（ｍＭ−１・ｃｍ−１）
ｄｆ ： 希釈係数。
（測定試薬キット、センサー）
ある実施形態において、本発明は、デヒドロゲナーゼ活性の向上した本発明のアマドリアーゼを含む、ＨｂＡ１ｃ測定キット及びＨｂＡ１ｃ測定装置を提供する。このキット又は装置は、場合により電子メディエーターを含んでもよい。
ある実施形態において、本発明は、デヒドロゲナーゼ活性の向上した本発明のアマドリアーゼを含む固定した酵素電極を提供する。ある実施形態において、デヒドロゲナーゼ活性の向上した本発明のアマドリアーゼは酵素電極に塗布、吸着、又は固定化されていてもよい。別の実施形態では、電子メディエーターも電極に塗布、吸着、又は固定化してよい。電極としては炭素電極、白金、金、銀、ニッケル、パラジウムなどの金属電極などを用いることができる。炭素電極の場合、材料としてパイロリティック・グラファイトカーボン（PG）、グラッシーカーボン（GC）、カーボンペースト、プラスチックフォームドカーボン(PFC)などが挙げられる。測定システムは二電極系であっても三電極系であってもよく、例えば作用電極上に酵素を固定することができる。参照電極としては、標準水素電極、可逆水素電極、銀−塩化銀電極（Ag/AgCl）、パラジウム・水素電極、飽和カロメル電極等が挙げられ、安定性や再現性の観点から、Ag/AgClを用いることが好ましい。
酵素は、架橋、透析膜による被覆、高分子マトリックスへの封入、光架橋性ポリマーの使用、電気伝導性ポリマーの使用、酸化／還元ポリマーの使用等により電極に固定することができる。また酵素を電子メディエーターと共にポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、これらの手法を組合せてもよい。
本発明のアマドリアーゼは、ポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いることにより、種々の電気化学的な測定手法に適用することができる。電気化学的測定法としては、アンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリーなどの様々な手法が挙げられる。例えばアンペロメトリー法により、還元されたメディエーターが印加電圧によって酸化される際に生じる電流値を測定することで、試料中の糖化基質の濃度を算出することができる。印加電圧はメディエーターや装置の設定にもよるが、例えば−１０００〜＋１０００ｍＶ（ｖ．ｓ． Ａｇ／ＡｇＣｌ）などとすることができる。
糖化基質（例えばαＦＶＨ）の濃度の測定は、例えば以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型アマドリアーゼを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、糖化基質（例えばαＦＶＨ）を含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度の糖化基質（例えばαＦＶＨ）溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中の糖化基質（αＦＶＨ）濃度を計算することができる。
さらに、測定に必要な溶液量を低減するために、印刷電極を用いることもできる。この場合、電極は絶縁基板上に形成されてなることが好ましい。具体的には、フォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷、フレキソ印刷などの印刷技術により、電極を基板上に形成されることが望ましい。また、絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルなどが挙げられるが、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものを用いるのがより好ましい。
ある実施形態において、本発明は、該酵素電極を含むセンサーを提供する。
別の実施形態では、本発明の酵素電極を利用し、試料中のアマドリ化合物の濃度を、酵素反応により生じる電流を測定することにより決定することができる。一例として、酵素電極を作用電極とし、これを対電極及び参照電極と共に使用する。対電極は例えば白金電極とすることができ、参照電極は例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極とすることができる。温度を一定に保ち、電極をメディエーターを含む緩衝液中に挿入する。作用電極に電圧を印加し、試料を添加後、電流の変化を測定する。
本発明の測定方法、キット、装置及びセンサーに用いるメディエーター（人工電子メディエーター、人工電子アクセプター、電子メディエーターともいう）は、デヒドロゲナーゼ活性の向上した本発明のアマドリアーゼから電子を受け取ることができるものであれば特に限定されない。メディエーターとしてはキノン類、フェナジン類、ビオロゲン類、シトクロム類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、例えばフェリシアン化カリウム、フェレドキシン類、フェロセン、オスミウム錯体およびその誘導体等などが挙げられ、フェナジン化合物としては例えばＰＭＳ、メトキシＰＭＳが挙げられるがこれに限定されない。
ある実施形態において本発明の改変アマドリアーゼはデヒドロゲナーゼ活性が向上している。ある実施形態におて本発明の改変アマドリアーゼはオキシダーゼ活性が低減されている。ある実施形態において、本発明の改変アマドリアーゼはオキシダーゼ活性／デヒドロゲナーゼ活性比（ＯＸ／ＤＨ比）が低下している。またある実施形態において、本発明の改変アマドリアーゼはデヒドロゲナーゼ活性が向上し、かつオキシダーゼ活性が低減されている。このような本発明の改変アマドリアーゼが触媒する酵素反応は、酸素の影響を受けない、ほとんど受けない又は受けにくい。本発明の改変アマドリアーゼは、従来のアマドリアーゼと同じ用途に使用することができる。また、本発明のアマドリアーゼは、試料中の糖化基質濃度の測定に使用することができ、これは例えば糖尿病の診断に役立てることができる。また、本発明のアマドリアーゼは酵素電極として使用することができる。これは種々の電気化学的測定に用いることができる。また、本発明のアマドリアーゼは酵素センサーとして使用することができる。また、本発明のアマドリアーゼは糖尿病マーカーの測定キットに利用することができる。ただしこれは例示であり、本発明の改変アマドリアーゼの用途はこれに限られない。
［実施例１］
（デヒドロゲナーゼ活性向上型変異について）
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡの調製
ＣＦＰ−Ｔ７遺伝子（配列番号２）を含む組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株（国際公開２００７／１２５７７９号参照）を、ＬＢ−ａｍｐ培地［１％（Ｗ／Ｖ） バクトトリプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ） ペプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ） ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ］２．５ｍｌに接種して、３７℃で２０時間振とう培養し、培養物を得た。
この培養物を７，０００ｒｐｍで、５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。次いで、この菌体よりＱＩＡＧＥＮ ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７を抽出して精製し、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７のＤＮＡ２．５μｇを得た。
（２）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡの部位特異的改変操作
得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号１４、１５の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて決定し、その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２８０位のシステインがグルタミンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-280Q）を得た。
