JP6959755B2 - 蛍光画像分析装置、蛍光画像の分析方法及びコンピュータプログラム - Google Patents

Description

本発明は、蛍光画像分析装置、蛍光画像の分析方法及びコンピュータプログラムに関する。

特許文献１には、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ法）の検出にフローサイトメータ等を適用する際の細胞の処理方法が記載されている。ＦＩＳＨ法は、はじめに、細胞の核内に存在する標的部位の塩基配列に蛍光標識プローブをハイブリダイズさせる前処理を施し標的部位を蛍光標識する。続いて、蛍光標識プローブから生じた蛍光（輝点）を検出する。ＦＩＳＨ法は、分裂していない細胞でも染色体上の標的部位に結合する蛍光標識プローブを使って染色体異常を検出できる。さらにＦＩＳＨ法は、正常細胞と混在する染色体異常を有する細胞も検出することができ、その割合も分析することができる。

特表２００５−５１５４０８号公報

現在ＦＩＳＨ法による分析は、主に蛍光顕微鏡を使用して人（オペレータ）の目によって行われている。オペレータは、検出に使用するプローブごとに異常があると判定する陽性パターンと異常がないと判定する陰性パターンを記憶しておかなければならない。しかし、現在ＦＩＳＨ法で染色体異常を検出するためのプローブは数十種類存在し、また、陽性パターンの中には、典型的な染色体異常パターンと非典型的な染色体異常のパターンが存在する。オペレータはこれら全てについて陽性パターンと陰性パターンを把握しなければならず、ＦＩＳＨ法による分析は煩雑化している。さらに、輝点の判定はオペレータの感覚に依存するため、観察している細胞の蛍光色素の輝点パターンが陽性パターンであるか陰性パターンであるかの判定基準がオペレータの熟練度によって変わり、ＦＩＳＨ法による染色体異常の有無の判定精度の維持が困難になっている。

現在のＦＩＳＨ法による測定分析の問題に鑑み、本発明は、輝点パターンが陽性パターンであるか否かの判定精度を向上させることを課題とする。

本発明の第１の態様は、蛍光画像分析装置に関する。本態様に係る蛍光画像分析装置（１）は、標的部位を蛍光色素により標識した複数の細胞を含む試料（１０）に光を照射する光源（１２０〜１２３）と、光が照射されることにより蛍光を発する細胞の蛍光画像を細胞ごとに撮像する撮像部（１６０）と、撮像部（１６０）により撮像された蛍光画像を処理して、蛍光画像における蛍光の輝点パターンを取得する処理部（１１）と、を備える。処理部（１１）は、複数の測定項目に対応した複数の参照パターンから、試料（１０）の測定項目に対応した参照パターンを選択し、蛍光画像における蛍光の輝点パターンと、選択した参照パターンと、に基づいて、試料（１０）の判定に用いられる情報を生成する。

本発明の第２の態様は、標的部位を蛍光色素により標識した複数の細胞を含む試料（１０）を撮像して取得した細胞の蛍光画像を分析する蛍光画像の分析方法に関する。本態様に係る分析方法は、試料（１０）の測定項目を受け付け、複数の測定項目に対応した複数の参照パターンから、受け付けた試料（１０）の測定項目に対応した参照パターンを読み込み、蛍光画像における蛍光の輝点パターンと、読み込まれた参照パターンと、に基づいて、試料（１０）の判定に用いられる情報を生成し、生成した試料（１０）の判定に用いられる情報を表示する。

本発明の第３の態様は、標的部位を蛍光色素により標識した複数の細胞を含む試料（１０）を撮像して取得した細胞の蛍光画像の分析処理を、コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムに関する。本態様に係るコンピュータプログラムは、コンピュータに、試料（１０）の測定項目を受け付けるステップと、複数の測定項目に対応した複数の参照パターンから、受け付けた試料（１０）の測定項目に対応した参照パターンを読み込むステップと、蛍光画像における蛍光の輝点パターンと、読み込まれた参照パターンと、に基づいて、試料（１０）の判定に用いられる情報を生成するステップと、生成した試料（１０）の判定に用いられる情報を表示するステップと、を実行させる。

本発明の上記第１〜第３の態様によれば、細胞ごとに取得された蛍光画像の蛍光の輝点パターンと、複数の測定項目に対応した複数の参照パターンの中から試料の測定項目に対応する参照パターンと、に基づいて、試料の判定に用いられる情報を生成し、表示する。よって、オペレータ等が、染色体異常を有する異常細胞を示す多種類の輝点パターンを記憶して異常細胞であるか判定する必要がなく、異常細胞の判定がオペレータの感覚に依存しない。そのため、異常細胞の判定精度を高めることができ、その結果、試料の判定に用いられる情報の精度を向上することができる。

本発明によると、細胞の輝点パターンが染色体異常を有する異常細胞の輝点パターンであるか否かの判定精度を向上させることができる。

蛍光画像分析装置の一実施形態の構成を示す概略図である。 （ａ）は、蛍光画像分析装置により取得される第１画像〜第３画像及び明視野画像を例示する図であり、（ｂ）は、蛍光画像分析装置が行う核領域の抽出を説明するための模式図であり、（ｃ）及び（ｄ）は、蛍光画像分析装置が行う輝点の抽出を説明するための模式図である。 処理部の動作を説明するフローチャートである。 処理部の動作を説明するフローチャートである。 処理部の動作を説明するフローチャートである。 （ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、陰性パターン、陽性パターン１〜３の輝点パターンを説明するための模式図である。 ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子を標的とする各プローブがハイブリダイズする標的部位の例を示す図である。 ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子の典型陽性パターンの参照パターンの例を示す図である。 ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子の非典型陽性パターンの参照パターンの例を示す図である。 ＡＬＫ遺伝子座のプローブ例を示す図である。 ＡＬＫ遺伝子座に関連する染色体異常を検出した場合の陰性パターンと陽性パターンの参照パターン、及び、第５番染色体長腕（５ｑ）が欠失する染色体異常の例を示す図である。 蛍光画像分析装置の表示部の表示画面の一例である。 蛍光画像分析装置の表示部の表示画面の一例である。 測定装置の他の例の構成を示す模式図である。 蛍光画像分析装置の他の実施形態の構成を示す概略図である。

以下、本発明の実施形態を、添付の図面を参照して詳細に説明する。以下の実施形態は、細胞の核内に存在する標的部位（標的配列）と、前記標的配列と相補的な配列を有する核酸配列を含み蛍光色素により標識された核酸プローブ（以下、単にプローブという）とをハイブリダイズさせる前処理が施された試料を測定し、試料中の複数の細胞について細胞ごとに取得された蛍光画像の分析を行う装置及び方法に、本発明を適用したものである。

本実施態様の一例は、Fluorescence In Situ Hybridization (ＦＩＳＨ)法による染色体異常の分析を、例えばフローサイトメータ（例えば、イメージングフローサイトメータ）、蛍光顕微鏡等において行う。以下の実施形態では、一例として、核酸中の標的部位を２２番染色体にあるＢＣＲ遺伝子および９番染色体にあるＡＢＬ遺伝子とし、フローサイトメータを使用して、ＦＩＳＨ法によって、慢性骨髄性白血病に見られる９番染色体と２２番染色体との間における転座（ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子、フィラデルフィア染色体とも呼ばれる：ｔ（９；２２）（ｑ３４．１２；ｑ１１．２３））を有する細胞を測定及び分析する態様を示す。蛍光画像分析装置において検出される染色体異常は、（ＦＩＳＨ）法によって検出できる限り制限されない。染色体異常としては、転座、欠失、逆位、重複等を挙げることができる。具体的には、例えば、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子、ＡＬＫ遺伝子等の遺伝子座に関連する染色体異常を挙げることができる。図８、図９及び図１１に染色体異常があると判定するための陽性パターンを遺伝子毎に示す。

