JP6685202B2 - シート照明装置 - Google Patents

Description

蛍光標本を照明するシート照明装置に関する。

蛍光標本（以降、蛍光標本を単に標本とも記載する）の画像を取得する手法として、シート照明を用いた観察手法が挙げられる。この手法では、蛍光を検出する観察光学系の光軸（Ｚ軸方向とする）と直交する方向（Ｘ軸方向とする）から、励起光を標本に向けて照射する。このとき、その励起光は、標本において集光する。集光した励起光を用いて標本を走査することで、標本の平面上で擬似的に光シートを形成する。尚、光シートを形成する平面を、観察光学系の焦点面とすることで焦点の合った画像を取得することができる。

このように光シートを形成することでシート照明を行う観察方法では、励起光の照射位置が観察光学系の焦点面に限定されるため、観察光学系の焦点面以外においても照明される一般的な落射型蛍光顕微鏡と比較して光毒性を低減することができる。

また、光シートを形成することで、面単位で発生する蛍光を検出できることから、点状に集光した励起光により発生する蛍光を検出している二光子励起顕微鏡や共焦点顕微鏡と比べて、高速に画像を取得することができる。

シート照明を用いた観察手法は、例えば、特許文献１、特許文献２に記載されている。

特開2016−91006号公報 特開2016−90767号公報

一方で、標本の平面上で光シートを形成するために行うＸ軸方向の走査の際に、例えば可変焦点レンズを用いた場合、焦点距離の変更に際して光束の角度が変わり、標本上での励起光の集光位置にズレが生じる場合がある。

特に、集光位置がＺ軸方向へ移動するようにズレが発生した場合、Ｘ軸方向の走査に応じて励起光の集光位置がＺ軸方向に広がってしまい、Ｚ軸方向の観察分解能の劣化を引き起こしてしまう。

一般に、可変焦点レンズでは、弾性を有する光学部材をアクチュエータ等の駆動機構により加圧、減圧を行い物理的に変形することで焦点距離を変化させる。この際、光学部材を、高精度で全体にわたり均等に加圧、減圧することは難しい。そのため、焦点距離の変更に際して光学部材の角度、ひいては、光束の角度が変わり、上記のような観察分解能の劣化を引き起こし得る。一方、アクチュエータの速度を遅くすることで高精度な調整が可能だが、標本の観察に時間を要してしまう。

以上の実情を鑑みて、観察時の分解能を劣化させずに光シートを形成するシート照明装置を提供することを本発明の課題とする。

本発明の一態様における、シート照明装置は、標本からの光を結像する観察光学系の光軸と垂直な方向から、前記標本に励起光を入射させるシート照明装置であって、前記励起光を前記標本へ導光する照明光学系と、前記照明光学系内の光路の光学的距離を変更する光学的距離変更手段と、を含み、前記照明光学系は、該照明光学系の光路中で前記励起光を集光させる第１の集光光学系と、前記第１の集光光学系によって集光される収束光または発散光を、前記第１の集光光学系へ再入射させる反射光学素子と、含み、前記光学的距離変更手段は、前記第１の集光光学系と前記反射光学素子との間の光学的距離を変更し、前記照明光学系は、前記第１の集光光学系の集光位置における像を前記標本へ拡大投影することを特徴とする。

本発明のシート照明装置によれば、観察時の分解能を劣化させずに光シートを形成することができる。

第１の実施形態におけるシート照明装置の構成を示す図。 制御装置の機能構成及び制御装置の制御系を示す図。 ミラーを移動させたときにミラーに角度ズレが生じた様子を示す図。 第２の実施形態におけるシート照明装置の構成を示す図。 第３の実施形態におけるシート照明装置の構成を示す図。 第４の実施形態におけるシート照明装置の構成を示す図。 第５の実施形態におけるシート照明装置の構成を示す図。 第６の実施形態におけるシート照明装置の構成を示す図。 （Ａ）は、標本での励起光の集光位置の様子をＸＹ平面上から見た図であり、（Ｂ）は、標本での励起光の集光位置の様子をＸＺ平面上から見た図である。 第７の実施形態におけるシート照明装置の構成を示す図。 蛍光画像取得方法の手順を示すフローチャート。 第１の光シート形成方法の手順を示すフローチャート。 第２の光シート形成方法の手順を示すフローチャート。

