JP6619650B2 - 新規のpcsk9結合タンパク質 - Google Patents
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Description
ヒトプロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)は、主に腎臓、肝臓、および腸で発現される分泌タンパク質である。これは、阻害性プロドメイン(アミノ酸1〜152;アミノ酸1〜30にシグナル配列を含む)、セリンプロテアーゼドメイン(または触媒ドメイン;アミノ酸153〜448)、およびシステイン残基に富んでいる210残基長のC末端ドメイン(またはシステイン/ヒスチジンに富むドメイン)(アミノ酸449〜692)という3つのドメインを有している。PCSK9は、小胞体においてプロドメインと触媒ドメインとの間が自己触媒的に切断されるチモーゲンとして合成される。プロドメインは切断後も成熟タンパク質に結合したままであり、複合体が分泌される。システインに富むドメインは、活性化されたプロテアーゼのフォールディングおよび調節に不可欠であると思われる他のフューリン/ケキシン/サブチリシン様セリンプロテアーゼのP-(プロセシング)ドメインに類似した役割を有する可能性がある。
下記のリストは、本明細書の全体を通して使用される用語、語句、および略語を定義するものである。本明細書において列挙され定義される用語はすべて、あらゆる文法的語形を包含することを意図する。
[本発明1001]
(a)成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列の配列位置26〜34、56〜58、80、83、104〜106、および108のうちのいずれか1つまたは複数における変異したアミノ酸残基、ならびに
(b)成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列の配列位置61、101、111、114、および153のうちのいずれか1つまたは複数における変異したアミノ酸残基
を含み、かつPCSK9に特異的に結合する、ヒト涙液リポカリンのムテイン。
[本発明1002]
PCSK9のアンタゴニストであるリポカリンムテイン。
[本発明1003]
PCSK9へのLDL-Rの結合に関して競合的であるリポカリンムテイン。
[本発明1004]
PCSK9への、SEQ ID NO: 29およびSEQ ID NO: 33を含むモノクローナル抗体の結合に関して競合的であるリポカリンムテイン。
[本発明1005]
PCSK9の媒介によるLDL-Rの下方調節を全面的にまたは部分的に阻害できるリポカリンムテイン。
[本発明1006]
PCSK9の存在下でLDL取込みを回復させることができるリポカリンムテイン。
[本発明1007]
10nM以下の解離定数(K D )でヒト以外の霊長類のPCSK9またはその免疫原性断片に結合する、本発明1001〜1006のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1008]
10nM以下の解離定数(K D )でマウスPCSK9またはその免疫原性断片に結合する、本発明1001〜1006のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1009]
10nM以下の解離定数(K D )でヒトPCSK9またはその断片に結合する、本発明1001〜1006のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1010]
1nM以下の解離定数(K D )でヒトPCSK9またはその断片に結合する、本発明1001〜1006のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1011]
0.1nM以下の解離定数(K D )でヒトPCSK9またはその断片に結合する、本発明1001〜1006のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1012]
1pM以下の解離定数(K D )でヒトPCSK9またはその断片に結合する、本発明1001〜1006のいずれかのリポカリンムテイン。
[本発明1013]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Arg26→Ser、Phe、Trp、His、またはThrのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1014]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Glu34→Asn、Thr、Arg、またはGly、Leu56→Met、Ser、Gln、Phe、His、またはAsnのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1015]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Ser58→Lys、Ala、Arg、Trp、またはProのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1016]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Met31→Ala、Gly、His、Pro、Ser Aps、Glu、またはGlnのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1017]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Leu33→Tyr、Trp、Tyr、Phe、Pro、またはAlaのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1018]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Ser61→TrpまたはPhe、Asp80→Ser、Met、Pro、Ile、Gln、Tyr、Ser、Val、またはThrのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1019]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Glu104→Leu、Pro、Ser、Ala、Asn、Thr、Lys、またはAspのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1020]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換His106→