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JP6856239B2 - 差次的ｇｓｔｔ１発現または遺伝子型を有する幹細胞亜集団 - Google Patents

差次的ｇｓｔｔ１発現または遺伝子型を有する幹細胞亜集団 Download PDF

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Description

本発明は、細胞のＧＳＴＴ１遺伝子型の決定に関与する方法または細胞中のＧＳＴＴ１発現レベルの測定に関与する方法に関し、および、低レベルのＧＳＴＴ１を発現するように改変した細胞に関する。
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼθ１（ＧＳＴＴ１）は、ＧＳＴスーパーファミリーに属する代謝酵素である。第ＩＩ相代謝タンパク質であるこのファミリーは、その配列と構造に従って、７種類のクラスに分類される。これらタンパク質は、解毒のために、還元型グルタチオンを求電子性且つ疎水性の生体異物へ結合する反応を触媒する（図１）。これらタンパク質はまた、活性酸素種を除去し、プロスタグランジンとステロイドを生合成および代謝する。
ＧＳＴ遺伝子内の遺伝子多型が全世界の人々で一般的であり、その個々の遺伝子メンバーは点変異を有するか、または、遺伝子を完全に失っている。ＧＳＴＴ１ホモ接合型欠損が、ほとんどの集団の約２０〜６０％で一般的に起こっている（図２）。ホモ接合型欠損は、遺伝子に隣接する二つの相同性の高い配列のストレッチの相同組換えにより引き起こされる。複数の研究が、ＧＳＴ多型とＤＮＡ損傷またはＤＮＡ修復との間に弱い相関があり、がん等の疾患リスクに繋がることを示した。しかしながら、他の多くの研究では、疾患との相関がないことを示している。従って、がんや他の疾患へのＧＳＴＴ１の関与に関する決定的なデータはない。
ＧＳＴファミリーのいくつかのメンバーには、非酵素的役割があるとされている。Ａ、Ｐ、およびＭのクラスは、細胞周期と分化を制御する情報伝達経路に関与する。それらは、細胞生存率と細胞死に関与するＭＡＰＫ経路における分子メンバーを経路から隔離する。最近の研究は、酸化ストレスがｐ３８情報伝達経路をおそらく介してＧＳＴＴ１の発現上昇を誘導することを示し、細胞周期制御へのＧＳＴＴ１の関与を示唆した。
高い自己複製能と多能性を有する、臨床応用用の理想的幹細胞を見出すことは難題であり続けている。
過去１０年に渡る多くの研究と米国ＦＤＡへのＩＮＤ提出のペースが増加し続けているにも関わらず、間葉系幹（または、間質）細胞（ＭＳＣ）の構成とは何かに関して、一般的に受け入れられた定義は未だない（非特許文献１；非特許文献２）。Ｋｅａｔｉｎｇ（２０１２年）が簡潔に指摘したのだが、ＭＳＣの（現状における定義に役立つもの）は「インビトロ培養の現象」であって、体内に移植して戻した際にＭＳＣがどのように働くのかを予測するのを困難にさせている。従って、ＭＳＣの特定集団のインビトロ特性を、インビボで移植して戻した際に適切な組織を形成する活性と慎重に関連付ける緊急の必要性がまだある。ＭＳＣの臨床利用への興味が芽生え始めているのを鑑みると、ＭＳＣを作製するのに使用するプロトコルをさらに精査する明らかな必要性がある。明らかなことには、プラスチックへの接着、表面マーカーの発現、および分化能（非特許文献３）は、選別に関する評価基準としては十分ではない。そして、他の特徴（例、増殖因子の分泌および免疫調節状態）を考慮に入れなければならず、その後、インビボの成績と相互関連付けされなければならない。本発明者らは、この必要性に取り組み、ＭＳＣの定義を修正しようと試みる。
ヒトＭＳＣ（ｈＭＳＣ）は、各種成体組織から取得可能な接着細胞のヘテロな亜集団からなると一般的に考えられていて、規定された培養条件下で自己複製能を示すと共に特定分化した細胞（例、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、および筋芽細胞）への分化能を保持することを示す（非特許文献４）。しかしながら、インビトロでの生存および分化能は、もはや組織修復能を予測するものとは見なされない。というのも、ｈＭＳＣのインビトロ特性はインビボ効力と全体として相関するものではないからだ（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。
明らかに、国際細胞治療学会（ＩＳＣＴ）によって与えられる、ＭＳＣの定義に関する公式見解（プラスチックへの接着、ＣＤマーカーの発現、およびインビトロ多能性を含むもの）は、培養物の不均一性状が原因の効力の問題に取り組むために修正されなければならない。単細胞由来コロニーとして作製されたＭＳＣを使用したとしても、その細胞培養において依然として不均一性があるという問題がある（非特許文献８）。近年、いくつかのグループが、基礎的な間葉系幹細胞機能に関連することが知られる一又は複数の表面マーカーで細胞を濃縮することによって、均質な細胞集団を単離しようと試みた（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。これらのアプローチは造血細胞からｈＭＳＣを単離するのに役立つ一方で、機能的に成熟した集団からナイーブ細胞を十分に区別することができない。ｈＭＳＣの均一な集団の単離および調製のための別の方法には、クローン増殖性が高く且つ多能性である細胞を取得するためにサイズを基にソーティングすることが含まれる（非特許文献１６；非特許文献１７）。最近出てきたさらに別のものには、これら細胞のセクレトームがある。ＭＳＣは、生着や創傷治癒に重要な役割を演じる、広く多様な生理活性パラクライン因子を分泌する（非特許文献１８；非特許文献１９）。そのような分泌のプロファイル解析もまた、ｈＭＳＣの有効性を予想する手段として想定されている（非特許文献２０；非特許文献２１）。
Ｋｅａｔｉｎｇ、２０１２年、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １０（６）：７０９−７１６ Ｍｅｎｄｉｃｉｎｏら、２０１４年、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １４（２）：１４１−１４５ Ｄｏｍｉｎｉｃｉら、２００６年、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ ８：３１５−３１７ Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、２００９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１４３−１４７ Ｋｏら、２００８年、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ａ １４：２１０５−１９ ＢｕｅｎｏとＧｌｏｗａｃｋｉ、２００９年、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ６８５−６９７ Ｒａｉら、２０１０年、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ７９６０−７０ Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、２０１１年、ＢＭＣ Ｐｒｏｃ ５ Ｓｕｐｐｌ ８：Ｏ１４ ＳｉｍｍｏｎｓとＴｏｒｏｋ−Ｓｔｏｒｂ、１９９１年、Ｂｌｏｏｄ ７８：５５−６２ Ｇｒｏｎｔｈｏｓら、１９９９年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４：４７−５６ Ｄｅｓｃｈａｓｅａｕｘら、２００３年、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ １２２：５０６−５１７ Ｂｕｅｈｒｉｎｇら、２００７年、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｖｉ ２６２−２７１ Ｇａｎｇら、２００７年、Ｂｌｏｏｄ １０９：１７４３−１７５１ Ｂａｔｔｕｌａら、２００９年、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ−ｔｈｅ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ９４：１７３−１８４ Ｔｏｒｍｉｎら、２０１１年、Ｂｌｏｏｄ １１７：５０６７−５０７７ Ｃｏｌｔｅｒら、２００１年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９８：７８４１−７８４５ Ｓｍｉｔｈら、２００４年、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：８２３−８３１ ＣａｐｌａｎとＤｅｎｎｉｓ、２００６年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９８：１０７６−１０８４ ＣａｐｌａｎとＣｏｒｒｅａ、２０１１年、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ９：１１−１５ Ｃａｐｌａｎ、２００９年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２１７：３１８−３２４ Ｐｒｏｃｋｏｐら、２０１０年、１４：２１９０−２１９９
本発明者が予想外に見出したのは、ＧＳＴＴ１発現が増殖速度、即ち、細胞倍化時間および／または組織形成能と逆相関することである。この発見は、相対的に早い増殖速度を有する細胞の同定、分離、濃縮、および／または選別を可能とする。幹細胞の文脈では、このことは、インビトロとインビボでの組織生成に有用な細胞集団の提供を実現する。そのように、患者に移植するのに適する組織をインビトロで作製可能であるか、あるいは、本発明の方法によって同定または選別される細胞は、医療措置（例、組織再生）を提供するために患者に投与または移植可能である。
従って、一つの観点では、本発明は、単一幹細胞または複数の幹細胞を同定する方法であって、前記単一幹細胞または複数幹細胞中のＧＳＴＴ１発現レベルを測定する工程を含む方法を提供する。
有利なことには、本発明を使用して、増殖速度および／または組織形成能が改善／向上した幹細胞を同定することができる。従って、いくつかの実施形態では、本発明は、（ｉ）単一幹細胞または複数の幹細胞でのＧＳＴＴ１発現レベルを測定する工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）で測定されたＧＳＴＴ１発現レベルとその幹細胞タイプに関するＧＳＴＴ１発現レベルの基準値とを比較する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、前記基準値に比べてＧＳＴＴ１発現が減少した単一幹細胞または複数の幹細胞を同定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、前記基準値に比べてＧＳＴＴ１発現が減少した単一幹細胞または複数の幹細胞を、他の細胞または幹細胞から分離および／または単離する工程をさらに含む。
本発明者らはまた、ある種のＧＳＴＴ１遺伝子型が、細胞増殖（すなわち、増殖速度）および／または組織形成能と相関することも発見した。従って、第二観点では、本発明は、単一幹細胞または複数の幹細胞を同定する方法であって、前記単一幹細胞または複数幹細胞のＧＳＴＴ１遺伝子型を決定する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子型が野生型ＧＳＴＴ１のホモ接合型ではない単一幹細胞または複数の幹細胞を同定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子型が野生型ＧＳＴＴ１のホモ接合型ではない単一幹細胞または複数の幹細胞を、他の細胞または幹細胞から分離および／または単離する工程をさらに含む。
ＧＳＴＴ１発現が比較的に減少もしくは低い幹細胞、および／または、細胞増殖（すなわち、増殖速度）や組織形成能の向上もしくは改善と相関するＧＳＴＴ１遺伝子型を有する幹細胞は、各種他の性質を有する。その性質は、それら幹細胞を、ＧＳＴＴ１発現が比較的に高い幹細胞および／または細胞増殖（すなわち、増殖速度）や組織形成能の向上もしくは改善と相関しないＧＳＴＴ１遺伝子型を有する幹細胞から識別するのに役立つ場合がある。従って、本発明の方法のいくつかの実施形態では、本幹細胞は、幹細胞の基準集団と比べた場合、一又は複数の以下の性質を持つ：（ｉ）コロニー形成能の向上；（ｉｉ）細胞サイズの減少；（ｉｉｉ）テロメア長の増加および／またはテロメア短縮率の減少；（ｉｖ）ＳＴＲＯ−１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ１４６および／またはＰＤＧＦＲβの発現の増加；（ｖ）ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１α、フラクタルカイン、ＰＤＧＦ−ＢＢ、および／またはＭＩＰ−１αの分泌の増加；（ｖｉ）Ｔ細胞抑制の増強；（ｖｉｉ）ＡＬＰ、ＲＵＮＸ２、および／またはＢＳＰ−ＩＩの発現の減少；（ｖｉｉｉ）ＴＷＩＳＴ−１および／またはＤＥＲＭＯ−１の発現の増加。
本発明者らは、幹細胞の増殖速度および／または組織形成能が、ＧＳＴＴ１遺伝子またはタンパク質の発現レベル、あるいは、ＧＳＴＴ１機能を変化させることによって改変可能であることを発見した。
第三観点では、本発明は、単一幹細胞または複数の幹細胞を改変する方法であって、単一幹細胞または複数の幹細胞を、ＧＳＴＴ１発現および／または機能を減少させるように幹細胞を改変することができる薬剤と接触させる工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｉ）任意ではあるが、個体から、単一幹細胞または複数の幹細胞を単離する工程と、（ｉｉ）単離された単一幹細胞または複数の幹細胞を、ＧＳＴＴ１発現および／または機能を減少させるように幹細胞を改変することができる薬剤とインビトロで接触させる工程と、を含む。
本発明はまた、内在性ＧＳＴＴ１発現および／または機能を減少させるように改変された単一幹細胞または複数の幹細胞を提供する。
また提供されるのは、ＧＳＴＴ１発現および／または機能を減少させることができる薬剤を含む単一幹細胞または複数の幹細胞である。
また提供されるのは、野生型ＧＳＴＴ１がホモ接合型である幹細胞および／またはその幹細胞タイプに関してＧＳＴＴ１発現および／または機能が平均（すなわち、中間）レベルの幹細胞に比べて、ＧＳＴＴ１発現および／または機能が減少するように改変された単一幹細胞または複数の幹細胞である。
さらにまた、本発明は、野生型ＧＳＴＴ１がホモ接合型の幹細胞に比べてＧＳＴＴ１発現および／または機能が減少した単離された単一幹細胞または複数の幹細胞を提供する。
本発明のさらなる観点では、本発明の単一幹細胞または複数の幹細胞を、医療措置方法中での使用のために提供する。
本発明の別の観点では、医療措置方法中での使用のための医薬の製造における本発明の単一幹細胞または複数の幹細胞の使用を提供する。
一つの観点では、本発明は、治療を必要とする患者の組織を再生する方法であって、本発明の幹細胞を治療に必要な数だけ前記患者に投与する工程を含む方法を提供する。
本発明はまた、骨折周辺組織または損傷部位へ幹細胞を投与する工程を含む、骨折を治療する方法において使用するため、または、軟骨組織の修復において使用するために、本発明の単一幹細胞または複数の幹細胞を提供する。
また提供されるのは、骨または軟骨組織をインビトロまたはインビボで生成させるための本発明の単一幹細胞または複数の幹細胞の使用である。
さらなる観点では、本発明は、幹細胞ドナーを選抜する方法であって、個体から単離される核酸含有サンプル中のＧＳＴＴ１の遺伝子型を決定する工程または個体から単離されるサンプル中のＧＳＴＴ１発現を測定する工程を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本方法は、核酸含有サンプル中のＧＳＴＴ１対立遺伝子の存在を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、ＧＳＴＴ１対立遺伝子は、一又は複数の野生型ＧＳＴＴ１対立遺伝子、野生型ＧＳＴＴ１と比べてＧＳＴＴ１発現が減少することが既知および／または予測され得るＧＳＴＴ１遺伝子型、およびＧＳＴＴ１ヌル型（すなわち、欠損型）対立遺伝子である。
さらなる観点では、本発明は、幹細胞ドナーを選抜する方法であって、個体から単離されるＤＮＡ含有サンプル中のＧＳＴＴ１の遺伝子型を決定する工程を含み、野生型ＧＳＴＴ１がホモ接合型である個体と比べてＧＳＴＴ１発現が減少することが既知および／または予測され得るＧＳＴＴ１遺伝子型を有すると決定された個体が、幹細胞ドナーとして選抜される、方法を提供する。
さらなる観点では、本発明は、幹細胞ドナーを選抜する方法であって、前記方法は、（ｉ）固体から単離されるサンプル中の単一幹細胞または複数の幹細胞のＧＳＴＴ１発現レベルを測定する工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）で測定された前記ＧＳＴＴ１発現レベルを、その幹細胞タイプのＧＳＴＴ１発現レベルの基準値と比較する工程と、を含み、前記基準値と比べてＧＳＴＴ１発現が減少していた単一幹細胞または複数の細胞を有すると決定された個体を幹細胞ドナーとして選抜する方法を提供する。
幹細胞ドナーを選抜する方法によると、いくつかの実施形態では、前記単一幹細胞または複数の幹細胞は、幹細胞の基準集団と比較する場合、一又は複数の以下の性質を追加的に持つ：（ｉ）コロニー形成能の向上；（ｉｉ）細胞サイズの減少；（ｉｉｉ）テロメア長の増加および／またはテロメア短縮率の減少；（ｉｖ）ＳＴＲＯ−１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ１４６および／またはＰＤＧＦＲβの発現の増加；（ｖ）ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１α、フラクタルカイン、ＰＤＧＦ−ＢＢ、および／またはＭＩＰ−１αの分泌の増加；（ｖｉ）Ｔ細胞抑制の増強；（ｖｉｉ）ＡＬＰ、ＲＵＮＸ２、および／またはＢＳＰ−ＩＩの発現の減少；（ｖｉｉｉ）ＴＷＩＳＴ−１および／またはＤＥＲＭＯ−１の発現の増加。
本発明の別の観点では、幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養物におけるコロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｆ）を濃縮する方法が提供され、前記方法は、ＧＳＴＴ１発現レベルが減少した幹細胞を分離する工程を含む。
本発明の別の観点では、幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養物におけるコロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｆ）を濃縮する方法が提供され、前記方法は、野生型ＧＳＴＴ１遺伝子型がホモ接合型ではない幹細胞を分離する工程を含む。
細胞の分離は、選択性質を有するかまたは有しない細胞を、前記性質をそれぞれ有しないまたは有する細胞から、分離および／または単離する工程に関与する場合がある。そのようにして、所望の性質を有する細胞を濃縮した細胞集団を提供可能である。前記性質は、ＧＳＴＴ１発現レベルの減少である場合もあるし、または、野生型ＧＳＴＴ１遺伝子型がホモ接合型でない場合もある。
本発明の別の観点では、ＧＳＴＴ１発現を測定するためのキットを提供し、前記キットは、サンプル中の単一幹細胞または複数の幹細胞のＧＳＴＴ１発現レベルを測定する試薬を含む。
本発明の別の観点では、ＧＳＴＴ１遺伝子型を決定するためのキットを提供し、前記キットは、ＤＮＡ含有サンプル中のＧＳＴＴ１遺伝子型を決定するための試薬を含む。
本発明の観点に係るキットは、本発明に従って幹細胞ドナーを選抜する方法に有用である。特に、前記キットは、幹細胞を取得するために、適切な骨髄ドナーを同定するのに有用である。
本発明の原理を説明する実施形態と実験を、以下の添付した図を参照して、今から議論する。
（Ａ）配列相同性と構造に基づくＧＳＴスーパーファミリーの分類。（Ｂ）ＧＳＴ酵素は、生体異物へのグルタチオンの結合を触媒する。 いくつかの人種集団間のＧＳＴＴ１ホモ接合型欠損の発生頻度。 増殖の速いＭＳＣ株と遅いＭＳＣ株の細胞増殖の継続的モニタリング。培養ウエル中の生細胞数を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステム上で５日間（時間は時間単位で示す）に渡って評価（細胞インデックス）した。各群を代表する２つの独立する細胞株に関して、各々３回技術的にリピートして得た結果を示す。増殖の速いもの＝他の線の下から始まり、その後交差して、そして、他の線よりも上方のままであった線；増殖の遅いもの＝他の線。 （Ａ）マイクロアレイビーズチップのシグナルを標準化したもの。増殖の遅い株（Ｂ、Ｄ、およびＦ）の全てはＧＳＴＴ１を中程度に発現する一方で、増殖の速い株の内２つ（ＡおよびＣ）の発現はごくわずかである。 （Ｂ）ＧＳＴＴ１の遺伝子型決定。ＢＭ−ＭＳＣ株ＡおよびＣは、ヌル型（ＧＳＴＴ１−／−）、そして残りは陽性（Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ：ＧＳＴＴ１＋／−；１０Ｒ、１１Ｒ：ＧＳＴＴ１＋／＋）である。 （Ｃ）ｑＲＴ−ＰＣＲによる発現解析。ＧＳＴＴ１レベルは、対立遺伝子のコピー数と相関する。 （Ｄ）タンパク質発現解析。発現は、「トリモーダル効果」と一貫していた。 コメットアッセイによるＤＮＡ損傷の評価溶解および電気泳動を、顕微鏡スライド上の低融点アガロースに埋め込まれた細胞について実施した。（Ａ）コメットアッセイ後のコメット画像。増殖の遅い株と速い株をＤＡＰＩで染色した核の尾部の長さは同程度である。（Ｂ）ＤＮＡ損傷のオリーブテイルモーメント（ｏｌｉｖｅ ｔａｉｌ ｍｏｍｅｎｔ）による定量では、両群において有意な損傷は検出されなかった。 酸化ストレス後のＤＮＡ損傷のコメットアッセイによる評価。埋め込まれた細胞を、１０μＭの過酸化水素で２０分間処理し、その後、溶解およびｈＯＧＧ１処理し、次に、電気泳動した。コントロール：非処理、突然変異原のみ、および、酵素のみ。（Ａ）コメットアッセイ後のコメット画像。尾部の長さは、過酸化水素処理および酵素処理で増加するが、増殖の速い株と遅い株の間では尾部の長さは同等である。（Ｂ）ＤＮＡ損傷のオリーブテイル測定各種処理下で群間の差異は検出できなかった。 （Ａ）ｑＲＴ−ＰＣＲによる、複数継代数間でのＧＳＴＴ１発現解析。ＧＳＴＴ１発現は、継代と伴に増加する。 （Ｂ）ウエスタンブロティングによる、複数継代数間でのＧＳＴＴ１発現解析。ＧＳＴＴ１発現は、継代と伴に増加する。 （Ａ）ＧＳＴＴ１ノックダウン効率。増殖の遅い株にＧＳＴＴ１に対するｓｈＲＮＡをレンチウイルス感染すると、サイレンシングしないコントロールと比較して、ｍＲＮＡレベルが７０％減少する。 （Ｂ）生細胞数。コントロールと比較して、ノックダウンでは細胞数の８０％増加が見られた。 （Ｃ）ＥｄＵ標識アッセイ。１０μＭのＥｄＵで細胞を１８時間インキュベートし、そして、硫酸銅と６４７アザイド反応で反応後の、フローサイトメトリー解析。ノックダウンでの、分裂細胞集団の有意な増加。 （Ｄ）ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステム上のリアルタイム増殖測定。ノックダウンでは、倍化時間がより短い。 ＣＦＵ−Ｆアッセイによるクローン増殖能の評価。１０ｃｍ形式のプレート上の１５０個の細胞を２週間培養して維持し、固定し、そして、ギムザ（Ｇｅｉｍｓａ）染色した。（Ａ）ギムザ染色したプレート。ノックダウンはコントロールよりもコロニーが大きく、コロニー数が多い。 ＣＦＵ−Ｆアッセイによるクローン増殖能の評価。１０ｃｍ形式のプレート上の１５０個の細胞を２週間培養して維持し、固定し、そして、ギムザ（Ｇｅｉｍｓａ）染色した。（Ｂ）ＣＦＵ−Ｆ頻度の定量。ノックダウンでは、ＣＦＵ−Ｆ頻度がより高く検出される。 ＣＦＵ−Ｆアッセイによるクローン増殖能の評価。１０ｃｍ形式のプレート上の１５０個の細胞を２週間培養して維持し、固定し、そして、ギムザ（Ｇｅｉｍｓａ）染色した。（Ｃ）コロニーサイズの測定。ノックダウンではコロニーサイズが増加する。 （Ａ）ＧＳＴＴ１過剰発現の解析。増殖の速い株（ヌル型）に発現ベクターをトランスフェクションすると、ＧＳＴＴ１レベルが、トランスフェクション後３日で、コントロールの約５００００倍増加することが分かる。 （Ｂ）生細胞数。コントロールと比較して、過剰発現系では細胞数が４０％減少する。 （Ｃ）ＥｄＵ標識アッセイ。標識後のフローサイトメトリー解析は、過剰発現で分裂細胞数の減少を示す。 （Ｄ）ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステム実施。過剰発現での増殖速度の増加率。 ドナーＡ〜Ｆから単離されたＢＭＭＮＣの特徴解析（Ａ）ドナーから単離されたＢＭＭＣの顕微鏡解析。 