また、以下の実施形態では、測定対象となる細胞は、有核細胞である限り制限されない。例えば被験者から採取された検体中の有核細胞を挙げることができ、好ましくは血液検体中の有核細胞である。本明細書等において試料は、プローブとハイブリダイズした標的部位を含む検体由来の細胞を含む、測定に供される細胞浮遊液である。試料には複数の細胞が含まれる。複数の細胞とは、少なくとも１０^２個以上、好ましくは１０^３個以上、より好ましくは１０^４個以上、さらに好ましくは１０^５個以上、さらにより好ましくは１０^６個以上である。

本態様において、異常細胞とは染色体異常を有する細胞を意味する。異常細胞の例としては、がん細胞等の腫瘍細胞を挙げることができる。好ましくは、白血病等の造血器腫瘍細胞、肺癌等のがん細胞である。

図１は、本実施形態の蛍光画像分析装置１の概略構成を示す。図１に示す蛍光画像分析装置１は、測定装置１００及び処理装置２００を備えており、前処理装置３００による前処理により調製された試料１０を測定し、分析を行う。オペレータは、被検者から採取した血液検体に対してフィコール等の細胞分離用媒体を用いて遠心分離等を行って、測定対象細胞である有核細胞を回収する。有核細胞の回収にあたっては、遠心分離による有核細胞の回収に代えて溶血剤を用いて赤血球等を溶血させることにより有核細胞を残してもよい。前処理装置３００は、遠心分離等により得られた有核細胞浮遊液と試薬とを混合させるための混合容器、有核細胞浮遊液と試薬を混合容器に分注するための分注ユニット、混合容器を加温するための加温部等を含む。前処理装置３００は、被検者から採取した細胞内の標的部位を蛍光色素により標識する工程と、細胞の核を核染色用色素により染色する工程と、を含む前処理を行って試料１０を調製する。具体的には、標的部位を蛍光色素により標識する工程では、前記標的配列と、前記標的配列と相補的な配列を有する核酸配列を含み蛍光色素により標識されたプローブとをハイブリダイズされる。

ＦＩＳＨ法は、１以上の蛍光色素を使用して染色体上の標的部位を検出する。好ましくはＦＩＳＨ法は、２以上の蛍光色素を使用して第１の染色体上の標的部位と第２の染色体上の標的部位を検出する（「染色体」を修飾する「第１」及び「第２」は染色体番号を意味しない、包括的な数の概念である）。例えば、ＢＣＲ遺伝子座とハイブリダイズするプローブは、ＢＣＲ遺伝子座の塩基配列に相補的な配列を有する核酸が、波長λ１１の光が照射されることにより波長λ２１の第１蛍光を生じる第１蛍光色素によって標識されたものである。このプローブを使うことで、ＢＣＲ遺伝子座が、第１蛍光色素によって標識される。ＡＢＬ遺伝子座とハイブリダイズするプローブは、ＡＢＬ遺伝子座の塩基配列に相補的な配列を有する核酸が、波長λ１２の光が照射されることにより波長λ２２の第２蛍光を生じる第２蛍光色素によって標識されたものである。このプローブを使うことで、ＡＢＬ遺伝子座が、第２蛍光色素によって標識される。核は、波長λ１３の光が照射されることにより波長λ２３の第３蛍光を生じる核染色用色素によって染色される。波長λ１１、波長λ１２及び波長λ１３はいわゆる励起光である。

より具体的には、前処理装置３００は、脱水により細胞が収縮しないよう細胞を固定する処理、プローブを細胞内に導入できる大きさの穴を細胞に開ける膜透過処理、細胞に熱を加える熱変性処理、標的部位とプローブとをハイブリダイゼーションさせる処理、細胞から不要なプローブを除去する洗浄処理、および、核を染色する処理を含んでいる。

測定装置１００は、フローセル１１０と、光源１２０〜１２３と、集光レンズ１３０〜１３３と、ダイクロイックミラー１４０〜１４１と、集光レンズ１５０と、光学ユニット１５１と、集光レンズ１５２と、撮像部１６０と、を備えている。フローセル１１０の流路１１１には、試料１０が流される。

光源１２０〜１２３は、フローセル１１０を流れる試料１０に光を照射する。光源１２０〜１２３は、例えば半導体レーザー光源により構成される。光源１２０〜１２３からは、それぞれ波長λ１１〜λ１４の光が出射される。

集光レンズ１３０〜１３３は、光源１２０〜１２３から出射された波長λ１１〜λ１４の光をそれぞれ集光する。ダイクロイックミラー１４０は、波長λ１１の光を透過させ、波長λ１２の光を屈折させる。ダイクロイックミラー１４１は、波長λ１１及びλ１２の光を透過させ、波長λ１３の光を屈折させる。こうして、波長λ１１〜λ１４の光が、フローセル１１０の流路１１１を流れる試料１０に照射される。なお、測定装置１００が備える半導体レーザー光源の数は１以上であれば制限されない。半導体レーザー光源の数は、例えば、１、２、３、４、５又は６の中から選択することができる。

フローセル１１０を流れる試料１０に波長λ１１〜λ１３の光が照射されると、細胞を染色している蛍光色素から蛍光が生じる。具体的には、波長λ１１の光がＢＣＲ遺伝子座を標識する第１蛍光色素に照射されると、第１蛍光色素から波長λ２１の第１蛍光が生じる。波長λ１２の光がＡＢＬ遺伝子座を標識する第２蛍光色素に照射されると、第２蛍光色素から波長λ２２の第２蛍光が生じる。波長λ１３の光が核を染色する核染色用色素に照射されると、核染色用色素から波長λ２３の第３蛍光が生じる。フローセル１１０を流れる試料１０に波長λ１４の光が照射されると、この光は細胞を透過する。細胞を透過した波長λ１４の透過光は、明視野画像の生成に用いられる。例えば、実施形態では、第１蛍光は緑色の光の波長帯域であり、第２蛍光は赤色の光の波長帯域であり、第３蛍光は青色の光の波長帯域である。

集光レンズ１５０は、フローセル１１０の流路１１１を流れる試料１０から生じた第１蛍光〜第３蛍光と、フローセル１１０の流路１１１を流れる試料１０を透過した透過光とを集光する。光学ユニット１５１は、４枚のダイクロイックミラーが組み合わせられた構成を有する。光学ユニット１５１の４枚のダイクロイックミラーは、第１蛍光〜第３蛍光と透過光とを、互いに僅かに異なる角度で反射し、撮像部１６０の受光面上において分離させる。集光レンズ１５２は、第１蛍光〜第３蛍光と透過光とを集光する。

撮像部１６０は、ＴＤＩ（Time Delay Integration）カメラにより構成される。撮像部１６０は、第１蛍光〜第３蛍光と透過光とを撮像して第１蛍光〜第３蛍光にそれぞれ対応した蛍光画像と、透過光に対応した明視野画像とを、撮像信号として処理装置２００に出力する。第１蛍光〜第３蛍光に対応する蛍光画像を、以下、それぞれ「第１画像」、「第２画像」、「第３画像」と称する。「第１画像」、「第２画像」及び「第３画像」は、輝点の重なりを分析するため同じ大きさであることが好ましい。「第１画像」、「第２画像」及び「第３画像」は、カラー画像であってもよいし、グレースケール画像であってもよい。

