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JP6878275B2 - プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびその使用 - Google Patents

プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびその使用 Download PDF

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Description

本発明は、加水分解物の調製において使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたは加水分解物を含む食料に関する。
プロテアーゼ（ペプチダーゼと同義語）は、基質ペプチド、オリゴペプチドおよび／またはタンパク質中のアミノ酸間のペプチド結合を開裂し得る酵素である。
プロテアーゼは、それらの触媒反応機序および触媒作用の活性部位に関与するアミノ酸残基に基づき７つのファミリーに分類される。セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼおよびメタロプロテアーゼが４つの主要なファミリーである一方、トレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼおよび未分類プロテアーゼが残りの３つのファミリーを構成する。
プロテアーゼの基質特異性は、通常、基質中の特定のアミノ酸残基間の結合の優先的開裂に関して定義される。典型的には、基質ペプチド中のアミノ酸位置は、被切断結合の局在（すなわち、プロテアーゼが開裂する位置）に対して定義される：
ＮＨ２−……Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１＊Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’……−ＣＯＯＨ
上記の仮定ペプチドを使用して説明されるとおり、被切断結合は、アスタリスク（＊）により示される一方、アミノ酸残基は、文字「Ｐ」により表され、被切断結合に対してＮ末端の残基はＰ１から出発し、Ｎ末端に向かって被切断結合から遠ざかると数字が増加する。被切断結合に対してＣ末端のアミノ酸残基はＰ１’から出発し、Ｃ末端残基に向かって近づくと数字が増加する。
プロテアーゼは、一般に、それらの基質特異性に基づき２つの広いグループに下位分類することもできる。第１のグループは、エンドプロテアーゼのものであり、それはペプチドまたはタンパク質基質の内部ペプチド結合を開裂し、Ｎ末端またはＣ末端から離れて作用する傾向があり得るタンパク質分解ペプチダーゼである。エンドプロテアーゼの例としては、トリプシン、キモトリプシンおよびペプシンが挙げられる。対照的に、プロテアーゼの第２のグループは、タンパク質またはペプチド基質のＣまたはＮ末端に向かって局在するアミノ酸残基間のペプチド結合を開裂するエキソペプチダーゼである。
エキソペプチダーゼグループのある酵素は、トリペプチジルペプチダーゼ活性を有し得る。したがって、このような酵素は、基質ペプチド、オリゴペプチドおよび／またはタンパク質の非置換Ｎ末端から３つのアミノ酸断片（トリペプチド）を開裂し得る。トリペプチジルペプチダーゼは、Ｐ１および／またはＰ１’位におけるプロリンとのペプチド結合を除く基質のＮ末端からトリペプチド配列を開裂することが公知である。あるいは、トリペプチジルペプチダーゼは、プロリン特異的であり得、被切断結合に対してＮ末端の（すなわち、Ｐ１位における）プロリン残基を有する基質のみを開裂し得る。
エキソペプチダーゼおよびエンドプロテアーゼの両方は、食料および飼料産業ならびに加水分解物の生産の両方において多くの用途を有する。
広い態様において、本発明は、（ａ）少なくとも１つのタンパク質またはその一部を、
（Ａ）少なくとも１つのエンドプロテアーゼ；および
配列番号２９、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９８、配列番号９９からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列またはその機能断片またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むトリペプチジルペプチダーゼ；または配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９８、配列番号９９からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つ以上またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または遺伝子コードの縮重によりそれらのヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列、または中程度もしくは高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列から発現されるトリペプチジルペプチダーゼ
と混合することを含む、加水分解物を生産する方法を提供する。
本発明の第１の態様によれば、
（ａ）少なくとも１つのタンパク質またはその一部を、
（Ａ）少なくとも１つのエンドプロテアーゼ；および
（Ｂ）（ａ’）少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたは主としてエキソペプチダーゼ活性を有するプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを含む発酵物（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
Ｐ１におけるプロリン；および
Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る）；または
（ｂ’）エキソペプチダーゼ活性を有する少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
Ｐ１’におけるプロリン；および
Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る）
を混合すること；ならびに
（ｂ）加水分解物を回収すること
を含む、加水分解物を生産する方法が提供される。
第２の態様において、
（ａ）植物タンパク質、乳汁ベースタンパク質、または卵タンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質またはその一部を、
（ｉ）少なくとも１つのエンドペプチダーゼ；
（ｉｉ）少なくとも１つのＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼ；および
（ｉｉｉ）１つ以上のアミノペプチダーゼ
と混合すること；ならびに
（ｂ）加水分解物を回収すること
を含む、加水分解物を生産する方法が提供される。
第３の態様において、非処理加水分解物に対する免疫反応を有する傾向がある対象における免疫原性を低減させるため、または加水分解物の苦味を低減させるための、植物タンパク質、乳汁ベースタンパク質、または卵タンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質またはその一部からの加水分解物の製造における、（ｉ）少なくとも１つのエンドペプチダーゼ；（ｉｉ）少なくとも１つのＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼ；および（ｉｉｉ）１つ以上のアミノペプチダーゼの使用が提供される。
第４の態様において、
（ａ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９８または配列番号９９として本明細書に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９８または配列番号９９と少なくとも約７０％の同一性を有するヌクレオチド配列；または
（ｃ）中程度のストリンジェンシー条件下で、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９８または配列番号９９にハイブリダイズする配列；または
（ｃ）遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９８または配列番号９９と異なるヌクレオチド配列
を含む単離核酸が提供される。
第５の態様において、本発明の核酸（好適には、第２の態様の単離核酸）を含むベクター（例えば、プラスミド）が提供される。
本発明の第６の態様によれば、本発明による核酸配列またはベクターを含む宿主細胞が提供される。
本発明の第７の態様によれば、主としてエキソペプチダーゼ活性を有するプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、コンセンサス配列開裂部位：
（ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；または
（ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る）を発現させる方法であって、
（ａ）プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸またはベクターにより宿主細胞を形質転換すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の核酸配列またはベクターを発現させること；ならびに
（ｃ）プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたは前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを含む発酵物を得、場合により、単離および／または精製および／または包装すること
を含む方法が提供される。
第８の態様において、非処理加水分解物に対する免疫反応を有する傾向がある対象における免疫原性を低減させるため、または加水分解物の苦味を低減させるための加水分解物の製造における、少なくとも１つのエンドプロテアーゼおよび少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを含む発酵物（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、主としてエキソペプチダーゼ活性を有し、
（ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；または
（ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得；
または本発明の方法のいずれか１つにより取得可能である）
の使用が提供される。
第９の態様において、少なくとも１つのエンドプロテアーゼおよび主としてエキソペプチダーゼ活性を有するプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
（ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；または
（ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得；
または本発明の方法のいずれか１つにより取得可能である）を含む加水分解物が提供される。
第１０の態様によれば、主としてエキソペプチダーゼを有する少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
（ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；または
（ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得；
または本発明の方法のいずれか１つにより取得可能である）；ならびにポリオール、例えば、グリセロールおよび／またはソルビトール；糖、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトースおよびトレハロース；塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、Ｎａ２ＳＯ４または他の食料グレード塩；保存剤、例えば、安息香酸ナトリウムおよび／またはソルビン酸カリウム；またはそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の成分
を含む組成物が提供される。
第１１の態様において、飼料構成成分または食料構成成分を本発明の加水分解物または組成物と接触させることを含む、飼料原料または食料原料を生産する方法が提供される。
第１２の態様において、少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、主としてエキソペプチダーゼ活性を有し、
（ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；または
（ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得；
または本発明の方法のいずれか１つにより取得可能である）または本発明の加水分解物を含み；
場合により、ポリオール、例えば、グリセロールおよび／またはソルビトール；糖、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトースおよびトレハロース；塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、Ｎａ２ＳＯ４または他の食料グレード塩；保存剤、例えば、安息香酸ナトリウムおよび／またはソルビン酸カリウム；またはそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の成分をさらに含む食料添加用組成物または飼料添加用組成物が提供される。
第１３の態様において、本発明による加水分解物を含む食料添加用または飼料添加用組成物が提供される。
第１４の態様において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９８、配列番号９９から選択されるアミノ酸配列またはその機能断片またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、または本発明の方法により取得可能な少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ；または本発明の加水分解物および場合により、少なくとも１つの食料または飼料成分を含む食料原料または飼料原料が提供される。
第１５の態様において、少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、主としてエキソペプチダーゼ活性を有し、
（ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；または
（ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得；
または本発明の方法のいずれか１つにより取得可能である）；少なくとも１つのエンドプロテアーゼ；およびそれらの同時投与のための説明書を含むキットが提供される。
第１６の態様において、
（ｉ）少なくとも１つのエンドペプチダーゼ；
（ｉｉ）少なくとも１つのＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼ；および
（ｉｉｉ）１つ以上のアミノペプチダーゼ、ならびにそれらの同時投与のための説明書
を含むキットが提供される。
第１７の態様において、本発明は、ヒトの皮膚上で使用される化粧品、ローション、または洗浄剤である、本発明の加水分解物を含む非食料品を提供する。
第１８の態様において、本発明は、
（ａ）Ｎ末端におけるプロリンを有するトリペプチド；または
（ｂ）Ｎ末端およびＣ末端におけるプロリンを有するトリペプチド
が濃縮された加水分解物を提供する。
本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のタンパク質加水分解プロセスにより生産された加水分解物は、限外濾過または当技術分野において公知の任意の好適な膜分離により除去し、または透過させることができる。
本発明の実施形態を、目下、添付の図面を参照して例としてのみ記載する。
ｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ−ＴＲＩ０８３発現ベクターのプラスミドマップを示す。 プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼについてのｐＨプロファイルを示す。 種々の温度におけるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの活性を示すグラフを示す。 Ａｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰ（本明細書においてＡＦＰと称する）（酸性プロテアーゼ）をプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼとの組合せでそれぞれの酵素の異なる投与量において使用した場合の酵素活性を示す。 基質ＡＡＰＰＡを経時的に開裂するプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの能力を示す。 ＡＡＰＰＡ基質からの開裂産物ＡＡＰの経時的な生産を示す。 発現ベクターｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−ＴＲＩ０７１のプラスミドマップを示す。内因性シグナル配列をトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）酸性真菌プロテアーゼ（ＡＦＰ）からの分泌シグナル配列およびトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グリコアミラーゼ遺伝子（ＴｒＧＡ１）からのイントロンにより置き換えた（図７の下段部参照）。 コーンソイ（ｃｏｒｎ ｓｏｙ）飼料のタンパク質加水分解に対するＡｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰの用量応答を示す。点線は、ペプシンおよびパンクレアチンのみを使用した対照を表す。 飼料試料中の酵素組成物に対するＤＨの依存性を示す。 異なる条件におけるＡｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰおよびプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼによる飼料処理の効果を示す。黒色バーは、４０℃における１００分間の処理を表す。白色バーは、４０℃における２００分間の処理を表す。 回腸Ｎ消化率％に対するプロリン耐性耐性トリペプチジルペプチダーゼと比較した市販のプロテアーゼの効果を示す。 エネルギーの回腸消化率（ＭＪ／ｋｇ）に対するプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼと比較した市販のプロテアーゼの効果を示す。 エンドペプチダーゼおよび異なるエンドペプチダーゼ／エキソペプチダーゼ組合せ（エンドペプチダーゼ（エンド）：Ａｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＦＰ２、ＰｅｐＮ：原液中１９７ｎｋａｔＨ−Ａｌａ−ｐＮＡ／ｍＬ；プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（ＴＲＩ０８３）４，３７５ｎｋａｔＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ／ｍＬ）を用いた１５％（ｗ／ｗ）のＷＰＩの加水分解のセリン当量の増加を示す。 エンドペプチダーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼ（エンドペプチダーゼ（エンド）：Ａｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＦＰ２、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（ＴＲＩ０７１＝３ＰＰ＿Ｆｏ）４，３７５ｎｋａｔＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ／ｍＬ）を用いた１５％（ｗ／ｗ）のＷＰＩの加水分解のセリン当量の増加を示す。 前加水分解されたＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨを用いてまたは用いずに分析されたＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡを使用して分析されたＴ．レーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼのミカエリス・メンテンプロットを示す。添加された前加水分解阻害剤は、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−ＡｌａおよびＡｌａを含有する。濃度は、加水分解前のＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨの濃度として挙げる。 液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により計測されたプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼによるβ−ラクトグロブリンの断片（ペプチドＩＩＡＥＫ）の消化を示す。 ＬＣ−ＭＳにより計測されたプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼによるβ−ラクトグロブリンの断片（ペプチドＡＬＰＭＨＩＲ）の消化を示す。 ＬＣ−ＭＳにより計測されたプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼによるβ−ラクトグロブリンの断片（ペプチドＷＥＮＧＥＣＡＱＫ）の消化を示す。 ＬＣ−ＭＳにより計測されたプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼによるβ−ラクトグロブリンの断片（ペプチドＶＹＶＥＥＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬＬＱＫ）の断片の消化を示す。 ＬＣ−ＭＳにより計測されたプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼによるβ−ラクトグロブリンのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ消化産物ＥＥＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬＬＱＫのさらなる消化を示す。 ＬＣ−ＭＳにより計測されたプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼによるβ−ラクトグロブリンの断片（ペプチドＶＡＧＴＷＹＳＬＡＭＡＡＳＤＩＳＬＬＤＡＱＳＡＰＬＲ）の断片の消化を示す。 ＬＣ−ＭＳにより計測されたプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼによるβ−カゼインのトリプシン分解断片（ＧＰＦＰＩＩＶ）の消化を示す。 ＬＣ−ＭＳにより計測されたプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼによるβ−カゼインのトリプシン分解断片（ＨＫＥＭＰＦＰＫ）の消化を示す。 プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼによるブラジキニンペプチドの消化を示す。 多数のプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼアミノ酸配列間のアラインメントを示す。ｘＥＡＮＬＤ、ｙ’Ｔｚｘ’ＧおよびＱＮＦＳＶモチーフを示す（枠線）。 基質としてＡＡＦ−ｐＮＡを使用したＴＲＩ０４５（プレ−プロ配列の配列番号９８および成熟タンパク質の配列番号９９を有するトリペプチジルペプチダーゼ）活性に対するｐＨの効果を示す（値は、０．８μｌのＴＲＩ０４５を用いた１つの試験の平均である（ｎ＝２）。 発現ベクターｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３−ＴＲＩ０４５のプラスミドマップを示す。 トリペプチジルペプチダーゼＴＲＩ０４５についてのｐＨプロファイルを示す。
本発明の画期的な知見は、トリペプチジルペプチダーゼが、Ｐ１および／またはＰ１’におけるプロリンならびにＰ１および／またはＰ１’における任意の他のアミノ酸を有する基質に対するエキソペプチダーゼ活性を有し得ることである。このことは、非常に驚くべきことである。それというのも、当技術分野において典型的に報告されたトリペプチジルペプチダーゼは、プロリンがＰ１に存在する場合に阻害され、またはプロリンが基質中のＰ１に存在する場合に活性であるが、プロリン以外のアミノ酸がＰ１位に存在する場合には不活性であるためであり、これは本明細書においてプロリン特異的トリペプチジルペプチダーゼと称されることが多い。
本発明者らは、本発明によるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼが加水分解物の調製における使用に非常に有利であり、加水分解物または加水分解物および／もしくはプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（場合により、少なくとも１つのエンドプロテアーゼとの組合せで）を含む食料および／もしくは飼料添加用組成物を含む食料および／もしくは飼料が給餌される対象に利点を付与することを最初に示した。
あるいはまたはさらに、エンドプロテアーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼを使用して生産された加水分解物は、非処理加水分解物と比較して低減した苦味も有し得る。
有利には、本発明における使用のために教示されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、広範なペプチドおよび／またはタンパク質基質に作用し得、そのような広い基質特異性を有することに起因して、あるアミノ酸（例えば、プロリンおよび／またはリジンおよび／またはアルギニンおよび／またはグリシン）が濃縮された基質の開裂が容易に阻害されない。したがって、このようなプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの使用は、タンパク質基質（例えば、加水分解物の調製のための基質中に存在する）を効率的および／または急速に分解し得る。
これらの知見に基づき、
（ａ）少なくとも１つのタンパク質またはその一部を、
（Ａ）少なくとも１つのエンドプロテアーゼ；および
（Ｂ）（ａ’）少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたは主としてエキソペプチダーゼ活性を有するプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを含む発酵物（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
Ｐ１におけるプロリン；および
Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る）；または
（ｂ’）エキソペプチダーゼ活性を有する少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
Ｐ１’におけるプロリン；および
Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る）
を混合すること；ならびに
（ｂ）加水分解物を回収すること
を含む、加水分解物を生産する方法が提供される。
好適には、本方法は、ステップ（ｂ）において回収された加水分解物を、少なくとも１つの食料または飼料成分と混合するさらなるステップを含み得る。
好適には、加水分解物を生産する方法のステップ（Ａ）およびステップ（Ｂ）は、同時に実施することができる（例えば、一緒に）。
好適には、タンパク質またはその一部は、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを添加する前にエンドプロテアーゼと混合することができる。好適には、タンパク質またはその一部は、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび本明細書に詳述される１つ以上のさらなるプロテアーゼを添加する前にエンドプロテアーゼと混合することができる。
第２の態様において、
（ａ）植物タンパク質、乳汁ベースタンパク質、または卵タンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質またはその一部を、
（ｉ）少なくとも１つのエンドペプチダーゼ；
（ｉｉ）少なくとも１つのＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼ；および
（ｉｉｉ）１つ以上のアミノペプチダーゼ
と混合すること、ならびに
（ｂ）加水分解物を回収すること
を含む、加水分解物を生産する方法も提供される。
好適には、（ｉ）（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）は、タンパク質またはその一部と同時に混合することができる。
あるいは、ステップ（ａ）における混合の順序は、規定の順序で実施することができ、すなわち、（ｉ）を（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の前に実施することができる。
別の態様において、非処理加水分解物に対する免疫反応を有する傾向がある対象における免疫原性を低減させるため、または加水分解物の苦味を低減させるための、植物タンパク質、乳汁ベースタンパク質、または卵タンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質またはその一部からの加水分解物の製造における、（ｉ）少なくとも１つのエンドペプチダーゼ；（ｉｉ）少なくとも１つのＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼ；および（ｉｉｉ）１つ以上のアミノペプチダーゼの使用も提供される。
本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、限外濾過または膜分離を使用して本明細書に記載のタンパク質加水分解プロセスを改善することができる。これにより、高度に低減したアレルギー性を有する短鎖ペプチドの生産を増加させることができる。
一実施形態において、本発明の方法および／または使用において使用される少なくとも１つのタンパク質は、植物タンパク質からなる群から選択することができ、好ましくは、そのタンパク質は、グリアジン、グリアジンの免疫原性断片、子実タンパク質、グルテン、ダイズタンパク質の１つ以上である。
別の実施形態において、本発明の方法および／または使用において使用される少なくとも１つのタンパク質は、乳汁ベースタンパク質からなる群から選択することができ、好ましくは、そのタンパク質は、カゼイン、例えば、ベータ−カゼイン；ラクトグロブリン、例えば、ベータ−ラクトグロブリン；またはホエイタンパク質の１つ以上である。
好適には、本発明の方法および／または使用において使用される少なくとも１つのタンパク質は、卵タンパク質であり得る。
本明細書において使用される用語「Ｓ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼ」は、主としてエキソペプチダーゼ活性ならびにタンパク質および／またはペプチド基質のＮ末端からトリペプチドを開裂する能力を有するプロテアーゼを指す。Ｓ５３ファミリーペプチダーゼは、セリンプロテアーゼのクラスを広く包含する。Ｓ５３ファミリーはエンドプロテアーゼおよびエキソペプチダーゼの両方を含むが、本明細書において、この定義は、主としてエキソペプチダーゼ活性を有するそれらのトリペプチジルペプチダーゼのみを指すものとする。
「Ｓ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼ」は、本明細書に教示される「エキソペプチダーゼ広域特異性アッセイ」（ＥＢＳＡ）においてタンパク質１ｍｇ当たり少なくとも約５０ｎｋａｔの活性を有する。好適には、本発明による「Ｓ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼ」は、本明細書に教示されるＥＢＳＡ活性アッセイにおいてタンパク質１ｍｇ当たり約５０〜２０００ｎｋａｔの活性を有する。
エンドプロテアーゼ、Ｓ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよびアミノペプチダーゼの組合せは、本明細書において「三重酵素組成物」と称することができる。用語「三重酵素組成物」は、少なくともエンドプロテアーゼ、Ｓ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよびアミノペプチダーゼの組合せを指す。換言すると、用語「三重酵素組成物」は、１つ以上のさらなる酵素活性および／またはさらなる構成要素も含み得る。
一実施形態において、Ｓ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼであり得る。
本明細書において使用される用語「アミノペプチダーゼ」は、タンパク質および／またはペプチド基質のＮ末端から単一アミノ酸を開裂し得るエキソペプチダーゼを指す。
アミノペプチダーゼは、ラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）から取得可能である（例えば、得ることができる）。
好適には、アミノペプチダーゼは、ラクトバシルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）から取得可能であり得る。より好適には、アミノペプチダーゼは、ラクトバシルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１２０４６から取得可能であり得る。
エンドプロテアーゼおよび本発明によるエキソトリペプチジルペプチダーゼとの組合せにおいて使用されるアミノペプチダーゼは、アミノペプチダーゼＮ（例えば、ＰｅｐＮ）（ＥＣ３．４．１１．２）であり得る。
一実施形態において、エンドプロテアーゼおよびＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼとの組合せにおいて使用されるアミノペプチダーゼは、以下に示される配列を含み得る：
Figure 0006878275
本明細書において使用される用語「混合すること」は、１つ以上の成分および／または酵素を混合し、１つ以上の成分または酵素を任意の順序および任意の組合せで添加することを指す。好適には、混合することは、１つ以上の成分および／または酵素を同時にまたは逐次的に混合することに関し得る。
一実施形態において、１つ以上の成分および／または酵素は、逐次的に混合することができる。
好ましくは、１つ以上の成分および／または酵素は、同時に混合することができる。
本明細書において使用される用語「加水分解物を回収すること」は、加水分解物の単離を指す。一部の実施形態において、これは、非加水分解タンパク質および／またはペプチド基質から加水分解物質を分離することを含み得る。他の実施形態において、それは、さらにまたは代替的に、前記加水分解物の調製に使用される本発明のプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエンドプロテアーゼまたは三重酵素組成物から加水分解物質を分離することを含み得る。一実施形態において、加水分解物は、少なくとも８０％、より好適には、少なくとも９０％、いっそうより好適には、少なくとも９５％の純度を有する加水分解物質を含み得る。好ましくは、加水分解物は、少なくとも約９９％の純度を有する加水分解物質を含み得る。
一実施形態において、本発明の方法および／または使用において使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたは三重酵素組成物は、少なくとも約４０℃の温度において基質（例えば、タンパク質および／またはペプチド基質）とインキュベートすることができる。換言すると、本発明の方法は、少なくとも約４０℃の温度において実施することができる。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたは三重酵素組成物は、少なくとも約４５℃、好適には、少なくとも約５０℃の温度において基質とインキュベートすることができる。
好ましくは、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたは三重酵素組成物は、少なくとも約５５℃の温度において基質とインキュベートすることができる。
別の実施形態において、本発明の方法および／または使用において使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたは三重酵素組成物は、約４０℃から約７０℃の間の温度において基質（例えば、タンパク質および／またはペプチド基質）とインキュベートすることができる。換言すると、本発明の方法は、約４０℃から約７０℃の間の温度において実施することができる。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたは三重酵素組成物は、約４０℃から約６０℃の温度において；いっそうより好適には、約４５℃から約６５℃において温度において基質とインキュベートすることができる。
好ましくは、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたは三重酵素組成物は、約５０℃から約６０℃の温度において基質とインキュベートすることができる。
好適には、本発明の方法および／もしくは使用において使用され、または本発明の産物のいずれかに含まれるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、Ｐ１におけるプロリン；およびＰ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る。
あるいはまたはさらに、本発明の方法および／もしくは使用において使用され、または本発明の産物のいずれかに含まれるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、Ｐ１’におけるプロリン；およびＰ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る。
本明細書において使用される用語「プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ」は、ペプチド、オリゴペプチドおよび／またはタンパク質基質のＮ末端からトリペプチドを開裂し得るエキソペプチダーゼに関する。「プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ」は、本明細書において３ＰＰとも称され、プロリンがＰ１位に存在するペプチド結合を開裂し得、プロリン以外のアミノ酸がＰ１に存在するペプチド結合を開裂し得、および／またはプロリンがＰ１’位に存在するペプチド結合を開裂し得、プロリン以外のアミノ酸がＰ１’に存在するペプチド結合を開裂し得る。
一実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、エンドプロテアーゼでない。
別の実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、基質のＮ末端からテトラペプチドを開裂する酵素でない。
さらなる実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、基質のＮ末端からジペプチドを開裂する酵素でない。
いっそうさらなる実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、基質のＮ末端から単一アミノ酸を開裂する酵素でない。
一実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、プロリンがＰ１位に存在するペプチド結合を開裂し得、さらにプロリン以外のアミノ酸がＰ１に存在するペプチド結合を開裂し得る。
別の実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、プロリンがＰ１’位に存在するペプチド結合を開裂し得、さらにプロリン以外のアミノ酸がＰ１’に存在するペプチド結合を開裂し得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、Ｐ１および／またはＰ１’位に存在するプロリンがそのシスまたはトランス立体構造で存在するペプチド結合も開裂し得る。
好適には、「プロリン以外のアミノ酸」は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸であり得る。
別の実施形態において、「プロリン以外のアミノ酸」は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンから選択されるアミノ酸であり得る。
好適には、そのような実施形態において、合成アミノ酸を排除することができる。
好ましくは、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、プロリンがＰ１およびＰ１’位に存在するペプチド結合を開裂し得る。
トリペプチジルペプチダーゼが、Ｐ１および／またはＰ１’位におけるプロリンを有する基質に作用し得ることは、驚くべきことである。この活性に加え、トリペプチジルペプチダーゼが、プロリン以外のアミノ酸がＰ１および／またはＰ１’位に存在する場合にも活性を有し得ることは、いっそうより驚くべきことである。
上記の種々の基質のいずれかに対する活性を有することに加え、本発明において使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、さらに、Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３およびＰ３’からなる群から選択される１つ以上の位置におけるプロリンに対して耐性であり得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、上記の活性を有することに加え、Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３およびＰ３’位におけるプロリンに対して耐性であり得る。
これによりプロリンのストレッチを有するペプチドおよび／またはタンパク質基質の効率的な開裂が可能となり、広範なペプチドおよび／またはタンパク質基質の開裂が可能となるため、このことは有利である。
好ましくは、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、Ｐ１位におけるリジン、アルギニンまたはグリシンの１つ以上を有するペプチドおよび／またはタンパク質に対する高い活性を有し得る。理論により拘束されるものではないが、Ｐ１位におけるそれらのアミノ酸を含むペプチドおよび／またはタンパク質基質は、多くのトリペプチジルペプチダーゼおよび／またはプロテアーゼについて一般に消化困難であり得、そのような残基との接触時、トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはプロテアーゼによるペプチドおよび／またはタンパク質基質の開裂は停止し、または緩慢であり得る。有利には、本発明のプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを使用することにより、Ｐ１におけるリジン、アルギニンおよび／またはグリシンを含むタンパク質および／またはペプチド基質を効率的に消化することが可能である。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、Ｐ１位におけるリジンを有するペプチドおよび／またはタンパク質に対する優先的活性を有し得る。有利には、これにより、高いリジン含有率を有する基質、例えば、ホエイタンパク質の効率的な開裂が可能となる。
一実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、アミノ酸のセリン、アスパラギン酸およびヒスチジンの触媒三残基を含み得る。
本発明において使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、耐熱性プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼであり得る。
用語「耐熱性」は、酵素が最大約６０℃に温度に加熱された場合にその活性を保持することを意味する。好適には、「耐熱性」は、酵素が約６５℃、より好適には、約７０℃に加熱された場合にその活性を保持することを意味し得る。
有利には、耐熱性プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、非耐熱性バリアントと比較して、例えば、動物中で変性する傾向が弱く、および／または長い時間その活性を保持する。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、約ｐＨ２から約ｐＨ７の範囲内の活性を有し得る。好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、約ｐＨ４から約ｐＨ７の範囲内、より好適には、約ｐＨ４．５から約ｐＨ６．５の範囲内の活性を有し得る。
好適には、本発明の方法、特に加水分解ステップは、２から約７のｐＨにおいて実施することができる。
一実施形態において、本発明の方法、特に加水分解ステップは、約４から約７、例えば、４．５から６．５のｐＨにおいて実施することができる。
約ｐＨ４から約ｐＨ７のｐＨ範囲内の活性を有するプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼを使用することは、有利である。それというのも、それによりプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼを、このｐＨ範囲内の活性を有する１つ以上のエンドプロテアーゼと使用することが可能となるためである。
約ｐＨ４から約ｐＨ７の間のｐＨ範囲内の活性を有するプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼを使用する場合、好適には、それを中性またはアルカリ性エンドプロテアーゼとの組合せで使用することができる。
有利には、これは、加水分解物生産のためのタンパク質および／またはペプチド基質を含む反応媒体のｐＨ変化が、酵素処理の間で必要でないことを意味する。換言すると、それにより、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびエンドプロテアーゼまたは三重酵素組成物の構成要素を反応に同時に添加することが可能となり、それにより、加水分解物を生産するプロセスをより迅速に、および／またはより効率的に、および／またはよりコスト効率的にすることができる。さらに、より低いｐＨ値において基質が溶液から沈殿し得、したがって開裂され得ないため、これにより、より効率的な反応が可能となる。
任意の好適なアルカリ性エンドプロテアーゼを本発明において使用することができる。好適には、アルカリ性エンドプロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシン、またはスブチリシンからなる群から選択される１つ以上であり得る。
別の実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、酸性ｐＨにおいて活性を有し得る（好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、酸性ｐＨにおいて最適活性を有し得る）。プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、約ｐＨ６未満、より好適には、約ｐＨ５未満のｐＨにおいて活性を有し得る。好ましくは、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、約２．５から約ｐＨ４．０、より好適には、約３．０から約３．３のｐＨにおいて活性を有し得る。
好適には、本発明の方法、特に加水分解ステップは、２から約４、例えば、３から３．３のｐＨにおいて実施することができる。一実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、ほぼ２．５のｐＨにおいて活性を有し得る。
酸性ｐＨにおいて活性を有するプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、酸性エンドプロテアーゼとの組合せにおいて使用することができ、有利には、加水分解物生産のためのタンパク質および／またはペプチド基質を含む反応媒体のｐＨの変化を酵素処理の間に要求しない。換言すると、それにより、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびエンドプロテアーゼまたは三重酵素組成物の構成要素を、反応に同時に添加することが可能となり、それにより、加水分解物を生産するプロセスをより迅速に、および／またはより効率的に、および／またはよりコスト効率的にすることができる。
少なくとも１つのエンドプロテアーゼを、本明細書における用途のいずれかのためのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼとの組合せにおいて使用することができる。例えば、少なくとも１つのエンドプロテアーゼを、本発明の組成物および／または食料添加用組成物および／または非食料品中に含めることができる。
本明細書において使用される用語「エンドプロテアーゼ」は、用語「エンドペプチダーゼ」と同義語であり、ペプチドまたはタンパク質基質の内部ペプチド結合（例えば、ペプチドまたはタンパク質基質のＣ末端に向かってもＮ末端に向かっても局在しない）を開裂し得るタンパク質分解ペプチダーゼである酵素を指す。このようなエンドプロテアーゼは、Ｎ末端またはＣ末端から離れて作用する傾向があるものと定義することができる。
一実施形態において、エンドプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼおよび未分類プロテアーゼのファミリーから選択されるプロテアーゼからなる群から選択される１つ以上であり得る。
一実施形態において、エンドプロテアーゼは、酸性真菌プロテアーゼ、スブチリシン、キモトリプシン、トリプシンおよびペプシンからなる群または市販のプロテアーゼ製品Ａｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰ、Ａｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＦＰ２、Ａｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＮＰ、ＦｏｏｄＰｒｏ（登録商標）アルカリ性プロテアーゼ、ＦｏｏｄＰｒｏ（登録商標）ＰＸＴ、ＦｏｏｄＰｒｏ（登録商標）ＰＢＲ、ＦｏｏｄＰｒｏ（登録商標）３０Ｌ、ＦｏｏｄＰｒｏ（登録商標）ＰＨＴもしくはＦｏｏｄＰｒｏ（登録商標）５１ＦＰの群から選択される１つ以上であり得る。
一実施形態において、エンドプロテアーゼは、酸性エンドプロテアーゼであり得る。好適には、エンドプロテアーゼは、酸性真菌プロテアーゼであり得る。
有利には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼとの組合せにおけるエンドプロテアーゼの使用は、基質開裂の効率を増加させ得る。理論により拘束されるものではないが、エンドプロテアーゼは、ペプチドおよび／またはタンパク質基質をＣまたはＮ末端から離れた複数の領域において開裂し得、それにより基質として使用するためのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼのためのより多くのＮ末端終端部を生産し、それにより有利には、反応効率を増加させ、および／または反応時間を低減させ、および／または抗原をより効率的に除去する（それにより、免疫原性を低減させる）ことが考えられる。
本発明により使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、「食料中」プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼであり得る。
本明細書において使用される用語「食料中」または「飼料中」は、酵素（例えば、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエンドプロテアーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または三重酵素組成物）が、対象の胃腸管（ＧＩＴ）中で機能的であり、好ましくは、主として機能的であり、より好ましくは、完全に機能的であることを意味する。換言すると、本明細書において使用される用語「食料中」は、酵素が、組成物および／または食料添加用組成物および／または飼料添加用組成物および／または食料原料および／または飼料原料中で、組成物および／または食料添加用組成物および／または飼料添加用組成物および／または食料原料および／または飼料原料の対象による消費前に実質的に不活性（または不活性）であることを意味する。
これらの用語「主として機能的」は、酵素がＧＩＴに流入したら主にその基質に対して機能することを意味する。換言すると、ＧＩＴに流入する前、ペプチドおよび／またはタンパク質基質の開裂物のトリペプチドへの量として定義される酵素活性のレベルは、それがＧＩＴに流入した後の酵素活性のレベルの約２０％未満、好適には、約１０％未満、好ましくは、約５％未満である。
本明細書において使用される用語「完全に機能的」は、酵素がＧＩＴへの流入前に不活性であり、ＧＩＴへの流入時に活性化されることを意味する。
本明細書において使用される用語「不活性」は、酵素が活性でないことを意味する。これは、酵素の活性がいくらか阻害されること、または酵素が不活性な環境中に存在すること、または活性である十分な時間がないように酵素が動物への給餌直前にその基質に提供されることを意味し得る。酵素の「不活性性」は、それが対象のＧＩＴに流入したら可逆的な任意のイベントにおけるものであり得る。
したがって、好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（場合により、エンドプロテアーゼとの組合せで）および／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または三重酵素組成物は、対象によるその消費直前に少なくとも１つのタンパク質またはその一部と混合することができる。
本明細書において使用される用語「実質的に不活性」は、酵素がＧＩＴに流入したときのその活性と比較して低い活性を有することを意味する。例えば、実質的に不活性は、飼料添加用組成物および／または食料添加用組成物および／または飼料添加用組成物および／または食料原料および／または飼料原料中の酵素が、ＧＩＴ中のその活性と比較してその活性の１０％未満を有することを意味し得る。
組成物および／または食料添加用組成物および／または飼料添加用組成物および／または食料原料および／または飼料原料中で「食料中」酵素を不活性または実質的に不活性状態に維持することは、当業者に公知の多数の手法で達成することができる。
例にすぎないが、組成物および／または食料添加用組成物および／または飼料添加用組成物および／または食料原料および／または飼料原料の含水率（重量％）を１５％未満、好ましくは、１０％未満に維持することは、組成物および／または食料添加用組成物および／または飼料添加用組成物および／または食料原料および／または飼料原料中で食料中酵素が不活性または実質的に不活性であることを確保するために十分である。
一実施形態において、組成物および／または食料添加用組成物および／または飼料添加用組成物および／または食料原料および／または飼料原料は、食料中酵素の混合後、乾燥状態または実質的に乾燥状態である（その状態で維持および／または貯蔵される）。
本明細書において使用される用語「乾燥状態」は、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（場合により、エンドプロテアーゼとの組合せで）および／または組成物および／または食料添加用組成物および／または飼料添加用組成物および／または食料原料および／または飼料原料が、水を含有せず、または極めて少量の水のみを含有することを意味する。換言すると、本明細書において使用される用語「乾燥状態」は、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（場合により、エンドプロテアーゼとの組合せで）および／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または三重酵素組成物および／または組成物および／または食料添加用組成物および／または飼料添加用組成物および／または食料原料および／または飼料原料が、５％未満、好ましくは、１％未満の水分含有率（重量％）を含むことを意味し得る。
一実施形態において、本発明の方法および／または使用および／または産物において使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエンドプロテアーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または三重酵素組成物は、乾燥または実質的に乾燥状態であり得る。
別の実施形態において、本発明の方法および／または使用および／または産物のいずれかにおいて使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、少なくとも１つのタンパク質またはタンパク質の少なくとも一部を含む組成物と混合することができ、組成物、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはそれらの組合せおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または三重酵素組成物は、混合される場合に乾燥または実質的乾燥状態である。好適には、エンドプロテアーゼをさらに混合することができる。
