JP6704563B2 - Chaotrope and method for extracting genomic DNA using the chaotrope - Google Patents
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Description
本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、具体的にはヒストンとゲノムDNAを快速に分
離させるカオトロープ剤、及びDNAの抽出方法に関する。
TECHNICAL FIELD The present invention relates to the field of biotechnology, and specifically to a chaotropic agent for rapidly separating histone and genomic DNA, and a method for extracting DNA.
人間を含む真核生物において、一の生物のゲノムDNAとは、該生物に含まれるDNA中の全部
の遺伝情報である。ゲノムDNAとヒストンとは非共有結合によって結合されるのであり、
このため、DNAとヒストンを如何に分離させるかということは、ゲノムDNAの抽出において
キーとなっており、かつ難点である。実際に、ゲノムDNAの様々な抽出方法においては、
前期のサンプル予め処理（細胞溶解）及び後期のDNAの沈殿、洗浄等のステップは大体同
様であるが、それらの主な相違はDNAとヒストンを如何に効果的に分離させるということ
にある。
In eukaryotes including humans, the genomic DNA of one organism is all the genetic information in the DNA contained in the organism. Genomic DNA and histones are bound by non-covalent bonds,
Therefore, how to separate DNA and histones is a key and difficult point in the extraction of genomic DNA. In fact, in various methods of extracting genomic DNA,
The steps of pretreatment of the sample in the early stage (cell lysis) and precipitation of the DNA in the late stage, washing, etc. are roughly the same, but the main difference between them is how to effectively separate the DNA and histones.
最もクラシックな手段としてプロテアーゼK法は、プロテアーゼKによってヒストンのデグ
レーションを行う。これによって、ゲノムDNAを釈放する。この方法の欠点は、以下のと
おりにある。（1）プロテアーゼKのインキュベーション温度が50〜65℃であり、付加な加
熱設備が必要である。（2）プロテアーゼKのヒストンに対する消化に時間がかかり、一般
に0.5hから徹夜で、試験が長時間にわたる。（3）放置時間が経ち、また繰り返して凍っ
て融解する回数が増加するにつれて、プロテアーゼKの酵素活性が低下し、試験の再生性
と安定性が悪い。
As the most classic method, the protease K method performs histone degration by protease K. This releases the genomic DNA. The drawbacks of this method are as follows. (1) The incubation temperature of Protease K is 50-65℃, and additional heating equipment is required. (2) It takes a long time to digest protease K with histones, and the test generally lasts from 0.5h to overnight, and the test takes a long time. (3) The enzymatic activity of Protease K decreases as the number of cycles of repeated freezing and thawing increases after the standing time, and the reproducibility and stability of the test are poor.
プロテアーゼK法の欠点に対して、実際の使用ではカオトロープ剤によってヒストンとゲ
ノムDNAを分離することが多い。カオトロープ剤によっては、ヒストンとゲノムDNAの間の
非共有作用力（水素結合、双極子相互作用、疎水性相互作用）を崩し、ヒストンに可逆的
な変性を引き起こすことができ、これによって、ゲノムDNAを釈放して、ゲノムDNAの抽出
を実現する。ゲノムDNAの抽出では、よく使われるカオトロープ剤は、塩酸グアニジニウ
ム、グアニジンチオシアン酸塩、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸リチウムがある。これら
において、塩酸グアニジニウム、グアニジンチオシアン酸塩法は試薬濃度が高く、過塩素
酸ナトリウム、過塩素酸リチウム法は試薬濃度が低いが、過塩素酸塩の塩基価数が+7で高
いので、試薬の酸素化性が強い。
In contrast to the shortcomings of the Protease K method, in practical use, histone and genomic DNA are often separated by a chaotropic agent. Some chaotropic agents can disrupt the noncovalent forces (hydrogen bonds, dipole interactions, hydrophobic interactions) between histones and genomic DNA, causing reversible denaturation of histones, which results in genomic DNA. To release the genomic DNA. In the extraction of genomic DNA, the most commonly used chaotropic agents are guanidinium hydrochloride, guanidine thiocyanate, sodium perchlorate and lithium perchlorate. Among these, the guanidinium hydrochloride and guanidine thiocyanate methods have a high reagent concentration, and the sodium perchlorate and lithium perchlorate methods have a low reagent concentration, but since the base number of perchlorate is +7, the reagent Is highly oxygenated.
本発明の目的は、プロテアーゼK法と過塩素酸塩法による欠点を克服し、ヒストンとゲノ
ムDNAを快速に分離させるカオトロープ剤、及びDNAの抽出方法を提供することにある。
It is an object of the present invention to provide a chaotrope agent that overcomes the drawbacks of the protease K method and the perchlorate method and that rapidly separates histone and genomic DNA, and a method for extracting DNA.
カオトロープ剤は、ヒストンとゲノムDNAの間の非共有作用力を崩すことができる化合物
系であって、ヒストンに可逆的な変性を引き起こすことが可能で、これにより、ゲノムDN
Aを釈放して、ゲノムDNAの抽出目的を実現する。
A chaotropic agent is a compound system that can break the noncovalent force between histones and genomic DNA, and can cause reversible denaturation of histones.
Release A to achieve the purpose of genomic DNA extraction.
本発明は、カオトロープ剤であって、臭素酸塩を含むことを特徴とする前記カオトロープ
剤を提供する。
The present invention provides a chaotropic agent, which comprises a bromate.
好ましくは、前記臭素酸塩は臭素酸ナトリウムである。 Preferably, the bromate is sodium bromate.
前記臭素酸ナトリウムの終濃度が0.1〜3mol/Lになるようヒストン及びゲノムDNAを含むサ
ンプルと前記カオトロープ剤を混合する。
The chaotropic agent is mixed with a sample containing histone and genomic DNA so that the final concentration of sodium bromate is 0.1 to 3 mol/L.