図２（ａ）は、蛍光画像の例である。図２（ａ）の第１画像において黒く点状に見える部分は、第１蛍光の輝点、すなわち第１蛍光色素で標識された標的部位を示す。第２画像において第１画像ほどではないが核を示す淡い灰色の中に濃い灰色の点が認められる。これは、第２蛍光の輝点、すなわち第２蛍光色素で標識された標的部位を示す。第３画像では、略円形の核の領域が黒く表されている。明視野画像では、実際の細胞の状態を観察できる。なお、図２（ａ）の各画像は、前処理後の白血球をスライドガラス上に配置して顕微鏡で観察したものを例として示す画像であり、蛍光画像は生データ（ローデータ）では、蛍光強度が高いほど白く、蛍光強度が低いほど黒く撮像される。図２（ａ）の第１〜第３画像は、撮像された生データの階調を反転させグレースケールで表したものである。上記のようにフローセル１１０を流れる試料１０を撮像部１６０により撮像した場合は、細胞が互いに分離した状態で流路１１１を流れるため、蛍光画像および明視野画像は、細胞ごとに取得されることになる。

図１に戻り、処理装置２００は、ハードウェア構成として、処理部１１と、記憶部１２と、表示部１３と、入力部１４と、を備える。処理部１１は、プロセッサ（ＣＰＵ）により構成される。記憶部１２は、処理部１１の各種処理の作業領域に使用する読み出し及び書き込み可能メモリ（ＲＡＭ）、コンピュータプログラム及びデータを記憶する読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）及びハードディスク等により構成される。処理部１１及び記憶部１２は、汎用コンピュータで構成することができる。ハードディスクは、コンピュータ内に含まれていてもよいし、コンピュータの外部装置として置かれてもよい。表示部１３は、ディスプレイにより構成される。入力部１４は、マウス、キーボード、タッチパネル装置等により構成される。処理部１１は、バス１５を介して記憶部１２との間でデータを伝送し、インターフェース１６を介して表示部１３、入力部１４、測定装置１００との間でデータの入出力を行う。

処理部１１は、ＲＯＭやハードディスクに記憶されている各種コンピュータプログラムをＲＡＭに読み出して実行することにより、測定装置１００による試料１０の測定により取得された細胞の蛍光画像の処理を行い、表示部１３、入力部１４などの動作を制御する。具体的に、処理部１１は、蛍光画像を処理して蛍光画像における蛍光の輝点パターンを取得し、記憶部１２に記憶された複数の測定項目に対応した複数の参照パターンから、試料１０の測定項目に対応した参照パターンを選択する。そして、蛍光画像における蛍光の輝点パターンと、選択した参照パターンと、に基づいて、試料１０の判定に用いられる情報を生成する。

以下、細胞の蛍光画像を分析するための処理手順を規定したコンピュータプログラムに基づき、処理部１１により実行される蛍光画像の分析方法の一例について、図３〜図５を参照して説明する。なお、当該コンピュータプログラムは、予め記憶部１２に格納されているが、例えばＣＤ−ＲＯＭ等のコンピュータ読み取り可能な可搬型記録媒体（図示せず）からインストールしてもよいし、例えば外部のサーバ（図示せず）からネットワーク（図示せず）を介してダウンロードしてインストールしてもよい。

図３〜図５に示すように、処理部１１は、画像取得ステップＳ１、輝点パターンの取得ステップＳ２、輝点パターン及び参照パターンの比較ステップＳ３、細胞が異常細胞又は正常細胞かの判定結果に関する情報の表示ステップＳ４、試料の判定に用いられる情報の生成ステップＳ５、試料の判定に用いられる情報の表示ステップＳ６で各処理を行う。

まず、処理部１１はＳ１において、撮像部１６０により撮像された生データを階調反転、グレースケール表示された第１〜第３画像を取得する。処理部１１は、取得した第１〜第３画像を記憶部１２に記憶させる。

次に、処理部１１はＳ２において、第１蛍光に基づく第１画像における第１蛍光の輝点パターンを取得するとともに、第２蛍光に基づく第２画像における第２蛍光の輝点パターンを取得する。

このＳ２においては、図４に示すように、まず、Ｓ２０において、処理部１１は、第１画像、第２画像、第３画像から、それぞれ、第１蛍光の輝点（第１輝点）、第２蛍光の輝点（第２輝点）、核領域を抽出する処理を行う。具体的に、図２（ｂ）〜（ｄ）を用いて説明すると、図２（ｂ）の左端に示す第３画像、図２（ｃ）の左端に示す第１画像、及び、図２（ｄ）の左端に示す第２画像は、フローセル１１０を流れる１つの細胞から取得されたものである。

図２（ｂ）の左端に示すような第３画像が取得された場合、処理部１１は、始めに第３画像を構成する横（ｘ方向）ｍ個×縦（ｙ方向）ｎ個の各画素における画素値に基づいて、図２（ｂ）の中央に示すように画素値及び画素数のグラフを作成する。縦軸の画素数は、画素の個数を示している。なお、画像の画素数は、特に限定されるものではないが、例えば横５１個×縦５１個である。また、１画素あたりの空間分解能も特に限定されるものではない。そして、処理部１１は、図２（ｂ）のグラフにおいて画素値の閾値を設定し、閾値よりも大きい画素値を有する画素が分布する範囲を、図２（ｂ）の右端において破線で示すように、核領域として抽出する。

図２（ｃ）の左端に示すような第１画像が取得された場合、処理部１１は、第１画像を構成する横（ｘ方向）ｍ個×縦（ｙ方向）ｎ個の各画素における画素値に基づいて、図２（ｃ）の中央に示すように画素値及び画素数のグラフを作成する。そして、処理部１１は、図２（ｃ）のグラフにおいて、たとえば大津法に基づいて輝点とバックグランドとの境界として画素値の閾値を設定し、閾値よりも大きい画素値を有する画素が分布する範囲を、図２（ｃ）の右端において破線で示すように、輝点として抽出する。なお、第１画像から輝点を抽出する場合に、極端に小さい範囲を有する輝点、極端に大きい範囲を有する輝点は除外される。

図２（ｄ）の左端に示すような第２画像が取得された場合、第１画像の場合と同様、処理部１１は、第２画像を構成する横（ｘ方向）ｍ個×縦（ｙ方向）ｎ個の各画素における画素値に基づいて、図２（ｄ）の中央に示すように画素値及び画素数のグラフを作成する。そして、処理部１１は、図２（ｃ）のグラフにおいて、画素値の閾値を設定し、閾値よりも大きい画素値を有する画素が分布する範囲を、図２（ｄ）の右端において破線で示すように、輝点として抽出する。なお、第２画像から輝点を抽出する場合に、極端に小さい範囲を有する輝点、極端に大きい範囲を有する輝点は除外される。

次に、処理部１１は、図４のＳ２１において、第３画像から抽出される核領域の位置と、第１画像から抽出される輝点の位置とを比較し、核領域に含まれない輝点を除外する。これにより、第１画像から第１蛍光の第１輝点が抽出され、第１画像における第１輝点の数、位置が導出される。同様に、第３画像から抽出される核領域の位置と、第２画像から抽出される輝点の位置とを比較し、核領域に含まれない輝点を除外する。これにより、第２画像から第２輝点が抽出され、第２画像における第２輝点の数、位置が導出される。

各画像における核領域及び輝点の位置は、例えば各画像を構成する横（ｘ方向）ｍ個×縦（ｙ方向）ｎ個の画素について座標情報（ｘ，ｙ）を予め定め、核領域及び輝点に含まれる複数の画素の座標情報に基づき計測できる。

なお、処理部１１は、図２（ｂ）〜（ｄ）の中央に示すようなグラフを作成することなく、上記のような手順に沿って、演算により、第３画像から核領域を抽出し、第１画像及び第２画像から各輝点を抽出してもよい。また、輝点の抽出は、正常とされる輝点の分布波形と判定対象の領域との整合の度合いを判定し、整合の度合いが高い場合に、判定対象の領域を輝点として抽出してもよい。処理部１１は、第３画像から核領域を抽出することにより細胞を検出したが、明視野画像に基づいて細胞を検出してもよい。明視野画像に基づいて細胞が検出される場合、第３画像の取得を省略することもできる。本実施形態における輝点とは、蛍光画像に生じる小さな蛍光の点を意味している。より具体的には、輝点とは、輝点の中心点（最も画素値（蛍光強度）が高い画素の位置）を意味している。なお、輝点の抽出は、例えば輝点として指定された画素以外の画素の色階調をバックグラウンドと同じレベルに変換する等して行うことができる。