用語「乾燥または実質的に乾燥状態」は、本明細書において使用される場合、組成物、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ、エンドプロテアーゼまたはそれらの組合せが、極めて少量の水のみを含有することを意味する。換言すると、本明細書において使用される用語「実質的に乾燥状態」は、組成物、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ、エンドプロテアーゼまたはそれらの組合せおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または三重酵素組成物が、１５％未満、好ましくは、１０％未満の水分含有率（重量％）を含むことを意味し得る。
一実施形態において、組成物、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ、エンドプロテアーゼまたはそれらの組合せおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または三重酵素組成物は、本発明の方法および／または使用における使用の前、その間、またはその後（好ましくは、その前）に乾燥させることができる。
別の実施形態において、本発明の方法および／または使用における使用前または後のいずれかの組成物、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ、エンドプロテアーゼまたはそれらの組合せおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または三重酵素組成物は、１５重量％未満の含水率を含む。
別の実施形態において、本発明の方法および／または使用における使用前または後のいずれかの組成物、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ、エンドプロテアーゼまたはそれらの組合せおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または三重酵素組成物は、１０重量％未満の水分含有率；より好適には、５重量％未満の水分含有率、いっそうより好適には、１重量％未満の水分含有率を含む。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（例えば、「食料中」プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ）、エンドプロテアーゼまたはそれらの組合せは、酵素のその基質との相互作用を物理的に防止することにより、組成物および／または食料添加用組成物および／または飼料添加用組成物および／または食料原料および／または飼料原料中で不活性または実質的に不活性状態で維持することができる。例えば、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（例えば、「食料中」プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ）、エンドプロテアーゼまたはそれらの組合せおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または三重酵素組成物は、本発明の方法および／または使用、組成物および／または食料添加用組成物および／または飼料添加用組成物および／または食料原料および／または飼料原料におけるその使用前に封入することができる。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（例えば、「食料中」プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ）、エンドプロテアーゼまたはそれらの組合せおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または三重酵素組成物が組成物および／または食料添加用組成物および／または飼料添加用組成物および／または食料原料および／または飼料原料中でその基質との相互作用を物理的に防止される場合、ＧＩＴ中で存在すると物理的障壁が除去され、したがってプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（例えば、「食料中」プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ）、エンドプロテアーゼまたはそれらの組合せおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または三重酵素組成物とその基質との相互作用が可能となる。
例にすぎないが、封入物は、封入されたプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（例えば、「食料中」プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ）、エンドプロテアーゼまたはそれらの組合せおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または三重酵素組成物の、対象の砂嚢、前胃または胃の通過により除去することができる。対象の砂嚢、前胃または胃は、極めて低い（酸性）ｐＨ（例えば、ｐＨ２〜４）である。この酸性度を使用して封入酵素を活性化させることができる。
一実施形態において、酵素は、ポリマー、例えば、キチンまたはキトサン、ゼラチン、アラビアゴムまたはワックスなどにより封入することができる。例にすぎないが、ポリマーは、Ｘｕｅ ｅｔ ａｌ Ｆｏｏｄ Ｆｕｎｃｔ．２０１３，Ａｐｒ ２５；６ Ｆｅｂ（ｅｐｕｂ）；４（４）６１０−７に教示されるゼラチンまたはアラビアゴムであり得る。あるいは、ポリマーは、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１１，１２，２８９４−２９０１に教示されるキトサンベースヒドロゲルであり得る。
一実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（例えば、「食料中」プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ）、エンドプロテアーゼまたはそれらの組合せおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または三重酵素組成物は、対象による酵素の消費により活性化させることができる。
本明細書において使用される用語「不活性」は、酵素が対象のＧＩＴに流入する前に活性である十分な時間がないように対象による酵素の消費直前にその基質に提供されることを意味し得る。
一部の実施形態において、酵素の不活性化は、例えば、熱、化学物質またはｐＨ変性による永久的脱活性化である。したがって、そのような実施形態において、「不活性」は、例えば、対象のＧＩＴ中に含まれると永久的に不活性であり得る。
本発明の酵素は、３ＰＰおよびエンドプロテアーゼの組合せを含め、液化を受けたゼラチン化、未加工、およびまたは粒状デンプンのデンプン転化プロセス、特に糖化および発酵プロセスにおいても有用である。所望の最終産物（「最終発酵物」または「ＥＯＦ」産物と称されることが多い）は、デンプン基質の酵素転化により生産することができる任意の産物であり得る。例えば、所望の産物は、グルコースおよびマルトースリッチのシロップであり得、それは他のプロセス、例えば、高フルクトーストウモロコシシロップ（ＨＦＣＳ）の調製において使用することができ、またはそれは多数の他の有用産物、例えば、アスコルビン酸中間体（例えば、グルコン塩；２−ケト−Ｌ−グロン酸；５−ケト−グルコン酸塩；および２，５−ジケトグルコン塩）；１，３−プロパンジオール；アミノ酸（例えば、チロシン、セリン、リジン、グルタミン酸、グリシン、フェニルアラニンおよびトリプトファン）；有機酸（例えば、乳酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、グルコン酸塩、イタコン酸塩、およびオキサロ酢酸塩）；抗生物質；抗菌剤；酵素；ビタミン；ホルモン；エタノール、ブタノール、および他のアルコール；グルコノデルタ−ラクトン；エリソルビン酸ナトリウム；オメガ−３脂肪酸；イソプレン；ならびに他の生化学物質および生物材料）に転化することができる。当業者は、それらのＥＯＦ産物の生産において使用することができる種々の発酵条件を認識する。
当業者は、転化のためのデンプン基質を調製するために使用することができる利用可能な方法を十分認識する。有用なデンプン基質は、塊茎、根、茎、マメ科植物、穀草または全粒から得ることができる。より具体的には、粒状デンプンは、トウモロコシ、トウモロコシ穂軸、コムギ、オオムギ、ライムギ、ライコムギ、ミロ、サゴ、キビ、キャッサバ、タピオカ、ソルガム、イネ、エンドウ、マメ、バナナ、またはジャガイモから得ることができる。デンプン基質は、非デンプン分画、例えば、胚残渣および繊維を含有する粉砕全粒からの粗デンプンであり得る。
液化は、一般に、α−アミラーゼの添加と同時の、またはそれが後に続くデンプンのゼラチン化を含むが、追加の液化誘導酵素を場合により添加することができる。一部の場合、デンプンの液化は、ゼラチン化温度またはそれ未満において実施し、典型的には、異なる性能基準を有する類似クラスの酵素を要求する。液化デンプンは、α−アミラーゼを場合により、他の酵素の存在下で使用して、より低い重合度（ＤＰ）を有するシロップに糖化することができる。糖化の産物の正確な組成は、使用される酵素の組合せ、および加工される粒状デンプンのタイプに依存する。
本発明の酵素は、単離酵素溶液、乾燥または顆粒酵素、澄明ブロス、限外濾過濃縮物、または全細胞ブロスとして、場合により、ブレンドの一部として液化および／または糖化の間に添加することができる。本発明の酵素は、酵素を発現する宿主細胞により産生された培養細胞材料の形態で添加することもできる。本発明の酵素は、酵素が連続的に反応中に提供されるように発酵または同時糖化発酵（ＳＳＦ）プロセスの間に宿主細胞により反応媒体中に分泌させることもできる（下記参照）。本発明の酵素を産生および分泌する宿主細胞は、追加の酵素、例えば、グルコアミラーゼおよび／またはα−アミラーゼも発現し得る。宿主細胞は、広域スペクトルの種々の糖分解酵素を発現するように遺伝子操作することができる。
アミラーゼによる処理により生産された可溶性デンプン加水分解物は、高フルクトースデンプンベースシロップ、例えば、高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）に転化することができる。この転化は、グルコースイソメラーゼ、特に固体担体上に固定化されたグルコースイソメラーゼを使用して達成することができる。
可溶性デンプン加水分解物、特にグルコースリッチシロップは、デンプン加水分解物を発酵生物と接触させることにより発酵することができる。エタノール生産微生物としては、酵母、例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および細菌、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼおよびピルビン酸デカルボキシラーゼを発現するザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）が挙げられる。酵母の市販源としては、ＥＴＨＡＮＯＬ ＲＥＤＯ（ＬｅＳａｆｆｒｅ）；ＴＨＥＲＭＯＳＡＣＣＯ（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ）；ＲＥＤ ＳＴＡＲＯ（Ｒｅｄ Ｓｔａｒ）；ＦＥＲＭＩＯＬＯ（ＤＳＭ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）；およびＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴＯ（Ａｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。他のＥＯＦ（例えば、上記のもの）を生産する微生物も、当技術分野において公知である。上記のとおり、糖化発酵プロセスは、発酵生物が本発明の酵素を、場合により、１つ以上の追加の酵素、例えば、グルコアミラーゼおよび／またはα−アミラーゼと発現するＳＳＦプロセスとして実施することができる。発酵は、ＥＯＦの後続の濃縮、精製、および回収を含み得る。
加水分解物
本発明はまた、本発明の方法により取得可能な（例えば、得られた）加水分解物を提供する。
好適には、そのような加水分解物は、トリペプチドが濃縮されていてよい。好適には、加水分解物は、そのＮ末端におけるプロリンを有するトリペプチドならびに／またはそのＮ末端およびＣ末端におけるプロリンを有するトリペプチドの１つ以上が濃縮されていてよい。
好ましくは、そのような加水分解物は、そのＮ末端におけるプロリンおよびそのＣ末端におけるプロリンを有する１つ以上のトリペプチドが濃縮されていてよい。
あるいはまたはさらに、加水分解物は、本明細書に記載のプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（場合により、エンドプロテアーゼまたはそれらの組合せで）および／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または三重酵素組成物、例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つまたは本明細書の方法のいずれかにより取得可能な（例えば、得られた）プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを含み得る。
本明細書において使用される用語「加水分解物」は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびエンドプロテアーゼによるタンパク質またはその一部の処理から得られる産物を指す。タンパク質またはその一部のタンパク質分解開裂の程度は、例えば、処理の条件、例えば、処理の長さ、温度、タンパク質の濃度、ならびにプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびエンドプロテアーゼの純度、濃度、および活性に応じて最小（例えば、単一タンパク質上の単一ペプチド結合の開裂）から広域に及び得る。
したがって、「加水分解物」は、典型的には、少なくとも１つのプロテアーゼ（好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ）によりペプチドおよび／またはタンパク質基質を開裂することにより取得可能な短鎖ペプチドの混合物を含む。好適には、そのような加水分解物は、実質的にトリペプチドが、ならびに場合により、単一アミノ酸および／またはジペプチドも濃縮されていてよい。
有利には、トリペプチド、ジペプチドおよび／または単一アミノ酸の濃縮は、動物および／またはヒトによる加水分解物のより効率的な取り込みをもたらし得る。
トリペプチドおよびジペプチドの高含有率を有する加水分解物は、栄養学的に有利である。それというのも、ジおよびトリペプチドの腸吸収は、遊離アミノ酸の取り込みとは独立して機能するＰｅｐＴ１受容体を介して起こるためである（Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２００８，Ｊ ＡＮＩＭ ＳＣＩ，８６：２１３５−２１５５）。
本明細書において使用される用語「実質的にトリペプチドが濃縮された」は、当技術分野において公知の任意の方法（例えば、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ））により計測される総ペプチド濃度のうち、それらのペプチドの少なくとも約２０％（好適には、少なくとも約３０％）がトリペプチドであることを意味する。好適には、それらのペプチドの少なくとも約４０％、より好適には、少なくとも約５０％がトリペプチドである。
一実施形態において、本明細書において使用される用語「実質的にトリペプチドが濃縮された」は、当技術分野において公知の任意の方法（例えば、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ））により計測される総ペプチド濃度のうち、それらのペプチドの少なくとも約７０％がトリペプチドであることを意味する。
有利には、タンパク質加水分解の間に限外濾過を使用することができる。酵素膜反応器は、加水分解反応器に連結している少なくとも１つの限外濾過膜を有する。それにより、限外濾過を加水分解の間に使用してペプチドを阻害する酵素を除去し、および／または膜の分子量カットオフにより決定される分子質量を有するペプチド分画を生産することができる。これは、高度に低減したアレルギー性を有する短鎖ペプチドの生産に有用である。酵素膜反応器は、タンパク質基質の所望のペプチドへのより高い変換率および適用されるタンパク質分解酵素の再使用も容易にし得る。酵素膜反応器の使用の例は、Ｅｉｓｅｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３６，４８３−４９０およびＣｈｅｉｓｏｎ ＳＣ，Ｗａｎｇ Ｚ，Ｘｕ ＳＹ（２００７）Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ５５，３８９６-３９０４に挙げられている。
一実施形態において、加水分解物は、全長出発基質（例えば、少なくとも１つのタンパク質）の約２０％未満、好適には、約１０％未満を含み得る。好適には、加水分解物は、全長出発基質（例えば、少なくとも１つのタンパク質）の約５％未満、より好適には、約１％未満を含み得る。
一部の実施形態において、加水分解物は、全長出発基質を含み得ず、または実質的に含み得ない。
本文脈において使用される用語「実質的に〜ない」は、全長出発基質の約０．５％未満、好適には、約０．１％未満を意味し得る。
エンドプロテアーゼ、Ｓ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよびアミノペプチダーゼを加水分解物の製造に使用した場合、そのような加水分解物は単一アミノ酸、ジペプチドおよびトリペプチドが濃縮していることが考えられる。
一実施形態において、そのような加水分解物中に存在する単一アミノ酸、ジペプチドおよびトリペプチドは、それぞれの規定のモル濃度に関して定量することができる。一実施形態において、加水分解物中の単一アミノ酸、ジペプチドおよびトリペプチドのモル比は、少なくとも約２０％の単一アミノ酸対少なくとも約１０％のジペプチド対少なくとも約１０％のトリペプチドであり得る。
別の実施形態において、加水分解物中の単一アミノ酸、ジペプチドおよびトリペプチドのモル比は、少なくとも約１０％の単一アミノ酸対少なくとも約２０％のジペプチド対少なくとも約２０％のトリペプチドであり得る。
本発明の方法により取得可能な、または本明細書に教示される用途のいずれかにおいて使用される加水分解物は、加水分解物の生産のための消化のための基質を形成した少なくとも１つのタンパク質またはその一部に対する免疫応答を有する傾向がある対象において低減した免疫原性を有し得る。
本発明の加水分解物は、少なくとも１つのタンパク質またはその一部をエンドプロテアーゼおよびプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼと混合することにより生産する。
加水分解物の製造において基質として使用されるタンパク質またはその一部は、動物タンパク質または植物タンパク質（例えば、植物性タンパク質）であり得る。
好適には、タンパク質またはその一部は、グリアジン、ベータ−カゼイン、ベータ−ラクトグロブリンまたはグリアジン、ベータ−カゼイン、ベータ−ラクトグロブリンの免疫原性断片、グリシニン、ベータ−コングリシニン、クルシフェリン、ナピン、コラーゲン、ホエイタンパク質、魚類タンパク質、食肉タンパク質、卵タンパク質、ダイズタンパク質、ホルデインおよび子実タンパク質からなる群から選択される１つ以上であり得る。
一実施形態において、好ましくは、タンパク質またはその一部は、植物タンパク質、乳汁ベースタンパク質、卵タンパク質またはそれらの組合せである。
一実施形態において、好ましくは、タンパク質またはその一部は、植物タンパク質であり、好ましくは、そのタンパク質は、グリアジン、グリアジンの免疫原性断片、子実タンパク質、グルテン、ダイズタンパク質の１つ以上である。
一実施形態において、好ましくは、タンパク質またはその一部は、乳汁ベースタンパク質であり、好ましくは、そのタンパク質は、カゼイン、例えば、ベータ−カゼイン；ラクトグロブリン、例えば、ベータ−ラクトグロブリン；またはホエイタンパク質の１つ以上である。
一実施形態において、好ましくは、タンパク質またはその一部は、卵タンパク質である。
タンパク質またはその一部は、トウモロコシ、ダイズミール、トウモロコシ可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣（ＤＤＧＳ）、コムギ、コムギタンパク質（例として、グルテン）、コムギ副産物、コムギふすま、トウモロコシ副産物、例として、トウモロコシグルテンミール、オオムギ、オートムギ、ライムギ、ライコムギ、高脂肪ダイズ、動物副産物ミール、アルコール可溶性タンパク質（好ましくは、ゼイン（例えば、メイズゼインメイズ）および／またはおよび／またはカフィリン（例えば、ソルガムからのもの））、油糧種子からのタンパク質（好ましくは、ダイズ種子タンパク質、ヒマワリ種子タンパク質、ナタネタンパク質、キャノーラ種子タンパク質またはそれらの組合せからのもの）またはそれらの組合せに含まれ得る。
一実施形態において、タンパク質またはその一部は、タンパク質食品であり得る。一実施形態において、これは、魚類からのタンパク質食品または動物（例えば、非ヒト哺乳動物）からのタンパク質食品であり得る。
一実施形態において、本発明により使用されるタンパク質またはその一部は、動物副産物であり得る。
このような副産物は、ヒト食料において利用されず、動物飼料およびペットフードにおいて使用される数々のタンパク質食品に加工される動物生産および加工からの組織を含み得る。一実施形態において、動物タンパク質副産物は、食肉および骨粉、肉食品、血粉、家禽副産物食品、家禽食品、羽毛粉および魚類食品であり得る。
別の実施形態において、本発明において使用されるタンパク質またはその一部は、微生物タンパク質であり得る。微生物タンパク質、例えば、酵母エキスなどは、典型的には、微生物培養物から細胞含有物を抽出することにより作製され；それらは食料添加剤もしくは着香料として、または微生物培養培地のための栄養素として使用することができる。
いっそうさらなる実施形態において、本発明において使用されるタンパク質またはその一部は、無脊椎動物タンパク質、好適には、昆虫タンパク質であり得る。
昆虫／無脊椎動物は、膨大な生物多様性を有し、大きなバイオマス（動物界の９５％）を表し、したがって、代替タンパク質源を提供する。
一実施形態において、タンパク質またはその一部は、コムギタンパク質、コムギタンパク質の一部、乳タンパク質および乳タンパク質の一部からなる群から選択される１つ以上であり得る。
コムギタンパク質またはその一部は、コムギ、コムギ製品（例えば、小麦粉）、コムギ副産物および／またはコムギふすまから取得可能であり得る。好適には、コムギタンパク質は、グリアジン、グリアジンの一部、グルテンおよびグルテンの一部からなる群から選択される１つ以上であり得る。
乳タンパク質またはその一部は、乳汁タンパク質であり得る。好適には、乳汁タンパク質は、ベータ−カゼイン、ベータ−ラクトグロブリンおよびホエイタンパク質からなる群から選択される１つ以上であり得る。
加水分解物の製造に使用されるタンパク質またはその一部に関する「その一部」は、タンパク質の免疫原性断片であり得る。「免疫原性断片」は、感受性個体において免疫応答を誘発し得る任意の部分である。「免疫原性断片」または「その一部」は、少なくとも１０アミノ酸、好適には、少なくとも２０アミノ酸、より好適には、少なくとも３０アミノ酸を含み、またはそれからなる全長タンパク質の一領域である。
一実施形態において、免疫原性断片またはその一部は、少なくとも約５０アミノ酸であり得；より好適には、少なくとも約１００アミノ酸、いっそうより好適には、少なくとも約２００アミノ酸であり得る。
本明細書において使用される「乳汁タンパク質」は、分娩後雌哺乳動物の乳腺の通常の分泌物中の任意の天然存在タンパク質、またはそれに由来する産物、例えば、その分画、またはそれから作製され、もしくはその構成成分を包含する。乳汁は、任意の哺乳動物種、例として、限定されるものではないが、ウシ、ヤギ、ヒツジ、スイギュウ、ヤク、ラクダ、ラマ、アルパカ、およびヒトからのものであり得る。乳汁が市場でまたは種々の文化および国々で広く使用されるそれらの哺乳動物からの乳汁タンパク質が好ましい。本明細書において使用される「乳汁タンパク質」は、語「タンパク質」の単数形および複数形の両方を包含し、したがって、用語「乳汁タンパク質」は、特に示される場合を除き単一タンパク質、または１つ以上のタンパク質の任意の混合物を指し得ることに留意すべきである。
用語「ホエイタンパク質」は、「ホエイ」；凝乳から分離されるチーズ作製の液体副産物中で任意の量で見出される任意のタンパク質を包含する。多くのチーズの生産から生じるホエイは、特にミセル乳汁タンパク質、例えば、カゼインが低濃度であるが、可溶性タンパク質、例えば、アルファラクトアルブミンおよびベータ−ラクトグロブリンが相対的に濃縮している。上記「乳汁タンパク質」に関して、本明細書において使用される用語「ホエイタンパク質」は、語「タンパク質」の単数形および複数形の両方を包含し、したがって、用語「ホエイタンパク質」は、特に示される場合を除き単一タンパク質、または１つ以上のホエイタンパク質の任意の混合物も指し得る。ホエイタンパク質は、実際、乳汁タンパク質のサブクラスであり、したがって、用語「乳汁タンパク質」は、本明細書に特に示される場合を除き１つ以上のホエイタンパク質を含み得ることが当業者により理解される。ホエイ組成物としては、例えば、乳汁、クリーム、およびチーズホエイを挙げることができる。任意のチーズタイプに由来するホエイを使用することができる。ホエイタンパク質は、任意の方法、例えば、チーズホエイの濾過、透析、蒸発、および逆浸透に由来し、または典型的に「ホエイタンパク質」と記載されるタンパク質をもたらす任意の他の方法により由来し得る。
好ましい実施形態において、本発明の方法により取得可能な（例えば、得られた）加水分解物は、乳汁タンパク質加水分解物、コムギタンパク質加水分解物（例えば、グリアジンおよび／またはグルテン加水分解物）、ダイズタンパク質加水分解物またはそれらの組合せであり得る。
したがって、非処理加水分解物に対する免疫反応を有する傾向がある対象における免疫原性を低減させるための加水分解物の製造における、少なくとも１つのエンドプロテアーゼおよび少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを含む発酵物（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、主としてエキソペプチダーゼ活性を有し、
（ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；または
（ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得；
または本発明の方法のいずれか１つにより取得可能である）の使用が提供される。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、Ｐ１におけるプロリン；およびＰ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；ならびにＰ１’におけるプロリン；およびＰ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る。
本明細書において、「低減した免疫原性」は、計測可能な免疫学的応答の任意の低減、減少または改善を指す。このような応答の計測は、インビトロまたはインビボで評価することができる。例えば、応答は、個体からの組織、細胞、もしくは体液など、もしくはそれらの任意の組合せを含む生物学的試料中で直接もしくは間接的に計測することができ、またはそれは、個体中で直接もしくは間接的のいずれかで評価することができる。本明細書に提供される種々の実施形態においてそのような応答の任意の数理的減少（または低減）がインビトロで計測されようともインビボで計測されようとも十分である一方、減少は、より相当量のものであることが好ましい。無論、当業者は、生物学的データ、例えば、免疫学的応答の計測値が個体内の、および個体間の潜在的に大きな変動を受けることを認識する。例えば、応答が「感受性」個体におけるものである場合、免疫応答は、好ましくは、実質的に低減される（例えば、少なくとも約５０％、６０％、または７０％、またはさらには約８０％以上だけ）。より好ましくは、１つ以上のタンパク質またはその一部に感受性でない個体からの免疫学的応答の尺度と比較して本明細書に記載のタンパク質加水分解物についてそのような感受性個体においてわずかなまたは最小の差が見られるにすぎない。これは、免疫学的応答が有害、例えば、アレルギー性応答であると考えられる場合に特に好ましい。このような場合、感受性個体の免疫学的応答（またはその尺度）の減少は、少なくとも約８５％から約９０％、より好ましくは、約９０％から約９５％、またはさらにはそれ以上であり得る。一部の場合、本明細書に記載のタンパク質加水分解物に対する感受性個体の応答は、感受性でない個体の応答と統計的に有意に異なるものでない。さらに他の場合、免疫学的応答の低減は、「感受性」個体における非加水分解タンパク質について見られるものに対して数倍であり得る。例えば、約１０倍から１００倍またはさらには１０００倍の応答の低減が存在し得る。より好ましくは、非改変タンパク質に対する個体の応答と比較して、本明細書に開示されるタンパク質加水分解物の組成物を消費し、またはそれに曝露される個体からの免疫学的応答の計測値の約１０００倍から１０，０００倍またはさらには１００，０００倍以上の低減が存在し得る。
本明細書において使用される「感受性」個体は、非加水分解形態のタンパク質に対する免疫応答または反応を有する傾向がある個体である。例えば、１つ以上のタンパク質またはその一部の消費またはそれへの曝露の直接または間接的結果としてのそのような免疫応答または反応は、それらのタンパク質の免疫原性の尺度である。このようなタンパク質は、タンパク質に対するそのような免疫応答を有すると予測されない個体における皆無またはそれに近い免疫原性を実証し、そのような個体は、本明細書において１つ以上のタンパク質またはその一部に対して「非感受性」または「感受性でない」と称されることがある。好ましくは、そのような個体は、タンパク質への曝露またはその消費のいずれに対しても顕著な免疫反応（免疫学的応答）を有さない。
コムギタンパク質（特に、グルテンおよび／またはグリアジン）に対する反応を有する感受性個体は、セリアック病（例えば、セリアックスプルー）の症状を呈し得る。症状としては、消化管中の疼痛および不快感、慢性便秘および下痢、発育障害（小児）、貧血および疲労が挙げられるが、それらは不存在であり得、他の器官系における症状が記載されている。ビタミン欠乏は、食料から栄養素を適切に吸収する小腸の低減した能力に起因してセリアック病を有する人々において留意されることが多い。理論により拘束されるものではないが、グリアジンへの曝露時、酵素組織トランスグルタミナーゼがグリアジンを修飾し、腸組織と免疫系の交差反応をもたらし、罹患個体における炎症反応を引き起こすことが考えられる。
乳汁タンパク質に対する反応を有する感受性個体は、乳汁中のタンパク質またはその免疫原性断片の１つ以上に対する有害免疫反応により引き起こされる乳汁アレルギーの症状を呈し得る。障害は、抗体媒介または非抗体媒介のいずれかであり得る。抗体媒介乳汁アレルギーは、典型的には急速に発症し、胃腸、皮膚および／または呼吸器症状を示す個体をもたらし得る。このような症状は、皮膚発疹、蕁麻疹、嘔吐、および胃部不快感、例えば、下痢、鼻炎、胃痛、喘鳴、またはアナフィラキシー反応としてさらに顕在し得る。非抗体媒介は、典型的には、Ｔ−リンパ球により媒介され、抗体によっては引き起こされないと考えられる。この形態の症状は、典型的には、胃腸および皮膚であり得る。
他の感受性個体は、一連の症状（最も重篤なものは、アナフィラキシーである）をもたらすダイズに対する反応を有し得る。
加水分解物および／または食料および／または飼料および／またはそのような加水分解物を含むことまたは本発明の組成物は、セリアック病、乳汁タンパク質アレルギーおよび／またはダイズタンパク質アレルギーを罹患する対象への投与に特に好適である。
有利には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼとの組合せのエンドプロテアーゼは、疾患、例えば、乳汁タンパク質アレルギーおよび／またはダイズタンパク質アレルギーを罹患する感受性個体における免疫応答を引き起こすことに関連するタンパク質基質を開裂し得る。
したがって、一実施形態において、本発明の方法および／または使用により生産された加水分解物を含む食料添加用または飼料添加用組成物が提供される。
本発明の別の態様において、加水分解物の苦味を低減させるための加水分解物の製造における、少なくとも１つのエンドプロテアーゼおよび少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを含む発酵物（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、主としてエキソペプチダーゼ活性を有し、
（ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；または
（ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得；
または本発明の方法のいずれか１つにより取得可能である）の使用も提供される。
加水分解物生産のためのタンパク質またはその一部の基質が疎水性Ｌ−アミノ酸リッチである場合、タンパク質加水分解物は、苦味を有し得る。理論により拘束されるものではないが、ペプチドの苦味は、そのペプチド長さおよびその中のＬ−アミノ酸残基の平均疎水度に依存的であることが考えられる。
加水分解物の「低減した苦味」は、加水分解物の苦味を格付けすることを求められる個人の試食審査を使用して客観的に計測することができる。苦味指標を使用して加水分解物の苦味を格付けすることができる。例えば、１の参照指標が与えられるキニンに対する物質を格付けする苦味指標を使用することができ、あるいは、０（苦味なし）から１０（苦味）のスケールを有する苦味指標を使用することができる。好適には、適切な対照、例えば、ブラインド試験を使用して加水分解物の任意の試食を行うことができる。さらにまたはあるいは、ＬＣ−ＭＳまたは当技術分野において公知の他の好適な技術を介して公知の苦味ペプチドの開裂をモニタリングすることができる。
エンドプロテアーゼおよびプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを使用して苦味ペプチドを開裂することができる。
有利には、これは、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼによるＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ１’、Ｐ２’および／またはＰ３’位における広範なアミノ酸に対する耐性に起因して達成することができる。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列ＧＰＦＰＩＩＶ、ＶＩＰＶＰＱＫおよび／またはＧＰＦＰＶＩを有するタンパク質を開裂し得る。ＧＰＦＰＶＩは、苦味の強いペプチドであることが公知である（Ｍａｔｏｂａ ｅｔ ａｌ（１９７０），Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３４，３２１）。
驚くべきことに、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、Ｐ１および／またはＰ１’位におけるプロリンを有するペプチドを開裂し得、したがって、そのような苦味ペプチドの開裂を容易にする。
一実施形態において、脱苦味性加水分解物は、食料およびまたは食料原料の調製において使用することができる。
一実施形態において、加水分解物は、
配列番号２９、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９８、配列番号９９から選択される１つ以上のアミノ酸配列またはその機能断片またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを含み得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８から選択される１つ以上のアミノ酸配列またはその機能断片またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９８、配列番号９９から選択される１つ以上のアミノ酸配列またはその機能断片またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
キット
一態様において、少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、主としてエキソペプチダーゼ活性を有し、
（ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；または
（ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得；
または本発明の方法のいずれか１つにより取得可能である）；少なくとも１つのエンドプロテアーゼ；およびそれらの同時投与のための説明書を含むキットが提供される。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
（ｉ）（Ａ）Ｐ１におけるプロリン；および
（Ｂ）Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；ならびに
（ｉｉ）（ａ’）Ｐ１’におけるプロリン；および
（ｂ’）Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る。
より好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、Ｐ１位およびＰ１’位におけるプロリンを有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る。
本発明はまた、（ｉ）少なくとも１つのエンドプロテアーゼ；
（ｉｉ）少なくとも１つのＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼ；および（ｉｉｉ）１つ以上のアミノペプチダーゼ、ならびにそれらの同時投与のための説明書を含むキットを提供する。
エンドプロテアーゼは、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼに対して別個にコンパートメント化することができる、または２つの酵素を混合することができる。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエンドプロテアーゼは、本明細書に記載の、または当業者に公知の任意の様式で配合することができる。
本明細書において使用される用語「同時投与する」は、１つ以上の成分および／または酵素を別個に（例えば、逐次的に）または一緒に（例えば、同時に）投与することのいずれかを意味する。
活性およびアッセイ
本発明において使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、主としてエキソペプチダーゼ活性を有する。
本明細書において使用される用語「エキソペプチダーゼ」活性は、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼが基質、例えば、タンパク質および／またはペプチド基質のＮ末端からトリペプチドを開裂し得ることを意味する。
本明細書において使用される用語「主としてエキソペプチダーゼ活性を有する」は、トリペプチジルペプチダーゼがエンドプロテアーゼ活性を有さず、または実質的に有さないことを意味する。
「実質的にエンドプロテアーゼを有さない」は、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソペプチダーゼが本明細書に教示される「エキソペプチダーゼ広域特異性アッセイ（ＥＢＳＡ）」における１０００ｎｋａｔのエキソペプチダーゼ活性と比較して本明細書に教示される「エンドプロテアーゼアッセイ」における約１００Ｕ未満のエンドプロテアーゼ活性を有することを意味する。好適には、「実質的にエンドプロテアーゼ活性を有さない」は、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼが本明細書に教示される「エキソペプチダーゼ広域特異性アッセイ」における１０００ｎｋａｔのエキソペプチダーゼ活性と比較して本明細書に教示される「エンドプロテアーゼアッセイ」における約１００Ｕ未満のエンドプロテアーゼ活性を有することを意味する。
好ましくは、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソペプチダーゼは、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼが本明細書に教示される「エキソペプチダーゼ広域特異性アッセイ」における１０００ｎｋａｔのエキソペプチダーゼ活性と比較して本明細書に教示される「エンドプロテアーゼアッセイ」における約１０Ｕ未満のエンドプロテアーゼ活性を有し得、より好ましくは、本明細書に教示される「エキソペプチダーゼ広域特異性アッセイ」における１０００ｎｋａｔのエキソペプチダーゼ活性と比較して約１Ｕ未満のエンドプロテアーゼ活性を有し得る。よりいっそう好ましくは、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはエキソトリペプチジルペプチダーゼは、本明細書に教示される「エキソペプチダーゼ広域特異性アッセイ」における１０００ｎｋａｔのエキソペプチダーゼ活性と比較して本明細書に教示される「エンドプロテアーゼアッセイ」における約０．１Ｕ未満のエンドプロテアーゼ活性を有し得る。
「エンドプロテアーゼアッセイ」
エンドプロテアーゼ活性のためのアゾスカゼイン（ａｚｏｓｃａｓｅｉｎ）アッセイ
Ｉｖｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，１９９５（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９，５７３−５７６）により記載されているエンドプロテアーゼアッセイの修正型を使用する。５０μｌの酵素試料を４倍希釈のマッキルベイン緩衝液、ｐＨ５中２５０μｌのアゾカゼイン（０．２５％ｗ／ｖ；Ｓｉｇｍａ製）に添加し、振盪（８００ｒｐｍ）しながら４０℃において１５分間インキュベートする。５０μｌの２Ｍのトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｅｎｍａｒｋ製）を添加し、２０，０００ｇにおいて５分間遠心分離することにより反応を終結させる。上清の１９５μｌの試料に６５μｌの１ＭのＮａＯＨを添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を計測する。１単位のエンドプロテアーゼ活性を、４５０ｎｍ、４０℃において１５分間で０．１の吸光度増加を生じさせる量と定義する。
「エキソペプチダーゼアッセイ」
本アッセイには２つのパートが存在する。
パート１−「エキソペプチダーゼ広域特異性アッセイ」（ＥＢＳＡ）
１０μＬの発色ペプチド溶液（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で溶解させた１０ｍＭのＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ；ＭＷ＝３８７．８２；Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、マイクロタイタープレート中で１３０μｌの酢酸Ｎａ（２０ｍＭ、酢酸によりｐＨ４．０に調整）に添加し、４０℃において５分間加熱した。１０μＬの適切に希釈された酵素を添加し、吸収をＭＴＰリーダー（Ｖｅｒｓａ ｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）において４０５ｎｍで計測した。１カタールのタンパク質分解活性を、毎秒１モルのｐ−ニトロアニリンを放出するために要求される酵素量と定義した。
パート２（ｉ）−Ｐ１プロリンアッセイ
（ａ）基質Ｈ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ（ＭＷ＝８９７．１２；Ｓｃｈａｆｅｒ−Ｎ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ製を、１０倍希釈のマッキルベイン緩衝液、ｐＨ＝４．５中で１ｍｇ／ｍｌの濃度において溶解させる。
（ｂ）１０００ｕｌの基質溶液を１０ｕｇのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ溶液と４０℃においてインキュベートする。
（ｃ）１００ｕｌの試料を７つの時点（０、３０、６０、１２０、７２０および９００分）において採取し、５０ｕｌの５％ＴＦＡにより希釈し、熱不活性化させ（８０℃において１０分間）、ＬＣ−ＭＳ分析まで−２０℃において保持する；
（ｄ）ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃハイブリッド質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にインターフェース接続されたＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズキャピラリーＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用してＬＣ−ＭＣ／ＭＳ分析を実施する；
（ｅ）試料を２．１ｍｍの内径および１．７μｍの実用サイズを有する５０ｍｍのＦｏｒｔｉｓ（商標）Ｃ１８カラム上に試料をロードする
（ｆ）ＩｏｎＭＡＸ源中への２〜２８％の溶媒Ｂ（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＨＣＯＯＨ（５０／９５０／０．６５ ｖ／ｖ／ｖ））の１４分間の勾配を使用して２００μＬ／分の流速において分離を実施する。ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃ機器をデータ依存的ＭＳ／ＭＳモードで操作した；
（ｇ）ペプチド質量をＯｒｂｉｔｒａｐにより計測し（ＭＳスキャンを６０．０００の分解能、ｍ／ｚ４００により得る）、最大強度ペプチドｍ／ｚを２つまで選択し、リニアイオントラップ（ＬＴＱ）中でＣＩＤを使用して断片化に供する。動的排除は、５００質量のリストサイズ、４０秒の持続時間、およびリスト上の質量に対して±１０ｐｐｍの排除質量幅により有効とする；
（ｈ）オープンソースプログラムＳｋｙｌｉｎｅ１．４．０．４４２１（ＭａｃＣｏｓｓ Ｌａｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３７２０ １５ｔｈ Ａｖｅ ＮＥ Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳから入手可能）を使用してＲＡＷファイルにアクセスし、ＭＳ１強度を抽出してクロマトグラムを構築する。プリカーサー同位体インポートフィルターを３つのカウント（Ｍ、Ｍ＋１、およびＭ＋２）に６０，０００の分解能において設定し、最大強度の電荷状態を使用する；
（ｉ）基質および開裂産物のペプチド配列を、Ｓｋｙｌｉｎｅ中にタイピングし、それぞれの試料（０、３０、６０、１２０、７２０および９００分間の加水分解）において計算した。
（ｊ）１単位の活性は、このアッセイにおいて７２０分以内に基質の５０％を加水分解する一方、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを放出する酵素の量と定義する。
パート２（ｉｉ）−Ｐ１’プロリンアッセイ
（ａ）ペプチドＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ２（ＭＷ＝４７４．５；Ｓｃｈａｆｅｒ−Ｎ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ製）を、１０倍希釈のＭｃＩｌｖａｉｎ緩衝液、ｐＨ＝４．５中で０．１ｍｇ／ｍｌの濃度において溶解させる。
（ｂ）１０００ｕｌの基質溶液を、１０ｕｇのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ溶液と４０℃においてインキュベートする。
（ｃ）１００ｕｌの試料を、７つの時点（０、３０、６０、１２０、７２０および９００分）において採取し、５０ｕｌの５％ＴＦＡにより希釈し、熱不活性化させ（８０℃において１０分間）、ＬＣ−ＭＳ分析まで−２０℃において保持する；
（ｄ）ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃハイブリッド質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にインターフェース接続されたＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズキャピラリーＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用してＬＣ−ＭＣ／ＭＳ分析を実施する；
（ｅ）試料を２．１ｍｍの内径および１．７μｍの実用サイズを有する５０ｍｍのＦｏｒｔｉｓ（商標）Ｃ１８カラム上に試料をロードする
（ｆ）ＩｏｎＭＡＸ源中への２〜２８％の溶媒Ｂ（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＨＣＯＯＨ（５０／９５０／０．６５ｖ／ｖ／ｖ））の１４分間の勾配を使用して２００μＬ／分の流速において分離を実施する。ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃ機器をデータ依存的ＭＳ／ＭＳモードで操作した；
（ｇ）ペプチド質量をＯｒｂｉｔｒａｐにより計測し（ＭＳスキャンを６０．０００の分解能、ｍ／ｚ４００により得る）、最大強度ペプチドｍ／ｚを２つまで選択し、リニアイオントラップ（ＬＴＱ）中でＣＩＤを使用して断片化に供する。動的排除を５００質量のリストサイズ、４０秒の持続時間、およびリスト上の質量に対して±１０ｐｐｍ排除質量幅により有効とする；
（ｈ）オープンソースプログラムＳｋｙｌｉｎｅ１．４．０．４４２１（ＭａｃＣｏｓｓ Ｌａｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３７２０ １５ｔｈ Ａｖｅ ＮＥ Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳから入手可能）を使用してＲＡＷファイルにアクセスし、ＭＳ１強度を抽出してクロマトグラムを構築する。プリカーサー同位体インポートフィルターを３つのカウント（Ｍ、Ｍ＋１、およびＭ＋２）に６０，０００の分解能において設定し、最大強度の電荷状態を使用する；
（ｉ）基質および開裂産物のペプチド配列を、Ｓｋｙｌｉｎｅ中にタイピングし、強度をそれぞれの試料において計算した。
（ｊ）１単位の活性は、このアッセイにおいて７２０分以内に基質の５０％を加水分解する一方、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅを放出する酵素の量と定義する。
一実施形態において、本発明によるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、タンパク質１ｍｇ当たり、本明細書に教示される活性のパート１における少なくとも５０ｎｋａｔの活性および本明細書に教示されるアッセイのパート２（ｉ）またはパート２（ｉｉ）における少なくとも１００Ｕ活性を有する。
一実施形態において、本発明によるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、タンパク質１ｍｇ当たり、本明細書に教示される活性のパート１における約５０〜２０００ｎｋａｔの活性および本明細書に教示されるアッセイのパート２（ｉ）またはパート２（ｉｉ）における約１〜５００単位活性の活性を有する。タンパク質計測を実施例２に記載することに留意されたい。
「Ｐ１およびＰ１’プロリン活性アッセイ」
好適には、本発明において使用されるトリペプチジルペプチダーゼは、Ｐ１およびＰ１’位におけるプロリンを有する基質を開裂し得る。これは、以下に教示されるアッセイを使用して評価することができる。
このアッセイにおいて、トリペプチジルペプチダーゼは、ＬＣ−ＭＳラベルフリー定量により合成基質ＡＡＰＰＡを加水分解するその能力について試験される。
（ａ）ペプチドＨ−ＡＡＰＰＡ−ＮＨ２（ＭＷ＝４２４．３、Ｓｃｈａｆｅｒ−Ｎ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ製）を２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ＝４．０中で溶解させる（１ｍｇ／ｍｌ）；
（ｂ）１０００ｕｌのＨ−ＡＡＰＰＡ−ＮＨ２溶液を、２００ｕｌのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ溶液（４０ｕｇ／ｍｌ）（基質／酵素１００：０．８）を室温においてインキュベートする；
（ｃ）１００ｕｌの試料を７つの時点（０、５、１５、６０、１８０、７２０および１４４０分）において採取し、５０ｕｌの５％ＴＦＡにより希釈し、熱不活性化させ（８０℃において１０分間）、ＬＣ−ＭＳ分析まで−２０℃において保持する；
（ｄ）ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃハイブリッド質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にインターフェース接続されたＥａｓｙ ＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｄｅｎｓｅ，ＤＫ）を使用してナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施する；
（ｅ）１０ｃｍ分析カラム（内径７５μｍ、外径３７５μｍ、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ Ｃ１８、３μｍの逆相粒子が充填（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ，Ａｍｍｅｒｂｕｃｈ−Ｅｎｔｒｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））に接続された特注２ｃｍ捕捉カラム（内径１００μｍ、外径３７５μｍ、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ Ｃ１８、５μｍの逆相粒子が充填（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ，Ａｍｍｅｒｂｕｃｈ−Ｅｎｔｒｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））上に試料を鋼製ニードルによりロードする；
（ｆ）ナノエレクトロスプレーイオン源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｄｅｎｓｅ，ＤＫ）中への０〜３４％の溶媒Ｂ（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＥ／ＨＣＯＯＨ（１００／８００／／１００／１ ｖ／ｖ／ｖ／ｖ））の１０分間の勾配を使用して３００ｎＬ／分の流速において分離を実施し、ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃ機器をデータ依存的ＭＳ／ＭＳモードで操作する；
（ｇ）ペプチド質量をＯｒｂｉｔｒａｐにより計測し（ＭＳスキャンを６０，０００の分解能、ｍ／ｚ４００により得る）、最大強度ペプチドｍ／ｚを２つまで選択し、リニアイオントラップ（ＬＴＱ）中でＣＩＤを使用して断片化に供する。動的排除を５００質量のリストサイズ、４０秒の持続時間、およびリスト上の質量に対して±１０ｐｐｍの排除質量幅により有効とする；
（ｈ）オープンソースプログラムＳｋｙｌｉｎｅ１．４．０．４４２１（ＭａｃＣｏｓｓ Ｌａｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３７２０ １５ｔｈ Ａｖｅ ＮＥ Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳから入手可能）を使用してプログラムがＭＳ１強度を使用してクロマトグラムを構築し得るＲＡＷファイルにアクセスする。プリカーサー同位体インポートフィルターを３つのカウント（Ｍ、Ｍ＋１、およびＭ＋２）に６０，０００の分解能において設定し、最大強度の電荷状態を使用する；
（ｉ）基質および開裂産物のペプチド配列を、Ｓｋｙｌｉｎｅ中にタイピングし、強度をそれぞれの試料において計算した。
（ｊ）１単位の活性は、このアッセイにおいて２４時間以内に基質の５０％を加水分解する一方、ＡＡＰを放出する酵素の量と定義する。
一実施形態において、本発明によるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、タンパク質１ｍｇ当たり、本明細書に教示される活性のパート１における少なくとも５０ｎｋａｔの活性および本明細書に教示されるアッセイのパート２（ｉ）またはパート２（ｉｉ）における少なくとも１００Ｕの活性を有する。
一実施形態において、本発明によるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、タンパク質１ｍｇ当たり、本明細書に教示される活性のパート１における約５０〜２０００ｎｋａｔの活性および本明細書に教示されるアッセイのパート２（ｉ）またはパート２（ｉｉ）における約１〜５００単位活性の活性を有する（タンパク質濃度は、実施例２と同様に計算する）。
一実施形態において、本発明において使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、タンパク質１ｍｇ当たり、本明細書に教示される「Ｐ１およびＰ１’プロリン活性アッセイ」における少なくとも１０Ｕの活性を有し得る。
一実施形態において、本発明によるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、タンパク質１ｍｇ当たり、本明細書に教示される「Ｐ１およびＰ１’プロリン活性アッセイ」における約１Ｕ〜５００Ｕの活性の活性を有する。
上記に加え、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、上記に教示される「エキソペプチダーゼ活性アッセイ」のパート１による活性も有し得る。
一実施形態において、本発明において使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、タンパク質１ｍｇ当たり、本明細書に教示される「Ｐ１およびＰ１’プロリン活性アッセイ」における少なくとも１０Ｕの活性および上記に教示される「エキソペプチダーゼ活性アッセイ」のパート１における少なくとも５０ｎカタールを有し得る。
