JP6630426B2 - Ｔａｕ結合抗体 - Google Patents

Description

本発明の分野
本発明はとりわけ、Ｔａｕ結合抗体及びこれらの結合フラグメント、このような抗体を作製する方法ならびにアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン症−認知症合併症、好銀性粒子病（ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ ｇｒａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、慢性外傷性脳症、皮質基底核変性、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、ＭＡＰＴ変異起因性１７番染色体連関型前頭側頭型認知症及びパーキンソン症、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、グアドループ島型パーキンソン症、筋緊張性ジストロフィー、脳内鉄蓄積を伴う神経変性、ニーマン・ピック病Ｃ型、神経原線維変化病併発性非グアマニアン型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソン症、プリオンタンパク質性脳アミロイド血管症、進行性皮質下神経膠症、進行性核上性麻痺、ＳＬＣ９Ａ６関連精神遅滞、亜急性硬化性全脳炎、変化のみの認知症（Ｔａｎｇｌｅ−ｏｎｌｙ ｄｅｍｅｎｔｉａ）、球状神経膠封入体を伴う白質タウオパチー（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ ｅｔ ａｌ． Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２３ （２０１３） ３４２−３４９）のようなタウオパチーを処置及び／又は診断するためのそれらの使用に関する。本発明は、先に説明したタウオパチー、特にアルツハイマー病及び進行性核上性麻痺のようなタウオパチーに罹患している又はであるヒト対象を処置する方法にも関する。

本発明の背景
アルツハイマー病（ＡＤ）及び進行性核上性（ＰＳＰ）は、医学的な満たされていない高い需要、社会の健康系に対する高いコスト、及び影響を受ける家族に対する高い負荷を伴う神経変性疾患である。ＡＤの臨床徴候には、記憶、認知、推論、判断及び情動安定性の喪失、ならびに究極的には死亡が含まれる。ＰＳＰは、歩行制御及び平衡の重篤な及び進行性の問題、転倒、垂直方向の眼球運動の障害、認知上の問題、うつ、無感情、ならびに軽度認知症を包含する。後期の症状には、霧視、制御されていない眼球運動、不明瞭言語、嚥下困難及び死亡が含まれる。

１０年超の間、ＡＤ疾患改変プログラムは、種々の機序を通じてアミロイドベータペプチドを標的としてきた。対照的に、ＡＤについての第二の主要特徴である細胞内Ｔａｕ病理に取り組む上での進行ははるかに少なかった。凝集した高リン酸化型Ｔａｕを含有する神経原線維の封入体又は濃縮体は、ＡＤ病理及びＰＳＰを含むいくつかの他のタウオパチーの特徴を定義しつつある。

これらの疾患において、症候性進行と神経内Ｔａｕ凝集のレベル及び分布の間には強い相関がある。ＡＤにおいて、ニューロンのＴａｕ濃縮体はまず、経内側嗅皮質（ｔｒａｎｓｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ ｃｏｒｔｅｘ）に現れ、そこから当該濃縮体は海馬及び新皮質へ拡散する。ＡＤニューロンにおいて観察される当該濃縮体は、高リン酸化型の凝集した不溶性Ｔａｕからなる。病理学的Ｔａｕ種の直接的な毒性効果及び／又は機能的Ｔａｕの隔離による高リン酸化型及び凝集型への軸索輸送の喪失（Ｉｏｓｓ）は、もはや軸索輸送を支援することができず、当該疾患に寄与すると提唱されてきた。

非病理学的状態において、Ｔａｕは、ヒト中枢神経系（ＣＮＳ）において、代替的スプライシングによる６個の主要アイソフォームにおいて生じる、非常に可溶性の高い細胞質微小管結合タンパク質であり、長さ３５２〜４４１アミノ酸に及ぶ。これらのアイソフォームは、０、１又は２個のＮ末端インサート（０Ｎ、１Ｎ、２Ｎ）、及び３個又は４個のいずれかのＣ末端「反復」配列（３Ｒ又は４Ｒ）を有することができる。これら３０〜３２個のアミノ酸からなるＣ末端反復配列Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はまとめて、Ｔａｕ微小管結合領域（ＭＴＢＲ）を構成する。実際、Ｔａｕの主要な役割は、軸索微小管の集合及び安定化にあると考えられている。微小管は、軸索輸送のためのトラック、及び細胞増殖のための細胞骨格要素を形成する（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａら，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２３（２０１３）３４２〜３４９）。３種類のＴａｕアイソフォームは、３個の微小管結合領域（ＭＴＢＲ）を含有することが実証されてきた。
・３Ｒ０Ｎとも呼ばれるアイソフォーム４型、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０５８５２５．１（３５２アミノ酸）
・３Ｒ１Ｎとも呼ばれるアイソフォーム７型、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１９０１８０．１（３８１アミノ酸）
・３Ｒ２Ｎとも呼ばれるアイソフォーム８型、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１９０１８１．１（４１０アミノ酸）
これに対し、その他の３種のＴａｕアイソフォームは４個のＭＴＢＲを含有する。
・４Ｒ２Ｎとも呼ばれるアイソフォーム２型、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００５９０１．２（４４１アミノ酸）、
・４Ｒ０Ｎとも呼ばれるアイソフォーム３型、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０５８５１８．１（３８３アミノ酸）、及び
・４Ｒ１Ｎとも呼ばれるアイソフォーム５型、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１１６５３９．１（４１２アミノ酸）。

他の症候性処置は、これらの疾患に対して得られるが、有効性は軽度であり又は全くない。当該疾患の発症を遅延させる又は理想的に停止させるための処置は現在、入手可能ではない。それゆえ、タウオパチーの処置において有用な新たな化合物及び組成物についての当該技術分野における需要があるままである。

本発明の目的及び概要
とりわけ、アルツハイマー病（ＡＤ）又は進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）のようなタウオパチーを処置又は診断するための薬剤を提供することが、本発明の目的である。さらに、とりわけ、アルツハイマー病（ＡＤ）又は進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）のようなタウオパチーを処置又は診断するための方法を提供することが、本発明の目的である。

以後の後続の説明から明らかとなるであろうこれらの及び他の目的は、独立請求項の対象によって達成される。本開示によって熟慮される具体的な態様及びその実施形態に関する一部は、従属請求項の対象を形成する。本開示によって熟慮されるさらに他の態様及びその実施形態は、後続の説明から得られ得る。

第一の態様において、本開示は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが、配列番号１もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、及び配列番号３もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を含む軽鎖可変部、ならびに／又は
配列番号４もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号５もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、及び／又は配列番号６もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を含む重鎖可変部
を含む、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。

第二の態様において、本開示は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが、
配列番号７もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号８もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖可変部を含む、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。

第三の態様において、本開示は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが、
配列番号９もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号１０もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖可変部を含む、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。

第四の態様において、本開示は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが、配列番号３５のＳ２３８、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ａ２４６の少なくともアミノ酸残基を含むエピトープへ結合する、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。

第一及び第四の態様の実施形態として、本開示は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全にヒト抗体又はそれらの結合フラグメントであることができる、モノクローナル抗体又はその結合フラグメントを提供する。

第二の態様の実施形態として、本開示は、キメラ抗体又はその結合フラグメントであることができる、モノクローナル抗体又はその結合フラグメントを提供する。

第３の態様の辞し形態として、本開示は、モノクローナル抗体又はその結合フラグメントであることができる、モノクローナル抗体又はその結合フラグメントを提供する。

第五の態様において、本開示は、第一〜第四の態様及びそれらの実施形態のいずれかのＴａｕ抗体又はその結合フラグメントとのＴａｕへ結合するために競合する、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。

第六の側面において、本開示は、第一〜第四の態様及びこれらの実施形態のうちのいずれかのＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントとしてＴａｕの実質的に同じエピトープへ結合する、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。

第五及び第六態様の実施形態として、本開示は、ヒト化抗体又はその結合フラグメントであることができる、モノクローナル抗体又はその結合フラグメントを提供する。

第一〜第六の態様及びその実施形態の抗体及びその結合フラグメントは、ヒトの可溶性形態、ヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）又はヒトＴａｕ可溶性形態のヒトＴａｕ及びヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の両方へ結合することができる。

第七の態様において、本開示は、第一〜第六の態様及びその実施形態の抗体及びその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列などの核酸配列を含む核酸分子を提供する。

第八の態様において、本開示は、これらの上述の核酸分子を含むクローニングベクター又は発現ベクターを提供する。

第九の態様において、本開示は、これらの上述の核酸分子、クローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

第十の態様において、本開示は、第一〜第六の態様及びその実施形態の抗体及びその結合フラグメントを作製する方法を提供する。

本開示の第十一の態様は、特にＡＤ及びＰＳＰなどのタウオパチーを処置するための、第一〜第六の態様及びその実施形態の抗体及びその結合フラグメントの使用に関する。

本開示の別の態様は、特にＡＤ及びＰＳＰなどのタウオパチーを診断するための、第一〜第六の態様及びその実施形態の抗体及びその結合フラグメントの使用に関する。

Ａ）は、ＣＤＲ１（配列番号１）、２（配列番号２）及び３（配列番号３）が下線を付されている配列番号７のＡＢ１（ＶＬ＿ＡＢ１）のドナーＶＬを示す。Ｂ）は、ＣＤＲ１（配列番号１）、２（配列番号２）及び３（配列番号３）が下線を付されている配列番号９のＣＤＲグラフト配列ｇＶＬ３_ＡＢ１を示す。 Ａ）は、ＣＤＲ１（配列番号４）、２（配列番号３６）及び３（配列番号６）が下線を付されている配列番号８のＡＢ１（ＶＨ＿ＡＢ１）のドナーＶＨを示す。Ｂ）は、アクセプターＣＤＲ１、２及び３が下線を付されている配列番号３２のヒトアクセプター領域ＩＧＨＶ４―５９のＶＨ配列を示す。Ｃ）は、ＣＤＲ１（配列番号４）、２（配列番号３７）及び３（配列番号６）が下線を付されている配列番号１２のＣＤＲグラフト配列ｇＶＨ１７＿ＡＢ１を示す。ドナー残基は、斜体かつ太字で示されている：Ｍ４８。フレームワークにおける変異は、強調されている（Ｅ１）。ＣＤＲ２は、ＶＨ＿ＡＢ１と比較してＳ６１Ａ置換を含む。Ｄ）は、ＣＤＲ１（配列番号４）、２（配列番号３８）及び３（配列番号６）が下線を付されている配列番号１３のＣＤＲグラフト配列ｇＶＨ１８＿ＡＢ１を示す。ドナー残基は、斜体かつ太字で示されている（Ｍ４８）。フレームワークにおける変異は、強調されている（Ｅ１）。ＣＤＲ２は、ＶＨ＿ＡＢ１と比較してＳ６１Ｔ置換を含む。 実験３．１の細胞凝集アッセイを示す図。 ヒトＡＤ患者（ＡＤ−ＰＪＦ８）からシードとして回収されたヒトＴａｕ病理学的原線維を用いた細胞Ｔａｕ凝集アッセイにおける配列番号１４の軽鎖及び配列番号１８の重鎖（Ａ）、並びに配列番号１４の軽鎖及び配列番号１７の重鎖（Ｂ）、又は陰性対照ＩｇＧ４抗体Ａ３３（Ｃ）を有するＴａｕ結合抗体の有効性。 ヒトＡＤ、ＰＳＰ又は対照患者からの画分８試料から回収されたＴａｕに対する配列番号１４の軽鎖及び配列番号１８の重鎖を有するＴａｕ結合抗体（Ｃ）の、配列番号７のＶＬ及び配列番号８のＶＨを有するＴａｕ結合抗体ＡＢ１（Ａ）、並びに配列番号１４の軽鎖及び配列番号１７の重鎖を有するヒト化抗体（Ｂ）の結合特性を示すウエスタンブロット。Ａ３３抗体を陰性対照として使用した。 配列番号１４の軽鎖及び配列番号１７の重鎖を有するＴａｕ結合抗体、配列番号１４の軽鎖及び配列番号１８の重鎖を有するＴａｕ結合抗体、配列番号１４の軽鎖及び配列番号５４の重鎖、並びに配列番号１４の軽鎖及び配列番号５５の重鎖のＴａｕ結合抗体のサーモグラムのオーバーレイ。 大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）発現のためのヒトＴａｕアイソフォーム２型（ｐＥＴ ６Ｈｉｓ ＴＥＶ―ｈＴａｕ ｉｓｏ ２ (１−４４１)）（ＢｉｏＲｅｇ ＩＤ： Ｄ０００３１０５）をコードするＤＮＡ構築物（配列番号３９）。アミノ酸配列をコードするＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ挿入は、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで切断した改変ｐＥＴ３２ベクターにサブクローンした（太字のイタリック体の配列をコードする６Ｈｉｓ−ＴＥＶ−Ｔａｕ）。 Ａ）ｐＥＴ ６Ｈｉｓ ＴＥＶ−ｈＴａｕ ｉｓｏ ２型(１−４４１)からの発現されたアミノ酸配列（配列番号４９）；Ｂ）ＴＥＶ切断後ｐＥＴ ６Ｈｉｓ ＴＥＶ−ｈＴａｕ ｉｓｏ ２型(１−４４１)からの発現されたアミノ酸配列（配列番号４１）。 大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）発現のためのヒトＴａｕアイソフォーム３型（ｐＥＴ ６Ｈｉｓ ＴＥＶ−ｈＴａｕ ｉｓｏ ３(１ｖ３８３)）（ＢｉｏＲｅｇ ＩＤ： Ｄ０００３１０４）をコードするＤＮＡ構築物（配列番号４２）。アミノ酸配列をコードするＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ挿入は、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ（太字イタリック体の配列をコードする６Ｈｉｓ−ＴＥＶ−Ｔａｕ）で切断した改変ｐＥＴ３２ベクターにサブクローニングされた。 Ａ）ｐＥＴ ６Ｈｉｓ ＴＥＶ−ｈＴａｕ ｉｓｏ ３(１−３８３)から発現されたアミノ酸配列（配列番号４３）；Ｂ）ＴＥＶ切断後のｐＥＴ ６Ｈｉｓ ＴＥＶ−ｈＴａｕ ｉｓｏ ３型(１―３８３)から発現された最終アミノ酸配列（配列番号４４）。 大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）発現のためのヒトＴａｕアイソフォーム４型をコードするＤＮＡ構築物（ｐＥＴ ６Ｈｉｓ ＴＥＶ―ｈＴａｕ ｉｓｏ ４(１−３５２)) (ＢｉｏＲｅｇ ＩＤ： Ｄ０００３０９３)（配列番号４５）。アミノ酸配列をコードするＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ挿入が、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで切断された改変ｐＥＴ３２ベクターにサブクローニングされた（太字イタリック体の配列をコードする６Ｈｉｓ−ＴＥＶ−Ｔａｕ）。 Ａ）ｐＥＴ ６Ｈｉｓ ＴＥＶ−ｈＴａｕ ｉｓｏ ４(１−３５２)から発現されたアミノ酸配列（配列番号４６）；Ｂ）ＴＥＶ切断後のｐＥＴ ６Ｈｉｓ ＴＥＶ―ｈＴａｕ ｉｓｏ ４型(１−３５２)から発現された最終アミノ酸配列（配列番号４７）。 大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）発現のためのヒトＴａｕアイソフォーム５型をコードするＤＮＡ構築物（ｐＥＴ ６Ｈｉｓ ＴＥＶ―ｈＴａｕ ｉｓｏ ５ (１−４１２)） (ＢｉｏＲｅｇ ＩＤ： Ｄ０００３１０３)（配列番号４８）。アミノ酸配列をコードするＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ挿入は、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで切断された修飾ｐＥＴ３２ベクターにサブクローニングされた（太字イタリック体の配列をコードする６Ｈｉｓ−ＴＥＶ−Ｔａｕ）。 Ａ）ｐＥＴ ６Ｈｉｓ ＴＥＶ−ｈＴａｕ ｉｓｏ ５ (１−４１２)から発現されたアミノ酸配列（配列番号４９）；Ｂ）ＴＥＶ切断後のｐＥＴ ６Ｈｉｓ ＴＥＶ−ｈＴａｕ ｉｓｏ ５ (１−４１２)から発現される最終アミノ酸配列（配列番号５０）。 ＨＥＫ２９３細胞（ｐＭＨ−１０Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ｈＴａｕ ｉｓｏ２ (１−４４１)） (ＢｉｏＲｅｇ ＩＤ： Ｄ０００３１０９)における発現のためのヒトＴａｕアイソフォーム２型をコードするＤＮＡ構築物（配列番号５１）。アミノ酸配列をコードするＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ挿入は、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで切断された哺乳動物発現ベクターｐＭＨ−１０ＨｉｓＴＥＶにサブクローニングされた（太字のイタリック体の配列をコードする１０Ｈｉｓ−ＴＥＶ−Ｔａｕ、下線を付した制限部位を除去するサイレントポイント変異Ａ１０３２Ｔ）。 Ａ）ｐＭＨ−１０Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ｈＴａｕ ｉｓｏ２ (１−４４１)から発現されたアミノ酸配列（配列番号５２）；Ｂ）ＴＥＶ切断後のｐＭＨ−１０Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ｈＴａｕ ｉｓｏ２ (１−４４１)から発現された最終アミノ酸配列（配列番号５３）。 シードとしてヒトＡＤ患者、又はヒトＰＳＰ患者若しくはヒトＦＴＤ患者から回収されたヒトＴａｕ病理学的原繊維を含む細胞Ｔａｕ凝集アッセイにおける配列番号１４の軽鎖および配列番号１８の重鎖を有するＴａｕ結合抗体の有効性。

詳細な説明
以下において例証として説明される本開示は、本明細書に具体的に開示されていないいかなる要素又は複数の要素、制限又は複数の制限の不在下でも適切に実施され得る。

本開示は、その特定の態様及びその実施形態に関して、ならびに特定の図面及び実施例に関して説明されるであろうが、本発明はそれらによる制限を受けないが、特許請求の範囲によってのみである。

技術用語は、別段の記載がない限り、当該用語の通常の意味によって使用される。具体的な意味が、ある特定の用語へ伝えられる場合、用語の定義は、当該用語が使用される脈絡で以下に付与されるであろう。

「を含んでいる」という用語が本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、当該用語は、他の要素を排除しない。本開示の目的のために、「からなる」という用語は、「から構成されている」という用語の好ましい実施形態であるとみなされる。以後、群が少なくともある特定の数の実施形態を含むと定義される場合、このことはまた、好ましくはこれらの実施形態のみからなる群を開示するよう理解されることになっている。

本開示の目的のために、「得られた」という用語は、「得られることができる」という用語の好ましい実施形態であるとみなされる。以後、例えば、抗体が具体的な源から得られることができると定義される場合、このことはまた、この源から得られる抗体を開示するよう理解されることになっている。

不定冠詞又は定冠詞、例えば「ａ」、「ａｎ」又は「ｔｈｅ」が、単数名詞を指すときに使用される場合、このことは、ほかに別段の具体的な記載がない限り、当該名詞の複数形も含む。「約」又は「およそ」という用語は、当業者が問題の特長の技術的な効果をなおも保証するよう理解するであろう正確性の間隔を示す。当該用語は典型的には、±１０％の、好ましくは±５％の示される数値からの偏差を示す。

種々の態様の好ましい実施形態としてのＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントに対するいかなる参照も、モノクローナルＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを熟慮することは理解されることになっている。