Pro、Gln、Gly、Arg、Val、Thr、Asn、またはLeuのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1021]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Lys108→Gln、Ala、Trp、Tyr、Arg、Asp、Asn、Ser、Glu、またはThrのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1022]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Glu27→Arg、Ser、Gln、Thr、Phe、Lys、Ala、またはArgのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1023]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Pro29→Gly、Asp、Asn、Ile、Leu、またはMetのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1024]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Asn32→Ile、Leu、Tyr、Met、またはTrpのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1025]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Leu105→Cys、Tyr、Trp、Glu、Arg、Ser、His、Ala、Val、Asp、Pro、Gly、またはLysのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1026]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Phe28→Cys、Arg、Lys、Trp、Asp、Gly、His、Leu、またはAsnのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1027]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Glu30→Arg、Asp、Thr、Ser、Gly、Ala、またはAsnのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1028]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Ile57→Tyr、Trp、His、Gln、Thr、またはArgのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1029]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換Lys83→Arg、Ser、Gln、Thr、またはGluのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1030]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換の以下のセットのうちの1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン:
。
[本発明1031]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換の以下のセットのうちの1つを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン:
。
[本発明1032]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換の以下の組合せを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン:
。
[本発明1033]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換
のうちの1つまたは複数をさらに含む、本発明1032のムテイン。
[本発明1034]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換の以下の組合せを含む、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン:
。
[本発明1035]
成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、アミノ酸置換
のうちの1つまたは複数をさらに含む、本発明1034のムテイン。
[本発明1036]
成熟ヒト涙液リポカリンのアミノ酸配列に対して、位置28または位置105におけるシステイン残基によるネイティブアミノ酸のアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1035のいずれかのムテイン。
[本発明1037]
成熟ヒト涙液リポカリンの配列に対して少なくとも75%の同一性を有する、本発明1001〜1036のいずれかのムテイン。
[本発明1038]
SEQ ID NO: 3〜28、62〜71、および82のいずれか1つに示すアミノ酸配列またはその断片もしくは変種のアミノ酸配列を有する、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1039]
SEQ ID NO: 23に示すアミノ酸配列またはその断片もしくは変種のアミノ酸配列を有する、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1040]
SEQ ID NO: 13に示すアミノ酸配列またはその断片もしくは変種のアミノ酸配列を有する、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1041]
SEQ ID NO: 20に示すアミノ酸配列またはその断片もしくは変種のアミノ酸配列を有する、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1042]
SEQ ID NO: 22に示すアミノ酸配列またはその断片もしくは変種のアミノ酸配列を有する、本発明1001〜1012のいずれかのムテイン。
[本発明1043]
標識部分にコンジュゲートされている、本発明1001〜1042のいずれかのムテイン。
[本発明1044]
対象の内部の特定の身体領域、生物、組織、器官、または細胞を標的とすることができる部分にコンジュゲートされている、本発明1001〜1042のいずれかのムテイン。