別の実施形態において、本発明によるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、タンパク質１ｍｇ当たり、本明細書に教示される「Ｐ１およびＰ１’プロリン活性アッセイ」における約１Ｕ〜５００Ｕの活性および本明細書に教示される「エキソペプチダーゼ活性アッセイ」のパート１における約５０Ｕ〜２０００Ｕカタールの活性を有する。
アミノ酸およびヌクレオチド配列
本発明により使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、それが本明細書に記載の活性を有する限り、任意の資源から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
一実施形態において、本発明により使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
好適には、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、より好適には、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６Ａから取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
好適には、トリコデルマ・ビレンス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓ）、より好適には、トリコデルマ・ビレンス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓ）Ｇｖ２９−８から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
好適には、トリコデルマ・アトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。より好適には、トリコデルマ・アトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）ＩＭＩ２０６０４０から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
一実施形態において、本発明により使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
好適には、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、より好適には、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ＣＡＥ１７６７５から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
好適には、白麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）、より好適には、白麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）ＩＦＯ４３０８から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
好適には、偽巣性麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、より好適には、偽巣性麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＦＧＳＣ Ａ４から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
好適には、黄麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、より好適には、黄麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＲＩＢ４０から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
好適には、アスペルギルス・ルベル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｕｂｅｒ）、より好適には、アスペルギルス・ルベル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｕｂｅｒ）ＣＢＳ１３５６８０から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
好適には、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、より好適には、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）ＮＩＨ２６２４から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
一実施形態において、本発明により使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、ビポラリス属（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）、好適には、トウモロコシごま葉枯病菌（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｍａｙｄｉｓ）、より好適には、トウモロコシごま葉枯病菌（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｍａｙｄｉｓ）Ｃ５から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
一実施形態において、本発明により使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、トグニニア属（Ｔｏｇｎｉｎｉａ）、好適には、トグニニア・ミニマ（Ｔｏｇｎｉｎｉａ ｍｉｎｉｍａ）、より好適には、トグニニア・ミニマ（Ｔｏｇｎｉｎｉａ ｍｉｎｉｍａ）ＵＣＲＰＡ７から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
一実施形態において、本発明により使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、好適には、タラロミセス・スティピタツス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ）、より好適には、タラロミセス・スティピタツス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ）ＡＴＣＣ１０５００から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
一実施形態において、本発明により使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、アルスロデルマ属（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ）、好適には、アルスロデルマ・ベンハミエ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｂｅｎｈａｍｉａｅ）、より好適には、アルスロデルマ・ベンハミエ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｂｅｎｈａｍｉａｅ）ＣＢＳ１１２３７１から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
一実施形態において、本発明により使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、好適には、イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ）、より好適には、イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ）７０−１から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
別の実施形態において、本発明により使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
好適には、パナマ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、より好適には、フザリウム・オキシスポルム・フォーマ・スピーシーズ・クベンス・レース４（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｃｕｂｅｎｓｅ ｒａｃｅ ４）から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
好適には、赤カビ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、より好適には、赤カビ病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）ＰＨ−１から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
さらなる実施形態において、本発明により使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、フェオスフェリア属（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）、好適には、コムギふ枯病菌（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ）、より好適には、コムギふ枯病菌（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ）ＳＮ１５から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
いっそうさらなる実施形態において、本発明により使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、好適には、マッシュルーム（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、より好適には、アガリクス・ビスポルス・バラエティ・ブルネッティ（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ ｖａｒ．ｂｕｒｎｅｔｔｉｉ）ＪＢ１３７−Ｓ８から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
いっそうさらなる実施形態において、本発明により使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、好適には、アクレモニウム・アルカロフィルム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
いっそうさらなる実施形態において、本発明により使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、ソディオミセス属（Ｓｏｄｉｏｍｙｃｅｓ）、好適には、ソディオミセス・アルカリヌス（Ｓｏｄｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｋａｌｉｎｕｓ）から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
一実施形態において、本発明により使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、ペニシリニウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、柑橘緑カビ病菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｉｇｉｔａｔｕｍ）、より好適には、柑橘緑カビ病菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｉｇｉｔａｔｕｍ）Ｐｄ１から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、ペニシリニウム・オクザリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｘａｌｉｃｕｍ）、より好適には、ペニシリニウム・オクザリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｘａｌｉｃｕｍ）１１４−２から取得可能であり得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、ペニシリニウム・ロケフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、より好適には、ペニシリニウム・ロケフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）ＦＭ１６４から取得可能であり得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、ペニシリニウム・ルベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｕｂｅｎｓ）、より好適には、ペニシリニウム・ルベンスウィスコンシン株（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｕｂｅｎｓ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）５４−１２５５から取得可能であり得る。
別の実施形態において、本発明により使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、ネオサルトリア属（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）から取得可能であり得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、ネオサルトリア・フィシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、より好適には、ネオサルトリア・フィシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）ＮＲＲＬ１８１から取得可能であり得る（例えば、得ることができる）。
一実施形態において、本発明により使用されるトリペプチジルペプチダーゼ（例えば、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ）は、黒麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）から取得可能なものでない（得られるものでない）。
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少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
（ａ）アミノ酸配列配列番号２９、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９８、配列番号９９またはその機能断片を含み得；
（ｂ）配列番号２９、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９８、配列番号９９またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得；
（ｃ）配列配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７を含むヌクレオチド配列によりコードされ得；
（ｄ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７と少なくとも約７０％の配列同一性を含むヌクレオチド配列によりコードされ得；
（ｅ）中程度のストリンジェンシー条件下で、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされ得；または
（ｆ）遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７と異なるヌクレオチド配列によりコードされ得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、さらなる転写後および／または翻訳後修飾を受けるポリペプチド配列として発現させることができる。
一実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、アミノ酸配列配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号９８またはその機能断片を含み得る。
別の実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号９８またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含む。
一実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、アミノ酸配列配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号９８またはその機能断片を含み得る。
別の実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号９８またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含む。
別の実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、転写後および／または翻訳後修飾（例えば、翻訳後開裂）を受けた「成熟」プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、そのような修飾は、酵素の活性化をもたらし得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、アミノ酸配列配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９９またはその機能断片を含み得る。
別の実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９９またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含む。
いっそうさらなる実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、アミノ酸配列配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号９９またはその機能断片を含み得る。
別の実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号９９またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含む。
用語「機能断片」は、そのペプチダーゼ酵素活性を保持するアミノ酸配列の一部である。したがって、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの機能断片は、主としてエキソペプチダーゼ活性を有するプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの一部であり、前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
（ｉ）（Ａ）Ｐ１におけるプロリン；および
（Ｂ）Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；ならびに／または
（ｉｉ）（ａ’）Ｐ１’におけるプロリン；および
（ｂ’）Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る。あるいはまたはさらに、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの機能断片は、主としてエキソペプチダーゼ活性を有し、Ｐ１およびＰ１’におけるプロリンを有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得るプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの一部である。
「一部」は、依然として上記定義の活性を有する任意の一部であり；好適には、一部は、少なくとも５０アミノ酸長、より好適には、少なくとも１００アミノ酸酸長であり得る。他の実施形態において、一部は、約１５０または約２００アミノ酸長であり得る。
一実施形態において、機能断片は、転写後および／または翻訳後修飾（例えば、開裂）後のプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの一部であり得る。好適には、機能断片は、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５または配列番号９９として示される配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１、またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２、またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号５またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号５またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号６またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号６またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号７またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号７またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号８またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号８またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号９またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号９またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１０またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１０またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１１またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１１またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１２またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１２またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１３またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１３またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１４またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１４またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１５またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１５またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１６またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１６またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１７またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１７またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１８またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１８またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１９またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１９またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２０またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２０またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２１またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２１またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２２またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２２またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２３またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２３またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２４またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２４またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２５またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２５またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２６またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２６またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２７またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２７またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２８、またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２８またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２９、またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２９またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３０またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３０またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３１またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３１またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３２またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３２またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３３またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３３またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３４またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３４またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３５またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３５またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３６またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３６またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３７またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３７またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３８またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３８またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３９またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３９またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４０またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４０またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４１またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４１またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４２またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４２またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４３またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４３またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４４またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４４またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４５またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４５またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４６またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４６またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４７またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４７またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４８またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４８またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４９またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号４９またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号５０またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号５０またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号５１またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号５１またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号５２またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号５２またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号５３またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号５３またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号５４またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号５４またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号５５またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号５５またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号９８またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号９８またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号９９またはその機能断片から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号９９またはその機能断片と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２９、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９８、配列番号９９またはその機能断片と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２９、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９８、配列番号９９またはその機能断片と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２９、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９８、配列番号９９またはその機能断片と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２９、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９８、配列番号９９またはその機能断片と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２９、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９８、配列番号９９またはその機能断片と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２９、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９８、配列番号９９またはその機能断片と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
一実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２９、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９８および配列番号９９からなる群の１つ以上から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
食料用途に使用される場合、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２９および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列；より好適には、それと少なくとも８０％またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み得る。
一部の実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号３、配列番号４、配列番号３０および配列番号３１からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含み得ることが好適であり得る。それと少なくとも８０％またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列が好適である。
有利には、これらの特定のアミノ酸配列は、リジン、アルギニンおよび／またはグリシンが濃縮されたペプチドおよび／またはタンパク質基質を開裂に特に好適であり得る。リジン、アルギニンおよび／またはグリシンがＰ１位に存在する場合に特に好適である。
飼料用途に使用される場合、好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号９８および配列番号９９からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含み得る。それと少なくとも８０％またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列が好適である。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列配列番号１、配列番号２または配列番号２９を有し得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、ｘＥＡＮＬＤ、ｙ’Ｔｚｘ’ＧおよびＱＮＦＳＶからなる群から選択される配列モチーフの１つ以上を含み得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、ｘＥＡＮＬＤを含み得る。
ｘは、Ｇ、Ｔ、ＳおよびＶからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸であり得る。
別の実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、ｙ’Ｔｚｘ’Ｇを含み得る。
ｙ’は、Ｉ、ＬおよびＶからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸であり得る。
ｚは、ＳおよびＴからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸であり得る。
ｘ’は、ＩおよびＶからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸であり得る。
別の実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列モチーフＱＮＦＳＶを含み得る。
さらなる実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列モチーフｘＥＡＮＬＤおよびｙ’Ｔｚｘ’ＧまたはｘＥＡＮＬＤおよびＱＮＦＳＶを含み得る。
いっそうさらなる実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列モチーフｙ’Ｔｚｘ’ＧおよびＱＮＦＳＶを含み得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列モチーフｘＥＡＮＬＤ、ｙ’Ｔｚｘ’ＧおよびＱＮＦＳＶを含み得る。
モチーフの１つ以上が、本発明において使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ中に存在する。図２５は、それらのモチーフの位置決めを示す。
一実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号９６、配列番号９７として示されるヌクレオチド配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。それと少なくとも８０％またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列が好適である。
好ましくは、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９または配列番号８０と少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号９６または配列番号９７と少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列よりコードされ得る。
別の実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、中程度のストリンジェンシー条件下で、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号９６または配列番号９７にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされ得る。高いストリンジェンシー条件下で、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号９６または配列番号９７にハイブリダイズするヌクレオチド配列が好適である。
さらなる実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号９６または配列番号９７と異なるヌクレオチド配列によりコードされ得る。
本発明はまた、
（ａ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７として本明細書に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７と少なくとも約７０％の同一性を有するヌクレオチド配列；または
（ｃ）中程度のストリンジェンシー条件下で、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７にハイブリダイズする配列；または
（ｄ）遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７と異なるヌクレオチド配列
を含む単離核酸を提供する。
好適には、ヌクレオチド配列は、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７と少なくとも約８０％の同一性、より好適には、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７と少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列であり得る。
ヌクレオチド配列は、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７と少なくとも約９５％の同一性、好適には、少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、単離核酸は、高いストリンジェンシー条件下で、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み得る。
一実施形態において、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６または配列番号９７として示されるヌクレオチド配列を含む単離ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列であり得る。
好ましくは、配列は、本発明のプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列、より好ましくは、ｃＤＮＡ配列である。
好適には、本発明はまた、
（ａ）配列番号５６として本明細書に示されるヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号５６と少なくとも約７０％の同一性を有するヌクレオチド配列；または
（ｃ）中程度のストリンジェンシー条件下で、配列番号５６にハイブリダイズする配列；または
（ｃ）遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号５６と異なるヌクレオチド配列
を含む単離核酸を提供する。
好適には、ヌクレオチド配列は、配列番号５６と少なくとも約８０％の同一性、より好適には、配列番号５６と少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列であり得る。
ヌクレオチド配列は、配列番号５６と少なくとも約９５％の同一性、好適には、少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、単離核酸は、高いストリンジェンシー条件下で、配列番号５６ハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み得る。
好適には、単離核酸は、ベクター（例えば、プラスミド）中に含めることができる。
本発明はまた、本発明による単離核酸配列またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
好適には、宿主細胞は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞、好ましくは、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞であり得る。
一態様において、好ましくは、本発明において使用されるアミノ酸および／またはヌクレオチド配列は、単離形態である。用語「単離」は、配列が天然で、天然に会合し、天然において見出される少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。本発明において使用されるアミノ酸および／またはヌクレオチド配列は、他の場合に物質が会合し得る１つ以上の汚染物質を実質的に含まない形態で提供することができる。したがって、例えば、それは、１つ以上の潜在的に汚染するポリペプチドおよび／または核酸分子を実質的に含まないことがある。
一態様において、好ましくは、本発明において使用されるアミノ酸および／またはヌクレオチド配列は、精製形態である。用語「精製」は、所与の構成成分が高レベルにおいて存在することを意味する。構成成分は、望ましくは、組成物中に存在する主な構成成分である。好ましくは、それは少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％または少なくとも約９８％のレベルにおいて存在し、前記レベルは、考慮される総組成物に関して乾燥重量／乾燥重量基準で測定される。
酵素
一実施形態において、本発明により使用されるトリペプチジルペプチダーゼまたはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、以下で選択される酵素配列のいずれかから選択することができる。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号１、その機能断片または配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号２、その機能断片または配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号３、その機能断片または配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号４、その機能断片または配列番号４と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号５、その機能断片または配列番号５と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号６、その機能断片または配列番号６と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号７、その機能断片または配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号８、その機能断片または配列番号８と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号９、その機能断片または配列番号９と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号１０、その機能断片または配列番号１０と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号１１、その機能断片または配列番号１１と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号１２、その機能断片または配列番号１２と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号１３、その機能断片または配列番号１３と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号１４、その機能断片または配列番号１４と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号１５、その機能断片または配列番号１５と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号１６、その機能断片または配列番号１６と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号１７、その機能断片または配列番号１７と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号１８、その機能断片または配列番号１８と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号１９、その機能断片または配列番号１９と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号２０、その機能断片または配列番号２０と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号２１、その機能断片または配列番号２１と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号２２、その機能断片または配列番号２２と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号２３、その機能断片または配列番号２３と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号２４、その機能断片または配列番号２４と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号２５、その機能断片または配列番号２５と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号２６、その機能断片または配列番号２６と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号２７、その機能断片または配列番号２７と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号２８、その機能断片または配列番号２８と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号２９、その機能断片または配列番号２９と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号３０、その機能断片または配列番号３０と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号３１、その機能断片または配列番号３１と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号３２、その機能断片または配列番号３２と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号３３、その機能断片または配列番号３３と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号３４、その機能断片または配列番号３４と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号３５、その機能断片または配列番号３５と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号３６、その機能断片または配列番号３６と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号３７、その機能断片または配列番号３７と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号３８、その機能断片または配列番号３８と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号３９、その機能断片または配列番号３９と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号４０、その機能断片または配列番号４０と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号４１、その機能断片または配列番号４１と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号４２、その機能断片または配列番号４２と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号４３、その機能断片または配列番号４３と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号４４、その機能断片または配列番号４４と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号４５、その機能断片または配列番号４５と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号４６、その機能断片または配列番号４６と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号４７、その機能断片または配列番号４７と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号４８、その機能断片または配列番号４８と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号４９、その機能断片または配列番号４９と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号５０、その機能断片または配列番号５０と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号５１、その機能断片または配列番号５１と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号５２、その機能断片または配列番号５２と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号５３、その機能断片または配列番号５３と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号５４、その機能断片または配列番号５４と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号５５、その機能断片または配列番号５５と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号９８、その機能断片または配列番号９８と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号９９、その機能断片または配列番号９９と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、酵素は、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有し得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号５６として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号５７として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号５８として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号５９として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号６０として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号６１として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号６２として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号６３として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号６４として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号６５として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号６６として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号６７として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号６８として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号６９として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号７０として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号７１として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号７２として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号７３として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号７４として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号７５として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。