本発明の第１の実施形態におけるシート照明装置について説明する。図１は、第１の実施形態におけるシート照明装置１０の構成を示している。シート照明装置１０は、標本Ｓからの光を結像する観察光学系１６の光軸と垂直な方向から、標本Ｓに励起光を入射させるシート照明装置である。シート照明装置１０は、励起光を出力する光源１とコレクタレンズ２とからなる光源ユニット３と、光源ユニット３から出力される励起光を標本Ｓへ導光する照明光学系４と、駆動モータ１４と、から構成される。照明光学系４は、偏光ビームスプリッター（ＰＢＳ）５と、集光レンズ６と、１／４λ板７と、ミラー８と、リレーレンズ９、１１と、ガルバノスキャナ１２と、コンデンサレンズ１３とを含む。また、シート照明装置１０は、制御装置１５と接続されている。

ＰＢＳ５は、光源ユニット３から出力された励起光を、集光レンズ６の光軸方向であって、ミラー８へ向かう方向へ偏向させる偏向光学素子である。

集光レンズ６は、照明光学系４の光路中で励起光を集光させる集光光学系（第１の集光光学系）である。尚、本構成では、第１の集光光学系として一枚の集光レンズ６を用いているが、第１の集光光学系は複数のレンズからなる構成としてもよい。

ミラー８は、集光レンズ６によって集光される励起光を反射させる反射光学素子である。ミラー８は、集光レンズ６によって集光される収束光または発散光を集光レンズ６に向けて反射させることで、集光レンズ６へ再入射させるように配置される。このとき、ミラー８は、集光レンズ６に入射した光が集光される位置（集光位置）の近傍に設置されることが望ましい。

駆動モータ１４は、ミラー８を集光レンズ６の光軸方向に移動させる。即ち、駆動モータ１４は、ミラー８を移動させることで、ミラー８と集光レンズ６との間の光学的距離を変更し、照明光学系４内の光路の光学的距離を変更する光学的距離変更手段として機能する。また、駆動モータ１４によるミラー８の移動によって、標本Ｓへ照射される励起光のＸ軸方向の位置が変更される。尚、駆動モータ１４の代わりに、ミラー８を高速に移動制御することができるピエゾ素子等を用いたアクチュエータを設けてもよい。

ガルバノスキャナ１２は、図１のＺ軸方向を回転軸として回転し、標本Ｓへ照射される励起光のＸ軸とＺ軸とにより作られる平面に垂直な方向（Ｙ軸方向とする）の位置を変更する。

ミラー８によって折り返された励起光の光束は、１／４λ板７を通過することで偏光される。１／４λ板７を通過した励起光は、ＰＢＳ５を反射せずに透過する。ＰＢＳ５を透過した光束は、リレーされ、コンデンサレンズ１３によって標本Ｓ上に集光される。

尚、ミラー８から標本Ｓまでの間の照明光学系４は、拡大光学系で構成される。即ち、集光レンズ６の集光位置における像（光源像）は、標本Ｓにおいて拡大投影される。

制御装置１５は、シート照明装置１０の各種制御を行なう制御装置であり、例えばコンピュータである。図２は、制御装置１５の機能構成と、制御装置１５が制御を行なう制御系との関係を説明する図である。制御装置１５は、シート照明装置１０内の構成、及び、モニタ１８と、標本Ｓに対してＺ軸方向に配置される観察光学系１６と、カメラ１７とに接続されており、各種制御を行なう。

具体的には、制御装置１５は、駆動モータ１４を制御することでミラー８を移動制御する第１制御手段２１として機能する。また、制御装置１５は、ガルバノスキャナ１２の回転を制御する第２制御手段２２として機能する。また、制御装置１５は、光源１を制御することで光源のＯＮ、ＯＦＦ等を行なう光源調整手段２３として機能する。また、制御装置１５は、観察光学系１６を構成するレンズ位置の変更、カメラ１７の露光の制御を行なう観察光学系制御手段２４として機能する。尚、観察光学系制御手段２４が行なう観察光学系１６のレンズ位置の変更制御は、例えば、そのレンズを光軸方向に変更することで、観察光学系１６の焦点距離を変更するようなものである。また、制御装置１５は、カメラ１７からの信号を受信し、画像を生成する画像処理手段２５として機能する。そして画像処理手段２５は、生成した画像をモニタ１８へ出力する。