ドナーＡ〜Ｆから単離されたＢＭＭＮＣの特徴解析（Ｂ）ＣＦＵ−Ｆ効率とコロニーサイズを示す棒グラフ。 ドナーＡ〜Ｆから単離されたＢＭＭＮＣの特徴解析（Ｃ）左図：「小」細胞の割合を示す棒グラフ。右図：散布図を示す。 ドナーＡ〜Ｆから単離されたＢＭＭＮＣの特徴解析（Ｄ）複数継代数を通しての細胞数を示すグラフと棒グラフ。 ドナーＡ〜Ｆから単離されたＢＭＭＮＣの特徴解析（Ｅ）複数継代数を通してのテロメア長を示すグラフ。 ドナーＡ〜Ｆから単離されたＢＭＭＮＣの特徴解析（Ｆ）Ｒ２値［相関係数］を示す棒グラフ。 ｈＭＳＣの表面表現型プロフィールを示す散布図。ｈＭＳＣ上の２４種類のＣＤマーカー群の発現をチェックした。全てのドナー由来の細胞は、ＣＤ１０３、ＣＤ７３、およびＣＤ９０が＞９５％で発現し、および、造血マーカーが＜２％で発現していて、ＩＣＳＴにより設定された最低限の評価基準を満足していた。点線で示した基準線は２％に相当する。それらの細胞は、増殖因子受容体と追加的ｈＭＳＣ関連マーカー（例、ＣＤ１４６、ＳＴＲＯ−１、およびＳＳＥＡ−４）の発現にばらつきを示した。 ドナーＡ〜Ｆ由来のｈＭＳＣによって生産されるサイトカインと増殖因子を示す棒グラフ。 ドナーＡ〜Ｆ由来のｈＭＳＣによる増殖因子の生産を示す棒グラフ。 Ｔ細胞増殖を阻害するＭＳＣの能力の解析。（Ａ）抗体刺激下でのＴ細胞増殖の、ｈＭＳＣによる用量依存的抑制を示す棒グラフ。（Ｂ）結果をまとめた表。＊Ｐ＜０．０５。 増殖の速いｈＭＳＣと増殖の遅いｈＭＳＣでの遺伝子発現。（Ａ）増殖の速いｈＭＳＣと増殖の遅いｈＭＳＣでのＴＷＩＳＴ−１とＤＥＲＭＯ−１の発現を示す棒グラフ。 増殖の速いｈＭＳＣと増殖の遅いｈＭＳＣでの遺伝子発現。（Ｂ）発現に差のある遺伝子の説明。 増殖の速いｈＭＳＣと増殖の遅いｈＭＳＣでの遺伝子発現。（Ｃ）ドナーＡ〜Ｆから単離された増殖の速いｈＭＳＣと増殖の遅いｈＭＳＣでのＲＵＮＸ２、ＡＬＰ、ＢＳＰ−ＩＩ、ＳＯＸ９、ＣＯＬ２、ＣＥＢＰα、およびＰＰＡＲγの発現を示すプロット図。＊Ｐ＜０．０５。 ドナーＡ〜Ｆから単離された増殖の速いｈＭＳＣと増殖の遅いｈＭＳＣの、他系列への分化能。（Ａ）ドナーＡ〜Ｆから単離された増殖の速いｈＭＳＣと増殖の遅いｈＭＳＣでのＲＵＮＸ２、ＢＳＰ−ＩＩ、ＡＬＰ、ＣＯＬ２Ａ１、ＳＯＸ９、ＣＥＢＰα、およびＰＰＡＲγの発現を示すプロット図。 ドナーＡ〜Ｆから単離された増殖の速いｈＭＳＣと増殖の遅いｈＭＳＣの、他系列への分化能。（Ｂ）ドナーＡ〜Ｆから単離された細胞のフォンコッサ染色、アリザリンレッド染色、アルシアンブルー（Ａｌｉｃｉａｎｂｌｕｅ）染色、およびオイルレッドＯ染色を示す画像。 ドナーＡ〜Ｆから単離された増殖の速いｈＭＳＣと増殖の遅いｈＭＳＣの、他系列への分化能。（Ｃ）（Ｂ）での染色像を定量したものを示すプロット図。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 （Ａ）ドナーＡ〜Ｆから単離されたｈＭＳＣによる、マウス中インビボの異所性化骨。 （Ｂ）ドナーＡ〜Ｆから単離されたｈＭＳＣによって形成された骨の画像、Ｘ線像および３Ｄ μＣＴイメージ。 （Ｃ）ドナーＡ〜Ｆから単離されたｈＭＳＣによって形成された骨量を示す棒グラフ。 （Ｄ）ドナーＡ〜Ｆから単離されたｈＭＳＣによって形成された骨量を示すとボックスプロット図。 （Ｅ）増殖の速いｈＭＳＣと増殖の遅いｈＭＳＣによって形成された骨量を示す棒グラフ；＊Ｐ＝＜０．００１（ｔ検定）。 （Ａ）ドナーＡ〜Ｆから単離された増殖の速いｈＭＳＣと増殖の遅いｈＭＳＣのインビボ移植片から得られた切片の免疫組織化学解析。 （Ｂ）組織学的解析。骨形成が最小（左）から最大（右）となる尺度に基づく代表的画像。各ドナーに関して、最初の３枚のパネルはＨ＆Ｅ染色であり、最後の３枚のパネルはラリス（Ｒａｌｌｉｓ）３色染色である。薄い染色＝線維組織；濃い染色＝骨組織。 ドナーＡ〜Ｆ由来の骨髄単核細胞をプレートに蒔いた際に形成されたｈＭＳＣコロニーを示す写真。 ＣＦＤＡ−ＳＥアッセイの代表的スキーム。代表的な増殖の速いドナー（ドナーＡ）または代表的な増殖の遅いドナー（ドナーＦ）由来ｈＭＳＣとＴ細胞を、Ｔ細胞：ＭＳＣの割合を変化させて共培養した。増殖しているＴ細胞のパーセンテージは、ＣＦＳＥリードアウト（ＦＩＴＣチャネルにより測定したもの）から取得可能であり、複数のピークは引き続く細胞分裂を示す。散布図（ＳＳＣ対ＦＩＴＣ）は、ＦＩＴＣ陽性細胞のパーセンテージを示す。増殖しているＴ細胞コロニーのサイズの差異は、９６穴プレートの個々のウエルのＴ細胞の顕微鏡写真により可視化される。ポジティブコントロール（ｈＭＳＣなし）およびネガティブコントロール（抗体なし）も含めた。 骨形成中の石灰化を検出するためのフォンコッサ法とアリザリンレッドで染色したものと、脂肪形成中の脂質形成を検出するオイルレッドＯで染色した誘導培養物（上段のウエル）とコントロール培養物（下段のウエル）間の染色強度の差異を示す、６穴プレートの撮像イメージ。軟骨形成中のグリコサミノグリカン形成の差を示す、アルシアンブルーで染色したペレット切片。 ＧＳＴＴ１のゲノム上の位置とヌル型対立遺伝子の原因となる欠失を示す模式図（Ｔｅｉｘｅｉｒａら（２０１３年）、結核−Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｓｓｕｅｓ ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ；第６章：結核の薬理遺伝学：最先端、から転載）。ＧＳＴＴ１のヌル型対立遺伝子は、染色体２２番上の全遺伝子を含む５０ｋｂｐの欠失から生じる。ヌル遺伝子型は、ヒト集団で一般的（２０〜５８％）である。 欠損型および野生型ＧＳＴＴ１対立遺伝子の検出用アッセイの模式図。ＧＳＴＴ１の存在下では、ＧＳＴＴ１＿欠損用プライマーセットは、産物を増幅することはない。というのも、フォーワードプライマーとリバースプライマー間の距離が増幅には長すぎるからだ。そして、ＧＳＴＴ１＿遺伝子プライマーセットのみが産物を生成することができる。前記ＧＳＴＴ１＿欠損用のものによる増幅は、当該遺伝子が無い場合のみ起こり得る。
ＧＳＴＴ１
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼθ１（ＧＳＴＴ１）は、ＧＳＴスーパーファミリーに属する代謝酵素である。第ＩＩ相代謝タンパク質であるこのファミリーは、その配列と構造に従って、７種類のクラスに分類される。これらタンパク質は、解毒のために、還元型グルタチオンを求電子性且つ疎水性の生体異物へ結合する反応を触媒する（図１Ａ）。これらタンパク質はまた、活性酸素種を除去し、プロスタグランジンとステロイドを生合成および代謝する。
野生型ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＧＳＴＴ１のＤＮＡ（コード化ＤＮＡ配列（即ち、ＣＤＳ））とアミノ酸配列を以下に提供する。
ヒトＧＳＴＴ１のＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＴ＿１８７６３３．１、ＧＩ：５６８８１５４６７）
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ヒトＧＳＴＴ１コード化配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００８５３．２、ＧＩ：１６７４６６１６３）
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ヒトＧＳＴＴ１アミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０００８５３．２、ＧＩ：１６７４６６１６４）
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本明細書において、「ＧＳＴＴ１」は、ＧＳＴＴ１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の内一つの配列同一性を有するタンパク質またはポリペプチドであって、グルタチオン還元機能を好ましくは保持するそのようなタンパク質またはペプチドを含む。
ＧＳＴＴ１タンパク質またはポリペプチドは、ＧＳＴＴ１全長タンパク質もしくはポリペプチドの断片もしくはトランケート型のもの、または、シグナル配列を欠く成熟型であってもよい。
ＧＳＴＴ１タンパク質の起源または由来は、任意の動物またはヒト（例、非ヒト動物（例、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、または他の齧歯類（ネズミ目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）の任意の動物由来のものを含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ（牛（例、乳牛）もしくはウシ目（Ｂｏｓ）の任意の動物を含む）、ウマ（ウマ目（Ｅｑｕｉｄａｅ）の任意の動物を含む）、ロバ、および非ヒト霊長類または非ヒト脊椎生物）；非ヒト哺乳動物；ならびに／またはヒト）であってもよい。
ＧＳＴＴ１遺伝子型は、当業者に周知の各種手段によって決定可能である。これら手段には、限定はされないが、ゲノムＤＮＡの制限断片長多型同定（ＲＦＬＰＩ）、ゲノムＤＮＡのランダム増幅多型検出（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型検出（ＡＦＬＰＤ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡシークエンシング、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ、およびＤＮＡマイクロアレイまたはビーズへのハイブリダイゼーションが含まれる。
同様に、当業者は、他の変異（例、エピジェネティックマーク）を同定する方法を上手に採用することができる。これら方法には、限定はされないが、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）系の方法、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、メチル化感受性制限酵素の使用、ＤＮＡアデニンメチルトランスフェラーゼ識別（ＤａｍＩＤ）、およびバイサルファイトシーケンシングが含まれる。
ＧＳＴＴ１発現と機能
ＧＳＴ遺伝子内の遺伝子多型が全世界の人々で一般的であり、その個々の遺伝子メンバーは点変異を有するか、または、遺伝子を完全に失っている。ＧＳＴＴ１ホモ接合型欠損が、ほとんどの集団の約２０〜６０％で一般的に起こっている（図２）。この原因は、ＧＳＴＴ１遺伝子に隣接する相同性の高い配列のストレッチの相同組換えである。
本発明が関わるのは任意の変異（例、遺伝子変異、エピジェネチック変異、ＤＮＡメチル化等）であって、ＧＳＴＴ１遺伝子やタンパク質発現のレベル、および／または、機能的ＧＳＴＴ１タンパク質やＧＳＴＴ１活性のレベルに影響するものである。例えば、その変異は、転写、ｍＲＮＡプロセシング（例、スプライシング）、ｍＲＮＡ安定性、翻訳、翻訳後プロセシング、タンパク質安定性、タンパク質分解、および／またはタンパク質機能／活性に影響を及ぼす場合がある。
本発明の観点では、ＧＳＴＴ１遺伝子型に基づいて、単一幹細胞または複数幹細胞を同定する方法、および／または、幹細胞ドナーを同定する方法が提供される。
特に、本発明が関わるのは、遺伝子やタンパク質発現のレベル、機能的ＧＳＴＴ１タンパク質のレベル、および／またはＧＳＴＴ１タンパク質機能のリードアウト（読み出された情報）が、基準幹細胞の遺伝子やタンパク質発現のレベル、機能的ＧＳＴＴ１タンパク質のレベル、および／またはＧＳＴＴ１タンパク質機能のリードアウト未満または相対的に低いものとなることを生じせしめるＧＳＴＴ１遺伝子型である。
本明細書中で使用される「基準幹細胞」は、野生型ＧＳＴＴ１がホモ接合型である幹細胞、好ましくは、対応するタイプの幹細胞である場合がある。また、「基準幹細胞」は、対応するタイプの代表的幹細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、「基準幹細胞」は、その幹細胞タイプの平均（すなわち、中間）値／レベル／状態を有する概念的幹細胞である場合がある。
いくつかの実施形態では、遺伝子やタンパク質発現のレベル、機能的ＧＳＴＴ１タンパク質のレベル、ＧＳＴＴ１タンパク質機能、および／または、遺伝子やタンパク質発現のリードアウトは、基準幹細胞の発現レベルと比べて、その発現レベルの１倍未満、０．９９倍未満、０．９５倍未満、０．９倍未満、０．８５倍未満、０．８倍未満、０．７５倍未満、０．７倍未満、０．６５倍未満、０．５倍未満、０．４５倍未満、０．４倍未満、０．３５倍未満、０．３倍未満、０．２５倍未満、０．２倍未満、０．１５倍未満、０．１倍未満、０．０５倍未満、または０．０２５倍未満である場合がある。
遺伝子型は、点変異、置換、挿入、または欠失がある場合があり、そして、転写、ｍＲＮＡプロセシング（例、スプライシング）、ｍＲＮＡ安定性、翻訳、翻訳後プロセシング、タンパク質安定性、タンパク質分解、および／またはタンパク質機能／活性を減少させるか、または、それらに影響を及ぼす場合がある。例えば、変異はＧＳＴＴ１遺伝子のホモ接合型欠損である場合がある。対象となる遺伝子型の例には、ＧＳＴＴ１がどちらも陰性のホモ接合遺伝子型（すなわち、ＧＳＴＴ１−／ＧＳＴＴ１−）およびヘテロ接合遺伝子型（ＧＳＴＴ１＋／ＧＳＴＴ１−）が含まれる。
ＧＳＴＴ１遺伝子やタンパク質発現のレベルおよび／または機能的ＧＳＴＴ１タンパク質やＧＳＴＴ１活性のレベルに影響を及ぼすと予測される変異は、インフォマティクス系の技術を使用して同定可能である。例えば、ＧＳＴＴ１コード配列中に同定される遺伝子変異の予想される効果は、変化のあるコード配列を、インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で予想アミノ酸配列に「翻訳すること」によって決定可能である。このように、例えば、未成熟終止コドンが生じて、その結果、トランケート型で、潜在的に機能が無いＧＳＴＴ１ができると予想される変異が同定可能である。
ＧＳＴＴ１発現と機能の評価
本発明者が予想外に見出したのは、ＧＳＴＴ１発現が、細胞増殖（すなわち、増殖速度、もしくは、細胞倍化時間）および／または組織形成能と逆相関することである。本明細書中で使用される「ＧＳＴＴ１発現」は、遺伝子発現、タンパク質発現、および／またはＧＳＴＴ１タンパク質活性である場合がある。
ＧＳＴＴ１遺伝子発現は、当業者に周知の各種手段によって測定可能である。例えば、遺伝子発現は、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）またはレポーターに基づく方法によって、ＧＳＴＴ１のｍＲＮＡレベルを測定することによって測定可能である。
同様に、ＧＳＴＴ１タンパク質発現は、当技術分野で周知の各種方法によって測定可能である。例えば、ＧＳＴＴ１タンパク質発現を、抗体ベースの方法（例、ウエスタンブロッティング、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ等）によって測定する。発現はまた、レポーターベースの方法によっても測定される。
ＧＳＴＴ１活性（すなわち、ＧＳＴＴ１タンパク質機能）は、各種手段、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ活性を測定することによって評価可能である。
ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／又はＧＳＴＴ１活性の減少した単一幹細胞または複数の幹細胞を、細胞増殖（すなわち、増殖速度）および／または組織形成能が改善／向上したものとして同定する。
本発明のある方法に従って、ＧＳＴＴ１発現のリードアウトを、例えば、細胞、サンプル、および／または個体間で比較するか、あるいは、ＧＳＴＴ１発現の基準値と比較する。
例えば、単一幹細胞または複数の幹細胞のＧＳＴＴ１発現レベルを、その幹細胞タイプのＧＳＴＴ１発現レベルの基準値と比較する場合がある。
基準値は、その幹細胞タイプのＧＳＴＴ１発現レベルに関して知られた及び／又は公開済みの値である場合があるか、または、その幹細胞タイプのＧＳＴＴ１発現の平均（すなわち、中間）値である場合がある。いくつかの実施形態では、基準値は経験的に決定可能または既に決定されたものである場合がある。
いくつかの実施形態では、基準値は、ＧＳＴＴ１の遺伝子型がホモ接合野生型の遺伝子型（ＧＳＴＴ１＋／ＧＳＴＴ１＋）を有する対応する細胞のＧＳＴＴ１発現レベルに関する値である場合がある。
ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性は、細胞間（例、ＧＳＴＴ１遺伝子型がホモ接合野生型の幹細胞とＧＳＴＴ１遺伝子型がホモ接合野生型でない幹細胞との間）で比較可能である。
いくつかの実施形態では、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の基準値の１００％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満のＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性を有する。
いくつかの実施形態では、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性のレベルは、野生型ＧＳＴＴ１遺伝子のコピー数と相関する。例えば、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の最も高いものから最も低いものへと、遺伝子型はＧＳＴＴ１＋／ＧＳＴＴ＋＞ＧＳＴＴ１＋／ＧＳＴＴ−＞ＧＳＴＴ１−／ＧＳＴＴ−となる。
ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性のレベルと相関する以下に記載される各特性に関して、その特性は野生型ＧＳＴＴ１遺伝子のコピー数と相関する。
幹細胞
本明細書中で培養および記載される幹細胞は任意の種類の幹細胞であってもよい。幹細胞は、全能性、多能性、または多分化能のものであってもよい。幹細胞は胚性幹細胞または任意の組織由来の成体幹細胞である場合があり、そして、造血幹細胞、神経幹細胞、または間葉系幹細胞であってもよい。好ましくは、幹細胞は成体幹細胞である。
本明細書中では、幹細胞は、分裂能（すなわち、自己複製能）を有し、全能性、多能性、または多分化能のままであり、そして、特定分化した細胞を生ずる任意の細胞タイプを意味する。
本発明中で培養される幹細胞は、既存培養物から取得またはそれに由来する場合があるか、あるいは、任意の成体、胚性、または胎児組織（例、血液、骨髄、皮膚、表皮、もしくは臍帯（通常は廃棄される組織））から直接取得またはそれに由来する場合がある。
幹細胞の多分化能は、適切なアッセイの使用によって決定可能である。そのようなアッセイには、多能性の一又は複数のマーカー（例、アルカリホスファターゼ活性、以下のもの（ＲＵＮＸ２、オステリクス（ｏｓｔｅｒｉｘ）、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、Ｘ、オステオポンチン、オステオカルシン、ＢＳＰＩＩ、アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）、ＡＬＢＰ、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質−α（Ｃ／ＥＢＰα）、アディポサイト脂質結合タンパク質（ＡＬＢＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、骨シアロタンパク質２（ＢＳＰＩＩ）、コラーゲン２ａ１（ＣＯＬ２Ａ１）、およびＳＯＸ９）の検出）を検出する工程が含まれる場合がある。
いくつかの好ましい実施形態では、幹細胞は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（例えば、結合組織および／または骨細胞（例、軟骨細胞、骨芽細胞、筋細胞、および脂肪細胞）へと分化することができるもの）である。いくつかの好ましい実施形態では、ＭＳＣはＢＭ−ＭＳＣである。
間葉系幹細胞は最小限の侵襲的手法によって骨髄から容易に取得可能であり、そして、培養して拡張可能で所望の系列細胞へと分化することができる。分化は、特定の増殖因子を添加することによって誘導可能である。トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバータンパク質（例、骨形成タンパク質（ＢＭＰ））は、間葉系幹細胞が軟骨および骨分化するのに重要な因子である。
間葉系幹細胞は、（骨髄再生能の指標）ＣＤ３４＋画分から、選択マーカー（例、ＳＴＲＯ−１）を使用して単離および検出可能である。これらの細胞表面マーカーは、間葉系幹細胞の細胞表面にのみ見出され、細胞の多分化能の指標となる。
適切な間葉系幹細胞は、骨髄の吸引液（例、Ｗｅｘｌｅｒら、Ａｄｕｌｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｉｓ ａ ｒｉｃｈ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ’ｓｔｅｍ’ ｃｅｌｌｓ ｂｕｔ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ａｎｄ ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ａｄｕｌｔ ｂｌｏｏｄ ａｒｅ ｎｏｔ．ＨＡＥＭＯＰＯＩＥＳＩＳ ＡＮＤ ＬＥＵＣＯＣＹＴＥＳ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、１２１（２）：３６８−３７４、２００３年４月）、または臍帯のＷｈａｒｔｏｎゼリー（例、Ｔａら、Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｍａｒｋｅｒ Ａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．、２００９年、７月２０日（Ｅｐｕｂ））から回収された骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）から取得可能またはそれ由来である場合がある。
間葉系幹細胞は、当該技術分野で周知の適切な分化因子を適用することによって多能性幹細胞（例、ヒト胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞）を分化させることにより取得可能である。
間葉系幹細胞は、軟骨、骨、筋肉、腱、靱帯、および脂肪といった構成要素を生成する能力を有する多分化能前駆細胞である。これらの原始前駆細胞は、出生後にも存在して、そして、幹細胞の性質（つまり、低い発生頻度と高い自己再生能）を示す。分化の可塑性と組み合わされるこれらの特性は、損傷組織を置換するためにこれら細胞を使用する可能性への非常に大きな興味を生み出した。原則的には、これらの幹細胞を培養してその数を増やし、その後、損傷部位へと移植するか、または、基材中／上に播種後、適切な組織構築物を生成することができる。
従って、骨格、筋肉、腱、靱帯、および血液の修復／再生に関する代替的アプローチは、特定の組織増殖因子を賢く選択することと合わせて、再生を支持およびガイドする伝導性または誘導性基材と適切な前駆細胞（例、間葉系幹細胞、軟骨細胞）とを組みあわせて選択、培養拡張、および調整することである。
幹細胞は、任意の動物またはヒト（例、非ヒト動物（例、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、もしくは他の齧歯類（ネズミ目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）の任意の動物由来のものを含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類、もしくは他の非ヒト脊椎動物；非ヒト哺乳動物；および／またはヒト）から取得可能である。好ましくは、それら幹細胞はヒトのものである。任意ではあるが、それら幹細胞は非ヒトのものである。任意ではあるが、それら幹細胞は非胚性幹細胞である。任意ではあるが、それら幹細胞は全能性ではない。
本発明のさらに別の観点では、本発明の方法の内の任意のものによって作製された幹細胞もしくは他の細胞、その一部、またはその製品を含む医薬組成物を提供する。その医薬組成物は、医療措置方法において有用である場合がある。適切な医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体、アジュバント、または希釈剤をさらに含んでもよい。
本発明の別の観点では、本発明の方法の内の任意のものによって作製された幹細胞または他の細胞は、医療措置方法中で使用可能である。好ましくは、治療を必要とする個体へと治療的有効量の前記医薬品または医薬組成物を投与する工程を含む医療措置方法を提供する。