好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号７６として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。
好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号７７として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。
好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号７８として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号７９として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号８０として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号８１として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号８２として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号８３として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号８４として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号８５として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号８６として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号８７として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号８８として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号８９として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号９０として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号９１として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号９２として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号９３として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号９４として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号９５として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号９６として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
一実施形態において、本発明において使用される酵素は、配列番号９７として示される配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。好適には、それと少なくとも８０％または８５％の同一性を有する配列によりコードされるトリペプチジルペプチダーゼであり得る。それと少なくとも９０％または９５％の同一性が好ましい。それと少なくとも９７％または９９％の同一性がより好ましい。
ヌクレオチド配列
本発明の範囲は、本明細書に定義される規定の特性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。
本明細書において使用される用語「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列、およびバリアント、ホモログ、それらの断片および誘導体（例えば、それらの一部）を指す。ヌクレオチド配列は、ゲノムまたは合成または組換え起源のものであり得、それは、センス鎖を表すかアンチセンス鎖を表すかにかかわらず二本鎖または一本鎖であり得る。
本発明に関する用語「ヌクレオチド配列」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＲＮＡを含む。好ましくは、それは本発明をコードするＤＮＡ、より好ましくは、ｃＤＮＡ配列を意味する。
好ましい実施形態において、本発明に関し、本発明それ自体の範囲により包含されるヌクレオチド配列は、その天然環境中に存在する場合、およびそれがその天然に会合する配列（それもその天然環境中に存在する）に結合している場合、本発明による天然ヌクレオチド配列を含まない。参照の容易性のため、本出願人らは、この好ましい実施形態を「非天然ヌクレオチド配列」と称する。これに関して、用語「天然ヌクレオチド配列」は、天然環境中に存在し、天然に会合するプロモーター（プロモーターもその天然環境中に存在する）全体に作動可能に結合している場合、作動可能に結合しているヌクレオチド配列全体を意味する。しかしながら、本発明の範囲により包含されるアミノ酸配列は、その天然生物中のヌクレオチド配列の発現後に単離および／または精製することができる。しかしながら、好ましくは、本発明の範囲により包含されるアミノ酸配列は、その天然生物中のヌクレオチド配列により発現させることができるが、そのヌクレオチド配列は、それがその生物内で天然に会合するプロモーターの制御下にない。
典型的には、本発明の範囲により包含されるヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術（すなわち、組換えＤＮＡ）を使用して調製される。しかしながら、本発明の代替的実施形態において、ヌクレオチド配列は、当技術分野において周知の化学的方法を使用して全部または一部を合成することができる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２１５−２３ ａｎｄ Ｈｏｒｎ Ｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２２５−２３２参照）。
ヌクレオチド配列の調製
本明細書に定義される規定の特性を有するタンパク質または改変に好適なタンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列は、前記タンパク質を産生する任意の細胞または生物から同定および／または単離および／または精製することができる。ヌクレオチド配列の同定および／または単離および／または精製についての技術分野において種々の方法が周知である。例として、好適な配列を同定および／または単離および／または精製したら、より多くの配列を調製するためのＰＣＲ増幅技術を使用することができる。
さらなる例として、ゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡライブラリーは、酵素を産生する生物からの染色体ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを使用して構築することができる。酵素のアミノ酸配列が公知である場合、標識オリゴヌクレオチドプローブを合成および使用して生物から調製されたゲノムライブラリーから酵素コードクローンを同定することができる。あるいは、別の公知酵素遺伝子と相同である配列を含有する標識オリゴヌクレオチドプローブを使用して酵素コードクローンを同定することができる。後者の場合、より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を使用する。
あるいは、酵素コードクローンは、発現ベクター、例えば、プラスミド中にゲノムＤＮＡの断片を挿入し、得られたゲノムＤＮＡライブラリーにより酵素陰性細菌を形質転換し、次いで酵素用基質（すなわち、マルトース）を含有する寒天プレート上に形質転換された細菌をプレーティングし、それにより酵素を発現するクローンの同定を可能とすることにより同定することができる。
いっそうさらなる代替例において、酵素をコードするヌクレオチド配列は、確立された標準的方法、例えば、Ｂｅｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２，ｐ １８５９−１８６９により記載されるホスホラミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３，ｐ８０１−８０５により記載される方法により合成により調製することができる。ホスホラミダイト法において、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置中で合成し、精製し、アニールし、ライゲートし、および適切なベクター中でクローニングする。
ヌクレオチド配列は、標準的技術により合成、ゲノムまたはｃＤＮＡ起源（適宜）の断片をライゲートすることにより調製される混合ゲノムおよび合成起源、混合合成およびｃＤＮＡ起源、または混合ゲノムおよびｃＤＮＡ起源のものであり得る。それぞれのライゲートされた断片は、ヌクレオチド配列全体の種々の部分に対応する。ＤＮＡ配列は、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号明細書またはＳａｉｋｉ Ｒ Ｋ ｅｔ ａｌ．，（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，ｐｐ ４８７−４９１）に記載のとおり特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製することもできる。
アミノ酸配列
本発明の範囲はまた、本明細書に定義される規定の特性を有する酵素のアミノ酸配列を包含する。
本明細書において使用される用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」および／または用語「タンパク質」と同義である。一部の例において、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。一部の例において、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
アミノ酸配列は、好適な資源から調製／単離することができ、またはそれは、合成により作製することができ、またはそれは組換えＤＮＡ技術の使用により調製することができる。
本発明において包含されるタンパク質は、他のタンパク質、特に酵素とともに使用することができる。したがって、本発明はまた、タンパク質の組合せをカバーし、その組合せは、本発明のタンパク質／酵素および本発明による別のタンパク質／酵素であり得る別のタンパク質／酵素を含む。この態様は、後述のセクションにおいて考察する。
好ましくは、本発明に関し、本発明それ自体の範囲により包含されるアミノ酸配列は、天然酵素でない。これに関して、用語「天然酵素」は、その天然環境中に存在し、その天然ヌクレオチド配列により発現された酵素全体を意味する。
単離
一態様において、好ましくは、本発明によるアミノ酸配列、または核酸、または酵素は、単離形態である。用語「単離」は、配列または酵素または核酸が、その配列、酵素または核酸が天然で、天然に会合し、天然において見出される少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。本発明の配列、酵素または核酸は、他の場合に物質が会合し得る１つ以上の汚染物質を実質的に含まない形態で提供することができる。したがって、例えば、それは、１つ以上の潜在的に汚染するポリペプチドおよび／または核酸分子を実質的に含まない。
精製
一態様において、好ましくは、本発明による配列、酵素または核酸は、精製形態である。用語「精製」は、所与の構成成分が高レベルにおいて存在することを意味する。構成要素は、望ましくは、組成物中に存在する主な構成成分である。好ましくは、それは、少なくとも約８０％のレベルにおいて存在し、前記レベルは、考慮される総組成物に関して乾燥重量／乾燥重量基準で測定される。好適には、それは少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％または少なくとも約９８％のレベルにおいて存在し得、前記レベルは、考慮される総組成物に関して乾燥重量／乾燥重量基準で測定される。
配列同一性または配列相同性
本発明はまた、本明細書に定義される規定の特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列とのある程度の配列同一性または配列相同性を有する配列またはそのようなポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列（以下、「相同配列」と称する）の使用を包含する。ここで、用語「ホモログ」は、対象アミノ酸配列および対象ヌクレオチド配列とのある相同性を有する実体を意味する。ここで、用語「相同性」は、「同一性」と同一視することができる。
相同アミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列は、酵素の機能活性を保持し、および／または活性を向上させるポリペプチドを提供および／またはコードするはずである。
本文脈において、相同配列は、対象配列と少なくとも７５、８５または９０％同一、好ましくは、少なくとも９５または９８％同一であり得るアミノ酸またはヌクレオチド配列を含むと解釈される。典型的には、ホモログは、例えば、対象アミノ酸配列と同一の活性部位などを含む。類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）に関して相同性を考慮することもできるが、本発明に関して、配列同一性に関して相同性を表現することが好ましい。
一実施形態において、相同配列は、対象配列と比較して１つまたはいくつかの付加、欠失および／または置換を有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を含むと解釈される。
一実施形態において、本発明は、アミノ酸配列が本明細書に表されるタンパク質または親タンパク質のアミノ酸配列中の１つもしくはいくつかのアミノ酸、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９つのアミノ酸、もしくはそれより多くのアミノ酸、例えば、１０個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加によりこの（親）タンパク質に由来し、親タンパク質の活性を有するタンパク質に関する。
好適には、アミノ酸配列に関する同一性の程度は、少なくとも２０個の連続アミノ酸にわたり、好ましくは、少なくとも３０個の連続アミノ酸にわたり、好ましくは、少なくとも４０個の連続アミノ酸にわたり、好ましくは、少なくとも５０個の連続アミノ酸にわたり、好ましくは、少なくとも６０個超の連続アミノ酸にわたり、好ましくは、少なくとも１００個の連続アミノ酸にわたり、好ましくは、少なくとも２００個超の連続アミノ酸にわたり決定される。
一実施形態において、本発明は、アミノ酸配列が本明細書に表されるタンパク質または親タンパク質のアミノ酸配列中の１つもしくはいくつかのアミノ酸、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９つのアミノ酸、もしくはそれより多くのアミノ酸、例えば、１０個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加によりこの（親）タンパク質に由来し、親タンパク質の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列（または遺伝子）に関する。
本文脈において、相同配列は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（対象配列）と少なくとも７５、８５または９０％同一、好ましくは、少なくとも９５または９８％同一であり得るヌクレオチド配列を含むと解釈される。典型的には、ホモログは、活性部位などをコードする対象配列と同一の配列を含む。類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）に関して相同性を考慮することもできるが、本発明に関して、配列同一性に関して相同性を表現することが好ましい。
相同性比較は、目視により、またはより通常には、容易に利用可能な配列比較プログラムを使用して実施することができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の同一性％を計算し得る。
相同性％は、連続配列にわたり計算することができ、すなわち、ある配列を他の配列とアラインし、ある配列中のそれぞれのアミノ酸を他の配列中の対応するアミノ酸と１回１残基、直接比較する。これは「ギャップなし」アラインメントと称される。典型的には、このようなギャップなしアラインメントは、比較的少数の残基にわたってのみ実施される。
これは極めて簡易で一貫した方法であるが、例えば、配列の他の場合の同一ペアにおいて、ある挿入または欠失がアラインメントから外すべき後続のアミノ酸残基を引き起こすことを考慮し得ず、したがって、グローバルアラインメントを実施する場合に相同性％の大きな低減を潜在的にもたらす。結果的に、ほとんどの配列比較法は、全相同性スコアを過度にペナルティ化せずに考えられる挿入および欠失を考慮する最適なアラインメントを作成するように設計される。これは、配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入して局所相同性の最大化を試みることにより達成される。
しかしながら、これらのより複雑な方法は、同数の同一アミノ酸について、可能な限り少ないギャップを有する配列アラインメント（２つの比較配列間のより高い関係性を反映する）が、多くのギャップを有するものより高いスコアを達成するように、そのアラインメント中で生じるそれぞれのギャップに対して「ギャップペナルティ」を割り当てる。典型的には、あるギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、そのギャップ中のそれぞれの後続の残基に対してより小さいペナルティを課す「アファインギャップコスト」が使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、無論、より少数のギャップを有する最適化されたアラインメントを生成する。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティの修正を許容する。しかしながら、配列比較のためにそのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。
したがって、最大相同性％または同一性％の計算は、最初にギャップペナルティを考慮して最適なアラインメントを作成することを要求する。このようなアラインメントを実施するために好適なコンピュータプログラムは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）である。配列比較を実施し得るソフトウェアの例としては、限定されるものではないが、例えば、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ １９９９ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ − Ｃｈａｐｔｅｒ １８参照）、ＢＬＡＳＴ２（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７７（１）：１８７−８およびｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ １９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）およびＡｌｉｇｎＸなどが挙げられる。少なくともＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２およびＦＡＳＴＡは、例えば、ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔサーチツール（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ）などにおいてオフラインおよびオンライン検索に利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ １９９９，ｐａｇｅｓ ７−５８ ｔｏ ７−６０参照）。
最終相同性％を同一性に関して計測することができるが、アラインメントプロセスそれ自体は、典型的には、オールオアナッシングのペア比較に基づくものではない。その代わり、化学的類似性または進化的距離に基づきそれぞれのペアワイズ比較にスコアを割り当てる数値換算類似度（ｓｃａｌｅｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）スコア行列が一般に使用される。一般に使用されるそのような行列の一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（ＢＬＡＳＴプログラムスイートのためのデフォルト行列）である。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩプログラムは、一般に、パブリックデフォルト値、または供給されている場合にはカスタムシンボル比較表のいずれかを使用する（さらなる詳細については、ユーザマニュアル参照）。一部の用途については、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩパッケージについてのデフォルト値を使用することが好ましい。
あるいは、相同性割合は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ ＆ Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ ７３（１），２３７−２４４）と類似するアルゴリズムに基づくＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）における多重アラインメント特徴を使用して計算することができる。
ソフトウェアが最適なアラインメントを生成したら、相同性％、好ましくは、配列同一性％を計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的には、これを配列比較の一部として行い、数値結果を生成する。
配列同一性を決定する場合にギャップペナルティを使用するのであれば、好ましくは、ペアワイズアラインメントに以下のパラメータを使用する：
Figure 0006878275
Figure 0006878275
一実施形態において、ＣＬＵＳＴＡＬは、上記定義のとおり設定されたギャップペナルティおよびギャップエクステンションを用いて使用することができる。
好適には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、少なくとも２０個の連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは、少なくとも３０個の連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは、少なくとも４０個の連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは、少なくとも５０個の連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは、少なくとも６０個の連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは、少なくとも１００個の連続ヌクレオチドにわたり決定される。
好適には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、少なくとも１００個の連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは、少なくとも２００個の連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは、少なくとも３００個の連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは、少なくとも４００個の連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは、少なくとも５００個の連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは、少なくとも６００個の連続ヌクレオチドにわたり、少なくとも７００個の連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは、少なくとも８００個の連続ヌクレオチドにわたり決定される。
好適には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、全配列にわたり決定することができる。
好適には、タンパク質（アミノ酸）配列に関する同一性の程度は、少なくとも１００個の連続アミノ酸にわたり、好ましくは、少なくとも２００個の連続アミノ酸にわたり、好ましくは、少なくとも３００個の連続アミノ酸にわたり決定される。
好適には、アミノ酸またはタンパク質配列に関する同一性の程度は、本明細書に教示される全配列にわたり決定することができる。
本文脈において、用語「クエリー配列」は、それが本発明の範囲内でないか否かを把握するために対象配列とアラインされる相同配列または外来配列を意味する。したがって、このようなクエリー配列は、例えば、先行技術配列または第３のパーティ配列であり得る。
１つの好ましい実施形態において、配列は、グローバルアラインメントプログラムによりアラインされ、配列同一性は、対象配列の長さにより割った、プログラムにより同定された正確なマッチ数を同定することにより計算される。
一実施形態において、クエリー配列および対象配列間の配列同一性の程度は、１）デフォルトスコアリング行列およびデフォルトギャップペナルティを使用して任意の好適なアラインメントプログラムにより２つの配列をアラインすること、２）正確なマッチ数を同定すること（正確なマッチは、アラインメントプログラムがアラインメント中の所与の位置上の２つのアラインされる配列中の同一アミノ酸またはヌクレオチドを同定した場合である）、および３）対象配列の長さにより正確なマッチ数を割ることにより決定される。
いっそうさらに好ましい実施形態において、グローバルアラインメントプログラムは、ＣＬＵＳＴＡＬおよびＢＬＡＳＴ（好ましくは、ＢＬＡＳＴ）からなる群から選択され、配列同一性は、対象配列の長さにより割った、プログラムにより同定された正確なマッチ数を同定することにより計算される。
配列は、サイレント変化を生成し、機能的に同等の物質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入または置換も有し得る。意図的なアミノ酸置換は、物質の二次結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づき作製することができる。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ；類似の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが挙げられる。
保存的置換は、例えば、以下の表に従って作製することができる。第２列の同一ブロックの、好ましくは、第３列の同一行のアミノ酸を互いに置換することができる：
Figure 0006878275
本発明はまた、生じ得る同種置換（置換および置き換えは、両方とも、既存のアミノ酸残基の代替残基による交換を意味するために本明細書において使用される）、すなわち、同等置換、例えば、塩基性置換、酸性置換、極性置換などを包含する。非同種置換、すなわち、あるクラスの残基から別のクラスの残基への置換も生じ得、または非天然アミノ酸、例えば、オルニチン（以下、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと称する）、ピリイルアラニン（ｐｙｒｉｙｌａｌａｎｉｎｅ）、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンの包含を含む。
置き換えは、合成アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸）により作製することもでき、それとしては、アルファ＊およびアルファ二置換＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然アミノ酸のハロゲン化誘導体、例えば、トリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊、Ｌ−アリル−グリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−α−アミノ酪酸＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＃、７−アミノヘプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルホン＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば、４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）＊、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸およびＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊が挙げられる。記号＊は、誘導体の疎水性を示すために上記考察の目的（同種または非同種置換に関する）に利用されている一方、＃は、誘導体の親水性を示すために利用されており、＃＊は、両親媒性特徴を示す。
バリアントアミノ酸配列は、配列の任意の２つのアミノ酸残基間に挿入することができる好適なスペーサー基、例として、アルキル基、例えば、メチル、エチルまたはプロピル基を、アミノ酸スペーサー、例えば、グリシンまたはβ−アラニン残基に加えて含み得る。バリエーションのさらなる形態は、ペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在を含み、当業者により十分理解される。疑義の回避のため、「ペプトイド形態」は、α炭素置換基がα炭素以外の残基の窒素原子上に存在するバリアントアミノ酸残基を指すために使用される。ペプトイド形態のペプチドを調製する方法は当技術分野、例えば、Ｓｉｍｏｎ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７１およびＨｏｒｗｅｌｌ ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２−１３４において公知である。
本発明において使用されるヌクレオチド配列は、それらの範囲内に、合成または改変ヌクレオチドを含み得る。多数の異なるタイプのオリゴヌクレオチドの改変が、当技術分野において公知である。これらとしては、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格ならびに／または分子の３’および／もしくは５’末端におけるアクリジンもしくはポリリジン鎖の付加が挙げられる。本発明の目的のため、本明細書に記載のヌクレオチド配列は、当技術分野において利用可能な任意の方法により改変することができることを理解すべきである。このような改変は、本発明のヌクレオチド配列のインビボ活性または寿命を向上させるように実施することもできる。
本発明はまた、本明細書に提示される配列に相補的なヌクレオチド配列、またはその任意の誘導体、断片または誘導体の使用を包含する。配列がその断片に相補的である場合、その配列をプローブとして使用して他の生物における類似のコード配列を同定することなどができる。
本発明の配列と１００％相同でないが、本発明の範囲内であるポリヌクレオチドは、多数の手法で得ることができる。本明細書に記載の配列の他のバリアントは、例えば、一連の個体、例えば、異なる集団からの個体から作製されたＤＮＡライブラリーをプロービングすることにより得ることができる。さらに、他のホモログを得ることができ、そのようなホモログおよびその断片は、一般に、本明細書の配列表に示される配列に選択的にハイブリダイズし得る。このような配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリーまたはそれからのゲノムＤＮＡライブラリーをプロービングし、中程度から高いストリンジェンシーの条件下で付属の配列表の配列のいずれか１つの全部または一部を含むプローブによりそのようなライブラリーをプロービングすることにより得ることができる。類似の考慮は、本発明のポリペプチドまたはヌクレオチド配列の種ホモログおよびアレルバリアントを得ることに当てはまる。
バリアントおよび株／種ホモログは、本発明の配列内の保存アミノ酸配列をコードするバリアントおよびホモログ内の配列を標的化するように設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを使用して得ることもできる。保存配列は、例えば、いくつかのバリアント／ホモログからのアミノ酸配列をアラインすることにより予測することができる。配列アラインメントは、当技術分野において公知のコンピュータソフトウェアを使用して実施することができる。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く使用される。
縮重ＰＣＲにおいて使用されるプライマーは、１つ以上の縮重位置を含有し、公知配列に対する単一配列プライマーを用いる配列のクローニングに使用されるものよりも低いストリンジェンシー条件において使用される。
あるいは、このようなポリヌクレオチドは、特徴付けされた配列の部位特異的突然変異誘発により得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞についてのコドン選好性を最適化するためにサイレントコドン配列変化が要求される場合に有用であり得る。制限酵素認識部位を導入するため、またはポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの特性もしくは機能を変更するために他の配列変化が望まれることがある。
本明細書のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）は、プライマー、例えば、ＰＣＲプライマー、代替増幅反応のためのプライマー、プローブ、例えば、放射性もしくは非放射性標識を使用して慣用の手段により顕示標識により標識されたものを産生するために使用することができ、またはポリヌクレオチドをベクター中にクローニングすることができる。このようなプライマー、プローブおよび他の断片は、少なくとも１５、好ましくは、少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、３０または４０ヌクレオチド長であり、それらも本明細書において使用されるポリヌクレオチドという用語により包含される。
本発明によるポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドおよびプローブは、組換えにより、合成により、または当業者に利用可能な任意の手段により産生することができる。これらは、標準的技術によりクローニングすることもできる。
一般に、プライマーは、所望の核酸配列の１回１ヌクレオチドの段階的製造を含む合成手段により産生される。自動化技術を使用してこれを達成するための技術は、当分野において容易に利用可能である。
より長いポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段を使用して、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を使用して産生される。プライマーは、増幅されたＤＮＡを好適なクローニングベクター中にクローニングすることができるように、好適な制限酵素認識部位を含有するように設計することができる。
ハイブリダイゼーション
本発明はまた、本発明の核酸配列に相補的な配列または本発明の配列に、もしくはそれに相補的な配列にハイブリダイズし得る配列を包含する。
本明細書において使用される用語「ハイブリダイゼーション」は、「核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合するプロセス」およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術において実施される増幅のプロセスを含む。
本発明はまた、本明細書に提示される配列に相補的な配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、またはその任意の誘導体、断片または誘導体の使用を包含する。
用語「バリアント」は、本明細書に提示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る配列に相補的な配列も包含する。
好ましくは、用語「バリアント」は、本明細書に提示されるヌクレオチド配列に中程度のストリンジェンシー条件（例えば、５０℃および０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３ ｐＨ７．０｝）下でハイブリダイズし得る配列に相補的な配列を包含する。
より好ましくは、用語「バリアント」は、本明細書に提示されるヌクレオチド配列に高いストリンジェンシー条件（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３ ｐＨ７．０｝）下でハイブリダイズし得る配列に相補的な配列を包含する。
本発明はまた、ヌクレオチドはまた、本発明のヌクレオチド配列（本明細書に提示されるものの相補的配列を含む）にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列に関する。
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（本明細書に提示されるものの相補的配列を含む）にハイブリダイズし得る配列に相補的なヌクレオチド配列に関する。
中間から最大ストリンジェンシーの条件下で本明細書に提示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列も本発明の範囲内に含まれる。
好ましい態様において、本発明は、中程度のストリンジェンシー条件（例えば、５０℃および０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３ ｐＨ７．０｝）下で本発明のヌクレオチド配列、またはその相補鎖にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列をカバーする。
より好ましい態様において、本発明は、高いストリンジェントな条件（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３ ｐＨ７．０｝）下で本発明のヌクレオチド配列、またはその相補鎖にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列をカバーする。
好ましくは、ハイブリダイゼーションは、本明細書に教示される配列の全体にわたり分析される。
分子進化
非限定的な例として、インビボまたはインビトロのいずれかでヌクレオチド配列中に多数の部位特異的またはランダム突然変異を産生すること、および続いて種々の手段によりコードされるポリペプチドの改善された機能性についてスクリーニングすることが可能である。
さらに、ポリヌクレオチド配列の突然変異または天然バリアントは、新たなバリアントを産生するために野生型または他の突然変異または天然バリアントにより組換えることができる。このような新たなバリアントは、コードされるポリペプチドの改善された機能性についてスクリーニングすることもできる。新たな好ましいバリアントの産生は、当技術分野において十分確立された種々の方法、例えば、エラー閾値突然変異誘発（Ｅｒｒｏｒ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（国際公開第９２／１８６４５号パンフレット）、オリゴヌクレオチド媒介ランダム突然変異誘発（米国特許第５，７２３，３２３号明細書）、ＤＮＡシャッフリング（米国特許第５，６０５，７９３号明細書）、エキソ媒介遺伝子アセンブリ、国際公開００／５８５１７号パンフレットにより達成することができる。これらおよび類似のランダム指向分子進化法の適用により、タンパク質構造または機能のいかなる予備知識もなしで好ましい特徴を有する本発明の酵素のバリアントの同定および選択が可能となり、予測可能でないが、有益な突然変異またはバリアントの産生が可能となる。酵素活性の最適化または変更についての技術分野における分子進化の適用の多数の例が存在し、そのような例としては、限定されるものではないが、以下の１つ以上が挙げられる：宿主細胞中またはインビトロにおける発現および／または活性の最適化、酵素活性の増加、基質および／または産物特異性の変更、酵素または構造安定性の増加または減少、好ましい環境条件、例えば、ｐＨ、基質における酵素活性／特異性の変更。
部位特異的突然変異誘発
タンパク質コードヌクレオチド配列を単離したら、または推定タンパク質コードヌクレオチド配列を同定したら、本発明のタンパク質を調製するために配列を突然変異させることが望ましいことがある。
突然変異は、合成オリゴヌクレオチドを使用して導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の突然変異部位をフランキングするヌクレオチド配列を含有する。
好適な方法は、Ｍｏｒｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）２，ｐ６４６−６４９）に開示されている。酵素コードヌクレオチド配列中に突然変異を導入する別の方法は、Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｎｇ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９），１８０，ｐ１４７−１５１）に記載されている。
組換え体
一態様において、本発明において使用される配列は、組換え配列、すなわち、組換えＤＮＡ技術を使用して調製された配列である。
これらの組換えＤＮＡ技術は、当業者の技能の範囲内である。このような技術は、文献、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ １−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに説明されている。
合成物
一態様において、本発明において使用される配列は、合成配列、すなわち、インビトロ化学または酵素的合成により調製された配列である。これとしては、限定されるものではないが、宿主生物、例えば、メチロトローフ酵母のピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）およびハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）に最適なコドン使用頻度を用いて作製された配列が挙げられる。
本発明において使用されるタンパク質および／またはペプチドは、合成起源のものであってもよい。
酵素の発現
本発明はまた、主としてエキソペプチダーゼ活性を有するプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、コンセンサス配列開裂部位：
（ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；または
（ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る）を発現させる方法であって、
（ａ）プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼをコードする核酸またはヌクレオチド配列を含むベクターにより宿主細胞を形質転換すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の核酸配列またはベクターを発現させること；および
（ｃ）プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたは前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを含む発酵物を得ること
を含む方法を提供する。
好適には、本方法は、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを単離および／または精製および／または包装することをさらに含み得る。
核酸は、本明細書に詳述される活性を有するプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼをコードする任意の核酸であり得る。好適には、核酸は、本明細書に詳述される核酸のいずれか１つであり得る。好適には、核酸は、本発明の単離核酸であり得る。
本明細書において使用される用語「発酵物」は、トリペプチジルペプチダーゼ（例えば、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ）および／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼを含む宿主細胞の培養後（例えば、その終了時）に存在する構成要素の混合物を指す。発酵物は、本発明によるトリペプチジルペプチダーゼの他、他の構成成分、例えば、微粒子物質、固体、培養の間に利用されなかった基質、デブリ、培地、細胞廃物などを含み得る。一態様において、細菌細胞（好ましくは、胞子）を発酵物から除去し、および／または不活性化させて無細胞発酵物を提供する。
本発明において使用されるヌクレオチド配列は、組換え複製ベクター中に取り込むことができる。ベクターは、ヌクレオチド配列を複製し、タンパク質／酵素形態で、適合性の宿主細胞中で、および／またはそれから発現させるために使用することができる。
発現は、制御配列、例えば、調節配列を使用して制御することができる。
使用される配列および／またはベクターに応じて、ヌクレオチド配列の発現により宿主組換え細胞により産生されるタンパク質は分泌させることができ、細胞内に含有させることができる。コード配列は、特定の原核または真核細胞膜を介する物質コード配列の分泌を指向するシグナル配列を用いて設計することができる。
用語「発現ベクター」は、インビボまたはインビトロで発現し得る構築物を意味する。
一実施形態において、本発明において使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエンドプロテアーゼは、ベクターによりコードさせることができる。換言すると、ベクターは、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
好ましくは、発現ベクターは、好適な宿主生物のゲノム中に取り込まれる。用語「取り込まれる」は、好ましくは、ゲノム中への安定的な取り込みをカバーする。
本発明のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列が、好適な宿主生物によるヌクレオチド配列の発現を提供し得る調節配列に作動可能に結合しているベクター中に存在し得る。
本発明において使用されるベクターは、本発明のポリペプチドの発現を提供するように下記の好適な宿主細胞中に形質転換することができる。
ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、またはファージベクターの選択は、それを導入すべき宿主細胞に依存することが多い。
本発明において使用されるベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子、例えば、抗生物質耐性、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリン耐性を付与する遺伝子を含有し得る。あるいは、選択は、同時形質転換（国際公開第９１／１７２４３号パンフレットに記載）により達成することができる。
ベクターは、例えば、ＲＮＡの産生にインビトロで使用することができ、または宿主細胞を形質移入し、形質転換し、形質導入し、または感染させるために使用することができる。
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、複製ベクター中に本発明のヌクレオチド配列を導入し、適合性の宿主細胞中にベクターを導入し、ベクターの複製を生じさせる条件下で宿主細胞を増殖させることにより、本発明のヌクレオチド配列を作製する方法を提供する。
ベクターは、当該宿主細胞中のベクターの複製を可能とするヌクレオチド配列をさらに含み得る。このような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１およびｐＩＪ７０２の複製起源である。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエンドプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列および／またはベクターは、特定の宿主生物の発現のためにコドン最適化することができる。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエンドプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列および／またはベクターは、原核または真核細胞の発現のためにコドン最適化することができる。好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエンドプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列および／またはベクターは、真菌宿主生物（例えば、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、好ましくは、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ））中の発現のためにコドン最適化することができる。
コドン最適化は、宿主細胞の遺伝子においてより高頻度で使用されるコドンにより天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、６０、７０、８０または１００超のコドン）を置き換える一方、天然アミノ酸配列を維持することにより、目的宿主細胞中の発現向上のために核酸配列を改変するプロセスを指す。種々の種は、特定のアミノ酸のあるコドンについての特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関することが多く、次いでとりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存的であると考えられる。細胞中の選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンの反映である。
したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づき所与の生物中の最適な遺伝子発現のために調整することができる。したがって、この調整を受けたヌクレオチド配列および／ベクターは、「コドン最適化」ヌクレオチド配列および／またはベクターと称することができる。
コドン使用頻度表は、例えば、「コドン使用頻度データベース」において容易に利用可能であり、それらの表は、多数の手法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）参照。特定の宿主細胞中の発現のための特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズム、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，Ｐａ．）も利用可能である。一部の実施形態において、本発明において使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエンドプロテアーゼをコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、それ以上、または全てのコドン）は、特定のアミノ酸に最も高頻度で使用されるコドンに対応する。
一実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼをコードするヌクレオチド配列は、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）中の発現についてコドン最適化されたヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、コドン最適化配列は、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７として示されるヌクレオチド配列またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。それと少なくとも８０％またはそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列が好適である。
好ましくは、コドン最適化配列は、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５と少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５または配列番号９７と少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
一実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、中程度のストリンジェンシー条件下で、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされ得る。高いストリンジェンシー条件下で、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５または配列番号９７にハイブリダイズするヌクレオチド配列が好適である。
さらなる実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５または配列番号９７と異なるヌクレオチド配列によりコードされ得る。
配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５または配列番号９７からなる群から選択される配列の１つ以上を含むベクター（例えば、プラスミド）も提供される。
調節配列
一部の適用において、本発明において使用されるヌクレオチド配列は、例えば、選択された宿主細胞によるヌクレオチド配列の発現を提供し得る調節配列に作動可能に結合している。例として、本発明は、そのような調節配列に作動可能に結合している本発明のヌクレオチド配列を含むベクターをカバーし、すなわち、ベクターは発現ベクターである。
用語「作動可能に結合している」は、記載の構成成分が、それらの意図される様式のそれらの機能を許容する関係である並置を指す。コード配列に「作動可能に結合している」調節配列は、コード配列の発現が制御配列と適合性の条件下で達成されるような手法でライゲートされる。
用語「調節配列」は、プロモーターおよびエンハンサーならびに他の発現調節シグナルを含む。
用語「プロモーター」は、当技術分野における通常の意味で使用され、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列の発現の向上は、異種調節領域、例えば、プロモーター、分泌リーダーおよびターミネーター領域の選択により達成することもできる。
好ましくは、本発明によるヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターに作動可能に結合している。
他のプロモーターを使用して本発明のポリペプチドの発現を指向することもできる。
細菌、真菌または酵母宿主中のヌクレオチド配列の転写の指向に好適なプロモーターの例は、当技術分野において周知である。
プロモーターは、好適な宿主中の発現を確保するため、または増加させるための特徴部をさらに含み得る。例えば、特徴部は、保存領域、例えば、プリブノーボックスまたはＴＡＴＡボックスであり得る。
構築物
用語「構築物」（「コンジュゲート」、「カセット」および「ハイブリッド」などの用語と同義である）は、プロモーターに直接または間接的に付着している本発明により使用されるヌクレオチド配列を含む。
間接的付着の一例は、プロモーターおよび本発明のヌクレオチド配列間の好適なスペーサー群、例えば、イントロン配列、例えば、Ｓｈ１−イントロンまたはＡＤＨイントロンの提供である。同じことは、直接または間接的付着を含む本発明に関する用語「融合している」にも当てはまる。一部の場合において、この用語は、野生型遺伝子プロモーターと通常会合するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の天然の組合せが両方ともそれらの天然環境に存在する場合、その組合せをカバーしない。
構築物は、遺伝子構築物の選択を可能とするマーカーも含有または発現し得る。
一部の適用のため、好ましくは、本発明の構築物は、少なくとも、プロモーターに作動可能に結合している本発明のヌクレオチド配列を含む。
宿主細胞
