JP6636334B2 - 遠隔虚血再灌流傷害の治療および予防 - Google Patents

Description

無血環境の確立は、再建手術および整形外科手術の必要条件であり、これは、一般に、タニケットの適用によって達成される。血液および酸素の欠乏は、虚血と呼ばれており、影響を受けた組織の時間依存的な分子変化および構造変化を引き起こす。次いで、血流が回復したときに、補体系、凝固系、および血漿カリクレイン−キニン系のような、複雑な炎症カスケードが活性化され、虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）が引き起こされる。タニケット誘発性ＩＲＩは、浮腫形成、筋細胞の生存性の低下、およびアポトーシスにおいて認められ、外科的介入の結果に大きく影響を与える。さらに、ＩＲＩは、局所的炎症反応に加えて、診療所で周知の現象である遠隔組織および遠隔臓器障害を引き起こす全身性炎症反応を誘発することが知られている。これまでに、ＩＲＩ後の局所的炎症反応に加えて全身性炎症反応も治療することができる診療所で利用可能な薬剤は存在しない（１）。

天然補体インヒビターであるＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１ＩＮＨ）は、３つすべての補体経路（古典経路、レクチン経路、および第二経路）、凝固系、およびカリクレイン−キニン系を阻害することが実証されている（２〜４）。血漿由来のＣ１ＩＮＨは、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）に罹患しているＣ１ＩＮＨ欠損患者を治療するのに診療所でうまく使用されている（２）。いくつかの動物研究は、局所ＩＲＩ、すなわち、固形臓器移植、心筋梗塞、脳卒中、肝臓および腸ＩＲＩでの、血漿由来Ｃ１ＩＮＨの治療的可能性を実証している（４）。２つの異なる研究は、局所骨格筋ＩＲＩに対する血漿由来Ｃ１ＩＮＨの、補体系による潜在的治療効果を実証している（５、６）。「超生理学的に」高い血漿レベルを有するヒトＣ１ＩＮＨを過剰発現しているトランスジェニックマウスを使用した研究は、下半身ＩＲＩモデルにおける、肺および骨格筋での遠隔臓器障害の減少を示した（７）。しかし、このモデルにおいて、Ｃ１ＩＮＨは、胚発生の間を含めて構成的に発現されていたことから、生理学および病態生理学的反応性の変化がもたらされる可能性がある。これまでのところ、ＩＲＩ誘発性遠隔組織または臓器障害に対する血漿由来Ｃ１ＩＮＨの効果は実証されていない。

驚くべきことに、本発明者らは、タニケットを適用した後肢のＩＲＩのラット動物モデルを使用して、局所だけでなく遠隔組織および臓器障害に対しても血漿由来Ｃ１ＩＮＨの治療効果を実証することができた。例えば、肺浮腫の有意な減少が観察された。Ｃ１ＩＮＨは、接触活性化系の阻害に主要な役割を果たし、遠隔組織および臓器障害に対するその効果は、局所組織および臓器障害だけでなく、ＩＲＩの間に観察された遠隔障害でも、この系の成分の主要な病態生理学的役割を示している。結果から、接触活性化系を標的とする物質、例えば、Ｃ１ＩＮＨ、カリクレインインヒビター、または第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）インヒビターが、遠隔組織および臓器障害を改善または予防さえすることが示される。

本発明は、とりわけ、以下の項目［１］〜［３２］で規定される主題に関する。

［１］遠隔虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）の治療および／または予防における使用のための、Ｃ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１ＩＮＨ）、カリクレインインヒビター、および第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）インヒビターからなる群から選択される接触活性化系インヒビターであって、該接触活性化系インヒビターを個体に投与することを含む、前記接触活性化系インヒビター。

［２］接触活性化系インヒビターは、Ｃ１ＩＮＨ、好ましくはヒトＣ１ＩＮＨ、より好ましくはヒト血漿由来Ｃ１ＩＮＨ、またはヒト組換えＣ１ＩＮＨである、項目［１］に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［３］接触活性化系インヒビターは、ＦＸＩＩインヒビターである、項目［１］に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［４］接触活性化系インヒビターは、個体に非経口投与される、項目［１］〜［３］のいずれか１項目に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［５］接触活性化系インヒビターは、個体に静脈内、動脈内または皮下投与される、項目［１］〜［４］のいずれか１項目に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［６］接触活性化系インヒビターは、Ｃ１ＩＮＨであり、個体に投与されるＣ１ＩＮＨの用量は、体重１ｋｇあたり１〜５０００ＩＵ、好ましくは体重１ｋｇあたり１〜１０００ＩＵ、より好ましくは体重１ｋｇあたり１０〜５００ＩＵである、項目［１］〜［５］のいずれか１項目に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［７］個体に投与されるＣ１ＩＮＨの用量は、体重１ｋｇあたり１０〜２５０ＩＵ、好ましくは体重１ｋｇあたり２０〜１００ＩＵである、項目［６］に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［８］接触活性化系インヒビターは、ＦＸＩＩインヒビターであり、個体に投与されるＦＸＩＩインヒビターの用量は、ＦＸＩＩａのアミド分解活性を完全に阻害するのに適している、項目［３］または［４］に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。好ましくは、ＦＸＩＩインヒビターが抗体である場合、個体に投与される用量は、体重１ｋｇあたり０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇあたり０．１〜１０ｍｇである。

［９］個体は、外科的介入を受けようとする、または受けている患者である、項目［１］〜［８］のいずれか１項目に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［１０］接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨは、外科的介入の開始または再灌流の開始前７日以内、好ましくは６日以内、より好ましくは５日以内、さらに好ましくは４日以内に患者に投与される、項目［９］に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。より好ましくは、外科的介入の開始または再灌流の開始前７２時間以内、好ましくは４８時間以内、より好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、さらに好ましくは６時間以内の投与である。

［１１］接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨは、外科的介入の間に患者に投与される、項目［９］または項目［１０］に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［１２］接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨは、外科的介入の終了後または再灌流の開始後に患者に投与される、項目［９］〜［１１］のいずれか１項目に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［１３］接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨは、外科的介入の終了後もしくは再灌流の開始後７２時間以内、好ましくは４８時間以内、より好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、さらに好ましくは６時間以内、または最も好ましくは外科的介入の終了直後もしくは再灌流の開始直後に患者に投与される、項目［１２］に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［１４］外科的介入は、再建手術または外傷手術である、項目［９］〜［１３］のいずれか１項目に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［１５］外科的介入は、整形外科手術である、項目［９］〜［１３］のいずれか１項目に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［１６］整形外科手術は、膝の手術、肩の手術、および手の手術からなる群から選択される、項目［１５］に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［１７］外科的介入は、移植である、項目［９］〜［１３］のいずれか１項目に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［１８］移植は、臓器、組織または細胞移植、好ましくは、腎臓、肝臓、肺、腸、膵臓、心臓、四肢（例えば、手）、皮膚、または膵島細胞の移植である、項目［１７］に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［１９］外科的介入は、血管手術、または衝突／圧挫損傷を治療する手術である、項目［９］〜［１３］のいずれか１項目に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［２０］外科的介入は、個体への、血栓溶解物質もしくは血管拡張剤のような薬理活性物質を送達するための器具、好ましくはカテーテルの挿入、または血栓溶解物質もしくは血管拡張剤のような薬理活性物質の注射、または完全もしくは部分的な血管閉塞の機械的除去のための器具の挿入である、［９］〜［１３］のいずれか１項目に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［２１］個体は、心筋梗塞、脳卒中、血栓症、好ましくは深部静脈血栓症もしくはステントのような異物表面での血栓事象、血栓塞栓症、肺塞栓症、アテローム性動脈硬化症による慢性虚血、好ましくは末梢性アテローム性動脈硬化症による慢性虚血肢、または他の完全もしくは部分的な血管閉塞に罹患している、項目［２０］に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［２２］遠隔ＩＲＩは、自発的である、または外科的介入以外の手段によって誘発された、個体における血流障害の改善によるものである、項目［１］〜［８］のいずれか１項目に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［２３］投与は、例えば、予防的に、再灌流前であるか、または再灌流が起こった後できるだけ早くである、項目［２２］に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［２４］接触活性化系インヒビターは、ヒト血漿から単離されたヒトＣ１ＩＮＨである、項目［１］〜［２３］のいずれか１項目に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。

［２５］有効用量の接触活性化系インヒビターを個体に投与することを含む、遠隔虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）を治療および／または予防する方法。

［２６］外科的介入を受けようとする、または受けている患者において、虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）を予防する方法であって、外科的介入の前および／もしくはその間および／もしくはその後、または再灌流開始の前および／もしくはその後に、有効用量の接触活性化系インヒビターを該患者に投与することを含み、ここで虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）は、手術部位および／または初期の虚血部位から遠隔の臓器、肢、または組織に影響を与える、前記方法。

［２７］接触活性化系インヒビターは、Ｃ１ＩＮＨ、ＦＸＩＩインヒビター、およびカリクレインインヒビターからなる群から選択される、項目［２５］または［２６］に記載の方法。

［２８］接触活性化系インヒビターは、Ｃ１ＩＮＨ、好ましくはヒトＣ１ＩＮＨ、より好ましくは血漿由来ヒトＣ１ＩＮＨである、項目［２７］に記載の方法。

［２９］接触活性化系インヒビターは、ＦＸＩＩインヒビターである、項目［２７］に記載の方法。

［３０］遠隔虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）は、肺、腎臓、脳、肝臓、心臓、腸、膵臓、または他の臓器、および四肢に影響を与える、項目［２５］〜［２９］のいずれか１項目に記載の方法。

［３１］虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）は、多臓器機能不全症候群または全身性炎症反応症候群を含む、項目［２５］〜［３０］のいずれか１項目に記載の方法。