本発明に係る培養方法および手法を介して取得される幹細胞および他の細胞を使用して、医療措置方法中での使用のために別の細胞タイプへと分化させる場合がある。従って、分化済み細胞タイプは、記載される培養方法および手法によって取得される幹細胞由来である場合があるか、または、その幹細胞をさらに分化させたものの製品として見なされる場合がある。そのような分化細胞を、任意ではあるが医薬的に許容可能な担体、アジュバント、または希釈剤と共に含む医薬組成物を提供可能である。そのような医薬組成物は、医療措置方法において有用である場合がある。
間葉系幹細胞
いくつかの好ましい実施形態では、幹細胞は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（例えば、結合組織および／または骨細胞（例、軟骨細胞、骨芽細胞、筋細胞、および脂肪細胞）へと分化することができるもの）である。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄から元来単離され、１０４〜１０５個の骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）全体のほんの１個として存在する（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎら、１９６６年）。これらの細胞は単一前駆細胞に由来するコロニー（ＣＦＵ−Ｆ（線維芽細胞コロニー形成単位）集団とも呼ばれるもの）を形成することができる。ＭＳＣは、現在では、多数の他の組織（脂肪組織（ＧｉｍｂｌｅとＧｕｉｌａｋ、２００３年；Ｚｕｋら、２００１年）、臍帯血（Ｂｉｅｂａｃｋら、２００４年；Ｅｒｉｃｅｓら、２０００年；Ｇｏｏｄｗｉｎら、２００１年；Ｋｏｇｌｅｒら、２００４年；Ｗａｇｎｅｒら、２００５年）、および筋肉（Ｊｉａｎｇら、２００２年））中で同定されている。
多分化能のヒト間葉系間細胞（ＭＳＣ）の最小限評価基準が、国際細胞治療学会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）により記載されている（Ｄｏｍｉｎｉｃｉら、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ（２００６年）、Ｖｏｌ．８、Ｎｏ．４、３１５−３１７）。ヒトＭＳＣを定義する３つの評価基準：プラスチックへの接着、特定の表面抗原の発現、および多分化能が提案されている。特に述べられているのは、「第一に、ＭＳＣが組織培養フラスコを使用する標準的培養条件で維持される場合に、ＭＳＣがプラスチックに接着することが必要である」ことである。第二に、フローサイトメトリーで測定する場合に、９５％≧のＭＳＣ集団がＣＤ１０５、ＣＤ７３、およびＣＤ９０を発現することが必要なことである。さらに、これらの細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９αまたはＣＤ１９、およびＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）の発現がない（≦２％が陽性）ことが必要である。第三に、ＭＳＣは、標準的インビトロ分化条件下で、骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨芽細胞へと分化することができることが必要である。
Ｄｏｍｉｎｉｃｉらがまた述べているのは、ＭＳＣを最も独自のものとして規定する生物学的特質は、標準的インビトロ組織培養条件を使用して、骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨芽細胞へと３系列間葉系分化することができる能力である。著者らは、骨芽細胞への分化がアリザリンレッドまたはフォンコッサ染色によって染色することによって実証可能であることを確認した。また、脂肪細胞分化がオイルレッドＯ染色によって容易に実証可能であることを確認し、そして、軟骨芽細胞分化がアルシアンブルー染色によるか、またはコラーゲンＩＩ型の免疫組織化学染色によって実証可能なことも確認した。Ｄｏｍｉｎｉｃｉらは、そのようなアッセイ用キットが市販されていて、分化の実証は研究者なら誰でも実施可能であると述べている。
Ｄｏｍｉｎｉｃｉらはまた、ヒトＭＳＣを定義するのに使用可能でもある新規表面マーカーが将来的には同定可能であることも認識している。３種類のそのようなマーカー：ＣＤ４９ａ、ＳＳＥＡ−４、およびＳＴＲＯ−１が、現在知られている。
Ｒｉｄｅｒらは、ＣＤ４９ａ＋クローンが、ソーティングしていない細胞に比べて、ＣＤ９０とＣＤ１０５の発現が向上していることを報告した。そして、ＣＤ４９ａ＋クローンが、ソーティングしていない細胞に比べ、脂肪、骨、および軟骨への多系列へと容易に分化することを実証した。このことは、間葉系幹細胞の濃縮にα１インテグリン（ＣＤ４９ａ）を選択して使用することを支持する。そして、Ｒｉｄｅｒらは、骨髄単核幹細胞のヘテロなプールから最も多分化能な細胞を選抜する戦略を提供した（Ｒｉｄｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｈｉｓｔ（２００７年）３８：４４９−４５８）。Ｒｉｄｅｒらはまた、ＣＦＵ−Ｆ細胞がＣＤ４９ａ発現と関連すること、そして、ＣＤ４９ａ発現ＣＦＵ−Ｆ細胞がまたＳＴＲＯ−１を共発現し、ＣＤ４９ａを使用して、ヒトに加えてラットとマウスからＭＳＣを単離することができることも報告する。このことは、ＣＤ４９ａが濃縮のための種間保存マーカーである可能性を示す。
Ｇａｎｇらは、ステージ特異的胚性抗原ＳＳＥＡ−４（未分化多能性ヒト胚性幹細胞のマーカーと胚盤胞ステージの胚の卵割のマーカーとして一般的に使用されるもの）が、成体ヒト間葉系幹細胞集団を識別し、そして、それを使用してＭＳＣを単離することができることを報告する（Ｇａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ、２００７年、１０９：１７４３〜１７５１）。Ｇａｎｇらはまた、クローン増殖性のストローマ細胞（ＣＦＵ−Ｆ）（いわゆる、ＳＴＲＯ−１＋ｂｒｉｇｈｔ）の濃縮における、表面マーカーＳＴＲＯ−１に結合するモノクローナル抗体の使用を記載する。
胚性幹細胞
胚性幹細胞は、霊長目の種のメンバーの胚盤胞から単離可能である（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：７８４４、１９９５年）。ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１１４５、１９９８年；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ｆｆ．、１９９８年）およびＲｅｕｂｉｎｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９、２０００年によって記載された手法を使用して、ヒト胚盤胞から調製可能である。
手短には、ヒト胚盤胞は、ヒトのインビボ着床前胚から取得可能である。代替的には、インビトロ授精（ＩＶＦ）胚を使用してもよいし、または、一細胞のヒト胚を胚盤胞ステージへと拡張してもよい（Ｂｏｎｇｓｏら、Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ４：７０６，１９８９）。ヒト胚を、Ｇ１．２とＧ２．２培地中で胚盤胞ステージへと培養する（Ｇａｒｄｎｅｒら、Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６９：８４、１９９８年）。発生する胚盤胞を、胚性幹細胞の単離のために選択する。プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ社）に短時間暴露することによって胚盤胞から透明帯を除去する。内部細胞塊を免疫外科的処置によって単離する。その処置では、胚盤胞を１：５０倍に希釈したウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に３０分間暴露し、その後、ＤＭＥＭ中で３回５分間洗浄し、そして、１：５倍希釈したモルモット補体（Ｇｉｂｃｏ社）に３分間暴露する（Ｓｏｌｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７２：５０９９、１９７５年を参照されたい）。さらに２回ＤＭＥＭ中で洗浄後、穏やかにピペッティングすることによってインタクトな内部細胞塊（ＩＣＭ）から溶解した栄養外胚葉細胞を除去し、そして、そのＩＣＭをｍＥＦフィーダー細胞層上に蒔く。
９〜１５日後、内部細胞塊から派生して伸び出たものを解離させて複数の集合体にするのは、１ｍＭのＥＤＴＡを有するカルシウムとマグネシウム不含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に暴露することによってか、ディスパーゼまたはトリプシンに暴露することによってか、または、マイクロピペットで機械的に解離させることによってかのいずれかで行う。その後、新らしい培地中でｍＥＦ上に再度蒔く。解離細胞を新しい胚性幹細胞（ＥＳ）培地中のｍＥＦフィーダー細胞層上に再度蒔き、そして、コロニー形成を観察する。未分化形態を示すコロニーを、マイクロピペットを用いて個別に選別し、機械的に解離させて複数の集合体にし、そして、再度播種する。胚性幹細胞様形態の特徴は、核対細胞質比が見かけ上高く且つはっきりとした核小体を有するコンパクトなコロニーである。得られた胚性幹細胞を、その後、軽くトリプシン処理し、ダルベッコＰＢＳ（カルシウムとマグネシウム不含有で２ｍＭのＥＤＴＡを有するもの）に暴露し、ＩＶ型コラーゲナーゼ（約２００Ｕ／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ社）に暴露することによってか、または、マイクロピペットで個々のコロニーを選択することによって、１〜２週間ごとにルーチン的に継代する。約５０〜１００個の細胞の集合体サイズが最適である。
誘導多能性幹細胞
誘導多能性幹細胞は、一般的にはｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略記されるが、非多能性細胞（一般的には、成体体細胞（例、線維芽細胞、肺細胞、又はＢ細胞））に、ある種の複数遺伝子を挿入することによって人工的に誘導される多能性幹細胞のあるタイプである。ｉＰＳ細胞は総説が書かれ議論もされている：Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．＆Ｙａｍａｎａｋａ（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ、２００６年；１２６：６６３-６７６）、Ｙａｍａｎａｋａ Ｓら（Ｙａｍａｎａｋａ Ｓら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｆａｃｔｏｒｓ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００７．１１．０１９、および、Ｙａｍａｎａｋａ Ｓら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｒｍｌｉｎｅ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ、２００７年；４４８：３１３−７）、Ｗｅｒｎｉｇ Ｍら（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｎｔｏ ａ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ＥＳ−ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ ｓｔａｔｅ．Ｎａｔｕｒｅ、２００７年；４４８：３１８−２４）、Ｍａｈｅｒａｌｉ Ｎら（Ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｓｈｏｗ ｇｌｏｂａｌ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、２００７年；１：５５-７０）とＴｈｏｍｓｏｎ ＪＡ，Ｙｕ Ｊら（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１５１５２６）、ならびにＴａｋａｈａｓｈｉら（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ．（２００７年）１３１（５）：８６１−７２．）（全ては参照によって本明細書中に組み込まれる）。
ｉＰＳ細胞は、ある種の複数の幹細胞関連遺伝子を非多能性細胞（例、成体線維芽細胞）へとトランスフェクションすることによって典型的には誘導される。トランスフェクションは、ウイルスベクター（例、レトロウイルス）を介して典型的には達成される。トランスフェクトされる遺伝子には、マスター転写制御因子Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２が含まれる。一方、他の遺伝子が誘導効率を向上させることも示唆されている。３〜４週間後、少ない数ではあるが、トランスフェクトされた細胞が、形態学的および生化学的に多能性幹細胞に類似するようになり始める。そして、その一般的単離は、形態学的選別を介したり、倍化時間を介したり、または、レポーター遺伝子と抗生物質を感染発現させることを通して行う。
多能性細胞の供給源
胚の破壊につながらないいくつかの方法（例、成体体細胞または生殖細胞を形質転換（誘導）することによるもの）が、多能性幹細胞の単離のために、現在提供されている。これらに方法には以下のものが含まれる。
１．核移植による初期化。この技術は体細胞から卵子または接合子中へと核を移植することに関わる。いくつかの状況では、核移植は動物−ヒトハイブリッド細胞の創出を導く場合がある。例えば、ヒト体細胞を動物卵子または接合子と融合すること、あるいは、ヒト卵子または接合子を動物体細胞と融合することによって細胞が創出可能である。
２．胚性幹細胞と融合することによる初期化。この技術は、体細胞を胚性幹細胞と融合することに関わる。この技術はまた、動物−ヒトハイブリッド細胞（上記１に記載）の創出を導く可能性がある。
３．培養による自発的初期化。この技術は、長期培養後に非多能性細胞から多能性細胞を作製することに関する。例えば、多能性胚性生殖（ＥＧ）細胞が、始原生殖細胞（ＰＧＣ）を長期培養することによって作製された（Ｍａｔｓｕｉら、Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｕｒｉｎｅ ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｃｅｌｌ、７０，８４１-８４７，１９９２；参照により本明細書中に組み込まれる）。骨髄由来細胞の長期培養後に多能性幹細胞が発生したことも報告されている（Ｊｉａｎｇら、Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍａｄｕｌｔ ｍａｒｒｏｗ．Ｎａｔｕｒｅ、４１８，４１-４９，２００２；参照により本明細書中に組み込まれる）。著者らはこれらの細胞を、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）と名付けた。Ｓｈｉｎｏｈａｒａらはまた、新生仔マウス精巣由来の生殖幹（ＧＳ）細胞の培養過程で、多能性幹細胞が生成可能であることを示した。著者らは、その細胞を多能性生殖幹（ｍＧＳ）細胞と名付けた（Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｎｅｏｎａｔａｌ ｍｏｕｓｅ ｔｅｓｔｉｓ．Ｃｅｌｌ、１１９，１００１-１０１２，２００４）。
４．特定因子による初期化。例えば、マウス胚または成体線維芽細胞中へ転写因子（例、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫＬＦ４）を、レトロウイルスを介して導入することによってｉＰＳ細胞を作製する（例えば、上記したように）。Ｋａｊｉら（Ｖｉｒｕｓ−ｆｒｅｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ．、オンライン出版、２００９年３月１日）はまた、複数タンパク質を発現する単一ベクター（２Ａペプチドで連結されたｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２のコード化配列を含むもの）であって、マウスとヒト線維芽細胞の両方ともを初期化することができるベクターを記載している。この非ウイルスベクターを用いて作製されたｉＰＳ細胞は、多能性マーカーの強力な発現を示す。このことは、初期化状態がインビトロ分化アッセイと成キメラマウスの形成により機能的に確認され得ることを示している。著者らは、多能性マーカーの強力な発現を有する胚性線維芽細胞から初期化されたヒト細胞株を確立するのに成功した。
１〜４の方法は、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｔｉｅｎｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、１、２００７年７月、ａ２００７ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社）（参照により本明細書中に組み込まれる）中で山中伸弥によって記載および考察されている。
５．単一の卵割球または生検卵割球からのｈＥＳＣの誘導。Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ Ｉ，Ｃｈｕｎｇ Ｙ，Ｂｅｃｋｅｒ Ｓ，Ｌｕ ＳＪ，Ｌａｎｚａ Ｒ．「Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ．」Ｎａｔｕｒｅ、２００６年；４４４：５１２、Ｌｅｉら、「Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ，ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．」Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７年）１７：６８２−６８８、Ｃｈｕｎｇ Ｙ，Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ Ｉ，Ｂｅｃｋｅｒ Ｓら、「Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｕｓｅ ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ．」Ｎａｔｕｒｅ．２００６年；４３９：２１６−２１９、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ Ｉ，Ｃｈｕｎｇ Ｙ，Ｂｅｃｋｅｒ Ｓら、「Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ．」Ｎａｔｕｒｅ．２００６年；４４４：４８１−４８５、Ｃｈｕｎｇ Ｙ，Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ Ｉ，Ｂｅｃｋｅｒ Ｓら、「Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｍｂｒｙｏ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．」Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００８年；２：１１３−１１７、およびＤｕｓｋｏ Ｉｌｉｃら、（「Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｂｉｏｐｓｉｅｄ ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｆｅｅｄｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｘｅｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．」Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ-出版前の論文）を参照されたい（全ては参照により本明細書中に組み込まれる）。
６．卵割が中断し、インビトロで桑実胚および胚盤胞へと発生できなかった停止胚から取得されるｈＥＳＣ株。Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃ Ｐ，Ｐｒｚｙｂｏｒｓｋｉ Ｓら、「Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａｎｄ ａｒｒｅｓｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｓ．」Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２００６年；２４：２６６９−２６７６、および、Ｌｅｉら、「Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ，ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．」Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７年）１７：６８２−６８８を参照されたい（両文献は参照により本明細書中に組み込まれる）。
７．単為生殖（単性生殖）。この技術は、未受精卵を化学または電気刺激して、それを、胚性幹細胞が誘導可能な卵割球へと発生させることに関する。例えば、Ｌｉｎら、「Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｍｅｔａｐｈａｓｅ ＩＩ ｏｏｃｙｔｅｓ．」Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２００３年；２１（２）：１５２−６１を参照されたい。著者らは、幹細胞を作製するために減数第二分裂中期の未受精卵を、化学物質を使って活性化した。
８．胎仔起源の幹細胞。これらの細胞は多能性に関して胚性幹細胞と成体幹細胞の中間にあり、そして、これら細胞を使用して、多能性または多分化能性細胞を誘導することができる。Ｃｈｒｉｓ Ｈ．Ｊｏらは、多能性マーカー（例、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｒｅｘ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１-６０、およびＴｒａ−１-８１；β−ガラクトシダーゼによって示される細胞老化（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）の証拠が最低限であること、テロメラーゼ活性の恒常的発現）を発現するヒト臍帯由来胎児間葉系幹細胞（ＵＣ ｆＭＳＣ）を誘導することに成功した（Ｆｅｔａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｓｕｓｔａｉｎ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｄｕｒｉｎｇ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．、Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ（２００８年）３３４：４２３-４３３；参照により本明細書中に組み込まれる）。Ｗｉｎｓｔｏｎ Ｃｏｓｔａ Ｐｅｒｅｉｒａら（「Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」、Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ、２００８年；２：３９４-３９９（参照により本明細書中に組み込まれる））は、ヒト臍帯のワルトンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ ｊｅｌｌｙ）から間葉系幹細胞の純粋な集団を単離した。ワルトンゼリー由来の間葉系幹細胞はまた、Ｔｒｏｙｅｒ＆Ｗｅｉｓｓによって総説が書かれている（Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｒｅｖｉｅｗ：「Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｒｅ ａ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．」Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２００８年：２６：５９１−５９９）。Ｋｉｍら（「Ｅｘ ｖｉｖｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．」Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２００７年冬；９（４）：５８１−９４（参照により本明細書中に組み込まれる））は、ヒト羊膜からヒト羊膜由来間葉系細胞を単離するのに成功した。臍帯は、通常は廃棄される組織であり、この組織から誘導される幹細胞は、道徳的または倫理的な反対を受けることがない傾向があった。