種々の態様について、本開示は、ＣＤＲならびに個々の軽鎖部及び／又は重鎖部の可変部を含む抗体ならびにその結合フラグメントを示す。軽鎖可変部及び／又は重鎖可変部のみを含む抗体又はその結合フラグメントは、例えば、対応する他の可変部と有効に結合することのできる可変部を製造する方法に対して、又は当該可変部をスクリーニングする方法に対して有用であり得る。しかしながら、ＣＤＲならびに個々の軽鎖部及び／又は重鎖部の可変部を含む抗体ならびにその結合フラグメントに対する参照がなされる場合はどこでも、このことが常に、ＣＤＲならびに個々の軽鎖部及び重鎖部の可変部を含む抗体ならびにその結合フラグメントを好ましい実施形態として熟慮することは理解されることになっている。

本明細書で使用される場合、「処置」、「処置すること」という用語及びこれらに類するものは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。当該効果は、疾患及び／もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防する点で予防的であり得、ならびに／又は疾患及び／もしくは当該疾患に起因する有害作用に対する部分的な又は完全な治癒の点で治療的であり得る。したがって、処置は、哺乳類における、特にヒトにおける疾患の何らかの処置を網羅し、（ａ）当該疾患に易罹患性であり得るが、当該疾患に罹患しているとまだ診断されてはいない対象において、当該疾患が発症するのを予防すること、（ｂ）当該疾患を抑制すること、すなわち、当該疾患の発症を抑止すること、及び（ｃ）当該疾患を緩和すること、すなわち、当該疾患の退行を生じることが含まれる。

「治療活性のある薬剤」としてのＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントに対する参照は、疾患の処置におけるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの使用を指す。

「治療有効量」は、疾患を処置するために哺乳類又は他の対象へ投与される時、当該疾患のためのこのような処置をもたらすのに十分であるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの量を指す。治療有効量は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、治療されることになっている対象の疾患及びその重症度ならびに齢、体重などによって変化するであろう。

「診断活性のある薬剤」としてのＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントに対する参照は、疾患の診断におけるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの使用を指す。

「診断有効量」は、生物試料に関する診断検査において使用される時に、疾患の識別、又は治療介入の有効性をモニターする手段として疾患組織の量をモニターすることを可能にするのに十分であるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの量を指す。

本出願は、ヒトＴａｕを結合するＡＢ１と呼ばれる抗体の識別に一部に基づいている。当該技術分野において通例であるように、この脈絡におけるＴａｕ残基の番号付けは、配列番号３５のアイソフォーム２型を指す（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５９０１．２）。免疫化ラットから分離されたＡＢ１と以後割り付けられるであろうように、配列番号３５のＳ２３８、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ａ２４６の少なくともアミノ酸残基を含むエピトープを認識する。この領域は、中枢神経系で見出され得るＴａｕの全ての６つのアイソフォームに存在する最初のＭＴＢＲ反復領域の直前である。

実施例は、ＡＢ１がヒトＴａｕの可溶性形体及び対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の両方へ結合することができること（実施例２．３を参照されたい）、ならびにヒト試料の凍結切片においてニューロン内神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）、ニューロン外ＮＦＴ、老人斑様構造及び神経柔毛糸（ｎｅｕｒｏｐｈｉｌ ｔｈｒｅａｄ）を検出することができたこと（実施例３．２を参照されたい）を確立している。試験したアッセイ及び試験したモデルのいくつかにおいて、ＡＢ１は、従来技術の抗体よりも低いＩＣ５０を示した。この挙動が、ＡＢ１の軽鎖可変部（ＶＬ）及び重鎖可変部（ＶＨ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）によって少なくとも一部仲介されていると想定することは妥当であるようである。

この背景に対して、本開示は、ＡＢ１（配列番号７）のＶＬ部のＣＤＲ若しくは特異性決定残基及び／又はＡＢ１（配列番号８）のＶＨ部のＣＤＲを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。

抗体可変部における残基は慣習的に、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムによって番号付けされている。このシステムは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ，米国におけるＫａｂａｔら，１９８７（以後、「Ｋａｂａｔら（上述）」）において発表されている。この番号付けシステムは、別段の記載がない限り、本明細書において使用される。

Ｋａｂａｔの残基命名法は必ずしも、アミノ酸残基の線形的な番号付けと直接対応してはいない。実際の線形アミノ酸配列は、フレームワークであろうと相補性決定領域（ＣＤＲ）であろうと、塩基性可変部構造の短縮又は構造成分への挿入に対応する厳密なＫａｂａｔの番号付けにおけるよりも少数の又は追加のアミノ酸を含有し得る。残基の正確なＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列における相同性の残基を「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列と整列させることによって、付与された抗体に対して決定され得る。しかしながら、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．及びＬｅｓｋ， Ａ．Ｍ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， １９６，９０１−９１７（１９８７））によると、ＣＤＲ−Ｈ１と等価のループは、残基２６から残基３２まで延びる。

ＡＢ１のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３はしたがって、それぞれ配列番号１、２、及び３に対応すると識別された。ＡＢ１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３はしたがって、それぞれ配列番号４、３６、及び６に対応すると識別された。１つ以上のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失は、Ｔａｕへ結合する抗体の能力を有意に変化させることなく、本開示によって提供されるＣＤＲに対してされ得ることが一般的に知られている。任意のアミノ酸置換の効果は、当業者によって、例えば、実施例において説明される方法を用いることによって容易に検査することができる。ＶＨの元々識別されたＣＤＲ２（ＣＤＲＨ２）、すなわち配列番号３６において、例えば、潜在的なアスパラギン脱アミド化部位を識別し、アラニン又はセリンのいずれかによって連続セリン残基を置き換えることによって修飾した。このことは、ＣＤＲＨ２に対してそれぞれ、配列番号３６、３７及び３８の配列をもたらした。簡潔にする目的のため、ＣＤＲＨ２に対する３つの配列、すなわち、配列番号３６、３７、及び３８を配列番号５として組み合わせた。

置換、付加及び／又は欠失のようなさらなる修飾が、例えばＡＢ１と比較して結合特性を実質的に変化させることなくＣＤＲに対してなされ得ることは認識されるであろう。このことは主として、例えば、ＣＤＲにおけるアミノ酸を類似のアミノ酸と置き換えることによって達成され得る。本明細書で使用される「類似性」は、整列した配列における何らかの特定の位置において、アミノ酸残基が配列間で類似のタイプであることを示す。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリンと置換され得る。しばしば互いに置換されることのできる他のアミノ酸には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
・フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）
・リジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）
・アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）
・アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）、ならびに
・システイン及びメチオニン（含硫側鎖を有するアミノ酸）。

この背景に対して、本開示は、一態様において、
配列番号１もしくはそれと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２もしくはそれと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、及び配列番号３もしくはそれと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３、ならびに／又は
配列番号４もしくはそれと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号５もしくはそれと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ２、もしくは配列番号６もしくはそれと少なくとも９０％同一の配列から選択されるＣＤＲ３
を含む、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを準備する。

本明細書で使用される「同一性」は、整列した配列における何らかの特定の位置において、アミノ酸残基が当該配列間で同一であることを示す。同一性の程度は、例えば、ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェアを用いて容易に算出することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ｇｉｓｈ，Ｗ及びＳｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２。Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ｋ．Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）。

それぞれ配列番号１、２、３、４、５、及び６に対するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の同一性は、少なくとも９０％であり得るが、より高い同一性に対して任意に好ましく少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のようにより高くもあり得る。異なる同一性の位置は、類似性の考慮により選択され得る。

この脈絡において、本開示は具体的には、それぞれ配列番号１、２、３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、５、及び６のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを考慮する。本開示は、それぞれ配列番号１、２、３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、３６、及び６のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、それぞれ配列番号１、２、３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、３７、及び６のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、それぞれ配列番号１、２、３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を有するＶＬ、ならびにそれぞれ配列番号４、３８、及び６のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントも考慮する。

当該第一の態様によって熟慮されるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、異なる起源のフレームワーク領域において埋め込まれたこれらのＣＤＲを含み得る。したがって、ＣＤＲは、ＡＢ１の元のフレームワーク領域、すなわち配列番号７のラッとＶＬ部内及び配列番号８のラッとＶＨ部内に含まれ得る。しかしながら、ＣＤＲは、このようなマウス又はヒトのフレームワーク領域のような異なる種起源のフレームワーク領域にも埋め込まれ得る。このようなフレーム枠領域と組み合わされることのできるフレームワーク領域の起源及び定常部に応じて、キメラ、ヒト化又は完全にヒト化のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを得られ得る。

キメラＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、ヒト起源の定常部と組み合わされた非ヒト起源のフレーム領域内にＣＤＲを含むであろう。ヒト化Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、ヒト起源の定常部と合わせて組み合わされたヒト起源のフレームワーク領域内にＣＤＲを含むであろう。

この背景に対して、本開示は、別の態様において、
配列番号７もしくはそれと少なくとも８０％同一の配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号８もしくはそれと少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖可変部
を含む、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。

配列番号７及び８のＶＬ及びＶＨの同一性はそれぞれ、少なくとも８０％であり得るが、より高い同一性に対して任意に好ましく少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のようにより高くもあり得る。異なる同一性の位置は、類似性の考慮により選択され得る。同一性の点で、ＣＤＲに対するフレームワーク領域についてより可撓性があり得ることは認識されるであろう。

この脈絡において、本開示は具体的には、配列番号７のＶＬ及び配列番号８のＶＨを含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを考慮する。

ヒト化Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、本開示によって特に熟慮される。

この目的のため、ＣＤＲは、ヒトフレームワーク領域へとグラフト結合され得る。このようなヒト化ＣＤＲをグラフト結合したＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの識別は、当該技術分野の確立されたアプローチに従って達成され得ることは認識されるであろう。ＣＤＲ又は特異性決定残基がグラフト結合した時、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプに関して、何らかの適切なアクセプターヒト可変部フレームワーク配列が使用され得る（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第０，１２５，０２３ Ｂ１号、Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら，欧州特許第０，１２０，６９４ Ｂ１号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ, Ｍ. Ｓ.ら、ＷＯ ８６／０１５３３、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、欧州特許第０，１９４，２７６ Ｂ１号、Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号、Ｗｉｎｔｅｒ，欧州特許第０，２３９，４００ Ｂ１号、Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．ら，欧州特許出願第０，５１９，５９６ Ａ１号を参照されたい）。

また、本発明のＣＤＲをグラフト結合した抗体可変部において、フレームワーク領域は、アクセプター抗体のフレームワーク領域と同じ配列を実際に有している必要はない。したがって、ＣＤＲは、フレームワークの変化とともに又は当該変化を伴わずにグラフト結合し得る。ドナー可変部のフレームワーク領域とアクセプターフレームワーク領域の間の比較を基にしてフレームワーク変化を導入することは、例えば、さもなくばヒト化の結果として低下し得る抗体の親和性を保有することが可能となり得る。例えば、異常な残基は、アクセプター鎖のクラス又はタイプのためにより頻繁に発生する残基へと変化し得る。あるいは、アクセプターフレームワーク領域における選択された残基は、ドナー抗体における同じ位置において認められる残基に対応するよう変化し得る（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２４を参照されたい）。このような変化は、ドナー抗体の親和性を回復させるのに必要な最低限まで維持されるべきである。変化のための残基は、Ａｄａｉｒら（１９９１）（ヒト化抗体，ＷＯ９１／０９９６７）によって概略されるプロトコルを用いて選択され得る。本発明のＣＤＲをグラフト結合した抗体において、アクセプター重鎖及び軽鎖は、同じ抗体に由来する必要は必ずしもなく、所望の場合、異なる鎖由来のフレームワーク領域を有する複合鎖を含み得る。

本発明において使用することのできるヒトアクセプターフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭである（Ｋａｂａｔら，上述）。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは、重鎖に使用することができ、ＲＥＩは、軽鎖に使用することができ、ならびにＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは、重鎖及び軽鎖の両方に使用することができる。あるいは、ヒト生殖系列配列を使用し得、これらは、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ.ｍｒｃ―ｃｅ.ｃａｍ.ａｃ.ｕｋ／又はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｉｍｇｔ.ｏｒｇにおいて入手可能である。本開示は具体的には、配列番号３１（ＩＭＧＴ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）のヒトＶ部ＩＧＫＶ２−２９プラスＪＫ２ Ｊ部を軽鎖ＣＤＲのアクセプターフレーム領域として、ならびに配列番号３２（ＩＭＧＴ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）のヒトＶ部ＩＧＨＶ４−５９プラスＪＨ３ Ｊ部を重鎖ＣＤＲについてのアクセプターフレームワーク領域として使用することを考慮する。配列番号３２において、位置１及び４８は例えば、フレームワーク領域における残基変化のために考慮され得る。位置１におけるグルタミン残基は、グルタミン又はアスパラギン酸へ変化し得る。位置４８におけるイソロイシン残基は、メチオニンへ変化し得る。フレームワーク領域における残基変化のための配列番号３２における他の位置は、位置３７及び／又は７１であり得る。例えば、配列番号３２の位置３７におけるイソロイシン残基は、バリンへ変化し得る。位置７１におけるバリン残基は、アルギニンへ変化し得る。フレームワーク領域における残基変化のための配列番号３１における位置は、位置６８であり得る。配列番号３１の位置６８におけるセリン残基は、イソロイシンへ変化し得る。

この背景に対し、本開示は、別の態様において、
配列番号９もしくはそれと少なくとも８０％同一の配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号１０もしくはそれと少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖可変部
を含む、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。

このような分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、
配列番号９もしくはそれと少なくとも８０％同一の配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号１１、１２，１３もしくはそれらと少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖可変部
を含み得る。

配列番号９及び１０のＶＬ及びＶＨの同一性はそれぞれ、少なくとも８０％であり得るが、より高い同一性に対して任意に好ましく少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のようにより高くもあり得る。異なる同一性の位置は、類似性の考慮により選択され得る。ＣＤＲに対するフレームワーク領域についてより可撓性があり得ることは認識されるであろう。

この脈絡において、本出願は具体的には、配列番号９のＶＬ及び配列番号１１のＶＨを含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、配列番号９のＶＬ及び配列番号１２のＶＨを含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、配列番号１２のＶＬ及び配列番号１４のＶＨを含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、ならびに配列番号９のＶＬ及び配列番号１３のＶＨを含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを考慮する。

ヒト化ＣＤＲをグラフト結合したＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、ヒト起源の定常部を含み得る。当該重鎖の定常部のアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのクラスへと分けられ、これらのうちのいくつかはさらにサブクラス（サブタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＧＡ１、及びＩｇＡ２へと分けられ得る。特にヒトＩｇＧ定常部ドメインは、抗体分子が治療用途に企図され及び抗体エフェクター機能が必要とされる時に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３のアイソタイプが特に使用され得る。あるいは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のアイソタイプは、抗体分子が治療目的のために企図され及び抗体エフェクター機能が必要とされない時に使用され得る。本開示は具体的には、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４サブタイプのヒト化抗体を考慮する。

これらの定常部ドメインの配列修正も使用され得ることは認識されるであろう。例えば、１つ又は２つのアミノ酸のような１つ以上のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失は、Ｔａｕへ結合する抗体の能力を有意に変化させることなく抗体定常部に対してなされ得る。位置２４１におけるセリンがＡｎｇａｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，３０（Ｉ），１０５−１０８において説明されるようにプロリンへ変化したＩｇＧ４分子は、同様に使用され得る。

抗体エフェクター機能には、ＡＤＣＣ及びＣＤＣが含まれる。ＡＤＣＣは、抗体依存性細胞傷害を指す。抗体が原理上、ＡＤＣＣを仲介することができるかどうかを判定するために、ＡＤＣＣは、例えば、いわゆるＣｒ^５１、Ｅｕ及びＳ^３５放出アッセイによってインビトロで測定され得る。関心対象の抗原、すなわちＴａｕを含有する標的細胞は、これらの化合物で標識され得る。治療用抗体の結合後、細胞を洗浄し、ＦｃγＲＩＩＩのようなＦｃ受容体を発現するエフェクター細胞を抗体標識標的細胞とともにインキュベートし、標的細胞の溶解を、標識の放出によってモニターすることができる。別のアプローチは、いわゆるａＣｅｌｌａ ＴＯＸ（商標）アッセイを用いる。ＣＤＣは、補体依存性細胞傷害を指す。抗体が原理上、ＣＤＣを仲介することができるかどうかを判定するために、ＣＤＣは、例えば、Ｄｅｌｏｂｅｌ Ａ ｅｔ ａｌ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． （２０１３）； ９８８：１１５−４３又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（Ｐｒｉｎｔ ＩＳＳＮ： １９３４−３６７１）において説明されるように、インビトロで測定され得る。

この背景に対して、本開示は、別の態様において、
配列番号１４もしくはそれと少なくとも７０％同一の配列を含む軽鎖、及び／又は
配列番号１５もしくはそれと少なくとも７０％同一の配列を含む重鎖
を含む、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。

このような分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、
配列番号１４もしくはそれと少なくとも７０％同一の配列を含む軽鎖、及び／又は
配列番号１６、１７、１８もしくはそれらと少なくとも７０％同一の配列を含む重鎖
を含み得る。

配列番号１４及び１５に対する軽鎖及び重鎖の同一性はそれぞれ、少なくとも７０％であり得るが、より高い同一性に対して任意に好ましく少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のようにより高くもあり得る。異なる同一性の位置は、類似性の考慮により選択され得る。同一性の点で、ＣＤＲに対するフレームワーク領域についてより可撓性があり得、定常部についてはさらにより可撓性があり得ることは認識されるであろう。

この脈絡において、本出願は具体的には、配列番号１４の軽鎖及び配列番号１６の重鎖を含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、配列番号１４の軽鎖及び配列番号１７の重鎖を含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント、ならびに配列番号１４の軽鎖及び配列番号１８の重鎖を含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを考慮する。

さらに、本開示は、別の態様において、
配列番号１４もしくはそれと少なくとも７０％同一の配列を含む軽鎖、及び／又は
配列番号５４もしくは配列番号５５又はそれと少なくとも７０％同一の配列を含む重鎖
を含む、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。

配列番号１４及び配列番号５４又は５５に対する軽鎖及び重鎖の同一性はそれぞれ、少なくとも７０％であり得るが、より高い同一性に対して任意に好ましく少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のようにより高くもあり得る。異なる同一性の位置は、類似性の考慮により選択され得る。同一性の点で、ＣＤＲに対するフレームワーク領域についてより可撓性があり得、定常部についてはさらにより可撓性があり得ることは認識されるであろう。

本開示によって提供される抗体又はその結合フラグメント、特にＣＤＲ−Ｈ１（配列番号４）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号５）、ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号６）、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号１）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号２）又はＣＤＲ−Ｌ３（配列番号３）のうちのいずれかを含む抗体又はその結合フラグメント、例えば、配列番号７のＶＬ及び配列番号８のＶＬを含む抗体によって結合するヒトＴａｕの特異的な領域又はエピトープも、本開示によって提供される。

本開示において提供される抗体又はその結合フラグメント、特に配列番号７のＶＬ及び配列番号８のＶＨを含む抗体又はその結合フラグメントによって結合するヒトＴａｕ、特に配列番号３５のアミノ酸２３５〜２５０内のエピトープの特異的な領域又はエピトープは、本開示によってさらに提供される。