［３２］接触活性化系インヒビターは、Ｃ１ＩＮＨ、好ましくはヒトＣ１ＩＮＨであり、治療効果を高めるために、例えば、ヘパリン、Ｎ−アセチルヘパリン、ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、およびコンドロイチン硫酸のような合成もしくは天然グリコサミノグリカンと組み合わされる、および／または、静注用免疫グロブリン、アンチトロンビンＩＩＩ、α１−アンチトリプシンもしくはＦＸＩＩインヒビターのような他の物質と組み合わされる、項目［２］に記載の使用のための接触活性化系インヒビター。これらの物質は、併用療法または多剤療法として投与されうる。

Ｃ１ＩＮＨが、腓腹筋の湿重量：乾燥重量比によって評価される、局所骨格筋の浮腫を有意に予防することを示す図である。Ａ：湿重量：乾燥重量比分析。Ｂ：Ｃ１ＩＮＨで処置されていない肢（左）およびＣ１ＩＮＨで処置された肢（右）の代表的な写真。各点は、１匹の動物の値を示す。横棒は、異なる動物の平均値を示す。平均値±ＳＤのデータを示す。統計的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用したダネットの事後検定による一元配置分散分析によって決定した。サンプル間の統計的有意性を、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１として示した。 Ｃ１ＩＮＨが、遠隔肺浮腫を有意に予防することを示す図である。各点は、１匹の動物の値を示す。横棒は、異なる動物の平均値を示す。平均値±ＳＤのデータを示す。統計的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用したダネットの事後検定による一元配置分散分析によって決定した。サンプル間の統計的有意性を、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１として示した。 ＩＦによって分析した、肺におけるブラジキニン受容体Ｂ_１ＲおよびＢ_２Ｒの発現に対するＣ１ＩＮＨの効果を示す図である。Ａ：Ｂ_１Ｒの発現。Ｂ：Ｂ_２Ｒの発現。各点は、１匹の動物の値を示す。横棒は、異なる動物の平均値を示す。平均値±ＳＤのデータを示す。統計的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用したダネットの事後検定による一元配置分散分析によって決定した。サンプル間の統計的有意性を、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１として示した。 Ｃ１ＩＮＨが、肺におけるフィブリン沈着を予防することを示す図である。各点は、１匹の動物の値を示す。横棒は、異なる動物の平均値を示す。統計的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用したダネットの事後検定による一元配置分散分析によって決定した。平均値±ＳＤのデータを示す。サンプル間の統計的有意性を、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１として示した。 Ｃ１ＩＮＨが、対側下肢におけるフィブリン沈着を減少させることを示す図である。各点は、１匹の動物の値を示す。横棒は、異なる動物の平均値を示す。平均値±ＳＤのデータを示す。統計的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用したダネットの事後検定による一元配置分散分析によって決定した。サンプル間の統計的有意性を、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１として示した。 Ｃ１ＩＮＨが、対側下肢におけるＣ３ｂおよびＢ因子の沈着を阻害することを示す図である。各点は、１匹の動物の値を示す。Ａ：Ｃ３ｂの沈着。Ｂ：Ｂ因子の沈着。横棒は、異なる動物の平均値を示す。平均値±ＳＤのデータを示す。統計的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用したダネットの事後検定による一元配置分散分析によって決定した。サンプル間の統計的有意性を、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１として示した。 対側下肢において、ヘパラン硫酸の放出がＣ１ＩＮＨによって弱められることを示す図である。各点は、１匹の動物の値を示す。横棒は、異なる動物の平均値を示す。平均値±ＳＤのデータを示す。統計的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用したダネットの事後検定による一元配置分散分析によって決定した。サンプル間の統計的有意性を、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１として示した。

一態様において、本発明は、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターを個体に投与することを含む、遠隔虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）の治療および／または予防における使用のための接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターに関する。

用語「治療」または「治療すること」は、病的状態の完全な治癒、および前記状態の改善または緩和を含むと理解するものとする。

用語「予防」は、病的状態の完全な予防、防御、その重症度の軽減に加え、前記状態を有する病気になる個体のリスクの低減を含むものと理解するものとする。この用語はまた、組織の障害を予防するために、極めて早い段階で（例えば、外科的介入の前に、遠隔ＩＲＩの完全な診断の前に）本明細書に記載する接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターを投与することによる、組織の前準備も含むものと理解するものとする。

用語「個体」は、ヒトまたは動物対象を指す。

「有効量」という表現は、特に、個体への投与時に、所望の治療的または防御的結果をもたらすのに十分な、本開示による薬剤の任意の量を含むものであることを意図する。

遠隔または遠位ＩＲＩ
本明細書で使用する場合、用語「虚血再灌流傷害」（ＩＲＩ）は、事前に虚血事象により血流が不足していた組織または臓器の部分への血流の回復に起因する傷害を指す。

ＩＲＩは、例えば、自然な事象（例えば、心筋梗塞後の血流の回復）、外傷、または血液の供給が減少していた組織もしくは臓器への血流を回復させる１つもしくはそれ以上の外科処置もしくは他の治療的介入によって、引き起こされうる。そのような外科処置としては、例えば、冠動脈バイパス術、冠動脈形成術、臓器移植手術などが挙げられる。

虚血組織の再灌流は、局所反応と全身または遠隔反応の両方を生じさせ、それらの反応は、広範囲にわたる微小血管機能障害、および組織のバリア機能の変化を生じさせる可能性がある。炎症反応は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）または多臓器機能不全症候群（ＭＯＤＳ）を引き起こす可能性さえある。

本明細書で使用する場合、「遠隔ＩＲＩ」または「遠位ＩＲＩ」または「遠隔もしくは遠位ＩＲＩ」という語句は、本明細書で互換的に使用され、再灌流した局所虚血臓器および組織とは異なる臓器または組織に影響を与える、細胞障害、補体活性化および／または浮腫形成を含む、血栓形成過程、血栓塞栓過程および／または炎症過程のような病態生理学的過程を指す。

一実施形態において、遠隔または遠位ＩＲＩは、肺に影響を与える。この実施形態の遠隔または遠位ＩＲＩは、肺浮腫、肺における血栓形成過程、肺塞栓、および／または肺組織の炎症を含みうる。

別の実施形態において、遠隔ＩＲＩは、腎臓に影響を与える。この実施形態の遠隔ＩＲＩは、腎不全、浮腫形成、血栓症、血栓塞栓症、および／または腎組織の炎症を含みうる。

別の実施形態において、遠隔ＩＲＩは、心血管系に影響を与える。この実施形態の遠隔ＩＲＩは、気絶心筋（不可逆的損傷がないにもかかわらず、再灌流後に持続する心筋機能障害）、血栓症、再灌流不整脈、および／または心筋組織の炎症／梗塞を含みうる。

別の実施形態において、遠隔ＩＲＩは、胃腸系、好ましくは腸に影響を与える。この実施形態の遠隔ＩＲＩは、腸のバリア機能の低下、消化管の運動および吸収障害、血栓症、血栓塞栓症、および／または胃腸組織の炎症を含みうる。

別の実施形態において、遠隔ＩＲＩは、中枢神経系に影響を与える。この実施形態の遠隔ＩＲＩは、血液脳関門の破壊、無症候性脳虚血、脳卒中、脳浮腫、頭蓋内圧亢進、および／または神経組織の炎症を含みうる。

遠隔ＩＲＩは、炎症、例えば、全身炎症によって特徴づけることができる。炎症は、例えば、肺、胃腸系、心血管系、他肢、および／または中枢神経系に影響を与えうる。

遠隔ＩＲＩは、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）および／または多臓器機能不全症候群（ＭＯＤＳ）を含みうる。

遠隔ＩＲＩに先立つ虚血事象は、手術によるもの、または、手術に起因しない血管閉塞によるものでありうる。

外科的介入
一実施形態において、遠隔ＩＲＩは、外科的介入後の、虚血組織および／または臓器の再灌流によるものである。外科的介入は、任意の外科処置を含む。

本発明に従う可能な適用は、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターを、動脈瘤疾患による胸部もしくは腎上部もしくは腹部の大動脈の外科的修復と併用するだけでなく、肝臓、腎臓、小腸、四肢および膵臓を含む主要な臓器移植の間および／またはその後に、内臓への血液供給の一時的閉塞もしくはバイパスを誘発するかもしくは必要とする外科処置とも併用して投与することによって、遠隔ＩＲＩを予防することを含む。肝臓および胆道の外科的切除、膵全摘もしくは膵部分切除、胃全摘および胃部分切除、食道切除、大腸手術、腸間膜血管疾患に対する血管手術、または腹腔鏡下手術の間の気腹（ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）を含めた、血流を一時的に減少させるもしくは阻止する外科処置と併用した、遠隔ＩＲＩの予防も含まれる。さらなる適用は、刺創から、または穿通創、もしくは自動車事故による鈍的腹部外傷から生じるものを含めた、内臓への血流遮断をもたらす、鈍的または穿通性外傷を含む。さらなる適用は、例えば自然災害後の、圧挫損傷を含む。さらなる適用は、それらに限定されないが、脳卒中、心筋梗塞、深部静脈血栓症、アテローム性動脈硬化症または異物表面での血栓事象を含めた、初期の血栓性、または血栓塞栓性、または別の虚血誘発性障害の発症後の、血栓溶解剤もしくは血管拡張剤のような薬理活性物質の送達のための、および／または完全なもしくは部分的な閉塞の機械的除去のための器具の挿入、ならびに血栓溶解剤もしくは血管拡張剤のような薬理活性物質の注射を含む。

好ましくは、外科的介入は、整形外科手術、血管手術、心臓手術、経カテーテル処置、癌手術、および外傷手術からなる群から選択される。整形外科手術は、好ましくは、膝の手術、手の手術、肩の手術、骨折した長骨（ｌｏｎｇ ｂｏｎｅｓ ｉｎ ｔｒａｕｍａ）、股関節置換、および背部の手術からなる群から選択される。