好ましくは、前記臭素酸ナトリウムの終濃度が0.2〜3mol/Lになるようヒストン及びゲノ
ムDNAを含むサンプルと前記カオトロープ剤を混合する。
Preferably, the chaotropic agent is mixed with a sample containing histone and genomic DNA so that the final concentration of the sodium bromate is 0.2 to 3 mol/L.
より好ましくは、前記臭素酸ナトリウムの終濃度が1〜3mol/Lになるようヒストン及びゲ
ノムDNAを含むサンプルと前記カオトロープ剤を混合する。
More preferably, the chaotropic agent is mixed with a sample containing histone and genomic DNA so that the final concentration of sodium bromate is 1 to 3 mol/L.
また、本発明は、前記カオトロープ剤によるゲノムDNAの抽出方法において、抽出される
前に前記DNAがヒストンに結合されている方法は、下記の通りである。
Further, in the present invention, in the method for extracting genomic DNA with the chaotropic agent, the method in which the DNA is bound to histone before extraction is as follows.
(1)サンプルを分散して細胞浮遊液になって、細胞溶解液を入れて細胞を破枠して、細胞
核内のヒストンとバーストゲノムDNAの複合物を釈放する。
(1) Disperse the sample into a cell suspension, add a cell lysate to break the cells, and release the complex of histone and burst genomic DNA in the cell nucleus.
(２)前記ステップ（1）で得られる材料と前記カオトロープ剤を均一に混ぜて、ヒストン
とゲノムDNAを分離させた材料が得られる。
(2) The material obtained in the step (1) is uniformly mixed with the chaotropic agent to obtain a material in which histone and genomic DNA are separated.
(３)前記ステップ（2）で得られる材料と蛋白質抽出液を均一に混ぜて、遠心分離して、
蛋白質が抽出された上澄み液が得られる。
(3) The material obtained in step (2) and the protein extract are uniformly mixed and centrifuged,
A supernatant is obtained in which the protein is extracted.
(４)前記蛋白質が抽出された上澄み液とDNA沈殿剤を混合して、遠心分離して、DNA沈殿が
得られる。
(4) A supernatant containing the extracted protein and a DNA precipitant are mixed and centrifuged to obtain a DNA precipitate.
前記方法は、さらに、前記DNA沈殿に対し、洗浄また再溶解を行うことを含む。 The method further comprises washing and redissolving the DNA precipitate.
上記の技術案によれば、本発明ではプロテアーゼKに代わって化学物質である臭素酸ナト
リウム（NaBrO3）を使ってヒストンとゲノムDNAを解離するもので、以下の利点がある。
（1）プロテアーゼKを使うことなく、加熱や時々均一に混ぜるなどの手間を回避し、操作
が簡単で、加熱設備が要らない。（2）プロテアーゼKの長時間消化を回避し、操作時間を
節約する。（3）化学試薬によってサンプルを処理するので、プロテアーゼKの消化不十分
による欠点を克服して、快速に充分的にヒストンとDNAを分離することができ、DNAの獲得
率と純粋度が高い。（4）プロテアーゼKの活性変化傾向による欠点を克服して、再生性と
安定性がよい。従来のプロテアーゼKによる消化法に比べて、本発明では、効率よく、快
速にかつ簡単に人間を含む真核生物のゲノムDNAを抽出することができる。
According to the above technical solution, the present invention uses sodium bromate (NaBrO 3 ) which is a chemical substance in place of protease K to dissociate histone and genomic DNA, and has the following advantages.
(1) Without using Protease K, it avoids the trouble of heating and sometimes evenly mixing, the operation is simple, and heating equipment is not required. (2) Avoid long digestion of Protease K and save operation time. (3) Since the sample is treated with a chemical reagent, the disadvantages due to insufficient digestion of protease K can be overcome, and histone and DNA can be separated rapidly and sufficiently, and the DNA acquisition rate and purity are high. (4) It overcomes the drawbacks due to the tendency of protease K activity change, and has good reproducibility and stability. In the present invention, genomic DNA of eukaryotes including humans can be extracted efficiently, quickly and easily as compared with the conventional digestion method using protease K.
過塩素酸ナトリウムや過塩素酸リチウム法に比べると、本発明の方法によって抽出される
ゲノムDNAの純粋度と濃度が該当することができながら、カオトロープ剤のハロゲン原子
の価数が+5で低いので、試薬の酸化性が弱い。抽出されるDNAの純粋度と濃度は、PCR遺伝
子のアンプリフィケイション、チップ分析、モレキュラークローニング、遺伝子（ゲノム
）シーケンシング/測定など分子生物学相関試験の要求にあわせる。
Compared to the sodium perchlorate or lithium perchlorate method, the purity and concentration of the genomic DNA extracted by the method of the present invention can be applied, but the valence of the halogen atom of the chaotropic agent is +5, which is low. Therefore, the oxidizing property of the reagent is weak. The purity and concentration of the extracted DNA are tailored to the requirements of molecular biology correlation tests such as PCR gene amplification, chip analysis, molecular cloning, and gene (genome) sequencing/measurement.
本発明のその他の特徴と有益な点は下記の具体的な実施形態で詳細に説明する。 Other features and advantages of the present invention are described in detail in the specific embodiments below.
図面は、本発明をより一層理解を促進するために提供され、明細書の一部を構成し、下記
の具体的な実施形態とともに本発明について説明するが、本発明を限定するものではない
。
The drawings are provided to facilitate a further understanding of the present invention, form a part of the specification, and describe the present invention together with the following specific embodiments, but are not intended to limit the present invention.
以下、本発明の最も優れた実施形態を説明する。 The most excellent embodiment of the present invention will be described below.
以下、図面とともに本発明に係る具体的な実施形態について詳細に説明する。これらの具
体的な実施形態は本発明の説明と解釈にのみ用いられ、本発明を限定するものではないこ
とを理解すべきである。
Hereinafter, specific embodiments according to the present invention will be described in detail with reference to the drawings. It should be understood that these specific embodiments are used only for the description and interpretation of the present invention, and not for limiting the present invention.