Ｔａｕのこの特異的な領域又はエピトープは、本開示によって提供される抗体のうちのいずれか１つとの組み合わせで、当該技術分野で公知の何らかの適切なエピトープマッピング法によって識別することができる。このような方法の例としては、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントによって認識されるエピトープの配列を含有する抗体へ特異的に結合することのできる最小のフラグメントを用いて、本開示のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントに対する結合について、配列番号３５に由来する変動する長さのペプチドをスクリーニングすることが挙げられる。中枢神経系における異なるＴａｕアイソフォームの存在を考慮すると、何らかのこのようなアイソフォームが本明細書で詳述される方法において使用され得ることは理解されることになっている。具体的な例において、Ｔａｕの最長のアイソフォーム、すなわち、配列番号３５に定義されるアイソフォーム２型が使用され得る。配列番号３５のＴａｕペプチドは、組換えで、合成で又はＴａｕポリペプチドのタンパク質分解性消化によって生成され得る。抗体を結合するペプチドは、例えば、ウエスタンブロット又は質量分析によって同定されることができる。別の例において、ＮＭＲ分光法又はＸ線結晶学的手法は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントによって結合したエピトープを同定するために使用されることができる。いったん同定されると、本発明の抗体を結合するエピトープフラグメントは、必要な場合、同じエピトープを結合する追加の抗体を得るための免疫原として使用されることができる。さらに、本発明の抗体を結合するエピトープフラグメントは、同じエピトープへ結合して、必要な場合、例えば、当該技術分野において公知のリポカリン（「アンチカリン」）、フィブロネクチン（「アドネクチン」、トリネクチン）、クーニッツドメイン、Ｃ型レクチン、トランスフェリン、ガンマ−クリスタリン、システインノット、アンキリン反復配列（「ＤＡＲＰｉｎ」）又はプロテインＡ（「アフィボディ」）由来のタンパク質足場を基にした１０個を超えるアミノ酸を含むタンパク質又はポリペプチドの化合物のような、Ｔａｕの少なくとも１つの生物学的活性を阻害するタンパク質を得るために使用されることができる（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ、２００４年、Ｍｏｓａｖｉら、２００４年；Ｇｉｌｌ及びＤａｍｌ、２００６年；Ｎｉｌｓｓｏｎ及びＴｏｌｍａｃｈｅｖ，２００７年；Ｂｉｎｚら、２００４年）。さらに、同じエピトープを結合する分子には、１０個以下のアミノ酸を含むペプチド及び環状ペプチドならびにペプチド模倣薬を含むさらなる有機分子が含まれる。ペプチド模倣薬は、タンパク質間相互作用において認められるアミノ酸配列に基づいた、及び当該技術分野で公知の化合物である（Ｓｉｌｌｅｒｕｄ及びＬａｒｓｏｎ、２００５年）。

この背景に対して、本開示は、別の態様において、配列番号３５のＳ２３８、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ａ２４６の少なくともアミノ酸残基を含むエピトープへ結合する、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。全エピトープは、配列番号３５のアミノ酸２３２〜２５１に及ぶ。１つの例において、本発明の抗体によって結合されたヒトＴａｕのエピトープは、アミノ酸配Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ａ２４６並びに配列番号３５のＳ２３５、Ｓ２３７、Ｋ２４０、Ｒ２４２、Ｌ２４３、Ｑ２４４、Ｖ２４８、及びＭ２５０から選択される１つ以上の残基を含む。

別の態様において、本開示は、配列番号３５のＳ２３５、Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｋ２４０、Ｓ２４１、Ｑ２４４、Ｔ２４５、及びＡ２４６の少なくともアミノ酸残基を含むエピトープへ結合する、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。１つの例において、本発明の抗体によって結合されたヒトＴａｕのエピトープは、アミノ酸Ｓ２３５、Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｋ２４０、Ｓ２４１、Ｑ２４４、Ｔ２４５、Ａ２４６ならびに配列番号３５のＳ２３７、Ｒ２４２、Ｌ２４３、Ｖ２４８、及びＭ２５０から選択される１つ以上の残基を含む。

別の態様において、本開示は、配列番号３５のＳ２３５、Ｓ２３７、Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｋ２４０、Ｓ２４１、Ｑ２４４、Ｔ２４５、及びＡ２４６の少なくともアミノ酸残基を含むエピトープに結合する、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。１つの例において、本発明の抗体によって結合されたヒトＴａｕのエピトープは、アミノ酸Ｓ２３５、Ｓ２３７、Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｋ２４０、Ｓ２４１、Ｑ２４４、Ｔ２４５、Ａ２４６、ならびに配列番号３５のＲ２４２、Ｌ２４３、Ｖ２４８、及びＭ２５０から選択される１つ以上のアミノ酸残基を含む。
１つの例において、本発明の抗体によって結合されたヒトＴａｕのエピトープは、配列番号３５のアミノ酸残基Ｓ２３５、Ｓ２３７、Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｋ２４０、Ｓ２４１、Ｒ２４２、Ｌ２４３、Ｑ２４４、Ｔ２４５、Ａ２４６、Ｖ２４８、及びＭ２５０を含む。
配列番号７のＶＬ及び配列番号８のＶＨを含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、前述のエピトープへ結合するＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの代表である。

このような抗体は、キメラ、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体であることができ、又はキメラ、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体を得るために使用されることができる。

別の態様において、本開示は、配列番号３５のアミノ酸残基Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ａ２４６を含むＴａｕのエピトープを結合する分離された中和Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。１つの例において、本発明の中和抗体によって結合されたヒトＴａｕのエピトープは、アミノ酸Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ａ２４６ならびに配列番号３５のＳ２３５、Ｓ２３７、Ｋ２４０、Ｒ２４２、Ｌ２４３、Ｑ２４４、Ｖ２４８、及びＭ２５０から選択される１つ以上の残基を含む。

別の態様において、本開示は、配列番号３５のＳ２３５、Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｋ２４０、Ｓ２４１、Ｑ２４４、Ｔ２４５、及びＡ２４６の少なくともアミノ酸残基を含むエピトープへ結合する分離された中和Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。１つの例において、本発明の中和抗体によって結合されたヒトＴａｕのエピトープは、アミノ酸Ｓ２３５、Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｋ２４０、Ｓ２４１、Ｑ２４４、Ｔ２４５、及び２４６ならびに配列番号３５のＳ２３７、Ｒ２４２、Ｌ２４３、Ｖ２４８、及びＭ２５０から選択される１つ以上の残基を含む。

別の態様において、本開示は、配列番号３５のＳ２３５、Ｓ２３７、Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｋ２４０、Ｓ２４１、Ｑ２４４、Ｔ２４５、及びＡ２４６の少なくともアミノ酸残基を含むエピトープへ結合する、分離された中和Ｔａｂ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。１つの例において、本発明の中和抗体によって結合されたヒトＴａｕのエピトープは、アミノ酸Ｓ２３５、Ｓ２３７、Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｋ２４０、Ｓ２４１、Ｑ２４４、Ｔ２４５、Ａ２４６、ならびに配列番号３５のＲ２４２、Ｌ２４３、Ｖ２４８及びＭ２５０から選択される１つ以上の残基を含む。

１つの例において、本発明の中和抗体によって結合されたヒトＴａｕエピトープは、配列番号３５のアミノ酸残基Ｓ２３５、Ｓ２３７、Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｋ２４０、Ｓ２４１、Ｒ２４２、Ｌ２４３、Ｑ２４４、Ｔ２４５、Ａ２４６、Ｖ２４８、及びＭ２５０を含む。
配列番号７のＶＬ及び配列番号８のＶＨを含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、前記エピトープへ結合する中和Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの代表である。

このような中和抗体は、キメラ、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体であることができ、又はキメラ、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体を得るために使用されることができる。

別の態様において、本開示は、先に説明したＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントと実質的に同じＴａｕエピトープへ結合する、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。エピトープへの結合は、例えば、参照としての配列番号７のＶＬ及び配列番号８のＶＨを含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを用いたエピトープマッピングについて説明されるように決定され得る。

このような抗体は、キメラ、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体であることができ、又はキメラ、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体を得るために使用されることができる。

また、本開示によって提供されるのは、ヒトＴａｕの領域又はエピトープ、特に配列番号３５のアミノ酸２３５〜２５０内のエピトープへ特異的に結合するＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントであり、異核単量子コヒーレンス核磁気共鳴（ＨＳＱＣ ＮＭＲ）によって決定される。

このような抗体は、キメラ、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体であることができ、又はキメラ、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体を得るために使用されることができる。

別の態様において、本開示は、Ｔａｕへの結合について、先に説明したＴａｕ結合抗体と競合する、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。

この脈絡において、本開示は具体的には、Ｔａｕへの結合について、配列番号７のＶＬ及び配列番号８のＶＨを含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントと競合する、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを熟慮する。

このような抗体は、キメラ、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体であることができ、又はキメラ、ヒト化もしくは完全にヒトのモノクローナル抗体を得るために使用されることができる。

Ｔａｕへの結合についての競合は、配列番号７のＶＬ及び配列番号８のＶＨを含み得る参照抗体又はその結合フラグメントの存在下でのＴａｕへの抗体又はその結合フラグメントの結合の少なくとも約５０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％、又は約１００％の低下によって判定することができる。結合は、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（登録商標）機器を用いた表面プラズモン共鳴法、種々の蛍光検出技術（例えば、蛍光相関分光法、蛍光交差相関、蛍光寿命測定など）又は種々のタイプのラジオイムノアッセイ又は標的分子に対する抗体結合を追うために使用される他のアッセイを用いて測定され得る。

「Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント」という用語は、当該抗体又はその結合フラグメントが、Ｔａｕへその可変部を経由して特異的に結合する、すなわち、Ｔａｕ抗原を、Ｔａｕの類似体ではない他の抗原よりも大きな親和性で結合することを意味する。「Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント」は、Ｔａｕへその可変部を経由して、Ｔａｕの類似体ではない他の抗原よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０、２０、１００、１０^３、１０^４、１０^５又は少なくとも１０^６倍の親和性で結合する。Ｔａｕ結合抗体及びその結合フラグメントがそれにもかかわらず、Ｔａｕ結合抗体及びその結合フラグメントの可変部の外側にある配列との相互作用を通じて他のタンパク質（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ又はＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）とも相互作用することは理解されるであろう。Ｔａｕ結合抗体及びその結合フラグメントの可変部の外側にある配列によって、特にＴａｕ結合抗体及びその結合フラグメントの定常部によって仲介されるこのような後者の結合特性は、「Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント」という用語によって包含されることを意味するものではない。抗体の結合特異性を判定するためのスクリーニングアッセイは周知であり、当該技術分野において通例で実施される。Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、ナノモル濃度の範囲での抗体の抗原に対する当該抗体（又はその結合フラグメント）の結合の親和性に対して平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を有し得る。したがって、Ｋ_Ｄは、約１×１０^−６未満、例えば、約２×１０^−７以下のような、約５×１０^−７未満であり得、例えば、実施例において説明される表面プラズモン共鳴法及びビアコア装置を用いて測定されることができる。

先に記載されたように、本開示は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供する。全長の抗体には、定常部及び可変部が含まれる。定常部は、抗体の抗原結合フラグメントにおいてその全長で存在する必要はないことがある。しかしながら、適用がＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを仲介する抗体の使用を考慮する場合はどこでも、結合フラグメントが、なおもＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを仲介することができるのに十分な長さの定常部を含まなければならないことは理解されることになっている。

先に記載されたように、本開示は、ヒト化に対する代替物質として生成することのできるヒトＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントにも言及する。例えば、免疫化の際に、内在性ネズミ抗体の産生の非存在下で、完全なレパートリーのヒト抗体を産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが可能である。例えば、キメラマウス及び生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖接合部（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失が内在性抗体産生の完全な阻害を結果的に生じることは説明されてきた。このような生殖系列変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、当該抗原を用いたヒト生殖系列免疫グロブリン胃炎死を保有するトランスジェニック動物の免疫化の際に、特定の抗原に対する特異性を有するヒト抗体の産生を結果的に生じるであろう。このようなトランスジェニック動物を作出するための技術、及びこのようなトランスジェニック動物からヒト抗体を分離及び生成するための技術は、当該技術分野で公知である（Ｌｏｎｂｅｒｇ，２００５、Ｇｒｅｅｎ，１９９９、Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ及びＧｒｅｅｎ，２００２、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら，１９９９）。あるいは、トランスジェニック動物、例えば、マウスにおいて、マウス抗体の可変部をコードする免疫グロブリン遺伝子のみが、対応するヒト可変部免疫グロブリン遺伝子配列と置き換えられる。抗体定常部をコードするマウス生殖系列免疫グロブリン遺伝子は、未変化のままである。この方法で、抗体エフェクターは、トランスジェニックマウスの免疫系において機能し、結果的にＢ細胞の発達が本質的に変わらず、このことは、インビボでの抗原負荷に及ぼす改善された抗体応答をもたらし得る。関心対象の特定の抗体をコードする遺伝子がいったんこのようなトランスジェニック動物から分離された場合、定常部をコードする遺伝子は、完全ヒト抗体を得るためにヒト定常部遺伝子と置き換えられることができる。ヒト抗体フラグメントをインビトロで得るための他の方法は、ファージディスプレイ技術又はリボソームディスプレイ技術のようなディスプレイ技術に基づいており、この中で、少なくとも一部人工的に、又はドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）部遺伝子レパートリーからのいずれかで作製された組換えＤＮＡライブラリが使用される。ヒト抗体を作製するためのファージディスプレイ技術及びリボソームディスプレイ技術は、当該技術分野で周知である（Ｗｉｎｔｅｒら，１９９４、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，２００２、Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ ａｎｄ ｖｏｎ Ｒｕｄｅｎ，２００２、Ｇｒｏｖｅｓ及びＯｓｂｏｕｒｎ，２００５、Ｄｕｆｎｅｒら，２００６）。

ヒト抗体は、関心対象の抗原でエクスビボで免疫化され、その後融合してハイブリドーマを作製し、次に当該ハイブリドーマを最適なヒト抗体についてスクリーニングすることができる、分離されたヒトＢ細胞からも作製され得る（Ｇｒａｓｓｏら，２００４、Ｌｉら，２００６）。

本明細書で使用する「Ｔａｕ結合抗体」又はその結合フラグメントという用語は、Ｔａｕへ結合してその少なくとも１つの生物活性を阻害する抗体又はその結合フラグメントを指す。Ｔａｕの生物学的活性は、当該技術分野で公知であり、限定されるものではないが、上記のもつれ又は原繊維のような凝集体の異なるタイプを形成するＴａｕ分子の凝集が挙げられる。特定の実施形態において、本明細書で使用する「中和Ｔａｕ結合抗体」又はその結合フラグメントは、インビトロアッセイにおける、例えば、以下の実験３．１において説明されるような例えばインビトロアッセイにおけるような、Ｔａｕ凝集を結合及び阻害する抗体を指す。

本明細書で使用する「抗体」という用語は概して、すなわち２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる要素を含む無処置（全、完全長）抗体に関する。抗体は、例えば、ＷＯ２００７／０２４７１５において開示される分子ＤＶＤ−Ｉｇ、又はＷＯ２０１１／０３０１０７において説明されるいわゆる（ＦａｂＦｖ）２Ｆｃにより、さらなる追加の結合ドメインを含み得る。したがって、本明細書で採用される抗体には、二価、三価又は四価の全長抗体が含まれる。

抗体の結合フラグメントには、一本鎖抗体（すなわち、全長の重鎖及び軽鎖）、Ｆａｂ、修飾されたＦａｂ、Ｆａｂ’、修飾されたＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｃ、ジスルフィド安定化したＦａｂ−ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｃ、ｄｓｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ−ｓｃＦｃ、二価、三価もしくは四価の抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トライボディ、トライアボディ、テトラボディ、ｓｄＡｂ、ＶＨＨフラグメント及びＶＮＡＲフラグメントのようなドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、ならびに上述のうちのいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６−１１３６、Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ ２（３），２０９−２１７を参照されたい）。これらの抗体フラグメントを作製及び生成するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１を参照されたい）。Ｆａｂ−Ｆｖフォーマット及びそのジスルフィド安定化版は、ＷＯ２００９／０４０５６２において最初に開示され、Ｆａｂ−ｄｓＦｖは、ＷＯ２０１０／０３５０１２において最初に開示された。Ｆａｂ−ｓｃＦｖのジスルフィド安定化形態は、ＷＯ２０１３／０６８５７１において説明された。ｓｃＦｃフォーマットを含む抗体フォーマットは、ＷＯ２００８／０１２５４３において最初に説明された。本発明における使用のための他の抗体フラグメントには、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１において説明されるＦａｂフラグメント及びＦａｂ’フラグメントが含まれる。

多価抗体は、多重特異性、例えば二重特異性を含み得、又は単一特異性であり得る（例えば、ＷＯ９２／２２５８３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照されたい）。後者の１つのこのような例は、ＷＯ９２／２２５８３において説明される三価Ｆａｂ（又はＴＦＭ）である。

一実施形態において、Ｆａｂフラグメントが提供される。

一実施形態において、Ｆａｂ’フラグメントが提供される。

典型的なＦａｂ’分子は、重鎖が可変部ＶＨ、定常部ＣＨ１及び天然の又は修飾されたヒンジ部を含み、ならびに軽鎖が可変部ＶＬ及び定常部ＣＬを含む、重鎖及び軽鎖の対を含む。

一実施形態において、例えば、二量体化がヒンジを通じてであり得るＦ（ａｂ’）２を作製するために、本開示によるＦａｂ’の二量体が提供される。

一実施形態において、抗体又はその結合フラグメントは、結合ドメインを含む。結合ドメインは概して、６個のＣＤＲを含み、３個は重鎖由来、及び３個は軽鎖由来であろう。一実施形態において、ＣＤＲは、フレームワークにあり、まとめて可変部を形成する。したがって、一実施形態において、抗体又は結合フラグメントは、軽鎖可変部及び重鎖可変部を含む、抗原に対して特異的な結合ドメインを含む。

本開示によって提供されるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの親和性が、当該技術分野で公知の適切な方法を用いて変化し得ることは認識されるであろう。本開示はそれゆえ、Ｔａｕに対する改善された親和性を有する、本発明の抗体分子のバリアントにも関する。このようなバリアントは、ＣＤＲを変異させること（Ｙａｎｇら，Ｊ. Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２−４０３，１９９５）、鎖のシャッフリング（Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９−７８３，１９９２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異誘発株の使用（Ｌｏｗら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５９−３６８，１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４−７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７７−８８，１９９６）及びセクシャルＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８−２９１，１９９８）を含む、いくつかの親和性成熟化プロトコルによって得られることができる。Ｖａｕｇｈａｎら（上述）は、親和性成熟化に関するこれらの方法を考察している。

したがって、Ｔａｕ結合抗体及びその結合フラグメントは、例えば、１つ以上の保存的置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５の保存的置換）を有する軽鎖又は重鎖の、上述の具体的に記載されたアミノ酸配列のうちのいずれかも包含する。保存的置換についての候補であるアミノ酸配列の位置を決定することができ、何らかの特定のアミノ酸についての保存的置換をもたらす合成の及び天然のアミノ酸を選択することができる。保存的置換を選択することについての考慮には、何らかの特定のアミノ酸置換がなされる脈絡、側鎖の疎水性又は極性、側鎖の一般的な大きさ、及び生理学的条件下で酸性又は塩基性の特徴を有する側鎖のｐＫ値が含まれる。例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジンはしばしば、互いに適切に置換される。当該技術分野で公知のように、このことは、３つのアミノ酸はすべて塩基性側鎖を有するからであるが、リジン及びアルギニンの側鎖についてのｐＫ値は、ヒスチジン（約６）よりも互いに非常に近い（約１０及び１２）。同様に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンはしばしば、互いに適切に置換され、但し、グリシンがしばしば、当該群の他のメンバーと適切に置換されることがないことを条件とする。しばしば互いに適切に置換されるアミノ酸の他の群には、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群、ならびにセリン、トレオニン、及び任意にチロシンからなる群が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の脈絡において記載されるようなＴａｕ結合抗体及びその結合フラグメントは、本明細書に開示される例示的な抗体、フラグメント及び配列の誘導体を包含し得る。「誘導体」には、化学的に修飾されたＴａｕ結合抗体及びその結合フラグメントが含まれる。化学修飾の例としては、水溶性ポリマー、Ｎ結合型もしくはＯ結合型炭水化物、糖、リン酸塩のような１つ以上のポリマーの、及び／又はフルオロフォアのような検出可能な標識のような他のこのような分子の共有結合が挙げられる。