血管手術は、修復および／または事故、例えば、大動脈瘤などを理由とするものであってもよい。

一実施形態において、手術は、例えば、自動車事故、一般的な衝突損傷および圧挫損傷（血液量が減少する主要な外傷を含む）を理由とする、外傷手術である。

特定の実施形態において、外科的介入は、移植、好ましくは臓器の移植である。

手術に起因しない血管閉塞
他の好ましい適用は、失血による出血性ショック、心筋梗塞もしくは心不全による心原性ショック、神経原性ショック、腎性ショック（ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｉｃ ｓｈｏｃｋ）、またはアナフィラキシーを含めた、内臓への血流を途絶または低下させる全身性低血圧を生じさせる疾患または処置を含む。

遠隔ＩＲＩは、臓器虚血を含むまたは含まない末梢性虚血をもたらす低灌流による虚血後の、血流の改善によるものでありうる。

遠隔ＩＲＩはまた、主要な臓器または組織内の初期の血栓形成または血栓塞栓過程、例えば、脳卒中および心筋梗塞後の、血流の改善によるものでありうる。

一実施形態において、遠隔ＩＲＩは、末梢性アテローム性動脈硬化症による慢性虚血肢のような慢性虚血事象後の、血流の改善によるものである。

接触活性化系インヒビター
本明細書で使用する用語「接触活性化系インヒビター」は、接触活性化系を阻害することができる任意の化合物を指す。接触活性化系インヒビターは、Ｃ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１ＩＮＨ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）インヒビター、およびカリクレインインヒビターからなる群から選択される。これらのインヒビターは、接触活性化系経路において早く作用し、接触活性化系における複数の箇所で相互作用するという利点を有する。それに対して、ブラジキニン受容体アンタゴニストのようなブラジキニンインヒビターは、系の遠位部で作用し、主要な介入点は、浮腫形成の段階においてである（Ｓｏｕｚａら（１０）参照）。

Ｃ１エステラーゼインヒビター
ヒト血漿由来のＣ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１ＩＮＨ）は、４７８アミノ酸残基のグリコシル化された単鎖ポリペプチドである。ヒトＣ１ＩＮＨのアミノ酸配列は、配列番号１で示される。平均血漿濃度は、約２４０μｇ／ｍＬである。Ｃ１ＩＮＨの同義語は、Ｃ１−エステラーゼインヒビター、α２−ノイラミノ−糖タンパク質、Ｃ１ｓ−インヒビター、およびＣ１−インアクチベーターである。

Ｃ１ＩＮＨの１つの国際単位（ＩＵ）は、ＷＨＯ国際標準Ｃ１−インヒビター（血漿）との比較によって規定される。現在の第一次国際標準は、ＮＩＢＳＣコード：０８／２６２であり、この調製物の表示力価（ａｓｓｉｇｎｅｄ ｐｏｔｅｎｃｙ）は、０．８９ＩＵ／アンプルである。

本明細書で使用する場合、用語「Ｃ１ＩＮＨ」は、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の同一性の度合いは、２つの配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを指す。配列番号１に対するアミノ酸配列の同一性の度合いは、「ＢＬＡＳＴ ２ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ（ｂｌａｓｔｐ）」プログラム（Ｔａｔｕｓｏｖａら（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４、２４７〜２５０頁）を使用して、以下のパラメーター：Ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯＳＵＭ６２；オープンギャップ１１およびエクステンションギャップ１ペナルティー；ギャップｘ＿ドロップオフ５０；予想の１０．０のワードサイズ３；フィルター：なしを用いて、当該アミノ酸配列と配列番号１とを比較することによって決定される。本発明によれば、配列比較は、少なくとも４００アミノ酸、好ましくは少なくとも４２５アミノ酸、より好ましくは少なくとも４５０アミノ酸、最も好ましくは少なくとも４７５アミノ酸をカバーする。

Ｃ１ＩＮＨは、好ましくは、Ｄｒｏｕｅｔら（１９８８、Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．１７４：１２１〜３０頁）に記載されているようにアッセイすることができる、Ｃ１−阻害活性を有する。より好ましくは、Ｃ１ＩＮＨは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するヒトＣ１ＩＮＨである（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０５１５５も参照）。

一実施形態において、Ｃ１ＩＮＨは、ヒトまたは動物の血漿から、好ましくはヒトの血漿から単離されたものである。この実施形態によれば、Ｃ１ＩＮＨは、好ましくは、天然ヒトＣ１ＩＮＨのようにグリコシル化されている。

別の実施形態において、ヒトまたは動物Ｃ１ＩＮＨは、Ｃ１ＩＮＨを発現するトランスフェクトされた宿主細胞から得られる。そのような「組換えで産生される」Ｃ１ＩＮＨは、任意の適切な方法によって調製することができる。例えば、それは、Ｃ１ＩＮＨをコードするＤＮＡでトランスフェクトされた、組換え宿主細胞または生物において調製することができる。

本発明での使用に適したＣ１ＩＮＨを、そのタンパク質を分泌する改変された細胞によって調整され、標準の方法によって精製された培養培地から得ることができる。

そのタンパク質またはポリペプチドは、Ｃ１ＩＮＨポリペプチドをコードする単離された核酸を使用する組換え技術によって得ることができる。分子生物学の一般的方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、第２版、１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）により記載されている。適切な配列は、標準の技術を使用して、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用することができる。例えば、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９０、Ｉｎｎｉｓら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい。ライブラリーは、適切な細胞から抽出された核酸から構築されている。有用な遺伝子配列を、例えば様々な配列データベース、例えば、核酸についてはＧｅｎＢａｎｋ、タンパク質についてはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔにおいて見つけることができる。

大量のポリペプチドを発現する形質転換された原核細胞株、哺乳動物細胞株、酵母細胞株または昆虫細胞株を生成するために、標準の方法を使用することができる。例示的な哺乳動物細胞株としては、ＣＯＳ−７細胞、マウスＬ細胞、およびＣＨＯ細胞が挙げられる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）前掲書、およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８７、前掲書を参照されたい。

Ｃ１ＩＮＨをコードするＤＮＡを発現させるために、様々な発現ベクターを使用することができる。原核細胞または真核細胞における組換えタンパク質の発現に使用される、従来のベクターを使用することができる。

Ｃ１ＩＮＨは、形質転換またはトランスフェクトされた酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞の分泌産物のような可溶性形態で産生させることができる。次いで、そのペプチドを、当分野で公知の標準的手法によって精製することができる。例えば、精製工程としては、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーなどを挙げることができる。Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．、１９８２）を参照されたい。

あるいは、Ｃ１ＩＮＨは、凝集体または封入体のような不溶性形態で産生させることができる。そのような形態のＣ１ＩＮＨは、当分野で周知である標準的手法により精製される。精製工程の例は、遠心分離によって、破壊された宿主細胞から封入体を分離すること、次いで、ペプチドが生物学的に活性な立体配座をとるようにカオトロピック剤および還元剤で封入体を可溶化することを含む。

様々な所望の特性を有するＣ１ＩＮＨまたはそのフラグメントを作製するために、宿主細胞をトランスフェクトするために使用されるヌクレオチド配列を、標準の技術を使用して改変することができる。そのような改変されたＣ１ＩＮＨは、例えば、アミノ酸の挿入、置換、欠失および融合によって、一次構造レベルで、天然に存在する配列から変更することができる。最終的な改変タンパク質鎖を産生するために、これらの改変を、いくつかの組み合わせで使用することができる。アミノ酸配列バリアントは、血清半減期を延長または短縮すること、精製または調製を容易にすること、治療効能を高めること、および治療的使用の間の副作用の重症度または発生を減少させることを含めた、様々な目的を念頭において調製することができる。アミノ酸配列バリアントは、通常、自然界に存在しない所定のバリアントであるが、その他は、翻訳後バリアントであってもよい。そのようなバリアントは、Ｃ１ＩＮＨの生物学的活性を保持している限り、本発明において使用することができる。本発明によるＣ１ＩＮＨは、ＷＯ２００７／０７３１８６およびＵＳ８，０７１，５３２Ｂ２に開示されているＣ１ＩＮＨ分子を含む。

宿主細胞における発現は、（血漿由来Ｃ１ＩＮＨと比較して）改変された糖鎖構造を有するＣ１ＩＮＨをもたらすことができる。Ｃ１ＩＮＨは、血漿由来Ｃ１ＩＮＨと比較して、以下の態様：炭水化物部分の除去（糖タンパク質の天然に存在するバリアントまたは組換えで発現したバリアントからの）、好ましくは、Ｎ−結合型糖鎖からのシアル酸および／もしくはガラクトースの除去、ならびに／またはマンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／もしくはフコース残基を露出させる、糖鎖の除去のうちの１つまたはそれ以上で、改変されていてもよい。さらに、血漿半減期を延長するための、Ｃ１ＩＮＨの改変は、例えば、半減期を延長させる部分、例えば、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域との融合、またはＣ１ＩＮＨのペグ化もしくはＨＥＳ化などの化学修飾が想定される。

第ＸＩＩ因子インヒビター
略語「ＦＸＩＩ」は、本出願で使用する場合、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）および活性化第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）のいずれかまたは両方を指す。したがって、用語「ＦＸＩＩインヒビター」は、ＦＸＩＩとＦＸＩＩａのいずれかまたは両方のインヒビターを含む。さらに、抗ＦＸＩＩ抗体は、ＦＸＩＩとＦＸＩＩａのいずれかまたは両方に結合する、およびＦＸＩＩとＦＸＩＩａのいずれかまたは両方を阻害する抗体を含む。用語「ＦＸＩＩインヒビター」はまた、半減期を延長させるポリペプチドに連結するＦＸＩＩインヒビターを含むものであることを意図する。ＦＸＩＩインヒビターは、半減期を延長させるポリペプチドに直接連結することもできるし、リンカー、好ましくは切断可能なリンカーを介して連結することもできる。