なお、本明細書における「画素値」とは、画像の各画素に割り当てられたディジタル値を指し、特に、カメラからの出力画像（いわゆる生画像）においては、撮像対象物体の輝度がディジタル信号に変換された値を指す。

次に、処理部１１は、Ｓ２２において、第１画像及び第２画像から抽出した第１輝点及び第２輝点の配置例（数、位置）に基づいて、第１画像及び第２画像の合成画像において互いに重なり合う第１輝点及び第２輝点を抽出する。

ここで、まず、細胞が染色体異常を有する異常細胞であるか否かの判定方法について説明する。

図６（ａ）は、染色体異常を有していない正常細胞の輝点の配置例つまり輝点パターン（陰性パターン）を例示し、図６（ｂ）〜（ｄ）は異常細胞の輝点パターン（陽性パターン）を例示している。なお、図６（ａ）〜（ｄ）のいずれにおいても、各画像には第３画像を重ね合わせた状態で表示している。

図６（ａ）に示すように、ＢＣＲ遺伝子座とＡＢＬ遺伝子座の転座等の染色体に異常が生じていない場合、それぞれの遺伝子は１つの核内に１対ずつ、各対立遺伝子が独立して存在する。したがって、第１画像において、第１輝点は１つの核領域内に２つ存在する。また、第２画像において、第２輝点は１つの核領域内に２つ存在する。この場合、同じ大きさで撮像された第１画像と第２画像とを重ね合わせて合成すると、合成画像においては、２つの第１輝点と２つの第２輝点とが、１つの核領域内に重ならずに存在することになる。そのため、図６（ａ）に示すように核領域内に第１輝点及び第２輝点が２つずつ存在する細胞は、染色体異常が認められない、すなわち染色体異常が陰性の正常細胞であると判定する。

陽性パターンの一例をＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子を標的とするプローブ［Cytocell BCR/ABL Translocation, Extra Signal (ES) Probe (シスメックス株式会社)］（以下、単に「ＥＳプローブ」ということがある）を使用した場合を例にして説明する。なお、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子を標的とするプローブは複数種ある。各プローブがハイブリダイズする標的部位の例を、図７に示す。ＢＣＲ遺伝子は染色体２２ｑ１１．２２−ｑ１１．２３に位置し、ＢＣＲ遺伝子座にハイブリダイズするプローブは第１蛍光（例えば、緑）で標識されている。ＡＢＬ遺伝子は染色体９ｑ３４．１１−ｑ３４．１２に位置し、ＡＢＬ遺伝子座にハイブリダイズするプローブは第２蛍光（例えば、赤）で標識されている。図７Ａは、上述のＥＳプローブの結合部位を示し、図７Ｂは、Cytocell BCR/ABL Translocation, Dual Fusion (DF) Probe (シスメックス株式会社、Cat No. LPH007)（以下、単に「ＤＦプローブ」ということがある）の結合部位を示す。

図６（ｂ）に示すように、転座によりＡＢＬ遺伝子座の一部が９番染色体に移動している場合、第１画像において、第１輝点は核内に２点存在し、第２画像において、第２輝点は核内に３点存在する。この場合に、第１画像と第２画像とを合成すると、合成画像においては、１つの第１輝点と、２つの第２輝点と、第１輝点及び第２輝点が互いに重なった１つの第４蛍光（例えば黄色）の輝点（融合輝点）とが、１つの核内に存在することになる。そのため、図６（ｂ）に示すように各輝点が存在する細胞は、ＢＣＲ遺伝子とＡＢＬ遺伝子について転座が生じている、すなわち染色体異常が陽性の異常細胞であると判定する。

図６（ｃ）に示すように、転座によりＢＣＲ遺伝子座の一部が２２番染色体に移動し、ＡＢＬ遺伝子の一部が９番染色体に移動している場合、第１画像において、第１輝点は核内に３点存在し、第２画像において、第２輝点は核内に３点存在する。この場合に、第１画像と第２画像とを合成すると、合成画像においては、１つの第１輝点と、１つの第２輝点と、第１輝点及び第２輝点が互いに重なった２つの融合輝点とが、１つの核内に存在することになる。そのため、図６（ｃ）に示すように各輝点が存在する細胞は、ＢＣＲ遺伝子座とＡＢＬ遺伝子座について転座が生じている、すなわち染色体異常が陽性の異常細胞であると判定する。

図６（ｄ）に示すように、転座によりＡＢＬ遺伝子座が９番染色体に移動している場合、第１画像において、第１輝点は核内に２点存在し、第２画像において、第２輝点は核内に２点存在する。この場合に、第１画像と第２画像を合成すると、合成画像において、１つの第１輝点と、１つの第２輝点と、第１輝点及び第２輝点が互いに重なった１つの融合輝点とが、１つの核内に存在することになる。そのため、図６（ｄ）に示すように各輝点が存在する細胞は、ＢＣＲ遺伝子座とＡＢＬ遺伝子座について転座が生じている、すなわち染色体異常が陽性の異常細胞であると判定する。

上述したように、第１画像及び第２画像を合成した合成画像における各輝点の位置、数に基づき、細胞ごとに染色体異常を有する異常細胞であるかどうかを判定することができる。そのため、処理部１１は、図４のＳ２２において、細胞ごとに、蛍光画像の蛍光の輝点パターンとして、第１画像及び第２画像の合成画像の各輝点の位置ごとの数、つまり、第２輝点と重ならない位置の第１輝点の数と、第１輝点と重ならない位置の第２輝点の数と、第１輝点及び第２輝点が互いに重なる位置の融合輝点の数とをカウントする。例えば、図６（ｄ）では、輝点パターンを、単体の第１輝点の数を「１」、単体の第２輝点の数を「１」、第１輝点及び第２輝点からなる融合輝点の数を「１」として作成することができる。

なお、第１輝点、第２輝点及び融合輝点は、色として示して、輝点パターン及び後述する参照パターンを作成してもよい。例えば単体の第１輝点を緑（Ｇ）、単体の第２輝点を赤（Ｒ）、融合輝点を黄（Ｆ）として表すことができ、Ｇ、Ｒ、Ｆの直後に、それぞれ、Ｇ、Ｒ、Ｆの輝点の数を示すことで、輝点パターンとすることができる。例えば、図６（ｄ）では、輝点パターンが「Ｇ１Ｒ１Ｆ１」で表示することができる。

また、蛍光画像の蛍光の輝点パターンとしては、上述した第１輝点の数を、第１画像における第１輝点の総数とし、上述した第２輝点の数を、第２画像における第２輝点の総数として作成することができる。例えば、図６（ｄ）では、輝点パターンを、第１画像における第１輝点の数を「２」、第２画像における第２輝点の数を「２」、合成画像における第１輝点及び第２輝点が互いに重なる融合輝点の数を「１」として作成し、「Ｇ２Ｒ２Ｆ１」と表示することができるが、意味は同じである。

合成画像において、第１画像の第１輝点と第２画像の第２輝点とが重なっているか否かは、第１輝点及び第２輝点の互いに重なる領域の割合、例えば、第１輝点に含まれる複数の画素のうち、第２輝点に含まれる各画素と同じ位置（座標情報（ｘ、ｙ））にある画素の割合が閾値よりも大きいか否かで判定することができる。また、第１輝点の中心点（最も蛍光強度が高い画素の位置）と、第２輝点の中心点（最も蛍光強度が高い画素の位置）との距離が閾値よりも小さいか否かで判定することができる。