所望の場合、本発明における使用のためのＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントはしたがって、１つ以上のエフェクター分子（複数可）へ共役し得る。エフェクター分子が、本発明の抗体へ結合することのできる単一の部分を形成するよう連結された単一のエフェクター分子又はこのような２つ以上のエフェクター分子を含み得ることは認識されるであろう。エフェクター分子へ連結された抗体フラグメントを得ることが所望の場合、このことは、抗体フラグメントがエフェクター分子へ直接又はカップリング剤を介してのいずれかで連結される標準的な化学的手順又は組換えＤＮＡ手順によって調製され得る。このようなエフェクター分子を抗体へ共役させるための技術は、当該技術分野で周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ 第２版，Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編），１９８７，ｐｐ．６２３−５３、Ｔｈｏｒｐｅら，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７−１２３を参照されたい）。エフェクター分子を共役させるためのこれらの技術には、部位特異的共役又は非部位特異的なもしくは無作為な共役が含まれ得る。特定の化学的手順には、例えば、ＷＯ ９３／０６２３１、ＷＯ ９２／２２５８３、ＷＯ ８９／００１９５、ＷＯ ８９／０１４７６及びＷＯ ０３／０３１５８１において説明されるものが含まれる。あるいは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、例えば、ＷＯ ８６／０１５３３及び欧州特許第３９２７４５号において説明される組換えＤＮＡ手順を用いて達成され得る。あるいは、エフェクター分子に対する特定の付着部位は、例えば、ＷＯ ２００８／０３８０２４において説明されるように、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントへと操作され得る。さらに、カップリング剤は、例えば、ＷＯ ２００５／１１３６０５において説明されるように、エフェクター分子を本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントへ連結するのに使用され得る。先に列挙した可能性が、それ自体で又は組み合わせで使用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。

本明細書で使用されるエフェクター分子という用語には、例えば、薬剤、毒素、生物活性のあるタンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体フラグメント、合成又は天然のポリマー、核酸及びそのフラグメント、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらのフラグメント、放射性核種、特に放射性ヨウ素、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子及び、蛍光化合物又はＮＭＭＲ分光法もしくはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物のようなレポーター群が含まれる。

他のエフェクター分子には、^１１１Ｉｎ及び^９０Ｙ、Ｌｕ^１７７、ビスマス^２１３、カリフォルニウム^２５２、イリジウム^１９２及びタングステン^１８８／レニウム^１８８のようなキレート化放射性核種又はアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害薬、タキソイド及びスラミンのような、しかしこれらに限定されない薬剤が含まれ得る。

他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド及び酵素が含まれる。関心対象の酵素には、タンパク質分解性酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。関心対象のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドには、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、もしくはジフテリア毒素のような毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子もしくは組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓薬もしくは血管新生抑制薬、例えば、アンギオスタチンもしくはエンドスタチン、又はリンホカイン、インターロイキン１（ＩＬ−Ｉ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）もしくは他の成長因子及び免疫グロブリンのような生物応答修飾薬、又は当該技術分野において公知のリポカリン（「アンチカリン」）、フィブロネクチン（「アドネクチン」、トリネクチン）、クーニッツドメイン、Ｃ型レクチン、トランスフェリン、ガンマ−クリスタリン、システインノット、アンキリン反復配列「ＤＡＲＰｉｎ」）、Ｆｙｎ ＳＨ３ドメイン（「フィノマー」）又はプロテインＡ（「アフィボディ」）由来のタンパク質足場を基にした１０個を超えるアミノ酸を含む他のタンパク質もしくはポリペプチドの化合物が含まれるが、これらに限定されない（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ, ２００４、Ｍｏｓａｖｉら, ２００４、Ｇｉｌｌ及びＤａｍｌｅ，２００６、Ｎｉｌｓｓｏｎ及びＴｏｌｍａｃｈｅｖ，２００７、Ｂｉｎｚら，２００４、Ｓｉｌａｃｃｉら，２０１４）。

他のエフェクター分子には、血液脳関門通過を亢進又は容易にするペプチド及びタンパク質が含まれる。例えば、ＷＯ２０１０／０４３０４７、ＷＯ２０１０／０６３１２２、ＷＯ２０１０／０６３１２３又はＷＯ２０１１／０４１８９７は、血液脳関門を通過して治療用分子を輸送することのできるベクターとして作用し得るペプチド又はポリペプチド、及びこれらを治療用分子へ共役させる方法を説明している。血液脳関門通過の脈絡における関心対象のペプチド及びタンパク質には、トランスフェリン受容体、グルコース受容体、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８型、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１型及びヘパリン結合性表皮成長因子様成長因子が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、エフェクター分子は、先の血液脳関門受容体のうちの１つへ特異的に結合するドメイン抗体のような抗体フラグメント、ラクダ抗体又はサメ由来抗体（ＶＮＡＲ）である。

他のエフェクター分子には、例えば、診断において有用な検出可能な物質が含まれ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補綴群（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ ｇｒｏｕｐ）、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性核種、ポジトロン放射断層撮影法もしくは単一光子放射断層撮影法において使用され得るようなポジトロン放射材料、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。診断薬としての使用のために抗体へ共役することのできる金属イオンについては概して、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な補綴群には、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが含まれ、適切な蛍光材料には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル及びフィコエリトリンが含まれ、適切な発光材料には、ルミノールが含まれ、適切な生物発光材料には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが含まれ、ならびに適切な放射性核種には、^１２４Ｉ ^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ、^９９Ｔｃ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^６４Ｃｕ、^６８Ｇａ及び^１８Ｆが含まれる。診断に有用な検出可能な物質として適した特定のタイプのエフェクター分子には、Ｗｙｆｆｅｌｓら ２０１４，Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ ４１（２０１４）：５１３−５２３において説明される電子欠乏性テトラジン及びトランスシクロオクテン（ＴＣＯ）が含まれ、ここで、テトラジンへ連結した本発明のＴａｕ結合抗体が投与され得、最大取り込み及び非標的部位からの十分な除去に到達することを許容し得、次いで、適切な放射性核種で標識されたＴＣＯ又は最適化されたＴＣＯ類似体のその後の投与があり、それにより、ＴＣＯは、本発明のＴａｕ結合抗体においてテトラジンを共有結合するであろうし、例えば、ポジトロン放射断層撮影法又は単一光子放射断層撮影法によるテトラジンの検出を許容するであろう。

一実施形態において、放射性核種へ又はテトラジンへ連結されたＴａｕ結合型のＦａｂ、Ｆａｂ’、又はｓｃＦｖが提供される。放射性核種に対する又はテトラジンに対する連結は、抗体フラグメントに位置する何らかの利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、何らかの遊離したアミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基を通じての付着を介してなされ得る。このようなアミノ酸は、抗体フラグメントにおいて自然に生じ得、又は組換えＤＮＡ法を用いてフラグメントへと操作され得る（例えば、米国特許第５，２１９，９９６号、米国特許第５，６６７，４２５号、ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい）。一例において、本発明のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、修飾されたＦａｂフラグメントであり、この中で、当該修飾は、当該フラグメントの重鎖のＣ末端への、エフェクター分子の付着を許容するための１つ以上のアミノ酸の付加である。適切には、追加のアミノ酸は、エフェクター分子が付着し得る１つ以上のシステイン残基を含有する修飾されたヒンジ部を形成する。一実施形態において、放射性核種が^１１１Ｉｎ、^９９Ｔｃ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^６４Ｃｕ、又は^６８Ｇａのような金属である場合、このことは、例えば、Ｔｕｒｎｅｒら（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９４，７０：３５−４１； Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｕｍ−１１１−ｌａｂｅｌｌｅｄ ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｂ７２．３ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ ｔｕｍｏｕｒ−ｂｅａｒｉｎｇ ｍｉｃｅ)によって説明される大環状キレーターによって結合し得、それにより後者は順に、当該抗体又は抗体フラグメントの上述のアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基（又は複数可）へ共有結合する。さらなる実施形態において、放射性核種の結合した大環状キレートは、２つ以上の抗Ｔａｕ抗体又はその結合フラグメントを連結するクロスリンカーの一部である、ＷＯ０５／１１３６０５において説明されるエフェクター分子であり得る。

別の例において、エフェクター分子は、インビボでの抗体の半減期を延長し得、及び／又は抗体の免疫原性を低下させ得、及び／又は上皮性関門を通過して免疫系に至る抗体の送達を亢進し得る。このタイプの適切なエフェクター分子の例としては、ポリマー、アルブミン、及びアルブミン結合タンパク質又はＷＯ０５／１１７９８４において説明されるもののようなアルブミン結合化合物が挙げられる。

このようなエフェクター分子がポリマーである場合、概して、合成又は天然のポリマー、例えば、任意に置換された直鎖もしくは分枝鎖のポリアルキレンポリマー、ポリアルケニレンポリマーもしくはポリオキシアルキレンポリマー又は分枝鎖もしくは非分枝鎖の多糖、例えば、ホモ多糖もしくはヘテロ多糖であり得る。

上述の合成ポリマーにおいて存在し得る具体的な任意置換には、１つ以上のヒドロキシ基、メチル基又はメトキシ基が含まれる。

合成ポリマーの具体例としては、任意に置換された直鎖又は分枝鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はこれらの誘導体、特にメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体のような、任意に置換されたポリ（エチレングリコール）が挙げられる。

具体的な天然ポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はこれらの誘導体が含まれる。

一実施形態において、ポリマーは、ヒト血清アルブミン又はそのフラグメントのような、アルブミン又はそのフラグメントである。

ポリマーの大きさは、所望の通り変化し得るが、概して、５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば、２００００〜４００００Ｄａのような５０００〜４００００Ｄａの平均分子量範囲にあるであろう。ポリマーの大きさは特に、生成物の企図される使用、例えば、脳のようなある特定の組織へ局在する又は循環半減期を延長する能力を基に選択され得る（総説については、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５を参照されたい）。したがって、例えば、当該生成物が、循環系を出て組織に浸透する場合である。

適切なポリマーには、分子量が約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲にあるポリ（エチレングリコール）又は、特に、メトキシポリ（エチレングリコール）もしくはその誘導体のような、ポリアルキレンポリマーが含まれる。

一例において、本発明における使用のための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分へ付着する。１つの特定の例において、抗体は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント及びＰＥＧ分子は、抗体フラグメントに位置する何らかの利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、何らかの遊離のアミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基を通じて付着し得る。このようなアミノ酸は、抗体フラグメントにおいて自然に生じ得、又は組換えＤＮＡ法を用いてフラグメントへと操作され得る（例えば、米国特許第５，２１９，９９６号、米国特許第５，６６７，４２５号、ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい）。一例において、本発明のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、修飾されたＦａｂフラグメントであり、この中で、当該修飾は、その重鎖のＣ末端への、エフェクター分子の付着を許容する１つ以上のアミノ酸の付加である。適切には、追加のアミノ酸は、エフェクター分子が付着し得る１つ以上のシステイン残基を含有する修飾されたヒンジ部を形成する。２つ以上のＰＥＧ分子を付着させるために、複数の部位を使用することができる。

適切に、ＰＥＧ分子は、抗体フラグメントに位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を通じて共有結合する。修飾された抗体フラグメントへ付着した各ポリマー分子は、当該フラグメントに位置するシステイン残基の硫黄原子へ共有結合し得る。当該共有結合は概して、ジスルフィド結合又は、特に硫黄−炭素結合であろう。チオール基が適切に活性化されたエフェクター分子の付着点として使用される場合、例えば、マレイミドのようなチオール選択的誘導体及びシステイン誘導体が使用され得る。活性化されたポリマーは、先に説明したポリマー修飾された抗体フラグメントの調製における出発材料として使用され得る。活性化されたポリマーは、α−ハロカルボン酸又はエステルのようなチオール反応基を含有する何らかのポリマー、例えば、ヨードアセトアミド、イミド、例えば、マレイミド、スルホンビニル又はジスルフィドであり得る。このような出発材料は、商業的に得られ得（例えば、Ｎｅｋｔａｒ，旧Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社，米国アラバマ州ハンツビル市）、又は従来の化学的手順を用いて市販の出発材料から調製され得る。特定のＰＥＧ分子には、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ，旧Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ，旧Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）が含まれる。

別の態様において、本開示は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの軽鎖可変部及び／又は重鎖可変部をコードする核酸配列を含む核酸分子に対する、ならびにＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの軽鎖可変部及び／又は重鎖可変部のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３をコードする核酸配列を含む核酸分子に対するＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。

例として、ＡＢ１のＶＬ（配列番号７）は、配列番号１９によってコードされ得る。ＡＢ１のＶＨ（配列番号８）は、配列番号２０によってコードされ得る。

配列番号９のヒト化ＶＬは、配列番号２１によってコードされ得る。配列番号１２のヒト化ＶＨは、配列番号２２によってコードされ得、配列番号１３のヒト化ＶＨは、配列番号２３によってコードされ得る。

配列番号１４のヒト化軽鎖は、配列番号２４によってコードされ得る。配列番号１７のヒト化重鎖は、配列番号２５によってコードされ得、配列番号１８のヒト化重鎖は、配列番号２６によってコードされ得る。配列番号５４のヒト化重鎖は、配列番号５６によってコードされ得、配列番号５５のヒト化重鎖は、配列番号５７によってコードされ得る。

Ｔａｕ結合抗体及びその結合フラグメントは、単一の核酸（例えば、当該抗体の軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチドをコードする塩基配列を含む単一の核酸）によって、又は２つ以上の別個の核酸によってコードされ得、これらの各々は、当該抗体又は抗体フラグメントの異なる一部をコードする。この点において、本開示は、上述の抗体のうちのいずれか又は結合フラグメントをコードする１つ以上の核酸を提供する。当該核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらに類するものであり得る。

例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の一部又は全部をコードするＤＮＡ配列は、決定されたＤＮＡ配列から所望の通り、又は対応するアミノ酸配列を基にして合成され得る。アクセプターフレームワーク配列をコードするＤＮＡは、当業者に対して広く入手可能であり、当業者が公知のアミノ酸配列を基にして容易に合成することができる。

分子生物学の標準的な技術は、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を調製するために使用され得る。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、完全に又は部分的に合成され得る。部位特異的変異誘発技術及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、適宜使用され得る。

好ましくは、コードする核酸配列は、原核細胞又は真核細胞における発現を許容する発言制御配列へ操作可能に連結される。当該ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なｍＲＮＡへのポリヌクレオチドの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳類細胞における発現を確実にする調節エレメントは、当業者に周知である。当該エレメントは通常、転写の開始を確実にする調節配列、ならびに任意に、転写の終結及び転写産物の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。追加の調節エレメントには、転写エンハンサー及び翻訳エンハンサー、ならびに／又は天然に会合した若しくは異種性のプロモーター領域を含み得る。

さらなる態様における本開示はしたがって、Ｔａｕ結合抗体及びその結合フラグメントをコードするこのような核酸配列を含むクローニングベクター又は発現ベクターを提供する。

「ベクター」とは、例えば、コードされたポリペプチドの合成が生じることのできる適切な宿主細胞へと核酸配列を運搬する能力を有する何らかの分子又は組成物である。典型的には及び好ましくは、ベクターとは、当該技術で公知である組換えＤＮＡ技術を用いて操作して所望の核酸配列（例えば、本発明の核酸）を組み込んだ核酸である。発現ベクターは典型的には、以下の構成要素（核酸分子によってまだ提供されていない場合）、すなわちプロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起源、転写終結配列、ドナー及びアクセプターのスライス部位を含有する完全イントロン配列、分泌のためのリーダー配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現することになっているポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能なマーカーエレメントのうちの１つ以上を含有する。

ベクターは典型的には、当該ベクターが使用されるであろう宿主細胞において機能的であるよう選択される（当該ベクターは、当該遺伝子及び／又は当該遺伝子の発現が生じることができるように宿主細胞機械と互換性がある）。

さらなる態様における本開示はしたがって、先に説明したクローニングベクターもしくは発現ベクターならびに／又は先に説明したＴａｕ結合抗体及びその結合フラグメントをコードする核酸配列を含む宿主細胞を提供する。

宿主細胞は、核酸又はベクターによりコードされたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを生成するよう、当該核酸又はベクターを用いて形質転換することのできる何らかのタイプの細胞であることができる。当該核酸又はベクターを含む宿主細胞は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントあるいはその一部（例えば、当該核酸又はベクターによってコードされる重鎖配列又は軽鎖配列）を生成するために使用することができる。当該核酸又はベクターを細胞へ導入した後、細胞を、コードした配列の発現に適した条件下で培養する。次に、抗体、抗原結合フラグメント、又は抗体の一部は、細胞から分離されることができる。

宿主細胞は、原核宿主細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような）又は真核宿主細胞（酵母細胞、昆虫細胞、又は脊椎動物細胞のような）であり得る。宿主細胞は、適切な条件下で培養される時、その後、培地（宿主細胞が培地へ抗体又はその結合フラグメントを分泌する場合）から又は抗体もしくはその結合フラグメントを産生する宿主細胞から（宿盗細胞が分泌しない場合）直接収集されることのできる当該抗体又はその結合フラグメントを発現する。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、グリコシル化又はリン酸化のような活性に対して望まれる又は必要なポリペプチド修飾、及び生物活性のある分子への折り畳みのしやすさのような種々の因子によるであろう。宿主細胞の選択は、抗体又はその結合フラグメントが転写後修飾される（例えば、グリコシル化される及び／又はリン酸化される）ことになっているかどうかに一部よるであろう。そうである場合、酵母、昆虫、又は哺乳類の宿主細胞が好ましい。

適切な哺乳類宿主細胞には、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞又はハイブリドーマ細胞が含まれる。本発明における使用に適したタイプのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）には、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞及びＣＨＯＤＸＢ１１細胞のようなかつＤＨＦＲ選択可能マーカーと併用され得るｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞、又はグルタミンシンテターゼ選択可能マーカーと併用され得るＣＨＯＫＩ−ＳＶ細胞を含む、ＣＨＯ細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞を含み得る。多くは、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ），バージニア州マナサス市から入手可能である。例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ６１番）、ヒト胚腎（ＨＥＫ）２９３細胞もしくはＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１５７３番）、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ９２番）、又はＰＥＲ．Ｃ６細胞のような哺乳類細胞が挙げられる。抗体を発現する上での使用に関する他の細胞タイプには、リンパ球細胞株、例えば、ＮＳＯ骨髄腫細胞及びＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞が含まれる。

本開示の別の態様は、例えば、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントをコードするＤＮＡからのＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの発現をもたらすのに適した条件下で、例えばベクターを含有する宿主細胞を培養すること、及び当該抗体分子を分離することを含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの精製のための方法を提供する。

Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドのみを含み得、いずれの場合においても、重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドのみをコードする配列が宿主細胞をトランスフェクトするために使用されることが必要である。重鎖お及び軽鎖の両方を含む生成物の生成のために、当該細胞株は、軽鎖ポリペプチドをコードする第一のベクター及び重鎖ポリペプチドをコードする第二のベクターの２つのベクターがトランスフェクトされ得る。あるいは、軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む単一のベクターが使用され得る。

Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメント本開示による抗体及びフラグメントは、良好なレベルで宿主細胞から発現する。したがって、当該抗体及び／又はフラグメントの特性は、商業的な加工をさせやすくする。

したがって、宿主細胞を培養すること、及びＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを発現させること、後者を分離し、任意にこれを精製して、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを提供することのための方法が提供される。一実施形態において、当該方法はさらに、エフェクター分子を当該分離された抗体又はフラグメントへ共役させるステップ、例えば、特に本明細書で説明されるＰＥＧポリマーへ共役させるステップを含む。

Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、組成物、特に医薬組成物又は診断用組成物において製剤化されることができる。医薬組成物は、治療有効量又は予防有効量のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを、適切な担体、例えば、診断上許容され得る薬剤との混合で含む。医薬組成物は、診断上有効な量のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを、適切な担体、例えば診断上許容される薬剤と混合で含む。

本医薬組成物における使用のための医薬として許容され得る薬剤には、担体、賦形剤、希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）、抗酸化物質、防腐剤、着色剤、香料及び希釈剤（ｄｉｌｕｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、乳化剤、懸濁剤、溶剤、充填剤、増量剤、緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒ）、送達ビヒクル、等張化剤、共溶媒、湿潤剤、錯化剤、緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、抗菌薬、ならびに界面活性剤が含まれる。

当該組成物は、液状に又は凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）形態もしくは凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）形態にあることができ、１つ以上の凍結防止剤、賦形剤、界面活性剤、高分子量構造付加剤及び／又は増量剤を含み得る（例えば、米国特許第６，６８５，９４０号、第６，５６６，３２９号、及び第６，３７２，７１６号を参照されたい）。

組成物は、非経口投与に適していることができる。例示的な組成物は、関節内経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、脳内（くも膜下内）経路、脳室内経路、筋肉内経路、眼内、動脈内、病変内経路のような、当業者に利用可能な何らかの経路による、動物への注射又は注入に適している。非経口製剤は典型的には、医薬として許容され得る防腐剤を任意に含有している、滅菌済みの、発熱物質非含有の、等張性水溶液であろう。

非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性担体には、塩類溶液及び緩衝媒体を含む、水、アルコール溶液／水溶液、エマルション又は懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化リンガー液、又は不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養物質の補液、リンガーデキストロースに基づいた補液のような電解質の補液、ならびにこれらに類するものが含まれる。例えば、抗菌薬、抗酸化物質、キレート剤、不活性ガス及びこれらに類するもののような、防腐剤及び他の添加剤も存在し得る。概して、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１６版，Ｍａｃｋ編，１９８０を参照されたい。

本明細書で説明される医薬組成物は、特定の局所環境における生成物の局所濃度（例えば、ボーラス、デポー作用）及び／又は安定性もしくは半減期の増大を提供する様式で徐放性送達又は持効性送達のために製剤化することができる。当該組成物には、後にデポー注射として送達することのできる作用薬の徐放性又は持効性を準備するポリ乳酸、ポリグリコール酸などのようなポリマー化合物の粒子状調製物、ならびに生分解性マトリックス、注射可能な微小球、マイクロカプセル粒子、マイクロカプセル、生体分解可能な粒子ビーズ、リポソーム、及び植え込み可能な送達装置のような薬剤の粒子状調製物を用いた、本発明の抗体、結合フラグメント、核酸又はベクターの製剤が含まれることができる。

あるいは又は加えて、当該組成物は、本発明の抗体、結合フラグメント、核酸、又はベクターが吸収又は封入されたメンブレン、スポンジ、又は他の適切な材料の、罹患した領域への植え込みを介して、局所的に投与することができる。植え込み装置を使用する場合、当該装置は、何らかの適切な組織又は器官へと植え込まれることができ、本発明の抗体、結合フラグメント、核酸、又はベクターの送達は、ボーラスを介して直接、又は連続投与を介して、又は連続注入を用いるカテーテルを介して当該装置を通じて直接であることができる。

Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを含む医薬組成物は、例えば、乾燥粉末としてのように吸入用に製剤化されることができる。吸入溶液は、エアゾール送達用液化高圧ガス中に製剤化することができる。さらに別の製剤において、溶液は、霧状化され得る。

本開示の一態様は、疾患の治療における治療活性のある薬剤としてのＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの使用に関する。

本開示の別の態様は、タウオパチーの治療におけるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの使用に関する。Ｔａｕ封入体を含むことが説明されてきたタウオパチー（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａら．Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２３（２０１３）３４２−３４９）には、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン症−認知症合併症、好銀性粒子病、慢性外傷性脳症、皮質基底核変性、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、ＭＡＰＴ変異起因性１７番染色体連関型前頭側頭型認知症及びパーキンソン症、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、グアドループ島型パーキンソン症、筋緊張性ジストロフィー、脳内鉄蓄積を伴う神経変性、ニーマン・ピック病Ｃ型、神経原線維変化病併発性非グアマニアン型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソン症、プリオンタンパク質性脳アミロイド血管症、進行性皮質下神経膠症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、ＳＬＣ９Ａ６関連精神遅滞、亜急性硬化性全脳炎、変化のみの認知症、ならびに球状神経膠封入体を伴う白質タウオパチーが含まれる。

本開示の別の態様はしたがって、アルツハイマー病及び／又は進行性核上性麻痺の処置におけるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの使用に関する。

同様に、本開示は、タウオパチー、特にアルツハイマー病及び／又は進行性核上性麻痺を処置することを必要とする対象へ、治療活性のある量のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを投与することによって、タウオパチー、特にアルツハイマー病及び／又は進行性核上性麻痺を処置する方法にも関する。

本開示は、タウオパチー、特にアルツハイマー病及び／又は進行性核上性麻痺の処置のための薬剤の製造におけるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの使用にも関する。

本開示の別の態様において、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、療法において単独で又は他の薬剤との組み合わせでのいずれかで使用され得る。例えば、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、少なくとも１つの追加の治療薬と併用投与され得る。ある特定の態様において、追加の治療薬は、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが処置するために使用中であるのと同じ又は異なる障害を処置するのに情動的な治療薬である。例示的な追加の治療薬には、コリンエステラーゼ阻害薬（ドネペジル、ガランタミン、ロバスチグミン、及びタクリンのような）、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（メマンチンのような）、アミロイドベータペプチド凝集阻害薬、抗酸化物質、ガンマ−セクレターゼ調節薬、神経成長因子（ＮＧＦ）模倣薬もしくはＮＧＦ遺伝子療法、ＰＰＡＲｙアゴニスト、ＨＭＳ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬（スタチン）、アンパキン、カルシウムチャネル遮断薬、ＧＡＢＡ受容体アンタゴニスト、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害薬、静脈内免疫グロブリン、ムスカリン性受容体アゴニスト、ニコチン性受容体調節薬、能動的又は受動的アミロイドベータペプチド免疫化、ホスホジエステラーゼ阻害薬、セロトニン受容体アンタゴニスト及び抗アミロイドベータペプチド抗体又はさらなる抗タウ抗体が含まれるが、これらに限定されない。追加の例示的な神経学的薬剤は、成長ホルモン又は神経栄養因子から選択され得、例としては、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン４型／５型、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）２型及び他のＦＧＦ、ニューロトロフィン（ＮＴ）３型、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞成長宇因子（ＨＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ），トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）アルファ、ＴＧＦベータ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン１型受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン、パーセフィン、インターロイキン類、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＦＲ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ、ネトリン、カルジオトロフィン１型、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミドカイン、プレイオトロフィン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン類、サポシン類、セマフォリン、ならびに幹細胞因子（ＳＣＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、当該少なくとも１つの追加の治療薬は、神経学的薬剤の１つ以上の副作用を軽減する能力について選択される。先に記載されたこのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療薬が同じ又は別個の製剤に含まれる場合）、及び個別投与を包含し、いずれの場合においても、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの投与は、追加の治療薬及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与後に生じることができる。Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントは、当該技術分野で公知の及び処置又は予防されることになっている神経学的障害に適切な、放射線療法、行動療法、又は他の療法のような、しかしこれらに限定されない他の介入療法と併用することもできる。

本開示の別の態様は、診断活性のある薬剤としてのＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの使用に関する。

本開示の一態様は、タウオパチー、特にアルツハイマー病及び／又は進行性核上性麻痺の診断におけるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの使用にも関する。

このような診断検査は好ましくは、生物試料に関して実施され得る。「生物試料」は、個体から得られた種々の試料タイプを包含し、診断アッセイ又はモニタリングアッセイにおいて使用することができる。当該定義は、脳脊髄液、血液及び生物起源の他の液体試料、生検標品もしくは組織培養物又はそれらから得られる細胞及び当該細胞の後代のような固体組織試料を包含する。当該定義には、試薬を用いた処置、可溶化、又はポリヌクレオチドのようなある特定の成分についての濃縮などによる、当該試料の獲得後に何らかの方法で操作されたものも含まれる。「生物試料」という用語は、臨床試料を包含し、これには培養物、細胞上清、細胞可溶化液、血清、生物流体、及び組織試料における細胞も含まれる。「生物試料」という用語には、尿、唾液、脳脊髄液、血漿及び血清のような血液画分、ならびにこれらに類するものが含まれる。

診断検査は好ましくは、ヒト又は動物の身体と接触していない生物試料に関して実施され得る。このような診断検査は、インビトロ検査とも呼ばれる。

インビトロ診断検査は、ｉ）生物試料を本明細書に説明されるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントと接書させるステップ、ならびにｉｉ）Ｔａｕに対する本明細書で説明されるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの結合を検出するステップを含む、個体から得られた生物試料におけるＴａｕを検出するインビトロ法に寄り得る。検出されたＴａｕレベルを適切な対照と比較することによって、次に、アルツハイマー病及び／又は進行性核上性麻痺のようなタウオパチーの存在又は発症見込みを診断することができる。このような検出方法はしたがって、対象がタウオパチーに罹患しているかどうか、又はタウオパチーを発症する危険にあるかどうかを、タウオパチーの病期（重症度）を判定することを含めて判定するために使用することができる。

本開示はしたがって、ｉ）本明細書で説明されるＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを使用することによって、対象から得た生物試料におけるＴａｕのレベル又は状態を評価するステップ、及びｉｉ）Ｔａｕのレベル又は状態を、基準値、標準値、又は正常対照対象におけるＴａｕのレベルもしくは状態を示す正常対照値と比較するステップを含む、対象におけるアルツハイマー病及び／又は進行性核上性麻痺のようなタウオパチーを診断するインビトロ法を提供する。Ｔａｕポリペプチドのレベル及び／又は状態の、生物試料と正常対照値の間の有意差は、個体がアルツハイマー病及び／又は進行性核上性麻痺のようなタウオパチーに罹患していることを示す。

本明細書で説明してきたこれらの種々の態様及び実施形態に関して、本開示はとりわけ、以下を熟慮する。

１．分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントであって、
配列番号１もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号２もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、及び配列番号３もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を含む軽鎖可変部、ならびに／又は
配列番号４もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号５もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、及び配列番号６もしくはそれと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を含む重鎖可変部
を含む、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。

２．配列番号１から選択されるＣＤＲ１、配列番号２から選択されるＣＤＲ２、及び配列番号３から選択されるＣＤＲ３を含む軽鎖可変部、ならびに
配列番号４から選択されるＣＤＲ１、配列番号５から選択されるＣＤＲ２、及び／又は配列番号６から選択されるＣＤＲ３を含む重鎖可変部
を含む、実施形態１に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。

３．配列番号５のＸ_１は、Ａである、実施形態１又は２に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。

４．配列番号５のＸ_１は、Ｔである、実施形態１又は２に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。

５．モノクローナル抗体である、実施形態１、２、３、又は４のいずれか１つに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。

６．キメラ、ヒト化又は完全にヒトの抗体である、実施形態５に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。

７．ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブタイプのヒト化抗体である、実施形態６に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。

８．配列番号３５のＡ２４６、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ｓ２３８のアミノ酸残基を含むエピトープへ結合する、実施形態１、２、３、４、５、６、又は７のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
９．アミノ酸残基Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ａ２４６ならびに配列番号３５のＳ２３５、Ｓ２３７、Ｋ２４０、Ｒ２４２、Ｌ２４３、Ｑ２４４、Ｖ２４８、及びＭ２５０から選択される１つ以上の残基を含むエピトープへ結合する、実施形態１、２、３、４、５、６、７、又は８のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。

１０．可溶性ヒトＴａｕへ結合する、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、又は９のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
１１．ヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）へ結合する、実施形態１、２、３、４、５、６、６、７、８、又は９のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。

１２．可溶性ヒト及びヒトＴａｕのらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の両方へ結合する、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、又は９のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
１３．配列番号７又はそれと少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号８又はそれと少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖可変部
を含む、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
１４．配列番号７を含む軽鎖可変部、及び
配列番号８を含む重鎖可変部
を含む、実施形態１３に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
１５．配列番号８のＸ_１は、Ａである、実施形態１３、又は１３に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
１６．配列番号８のＸ_１は、Ｔである、実施形態１３、又は１３に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
１７．モノクローナル抗体である、実施形態１３、１４、１５、又は１６のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
１８．キメラ抗体である、実施形態１７に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
１９．配列番号３５のＡ２４６、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ｓ２３８のアミノ酸残基を含むエピトープへ結合する、実施形態１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
２０．アミノ酸残基Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ａ２４６ならびに配列番号３５のＳ２３５、Ｓ２３７、Ｋ２４０、Ｒ２４２、Ｌ２４３、Ｑ２４４、Ｖ２４８、及びＭ２５０から選択される１つ以上の残基を含むエピトープへ結合する、実施形態１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
２１．可溶性ヒトＴａｕへ結合する、実施態様１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
２２．ヒトＴａｕのらせん状フィラメント（ＰＨＦ）へ結合する、実施形態１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
２３．可溶性ヒト及びヒトＴａｕのらせん状フィラメント（ＰＨＦ）へ結合する、実施形態１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
２４．配列番号９もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号１０もしくはそれと少なくとも８０％同一である配列を含む重鎖可変部
を含む、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
２５．配列番号９を含む軽鎖可変部、及び
配列番号１０を含む重鎖可変部
を含む、実施形態２４に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
２６．配列番号１０のＸ_３は、Ａである、実施形態２４、又は２５に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
２７．配列番号１０のＸ_３は、Ｔである、実施形態２４、又は２５に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
２８．重鎖可変部が、配列番号１１又は１２を含む、実施形態２４に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
２９．モノクローナル抗体である、実施形態２４、２５、２６、２７、又は２８のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
３０．ヒト化抗体である、実施形態２９に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
３１．ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブタイプである、実施形態３０に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
３２．配列番号３５のＡ２４６、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ｓ２３８のアミノ酸残基を含むエピトープへ結合する、実施形態２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３１のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
３３．アミノ酸残基Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ａ２４６ならびに配列番号３５のＳ２３５、Ｓ２３７、Ｋ２４０、Ｒ２４２、Ｌ２４３、Ｑ２４４、Ｖ２４８、及びＭ２５０から選択される１つ以上の残基を含むエピトープへ結合する、実施形態２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、又は３２のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
３４．可溶性ヒトＴａｕへ結合する、実施形態２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、又は３２のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
３５．ヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）へ結合する、実施形態２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、又は３２のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
３６．ヒトＴａｕの可溶性ヒト及び対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の両方へ結合する、実施形態２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、又は３２のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
３７．配列番号１４もしくはそれと少なくとも７０％同一である配列を含む軽鎖可変部、及び／又は
配列番号１５もしくはそれと少なくとも７０％同一である配列を含む重鎖可変部
を含む、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
３８．配列番号１４を含む軽鎖可変部、及び
配列番号１５を含む重鎖可変部
を含む、実施形態４７に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
３９．配列番号１５のＸ_３は、Ａである、実施形３７、又は３８に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
４０．配列番号１５のＸ_３は、Ｔである、実施形態３７、又は３８に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
４１．重鎖可変部が、配列番号１７又は１８を含む、実施形態３７に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
４２．モノクローナルヒト化抗体である、実施形態３７、３８、３９、４０、又は４１のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
４３．ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブタイプである、実施形態４２に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
４４．配列番号３５のＡ２４６、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ｓ２３８のアミノ酸残基を含むエピトープへ結合する、実施形態３７、３８、３９、４０、４１、４２、又は４３のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
４５．アミノ酸残基Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ａ２４６ならびに配列番号３５のＳ２３５、Ｓ２３７、Ｋ２４０、Ｒ２４２、Ｌ２４３、Ｑ２４４、Ｖ２４８、及びＭ２５０から選択される１つ以上の残基を含むエピトープへ結合する、実施形態３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、又は４４のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
４６．可溶性ヒトＴａｕへ結合する、実施形態３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、又は４５のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
４７．ヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）へ結合する、実施形態３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、又は４５のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
４８．ヒトＴａｕの可溶性ヒト及び対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の両方へ結合する、実施形態３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、又は４５のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
４９．配列番号３５のＡ２４６、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ｓ２３８のアミノ酸残基を含むエピトープへ結合する、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
５０．アミノ酸残基Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ａ２４６ならびに配列番号３５のＳ２３５、Ｓ２３７、Ｋ２４０、Ｒ２４２、Ｌ２４３、Ｑ２４４、Ｖ２４８、及びＭ２５０から選択される１つ以上の残基を含むエピトープへ結合する、実施形態４９に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
５１．モノクローナル抗体である、実施形態５０に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
５２．キメラ、ヒト化又は完全にヒトの抗体である、実施形態５０又は５１に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
５３．当該ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブタイプのモノクローナル抗体ヒト化抗体又はその結合フラグメントである、実施形態５２に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
５４．可溶性ヒトＴａｕへ結合する、実施形態５０、５１、５２、又は５３のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
５５．ヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）へ結合する、実施形態５０、５１、５２、又は５３のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
５６．ヒトＴａｕの可溶性ヒトＴａｕ及び対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の両方へ結合する、実施形態５０、５１、５２、又は５３のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
５７．Ｔａｕへの結合に対して、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、又は５６のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントと競合する、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
５８．Ｔａｕへの結合に対して、
配列番号９を含む軽鎖可変部、及び
配列番号１２又は１３を含む重鎖可変部
を含むＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントと競合する、実施形態５７に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
５９．実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、又は５６のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントと実質的に同じＴａｕエピトープへ結合する、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
６０．配列番号９を含む軽鎖可変部、及び
配列番号１２又は１３を含む重鎖可変部
を含むＴａｕ結合抗体又は結合フラグメントと実質的に同じＴａｕエピトープへ結合する、実施形態５９に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
６１．モノクローナル抗体である、実施形態５７、５８、５９、又は６０のいずれかに記載の分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
６２．キメラ、ヒト化又は完全にヒトの抗体である、実施形態６１に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
６３．ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブタイプのヒト化抗体である、実施形態６２に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
６４．配列番号３５のＡ２４６、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ｓ２３８のアミノ酸残基を含むエピトープへ結合する、実施形態５７、５８、５９、６０、６１、６２、又は６３のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
６５．アミノ酸残基Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ａ２４６ならびに配列番号３５のＳ２３５、Ｓ２３７、Ｋ２４０、Ｒ２４２、Ｌ２４３、Ｑ２４４、Ｖ２４８、及びＭ２５０から選択される１つ以上の残基を含むエピトープへ結合する、実施形態５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３又は６４のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
６６．可溶性ヒトＴａｕへ結合する、実施形態５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４又は６５のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
６７．ヒトＴａｕの対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）へ結合する、実施形態５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４又は６５のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
６８．ヒトＴａｕの可溶性ヒト及び対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）の両方へ結合する、実施形態５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４又は６５のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
６９．Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ及びＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｃ、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｃ、ｄｓｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ−ｓｃＦｃ、ダイアボディ、トライアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ、線形抗体、又はＶＨＨ含有抗体である、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、又は６８のいずれかに記載の分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
７０．実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、又は６９のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの軽鎖及び／又は重鎖をコードする、分離された核酸分子。
７１．実施形態７０に記載の１つ以上の核酸配列を含む、クローニングベクター又は発現ベクター。
７２．実施形態７０に記載の１つ以上の核酸配列又は実施形態７１に記載の１つ以上のクローニングベクターもしくは発現ベクターを含む、宿主細胞。
７３．ヒト胚性幹細胞ではない、実施形態７２に記載の宿主細胞。
７４．少なくとも
ａ）実施形態７２又は７３に記載の宿主細胞を培養するステップ、及び
ｂ）当該Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを分離するステップ
を含む、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、又は６９のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを生成する方法。
７５．治療活性のある薬剤としての使用のための、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、又は６８のいずれかに記載の分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
７６．タウオパチーを処置する上での使用のための、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、又は６８のいずれかに記載の分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
７７．当該タウオパチーは、アルツハイマー病である、実施形態７６に記載の使用のための、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
７８．当該タウオパチーは、進行性核上性麻痺である、実施形態７６に記載の使用のための、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
７９．処置する必要のある対象へ、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、又は６８のいずれかに記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを投与するステップを含む、タウオパチーを処置する方法。
８０．当該タウオパチーは、アルツハイマー病である、実施形態７９に記載の方法。
８１．当該タウオパチーは、進行性核上性麻痺である、実施形態７９に記載の方法。
８２．診断薬としての使用のための、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、又は６８のいずれかに記載の分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
８３．タウオパチーを診断する上での使用のための、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、又は６８のいずれかに記載の分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
８４．当該タウオパチーは、アルツハイマー病である、実施形態８３に記載の使用のための、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
８５．当該タウオパチーは、進行性核上性麻痺である、実施形態８３に記載の使用のための、分離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
さて、本発明は、制限するものとして解釈されることのない一部の実施例に関して説明される。