同様の手順で、配列番号１記載のアミノ酸配列の２８０位のシステインをセリンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ ＤＮＡを鋳型として、配列番号１５、１６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２８０位のシステインがセリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CFP-T7-280S）を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号１５、１７の合成オリゴヌクレオチドを使用し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２８０位のシステインがアスパラギン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-280D)を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号１５、１８の合成オリゴヌクレオチドを使用し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２８０位のシステインがグルタミン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-280E)を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号１５、１９の合成オリゴヌクレオチドを使用し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２８０位のシステインがメチオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-280M)を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号１５、２０の合成オリゴヌクレオチドを使用し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２８０位のシステインがリシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-280K)を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号１５、２１の合成オリゴヌクレオチドを使用し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２８０位のシステインがアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-280R)を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号１５、２２の合成オリゴヌクレオチドを使用し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２８０位のシステインがバリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-280V)を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号１５、２３の合成オリゴヌクレオチドを使用し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２８０位のシステインがアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-280N)を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号２４、２５の合成オリゴヌクレオチドを使用し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６７位のフェニルアラニンがチロシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-267Y)を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号２６、２７の合成オリゴヌクレオチドを使用し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６９位のフェニルアラニンがチロシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-269Y)を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号２８、２９の合成オリゴヌクレオチドを使用し、配列番号１記載のアミノ酸配列の５４位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-54N)を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号２９、３０の合成オリゴヌクレオチドを使用し、配列番号１記載のアミノ酸配列の５４位のアスパラギン酸がアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-54A)を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号３１、３２の合成オリゴヌクレオチドを使用し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２４１位のチロシンがグルタミン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-241E)を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号３２、３３の合成オリゴヌクレオチドを使用し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２４１位のチロシンがグルタミンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-241Q)を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号３２、３４の合成オリゴヌクレオチドを使用し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２４１位のチロシンがリシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-241K)を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号３５、３６の合成オリゴヌクレオチドを使用し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２８０位のシステインがヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-280H)を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号３５、３７の合成オリゴヌクレオチドを使用し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２８０位のシステインがスレオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-280T)を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号３８、３９の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応、DpnI処理を行った後、DpnI処理済みのDNAを２μｌ、Ligation high ver.2 (東洋紡製)を５μｌ、5 U/μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼを１μｌ加えて、滅菌水により全量を１５μｌとして、16℃で1時間反応させた。その後、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６７位のフェニルアラニンがロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-267L)を保持する大腸菌JM109株を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号３８、４０の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応、DpnI処理を行った後、DpnI処理済みのDNAを２μｌ、Ligation high ver.2 (東洋紡製)を５μｌ、5 U/μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼを１μｌ加えて、滅菌水により全量を１５μｌとして、16℃で1時間反応させた。その後、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６７位のフェニルアラニンがメチオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-267M)を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号４１、４２の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応、DpnI処理を行った後、DpnI処理済みのDNAを２μｌ、Ligation high ver.2 (東洋紡製)を５μｌ、5 U/μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼを１μｌ加えて、滅菌水により全量を１５μｌとして、16℃で1時間反応させた。その後、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６９位のフェニルアラニンがロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-269L)を得た。