９．Ｃｈｕｎｇら［（２００８年）「Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｅｍｂｒｙｏ Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．」Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．、２（２）１１３−１１７．Ｅｐｕｂ２００８年１月１０日］は、胚を破壊してヒト胚性幹（ｓｅｔｍ）細胞株を作製したことを記載する。
誘導多能性幹細胞の利点は、それら細胞が、胚を破壊しない方法、より特には、ヒトまたは哺乳動物胚の破壊を生じない方法によって取得可能なことである。
Ｃｈｕｎｇら（上記９項）に記載される方法はまた、ヒト胚を破壊しない方法によっても、ヒト胚性幹細胞を取得することを可能とする。
そのように、本発明の観点は、細胞が由来するヒトまたは動物胚の破壊に関与する必要のある方法によって調製することが必須でない細胞を使用することによって実行または実施可能である。この任意的な限定は、欧州特許庁の拡大審判部の審決Ｇ０００２／０６（２００８年１１月２５日）を考慮することを具体的には意図している。
細胞増殖
本発明が部分的に基づく知見は、幹細胞増殖（即ち、増殖速度）がＧＳＴＴ１発現と逆相関することである。本明細書中で使用される「細胞増殖」は、細胞分裂による細胞数の増加を指す。
本発明者らは、ＧＳＴＴ１発現レベルのより低い幹細胞がより早く増殖する（すなわち、その幹細胞の増殖速度がより高い）ことを予想外に見出した。細胞増殖／増殖速度は、細胞が二つの娘細胞に分裂するのにかかる時間（すなわち、細胞倍化時間）として測定可能である。
細胞増殖、細胞倍化時間、および／または増殖速度は、当業者に周知の方法によってルーチン的に決定可能である。
ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞、ならびに、増殖速度が増加した幹細胞は、その幹細胞タイプの細胞倍化時間の基準値未満の細胞倍化時間を有する。
基準値は、その幹細胞タイプの既知および／または公開済みの細胞倍化時間である場合があるか、あるいは、その幹細胞タイプの平均（すなわち、中間）細胞倍化時間である場合がある。いくつかの実施形態では、基準細胞倍化時間は経験的に決定可能または既に決定されたものである場合がある。
細胞増殖、細胞倍化時間、および／または増殖速度は、同一の培養条件下でインビトロ細胞培養し、所定の時点で細胞を計数することによって、細胞間（例、ＧＳＴＴ１の遺伝子型がホモ接合野生型の幹細胞とＧＳＴＴ１の遺伝子型がホモ接合野生型でない幹細胞との間）で比較可能である。
いくつかの実施形態では、基準細胞倍化時間は、ＧＳＴＴ１の遺伝子型がホモ接合野生型（ＧＳＴＴ１＋／ＧＳＴＴ１＋）の幹細胞の細胞倍化時間である場合がある。
いくつかの実施形態では、増殖速度の増加した幹細胞は、基準細胞倍化時間の１００％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満の細胞倍化時間を有する。
クローン増殖能
本発明が部分的に基づく知見は、幹細胞のクローン増殖能がＧＳＴＴ１発現と逆相関することである。つまり、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、クローン増殖能が増加している。本明細書中で使用される「クローン増殖能」は、幹細胞が自己複製する能力を指す。
例えば、ＭＳＣに関するクローン増殖能は、線維芽細胞コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｆ）の解析によって測定可能である。例えば、ＣＦＵ−Ｆ解析を以下のように実施してもよい：
（ｉ）２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２ｍＭのｌ−グルタミン、１００μＭのｌ−アスコルベート−２−ホスフェート、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、およびβ−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）を添加したα−ＭＥＭ中、各ウエル当たり０．３、１．０、および３．０×１０５細胞で、６穴培養プレート中に骨髄単核細胞を播種し；
（ｉｉ）１２日間、５％ＣＯ２および＞９０％の湿度において、３７℃で細胞をインキュベートし；
（ｉｉｉ）細胞を、ＰＢＳで洗浄し、そして、ＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで２０分間固定し；
（ｉｖ）１時間、０．１％（ｗ／ｖ）のトルイジン・ブルー（１％パラホルムアルデヒド溶液中のもの）で固定後の細胞を染色し、そして；
（ｖ）ＣＦＵ−Ｆを計数する
（５０個より多い細胞からなる集合体をＣＦＵ−Ｆとして数を数える）。
クローン増殖能が増加した幹細胞は、その幹細胞タイプのＣＦＵ−Ｆの基準値に比較して、ＣＦＵ−Ｆ頻度が増加している。
基準値は、その幹細胞タイプの既知および／または公開済みのＣＦＵ−Ｆ頻度である場合があるか、あるいは、その幹細胞タイプの平均（すなわち、中間）ＣＦＵ−Ｆ頻度である場合がある。いくつかの実施形態では、基準ＣＦＵ−Ｆ頻度は経験的に決定可能または既に決定されたものである場合がある。
いくつかの実施形態では、基準ＣＦＵ−Ｆ頻度は、ＧＳＴＴ１の遺伝子型がホモ接合野生型（ＧＳＴＴ１＋／ＧＳＴＴ１＋）の幹細胞のＣＦＵ−Ｆ頻度である場合がある。
いくつかの実施形態では、クローン増殖能の増加した幹細胞は、ＣＦＵ−Ｆ頻度が基準ＣＦＵ−Ｆ頻度よりも０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．５％、０．７５％、１％、１．２５％、１．５％、１．７５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１２．５％、１５％、１７．５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以上増加している。
ＣＦＵ−Ｆ頻度は、上記方法または当業者に既知の他の方法によって、細胞間（例、ＧＳＴＴ１の遺伝子型がホモ接合野生型の幹細胞とＧＳＴＴ１の遺伝子型がホモ接合野生型でない幹細胞との間）で比較可能である。
いくつかの実施形態では、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した培養幹細胞の部分の多くは、親幹細胞の多能性または多分化能性（例、幹細胞がその幹細胞のタイプに特徴的な特異的組織型へと分化する能力）を維持する。例えば、好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の内一つの培養幹細胞が、親幹細胞の多能性または多分化能性を示す。このことは、多能性または多分化能性培養物の培養開始時の細胞数と比べて評価可能である。いくつかの実施形態では、多能性または多分化能性細胞の割合の増加は、対応する培養条件に供されるコントロール幹細胞培養物に対して比較する場合がある。
組織形成
増殖速度および／またはクローン増殖能が適宜向上している幹細胞は、組織形成能も向上している。つまり、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、組織を形成する能力が向上している。
本明細書中で使用される「組織形成能」は、幹細胞が組織を形成する能力を指す。この能力は、組織量（例、組織の立体的容量および／または重量）である場合があるし、または、組織の質的なもの（例、密度）であってもよい。
例えば、組織は、骨、軟骨、筋肉、腱、靱帯、脂肪、半月板、または神経組織である場合がある。いくつかの実施形態では、幹細胞はＭＳＣであり、そして、組織は骨組織である。
いくつかの実施形態では、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、インビトロおよび／またはインビボで組織を形成する能力が向上している。
組織形成能は、当業者に既知の方法によってルーチン的に評価可能である。典型的には、単一幹細胞または幹細胞集団を、幹細胞を誘導して特定組織の系列へと分化させる（インビトロまたはインビボ）条件下に置くことになる。
例えば、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）の骨形成は、以下に記載されるように測定可能である。
組織形成能が向上した幹細胞は、同じ条件下でのその幹細胞タイプの基準組織量と比較して、開始時の細胞当たりの組織よりも多く、所定時間内に組織を形成する。基準組織量は、既知および／または公開済みである場合があるか、あるいは、その幹細胞タイプの平均値（すなわち、中間値）である場合がある。いくつかの実施形態では、基準組織量は経験的に決定可能または既に決定されたものである場合がある。
いくつかの実施形態では、基準組織量は、ＧＳＴＴ１の遺伝子型がホモ接合野生型（ＧＳＴＴ１＋／ＧＳＴＴ１＋）の幹細胞によって形成される組織量である場合がある。
組織形成能は、同じ組織型へと分化することに関してと同じ時間量に関して同一条件下で同じ数の幹細胞を入れることによって、細胞間（例、ＧＳＴＴ１の遺伝子型がホモ接合野生型の幹細胞とＧＳＴＴ１の遺伝子型がホモ接合野生型でない幹細胞との間）で比較可能である。得られた組織を、その後、解析する。
いくつかの実施形態では、組織形成能が向上した幹細胞は、基準幹細胞によって形成される組織量と比較して、その組織量の１倍より多く、１．１倍より多く、１．２倍より多く、１．３倍より多く、１．４倍より多く、１．５倍より多く、１．６倍より多く、１．７倍より多く、１．８倍より多く、１．９倍より多く、２倍より多く、２．１倍より多く、２．２倍より多く、２．３倍より多く、２．４倍より多く、２．５倍より多く、２．６倍より多く、２．７倍より多く、２．８倍より多く、２．９倍より多く、３倍より多く、３．１倍より多く、３．２倍より多く、３．３倍より多く、３．４倍より多く、３．５倍より多く、３．６倍より多く、３．７倍より多く、３．８倍より多く、３．９倍より多く、４倍より多く、４．１倍より多く、４．２倍より多く、４．３倍より多く、４．４倍より多く、４．５倍より多く、４．６倍より多く、４．７倍より多く、４．８倍より多く、４．９倍より多く、または５倍より多く形成する。
マーカー
本発明者らは、ＧＳＴＴ１発現と相関する性質をさらに同定した。
いくつかの実施形態では、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、ＧＳＴＴ１がホモ接合で野生型（ＧＳＴＴ１＋／ＧＳＴＴ１＋）の幹細胞および／またはその幹細胞タイプの平均値（すなわち、中間値）よりも、
（ｉ）コロニー形成能の向上している場合があり；
（ｉｉ）サイズがより小さい場合があり；
（ｉｉｉ）テロメアがより長い、またはテロメア短縮率が減少している場合があり；
（ｉｖ）ＳＴＲＯ−１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ１４６および／またはＰＤＧＦＲβの発現が増加している場合があり；
（ｖ）ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１α、フラクタルカイン、ＰＤＧＦ−ＢＢ、および／またはＭＩＰ−１αの分泌が増加している場合があり；
（ｖｉ）Ｔ細胞抑制能の向上を示す場合があり；
（ｖｉｉ）ＡＬＰ、ＲＵＮＸ２、および／またはＢＳＰ−ＩＩの発現が減少している場合があり；
（ｖｉｉｉ）ＴＷＩＳＴ−１および／またはＤＥＲＭＯ−１の発現が増加している場合がある。
これらの特性は、当業者によって容易に検証可能である。
一又は複数のこれらの特性を有する幹細胞は、従って、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞を同定するのに有用である。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、スクリーニング前工程を含んでいて、そこでは、幹細胞集団または個体から取得したサンプルは、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現、ＧＳＴＴ１活性、および／またはＧＳＴＴ１遺伝子型の決定前に、一又は複数のこれらの性質に関して解析可能である。
いくつかの実施形態では、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、基準幹細胞（ここで、基準細胞は、ＧＳＴＴ１がホモ接合野生型（ＧＳＴＴ１＋／ＧＳＴＴ１＋）の幹細胞である場合がある）のサイズまたはその幹細胞タイプの平均（すなわち、中間）サイズの１００％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満のサイズを有する。
いくつかの実施形態では、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、基準幹細胞（ここで、基準細胞は、ＧＳＴＴ１がホモ接合野生型（ＧＳＴＴ１＋／ＧＳＴＴ１＋）の幹細胞である場合がある）のテロメア短縮率またはその幹細胞タイプのテロメア短縮率の平均値（すなわち、中間値）の１００％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満のテロメア短縮率を有する。
テロメア短縮率は、例えば、Ｓａｍｓｏｎｒａｊら、「Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｌｅｎｇｔｈ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ」、Ｇｅｎｅ、２０１３年中のように調べることができる。
いくつかの実施形態では、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、基準幹細胞（ここで、基準細胞は、ＧＳＴＴ１がホモ接合野生型（ＧＳＴＴ１＋／ＧＳＴＴ１＋）の幹細胞）またはその幹細胞タイプの増殖因子受容体発現の平均値（すなわち、中間値）と比較すると、増殖因子受容体の発現が相対的に高い。
例えば、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、ＳＴＲＯ−１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ１４６、および／またはＰＤＧＦＲβの内一又は複数のものの発現が相対的に高い場合がある。いくつかの実施形態では、発現レベルは、基準幹細胞の発現と比較すると、１倍より多く、１．１倍より多く、１．２倍より多く、１．３倍より多く、１．４倍より多く、１．５倍より多く、１．６倍より多く、１．７倍より多く、１．８倍より多く、１．９倍より多く、２倍より多く、２．１倍より多く、２．２倍より多く、２．３倍より多く、２．４倍より多く、２．５倍より多く、２．６倍より多く、２．７倍より多く、２．８倍より多く、２．９倍より多く、３倍より多く、３．１倍より多く、３．２倍より多く、３．３倍より多く、３．４倍より多く、３．５倍より多く、３．６倍より多く、３．７倍より多く、３．８倍より多く、３．９倍より多く、４倍より多く、４．１倍より多く、４．２倍より多く、４．３倍より多く、４．４倍より多く、４．５倍より多く、４．６倍より多く、４．７倍より多く、４．８倍より多く、４．９倍より多く、または５倍より多い。
例えば、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した細胞は比較的高い割合で、ＳＴＲＯ−１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ１４６、および／またはＰＤＧＦＲβの内一又は複数のものの発現が、基準幹細胞と比較して陽性となる。
増殖因子受容体の発現は、当業者に既知の各種手段（例、フローサイトメトリーおよび／または遺伝子発現解析）によって測定可能である。
いくつかの実施形態では、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、基準幹細胞（ここで、基準細胞は、ＧＳＴＴ１がホモ接合野生型（ＧＳＴＴ１＋／ＧＳＴＴ１＋）の幹細胞である場合がある）またはその幹細胞タイプの創傷治癒に関与する因子の分泌レベルの平均値（すなわち、中間値）と比較すると、創傷治癒に関与する因子の分泌が相対的に高い。
例えば、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、相対的に高い量のＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１α、フラクタルカイン、ＰＤＧＦ−ＢＢ、および／またはＭＩＰ−１αを分泌する場合がある。いくつかの実施形態では、その分泌レベルは、基準幹細胞による分泌の１倍より多く、１．１倍より多く、１．２倍より多く、１．３倍より多く、１．４倍より多く、１．５倍より多く、１．６倍より多く、１．７倍より多く、１．８倍より多く、１．９倍より多く、２倍より多く、２．１倍より多く、２．２倍より多く、２．３倍より多く、２．４倍より多く、２．５倍より多く、２．６倍より多く、２．７倍より多く、２．８倍より多く、２．９倍より多く、３倍より多く、３．１倍より多く、３．２倍より多く、３．３倍より多く、３．４倍より多く、３．５倍より多く、３．６倍より多く、３．７倍より多く、３．８倍より多く、３．９倍より多く、４倍より多く、４．１倍より多く、４．２倍より多く、４．３倍より多く、４．４倍より多く、４．５倍より多く、４．６倍より多く、４．７倍より多く、４．８倍より多く、４．９倍より多く、または５倍より多い。
創傷治癒に関与する因子の発現は、当業者に既知の各種手段（例、ＥＬＩＳＡによる遺伝子発現解析）によって測定可能である。
いくつかの実施形態では、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、基準幹細胞（ここで、基準細胞は、ＧＳＴＴ１がホモ接合野生型（ＧＳＴＴ１＋／ＧＳＴＴ１＋）の幹細胞）またはその幹細胞タイプのＴ細胞抑制能の平均値（すなわち、中間値）と比較すると、Ｔ細胞を抑制する能力が向上している。Ｔ細胞抑制能を評価するアッセイは、当業者に周知である。例えば、Ｔ細胞抑制は、Ｔ細胞増殖を抑制する能力を評価することによって測定可能である。
いくつかの実施形態では、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、骨形成マーカーの発現が減少している。例えば、その幹細胞は、ＧＳＴＴ１がホモ接合野生型（ＧＳＴＴ１＋／ＧＳＴＴ１＋）の幹細胞および／またはその幹細胞タイプの発現の平均値（すなわち、中間値）よりも、ＡＬＰ、ＲＵＮＸ２、および／またはＢＳＰ−ＩＩの発現が減少している場合がある。いくつかの実施形態では、その発現レベルは、基準幹細胞の発現レベルと比較すると、その発現レベルの１倍未満、０．９倍未満、０．９倍未満、０．８倍未満、０．７倍未満、０．６倍未満、０．５倍未満、０．４倍未満、０．３倍未満、０．２倍未満、または０．１倍未満である場合がある。
いくつかの実施形態では、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、中胚葉系の遺伝子の発現が増加している。例えば、その幹細胞は、ＧＳＴＴ１がホモ接合野生型（ＧＳＴＴ１＋／ＧＳＴＴ１＋）の幹細胞および／またはその幹細胞タイプの発現の平均値（すなわち、中間値）と比較すると、ＴＷＩＳＴ−１および／またはＤＥＲＭＯ−１の発現が増加している。いくつかの実施形態では、その発現レベルは、基準幹細胞の発現レベルと比較すると、その発現レベルの１倍より多く、１．１倍より多く、１．２倍より多く、１．３倍より多く、１．４倍より多く、１．５倍より多く、１．６倍より多く、１．７倍より多く、１．８倍より多く、１．９倍より多く、２倍より多く、２．１倍より多く、２．２倍より多く、２．３倍より多く、２．４倍より多く、２．５倍より多く、２．６倍より多く、２．７倍より多く、２．８倍より多く、２．９倍より多く、３倍より多く、３．１倍より多く、３．２倍より多く、３．３倍より多く、３．４倍より多く、３．５倍より多く、３．６倍より多く、３．７倍より多く、３．８倍より多く、３．９倍より多く、４倍より多く、４．１倍より多く、４．２倍より多く、４．３倍より多く、４．４倍より多く、４．５倍より多く、４．６倍より多く、４．７倍より多く、４．８倍より多く、４．９倍より多く、または５倍より多い場合がある。
遺伝子発現は、当業者に周知の各種手段（例、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ））によって測定可能である。
本発明に係る方法は、インビトロまたはインビボで実施可能である。用語「インビトロ」は、実験室条件中または培養中の材料、生体物質、細胞、および／または組織を用いる実験を含むことを意図している。一方で、用語「インビボ」は、インタクトな多細胞生物を用いる実験および手順を含むことを意図している。
ＧＳＴＴ１発現の改変
本発明者らは、幹細胞の増殖速度および／または組織形成能が、ＧＳＴＴ１遺伝子またはタンパク質の発現レベル、あるいは、ＧＳＴＴ１機能を変化させることによって改変可能であることを発見した。
従って、本発明は、単一幹細胞または複数の幹細胞を改変する方法であって、単一幹細胞または複数の幹細胞を、ＧＳＴＴ１発現および／または機能を減少させるように幹細胞を改変することができる薬剤と接触させる工程を含む方法を提供する。
当業者は、ＧＳＴＴ１遺伝子やタンパク質の発現および／または機能を減少させるように幹細胞を改変することができる薬剤を同定する能力は十分にある。
いくつかの実施形態では、ＧＳＴＴ１発現および／または機能を減少させるように幹細胞を改変可能な薬剤は、ＧＳＴＴ１の転写、ｍＲＮＡプロセシング（例、スプライシング）、ｍＲＮＡ安定性、翻訳、翻訳後プロセシング、タンパク質安定性、タンパク質分解、および／またはＧＳＴＴ１タンパク質機能／活性に影響を与えることによって、ＧＳＴＴ１遺伝子やタンパク質の発現および／またはＧＳＴＴ１機能の減少を実効化する場合がある。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＧＳＴＴ１ｍＲＮＡのレベルに作用する薬剤である場合がある。例えば、その薬剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって、ＧＳＴＴ１発現をノックダウン可能である。
いくつかの実施形態では、薬剤は阻害的核酸である場合がある。阻害的核酸は、アンチセンスまたは小分子干渉ＲＮＡ（限定はされないが、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含むもの）であってもよい。
いくつかの実施形態では、阻害的核酸を、ベクター上で提供する。例えば、いくつかの実施形態では、その薬剤は、ＧＳＴＴ１に対するｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスベクターであってもよい。
いくつかの実施形態では、薬剤は、幹細胞によるＧＳＴＴ１遺伝子やタンパク質の発現および／またはＧＳＴＴ１機能／活性を減少させるように幹細胞のゲノムを改変可能な薬剤である場合がある。例えば、その薬剤は、ＧＳＴＴ１を破壊および／または不活性化することができる場合があり、および／または、ＧＳＴＴ１遺伝子やタンパク質の発現および／またはＧＳＴＴ１機能／活性を減少可能な分子をコードする配列をコードするＤＮＡ配列と一体となっている場合がある。
いくつかの実施形態では、薬剤はＧＳＴＴ１タンパク質の阻害剤である場合がある。例えば、その薬剤は、ＧＳＴＴ１タンパク質に結合して、ＧＳＴＴ１機能／活性を阻害可能な分子であってもよい。いくつかの実施形態では、薬剤はＧＳＴＴ１に対する抗体である場合がある。いくつかの実施形態では、薬剤はＧＳＴＴ１機能／活性の競合阻害剤である場合がある。
いくつかの実施形態では、本方法は、（ｉ）任意ではあるが、個体から、単一幹細胞または複数の幹細胞を単離する工程と、（ｉｉ）単離された単一幹細胞または複数の幹細胞を、ＧＳＴＴ１発現および／または機能を減少させるように幹細胞を改変することができる薬剤とインビトロで接触させる工程と、を含む。
本発明はまた、内在性ＧＳＴＴ１発現および／または機能を減少させるように改変された単一幹細胞または複数の幹細胞を提供する。いくつかの実施形態では、幹細胞（複数可）は、薬剤を用いて、ＧＳＴＴ１遺伝子やタンパク質の発現および／またはＧＳＴＴ１機能が改変された。
また提供されるのは、ＧＳＴＴ１遺伝子やタンパク質の発現および／またはＧＳＴＴ１の機能を減少させることができる薬剤を含む単一幹細胞または複数の幹細胞である。
また提供されるのは、単一幹細胞または複数の幹細胞が改変されて、野生型ＧＳＴＴ１がホモ接合型である幹細胞および／またはその幹細胞タイプに関してＧＳＴＴ１発現および／または機能が平均（すなわち、中間）レベルの幹細胞に比べて、ＧＳＴＴ１発現および／または機能が減少した、単一幹細胞または複数の幹細胞である。
用途
ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少し、ならびに、増殖速度および／または組織形成能の増加した幹細胞は、当業者にはすぐに明白となるであろう各種応用例において有用である。
その幹細胞は、インビトロとインビボでの組織作製に有用である場合がある。そのように、インビトロで組織を作製可能であり、その組織は患者に移植するのに適しているか、あるいは、本発明の方法によって同定または選別される細胞は、医療措置（例、組織再生）を提供するために患者に投与または移植可能である。
従って、本発明は、本発明の単一幹細胞または複数の幹細胞を、医療措置方法中での使用のために提供する。
本発明に係る単一幹細胞または複数の幹細胞はまた、医療措置方法中で使用するための医薬の製造においても使用可能である。
さらにまた、本発明は、治療を必要とする患者の組織を再生する方法であって、前記患者に治療に必要な数の本発明の幹細胞を投与する工程を含む方法を提供する。
骨折周辺組織または損傷部位へ幹細胞を投与する工程を含む、骨折を治療する方法において使用するため、または、軟骨組織の修復において使用するために、本発明の単一幹細胞または複数の幹細胞を提供する。
ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞を使用する予防または治療は、組織、特に、結合組織（例、骨、軟骨、筋肉、脂肪、靱帯、もしくは腱）の修復、再生、または置換に関与する場合がある。
これら組織の一つが悪化している患者において、その悪化部位に投与される、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞（好ましくは間葉系幹細胞）は、適切な結合組織へと増殖および分化可能であり、それによって、損傷組織の置換／再生および傷害の治療を提供する。
また、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した間葉系幹細胞のインビトロ培養物から得られる結合組織を、回収および傷害または疾患の部位に移植して、損傷または悪化組織を置換する場合がある。損傷または悪化組織は、任意ではあるが、傷害または疾患の部位からまず切除してもよい。
従って、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、インビボの創傷治癒（治療を必要とする患者へ、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞（好ましくは、間葉系幹細胞）を直接適用することによって実効化される組織修復、再生および／または置換（例、瘢痕組織もしくは骨折の治癒）を含むもの）において有用である。ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞はまた、組織の修復、再生、および／または置換の必要のある患者への移植に適する組織のインビトロでの作製において有用である。
骨折
いくつかの観点では、本発明は、骨折を治療するための、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞の（ヒトや動物の）治療用途に関する。
骨折は医学的状態である。本願では、「骨折」には、骨にひびが入る、折れる、または砕ける骨損傷または骨傷害が含まれる。折れることは、骨が不連続になることを指す。骨折は、物理的衝撃もしくは力学的負荷が原因か、または、医学的状態（例、骨粗鬆症もしくは変形性関節症）が原因である場合がある。
骨折の整形外科的分類には、閉鎖骨折または開放骨折および単純骨折または複雑骨折が含まれる。閉鎖骨折では、皮膚はインタクトなままであるが、開放骨折では、骨は創傷部位で露出している場合があり、感染リスクが高くなっている。単純骨折は、単一の線に沿って起こり、骨が二つに分割される傾向がある。複雑骨折では、骨が複数の片へ分裂する。
他の骨折のタイプには、圧迫骨折、圧縮骨折、螺旋骨折、完全および不完全骨折、横骨折、線状骨折、斜骨折、ならびに粉砕骨折が含まれる。
ほとんどの被験体では、骨治癒（骨癒合）は自然に起こり、傷害後に開始される。出血は通常、凝固し、および、白血球と線維芽細胞とを引き寄せ、その後、コラーゲン繊維を作り出すことにつながる。この次に、骨マトリクス（カルシウムハイドロキシアパタイト）が沈着（石化）して、コラーゲンマトリクスを骨へと変える。未成熟再生骨は、一般的には成熟骨よりも弱く、時間をかけて、未成熟骨はリモデリング過程を経て、成熟した「層状」骨を作る。完全な骨治癒過程は、典型的には数か月の相当な時間がかかる。
骨折が起こる骨であって、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞を用いる治療が利益のある場合がある骨には、全ての骨のタイプ、特に、あらゆる哺乳動物の骨（例、限定はされないが、長骨（例、大腿骨、上腕骨、指骨）、短骨（例、手根骨、足根骨）、扁平骨（例、頭蓋骨、肋骨、肩甲骨、胸骨、骨盤帯）、不規則骨（例、脊椎）、種子骨（例、膝蓋骨））が含まれる。
骨折が起こる骨であって、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞を使用する治療が利益のある場合がある骨には、骨格骨（すなわち、骨格の任意の骨）、頭蓋顔面領域の骨、中軸骨格の骨（例、脊椎、肋骨）、体肢の骨（例、各種肢のもの）、骨盤骨格の骨（例、骨盤）が含まれる。
骨折が起こる骨であって、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞を使用する治療が利益のある場合がある骨には、また、頭（頭蓋）頸部の骨（顔面（例、あご、鼻、ほお）の骨）も含まれる。ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、歯科、顔面、または頭蓋外科処置中の骨修復または再生（例、顔面や口（例、あご骨を含む）の骨（歯とは別物）の再構築を含んでもよい）を補助するのにも使用可能である。
骨折にはまた、病的多孔性（骨粗鬆症患者によって呈されるようなもの）も含まれる。
ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞、ならびに、そのような幹細胞を含む医薬組成物と医薬品を、哺乳類被験体の骨折治療方法における使用のために提供する。
治療は、骨の創傷治癒を含んでもよい。その治療には、骨の修復、再生、および成長が含まれる場合がある。ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、新たな骨の成長を助長することによって、骨折の修復を容易にする。ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、骨折の修復速度を改善するように働き、そして、骨治癒が迅速に起こり、傷害からの回復時間の改善につながる。治療は骨強度の改善につながる。
治療にはまた、骨粗鬆症または変形性関節症の治療も含まれる。
ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞を、好ましくは、骨折周辺組織へと投与する。これには、骨折が起こった骨組織への直接投与が含まれる。投与は、骨折周辺結合組織へ、または、骨に隣接し及び骨を満たす脈管構造（例、血管）へのものであってもよい。投与は、傷害部位へ直接であってもよいし、創傷の初期治癒によって形成されるカルスへのものであってもよい。
本発明に係る医薬品および医薬組成物は、いろいろな経路での投与のために処方可能である。
好ましくは、「治療有効数」のＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞を投与し、その投与は、対応する未治療骨折に比較すると、骨折の治癒が改善するのに十分である。実際の投与数と投与の時間経過は、骨折の性状と重症度に依存する。治療の処方は、一般開業医や他の医師の責任の範囲内のものであり、一般的には、骨折の性状、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、および医師に知られた他の因子を考慮する。ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞の単回または複数回投与は、処方する医師の指示に従って投与可能である。
ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、他の治療（例、鎮痛剤または抗炎症剤の投与、骨の固定と装具（例、負傷した肢をギプスに固定すること）、外科処置（例、骨整復あるいは骨を動かして正しく置換し、角度にし、または移動すること））と一緒に、骨折を治療するのに使用可能である。外科手術が必要な場合、ＧＳＴＴ１遺伝子発現および／またはＧＳＴＴ１タンパク質発現および／またはＧＳＴＴ１活性の減少した幹細胞は、その外科手術過程中で骨へ直接投与（例、適用）してもよい。
幹細胞ドナーを選抜する方法
本発明の別の観点では、幹細胞ドナーを選抜する方法を提供する。「幹細胞ドナーの選抜」は、幹細胞取得用の骨髄の適切なドナーを同定する工程を含む場合がある。
いくつかの実施形態では、本方法は、個体から得られる核酸含有サンプル中のＧＳＴＴ１の遺伝子型を決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、個体から得られる組織または液状サンプル（例、口腔粘膜スワブ、血液、または皮膚をパンチで切り抜いたサンプル）である場合があるか、または、そのサンプルに由来する場合がある。いくつかの実施形態では、それら方法は、サンプルから核酸を調製または抽出する工程を含む。
いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡ（例、ゲノムＤＮＡ）である場合がある。いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡである場合がある。そのような実施形態では、本方法は、ＲＮＡからｃＤＮＡを（例えば、逆転写反応によって）調製する工程を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、サンプル中のＧＳＴＴ１核酸を検出および／または定量する工程を含む。
本明細書中で使用されるＧＳＴＴ１核酸は、ＧＳＴＴ１遺伝子座に含まれるか、または、それから転写される核酸を指す。いくつかの実施形態では、ＧＳＴＴ１核酸は、ＧＳＴＴ１タンパク質をコードする核酸である場合がある。つまり、上記で定義したように、ＧＳＴＴ１核酸は、転写されて、次に、ＧＳＴＴ１タンパク質へと翻訳され得る核酸、または、ＧＳＴＴ１タンパク質に翻訳可能な核酸である場合がある。
いくつかの実施形態では、本方法は、サンプル中のＧＳＴＴ１核酸の欠如を検出する工程を含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、核酸含有サンプル中のＧＳＴＴ１核酸の検出および／または定量に使用するのに適する一又は複数のオリゴヌクレオチドと、核酸含有サンプルを接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、核酸含有サンプル中のＧＳＴＴ１核酸の欠如の検出に使用するのに適する一又は複数のオリゴヌクレオチドと、核酸含有サンプルを接触させる工程を含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、核酸含有サンプル中のＧＳＴＴ１対立遺伝子の存在を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、ＧＳＴＴ１対立遺伝子は、一又は複数の野生型ＧＳＴＴ１対立遺伝子、野生型ＧＳＴＴ１対立遺伝子と比べてＧＳＴＴ１発現が減少することが既知および／または予測され得るＧＳＴＴ１対立遺伝子、およびＧＳＴＴ１ヌル型（すなわち、欠損型）対立遺伝子である。いくつかの実施形態では、本方法は、核酸含有サンプル中のＧＳＴＴ１対立遺伝子の検出に使用するためのオリゴヌクレオチドと、核酸含有サンプルを接触させる工程を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（例、プライマー）は、サンプルに特定のＧＳＴＴ１対立遺伝子が存在する場合のみ、ＤＮＡ断片を増幅することができる。例えば、野生型ＧＳＴＴ１対立遺伝子の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドは、ＧＳＴＴ１ヌル型（欠損型）対立遺伝子を含むＤＮＡ配列が無いＤＮＡ配列とアニーリング可能である。例えば、ＧＳＴＴ１欠損型対立遺伝子の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドは、野生型ＧＳＴＴ１対立遺伝子を含むＤＮＡ配列から増幅産物を生成しないＤＮＡ配列とアニーリング可能である。ＰＣＲ増幅反応の増幅産物は、当業者に周知の手段によって（例、ＰＣＲ増幅反応産物をゲル電気泳動し、そして、増幅ＤＮＡを可視化することによって）解析可能である。
いくつかの実施形態では、本方法に使用されるオリゴヌクレオチドには、Ｂｕｃｈａｒｄら、Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ、（２００７年）９（５）：６１２−６１７（参照により、完全に本明細書中に組み込まれる）に開示された（６１３と６１４ページの表１と２の）一又は複数のＧＳＴＴ１検出用プライマーが含まれる場合がある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドには、一又は複数の次のオリゴヌクレオチドが含まれる場合がある。
Figure 0006856239
いくつかの実施形態では、本方法は、ＰＣＲ反応の実施工程を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の実施工程を含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、サンプル中のＧＳＴＴ１核酸を検出および／または定量する工程を含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、ＧＳＴＴ１発現の解析工程を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、個体から得られる核酸含有サンプルから調製されるｃＤＮＡサンプル中のＧＳＴＴ１核酸を検出および／または定量する工程を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＴ−ＰＣＲによってＧＳＴＴ１発現を解析する工程を含む。いくつかの実施形態では、ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲ方式を使用するＲＴ−ＰＣＲによって、ＧＳＴＴ１の発現を検出するのに適するオリゴヌクレオチド（例、プライマーおよびプローブ）を使用して解析を実行する。
いくつかの実施形態では、本方法は、（ｉ）野生型ＧＳＴＴ１がホモ接合体の個体に比べてＧＳＴＴ１の発現が減少していることが知られるか、および／または、予測され得るＧＳＴＴ１遺伝子型を有すると決定される個体、あるいは、（ｉｉ）野生型ＧＳＴＴ１がホモ接合体の個体でのＧＳＴＴ１発現に比べて、減少していることが知られているか、および／または、予測され得るＧＳＴＴ１発現を有すると決定される個体を、幹細胞ドナーとして選抜する工程を含む。
関連する観点では、本発明は、個体によって生み出される幹細胞の質を評価する方法を提供する。本方法は、上記したように、ＧＳＴＴ１遺伝子型またはＧＳＴＴ１の発現を決定する工程を含む。そのような実施形態では、野生型ＧＳＴＴ１がホモ接合体の個体に比べてＧＳＴＴ１の発現が減少していることが知られるか、および／または、予測され得るＧＳＴＴ１遺伝子型、あるいは、（ｉｉ）野生型ＧＳＴＴ１がホモ接合体の個体でのＧＳＴＴ１発現に比べて、減少していることが知られているか、および／または、予測され得るＧＳＴＴ１発現は、高品質幹細胞の指標となる。
別の観点では、本発明は、本発明に係るキットを使用して、幹細胞ドナーを選抜する方法を提供する。
キット
本発明のいくつかの観点では、ＧＳＴＴ１またはＧＳＴＴ１遺伝子型の検出用キットが提供される。いくつかの実施形態では、本キットは幹細胞ドナーを選抜するのに適している場合があり、そして、本キットが意図するアッセイ中で使用するための組織または細胞サンプルを処理するのに適する試薬またはバッファーを含む場合がある。そのようなキットは、幹細胞を取得するために、適切な骨髄ドナーを同定するのに有用である場合がある。本キットは、個体によって生み出される幹細胞の質を評価するのに適する場合がある。
従って、ＧＳＴＴ１発現測定キットを提供する。本キットは、サンプル中のＧＳＴＴ１発現を測定するための所定量の一又は複数の試薬を有する少なくとも一つの容器を有していてもよい。いくつかの実施形態では、本キットは、サンプル中のＧＳＴＴ１発現レベルの定量または定性測定に必要な一又は複数の試薬を含むことができる。いくつかの実施形態では、本キットは、個体から単離されるサンプル中の単一幹細胞または複数の幹細胞におけるＧＳＴＴ１発現レベルの測定用の一又は複数の試薬を含むことができる。
当業者は、サンプル中のＧＳＴＴ１発現レベルの測定に適する試薬を容易に同定することができる。適する試薬には、一又は複数（例、ペア）のオリゴヌクレオチドプライマーであって、それぞれが核酸（例、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）をコードするＧＳＴＴ１核酸配列領域に相補的な核酸配列を有するものが含まれる場合がある。
そのように、適するキットには、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって、ＧＳＴＴ１コード化核酸の増幅に有用な所定量の一又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーを有する少なくとも一つの容器と、任意ではあるが、適切なバッファーまたは溶媒と共に所定量の一又は複数の熱的に安定な酵素（例、Ｔａｑポリメラーゼ）を有する容器（任意ではあるが、同一容器）とが含まれ、任意ではあるが、一又は複数の検出可能な標識、および、任意ではあるが、増幅実験の実施に適する一又は複数の滅菌反応容器もまた含まれる場合がある。
また、適する試薬には、ＧＳＴＴ１に特異的な一又は複数の結合剤（例、抗体またはアプタマー）と、任意ではあるが、検出可能な標識とが含まれ、その試薬はＧＳＴＴ１タンパク質に結合するのに適していて、そして、その結合複合体は、標識と結合することによって検出するのに適している。例えば、本キットはサンドイッチ検出アッセイを実施するのに適していて、そして、任意ではあるが固相支持体上に固定された第一ＧＳＴＴ１結合剤（例、抗体）と、その第一ＧＳＴＴ１結合剤と複合体を作る際にＧＳＴＴ１と結合することができる第二ＧＳＴＴ１結合剤と、第一ＧＳＴＴ１結合剤：第二ＧＳＴＴ１結合剤の複合体を標識または検出するのに適する一又は複数の検出試薬と、任意ではあるが、その検出試薬に対する基質と、任意ではあるが、バッファーとを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本キットは、サンプル中のＧＳＴＴ１発現レベルの測定用アッセイを実施するのに必要および／または十分な構成要素の全てを含み、全てのコントロール、アッセイを実施するための説明書／指示書、および結果の解析・提示用の任意の必要なソフトウェアを含む。
また提供されるのは、ＧＳＴＴ１遺伝子型を決定するキットである。本キットはサンプル中のＧＳＴＴ１遺伝子型を決定する試薬（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、個体から単離されるＤＮＡ含有サンプル中のＧＳＴＴ１の遺伝子型を決定するための試薬（複数可）を含む。当業者は、サンプル中のＧＳＴＴ１遺伝子型の決定に適する試薬を容易に同定することができる。いくつかの実施形態では、この試薬には、一又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーが含まれる場合がある。いくつかの実施形態では、本キットは、サンプル中のＧＳＴＴ１遺伝子型を決定するためのアッセイを実施するのに必要および／または十分な構成要素の全てを含み、全てのコントロール、アッセイを実施するための説明書／指示書、および結果の解析・提示用の任意の必要なソフトウェアを含む。
特定の実施形態では、本キットは、核酸含有サンプル中のＧＳＴＴ１対立遺伝子の存在を検出することができる。いくつかの実施形態では、ＧＳＴＴ１対立遺伝子は、一又は複数の野生型ＧＳＴＴ１対立遺伝子、野生型ＧＳＴＴ１対立遺伝子と比べてＧＳＴＴ１の発現が減少していることが既知および／または予測され得るＧＳＴＴ１対立遺伝子、ならびに、ＧＳＴＴ１ヌル型（すなわち、欠損型）対立遺伝子である。
いくつかの実施形態では、本キットは、例えば、ＰＣＲ増幅によって、野生型および欠損型ＧＳＴＴ１対立遺伝子を検出することができる。いくつかの実施形態では、本キットは、野生型および欠損型ＧＳＴＴ１対立遺伝子の検出用のオリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本キットは、核酸含有サンプル中のＧＳＴＴ１遺伝子の存在または非存在を検出するのに適している。いくつかの実施形態では、サンプルは個体から取得可能である。いくつかの実施形態では、核酸含有サンプルは、個体から得られる組織または液状サンプル（例、口腔粘膜スワブ、血液、または皮膚をパンチで切り抜いたサンプル）である場合があるか、または、そのサンプルに由来する場合がある。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡ（例、ゲノムＤＮＡ）である場合がある。
いくつかの実施形態では、本キットは、ゲノムＤＮＡ中の野生型および欠損型ＧＳＴＴ１対立遺伝子の検出用のオリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本キットは、オリゴヌクレオチド（例、プライマー）であって、サンプルに特定のＧＳＴＴ１対立遺伝子が存在する場合のみ、ＤＮＡ断片を増幅することができるものを含む。例えば、野生型ＧＳＴＴ１対立遺伝子の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドは、ＧＳＴＴ１欠損型対立遺伝子を含むＤＮＡ配列が無いＤＮＡ配列とアニーリング可能である。例えば、ＧＳＴＴ１欠損型対立遺伝子の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドは、野生型ＧＳＴＴ１対立遺伝子を含むＤＮＡ配列から増幅産物を生成しないＤＮＡ配列とアニーリング可能である。
いくつかの実施形態では、本キットは、Ｂｕｃｈａｒｄら、Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ、（２００７年）９（５）：６１２−６１７に開示された（６１３と６１４ページの表１と２の）一又は複数のＧＳＴＴ１検出用オリゴヌクレオチドプライマーを含む。特定の実施形態では、本キットは、上記「ＧＳＴＴ１＿遺伝子」および「ＧＳＴＴ１＿欠損」プライマーセットの一又は複数のオリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本キットは、単回ＰＣＲ増幅反応中で、野生型および欠損型ＧＳＴＴ１対立遺伝子（もし、サンプル中に存在すれば）の両者を検出することができる。いくつかの実施形態では、本キットは、野生型および欠損型ＧＳＴＴ１対立遺伝子を、多重方式で検出するために使用するのに適するオリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、（当業者に周知の）ＴａｑＭａｎ方式（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて使用するのに適している。例えば、そのオリゴヌクレオチドは、ＴａｑＭａｎ方式を用いて使用するのに適する特性（例、長さ、組成、アニーリング温度等）を有する場合がある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一又は複数の野生型ＧＳＴＴ１対立遺伝子、野生型ＧＳＴＴ１対立遺伝子と比べてＧＳＴＴ１の発現が減少していることが既知および／または予測され得るＧＳＴＴ１対立遺伝子、ならびに、ＧＳＴＴ１ヌル型（すなわち、欠損型）対立遺伝子を検出するのに適している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ中の野生型ＧＳＴＴ１対立遺伝子および欠損型ＧＳＴＴ１対立遺伝子の検出に適している。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、個体から得られる核酸含有サンプルから調製されるｃＤＮＡサンプル中のＧＳＴＴ１を検出するのに適している。従って、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＴ−ＰＣＲによってＧＳＴＴ１発現を検出するために使用するのに適している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（例、プライマーおよびプローブ）は、ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲ方式を使用するＲＴ−ＰＣＲによって検出するのに適している。