実験
実験１−Ｔａｕ結合抗体の作製
１．１ 組換えＴａｕ発現
ヒトＴａｕタンパク質は、２つの宿主系、大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ (ＤＥ３)及びＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚性腎臓細胞株）で発現された。Ｔａｕの４つの異なるアイソフォームが、大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）、アイソフォーム２、３、４＆５型及びＨＥＫ２９３細胞中の１つのアイソフォーム、アイソフォーム２型で産生された。産生された全ての発現ベクター及びタンパク質の完全な配列は、図５〜１４に含まれる。
大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）におけるＴａｕ産生
異なるＴａｕアイソフォームをコードする遺伝子を、合成的に作製し、コドンは大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）における発現のために最適化した。標準的な分子生物学技術を用いて、Ｎ末端６Ｈｉｓ−ＴＥＶ ｔａｇを有するＴａｕを精製するように操作された改変ｐＥＴ３２ベクター中にサブクローニングした。
大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞を、上記ベクターで形質転換し、タンパク質を、標準的な技術を用いて発現させた。
大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）を次に、遠心分離によって回収し、溶解し、Ｔａｕタンパク質を、ＮｉＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより可溶性画分から捕獲した。６Ｈｉｓ ｔａｇを、ＴＥＶプロテアーゼを使用して除去し、続いて第２のＮｉＮＴＡクロマトグラフィー工程を行った。精製されたＴａｕは、適用に応じて適切な緩衝液に緩衝液交換した。免疫化のために生成した試料は、Ｐｒｏｔｅｕｓ ＮｏＥｎｄｏ（商標）カラム（Ｖｉｖａｐｒｏｄｕｃｔｓ）を使用してエンドトキシン除去した。

核磁気共鳴（ＮＭＲ）のための同位体標識Ｔａｕの生成：
タンパク質発現を、タンパク質への１５Ｎ、１３Ｃ及び２Ｈの取り込みのために最小培地を使用したことを除いて、上記のように行った。大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）ペレットを溶解し、ＮｉＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）アフィニティークロマトグラフィー工程を使用してＴａｕタンパク質を精製し、６Ｈｉｓ ｔａｇをＴＥＶプロテアーゼで除去し、次にＴａｕタンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ユニット（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するゲルろ過により精製した。
ＨＥＫ２９３におけるＴａｕの生成
Ｔａｕアイソフォーム２型をコードする遺伝子を、野生型ＤＮＡ配列を使用して合成的に作製した。標準的な分子生物学技術を用いて、Ｎ末端１０Ｈｉｓ−ＴＥＶ ｔａｇ（配列番号５１）とのＴａｕを生成するように操作された発現ベクターｐＭＶ−１０ＨｉｓＴＥＶ（ＣＭＶプロモーターを含む）にサブクローニングした。
得られたベクターを、製造者のプロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を使用して形質転換した。このシステムは、ＨＥＫ２０３細胞株に由来するＥｘｐｉ２９３Ｆヒト細胞を使用する。
Ｔａｕタンパク質は、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｅｘｃｅｌ (ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)を使用して回収された培養培地中に蓄積した。次に１０Ｈｉｓ ｔａｇを、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに再適用し、フロースルーで切断されたＴａｕを回収する前に、ＴＥＶプロテアーゼを使用して除去した。精製されたＴａｕを、適用に応じて適切な緩衝液に交換した。

原繊維形成
４５０μＭでＴａｕタンパク質を、滅菌ろ過し、サーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して１．５ｍｌＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中で、７５０ｒｐｍ、３７℃で３１０時間振盪した。原繊維形成を、Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ−Ｔ色素を使用してモニターし、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ分光光度計（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で吸光度を読み取った。対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）形成を、陰性染色電子顕微鏡によって確認した。

１．２ 免疫化
１０匹の雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（２６０〜２８０ｇ）を、注射器で激しく混合することにより等量の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に乳化した５０μｇの組み換えＴａｕタンパク質で皮下的に免疫化した。ラットを、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いて、１４日間隔でブースター注射を行い、尾尻からも採血した。−８０℃のウシ胎児血清（ＦＣＳ）中の１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で調製及び凍結された脾臓及び骨髄の単細胞懸濁液を用いて最終ブーストの１４日後に終了した。組換えヒトＴａｕタンパク質を、免疫前にインビトロで精製および凝集した大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）で発現させた。可溶性Ｔａｕおよび不溶性原繊維を含むＴａｕの４つのアイソフォーム（２、３、４＆５型）の等モル混合物の最終サンプルを免疫化に使用した。

１．３ Ｂ細胞培養
Ｂ細胞培養物を、Ｚｕｂｌｅｒら（１９８５年）によって説明された方法と類似の方法を用いて調製した。簡潔には、免疫化したラットからのＰＢＭＣ由来Ｂ細胞を、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｌｔｄ）、２％ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、０．１％β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、３％活性化型脾細胞培養上清及びガンマ照射済み変異ＥＬ４ネズミ胸腺腫細胞（５×１０^４／ウェル）を補充した２００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いたバーコード入り９６穴組織培養プレート中に１ウェルあたりおよそ３０００細胞の密度で、３７℃、５％ＣＯ_２の雰囲気下で７日間培養した。総じて、およそ１．２×１０^８個のＢ細胞を採取した。

１．４ 一次スクリーニング
Ｂ細胞培養上清中のＴａｕ結合抗体の存在を、セクション１．１で説明したようにして得られたビオチン化可溶性又は不溶性Ｔａｕを用いてコーティングしたＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いる均質蛍光系結合アッセイを用いて判定した。発生したＴａｕは、可溶性画分及び不溶性画分の両方を有していた。不溶性Ｔａｕを、１０分間、１４，５００ＲＰＭで、ベンチトップＥｐｐｅｎｄｏｒｆミニスピンプラス遠心分離を使用して遠心分離で混合物から除去した。各画分を、製造元の指示に従って、ＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キットを使用して、別々にビオチン化した。可溶性ビオチン化画分を、製造元の指示に従って、Ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用して遊離ビオチンから除去した。不溶性画分を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆミニスピンプラス遠心分離機で１４，５００ＲＰＭで、１０分間、混合物を遠心分離し、それを１．５ｍｌリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し、５回このプロセスを繰りかえすことによって、遊離ビオチンから除去した。このアッセイは、可溶性Ｔａｕ形態又は不溶性Ｔａｕ形態のいずれかへ結合することを示す上清についてスクリーニングすることができた。１０μｌの上清を、Ｍａｔｒｉｘ Ｐｌａｔｅｍａｔｅ液体取り扱い装置を用いて、バーコード入り９６穴組織培養プレートから、ビーズ（１０μｌ／ウェル）上に免疫化した可溶性又は不溶性Ｔａｕを含むバーコード入りの３８４穴黒色壁アッセイプレート中へと転移させた。ヤギ抗ラットＩｇＧ Ｆｃγ特異的Ｃｙ−５共役体（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いて、結合を評価した。プレートをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ８２００細胞検出システム上で読み取った。

１．５ 二次スクリーニング
一次スクリーニング後、陽性上清を９６穴バーコード入りマスタープレートに、Ａｖｉｓｏ Ｏｎｙｘヒットピッキングロボットを用いてまとめ、細胞培養プレート中のＢ細胞を−８００℃で凍結させた。次に、マスタープレートを可溶性Ｔａｕ画分に関して、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてスクリーニングした。このことは、より厳格なスクリーニングにおいて、抗体がＴａｕに結合する能力を決定し、それらが一次スクリーニングにおいてビーズを結合していないことを確認するために行われた。ＥＬＩＳＡアッセイは、炭酸塩コーティング緩衝液（ｄＨ_２Ｏ＋０．１６％Ｎａ_２ＣＯ_３＋０．３％ＮａＨＣＯ３）中、３μｇ／ｍｌで可溶性Ｔａｕのコーティングを３８４穴Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｎｕｎｃ）上への可溶性Ｔａｕのコーティングを含む。プレートを、ＰＢＳ中１％ｗ／ｖカゼイン＋１％ｗ／ｖＢＳＡでブロックし、次に、Ｂ細胞培養上清と一緒にインキュベートした。二次ＨＲＰ共役したヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｓｔｒａｔｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ／Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をプレートへ添加した後、ＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製、１０μｌ／ウェル）を用いた結合の可視化を行った。光学密度を、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ２マイクロプレートリーダーを用いて６３０ｎＭで測定した。Ｔａｕに対する特異性を実証するＢ細胞上清を、可変領域回復のために選択した。

１．６ 可変部の回復
目的のウェルの選択からの抗体可変部遺伝子の回復を可能にするために、逆重畳積分のステップは、Ｂ細胞の異種性集団を含有する付与されたウェルにおける抗原特異的Ｂ細胞の同定を可能にするために実施しなければならなかった。このことは、蛍光焦点法（Ｃｌａｒｇｏら，２０１４年）を用いて達成された。簡潔には、陽性ウェルからの免疫グロブリン分泌Ｂ細胞を、ビオチン化可溶性Ｔａｕ及び１：１２００の最終希釈のヤギ抗ラットＦｃγフラグメント特異的ＦＩＴＣ共役体（Ｊａｃｋｓｏｎ）でコーティングしたストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と混合した。３７℃で１時間の静的インキュベーション後、抗原特異的Ｂ細胞を、当該Ｂ細胞を取り囲む蛍光ハローの存在により識別することができた。次に、Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を用いて識別したこれらの個々のＢ細胞を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微小操作装置を用いて拾い、ＰＣＲチューブへと入れた。

抗体可変部遺伝子を、重鎖及び軽鎖の可変部に特異的なプライマーを用いる逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによって単一細胞から回収した。２回のＰＣＲをＡｖｉｓｏ Ｏｎｙｘ液体取り扱いロボット上で実施し、入れ子状態になった２回目のＰＣＲは、マウスγ１ ＩｇＧ（ＶＨ）又はマウスカッパ（ＶＬ）哺乳類発現ベクターへと可変部のクローニングを可能にする３’末端及び５’末端における制限部位を組み込んだ。重鎖及び軽鎖のコンストラクトを、Ｆｅｃｔｉｎ ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ−２９３細胞中へと同時トランスフェクトし、組換え抗体を１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中で３０ｍｌの容積で発現させた。５〜７日間の培養後、上清を収集し、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。

実験２−識別した抗体のさらなるスクリーニング
２．１ ＰＨＦ調製
対形成したらせん状フィラメント（ＰＨＦ）−Ｔａｕタンパク質を、アルツハイマー病又は進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）又は前頭側頭型認知症に罹患しているドナー由来の脳試料から、Ｋｓｉｅｚａｋ−Ｒｅｄｉｎｇ及びＷａｌｌ（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ １５，１１−１９，１９９４）によって公開されたプロトコルにより精製した。ＰＨＦ−Ｔａｕが豊富であることがすでに説明されてきた画分８（この参照におけるスクロース勾配遠心分離前の粗ＰＨＦ−Ｔａｕに相当する）及び画分１１（画分Ａ２に相当する、この参照において説明されるＳＤＳ可溶性ＰＨＦ）を回収し、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ及び実験３の細胞アッセイに使用した。

２．２ ＥＬＩＳＡスクリーニング
ＥＬＩＳＡアッセイはまた、可溶性Ｔａｕの、炭酸塩コーティング緩衝液（ｄＨ_２Ｏ＋０．１６％Ｎａ_２ＣＯ_３＋０．３％ＮａＨＣＯ_３）中の３μｇ／ｍｌで３８４穴Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｎｕｎｃ）上への捕捉を包含した。プレートをＰＢＳ中１％ ｗ／ｖカゼイン＋１％ ＢＳＡでブロッキングし、次に、１０μｌ／ウェル精製抗体を用いてインキュベートした。二次ＨＲＰ共役型ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｓｔｒａｔｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ／Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をプレートへ添加した後、ＨＲＰ基質ＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製、１０μｌ／ウェル）を用いて結合を可視化した。光学密度を、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ２マイクロプレートリーダーを用いて、６３０ｎＭで測定した。

２．３ ＢＩＡｃｏｒｅスクリーニング
選択されたモノクローナルＦａｂフラグメント（ｍＦａｂ）を、製造元のプロトコルに従って、Ｐｉｅｒｃｅ Ｆｉｃｉｎ開裂キット（カタログ番号４４９８０，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、キメラｍＩｇＧＩ抗体から調製した。

２８０ｎｍでの吸光度を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ分析のためのＦａｂストック溶液の濃度を測定した。アルツハイマー病患者由来の不溶性Ｔａｕタンパク質調製物（ＡＤ−ＰＨＦ、画分１１）、ＨＥＫ由来のＴａｕアイソフォーム２型モノマー（アミノ酸１〜４４１）、及び大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）において発現したアイソフォーム２型モノマーをＣＭ５チップ上へとアミン固定し、抗Ｔａｕ ｍＦａｂの結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機を用いて測定した。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製の緩衝液ＨＢＳ−ＥＰを、１０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．０）を使用するＡＤ−ＰＨＦを除き、固定に使用した。ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液に３００ｍＭ ＮａＣｌ及び１．２５％ＣＭ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ）を補充し、アッセイ緩衝液として使用した。浮遊細胞（Ｆｃ）１を参照として使用したのに対し、以下のＲＵ値、すなわち、５ｕｇ／ｍｌの大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）Ｔａｕによる４４ＲＵ、５ｕｇ／ｍのＨＥＫ Ｔａｕによる５６ＲＵ、及びＡＤ−ＰＨＦ材料の１：２０希釈溶液による５００ＲＵをＦｃ２〜４について得た。１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．７）の２回の６０秒間周期を再生に使用した。１０ｕｌ／分の流量を固定及び再生に使用したのに対し、３０ｕｌ／分の流量を分析物の結合に使用した。ＡＤ−ＰＨＦのために、複数回の手動注入を適用して、５００ＲＵに到達し、ＥＤＣ／ＮＨＳ及びＥからＡへのキャッピングを含んだ。５回の開始周期及びｍＦａｂ試料又は緩衝液対照あたり１２回の周期を適用し、解離については１８０秒間又は３００秒間のいずれかの９０ｕｌ分析物注入を用いた。６００ｎＭ溶液プラス緩衝液の１１１：３の希釈を各ｍＦａｂについて使用した。ＡＢ１を、ＢＩＡｃｏｒｅ試験を使用して分析した。

結果を表１に示すが、これは、配列番号７のラットＶＬ及び配列番号８のラットＶＨを有するｍＦａｂ ＡＢ１のが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された単量体Ｔａｕアイソフォーム２型、及びアルツハイマー病患者由来の単離されたＴａｕ ＰＨＦ原繊維（凝集Ｔａｕ）への結合することを示す。ＡＢ１及び先に参照した先行技術の抗体の結合プロファイルを、表３に示す。

実験３−識別した抗体のさらなる特徴づけ
３．１ 細胞アッセイ
Ｔａｕ凝集を誘導するための、Ｔａｕトランスジェニックマウスからの粗可溶性画分及び粗不溶性画分の調製
これらの実験について、ヒトＴａｕＰ３０１Ｓ（Ａｌｌｅｎら，２００２ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２（２１）：９３４０−５１）及びＰ３０１Ｌ（Ｌｅｗｉｓら，２０００ Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．（４）：４０２−５、Ｇｏｔｚ Ｊら，２００１ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６（１）：５２９−３４）を発現するトランスジェニックマウスを使用した。

粗可溶性画分及び粗不溶性画分を、Ｐ３０１Ｓ及びＰ３０１ＬのＴａｕトランスジェニックマウスの脳から、差次的遠心分離によって調製した。簡潔には、Ｐ３０１Ｓ（脊髄及び脳幹）及びＰ３０１Ｌ（中脳及び脳幹）のＴａｕトランスジェニックマウス由来の脳組織を氷冷ＴＢＳ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、把持型のホモジナイザーであるＰｅｌｌｅｔ Ｐｅｓｔｌｅ Ｍｏｔｏｒ（Ｋｏｎｔｅｓ）を用いて、氷上の１．５ｍｌ微量遠心分離チューブ中で均質化した。次に、均質液（Ｈ）を４℃、４，０００ｇで１０分間遠心分離して、細胞デブリを除去した。結果として生じる上清（Ｓ０）を４℃、２０，０００ｇで２０分間遠心分離して、粗可溶性画分（Ｓ１）に対応する上清を提供した。残存するペレット（Ｐ１）を、ＴＢＳ中で調製した１ｍｌの１％サルコシル溶液中に再懸濁し、室温で１時間インキュベートした後、４℃、１００，０００ｇで１時間遠心分離した。上清（Ｓ２）を廃棄した。ペレット（Ｐ２）を５ｍｌの氷冷ＴＢＳで洗浄した後、ＴＢＳ中に再懸濁して、粗不溶性画分（Ｐ２’）を提供した。