本発明はカオトロープ剤を提供している。該カオトロープ剤は、ヒストンとゲノムDNAの
間の非共有作用力を破枠できる化合物であって、ヒストンに可逆的な変性を引き起こすこ
とができ、これにより、ゲノムDNAを釈放して、ゲノムDNA抽出の目的を実現する。
The present invention provides a chaotropic agent. The chaotropic agent is a compound capable of disrupting the noncovalent force between histone and genomic DNA, and can cause reversible denaturation of histone, thereby releasing the genomic DNA and extracting the genomic DNA. Realize the purpose of.
前記臭素酸ナトリウムの終濃度が0.1〜3mol/Lになるよう、好ましくは0.2〜3mol/Lになる
よう、より好ましくは1〜3mol/Lになるようヒストン及びゲノムDNAを含むサンプルと前記
カオトロープ剤を混合する。
The final concentration of the sodium bromate is 0.1 to 3 mol/L, preferably 0.2 to 3 mol/L, more preferably 1 to 3 mol/L, and a sample containing histone and genomic DNA and the chaotropic agent. To mix.
また、他の側面において、本発明に係るDNAの抽出方法を提供し、抽出される前に前記DNA
がヒストンに結合されされ、（１）サンプルを分散して細胞浮遊液になって、細胞溶解液
を入れて細胞を破枠して、細胞核内のヒストンとバーストゲノムDNAの複合物を釈放する
こと、（２）前記ステップ（1）で得られる材料と前記カオトロープ剤を均一に混ぜて、
ヒストンとゲノムDNAを分離させた材料が得られること、（３）前記ステップ（2）で得ら
れる材料と蛋白質抽出液を均一に混ぜて、遠心分離して、蛋白質が抽出された上澄み液が
得られること、及び（４）前記蛋白質が抽出された上澄み液とDNA沈殿剤を混合して、遠
心分離して、DNA沈殿が得られること、を含む。
In another aspect, there is provided a method for extracting DNA according to the present invention, wherein the DNA is extracted before being extracted.
Are bound to histones, and (1) disperse the sample into a cell suspension, add cell lysate to break the cells, and release the complex of histone and burst genomic DNA in the cell nucleus. (2) Mix the material obtained in step (1) and the chaotropic agent uniformly,
The material obtained by separating the histone and the genomic DNA can be obtained. (3) The material obtained in step (2) and the protein extract are uniformly mixed and centrifuged to obtain a supernatant in which the protein is extracted. And (4) mixing the supernatant from which the protein has been extracted with a DNA precipitant and centrifuging to obtain a DNA precipitate.
前記方法に於いて、より好ましい実施形態として、前記DNA沈殿に対し、洗浄また再溶解
を行うことを含む。
In a more preferred embodiment of the method, the DNA precipitate is washed and redissolved.
この方法において、本発明に係る該方法は、さらに、真核生物の材料に予め処理を行って
、溶解に直接に適用できるヒストンとゲノムDNAを含む生物材料を獲得することを含む。
前記予め処理の操作は洗浄、乾燥、破砕、ラビング、冷凍及び凍結融解の少なくとも一つ
を含む。本分野の常規手段によって予め処理の操作を行えばよく、例えば『モレキュラー
クローニング試験指導』に記載の内容に従って操作を行えば良い。
In this method, the method according to the invention further comprises pre-treating the eukaryotic material to obtain biological material comprising histones and genomic DNA which can be directly applied for lysis.
The pretreatment process includes at least one of washing, drying, crushing, rubbing, freezing and thawing. The operation of the treatment may be performed in advance by a conventional means in this field, for example, the operation may be performed according to the contents described in "Molecular cloning test guidance".
この方法において、前記真核生物の材料は、組織、器官、インディビデュアル及び片利共
生なものの少なくとも一つを含むことができる。前記生物材料は、口腔粘膜上皮細胞、血
液及び人工培養細胞の少なくとも一つを含むことができる
In this method, the eukaryotic material can include at least one of tissue, organ, individual and symbiotic. The biological material may include at least one of oral mucosal epithelial cells, blood and artificially cultured cells.
該方法は、さらに、前記DNAに沈殿、洗浄及び再溶解を行うことを含む。この方法におい
て、ゲノムDNAの沈殿に用いられる試薬は、2〜2.5倍体積の95%エタノールや無水エタノー
ル、または等体積のイソプロパノールであってもよい。洗浄に用いられる洗浄液は、60〜
80体積%濃度のエタノール水溶液であってもよい。再溶解に用いられる溶剤は、水又はTE
緩衝液であってもよい。
The method further comprises subjecting the DNA to precipitation, washing and redissolving. In this method, the reagent used for precipitation of genomic DNA may be 2-2.5 volumes of 95% ethanol or absolute ethanol, or an equal volume of isopropanol. The cleaning solution used for cleaning is 60-
It may be an aqueous ethanol solution having a concentration of 80% by volume. The solvent used for redissolution is water or TE.
It may be a buffer solution.
以下、実施例によって本発明のさらなる詳細な説明を行う。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples.
実施例1： Example 1:
本実施例は、二つ異なる方法によって唾液サンプルからDNAを抽出する操作を説明する
ためである。
This example is for explaining the operation of extracting DNA from a saliva sample by two different methods.
（１）2000gの唾液を10min遠心分離して、上澄みを処分して、1mLの生理的塩類溶液に口
腔粘膜上皮細胞を浮遊させて、再び2000gを10min遠心分離して、上澄みを処分するサンプ
ルの予め処理。
(1) 2000 g of saliva is centrifuged for 10 min, the supernatant is discarded, the oral mucosa epithelial cells are suspended in 1 mL of physiological saline solution, and 2000 g is centrifuged again for 10 min, and the supernatant is discarded. Processed in advance.