本発明に関する用語「宿主細胞」は、上記のヌクレオチド配列または発現ベクターのいずれかを含み、本明細書に定義される規定の特性を有するタンパク質の組換え産生において使用される任意の細胞を含む。
したがって、本発明のさらなる実施形態は、本発明のタンパク質を発現するヌクレオチド配列により形質転換または形質移入された宿主細胞を提供する。細胞は、前記ベクターと適合性であるように選択され、例えば、原核（例えば、細菌）、真菌、酵母または植物細胞であり得る。
好適な細菌宿主生物の例は、グラム陽性またはグラム陰性細菌種である。
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の性質、および／または発現タンパク質のさらなるプロセシングについての所望度に応じて、真核宿主、例えば、酵母または他の真菌が好ましいことがある。一般に、酵母細胞は、操作がより容易なため、真菌細胞よりも好ましい。しかしながら、一部のタンパク質は、酵母細胞から不十分に分泌され、または一部の場合、適切にプロセシングされない（例えば、酵母中の超グリコシル化）。これらの例において、異なる真菌宿主生物を選択すべきである。
好適な宿主細胞、例えば、酵母、真菌および植物宿主細胞の使用は、本発明の組換え発現産物に最適な生物学的活性を付与することが必要であり得る場合に翻訳後修飾（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、トランケーション、脂質化およびチロシン、セリンまたはトレオニンリン酸化）を提供し得る。
宿主細胞は、プロテアーゼ欠損またはプロテアーゼマイナス株であり得る。これは、例えば、「ａｌｐ」と命名されたアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を欠失したプロテアーゼ欠損株黄麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＪａＬ１２５であり得る。この株は、国際公開第９７／３５９５６号パンフレットに記載されている。
生物
本発明に関する用語「生物」は、本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および／もしくはそれから得られた産物を含み得、ならびに／またはプロモーターが生物中に存在する場合に本発明によるヌクレオチド配列の発現を可能とし得るを含み得る任意の生物を含む。
好適な生物としては、原核、真菌、酵母または植物を挙げることができる。
本発明に関する用語「トランスジェニック生物」は、本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および／もしくはそれから得られた産物を含み、ならびにプロモーターが生物内の本発明によるヌクレオチド配列の発現を可能とし得る任意の生物を含む。好ましくは、ヌクレオチド配列は、生物のゲノム中に取り込まれる。
用語「トランスジェニック生物」は、天然ヌクレオチドコード配列がその天然プロモーター（それもその天然環境中に存在する）の制御下にある場合、天然環境中の天然ヌクレオチドコード配列をカバーしない。
したがって、本発明のトランスジェニック生物は、本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、本発明による構築物、本発明によるベクター、本発明によるプラスミド、本発明による細胞、本発明による組織、またはその産物のいずれか１つ、またはそれらの組合せを含む生物を含む。
例えば、トランスジェニック生物は、異種プロモーターの制御下で本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含み得る。
宿主細胞／生物の形質転換
上記のとおり、宿主生物は、宿主生物は、原核または真核生物であり得る。好適な原核宿主の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。
原核宿主の形質転換に関する教示は、当技術分野において十分に公開されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）参照。原核宿主を使用する場合、ヌクレオチド配列は、例えば、イントロンの除去により形質転換前に好適に改変する必要があり得る。
糸状真菌細胞は、当技術分野において公知の種々の方法、例えば、公知の様式のプロトプラスト形成およびプロトプラストの形質転換とそれに続く細胞壁の再生を含む方法を使用して形質転換することができる。宿主微生物としてのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の使用が、欧州特許第０２３８０２３号明細書に記載されている。
別の宿主生物は、植物であり得る。植物の形質転換に使用される一般的技術の概要は、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ［１９９１］４２：２０５−２２５）およびＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｈｉ−Ｔｅｃｈ Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ １９９４ １７−２７）による論文に見出すことができる。植物形質転換に関するさらなる教示は、欧州特許第０４４９３７５号明細書に見出すことができる。
真菌、酵母および植物の形質転換に関する一般的教示は、以下のセクションに提示される。
形質転換される真菌
宿主生物は、真菌、例えば、カビであり得る。好適なそのような宿主の例としては、サーモミセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリニウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ムコル属（Ｍｕｃｏｒ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などの属に属する任意のメンバーが挙げられる。
一実施形態において、宿主生物は、糸状真菌であり得る。
糸状真菌の形質転換は、糸状真菌の形質転換についてのその標準的技術を記述する米国特許第５７４１６６５号明細書に考察され、真菌の培養は、当技術分野において周知である。アカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）に適用される技術の広範な概説は、例えば、Ｄａｖｉｓ ａｎｄ ｄｅ Ｓｅｒｒｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９７１）１７Ａ：７９−１４３に見出される。
糸状真菌の形質転換において利用することもできるさらなる教示は、米国特許第５６７４７０７号明細書に概説される。
さらに、糸状真菌中の遺伝子発現は、Ｐｕｎｔ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００２ Ｍａｙ；２０（５）：２００−６，Ａｒｃｈｅｒ ＆ Ｐｅｂｅｒｄｙ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９７）１７（４）：２７３−３０６に教示される。
本発明は、それらの標準的技術の使用により調製される本発明によるトランスジェニック糸状真菌の生産を包含する。
好適には、宿主生物は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主生物、例えば、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）宿主生物である。
別の実施形態において、宿主生物は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の属のもの、例えば、黒麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）であり得る。
本発明によるトランスジェニックアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）は、例えば、Ｔｕｒｎｅｒ Ｇ．１９９４（Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ，Ｓ．Ｄ．，Ｋｉｎｇｈｏｒｎ Ｊ．Ｒ．（Ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ：５０ ｙｅａｒｓ ｏｎ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ ２９．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ １９９４．ｐｐ．６４１−６６６）の教示に従うことにより調製することもできる。
形質転換される酵母
別の実施形態において、トランスジェニック生物は、酵母であり得る。
酵母中の異種遺伝子発現の原理の概説は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９５），４９：３４１−５４、およびＣｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９７）Ｏｃｔ；８（５）：５５４−６０に提供される。
これに関して、酵母、例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ（２０００ ２４（１）：４５−６６参照）の種は、異種遺伝子発現のためのビヒクルとして使用することができる。
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の異種遺伝子発現および遺伝子産物の分泌の原理の概説は、Ｅ Ｈｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅ Ｅ Ｋｅｎｎｙ（１９９３，“Ｙｅａｓｔ ａｓ ａ ｖｅｈｉｃｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ”，Ｙｅａｓｔｓ，Ｖｏｌ ５，Ａｎｔｈｏｎｙ Ｈ Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｊ Ｓｔｕａｒｔ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，ｅｄｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．）により挙げられている。
酵母の形質転換のため、いくつかの形質転換プロトコルが開発されている。例えば、本発明によるトランスジェニックサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は、Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ ７５，１９２９）；Ｂｅｇｇｓ，Ｊ Ｄ（１９７８，Ｎａｔｕｒｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，２７５，１０４）；およびＩｔｏ，Ｈ ｅｔ ａｌ（１９８３，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３，１６３−１６８）の教示に従うことにより調製することができる。
形質転換された酵母細胞は、種々の選択マーカー、例えば、栄養要求性マーカー、ドミナント抗生物質耐性マーカーを使用して選択することができる。
培養および産生
本発明のヌクレオチド配列により形質転換された宿主細胞は、コードされるポリペプチドの産生をもたらし、細胞および／または培養培地からのポリペプチドの回収を容易にする条件下で培養することができる。
細胞を培養するために使用される培地は、当該宿主細胞の増殖およびポリペプチドの発現の取得に好適な任意の慣用培地であり得る。
組換え細胞により産生されたタンパク質は、細胞の表面上でディスプレイすることができる。
タンパク質は、宿主細胞から分泌させることができ、周知の手順を使用して培養培地から簡便に回収することができる。
分泌
タンパク質は、発現宿主から、タンパク質をより容易に回収することができる培養培地中に分泌されることが望ましいことが多い。本発明によれば、分泌リーダー配列を所望の発現宿主に基づき選択することができる。ハイブリッドシグナル配列も、本発明に関して使用することができる。
異種分泌リーダー配列の典型的な例は、真菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（ｇｌａＡ−例えば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からの１８および２４アミノ酸型の両方）、ａ因子遺伝子（酵母、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）およびハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ））またはα−アミラーゼ遺伝子（バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））に由来するものである。
例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の異種タンパク質の分泌は、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）１８２：１３２−４３に概説される。
転写後および翻訳後修飾
好適には、本発明において使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエンドプロテアーゼは、本明細書に教示されるヌクレオチド配列のいずれか１つによりコードさせることができる。
使用される宿主細胞に応じて、転写後および／または翻訳後修飾を作製することができる。本方法および／または使用において使用される酵素（例えば、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエンドプロテアーゼ）は、転写後および／または翻訳後修飾を受けた酵素（例えば、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエンドプロテアーゼ）を包含することが想定される。
転写後および／または翻訳後修飾の１つの非限定的な例は、ポリペプチドの（例えば、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエンドプロテアーゼの）「クリッピング」または「開裂」である。
一部の実施形態において、ポリペプチド（例えば、本発明のトリペプチジルペプチダーゼ、例えば、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエンドプロテアーゼ）は、クリッピングまたは開裂させることができる。これは、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエンドプロテアーゼの不活性または実質的に不活性な状態から活性状態（すなわち、本明細書に記載の活性を実施し得る）への変換をもたらし得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、成熟ペプチド、すなわち、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ活性を有するポリペプチドへのさらなる翻訳後修飾を受けるプロペプチドであり得る。
例にすぎないが、配列番号１は、配列番号１が一部のアミノ酸、より具体的には、Ｎ末端から１９７個のアミノ酸を除去するための翻訳後修飾および／または転写後修飾を受けたこと以外、配列番号２９と同一である。したがって、配列番号１として本明細書に示されるポリペプチドは、一部の状況において（すなわち、一部の宿主細胞中で）、翻訳後修飾および／または転写後修飾により成熟ペプチド（配列番号２９）にさらにプロセシングされるプロペプチドとしてみなすことができる。翻訳後修飾および／または転写後修飾に関する正確な修飾、例えば、配列部位は、宿主種に応じてわずかに変動し得る。一部の宿主種において、プロペプチドが成熟ペプチド（すなわち、本発明のトリペプチジルペプチダーゼ活性を有するポリペプチド）と同等であるため、翻訳後修飾および／または転写後修飾は存在し得ない。理論により拘束されるものではないが、開裂部位は、配列番号１と比較した配列番号２９の参照により示される開裂部位と比較したいずれかの方向に数残基（例えば、１、２または３残基）だけシフトさせることができる。換言すると、例えば、１９７位（Ｒ）における開裂ではなく、開裂は、例えば、１９６−Ａ、１９５−Ａ、１９４−Ａ、１９８Ｑ、１９９Ｅ、２００Ｐ位におけるものであり得る。さらにまたはあるいは、開裂は、約１９７個のアミノ酸の除去をもたらし得、一部の実施形態において、開裂は、１９４から２００個の残基の除去をもたらし得る。
転写後および／または翻訳後修飾の他の例としては、限定されるものではないが、ミリストイル化、グリコシル化、トランケーション、脂質化およびチロシン、セリンまたはトレオニンリン酸化が挙げられる。当業者は、タンパク質（例えば、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエンドプロテアーゼ）を生じ得る転写後および／または翻訳後修飾のタイプが、タンパク質（例えば、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエンドプロテアーゼ）が発現される宿主生物に依存し得ることを認識する。
検出
アミノ酸配列の発現を検出および計測するための種々のプロトコルは、当技術分野において公知である。例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
広範な標識およびコンジュゲーション技術が当業者により知られており、それを種々の核酸およびアミノ酸アッセイにおいて使用することができる。
多数の会社、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、およびＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）が市販のキットおよびそれらの手順についてのプロトコルを供給している。
好適なレポーター分子または標識としては、それらの放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または発色剤および基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、ＵＳ−Ａ−３，８１７，８３７；ＵＳ−Ａ−３，８５０，７５２；ＵＳ−Ａ−３，９３９，３５０；ＵＳ−Ａ−３，９９６，３４５；ＵＳ−Ａ−４，２７７，４３７；ＵＳ−Ａ−４，２７５，１４９およびＵＳ−Ａ−４，３６６，２４１が挙げられる。
さらに、組換え免疫グロブリンを米国特許第４，８１６，５６７号明細書に示されるとおりに産生することができる。
融合タンパク質
本発明により使用されるアミノ酸配列は、例えば、抽出および精製を補助するために融合タンパク質として産生することができる。融合タンパク質パートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）および（β−ガラクトシダーゼ）が挙げられる。融合タンパク質パートナーおよび目的タンパク質配列間にタンパク質分解開裂部位を含めて融合タンパク質配列の取り出しを可能とすることも簡便であり得る。
好ましくは、融合タンパク質は、タンパク質配列の活性を妨害しない。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の遺伝子融合発現系は、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９５）６（５）：５０１−６に概説されている。
本発明の別の実施形態において、アミノ酸配列は、異種配列にライゲートして融合タンパク質をコードさせることができる。例えば、物質活性に影響し得る薬剤についてのペプチドライブラリーのスクリーニングのため、市販の抗体により認識される異種エピトープを発現するキメラ物質をコードさせることが有用であり得る。
一般的組換えＤＮＡ方法の技術
本発明は、特に記載のない限り、当業者の技能の範囲内である化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用技術を用いる。このような技術は、文献に説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ １−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ １６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ Ａ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ；およびＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ参照。
投与量
本発明の方法および／または使用において使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエンドプロテアーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、任意の好適な量で投与することができる。
一実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、タンパク質基質および／または食料および／または飼料添加用組成物１ｋｇ当たり約５ｍｇから３ｇの酵素の量で投与することができる。
加水分解物の調製において、好適には、酵素プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、タンパク質基質１ｋｇ当たり５ｍｇから３ｇの酵素の量で投与することができる。
一実施形態において、好適には、酵素プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、タンパク質基質１ｋｇ当たり２５ｍｇから１０００ｍｇの酵素の量で投与することができる。
一実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、飼料添加用組成物１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ−１００ｍｇ；０．５ｍｇ−１００ｍｇ；１ｍｇ−５０ｍｇ；５ｍｇ−１００ｍｇ；５ｍｇ−２０ｍｇ、１０ｍｇ−１００ｍｇ；０．０５ｍｇ−５０ｍｇ；または０．１０ｍｇ−１０ｍｇの酵素の量で投与することができる。
ある実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、飼料添加用組成物１ｋｇ当たり約０．０１ｇから１０００ｇの酵素の量で、例えば、０．１ｇから５００ｇ、例えば、０．５ｇから７００ｇ、例えば、飼料添加用組成物１ｋｇ当たり約０．０１ｇ−２００ｇ、０．０１ｇ−１００ｇ；０．５ｇ−１００ｇ；１ｇ−５０ｇ；５ｇ−１００ｇ；５ｇ−２０ｇ、５ｇ−１５ｇ、１０ｇ−１００ｇ；０．０５ｇ−５０ｇ；または０．１０ｇ−１０ｇの酵素の量で投与することができる。
１つの好ましい実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、飼料添加用組成物１ｋｇ当たり約５ｍｇ〜２０ｍｇの酵素の量で投与することができる。
正確な量は、用いられる組成物の特定のタイプに、およびタンパク質１ｍｇ当たりの特異的プロテアーゼ活性に依存する。
別の実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、食料および／または飼料および／または飼料原料および／またはプレミックス１ｋｇ当たり約１ｍｇから約１ｋｇの酵素の量で投与することができる。好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼは、食料および／または飼料および／または飼料原料および／またはプレミックス１ｋｇ当たり約１ｍｇから約２５０ｇにおいて投与することができる。好ましくは、食料および／または飼料および／または飼料原料および／またはプレミックス１ｋｇ当たり約１ｍｇから約１００ｇ（より好ましくは、約１ｍｇから約１ｇ）である。
エンドプロテアーゼは、タンパク質基質１ｋｇ当たり約５０から約３０００ｍｇの酵素、例えば、タンパク質基質１メートルトン（ＭＴ）当たり０．０５から３ｇの酵素の量で投与することができる。
好適には、エンドプロテアーゼは、タンパク質基質１ＭＴ当たり約４．０ｇ未満の酵素の量で投与することができる。
別の実施形態において、エンドプロテアーゼは、タンパク質基質１ＭＴ当たり約０．５ｇから約５．０ｇの酵素において投与することができる。好適には、エンドプロテアーゼは、タンパク質基質１ＭＴ当たり約０．５ｇから約３．０ｇの酵素において投与することができる。より好適には、エンドプロテアーゼは、タンパク質基質１ＭＴ当たり約１．０ｇから約２．０ｇの酵素において投与することができる。
一実施形態において、アミノペプチダーゼは、タンパク質基質および／または食料および／または飼料添加用組成物１ｋｇ当たり約０．５ｍｇから約２ｇの酵素の量で投与することができる。好適には、アミノペプチダーゼは、タンパク質基質および／または食料および／または飼料添加用組成物１ｋｇ当たり約１ｍｇから約２ｇの酵素の量で投与することができる。より好適には、タンパク質基質および／または食料および／または飼料添加用組成物１ｋｇ当たり約５ｍｇから約１．５ｇの酵素の量である。
加水分解物の調製において、アミノペプチダーゼは、タンパク質基質１ｋｇ当たり約０．５ｍｇから約２ｇの酵素の量で投与することができる。好適には、アミノペプチダーゼは、タンパク質基質１ｋｇ当たり約１ｍｇから約２ｇの酵素の量で投与することができる。より好適には、タンパク質基質１ｋｇ当たり約５ｍｇから約１．５ｇの酵素の量である。
一実施形態において、アミノペプチダーゼは、タンパク質基質１ｋｇ当たり約５ｍｇから約５００ｍｇの酵素の量で投与することができる。好適には、アミノペプチダーゼは、タンパク質基質１ｋｇ当たり約５０ｍｇから約５００ｍｇの酵素の量で投与することができる。好適には、アミノペプチダーゼは、タンパク質基質１ｋｇ当たり約１００ｍｇから約４５０ｍｇの酵素の量で投与することができる。
対象
用語「対象」は、「動物」または「ヒト」を指すために使用することができる。
好適には、対象は、１つ以上の特定のタンパク質またはその一部を含む非処理加水分解物に対する免疫反応を有する傾向がある「感受性個体」であり得る。例えば、対象は、グルテン（例えば、グリアジン）アレルギー、乳汁タンパク質アレルギーおよび／またはダイズタンパク質アレルギーを有する感受性個体であり得る。
本明細書においてされる用語「動物」は、本発明による飼料添加用組成物または本発明による前記飼料添加用組成物を含む飼料原料を投与すべき、または投与された動物を意味する。
好ましくは、動物は、哺乳動物、反芻動物、単胃動物、魚類または甲殻類、例として、例えば、家畜または家庭動物（例えば、ペット）である。
一実施形態において、「動物」は家畜である。
本明細書において少なくともされる用語「家畜」は、任意の飼育動物を指す。好ましくは、家畜は、雌牛または雄牛（仔牛を含む）、ブタ（仔豚、肉豚、育成豚、雌豚を含む）、家禽（例として、ブロイラー、ニワトリ、産卵鶏およびシチメンチョウ）、鳥類、魚類（例として、淡水魚、例えば、サケ、タラ、トラウトおよびコイ、例えば、ニシキゴイ、および海産魚、例えば、シーバス）、甲殻類（例えば、エビ、イガイおよびホタテ）、ウマ（例として、競走馬）、ヒツジ（例として、ラム）の１つ以上である。
別の実施形態において、「動物」は、家庭動物またはペットまたは動物園環境で飼育される動物である。
本明細書において使用される用語「家庭動物またはペットまたは動物園環境で飼育される動物」は、任意の関連動物、例として、イヌ科（例えば、イヌ）、ネコ科（例えば、ネコ）、げっ歯類（例えば、モルモット、ラット、マウス）、鳥類、魚類（例として、淡水魚および海産魚）、およびウマを指す。
一実施形態において、動物は、単胃動物である。好ましい実施形態において、単胃動物は、家禽またはブタ（またはそれらの組合せ）であり得る。
別の実施形態において、動物は、反芻動物である。
動物という用語は、ヒトを指すものではない。
組成物
本発明は、主としてエキソペプチダーゼを有する少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
（ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；または
（ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る）を含む一般組成物を提供する。
一実施形態において、少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、主としてエキソペプチダーゼ活性を有し、
（ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；または
（ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る）を含む食料添加用組成物が提供される。
少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、主としてエキソペプチダーゼ活性を有し、
（ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；または
（ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る）を含む飼料添加用組成物も提供される。
あるいはまたはさらに、組成物および／または食料添加用組成物および／または飼料添加用組成物は、本発明の方法のいずれか１つにより取得可能なプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを含み得る。
別の実施形態において、本発明の加水分解物を組成物および／または食料添加および／または飼料添加用組成物が提供される。好適には、このような食料および／または飼料添加用組成物は、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（場合により、エンドプロテアーゼとの組合せで）をさらに含み得る。
本発明の方法および／または使用において使用される本発明の酵素、例えば、使用されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または組成物および／または食料添加用および／または飼料添加用組成物は、当技術分野において公知の任意の適切な様式で配合することができる。
一部の実施形態において、トリペプチジルペプチダーゼ（例えば、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ）と、さらなる成分、例えば、塩、例えば、Ｎａ２ＳＯ４、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギまたはコムギ構成成分、デンプン、タルク、ＰＶＡ、ポリオール、例えば、ソルビトールおよびグリセロール、安息香酸塩、ソルビン酸塩、糖、例えば、スクロースおよびグルコース、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、酢酸ナトリウム、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩またはそれらの混合物を混合することができる。
好ましい実施形態において、本発明による食料添加用組成物または飼料添加用組成物は、本発明によるトリペプチジルペプチダーゼ（例えば、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ）または本発明による発酵物を含み、さらに、塩、ポリオール、例として、ソルビトールおよびグリセロール、コムギまたはコムギ構成成分、酢酸ナトリウム、酢酸ナトリウム三水和物、ソルビン酸カリウム、タルク、ＰＶＡ、安息香酸塩、ソルビン酸塩、１，３−プロパンジオール、グルコース、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩またはそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の成分を含む。
一実施形態において、塩は、Ｎａ２ＳＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４、（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＫＨＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＣｕＳＯ４、Ｍｇ（ＮＯ３）２、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ホウ酸ナトリウム、酢酸マグネシウム、クエン酸ナトリウム、またはそれらの組合せからなる群から選択することができる。
食料グレード酵素の典型的な液体配合物は、以下の構成成分（％は、ｗ／ｗである）：０．２％〜３０％、好ましくは、２％〜２０％の目的酵素を含み得る。
酵素配合物の安定性は、塩、例えば、約０．１％から約２０％（好適には、約０．１％から約５％）の濃度のＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、Ｎａ２ＳＯ４または他の食料グレード塩を使用することにより増加させることもできる。理論により拘束されるものではないが、ここでも高い塩濃度が、単独でまたはさらなる成分との組合せのいずれかで微生物安定性を達成する手法であり得ることが考えられる。作用機序は、より低い水分活性またはある酵素および塩間の特異的作用に起因し得る。したがって、一部の実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、少なくとも１つの塩と混合することができる。
好適には、保存剤は、安息香酸ナトリウムおよび／またはソルビン酸カリウムであり得る。これらの保存剤は、典型的には、約０．１〜１％、好適には、約０．２〜０．５％の組合せ濃度において使用することができる。安息香酸ナトリウムはｐＨ＜５．５において、ソルビンナトリウムはｐＨ＜６において最も効率である。
好適には、糖はソルビトールである。
好適には、塩は、硫酸ナトリウムである。
一実施形態において、１つ以上の成分（例えば、組成物および／または食料添加用組成物および／または飼料添加用組成物の配合に使用される）は、ポリオール、例えば、グリセロールおよび／またはソルビトール；糖、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトースおよびトレハロース；塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、Ｎａ２ＳＯ４または他の食料グレード塩；保存剤、例えば、安息香酸ナトリウムおよび／またはソルビン酸カリウム；またはそれらの組合せからなる群から選択することができる。
好適には、１つ以上の成分（例えば、組成物および／または食料添加用組成物および／または飼料添加用組成物の配合に使用される）は、コムギ担体、ソルビトールおよび硫酸ナトリウムからなる群から選択することができる。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または組成物および／または食料添加用および／または飼料添加用組成物は、コムギ担体と混合することができる。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または組成物および／または食料添加用および／または飼料添加用組成物は、ソルビトールと混合することができる。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または組成物および／または食料添加用および／または飼料添加用組成物は、硫酸ナトリウムと混合することができる。
好ましい実施形態において、組成物および／または食料添加用および／または飼料添加用組成物は、本明細書に詳述される任意のエンドプロテアーゼをさらに含み得る。
形態
本発明の飼料添加用組成物および他の構成成分および／またはそれを含む飼料原料は、任意の好適の形態で使用することができる。
本発明の飼料添加用組成物は、固体または液体調製物またはその代替物の形態で使用することができる。固体調製物の例としては、湿潤性、噴霧乾燥または凍結乾燥型であり得る粉末、ペースト、ボーラス、カプセル、ペレット、タブレット、ダストおよび顆粒が挙げられる。液体調製物の例としては、限定されるものではないが、水性、有機または水性−有機溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。
一部の適用において、本発明の飼料添加用組成物は、飼料と混合し、または飲料水中で投与することができる。
形態の好適な例としては、即時放出、遅延放出、改変放出、持続放出、パルス放出または制御放出用途のための着香料または着色剤を含有し得る粉末、ペースト、ボーラス、ペレット、タブレット、ピル、顆粒、カプセル、オーバル、溶液または懸濁液の１つ以上が挙げられる。
例として、本発明の組成物を固体、例えば、ペレット化形態で使用する場合、これは、賦形剤、例えば、微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウムおよびグリシン；崩壊剤、例えば、デンプン（好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよびある錯体ケイ酸塩；造粒結合剤、例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチンおよびアカシアゴム；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルクの１つ以上も含有し得、それらを含めることができる。
形態の調製において使用される栄養学的に許容可能な担体の例としては、例えば、水、塩溶液、アルコール、シリコーン、ワックス、ワセリン、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペトロエスラル（ｐｅｔｒｏｅｔｈｒａｌ）脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
形態の好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。
水性懸濁液および／またはエリキシル剤については、本発明の組成物は、種々の甘味料または着香料、着色物質または色素、乳化剤および／または懸濁化剤、および希釈剤、例えば水、プロピレングリコールおよびグリセリン、ならびにそれらの組合せと組み合わせることができる。
他の構成成分との組合せ
本発明のプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびエンドプロテアーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または３酵素組成物および／または組成物および／または食料添加用および／または飼料添加用組成物および／または加水分解物は、他の構成成分との組合せで使用することができる。
本発明のプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびエンドプロテアーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または３酵素組成物および／または組成物および／または食料添加用および／または飼料添加用組成物および／または加水分解物ならびに動物消費に好適であり、消費者に医学または生理学的利益を提供し得る別の構成成分。
一部の実施形態において、「別の構成成分」は、１つ以上の酵素であり得る。
本発明において使用される好適な追加の酵素は、エンドグルカナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４）；セリオビオヒドロラーゼ（ｃｅｌｌｉｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１）、β−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）、セルラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．７４）、リケナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．７３）、リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、脂質アシルトランスフェラーゼ（一般に、Ｅ．Ｃ．２．３．１．ｘとして分類）、ホスホリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２またはＥ．Ｃ．３．１．１．５）、フィターゼ（例えば、６−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２６）または３−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．８）、アルファ−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）、キシラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．８、Ｅ．Ｃ．３．２．１．３２、Ｅ．Ｃ．３．２．１．３７、Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２、Ｅ．Ｃ．３．１．１．７３）、グルコアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）、プロテアーゼ（例えば、スブチリシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．６２）またはバシロリシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２４．２８）またはアルカリ性セリンプロテアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．ｘ）またはケラチナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．ｘ．ｘ））および／またはマンナナーゼ（例えば、β−マンナナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．７８））からなる群から選択される酵素の１つ以上であり得る。
好適には、他の構成成分は、フィターゼ（例えば、６−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２６）または３−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．８））フィターゼであり得る。
一実施形態（特に、飼料用途）において、他の構成成分は、キシラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．８、Ｅ．Ｃ．３．２．１．３２、Ｅ．Ｃ．３．２．１．３７、Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２、Ｅ．Ｃ．３．１．１．７３）、アミラーゼ（例として、α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）、Ｇ４−形成アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．６０）、β−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２）およびγ−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）；および／またはプロテアーゼ（例えば、スブチリシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．６２）またはバシロリシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２４．２８）またはアルカリ性セリンプロテアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．ｘ）またはケラチナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．ｘ．ｘ））らなる群から選択される酵素の１つ以上であり得る。
一実施形態（特に、飼料用途）において、他の構成成分は、アミラーゼ（例えば、α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１））およびプロテアーゼ（例えば、スブチリシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．６２））の組合せであり得る。
一実施形態（特に、飼料用途）において、他の構成成分は、β−グルカナーゼ、例えば、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．６）であり得る。
一実施形態（特に、飼料用途）において、他の構成成分は、マンナナーゼ（例えば、β−マンナナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．７８））であり得る。
一実施形態（特に、飼料用途）において、他の構成成分は、リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、脂質アシルトランスフェラーゼ（一般に、Ｅ．Ｃ．２．３．１．ｘとして分類）、またはホスホリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２またはＥ．Ｃ．３．１．１．５）、好適には、リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）であり得る。
一実施形態（特に、飼料用途）において、他の構成成分は、プロテアーゼ（例えば、スブチリシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．６２）またはバシロリシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２４．２８）またはアルカリ性セリンプロテアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．ｘ）またはケラチナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．ｘ．ｘ））であり得る。
別の実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（場合により、エンドプロテアーゼとの組合せで）と組み合わせるための、ならびに／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよびアミノペプチダーゼとの組合せのエンドプロテアーゼと組み合わせるための他の構成成分は、さらなるプロテアーゼであり得る。好適には、さらなるプロテアーゼは、アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼからなる群から選択することができる。
本明細書において使用される用語「カルボキシペプチダーゼ」は、当技術分野においてその通常の意味を有し、ペプチドおよび／またはタンパク質基質のＣ末端からｎ個のアミノ酸を開裂し得るエキソペプチダーゼを指す。一実施形態において、ｎは、少なくとも１であり得、好適には、ｎは、少なくとも２であり得る。他の実施形態において、ｎは、少なくとも３、好適には、少なくとも４であり得る。
他の実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（場合により、エンドプロテアーゼとの組合せで）および／または３酵素組成物は、１つ以上のさらなるエキソペプチダーゼと使用することができる。
一実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（場合により、エンドプロテアーゼとの組合せで）および／または３酵素組成物は、プロリン特異的エキソペプチダーゼと組み合わせない。
特に好ましい実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび／または３酵素組成物は、以下のポリペプチド配列を有する酵素と組み合わせることはできない：
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一実施形態において、追加の構成成分は、安定剤または乳化剤または結合剤または担体または賦形剤または希釈剤または崩壊剤であり得る。
本明細書において使用される用語「安定剤」は、製品（例えば、飼料製品）を経時的変化から保持する成分または成分の組合せとして定義される。
本明細書において使用される用語「乳化剤」は、エマルジョンの分離を防止する成分（例えば、飼料成分）を指す。エマルジョンは、一方が液滴形態で存在し、他方の中に含有される物質である２つの非混和性の物質である。エマルジョンは、液滴または分散相が油であり、連続相が水である水中油型；または水が分散相となり、連続相が油である油中水型からなり得る。液中気体の状態である発泡体、および液中固体の状態である懸濁液は、乳化剤の使用を介して安定化することもできる。
本明細書において使用される用語「結合剤」は、物理的または化学的反応を介して製品を互いに結合させる成分（例えば、飼料成分）を指す。例えば、「ゲル化」の間に水が吸収されて、結合効果が提供される。しかしながら、結合剤は、他の液体、例えば、油を吸収し、製品内でそれを保持し得る。本発明に関して、結合剤は、典型的には、固体または低湿分製品に、例えば、ベーキング製品；ペストリー、ドーナツ、パンなどに使用される。造粒結合剤の例としては、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、マルトース、ゼラチンおよびアカシアゴムの１つ以上が挙げられる。
「担体」は、酵素の投与に好適な材料を意味し、当技術分野において公知の任意のそのような材料、例えば、任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤などを含み、それらの材料は非毒性であり、組成物のいずれの構成成分とも有害な様式で相互作用しない。
本発明は、本発明の飼料添加剤（好ましくは、トウモロコシまたはトウモロコシ副産物）を、マルトデキストリン、石灰岩（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギまたはコムギ構成成分、スクロース、デンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、安息香酸塩、ソルビン酸塩、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、グルコース、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩、およびそれらの混合物の少なくとも１つから選択される少なくとも１つの生理学的に許容可能な担体と混合することを含む、組成物（例えば、飼料添加用組成物）を調製する方法を提供する。
「賦形剤」の例としては、微結晶性セルロースおよび他のセルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、グリシン、デンプン、乳糖および高分子量ポリエチレングリコールの１つ以上が挙げられる。
「崩壊剤」の例としては、デンプン（好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよびあるケイ酸塩錯体の１つ以上が挙げられる。
「希釈剤」の例しては、水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリンならびにそれらの組合せの１つ以上が挙げられる。
他の構成成分は、同時に（例えば、これらの成分を一緒に混合する場合、またはさらにはこれらの成分を異なる経路により送達する場合）または逐次的に（例えば、これらの成分を異なる経路により送達することができる）、本発明の飼料添加用組成物または飼料添加用組成物または加水分解物に使用することができる。
一実施形態において、好ましくは、本発明による飼料添加用組成物、または飼料成分、または飼料または飼料原料またはプレミックスは、クロムも有機クロムも含まない。
一実施形態において、好ましくは、本発明による飼料添加用組成物、または飼料成分、または飼料または飼料原料またはプレミックスは、ソルビン酸を含有しない。
包装
一実施形態において、本発明によるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびエンドプロテアーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または３酵素組成物および／または組成物および／または食料および／または飼料添加用組成物および／または加水分解物および／または食料原料および／または飼料原料は、包装される。
好ましい１つの好ましい実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびエンドプロテアーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または３酵素組成物および／または組成物および／または食料および／または飼料添加用組成物および／または加水分解物および／または食料原料および／または飼料原料は、袋、例えば、紙袋中で包装される。
代替的実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびエンドプロテアーゼおよび／またはＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼおよび／または３酵素組成物および／または組成物および／または食料および／または飼料添加用組成物および／または加水分解物および／または食料原料および／または飼料原料は、容器中で密封することができる。任意の好適な容器を使用することができる。
食料原料
用語「食料原料」は、本明細書において「食料」と同義に使用される。
ここで、用語「食料原料」は、ヒト用食料を指すために使用される。
食料は、使用および／または適用方式および／または投与方式に応じて溶液の形態または固体として存在し得る。
食料、例えば、機能性食料として、またはその調製において使用される場合、本発明の加水分解物および／または組成物および／または食料添加用組成物は、栄養学的に許容可能な担体、栄養学的に許容可能な希釈剤、栄養学的に許容可能な賦形剤、栄養学的に許容可能な助剤、栄養学的に許容可能な活性成分の１つ以上とともに使用することができる。
一実施形態において、本発明は、本発明による加水分解物を含む食料原料を提供する。食料原料は、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（例えば、本明細書の方法のいずれかにより取得可能なもの）を、場合により、エンドプロテアーゼとの組合せでさらに含み得る。
場合により、食料原料は、少なくとも１つの食料成分をさらに含み得る。
好適には、食料原料は、配列番号２９、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９８、配列番号９９から選択されるアミノ酸配列またはその機能断片またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを含み得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８から選択される１つ以上のアミノ酸配列またはその機能断片またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９８、配列番号９９から選択される１つ以上のアミノ酸配列またはその機能断片またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
本発明はまた、食料構成成分を本発明の加水分解物または本発明の組成物および／もしくは食料添加用組成物と接触させることを含む、食料原料を生産する方法に関する。
食料構成成分を組成物および／または食料添加用組成物と接触させる場合、好適には、食料構成成分は、エンドプロテアーゼとも接触させることができる。
本発明の組成物は、食料品、例えば、ジャム、マーマレード、ゼリー、乳製品（例えば、乳汁またはチーズ）、肉製品、家禽製品、魚類製品およびベーカリー製品の１つ以上の調製において使用することができる。
一実施形態において、本発明の組成物は、タンパク質リッチ廃物流の調製において使用することができる。本明細書において使用される用語「タンパク質リッチ廃物流」は、植物または動物加工、例えば、ダイズ加工からの副産物、レンダリング施設からの副産物（例えば、食肉処理場および／または魚類加工施設からの廃物）である基質を含み得る。
例として、本発明の組成物は、ソフトドリンク、ホエイタンパク質を含む果汁または飲料、健康茶、ココア飲料、乳汁飲料および乳酸菌飲料、ヨーグルトおよびドリンクヨーグルト、チーズ、アイスクリーム、氷菓およびデザート、菓子、ビスケットケーキおよびケーキミックス、スナック食料、朝食用シリアル、即席麺およびカップ麺、即席スープおよびカップスープ、栄養調整食料および飲料、甘味料、テクスチャー改善スナックバー、繊維バー、ベーキング安定性果実フィリング、保護グレーズ、チョコレートベーカリーフィリング、チーズケーキ着香フィリング、フルーツ着香ケーキフィリング、ケーキおよびドーナツの糖衣、耐熱性ベーカリーフィリング、即席ベーカリーフィリングクリーム、クッキー用フィリング、そのまま食べられるベーカリーフィリング、低カロリーフィリング、成人用栄養飲料、酸性化ダイズ／ジュース飲料、無菌／レトルトチョコレート飲料、バーミックス、飲料粉末、カルシウム強化ダイズ／プレーンおよびチョコレートミルク、カルシウム強化コーヒー飲料、粉末化シェイク（例えば、タンパク質サプリメントシェイクまたは健康シェイクまたはスポーツシェイクまたは高齢者用シェイク））、スポーツ栄養製品、高性能食料、ベビーフード、高齢者用食料、医療対象者用食料、満腹サプリメントの成分として使用することができる。
本発明による組成物は、食料品、例えば、アメリカンチーズソース、粉および細切りチーズ用の固化防止剤、チップディップ、クリームチーズ、ドライブレンドホイップトッピング無脂肪サワークリーム、凍結／解凍した乳製品ホイップクリーム、凍結／解凍に安定なホイップチップ、低脂肪および低カロリーナチュラルチェダーチーズ、低脂肪スイス型ヨーグルト、気泡入り冷凍デザート、および新型バー、ハードパックアイスクリーム、ラベルフレンドリー（ｌａｂｅｌ ｆｒｉｅｎｄｌｙ）のハードパックアイスクリームの経済性およびインダルジェンス（ｉｎｄｕｌｇｅｎｃｅ）の改善、低脂肪アイスクリーム：ソフトクリーム、バーベキューソース、チーズディップソース、カッテージチーズドレッシング、ドライミックスアルフレッドソース、ミックスチーズソース、ドライミックストマトソースなどの中の成分としてさらに使用することができる。
ある態様において、好ましくは、食料原料は、飲料である。