なお、細胞ごとに取得する蛍光画像における蛍光の輝点パターンとしては、合成画像における輝点の色ごとの数であってもよい。つまり、各画像をグレースケールで表示することに代えて、第１画像の各画素の色をその画素値に基づく緑色の色階調（ＲＧＢ値）で表示し、第２画像の各画素の色を赤色の色階調（ＲＧＢ値）で表示する。そして、各画像を重ねて合成した際には、合成画像の各画素のＲＧＢ値の組み合わせに基づき、細胞が異常細胞であると、核領域に、緑色の第１輝点と、赤色の第２輝点と、第１輝点及び第２輝点が重なることで黄色の融合輝点とが存在する。よって、輝点パターンとして、輝点の色ごとの数をカウントすることでも、細胞が異常細胞であるか否かを判定できる。

処理部１１は、図３のＳ２で作成した第１画像及び第２画像の合成画像と、合成画像における蛍光の輝点パターンとを細胞ごとに記憶部１２に記憶させる。

上述したように、細胞の蛍光画像における蛍光の輝点パターンを取得すると、次に、処理部１１は、細胞ごとに取得した輝点パターンに基づいて、細胞が異常細胞であるか正常細胞であるかを判定する。本実施形態では、記憶部１２は、細胞が異常細胞であるか正常細胞であるかを判定するための参照パターンを、複数の測定項目について測定項目ごとに記憶している。処理部１１は、Ｓ３において、細胞ごとに取得した輝点パターンと、記憶部１２に記憶された複数の参照パターンから試料１０の測定項目に対応した参照パターンとを比較することで、細胞ごとに異常細胞であるか否かを判定する。処理部１１による異常細胞の判定については、追って図５を参照して説明する。

なお、参照パターンとは、例えば図６で示したような、染色体異常を有する異常細胞の蛍光画像における蛍光の輝点パターン（陽性パターン）、及び、染色体異常を有していない正常細胞の蛍光画像における蛍光の輝点パターン（陰性パターン）の少なくとも一方を含むものである。本実施形態では、参照パターンに、異常細胞の輝点パターン（陽性パターン）及び正常細胞の輝点パターン（陰性パターン）の両方を含んでいる。

本実施形態では、例えば図８、図９及び図１１に示すように、測定項目としてＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子、ＡＬＫ遺伝子、第５染色体長腕欠失の参照パターン（陰性パターン及び陽性パターン）が記憶部１２に記憶されている。また、本実施形態では、測定項目は、標的部位にハイブリダイズするプローブごとにさらに分類されており、記憶部１２には、参照パターンがプローブごとに記憶されている。さらに、本実施形態では、記憶部１２には、プローブごとに、異常細胞の参照パターン（陽性パターン）について、典型異常細胞の参照パターン（典型陽性パターン）と、非典型異常細胞の参照パターン（非典型陽性パターン）とが分類されて記憶されている。

図８は、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子の典型陽性パターン（メジャーパターン）の参照パターンの例である。第１画像及び第２画像を重ねた状態では、ＥＳプローブを用いた場合、陰性パターンは第１輝点の数が２個であり、第２輝点の数が２個であり、融合輝点の数は０個である。ＥＳプローブを用いた典型陽性パターンの例は、第１輝点の数が１個であり、第２輝点の数が２個であり、融合輝点の数は１個である。ＤＦプローブを用いた場合、第１画像及び第２画像を重ねた状態では、陰性パターンは第１輝点の数が２個であり、第２輝点の数が２個であり、融合輝点の数は０個である。ＤＦプローブを用いた典型陽性パターンの例は、第１輝点の数が１個であり、第２輝点の数が１個であり、融合輝点の数は２個である。

図９は、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子の非典型陽性パターンの参照パターンの例である。非典型陽性パターンの１例は、マイナーＢＣＲ／ＡＢＬパターンであり、ＢＣＲ遺伝子の切断点がＢＣＲ遺伝子の比較的上流にあるため、ＥＳプローブでも第１輝点が３個検出される。非典型陽性パターンの他の例は、９番染色体のＡＢＬ遺伝子を標的とするプローブの結合領域の一部が欠失した例であり、これに依存してＤＦプローブを使用した場合に本来２個検出されるはずの融合輝点が１個のみ検出されている。また、非典型陽性パターンの他の例は、９番染色体のＡＢＬ遺伝子を標的とするプローブの結合領域の一部と２２番染色体のＢＣＲ遺伝子を標的とするプローブの結合領域の一部とがともに欠失した例である。これに依存してＤＦプローブを使用した場合に本来２個検出されるはずの融合輝点が１個のみ検出されている。

ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子の他、ＦＩＳＨ法によって融合輝点を検出できる染色体転座としては、ＡＭＬ１／ＥＴＯ（ＭＴＧ８）融合遺伝子（ｔ（８；２１））、ＰＭＬ／ＲＡＲα融合遺伝子（ｔ（１５；１７））、ＡＭＬ１（２１ｑ２２）転座、ＭＬＬ（１１ｑ２３）転座、ＴＥＬ（１２ｐ１３）転座、ＴＥＬ／ＡＭＬ１融合遺伝子（ｔ（１２；２１））、ＩｇＨ（１４ｑ３２）転座、ＣＣＮＤ１（ＢＣＬ１）／ＩｇＨ融合遺伝子（ｔ（１１；１４））、ＢＣＬ２（１８ｑ２１）転座、ＩｇＨ／ＭＡＦ融合遺伝子（ｔ（１４；１６））、ＩｇＨ／ＢＣＬ２融合遺伝子（ｔ（１４；１８））、ｃ−ｍｙｃ／ＩｇＨ融合遺伝子（ｔ（８；１４））、ＦＧＦＲ３／ＩｇＨ融合遺伝子（ｔ（４；１４））、ＢＣＬ６（３ｑ２７）転座、ｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）転座、ＭＡＬＴ１（１８ｑ２１）転座、ＡＰＩ２／ＭＡＬＴ１融合遺伝子（ｔ（１１；１８）転座）、ＴＣＦ３／ＰＢＸ１融合遺伝子（ｔ（１；１９）転座）、ＥＷＳＲ１（２２ｑ１２）転座、ＰＤＧＦＲβ（５ｑ３２）転座等を挙げることができる。

図１０には、ＡＬＫ遺伝子座のプローブ例を示す。また、図１１には、ＡＬＫ遺伝子座に関連する染色体異常を検出する場合の陰性パターン及び陽性パターンの参照パターンの例を示す。図１０に示すように、ＡＬＫ遺伝子の染色体異常はＤ２Ｓ４０５付近に切断点を有し、ＡＬＫ遺伝子の一部が他の部位に転座する。このため切断点を挟んで、第１蛍光標識プローブと第２蛍光標識プローブを設計する。図１１に示す陰性パターンでは、ＡＬＫ遺伝子が切断されていないため、融合輝点が２個存在する。一方、陽性パターンでは、ＡＬＫ遺伝子が切断されているため、融合輝点が１個のみとなる（対立遺伝子の一方のみが切断された場合）か、融合輝点が認められなくなる（対立遺伝子の両方が切断された場合）。この陰性パターン及び陽性パターンは、ＡＬＫ遺伝子の他、ＲＯＳ１遺伝子、ＲＥＴ遺伝子でも同じである。