（２）Eppendorf（EP）管に400μLの細胞溶解液を入れて、はっきりした細胞集団がない
よう充分に均一に混ぜる。その細胞溶解液の成分は、10mmol/LTris-HCl(pH8.0)、30mmol/
LEDTA(pH8.0)、0.5%SDS、RNaseA(20μg/mL)である。
(2) Add 400 μL of cell lysate to the Eppendorf (EP) tube, and mix thoroughly enough so that there is no clear cell population. The components of the cell lysate were 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 30 mmol/L.
LEDTA (pH8.0), 0.5% SDS, RNase A (20 μg/mL).
（３）それぞれプロテアーゼK法と臭素酸ナトリウム法によってゲノムDNAを抽出する。プ
ロテアーゼK法においては、ステップ（2）におけるEP管に終濃度が100μg/mLのプロテア
ーゼKを入れて充分に均一に混ぜて、56℃で40min放置しながら、時々均一に混ぜる。臭素
酸ナトリウム法においては、ステップ（2）におけるEP管に終濃度が1mol/Lのカオトロー
プ剤である臭素酸ナトリウムを入れて充分に均一に混ぜる。その他のステップは同じであ
る。
(3) Genomic DNA is extracted by the protease K method and the sodium bromate method, respectively. In the protease K method, put the protease K at a final concentration of 100 μg/mL in the EP tube in step (2) and mix it well, and occasionally mix while leaving it at 56°C for 40 minutes. In the sodium bromate method, add sodium bromate, which is a chaotropic agent with a final concentration of 1 mol/L, to the EP tube in step (2) and mix thoroughly. The other steps are the same.
ステップ(3)におけるEP管に等体積のフェノール/クロロフォルム/イソプロパノール(25:2
4:1)を入れて振り動して均一に混ぜて、液層に分かれるよう遠心分離して、上層液体を別
の清潔的なEP管に移す。本ステップは一回繰り返してもよいが、この場合、クロロフォル
ムによって一回にて上澄みを吸い上げ、上澄みを別の清潔的なEP管に移す。
Equal volume of phenol/chloroform/isopropanol (25:2
4:1) and shake to mix evenly, centrifuge to separate into liquid layers, and transfer the upper layer liquid to another clean EP tube. This step may be repeated once, but in this case, the supernatant is sucked up once with chloroform and the supernatant is transferred to another clean EP tube.
（５）
ステップ(4)におけるEP管に2.5倍体積の無水エタノールを入れる。ただし、プロテアーゼ
Kの場合、1/10体積のNaAc（3mol/L、pH5.2）を入れておく必要がある。そして、-20℃で2
0min放置して、遠心分離してゲノムDNAを収集する。
(5)
Fill the EP tube in step (4) with 2.5 volumes of absolute ethanol. However, protease
In the case of K, it is necessary to add 1/10 volume of NaAc (3mol/L, pH5.2). And 2 at -20°C
Leave for 0 min and centrifuge to collect genomic DNA.
（６）ステップ(5)におけるEP管に1mLの70％エタノールを入れてDNAを洗浄して、上澄み
を除去して、ふさがられないままゲノムを干す。
(6) Add 1 mL of 70% ethanol to the EP tube in step (5) to wash the DNA, remove the supernatant, and dry the genome without blocking it.
（７）ステップ(6)におけるEP管に100μLのTE緩衝液を入れて、ゲノムDNA沈殿を溶解する
。光学密度測定法によってゲノムDNAの濃度を測定して、アガロースゲル電気泳動によっ
てゲノムDNAの完全性を検出する。
(7) Add 100 μL of TE buffer to the EP tube in step (6) to dissolve the genomic DNA precipitate. The concentration of genomic DNA is measured by optical densitometry and the integrity of genomic DNA is detected by agarose gel electrophoresis.
実施例2： Example 2:
本実施例は、二つ異なる方法によって口腔清拭法で採集される口腔粘膜上皮細胞中からDN
Aを抽出する操作を説明するためである。
In this example, DN is selected from oral mucosal epithelial cells collected by the oral wiping method by two different methods.
This is for explaining the operation of extracting A.
（１）口腔粘膜上皮細胞が持たれている材料を切り取って、Eppendorf（EP）管に放置す
るサンプルの予め処理。
(1) Pretreatment of a sample in which a material containing oral mucosal epithelial cells is cut out and left to stand in an Eppendorf (EP) tube.
（２）EP管に400μLの細胞溶解液を入れて、はっきりした細胞集団がないよう充分に均一
に混ぜる。その細胞溶解液の成分はk10mmol/LTris-HCl(pH8.0)、30mmol/LEDTA(pH8.0)、0
.5%SDS、RNaseA(20μg/mL)である。
(2) Add 400 μL of cell lysate to the EP tube and mix evenly so that there is no clear cell population. The components of the cell lysate were k10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 30 mmol/L EDTA (pH8.0), 0
.5% SDS, RNase A (20 μg/mL).
（３）それぞれプロテアーゼK法と臭素酸ナトリウム法によってゲノムDNAを抽出する。プ
ロテアーゼK法においては、ステップ（2）におけるEP管に終濃度が100μg/mLのプロテア
ーゼKを入れて充分に均一に混ぜて、56℃で40min放置しながら、時々均一に混ぜる。臭素
酸ナトリウム法においては、ステップ（2）におけるEP管に終濃度が1mol/Lのカオトロー
プ剤である臭素酸ナトリウムを入れて充分に均一に混ぜる。その他のステップは同じであ
る。
(3) Genomic DNA is extracted by the protease K method and the sodium bromate method, respectively. In the protease K method, put the protease K at a final concentration of 100 μg/mL in the EP tube in step (2) and mix it well, and occasionally mix while leaving it at 56°C for 40 minutes. In the sodium bromate method, add sodium bromate, which is a chaotropic agent with a final concentration of 1 mol/L, to the EP tube in step (2) and mix thoroughly. The other steps are the same.