好ましくは、食料原料は、ベーカリー製品、例えば、パン、デニッシュペストリー、ビスケットまたはクッキーであり得る。
本発明はまた、本発明の方法により生産された５−ＫＧＡまたは本発明による組成物を別の食料成分と混合することを含む、食料または食料成分を調製する方法を提供する。調製方法または食料成分も、本発明の別の態様である。
本発明による食料原料は、乳製品、ホエイタンパク質製品、ベーカリー製品、発酵製品、高性能食料、ベビーフード、飲料、シェイク、ケーシング、スポーツ栄養製品、高性能食料、ベビーフード、高齢者用食料、または医療対象者用の食料であり得る。
好適には、乳製品は、乳汁ベース製品であり得る。このような乳汁ベース製品は、１つ以上の乳汁タンパク質またはその断片を含み得る。
好ましくは、乳製品（例えば、乳汁ベース製品）は、特殊調製粉乳であり得る。
好適には、ベーカリー製品は、パン製品である。
好適には、発酵製品は、ダイズベース発酵製品であり得る。
好適には、ケーシングは、飲料（好ましくは、ビール用ケーシング）または乳製品ケーシングであり得る。
食料成分
本発明の組成物および／または食料添加用組成物は、食料成分として使用することができる。
本明細書において使用される用語「食料成分」は、栄養サプリメントおよび／または繊維サプリメントとして機能性食料または食料原料に添加され、および／または添加することができる配合物を含む。本明細書において使用される食料成分という用語は、ゲル化、テクスチャー付与、安定化、懸濁化、皮膜形成および構造化、ジューシーさの保持、食感の改善、ペプチド含有率の改善、栄養構成成分の改善を粘性添加なしで要求する広範な製品中で低レベルにおいて使用することができる配合物も指す。
食料成分は、使用および／または適用方式および／または投与方式に応じて溶液の形態または固体として存在し得る。
食料サプリメント
本発明の加水分解物および／または組成物および／または食料添加用組成物は、食料サプリメントであり得、またはそれに添加することができる。
機能性食料
本発明の組成物は、機能性食料であり得、またはそれに添加することができる。
本明細書において使用される用語「機能性食料」は、栄養学的効果および／または味覚の満足感を提供し得るだけでなく、消費者にさらなる有益な効果も与え得る食品を意味する。
したがって、機能性食料は、その食料に純粋な栄養学的効果以外の規定の機能的効果、例えば、医学的または生理学的利益を付与する構成成分または成分（例えば、本明細書に記載のもの）が中に取り込まれた身近な食料である。
機能性食料の法的な定義づけは存在しないが、この分野において利害関係を有する団体の大部分は、それらが規定の健康効果を有するものとして市販されている食品であることに同意している。
一部の機能性食料は、栄養補助食品である。ここで用語「栄養補助食料」は、栄養学的効果および／または味覚の満足感を提供し得るだけでなく、消費者に治療（または他の有益な）効果を与え得る食料を意味する。栄養補助食品は、食料および医薬間の従来の境界線を越える。
調査により、消費者は心疾患に関する機能性食料の要求を最も強調することが示唆されている。癌予防は、消費者を大きくひきつける栄養の別の態様であるが、興味深いことに、それは、最小の管理を発揮し得ると消費者が感じる分野である。実際、世界保健機関によれば、癌症例の少なくとも３５％は、食事関連である。骨粗鬆症、腸健康および肥満効果に関するさらなる要求も、機能性食料の購買を引き起こし、市場拡大をもたらす可能性が高いキー因子である。
飼料
本発明の飼料添加用組成物は、飼料として、またはその調製において使用することができる。
一実施形態において、本発明は、本発明による加水分解物を含む飼料原料を提供する。飼料原料は、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（例えば、本明細書の方法のいずれかにより取得可能なもの）を、場合によりエンドプロテアーゼとの組合せでさらに含み得る。
場合により、飼料原料は、少なくとも１つの飼料成分をさらに含み得る。
好適には、飼料原料は、配列番号２９、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９８、配列番号９９から選択されるアミノ酸またはその機能断片またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを含み得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８から選択される１つ以上のアミノ酸配列またはその機能断片またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
好適には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号９８、配列番号９９から選択される１つ以上のアミノ酸配列またはその機能断片またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
本発明はまた、飼料構成成分を、本発明の加水分解物または本発明の組成物および／もしくは飼料添加用組成物と接触させることを含む、飼料原料を生産する方法に関する。
飼料構成成分を組成物および／または飼料添加用組成物と接触させる場合、好適には、飼料構成成分は、エンドプロテアーゼとも接触させることができる。
用語「飼料」は、本明細書において「飼料原料」と同義に使用される。
飼料は、使用および／または適用方式および／または投与方式に応じて溶液の形態または固体として存在し得る。
飼料、例えば、機能性飼料として、またはその調製において使用する場合、本発明の組成物は、栄養学的に許容可能な担体、栄養学的に許容可能な希釈剤、栄養学的に許容可能な賦形剤、栄養学的に許容可能な助剤、栄養学的に許容可能な活性成分の１つ以上とともに使用することができる。
好ましい実施形態において、本発明の飼料添加用組成物は、飼料構成成分と混合して飼料原料を形成する。
本明細書において使用される用語「飼料構成成分」は、飼料原料の全部または一部を意味する。飼料原料の一部は、飼料原料の１つの構成要素または飼料原料の２つ以上、例えば、２または３または４つの構成要素を意味し得る。一実施形態において、用語「飼料構成成分」は、プレミックスまたはプレミックス構成要素を包含する。
一実施形態において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼと、ポリオール、例えば、グリセロールおよび／またはソルビトール；糖、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトースおよびトレハロース；塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、Ｎａ２ＳＯ４または他の食料グレード塩；保存剤、例えば、安息香酸ナトリウムおよび／またはソルビン酸カリウム；またはそれらの組合せ（場合により、エンドプロテアーゼとの組合せで）からなる群から選択される１つ以上の成分とを含む飼料添加用組成物は、少なくとも１つのタンパク質またはその一部と混合することができ、それは、動物タンパク質または植物タンパク質（例えば、グリアジン、ベータ−カゼイン、ベータ−ラクトグロブリンまたはグリアジン、ベータ−カゼイン、ベータ−ラクトグロブリンの免疫原性断片、グリシニン、ベータ−コングリシニン、クルシフェリン、ナピン、コラーゲン、ホエイタンパク質、魚類タンパク質、食肉タンパク質、卵タンパク質、ダイズタンパク質、ホルデインおよび子実タンパク質の１つ以上から選択される）であり、好ましくは、トウモロコシ、ダイズミール、トウモロコシ可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣（ＤＤＧＳ）、コムギ、コムギタンパク質、例として、グルテン、コムギ副産物、コムギふすま、トウモロコシ副産物、例として、トウモロコシグルテンミール、オオムギ、オートムギ、ライムギ、ライコムギ、高脂肪ダイズ、動物副産物ミール、アルコール可溶性タンパク質（好ましくは、ゼイン（例えば、メイズゼインメイズ）および／またはカフィリン（例えば、ソルガムからのもの））、種子からのタンパク質（好ましくは、ダイズ種子タンパク質、ヒマワリ種子タンパク質、ナタネタンパク質、キャノーラ（ナタネ）種子タンパク質またはそれらの組合せからのもの）またはそれらの組合せに含まれる。
好ましくは、飼料は、飼い葉、またはそのプレミックス、配合飼料、またはそのプレミックスであり得る。一実施形態において、本発明による飼料添加用組成物は、配合飼料、配合飼料構成成分と、または配合飼料のプレミックスに、または飼い葉、飼い葉構成成分、もしくは飼い葉のプレミックスに混合することができる。
本明細書において使用される飼い葉という用語は、動物に提供される（動物がそれ自体を探しまわるものではない）任意の食料を意味する。飼い葉は、切断された植物を包含する。
飼い葉という用語は、干し草、わら、貯蔵牧草、圧縮およびペレット化飼料、油および混合レーション、ならびにさらには発芽穀類およびマメ科植物を含む。
飼い葉は、アルファルファ（ルーサン）、オオムギ、ミヤコグサ、アブラナ属、ショウモエリエ（Ｃｈａｕ ｍｏｅｌｌｉｅｒ）、ケール、ナタネ（キャノーラ）、ルタバガ（スウェーデンカブ）、カブ、ツメクサ、タチオランダゲンゲ、ムラサキツメクサ、サブタレニアンクローバー、シロツメクサ、イネ科草本、偽オートムギ草本、ウシノケグサ、ギョウギシバ、スズメノチャヒキ、ヒース草本、牧草（天然混合の草原、草地からのもの、カモガヤ、ホソムギ、オオアワガエリ、トウモロコシ（メイズ）、アワ、オートムギ、ソルガム、ダイズ、樹木（まぐさ用に刈り込まれた枝葉）、コムギ、およびマメ科植物から選択される植物の１つ以上から得ることができる。
用語「配合飼料」は、ミール、ペレット、ナッツ、ケーキまたはクランブルの形態の市販の飼料を意味する。配合飼料は、種々の原材料および添加剤からブレンドすることができる。これらのブレンドは、標的動物の規定の要求に従って配合することができる。
配合飼料は、１日に要求される全ての栄養素を提供する完全飼料、レーションの一部を提供する濃縮物（タンパク質、エネルギー）または追加の微量栄養素、例えば、ミネラルおよびビタミンのみを提供するサプリメントであり得る。
配合飼料において使用される主成分は、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、メイズ、ダイズ、ソルガム、オートムギ、およびオオムギを含む飼料穀物である。
好適には、本明細書においてプレミックスと称されるものは、微量成分、例えば、ビタミン、ミネラル、化学保存剤、抗生物質、発酵産物、および他の必須成分から構成される組成物であり得る。プレミックスは、通常、市販のレーションへのブレンドに好適な組成物である。
本発明の任意の飼料原料は、ａ）穀草、例えば、小粒穀物（例えば、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、およびそれらの組合せ）および／または大粒穀物、例えば、トウモロコシまたはソルガムなど；ｂ）植物からの製品、例えば、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣（ＤＤＧＳ）、コムギふすま、コムギミドリング粉、コムギショート、米ぬか、もみ殻、オートムギのもみ殻、パーム核、柑橘パルプ、トウモロコシ繊維、トウモロコシ胚芽ミール、トウモロコシふすま、ひき割りトウモロコシ飼料、トウモロコシグルテンフィード、グルテンミール、コムギショート、コムギミドリング粉またはそれらの組合せ；ｃ）例えば、ダイズ、ヒマワリ、ラッカセイ、ルーピン、エンドウマメ、ソラマメ、ワタ、キャノーラ（ナタネ）、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉骨粉飼料、ジャガイモタンパク質、ホエイ、コプラ、ゴマなどの資源から得られるタンパク質；ｄ）植物および動物資源から得られる油および脂肪；ｅ）ミネラルおよびビタミンからなる群から選択される１つ以上の飼料材料を含み得る。
本発明の飼料原料は、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％または少なくとも６０重量％のトウモロコシおよびダイズミールまたはトウモロコシおよび高脂肪ダイズ、またはコムギミールまたはヒマワリミールを含有し得る。
これに加え、またはこれに代替して、本発明の飼料原料は、少なくとも１つの高繊維飼料材料および／または少なくとも１つの高繊維飼料材料の少なくとも１つの副産物を含み得、高繊維飼料原料を提供し得る。高繊維飼料材料の例としては、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、植物（例えば、穀草）からの副産物、例えば、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣（ＤＤＧＳ）、コムギふすま、コムギミドリング粉、コムギショート、米ぬか、もみ殻、オートムギのもみ殻、パーム核、柑橘パルプ、トウモロコシ繊維、トウモロコシ胚芽ミール、トウモロコシふすま、ひき割りトウモロコシ飼料、トウモロコシグルテンフィード、グルテンミール、コムギショート、コムギミドリング粉またはそれらの組合せが挙げられる。一部のタンパク質資源：ヒマワリ、ルーピン、ソラマメおよびワタなどの資源から得られるタンパク質も、高繊維であるとみなすことができる。
本発明において、飼料は、以下のもの：配合飼料およびプレミックス、例として、ペレット、ナッツまたは（ウシ用）ケーキ；作物または作物残渣：トウモロコシ、ダイズ、ソルガム、オートムギ、オオムギ、トウモロコシ茎葉、コプラ、麦わら、まぐさ、サトウダイコン廃棄物；魚粉；刈りたての牧草および他の飼料用植物；肉骨粉飼料；糖蜜；油かすおよび圧搾ケーキ；オリゴ糖；保存された飼料植物：まぐさおよび貯蔵牧草；海草；全粒のまたは圧砕、製粉などにより調製された種子および穀物；発芽穀物およびマメ科植物；酵母エキスの１つ以上であり得る。
本発明における用語「飼料」は、一部の実施形態においてペットフードも包含する。ペットフードは、ペットによる消費が意図される植物または動物材料、例えば、ドッグフードまたはキャットフードである。ペットフード、例えば、ドッグおよびキャットフードは、乾燥形態、例えば、犬用キブル、またはウェットタイプの缶詰のいずれであってもよい。キャットフードは、アミノ酸のタウリンを含有し得る。
本発明における用語「飼料」は、一部の実施形態において魚用飼料も包含する。魚用飼料は、通常、飼育魚の健康を良好に保つために必要とされる多量栄養素、微量元素およびビタミンを含有する。魚用飼料は、フレーク、ペレットまたはタブレット形態で有り得る。ペレット化形態の飼料は、その一部が急速に沈降し、大型魚または底棲種に使用されることが多い。一部の魚用飼料は、添加剤、例えば、観賞魚の発色を人工的に向上させるためにベータカロテンまたは性ホルモンも含有する。
本発明における用語「飼料」は、一部の実施形態において鳥用飼料も包含する。鳥用飼料は、バードフィーダーに用いられるものおよびペットの鳥に給餌するためのものの両方の食料を含む。典型的には、鳥用食料は、種々の種子を含むが、スエット（牛脂または羊脂）も包含し得る。
本明細書において使用される用語「接触させること」は、製品（例えば、飼料）への本発明の組成物の間接または直接適用を指す。使用することができる適用方法の例としては、限定するものではないが、飼料添加用組成物を含む材料中で製品を処理する方法、飼料添加用組成物を製品と混合することにより直接適用する方法、飼料添加用組成物を製品表面上に噴霧する方法または製品を飼料添加用組成物の調製物に浸漬する方法が挙げられる。
一実施形態において、本発明の飼料添加用組成物は、好ましくは、製品（例えば、飼料原料）と混合する。あるいは、飼料添加用組成物は、飼料原料のエマルジョンまたは原材料に含めることができる。
一部の適用のため、組成物を、作用させる／処理すべき製品表面上にまたは表面に対して利用可能であるように、組成物を作製することが重要である。これにより、組成物に以下の望ましい特徴の１つ以上を付与することが可能となり、生物物理学的特徴は、以下の１つ以上からなる群から選択される：動物の性能、動物の成長性能、飼料要求率（ＦＣＲ）、原料の消化能（例えば、栄養消化率、例として、デンプン、脂肪、タンパク質、繊維消化率）、窒素消化率（例えば、回腸窒素消化率）および可消化エネルギー（例えば、回腸可消化エネルギー）、窒素保持量、枝肉歩留まり、成長速度、増体量、体重、質量、飼料効率、体脂肪率、体脂肪分布、成長、卵サイズ、卵重量、卵質量、産卵率、リーン増加量（ｌｅａｎ ｇａｉｎ）、骨灰％、骨灰ｍｇ、背脂肪％、乳汁生産量、乳脂肪％、生殖生産、例えば、リッターサイズ、リッター生存率、孵化率％および環境影響、例えば、糞尿生産量および／または窒素排泄量。
本発明の飼料添加用組成物は、酵素の量を制御して、製品（例えば、飼料原料または飼料原料の原材料）に散在、コーティングおよび／または含浸させることができる。
好ましくは、本発明の飼料添加用組成物は、約７０℃まで；約８５℃まで；または約９５℃までの熱処理に対して耐熱性である。熱処理は、約１分間まで；約５分間まで；約１０分間まで；約３０分間まで；約６０分間まで実施することができる。耐熱性という用語は、規定温度への加熱前に添加剤中に存在した／添加剤中で活性であった酵素構成成分の少なくとも約７５％が、室温への冷却後に依然として存在する／活性であることを意味する。好ましくは、規定温度への加熱前に添加剤中に存在し、活性であった酵素構成成分の少なくとも約８０％が、室温への冷却後に依然として存在し、活性である。
特に好ましい実施形態において、飼料添加用組成物を均質化させて粉末を生産する。
代替的な好ましい実施形態において、飼料添加用組成物は、参照により本案件に組み込まれる国際公開第２００７／０４４９６８号パンフレットに記載の顆粒（ＴＰＴ顆粒と称される）に配合する。
別の好ましい実施形態において、飼料添加用組成物を顆粒に配合する場合、顆粒は、タンパク質コア上でコーティングされる水和障壁塩を含む。このような塩コーティングの利点は、熱耐性の改善、貯蔵安定性の改善および他の場合には酵素に対して有害効果を有する他の飼料添加剤からの保護である。
好ましくは、塩コーティングに使用される塩は、０．２５超の水分活性または２０℃における６０％超の一定湿度を有する。
好ましくは、塩コーティングは、Ｎａ２ＳＯ４を含む。
飼料添加用組成物を調製する方法は、粉末をペレット化するステップをさらに含み得る。粉末は、当技術分野において公知の他の構成成分と混合することもできる。粉末、または粉末を含む混合物をダイに通し、得られたストランドを変動長さの好適なペレットに切断することができる。
場合により、ペレット化ステップは、ペレット形成前の蒸気処理、または調整ステップを含み得る。粉末を含む混合物は、調整槽中に、例えば、水蒸気注入装置を備えるミキサー中に装入することができる。混合物を調整槽中で、規定温度まで、例えば、６０〜１００℃に加熱する。典型的な温度は、７０℃、８０℃、８５℃、９０℃、または９５℃である。滞留時間は、秒単位から分単位、およびさらには時間単位で変動可能である。例えば、５秒、１０秒、１５秒、３０秒、１分、２分、５分、１０分、１５分、３０分および１時間である。
本発明の飼料添加用組成物は、任意の適切な飼料材料への添加に好適であることが理解される。
本明細書において使用される飼料材料という用語は、動物により消費されるべき基礎的な飼料材料を指す。これは、例えば、少なくとも１つ以上の未加工穀類および／または加工植物および／または動物材料、例えば、ダイズミールまたは骨粉を含み得ることがさらに理解される。
本明細書において使用される用語「飼料原料」は、１つ以上の飼料添加用組成物が添加された飼料材料を意味する。
異なる動物は異なる飼料原料を要求すること、およびさらには同一動物であっても、その動物の飼育目的に応じて異なる飼料原料を要求し得ることが、当業者により理解される。
好ましくは、飼料原料は、メイズまたはトウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライコムギ、ライムギ、イネ、タピオカ、ソルガムおよび／または副産物のいずれか、ならびにタンパク質リッチ構成成分、例えば、ダイズミール、ナタネミール、キャノーラミール、綿実ミール、ヒマワリ種子ミール、動物副産物ミールおよびそれらの混合物を含む飼料材料を含み得る。より好ましくは、飼料原料は、動物脂肪および／または植物油を含み得る。
場合により、飼料原料は、追加のミネラル、例えば、カルシウムなどおよび／または追加のビタミンも含有し得る。
好ましくは、飼料原料は、トウモロコシダイズミール混合物である。
飼料原料は、典型的には、最初に原材料を好適な粒経に挽き、次いで適切な添加剤と混合する飼料粉砕機中で生産する。次いで、飼料原料をマッシュまたはペレットとして生産することができ；後者は、典型的には、温度を標的レベルに上昇させ、次いで飼料をダイに通して特定のサイズのペレットを生産する方法を含む。ペレットを冷却させる。続いて、液体添加剤、例えば、脂肪および酵素を添加することができる。飼料原料の生産は、特に、少なくとも蒸気の使用を含み得る好適な技術により、ペレット化の前に押出し、または膨張させることを含む追加のステップも含み得る。
飼料原料は、単胃動物、例えば、家禽（例えば、ブロイラー、産卵鶏、ブロイラーブリーダー、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、水鳥）、肉豚（全年齢種）、ペット（例えば、イヌ、ネコ）または魚類用の飼料原料であり得、好ましくは、飼料原料は家禽用である。
例にすぎないが、ニワトリ、例えば、ブロイラー用の飼料原料は、下表に列挙される成分の１つ以上を、例えば、下表に挙げられる割合％で含み得る：
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例にすぎないが、ニワトリ、例えば、ブロイラー用の食餌仕様は、下表に記載のとおりのものであり得る：
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例にすぎないが、産卵鶏用の飼料は、下表に列挙される成分の１つ以上を、例えば、下表に挙げられる割合％で含み得る：
Figure 0006878275
例にすぎないが、産卵鶏用の食餌仕様は、下表に記載のとおりのものであり得る：
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例にすぎないが、シチメンチョウ用の飼料は、下表に列挙される成分の１つ以上を、例えば、下表に挙げられる割合％で含み得る。
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例にすぎないが、シチメンチョウ用の食餌仕様は、下表に記載のとおりのものであり得る。
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例にすぎないが、仔豚用の飼料は、下表に列挙される成分の１つ以上を、例えば、下表に挙げられる割合％で含み得る：
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例にすぎないが、仔豚用の食餌仕様は、下表に記載のとおりのものであり得る：
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例にすぎないが、育成期／仕上げ期のブタ用の飼料は、下表に列挙される成分の１つ以上を、例えば、下表に挙げられる割合％で含み得る：
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例にすぎないが、育成期／仕上げ期のブタ用の食餌仕様は、下表に記載のとおりのものであり得る：
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食肉ベース食料品／飼料製品
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびエンドプロテアーゼおよび／または組成物および／または食料／飼料組成物および／または加水分解物は、食肉ベース食料／飼料製品の製造において使用することができる。
本発明による「食肉ベース食料品」および「食肉ベース飼料製品」は、食肉をベースとする任意の製品である。
食肉ベース食料品は、食料および／または飼料としてヒトおよび／または動物消費に好適である。本発明の一実施形態において、食肉ベース食料品は、動物に給餌するための飼料製品、例えば、ペットフード製品などである。本発明の別の実施形態において、食肉ベース食料品は、ヒト用の食料品である。
食肉ベース食料／飼料製品は、非食肉成分、例えば、水、塩、小麦粉、乳汁タンパク質、植物タンパク質、デンプン、加水分解タンパク質、リン酸塩、酸、香辛料、着色剤および／またはテクスチャー付与剤などを含み得る。
本発明による食肉ベース食料品／飼料製品は、好ましくは、５〜９０％（重量／重量）の食肉を含む。一部の実施形態において、食肉ベース食料品は、少なくとも３０％（重量／重量）の食肉、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％の食肉を含み得る。
一部の実施形態において、食肉ベース食料／飼料製品は、調理肉、例えば、ハム、ロイン、ピクニックハム、ベーコンおよび／または豚脇腹肉などである。
食肉ベース食料品／飼料製品は、以下の１つ以上のであり得る：
乾燥および半乾燥塩漬け肉−例えば、発酵製品、乾燥塩漬けおよびスターター培養を用いて発酵させたもの、例えば、ドライソーセージ、サラミ、ペパロニおよびドライハム；
乳化肉製品（例えば、低温消費および高温消費用）、例えば、モルタデッラ、フランクフルトソーセージ、ランチョンミートおよびパテ；
魚類および海産食品、例えば、エビ、サケ、再配合魚類製品、凍結コールドパック魚類；
新鮮肉筋肉−例えば、全注入食肉筋肉、例えば、ロイン、ショルダーハム、マリネ肉；
挽いた新鮮肉および／または再構成新鮮肉−または再配合肉、例えば、低温硬化性ゲルまたは結合により性能向上させた切り取り肉、例えば、生の、未調理のロインチョップ、ステーキ、ロースト、フレッシュソーセージ、ビーフバーガー、ミートボール、ペルメニ；
家禽製品−例えば、鶏または七面鳥胸肉または再配合家禽、例えば、チキンナゲット、および／またはチキンソーセージ；
レトルト製品−オートクレーブ処理した食肉製品、例えば、ピクニックハム、ランチョンミート、乳化製品。
本発明の一実施形態において、食肉ベース食料品／飼料製品は、加工肉製品、例えば、ソーセージ、ボローニャソーセージ、ミートローフ、挽肉製品、挽肉、ベーコン、ポロニー、サラミまたはパテなどである。
加工肉製品は、例えば、食肉ベースエマルジョンから製造された乳化肉製品、例えば、モルタデッラ、ボローニャソーセージ、ペパロニ、レバーソーセージ、チキンソーセージ、フランクフルトソーセージ、フランクフルト、ランチョンミート、ミートパテなどであり得る。
食肉ベースエマルジョンは、例えば、ベーキング形態で、または例えば、プラスチック、コラーゲン、セルロースもしくは天然ケーシングのケーシング中に充填した後に調理し、殺菌し、またはベーキングすることができる。加工肉製品は、再構成肉製品、例えば、再構成ハムなどであり得る。本発明の食肉製品は、加工ステップ、例えば、加塩、例えば、乾燥加塩；塩漬け、例えば、塩水塩漬け；乾燥；燻製；発酵；調理；缶詰化；レトルト化；スライスおよび／またはシュレディングなどを受け得る。
別の実施形態において、食料品／飼料製品は、乳化肉製品であり得る。
食肉
本明細書において使用される用語「食肉」は、任意の種類の動物に由来する任意の種類の組織を意味する。
本明細書において使用される食肉という用語は、動物に由来する筋繊維を含む組織であり得る。食肉は、動物筋肉、例えば、全動物筋肉または動物筋肉から切断された肉片であり得る。
別の実施形態において、食肉は、例えば、動物の内部器官、例えば、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺および脳などを含み得る。
食肉という用語は、当技術分野において公知の任意の他の適切な方法により小さい肉片に挽肉化、ミンチ化または切断された食肉を包含する。
食肉は、任意の種類の動物、例えば、ウシ、ブタ、ラム、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、キジ、シカ、ヘラジカ、トナカイ、スイギュウ、バイソン、レイヨウ、ラクダ、カンガルー；任意の種類の魚類、例えば、スプラット、タラ、コダラ、マグロ、アナゴ、サケ、ニシン、イワシ、サバ、アジ、サンマ、ウルメイワシ、タラ、カレイ、アンチョビ、マイワシ、ブルーホワイティング、パシフィックホワイティング、トラウト、ナマズ、バス、カラフトシシャモ、マーリン、レッドスナッパー、ノルウェーコダラおよび／またはメルルーサ；任意の種類の貝類、例えば、ハマグリ、イガイ、ホタテ、ザルガイ、タマキビ、カタツムリ、カキ、エビ、ロブスター、ヨーロッパアカザエビ、カニ、ザリガニ、コウイカ、イカ、および／またはタコに由来し得る。
一実施形態において、食肉は、牛肉、豚肉、鶏肉、ラム肉および／または七面鳥肉である。
生物物理学的特徴
本発明のトリペプチジルペプチダーゼ（場合により、エンドプロテアーゼとの組合せで）および／または飼料原料および／または飼料添加用組成物および／または組成物の動物への給餌は、そうして給餌された動物の生物物理学的特徴を改善し得る。
好適には、本方法および／または使用は、少なくとも１つの飼料構成成分、少なくとも１つのミネラル、少なくとも１つのビタミンまたはそれらの組合せを動物に投与することをさらに含み得る。
あるいはまたはさらに、本方法および／または使用は、少なくとも１つのエンドプロテアーゼを動物に投与することをさらに含み得る。
本明細書において使用される「生物物理学的特徴」は、健康および／または性能および／または生産量を改善する動物の任意の生物物理学的特性を意味する。
例として、生物物理学的特徴は、以下の１つ以上からなる群から選択される１つ以上であり得る：動物の性能、動物の成長性能、飼料要求率（ＦＣＲ）、原料の消化能（例えば、栄養消化率、例として、デンプン、脂肪、タンパク質、繊維消化率）、窒素消化率（例えば、回腸窒素消化率）および可消化エネルギー（例えば、回腸可消化エネルギー）、窒素保持量、枝肉歩留まり、成長速度、増体量、体重、質量、飼料効率、体脂肪率、体脂肪分布、成長、卵サイズ、卵重量、卵質量、産卵率、リーン増加量、骨灰％、骨灰ｍｇ、背脂肪％、乳汁生産量、乳脂肪％、生殖生産、例えば、リッターサイズ、リッター生存率、孵化率％および環境影響、例えば、糞尿生産量および／または窒素排泄量。
好適には、生物物理学的特徴は、飼料要求率、窒素消化率（例えば、回腸窒素消化率）および可消化エネルギー（例えば、回腸可消化エネルギー）からなる群から選択される１つ以上であり得る。
好ましい実施形態において、生物物理学的特徴は、タンパク質の消化能であり得る。
一実施形態において、動物の生物物理学的特徴は、動物の性能を意味する。
好適には、本発明の飼料添加用組成物および／または飼料および／または飼料原料および／または飼料成分および／またはプレミックスの動物への投与は、本発明の飼料添加用組成物および／または飼料および／または飼料原料および／または飼料成分および／またはプレミックスを給餌しなかった動物と比較して動物における壊死性腸炎の発症率を実質的に増加させ得ない。
本明細書において使用される用語「壊死性腸炎の発症率を実質的に増加させる」は、発症率が約２０％を超えて増加せず、好適には、約１０％を超えて増加しないことを意味する。好ましくは、これは、壊死性腸炎の発症率が約５％を超えて、より好ましくは、約１％を超えて増加しないことを意味する。
性能
本明細書において使用される「動物の性能」は、飼料効率および／もしくは動物の増体量により、ならびに／または飼料要求率により、ならびに／もしくは飼料中の栄養素の消化率（例えば、アミノ酸消化率）および／もしくは飼料中のエネルギーもしくは代謝エネルギー消化率により、ならびに／または窒素保持量により決定することができる。
好ましくは、「動物の性能」は、飼料効率および／または動物の増体量により、ならびに／あるいは飼料要求率により決定される。
「動物の性能の改善」は、飼料中の本発明の加水分解物または本発明の組成物（例えば、食料または飼料添加用組成物）の使用から生じる、本発明により調製された加水分解物も組成物も含まない飼料を動物に給餌する場合と比較した、対象における飼料効率の増加、および／または増体量の増加、および／または飼料要求率の低減および／または飼料中の栄養素もしくはエネルギー消化率の改善、および／または窒素保持量の改善が存在することを意味する。
好ましくは、「動物性能の改善」は、飼料効率の増加および／または増体量の増加および／または飼料要求率の低減が存在することを意味する。
本明細書において使用される用語「飼料効率」は、一定期間の間、動物に食料を適宜または規定量で給餌する場合に生じる、動物の増体量を指す。
「飼料効率の増加」は、飼料中の本発明による加水分解物または組成物（例えば、食料または飼料添加用組成物）の使用が、本発明により調製された加水分解物も組成物も給餌しない動物と比較して増加した飼料摂取量単位当たりの増体量をもたらすことを意味する。
飼料要求率（ＦＣＲ）
本明細書において使用される用語「飼料要求率」は、動物の体重を規定量だけ増加させるために動物に給餌される飼料量を指す。
飼料要求率の改善は、より低い飼料要求率を意味する。
「より低い飼料要求率」または「飼料要求率の改善」は、飼料中の本発明の加水分解物または組成物（例えば、食料または飼料添加用組成物）の使用が、本発明により調製された前記加水分解物も組成物も用いずに規定量だけ動物体重を増加させるために要求される飼料量と比較して低い、動物の体重を同一量だけ増加させるために動物に給餌することが要求される飼料量をもたらすことを意味する。
栄養素消化率
本明細書において使用される栄養素消化率は、胃腸管または胃腸管の規定の分節、例えば、小腸から消失する栄養素の割合を意味する。栄養素消化率は、対象に投与されるものと、対象の糞便中に分泌されるものとの差、または対象に投与されるものと、胃腸管の規定の分節、例えば、回腸上で消化物中に残存するものとの差として計測することができる。
本明細書において使用される栄養素消化率は、一定期間中の排泄物の総回収量を用いて、栄養素の摂取量と栄養素の排泄量との差により計測することができ；または動物により吸収されず、胃腸管全体または胃腸管分節中で消失した栄養素の量が研究者により計算可能な不活性マーカーを使用して計測することができる。このような不活性マーカーは、二酸化チタン、酸化クロムまたは酸不溶性灰分であり得る。消化率は、飼料中の栄養素の割合として、または飼料中の栄養素の質量単位当たりの可消化栄養素の質量単位として表現することができる。
本明細書において使用される栄養素消化率は、デンプン消化率、脂肪消化率、タンパク質消化率、ミネラル消化率、およびアミノ酸消化率を包含する。
好適には、本発明の方法および／または使用または本発明の態様のいずれかによるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの使用（場合により、少なくとも１つのエンドプロテアーゼとの組合せで）は、本発明の飼料添加用組成物および／または飼料成分および／または飼料および／または飼料原料および／またはプレミックスおよび／または加水分解物を給餌される動物中のタンパク質および／またはアミノ酸消化率を増加させる。
本明細書において使用されるエネルギー消化率は、消費される飼料の総エネルギーから糞便の総エネルギーを減算したものまたは消費される飼料の総エネルギーから動物の胃腸管の規定の分節、例えば、回腸上の残留消化物の総エネルギーを減算したものを意味する。本明細書において使用される代謝エネルギーは、見かけの代謝エネルギーを指し、消費される飼料の総エネルギーから糞便、尿、および消化のガス産物中に含有される総エネルギーを減算したものを意味する。エネルギー消化率および代謝エネルギーは、栄養素消化率の計測法と同一の方法を使用して、飼料の代謝エネルギーを計算するために窒素排出について適切な補正を行って、摂取総エネルギーと、糞便に中に排泄されたまたは胃腸管の規定の分節に存在する消化物に残存する総エネルギーとの差として計測することができる。
窒素保持量
本明細書において使用される窒素保持量は、食餌からの窒素を体重として保持する対象の能力を意味する。窒素の排泄量が１日摂取量を超過する場合に負の窒素バランスが生じ、それは筋肉が損失している場合に見られることが多い。正の窒素バランスは、特に成長期の動物における筋肉成長と関連することが多い。
窒素保持量は、一定期間のし尿の総回収量を用いて、窒素摂取量と窒素排泄量との差として計測することができる。窒素排泄量は、飼料からの未消化タンパク質、内因性のタンパク質性分泌物、微生物タンパク質、および尿窒素を含むことが理解される。
枝肉歩留まりおよび採肉歩留まり
本明細書において使用される枝肉歩留まりという用語は、食肉処理の商業または実験プロセス後の、生体重の比率としての枝肉の量を意味する。枝肉という用語は、頭部、尾部、肢部、および羽または皮を除去して食料用に食肉処理された動物の肉体を意味する。本明細書において使用される採肉歩留まりという用語は、生体重の比率としての食用肉の量、または生体重の比率としての規定の切り出し肉の量を意味する。
増体量
本発明は、本発明による飼料添加用組成物を含む飼料原料を対象に給餌することを含む、対象、例えば、家禽または肉豚における増体量を増加させる方法をさらに提供する。
「増体量の増加」は、本発明により調製された加水分解物も組成物も含まない飼料を給餌される動物と比較して、本発明の加水分解物または本発明による組成物（例えば、食料または飼料添加用組成物）を含む飼料の給餌時に体重が増加する動物を指す。
非食料品
本発明は、本発明の加水分解物を含む非食料品を提供する。
取得可能な（例えば、得られた）加水分解物は、局所的に適用される製品、例えば、ローション、クリーム、軟膏剤、ラブ、洗浄剤などの製造において使用することができる。したがって、本明細書に記載の加水分解タンパク質組成物を含むこのような製品が本明細書において企図される。このような製品は、例えば、治療目的、例えば、乾燥皮膚、掻痒、不快感などの緩和を提供するために有用である。
これらの製品は、好ましくは、加水分解タンパク質構成成分に加え、基剤として、脂質、ワックス、油、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョンなどを含む。典型的には、これらは、１つ以上の芳香構成成分、および他の成分、例えば、界面活性剤または乳化剤をさらに含み得る。
本明細書に記載の乳汁またはホエイタンパク質加水分解物を含む化粧品および他の外見補助剤または美容補助剤も提供される。
一実施形態において、化粧製品は、対象者の顔面、頬、唇、または眼に適用することができる。別の実施形態において、製品は、皮膚の化粧外見の改善を支援するため、または、例えば、しわ、痣、そばかす、瘢痕、傷などの外見を縮小させるために身体上のいずれの箇所にも使用することができる。
利点
本発明者らは、本発明によるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼが、加水分解物の調製における使用に高度に有利であり、加水分解物または加水分解物を含む食料および／または飼料および／またはプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（場合により、少なくとも１つのエンドプロテアーゼとの組合せで）を含む食料または飼料添加用組成物を給餌される対象に利点を付与することを最初に示した。
あるいはまたはさらに、エンドプロテアーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼを使用して生産された加水分解物は、非処理加水分解物と比較して低減した苦味も有し得る。
有利には、本発明における使用のために教示されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、広範なペプチドおよび／またはタンパク質基質に作用し得、そのような広い基質特異性を有することに起因して、あるアミノ酸（例えば、プロリンおよび／またはリジンおよび／またはアルギニンおよび／またはグリシン）が濃縮された基質の開裂が容易に阻害される。したがって、このようなプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの使用は、タンパク質基質（例えば、加水分解物の調製のための基質中に存在）を効率的および／または急速に分解し得る。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、Ｐ１位のリジン、アルギニンまたはグリシンの１つ以上を有するペプチドおよび／またはタンパク質に対する優先的活性を有し得る。理論により拘束されるものではないが、Ｐ１位におけるそれらのアミノ酸を含むペプチドおよび／またはタンパク質基質は、多くのトリペプチジルペプチダーゼおよび／またはプロテアーゼについて一般に消化困難であり得、そのような残基との接触時、トリペプチジルペプチダーゼおよび／またはプロテアーゼによるペプチドおよび／またはタンパク質基質のそのような残基開裂は停止し、または緩慢であり得る。有利には、本発明のプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを使用することにより、Ｐ１におけるリジン、アルギニンおよび／またはグリシンを含むタンパク質および／またはペプチド基質を効率的におよび／または開裂反応をそれほど緩慢にせずに消化することが可能である。
本発明はまた、上記活性を有することに加え、Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３およびＰ３’位におけるプロリンに耐性であり得るプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを提供する。これにより、プロリンのストレッチを有するペプチドおよび／またはタンパク質基質の効率的な開裂が可能となり、広範なペプチドおよび／またはタンパク質基質の開裂が可能となるため、有利である。
有利には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、Ｐ１におけるリジンを有するペプチドおよび／またはタンパク質に対する優先的活性を有し得、これにより、高いリジン含有率を有する基質、例えば、ホエイタンパク質の効率的な開裂が可能となる。
本発明はまた、非耐熱性バリアントと比較して変性する傾向が低く、および／または、したがって長期の活性を保持する耐熱性プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを提供する。
有利には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、約ｐＨ７のｐＨ範囲の活性を有し得、したがって、アルカリ性エンドプロテアーゼと使用することができる。これは、加水分解物生産のためのタンパク質および／またはペプチド基質を含む反応媒体のｐＨの変化が、酵素処理間で必要でないことを意味する。換言すると、これにより、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびエンドプロテアーゼを反応に同時に添加することが可能となり、それにより、加水分解物を生産するプロセスをより迅速に、および／またはより効率的に、および／またはよりコスト効率的にすることができる。さらに、より低いｐＨ値において基質が溶液から沈殿し得、したがって開裂され得ないため、これにより、より効率的な反応が可能となる。
酸性ｐＨにおける活性を有するプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、酸性エンドプロテアーゼとの組合せで使用することができ、有利には、加水分解物生産のためのタンパク質および／またはペプチド基質を含む反応媒体のｐＨの変化を酵素処理間で要求しない。換言すると、これにより、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびエンドプロテアーゼを反応に同時に添加することが可能となり、それにより、加水分解物を生産するプロセスをより迅速に、および／またはより効率的に、および／またはよりコスト効率的にすることができる。
有利には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼとの組合せのエンドプロテアーゼは、疾患、例えば、乳汁タンパク質アレルギーおよび／またはダイズタンパク質アレルギーを罹患する感受性個体における免疫応答を引き起こすことと関連するタンパク質基質を開裂し得る。
有利には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼとの組合せでのエンドプロテアーゼの使用は、基質開裂の効率を増加させ得る。理論により拘束されるものではないが、エンドプロテアーゼは、ペプチドおよび／またはタンパク質基質をＣまたはＮ末端から離れた複数の領域において開裂し得、それにより基質として使用するためのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼのためのより多くのＮ末端終端部を産生し、それにより、有利には、反応効率を増加させ、反応時間を低減させることが考えられる。
多くの現在の給餌実務は、高いｐＨ（例えば、ｐＨ８）において活性なアルカリ性プロテアーゼを動物に投与することを含む。したがって、アルカリ性プロテアーゼは、よりアルカリ性になる動物の胃腸管の下部（例えば、後方部）、例えば、小腸の後方部および大腸および盲腸中でのみ活性である。理論により拘束されるものではないが、胃腸管の後方部中のオリゴペプチドの生産は、オリゴペプチドを利用する微生物の集団を増加させ、次いでそのことが腸内疾患チャレンジおよび／または動物による摂取に利用可能な栄養素の低減をもたらし得ることが考えられる。さらに、胃腸管の後方部（すなわち、下部）において、粘膜は、上部（例えば、砂嚢、前胃または胃）よりも十分に保護されていないため、より容易に損傷され、炎症をもたらす。有利には、酸性ｐＨにおける活性を有するプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの使用は、この問題を緩和する。それというのも、それは、上部胃腸管中でその基質を消化し得、それにより微生物の集団を実質的に増加させず、および／または動物による摂取に利用可能な栄養素（例えば、アミノ酸／ペプチド）の量を増加させ、および／または炎症を低減させるためである。
有利には、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼとの組合せのエンドプロテアーゼの使用は、基質開裂の効率を増加させ得る。理論により拘束されるものではないが、エンドプロテアーゼは、ペプチドおよび／またはタンパク質基質をＣまたはＮ末端から離れた複数の領域において開裂し得、それにより基質として使用するためのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼのためのより多くのＮ末端終端部を生産し、それにより有利には、反応効率を増加させ、および／または反応時間を低減させることが考えられる。
酸性エンドプロテアーゼおよび酸性ｐＨにおける活性を有するプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの使用は、非常に有利である。それというのも、この２つの酵素は、協働して動物の上部胃腸管（例えば、砂嚢、前胃または胃）中のペプチドおよび／またはタンパク質基質を消化し得、その動物中に存在する他の内因性プロテアーゼ（例えば、ペプシン、トリプシンまたはキモトリプシン）との組合せで活性であり得るためである。
有利には、動物へのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの給餌は、増体量の増加および／または飼料要求率の低減および／または窒素消化率（すなわち、回腸窒素消化率）の増加および／またはエネルギー消化の増加（例えば、回腸エネルギー消化）をもたらす。
エンドプロテアーゼ、Ｓ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼ（例えば、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ）およびアミノペプチダーゼの使用は、場合により、１つ以上のさらなる構成成分との組合せで、多くの利点を有する：
・それにより、対象により効率的に吸収され得る単一アミノ酸および／またはジペプチドおよび／またはトリペプチドの効率的な生産が可能となる（例えば、摂取に良好な浸透ポテンシャルを有することに起因）；
・タンパク質および／またはペプチド基質が、より効率的に、および／またはより急速に消化され得る；
・特に、例えば、トリペプチドを単一アミノ酸および／またはジペプチドに消化することにより加水分解物の製造においてインビトロで使用される場合、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼのエンドポイント阻害（すなわち、その反応産物による阻害）の低減；および／または
・高レベルのプロリン、リジン、アルギニンおよび／またはグリシンを含有する物質に対する相乗および／または相加活性。
追加の定義
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本開示が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，２０ ＥＤ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、当業者に本開示において使用される用語の多くの一般辞書を提供する。
本開示は、本開示の開示の例示的な方法および材料により限定されず、本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を本開示の実施形態の実施または試験において使用することができる。数値範囲には、範囲を定義する数字が含まれる。特に記載のない限り、任意の核酸配列は、左から右に５’から３’配向に記載され；アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシ配向にそれぞれ記載される。
本明細書において提供される見出しは、本明細書を全体として参照することにより有され得る本開示の種々の態様にも実施形態にも限定されない。したがって、直後に定義される用語は、本明細書を全体として参照することにより十分に定義される。
アミノ酸は、本明細書において３文字略記または１文字略記のアミノ酸の名称を使用して称される。
本明細書において使用される用語「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを含む。
本明細書において使用される用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」および／または用語「タンパク質」と同義である。一部の例において、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。一部の例において、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において交換可能に使用される。本開示および特許請求の範囲において、アミノ酸残基についての慣用の１文字および３文字コードを使用することができる。アミノ酸についての３文字コードは、ＩＵＰＡＣＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に準拠して定義されるとおりである。ポリペプチドは、遺伝子コードの縮重に起因して２つ以上のヌクレオチド配列によりコードさせることができることも理解される。
用語の他の定義は、本明細書全体にわたり記載され得る。例示的な実施形態をより詳細に記載する前に、本開示は、記載の特定の実施形態に限定されず、無論、それ自体変動し得ることを理解すべきである。本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためにすぎず、限定するものでないことも理解すべきである。
値の範囲が提供される場合、文脈上明記されない限り、下限とする単位の少数第一位までが開示され、それ以外には、その範囲の上限値および下限値の間に含まれるそれぞれの数値も具体的に開示されることが理解される。任意の記述値または記述値の間に含まれる値、および任意の他の記述値またはその記述範囲に含まれる値の間のより小さなそれぞれの範囲も本開示に包含される。これらのより小さな範囲の限界値は独立してその範囲に包含し、またはそれから除外することができ、そのより小さな範囲に限界値のいずれかが含まれ、そのいずれも含まれず、またはその両方が含まれるそれぞれの範囲も本開示内に包含され、記述範囲の限界値が任意に具体的に排除されることもある。記述範囲が限界値のいずれかまたは両方を含む場合、これらの含まれる限界値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明記されない限り複数形の指示対象も含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ」、「エンドプロテアーゼ」、「Ｓ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼ」、「アミノペプチダーゼ」または「酵素」への言及は、複数のそのような候補薬剤を含み、「飼料」、「飼料原料」、「プレミックス」または「飼料添加用組成物」への言及は、当業者に公知の１つ以上の飼料、飼料原料、プレミックスおよびそれらの均等物などへの言及を含む。
本明細書において考察される刊行物は、本出願の出願日よりも先に開示されているという意味でのみ提供される。本明細書において、このような刊行物が、本明細書に添付の特許請求の範囲に対する先行技術を構成することの容認と解釈すべきでない。
本発明は、目下、例にすぎないが、以下の図面および実施例を参照して記載される。
実施例１
トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）中のプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼのクローニングおよび発現
ゲノム配列として生成されたＲＩ０７９（配列番号５７）およびＴＲＩ０８３（配列番号５６）を除きトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）中の発現に好ましいコドンを使用してプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼをコードする合成遺伝子を生成した。予測される分泌シグナル配列（ＳｉｇｎａｌＰ ４．０：Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｔｈｏｍａｓ Ｎｏｒｄａｈｌ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｓｏｒｅｎ Ｂｒｕｎａｋ，Ｇｕｎｎａｒ ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ＆ Ｈｅｎｒｉｋ Ｎｉｅｌｓｅｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５−７８６，２０１１）を、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）酸性真菌プロテアーゼ（ＡＦＰ）からの分泌シグナル配列およびトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ遺伝子（ＴｒＧＡ１）からのイントロンにより置き換えた（ＴＲＩ０７９およびＴＲＩ０８３を除く）（図７の下段パネル参照）。
ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）酵素ミックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してデスティネーションベクターｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３（米国特許第８５９２１９４Ｂ２号明細書に記載、その教示は、参照により本明細書に組み込まれる）中に合成遺伝子を導入し、本明細書におけるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼのための発現ベクターｐＴＴＴ−ｐｙｒＧ１３の構築をもたらした。配列番号１、２および２９をコードする発現ベクターを図１に示し、配列番号１２および３９をコードする発現ベクターを図７に示す。配列番号９６または９７（ＴＲＩ０４５）をコードする発現ベクターを図２に示す。本質的に（米国特許第８５９２１９４Ｂ２号明細書）に記載のＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換を使用して５〜１０μｇの発現ベクターを、好適なトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株中に個々に形質転換した。発芽胞子を遠心分離により回収し、洗浄し、４５ｍｇ／ｍｌの溶解酵素溶液（トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ），Ｓｉｇｍａ Ｌ１４１２）により処理して真菌細胞壁を溶解させた。プロトプラストのさらなる調製は、Ｐｅｎｔｔｉｌａｅ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ６１（１９８７）１５５−１６４）により記載されている標準的方法により実施した。
０．８５％のＮａＣｌ、０．０１５％のＴｗｅｅｎ ８０の溶液を使用して胞子を回収した。胞子懸濁液を使用して液体培養物を植菌した。
培養物を、２８℃および８０％の湿度において、１８０ｒｐｍにおいて振盪しながら７日間増殖させた。培養物上清を真空濾過により回収し、それを使用して発現および酵素性能を計測した。
実施例２
精製および特徴付け
Ａ．プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの精製
２０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ４．５（緩衝液Ａ）により平衡化したＰＤ１０カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）上で試料の脱塩を実施した。Ｓｏｕｒｃｅ Ｓ１５ ＨＲ２５／５（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）上のイオン交換クロマトグラフィーのため、カラムを緩衝液Ａにより平衡化した。脱塩試料（７ｍｌ）を６ｍｌ／分の流速においてカラムにアプライし、カラムを緩衝液Ａにより洗浄した。結合タンパク質を２０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ４．５中０〜０．３５ＭのＮａＣｌ（３５分）の線形勾配により溶出させた。ラン全体の間、１０ｍｌの分画を回収した。回収された試料は、下記のトリペプチジルアミノ活性のためのアッセイであった。タンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度計測値に基づき計算し、ＥｘＰＡＳｙ ＰｒｏｔＰａｒａｍツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ）を使用してタンパク質の理論吸光度を計算した。
Ｂ．プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼ活性の測定