本発明は、記載した観点と好ましい特徴の組合せを含むが、そのような組み合わせが明らかに許容され得ないか、または、明示的に回避される場合は除く。
本明細書中で使用される章の見出しは、体系的な目的のためだけであって、記載される主題物を限定するものとは解釈されない。
本発明の観点および実施形態を、添付した図面を参照して、例として今から説明する。さらなる観点および実施形態が、当業者に明らかとなる。本文中に述べた全ての文書は、参照により、本明細書中に組み込まれる。
実施例
実施例１−ＧＳＴＴ１は間葉系幹細胞の骨再生機能の予後バイオマーカーである
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアイソフォームＴ１（ＧＳＴＴ１）をコードする遺伝子は、ヒト集団においてよく欠失している。本発明者らは、ＧＳＴＴ１遺伝子型が患者由来のＢＭ−ＭＳＣの増殖と骨形成能に有意に影響を及ぼすことを見つけた。特に、ＧＳＴＴ１のヌル型対立遺伝子は、ＧＳＴＴ１の機能的対立遺伝子を保持するＢＭ−ＭＳＣに比べて、ＢＭ−ＭＳＣをインビトロでより増殖するようにし、そして、ＢＭ−ＭＳＣの骨形成活性が向上する。
この知見が臨床応用できるのは、その遺伝子型に基づいてドナーをプレスクリーニングおよび選抜する手段を提供し、従って、ＢＭ−ＭＳＣ移植での骨修復効率を改善するからだ。
１．１ 増殖の速い株と遅い株との間の増殖速度のバリエーション
数人のドナーからの骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）を、増殖速度にしたがって特徴解析して、「増殖の速い株」または「増殖の遅い株」のいずれかとした。
マイクロアレイによる全ゲノム発現解析を実施して、両群間のトランスクリプトームレベルでの差異を見出した。その目的は、固有の分子的なバリエーションがあるかどうかを決定し、また、その表現型の差に寄与する遺伝的差異を見出すことであった。得られたデータのジーンオントロジーは、増殖の速い株において、細胞周期にリンクするいくつかの生物学的プロセスがアップレギュレートされる一方、分化／発生関連プロセスが、増殖の遅い株に比べてダウンしていたことを示し、このことは表現型と相関している。
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステム上での増殖速度の評価は、増殖の速い株と遅い株との間のリアルタイムでの増殖速度の変化を示した（図３）。増殖の速い株の細胞倍化時間の平均は３５時間であった一方で、増殖の遅い株に関しては、二倍より多くかかる７５時間であった。このことは、他の増殖アッセイによって観察される、二つの群間の増殖の差異を裏付ける（Ｓａｍｓｏｎｒａｊら、論文草稿中）。
１．２ 増殖の遅い株はＧＳＴＴ１を発現し、最も増殖の速い株はそれを欠く
ドナー由来の株の増殖とクローン増殖能に関する解析により、ドナーＡ、Ｃ、およびＥ由来のＢＭ−ＭＳＣは増殖の速い株である一方、ドナーＢ、Ｄ、Ｆ由来のものと１０Ｒおよび１１Ｒは増殖の遅い株であったことが分かった。それらＢＭ−ＭＳＣ株のマイクロアレイ解析は、ＧＳＴＴ１が、二つの群間で最も差次的に発現される遺伝子であり、増殖の速い株に比べて、増殖の遅い株はこの遺伝子を高く発現していたことを示した（図４Ａ）。
ＧＳＴＴ１の遺伝子型決定により、３つの増殖の速い株の中で二つ（ＡとＣ）は、この遺伝子のホモ接合型欠損を有することが分かった。一方で、増殖の遅い株は陽性、つまり、ヘテロ接合体（Ｂ、Ｄ、およびＦ）またはホモ接合型陽性（１０Ｒおよび１１Ｒ）のいずれかであった（図４Ｂ）。
それぞれ、ｑＲＴ−ＰＣＲとウエスタンブロティングによるＲＮＡとタンパク質発現解析は、ＡおよびＣ株のＧＳＴＴ１発現が無く、その他の株では発現があることを示し、このことは遺伝子型決定結果と一貫していた（図４Ｃと４Ｄ）。ホモ接合型陽性のものはまた、ヘテロ接合体よりもこの遺伝子の発現が高く、対立遺伝子のコピー数に見られるトリモーダル効果と一致していた。
１．３ 増殖の速い株と遅い株との間のＤＮＡ損傷差は無い
ＤＮＡ修復機構の異常は、しばしば、誤った細胞周期チェックポイントに起因する増殖の加速と関連する。このことは、ＤＮＡ損傷の蓄積につながる場合がある。ＤＮＡ損傷はＤＮＡ損傷を検出するアッセイ（例、コメットアッセイ（単一細胞電気泳動アッセイとしても知られるもの））を介して試験可能である。増殖の速い株と遅い株はこの方法を使用して試験して、ＤＮＡ損傷の程度をチェックし、増殖の差異がＤＮＡ損傷監視メカニズムの機能不全によるものではなかったことを確認した。コメットテールは、両群ともほとんど損傷はなかったし、もしあるとしても、コメットテールは非常に少なかった（図５Ａ）。コメットの定量はまた、それらの群に関して、ほとんど無視できるレベルのＤＮＡ損傷を示した（図５Ｂ）。このことはＤＮＡの状態が正常でインタクトなものであることを確認する。ＤＮＡ修復／損傷の細胞周期制御は、増殖の速い株ではコントロールされているように見える。
１．４ 増殖の速い株と遅い株の酸化ストレス応答は似ている
ＧＳＴスーパーファミリーの酵素が酸化ストレス応答に主要な役割を演じる理由は、それがグルタチオンを結合することによって活性酸素種（ＲＯＳ）を除去するからである。ＧＳＴＴ１消失の酸化ストレス応答への効果に関する説得力のあるデータは利用不能である。ＧＳＴＴ１遺伝子型が酸化ストレス応答に影響を及ぼすかどうかを評価するために、増殖の速い株と遅い株を過酸化水素で処理し、その次に、酸化プリンで切断するｈＯＧＧ１（ＤＮＡグリコシラーゼ）処理を行い、その後、コメットアッセイで解析した。両群とも、過酸化水素とその酵素で処理したサンプルは、非処理コントロールよりも有意に高いレベルの酸化ＤＮＡ損傷を有していた（図６）。さらに、ＤＮＡ損傷の程度は両群間で同等なものであった。このことは、遺伝子型の差異にも関わらず、ストレス応答にバリエーションは無いことを示している。従って、ＧＳＴＴ１の消失は、酸化因子の除去に影響は及ぼさず、このことは、他のＧＳＴ酵素の存在がこのストレスをうまく処理するのに十分であることを示す。
１．５ ＧＳＴＴ１発現は継代と共に増加する
細胞周期関連遺伝子は継代が長くなる（老化を模倣すると考えられる効果）につれ一般的に調節される。ＧＳＴＴ１は老化と共に増加することが知られるが、どうしてこのことが起こるかという理由は知られていない。ＭＳＣは継代数が８になるまで最適な状態で培養して維持可能であるが、それを超えると、増殖がスローダウンし、細胞老化の徴候を示す。ＧＳＴＴ１に関する継代を重ねることの効果を検証するために、増殖の遅い株を培養して維持し、そして、７０％コンフルエントになると継代した。ある継代数で、ｑＲＴ−ＰＣＲとウエスタンブロッティングによって発現解析するために、細胞を回収した。両方の方法によって、ＧＳＴＴ１の発現レベルが継代数と共に増加すること（図７）が判明し、このことは細胞周期制御でのＧＳＴＴ１の役割を示唆した。ｐ５とｐ８との間では同等の発現が見られるが、ｐ１０を超えるとその発現は堅実に増加した。ｐ１５までに、そのｍＲＮＡレベルは、初期継代数のものよりも２．５倍高くなった。
１．６ ＧＳＴＴ１ノックダウンは増殖とクローン増殖能を増加させる
ＧＳＴＴ１遺伝子型が、増殖の遅い株（ＧＳＴＴ１陽性）に比べて増殖の速い株（ＧＳＴＴ１ヌル型）で観察される増殖の向上に寄与するかどうかを評価するために、ＧＳＴＴ１の安定的ノックダウンを実施して、増殖能を試験した。ＧＳＴＴ１発現は、サイレンシングしなかったコントロールのものの０．３０（ＳＤ±０．１４）倍まで抑制された（図８Ａ）。
両方の処理のために、同じ密度で播種された細胞を、トリパンブルーで染色し、そして、播種後５日目に定量した。生細胞数は、サイレンシングしなかったものに対して約８０％（ＳＤ±２８．２８％）ノックダウンでは有意に高かった（図８Ｂ）。５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ）の取り込みによって測定すると、２４時間内の分裂細胞のパーセンテージもより高かった（図８Ｃ）。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムによる増殖のリアルタイムモニタリングもまた、ノックダウンしたものの増殖が加速したことを確認した。ノックダウンしたのもの増殖率は約３４時間であって、４３時間であるサイレンシングしなかったものの倍化時間との差は、１０時間近かった（図８Ｄ）。まとめると、増殖アッセイは、ＧＳＴＴ１が減少するにつれ、増殖速度が増加することを示す。
ＧＳＴＴ１ヌル型ＢＭ−ＭＳＣ株にｓｈＲＮＡをパッケージしたレンチウイルスを感染させても、各種手法で評価したその株の増殖には影響がなかった（データ未発表）。このことは、ＧＳＴＴ１に対するｓｈＲＮＡの特異性を示している。
クローン増殖能も測定して、ＢＭ−ＭＳＣの自己複製がＧＳＴＴ１発現のノックダウンによって影響を受けるかどうかを決定した。ＭＳＣのクローン増殖能は、線維芽細胞コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｆ）によって定義される。ノックダウンしたものとサイレンシングしなかったコントロールを低密度でプレートに蒔き、２週間維持し、その後、それらを固定し、そして、ギムザ対比染色を行った。
目で確認すると、コントロールよりも大きなサイズの、ノックダウンのものにより形成されるコロニーの数はより多かった（図９Ａ）。結果を定量すると、ＣＦＵ−Ｆの頻度は平均７％増加し（図９Ｂ）、コロニーサイズは約１ｍｍ増加したこと（図９Ｃ）が判明した。このデータは、ＧＳＴＴ１発現の低下と共にクローン増殖能が良くなることを示している。このことは、ＢＭ−ＭＳＣの自己複製特性への影響を示している。
１．７ ＧＳＴＴ１の過剰発現は増殖を低下させる。
ＧＳＴＴ１発現は、ＢＭ−ＭＳＣの増殖に逆相関するように思える。ＧＳＴＴ１遺伝子の過剰発現がノックダウンの効果と逆効果を導く／有するかどうかを検証するために、ＧＳＴＴ１遺伝子を、ＧＳＴＴ１ヌル型の増殖の速い株で一過性に過剰発現させた。トランスフェクション３日以内に、発現レベルは、空ベクターをトランスフェクトした細胞に比較して５００００倍近くになった（図１０Ａ）。トランスフェクション後１〜２週間の間の増殖を評価した。
一定の密度で播種後５日目にトリパンブルーを用いて計数した生細胞数が示したのは、空ベクターをトランスフェクトした細胞に対して、過剰発現トランスジェニック細胞集団の細胞のパーセンテージの減少が６０％（ＳＤ±３．７９）であったことである（図１０Ｂ）。分裂細胞を２４時間かけてＥｄＵ標識すると、有糸分裂細胞の割合が約８％減少したことが分かった（図１０Ｃ）。増殖速度のリアルタイム測定は、他の増殖アッセイと一貫していた。過剰発現細胞株は、コントロールの倍化時間が５３時間であったのに比べて、倍化時間が６３時間であり、より長いものであった。まとめると、ＧＳＴＴ１の過剰発現は細胞の増殖を遅延させた。このデータは、ＧＳＴＴ１が細胞増殖に関与し、増殖に逆相関することを確認する。
１．８ 結論
増殖の遅いＢＭ−ＭＳＣと増殖の速いＢＭ−ＭＳＣに関するマイクロアレイデータは、ＧＳＴＴ１がこの二群間で最も差次的に発現されることを確認する。増殖の遅い株はＧＳＴＴ１を発現する一方で、増殖の速い株の発現はごくわずかであった。ＧＳＴＴ１の遺伝子型決定は、増殖の遅い株が機能的な対立遺伝子を所持するが、増殖の速い株はＧＳＴＴ１がヌル型であったことを確認した。
増殖の速い株（ＧＳＴＴ１ヌル型）は、我々の異所性動物試験において、より多くの骨量を生成した。従って、我々は、ＧＳＴＴ１遺伝子型が患者から単離されるＢＭ−ＭＳＣからの骨形成を予測するものであることを示す。
ＧＳＴＴ１遺伝子型がＢＭ−ＭＳＣの増殖と分化に影響があるという知見は、酸化ストレスが、おそらくｐ３８情報伝達経路を通してＧＳＴＴ１発現の増加を誘導することを示す過去の研究と一致し、このことは、細胞周期制御へのＧＳＴＴ１の関与を示唆する。発現試験は、ＧＳＴＴ１と増殖との相関を証明し、また、ＧＳＴＴ１の消失が酸化ストレス応答に影響を及ぼさないことも示す。これらのことは、細胞の正常な生理にとって重要である。
実施例２−インビボ効力とインビトロｈＭＳＣ挙動の相関
２．１ はじめに
本発明者らは、高い効力を有するｈＭＳＣの選択に関する基準セットを確立する。インビトロ分化能が、それ自体幹細胞の能力の信頼できる指標ではないと確認し、その最低限の評価基準の再評価を試みて、ｈＭＳＣをより良く定義し、そして、インビボ効力に対して基準を設定した。本発明者らは、ＩＳＣＴ（２００６年）によって定義されたマーカーに加えて、Ｓｔｒｏ−１、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ｂが、インビボでの骨形成能と最もよく相関することを見出した。また、判明したのは、これら追加マーカーを発現する細胞はまた、集団倍化時間がより早く、そして、より小さな細胞表現型、およびＦＧＦ２、ＶＥＧＦ１６５とＰＤＧＦ−ＢＢが比較的豊富なセクレトームを呈することである。本発明者らは、それにより、良好なインビボ実績の予言性の高い幹細胞サインを構成する組合せを同定する。
２．２ ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の単離と培養
ヒトＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ社、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）の骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）（表１）からの単離は、過去に記載（Ｒｉｄｅｒら、２００８年）されたように、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ−低グルコース、１０００ｍｇ／ｌ）を含む維持培地中で単核細胞画分をプレートに蒔くことによって行われた。継代数４の細胞を、特に他に述べない限りは、全ての実験に使用した。個々のドナー由来の細胞を特徴解析し、個別のｈＭＳＣ集団として全過程を通して取り扱った。ＣＦＵ−Ｆアッセイのために、ＢＭＭＮＣを、０．５〜３．０×１０６細胞／Ｔ７５フラスコで蒔き、接着させて、コロニーを形成させ、そして、１４日後に０．５％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＵＳＡ）で染色した。視認できるコロニーを、その後、その数が５０細胞以上であり且つ他のコロニーと接触していない場合にのみ、数を数えた。
Figure 0006856239
２．３ コロニー形成、細胞サイズ、増殖、およびテロメア長のドナーでのばらつき
２．３．１ 細胞サイズ解析
単一細胞懸濁物のｈＭＳＣを、アネキシンＶで染色し、洗浄し、そして、ＭＡＣＳバッファー（（ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の）２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ）中に再懸濁し、その後、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（商標）Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで解析した。アネキシンＶ＋細胞をゲーティングして除いたのち、象限ゲートの一つを、生細胞であって、ＦＳＣ／ＳＳＣイベントが非常に低いと推測される画分に適用して、小型サイズの細胞の相対的パーセンテージを得た。
全てのドナーのＢＭＭＮＣは、組織培養プラスチックに速やかに接着し、そして、培養で容易に拡張するコロニーを生じた（図１１Ａ）。ドナー間で比較すると、ＣＦＵ−Ｆ効率とコロニーサイズにおいて有意差があることが分かった。ドナーＡ、Ｃ、およびＥ（７．４±１．７）は、ドナーＢ、Ｄ、およびＦ（３．２±１．１）よりもコロニー形成効率が比較的高かった（図１１Ｂ）。初期の継代数では、形態の差は観察されなかった（図１１Ａ）。しかし、後期の継代数では、ＣＦＵ−Ｆ効率の高いドナー由来ｈＭＳＣは、小型、コンパクト、紡錘状形態を示す一方で、ＣＦＵ−Ｆ効率の低いドナー由来ｈＭＳＣは、大型でより伸びたもののように見えた（データ未発表）。プラスチックへの接着とコロニー形成によると、全てのドナーは、従って、間葉系幹細胞として同定するためのＩＳＣＴ評価基準を満足した。
細胞サイズを解析した。豊富にある紡錘状で大型、扁平な細胞に加え、ヘテロな集団はまた、小型で丸い細胞であって、迅速に自己複製するもの（ＲＳ）として同定可能な細胞も含んでいた（Ｃｏｌｔｅｒら、２００１年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、９８：７８４１−７８４５；Ｓｅｋｉｙａら、２００２年、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２０：５３０−５４１；Ｓｍｉｔｈら、２００４年、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２２：８２３−８３１）。フローサイトメトリーによるこれら細胞の特徴は、光の前方散乱が低く（ＦＳＣｌｏ）、および、側方散乱も低い（ＳＳＣｌｏ）ことである。より高いコロニー形成能を有するドナーＡ、Ｃ、Ｅは、平均すると、７４．４％の小型サイズの細胞（図１１Ｃでの象限１中でＦＳＣｌｏ／ＳＳＣｌｏとして同定されたもの）からなる一方で、より低いコロニー形成能を有するドナーＢ、Ｄ、Ｆは、ほんの６６．４％の小型細胞からなっていた。従って、ＣＦＵ−Ｆ効率と存在する小型細胞の割合との間に正の相関があった（図１１Ｂ、１１Ｃ）。
２．３．２ 累積的増殖とテロメア長の解析
ドナー間のｈＭＳＣ増殖を比較するために、細胞を、５，０００細胞／ｃｍ２で播種し、そして、維持条件下で培養した。７０〜８０％コンフルエントで、細胞を、０．１２５％トリプシン／バーゼン液によって酵素を使って除去し、そして、生細胞の数を、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ（商標）Ｐｌｕｓシステム／ＣｙｔｏＳｏｆｔ（商標）ソフトウェア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）社）を用いるＧｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ（登録商標）アッセイを使用して計数した。細胞を同じ密度でプレートに再度蒔き、引き続いて継代培養し、１３〜１５継代数または細胞老化が起こるまで累積的細胞数と集団倍化時間を推定した。様々な継代数でのゲノムＤＮＡを単離し、テロメア長を解析した。参照としてヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ３、ＥＳ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、シンガポール）を使用して、ｈＭＳＣのテロメア長を、基準細胞株に対して相対的に決定し、そして、テロメア長相対単位（ＲＴＬ）で表した（過去に記載（Ｓａｍｓｏｎｒａｊら、２０１３年、Ｇｅｎｅ）されたようにした）。特異的テロメア（Ｔｅｌ）プライマーと３６Ｂ４（シングルコピー遺伝子）プライマーと共に、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ系リアルタイムＰＣＲ設定での鋳型としてｈＭＳＣサンプルＤＮＡ（１２ｎｇ／反応）と基準ＤＮＡ（各種希釈割合のもの）を使用した。
増殖がＭＳＣの資質の重要な尺度となる理由は、自己複製能が決定的特質であるからだ。ＭＳＣは、長期培養拡張に伴って表現型が変化し、最終的には増殖能力を喪失することが知られている。培養における細胞増殖を、長期（８〜１０週間）モニターした。いくつかの継代数に渡ってアッセイした累積的細胞数と集団倍化の程度が明らかにしたのは、増殖能に有意差があることである。ドナーＣは、最大限の増殖を示し、ドナーＦは最小限のものを示した（図１１Ｄ）。平均すると、（増殖の速い）ドナーＡ、Ｃ、およびＥ由来の細胞は、（増殖の遅い）ドナーＢ、Ｄ、およびＦよりも累積的細胞数が３３％多かった（Ｐ＜０．０５）。これらのドナーはまた、コロニー形成効率がより大きく（図１１Ｂ）、小型細胞のパーセンテージもより高かった（図１１Ｃ）。このことは、細胞増殖と、コロニー形成と、サイズとの間の相関を意味する。まとめると、これらの結果によって、ドナーＡ、Ｃ、およびＥを増殖の速いｈＭＳＣとし、Ｂ、Ｄ、およびＦを増殖の遅いｈＭＳＣとしてグループ分けすることを可能にした。増殖速度のリアルタイム評価は、増殖の速い細胞の集団倍化時間（約３５時間）は、増殖の遅い細胞（約７５時間）より短いことを実証し、従って、長期培養拡張において観察されるこの二群間での増殖の差を確認した（図２０）。
テロメアは細胞分裂と密接に関連するので、これらの細胞のテロメア状態をチェックした。播種初期（Ｐ１）から細胞老化（Ｐ１３〜Ｐ１５）までの、７つの異なる継代数での解析は、細胞が分裂を経るにしたがって、その相対的長さが漸次減少することを示した。テロメア短縮率は、直線的様式で起こり、これは、互いに異なる率であるが、曲線の負の傾斜（図１１Ｅ）により示されていた。これら率の違いは、直線勾配とＲ２値（相関係数）（図１１Ｆ）によって示されている。ドナーＡ、Ｃ、およびＥの回帰プロットは、ドナーＢ、Ｄ、およびＦよりも実質的に低い回帰（Ｒ２）値を示した。このことは、増殖の速いｈＭＳＣのテロメア減少率が、増殖の遅いｈＭＳＣのものよりも小さいことを示唆する（図１１Ｆ）。また、増殖の遅いｈＭＳＣは、継代数１３後に細胞老化に到達したが、細胞増殖の速いｈＭＳＣは継代数１５まで細胞分裂が起こった。
ドナーの年齢（２０〜３０歳の間）が狭い限定内にあったことを一緒に考慮すると、我々の結果は、より多くのコロニーを生じた細胞のドナーについては、増殖速度が増加し、テロメアが相対的に長い小型サイズの細胞の割合がより高かったことを確認する。
２．４ フローサイトメトリーによる免疫表現型特徴解析
フローサイトメトリーを実施して、ｈＭＳＣの表面の免疫的表現型プロフィールを比較した。単一細胞懸濁物は、フィコエリトリン（ＰＥ）またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を結合した抗ヒトＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ２９、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＧＦ−ＩＲα（ＣＤ２２１）、ＮＧＦ−Ｒ（ＣＤ２７１）、ＰＤＧＦ−Ｒαおよびβ（ＣＤ１４０ａおよびＣＤ１４０ｂ）、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ１０６、ＣＤ１４６、ＳＳＥＡ−４、ＳＴＲＯ−１抗体か、または、アイソタイプが合致したコントロールＩｇＧ１、ＩｇＧ１κ、ＩｇＧ２ａκ、ＩｇＧ２ｂκ、ＩｇＭ（μ）、およびＩｇＧ３を用いて染色し、そして、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（商標）ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒとＦｌｏｗＪｏソフトウェア上で解析した。ＩｇＭ（μ）（Ｃａｌｔａｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）とＳＴＲＯ−１（Ｓｔａｎ Ｇｒｏｎｔｈｏｓ教授、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｄｅｌａｉｄｅ、オーストラリア、から贈答されたもの）を除いては、全ての抗体を、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した。
２．４．１ ｈＭＳＣの免疫的表現型のプロフィール
次のステップは、ＣＤマーカーの存在を確認することであった。ＭＳＣを完全且つ正確に規定するとしてＩＳＣＴによって記載（Ｄｏｍｉｎｉｃｉら、２００６年、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、８：３１５−３１７）されたものを含む２７個のマーカーのセットを解析した。全てのドナー由来の培養拡張したｈＭＳＣは、（９５％より多くが）ＣＤ１０５、ＣＤ７３、およびＣＤ９０が均一に且つ強く陽性であり、血球系マーカーＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ３１、およびＨＬＡ−ＤＲが陰性であった（図１２）。ＭＳＣを同定すると近年提案されていたマーカーの発現には、ドナーによるばらつきが見られた。増殖因子受容体（例、ＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα／β）の発現には差があって、それは、そのプロフィールにおけるデータのばらつきにより明らかであった。他の最近記載されたマーカー（例、細胞接着分子ＣＤ１０６、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６）もまた、差次的に発現されていたが、増殖との相関はほとんどなかった。ＰＤＧＦＲαレベルは、骨形成能と相関している（Ｔｏｋｕｎａｇａら、ＪＢＭＲ、２００８年）が、増殖の遅いｈＭＳＣでより高かった。注目すべきは、増殖の速いｈＭＳＣがＳＴＲＯ−１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ１４６、およびＰＤＧＦＲβの発現が有意により高かったことである（Ｐ＜０．０５、ｔ検定）。我々のプロフィール解析から明らかなのは、ＩＳＣＴ評価基準が不十分であることと、ＭＳＣ同定にはＳＴＲＯ−１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ１４６、およびＰＤＧＦＲβのレベルをチェックすることを含めるべきであることである。