（４）ステップ(3)におけるEP管に等体積のフェノール/クロロフォルム/イソプロパノー
ル(25:24:1)を入れて振り動して均一に混ぜて、液層に分かれるよう遠心分離して、上層
液体を別の清潔的なEP管に移す。本ステップは一回繰り返してもよいが、この場合、クロ
ロフォルムによって一回にて上澄みを吸い上げ、上澄みを別の清潔的なEP管に移す。
(4) Put an equal volume of phenol/chloroform/isopropanol (25:24:1) in the EP tube in step (3), shake to mix evenly, and centrifuge to separate into liquid layers, and then upper liquid Transfer to another clean EP tube. This step may be repeated once, but in this case, the supernatant is sucked up once with chloroform and the supernatant is transferred to another clean EP tube.
（５）
ステップ(4)におけるEP管に2.5倍体積の無水エタノールを入れる。ただし、プロテアーゼ
Kの場合、1/10体積のNaAc（3mol/L、pH5.2）を入れておく必要がある。そして、-20℃で2
0min放置して、遠心分離してゲノムDNAを収集する。
(5)
Fill the EP tube in step (4) with 2.5 volumes of absolute ethanol. However, protease
In the case of K, it is necessary to add 1/10 volume of NaAc (3mol/L, pH5.2). And 2 at -20°C
Leave for 0 min and centrifuge to collect genomic DNA.
（６）ステップ(5)におけるEP管に1mLの70％エタノール洗浄DNA、上澄みを除去して、ふ
さがられないままゲノムを干す。
(6) Remove 1 mL of 70% ethanol-washed DNA and the supernatant from the EP tube in step (5) and dry the genome without blocking it.
（７）ステップ(6)におけるEP管に100μLのTE緩衝液を入れて、ゲノムDNA沈殿を溶解する
。光学密度測定法によってゲノムDNAの濃度を測定して、アガロースゲル電気泳動によっ
てゲノムDNAの完全性を検出する。
(7) Add 100 μL of TE buffer to the EP tube in step (6) to dissolve the genomic DNA precipitate. The concentration of genomic DNA is measured by optical densitometry and the integrity of genomic DNA is detected by agarose gel electrophoresis.
実施例3： Example 3:
本実施例は、臭素酸ナトリウム法（NaBrO3法）とプロテアーゼK短時間消化法によって
それぞれ唾液中の口腔粘膜上皮細胞DNAを抽出する操作を説明するためである。
This example is for explaining the operation of extracting the oral mucosal epithelial cell DNA in saliva by the sodium bromate method (NaBrO 3 method) and the protease K short-time digestion method, respectively.
(1)2000gの唾液を10min遠心分離して、上澄みを処分して、そして、1mLの生理的塩類溶
液に口腔粘膜上皮細胞を浮遊させて、再び2000gを10min遠心分離して、上澄みを処分する
サンプルの予め処理。
(1) 2000 g of saliva is centrifuged for 10 min, the supernatant is discarded, and oral mucosal epithelial cells are suspended in 1 mL of physiological salt solution, and 2000 g is centrifuged again for 10 min, and the supernatant is discarded. Pre-treatment of samples.
(2)Eppendorf（EP）管に400μLの細胞溶解液を入れて、はっきりした細胞集団がないよ
う充分に均一に混ぜる。その細胞溶解液の成分は、10mmol/LTris-HCl(pH8.0)、30mmol/LE
DTA(pH8.0)、0.5%SDS、RNaseA(20μg/mL)である。
(2) Add 400 μL of cell lysate to the Eppendorf (EP) tube and mix evenly so that there is no clear cell population. The components of the cell lysate were 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 30 mmol/LE.
These are DTA (pH8.0), 0.5% SDS, and RNase A (20 μg/mL).
(3)それぞれプロテアーゼK短時間消化法と臭素酸ナトリウム法によってゲノムDNAを抽
出する。プロテアーゼK法においては、ステップ（2）におけるEP管に終濃度が100μg/mL
のプロテアーゼKを入れて充分に均一に混ぜて、56℃で5min消化させる。臭素酸ナトリウ
ム法においては、ステップ（2）におけるEP管に終濃度が1mol/Lのカオトロープ剤である
臭素酸ナトリウムを入れて充分に均一に混ぜる。その他のステップは同じである。
(3) Genomic DNA is extracted by protease K short-time digestion method and sodium bromate method, respectively. In the protease K method, the final concentration in the EP tube in step (2) is 100 μg/mL.
Add Protease K from and mix well and mix at 56℃ for 5 minutes. In the sodium bromate method, add sodium bromate, which is a chaotropic agent with a final concentration of 1 mol/L, to the EP tube in step (2) and mix thoroughly. The other steps are the same.
(4）ステップ(3)におけるEP管に等体積のフェノール/クロロフォルム/イソプロパノー
ル(25:24:1)を入れて振り動して均一に混ぜて、液層に分かれるよう遠心分離して、上層
液体を別の清潔的なEP管に移す。本ステップは一回繰り返してもよいが、この場合、クロ
ロフォルムによって一回にて上澄みを吸い上げ、上澄みを別の清潔的なEP管に移す。
(4) Put an equal volume of phenol/chloroform/isopropanol (25:24:1) in the EP tube in step (3), shake to mix evenly, centrifuge to separate into liquid layers, and then liquid Transfer to another clean EP tube. This step may be repeated once, but in this case, the supernatant is sucked up once with chloroform and the supernatant is transferred to another clean EP tube.
(5）ステップ(4)におけるEP管に2.5倍体積の無水エタノールを入れる。ただし、プロテ
アーゼKの場合、1/10体積のNaAc（3mol/L、pH5.2）を入れておく必要がある。そして、-2
0℃で20min放置して、遠心分離してゲノムDNAを収集する。
(5) Add 2.5 volumes of absolute ethanol to the EP tube in step (4). However, in the case of protease K, it is necessary to add 1/10 volume of NaAc (3 mol/L, pH5.2). And -2
Leave at 0°C for 20 min and centrifuge to collect genomic DNA.