Ｐ３０１Ｓ変異を有するヒトＴａｕを発現するＨＥＫ−２９３−Ｆ細胞の調製
ＨＥＫ−２９３−Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、Ｐ３０１Ｓ変異を有するヒトＴａｕアイソフォーム２型を発現するｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを、２９３フェクチン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造元の説明書によりトランスフェクトした。一定分量のトランスフェクトした細胞を液体窒素中で保存した。

Ｔａｕ凝集の誘導
図３は、Ｔａｕ治療用抗体の活性を特徴づけるために使用される細胞凝集アッセイの異なるステップを示す。１日目に、Ｐ３０１Ｓ変異を有するヒトＴａｕアイソフォーム２型を発現するＨＥＫ−２９３−Ｆ細胞（Ｐ３０１Ｓ−ｔａｕ）を３７℃で解凍し、１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＦＦＢＳ）を含有する２９３発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に希釈した。細胞を自動細胞計数機（Ｖｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて計数した後、ウェルあたり２５，０００個の生細胞密度で、ポリ−Ｄ−リジンでプレコーティングしておいた９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）の中に播種した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で維持した。同日、アルツハイマー病患者（ＡＤ−ＰＨＦ、画分８）又は進行性核上性麻痺患者（ＰＳＰ−ＰＨＦ、画分８）又は前頭側頭型認知症（ＦＴＤ−ＰＨＦ）又はＰ３０１ＳもしくはＰ３０１Ｌのトランスジェニックマウス脳に由来する脳画分（Ｔａｕ凝集を誘導するためのシードとして使用）からの超音波処理されたヒト不溶性Ｔａｕを、４℃のＦＦＢＳ培地中で抗Ｔａｕ抗体ととともに又はそれなしで、緩徐に撹拌しながら一晩インキュベートした。ＡＤ−ＰＨＦ（画分８）をＡＤ試料及びＰＳＰ試料についてそれぞれ８０ｎｇ／μｌ及び６０ｎｇ／μｌで使用し、トランスジェニックマウスＰ３０１Ｓ及びＰ３０１Ｌ由来の可溶性能画分をそれぞれ０．１μｇ／μｌ、１．２μｇ／μｌで使用した。２日目に、シード又はシード／抗体混合物を細胞へ２４時間適用した。３日目に、培地を、抗体を含有する新鮮ＦＦＢＳ培地と交換し、細胞を培養物中でさらに２４時間維持した。４日目に、Ｔａｕ凝集を、均質時間分解性蛍光エネルギー転移（ＨＴＲＦ）を基にしたＴａｕ凝集アッセイキット（Ｃｉｓｂｉｏ）を用いて、製造元の説明書により測定した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐａｄａｄｉｇｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて蛍光を測定した。凝集を、抗体の非存在下で外来性の原線維又は画分によって誘導される最大凝集応答に相当する、対照（−）に対する％凝集として報告した。誘導したＴａｕ凝集に及ぼすＡＢ１及び従来技術の他のＴａｕ結合抗体の効果を検査した。従来技術の抗体は、ＷＯ２０１４/０２８７７７Ａ２のＩＰＮ００２、ＷＯ２０１３／０９６３８０Ａ２のＰＴ３、ＷＯ２０１０／１４２４２３Ａ２のｍＡｂ２．１０．３、及びＷＯ ２０１４／００８４０４のＨＪ８．５とした。

本アッセイの結果を表２及び図４に要約する。

表２は、配列番号７のラットＶＬ及び配列番号８のラットＶＨを有するＡＢ１、配列番号１４の軽鎖及び配列番号１７の重鎖を有するＴａｕ結合抗体（Ｌ１４Ｈ１７）、配列番号１４の軽鎖及び配列番号１８の重鎖を有するＴａｕ結合抗体（Ｌ１４Ｈ１８）、ならびに種々の脳抽出物由来のＴａｕシードの範囲に対する競合抗体に関する効力（ＩＣ_５０）及び最大有効性（３００ｎＭにおけるＩ_ｍａｘ）を要約する。図４は、ヒトＡＤ患者由来のヒトＴａｕ病理学的原繊維を用いた細胞凝集アッセイにおける配列番号１４の軽鎖及び配列番号１７の重鎖を有するＴａｕ結合抗体（Ｌ１４Ｈ１７）の、ならびに配列番号１４の軽鎖及び配列番号１８の重鎖を有するＴａｕ結合抗体（Ｌ１４Ｈ１８）の有効性を示す。

３．２ 組織学的分析
配列番号７のラットＶＬ及び配列番号８のラットＶＨを有するＡＢ１ならびに従来技術の抗体ＩＰＮ００２、ＰＴ３及びＭａｂ２．１０．３をアッセイして、病理学的Ｔａｕ構造を含有することがＡＴ８免疫染色を用いて既に示されてきたアルツハイマー疾患に罹患しているドナー由来のヒト海馬の凍結切片を用いて至適濃度を判定した（Ｂｒａａｋ及びＢｒａａｋ，１９９５年，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ； １６（３）：２７１−８において説明されるように）。ＡＢ１抗体及び全部の従来技術の抗体は、１０１．４（陰性対照抗体）を除き、特異的なかつ濃度依存的な免疫反応性を呈した。これらのデータから、抗体の単一の至適濃度を選択し、６個のヒト脳試料のパネルをスクリーニングするために使用した。３個の試料は、アルツハイマー病に罹患しているドナー又は高レベルのＴａｕ病理（ＡＴ８免疫染色を用いて検出された陽性Ｔａｕ病理）を呈する非常に高齢のドナーから得、３個はＴａｕ病理に罹患していない（ＡＴ８免疫染色を用いて検出された陰性Ｔａｕ病理）ドナーから得た。

ＡＢ１及びＩＰＮ００２は、Ｔａｕ陽性病理試料内で、神経原繊維変化（ニューロン内ＮＦＴ）の特異的免疫染色、神経原繊維変化（ニューロン内ＮＦＴ）、老人斑様構造及び神経絨毛糸の細胞質染色を示した。それらはまた、Ｔａｕ陰性病理で分類された試料で免疫染色を示した。
実験２及び３の結果を、以下の表２及び３に要約する。

３．３ ウエスタンブロット
化学発光読み出しを用いて実施したウエスタンブロット：ＡＤ、ＰＳＰ又は対照ヒトから調製したホモジネートを１０％ポリアクリルアミドゲルへと充填した（レーン当たり２０μｇタンパク質）。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法）によって分離し、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオリド）膜上へと電気泳動で転写した。膜を４％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン（ＴＢＳＴ溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＨＣｌを用いてｐＨをｐＨ７．６に調整）中でブロッキングした。膜を４℃で一晩、一次抗体又は非免疫ＩｇＧ対照抗体とともにインキュベートし、ＴＢＳＴですすぎ、二次抗体とともに１時間インキュベートし（マウス抗ビオチン）、ＴＢＳＴですすぎ、三次抗体とともに１時間インキュベートし（抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼ）、ＴＢＳＴですすぎ、ＥＣＬ（増強化学発光法）、すなわち２〜５分間のフィルム露光を用いて発光させた。

あるいは、ウエスタンブロットを、蛍光読み取りを使用して実施した：ｔａｕトランスジェニックマウス又はＡＤ−ＰＨＦ画分８からのホモジネート（Ｈ）、可溶性（Ｓ１）及び不溶性（Ｐ２’）画分を、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に充填し、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。分離したタンパク質を、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ (Ｂｉｏ−Ｒａｄ)を使用して、ポリビニリデンフルオリド膜上に電気転写した。膜を、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ブロッキング緩衝液（ＬＩ−ＣＯＲ）でブロックし、０．１％Ｔｅｅｎ−２０を含む同じ緩衝液中で希釈した異なる一次抗体で４℃で一晩インキュベートした。ＩＲＤｙｅ第二抗体を、０．１Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．０１％ＳＤＳを含む、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ブロッキング緩衝液（１：５，０００；ＬＩ−ＣＯＲ）に希釈し、室温で、１時間インキュベートし、視覚化を、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用して実施した。ＶＲ４２９５（ＵＣＢ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｓ.Ｐ.Ｒ.Ｌ）、ＩＰＮ００２、ＰＴＲ３及びＭａｂ２.１０．３抗体を、０．１〜１μｇ／ｍｌで使用した。抗ｔａｕ ｐＳ２０２/Ｔ２０５(ＡＴ８； Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)、抗Ｔａｕ ｐＴｈｒ２３１(ＡＴ１８０； Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)及び抗総Ｔａｕ(ＨＴ７； Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)を１：２００希釈で使用した。ローディングを制御するために、ブロットを、β−アクチン（１：２，０００；Ｓｉｇｍａ）について分析した。シグナル強度は、Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ ３．１(Ｌｉ−ＣＯＲ)を使用して定量化した。

配列番号７のラットＶＬ及び配列番号８のラットＶＨを有するＡＢ１ならびに配列番号１４の軽鎖及び配列番号１７の重鎖又は配列番号１４の軽鎖及び配列番号１８の重鎖を有するヒト化バージョンは、Ｐ３０１Ｓ及びＰ３０１Ｌトランスジェニックマウス及びヒトＡＤ、ＰＳＰ及び対照患者の試料由来の病理学的Ｔａｕへ結合する。全ての３つの抗体は、ウエスタンブロットによる結合の類似のパターンを示し、ＡＤ及びＰＳＰで、ＡＤ及びＰＳＰ由来の病理学的Ｔａｕに対応する５０及び７５ｋＤａの間の典型的なバンドパターンを示す（図５参照）。ＩＰＮ００２は、同様の挙動を示したが、ＰＴＲ３及びＭａｂ２.１０．３抗体は、Ｐ３０１Ｓ及びＰ３０１Ｌトランスジェニックマウス由来の病理学的Ｔａｕに結合し、ヒトＡＤを弱く結合するが、ウエスタンブロットによって異なるパターンを示す。陰性対照１０１．４及びＡ３３抗体は、有意なシグナルを示さなかった。アクチンを、充填対照として使用した。

３．４ ＡＢ１のエピトープの定義
配列番号７のＶＬ及び配列番号８のＶＨを有する抗体ＡＢ１のエピトープ結合を、抗体のＦａｂフラグメントを使用する異核単一量子コヒーレンス核磁気共鳴（ＨＳＱＣ ＮＭＲ）を使用して、決定した。

Ｔａｕアイソフォーム４型の骨格割り当て
ＮＭＲ試料は、Ｓｈｉｇｅｍｉチューブ中の２７０μＭの^２Ｈ／^１３Ｃ／^１５Ｎ標識ヒトＴａｕアイソフォーム４型のタンパク質濃度の容量で典型的には３５０μｌであった。５ｍｍ緩衝液条件は、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．４、１０μＭ ＡＥＢＳＦ、０．０２％ＮａＮ_３であった。全ての実験は、低温冷却プローブを取り付けた６００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ ＤＲＸ又は８００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ分光器のいずれかで２０℃を記録した。タンパク質、Ｈ_Ｎ(ｉ)−Ｎ(ｉ)−Ｎ(ｉ±１)中の残基の骨格ＮＭＲシグナル間の逐次的接続を、１６４０、１６４０及び７０００Ｈｚのスペクトル幅及び１２０ (Ｆ１)、１２０(Ｆ２)及び１５０(Ｆ３)ｍｓの時間間隔で記録され、ならびにインクレメント毎に８スキャン及び１．５秒の緩和遅延を伴う、それぞれ^１５Ｎ、^１５Ｎ及び^１Ｈ次元において、３Ｄ (Ｈ)Ｎ(ＣＡ)ＮＮＨ実験（Ｗｅｉｓｅｍａｎら、１９９３年 ３Ｄ Ｔｒｉｐｌｅ―ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ＮＭＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ＮＨ ａｎｄ １５Ｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ ｉｎ １５Ｎ― ａｎｄ １３Ｃ―ｌａｂｅｌｌｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ.（１５Ｎ及び１３Ｃ標識タンパク質におけるＮＨ及び１５Ｎ共鳴の逐次割り当てのための３Ｄ三重共鳴ＮＭＲ技術） Ｊ. Ｂｉｏｍｏｌ. ＮＭＲ ３. ｄｏｉ：１０．１００７／ＢＦ００２４２４７９）を使用して行った。不均一試料を、３．５日の合計取得時間を与える１３％のサンプリング密度（４００００個の多元点のうち５２００個）で行った。連続した接続が確認され、残基のタイプを、ＨＮＣＡ（Ｇｒｚｅｓｉｅｋ及びＢａｘ、１９９２年 Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ３Ｄ ｔｒｉｐｌｅ−ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ＮＭＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｐｐｌｉｅd ｔｏ ａ ３１ ｋＤａ ｐｒｏｔｅｉｎ.（３１ｋＤａタンパク質に適用される改良された３Ｄ三重共鳴ＮＭＲ技術） J. Ｍａｇｎ. Ｒｅｓｏｎ. ９６, ４３２−４４０. ｄｏｉ：１０．１０１６／００２２−２３６４(９２)９００９９―Ｓ）及びＨＮＣＡＣＢ（Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ及びＭｕｅｌｌｅｒ, １９９３年 ＨＮＣＡＣＢ, ａ Ｈｉｇｈ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ３Ｄ ＮＭＲ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｔｏ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅ Ａｍｉｄｅ−Ｐｒｏｔｏｎ ａｎｄ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ａｌｐｈａ− ａｎｄ Ｂｅｔａ−Ｃａｒｂｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ.（ＨＮＣＡＣＢ、タンパク質におけるα−及びβ−炭素共鳴との相関アミド−たんぱく質及び窒素共鳴に対する高感度３Ｄ ＮＭＲ実験） Ｊ. Ｍａｇｎ. Ｒｅｓｏｎ. Ｓｅｒ. Ｂ １０１, ２０１-２０５. ｄｏｉ：１０．１００６／ｊｍｒｂ.１９９３．１０３３）実験を使用して同定した。ＨＮＣＡ実験は、それぞれ^１５Ｎ、^１３Ｃ及び^１Ｈ次元で、１６４０、４８３０及び６６００Ｈｚのスペクトル幅及び２４（Ｆ１）、６．６（Ｆ２）及び８０（Ｆ３）ｍｓの取得時間で記録したが（増加あたり８スキャン、１．５秒緩和遅延、１９時間総取得時間）、ＨＮＣＡＣＢは、それぞれ^１５Ｎ、^１３Ｃ及び^１Ｈ次元で、９８００、１６４０及び６６００Ｈｚのスペクトル幅及び６(Ｆ１)、２４(Ｆ２)及び８０(Ｆ３)ｍｓの取得時間で記録した（増加あたり８スキャン、１．５秒緩和遅延、１．５日総取得時間）。ＮＭＲスペクトルを、Ｈａｒｖａｒｄ反復ソフト閾値処理法を使用して実施されたＮＵＳデータの再構成を伴うＮＭＲＰｉｐｅ（Ｄｅｌａｇｌｉｏら、１９９５年 ＮＭＲＰｉｐｅ: ａ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＵＮＩＸ（登録商標） ｐｉｐｅｓ. Ｊ. Ｂｉｏｍｏｌ. ＮＭＲ ６, ２７７−９３）を使用して処理した（Ｈｙｂｅｒｔｓら、２０１２年）。データ分析を、Ｓｐａｒｋｙ（Ｇｏｄｄａｒｄ及びＫｎｅｌｌｅｒ, , Ｄ. Ｇ. ＳＰＡＲＫＹ ３. Ｉｎ., Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ, Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）を使用して実施し、残基の９６％に相当する３０４残基のアミドプロトン及び窒素源（プロリン残基及びＮ末端グリシンを除く）の割り当てを得た。

ＡＢ１の結合部位のマッピング：
ＡＢ１の結合部位のマッピングを、８０〜１５０μＭの濃度範囲で、対応するＡＢ１ Ｆａｂの１０％モル過剰を含む^２Ｈ／^１３Ｃ／^１５Ｎ標識ヒトＴａｕアイソフォーム４型の試料を使用して行った。試料を、Ｔａｕの骨格割り当てについて上記と同じ緩衝液中で調製した。^１Ｈ、^１５Ｎ及び^１３Ｃの化学シフトの変化を、Ｔａｕ／Ｆａｂ複合体試料並びに遊離Ｔａｕの試料（上記）に記録されたＨＮＣＯ（Ｇｒｚｅｓｉｅｋ及びＢａｘ, １９９２年 Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ３Ｄ ｔｒｉｐｌｅ―ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ＮＭＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ａ ３１ ｋＤａ ｐｒｏｔｅｉｎ. Ｊ. Ｍａｇｎ. Ｒｅｓｏｎ. ９６, ４３２−４４０. ｄｏｉ：１０．１０１６/００２２−２３６４(９２)９００９９−Ｓ）スペクトルから決定した。ＨＮＣＯ実験を、それぞれ^１５Ｎ、^１３Ｃ及び^１Ｈ次元において、２１９０、２２１０及び８８００Ｈｚのスペクトル幅及び２５(Ｆ１)、２９(Ｆ２)及び８０(Ｆ３)ｍｓの取得時間を用いて記録し（増加あたり８スキャン、１．８秒緩和遅延）、ＮＵＳは、２５〜３５％の思料密度を使用しており、総取得時間を６０時間から１５〜２１時間に短縮した。化学シフト変化を、最小シフトアプローチを用いて分析し（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、１９９７年 Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｆｏｒ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｎ―ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ―２ ｂｙ ＮＭＲ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｈｉｆｔ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ.（ＮＭＲ化学シフト摂動によるメタロプロテイナーゼ−２の組織阻害剤のＮ末端ドメイン上でのマトリックスメタロプロテイナーゼの結合部位のマッピング） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６, １３８８２−９. ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ９７１２０９１）、カルボニル化学シフトを含むあわせた化学シフト変化（Δδ）を計算するために使用される方程式の変更を除いて、本質的には、以前に記載されたとおりであり(Ｖｅｖｅｒｋら、２００８年 Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍＴＯＲ ｗｉｔｈ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ： ｃｏｍｐｅｌｌｉｎｇ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｃｅｎｔｒａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ＦＲＢ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ―ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａtion of mTOR.（ホスファチジン酸とのｍＴＯＲの相互作用の構造的禿頭付け及び阻害剤の新規クラス：ｍＴＯＲの小分子媒介調節におけるＦＲＢの中心的役割についての説得力のある証拠） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２７, ５８５-９５. ｄｏｉ：１０．１０３８/ｓｊ.ｏｎｃ.１２１０６９３)、以下ので得られる：

式中、Δδ_ＨＮ、Δδ_Ｎ及びΔδ_Ｃは、それぞれ^１Ｈ、^１５Ｎ及び^１３Ｃ化学シフトの差である。αＮ及びαＣは、アミドプロトン、窒素およびカルボニル化学シフトの化学シフト範囲で差を説明するために使用される、それぞれ０．２及び０．３５のスケーリング因子に相当する。

Ｔａｕ上のＦａｂ結合部位（エピトープ）を同定するために、組み合わされた最小配列対タンパク質配列のヒストグラムを、有意な摂動シグナルを含むＴａｕの領域を明らかにするために使用した。個々のアミノ酸の組み合わされた化学シフト変化のサイズが、全てのアミノ酸プラスその平均からの１つの標準偏差について組み合わされた化学シフトの平均の閾値を超える場合、これらの残基は、Ｆａｂ結合部位で可能性のある接触残基としてさらなる評価のために選択された。