[本発明1045]
ムテインの血清半減期を延ばすことができる部分にコンジュゲートされている、本発明1001〜1042のいずれかのムテイン。
[本発明1046]
ポリアルキレングリコール分子にコンジュゲートされている、本発明1001〜1042のいずれかのムテイン。
[本発明1047]
SEQ ID NO: 30〜32のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含む、本発明1046のコンジュゲートされたムテイン。
[本発明1048]
アルブミン結合タンパク質にコンジュゲートされている、本発明1001〜1042のいずれかのムテイン。
[本発明1049]
SEQ ID NO: 83〜84のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含む、本発明1048のコンジュゲートされたムテイン。
[本発明1050]
融合物に新しい特徴を与えることができる部分に融合されている、本発明1001〜1042のいずれかのムテイン。
[本発明1051]
PCSK9に結合する、ヒト涙液リポカリンの1種または複数種のムテインを作製する方法であって、
(a)ヒト涙液リポカリンをコードする核酸分子を、
(i)成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置26〜34、56〜58、80、83、104〜106、および108のうちのいずれか1つまたは複数、ならびに
(ii)成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置61、101、111、114、および153のうちのいずれか1つまたは複数
における変異誘発に供し、それによって、ヒト涙液リポカリンの1種または複数種のムテインをコードする1種または複数種の核酸分子を得る段階、
(b)(a)で得られた1種または複数種の核酸分子を発現系において発現させ、それによって、ヒト涙液リポカリンの1種または複数種のムテインを得る段階、ならびに
(c)(b)で得られた1種または複数種のムテインをさらに選択する段階
を含む方法。
[本発明1052]
段階(c)が、
(ci)PCSK9またはその免疫原性断片を提供する段階、
(cii)選択によって得られた1種または複数種のムテインをPCSK9またはその免疫原性断片と接触させ、それによって、PCSK9またはその免疫原性断片とそれに対する結合親和性を有するムテインとの複合体の形成を可能にする段階、および
(ciii)結合親和性を有していない、または実質的な結合親和性を有していない、1種または複数種のムテインを除去する段階
をさらに含む、本発明1051の方法。
[本発明1053]
段階(c)における選択が、競合的条件下で実施される、本発明1051または1052の方法。
[本発明1054]
段階(a)が、
(a)(iii)ヒト涙液リポカリンをコードする核酸分子を、成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置79、92、および105のうちのいずれか1つまたは複数における変異誘発に供する段階
をさらに含む、本発明1051〜1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
本発明1001〜1050のいずれかのムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
[本発明1056]
SEQ ID NO: 36〜61、72〜81、および86〜89のいずれか1つに示す核酸分子。
[本発明1057]
本発明1055または1056の核酸分子を含む宿主細胞。
[本発明1058]
対象の中のPCSK9に結合させるための、本発明1001〜1050のいずれかのムテインまたはそのようなムテインを含む組成物の使用。
[本発明1059]
対象におけるLDL-RへのPCSK9の結合を阻害するための、本発明1001〜1050のいずれかのムテインまたはそのようなムテインを含む組成物の使用。
[本発明1060]
PCSK9の検出のための、本発明1001〜1050のいずれかのムテインの使用であって、
(a)ムテインを、PCSK9を含むと疑われる試験試料と適切な条件下で接触させ、それによって、ムテインとPCSK9またはそのドメインもしくは断片との複合体の形成を可能にすること、および
(b)適切なシグナルによって複合体を検出すること
を含む使用。
[本発明1061]
PCSK9の分離のための、本発明1001〜1050のいずれかのムテインの使用であって、
(a)ムテインを、PCSK9を含むことになっている試料と適切な条件下で接触させ、それによって、ムテインとPCSK9またはそのドメインもしくは断片との複合体の形成を可能にすること、および
(b)試料から複合体を分離すること
を含む使用。
[本発明1062]
化合物で処置すべき予め選択された生物、組織、器官、または細胞へとその化合物を標的指向させるための、本発明1001〜1050のいずれかのムテインの使用であって、
(a)ムテインを前記化合物とコンジュゲートさせること、および
(b)予め選択された生物、組織、器官、または細胞にムテイン/化合物複合体を送達すること
を含む使用。
[本発明1063]
本発明1001〜1050のいずれかのムテインを含むキット。
1つの局面において、本開示は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型またはPCSK9に結合するヒト涙液リポカリンのムテインを提供する。いくつかの態様において、リポカリンムテインは、PCSK9に対して高い親和性を有する。本開示のムテインの標的としてのPCSK9は、典型的には、哺乳動物のタンパク質、例えば、ヒト以外の霊長類のタンパク質またはヒトタンパク質である。完全長ヒトPCSK9は、SEQ ID NO: 34に示すアミノ酸配列を有する。
。さらに別の態様において、ヒト涙液リポカリンムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、以下のアミノ酸置換のうちの1つまたは複数を含む:
。
。さらに別の態様において、ヒト涙液リポカリンムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンと比較して、以下のアミノ酸置換のうちの1つまたは複数を含む:
。
、T7エピトープ
、マルトース結合タンパク質(MBP)、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Dの配列
を有するHSVエピトープ、配列
のヘマグルチニン(HA)エピトープ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質のVSV-Gエピトープ