(6）ステップ(5)におけるEP管に1mLの70％エタノールを入れてDNAを洗浄して、上澄み
を除去して、ふさがられないままゲノムを干す。
(6) Add 1 mL of 70% ethanol to the EP tube in step (5) to wash the DNA, remove the supernatant, and dry the genome without blocking it.
(7)ステップ(6)におけるEP管に100μLのTE緩衝液を入れて、ゲノムDNA沈殿を溶解する
。光学密度測定法によってゲノムDNAの濃度を測定して、アガロースゲル電気泳動によっ
てゲノムDNAの完全性を検出する。
(7) Add 100 μL of TE buffer to the EP tube in step (6) to dissolve the genomic DNA precipitate. The concentration of genomic DNA is measured by optical densitometry and the integrity of genomic DNA is detected by agarose gel electrophoresis.
実施例4： Example 4:
本実施例は、異なる濃度の臭素酸ナトリウム（NaBrO3）と1mol/Lの過塩素酸ナトリウム
によってそれぞれ人間血液白細胞DNAを抽出する操作を説明するためである。
This example is for explaining the operation of extracting human blood white cell DNA with different concentrations of sodium bromate (NaBrO 3 ) and 1 mol/L sodium perchlorate.
(1)200μLの抗凝血に400μLの赤細胞溶解液を入れて均一に混ぜて、2000gを10min遠心
分離して、上澄みを処分するサンプルの予め処理（可選）。もし多い赤細胞が残られたら
、一回繰り返して溶解すればよい。
(1) Add 200 μL of anticoagulant to 400 μL of red cell lysate, mix evenly, centrifuge 2000 g for 10 min, and discard the supernatant. If many red cells remain, repeat once to lyse.
(2)Eppendorf（EP）管に400μLの上記細胞溶解液を入れて、はっきりした細胞集団がな
いよう充分に均一に混ぜる。
(2) Add 400 μL of the above cell lysate to an Eppendorf (EP) tube, and mix thoroughly enough so that there is no clear cell population.
(3)それぞれ過塩素酸ナトリウム法と臭素酸ナトリウム法によってゲノムDNAを抽出する
。過塩素酸ナトリウム法においては、ステップ（2）におけるEP管に終濃度が100μg/mLの
過塩素酸ナトリウムを入れて充分に均一に混ぜる。臭素酸ナトリウム法においては、ステ
ップ（2）におけるEP管に終濃度が0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/Lと3mol/Lの臭
素酸ナトリウムを入れて充分に均一に混ぜる。その他のステップは同じである。
(3) Genomic DNA is extracted by the sodium perchlorate method and the sodium bromate method, respectively. In the sodium perchlorate method, add sodium perchlorate with a final concentration of 100 μg/mL to the EP tube in step (2) and mix thoroughly. In the sodium bromate method, the final concentration of 0.1 mol/L, 0.2 mol/L, 0.5 mol/L, 1 mol/L and 3 mol/L of sodium bromate was added to the EP tube in step (2), and it was sufficiently homogeneous. Mix in. The other steps are the same.
(4）ステップ(3)におけるEP管に等体積のフェノール/クロロフォルム/イソプロパノー
ル(25:24:1)を入れて振り動して均一に混ぜて、液層に分かれるよう遠心分離して、上層
液体を別の清潔的なEP管に移す。本ステップは一回繰り返してもよいが、この場合、クロ
ロフォルムによって一回にて上澄みを吸い上げ、上澄みを別の清潔的なEP管に移す。
(4) Put an equal volume of phenol/chloroform/isopropanol (25:24:1) in the EP tube in step (3), shake to mix evenly, centrifuge to separate into liquid layers, and then liquid Transfer to another clean EP tube. This step may be repeated once, but in this case, the supernatant is sucked up once with chloroform and the supernatant is transferred to another clean EP tube.
(5）ステップ(4)におけるEP管に2.5倍体積の無水エタノールを入れて、-20℃で20min放
置して、遠心分離してゲノムDNAを収集する。
(5) Add 2.5 volumes of absolute ethanol to the EP tube in step (4), leave at -20°C for 20 min, and centrifuge to collect genomic DNA.
(6）ステップ(5)におけるEP管に1mLの70％エタノールを入れてDNAを洗浄して、上澄み
を除去して、ふさがられないままゲノムを干す。
(6) Add 1 mL of 70% ethanol to the EP tube in step (5) to wash the DNA, remove the supernatant, and dry the genome without blocking it.
(7）ステップ(6)におけるEP管に100μLのTE緩衝液を入れて、ゲノムDNA沈殿を溶解する
。光学密度測定法によってゲノムDNAの濃度を測定して、アガロースゲル電気泳動によっ
てゲノムDNAの完全性を検出する。
(7) Add 100 μL of TE buffer to the EP tube in step (6) to dissolve the genomic DNA precipitate. The concentration of genomic DNA is measured by optical densitometry and the integrity of genomic DNA is detected by agarose gel electrophoresis.
試験実施例 Test example
実施例1〜4において抽出される人間ゲノムDNAの純粋度と濃度についてまとめて、その
結果を表1に示す。
The purity and concentration of human genomic DNA extracted in Examples 1 to 4 are summarized and the results are shown in Table 1.
表1. 異なる方法による不同出所のサンプルから抽出のゲノムDNAのパラメータ比較。
Table 1. Parameter comparison of genomic DNA extracted from samples of heterogeneous sources by different methods.