さらに、図１１に、第５番染色体長腕（５ｑ）が欠失する染色体異常の参照パターンの例を示す。例えば、第１蛍光標識プローブは第５番染色体長腕に結合し、第２蛍光標識プローブは第５番染色体のセントロメアと結合するように設計する。陰性パターンでは、第５番染色体のセントロメアの数と第５番染色体長腕の数は同じであるため、第１輝点と第２輝点は、相同染色体の数を反映し２個ずつ存在する。陽性パターンでは、第５番染色体の一方又は両方に長腕の欠失が起り、第１輝点の数が１個のみ又は０個となる。この陰性パターンと陽性パターンは、他の染色体の短腕又は長腕の欠失でも同じである。他の染色体の長腕欠失の例として、第７番染色体、及び第２０番染色体の長腕欠失を挙げることができる。また、この他、同様の陽性パターン及び陰性パターンを示す例として、７ｑ３１（欠失）、ｐ１６ （９ｐ２１欠失解析）、ＩＲＦ−１（５ｑ３１）欠失、Ｄ２０Ｓ１０８（２０ｑ１２）欠失、Ｄ１３Ｓ３１９（１３ｑ１４）欠失、４ｑ１２欠失、ＡＴＭ（１１ｑ２２．３）欠失、ｐ５３（１７ｐ１３．１）欠失等を挙げることができる。

さらにまた、図１１に第８番染色体トリソミーの例を示す。第１蛍光標識プローブは例えば第８番染色体のセントロメアと結合する。陽性パターンは第１輝点が３個となる。陰性パターンは、第１輝点が２個となる。このような輝点パターンは第１２番染色体トリソミーでも同様である。さらに、第７番染色体モノソミーでは、例えば第７番染色体のセントロメアと結合する第１蛍光標識プローブを用いた場合、陽性パターンは第１輝点が１個となる。陰性パターンは、第１輝点が２個となる。

次に、図５を用いて、図３のＳ３の詳細を示す。まず、処理部１１は、Ｓ３０において、記憶部１２に記憶された複数の測定項目に対応した複数の参照パターンから、試料１０の測定項目に対応した参照パターンを選択する処理を行う。そして、Ｓ３１において、細胞ごとに取得した輝点パターンと、試料１０の測定項目に応じて選択した参照パターンの中の陰性パターンと比較する処理を行う。測定項目の選択は、例えば図１２に示すように、表示部１３に測定項目の選択のための受付画面３０を表示して受け付けることができる。図１２の受付画面３０には、分析対象の複数（図示例では縦（Ａ〜Ｈ）８個×横（１〜１２）１２個＝９６個）の細胞について測定項目を選択するための選択欄３１が設けられており、例えばプルダウン方式で測定項目（例えばＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子、ＡＬＫ遺伝子、第５染色体長腕欠失等）を細胞ごとに選択可能である。なお、図１２では、選択欄３１において、測定項目に加えて測定項目をさらに分類するプローブ（例えば測定項目がＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子であれば、ＤＦプローブあるいはＥＳプローブ）まで選択することが可能である。

処理部１１は、記憶部１２に記憶された複数の測定項目に対応した複数の参照パターンから、受付画面３０で選択された測定項目あるいは測定項目の中のプローブに応じた参照パターン（陰性パターン及び陽性パターン）を読み込み、分析対象の細胞の輝点パターンと比較する。分析対象の細胞の輝点パターンが陰性パターンに合致する場合には、Ｓ３１がＹＥＳとなってＳ３２に進み、当該細胞が正常細胞であると判定する。一方、分析対象の細胞の輝点パターンが陰性パターンに合致しない場合には、Ｓ３１がＮＯとなってＳ３３に進み、典型陽性パターンと比較する。典型陽性パターンに合致する場合には、Ｓ３３がＹＥＳとなってＳ３４に進み、当該細胞が典型異常細胞であると判定する。一方で、典型陽性パターンに合致しない場合には、Ｓ３３がＮＯとなってＳ３５に進み、当該細胞が非典型異常細胞であると判定する。処理部１１は、同様の比較処理を分析対象の細胞の全てに対し繰り返し行って、細胞ごとに異常細胞又は正常細胞の判定を行う。処理部１１は、図３のＳ３による判定結果を細胞ごとに記憶部１２に記憶させる。

図３に戻って、次に、処理部１１はＳ４において、分析対象の細胞ごとの判定結果に関する情報を表示部１３に表示させる。判定結果に関する情報として、処理部１１は、例えば、異常細胞と判定した細胞の蛍光画像（第１画像、第２画像及び第３画像の合成画像）、正常細胞と判定した細胞の蛍光画像（第１画像、第２画像及び第３画像の合成画像）等を、表示部１３に表示させる。

図１３は、表示部１３の情報表示画面３２の一例である。図１３の情報表示画面３２では、分析対象の細胞のうち、所定の分析方法に基づき検出した細胞ごとに蛍光画像が縦横に並べて表示される。情報表示画面３２には、細胞の分析に用いた測定項目３３が表示されるとともに、分析方法を選択可能な分析方法選択欄３４が設けられている。分析方法選択欄３４では、異常細胞の分析方法として、典型異常細胞（ＥＳメジャーパターン）を検出するか、非典型異常細胞（ＥＳマイナーパターン、ＥＳディリーションパターン）を検出するか、選択できる。また、情報表示画面３２には、分析方法選択欄３４で選択された分析方法に基づき検出された細胞について、異常細胞（ポジティブ）と判定された細胞の蛍光画像を表示させる選択肢、正常細胞（ネガティブ）と判定された細胞の蛍光画像を表示させる選択肢、分析した全ての細胞の蛍光画像を表示させる選択肢、を例えばプルダウン方式で選択可能な表示画像選択欄３８が設けられている。

処理部１１は、選択欄３４で選択された分析方法に基づいて検出した細胞について、表示画像選択欄３８で選択された細胞の蛍光画像を表示画面３２の画像表示欄３５に表示させる。画像表示欄３５に表示される細胞の蛍光画像には、細胞の蛍光画像ごとに、Ｃｅｌｌ ＩＤの他、異常細胞（ポジティブ）であるか正常細胞（ネガティブ）であるかの判定結果が表示されている。図１３では、典型異常細胞（ＥＳメジャーパターン）を検出する分析方法が選択されているため、表示画像選択欄３８で異常細胞（ポジティブ）と判定された細胞の蛍光画像を表示させる選択肢が選択されると、画像表示欄３５には、典型異常細胞（ＥＳメジャーパターン）と判定された細胞の蛍光画像が表示される。なお、表示画像選択欄３８の選択に応じて、正常細胞と判定された細胞の蛍光画像、あるいは、分析した全ての細胞の蛍光画像を表示させることができる。

これにより、オペレータ等は、異常細胞と判定された細胞の蛍光画像を表示部１３で観察することができる。なお、オペレータ等の観察により、異常細胞であると判定された細胞が正常細胞であると判断された場合には、処理部１１は、表示部１３に表示された異常細胞の蛍光画像の中から、オペレータ等に入力部１４により正常細胞であるとして選択され、改訂ボタン３６で改訂された異常細胞については正常細胞に判定結果を修正する。そして、処理部１１は、改訂後の判定結果を記憶部１２に記憶する。同様に、オペレータ等の観察者の観察により、正常細胞であると判定された細胞が異常細胞であると判断された場合には、処理部１１は、表示部１３に表示された正常細胞の蛍光画像の中から、オペレータ等に入力部１４で異常細胞であるとして選択され、改訂ボタン３６で改訂された正常細胞については異常細胞に判定結果を修正する。そして、処理部１１は、改訂後の判定結果を記憶部１２に記憶する。これにより、異常細胞及び正常細胞の検出精度を高めることができる。また、処理部１１は、改訂後の異常細胞あるいは正常細胞と判定した細胞の蛍光画像を表示部１３に再表示させることもできる。

図３に戻って、次に、処理部１１はＳ５において、細胞ごとの異常細胞であるか否かの判定結果に基づいて、試料１０の判定に用いられる情報を生成する。

例えば、処理部１１は、分析方法選択欄３４で選択された分析方法による分析結果に基づき、異常細胞の数、異常細胞の数の割合、正常細胞の数、及び、正常細胞の数の割合からなる群より選ばれる少なくとも一つの情報を生成する処理を行う。なお、異常細胞の数の割合及び正常細胞の数の割合は、検出した全ての細胞の数（異常細胞と判定した細胞の数及び正常細胞と判定した細胞の数の合算値）に対する割合であってもよいし、分析した細胞の総数に対する割合であってもよい。