２．５ サイトカインの定量的多重検出
維持培地に３，０００細胞／ｃｍ２で播種された細胞の条件培地を４日後に回収した。マトリクス結合タンパク質を遊離させるため、細胞層を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中の２ＭのＮａＣｌで、５〜１０秒処理した。条件培地と塩洗浄液を、別々に、ミリポアのＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ＭＡＰ−ヒトサイトカイン／ケモカインキット（カタログ番号ＭＰＸＨＣＹＴＯ−６０Ｋ）を使用して解析し、製造事業者の取扱説明書に従って、１４種類の異なる増殖因子を同時に定量した。細胞数で標準化されたピコグラム／ｍｌ単位で、（培地に分泌された因子とマトリクスに結合していた因子の）総増殖因子の濃度として、結果を提示する。
２．５．１ ｈＭＳＣのサイトカイン分泌プロフィール
ｈＭＳＣによって生産されるサイトカインと増殖因子のレベルを、インビボ効力を推定する指標として測定する。有意なドナー間のばらつきが、大多数の増殖因子に関して観察された。線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）が最もよく分泌される因子（５００〜６０００ｐｇ／ｍｌ）（図１３）であり、次に、ＭＣＰ１（細胞移動と血管新生の両方に重要な役割を演じることが知られているもの）であった。ＰＤＧＦ−ＢＢ（細胞性構成要素と骨芽細胞分化プログラムとの間の中心的連結因子（ＣａｐｌａｎとＣｏｒｒｅａ、２０１１年））のレベルは、ＰＤＧＦ−ＡＡのものよりも有意に大きかった。まとめると、増殖に基づいてこれら因子をグループ分けする際に注目すべきは、ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１α、フラクタルカイン、ＰＤＧＦ−ＢＢ、およびＭＩＰ−１αの量が、増殖の速いｈＭＳＣで有意により高かったことである（図１４）。注目すべきは、創傷治癒に関与する重要な因子（例、分裂促進因子ＦＧＦ−２、血管新生促進因子ＶＥＧＦ、ケモカインＳＤＦ−１αおよびフラクタルカイン、炎症促進性ケモカインＭＩＰ−１α、ならびにＰＤＧＦ−ＢＢ（強力な血管新生、分裂促進、および走化性因子））が、増殖の速い細胞中でアップレギュレートされていることである。我々の結果は、ｈＭＳＣのインビボ効力を予測するのに中心的である可能性があり、従って、潜在的に臨床で使用することに関してＭＳＣの選択を容易にする重要な因子として働くこれら増殖因子のレベルを測定する重要性を強調する。
２．６ 活性化型Ｔ細胞の免疫抑制
成体の全血由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して得た。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐネガティブセレクションＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カナダ）を使用して、ＰＢＭＣから単離し、そして、カルボキシ−フルオレセイン−ジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＣＦＤＡ ＳＥ細胞トレーサーキット）を用いて標識した。Ｔ細胞一つ当たり４個のビーズとなる比率で、抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８のＭＡＣＳｉビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、ドイツ）によって、ＣＤ４＋ＣＦＳＥ＋細胞（０．５〜１×１０５）を刺激し、それに対して、ｈＭＳＣを、様々なＴ細胞：ＭＳＣ比率で加えて、３７℃でインキュベートした。ＣＤ４＋ＣＦＳＥ＋細胞の増殖を、フローサイトメトリーによって７日後に測定し、そして、Ｔ細胞増殖のｈＭＳＣによる阻害のパーセンテージを決定した。
２．６．１ ｈＭＳＣの免疫抑制能
リンパ球混合培養または分裂促進刺激下のいずれかでのＴ細胞増殖の阻害によって、進行中の免疫応答を抑制することができる免疫調整因子を分泌するＭＳＣの能力を試験するために、増殖の速い（ドナーＡ）プールと増殖の遅い（ドナーＦ）プールの両者からの内一つの代表由来の細胞を調べた（図２１；表２）。フローサイトメトリーを介する細胞分裂解析は、抗体刺激下のＴ細胞増殖が、ｈＭＳＣによって、用量依存的様式で抑制されることを示した（図１５）。Ｔ細胞：ＭＳＣ比率が３２：１では、抑制は観察されず、そのような条件下で増殖する細胞のパーセンテージは「ｈＭＳＣ無し」コントロール群のものと同じであった。阻害は、Ｔ細胞１つ：ｈＭＳＣ２つの比率で最も高く、その増殖パーセンテージは抗体刺激無しのＴ細胞増殖に相当した。増殖の速いｈＭＳＣは、Ｔ細胞の抑制が一貫して有意により大きかった（＊Ｐ＜０．０５）。注目すべきことには、増殖の速いｈＭＳＣは、一貫して有意により高いＴ細胞抑制を示した（＊Ｐ＜０．０５）。免疫抑制のこの機能的アッセイは、増殖の速い細胞が治療に効力のあるという優位性を強調する。
Figure 0006856239
２．７ 遺伝子発現試験
２．７．１ 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）：製造事業者の取扱説明書に従って、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ社、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）を使用して、トータルＲＮＡを単離し、そして、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって定量した。ｃＤＮＡに変換（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＣＡ）後、中胚葉系遺伝子ＴＷＩＳＴ−１およびＤＥＲＭＯ−１、骨形成マーカーＲＵＮＸ２、ＡＬＰ、およびＢＳＰ−ＩＩ、脂肪形成マーカーＰＰＡＲγおよびＣＥＢＰα、ならびに、軟骨形成遺伝子ＣＯＬ２Ａ１およびＳＯＸ９の発現を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム上で、ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイを使用して評価した（表３）。Ｃｔ値をβ−アクチンに対して標準化し、そして、結果を相対的発現単位（ＲＥＵ）としてプロットした。
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２．７．２ マイクロアレイとジーンオントロジー分析：Ｐ５で抽出したＲＮＡを、製造事業者の取扱説明書に従って、ＴｏｔａｌＰｒｅｐ ＲＮＡ増幅キット（Ａｍｂｉｏｎ社、米国）を使用してマイクロアレイ用に増幅した。得られた精製済みのビオチン標識相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を標準化して、そして、直接的ハイブリダイゼーションアッセイ設備を使用して、ヒトＨＴ−１２ バージョン４ビーズチップ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、米国）上にハイブリダイズした。そのチップを、その後、洗浄し、ブロッキングし、そして、ハイブリダイズしたｃＲＮＡにＣｙ３−ストレプトアビジンを結合した。ＩｌｌｕｍｉｎａのＢｅａｄＳｃａｎソフトウェアを使用するＩｌｌｕｍｉｎａのＢｅａｄＡｒｒａｙ読み取り装置を使用して、チップをイメージングし、そして、イメージデータをＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、米国）によって発現プロフィールへと変換した。バックグラウンドを差し引いて、データをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ａｇｉｌｅｎｔ社、米国）へと提出した。リピートしたものを平均し、そして、ペア解析を実施し、その後、ｐ＜０．０５および変化倍率≧１．５でスチューデントのｔ検定不対統計解析を行った。各群を代表する二つのドナーサンプルを、二回技術的にリピートして、解析した。作成した遺伝子リストを、Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤを使用してＤＡＶＩＤ上にアップロードして、中程度の分類厳格さのＧＯＴＥＲＭ＿ＢＰ＿ＦＡＴによって群別に機能的注釈をつけた。ｐ≦０．０５の生物学的プロセスだけを考慮に入れた。
２．７．３ 遺伝子発現解析
増殖の速い細胞と遅い細胞との間の表現型の差異は、遺伝子発現の体系的差異に起因する可能性がある。トランスクリプトームレベルのそのような持続的差異を同定するために、ｑＰＣＲを実施して、中胚葉関連マーカーＴｗｉｓｔ−１とＤｅｒｍｏ−１のレベルをチェックした。増殖の速いｈＭＳＣは、これらのマーカーの転写物レベルがより高かった。そのような差異の同定の際には、マイクロアレイによるグローバル遺伝子発現解析を、前記二群に関して実施した。変化倍率カットオフ値が１．５でｐ値が＜０．０５によって、この二群間で差次的に発現される少数のものからなる転写物セットの線引きをし、増殖の速い株では７４個が有意に高く、増殖の遅い株では１４９個が有意に高かった（図１６Ｂ）。この遺伝子セットのサイズが限定されていることは、この二群が大まかには類似していて、特質のばらつきはこれらの遺伝子に帰することを示す。
ＤＡＶＩＤの機能的注釈クラスタリングによるジーンオントロジー（ＧＯ）解析を、作成した遺伝子リストに実施して、増殖の速い群と遅い群において強化される生物学的プロセスを同定した。細胞接着、細胞骨格、およびオルガネラを制御する遺伝子が増殖の速い群で有意にアップレギュレートされ（ｐ値≦０．０５）（表４）、後者はターンオーバー率がより速いことを示していた。細胞外マトリックスと近隣細胞への接着は、細胞周期進行と相関する（２，３）。増殖の遅い細胞で高い遺伝子は、細胞形態形成遺伝子となる傾向があり、間充織由来器官の発生と関わる傾向もある（表４）。
表４
ジーンオントロジー（ＧＯ）解析。増殖の速いｈＭＳＣ（表４Ａ）と増殖の遅いｈＭＳＣ（表４Ｂ）で高い遺伝子セットについて、ＤＡＶＩＤの機能的注釈用語（サブセット：ＧＯＴＥＲＭ＿ＢＰ＿ＦＡＴ）を使用して、ＧＯ解析を実施した。派生したＧＯ用語は、元の用語により表した。
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ＭＳＣ分化に関与する遺伝子のアップレギュレーション／ダウンレギュレーションを調査するために、前記マーカーの転写物レベルを、非誘導条件下でｑＰＣＲによって測定した。個々のドナーは、これらの遺伝子のベースライン発現にばらつきを示したが、二群間での三系列分化マーカーの有意差は観察されなかった。
２．８ インビトロ多系列分化
ｈＭＳＣの骨形成系列、脂肪形成系列、および軟骨形成系列への分化能を、過去に記載（Ｒｉｄｅｒら、２００８年）されたように評価した。染色したプレート／ウエルの平均強度を、ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用して解析し、そして、相対強度単位（つまり、各コントロールウエルに比較する処理ウエルの強度の増加倍率）として記録および表現した。これらの測定では、染色がより濃いほど密度値がより高いことを意味する。
２．８．１ 多系列分化能
ｈＭＳＣの多分化能性を評価するために、それら細胞を、特定培地構成成分と培養条件を用いて培養することによって誘導して、骨形成系列、脂肪形成系列、および軟骨形成系列へと分化させた（図２２）。全てのドナーｈＭＳＣは、間葉系幹細胞として記載される最低限の評価基準を満たしていた。なぜなら、それら細胞は全て自己複製と分化の両方をすることができたからであるが、その能力は互いに異なっていた。ＴＷＩＳＴとＤＥＲＭＯのレベルから明らかな潜在的前駆細胞の割合が最も高い増殖の速い細胞は、ＲＵＮＸ２、ＡＬＰ、およびＣＥＢＰαの発現と関連する差を呈していた。Ｔｗｉｓｔ−１とＤｅｒｍｏ−１高発現ｈＭＳＣは、増殖能が最も高かったことが判明した。従って、ＴＷＩＳＴの発現がより高いことは、骨形成分化能が減少し、自己複製能が増加することの両方と相関する（図１７Ａ）。平均値の比較を見ると、差が観察されるが、注目すべき他の有意な効果はなかった。マトリックスの堆積がより機能的なリードアウトであるので、細胞層の染色を解析した。誘導条件下でのカルシウム沈着の有意差が、増殖の速い細胞と遅い細胞との間で観察された（図１７Ｂ、１７Ｃ）。注目に値するのは、ＡＬＰのｍＲＮＡレベルが増殖の遅い細胞で対応してより高かったことである。このことは、これらの細胞が既にプライムされて、骨形成系列へと分化が進んでいる可能性があることを示している。確かに、骨系列に関しては、その遺伝子発現レベルが、増殖の速いドナーのものの間でひとかたまりとなっている。脂肪形成に関与する遺伝子では、脂肪細胞化する培養物中でＰＰＡＲγとＣＥＢＰαのアップレギュレーションを示した。転写物レベルでは有意差は観察されなかったが、ｈＭＳＣの二群間で染色強度を標準化したものでは有意差が観察された（Ｐ＜０．０５）（図１７Ｃ）。一般的には、骨形成分化と軟骨形成分化下での増殖の速いドナーのものの間でのばらつきは少なかった。軟骨形成条件下では、二群間で差は観察されなかった。
この差が生物学的に妥当なものでない可能性を考量すると、注目に値するのは、全てのドナーのものが三系列分化能を示すことである。我々の試験は臨床関連物の同定に焦点を当てているので、分化に関する我々の結果は、ＭＳＣ同定基準セットの包括的評価を提供した。この段階では、ＭＳＣの効率にやや差があるが、増殖の速い細胞が分化に関してより良好な細胞となる十分な証拠として、上記結果を捉えることはできない。それにも関わらず、全ての個々のドナーのものは、三系列分化能を示していて、従って、ＭＳＣの同定のためのＩＳＣＴ評価基準を満足していた。
２．９ 異所性化骨アッセイ
エクスビボ（ｅｘ−ｖｉｖｏ）継代数４の細胞を培養拡張して、ＭａｓｔｅｒＧｒａｆｔ（登録商標）マトリクス基材（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ社、米国）上に約３〜５×１０６で播種し、その後、過去に記載（Ｚａｎｎｅｎｔｉｎｏら、２０１０年）されたように、８週齢免疫不全マウス（ＮＩＨ−ｂｇ−ｎｕ−ｘｉｄ、Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）の皮下ポケットへ、それら細胞を移植した。倫理承認済み小型動物プロトコル（ＩＡＣＵＣ：＃１１０６５１）の規定に従って、外科手術を実施した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＭｏｂｉｌｅＡｒｔ ＭＵＸ−１０１スタンダード（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社、日本）とＤｕＲＲ ＭＥＤＩＣＡＬ−ＣＲ３５ ＶＥＴイメージプレートスキャナーを使用して、移植直後と８週目に、Ｘ線像を撮影した。ＳｋｙＳｃａｎ ＣＴ解析装置を使用して、４週目と８週目に、マイクロＣＴを実施した。そして、ＣＴＡｎ（ＳｋｙＳｃａｎ）とＭｉｍｉｃｓソフトウェアによって、データセットを再構築および解析して、適切な閾値設定を適用することによって骨量を計算した。移植物を８週後に動物から回収して、脱灰処理し、パラフィンに包埋し、そして、ヘマトキシリン／エオシンおよびラリス三色染色で染色した。免疫組織化学は、ブロッキングバッファー中で４℃一晩、マウスオステオカルシン（Ｍ１８８、１：１００、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社）、ヒトオステオカルシン（ａｂ７６６９０、１：５０、Ａｂｃａｍ社）、マウスコラーゲンＩ型（ＮＢＰ１−７７４５８、１：２００、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）に対する適切な濃度の一次抗体と共に、または、同じ濃度のマウスＩｇＧ（ＭＧ１００、Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂ社、米国；ネガティブコントロールとして）と共に組織切片をインキュベートして実施した。切片を洗浄し、そして、ラット吸着済みビオチン標識抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ社、米国）で１時間インキュベートし、次に、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合（ＡＢＣ）溶液（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ ＡＢＣペルオキシダーゼ染色キット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ社）を１時間加えた。ペルオキシダーゼ活性は、３，３−ジアミノベンジジン−テトラヒドロピリド（ＤＡＢ；ＤＡＫＯ社、米国）を使用して検出した。切片を洗浄し、マウントし、そして、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ（Ｚ１）倒立顕微鏡下で検査した。
２．９．１ ｈＭＳＣのインビボ異所性化骨効力
ｈＭＳＣのインビトロ特徴解析に引き続いて、機能的インビボアッセイを行った。ＭＳＣの効力に関する最も重要なアッセイにおいては、異所部位での移植後の骨形成能がある。全てのドナー由来のＭＳＣは、程度に有意な差はあるが、骨を形成する能力があることを確認した。μＣＴで定量する移植物の解析を積み重ねると、増殖の速いｈＭＳＣが、増殖の遅いものよりも異所に骨を形成する能力が２〜３倍大きかったことが示される（図１８Ａ〜１８Ｅ）。Ｈ＆Ｅおよびラリス３色染色で染色した移植物の切片は、色勾配バーにより示される形態、つまり、骨形成と繊維状組織の程度を示した（図１９Ｂ）。形成された骨がヒト起源であるか、または、マウス起源であるかを決定するために、回収した移植物の切片を種特異的抗オステオカルシン抗体で染色した。このことは、移植したｈＭＳＣがヒト骨芽細胞に分化して異所部位で骨を形成したかどうか、または、移植したｈＭＳＣが骨を形成するための宿主組織を支持していたかどうかの決定を可能にする。免疫組織化学的解析は、ヒトオステオカルシンの存在するレベルがマウスオステオカルシンよりも大きいことを明らかにした（図１９Ａ）。基材の穴に骨を沈着させていると観察される骨芽細胞様細胞は、ヒトオステオカルシンに対する染色によって示されるようにヒト起源のものであった。ドナーＡ、Ｃ、およびＥは、ドナーＢ、Ｄ、およびＦよりも多くの量のオステオカルシン沈着を誘起し、このことはμＣＴ解析と相関していた。ｈＭＳＣの無い基材はまた、その担体の骨伝導性に見合う何らかの沈着があったことも判明した。マウスコラーゲンが全ての移植物中で主として存在し、増殖の速いｈＭＳＣは、増殖の遅い細胞よりもコラーゲン１型の堆積が多かった。
試験した全てのｈＭＳＣ集団は、レベルは異なるけれども、インビボ化骨能を呈することができた。インビトロのパラメータを上記インビボの結果と相関させると、いくつかのｈＭＳＣは、増殖能が増加し、テロメアがより長くなり、そして、増殖因子の分泌レベルのより高くなることが判明し、異所部位で骨を形成する能力がより高かった。
２．１０ 結論
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞のインビトロとインビボの属性を相関させて明らかになったことは、ＣＦＵ−Ｆ効率の高いドナー由来細胞は、増殖の遅い細胞に比べて、平均すると、サイズが小さく、増殖が増加し、テロメアが長いこと；多分化能のバイオマーカー（ＣＤプロフィール）が、より高い割合の小型サイズのｈＭＳＣを有するドナーにおいて同様に高いこと；栄養因子ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＳＤＦ−１α、フラクタルカインの分泌が、増殖能が向上したｈＭＳＣで高くなっていること；ならびに、皮下の異所部位での骨形成が、栄養因子の分泌レベルがより高く、増殖能がより高く、そして、テロメアが相対的に長い培養ｈＭＳＣの移植と正に相関することである。本試験で記載されるＦＧＦ−２レベル、テロメア長、および増殖速度の基準値をモニターすることは、治療に効能のある細胞の選択を可能にし、ｈＭＳＣ移植に掛かる時間と資源を節約することができる。上記性質に関して効率がより高いｈＭＳＣの選択は、インビボ効力を際立たせることが期待される。これらの知見は、このクラスの中で最良のｈＭＳＣの選択を可能とすることによって、組織工学応用用の培養拡張ＭＳＣの増殖と分化を指揮且つ増強する将来的戦略を開発するための基礎を敷く。
インビトロの知見をインビボのものと相関することによって本発明者らが下した結論は、倍化時間がより早く、より長いテロメアを有する迅速に自己複製する細胞の割合がより高く、そして、ある種の重要な増殖因子（特に、ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、およびＳＤＦ−１α）の分泌レベルがより多いｈＭＳＣが異所部位での新規骨形成のインビボ効力がより大きいことである。いくぶん逆説的であるが、新規骨形成をより多く生み出した増殖の速いｈＭＳＣは、インビトロでの石化能が非常に低かった。増殖の速い株と遅い株の、それぞれ増殖関連プロセスと成熟関連プロセスの増強は、それらの表現型の多様性を下支えする生理学的基礎を示唆する。出来る限り操作によるばらつきを最小限にして、標準的手順に従って、ドナーからＢＭ−ＭＳＣを誘導および派生させた場合、それら細胞の生理的差異は、基礎とするトランスクリプトームのバリエーションに起因する可能性がある。
現時点まで、ｈＭＳＣのインビトロの特性とインビボでの治療効果との間の体系的相関は実証されていなかった。その主とした理由は、ＭＳＣの治療能力を予想する世界的に受容されたインビトロ方法が無いからである（文献）。臨床的に妥当な効能アッセイの提供を試みたＪａｎｉｃｋｉら（２０１１年）の重要な研究は、ｈＭＳＣの倍化時間がインビボの骨形成とよく相関することを実証した。ここで、本発明者らはこの概念を、他のインビトロパラメータ（つまり、異所性組織形成に相関する因子）（分裂促進因子とサイトカイン因子の分泌に関するアッセイを含めるもの）へと大きく拡大した。遡及的には、増殖の速いｈＭＳＣを生み出すドナーのもののＣＦＵ−Ｆ効率の解析は、７回の継代内に１５回より多くの累積的集団倍化を完了することができるｈＭＳＣがインビボで化骨を誘導する優れた能力を持っていることを確認した。
以前報告されたのは、迅速に自己複製する細胞が、それぞれ、ＳＤＦ−１αとフラクタルカインに対するＣＸＣＲ４とＣＸ３Ｒ１（造血、血管系新生、および免疫細胞の効率的輸送へ関与する受容体）をより高いレベルで発現することであり（Ｌｅｅら、２００６年）、このこともまた観察された。ケモカイン受容体の発現が増加した迅速に自己複製する前駆細胞はまた、マウスのニューロスフィアへとより良好に生着することが知られている（文献）。増殖の速いｈＭＳＣ中でのｔｗｉｓｔ−１とｄｅｒｍｏ−１（間葉系幹細胞の増殖と分化に重要なことが知られている遺伝子）の発現がより大きくなることは、Ｉｓｅｎｍａｎｎら（２００９年）（著者らは、そのようなＭＳＣが骨形成／軟骨形成分化能が減少して、脂肪形成に向かう傾向が増強することを実証した）によってなされた機能的試験を確証するのに役立つ。
２．１０．１ インビトロｈＭＳＣ特性とインビボ効率との相関
どうしてｈＭＳＣ増殖が、異所性モデル（そこでは、骨誘導性増殖因子、力学的刺激、および骨支持環境も役割があるはずである）における実績の予想因子となるかは知られていない。おそらく、高い同化作用が、移植部位での、活性のある血液に富む微小環境を作り出すのに必要とされる。Ｈｅｌｌｅｄｉｅら（２０１２年）が示したのは、テロメアのより長いｈＭＳＣが、ヌードラットの臨界的サイズの骨損傷中に移植される場合に、より長く生存していたことである。