以上の構成を有するシート照明装置１０では、標本Ｓに集光される励起光は、ミラー８が移動制御されることで、標本Ｓでの集光位置がＸ軸方向に変更される。具体的には、ミラー８が移動制御されて、集光レンズ６とミラー８の間の実際の距離（ユークリッド距離のことであり、以降物理的距離とも表記する）が変更されることで、集光レンズ６とミラー８の間の光学的距離（光路長）が変更され、照明光学系４の焦点位置が変わり、励起光が標本Ｓで集光する位置がＸ軸方向に変更される。従って、ミラー８の制御を行ない、標本ＳをＸ軸方向に走査することで、擬似的に光シートを形成することができる。

このように光シートを形成し、標本Ｓから蛍光を発生させる。標本Ｓから発生した蛍光を、図２の観察光学系１６を通してカメラ１７によって検出することで、標本Ｓの蛍光観察を行なうことができる。また、ガルバノスキャナ１２が回転制御されることで、標本Ｓでの集光位置がＹ軸方向においても変更される。そのため、Ｘ軸方向とＹ軸方向での標本Ｓの走査を行なうことができ、標本Ｓ上の所定のＸＹ平面上において蛍光画像を取得することができる。

尚、標本Ｓは、図示しないステージに固定され、そのステージをＺ軸方向に駆動させることで複数の平面において蛍光画像を取得し、制御装置１５（画像処理手段２５）は、その蛍光画像のスタックを作成することで、３次元画像を生成することもできる。尚、生成された画像は、制御装置１５（画像処理手段２５）の制御によってモニタ１８に表示される。

以下、図３を用いて、本発明におけるシート照明装置１０の特徴を説明する。図３は、光シートを形成する際に標本Ｓでの励起光の集光位置を変更するため、ミラー８を位置Iから位置IIへ移動させたときの様子を示している。一般的にミラーやレンズ等の光学部材をモータによって駆動させて移動させた場合、その移動に伴って、本来の規定された状態に対する微小な角度ズレが生じ得る。ここで、図３では、ミラー８の移動後に角度αだけ集光レンズ６の光軸に対して垂直な平面からの角度ズレが生じたものとする。このようなミラー８の角度ズレによって、ミラー８で反射された光束においても、反射前の光束に対して角度２αだけ角度ズレが生じる。尚、図３では、便宜上１／４λ板を省略している。

一般に、上記のような光学部材の角度ズレ（図３におけるミラー８の移動に伴い生じる角度ズレ）によって光束の角度ズレが生じると、集光レンズ６への光束の入射角度が変わり、結果的に標本Ｓでの集光位置のＺ軸方向へのズレに影響する。

一方で、本実施形態におけるシート照明装置１０では、集光レンズ６は、ある程度の開口数（ＮＡ）を有している。即ち、ミラー８は、集光レンズ６によって集光されるある程度の角度を有する光束（収束光または発散光）を反射し、集光レンズ６に再入射するように構成されている。

このような構成により、例えば、集光レンズ６のＮＡを０．４、つまり光束が本来は光軸に対して２３．５８度の角度をもっており、ミラー８の角度ズレの角度αを１分とすると、本来の光束に対する光束の角度ズレの比率は、２α/６０（度）を２３．５８度で除算することで算出され、０．１４％程でしかない。即ち、集光レンズ６のＮＡが大きいほどミラー８の角度ズレによって生じる本来の光束に対する光束の角度ズレの比率は微小なものとなる。従って、ミラー８の移動に伴って生じるミラー８の角度ズレによる標本Ｓでの集光位置のズレへの影響は小さくなる。即ち、上述の通り０．４程のＮＡであれば、ミラー８の角度ズレによる影響を微小なものとすることができる。

以上を踏まえると、集光レンズ６によって集光されるある程度の角度を有する光束（収束光または発散光）を反射するミラー８を有し、ミラー８と集光レンズ６の間の光学的距離を変更する本構成では、ミラー８の移動に伴って生じ得る角度ズレに起因して発生する標本Ｓ上での集光位置のズレ量を、Ｚ軸方向の分解能に影響を及ぼさない程度に微小なものとすることができる。

また、反射面であるミラー８が集光レンズ６の光軸と垂直な方向へ動いたとしても、反射面の位置が変わらないことから、光束の角度ズレへの影響はない。つまり、シート照明装置１０によれば、光軸方向へのミラー８の移動に際して起こり得る、ミラー８自身の角度ズレ及び、光軸と垂直な方向への移動等による標本Ｓの集光位置のズレへの影響を微小なものとすることができる。従って、本構成によれば、Ｚ軸方向の分解能を損なうことなく、光シートを形成することができる。