、配列
のEエピトープタグ、配列
のE2エピトープタグ、配列
を有する、哺乳動物MAPK/ERKキナーゼのC末端のTag-100エピトープタグ、配列
のSタグ、配列
の転写因子c-mycの「myc」エピトープ、およびパラミクソウイルスのサルウイルス5のPプロテインおよびVプロテイン上に存在する小型V5エピトープ
である。さらに、ただし通常は単一のタグとしてではないが、NusA、チオレドキシン (TRX)、低分子ユビキチン様修飾因子(SUMO)、およびユビキチン(Ub)などの溶解性を高めるタグも使用され得る。ハプテンおよびエピトープタグは、結合相手としての対応する抗体または抗体に似たタンパク質性分子と組み合わせて使用され得る。配列
のSペプチドエピトープは、それぞれの抗体と共に、または結合相手としてのSプロテインと組み合わせて、エピトープタグとして使用され得る(Hackbarth, JS, et al., BioTechniques (2004) 37, 5, 835-839)。
実施例1: 組換えヒトPCSK9およびヒトPCSK9変異体の作製および特徴付け
C末端FLAGタグを含むヒトPCSK9(SEQ ID NO: 34)を、形質移入したHEK293F細胞において発現させた。形質移入細胞600mlをDMEM/TS/0.05%BSA中で6日間培養し、hPCSK9を含む上清を回収した。hPCSK9をFLAG M2樹脂に結合させ、50CVの洗浄緩衝液(10mM Tris/HCL pH7.4、150ml NaCl、2mM Cacl2、10%グリセロール)で洗浄し、100μg/mlの3×FLAGペプチドを含む5CVの洗浄緩衝液を用いて溶出させた。Superdex 200 16/60カラム(GE Healthcare)を用いたゲルろ過によって、溶出されたタンパク質をさらに精製した。HepG2細胞を用いたLDL-R細胞ELISAによって、機能性を調べた。
多様性の高い2×1010個のリポカリンムテインのランダムライブラリーを、成熟ヒト涙液リポカリンのランダム変異誘発によって作製した(例えば、WO2007/107563を参照されたい)。PCSK9特異的リポカリンムテインを選択するために、このライブラリーから得た2×1012個のファージミドを、200nMのビオチン標識したヒトPCSK9および/またはカニクイザルPCSK9と共にインキュベートした。ニュートラアビジンまたはストレプトアビジンでコーティングした常磁性ビーズを用いて、PCSK9/ファージミド複合体を捕捉し、続いて磁石を用いてそれらを単離した。1ml PBS/Tで8回ビーズを洗浄することにより、結合されなかったファージミドを除去した。最初にトリエチルアミンと、次いで0.1MグリシンpH2.2とインキュベーションすることによって、結合したファージミドを溶出させた。選択を4回連続して実施した。
上記の実施例2においてリポカリンライブラリーから同定されたPCSK9特異的ムテインを最適化するために、リポカリンムテインSEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、およびSEQ ID NO: 7(以後、本実施例において「母クローン(mother clone)」と名付ける)をそれぞれベースとする追加のライブラリーを作製した。これらのライブラリーは、選択された位置のみの部分的なランダム化をもたらすように、作製した。選択された各位置について、コードされるアミノ酸が、各母クローンに存在するアミノ酸に確率70%で対応し、同時に、それが確率30%で異なるアミノ酸であることができるように、設計を行った。標的とされる位置の数をNとし、Bを偏りとすると、最も確率が高いクローン1個当たり交換数は、N×(1-B)である。例えば、20個のアミノ酸位置が、母クローンのアミノ酸に対して70%の偏りで部分的にランダム化される場合、これにより、母クローンと比べて、全体的に、ただし標的とされた位置のみに、6個の変異を平均して含む変異体のライブラリーが得られると考えられる。しかしながら、これらクローンのどれもが6個の交換を有すると思われるわけではない:クローン1個当たりの変異の頻度は、図11Dに示すように、二項分布に従うと考えられる。
最適化されたPCSK9特異的リポカリンムテインを選択するために、実施例3で説明したライブラリーから得た2×1012個のファージミドを使用した。0.1% Tween-20(v/v)(すなわちPBS/T)、50mMベンズアミジン、および1%(w/v)カゼインを添加したPBSにファージミドを溶解させた。親和性が増大したリポカリンムテインを選択するために、0.01〜10nMの範囲の低濃度のビオチン標識PCSK9タンパク質と共にファージミドをインキュベートした。いくつかの例において、耐熱性が上昇したムテインを選択するために、65℃で10分間、ファージミドをインキュベートした。ブロックしたファージミドをビオチン標識PCSK9タンパク質と共に40分間インキュベートした後、0.3mMデスチオビオチンを溶液に添加して、空いているストレプトアビジン結合部位を完全にふさぎ、インキュベーションを20分間継続した。続いて、ブロック(PBS/T中1%(w/v)カゼイン)し水気を切った、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンのいずれかでコーティングした常磁性ビーズを、20分間添加して、PCSK9-ファージミド複合体を捕捉した。徹底的に再懸濁し、続いて磁石を用いてビーズを回収することにより、1ml PBS/Tで8回ビーズを洗浄することによって、複合体を形成していないファージミドを除去した。koff速度が低下したムテインを特異的に選択するために、1回目の後に5回、2回目の後に10回、3回目の後に15回、4回目の後に20回の洗浄段階を追加して実施することにより、よりストリンジェントな洗浄プロトコールを適用するか、または様々な量(10nM〜5μM)の精製親ムテイン(例えば、SEQ ID NO: 3、4、または7)と共にムテイン-PCSK9複合体をインキュベートして、最適化されたリポカリンムテインと親リポカリンムテインとの間でPCSK9結合の競合を起こさせた。さらに、両方の方法の組合せも適用した。結合したファージミドを、70mMトリエチルアミン300μlを10分間用いて最初に溶出させ、続いて、1M Tris-Cl pH6.0 100μlを用いて上清を直ちに中和した。1回の中間洗浄サイクルの後に、100mMグリシンpH2.2を10分間用いて、残存するファージミドを溶出させ、続いて、0.5M Tris塩基50μlを用いて直ちに中和した。両方の溶出画分を集め、再増幅させるために大腸菌の対数期培養物(OD5500.45〜0.6)4mlを感染させるのに使用した。