表1のデータによれば、プロテアーゼKの消化時間が充分（実施例では40minの消化時間）
の場合、同様出所の口腔粘膜上皮細胞は、臭素酸ナトリウム法とプロテアーゼK法によるD
NA獲得率及び純粋度が該当する。しかしながら、消化時間が大幅に短縮されたら（実施例
では5minの消化時間）プロテアーゼKが充分にヒストンを消化できないようになる場合、
プロテアーゼK法によるDNA獲得率が大幅に低下する。一方、本発明にかかるカオトロープ
剤である臭素酸ナトリウムが快速にヒストンとゲノムDNAを分離させることができる。本
方法によればDNAの獲得率がほぼプロテアーゼK法の5倍でありながら、DNAの純粋度が影響
されていない。0.1〜3mol/Lの臭素酸ナトリウムであればゲノムDNAを抽出することが可能
で、1〜3mol/Lの臭素酸ナトリウムによる抽出濃度が最高で且つ相対に安定である。1mol/
Lの臭素酸ナトリウムと1mol/Lの過塩素酸ナトリウムによって抽出されるゲノムDNAは獲得
率と純粋度が該当する。
According to the data in Table 1, the digestion time of protease K is sufficient (40 minutes in the example)
Oral mucosal epithelial cells of the same origin were treated with the sodium bromate method and the protease K method.
NA acquisition rate and purity are applicable. However, if the digestion time is significantly shortened (digestion time of 5 min in the example), protease K becomes unable to digest histones sufficiently,
The DNA acquisition rate by the protease K method is significantly reduced. On the other hand, sodium bromate, which is a chaotropic agent according to the present invention, can rapidly separate histone and genomic DNA. According to this method, the DNA acquisition rate is almost 5 times that of the protease K method, but the purity of DNA is not affected. Genomic DNA can be extracted with 0.1 to 3 mol/L sodium bromate, and the extraction concentration with 1 to 3 mol/L sodium bromate is the highest and relatively stable. 1 mol/
Genomic DNA extracted with L sodium bromate and 1 mol/L sodium perchlorate corresponds to acquisition rate and purity.
実施例1〜4で抽出される人間のゲノムDNAに対して電気泳動検出を行って、その結果を
図1〜図3に示す。具体的には、以下のとおり。
The human genomic DNA extracted in Examples 1 to 4 was subjected to electrophoretic detection, and the results are shown in FIGS. 1 to 3. Specifically:
図1はそれぞれ臭素酸ナトリウム法（NaBrO3法）とプロテアーゼK法（40min消化）によ
る唾液抽出法と口腔清拭法によって採集される口腔粘膜上皮細胞DNAの電気泳動検出結果
である。MはDNA marker（分子量は上からそれぞれ2000、1000、750、500、250、100。そ
の単位がbp）である。泳道1はプロテアーゼK法によって抽出される唾液出所の口腔粘膜上
皮細胞DNA。泳道2は臭素酸ナトリウム法によって抽出される唾液出所の口腔粘膜上皮細胞
DNA。泳道3はプロテアーゼK法によって抽出される口腔清拭出所の口腔粘膜上皮細胞DNA。
泳道4は臭素酸ナトリウム法によって抽出される口腔清拭出所の口腔粘膜上皮細胞DNA。図
1からわかるように、プロテアーゼKの消化時間が充分の場合、、同様出所の口腔粘膜上皮
細胞は、臭素酸ナトリウム法とプロテアーゼK法によるDNA獲得率及び純粋度が該当する。
Figure 1 shows the results of electrophoretic detection of oral mucosal epithelial cell DNA collected by saliva extraction and oral wiping by the sodium bromate method (NaBrO 3 method) and protease K method (40 min digestion), respectively. M is a DNA marker (molecular weight is 2000, 1000, 750, 500, 250, 100 from the top, the unit is bp). Swimway 1 is the oral mucosal epithelial cell DNA extracted from the saliva source by the protease K method. Swimway 2 is extracted by sodium bromate method. Oral mucosal epithelial cells of saliva origin.
DNA. Swimway 3 is the oral mucosal epithelial cell DNA extracted by the protease K method at the oral wipe.
Swimway 4 is the oral mucosa epithelial cell DNA extracted from the oral cavity wipes extracted by the sodium bromate method. Figure
As can be seen from 1, when the digestion time of protease K is sufficient, the oral mucosa epithelial cells of the same source have the DNA acquisition rate and purity by the sodium bromate method and the protease K method.
図2はそれぞれ臭素酸ナトリウム法（NaBrO3法）とプロテアーゼK法（消化時間が5minの
み）による唾液抽出法によって採集される口腔粘膜上皮細胞DNAの電気泳動検出結果であ
る。MはDNA marker（分子量は上からそれぞれ2000、1000、750、500、250、100。その単
位がbp）である。泳道1はプロテアーゼK法によって抽出される唾液出所の口腔粘膜上皮細
胞DNA。泳道2は臭素酸ナトリウム法によって抽出される唾液出所の口腔粘膜上皮細胞DNA
。図2からわかるように、消化時間が短かい場合、本発明に用いられる臭素酸ナトリウム
法は従来のプロテアーゼK法より高いDNA獲得率が得られる。
Figure 2 shows the results of electrophoretic detection of oral mucosal epithelial cell DNA collected by saliva extraction using the sodium bromate method (NaBrO 3 method) and the protease K method (digestion time only 5 min). M is a DNA marker (molecular weight is 2000, 1000, 750, 500, 250, 100 from the top, the unit is bp). Swimway 1 is the oral mucosal epithelial cell DNA extracted from the saliva source by the protease K method. Swimway 2 is extracted by sodium bromate method. Oral mucosal epithelial cell DNA of saliva source.
.. As can be seen from FIG. 2, when the digestion time is short, the sodium bromate method used in the present invention can obtain a higher DNA acquisition rate than the conventional protease K method.