いくつかの実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、ＦＸＩＩの直接的インヒビターである。用語「直接的」インヒビターは、ＦＸＩＩ（またはＦＸＩＩａ）との接触（例えば、結合）によって作用するインヒビターを意味する。それに対して、間接的インヒビターは、ＦＸＩＩ（またはＦＸＩＩａ）タンパク質に接触することなく作用することができ；例えば、ＦＸＩＩ遺伝子の発現を低下させるためにアンチセンスＲＮＡを使用することもできるし、分子が、第ＸＩ因子のような、直接のＦＸＩＩａの下流の反応相手と直接相互作用することによってＦＸＩＩａの効果を阻害することもできるが、それは、ＦＸＩＩタンパク質と直接相互作用しない。したがって、間接的インヒビターは、直接的インヒビターとは異なり、ＦＸＩＩタンパク質の上流または下流で作用する。直接的インヒビターのいくつかの例を、後に示す。ＦＸＩＩインヒビターは、一般的に、非内在性のインヒビターである；すなわち、それらは、ヒトまたは動物の体内に自然に存在するインヒビターではない。

Ａ．インフェスチン−４
一実施形態において、本出願は、インフェスチンドメイン４、インフェスチン−４を含む、ＦＸＩＩインヒビターを提供する。一実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、インフェスチン−４のバリアントを含む。別の実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、インフェスチンドメイン４と、場合によりインフェスチンドメイン１、２および／または３とを含み；これらのタンパク質は、ＦＸＩＩの強力なインヒビターであることが知られている（ＷＯ２００８／０９８７２０参照；また、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５１２〜５１６頁、２００４参照）。インフェスチン−４の野生型ポリペプチド配列を示す（配列番号２）。本明細書で使用する場合、用語「バリアント」は、アミノ酸変異を有するポリペプチドを指し、ここで「変異」は、野生型インフェスチン−４の配列に対する置換、欠失または付加と定義され、そのような変化は、該ポリペプチドのＦＸＩＩを阻害する機能的能力を変更しない。用語「バリアント」は、野生型または変異インフェスチン−４配列のフラグメントを含む。そのようなバリアントのさらなる例を以下に示す。

一実施形態において、インフェスチン−４バリアントは、野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３、および、野生型インフェスチン−４配列との差異を生じさせる、Ｎ末端アミノ酸の外側の少なくとも１つから５つまでのアミノ酸変異、または、６個の保存されたシステイン残基、および野生型インフェスチン−４配列に対する少なくとも７０％の相同性を含む。トロンビンに結合する関連するインヒビターであるベネズエラサシガメ（Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｐｒｏｌｉｘｕｓ）（ＰＤＢ：１ＴＳＯ）の構造データの分析、加えてキモトリプシンに結合するＳＰＩＮＫ−１の分析によれば、これらは両方ともＮ末端領域における接触部位の蓄積という共通の特徴を有することから、インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３は、ＦＸＩＩの結合に重要である可能性がある。したがって、一実施形態において、インフェスチン−４のバリアントは、野生型インフェスチン−４配列のアミノ酸２〜１３の保存されたＮ末端領域と、野生型インフェスチン−４配列との差異を生じさせるこれらの保存されたＮ末端アミノ酸の外側における少なくとも１つから５つまでのアミノ酸変異とを含む。変異は、置換、欠失、または付加であってもよい。本明細書で使用する場合、用語「前記Ｎ末端アミノ酸の外側」は、配列ＶＲＮＰＣＡＣＦＲＮＹＶ、すなわち、野生型インフェスチン−４配列からのアミノ酸２〜１３を含むアミノ酸の連続した伸長部以外の、バリアントのポリペプチド鎖に沿った任意のアミノ酸を指す。別の実施形態において、インフェスチン−４バリアントは、６個の保存されたシステイン残基を含み、野生型インフェスチン−４配列に対して、少なくとも７０％の相同性を有する。一実施形態において、６個の保存されたシステイン残基は、野生型インフェスチン−４配列の６位、８位、１６位、２７位、３１位、および４８位のアミノ酸である。一実施形態において、バリアントは、最後の保存されたシステインを含む。他の実施形態において、システイン残基の正確な位置、および互いの相対的な位置は、インフェスチン−４バリアントにおける挿入または欠失に起因して野生型インフェスチン−４配列の６位、８位、１６位、２７位、３１位、および４８位から変化しうる。それにもかかわらず、これらの実施形態において、インフェスチン−４バリアントは、６個すべてのシステインを含み、野生型インフェスチン−４配列に対する７０％、７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を共有しうる。

実施形態において、インフェスチン−４のバリアントは、ＦＸＩＩを阻害することを特徴とする。ＦＸＩＩを阻害する機能的活性は、例えばインビトロおよび／またはインビボでの特徴づけにより評価してもよく、このような特徴づけとしては、ＦＸＩＩ酵素活性の阻害を試験する直接的アッセイ、延長された凝固時間、すなわち、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、または凝固を評価するインビボでの方法が挙げられる。インフェスチン−４バリアントのさらなる例は、ＳＰＩＮＫ−１変異体であり、それらを以下に記載する。

Ｂ．ＳＰＩＮＫ−１変異体
一実施形態は、ヒトにおける治療的使用のためのＦＸＩＩインヒビターを含む。インフェスチン−４との類似性が高いヒトタンパク質を使用することができる。例えば、インフェスチン−４との類似性が最も高いヒトタンパク質は、膵臓で発現するＫａｚａｌ型セリンプロテアーゼインヒビターである、ＳＰＩＮＫ−１である（膵分泌性トリプシンインヒビター、ＰＳＴＩとしても知られる）。Ｋａｚａｌ型セリンプロテアーゼインヒビターのファミリーは、セリンプロテアーゼインヒビターの多数のファミリーのうちの１つである。異なる種由来の多くのタンパク質が記載されている（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ Ｍ ａｎｄ Ｋａｔｏ Ｉ、４９ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９３〜６２６頁、１９８０）。インフェスチン−４に対するＳＰＩＮＫ−１配列の相同性を増大させるために、野生型ＳＰＩＮＫ−１配列に基づいて、異なるバリアントを作り出すことができる。語句「インフェスチン−４に対する相同性の増大」は、ＳＰＩＮＫ−１配列をインフェスチン−４配列に近づけるために、ＳＰＩＮＫ−１に対してアミノ酸変異を行うプロセスを指す。

一実施形態において、ＳＰＩＮＫ−１は、野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３を含むように変異され；ポリペプチド配列がもたらされ、これをＫ１と呼ぶ。上記の通り、インフェスチン−４配列のＮ末端部分は、ＦＸＩＩ阻害機能に重要であると考えられる。

したがって、一実施形態において、変異ＳＰＩＮＫ−１のバリアントはまた、野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３、および、野生型ＳＰＩＮＫ−１配列との差異を生じさせ、野生型インフェスチン−４配列に対するバリアントの相同性を増大させる、前記Ｎ末端アミノ酸の外側の少なくとも１つから５つまでのアミノ酸変異を含む。別の実施形態において、変異ＳＰＩＮＫ−１のバリアントは、６個の保存されたシステイン残基を含み、野生型ＳＰＩＮＫ−１配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する。変異は、置換、欠失、または付加であってもよい。先に定義した通り、用語「前記Ｎ末端アミノ酸の外側」は、配列ＶＲＮＰＣＡＣＦＲＮＹＶ、すなわち、野生型インフェスチン−４配列からのアミノ酸２〜１３を含むアミノ酸の連続した伸長部以外の、バリアントのポリペプチド鎖に沿った、任意のアミノ酸を指す。用語「バリアント」は、前記変異ＳＰＩＮＫ−１配列のフラグメントを含む。一実施形態において、６個の保存されたシステイン残基は、野生型ＳＰＩＮＫ−１配列の９位、１６位、２４位、３５位、３８位、および５６位のアミノ酸でありうる。一実施形態において、バリアントは、最終の保存されたシステインを含む。別の実施形態において、システインの正確な位置、および互いの相対的な位置は、ＳＰＩＮＫ−１バリアントにおける挿入または欠失に起因して、野生型ＳＰＩＮＫ−１配列の９位、１６位、２４位、３５位、３８位、および５６位から変化しうる。それにもかかわらず、これらの実施形態において、ＳＰＩＮＫ−１バリアントは、６個すべてのシステインを含む。実施形態において、ＳＰＩＮＫ−１バリアントは、ＦＸＩＩを阻害することも特徴とする。さらなるＳＰＩＮＫバリアントは、ＥＰ２４９７４８９Ａ１に開示されており、その開示は本明細書にその全体が組み込まれる。

Ｃ．他のＦＸＩＩインヒビター
一実施形態では、他のＦＸＩＩインヒビターが、医療処置を受けている患者に投与される。先に検討した通り、ＦＸＩＩインヒビターという用語は、ＦＸＩＩとＦＸＩＩａの両方のインヒビターを含む。Ｗ０２００６／０６６８７８において、ＦＸＩＩに対する抗体の使用、またはＦＸＩＩインヒビターの使用が提案されている。詳細には、ＦＸＩＩに対するインヒビターとしては、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、アンギオテンシン変換酵素インヒビター、アプロチニン、α−１プロテアーゼインヒビター、アンチパイン（［（Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］−カルバモイル−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｖａｌ−アルギナール（Ａｒｇｉｎａｌ））、Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏアルデヒド−ジメチルアセテート、ＤＸ８８（Ｄｙａｘ Ｉｎｃ．、３００ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｑｕａｒｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ ０２１３９、ＵＳＡ；Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ａ ａｎｄ Ｂａｉｒｄ ＬＧ、２９ Ｔｒａｎｓｆｕｓ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｓｃｉ．２５５〜２５８頁、２００３で引用されている）、ロイペプチン、プロリルオリゴペプチダーゼインヒビター、例えば、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒ−ＣＮ、トウモロコシトリプシンインヒビター、ウシ膵臓トリプシンインヒビターの変異体、エコチン、コガネガレイ抗凝固タンパク質、セイヨウカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ）トリプシンインヒビターＶ（セイヨウカボチャイソインヒビターを含む）、およびハマダリン（Ｈａｍａｄａｒｉｎ）（Ｉｓａｗａ Ｈら、２７７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６５１〜２７６５８頁、２００２に開示されている）が挙げられる。