撹拌しながら30分間インキュベーションした後、5000×gで2分間遠心分離することによって細菌を回収し、2xYT培地1ml中に再懸濁し、大きなLB/Amp寒天プレート(10g/lバクトトリプトン、5g/l酵母抽出物、5g/l NaCl、pH7.5、15g/l寒天、100μg/mlアンピシリン)3枚に播いた。プレートを32℃で一晩インキュベートした。100μg/mlアンピシリンを添加した2xYT培地(2xYT/Amp)50mlを用いて、寒天プレートから感染細胞をかき取った。OD550が0.08に達するまで、適切な体積の細菌懸濁液を2xYT/Amp培地50mlに植え付けた。OD550が0.5に達するまで、37℃、振盪機(160rpm)上でこの培養物をインキュベートし、次いで、穏やかに撹拌しながら15分間、および37℃、振盪機上で45分間のインキュベーションによって、ヘルパーファージ(1.5×1011pfu)に感染させた。続いて、最終濃度が70μg/mlとなるようにカナマイシンを添加して、ヘルパーファージに感染した細菌を選択した。最後に、25ng/mlアンヒドロテトラサイクリンの添加によって、pIII-リポカリンタンパク質の発現を誘導した。
実施例4で説明したように、ファージディスプレイ選択の後に得られたファスミド調製物の変異誘発した中央のカセットを、BstX1を用いてDNAを消化し、続いて標準的方法を用いたアガロースゲル電気泳動によって精製することによって単離した(Sambrook et al. 1989)。このDNAを、テトラサイクリンプロモーターの制御下でムテインを細菌に産生させることを可能にする同様に切断したベクターに挿入した。ライゲーション混合物を用いて、CaCl2によってコンピテントにしたTG1-F'細胞を形質転換し、LB/Ampプレート上に播種した。個々のコロニーを用いて、2xYT/Amp培地に植え付け、定常期になるまで一晩(14〜18時間)増殖させた。続いて、定常期の培養物から50μlの2xYT/Ampを植え付け、37℃で3時間、次いで22℃に変えて、OD595が0.6〜0.8に達するまでインキュベートした。1.2μg/mlアンヒドロテトラサイクリンを添加した2xYT/Amp 10μlを添加することによって、リポカリンムテイン産生を誘導した。翌日まで22℃で培養物をインキュベートした。PBS/T中5%(w/v)BSA 40μlを添加し25℃で1時間インキュベーションした後、培養物は、スクリーニングアッセイ法で使用する準備が整った状態となった。
ビオチン標識PCSK9に対するリポカリンムテインの代表的なグループの結合親和性を測定するために、Biacore T200装置(GE Healthcare)を利用して、表面プラズモン共鳴 (SPR)に基づくアッセイ法を用いた。SPR親和性アッセイ法(図1)のために、Biotin CAPtureキット(GE Healthcare)を使用した。
実施例6で開示したリポカリンムテインが競合的な様式でPCSK9に結合するかどうかを、競合ELISA形式を用いてインビトロで試験した。この実験において、一定の濃度のヒトPCSK9(SEQ ID NO: 34)またはヒトPCSK9_D374Y変異体を、多様な濃度のリポカリンムテインと共に1時間インキュベートした。溶液中でのこのプレインキュベーションの後、一定量のリポカリンムテイン/PCSK9混合物を、ヒトLDL-RでコーティングしたELISAプレートに移して、hLDL-Rに結合するのを妨害されなかったhPCSK9の濃度を測定した。
リポカリンムテインの特異性および種交差反応性(図3(A〜D))を結合ELISAにおいて分析した。結合ELISAの原理は次のとおりであった:ニュートラアビジンでコーティングしたELISAプレート上にビオチン標識リガンド(ヒトPCSK9、ヒトPCSK9_D374Y、マウスPCSK9、およびカニクイザルPCSK9)を捕捉し、様々な濃度のリポカリンムテインを添加した。ウサギ抗Streptag II抗体(GenScript、カタログ番号A00626)およびHRP標識抗ウサギIgG抗体(Jackson ImmunoResearch、カタログ番号211-035-109)を用いて、結合したリポカリンムテインを検出した。
PCSK9に結合するリポカリンムテイン(SEQ NO: 3、SEQ NO: 4、SEQ NO: 6、SEQ NO: 7、およびSEQ NO: 8)が、PCSK9の媒介による表面LDL-R分子数の減少を無効にし、その結果、下方調節されたLDL取込みをHepG2細胞において回復させる能力を、細胞ベースのアッセイ法を用いて実証した。SEQ ID NO: 2が、陰性対照しての機能を果たした。
ビオチン標識ヒトPCSK9(hPCSK9-Bio)に対するその他のリポカリンムテインの結合親和性を測定するために、Biacore T200装置(GE Healthcare)を利用して、表面プラズモン共鳴(SPR)に基づくアッセイ法を用いた。SPR親和性アッセイ法(図5(A〜C))のために、Biotin CAPtureキット(GE Healthcare)を使用した。
ビオチン標識したヒトPCSK9、カニクイザルPCSK9、およびマウスPCSK9に対するリポカリンムテインSEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 20、およびSEQ ID NO: 22の結合親和性を測定するために、Biacore T200装置(GE Healthcare)を利用して、表面プラズモン共鳴 (SPR)に基づくアッセイ法を用いた。SPR親和性アッセイ法(図6(A〜C))のために、Biotin CAPtureキット(GE Healthcare)を使用した。
溶液中のビオチン標識ヒトPCSK9(hPCSK9-Bio)に対するリポカリンムテインおよびそのPEG化変種(ここでは、分枝PEG40を有するもの)の結合を、競合的電気化学発光(ECL) アッセイ形式を用いてインビトロで試験した(図7)。この実験では、一定の濃度のhPCSK9-Bioを、様々な濃度のリポカリンムテインSEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 20、およびSEQ ID NO: 22、ならびにPEG化変種SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、およびSEQ ID NO: 32と共に1時間インキュベートした。溶液中でのこのプレインキュベーションの後、一定量のリポカリンムテイン/PCSK9混合物を、基準モノクローナル抗体(SEQ ID NO: 29の軽鎖およびSEQ ID NO: 33の重鎖を含む)でコーティングしたECLプレートに移して、リポカリンムテイン(PEG化型ならびに非PEG化型)によって妨害されず、したがって抗体が依然として結合することができるhPCSK9の濃度を測定した(図7)。これらのリポカリンムテインの競合的な作用様式を、hPCSK9-Bioを用いて示した。