発色ペプチドＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ（ＭＷ＝３８７．８２；Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して上記のとおり産生された試料中のプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの活性を測定した。アッセイを以下のとおり実施し、１０μＬの発色ペプチド溶液（ジメチルスルホキシド；ＤＭＳＯ中で溶解させた１０ｍＭ）をマイクロタイタープレート中で１３０μｌの酢酸Ｎａ（２０ｍＭ、酢酸によりｐＨ４．０に調整）に添加し、４０℃において５分間加熱した。１０μＬの適切に希釈された酵素を添加し、吸収をＭＴＰリーダー（Ｖｅｒｓａ ｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中で４０５ｎｍにおいて計測した。１カタールのタンパク質分解は、毎秒１モルのｐ−ニトロアニリンを放出するために要求される酵素の量と定義した。
エンドプロテアーゼ活性のためのアゾスカゼイン（ａｚｏｓｃａｓｅｉｎ）アッセイ
Ｉｖｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，１９９５により記載されているエンドプロテアーゼアッセイの修正バージョンを使用する。５０μｌの酵素試料を、４倍希釈のマッキルベイン緩衝液、ｐＨ５中で２５０μｌのアゾカゼイン（０．２５％ｗ／ｖ；Ｓｉｇｍａ製）に添加し、振盪（８００ｒｐｍ）しながら４０℃において１５分間インキュベートした。５０μｌの２ＭのＴＣＡを添加し、２０，０００ｇにおいて５分間遠心分離することにより反応を終結させた。上清の１９５μｌの試料に、６５μｌの１ＭのＮａＯＨを添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を計測する。１単位のエンドプロテアーゼ活性は、４０℃において１５分間で０．１の吸光度の増加を生じさせる量と定義する。
実施例１に記載のとおり産生されたプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ試料は、エンドペプチダーゼ副活性を本質的に含まないことが見出された。実施例２Ａに記載の精製時、エンドペプチダーゼ副活性は実質的に検出されなかった。
Ｃ．ｐＨプロファイル
上記のＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ基質について記載されるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼアッセイを２０ｍＭのＮａ−グリシンの緩衝液（ｐＨ２．０、２．５、３．０、３．５および４．０）または２０ｍＭの酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ４．０、４．５および５．５）の使用に修正したものを使用してプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼＴＲＩ０８３（図２）およびＴＲＩ０４５（図２４）のｐＨプロファイルを測定した。ＴＲＩ０８３およびＴＲＩ０４５の最適ｐＨは、４．０であることが観察された
Ｄ．温度プロファイル
上記のプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼアッセイを、２５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０および８５℃の温度において使用した。プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼＴＲＩ０８３の最適温度は、５０℃であることが見出された一方、７０℃以上の温度において活性は見出されなかった（図３）。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼをエンドプロテアーゼ（Ａｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰ）との組合せで使用するタンパク質加水分解
酵素：Ａｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰおよびプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼＴＲＩ０８３を、実施例１に記載のとおり発現させる。
アッセイ緩衝液：５０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、３％のジメチルヘモグロビン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、３７℃、１時間のインキュベーション（ＭＴＰウェル当たり１００μｌの反応混合物）。
停止／発色試薬：１２５ｍＭのホウ酸Ｎａ ｐＨ８．６中０．０５％のトリニトロベンゼンスルホン酸（ウェル当たり２００μｌ）。
停止／発色試薬との約２０分間のインキュベーション後にＶｅｒｓａ ｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してプレートを４５０ｎｍにおいて読み取った。アッセイの結果（図４）は、エンドプロテアーゼ（Ａｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰ）をプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼとの組合せで使用する場合の相乗効果を示す。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼをエンドペプチダーゼとの組合せで用いるホエイタンパク質（ＷＰＩ）の加水分解
ホエイタンパク質加水分解のため、Ｌａｃｐｒｏｄａｎ−９２２４（Ａｒｌａ Ｆｏｏｄ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いた。２０％（ｗ／ｗ）のＷＰＩ懸濁液をＨ２Ｏｄ中で調製し、酢酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によりｐＨ４．０に調整した。微生物成長を防止するため、０．０２８５％（ｗ／ｗ）のＮａＮ３を添加した。２００μｌの容量のＷＰＩ懸濁液をマイクロタイタープレート（ＭＴＰ；ＶＷＲ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の９６ウェルのそれぞれの中に移した。続いて、５μｌのそれぞれの連続希釈されたペプチダーゼ、Ａｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＦＰ２およびプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（３ＰＰ＝ＴＲＩ０８３；添加される原液中０〜８７５０ｎｋａｔのＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ／ｍＬの活性）をそれぞれウェルに添加し、表１に示される投与量をもたらした。ＭＴＰを密封し、ｉＥＭＳインキュベーター／シェイカー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中において４０℃において配置した。２４時間のインキュベーションおよび４００ｒｐｍにおける振盪後、２０μｌの２Ｍのトリクロロ酢酸（ＴＣＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の添加により加水分解を停止させた。参照として、無添加の２０％のＷＰＩ（ｗ／ｗ）懸濁液を使用し、それをＷＰＩ加水分解と同一の様式で処理した。非加水分解沈殿ＷＰＩを濾過（０．２２μｍ）により除去した。濾過されたＷＰＩ加水分解物に対してｏ−フタルデヒド（ＯＰＡ）誘導体化をＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）に従ってわずかに修正して実施した。２５μｌの試料容量をウェルに移し、続いてリン酸緩衝液ｐＨ１１中で溶解された１７５μｌのＯＰＡ試薬を添加した。ＭＴＰリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中で３４０ｎｍにおいて計測された吸収を、パーセントの相対加水分解度（ＤＨ）に変換した。
６ＭのＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中で１００℃において２４時間加水分解された２０％（ｗ／ｗ）のＷＰＩ懸濁液は、参照（１００％のＤＨ）として機能した。
表１に示されるとおり、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼＡｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＦＰ２の組合せは、最良の加水分解度を与えた。エンドペプチダーゼへのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの補給は、一般に、ＴＲＩ０８３（配列番号１、配列番号２または配列番号２９）の添加なしよりも高いＤＨをもたらした。例えば、０．６％のＡｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＦＰ２への５ｕｌの２，１８８ｎｋａｔ／ｍｌのＴＲＩ０８３の添加は、２５．０％の加水分解度の増加をもたらした一方、１．２％（ｗ／ｗ）のＡｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＦＰ２への５ｕｌの８，３７５ｎｋａｔ／ｍｌのＴＲＩ０８３の補給は、ＤＨの２１．４％の増加をもたらした。
Figure 0006878275
３３ｍｅｒグリアジンペプチドの加水分解
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを、ＬＣ−ＭＳおよびラベルフリー定量によりアルファグリアジン（アルファ−２−グリアジン）から合成基質を加水分解するその能力について試験した。基質中の高いプロリン含有率に関係なく基質をトリペプチドに開裂することが見出された。
実験設定
３３ｍｅｒのグリアジン（アルファ−２−グリアジン）（ａａ５６〜８８）Ｈ−ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ−ＯＨ（Ｚｅｄｉｒａ ＧｍｂＨ；Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）Ｃ１９０Ｈ２７３Ｎ４３Ｏ４７（ＭＷ＝３９１１．４６）（１ｍｇ／ｍｌ；０．２６ｍＭ）を、２４℃において、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（０．０１ｍｇ／ｍｌのＴＲＩ０８３）の存在下で、１０００ｕｌの総容量の緩衝液（ｐＨ＝４．５）中でインキュベートした（基質／酵素比１００：１、ｗ／ｗ）。０、１、３、５、１０、１５および３０分後にそれぞれ２０ｕｌの５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によりアリコート（１００ｕｌ）の酵素反応を停止させた。次いで、試料を新たなバイアルに移し、ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計上で分析した。
データ収集、ラベルフリー定量およびＭＳ／ＭＳデータ分析
ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃハイブリッド質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にインターフェース接続されたＥａｓｙ ＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｄｅｎｓｅ，ＤＫ）を使用してナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。試料を、１０ｃｍ分析カラム（７５μｍ内径、３７５μｍ外径、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ Ｃ１８、３μｍ逆相粒子（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ，Ａｍｍｅｒｂｕｃｈ−Ｅｎｔｒｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が充填された）に接続された特注２ｃｍ捕捉カラム（１００μｍ内径、３７５μｍ外径、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ Ｃ１８、５μｍの逆相粒子（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ，Ａｍｍｅｒｂｕｃｈ−Ｅｎｔｒｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が充填された）上に鋼製ニードルによりロードした。分離は、ナノエレクトロスプレーイオン源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｄｅｎｓｅ，ＤＫ）中への０〜３４％の溶媒Ｂ（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＥ／ＨＣＯＯＨ（１００／８００／／１００／１ ｖ／ｖ／ｖ／ｖ））の１０分間の勾配を使用して３００ｎＬ／分の流速において実施した。ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃ機器をデータ依存的ＭＳ／ＭＳモードで操作した。ペプチド質量をＯｒｂｉｔｒａｐ（ＭＳスキャンは、６００００の分解能によりｍ／ｚ４００において得た）により計測し、最大強度ペプチドｍ／ｚを２つまで選択し、リニアイオントラップ（ＬＴＱ）中でＣＩＤを使用して断片化に供した。動的排除は、５００質量のリストサイズ、４０秒の持続時間、およびリスト上の質量に対して±１０ｐｐｍの排除質量幅により有効とした。
ＭＳ１強度を使用してクロマトグラムを構築し得るオープンソースプログラムＳｋｙｌｉｎｅ１．４．０．４４２１（ＭａｃＣｏｓｓ Ｌａｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３７２０ １５ｔｈ Ａｖｅ ＮＥ Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳから入手可能）によりＲＡＷファイルにアクセスした。プリカーサー同位体インポートフィルターを３つのカウント（Ｍ、Ｍ＋１，およびＭ＋２）に６０，０００の分解能において設定し、最大強度の電荷状態を使用した。２つの基質およびそれらの開裂産物のペプチド配列をＳｋｙｌｉｎｅ中にタイピングし、強度をそれぞれの試料において計算した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータは、ＧＰＭＡＷを使用して手作業でアノテートして断片化の理論値を計算した。
三重荷電質量のインタクトアルファ−２−グリアジンペプチドを単離し、経時的に追跡した。インタクトペプチドは、３分後に検出可能でなく、極めて急速に加水分解された（表２）。３３ｍｅｒアルファ−２−グリアジンペプチドの完全加水分解は、以下のトリペプチドを生じさせる：ＬＱＬ’ ＱＰＦ’ ＰＱＰ’ ＱＬＰ’ ＹＰＱ’ ＰＱＬ’ ＰＹＰ’ ＱＰＱ’ ＬＰＹ’ ＰＱＰ’ ＱＰＦ。アルファ−２−グリアジン基質からの４つのトリペプチドＬＱＬ、ＱＰＦ、ＰＱＰおよびＱＬＰの開裂から生じた中間産物ＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦが蓄積し、次いで減少することが見出された（表２）。
Figure 0006878275
予測されるトリペプチドの多くの蓄積が検出された。下線のトリペプチドが見出され、それらのＭＳ／ＭＳ断片化：ＬＱＬ’ ＱＰＦ’ ＰＱＰ’ ＱＬＰ’ ＹＰＱ’ ＰＱＬ’ ＰＹＰ’ ＱＰＱ’ ＬＰＹ’ ＰＱＰ’ＱＰＦに基づき確認された一方、ＱＰＦトリペプチドは、その質量に基づいてのみ見出された。
まとめると、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、高いプロリン含有率に関係なく基質アルファ−２−グリアジンをトリペプチドに連続的に開裂することが見出された。加水分解の間、プロリンは、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’およびＰ３’位にそれぞれ存在した。
これは、従来見出されたトリペプチジルペプチダーゼがＰ１位におけるプロリンもＰ１’位におけるプロリンも開裂しないこととは対照的である（ＵＳ７９７２８０８Ｂ２，ＵＳ５８２１１０４，Ｒｅｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．２００６，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７２，１７３９-１７４８）。
ＡＡＰＰＡペプチドの開裂
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを、ＬＣ−ＭＳおよびラベルフリー定量により合成基質ＡＡＰＰＡを加水分解するその能力について試験した。ペプチドＨ−ＡＡＰＰＡ−ＮＨ２（ＭＷ＝４２４．４９，Ｓｃｈａｆｅｒ−Ｎ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ製）を、２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ＝４．０中で溶解させた（１ｍｇ／ｍｌ）。１０００ｕｌのＨ−ＡＡＰＰＡ−ＮＨ２溶液を室温において２００ｕｌのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（ＴＲＩ０８３）溶液（４０ｕｇ／ｍｌ）（基質／酵素１００：０．８）とインキュベートした。７つの時点（０、５、１５、６０、１８０、７２０および１４４０分）において、１００ｕｌの試料を抜き出し、５０ｕｌ５％のＴＦＡにより希釈し、熱不活性化（８０℃において１０分間）させ、ＬＣ−ＭＳ分析まで−２０℃において保持した。
ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃハイブリッド質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にインターフェース接続されたＥａｓｙ ＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｄｅｎｓｅ，ＤＫ）を使用してナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。試料を、１０ｃｍ分析カラム（７５μｍ内径、３７５μｍ外径、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ Ｃ１８、３μｍ逆相粒子（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ，Ａｍｍｅｒｂｕｃｈ−Ｅｎｔｒｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が充填された）に接続された特注２ｃｍ捕捉カラム（１００μｍ内径、３７５μｍ外径、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ Ｃ１８、５μｍ逆相粒子（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ，Ａｍｍｅｒｂｕｃｈ−Ｅｎｔｒｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が充填された）上に鋼製ニードルによりロードした。分離は、ナノエレクトロスプレーイオン源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｄｅｎｓｅ，ＤＫ）中への０〜３４％の溶媒Ｂ（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＥ／ＨＣＯＯＨ（１００／８００／／１００／１ ｖ／ｖ／ｖ／ｖ））の１０分間の勾配を使用して３００ｎＬ／分の流速において実施した。ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃ機器をデータ依存的ＭＳ／ＭＳモードで操作した。ペプチド質量をＯｒｂｉｔｒａｐ（ＭＳスキャンは、６００００の分解能によりｍ／ｚ４００において得た）により計測し、最大強度ペプチドｍ／ｚを２つまで選択し、リニアイオントラップ（ＬＴＱ）中でＣＩＤを使用して断片化に供した。動的排除は、５００質量のリストサイズ、４０秒の持続時間、およびリスト上の質量に対して±１０ｐｐｍの排除質量幅により有効とした。
ＭＳ１強度を使用してクロマトグラムを構築し得るオープンソースプログラムＳｋｙｌｉｎｅ１．４．０．４４２１により、ＲＡＷファイルにアクセスした。プリカーサー同位体インポートフィルターを３つのカウント（Ｍ、Ｍ＋１、およびＭ＋２）に６０，０００の分解能において設定し、最大強度の電荷状態を使用した。プリカーサー同位体インポートフィルターを３つのカウント（Ｍ、Ｍ＋１，およびＭ＋２）に６０，０００の分解能において設定し、最も強度の高い電荷状態を使用した。基質および開裂産物のペプチド配列をＳｋｙｌｉｎｅ中にタイピングし、強度をそれぞれの試料において計算した。
分析は、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼがペプチドＡＡＰＰＡを経時的に分解し（図５）、産物ＡＡＰを生成し得ることを示し（図６）、そのことはＡＡＰＰＡ中のＰＰペプチド結合がプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼにより加水分解されることを示す。
β−ラクトグロブリンアレルギー性を低減させるためのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの使用
本実験は、キット：ＭＩｏＢＳ（Ｍｏｒｉａｎｇａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｙｏｋｏｈａｍａ，Ｊａｐａｎ．Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１７１ＬＧ）により供給されている「乳汁タンパク質ＥＬＩＳＡキット（β−ラクトグロブリン）」を使用して実施した。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ、エンドプロテアーゼならびにプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびエンドプロテアーゼの組合せによりβ−ラクトグロブリン溶液を処理することにより、潜在的なアレルギー性の低減を調査した。
緩衝液：５０ｍＭの酢酸塩、ｐＨ４．５
β−ラクトグロブリン溶液：緩衝液中１００μｇ／ｍｌ
酵素：プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼＴＲＩ０８３（緩衝液中４００００ｎｋａｔ／ｍｌ）およびＡｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰ（緩衝液中１００ＳＡＰＵ／ｍｌ）。
β−ラクトグロブリン溶液（１０００μＬ）をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中に装入し、４０℃に加熱した。２０μＬの緩衝液および５０μＬのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを添加し（ｔ＝０）、ピペットによりポンプ輸送することにより溶液を混合した。酵素の添加直後、５０μＬのアリコートを９５０μＬの氷冷試料抽出溶液（キットにより供給される）に移した。後続のアリコートを採取し、１時間、３時間、６時間および２４時間後に同一の手法で処理した。さらなる分析まで全ての試料を氷上で貯蔵した。２０μｌのＡｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰ＋５０μｌの緩衝液；２０μｌのＡｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰ＋５０μｌのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたは７０μｌの緩衝液（酵素なし）を使用して実験を繰り返した。キット中で供給されるプロトコル（手順の初期ステップとして全ての試料を抽出溶液中で室温において２４時間インキュベートすることを含む）を使用して全ての試料を分析した。
乳汁タンパク質ＥＬＩＳＡキット（β−ラクトグロブリン）を使用して、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼが、エンドプロテアーゼとの組合せで、アッセイ応答を低減させ得、それによりＡｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰを単独よりも顕著に大きな潜在的なアレルギー性を低減させ得ることが見出された。プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、単独で、アッセイ応答に対するわずかな効果のみを有した。
実施例３
材料および方法
１．コーンソイ飼料の酵素処理
飼料粉を２１２μｍ未満の粒径に篩にかけ、水中で１０％（ｗ／ｗ）のスラリーに懸濁させ、ｐＨをｐＨ３．５に調整した。次いで、Ｂｉｏｍｅｃｋ ＮＸロボットを用いるＡｇｉｌｅｎｔ０．５ｍＬ機器を使用して１３８μＬの１０％スラリーを９６ＭＴＰウェルプレート中でそれぞれのウェルに添加した。広口径チップを使用した。次いで、２０ｍＭの酢酸塩ｐＨ３．５中で試験すべきプロテアーゼを含有する２０μｌの酵素溶液を添加し、その後に水中で溶解させた１０μＬ（１．１４Ｕ／μＬ）ペプシンを添加した。プレートをｉＥＭＳインキュベーター／シェイカー中で１１５０ｒｐｍにおいて４０℃において４５分間インキュベートした。次いで、１Ｍの重炭酸Ｎａ中３４μＬのパンクレアチン１．１２６ｍｇ／ｍＬを添加し、プレートを４０℃においてｉＥＭＳ中で１１５０ｒｐｍにおいて６０分間インキュベートした。その後、プレートを５℃、４０００ｒｐｍにおいて１５分間遠心分離し、１０μＬの上清を、それぞれのウェル中で１９０μＬの水を含有する新たなプレート（ｃｏｒｎｉｎｇプレート＃３６４１ノンバインディング）に２０倍希釈で移した。得られたプレート（マスタープレート）を冷凍庫中で−２０℃において貯蔵した。
２．加水分解度計測
可溶性タンパク質の加水分解度（ＤＨ）を分析する方法は、第１級アミノ基とｏ−フタルジアルデヒドとの反応に基づく（ＯＰＡ−アッセイ）。参照文献：Ｐ．Ｍ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｄ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｃ．Ｄａｍｂｍａｎｎ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ．６６（２００１）６４２−６４６．
ＯＰＡアッセイのため、以下の手順を実施した。マスタープレートからの酵素により処理された１０〜２５μｌの飼料試料を新たなプレートに移し、次いでホウ酸ナトリウム、ドデシル硫酸塩およびジチオトレイトールを含有する１７５μｌのＯＰＡ試薬をプレートに添加した。３４０ｎｍにおける光学密度の終点計測を、２分および５秒間の混合直後に実施した。
ペプシンおよびパンクレアチンの存在下のコーンソイ飼料に対するＡｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰ（酸性プロテアーゼ）の効果。インビトロ試験。
コーンソイ飼料の組成を、下表に提示する（フィチン酸塩およびＩＰ５異性体を含むｍｙｏ−イノシトールリン酸エステル（ＩＰ１−５）と、乳タンパク質および鉄との相互作用ならびにペプシンの阻害）。Ｓ．Ｙｕ，Ａ．Ｃｏｗｉｅｓｏｎ，Ｃ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐ．Ｐｌｕｍｓｔｅａｄ ａｎｄ Ｓ．Ｄａｌｓｇａａｒｄ Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．９０（２０１２）１８２４−１８３２．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）．
Figure 0006878275
コーンソイ飼料を、ペプシンおよびパンクレアチンの存在下でＡｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰ（ＮＳＰ２４、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｆｏｏｄ Ｅｎｚｙｍｅｓにおいて入手可能）（本明細書において「ＡＦＰ」と称する）により、異なる濃度（コーンソイ飼料に対して４５０、１０００および１５００ｐｐｍ）において処理した（図８）。結果を以下に提示し；コーンソイ飼料ＤＨの改善のレベルは、それぞれ４．５、６．３および９．０％である。
実施例４
ペプシンおよびパンクレアチンの存在下、ならびにＡｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰの存在および不存在下のコーンソイ飼料に対するプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの効果。インビトロ試験。
これらの試験において、Ａｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰおよびプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼをそれぞれ１０００および４５０ｐｐｍの投与量においてのみ使用した。結果を表３に提示する。対照実験においては、ペプシンおよびパンクレアチンのみを使用した。加水分解の改善は、処理および対照間の比である。
Figure 0006878275
表３から把握することができるとおり、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、そのままではコーンソイタンパク質加水分解において十分な利益を与えない。Ａｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰの性能は、実施例３において提示される結果と類似する。しかしながら、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびＡｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰの組合せは最大結果を与え、エンドおよびエキソプロテアーゼの相乗作用に関連し得る。
実施例５
ペプシンおよびパンクレアチンの不存在下のコーンソイ飼料加水分解に対するエンドプロテアーゼとの組合せにおけるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの用量応答のバリデーション
本試験の目的は、酵素性能の起源を同定し、エンドおよびエキソプロテアーゼの考えられる相加または相乗性能を正確にモニタリングすることであった。この理由のため、実験をペプシンおよびパンクレアチンの不存在下で実施し、結果を図９にまとめる。
図９から把握することができるとおり、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼをエンドプロテアーゼと使用する場合の加水分解度は、極めて顕著である。この現象は、相乗作用であることが明らかである。それというのも、用量応答はプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼのレベルおよびエンドプロテアーゼの性質に依存するためである。Ａｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰの場合、効果はいっそうより顕著である。
実施例６
ペプシンおよびパンクレアチンの存在下のコーンソイ飼料加水分解に対する異なる投与量のＡｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰエンドプロテアーゼとの組合せにおけるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの用量応答のバリデーション
Ａｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰおよびプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ間の相乗作用のレベルを推定するため、異なる投与量の酵素を用い、ペプシンおよびパンクレアチンの存在下で実験を実施した。
図１０から把握することができるとおり、加水分解度のレベルは、組成物中のプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよびＡｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰの濃度に依存的でない。両方の酵素について、１０００ｐｐｍおよび２０００ｐｐｍの濃度が飽和レベルに対応する可能性が高い。しかしながら、処理時間が１００分から２００分に増加する場合に加水分解度は大幅に増加する。
実施例７
２０個のトリペプチジルペプチダーゼのｐＨ２．５、４０℃、６０分間におけるそれらの低ｐＨ安定性についての分析
単胃飼料原料中の酵素の利用のための要求として、酵素はより低いｐＨにおいて活性であるべきである。この理由のため、多数のトリペプチジルペプチダーゼを合成基質ＡＡＦ（Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ．ＢＡＣＨＥＭ，Ｌ−１０９５）に対するｐＨ２．５における反応について試験した。
トリペプチド基質ＡＡＦをＤＭＳＯ中２．５ｍｇ／ｍｌにおいて調製した。トリペプチジルペプチダーゼをブロスとして使用した。２．５μｌの酵素および９０μＬのグリシン酢酸−トリス緩衝液（それぞれの緩衝液構成成分は、５０ｍＭ、ｐＨ２．５における）を含有する反応混合物を９６ウェルインキュベーションプレート中で調製した。
インキュベーションプレートを混合し、４０℃において６０分間インキュベートした。次いで、５０μｌの０．２ＭのＭｅｓ−ＮａＯＨ ｐＨ６．０をそれぞれのウェルに添加し、６００ｒｐｍにおいて２分間混合した。その後、８５μｌの０．１Ｍの酢酸緩衝液、ｐＨ４．０および５μｌの２．５ｍｇ／ｍｌのＡＡＦ基質溶液を既に充填した９６ウェルアッセイプレートに５ｕｌのインキュベーション混合物を取った。
反応混合物を６００ｒｐｍにおいて２分間撹拌し、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中で４１０ｎｍにおいて３０℃において３０秒毎に１５分間直接読み取った。
初期酵素活性を計測するため、４０℃における６０分間の酵素インキュベーションのステップを除き類似手順を実施した。
初期および最終活性の計測の結果を、活性回収率とともに表４に提示する。
Figure 0006878275
表４から、トリペプチジルペプチダーゼの２０個の試料のうち１１個が、７０％を超える活性が保持されたため、ｐＨ２．５、４０℃、６０分間でかなり安定であることを把握することができる。最後の４つの試料は、同一分子（ＴＲＩ０７１）であり、２つの試料は、陰性対照であることに留意されたい。これらの結果から、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは低ｐＨにおいて安定であることを結論付けることができる。
結論
本試験は、単胃消化系を模倣する条件下でコーンソイベース飼料の加水分解におけるセリンエキソペプチダーゼのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼと、セリンエンドプロテアーゼのＦｏｏｄＰｒｏ（登録商標）３０Ｌおよびさらにはアスパラギン酸プロテアーゼＡｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＡＦＰとの相乗作用を実証した。多くのトリペプチジルペプチダーゼは低ｐＨにおいて安定であることも示され、飼料用途とみなすことができる。
実施例８
動物飼料中のプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ
合計２８８羽の１日齢Ｒｏｓｓ３０８雄ブロイラーを、商業孵化場から購入した。試験開始時、８羽の鶏を、ブロックごとのそれぞれ処理に従うバタリーケージにランダムに割り当てた。健常な鶏のみを実験に選択し、試験過程全体にわたり鶏は交換しなかった。本試験は、以下の処理からなるものであった（表５）：
Figure 0006878275
鶏体重を、試験開始時（０日目）、１４日目、および試験終了時（２１日目）において記録した。ケージは実験単位である。食餌はマッシュ形態で給餌し、ＣａおよびＡｖＰを除きＮＲＣ規格を満たし、または超えるように配合した（表５）。Ｄａｖｉｓ Ｓ−２０ミキサーを使用して全ての飼料を混合し、ミキサーをそれぞれの処理間にフラッシングしてレーション間の交差汚染を防止した。それぞれのバッチの初期、中期、終期からのそれぞれの処理食餌から試料を回収し、飼料中の酵素活性の分析のために一緒にミンチにした。
全ての鶏に、１４日目までコーンソイベースレーションを給餌し；１４日目から、処理レーションを給餌した。フィターゼを全ての処理レーションに添加した。飼料交換において、フィーダーをケージから取り出し、戻して秤量し、空にし、適切な処理食餌を再度充填した。試験の最終日（２１日目）、飼料および鶏を秤量して実験期間についての飼料摂取量（ＦＩ）および増体量（ＢＷＧ）を決定した。致死率についてペンを毎日確認した。鶏が廃棄され、または死亡が見出された場合、日付および除去重量（ｋｇ）を記録した。全ての死亡または廃棄された鶏に対して全体解剖を実施して考えられる死因を決定した。致死率について補正された飼料要求率（ＦＣＲ）を決定した。
２１日目、ケージ当たりの全ての鶏を、ペントバルビトンナトリウムの心臓内注射により麻酔し、下部回腸の内容物を蒸留水による穏やかなフラッシングにより排出させた。ケージ内の鶏からの消化物をプールし、食餌処理当たり８つの試料をもたらした。消化物試料を回収直後に冷凍し、凍結乾燥させ、加工した。食餌および消化物試料を、消化率係数の計算を可能とするためのマーカーの窒素（Ｎ）および総エネルギーについて分析した。
Figure 0006878275
統計的分析
データはＡＮＯＶＡを使用して分析し、平均分離（ｍｅａｎｓ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）を実施して異なる酵素および酵素投与量間の差を検定した。ケージを実験単位として使用した。
結果
Figure 0006878275
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの補給は、陰性対照および市販のプロテアーゼＢと比較してＦＣＲの顕著な低減を、ならびに市販のプロテアーゼＡと比較して数値低減をもたらした。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ補給は、ＮＣと比較してＢＷＧを顕著に増加させ、これは市販のプロテアーゼＡについても市販のプロテアーゼＢについては当てはまらなかった。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、対照および市販のプロテアーゼＡと比較して回腸Ｎ消化率％を顕著に増加させた（図１１）。プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、エネルギー消化も、陰性対照よりも顕著に高く、２つの市販のプロテアーゼよりも数値が高いレベルに顕著に増加させた（図１２）。
結論
まとめると、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの補給は、ＦＣＲおよびＢＷＧに関してＮＣおよび市販のプロテアーゼＢよりも顕著に良好な鶏性能をもたらした。市販のプロテアーゼＡと比較してプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを補給した場合にＢＷＧの数値増加およびＦＣＲの低減が存在した。
本発明者らにより推進された鶏性能の改善は、市販のプロテアーゼと比較してエネルギーおよびタンパク質（Ｎ）消化率を改善した。
実施例９
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ、アミノペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼ活性の測定
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼのため、発色ペプチドＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡを使用した。アッセイを以下のとおり実施し、２７．５μＬの適切に希釈された酵素を２００μｌのマッキルベイン緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ４．０）に添加した。５０℃における５分間のインキュベーション後、１２．５μＬの発色ペプチド溶液（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｅｎｍａｒｋ中で５ｍｇ／ｍＬに溶解）を反応混合物に添加した。５０μＬの０．５Ｍのトリクロロ酢酸（ＴＣＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を添加することにより反応を終結させた。遠心分離（１５，０００×ｇ、５分間）後、２４０μＬの溶液をマイクロタイタープレート（ＭＴＰ；Ｋｉｓｋｅｒ−ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に移し、吸収をＭＴＰリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中で４０５ｎｍにおいて計測した。１カタールのタンパク質分解活性を、毎秒１モルのｐ−ニトロアニリンを放出するために要求される酵素量と定義した。
アミノペプチダーゼ活性は、Ｓｔｒｅｓｓｌｅｒ，Ｅｉｓｅｌｅ ｅｔ ａｌ．２０１３に記載のとおり計測した。
エンドペプチダーゼ副活性は、実施例２に記載のとおりアゾカゼインを用いて計測した。
実施例１０
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび一般アミノペプチダーゼとの組合せでエンドペプチダーゼを用いるホエイタンパク質加水分解
組換えにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現され、Ｈｉｓタグ精製されたラクトバシルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１２０４６からの一般アミノペプチダーゼ（ＰｅｐＮ）を、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）加水分解に用いた（Ｓｔｒｅｓｓｌｅｒ，Ｅｉｓｅｌｅ ｅｔ ａｌ．２０１３）。適用されるＰｅｐＮは、科学文献における他のＰｅｐＮと同等の最適ｐＨ、温度範囲および配列特異性などの生化学的パラメータ（表８）を有し、したがって、原核および真核生物種からの一般アミノペプチダーゼの代表である。
Figure 0006878275
ＷＰＩ加水分解において適用されたＰｅｐＮは、それぞれアゾカゼインアッセイまたはＰｅｐＸのための基質としてのＨ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡのいずれかによりアッセイされたエンドペプチダーゼおよびＸ−プロリル−ジペプチジル（ＰｅｐＸ）副活性を含まなかった。
ホエイタンパク質加水分解のため、Ｌａｃｐｒｏｄａｎ−９２２４（Ａｒｌａ Ｆｏｏｄ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用い、１５％（ｗ／ｗ）のＷＰＩ懸濁液をＨ２Ｏｄ中で調製し、酢酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によりｐＨ４．５に調整した。微生物増殖を防止するため、０．０２８５％（ｗ／ｗ）のＮａＮ３を添加した。エキソペプチダーゼ加水分解前、１％（ｗ／ｗＷＰＩ適用）のＡｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＦＰ２を添加してＷＰＩの加水分解を開始してエキソペプチダーゼ（トリペプチジルペプチダーゼおよび一般アミノペプチダーゼ）のための基質を生成した。２００μｌの容量のＷＰＩ懸濁液をマイクロタイタープレート（ＭＴＰ；ＶＷＲ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の９６ウェルのそれぞれの中に移した。続いて、５μｌの連続希釈されたＰｅｐＮ（０〜１５７２ｎｋａｔＨ−Ａｌａ−ｐＮＡ／ｍＬ）およびプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（０〜７０，０００ｎｋａｔＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ／ｍＬ）をそれぞれのウェルに添加した。次いで、ＭＴＰを密封し、インキュベーター（ｉＥＭＳインキュベーター／シェーカーＨＴ，Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中に装入し、それを４０℃においてインキュベートした。４００ｒｐｍにおける２４時間のインキュベーション後、２０μｌの２Ｍのトリクロロ酢酸（ＴＣＡ；Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の添加により加水分解を停止させた一方、参照（０時間）にはエンドおよびエキソペプチダーゼ添加前にＴＣＡを添加した。非加水分解沈殿ＷＰＩを濾過（０．２２μｍ；Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５０４フィルタープレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＵＳＡ）により除去した。濾過されたＷＰＩ加水分解物をｏ−フタルデヒド（ＯＰＡ）誘導体化（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００１）に用いた。ＯＰＡ誘導体化は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）に従ってわずかに修正して実施した。２５μｌの試料容量をウェルに移し、リン酸三ナトリウム十二水和物を含有する１７５μｌのＯＰＡ試薬を添加した。ＭＴＰリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中で３４０ｎｍにおいて計測された吸収は、場合により、パーセントの相対加水分解度（ＤＨ）に変換した一方、１５％（ｗ／ｗ）のＷＰＩ懸濁液を６ＭのＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中で調製し、１００℃において２４時間保持した。１５％（ｗ／ｗ）のＷＰＩの酸加水分解物は、加水分解度の計算のための参照（１００％のＤＨ）として機能した。
図１３は、異なるエンドおよびエキソペプチダーゼ組合せを用いた２４時間にわたるセリン当量（ＳＥ）として表現されるフリーアルファアミノ基の増加を示す。ＳＥの最小の増加は、エンドペプチダーゼの単独添加について測定され、エンドペプチダーゼおよびペプチドのＮ末端終端部からトリペプチドを放出させるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（ＴＲＩ０８３）の組合せがそれに続いた。プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼＴＲＩ０８３が、その遊離したトリペプチドにより阻害される産物であるという事実に起因して、ＳＥの増加はそれほど高くない。組換え発現され、Ｈｉｓタグ精製されたラクトバシルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１２０４６からの一般アミノペプチダーゼ（ＰｅｐＮ）のエンドペプチダーゼへの補給は、フリーアミノ酸の遊離に起因してＳＥの顕著な増加をもたらした（図１３）。エンドペプチダーゼ、ＴＲＩ０８３およびＰｅｐＮの組合せ適用は、エンドペプチダーゼおよびＴＲＩ０８３ならびにエンドペプチダーゼおよびＰｅｐＮの添加と比較して４３．５％の顕著に高いフリーアルファアミノ基の放出をもたらした（図１３）。
エンドペプチダーゼ、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび一般アミノペプチダーゼ（ＰｅｐＮ）の相加効果のまとめを表９に示す。
Figure 0006878275
実施例１１
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（ＴＲＩ０８３）および一般アミノペプチダーゼ（ＰｅｐＮ）との組合せでエンドペプチダーゼを用いるカゼイン加水分解
５％（ｗ／ｗ）のカゼイン酸ナトリウム溶液の加水分解を実施例２にホエイタンパク質加水分解について記載されるものと同一の設定で実施し、但し、５％（ｗ／ｗ）のカゼイン酸ナトリウム（Ａｒｌａ Ｆｏｏｄｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いた。表１０に示されるとおり、ＰｅｐＮまたはＴＲＩ０８３の適用される活性とは独立して、測定されたセリン当量（ＳＥ）は、エンドペプチダーゼへのＴＲＩ０８３添加またはエンドペプチダーゼへのＰｅｐＮの添加のいずれによっても増加し得た。
さらに、高いＰｅｐＮおよび高いＴＲＩ０８３投与量について相乗効果が観察された（表１１）。ＰｅｐＮ活性が７８６から１５７２ｎｋａｔ／ｍＬに２倍になることにより、１０ｍＭのセリン当量のかなり小さい増加をもたらした一方、１７，５００ｎｋａｔ／ｍＬのＴＲＩ０８３の適用によりＳＥが１８ｍＭだけ増加した。ＴＲＩ０８３およびＰｅｐＮの１７，５００および１，５７２ｎｋａｔ／ｍＬにおける両方の適用は、９７ｍＭのＳＥの増加をもたらした。これは、エンドペプチダーゼに対するＴＲＩ０８３およびＰｅｐＮの単独添加の合計と比較して２１％のＳＥ値増加に対応する。
Figure 0006878275
実施例１２
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼおよび部分不活性化Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ５００との組合せでエンドペプチダーゼを用いるカゼイン加水分解
カゼイン酸ナトリウム加水分解を実施例１０に記載のとおり実施し、但し、精製ＰｅｐＮに代えて部分不活性化Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ５００（ＦＺ５００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を適用した。エンドペプチダーゼを不活性化させるため、ＦＺ５００を加熱処理した（５５℃、２４時間）。エンドペプチダーゼ活性は、顕著に低減した（９６％の不活性化、４％の残留活性）。ＦＺ５００の加熱処理後、約９７％の残留ＰｅｐＮ活性が測定された。
Figure 0006878275
表１１に示されるとおり、エンドペプチダーゼ、またはいくつかのエキソペプチダーゼ（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ５００（ＦＺ５００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｅｎｍａｒｋ））が補給されたエンドペプチダーゼのいずれかへのＴＲＩ０８３の添加は、両方について、セリン当量値の増加をもたらし、そのことは、エキソペプチダーゼ、例えば、ＦＺ５００の複合混合物を用いて生産された加水分解物の加水分解度は、トリペプチジルペプチダーゼ（例えば、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ）を適用することにより増加させることができることを示唆した。
実施例１３
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼホモログとの組合せでエンドペプチダーゼを用いるホエイタンパク質加水分解（ＷＰＩ）
ＷＰＩ加水分解のため、Ｌａｃｐｒｏｄａｎ−９２２４（Ａｒｌａ Ｆｏｏｄ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用い、１５％（ｗ／ｗ）のＷＰＩ懸濁液をＨ２Ｏｄ中で調製し、酢酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によりｐＨ４．５に調整した。微生物増殖を防止するため、０．０２８５％（ｗ／ｗ）のＮａＮ３を添加した。続いて、１％（ｗ／ｗ）のＡｌｐｈａｌａｓｅ（登録商標）ＦＰ２を添加し、２００μｌの容量のＷＰＩ懸濁液をマイクロタイタープレート（ＭＴＰ；ＶＷＲ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の９６ウェルのそれぞれの中に移した。これに続き、０または４３７５ｎｋａｔＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ／ｍＬのいずれかを含有する５μｌのそれぞれのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼホモログをＭＴＰの特定のウェルに添加した。次いで、ＭＴＰを密封し、４０℃におけるインキュベーター（ｉＥＭＳ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ／ｓｈａｋｅｒ ＨＴ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中に装入した。
２４時間のインキュベーションおよび４００ｒｐｍにおける振盪の後、加水分解を２０μｌの２Ｍのトリクロロ酢酸（ＴＣＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の添加により停止させ、但し、参照（０時間）にはエンドおよびエキソペプチダーゼ添加前にＴＣＡを添加した。非加水分解沈殿ＷＰＩを濾過（０．２２μｍ；Ｃｏｒｎｉｎｇ３５０４フィルタープレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＵＳＡ）により除去した。濾過されたＷＰＩ加水分解物をｏ−フタルデヒド（ＯＰＡ）誘導体化（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００１）に用いた。ＯＰＡ誘導体化は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）に従ってわずかに修正して実施した。２５μｌの試料容量をウェルに移し、続いてリン酸三ナトリウム十二水和物中で溶解させた１７５μｌのＯＰＡ試薬を添加した。セリン較正曲線（０〜２ｍＭ）を用いてＭＴＰリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中で３４０ｎｍにおいて計測された吸収をセリン当量に変換した。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼＴＲＩ０７１（配列番号１２または配列番号３９）は、参照（エンドペプチダーゼ）と比較して計測セリン当量を経時的に顕著に増加させた。ＳＥの相対増加は、７時間の加水分解後にそれぞれＴＲＩ０７１について約６４％であった（図１４）。
実施例１４
天然トリペプチド（Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ）によるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（ＴＲＩ０８３）の産物阻害
実施例８に記載のアッセイにおいてＴＲＩ０８３および基質としてのＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ（０−２０００ｎＭ）を用いて阻害実験を実施した。アッセイは、阻害剤を用いず、３．６ｍＭのトリペプチド（Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ；Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、１８ｍＭのジペプチド（Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ；Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）または１８ｍＭのアラニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて実行した。曲線フィッティングおよび阻害分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０２ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ，ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ，ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍを使用して競合阻害剤としてのＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨおよびアラニンを処理することにより行った。
トリペプチドＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨについて、０．３４ｍＭのＫｉの強力な阻害が見出された一方、ジペプチドＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨは、４０ｍＭのＫｉの極めて弱い阻害のみを示した。アラニンは、全く阻害を示さなかった。
実施例１５
一般アミノペプチダーゼ（ＰｅｐＮ）により前加水分解された天然トリペプチド（Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ）によるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（ＴＲＩ０８３）の産物阻害の減少
阻害実験を実施例１４に記載のとおり設定した。さらに、１ｍｇ／ｍＬのＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、１２．５倍希釈のマッキルベイン緩衝液（ｐＨ４．０）中で一般アミノペプチダーゼ（ＰｅｐＮ）加水分解に４０℃において２４時間供した。このため、１．２ｍｇ／ｍＬのＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨを、８ｍＬの１０倍希釈のマッキルベイン緩衝液（ｐＨ４．０）中で溶解させ、１０ｍＬまで精製ＰｅｐＮ（１，５７２ｎｋａｔ／ｍＬ［ｐＨ６．５］）を充填した。２４時間の加水分解後、ＰｅｐＮの熱不活性化（９０℃；１０分間）によりＰｅｐＮ加水分解を終結させた。Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨの前加水分解度は、ガスクロマトグラフィー（Ｈｕｓｅｋ，１９９１；ＦＥＢＳ−Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８０，３５４−３５６）により測定した。約０．１８ｍｇ／ｍＬのアラニンが計測され、それは最初に適用されたＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨの約５４％の加水分解に対応する。