同様に、組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7 DNAを鋳型として、ただし配列番号４１、４３の合成オリゴヌクレオチドを使用し、PCR反応、DpnI処理を行った後、DpnI処理済みのDNAを２μｌ、Ligation high ver.2 (東洋紡製)を５μｌ、5 U/μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼを１μｌ加えて、滅菌水により全量を１５μｌとして、16℃で1時間反応させた。その後、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６９位のフェニルアラニンがメチオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CFP-T7-269M)を得た。
ＰＣＲ反応、形質転換及び塩基配列決定はいずれも上記と同様に行った。
（３）各種改変型アマドリアーゼの生産
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌ＪＭ１０９株を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、３０℃で１６時間培養した。その後、各菌体をｐＨ７．０の０．０１Ｍリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各粗酵素液１．５ｍｌを調製した。
（４）各種改変型アマドリアーゼのオキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性評価
このようにして調製した各粗酵素液をサンプルとし、上記のオキシダーゼ活性測定法およびデヒドロゲナーゼ活性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼのオキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性の評価を行った。結果の一例を表１に示す。
表１において、ＣＦＰ−Ｔ７は、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株由来のアマドリアーゼを示す。なお、本実施例では大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株由来のアマドリアーゼであるＣＦＰ−Ｔ７を変異元酵素としたため、表中に記載の「アミノ酸変異」の記載には、ＣＦＰ−Ｔ７に既に導入済みの各種変異点は含めていない。表中、オキシダーゼ活性（％）とデヒドロゲナーゼ活性（％）は、元酵素ＣＦＰ−Ｔ７のオキシダーゼ活性（Ｕ／ｍＬ）を１００とした場合のパーセンテージで示す。また表中のＯＸ／ＤＨ（％）は、元酵素ＣＦＰ−Ｔ７のＯＸ／ＤＨ比を１００とした場合のパーセンテージを示す。
Figure 0006980383
表１に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ７のデヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合、ＯＸ／ＤＨは２６．０となり、酸素の影響を強く受けることが分かった。これに対し、部位特異的変異導入により得られた２２の変異体のうち、Ｃ２８０Ｖを除くすべての変異体、すなわち、ＣＦＰ−Ｔ７の２８０位のシステインがグルタミン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、メチオニン、リシン、アルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、トレオニンに、２６７位のフェニルアラニンがチロシン、ロイシン、メチオニンに、２６９位のフェニルアラニンがチロシン、ロイシン、メチオニンに、５４位のアスパラギン酸がアスパラギン、アラニンに、２４１位のチロシンがグルタミン酸、グルタミン、リシンに、それぞれ変異したアマドリアーゼにおいては、ＯＸ／ＤＨがいずれも１９以下まで改善し、顕著なものでは１０以下まで改善し、より顕著なものでは６以下まで改善し、さらに顕著なものでは３．７以下まで改善した。特に、Ｃ２８０Ｑ、Ｃ２８０Ｓ、Ｆ２６７Ｙ、Ｆ２６７Ｌ、Ｆ２６７Ｍ、Ｆ２６９Ｙ、Ｆ２６９Ｌ、Ｆ２６９Ｍ、Ｙ２４１Ｑについては、ＣＦＰ−Ｔ７と比較して、デヒドロゲナーゼ活性が向上しているにも関わらず、オキシダーゼ活性が低減していることが示された。したがって、これらの各変異点が、アマドリアーゼのデヒドロゲナーゼ活性を向上させる変異点であることが示された。
２８０位については、グルタミン、セリン、アスパラギンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく極性アミノ酸残基であるトレオニンへの置換により同様の結果が得られると考えられ、これは上記のとおり確認された。
また２８０位については、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく荷電アミノ酸残基であるヒスチジンへの置換により同様の結果が得られると考えられ、これは上記のとおり確認された。
また２８０位については、メチオニンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく嵩高いアミノ酸であるフェニルアラニン、チロシン、トリプトファンやさらにはプロリンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
２６７位及び２６９位については、チロシン、メチオニン、ロイシンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく疎水性アミノ酸残基であるイソロイシン、トリプトファン、さらにはバリンやアラニンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
５４位については、アスパラギンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく極性アミノ酸残基であるグルタミンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。また、極性アミノ酸残基への置換により良好な結果が得られたことから、荷電アミノ酸であるヒスチジンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また５４位についてはアラニンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく非極性で側鎖の比較的小さいグリシン及びバリンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
２４１位については、グルタミンへの置換により良好な結果が得られたことから、同じく極性アミノ酸残基であるアスパラギンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
また２４１位については、リジン、グルタミン酸への置換により良好な結果が得られたことから、同じく荷電アミノ酸残基であるアルギニン、アスパラギン酸及びヒスチジンへの置換により同様の結果が得られると考えられる。
［実施例２］
（ＣＦＰ−Ｔ７、ＣＦＰ−Ｔ７−２８０Ｑの精製）