ヒトPCSK9は、LDL-Rの内部移行、したがって、細胞表面からのLDL-Rの減少を引き起こす。実施例12で言及したリポカリンムテイン(PEG化型(ここでは、分枝PEG40を有するもの)ならびに非PEG化型)の存在下で、このアッセイ法においてLDL-R発現を評価して、LDL-Rの細胞表面での減少をもたらす際のPCSK9活性をリポカリンムテインが阻害する効力を測定した。その際、SEQ ID NO: 2を陰性対照として使用した。
PCSK9特異的ムテインの熱安定性を向上させるために、(図14に示すように)SEQ ID NO: 13のリポカリンムテインの位置79および位置105を変異させた。それ自体でまたはポリメラーゼ連鎖反応におけるNNKオリゴヌクレオチドの反復的組立ての使用(例えば、WO2007/107563を参照されたい)と組み合わせて、前述の位置が最大限に(saturated)ランダム化される様式で、SEQ ID NO: 13の熱安定化させた誘導体のライブラリーを作製した。同じ目的のために、(図14に示すように)SEQ ID NO: 22のリポカリンムテインの位置92をヒスチジンからプロリンに変異させた。
実施例14で説明したような、PCR組立て後に得られたライブラリー調製物の変異誘発した中央のカセットを、(実施例5で説明したように)テトラサイクリンプロモーターの制御下でリポカリンムテインを細菌に産生させることを可能にするベクターに挿入した。
PCSK9特異的ムテインの融解温度を測定するために、PBS(Gibco)に溶かしたタンパク質濃度1mg/mlの試料を、キャピラリーナノDSC装置(Q2000, TA Instruments)を用いて、1C/分で走査した(25〜100℃)。内蔵型のソフトウェアによって、表示されたサーモグラムから融解温度(Tm)を算出した。
ビオチン標識ヒトPCSK9に対するリポカリンムテインの代表的なグループの結合親和性を測定するために、Biacore T200装置(GE Healthcare)を利用して、表面プラズモン共鳴(SPR)に基づくアッセイ法を用いた。SPR親和性アッセイ法のために、Biotin CAPtureキット(GE Healthcare)を使用した。
PCSK9特異的リポカリンムテイン(SEQ ID NO: 62、82、83、および84)を大腸菌において発現させた。各リポカリンムテインをコードするDNA(それぞれ、SEQ ID NO: 86、87、88、および89)を、T5プロモーター(SEQ ID NO: 62、82、および84の場合)またはT7A3プロモーター(SEQ ID NO: 83の場合)の制御下でムテインを細菌に産生させることを可能にする同様に切断したベクターに挿入した。陰イオン交換カラム、フェニルセファロースカラム、ゲルろ過カラム、およびキレート化カラムを用いたカラムクロマトグラフィー法の組合せによって(SEQ ID NO: 82およびSEQ ID NO: 84の場合)、細胞溶解物からムテインを精製した。最後に、精製したムテインをPBS中で可溶化した。
手順はすべて、Biacore T200(GE Healthcare)を用いて25℃で実施した。HBS-EP+緩衝液(10mM HEPES、pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、および0.05% surfactant P20)を泳動用緩衝液として使用した。標識試薬であるEZ-リンクスルホ-NHS-LC-LC-ビオチン(Thermo Scientific)を用いる一般的な様式で、PCSK9タンパク質のビオチン標識を実施し、脱塩スピンカラムによって、未反応の試薬を除去した。Biotin CAPtureキット(GE Healthcare)を用いて、ビオチン標識PCSK9リガンドをセンサーチップに固定した。ss-DNAオリゴが予め固定されたCAPセンサーチップ上のフローセルを、ストレプトアビジンとコンジュゲートさせた相補的ss-DNAオリゴとハイブリダイズさせ、続いて、ビオチン標識リガンドを注入した。
分泌されたPCSK9は、肝臓LDLRの分解を促進して、血清LDL-Cレベルの上昇をもたらす。したがって、PCSK9とLDLRの相互作用の邪魔をするPCSK9特異的リポカリンムテインにより、LDLRの原形質膜への再利用が高まって、LDL-C取込み(intake)が活性化され、最終的に循環血中LDL-C レベルが低下する。
TR-FRET比=(665nmにおける計数値/620nmにおける計数値)×10,000
リポカリンムテインを、特定の身体領域、生物、組織、器官、または細胞を標的とすることができる部分とコンジュゲートさせることによって、体内のリポカリンムテインの半減期を延ばすことができる。例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)の半減期は約19日であると報告されており(Biochimica et Biophysica Acta 1830; 5526-5534, 2013)、したがって、PCSK9特異的リポカリンムテイン(SEQ ID NO: 62およびSEQ ID NO: 82)を、HSAに結合するアルブミン結合タンパク質(G148およびSEQ ID NO: 85など)にコンジュゲートさせ、その結果、リポカリンムテインの体内での長い(long)半減期を延ばすことができる。
Claims (13)
- (i) 成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列(SEQ ID NO: 1)と比較して、アミノ酸置換の以下の組み合わせ:
Arg 26 → Phe、Glu 27 → Ser、Phe 28 → Arg、Pro 29 → Gly、Glu 30 → Asp、Met 31 → Ala、Asn 32 → Ile、Leu 33 → Trp、Glu 34 → Thr、Leu 56 → Met、Ile 57 → Tyr、Ser 58 → Ala、Lys 83 → Ser、Glu 104 → ProおよびLys 108 → Ala
を含み、かつ、成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列(SEQ ID NO: 1)と比較して、アミノ酸置換の以下の組み合わせ:
(1) Lys 70 → Arg、Ala 79 → Thr、Asp 80 → Met、His 92 → Pro、Leu 105 → His、およびHis 106 → Gln;
(2) Asp 80 → Met、Ile 89 → Thr、Leu 105 → His、およびHis 106 → Gln;
(3) Thr 43 → Ile、Glu 63 → Gly、Ala 66 → Val、Asp 80 → Met、His 84 → Gln、Leu 105 → Tyr、およびHis 106 → Gln;