図3はそれぞれ異なる濃度の臭素酸ナトリウム（NaBrO3）と1mol/Lの過塩素酸ナトリウ
ムによる抽出の人間血液白細胞DNAの電気泳動検出結果である。MはDNA marker（分子量は
上からそれぞれ2000、1000、750、500、250、100。その単位がbp）である。泳道1〜5はそ
れぞれ終濃度が0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/Lと3mol/LのNaBrO3による抽出の人
間血液白細胞ゲノムDNA。泳道6は終濃度が1mol/Lの過塩素酸ナトリウムによる抽出の人血
液白細胞ゲノムDNA。図3からわかるように、0.1mol/L〜3mol/LのNaBrO3であれば細胞ゲノ
ムDNAを抽出することが可能で、1mol/L〜3mol/LのNaBrO3による抽出のゲノムは差別が大
きくない。1mol/L〜3mol/LのNaBrO3と1mol/Lの過塩素酸ナトリウム法による獲得率が該当
する。
Figure 3 shows the results of electrophoretic detection of human blood white cell DNA extracted with different concentrations of sodium bromate (NaBrO 3 ) and 1 mol/L sodium perchlorate. M is a DNA marker (molecular weight is 2000, 1000, 750, 500, 250, 100 from the top, the unit is bp). Swimways 1 to 5 are human blood white cell genomic DNA extracted with final concentrations of 0.1 mol/L, 0.2 mol/L, 0.5 mol/L, 1 mol/L and 3 mol/L NaBrO 3, respectively . Swimway 6 is human blood white cell genomic DNA extracted with sodium perchlorate at a final concentration of 1 mol/L. As can be seen from Fig. 3, 0.1 mol/L to 3 mol/L of NaBrO 3 can be used to extract cellular genomic DNA, and the genome extracted with 1 mol/L to 3 mol/L of NaBrO 3 has large discrimination. Absent. 1 mol/L to 3 mol/L NaBrO 3 and 1 mol/L sodium perchlorate acquisition rate are applicable.
以上、図面をもちいて本発明に係る好ましい実施形態について説明したが、本発明は上
記の実施形態の中の具体的な事項に制限されるものではなく、本発明の技術思想の範囲内
において、本発明の技術方案について多種の容易な変形を施すことができ、これらの多種
の容易な変形は全て本発明の保護範囲に属する。
Although the preferred embodiments according to the present invention have been described above with reference to the drawings, the present invention is not limited to the specific items in the above embodiments, and within the scope of the technical idea of the present invention. Various easy modifications can be applied to the technical solution of the present invention, and all these various easy modifications are within the protection scope of the present invention.
それ以外に説明する必要が有るのは、上記の具体的な実施形態における各具体的な技術
特徴は矛盾が存在しない状況下において、いかなる方式を通じても結合することができ、
不必要な重複を避けるために、本発明は各種の可能な結合方式については説明しない。
Besides, it is necessary to explain that each specific technical feature in the above specific embodiments can be combined through any method under the condition that there is no contradiction.
To avoid unnecessary duplication, the invention does not describe the various possible combining schemes.
また、本発明の各種の異なる実施形態の間で任意の結合を実施することができ、発明思
想を逸脱しない範囲において、本発明の公開の内容を同様にみなすべきである。
Further, any combination can be implemented between various different embodiments of the present invention, and the disclosure of the present invention should be regarded as the same within the scope of the invention.
Claims (1)
前記カオトロープ剤は、臭素酸塩を含み、
前記臭素酸塩は臭素酸ナトリウムであり、
前記臭素酸ナトリウムの終濃度が1〜3mol/Lになるようヒストン及びゲノムDNAを含むサン
プルと前記カオトロープ剤を混合する、
カオトロープ剤を用いてゲノムDNAを抽出する方法において、抽出される前に前記DNAがヒ
ストンに結合され、
(1) 200μLの血液に400μLの細胞溶解液を入れて均一に混ぜて、10min遠心分離するステ
ップと、
(2) 試験管に400μLの上記細胞溶解液を入れて、細胞集団がないよう均一に混ぜるステ
ップと、
(3) ステップ（2）における試験管に終濃度が1〜3mol/Lの臭素酸ナトリウムを入れて充
分に均一に混ぜるステップと、
(4） ステップ(3)における試験管に等体積のフェノール/クロロフォルム/イソプロパノー
ル(25:24:1)を入れて振り動して均一に混ぜて、液層に分かれるよう遠心分離して、上層
液体を別の試験管に移すステップと、
(5） ステップ(4)における試験管に2〜2.5倍体積の95%エタノール或いは無水エタノール
、または等体積のイソプロパノールを入れて、-20℃で20min放置して、遠心分離してゲノ
ムDNAを収集するステップと、
(6） ステップ(5)における試験管に1mLの60〜80％エタノールを入れてDNAを洗浄して、上
澄みを除去して、ゲノムDNAを乾燥させるステップと、
(7） ステップ(6)における試験管に100μLの水またはTE緩衝液を入れて、ゲノムDNA沈殿
を溶解させるステップと、
を含むことを特徴とするカオトロープ剤を用いてゲノムDNAを抽出する方法。 A method for extracting genomic DNA using a chaotropic agent, comprising:
The chaotropic agent contains bromate,
The bromate is sodium bromate,
A sample containing histone and genomic DNA is mixed with the chaotropic agent so that the final concentration of the sodium bromate is 1 to 3 mol/L,
In a method for extracting genomic DNA using a chaotropic agent, the DNA is bound to histone before being extracted,
(1) A step of adding 400 μL of the cell lysate to 200 μL of blood, mixing the mixture uniformly, and centrifuging for 10 min,
(2) Add 400 μL of the above cell lysate to a test tube and mix evenly so that there is no cell population,
(3) A step of adding sodium bromate having a final concentration of 1 to 3 mol/L to the test tube in step (2) and thoroughly mixing the mixture,
(4) Put an equal volume of phenol/chloroform/isopropanol (25:24:1) in the test tube in step (3), shake to mix evenly, centrifuge to separate into liquid layers, and then liquid To another test tube,
(5) Add 2-2.5 volumes of 95% ethanol or absolute ethanol to the test tube in step (4).
, Or an equal volume of isopropanol , leave at -20°C for 20 minutes, and centrifuge to collect genomic DNA.
(6) Putting 1 mL of 60 to 80 % ethanol into the test tube in step (5) to wash the DNA, removing the supernatant, and drying the genomic DNA,
(7) Adding 100 μL of water or TE buffer to the test tube in step (6) to dissolve the genomic DNA precipitate,
A method for extracting genomic DNA using a chaotropic agent, which comprises:
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