さらに他の実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、Ｈ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＣＫ）である（Ｔａｎｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７；１６４：６３７〜４２頁；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｔｚら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２００６；２０３：５１３〜８頁）。

ＦＸＩＩインヒビターは、例えば、米国特許第６，６１３，８９０号、第４〜８段に開示されているアミロイド前駆体タンパク質のＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼインヒビタードメインの類似体であってもよい。

別の実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、ＦＸＩＩに結合し、ＦＸＩＩの活性化および／または活性を阻害する、抗ＦＸＩＩ抗体であってもよい。そのような抗体は、例えば、ＷＯ２００６／０６６８７８、およびＲａｖｏｎら、１ Ｂｌｏｏｄ ４１３４〜４３頁、１９９５に記載されている。

ヒトＦＸＩＩに対する他のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）としては、Ｐｉｘｌｅｙら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８７；２６２、１０１４０〜４５頁）によって記載されているＢ７Ｃ９ｍＡｂ、Ｓｍａｌｌら（Ｂｌｏｏｄ １９８５；６５：２０２〜１０頁）によって記載されているｍＡｂ；Ｎｕｉｊｅｎｓら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：１２９４１〜４９頁）によって記載されているｍＡｂＦ１およびＦ３；ＷＯ８９／１１８６５に記載されている、ＦＸＩＩの軽鎖に対するＢ６Ｆ５、Ｃ６Ｂ７、およびＤ２Ｅ１０ｍＡｂ；ＷＯ９０／０８８３５に記載されている、ＦＸＩＩよりＦＸＩＩａ−βに選択的に結合するｍＡｂ、ならびにＷＯ９１／１７２５８に記載されている抗ＦＸＩＩ抗体ＯＴ−２が挙げられる。

追加の好ましい抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａモノクローナル抗体、およびそれらの抗原結合性フラグメントは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０１４０９２に記載されている。それらの抗体は、ヒトＦＸＩＩに対してよりも２倍超高い、ヒトＦＸＩＩａ−βに対する結合親和性を有し、ヒトＦＸＩＩａのアミド分解活性を阻害することができる。いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合性フラグメントは、（ａ）マウスＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａと結合する；（ｂ）配列番号７の配列と８５％超同一である重鎖可変（ＶＨ）領域を含む；（ｃ）配列番号８の配列と８５％超同一である軽鎖可変（ｖＬ）領域を含む；（ｄ）配列番号９の配列と少なくとも８０％同一である重鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号１０と少なくとも６０％同一である重鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号１２の配列と少なくとも８０％同一である重鎖ＣＤＲ３を含む；（ｅ）配列番号１４と少なくとも５０％同一である軽鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２、および／または配列Ａ−Ｘ_１−Ｗ−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｒ−Ｘ_６−Ｘ_７（ここで、Ｘ_１は、ＡまたはＳであってもよく、Ｘ_５は、ＬまたはＶであってもよく、その他のＸ_ｎは、任意のアミノ酸であってもよい）（配列番号１７）を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む；（ｆ）１０^−８Ｍよりも高いＫ_Ｄを有するヒトＦＸＩＩａ−βと結合する；（ｇ）ヒトＦＸＩＩａ−βに結合するために、インフェスチン−４と競合する；または（ｈ）ヒトＩｇＧもしくはそのバリアント、好ましくはヒトＩｇＧ４もしくはそのバリアントであるという特徴のうちの１つまたはそれ以上を有する。

他の実施形態において、抗ＦＸＩＩ抗体は、ヒトＦＸＩＩと結合し、（ａ）配列番号９で示される重鎖ＣＤＲ１と、配列番号１１で示される重鎖ＣＤＲ２と、配列番号１３で示される重鎖ＣＤＲ３とを含むＶＨ領域；および／または（ｂ）配列番号１４で示される軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号１５で示される軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号１７で示される軽鎖ＣＤＲ３とを含むＶＬ領域を含む、ＩｇＧ抗体である。配列番号１１を含む重鎖ＣＤＲ２は、配列ＧＩＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＴＶＹＡＤＳＶＫＧを含み、ここで、Ｘ_１は、Ｒ、ＮまたはＤであり、Ｘ_２は、Ｐ、Ｖ、ＩまたはＭであり；Ｘ_３は、Ｓ、ＰまたはＡであり；Ｘ_４は、Ｇ、Ｌ、ＶまたはＴであり；Ｘ_５は、任意のアミノ酸であってもよく、好ましくは、Ｘ_５は、Ｇ、Ｙ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、ＮまたはＭであり；Ｘ_６は、Ｔ、ＧまたはＳである。配列番号１３を含む重鎖ＣＤＲ３は、配列ＡＬＰＲＳＧＹＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＹＹＹＹＡＬＤＶを含み、ここで、Ｘ_１は、Ｉ、ＭまたはＶであり；Ｘ_２は、ＳまたはＫであり；Ｘ_３は、Ｐ、Ｋ、ＴまたはＨであり；Ｘ_４は、Ｈ、Ｎ、ＧまたはＱである。配列番号１７を含む軽鎖ＣＤＲ３は、配列ＡＸ_１ＷＸ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５ＲＸ_６Ｘ_７を含み、ここで、Ｘ_１は、ＡまたはＳであり；Ｘ_２は、Ｄ、Ｙ、Ｅ、Ｔ、Ｗ、ＥまたはＳであり；Ｘ_３は、Ａ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｐ、ＱまたはＥであり；Ｘ_４は、Ｓ、Ｄ、Ｐ、Ｅ、ＱまたはＲであり；Ｘ_５は、ＬまたはＶであり；Ｘ_６は、Ｇ、ＬまたはＫであり；Ｘ_７は、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｔ、ＭまたはＧである。

他の実施形態において、抗ＦＸＩＩ抗体の抗原結合性フラグメントは、ヒトＦＸＩＩと結合し、（ａ）配列番号９で示される重鎖ＣＤＲ１と、配列番号１０で示される重鎖ＣＤＲ２と、配列番号１２で示される重鎖ＣＤＲ３とを含むＶＨ領域；および／または（ｂ）配列番号１４で示される軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号１５で示される軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号１６で示される軽鎖ＣＤＲ３とを含むＶＬ領域を含むＩｇＧ抗体のフラグメントである。

一実施形態において、抗ＦＸＩＩ抗体またはその抗原結合性フラグメントは、実施例３で使用される抗体「３Ｆ７」である。３Ｆ７の可変領域およびＣＤＲの配列を表１に示す。

さらに他の実施形態において、抗ＦＸＩＩ抗体または抗原結合性フラグメントは、（３Ｆ７と比較して）親和性が成熟した抗体ＶＲ１１５、ＶＲ１１２、ＶＲ２４、ＶＲ１１０、ＶＲ１１９から選択される。

上記の通り、配列番号１１は、縮重配列である。ＶＲ１１９は、配列番号１１を含み、ここで、Ｘ_１は、Ｎであり、Ｘ_２は、Ｖであり、Ｘ_３は、Ｐであり；Ｘ_４は、Ｌであり、Ｘ_５は、Ｙであり；Ｘ_６は、Ｇである。ＶＲ１１２は、配列番号１１を含み、ここで、Ｘ_１は、Ｎであり、Ｘ_２は、Ｖであり、Ｘ_３は、Ｐであり、Ｘ_４は、Ｖであり、Ｘ_５は、Ｑであり、Ｘ_６は、Ｇである。ＶＲ１１５は、配列番号１１を含み、ここで、Ｘ_１は、Ｄであり、Ｘ_２は、Ｉであり、Ｘ_３は、Ｐであり、Ｘ_４は、Ｔであり、Ｘ_５は、Ｋであり、Ｘ_６は、Ｇである。ＶＲ１１０は、配列番号１１を含み、ここで、Ｘ_１は、Ｄであり、Ｘ_２は、Ｍであり、Ｘ_３は、Ｐであり、Ｘ_４は、Ｔであり、Ｘ_５は、Ｋであり、Ｘ_６は、Ｇである。ＶＲ２４は、独特のＬＣＤＲ１：ＳＧＳＳＥＭＴＶＨＨＹＶＹ（配列番号１８）を含む。

抗体ＣＤＲを含む実施形態において、ＣＤＲは、ＫＡＢＡＴ番号付けシステムに従って規定される（Ｋａｂａｔ ＥＡ、Ｗｕ ＴＴ、Ｐｅｒｒｙ ＨＭ、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ ＫＳ、Ｆｏｅｌｌｅｒ Ｃ（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）。

いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＦＸＩＩａ−αと抗体とのモル比が１：０．２で使用された場合に、ＦＸＩＩａ−αを４０％超、５０％超、または６０％超阻害する、抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＦＸＩＩａ−αと抗体とのモル比が１：０．５で、ＦＸＩＩａ−αを８０％超、８５％超、または９０％超阻害する。一実施形態において、抗体は、モル比が１：０．５で、ＦＸＩＩａ−αの完全な阻害を実現する。一実施形態において、ＦＸＩＩａ−αは、ヒトＦＸＩＩａ−αである。一実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、抗体３Ｆ７に少なくとも匹敵する、ヒトＦＸＩＩａに対する親和性を有する。