そして、処理部１１は、図３のＳ６において、Ｓ５で生成した情報を記憶部１２に記憶させるとともに表示部１３に表示させる。例えば、図１３の情報表示画面３２では、判定結果欄３７が設けられており、この判定結果欄３７に、異常細胞と判定した細胞の数及び割合、正常細胞と判定した細胞の数及び割合が表示されている。ここでは、分析方法選択欄３４で典型異常細胞（ＥＳメジャーパターン）を検出する分析方法が選択されているため、判定結果欄３７に、判定結果が「Ｇ１Ｒ２Ｆ１」の典型異常細胞（ポジティブ）の数及び割合、判定結果が「Ｇ２Ｒ２Ｆ０」の正常細胞（ネガティブ）の数及び割合が表示されている。なお、その他にも、分析方法選択欄３４で非典型異常細胞（ＥＳマイナーパターン、ＥＳディリーションパターン）を検出する分析方法が選択されると、判定結果が非典型異常細胞（ポジティブ）の数及び割合、判定結果が正常細胞（ネガティブ）の数及び割合が分析結果欄３７に表示される。

これにより、医師等は、情報表示画面３２に表示される情報を参照して、試料１０中に異常細胞が含まれているか否か、さらには試料１０中の有核細胞に含まれる異常細胞の割合を把握でき、試料１０が陽性及び陰性のいずれであるかを高精度に判定することができる。

なお、試料１０の判定に用いられる情報としては、「陽性の可能性？」、「陰性の可能性？」などの文字情報等、他の様々な情報を、処理部１１は生成して表示部１３に表示させることができる。「陽性の可能性？」は、異常細胞の割合が所定の閾値より大きい場合、正常細胞の割合が所定の閾値より小さい場合に表示される。正常細胞の割合が所定の閾値より大きい場合、異常細胞の割合が所定の閾値より小さい場合には「陰性の可能性？」が表示される。

以上、本発明によれば、分析対象の細胞ごとに取得された蛍光画像の蛍光の輝点パターンと、測定項目ごとの参照パターンの中から試料１０の測定項目に対応する参照パターンと、に基づいて、試料１０の判定に用いられる情報を生成する。よって、オペレータ等が、染色体異常を有する異常細胞を示す多種類の輝点パターンを記憶して、細胞ごとに異常細胞であるか判定する必要がなく、異常細胞の判定がオペレータの感覚に依存しない。そのため、異常細胞の判定精度を高めることができ、その結果、試料１０の判定に用いられる情報の精度を向上することができる。

以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて種々の変更が可能である

例えば、上述した本実施形態の蛍光画像分析装置１において、図１に示す測定装置１００を、図１４に示す蛍光顕微鏡を含む測定装置４００に代えてもよい。

図１４に示す測定装置４００は、光源４１０〜４１２と、ミラー４２０と、ダイクロイックミラー４２１〜４２２と、シャッター４３０と、１／４波長板４３１と、ビームエキスパンダ４３２と、集光レンズ４３３と、ダイクロイックミラー４３４と、対物レンズ４３５と、ステージ４４０と、集光レンズ４５０と、撮像部４５１と、コントローラ４６０〜４６１と、を備えている。ステージ４４０には、スライドガラス４４１が設置される。スライドガラス４４１には、前処理装置３００で前処理により調製された試料１０（図１に示す）が載せられる。

光源４１０〜４１２は、それぞれ、図１に示す光源１２０〜１２２と同様である。ミラー４２０は、光源４１０からの光を反射する。ダイクロイックミラー４２１は、光源４１０からの光を透過し、光源４１１からの光を反射する。ダイクロイックミラー４２２は、光源４１０〜４１１からの光を透過し、光源４１２からの光を反射する。光源４１０〜４１２からの光の光軸は、ミラー４２０とダイクロイックミラー４２１〜４２２により、互いに一致させられる。

シャッター４３０は、コントローラ４６０により駆動され、光源４１０〜４１２から出射された光を通過させる状態と、光源４１０〜４１２から出射された光を遮断する状態とに切り替える。これにより、試料１０に対する光の照射時間が調整される。１／４波長板４３１は、光源４１０〜４１２から出射された直線偏光の光を円偏光に変換する。プローブに結合している蛍光色素は、所定の偏光方向の光に反応する。よって、光源４１０〜４１２から出射された励起用の光を円偏光に変換することにより、励起用の光の偏光方向が、蛍光色素が反応する偏光方向に一致し易くなる。これにより、蛍光色素に効率良く蛍光を励起させることができる。ビームエキスパンダ４３２は、スライドガラス４４１上における光の照射領域を広げる。集光レンズ４３３は、対物レンズ４３５からスライドガラス４４１に平行光が照射されるよう光を集光する。

ダイクロイックミラー４３４は、光源４１０〜４１２から出射された光を反射し、試料１０から生じた蛍光を透過する。対物レンズ４３５は、ダイクロイックミラー４３４で反射された光を、スライドガラス４４１に導く。ステージ４４０は、コントローラ４６１により駆動される。試料１０から生じた蛍光は、対物レンズ４３５を通り、ダイクロイックミラー４３４を透過する。集光レンズ４５０は、ダイクロイックミラー４３４を透過した蛍光を集光して、撮像部４５１の撮像面４５２に導く。撮像部４５１は、撮像面４５２に照射された蛍光の像を撮像し、蛍光画像を生成する。撮像部４５１は、たとえばＣＣＤ等により構成される。

コントローラ４６０〜４６１と撮像部４５１とは、図１に示す処理部１１と接続されており、処理部１１は、コントローラ４６０〜４６１と撮像部４５１とを制御し、撮像部４５１により撮像された蛍光画像を受信する。なお、撮像部４５１により撮像される蛍光画像は、図１に示すようにフローセル１１０が用いられる場合とは異なり、図２（ａ）に示すように細胞が密接した状態となっている場合がある。このため、処理部１１は、取得した蛍光画像を、細胞の核ごとに分割する処理、又は、蛍光画像において１つの細胞の核に対応する領域を設定する処理等を行う。

この図１４に示す測定装置４００においても、本実施形態と同様、３つの蛍光画像（第１画像〜第３画像）を取得できるため、各蛍光画像に基づいて細胞ごとに輝点パターンを抽出し、抽出した輝点パターンに基づいて、細胞ごとに参照パターンと比較することで、細胞ごとに異常細胞であるか正常細胞であるかを判定することができる。

また、図１５に示す実施形態のように、蛍光画像分析装置１において、処理部１１をインターフェース１６を介して前処理装置３００との間でデータの入出力可能に接続してもよい。この実施形態では、処理部１１は、前処理装置３００からの情報として、測定項目、プローブを含む試薬に関する情報を受信することができる。これにより、処理部１１が、図５のＳ３０において、記憶部１２に記憶された複数の測定項目に対応した複数の参照パターンから、試料１０の測定項目に対応した参照パターンを選択する際に、前処理装置３００から送信される測定項目、プローブを含む試薬に関する情報に応じた参照パターンを自動的に読み込み、Ｓ３１において、処理部１１は、選択した参照パターンと、細胞ごとに取得した輝点パターンとを比較してもよい。

また、上述した本実施形態の蛍光画像分析装置１において、参照パターンが蛍光画像分析装置１内の記憶部１２に予め記憶されているが、外部のサーバ（図示せず）からネットワークを介して取得してもよい。