(4) Ala 79 → Thr、Asp 80 → Met、Leu 105 → Tyr、およびHis 106 → Gln;
(5) Asp 80 → Ser、Leu 105 → His、およびHis 106 → Gln;
(6) Thr 43 → Ala、Asn 48 → Gly、Ala 66 → Val、Asp 80 → Met、Val 85 → Gly、Ile 89 → Thr、Leu 105 → Tyr、およびHis 106 → Arg;
(7) Glu 45 → Gly、Glu 69 → Val、Asp 80 → Met、Gly 82 → Ser、Leu 105 → Tyr、およびHis 106 → Gln;
(8) Ala 79 → Val、Asp 80 → Met、Tyr 87 → Ser、Leu 105 → Tyr、およびHis 106 → Gln;
(9) Asp 80 → Met、Ile 89 → Leu、Leu 105 → His、およびHis 106 → Gln;
(10) Lys 70 → Arg、Ala 79 → Val、Asp 80 → Met、His 92 → Pro、Leu 105 → Gly、およびHis 106 → Gln;
(11) Lys 70 → Arg、Ala 79 → Val、Asp 80 → Met、His 92 → Pro、Leu 105 → Arg、およびHis 106 → Gln;
(12) Lys 70 → Arg、Ala 79 → Thr、Asp 80 → Met、His 92 → Pro、Leu 105 → Ala、およびHis 106 → Gln;
(13) Lys 70 → Arg、Ala 79 → Val、Asp 80 → Met、His 92 → Pro、Leu 105 → Asp、およびHis 106 → Gln;
(14) Lys 70 → Arg、Ala 79 → Met、Asp 80 → Met、His 92 → Pro、Leu 105 → Val、およびHis 106 → Gln;
(15) Lys 70 → Arg、Ala 79 → Val、Asp 80 → Met、His 92 → Pro、Leu 105 → Pro、およびHis 106 → Gln;
(16) Lys 70 → Arg、Ala 79 → Val、Asp 80 → Met、His 92 → Pro、Leu 105 → Lys、およびHis 106 → Gln;
(17) Lys 70 → Arg、Ala 79 → Thr、Asp 80 → Met、His 92 → Pro、Leu 105 → Arg、およびHis 106 → Gln;
(18) Lys 70 → Arg、Ala 79 → Val、Asp 80 → Met、His 92 → Pro、およびHis 106 → Gln; または
(19) Asp 80 → Met、Leu 105 → Tyr、およびHis 106 → Gln
のうちの1つを含み、
成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列(SEQ ID NO: 1)の配列位置61、101、111、114、および153のうちのいずれか1つまたは複数における変異したアミノ酸残基をさらに含み、かつ、
SEQ ID NO: 1に示す成熟ヒト涙液リポカリンの配列に対して少なくとも75%の同一性を有する;あるいは、
(ii) 成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列(SEQ ID NO: 1)と比較して、アミノ酸置換の以下の組み合わせ:
Glu 27 → Phe、Phe 28 → Lys、Pro 29 → Ile、Asn 32 → Trp、Leu 33 → Pro、Glu 34 → Arg、Leu 56 → Asn、Ile 57 → Trp、His 106 → GlnおよびLys 108 → Glu
を含み、かつ、成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列(SEQ ID NO: 1)と比較して、アミノ酸置換の以下の組み合わせ:
(1) Glu 30 → Ala、Met 31 → Ser、Ser 58 → Trp、Lys 70 → Arg、Asp 80 → Gln、Gly 82 → Asp、Lys 83 → Arg、Glu 104 → Asn、およびPro 109 → Thr;
(2) Glu 30 → Ala、Met 31 → Ser、Glu 45 → Gly、Ser 58 → Trp、Asp 80 → Gln、Lys 83 → Ser、Ala 86 → Glu、Tyr 87 → His、Glu 102 → Lys、およびGlu 104 → Asn;
(3) Glu 30 → Ala、Met 31 → Ser、Ser 58 → Trp、Asp 80 → Gln、Lys 83 → Ser、Ala 86 → Glu、およびGlu 104 → Asn;
(4) Glu 30 → Ala、Met 31 → Ser、Ser 58 → Trp、Glu 63 → Asp、Glu 69 → Gly、Asp 80 → Gln、Gly 82 → Asp、Lys 83 → Ser、Ala 86 → Ser、Phe 99 → Leu、Glu 102 → Val、Glu 104 → Asn、およびPro 109 → Thr;
(5) Glu 30 → Ala、Met 31 → Ser、Ser 58 → Trp、Asp 80 → Val、Lys 83 → Ser、およびGlu 104 → Lys;
(6) Glu 30 → Gly、Met 31 → Ser、Ser 58 → Arg、Asp 80 → Gln、Lys 83 → Ser、およびGlu 104 → Lys;
(7) Glu 30 → Gly、Met 31 → Ala、Ser 58 → Trp、Asp 80 → Thr、Lys 83 → Ser、およびGlu 104 → Lys;
(8) Glu 30 → Ala、Met 31 → Ser、Ser 58 → Trp、Lys 70 → Arg、Asp 80 → Gln、Gly 82 → Asp、Lys 83 → Arg、His 92 → Pro、Glu 104 → Asn、およびPro 109 → Thr; または
(9) Glu 30 → Ala、Met 31 → Ser、Ser 58 → Trp、Asp 80 → Gln、Lys 83 → Ser、Glu 104 → Asn、およびLeu 105 → Arg
のうちの1つを含み、
成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列(SEQ ID NO: 1)の配列位置61、101、111、114、および153のうちのいずれか1つまたは複数における変異したアミノ酸残基をさらに含み、かつ、