先に検討した通り、「抗ＦＸＩＩ抗体」は、ＦＸＩＩとＦＸＩＩａのいずれかまたは両方に結合する、およびＦＸＩＩとＦＸＩＩａのいずれかまたは両方を阻害する抗体を含む。一実施形態において、抗体は、完全長Ｉｇ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖの形態、もしくは他の形態、またはそれらのバリアントであってもよい。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよい。抗体は、アイソタイプが、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＥ、またはその任意のサブクラス、例えば、ＩｇＧ_１、または、それらのバリアントであることを特徴とするものであってもよい。抗体は、それらに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ハムスター、またはサルを含めた、哺乳動物種由来のものであってもよい。抗体は、ヒト化されてもよいし、ＣＤＲを移植されてもよい。抗体は、免疫原性、半減期を変えるために、または治療用抗体に関連する他の有利な特性を付与するために、変異させてもよいし、改変されてもよい。一実施形態において、抗体は、ＦＸＩＩ（ここで、「ＦＸＩＩ」は、ＦＸＩＩおよびＦＸＩＩａを含む）の重鎖または軽鎖上のエピトープ、例えば、中和エピトープに結合する、抗ＦＸＩＩ抗体である。抗体は、ＦＸＩＩ結合に関して高親和性および／または高結合活性であってもよい。抗体は、ポリペプチド、核酸、または小分子とコンジュゲートされてもよい。

Ｄ．半減期を延長させる部分に連結するＦＸＩＩインヒビター
ポリペプチド
本出願の別の態様は、半減期増大ポリペプチド（ＨＬＥＰ）に連結するＦＸＩＩインヒビターを提供する。例えば、一実施形態において、ＦＸＩＩインヒビターは、半減期を延長させるタンパク質に連結する。「半減期増大ポリペプチド」は、インビボで、患者または動物におけるＦＸＩＩインヒビターの半減期を長くする。例えば、アルブミンおよび免疫グロブリン、ならびにそれらのフラグメントまたは誘導体は、半減期増大ポリペプチド（ＨＬＥＰ）として記載されている。Ｂａｌｌａｎｃｅら（ＷＯ２００１／７９２７１）は、ヒト血清アルブミンと融合した場合に、インビボでの機能的半減期が長くなり、保存期間が延びると予想される、多数の異なる治療用ポリペプチドの融合ポリペプチドを記載している。ＥＰ２４９７４８９Ａ１に開示されている、半減期増大ポリペプチドに連結するＦＸＩＩインヒビターに関連する実施形態を、本発明に従って使用することができ、参照により本明細書に組み込まれる。

Ｅ．リンカー
一実施形態において、治療用ポリペプチドとＨＬＥＰとの間に、介在するペプチドリンカーを導入することができる。一実施形態において、切断可能なリンカーは、特に、ＨＬＥＰが、治療用ポリペプチドの特異的活性を、例えば、立体障害によって妨げる場合に導入される。ある種の実施形態において、リンカーは、内因性、外因性、または共通の凝固経路の凝固プロテアーゼのような酵素によって切断される。内因性経路の凝固プロテアーゼは、例えば、ＦＸＩＩａ、ＦＸＩａ、またはＦＩＸａを含めた、接触活性化経路におけるプロテアーゼである。一実施形態において、リンカーは、ＦＸＩＩａによって切断される。外因性経路のプロテアーゼとしては、組織因子経路におけるプロテアーゼ、例えば、ＦＶＩＩａが挙げられる。共通経路のプロテアーゼとしては、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換に関与するプロテアーゼ、例えば、ＦＸａ、ＦＩＩａ、およびＦＸＩＩＩａが挙げられる。

組み合わせ／キット
本発明の別の態様は、Ｃ１ＩＮＨと薬剤との組み合わせである。好ましくは、Ｃ１ＩＮＨを、Ｃ１ＩＮＨの活性を強めることが知られている、例えば、ヘパリン、Ｎ−アセチルヘパリン、ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、およびコンドロイチン硫酸のような、合成または天然グリコサミノグリカンと組み合わせて、投与することができる。加えて、Ｃ１ＩＮＨを、治療効果を高めるために、それらに限定されないが、静注用免疫グロブリン、アンチトロンビンＩＩＩ、α１−アンチトリプシンまたはＦＸＩＩインヒビターを含めた他の物質と組み合わせることができる。これらの物質は、併用療法または多剤療法として投与されうる。したがって、遠隔ＩＲＩの予防および／または治療における使用のための、投与説明書を含む、Ｃ１ＩＮＨと上述の物質の１つまたはそれ以上とを含むキットも、本発明の態様である。したがって、本発明の一実施形態は、遠隔ＩＲＩの予防および／または治療における同時的な、別々のもしくは逐次的な使用のための、Ｃ１ＩＮＨと先に挙げた少なくとも１つの他の物質とを含む部品のキットである。

投与
接触活性化系インヒビター、好ましくは本明細書に記載するＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターは、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物の一部として投与されることが好ましい。該医薬組成物は、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、鼻腔内、肺内、経皮、または皮下適用によって、容易に非経口投与することができる。非経口投与は、本発明の組成物を、溶液、乳濁液、または懸濁液に入れることによって実現することができる。

好ましくは、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターを含む、組成物は、単回もしくは複数回ボーラス注射によって、および／または連続注入もしくは特定の時間にわたる注入によって、静脈内、動脈内、または皮下投与される。

あるいは、医薬組成物は、例えば、経口または直腸内適用によって経腸投与されうる。

個体に投与されるＣ１ＩＮＨの用量は、体重１ｋｇあたり１〜５０００ＩＵの範囲である。用量は、好ましくは体重１ｋｇあたり１〜２５００ＩＵ、より好ましくは、体重１ｋｇあたり１〜５００ＩＵ、さらに好ましくは、体重１ｋｇあたり１０〜５００ＩＵの範囲内である。用量は、最も好ましくは体重１ｋｇあたり１０ＩＵ〜２５０ＩＵ、またはさらに体重１ｋｇあたり２０ＩＵ〜１００ＩＵの範囲である。当業者は、投与経路などの様々な因子に応じて用量を調整する必要性を知っていると予想される。

ＦＸＩＩインヒビターの用量範囲は、使用されるインヒビターのタイプ、投与経路、および当業者がよく知っている他の因子に応じて調整される。用量および投与間隔は、ＦＸＩＩａのアミド分解活性が、所望の治療期間の間完全に阻害されるように好ましくは選択される。例えば、ＦＸＩＩ阻害抗体は、体重１ｋｇあたり０．０１〜５０ｍｇ、約０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、約１〜５ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜２ｍｇ／ｋｇ、または約０．１〜１ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与されると予想される。治療は、単回投与または複数回投与することを含みうる。複数回投与が必要とされる場合、それらは、毎日、１日おきに、毎週、隔週、毎月、もしくは隔月、または必要に応じて投与されうる。抗体またはその抗原結合性フラグメントをゆっくりと連続的に放出する、デポ剤（ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）も使用することができる。治療有効用量は、対象において、ＦＸＩＩａを少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９９％またはさらに１００％阻害する用量でありうる。

インフェスチンをベースにしたＦＸＩＩインヒビター、例えば、アルブミン融合インフェスチン−４の場合、用量は、体重１ｋｇあたり０．１〜１０００ｍｇの間、好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは１〜５００ｍｇ／ｋｇの間、さらに好ましくは５０〜５００ｍｇ／ｋｇの間でありうる。

これらのおよび他のＦＸＩＩインヒビターについて、当業者は、治療で必要とされる用量を調整することができるであろうし、必要な用量に影響する因子、例えば、投与経路、インヒビターの半減期、インヒビターの阻害活性、インヒビターのＦＸＩＩａへの親和性などを知っていると予想される。

外科処置などの治療的介入によって引き起こされた遠隔または遠位ＩＲＩの治療の場合、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターは、外科的介入（例えば、肢手術、心臓手術、臓器移植など）の前に、治療を受ける個体に投与されることが好ましい。一態様において、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターは、したがって、外科的介入の開始前に、個体に投与される。

接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターを、外科的介入の開始前、１週間、６日、５日、４日、または７２時間以内に、好ましくは４８時間以内に、より好ましくは２４時間以内に、さらに好ましくは、外科的介入の開始前１２時間以内に、最も好ましくは６時間以内に患者に投与することができる。

例えば、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターを、例えば、外科的介入の約１時間前、約２時間前、約３時間前、約４時間前、約５時間前、約１２時間前、約２４時間前、約３６時間前、約４８時間前、または約７２時間前に、治療を受ける個体に投与することができる。接触活性化系インヒビター、好ましくは、Ｃ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターを、例えば、治療的介入の約５分前、約１０分前、約１５分前、約２０分前、約３０分前、または約４５分前に、治療を受ける個体に投与することもできる。

あるいはまたは加えて、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターを、外科的介入の時またはその間に、治療を受ける個体に投与することができる。別の実施形態において、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターは、したがって、外科的介入の間に患者に投与される。例えば、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターを、外科的介入の途中に、間隔をあけて（例えば、１５分間隔）、１回またはそれ以上投与することができる。あるいは、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターを、治療的介入の継続時間を通して、連続的に投与することができる。

さらに、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターを、外科的介入後に、治療を受ける個体に投与することができる。さらに別の実施形態において、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターは、外科的介入の終了後、好ましくは外科的介入の終了後７２時間以内に患者に投与される。例えば、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターを、例えば、外科的介入の約１時間後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約５時間後、約１２時間後、約２４時間後、または約４８時間後に、治療を受ける対象に投与することができる。接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターを、例えば、外科的介入の約５分後、約１０分後、約１５分後、約２０分後、約３０分後、または約４５分後に、治療を受ける対象に投与することもできる。外科的介入後できるだけ早く接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターを投与し、外科的介入後少なくとも２４時間、好ましくは少なくとも４８時間、より好ましくは少なくとも７２時間、または必要ならばそれよりも長い時間、治療を維持することが好ましい。

さらに別の実施形態において、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターは、外科的介入の間、および外科的介入の終了後に患者に投与される。

さらなる実施形態において、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターは、外科的介入の開始前、外科的介入の間、および外科的介入の終了後に患者に投与される。

さらなる実施形態において、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターは、外科的介入の開始前、および外科的介入の終了後に患者に投与されるが、外科的介入の間は投与されない。

さらなる実施形態において、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターは、外科的介入の開始前、および外科的介入の間に患者に投与されるが、外科的介入の終了後は投与されない。