インビトロでは、増殖の速いｈＭＳＣと遅いｈＭＳＣの間で骨形成遺伝子の発現に有意差があった。増殖の遅いｈＭＳＣは、骨形成誘導の際にインビトロ石化がより良好であったが、インビボの実績は不良であった。このことが示唆するのは、集団内の大部分のＭＳＣの増殖速度が速いことは、既に骨芽細胞になり始めた可能性のある細胞の一部により生じる可能な利点を凌駕したことである。基材の穴の中での骨沈着が示唆するのは、石化マトリクス沈着能が空間的に制御され、そして、これを実現するのに最も適応するｈＭＳＣは、増殖の遅い先に分化した細胞というよりはむしろ増殖の速いものである場合があることである。標準的インビトロ骨形成アッセイの予測性が乏しいのは、我々のグループの以前の研究と一致している。また、他のグループの仕事は、エクスビボのマトリクス石化アッセイが特異性を欠き、真の骨形成とほとんど一致しないか又は全く一致しないことを示している（Ｗａｔｓｏｎら、２００４年；Ｒａｉら、２０１０年）。
増殖の速いｈＭＳＣは、小型サイズの細胞であって、ヘテロな集団内由来で、高いクローン増殖能と多分化能を有する細胞から高い割合でなっていた。この相関が興味深いのは、この特徴がｈＭＳＣ挙動の３つの観点（栄養因子の分泌、ＲＳ細胞亜集団の割合、および骨形成力）を連結するからである。
骨代謝を制御する多数の増殖因子の中で、ＦＧＦ−２は間葉系細胞の特に強力な分裂促進因子として認識されている。ＦＧＦ−２は、骨芽細胞系列内の細胞により生産され、骨マトリクス中に蓄積し、そして、骨細胞の自己分泌／傍分泌因子として働く（文献）。骨芽細胞分化と骨形成のＦＧＦ−２刺激は、Ｗｎｔ経路の調節によって一部媒介されている（Ｋａｓｔｅｎら、２００８年；Ｆｅｉら、２０１１年）。ＦＧＦ−２を外から適用することは、骨形成前駆細胞表面のＢＭＰＲの発現を変化させることを通して、ＢＭＰ−２誘導型異所性化骨を促進することによる骨形成への刺激性効果を有する。これは、現在、ＦＧＦ−２のインビボの主要な薬理作用であると考えられる効果であり（Ｎａｋａｍｕｒａら、２００５年）、そして、何故ｈＭＳＣが、先に分化した骨芽細胞よりも、異所性化骨をより良好に生じるかというもっともらしい理由である（図１５Ｂ）。ＶＥＧＦはＰＤＧＦ増殖因子スーパーファミリーに属し、血管新生（あらゆる組織治癒に重要なプロセス）の鍵となる制御因子である（Ｚｅｎｔｉｌｉｎら、２００６年；Ｓｃｈｉｐａｎｉら、２００９年）。ＶＥＧＦはまた、内皮細胞（Ｈａｎら、２００９年）、骨芽細胞（Ｈｉｌｔｕｎｅｎら、２００３年）、およびＭＳＣ（Ｈｕａｎｇら、２０１０年）にとって強力な分裂促進刺激として働く。本発明者らはまた、ＶＥＧＦがｈＭＳＣによって分泌されたことを実証する。増殖の速い細胞が上質の骨を作りだした理由の一部は、組織学によって支持されることであるが、内皮細胞の補充を刺激する能力が優れていたからである可能性がある。血管新生は、毛細血管を形成する内皮細胞の補充に関与し、その細胞は次に血管新生増強因子によって刺激されて、新生血管細胞のさらなる移動と増殖を誘導する（Ａｂｂｏｕｄ、１９９３年）。骨治癒は、血管新生と密接に関連するので、ＶＥＧＦとＭＣＰ−１のレベルの増加は、過去の報告とよく相関する（Ｚｉｓａら、２００９年）。
過去１０年に渡る膨大な量の仕事にも関わらず、（予想不能の特質を有するヘテロな細胞混合物である）ＭＳＣは未だ理解が相対的に貧弱である。最近の総説でＭｅｎｄｉｃｉｎｏら（２０１４年）によって指摘されたように、米国ＦＤＡへのＭＳＣ規制に関する提出物のなかで、提供者がＭＳＣを如何に定義し、製造し、そして、記載したかについては途方に暮れるほどの多様性がある。組織提供に関するものだけではなく、インビトロ増殖法、細胞表面マーカー発現、および製品製造にも多様性がある。ＦＤＡへの提出物の調査から確認されたのは、ＭＳＣベースの製品のＩＮＤ提出物に関しては、７種類の細胞表面マーカー（ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、およびＨＬＡクラスＩＩ）がルーチン的に利用されることである。このことは、２００６年の見解論文でＩＳＣＴによって規定されたマーカーセットと一貫している（Ｄｏｍｉｎｉｃｉら、２００６年、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、８：３１５−３１７）。しかしながら、このマーカーセットが最も完全で正確なものとはかけ離れており、真に「幹様」な資質を持たない非常に多くの細胞を含んでいることは明らかである。最近示されたのは、自己複製可能な骨髄由来接着細胞の画分を維持および増殖さえさせるために、特定のＨＳ含有量を含む特別な条件培養が要求されることである（Ｈｅｌｌｅｄｉｅら、２０１２年）。従って、どの特定のマーカーセットが、真にこのヘテロな細胞クラスを記述するのかは未解決の問題となっている。
ＭＳＣの生理活性はまた、微小環境のキュー、臨床での適応症、および投与経路に依存している場合もある。ＭＳＣが最も標的とする臨床適応症は、循環器疾患、神経疾患、整形外科疾患、および代謝疾患（特に、糖尿病）である。約１／４が、免疫媒介疾患（特に、移植片対宿主病）に注目している。複数の投与経路（例、静脈内、直接注射（ほとんどは心臓）、および局所適用）が採用されてきた（文献）。如何に本細胞がその生理活性を発揮するかを正確に評価する説得力のある手段が無いにも関わらず、概念を証明する動物試験では、表現型、増殖能、分布、および投与後生存期間、そして、その組み合わせさえとして、細胞挙動のそのような複雑な観点をモニターするようにいろいろな試みがある。
表現型の安定性、ＭＳＣベースの治療への亜集団の影響をより良く理解するために、ここに記載される種類の仕事がさらに必要とされることは、明白であるように思える。このことは、利用可能な情報がさらにほとんどない非骨髄由来ＭＳＣベースの治療に関してはさらにもっと当てはまる可能性がある。治療効果を予測するマーカーは、ＭＳＣベースの製品の臨床応用に関する効果を掛け算的に増加させることが期待できる。
実施例３−ＧＳＴＴ１に基づく技術開発
３．１ バイオマーカーキットの開発−臨床設定で使用するためのＧＳＴＴ１遺伝子型テストの設計
実現可能なＰＣＲ診断キットを、２つの主要なＧＳＴＴ１対立遺伝子（野生型とＧＳＴＴ１欠損対立遺伝子）を検出するように設計する。
最も簡単で、早く、そして安い手段は、診断薬業界で広く使用されているＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲ方式を診断キットに採用することである。このＴａｑＭａｎ形式でうまく働くように、両対立遺伝子のＲＴ−ＰＣＲプライマーを設計する。商業的に考えると、将来のドナーから採血される末梢血を使用するために、キットを最適化しようと思う。
キットは汎用性があり、ＭＳＣの単離中に典型的には廃棄される骨髄調製物由来の非接着細胞から抽出されるＤＮＡを用いて開始可能である。ＴａｑＭａｎ方式で使用するための適切な特性（例、アニーリング温度）を有するプライマーとプローブを選択する。
１０〜２０種類のプライマーペアの組合せを、最適化プライマー設計アルゴリズムを使用して設計し、そして、ＧＳＴＴ１対立遺伝子を検出する能力に関してテストする。最良のペアを、その後、ペアとしてテストして、一回の反応で複数のＧＳＴＴ１対立遺伝子を検出する多重方式で使用するための適切に適合するセットを同定する。
患者または将来のドナーにおけるＧＳＴＴ１の存在または非存在をスクリーニングして、その後、幹細胞を得るかどうかに関して決定することを可能にする簡単なＤＮＡベースのキットを設計している。
各種組織（例、口腔粘膜スワブ、血液、および皮膚をパンチで切り抜いたもの）を利用して、ＧＳＴＴ１の存在または非存在を検出することができる。同意しているドナーの口腔粘膜スワブから回収される細胞をテストするキットを主として使用する。組織が利用可能であるかどうかによるが、他の組織材料もまた、口腔粘膜スワブの代替物として考慮することもある。
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、標準的抽出手順を使用してサンプルから抽出する。ＧＳＴＴ１遺伝子のコピー数を検出するようにＢｕｃｈａｒｄらによって設計されたプライマーを利用して、ｇＤＮＡサンプルを調べることができる（図２４）ーＢｕｃｈａｒｄら、Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ、（２００７年）９（５）：６１２−６１７を参照されたい。
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「ＧＳＴＴ１＿欠損」プライマーセットは、ＧＳＴＴ１の両脇の相同領域に隣接する特異的配列にハイブリダイズする（図２４）。ＧＳＴＴ１遺伝子が欠失すると、これらのプライマーは、約３Ｋｂの産物を増幅する。その理由は、その欠失が、プライマーのハイブリダイゼーション部位を、ＰＣＲ増幅ができるほど近くに引き寄せるからだ。「ＧＳＴＴ１＿遺伝子」プライマーセットは、ＧＳＴＴ１配列のある区間に特異的で、遺伝子が存在する（すなわち、欠失していない）場合１ｋｂの産物を増幅することができる：
１＋／＋：１ｋｂバンドだけ、
ＧＳＴＴ１＋／−：１ｋｂバンドと３ｋｂバンド、
ＧＳＴＴ１＋／＋：３ｋｂバンドだけ。
多重ＰＣＲアッセイでは、それらプライマーは、ドナーの遺伝子型を決定することを可能にする。従って、患者やドナーのＧＳＴＴ１コピー数は、同定可能であり、幹細胞単離用のこのバイオマーカーがヌル型の個人の前選抜を可能とする。これにより、細胞ベースの治療用の質の高い幹細胞を作製する時間と資源を節約可能である。これら選択して単離された幹細胞を適用することは、そのような臨床目的に、より良好な効力を有する場合がある。
３．２ インビトロでの幹細胞資質の評価
幹細胞ドナーを、ＧＳＴＴ１遺伝子型に関してスクリーニングし、そして、ＧＳＴＴ１遺伝子型を、幹細胞表現型と関係づける。
ａ．骨髄吸引：インフォームドコンセントとその後の標準的手続き後に、Ｊａｍｓｈｉｄｉ針を使って、局所麻酔下の１０人の健常成人ドナー（ｎ＝１０）の腸骨稜から、骨髄吸引物（３０ｍｌ）を得る。
ｂ．ＭＳＣの単離：骨髄吸引物を、Ｆｉｃｏｌｌ上に積層し、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。単核細胞画分を、滅菌的に組織培養プレートへ移し、そして、接着細胞のコロニーが形成されるまで３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。非接着細胞集団を回収し、そして、第３．１章に記載したバイオマーカーキットを使用してＧＳＴＴ１状態を確認するためにＤＮＡを単離する。
ｃ．ＭＳＣの特徴解析：複数ドナーから単離したＭＳＣを以下の方法によって個々に特徴解析する。
（ｉ）コロニー効率−互いに異なるＭＳＣ調製物（Ｔ７５フラスコ１個当たり、０．５〜２百万個の骨髄単核細胞）をプレートに蒔いて、それらを１４日間培養することによって、ＣＦＵ−Ｆをアッセイした。５０個より多い細胞を有するコロニー（他のコロニーと接触していないもの）をスコア化する。
（ｉｉ）増殖−継代数１０までの累積的細胞数を、製造事業者（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）の取扱説明書に従って、Ｇｕａｖａ ＰＣＡ−９６ベースシステムを使用するＶｉａＣｏｕｎｔアッセイによって測定する。
（ｉｉｉ）細胞表面抗原マーカー発現−細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）を使用して剥がし、そして、洗浄する。約１×１０５細胞を、抗体（抗ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＳＴＲＯ−１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ−１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４、およびＨＬＡ−ＤＲ）とインキュベートし、そして、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｒａｙ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で解析する。全てのサンプルを、３回リピートして測定する。
（ｉｖ）多系列分化−ＭＳＣを骨形成、脂肪形成、または軟骨形成サプリメントで刺激した場合、骨様マトリクスを堆積するか、脂肪滴を形成するか、またはグリコサミノグリカンを分泌する能力に関して、ＭＳＣの表現型を評価する。並行する培養物中のトータルＲＮＡを単離し、そして、ＴＷＩＳＴ−１、ＤＥＲＭＯ−１、と共に他の主要な骨形成、脂肪形成、および軟骨形成バイオマーカーのｍＲＮＡ転写物のレベルをβ−アクチンで標準化する。
（ｖ）テロメア長−染色体ＤＮＡを単離し、その後、沈殿、洗浄、乾燥、および定量する。ＤＮＡ（１２．５ｎｇ）を使用して、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＱ−ＰＣＲ）によってテロメアリピートを増幅するのを３回リピートする。テロメアリピートの相対的発現を、ヒト胚性幹細胞株ＢＧ０１Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から単離した染色体ＤＮＡから作成する検量線（Ｃｔ対ログ尺度）により推定する。
３．３ 異所性化骨モデルでのインビボ幹細胞資質の評価
第３．２章で特徴解析したＭＳＣの骨治癒能を、臨床的に妥当なマウスの異所性化骨モデルにおいて、ＧＳＴＴ１遺伝子型と相関させる。
異所性化骨アッセイ
Figure 0006856239
（ｉ）動物種：８週齢の免疫不全雌ベージュマウス（（ＮＩＨ−ｂｇ−ｎｕ−ｘｉｄ）を、皮下移植片のレシピエントとして使用する。
（ｉｉ）細胞と基材の調製：ドナー由来のエクスビボで拡張した継代数４のＭＳＣ（維持条件下のもの）を、０．１２５％トリプシン／バーゼン液で剥がし、維持培地中に再懸濁して、その後、ＭａｓｔｅｒｔＧｒａｆｔ（登録商標）マトリクス基材（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ社、米国）上に播種する。ＭａｓｔｅｒｔＧｒａｆｔ（登録商標）マトリクス基材は、１５％ＨＡ／８０％β−ＴＣＰセラミック粒子含有コラーゲンスポンジである。その基材を、滅菌条件下で、外科用メスを使用して、３×３×３ｍｍ（２７ｍｍ３）の大きさの立方体へと切断する。約３〜５百万個の骨芽細胞を、切断した基材上に播種し、１時間３７℃でインキュベートし、その後、移植する。フィブリン凝集物（１５μｌのマウストロンビン（２％ＣａＣｌ２中で１００Ｕ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）社、米国）と１５μｌのマウスフィブリノーゲン（ＰＢＳ中で３０ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）社、米国）を用いて作製されるもの）を用いて、その基材と細胞を一緒に保つ。
（ｉｉｉ）外科手術：倫理承認済み小型動物プロトコル（ＩＡＣＵＣ：＃１１０６５１）の規定に従って、外科手術を実施する。各マウスの背の表面中央部に縦の０．５ｃｍの皮膚の切れ目を入れ、そして、皮下ポケットを鈍的解剖によって形成させる。一つの移植片を各ポケットに入れ、動物一匹当たり２個の移植片を入れる。切れ目を、外科用ステープルで閉じる。各移植片と対応するコントロール移植片を、同じ条件下で移植する（ｎ＝６）。
（ｉｖ）解析方法：新たな骨形成の程度を、Ｘ線像、マイクロ−ＣＴ、および組織学によって解析する。Ｘ線像を、移植直後の手術日と８週間後に撮影する。
ＳｋｙＳｃａｎ μＣＴ解析装置を使用して、４週目と８週目の動物に、マイクロＣＴを実施した。再構成画像はＭｉｍｉｃｓソフトウェアを使用して解析し、各成分用に設定された適切な閾値設定を適用することによって、総骨量を計算する。組織学的解析に関しては、５μｍの厚さの切片を、各３〜４ｍｍの移植片の中央部から及びどちらかの端部から回転式ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ドイツ）を使用して切る。パラフィン切片を、正に帯電した顕微鏡用スライド上に置き、乾燥させ、Ｈ＆Ｅとラリス３色染色で染色し、そして、最後にＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ（Ｚ１）倒立顕微鏡下で検査する。免疫組織化学解析に関しては、組織切片を、適切な濃度の一次抗体（マウスオステオカルシン、ヒトオステオカルシン、マウスコラーゲンＩ型に対するもの）、または同濃度のマウスＩｇＧと共にインキュベートする。切片を、ラット吸着−ビオチン標識−抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ社、米国）とインキュベートし、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ）溶液（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ ＡＢＣペルオキシダーゼ染色キット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ社）と１時間インキュベートする。ペルオキシダーゼ活性は、３，３−ジアミノベンジジン−テトラヒドロピリド（ＤＡＢ；ＤＡＫＯ社、米国）を使用して検出する。
Figure 0006856239
３．４ ＧＳＴＴ１を調節する方法と幹細胞資質への効果を測定する方法の評価
ｓｉＲＮＡと小分子阻害剤を介してＧＳＴＴ１レベルを調節することのＭＳＣへのインビトロ効果を検討する。
その重要性を考慮して、ＧＳＴは、特にがんと炎症性疾患に対する創薬の実際の標的となった。予備的データは、ＧＳＴＴ１の発現がＭＳＣの増殖速度に直接影響があることを示す。ＧＳＴＴ１の小分子阻害剤を同定し、ＭＳＣを移植前にその阻害剤で処理し、そして、ＧＳＴＴ１野生型細胞に骨形成能を与えることが可能かどうかを評価する。
ＧＳＴ阻害剤を、市販のものから取得し、ＧＳＴＴ１発現ＭＳＣ上でのインビトロ増殖効果をテストする。一連の既に確立したアッセイ（ＧＳＴＴ１＋とＧＳＴＴ１−／−ＭＳＣ内で差次的な活性（クローン増殖能（コロニー形成活性）、細胞増殖（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステム）、および増殖速度（ＥｄＵ標識））を明らかにするもの）を使用する。選択したＧＳＴＴ１阻害剤を、その後、ＭＳＣのサイトカイン発現プロフィール、免疫表現型、およびインビトロでの多分化能への影響に関してテストする。
ＧＳＴＴ１の下流情報伝達経路を標的とすることも可能である。予備的データは、ｐ３８ＭＡＰＫがＧＳＴＴ１発現を制御することを示す（データ未発表）。ｐ３８ＭＡＰＫは、従って、ＭＳＣの増殖と骨形成活性の重要な制御因子となり得る。ＭＳＣの再生能を増強するこの経路を選択的に標的とすることが、従って、可能である。分子的ツールと薬理学的ツールを使用して、ＧＳＴＴ１がどのサイトカインに影響を与えるか、また、その作用機序を検討する。ＧＳＴＴ１をヌル型細胞で過剰発現させ、サイトカイン発現の変化を検討する。同様に、ＧＳＴＴ１発現を、野生型ＭＳＣでｓｈＲＮＡによってノックダウンし、そして、その結果起こる、増殖、情報伝達、表現型、およびサイトカイン生産の変化を検討する。そのような阻害試験は、サイトカイン発現の理解に情報を与え、そして、ＧＳＴＴ１の存在／非存在下で作用する基礎的情報伝達経路の探索手段を提供する。
サンプルサイズの統計における正当化とデータ解析および解釈手段
細胞ベースアッセイ−全ての実験を、３回独立してリピートして実施する。平均値と標準偏差を計算する。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を利用して、実験群間の有意差レベルを評価し、その後、適切であれば、Ｔｕｋｅｙ事後検定を実施する。全ての統計解析を、ＳＰＳＳ Ｖ １２．０ソフトウェア（ＳＰＳＳ社、Ｃｈｉｃａｇｏ、米国）を使用して実施する。もしｐ≦０．０５であれば、差は有意であると考える。

Claims (10)

  1. 改善した増殖速度および／もしくは組織形成能を有する単一間葉系幹細胞または複数の間葉系幹細胞を同定する方法であって、
    前記単一間葉系幹細胞または複数の間葉系幹細胞中のＧＳＴＴ１発現レベルを測定する工程と、
    測定されたＧＳＴＴ１発現レベルを、間葉系幹細胞のＧＳＴＴ１発現レベルの基準値と比較する工程と、を含み、
    間葉系幹細胞のＧＳＴＴ１発現レベルの前記基準値に比べて、ＧＳＴＴ１発現が減少したと同定された単一間葉系幹細胞または複数の間葉系幹細胞は、改善した増殖速度および／または組織形成能を有すると同定される、
    方法。
  2. 前記方法が、間葉系幹細胞のＧＳＴＴ１発現レベルの前記基準値に比べて減少したＧＳＴＴ１発現を有すると同定された単一間葉系幹細胞または複数の間葉系幹細胞を、他の細胞または幹細胞から分離および／または単離する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 改善した増殖速度および／もしくは組織形成能を有する単一間葉系幹細胞または複数の間葉系幹細胞を同定する方法であって、
    前記単一間葉系幹細胞または複数の間葉系幹細胞のＧＳＴＴ１遺伝子型を決定する工程を含み、
    減少したＧＳＴＴ１発現に関連する、野生型ＧＳＴＴ１のホモ接合型ではない遺伝子型を有すると同定された単一間葉系幹細胞または複数の間葉系幹細胞は、改善した増殖速度および／または組織形成能を有すると同定される、
    方法。
  4. 前記方法が、遺伝子型が野生型ＧＳＴＴ１のホモ接合型ではないと同定された単一間葉系幹細胞または複数の間葉系幹細胞を、他の細胞または間葉系幹細胞から分離および／または単離する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
  5. 改善した増殖速度および／もしくは組織形成能を有すると同定された前記単一間葉系幹細胞または複数の間葉系幹細胞が、間葉系幹細胞の基準集団と比較する場合、一又は複数の以下の性質：
    （ｉ）コロニー形成能の向上；
    （ｉｉ）細胞サイズの減少；
    （ｉｉｉ）テロメア長の増加および／またはテロメア短縮率の減少；
    （ｉｖ）ＳＴＲＯ−１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ１４６および／またはＰＤＧＦＲβの発現の増加；
    （ｖ）ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１α、フラクタルカイン、ＰＤＧＦ−ＢＢ、および／またはＭＩＰ−１αの分泌の増加；
    （ｖｉ）Ｔ細胞抑制の増強；
    （ｖｉｉ）ＡＬＰ、ＲＵＮＸ２、および／またはＢＳＰ−ＩＩの発現の減少；
    （ｖｉｉｉ）ＴＷＩＳＴ−１およびＤＥＲＭＯ−１の発現の増加を、追加的に持つ、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 単一間葉系幹細胞または複数の間葉系幹細胞を改変する方法であって、単一間葉系幹細胞または複数の間葉系幹細胞を、ＧＳＴＴ１発現および／または機能を減少させるように細胞を改変することができる薬剤と接触させる工程を含む方法。
  7. ＧＳＴＴ１発現および／または機能を減少させることができる薬剤を含む単一間葉系幹細胞または複数の間葉系幹細胞。
  8. 間葉系幹細胞ドナーを選抜する方法であって、個体から単離されたＤＮＡ含有サンプル中のＧＳＴＴ１の遺伝子型を決定する工程を含み、野生型ＧＳＴＴ１がホモ接合型である個体と比べてＧＳＴＴ１発現が減少することが既知および／または予測されるＧＳＴＴ１遺伝子型を有すると決定された個体が、間葉系幹細胞ドナーとして選抜される、方法。
  9. 間葉系幹細胞ドナーを選抜する方法であって、
    （ｉ）個体から単離されたサンプル中の単一間葉系幹細胞または複数の間葉系幹細胞のＧＳＴＴ１発現レベルを測定する工程と、
    （ｉｉ）工程（ｉ）で測定されたＧＳＴＴ１発現レベルを、その間葉系幹細胞のＧＳＴＴ１発現レベルの基準値と比較する工程と、を含み、
    前記基準値と比べてＧＳＴＴ１発現が減少していた単一間葉系幹細胞または複数の間葉系幹細胞を有すると決定された個体を間葉系幹細胞ドナーとして選抜する方法。
  10. 単一間葉系幹細胞または複数の間葉系幹細胞が、間葉系幹細胞の基準集団と比較する場合、一又は複数の以下の性質：
    （ｉ）コロニー形成能の向上；
    （ｉｉ）細胞サイズの減少；
    （ｉｉｉ）テロメア長の増加および／またはテロメア短縮率の減少；
    （ｉｖ）ＳＴＲＯ−１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ１４６および／またはＰＤＧＦＲβの発現の増加；
    （ｖ）ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１α、フラクタルカイン、ＰＤＧＦ−ＢＢ、および／またはＭＩＰ−１αの分泌の増加；
    （ｖｉ）Ｔ細胞抑制の増強；
    （ｖｉｉ）ＡＬＰ、ＲＵＮＸ２、および／またはＢＳＰ−ＩＩの発現の減少；
    （ｖｉｉｉ）ＴＷＩＳＴ−１および／またはＤＥＲＭＯ−１の発現の増加を、追加的に持つ、請求項８または９に記載の方法。
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