実施例１で得たＣＦＰ−Ｔ７およびＣＦＰ−Ｔ７−２８０Ｑの粗酵素を用いて、調製した粗酵素液を２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した４ｍｌのＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に８０ｍｌの同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて１００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂に吸着していた蛋白質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。
得られたアマドリアーゼ活性を示す画分を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５， ３０Ｋ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）で濃縮した。その後、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、同緩衝液で溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収し、野生型および改変型アマドリアーゼの精製標品を得た。得られた精製標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により、単一なバンドまで精製されていることを確認した。
（オキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性評価）
上記のようにして得た精製酵素ＣＦＰ−Ｔ７およびＣＦＰ−Ｔ７−２８０Ｑのオキシダーゼ活性、デヒドロゲナーゼ活性を評価した。実施例１に準じたオキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性測定方法に従って、評価を行った。ただし、用いた基質は３０ｍＭのαＦＶＨであり、測定に用いた酵素の２８０ｎｍの吸光度が１あたりの酵素活性値（Ｕ／Ａ２８０）を算出した。結果の一例を表２に示す。表中のＯＸ／ＤＨ（％）は、元酵素ＣＦＰ−Ｔ７のＯＸ／ＤＨ比を１００とした場合のパーセンテージを示す。
Figure 0006980383
表２より、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ７のオキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性の割合、ＯＸ／ＤＨは９．９となり、αＦＶＨの測定においても酸素の影響を強く受けることが分かった。これに対し、ＣＦＰ−Ｔ７−２８０ＱのＯＸ／ＤＨは０．０３７となり、大幅に改善した。本発明であるＣ２８０Ｑ変異体はオキシダーゼ活性を２０８倍低下させ、デヒドロゲナーゼ活性を１．３倍向上させた。すなわち、酸素の影響をほとんど受けずに、αＦＶＨを測定することができるといえる。
［実施例３］（各種アマドリアーゼの部位特異的改変操作）
（組換え体プラスミドpUTE100K’-EFP-T5 DNAの調製）
配列番号４４はEupenicillium terrenum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（EFP-T5）の改変型酵素のアミノ酸配列であり、配列番号４４のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号４５）を挿入した組換え体プラスミドpUTE100K’-EFP-T5を保持する大腸菌により生産できる（国際公開第２００７／１２５７７９号公報参照）。pUTE100K’-EFP-T5を保持する大腸菌JM109株を「実施例１ （１）組換え体プラスミドpK223-3-CFP-T7 DNAの調製」に記載の方法に従って培養し、pUTE100K’-EFP-T5を抽出、精製した。
（Eupenicillium terrenum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入）
EFP-T5にデヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合を改善する変異を導入するために、組換え体プラスミドpUTE100K’-EFP-T5を鋳型にして、配列番号４６、４７の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のEFP-T5変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号４４記載のアミノ酸配列の２８０位のシステインがグルタミンに置換されたEFP-T5遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pUTE100K’-EFP-T5−280Q）を得た。
同様に、組換え体プラスミドドpUTE100K’-EFP-T5を鋳型として、ただし配列番号３５、３６の合成オリゴヌクレオチドを使用し、配列番号４４記載のアミノ酸配列の２８０位のシステインがセリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド(pUTE100K’-EFP-T5−280S)を得た。
（組換え体プラスミドpET22b-PnFX DNAの調製）
配列番号９はPhaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（PnFX）のアミノ酸配列であり、配列番号９のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号４９）を挿入した組換え体プラスミドpET22b-PnFXを保持する大腸菌により生産できる（国際公開第２０１３／１６２０３５号公報参照）。pET22b-PnFXを保持する大腸菌JM109株を「実施例１ （１）組換え体プラスミドpK223-3-CFP-T7 DNAの調製」に記載の方法に従って培養し、pET22b-PnFXを抽出、精製した。
（Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入）
PnFXにデヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合を改善する変異を導入するために、前述の様に調製した組換え体プラスミドpET22b-PnFXを鋳型にして、配列番号５０、５１の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＰｎＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号９記載のアミノ酸配列の２７６位のシステインがグルタミンに置換されたPnFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pET22b-PnFX-276Q）を得た。
続いて、上記と同様にして、pET22b-PnFXを鋳型とし、配列番号５０、５２の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９記載のアミノ酸配列の２７６位のシステインがセリンに置換されたPnFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pET22b-PnFX-276S）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌BL21(DE3)株を形質転換し、大腸菌BL21(DE3) （pET22b-PnFX-276Q）株、大腸菌BL21(DE3) （pET22b-PnFX-276S）株を得た。
（組換え体プラスミドpET22b-AnFX DNAの調製）
配列番号５３はフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を付与するために５９位のセリンをグリシンへ置換したAspergillus nidulans由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（AnFX）のアミノ酸配列であり、配列番号５３のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号５４）を挿入した組換え体プラスミドpET22b-AnFXを保持する大腸菌により生産できる（国際公開第２０１２／０１８０９４号公報参照）。pET22b-AnFXを保持する大腸菌JM109株を「実施例１ （１）組換え体プラスミドpK223-3-CFP-T7 DNAの調製」に記載の方法に従って培養し、pET22b-AnFXを抽出、精製した。
（Aspergillus nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入）
AnFXにデヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合を改善する変異を導入するために、組換え体プラスミドpET22b-AnFXを鋳型にして、配列番号５５、５６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のAnFX変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号５３記載のアミノ酸配列の280位のシステインがグルタミンに置換されたAnFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pET22b-AnFX-280Q）を得た。
続いて、上記と同様にして、pET22b-AnFXを鋳型とし、配列番号５５，５７の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号５３記載のアミノ酸配列の280位のシステインがセリンに置換されたAnFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pET22b-AnFX-280S）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌BL21(DE3)株を形質転換し、大腸菌BL21(DE3) （pET22b-AnFX-280Q）株、大腸菌BL21(DE3) （pET22b-AnFX-280S）株を得た。
（組換え体プラスミドpKK223-3-CcFX DNAの調製）
配列番号６はＣｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来ケトアミンオキシダーゼ（CcFX）のアミノ酸配列である（国際公開第ＷＯ２００４／１０４２０３号）。配列番号6のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号５８）を挿入した組換え体プラスミドpKK223-3-CcFXを保持する大腸菌により生産できる（国際公開第２０１５／０２０２００号公報参照）。pKK223-3-CcFXを保持する大腸菌JM109株を「実施例１ （１）組換え体プラスミドpK223-3-CFP-T7 DNAの調製」に記載の方法に従って培養し、pKK223-3-CcFXを抽出、精製した。
（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ遺伝子への点変異導入）
CcFXにデヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合を改善する変異を導入するために、組換え体プラスミドpKK223-3-CcFXを鋳型にして、配列番号５９、６０の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のCcFX変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号6記載のアミノ酸配列の278位のシステインがグルタミンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CcFX-278Q）を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号５９，６１の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号6記載のアミノ酸配列の278位のシステインがセリンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CcFX-278S）を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号６２，６３の合成オリゴヌクレオチドを使用して、PCR反応、DpnI処理を行った後、DpnI処理済みのDNAを２μｌ、Ligation high ver.2 (東洋紡製)を５μｌ、5 U/μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼを１μｌ加えて、滅菌水により全量を１５μｌとして、16℃で1時間反応させた。その後、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、配列番号6記載のアミノ酸配列の265位のフェニルアラニンがロイシンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CcFX-265L）を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号６２，６４の合成オリゴヌクレオチドを使用して、PCR反応、DpnI処理を行った後、DpnI処理済みのDNAを２μｌ、Ligation high ver.2 (東洋紡製)を５μｌ、5 U/μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼを１μｌ加えて、滅菌水により全量を１５μｌとして、16℃で1時間反応させた。その後、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、配列番号6記載のアミノ酸配列の265位のフェニルアラニンがメチオニンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CcFX-265M）を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号６５，６６の合成オリゴヌクレオチドを使用して、PCR反応、DpnI処理を行った後、DpnI処理済みのDNAを２μｌ、Ligation high ver.2 (東洋紡製)を５μｌ、5 U/μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼを１μｌ加えて、滅菌水により全量を１５μｌとして、16℃で1時間反応させた。その後、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、配列番号6記載のアミノ酸配列の267位のフェニルアラニンがロイシンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CcFX-267L）を得た。
続いて、上記と同様にして、pKK223-3-CcFXを鋳型とし、配列番号６５，８２の合成オリゴヌクレオチドを使用して、PCR反応、DpnI処理を行った後、DpnI処理済みのDNAを２μｌ、Ligation high ver.2 (東洋紡製)を５μｌ、5 U/μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼを１μｌ加えて、滅菌水により全量を１５μｌとして、16℃で1時間反応させた。その後、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、配列番号6記載のアミノ酸配列の267位のフェニルアラニンがメチオニンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pKK223-3-CcFX-267M）を得た。
（Emericella nidulans由来のケトアミンオキシダーゼ遺伝子への点変異導入）
配列番号６７はEmericella nidulans由来糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ（En42FX）のアミノ酸配列である（国際公開第ＷＯ２０１５／００５２５８号）。配列番号６７のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号６８）を定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成によりｃＤＮＡを全合成することで取得した（終止コドンＴＡＡを含む）。続いて、取得した配列番号６９の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.製)のユーザーマニュアルに従って、配列番号６８の遺伝子を含む断片を、配列番号６９,７０の合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅した。平行して、pET22bを含む断片を、配列番号７１、７２の合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅した。続いて、In-fusion反応により、配列番号６８の遺伝子を含む断片を、pET22bを含む断片にサブクローニングし、組換え体プラスミドpET22b-En42FXを取得し、上記と同様の条件で大腸菌JM109株を形質転換し、大腸菌JM109 (pET22b-En42FX)株を得た。