さらなる実施形態において、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターは、再灌流の開始前に投与される。好ましくは、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターは、再灌流前の１週間までに、再灌流前の６日までに、５日までに、４日までに、好ましくは７２時間までに、より好ましくは４８時間までに、さらに好ましくは２４時間までに、１２時間までに、最も好ましくは６時間までに投与される。

さらなる実施形態において、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターは、再灌流の開始後に投与される。好ましくは、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターは、再灌流の開始後７２時間までに、より好ましくは、４８時間までに、１２時間までに、さらに好ましくは６時間までに、最も好ましくは再灌流の開始直後に投与される。

好ましい実施形態において、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターは、再灌流の開始前および再灌流の開始後に投与される。好ましくは、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターは、再灌流の１週間前までに、再灌流の６日前までに、５日前までに、４日前までに、好ましくは７２時間前までに、より好ましくは４８時間前までに、さらに好ましくは２４時間前までに、１２時間前までに、最も好ましくは６時間前までに投与され、次いで、治療は、再灌流の開始後、ある期間、好ましくは少なくとも７２時間、より好ましくは少なくとも４日間、さらに好ましくは少なくとも１週間、最も好ましくは２週間、必要ならばそれよりも長い期間維持される。

特定の実施形態において、接触活性化系インヒビター、好ましくはＣ１ＩＮＨまたはＦＸＩＩインヒビターは、１か月未満の間、好ましくは１４日未満の間、より好ましくは７日未満の間、最も好ましくは４８時間未満の間患者に投与される。

材料および方法
動物および飼育環境
すべての実験は、スイス連邦動物保護法（Ｓｗｉｓｓ Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｌａｗ）の条件下で実施し、州の獣医部門（Ｃａｎｔｏｎｅ ｏｆ Ｂｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の動物倫理委員会の承認を受けた。オスのＷｉｓｔａｒラット（野生型、国内の動物施設、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｅｒｎ）を、餌および水を自由に得られる標準的な収容条件下で、１ケージあたり３匹飼育した。動物を、１２／１２時間の概日リズム（冬時間に基づく）を維持した、２０±２℃の常温環境および４５％〜６５％の室内湿度の制御された部屋に収容した。明期の間、動物を、照度２００ルクスに曝露した。

試薬
Ｃ１ＩＮＨ（Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標））、およびビヒクル（グリシン１０ｍｇ／ｍＬ、クエン酸ナトリウム２．９ｍｇ／ｍＬ、および塩化ナトリウム８．５ｍｇ／ｍＬ）は、ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＡＧ（Ｂｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から提供された。Ｃ１ＩＮＨを、虚血を誘発する５分前に、Ｉ．Ｖ．カニューレ（ＢＤ Ｖａｓｃｕｌｏｎ Ｐｌｕｓ）を使用して、尾静脈を介してボーラスとして投与した。

ＦＸＩＩａインヒビターであるｒＨＡ−インフェスチン−４（Ｈａｇｅｄｏｒｎら、２０１０、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １２１：１５１０〜１５１７頁）を、虚血を誘発する５分前に、１００ｍｇ／ｋｇの用量で、尾静脈を介するボーラスとして投与した。

外科処置
重量２５０〜３５０ｇのオスのＷｉｓｔａｒラットを、以下の実験に使用した。麻酔導入チャンバー内で、酸素中の２．５％イソフルランを用いて、麻酔の導入を行い、その後、鼻マスクを介して１．５％イソフルランの吸入によって維持した。肢灌流の評価のために、両方の後肢の毛を、電気シェーバーで完全に剃った。ラットを加温パッドの上で保ち、体温を３７℃に維持した。麻酔を導入して約３０分後、片方の後肢の虚血を３時間誘発させた。虚血を、大腿動脈を締め付けることによって誘発した。したがって、鼠径部の切開を行い、脂肪組織を慎重に取り除いて大腿血管を露出させた。次に、大腿動脈を静脈から分離した。

動脈を締め付ける前に、タニケット（標準重量４５０ｇ）を、以前に記載されている通り（８）、大腿血管の下に置いた。大腿動脈を、２つの微小血管鉗子（Ｂ１−Ｖ、Ｓ＆Ｔ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で一時的に閉塞させた。直ちに、タニケットをきつく巻き、微小血管の血流を遮断した。処置全体の間、血液動態をモニタリングした（Ｍｏｕｓｅ ｏｘ ｐｌｕｓ、Ｓｔａｒｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）。３時間の虚血後、その肢をそれぞれ２４時間再灌流した。２４時間の再灌流の間、ラットは覚醒し、ラットを鎮痛剤（ブプレノルフィン０．０５ｍｇ／ｋｇ、Ｔｅｍｇｅｓｉｃ Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ ＡＧ））で処置した。実験の最後に、分析のために肺に加えて、虚血および対側腓腹筋を採取した。

浮腫形成の評価
浮腫形成の評価のために、両下肢から腓腹筋の２つサンプルを採取し、直ちに秤量し、湿重量を得た。筋肉のサンプルまたは肺を、一定の重量が得られるまで、８０℃で２４時間乾燥させた。第２の秤量工程で、乾燥重量を得た。その後、湿重量対乾燥重量比を算出し、対側の対照筋肉の湿重量対乾燥重量比と比較した。

筋肉および肺組織における沈着した補体成分および他のタンパク質の決定
免疫蛍光法（ＩＦ）を使用して、補体系の様々な成分、ならびにフィブリン／フィブリノーゲン、ヘパラン硫酸、ブラジキニン受容体Ｂ_１、およびブラジキニン受容体Ｂ_２の沈着を定量化した。両下肢の腓腹筋および肺からの組織サンプルを採取し、ＰＢＳ中で洗浄し、水気をとって乾燥させ、ドライアイス上でマトリックス（ＯＣＴ、Ｔｉｓｓｕｅ ｔｅｋ）に埋め込んだ。凍結切片を切るまで、直ちにサンプルを−２０℃で保存した（Ｃｒｙｏｓｔａｔ、Ｌｅｉｃａ ＣＭ ３０５０Ｓ）。切片をアセトンで固定し、ＴＢＳ中で再水和した。一次抗体を、４℃で、一晩かけてインキュベートし、次の二次抗体を室温で１時間インキュベートした。その後、スライドを乗せてカバーをかけた。蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で写真を撮り、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して分析した。

多重アレイを使用するサイトカイン／ケモカインの測定
標的タンパク質に特異的な捕捉抗体とコンジュゲートされた磁気ビーズからなる多重免疫アッセイを使用して、サイトカインおよびケモカインのアレイを検出した（Ｂｉｏｐｌｅｘ Ｐｒｏ（商標）Ｒａｔ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｕｐ Ｉ ｐａｎｅｌ、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）。製造元の説明書に従って、アッセイを実施した。

手短に述べると、血漿を１：３に希釈し、抗体結合磁気ビーズとインキュベートした。洗浄工程の後、ビオチン化検出抗体とインキュベーションした。ストレプトアビジン−フィコエリスリンのインキュベーション後、サイトカイン／ケモカインの濃度を測定した。組換えサイトカイン／ケモカインを使用して、標準曲線を確定した。分析物の濃度を、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ ４．０ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）を使用して算出した。

ＴＵＮＥＬアッセイによるアポトーシスの評価
ＴｄＴを介したｄＵＴＰニック末端標識法（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ ｅｎｄ−ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ））アッセイ（ｉｎ ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＴＭＲ ｒｅｄ、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、アポトーシスを評価した。手短に述べると、組織サンプルの凍結切片を、室温で、アセトンで５分間固定し、洗浄し、氷上で、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で透過性にした。切片を、ＴＵＮＥＬ反応混合物と、暗所で、３７℃で、１時間インキュベートし、ＤＡＰＩで対比染色した。洗浄工程後、切片を乗せ、カバースリップを乗せ、蛍光顕微鏡で分析した。免疫蛍光画像を、ｉｍａｇｅ Ｊ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）で分析した。すべてＤＡＰＩで染色された核で覆われた面積との関連で、ＴＵＮＥＬ陽性核で覆われた面積（％）を分析し、算出した。

統計的分析
データを、平均値±ＳＤとして表す。統計的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用したダネットの事後検定による一元配置分散分析によって決定した。Ｐ値＜０．０５を、統計的に有意であると考えた。

結果
ｉ）局所ＩＲＩ組織障害に対するＣ１ＩＮＨの効果
Ｃ１ＩＮＨは、局所ＩＲＩ誘発性骨格筋浮腫を予防した
第１の工程として、Ｃ１ＩＮＨ（５０ＩＵ／ｋｇ）の治療効果を、後肢における局所浮腫形成の予防により評価した。動物の全身にヒト血漿由来Ｃ１ＩＮＨを前もって取り込ませることによって、骨格筋浮腫の形成が極めて有意に予防された（例えば、図１ＡおよびＢ参照）。ＦＸＩＩインヒビター、例えば、モノクローナル抗ＦＸＩＩ抗体、またはｒＨＡ−インフェスチン−４を使用して、同様の結果、すなわち、筋浮腫形成の減少が期待された。

ｉｉ）ＩＲＩ誘発性遠隔組織および臓器障害に対するＣ１ＩＮＨの効果
Ｃ１ＩＮＨは、肺浮腫を減少させることによって、遠隔臓器障害を阻害した
遠隔組織および臓器障害に対するＣ１ＩＮＨの効果を分析した。Ｃ１ＩＮＨは、ＦＸＩＩａおよびカリクレインと相互作用することによる、血漿カリクレイン−キニン系の極めて強力なインヒビターである。図２に示す通り、Ｃ１ＩＮＨは、湿重量：乾燥重量比により分析した浮腫形成を有意に予防し、したがって肺における内皮細胞の完全性が保存された。