また、上述した本実施形態の蛍光画像分析装置１において、処理部１１は、新たに取得した異常細胞の蛍光画像における蛍光の輝点パターンを、参照パターンとして測定項目ごとに記憶部１２に記憶してもよい。新たな参照パターンは、ユーザが入力部１４を介して入力することで取得してもよいし、処理部１１が外部のサーバ（図示せず）からネットワークを介して取得してもよい。

また、上述した処理装置２００の処理部１１による細胞の蛍光画像を処理するための処理手順を規定したコンピュータプログラムを記憶させた記憶媒体も提供することができる。

１ 蛍光画像分析装置
１０ 試料
１１ 処理部
１２ 記憶部
１３ 表示部
１４ 入力部
１００ 測定装置
１２０〜１２３ 光源
１６０ 撮像部
２００ 処理装置
３００ 前処理装置
４００ 測定装置

Claims (18)

1. 標的部位を蛍光色素により標識した複数の細胞を含む試料に光を照射する光源と、
   前記光が照射されることにより蛍光を発する前記細胞の蛍光画像を細胞ごとに撮像する撮像部と、
   前記撮像部により撮像された前記蛍光画像を処理して、前記蛍光画像における蛍光の輝点パターンを取得する処理部と、を備え、
   前記処理部は、
   複数の測定項目に対応した複数の参照パターンから、前記試料の測定項目に対応した少なくとも一つの陰性パターンおよび少なくとも一つの陽性パターンを含む一つの参照パターンを選択し、
   前記蛍光画像における蛍光の輝点パターンと、選択した前記一つの参照パターンと、を比較して、前記試料の判定に用いられる情報を生成する、蛍光画像分析装置。
2. 前記複数の測定項目に対応した複数の参照パターンを記憶する記憶部をさらに備え、
   前記処理部は、前記記憶部に記憶された複数の参照パターンから、前記試料の測定項目に対応した少なくとも一つの陰性パターンおよび少なくとも一つの陽性パターンを含む一つの参照パターンを選択し、前記試料の判定に用いられる情報を生成する、請求項１に記載の蛍光画像分析装置。
3. 前記処理部は、前記試料の判定に用いられる情報として、異常細胞の数、異常細胞の数の割合、正常細胞の数、及び、正常細胞の数の割合の少なくとも一つの情報を生成する、請求項１または２に記載の蛍光画像分析装置。
4. 前記処理部は、前記蛍光画像における蛍光の輝点パターンと、前記試料の測定項目に対応した少なくとも一つの陰性パターンおよび少なくとも一つの陽性パターンを含む一つの参照パターンとを比較することにより、前記試料に含まれる複数の細胞ごとに異常細胞であるか否か判定し、前記複数の細胞ごとに判定した判定結果に基づいて、前記試料の判定に用いられる情報を生成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光画像分析装置。
5. 前記測定項目は、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子、ＡＭＬ１／ＥＴＯ（ＭＴＧ８）融合遺伝子、ＰＭＬ／ＲＡＲα融合遺伝子、ＴＥＬ／ＡＭＬ１融合遺伝子、ＡＬＫ遺伝子、第５番染色体長腕欠失、第７番染色体長腕欠失、及び第２０番染色体長腕欠失からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の蛍光画像分析装置。
6. 前記測定項目は、前記標的部位にハイブリダイズするプローブごとにさらに分類され、
   前記記憶部には、前記一つの参照パターンが前記プローブごとに記憶されている、請求項２〜５のいずれか一項に記載の蛍光画像分析装置。
7. 前記処理部は、前記蛍光画像における蛍光の輝点パターンと、複数の測定項目に対応した複数の参照パターンから前記試料の前記測定項目の前記プローブに対応して選択された前記一つの参照パターンと、に基づいて、前記試料の判定に用いられる情報を生成する、請求項６に記載の蛍光画像分析装置。
8. 前記測定項目は、前記標的部位にハイブリダイズするプローブについて、さらに典型陽性パターン及び非典型陽性パターンに分類され、
   前記記憶部には、前記参照パターンが前記典型陽性パターン及び非典型陽性パターンごとに記憶されている、請求項６または７に記載の蛍光画像分析装置。
9. 表示部をさらに備え、
   前記処理部は、異常細胞と判定した細胞の蛍光画像を選択して前記表示部に表示させる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の蛍光画像分析装置。
10. 入力部をさらに備え、
    前記処理部は、前記表示部に表示された異常細胞の蛍光画像のうち、前記入力部により選択された異常細胞を正常細胞に判定結果を修正する、請求項９に記載の蛍光画像分析装置。
11. 入力部をさらに備え、
    前記処理部は、前記表示部に表示された正常細胞の蛍光画像のうち、前記入力部により選択された正常細胞を異常細胞に判定結果を修正する、請求項９に記載の蛍光画像分析装置。
12. 前記処理部は、新たに取得した異常細胞の蛍光画像における蛍光の輝点パターンを、前記一つの参照パターンとして前記測定項目ごとに前記記憶部に記憶する、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の蛍光画像分析装置。
13. 設定された測定項目に基づいて、試料中の複数の細胞に対し細胞中の標的部位を蛍光色素により標識する前処理を行う前処理装置をさらに備え、
    前記処理部は、
    前記前処理装置に設定された測定項目に基づいて、複数の測定項目に対応した複数の参照パターンから、前記試料の測定項目に対応した少なくとも一つの陰性パターンおよび少なくとも一つの陽性パターンを含む一つの参照パターンを選択し、
    前記蛍光画像における蛍光の輝点のパターンと、選択した前記一つの参照パターンと、を比較して、前記試料の判定に用いられる情報を生成する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の蛍光画像分析装置。
14. 試料が流れるフローセルをさらに備え、
    前記光源は、前記フローセルを流れる試料に光を照射する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の蛍光画像分析装置。
15. 標的部位を蛍光色素により標識した複数の細胞を含む試料を撮像して取得した前記細胞の蛍光画像を分析する蛍光画像の分析方法であって、
    前記試料の測定項目を受け付け、
    複数の測定項目に対応した複数の参照パターンから、受け付けた前記試料の測定項目に対応した少なくとも一つの陰性パターンおよび少なくとも一つの陽性パターンを含む一つの参照パターンを選択し、
    前記蛍光画像における蛍光の輝点パターンと、選択した前記一つの参照パターンと、を比較して、前記試料の判定に用いられる情報を生成し、
    生成した前記試料の判定に用いられる情報を表示する、蛍光画像の分析方法。
16. コンピュータの記憶部に記憶された前記複数の測定項目に対応した複数の参照パターンから、受け付けた前記試料の測定項目に対応した少なくとも一つの陰性パターンおよび少なくとも一つの陽性パターンを含む一つの参照パターンを選択する、請求項１５に記載の蛍光画像の分析方法。
17. 標的部位を蛍光色素により標識した複数の細胞を含む試料を撮像して取得した前記細胞の蛍光画像の分析処理を、コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムであって、
    コンピュータに、
    前記試料の測定項目を受け付けるステップと、
    複数の測定項目に対応した複数の参照パターンから、受け付けた前記試料の測定項目に対応した少なくとも一つの陰性パターンおよび少なくとも一つの陽性パターンを含む一つの参照パターンを選択するステップと、
    前記蛍光画像における蛍光の輝点パターンと、選択した前記一つの参照パターンと、を比較して、前記試料の判定に用いられる情報を生成するステップと、
    生成した前記試料の判定に用いられる情報を表示するステップと、を実行させるコンピュータプログラム。
18. 参照パターンを読み込むステップにおいて、
    前記コンピュータの記憶部に記憶された前記複数の測定項目に対応した複数の参照パターンから、受け付けた前記試料の測定項目に対応した少なくとも一つの陰性パターンおよび少なくとも一つの陽性パターンを含む一つの参照パターンを選択する、請求項１７に記載のコンピュータプログラム。

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