有意に摂動された残基は、最小シフトが、平均プラス全ての計算されたシフトの１つの標準偏差より少なくとも大きいものとして同定された。４つの異なる閾値を適用して、Ｆａｂによって結合された残基を同定した。結合部位に関与する残基は、次のように増大するストリンジェンシーでスコアされる：最小シフトが、平均プラス全ての計算されたシフトの１つの標準偏差を超えるもの（＞０．００９８１７）；最小シフトが、平均プラス全ての計算されたシフトの２つの標準偏差を超えるもの（＞０．０１６９１３）；最小シフトが平均プラス全ての計算されたシフトの３つの標準偏差を超えるもの（＞０．０２４００９）；最小シフトが、全ての計算されたシフトの４つの標準偏差を超えるもの（＞０．０３１１０５）。この分析において、プロリン残基は、アミドプロトンを含有しないので、同定されることができない。

したがって、ＡＢ１ Ｆａｂのエピトープは、平均プラス全ての計算されたシフトの１つの標準偏差として増大したストリンジェンシーで定義される：Ａ２４６、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ｓ２３８、Ｓ２３５、Ｋ２４０、Ｑ２４４、Ｓ２３７、Ｖ２４８、Ｌ２４３、Ｍ２５０、Ｒ２４２；平均プラス全ての計算されたシフトの２つの標準偏差：Ａ２４６、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ｓ２３８、Ｓ２３５、Ｋ２４０、Ｑ２４４、Ｓ２３７；平均プラス全ての計算されたシフトの４つの標準偏差：Ａ２４６、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ｓ２３８。

ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００５９０１．２（配列番号３５）で使用されるアミノ酸番号付けを使用して、ＡＢ１は、少なくとも次の残基（平均＋３ＳＤ）Ａ２４６、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ｓ２３８、Ｓ２３５、Ｋ２４０、Ｑ２４４を結合することがわかった。抗体は、次の残基（平均＋１ＳＤ）Ａ２４６、Ａ２３９、Ｓ２４１、Ｔ２４５、Ｓ２３８、Ｓ２３５、Ｋ２４０、Ｑ２４４、Ｓ２３７、Ｖ２４８、Ｌ２４３、Ｍ２５０、Ｒ２４２の全てのｏｆｔｈｅを結合し得る。

実験４−同定された抗体のヒト化
配列番号７のＶＬ及び配列番号８のＶＨを有する抗体ＡＢ１を、ラット抗体Ｖ部由来のＣＤＲをヒト生殖系列抗体Ｖ部フレームワークへと移植することによってヒト化した。

抗体の活性を回復させるために、ラット又はウサギＶ部由来のいくつかのフレームワーク残基もヒト化配列において保有された。これらの残基を、Ａｄａｉｒら（１９９１年）（ヒト化抗体、ＷＯ９１／０９９６７）によって概略されるプロトコルを用いて選択した。ラット抗体（ドナー）Ｖ部配列とヒト生殖系列（アクセプター）Ｖ部配列との整列を図１、及び２に、設計したヒト化配列とまとめて示す。ドナーからアクセプター配列へと移植したＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、１９８７年）によって定義されるとおりであるが、例外はＣＤＲ−Ｈ１で、組み合わされたＣｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔ定義を使用する（Ａｄａｉｒら，１９９１年 ヒト化抗体、ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）。

ヒトＶ部ＩＧＫＶ２−２９プラスＪＫ２ Ｊ部（ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を抗体ＡＢ１軽鎖ＣＤＲのためのアクセプターとして選択した。移植片ｇＶＬ３＿ＡＢ１（配列番号１４）における軽鎖フレームワーク残基はすべて、ヒト生殖系列遺伝子に由来する。

ヒトＶ部ＩＧＨＶ４−５９プラスＪＨ３ Ｊ部（ＩＭＧＴ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）（配列番号３２）を、抗体ＡＢ１の重鎖ＣＤＲのアクセプターとして選択した。移植片ｇＶＨ１７＿ＡＢ１（配列番号１７）及びｇＶＨ１８＿ＡＢ１（配列番号１８）における重鎖フレームワーク残基はすべて、ヒト生殖系列遺伝子由来であるが、例外は、残基４８であり（Ｋａｂａｔの番号付け）、ここでは、ドナー残基であるメチオニン（Ｍ４８）保有していた。残基Ｍ４８の保持は、ヒト化抗体の完全な効力に必須であった。ヒトフレームワークの位置１におけるグルタミン残基をグルタミン酸（Ｅ１）と置き換えて、均質な生成物の発現及び精製を得た：抗体及び抗体フラグメントのＮ末端におけるグルタミンからピログルタミン酸への変換は、広く報告されている。配列番号３７及び３８のＣＤＲＨ２を、それぞれ移植片ｇＶＨ１７＿ＡＢ１及びｇＶＨ１８＿ＡＢ１において変異させ、潜在的な脱アミド化部位を修飾した。

抗体についていくつかのバリアントの重鎖及び軽鎖のＶ部配列をコードする遺伝子を、ＤＮＡ２．０ Ｉｎｃ．による自動化合成アプローチによって設計及び構築した。重鎖及び軽鎖のＶ部のさらなるバリアントを、潜在的な脱アミド化部位を修飾するためのＣＤＲ内での変異を一部の場合に含むオリゴヌクレオチド直接突然変異によってＶＨ遺伝子及びＶＫ遺伝子を修飾することによって作製した。哺乳動物細胞での一過性発現のために、ヒト化軽鎖Ｖ部遺伝子を、ヒトカッパ鎖定常部（Ｋｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡを含有するＵＣＢヒト軽鎖発現ベクターｐＭｈＣＫへとクローニングした。ヒト化重鎖Ｖ部遺伝子は、ヒンジが変異Ｓ２４１Ｐを安定化しているヒトガンマ４重鎖定常領域をコードするＤＮＡを含有するＵＣＢヒトガンマ４重鎖発現ベクターｐＭｈγ４Ｐ ＦＬへとクローニングした（Ａｎｇａｌら，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３，３０（１）：１０５−８）。あるいは、ヒト化ＶＨ遺伝子を、ヒトガンマ１重鎖定常部（Ｇ１ｍ１７、１アロタイプ）をコードするＤＮＡを含有するＵＣＢヒトガンマ１重鎖発現ベクターｐＭｈγ１ＦＬへとクローニングした。ヒト化抗体の一価の結合動態を評価するために、ヒト化ＶＨ遺伝子を、１０個のヒスチジン残基からなるＣ末端ｔａｇを有するヒトガンマ１ＣＨ１−ヒンジドメインをコードするＤＮＡを含有するＵＣＢヒトＦａｂ−ＨＩＳ発現ベクターｐＭｈＦａｂ１０ＨＩＳへもクローニングした：ヒスチジンｔａｇは、発現したＦａｂのアフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にする。結果として生じる重鎖ベクター及び軽鎖ベクターのＨＥＫ２９３懸濁細胞への同時トランスフェクションは、２９３Ｆｅｃｔｉｎ（１２３４７−０１９ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて達成され、ヒトＩｇＧ４Ｐ、ＩｇＧ１又はＦａｂ−ＨＩＳフォーマットのいずれかにおけるヒト化組換え抗体の発現を与えた。

複数のバリアントヒト化抗体鎖及びこれらの組み合わせを発現させ、親抗体に対するこれらの効力、これらの生物物理的特性及び下流プロセシングに対する適切性について評価した。

哺乳類細胞におけるヒト化組換え抗体の安定した発現のために、ヒト化軽鎖Ｖ部遺伝子を、ヒトＣ−カッパ定常部（Ｋｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡ配列へと接合させて、連続的な軽鎖遺伝子を作製した。ヒト化重鎖遺伝子を、ヒトガンマ−４Ｐ重鎖定常部、又はヒトガンマ−１重鎖定常部（Ｇｌｍｌ７、１アロタイプ）のいずれかをコードするＤＮＡへと接合させて、連続的な重鎖遺伝子を作製した。重鎖及び軽鎖の遺伝子を哺乳類発現ベクターへとクローニングした。

実験５−熱安定性測定
融解温度（Ｔｍ）又はアンフォールディングの中間点での温度を、Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒアッセイを使用して測定した。この方法において、蛍光色素ＳＹＰＲＯオレンジを用いて、温度上昇するにつれて曝露される疎水性領域に結合することによって、タンパク質アンフォールディングプロセスをモニターした。

反応混合物は、５０００Ｘストック溶液及び０．１２ｍｇ／ｍｌの４５μｌの試料からＰＢＳ（ＰＢＳ ｐＨ７．４中）で希釈した５μｌの３０ｘＳＹＰＲＯ（登録商標）オレンジ色色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含んだ。１０μｌの混合物を、３８４ＰＣＲ光学ウェルプレートに４回に分けて分注し、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ (Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)で分析した。ＰＣＲシステムの加熱装置は、２０℃〜９９度に設定し、１．１℃／分の上昇速度で行った。電荷結合装置が、ウェルの蛍光変化をモニタリングした。強度増加をプロットし、傾き（複数可）の変曲点を用いて、以下のようにＴｍを計算して使用した。

アイソタイプ ＩｇＧ１（配列番号１４の軽鎖及び配列番号５４の重鎖（Ｌ１４／Ｈ５４）、又は配列番号１４の軽鎖及び配列番号５５の重鎖（Ｌ１４／Ｈ５５））及びＩｇＧ４（配列番号１４の軽鎖及び配列番号１７の重鎖（Ｌ１４／Ｈ１７）、又は配列番号１４の軽鎖及び配列番号１８の重鎖（Ｌ１４／Ｈ１８））の配列番号１４の軽鎖及び配列番号１２又は配列番号１３の重鎖を含む抗体の分析を、以下の図６及び表３に示す。２つのアンフォールディングドメインが両方のアイソタイプで観察された。第１のものは、ＣＨ２ドメインのＴｍに起因することができ；ＩｇＧ１ アイソタイプについて、これは、文献（Ｇａｒｂｅｒ Ｅ, Ｄｅｍａｒｅｓｔ ＳＪ. Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ. ２００７年 Ａｐｒ １３；３５５(３)：７５１―７）に従って、ＩｇＧ４フォーマットより高い（より安定している）ことが判明した。第２のアンフォールディングドメインは、Ｆａｂアンフォールディングドメイン及びＣＨ３ドメインのＴｍの平均に起因することができる。

実験６−Ｘ線結晶学
配列番号１４の軽鎖及び配列番号１８の重鎖を有するＴａｕ結合抗体（Ｌ１４Ｈ１８）ならびに配列番号３５（ペプチド）で定義されるＴａｕの残基２３４〜２５０、配列番号で定義されるＮ−アセチル−ＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭ−アミドからなるペプチドの間の相互作用を、Ｘ線結晶額によって研究した。

Ｌ１４Ｈ１８ Ｆａｂと複合体化したｔａｕペプチドの結晶構造の結晶化、構造決定及び精密化。
結晶化
Ｌ１４Ｈ１８ Ｆａｂ／ｔａｕペプチド２３４−２５０複合体は、ＭＲＣプレートで、１〜２週間の間、３０％ｗ／ｖポリエチレングリコール４０００、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．２Ｍ塩化カルシウム脱水物を含むリザーバーに対する気相を介した着滴から結晶化した。

滴は、２モル過剰のｔａｕペプチド２３４−２５０及び４００ｎｌのリザーバー溶液の１１ｍｇ／ｍｌで４００ｎｌのＬ１４Ｈ１８ Ｆａｂタンパク質を含んだ。
結晶は、空間群Ｐ３１ ２ ２１に属し、非対称単位中に２コピーのＬ１４Ｈ１８ Ｆａｂ／ｔａｕペプチド２３４−２５０を有する。

Ｘ線回折コレクション
我々は、単一のＬ１４Ｈ１８ Ｆａｂ／ｔａｕペプチド２３４−２５０結晶を介してＸ線回折データを収集した。３０％ポリエチレングリコール４０００、０．２Ｍ塩化カルシウム、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５及び１０％エチレングリコールを含む凍結保護剤溶液を短時間通過させた後、結晶を、リソループに懸濁し、液体窒素下で急速凍結した。回折データは、Ｄｉａｍｏｎｄシンクロトロン, Ｄｉｄｃｏｔ, Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、英国で、Ｉ０４−１ビームラインステーションのＰｉｌａｔｉｓ ６Ｍで収集した。単色Ｘ線ビームの波長は、０．９２８１９Åであった。逆格子空間を、φゴニスタット軸周りの０．２°振動ステップでサンプリングした。シンクロトン施設から提供された加工データＸＩＡファイルを、構造決定に使用した。

構造決定
Ｆａｂ位置は、分子置換プログラムＰｈａｓｅｒ (Ｒｅａｄ,ＲＪ, Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ. Ｄ５７, １３７３−１３８２(２００１年))によって、ＰＤＢコード４ＨＩＸを有するＦａｂを使用して位置付けた。Ｍａｔｔｈｅｗｓ計数は、単位細胞における１００ｋＤａのある分子量を示し、溶液は、非対称単位中にＦａｂの２つのコピーを見出した。

モデル構築と改良
２Ｆｏ−Ｆｃ及びＦｏ−Ｆｃ電子密度マップを使用して、Ｆａｂ分子中の残基を、Ｌ１４Ｈ１８ Ｆａｂの配列に従って、電子密度マップによって誘導された位置に置換した。
Ｆａｂの第２のコピーについてのＦａｂ鎖Ｃ及びＤは、第１のコピー（鎖Ｈ及びＬ）よりも明瞭な密度を有した。

余分な電子密度は、Ｆａｂの１つのコピー（鎖Ｃ及びＤ）のＣＤＲに隣接して見えた。これは、ペプチド２３４−２５０の配列の一部を構成することができるらせん構造を有するペプチド鎖を明らかにした。ペプチドは、既知の配列に従って構成されたアルギニン及びリシン残基について明らかな密度を使用して整列された。モデル構築及び改良のさらなるラウンドは、ペプチド領域の密度を改良し、Ｆａｂの他のコピー（鎖Ｈ及びＬ）に結合したペプチドについていくらかの密度を示した。

コンピュータプログラムＣｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ Ｐ., Ｌｏｈｋａｍｐ Ｂ., Ｓｃｏｔｔ Ｗ.Ｇ., Ｃｏｗｔｏｎ Ｋ. Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ, ２０１０ Ａｐｒ； 66 (Pt 4): 486 - 501）を構築するモデルを使用した。改良は、プログラムＲＥＦＭＡＣ (Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ Ｇ.Ｎ., Ｓｋｕｂａｋ Ｐ., Ｌｅｂｅｄｅｖ Ａ.Ａ., Ｐａｎｎｕ Ｎ.Ｓ., Ｓｔｅｉｎｅｒ Ｒ.Ａ., Ｎｉｃｈｏｌｌｓ Ｒ.Ａ., Ｗｉｎｎ Ｍ.Ｄ., Ｌｏｎｇ Ｆ., Ｖａｇｉｎ Ａ.Ａ. Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ２０１１ Ａｐｒ； ６７ (Ｐｔ ４)： ３５５−６７)を使用して行った。

Ｌ１４Ｈ１８ Ｆａｂ／ｔａｕペプチド２３４−２５０複合体のモデルは、配列番号３５として定義されるＴａｕペプチドの残基２３４−２４４、重鎖の残基２−２１９及び軽鎖の１−２１９からなる。
モデルのＲ因子は、０．２３４であり、Ｒフリーは、３６４８３回の反射に対して０．２９１である。標準形状からのｒｍｓ偏差は、結合長さで０．０１４５、結合角度で１．９３°である。

エピトープ
抗体Ｌ１４Ｈ１８及びｔａｕペプチドであるＮ−アセチル−ＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭ−アミド（ヒトｔａｕアイソフォーム２型配列２３４−２５０に基づく）の間の相互作用を、ペプチドでインキュベートされたＬ１４Ｈ１８ Ｆａｂフラグメントから調製された共複合体を用いたＸ線結晶学によって調べた。得られた構造は、Ｌ１４Ｈ１８ Ｆａｂとｔａｕタンパク質の間の主要な接触部位を明らかにし、主に抗体のＣＤＲループでクラスター化され、ｔａｕタンパク質の残基２３５−２４４に対応するペプチド残基ＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱとして同定された。ナンバリング配列によれば、配列番号３５で示されるように、５．０Ａ内のＬ１４Ｈ１８のＣＤＲ領域と最も密接に相互作用する残基は、Ｓ２３５、Ｐ２３６、Ｓ２３７、Ｓ２３８、Ａ２３９、Ｋ２４０、Ｒ２４２、Ｌ２４３、Ｑ２４４及びＴ２４５である。

Claims (32)

1. 以下を含む単離されたＴａｕ結合モノクローナル抗体又はその結合フラグメント：
   配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＣＤＲ１）、配列番号２で表されるアミノ酸配列（ＣＤＲ２）、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列（ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域、ならびに
   配列番号４で表されるアミノ酸配列（ＣＤＲ１）、配列番号５で表されるアミノ酸配列（ＣＤＲ２）、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列（ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域。
2. 以下を含む請求項１に記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント：
   ａ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
   ｂ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ｃ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；又は
   ｄ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。
3. 重鎖可変領域が、配列番号１１又は１２又は１３で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
4. Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが、
   配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖、及び
   配列番号１７もしくは１８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖
   を含む、請求項１に記載の単離されたＴａｕ結合抗体あるいはその結合フラグメント。
5. Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが、モノクローナルヒト化抗体である、請求項１に記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
6. 請求項１に記載のＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントの軽鎖及び／又は重鎖をコードする、単離された核酸分子。
7. 請求項６に記載の核酸分子を１つ又は２つ以上含む、クローニングベクター又は発現ベクター。
8. 請求項６に記載の核酸分子を１つ又は２つ以上又は前記核酸分子を１つ又は２つ以上含むクローニングベクターもしくは発現ベクターを含む、宿主細胞。
9. ａ）請求項８に記載の宿主細胞を培養するステップ、及び
   ｂ）前記Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを単離するステップ
   を少なくとも含む、Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを作製する方法。
10. タウオパチーを処置するための、請求項１に記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを含む医薬組成物。
11. タウオパチーがアルツハイマー病又は進行性核上性麻痺である、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 請求項１に記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメントを含む、タウオパチーを診断するための組成物。
13. タウオパチーがアルツハイマー病又は進行性核上性麻痺である、請求項１２に記載の組成物。
14. 配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    を含む、請求項２に記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
15. 配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    を含む、請求項２に記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
16. 配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    を含む、請求項２に記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
17. 配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    を含む、請求項２に記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
18. 配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    を含む、請求項４に記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
19. 配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    を含む、請求項４に記載の単離されたＴａｕ結合抗体又はその結合フラグメント。
20. Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが
    配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
21. Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが
    配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
22. Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが
    配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
23. Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが
    配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
24. Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが
    配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
25. Ｔａｕ結合抗体又はその結合フラグメントが
    配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
    配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
26. 以下をコードする、請求項６に記載の単離された核酸分子：
    ａ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
    ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｃ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｄ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｅ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｆ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    ｇ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｈ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；又は
    ｉ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。
27. 配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする、請求項６に記載の単離された核酸分子。
28. 配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする、請求項６に記載の単離された核酸分子。
29. 以下をコードする核酸分子を含む、請求項７に記載のクローニングベクター又は発現ベクター：
    ａ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
    ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｃ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｄ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｅ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｆ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    ｇ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｈ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；又は
    ｉ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。
30. 配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする核酸分子を含む、請求項７に記載のクローニングベクター又は発現ベクター。
31. 配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする核酸分子を含む、請求項７に記載のクローニングベクター又は発現ベクター。
32. 以下をコードする核酸分子を含む、宿主細胞：
    ａ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
    ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｃ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｄ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｅ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｆ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    ｇ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
    ｈ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；又は
    ｉ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。