肺および心臓におけるブラジキニン受容体の発現に対するＣ１ＩＮＨの効果
血漿カリクレイン−キニン系の活性化によって、ブラジキニンが生じる。この分子は、血管拡張および浮腫を誘発する極めて強力な血管作動性ペプチドである。カリクレイン−キニン系は、ＩＲＩで重大な役割を果たすことが分かっている。ブラジキニン２受容体（Ｂ_２Ｒ）のアンタゴニストは、ＨＡＥ患者を治療するために、診療所でうまく使用されている（９）。Ｂ_１ＲおよびＢ_２Ｒの発現に対するＣ１ＩＮＨの効果を、ＩＦによって分析した。驚くべきことに、Ｃ１ＩＮＨは、肺組織における、ＩＲＩ誘発性のＢ_１Ｒ上方調節を有意に阻害した（図３Ａ参照）が、Ｂ_２Ｒの発現に対して、阻害を観察することはできなかった（図３Ｂ参照）。心臓組織においても、同じ効果を観察した（データ示さず）。

肺において、Ｃ１ＩＮＨはフィブリン沈着を阻害した
補体阻害の他に、Ｃ１ＩＮＨは、ＦＸＩＩおよびＦＸＩとの相互作用によって、凝固系に作用する。凝固系の活性化は、フィブリノーゲンを切断してフィブリンにするトロンビンを生じさせる。Ｃ１ＩＮＨによる処置は、肺組織におけるフィブリン沈着を有意に阻害した（図４参照）。

Ｃ１ＩＮＨは、フィブリン沈着を予防することによって、対側肢における遠隔組織障害を予防した
上記の通り、本発明者らは、対側の非虚血肢における浮腫形成を検出できなかった。驚くべきことに、本発明者らは、対側下肢におけるフィブリン沈着を観察することができた（図５参照）。肺において観察されるように（図４Ａ参照）、本発明者らは、Ｃ１ＩＮＨによる、非虚血肢におけるフィブリン沈着の有意な阻害を観察した（図５参照）。

対側肢、腎臓および肝臓において、Ｃ１ＩＮＨは補体沈着を阻害した
虚血下肢および対側の非虚血下肢を、補体活性化マーカーとしての補体フラグメントの沈着について分析した。図６ＡおよびＢに示す通り、Ｃ１ＩＮＨは、再灌流した下肢、および対側下肢における、Ｃ３ｂ（古典経路およびレクチン経路）ならびにＢ因子（補体活性化の第二経路）の沈着を有意に減少させた。加えて、Ｃ１ＩＮＨによる処置によって、腎臓におけるＣ３ｂの沈着、および肝臓におけるＢ因子の沈着が有意に減少した。

対側肢において、Ｃ１ＩＮＨによる処置は内皮グリコカリックスを保存した
健康なＥＣは、例えば、内皮の抗凝固および抗炎症特性に重要であるヘパラン硫酸（ＨＳ）のような、グリコサミノグリカンの層によって覆われている。ＨＳは、炎症および組織障害の条件下で、速やかに放出される（１１〜１４）。驚くべきことに、Ｃ１ＩＮＨは、対側肢におけるＨＳの放出を予防した（図７参照）。

炎症性サイトカインおよびケモカインのネットワークに対するＣ１ＩＮＨの阻害効果
サイトカイン、成長因子、およびケモカインを、ベースラインで、すなわち、虚血の誘発前に採取した、および２４時間の再灌流後のエンドポイントで採取したＥＤＴＡ血漿において、ｘＭＡＰ技術を使用して測定した。分析は、Ｃ１ＩＮＨによる処置が、ＩＬ−１α、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１８、ならびにＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−３α、およびＴＮＦ−αのレベルを有意に低下させることを明らかにした（表３参照）。

以下のサイトカイン：ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦを検出することはできなかった。データは平均値±ＳＤとして表す。統計的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用したスチューデントのｔ検定によって決定した。Ｐ値＜０．０５を、統計的に有意であると考えた。

肺および腎皮質におけるアポトーシスに対するＣ１ＩＮＨ処置の効果
ＴＵＮＥＬアッセイを使用して、アポトーシスを評価した。ビヒクルで処置した動物の肺組織の細胞は、高い割合のアポトーシスを示した（７６±２１％）。腎皮質においても、近位尿細管上皮細胞においても、ビヒクルで処置した動物でのアポトーシスを観察した（４３±２５％）。それと比較して、Ｃ１ＩＮＨで処置した動物は、アポトーシス細胞の有意な減少を示した（肺において１０±１２％（Ｐ＜０．０００１）および腎皮質において７±８％）。

ｉｉｉ）ＩＲＩ誘発性遠隔組織および臓器障害に対する、ＦＸＩＩインヒビターであるｒＨＡ−インフェスチン−４の効果
上記したｒＨＡ−インフェスチン−４による処置は、肺浮腫も有意に減少させ、潜在的には、他の組織における浮腫形成も減少させる。

加えて、肺において（および潜在的には他の組織においても）、フィブリン沈着の有意な減少が観察される。

ｒＨＡ−インフェスチン−４による処置の後、肺および他の組織におけるアポトーシスに対する有意な減少効果が観察される。ｒＨＡ−インフェスチン−４はまた、ＩｇＭおよび補体成分の沈着も減少させ、潜在的には、炎症性サイトカインおよびケモカインのネットワークに対する効果も示す。

参照文献
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8. Dick, F., J. Li, M. N. Giraud, C. Kalka, J. Schmidli, and H. Tevaearai. 2008. Basic control of reperfusion effectively protects against reperfusion injury in a realistic rodent model of acute limb ischemia. Circulation 118: 1920-1928.
9. Bouillet, L. 2011. Icatibant in hereditary angioedema: news and challenges. Expert Rev Clin Immunol 7: 267-272.
10. Souza, D. G., E. S. Lomez, V. Pinho, J. B. Pesquero, M. Bader, J. L. Pesquero, and M. M. Teixeira. 2004. Role of bradykinin B2 and B1 receptors in
the local, remote, and systemic inflammatory responses that follow intestinal ischemia and reperfusion injury. J Immunol 172: 2542-2548.
11. Johnson, G. B., G. J. Brunn, Y. Kodaira, and J. L. Platt. 2002. Receptor-mediated monitoring of tissue well-being via detection of soluble heparan sulfate by Toll-like receptor 4. J Immunol 168.
12. Platt, J. L., G. M. Vercellotti, B. J. Lindman, T. R. Oegema, Jr.,
F. H. Bach, and A. P. Dalmasso. 1990. Release of heparan sulfate from endothelial cells. Implications for pathogenesis of hyperacute rejection. J Exp Med 171.
13. Ihrcke, N. S., and J. L. Platt. 1996. Shedding of heparan sulfate proteoglycan by stimulated endothelial cells: evidence for proteolysis of cell-s
urface molecules. J Cell Physiol 168.
14. Ihrcke, N. S., W. Parker, K. J. Reissner, and J. L. Platt. 1998. Regulation of platelet heparanase during inflammation: role of pH and proteinases. J Cell Physiol 175.
15. Liu, D., F. Lu, G. Qin, S. M. Fernandes, J. Li, and A. E. Davis, III. 2007. C1 inhibitor-mediated protection from sepsis. J Immunol 179: 3966-3972.
16. Storini, C., E. Rossi, V. Marrella, M. Distaso, R. Veerhuis, C. Vergani, L. Bergamaschini, and M. G. De Simoni. 2005. C1-inhibitor protects against brain ischemia-reperfusion injury via inhibition of cell recruitment and inflammation. Neurobiol. Dis 19: 10-17.

Claims (13)

1. 遠隔虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）の治療および／または予防における使用のための、Ｃ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１ＩＮＨ）である接触活性化系インヒビターを含む医薬組成物であって、該治療および／または予防は、前記医薬組成物を個体に投与することを含む、前記医薬組成物。
2. 接触活性化系インヒビターは、個体に非経口投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 接触活性化系インヒビターは、個体に静脈内、動脈内または皮下投与される、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 個体に投与されるＣ１ＩＮＨの用量は、体重１ｋｇあたり１〜１０００ＩＵである、請求項１に記載の医薬組成物。
5. 個体は、外科的介入を受けようとする、または受けている患者である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
6. 接触活性化系インヒビターは、外科的介入の開始または再灌流の開始前６時間以内に患者に投与される、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 接触活性化系インヒビターは、外科的介入の前および／もしくはその間および／もしくはその後、または再灌流開始の前および／もしくはその後に、患者に投与される、請求項５または６に記載の医薬組成物。
8. 接触活性化系インヒビターは、外科的介入の終了後または再灌流の開始後７２時間以内
   に患者に投与される、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 外科的介入は、（ａ）待機的手術、再建手術、血管手術、心臓手術、外傷手術、衝突損傷もしくは圧挫損傷の手術、癌手術、整形外科手術、移植、低侵襲手術、または（ｂ）
   初期の血栓性、または血栓塞栓性、または別の虚血誘発性障害の発症後の、血栓溶解剤もしくは血管拡張剤のような薬理活性物質の送達のための、および／または完全なもしくは部分的な閉塞の機械的除去のための器具の挿入、ならびに血栓溶解剤もしくは血管拡張剤のような医薬活性物質の注射からなる群から選択される、請求項５〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
10. 再灌流は自発的に起こるか、または外科的介入以外の介入によって血流障害は改善される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
11. 外科的介入を受けようとする患者において虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）を予防するための医薬組成物であって、有効用量の、Ｃ１エステラーゼインヒビター（Ｃ１ＩＮＨ）である接触活性化系インヒビターを含み、外科的介入の前および／もしくはその間および／もしくはその後、または再灌流開始の前および／もしくはその後に投与され、ここで虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）は、手術部位から遠隔の臓器または組織に影響を与えるものである、前記医薬組成物。
12. 遠隔虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）は、肺、心臓、脳、腎臓、腸、膵臓、肝臓、または四肢／手足に影響を与える、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 遠隔虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）は、治療されないと、多臓器機能不全症候群または全身性炎症反応症候群につながる、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。