続いて、ＴＲＩ０８３を、阻害剤を用いない産物阻害、１ｍｇ／ｍＬのＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨを用いる産物阻害、さらにはＰｅｐＮにより前加水分解されたＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ（１ｍｇ／ｍＬ）を用いる産物阻害について分析した。
図１５に示されるとおり、前加水分解Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨは、０．８ｍＭのＫｉを有することが見出された。これは、既に測定されたＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨの０．３４ｍＭのＫｉと良好に一致する。それというのも、Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨの半数よりもわずかに多くが、Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨおよびアラニンに前加水分解されたためである。これは、一般アミノペプチダーゼが、トリペプチドをジペプチドおよびフリーアミノ酸に開裂することによりプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼの産物阻害を低減し得ることを示す。
実施例１６
牛乳アレルギー（ＣＭＡ）中のβ−ラクトグロブリンペプチドの免疫原性の低減におけるプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ
加水分解手順の説明
１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中のβ−ラクトグロブリン（１ｍｇ／ｍｌ）を、トリプシン（１０ｕｇ／ｍｌ）により２５℃において２４時間加水分解した。２４時間後、８０℃まで１５分間加温することによりトリプシンを不活性化させた。
使用されるβ−ラクトグロブリンは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 0006878275
１０ｍＭのトリスＨＣＬ−ｐＨ４．０中のトリプシン処理β−ラクトグロブリン加水分解物（１ｍｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液ｐＨ４．０中で５倍希釈した。２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ４．０中１００ｕｌのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼＴＲＩ０８３溶液（８０ｕｇ／ｍｌ）を、１ｍｌの５倍希釈β−ラクトグロブリン溶液（２００ｕｇ／ｍｌ）に添加することにより加水分解を開始し、室温においてインキュベートした。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼによるタンパク質分解は、１、５、１５、３０、６０、１２０、および１８０分後ならびに２４時間後に５％のＴＦＡ（５０ｕｌ）を１００ｕｌのβ−ラクトグロブリン溶液に添加することにより終結させた。プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、８０℃において１０分間熱不活性化させた。溶液をさらなるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析まで−２０℃において貯蔵した。
ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃハイブリッド質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にインターフェース接続されたＥａｓｙ ＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｄｅｎｓｅ，ＤＫ）を使用してナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。試料を、１０ｃｍ分析カラム（７５μｍ内径、３７５μｍ外径、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ Ｃ１８、３μｍ逆相粒子（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ，Ａｍｍｅｒｂｕｃｈ−Ｅｎｔｒｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が充填された）に接続された特注２ｃｍ捕捉カラム（１００μｍ内径、３７５μｍ外径、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ Ｃ１８、５μｍ逆相粒子（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ，Ａｍｍｅｒｂｕｃｈ−Ｅｎｔｒｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が充填された）上に鋼製ニードルによりロードした。ナノエレクトロスプレーイオン源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｄｅｎｓｅ，ＤＫ）中への０〜３４％の溶媒Ｂ（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＥ／ＨＣＯＯＨ（１００／８００／／１００／１ ｖ／ｖ／ｖ／ｖ））の１０分間の勾配を使用して３００ｎＬ／分の流速において分離を実施した。ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃ機器をデータ依存的ＭＳ／ＭＳモードで操作した。ペプチド質量をＯｒｂｉｔｒａｐ（ＭＳスキャンは、６００００の分解能によりｍ／ｚ４００において得た）により計測し、最大強度ペプチドｍ／ｚを２つまで選択し、リニアイオントラップ（ＬＴＱ）中でＣＩＤを使用して断片化に供した。動的排除は、５００質量のリストサイズ、４０秒の持続時間、およびリスト上の質量に対して±１０ｐｐｍ排除質量幅により有効とした。
ＭＳ１強度を使用してクロマトグラムを構築し得るオープンソースプログラムＳｋｙｌｉｎｅ１．４．０．４４２１によりＲＡＷファイルにアクセスした。プリカーサー同位体インポートフィルターを３つのカウント（Ｍ、Ｍ＋１、およびＭ＋２）に６０，０００の分解能において設定し、最大強度の電荷状態を使用した。基質および開裂産物のペプチド配列をＳｋｙｌｉｎｅ中にタイピングし、強度をそれぞれの試料において計算した。
結果
図１６〜２１に示されるとおり、トリプシン処理されたβ−ラクトグロブリンはプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼにより効率的に加水分解された。特に、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、極めて広い基質特異性を有し、Ｐ１位におけるプロリン（図１７）およびＰ１におけるグリシン（図２１）を有するペプチドを開裂し得た。
実施例１７
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼによるベータ−カゼインの加水分解
β−カゼインをトリプシンにより最初に加水分解してから、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼによる開裂に供した。１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ＝８．０中のβ−カゼイン（１ｍｇ／ｍｌ）を室温においてトリプシン（１０ｕｇ／ｍｌ）により２４時間加水分解し、次いで８０℃まで１５分間加温することにより不活性化させた。
１０ｍＭのトリスＨＣＬ−ｐＨ４．０中のトリプシン処理β−カゼイン加水分解物（１ｍｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液ｐＨ４．０中で５倍希釈した。加水分解は、２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ４．０中１００ｕｌのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼＴＲＩ０８３溶液（８０ｕｇ／ｍｌ）を、１ｍｌの５倍希釈β−カゼイン溶液（２００ｕｇ／ｍｌ）に添加することにより開始し、室温においてインキュベートした。
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼによるタンパク質分解は、５％のＴＦＡ（５０ｕｌ）を１００ｕｌのβ−カゼイン溶液に添加することにより１、５、１５、３０、６０、１２０、および１８０分ならびに２４時間後に終結させた。プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、８０℃において１０分間熱不活性化させた。溶液は、実施例１６に記載のとおり実施されるさらなるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析まで−２０℃において貯蔵した。
使用されるベータ−カゼインは、以下のアミノ酸配列を有した：
Figure 0006878275
結果
β−カゼインのトリプシン消化から生じるペプチドＧＰＦＰＩＩＶは、極めて疎水性であり、苦味が強い。図２２は、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼがＰ’１位およびＰ２位のプロリンを有するこのペプチドを効率的に消化し得ることを示す。図２３は、ペプチドＨＫＥＭＰＦＰＫもプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼにより効率的に消化されることを示す。
実施例１８
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼによるブラジキニンペプチドの分解
ブラジキニン（ＲＰＰＧＦＳＰＦＲ；ＭＷ１６６０，２１；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製のＢ２２５９）を２０ｍＭのマッキルベイン緩衝液（ｐＨ４．５）中で１ｍｇ／ｍｌにおいて溶解させた。プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼＴＲＩ０８３（１０ｕｇ）をペプチド溶液に添加した。加水分解は、１、３、５、１５、３０、および６０分ならびに２０時間後に５％のＴＦＡ（５０ｕｌ）の１００ｕｌの溶液への添加により終結させた。プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、８０℃において１０分間熱不活性化させた。溶液を、実施例１６に記載のとおり実施されるさらなるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析まで−２０℃において貯蔵した。
結果
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、アミノ酸配列ＲＰＰＧＦＳＰＦＲを有するブラジキニンペプチドを効率的に消化する（図２４参照）。これは、プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼがＰ１およびＰ２位のプロリンを有する基質を分解し得ることを示し、その特徴はトリペプチジルペプチダーゼについて非常に驚くべきことである。
実施例１９
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼＴＲＩ０７９によるＡＡＸＦ−ＮＨ２基質の加水分解
加水分解手順およびＬＣ−ＭＳ分析の説明
ＡＡＸＦ−ＮＨ２基質ライブラリー（Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎにより合成）（Ｘは、ＣｙｓおよびＭｅｔを除く全てのアミノ酸を表す）を２０ｍＭのマッキルベイン緩衝液、ｐＨ４．５中で可溶化した（１ｍｌ中１ｍｇ）。ペプチド溶液を、実施例１に記載のとおり産生されたＴＲＩ０７９（配列番号５７）、１０ｕｌの１ｍｇ／ｍｌにより２５℃において１または２時間加水分解した。続いて、５％のＴＦＡ（５０ｕｌ）の５０ｕｌのペプチド溶液への添加により加水分解を停止させた。溶液をさらなるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析まで−２０℃において貯蔵した。
ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃハイブリッド質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にインターフェース接続されたＥａｓｙ ＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｄｅｎｓｅ，ＤＫ）を使用してナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。試料を、１０ｃｍ分析カラム（７５μｍ内径、３７５μｍ外径、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ Ｃ１８、３μｍ逆相粒子（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ，Ａｍｍｅｒｂｕｃｈ−Ｅｎｔｒｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が充填された）に接続された特注２ｃｍ捕捉カラム（１００μｍ内径、３７５μｍ外径、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ Ｃ１８、５μｍ逆相粒子（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ，Ａｍｍｅｒｂｕｃｈ−Ｅｎｔｒｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が充填された）により鋼製ニードルによりロードした。ナノエレクトロスプレーイオン源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｄｅｎｓｅ，ＤＫ）中への０〜３４％の溶媒Ｂ（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＥ／ＨＣＯＯＨ（１００／８００／／１００／１ ｖ／ｖ／ｖ／ｖ））の１０分間の勾配を使用して３００ｎＬ／分の流速において分離を実施した。ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃ機器をデータ依存的ＭＳ／ＭＳモードで操作した。ペプチド質量をＯｒｂｉｔｒａｐ（ＭＳスキャンは、６００００の分解能によりｍ／ｚ４００において得た）により計測し、最大強度ペプチドｍ／ｚを２つまで選択し、リニアイオントラップ（ＬＴＱ）中でＣＩＤを使用して断片化に供した。動的排除は、５００質量のリストサイズ、４０秒の持続時間、およびリスト上の質量に対して±１０ｐｐｍの排除質量幅により有効とした。
ＭＳ１強度を使用してクロマトグラムを構築し得るオープンソースプログラムＳｋｙｌｉｎｅ１．４．０．４４２１によりＲＡＷファイルにアクセスした。プリカーサー同位体インポートフィルターを３つのカウント（Ｍ、Ｍ＋１、およびＭ＋２）に６０，０００の分解能において設定し、最大強度の電荷状態を使用した。基質および開裂産物のペプチド配列をＳｋｙｌｉｎｅ中にタイピングし、強度をそれぞれの試料において計算した。
結果
ＬＣ−ＭＳ分析は、ＴＲＩ０７９が、どのアミノ酸がＰ１に存在するかに関係なく全てのＡＡＸＦ−ＮＨ２ペプチドをトリペプチドに開裂し得ることを示した。Ｐ１に存在するプロリンの場合、開裂産物ＡＡＰが経時的に増加することが観察され、そのことはＴＲＩ０７９がＰ１位のプロリンに耐性であることを示した。
実施例２０
エンドペプチダーゼおよび一般アミノペプチダーゼＰｅｐＮとの組合せでプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼＴＲＩ０７９を用いるホエイタンパク質加水分解（ＷＰＩ）
ＷＰＩ加水分解のため、Ｌａｃｐｒｏｄａｎ−９２２４（Ａｒｌａ Ｆｏｏｄ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用い、１５％（ｗ／ｗ）のＷＰＩ懸濁液をＨ２Ｏｄ中で調製し、水酸化ナトリウムによりｐＨ６に調整した。微生物増殖を防止するため、０．０２８５％（ｗ／ｗ）のＮａＮ３を添加した。続いて、０．５％（タンパク質基質に対するｗ／ｗ）のＦｏｏｄ Ｐｒｏ（登録商標）アルカリ性プロテアーゼおよび０．５％（タンパク質基質に対するｗ／ｗ）のＦｏｏｄ Ｐｒｏ（登録商標）ＰＮＬを添加し、２００μｌの容量のＷＰＩ懸濁液をマイクロタイタープレート（ＭＴＰ；ＶＷＲ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の９６ウェルのそれぞれに移した。これに続き、０または２１８８ｎｋａｔ／ｍＬのいずれかを含有する５μｌのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼＴＲＩ０７９および０、１９７または３９３ｎｋａｔ／ｍＬのいずれかを含有する５ｕｌのＰｅｐＮ（実施例１０に記載）を、ＭＴＰの特定のウェルに添加した。次いで、ＭＴＰを密封し、５０℃におけるインキュベーター（ｉＥＭＳインキュベーター／シェイカーＨＴ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中に装入した。
２４時間のインキュベーションおよび４００ｒｐｍにおける振盪後、２０μｌの２Ｍのトリクロロ酢酸（ＴＣＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の添加により加水分解を停止させ、但し、参照（０時間）にはエンドおよびエキソペプチダーゼ添加前にＴＣＡを添加した。非加水分解沈殿ＷＰＩを濾過（０．２２μｍ；Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５０４フィルタープレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＵＳＡ）により除去した。濾過されたＷＰＩ加水分解物をｏ−フタルデヒド（ＯＰＡ）誘導体化（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００１）に用いた。ＯＰＡ誘導体化は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）に従ってわずかに修正して実施した。２５μｌの試料容量をウェルに移し、続いてリン酸三ナトリウム十二水和物中で溶解させた１７５μｌのＯＰＡ試薬を添加した。セリン較正曲線を用いてＭＴＰリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中で３４０ｎｍにおいて計測された吸収をセリン当量に変換した（０〜２ｍＭ）。
表１２に示されるとおり、トリペプチジルアミノペプチダーゼＴＲＩ０７９（配列番号５７）およびＰｅｐＮは、エンドペプチダーゼのみを用いる参照と比較して計測加水分解度を強力に増加させた。ＴＲＩ０７９およびＰｅｐＮを組み合わせた場合に加水分解度の相加的増加が得られた。
Figure 0006878275
実施例２１
プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼＴＲＩ０７９によるＡＡＦＰＡ−ＮＨ２基質の加水分解
加水分解手順およびＬＣ−ＭＳ分析の説明
ＡＡＦＰＡ−ＮＨ２基質（Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎにより合成）を２０ｍＭのマッキルベイン緩衝液、ｐＨ４．５中で可溶化させ（１ｍｌ中１ｍｇ）、実施例１に記載のとおり産生されたＴＲＩ０７９（１０ｕｌの１ｍｇ／ｍｌのＴＲＩ０７９溶液）により２５℃において８時間まで加水分解した。続いて、５％のＴＦＡ（５０ｕｌ）の５０ｕｌのペプチド溶液への添加により加水分解を停止させた。溶液をさらなるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析まで−２０℃において貯蔵した。
ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃハイブリッド質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にインターフェース接続されたＥａｓｙ ＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｄｅｎｓｅ，ＤＫ）を使用してナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。試料を、１０ｃｍ分析カラム（７５μｍ内径、３７５μｍ外径、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ Ｃ１８、３μｍ逆相粒子（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ，Ａｍｍｅｒｂｕｃｈ−Ｅｎｔｒｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が充填された）に接続された特注２ｃｍ捕捉カラム（１００μｍ内径、３７５μｍ外径、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ Ｃ１８、５μｍ逆相粒子（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ，Ａｍｍｅｒｂｕｃｈ−Ｅｎｔｒｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が充填された）により鋼製ニードルによりロードした。ナノエレクトロスプレーイオン源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｄｅｎｓｅ，ＤＫ）中への０〜３４％の溶媒Ｂ（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＥ／ＨＣＯＯＨ（１００／８００／／１００／１ ｖ／ｖ／ｖ／ｖ））の１０分間の勾配を使用して３００ｎＬ／分の流速において分離を実施した。ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｃｌａｓｓｉｃ機器をデータ依存的ＭＳ／ＭＳモードで操作した。ペプチド質量をＯｒｂｉｔｒａｐ（ＭＳスキャンは、６００００の分解能によりｍ／ｚ４００において得た）により計測し、最大強度ペプチドｍ／ｚを２つまで選択し、リニアイオントラップ（ＬＴＱ）中でＣＩＤを使用して断片化に供した。動的排除は、５００質量のリストサイズ、４０秒の持続時間、およびリスト上の質量に対して±１０ｐｐｍの排除質量幅により有効とした。
ＭＳ１強度を使用してクロマトグラムを構築し得るオープンソースプログラムＳｋｙｌｉｎｅ１．４．０．４４２１によりＲＡＷファイルにアクセスした。プリカーサー同位体インポートフィルターを３つのカウント（Ｍ、Ｍ＋１、およびＭ＋２）に６０，０００の分解能において設定し、最大強度の電荷状態を使用した。基質および開裂産物のペプチド配列をＳｋｙｌｉｎｅ中にタイピングし、強度をそれぞれの試料において計算した。
結果
ＬＣ−ＭＳ分析は、経時的なＡＡＦＰＡ−ＮＨ２の低減およびＡＡＦの蓄積を示し、そのことはＴＲＩ０７９がＡＡＦＰＡ−ＮＨ２を加水分解し得、Ｐ１’位のプロリンに耐性であることを示した。
実施例２２
ペプシン存在下のＴＲＩ０４５（配列番号９９）トリペプチジルペプチダーゼの安定性
材料および方法
ペプシン溶液：本実施例において、Ｓｉｇｍａ製の肉豚ペプシン（Ｐ７０００、６７４Ｓｉｇｍａ単位／ｍｇ、ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ．ｃｏｍ）を使用し、ＭｉｌｌｉＱ水中で１００００Ｓｉｇｍａ単位／ｍｌにおいて、１００００Ｓｉｇｍａ単位／ｍＬにおいて調製した。
プレインキュベーション混合物は、２．５μｌのＴＲＩ０４５試料、９５μｌのＧＡＴ緩衝液（５０ｍＭのグリシン−５０ｍＭの酢酸−５０ｍＭのトリス、ｐＨ３．５）、ｍｉｌｌｉＱ水中の５μｌのペプシン（１００００Ｓｉｇｍａ単位／ｍｌ）（最終ペプシン単位濃度：反応混合物１ｍｌ当たり５００Ｓｉｇｍａ単位）をハーフボトムエリア９６ウェルＣｏｒｎｉｎｇ ＭＴＰ中で含有した。対照のため、プレインキュベーション混合物は、５μｌのペプシンに代えて５μｌの水を含有した。混合物を４０℃において６０分間インキュベートし、次いで氷上で保持した。残留活性をアッセイするため、アッセイ混合物は、プレインキュベーション混合物５μｌ、０．１Ｍの酢酸−酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）８５μｌ、ＢＡＣＨＥＭ．ｃｏｍ製の５μｌのＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ（２．５ｍｇ／ｍｌ）（Ｌ−１０９５．０２５０）を含有した。次いで、４１０ｎｍの読取りを、マイクロプレートリーダー中で０．５分毎に３０ｏＣ、Ｎ＝２において行った。
結果
アッセイ条件および４０℃における６０分間のプレインキュベーション下、残留活性は、プレインキュベーション混合物１ｍＬ当たり５００単位のペプシンの存在下でＴＲＩ０４５について９０％を超えることが見出された。
実施例２３
飼料タンパク質加水分解を促進するための飼料酵素としてのＴＲＩ０４５（配列番号９９）
動物は、飼料消化のためにその消化管中にプロテアーゼを生産および分泌する。これらのプロテアーゼとしては、ペプシン、トリプシンおよびキモトリプシンのエンドプロテアーゼならびにカルボキシペプチダーゼＡおよびＢのエキソペプチダーゼなどが挙げられる。しかしながら、動物は、消化酵素としてアミノペプチダーゼを生産せず、または少なくとも認識可能な量で生産しない。本実施例において示されるとおり、トリペプチジルペプチダーゼＴＲＩ０４５（セドリシン）の添加は、コーンソイベース飼料についてのインビトロ系中でタンパク質消化を促進する。本実施例は、ＴＲＩ０４５がｐＨ４から６．５で高い活性を有したことを示す。
材料および方法
セドリシンのためのトリペプチド基質Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ（ＢＡＣＨＥＭ．ｃｏｍ製のＡＡＦ−ｐＮＡ、Ｌ−１０９５．０２５０）を、ＤＭＳＯ中で２．５ｍｇ／ｍｌにおいて調製した。反応物は、８．５μｌのＡＡＦ−ｐＮＡ、７μｌのＤＭＳＯ、３２μｌの水およびｐＨ４．１４〜６．５７の５０μｌの緩衝液、ならびに０．８μｌまたは１．５ｕｌのＴＲＩ０４５を混合することにより調製した。反応は、酵素ＴＲＩ０４５の添加により３０℃において開始した。マイクロプレートリーダーを使用して０．５分間隔毎に４１０ｎｍにおいて９６ウェルプレート中で初期反応速度を記録した。
結果
表１３は、ＴＲＩ０４５が約ｐＨ５．０において最適な活性を有したが、胃飼料消化に理想的である約ｐＨ４およびｐＨ６．５において依然として５０％超の活性を有したことを示す。図２２は、ｐＨ５、ｐＨ５．５およびｐＨ６において到達する最終反応度が極めて類似することをさらに示す。高い最適ｐＨが、動物飼料に理想的である。それというのも、そのような状況において、パンクレアチンは、ＴＲＩ０４５のためのより多くのオリゴペプチド基質を作製する機会を有するためである。
Figure 0006878275
実施例２４
コーンソイ飼料基質の加水分解に対するＴＲＩ０４５（配列番号９９）とペプシンおよびパンクレアチンの効果
インビトロ反応系は、１４０μｌの１０％（ｗ／ｖ）コーンソイ飼料スラリー（１４ｍｇのコーンソイ飼料）、５０ｍＭのＭＥＳ−ＮａＯＨ ｐＨ６．０中１０μｌのＴＲＩ０４５、１０μｌの肉豚ペプシン（水中１，１４Ｕ／μＬ）を含有した。反応物を４０℃において４５分間振盪させながらインキュベートし、続いて３４μｌの肉豚パンクレアチン（１Ｍの重炭酸Ｎａ中０．４６３６ｍｇ／ｍＬ）を添加し、さらに追加で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、９６ウェルプレートを遠心分離し、上清を残留ＴＲＩ０４５活性アッセイならびにＯＰＡおよびＢＣＡアッセイ（下記参照）に使用した。
可溶性タンパク質の加水分解度計測は、第１級アミノ基とｏ−フタルジアルデヒドとの反応に基づく（ＯＰＡ−アッセイ）。参照：Ｐ．Ｍ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｄ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｃ．Ｄａｍｂｍａｎｎ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ．６６（２００１）６４２−６４６．
ＯＰＡアッセイのため、以下の手順を実施した。マスタープレートからの酵素により処理された１０〜２５μｌの飼料試料を新たなプレートに移し、次いでホウ酸ナトリウム、ドデシル硫酸塩およびジチオトレイトールを含有する１７５μｌのＯＰＡ試薬をプレートに添加した。３４０ｎｍにおける光学密度の終点計測を、２分および５秒間の混合直後に実施した。
それぞれのプロテアーゼ試料のタンパク質濃度を定量するため、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２３２２８）を使用した。ＴＲＩ０４５試料は定量前に精製しなかった。Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キットは、総タンパク質の比色検出および定量のためのビシンコニン酸（ＢＣＡ）をベースとする洗浄剤適合性配合物である。この方法は、アルカリ性培地中のタンパク質によるＣｕ２＋のＣｕ１＋への周知の還元を、ビシンコニン酸を含有するユニーク試薬を使用する銅カチオン（Ｃｕ＋１）の高感度および選択的比色検出と組み合わせる。このアッセイの紫色を呈する反応産物は、ＢＣＡと１つの銅イオンとの２つの分子のキレート化により形成される。この水溶性複合体は、５６２ｎｍにおける強力な吸光度を示し、それは広試験範囲（２０〜２０００μｇ／ｍＬ）にわたりタンパク質濃度の増加につれてほぼ線形である。タンパク質の巨大分子構造、ペプチド結合の数および４つの特定のアミノ酸システイン、シスチン、トリプトファンおよびチロシンの存在が、ＢＣＡとの色形成を担うと報告されている。
ＯＰＡ（放出された総アミノ基）およびＢＣＡ（可溶性分画中の総タンパク質）測定のため、上清を２０倍希釈し、１０ｕｌを使用した。
ＴＲＩ０４５を含有する系中で、１０００ｐｐｍにおいて、肉豚ペプシンおよびパンクレアチンの存在下でコーンソイ飼料からのフリーアミノ基の放出（タンパク質加水分解の尺度（ＯＰＡ値）として）は９％だけ増加し、タンパク質溶解度は５％だけ増加した。
上記のインビトロアッセイ条件（４０℃における４５分間のｐＨ３におけるペプシンの存在下、続いて４０℃における６０分間のパンクレアチンの存在下のインキュベーション）下でＴＲＩ０４５の安定性を試験するため。続いて、ＴＲＩ０４５の残留活性をアッセイした。反応混合物は、５０μｌの緩衝液０．１ＭのＨＡＣ−ＮａＡＣ（ｐＨ５．０）、１０μｌの上清、および５μｌのＡＡＦ−ｐＮＡ（ＤＭＳＯ中５ｍｇ／ｍｌ）を含有した。反応速度は、マイクロプレートリーダーを使用して４１０ｎｍおよび３０℃において３０秒毎に追跡した。対照として、１０００ｐｐｍの同一濃度における市販のプロテアーゼを使用した。
実施例２２〜２４についての結論
対照（ペプシンおよびパンクレアチン単独）についての反応速度は４．３ｍＯＤ／分であり、市販のプロテアーゼについて、それは１１．０ｍＯＤ／分であり、ＴＲＩ０４５について、それは１９．３ｍＯＤ／分であった。対照（４．３ｍＯＤ／分）の減算後、ＡＡＦ−ｐＮＡ基質に対するＴＲＩ０４５の残留活性は、市販のプロテアーゼよりも２．２倍高かった。これらの結果は、ＴＲＩ０４５が４０℃において少なくとも１００分間、ペプシンおよびパンクレアチンに対して安定であることを示す。
まとめると、本実施例は、ＴＲＩ０４５が、３から７のｐＨ範囲におけるコーンソイ飼料の存在下で４０℃において１０５分間インキュベートされる場合にペプシンおよびパンクレアチンに対して安定であることを実証する。これは、単胃消化系を模倣する条件下で基質としてコーンソイ飼料を使用した場合、ペプシンおよびパンクレアチンの存在下でタンパク質可溶化およびタンパク質加水分解を増加させる相加効果も有し（ＢＥＤＦＯＲＤ，Ｍ．Ｒ．，＆ ＣＬＡＳＳＥＮ，Ｈ．Ｌ．（１９９３）“Ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒｏｉｌｅｒ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｗｈｅｎ ｆｅｄ ｒｙｅ−ｂａｓｅｄ ｄｉｅｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｅｎｚｙｍｅｓ”．Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，７２：１３７−１４３）、すなわち、反応を、４５分間のペプシンの存在下でｐＨ３．０〜３．３、次いでｐＨをｐＨ６．５〜７．０に上昇させ、さらに６０分間のインキュベーションでパンクレアチンを添加して４０℃において実施した。
参照文献
Ｎａｋａｄａｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（１９７３）．“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｌｅｕｃｉｎｅ ａｍｉｎｏ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｉ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ．”Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７（４）：７５７−７６５．
Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）．“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｆｏｏｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６６（５）：６４２−６４６．
Ｓｔｒｅｓｓｌｅｒ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｘｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ ＰｅｐＸ ａｎｄ ＰｅｐＮ ｆｒｏｍ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ １２０４６ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．”ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（７）ｅ７００５５．
Ｗａｎｇ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｅｕｃｉｎｅ ａｍｉｎｏ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＮＧ８０−２．”Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８（１１）：３２２７−３２３７．
本発明の記載される方法および系の種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および主旨から逸脱せずに当業者に明らかである。本発明を具体的な好ましい実施形態に関して記載してきたが、特許請求される本発明はそのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解すべきである。実際、生化学およびバイオテクノロジーまたは関連分野の当業者に明らかな本発明を実施するための記載される方式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあるものとする。

Claims (31)

  1. 加水分解物を生産する方法であって、
    （ａ）少なくとも１つのタンパク質またはその一部を、
    （Ａ）少なくとも１つのエンドプロテアーゼ；および
    （Ｂ）（ａ’）少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたは主としてエキソペプチダーゼ活性を有するプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを含む発酵物（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
    Ｐ１におけるプロリン；および
    Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る）；または
    （ｂ’）エキソペプチダーゼ活性を有する少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
    Ｐ１’におけるプロリン；および
    Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る）
    を混合すること；ならびに
    （ｂ）加水分解物を回収すること
    を含み、
    前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
    （ａ）配列番号２９、配列番号１、配列番号２、または配列番号９９を含み；
    （ｂ）配列番号２９、配列番号１、配列番号２、または配列番号９９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸を含み；
    （ｃ）配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７を含むヌクレオチド配列によりコードされ；
    （ｄ）配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７と少なくとも約９０％の配列同一性を含むヌクレオチド配列によりコードされ；
    （ｅ）高いストリンジェンシー条件下で、配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされ；または
    （ｆ）遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７と異なるヌクレオチド配列によりコードされる、方法。
  2. 前記少なくとも１つのタンパク質が、植物タンパク質からなる群から選択され、好ましくは、前記タンパク質は、グリアジン、グリアジンの免疫原性断片、子実タンパク質、グルテン、ダイズタンパク質の１つ以上である、請求項１に記載の方法。
    または使用。
  3. 前記少なくとも１つのタンパク質が、乳汁ベースタンパク質からなる群から選択され、好ましくは、前記タンパク質は、カゼイン、例えば、ベータ−カゼイン；ラクトグロブリン、例えば、ベータ−ラクトグロブリン；またはホエイタンパク質の１つ以上である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記少なくとも１つのタンパク質が、卵タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記少なくとも１つのトリペプチジルペプチダーゼが、リジン、アルギニンおよびグリシンからなる群から選択されるＰ１位における１つ以上のアミノ酸を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたは少なくとも１つのＳ５３ファミリーのエキソトリペプチジルペプチダーゼが、
    （ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
    Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；ならびに
    （ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
    Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
    を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼが、Ｐ１におけるプロリンおよびＰ１’におけるプロリンを有するペプチドのＮ末端からトリペプチドをさらに開裂し得る、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 回収された前記加水分解物を、少なくとも１つの飼料または食料成分と混合することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. ステップ（Ａ）およびステップ（Ｂ）を同時に実施する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記少なくとも１つのエンドプロテアーゼおよび少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼが、類似ｐＨ範囲において活性である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記エンドプロテアーゼが、酸性エンドプロテアーゼである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記少なくとも１つのエンドプロテアーゼが、好ましくは、トリプシンまたはキモトリプシンの１つ以上から選択されるアルカリ性エンドプロテアーゼである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記加水分解物が、前記少なくとも１つのタンパク質またはその一部に対する免疫応答を有する傾向がある対象において低減した免疫原性を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記少なくとも１つのタンパク質が、動物タンパク質または植物タンパク質であり、好ましくは、前記タンパク質は、グリアジン、ベータカゼイン、ベータ−ラクトグロブリンまたはグリアジン、ベータ−カゼイン、ベータ−ラクトグロブリンの免疫原性断片、ホエイタンパク質、魚類タンパク質、食肉タンパク質、卵タンパク質、ダイズタンパク質、ホルデインまたは子実タンパク質の１つ以上である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 非処理加水分解物に対する免疫反応を有する傾向がある対象における免疫原性を低減させるため、または加水分解物の苦味を低減させるための加水分解物の製造における、少なくとも１つのエンドプロテアーゼおよび少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼまたはプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼを含む発酵物（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、主としてエキソペプチダーゼ活性を有し、
    （ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
    Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；または
    （ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
    Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；
    を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得、
    または請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法により取得可能である）の使用であって、
    前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
    （ａ）配列番号２９、配列番号１、配列番号２、または配列番号９９を含み；
    （ｂ）配列番号２９、配列番号１、配列番号２、または配列番号９９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸を含み；
    （ｃ）配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７を含むヌクレオチド配列によりコードされ；
    （ｄ）配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７と少なくとも約９０％の配列同一性を含むヌクレオチド配列によりコードされ；
    （ｅ）高いストリンジェンシー条件下で、配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされ；または
    （ｆ）遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７と異なるヌクレオチド配列によりコードされる、使用。
  16. アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼからなる群から選択される１つ以上のさらなるプロテアーゼの添加をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法または請求項１５に記載の使用。
  17. 前記少なくとも１つのさらなるプロテアーゼが、アミノペプチダーゼ、好ましくは、ラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、より好ましくは、ラクトバシルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）から取得可能なアミノペプチダーゼである、請求項１６に記載の方法または使用。
  18. 前記少なくとも１つのタンパク質またはその一部を、前記少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（および場合により、前記少なくとも１つのさらなるプロテアーゼ）の添加前に前記少なくとも１つのエンドプロテアーゼと混合する、請求項１〜１４もしくは１６〜１７のいずれか一項に記載の方法または請求項１５〜１７に記載の使用。
  19. 少なくとも１つのエンドプロテアーゼおよび主としてエキソペプチダーゼ活性を有するプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
    （ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
    Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；または
    （ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
    Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
    を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る）を含む加水分解物であって、
    前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
    （ａ）配列番号２９、配列番号１、配列番号２、または配列番号９９を含み；
    （ｂ）配列番号２９、配列番号１、配列番号２、または配列番号９９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸を含み；
    （ｃ）配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７を含むヌクレオチド配列によりコードされ；
    （ｄ）配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７と少なくとも約９０％の配列同一性を含むヌクレオチド配列によりコードされ；
    （ｅ）高いストリンジェンシー条件下で、配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされ；または
    （ｆ）遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７と異なるヌクレオチド配列によりコードされる、加水分解物。
  20. 実質的に１つ以上のトリペプチドが濃縮された、請求項１９に記載の加水分解物。
  21. 乳汁タンパク質加水分解物、グリアジン加水分解物またはダイズタンパク質加水分解物
    である、請求項１９または請求項２０に記載の加水分解物。
  22. 主としてエキソペプチダーゼを有する少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
    （ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
    Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；または
    （ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
    Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
    を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る）、ならびに
    ポリオール、例えば、グリセロールおよび／またはソルビトール；糖、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトースおよびトレハロース；塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ ２ 、Ｎａ ２ ＳＯ ４ または他の食料グレード塩；保存剤、例えば、安息香酸ナトリウムおよび／またはソルビン酸カリウム；またはそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の成分
    を含む組成物であって、
    前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
    （ａ）配列番号２９、配列番号１、配列番号２、または配列番号９９を含み；
    （ｂ）配列番号２９、配列番号１、配列番号２、または配列番号９９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸を含み；
    （ｃ）配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７を含むヌクレオチド配列によりコードされ；
    （ｄ）配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７と少なくとも約９０％の配列同一性を含むヌクレオチド配列によりコードされ；
    （ｅ）高いストリンジェンシー条件下で、配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされ；または
    （ｆ）遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７と異なるヌクレオチド配列によりコードされる、組成物。
  23. 少なくとも１つのエンドプロテアーゼをさらに含む、請求項２２に記載の組成物。
  24. 飼料構成成分または食料構成成分を、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の加水分解物または請求項２２もしくは２３に記載の組成物と接触させることを含む、飼料原料または食料原料を生産する方法。
  25. 少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、主としてエキソペプチダーゼ活性を有し、
    （ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
    Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；または
    （ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
    Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
    を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る）、または請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の加水分解物を含み、場合により、ポリオール、例えば、グリセロールおよび／またはソルビトール；糖、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトースおよびトレハロース；塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ ２ 、Ｎａ ２ ＳＯ ４ または他の食料グレード塩；保存剤、例えば、安息香酸ナトリウムおよび／またはソルビン酸カリウム；またはそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の成分をさらに含む、
    を含む食料添加用組成物または飼料添加用組成物であって、
    前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
    （ａ）配列番号２９、配列番号１、配列番号２、または配列番号９９を含み；
    （ｂ）配列番号２９、配列番号１、配列番号２、または配列番号９９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸を含み；
    （ｃ）配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７を含むヌクレオチド配列によりコードされ；
    （ｄ）配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７と少なくとも約９０％の配列同一性を含むヌクレオチド配列によりコードされ；
    （ｅ）高いストリンジェンシー条件下で、配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされ；または
    （ｆ）遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７と異なるヌクレオチド配列によりコードされる、食料添加用組成物または飼料添加用組成物。
  26. 少なくとも１つのエンドプロテアーゼをさらに含む、請求項２５に記載の食料添加用組成物または飼料添加用組成物。
  27. 請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の加水分解物を含む食料添加用または飼料添加用組成物。
  28. 配列番号２９、配列番号１、配列番号２、および配列番号９９から選択されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ、または請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の加水分解物を含む、食料または飼料。
  29. 前記食料または飼料が、乳製品、ホエイタンパク質製品、ベーカリー製品、発酵製品、スポーツ栄養製品、高性能食料、飲料、ベビーフード、高齢者用食料、医療対象者用食料、シェイク、またはケーシングである、請求項２８に記載の食料または飼料。
  30. 少なくとも１つのプロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼ（前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、主としてエキソペプチダーゼ活性を有し、
    （ｉ）Ｐ１におけるプロリン；および
    Ｐ１におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸；または
    （ｉｉ）Ｐ１’におけるプロリン；および
    Ｐ１’におけるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンまたは合成アミノ酸から選択されるアミノ酸
    を有するペプチドのＮ末端からトリペプチドを開裂し得る）；少なくとも１つのエンドプロテアーゼ；およびそれらの同時投与のための説明書を含むキットであって、
    前記プロリン耐性トリペプチジルペプチダーゼは、
    （ａ）配列番号２９、配列番号１、配列番号２、または配列番号９９を含み；
    （ｂ）配列番号２９、配列番号１、配列番号２、または配列番号９９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸を含み；
    （ｃ）配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７を含むヌクレオチド配列によりコードされ；
    （ｄ）配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７と少なくとも約９０％の配列同一性を含むヌクレオチド配列によりコードされ；
    （ｅ）高いストリンジェンシー条件下で、配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされ；または
    （ｆ）遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号５６、配列番号９６または配列番号９７と異なるヌクレオチド配列によりコードされる、キット。
  31. ヒトの皮膚上で使用される化粧品、ローション、または洗浄剤である、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の加水分解物を含む非食料品。
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