En42FXにデヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合を改善する変異を導入するために、組換え体プラスミドpET22b-En42FXを鋳型にして、配列番号７３、７４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応を行った後、DpnI処理済みのDNAを２μｌ、Ligation high ver.2 (東洋紡製)を５μｌ、5 U/μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼを１μｌ加えて、滅菌水により全量を１５μｌとして、16℃で1時間反応させた。その後、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のEn42FX変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号６７記載のアミノ酸配列の280位のシステインがグルタミンに置換されたEn42FX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pET22b-En42FX-280Q）を得た。
続いて、上記と同様にして、pET22b-En42FXを鋳型とし、配列番号７３，７５の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６７記載のアミノ酸配列の280位のシステインがセリンに置換されたEn42FX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pET22b-En42FX-280S）を得た。
続いて、上記と同様にして、pET22b-En42FXを鋳型とし、配列番号７６，７７の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６７記載のアミノ酸配列の267位のフェニルアラニンがロイシンに置換されたEn42FX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pET22b-En42FX-267L）を得た。
続いて、上記と同様にして、pET22b-En42FXを鋳型とし、配列番号７６，７８の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６７記載のアミノ酸配列の267位のフェニルアラニンがメチオニンに置換されたEn42FX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pET22b-En42FX-267M）を得た。
続いて、上記と同様にして、pET22b-En42FXを鋳型とし、配列番号７９，８０の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６７記載のアミノ酸配列の269位のイソロイシンがロイシンに置換されたEn42FX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pET22b-En42FX-269L）を得た。
続いて、上記と同様にして、pET22b-En42FXを鋳型とし、配列番号７９，８１の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６７記載のアミノ酸配列の269位のイソロイシンがメチオニンに置換されたEn42FX遺伝子をコードする組換え体プラスミド（pET22b-En42FX-269M）を得た。
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌BL21(DE3)株を形質転換し、大腸菌BL21(DE3) （pET22b-En42FX-280Q）株、大腸菌BL21(DE3) （pET22b-En42FX-280S）株、大腸菌BL21(DE3) （pET22b-En42FX-267L）株、大腸菌BL21(DE3) （pET22b-En42FX-267M）株、大腸菌BL21(DE3) （pET22b-En42FX-269L）株、大腸菌BL21(DE3) （pET22b-En42FX-269M）株を得た。
（各種改変型アマドリアーゼの生産）
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌ＪＭ１０９株、もしくは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、２５℃で１６時間培養した。その後、各菌体をｐＨ７．０の０．０１Ｍリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各粗酵素液１．５ｍｌを調製した。
（各種改変型アマドリアーゼのオキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性評価）
このようにして調製した各粗酵素液をサンプルとし、上記のオキシダーゼ活性測定法およびデヒドロゲナーゼ活性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼのオキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性の評価を行った。結果を表３−７に示す。表４、５、６中、オキシダーゼ活性（％）とデヒドロゲナーゼ活性（％）は、それぞれの野生型酵素または元酵素のオキシダーゼ活性（Ｕ／ｍＬ）を１００とした場合のパーセンテージで示す。また表３−７中のＯＸ／ＤＨ（％）は、それぞれの野生型酵素または元酵素のＯＸ／ＤＨ比を１００とした場合のパーセンテージを示す。
Figure 0006980383
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表３-７に示す通り、配列番号１のアマドリアーゼの２８０位のシステインに対応する位置のアミノ酸残基をグルタミン、もしくはセリンに置換した全ての場合において、アミノ酸置換前の野生型酵素と比較して、ＯＸ／ＤＨの値が改善された。これは、前述のアミノ酸置換によるＯＸ／ＤＨ改善効果が、アマドリアーゼの由来を問わず発揮されることを意味する。
［実施例４］
（印刷電極によるαＦＶＨの定量）
実施例２で得たＣＦＰ−Ｔ７及びＣＦＰ−Ｔ７−２８０Ｑの精製酵素を用いて、印刷電極測定によるαＦＶＨの定量を行った。具体的には、カーボンの作用電極、銀塩化銀の参照電極が印刷されてなる、ＤＥＰ Ｃｈｉｐ電極（ＤＥＰ−ＥＰ−ＰＰ，丸形・カーボン・ダムリング付き；バイオデバイステクノロジー社製）上に、終濃度３．７５ｍＭ又は７．５ｍＭのｍＰＭＳ、終濃度約１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び１ｍＭ αＦＶＨに対して５０ｍＵの各種精製酵素液を１５μＬに溶解した液を載せた。その後、ＤＥＰ Ｃｈｉｐ専用コネクターを用いて、小型ポテンショスタット ＢＤＴ ｍｉｎｉＳＴＡＴ １００（バイオデバイステクノロジー社製）に接続した。そして、＋２００ｍＶ（ｖ．ｓ． Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電圧を印加して、所定濃度のαＦＶＨ溶液５μＬをそれぞれ電極上に載せて反応を行い、１２０秒後の電流値を測定した。ＣＦＰ−Ｔ７を用いて反応させた各αＦＶＨ濃度における電流応答値をプロットした結果を図３に、ＣＦＰ−Ｔ７−２８０Ｑを用いて反応させた各αＦＶＨ濃度における電流応答値をプロットした結果を図４に示す。
図３−１、４−１より、３．７５ｍＭのｍＰＭＳを添加した系においては、ＣＦＰ−Ｔ７よりもＣＦＰ−Ｔ７−２８０Ｑの方が、精度よくαＦＶＨを定量できることが示された。また、図３−２、４−２より、７．５ｍＭのｍＰＭＳを添加した系においても、ＣＦＰ−Ｔ７よりもＣＦＰ−Ｔ７−２８０Ｑの方が、精度よくαＦＶＨを定量できることが示された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列の簡単な説明
配列番号１ ＣＦＰ−Ｔ７のアミノ酸配列
配列番号２ ＣＦＰ−Ｔ７の遺伝子配列
配列番号３ Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ
配列番号４ Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号５ Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号６ Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号７ Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号８ Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号９ Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号１０ Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号１１ Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号１２ Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号１３ Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号１４ C280Q-Fw