SEQ ID NO: 1に示す成熟ヒト涙液リポカリンの配列に対して少なくとも75%の同一性を有する;あるいは、
(iii) SEQ ID NO: 3〜28、30〜32、62〜71、および82のいずれか1つに示すアミノ酸配列、を含み、
かつ、プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)に特異的に結合する、
ヒト涙液リポカリンのムテイン。 - PCSK9のアンタゴニストであり、
PCSK9への低密度リポタンパク質受容体(LDL-R)の結合に関して競合的であり、
PCSK9への、SEQ ID NO: 29およびSEQ ID NO: 33を含むモノクローナル抗体の結合に関して競合的であり、
PCSK9の媒介によるLDL-Rの下方調節を全面的にもしくは部分的に阻害でき、または
PCSK9の存在下で低密度リポタンパク質(LDL)取込みを回復させることができる、
請求項1に記載のムテイン。 - 10nM以下の解離定数(KD)でヒト以外の霊長類のPCSK9またはその免疫原性断片、
10nM以下の解離定数(KD)でマウスPCSK9もしくはその免疫原性断片、または
10nM以下の解離定数(KD)でヒトPCSK9またはその免疫原性断片
に結合する、請求項1または2に記載のムテイン。 - 成熟ヒト涙液リポカリンのアミノ酸配列に対して、位置28または位置105におけるシステイン残基によるネイティブアミノ酸のアミノ酸置換を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のムテイン。
- SEQ ID NO: 23に示すアミノ酸配列、
SEQ ID NO: 13に示すアミノ酸配列、
SEQ ID NO: 20に示すアミノ酸配列、
SEQ ID NO: 62に示すアミノ酸配列、または
SEQ ID NO: 22に示すアミノ酸配列
を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のムテイン。 - 標識部分にコンジュゲートされている、
対象の内部の特定の身体領域、生物、組織、器官、または細胞を標的とすることができる部分にコンジュゲートされている、
ムテインの血清半減期を延ばすことができる部分にコンジュゲートされている、
ポリエチレングリコール分子にコンジュゲートされており、SEQ ID NO: 30〜32のいずれか1つに示すアミノ酸配列を好ましくは含む、
アルブミン結合タンパク質にコンジュゲートされている、または
ムテインに新しい特徴を与えることができる部分に融合されている、
請求項1〜5のいずれか一項に記載のムテイン。 - プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)に結合する、請求項1に記載のヒト涙液リポカリンの1種または複数種のムテインを作製する方法であって、
(a)ヒト涙液リポカリンをコードする核酸分子を、
(i)成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列(SEQ ID NO: 1)のアミノ酸配列位置26〜34、56〜58、80、83、104〜106、および108のうちの少なくとも10個、ならびに
(ii)成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列(SEQ ID NO: 1)のアミノ酸配列位置61、101、111、114、および153のうちのいずれか1つまたは複数
における変異誘発に供し、それによって、ヒト涙液リポカリンの1種または複数種のムテインをコードする1種または複数種の核酸分子を得る段階、
(b)(a)で得られた1種または複数種の核酸分子を発現系において発現させ、それによって、ヒト涙液リポカリンの1種または複数種のムテインを得る段階、ならびに
(c)(b)で得られた1種または複数種のムテインをさらに選択する段階
を含み、
該1種または複数種のムテインが、10nM以下の解離定数(KD)で、ヒト以外の霊長類のPCSK9またはその免疫原性断片、マウスPCSK9またはその免疫原性断片、およびヒトPCSK9またはその免疫原性断片のそれぞれに結合する、
方法。 - (I)段階(c)が、
(ci)PCSK9またはその免疫原性断片を提供する段階、
(cii)選択によって得られた1種または複数種のムテインをPCSK9またはその免疫原性断片と接触させ、それによって、PCSK9またはその免疫原性断片とそれに対する結合親和性を有するムテインとの複合体の形成を可能にする段階、および
(ciii)結合親和性を有していない、または実質的な結合親和性を有していない、1種または複数種のムテインを除去する段階
をさらに含み、
(II)段階(c)における選択が、競合的条件下で実施され、または
(III)段階(a)が、
(a)(iii)ヒト涙液リポカリンをコードする核酸分子を、成熟ヒト涙液リポカリンの直線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置79、92、および105のうちのいずれか1つまたは複数における変異誘発に供する段階
をさらに含む、
請求項7に記載の方法。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載のムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子またはSEQ ID NO: 36〜61、72〜81、および86〜87のいずれか1つに示す核酸分子。
- 請求項9に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
- 対象の中のPCSK9に結合させるための、または
対象におけるLDL-RへのPCSK9の結合を阻害するための、
請求項1〜6のいずれか一項に記載のムテインを含む組成物。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載のムテインの使用であって、
(I) PCSK9の検出のための、
(a)ムテインを、PCSK9を含むと疑われる試験試料と適切な条件下で接触させ、それによって、ムテインとPCSK9またはそのドメインもしくは断片との複合体の形成を可能にすること、および
(b)適切なシグナルによって複合体を検出すること
を含む使用;または
(II)PCSK9の分離のための、
(c)ムテインを、PCSK9を含むことになっている試料と適切な条件下で接触させ、それによって、ムテインとPCSK9またはそのドメインもしくは断片との複合体の形成を可能にすること、および
(d)試料から複合体を分離すること
を含む使用。 - PCSK9の検出のための、または
PCSK9の分離のための、
請求項1〜6のいずれか一項に記載のムテインを含むキット。
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