配列番号１５ C280Q-Rv
配列番号１６ C280S-Fw
配列番号１７ C280D-Fw
配列番号１８ C280E-Fw
配列番号１９ C280M-Fw
配列番号２０ C280K-Fw
配列番号２１ C280R-Fw
配列番号２２ C280V-Fw
配列番号２３ C280N-Fw
配列番号２４ F267Y-Fw
配列番号２５ F267X-Rv
配列番号２６ F269Y-Fw
配列番号２７ F269X-Rv
配列番号２８ D54N-Fw
配列番号２９ D54X-Rv
配列番号３０ D54A-Fw
配列番号３１ Y241E-Fw
配列番号３２ Y241X-Rv
配列番号３３ Y241Q-Fw
配列番号３４ Y241K-Fw
配列番号３５ CFP-T7 C280X r
配列番号３６ CFP-T7 C280H f
配列番号３７ CFP-T7 C280T f
配列番号３８ CFP-T7 F267X r
配列番号３９ CFP-T7 F267L f
配列番号４０ CFP-T7 F267M f
配列番号４１ CFP-T7 F269X r
配列番号４２ CFP-T7 F269L f
配列番号４３ CFP-T7 F269M f
配列番号４４ EFP-T5 protein
配列番号４５ EFP-T5 gene
配列番号４６ EFP C280X r
配列番号４７ EFP C280Q f
配列番号４８ EFP C280S f
配列番号４９ PnFX gene
配列番号５０ Pn C276X r
配列番号５１ Pn C276Q f
配列番号５２ Pn C276S r
配列番号５３ AnFX protein
配列番号５４ AnFX gene
配列番号５５ An C280X r
配列番号５６ An C280Q f
配列番号５７ An C280S f
配列番号５８ CcFX gene
配列番号５９ Cc C278X r
配列番号６０ Cc C278Q f
配列番号６１ Cc C278S f
配列番号６２ Cc F265X r
配列番号６３ Cc F265L f
配列番号６４ Cc F265M f
配列番号６５ Cc F267X r
配列番号６６ Cc F267L f
配列番号６７ En42FX protein
配列番号６８ En42FX gene
配列番号６９ In-fusion En42X insert
配列番号７０ In-fusion En42X insert
配列番号７１ In-fusion pET22b vector
配列番号７２ In-fusion pET22b vector
配列番号７３ En C280X r
配列番号７４ En C280Q f
配列番号７５ En C280S f
配列番号７６ En F267X r
配列番号７７ En F267L f
配列番号７８ En F267M f
配列番号７９ En I269X r
配列番号８０ En I269L f
配列番号８１ En I269M f
配列番号８２ Cc F267M f

Claims (16)

  1. デヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合（ＯＸ／ＤＨ）が、改変前のアマドリアーゼと比較して低減している改変アマドリアーゼであって、
    (i) 前記改変アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号４４、配列番号５３又は配列番号６７のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有し、かつデヒドロゲナーゼ活性及びオキシダーゼ活性を有する改変アマドリアーゼ、
    (ii) 前記改変前のアマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号４４、配列番号５３又は配列番号６７のアミノ酸配列を有するものであり、前記改変アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、さらに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつデヒドロゲナーゼ活性及びオキシダーゼ活性を有する改変アマドリアーゼ、或いは
    (iv) 前記改変アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号４４、配列番号５３又は配列番号６７のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつデヒドロゲナーゼ活性及びオキシダーゼ活性を有する改変アマドリアーゼ、
    からなる群より選択され、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、セリン、トレオニン及びアスパラギンからなる群より選択される極性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群より選択される荷電アミノ酸、又はメチオニンに置換されている、前記改変アマドリアーゼ。
  2. さらに、
    配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン、トリプトファン、バリン又はアラニンに置換されている、
    配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン、トリプトファン、バリン又はアラニンに置換されている、
    配列番号１に示すアミノ酸配列における５４位に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン、アラニン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン又はバリンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、或いは
    配列番号１に示すアミノ酸配列における２４１位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸又はヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、請求項１に記載の改変アマドリアーゼ。
  3. 配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、セリン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン又はメチオニンに置換されている、
    配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン又はトリプトファンに置換されている、
    配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン又はトリプトファンに置換されている、
    配列番号１に示すアミノ酸配列における５４位に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン又はアラニンに置換されている、或いは
    配列番号１に示すアミノ酸配列における２４１位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸又はリシンに置換されている、請求項２に記載の改変アマドリアーゼ。
  4. 配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、セリン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン又はメチオニンに置換されている、
    配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
    配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
    配列番号１に示すアミノ酸配列における５４位に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン又はアラニンに置換されている、或いは
    配列番号１に示すアミノ酸配列における２４１位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸又はリシンに置換されている、請求項３に記載の改変アマドリアーゼ。
  5. 配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、又はセリンに置換されている、
    配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
    配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、或いは
    配列番号１に示すアミノ酸配列における２４１位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミンに置換されている、請求項３に記載の改変アマドリアーゼ。
  6. 配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン又はヒスチジンに置換されている、
    配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、或いは
    配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、請求項３に記載の改変アマドリアーゼ。
  7. 配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミンに置換されている、
    配列番号１に示すアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、或いは
    配列番号１に示すアミノ酸配列における２６９位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、請求項３に記載の改変アマドリアーゼ。
  8. 前記改変アマドリアーゼのデヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合（ＯＸ／ＤＨ）が、配列番号１に示すアミノ酸配列における２８０位に対応する位置についての改変が行われる前のアマドリアーゼ（１００％）と比較して８０％未満に低減されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の改変アマドリアーゼ。
  9. 前記改変前のアマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属由来である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の改変アマドリアーゼ。
  10. 前記改変前のアマドリアーゼが、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号４４、配列番号５３又は配列番号６７に示すアミノ酸配列を有し、前記改変アマドリアーゼが請求項１〜７のいずれかに規定したアミノ酸置換を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の改変アマドリアーゼ。
  11. さらに、前記改変アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下からなる群より選択される位置に対応する位置にアミノ酸置換又は欠失を１以上有し、かつデヒドロゲナーゼ活性及びオキシダーゼ活性を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の改変アマドリアーゼ、
    （Ａ）６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９位、６８位及び３５６位、
    （Ｂ）２６２位、２５７位、２４９位、２５３位、３３７位、３４０位、２３２位、１２９位、１３２位、１３３位、４４位、２５６位、２３１位及び８１位、並びに
    （Ｃ）カルボキシル末端の４３５位、４３６位及び４３７位の３アミノ酸残基の欠失。
  12. さらに、前記改変アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸の１以上が、以下からなる群より選択されるアミノ酸に置換されており又は欠失しており、かつデヒドロゲナーゼ活性及びオキシダーゼ活性を有する、請求項１１に記載の改変アマドリアーゼ、
    （Ａ）６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸の、アラニン、アスパラギン又はアスパラギン酸への置換、
    ６３位のロイシンに対応する位置のアミノ酸の、ヒスチジン又はアラニンへの置換、
    １０２位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の、リジンへの置換
    １０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸の、アラニン、リジン、又はアルギニンへの置換、
    １１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のロイシン又はチロシンへの置換、
    １１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のリジン又はアルギニンへの置換、
    ３５５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換、
    ４１９位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、
    ６８位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、
    ３５６位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のトレオニンへの置換、
    （Ｂ）２６２位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、
    ２５７位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステイン、セリン、トレオニンへの置換、
    ２４９位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
    ２５３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
    ３３７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
    ３４０位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、
    ２３２位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
    １２９位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
    １３２位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
    １３３位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンへの置換、
    ４４位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、
    ２５６位のグリシンに対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
    ２３１位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
    ８１位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、並びに（Ｃ）４３５位のプロリン、４３６位のリジン及び４３７位のロイシンに対応する位置のカルボキシル末端３アミノ酸の欠失。
  13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の改変アマドリアーゼを含むＨｂＡ１ｃ測定試薬キット。
  14. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の改変アマドリアーゼを含む酵素電極。
  15. 請求項１４に記載の酵素電極を作用電極として有する酵素センサー。
  16. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の改変アマドリアーゼ又は請求項１４に記載の酵素電極若しくは請求項１５に記載の酵素センサー及び電子メディエーターを用いる、ＨｂＡ１ｃの測定方法。
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