また、シート照明装置１０では、ミラー８から標本Ｓまでの間の照明光学系４は、拡大光学系で構成され、尚且つ、ミラー８が集光レンズ６からの光束を反射して集光レンズ６に再入射させる構成を有している。縦倍率は横倍率の２乗となるため、上記構成では、光軸方向のミラー８の移動量に対してミラー８から標本Ｓまでの間の照明光学系４の拡大倍率の２乗を乗算した分だけ、標本Ｓの集光位置がＸ軸方向へ移動することとなる。即ち、上記構成によれば、少ないミラー８の移動量で標本Ｓを大きく走査することが可能であり、迅速な光シートの形成を可能とする。また、ミラー８を大きく移動させる必要が無いことから、ミラー８の移動に起因する角度ズレを実質減少し得るため、より標本Ｓの集光位置のズレの発生を低下させるという効果を生む。

以上により、シート照明装置１０によれば、観察時の分解能を劣化させずに光シートを形成することができる。

尚、シート照明装置１０では、照明光学系４として無限遠補正系の光学系を採用したが、照明光学系４の構成はこれに限られない。例えば、変形例として、照明光学系は、集光レンズ６によってのみ構成され、集光レンズ６によって標本Ｓに励起光を集光する有限遠補正光学系を採用してもよい。

また、集光レンズ６のＮＡは、０．５未満であることが望ましい。ＮＡを０．５未満とすることで、ミラー８での励起光の反射時の球面収差を小さく抑えることができる。また、標本Ｓに照射される励起光の光束のＺ軸方向の広がりを小さく抑えることができ、即ち、Ｚ軸方向の分解能の劣化を防ぐことができる。

以下、第２の実施形態におけるシート照明装置３０について説明する。図４は、シート照明装置３０の構成を示す図である。シート照明装置３０では、ＰＢＳ５の代わりにＰＢＳ３１を備える点及び、集光レンズ６と、１／４λ板７と、ミラー８の配置がシート照明装置１０と異なっている。

ＰＢＳ３１は、光源１からの励起光を透過し、１／４λ板７を通過し偏光した励起光を反射するように設計される。

以上のシート照明装置３０によっても観察時の分解能を劣化させずに光シートを形成することができる。

以下、第３の実施形態におけるシート照明装置４０について説明する。図５は、シート照明装置４０の構成を示す図である。シート照明装置４０は、駆動モータ１４の代わりに駆動モータ４１を備える点で、シート照明装置１０と異なっている。

駆動モータ４１は、集光レンズ６を集光レンズ６の光軸方向に移動させることで集光レンズ６とミラー８との間の光学的距離を変更する光学的距離変更手段として機能する。また、駆動モータ４１は、第１の実施形態の駆動モータ１４と同様に、制御装置１５により制御を受ける。

シート照明装置４０では、駆動モータ４１を動作させることで、集光レンズ６を移動させているため、第１の実施形態では、ミラー８に角度ズレや偏芯が生じ得たが、本構成では、集光レンズ６の移動に伴って集光レンズ６において角度ズレや偏芯が生じ得る。具体的には、集光レンズ６の光軸と垂直な平面に対しての集光レンズ６の角度ズレと、集光レンズ６の光軸と垂直な方向への集光レンズ６の偏芯が生じ得る。そしてここでは、集光レンズ６の光軸と垂直な方向への集光レンズ６の偏芯が生じた場合に、ミラー８へ入射する光束の入射角度にズレが生じ、ひいては標本Ｓでの集光位置のＺ軸方向のズレが生じ得る。

一方で、本構成では、集光レンズ６がある程度の開口数（ＮＡ）を有している。即ち、ミラー８は、集光レンズ６によって集光されるある程度の角度を有する光束（収束光または発散光）を反射し、集光レンズ６に再入射するように構成される。本構成においても、第１の実施形態と同様、集光レンズ６がある程度大きなＮＡを有していることで、標本Ｓでの集光位置のズレへの影響を低減することができる。以下、具体的に説明する。

集光レンズ６の瞳径は、集光レンズ６のＮＡによって決定され、瞳径とＮＡは比例関係にある。また、瞳の径方向の位置ズレである集光レンズ６の偏芯が、光束の入射角度のズレを生じさせている。以上の関係から、本来の光束（集光レンズ６のＮＡにより定められた角度を有する）に対するミラー８への入射角度のズレの割合は、集光レンズ６の瞳径に対する集光レンズ６の偏芯量の割合と対応している。

本構成として、例えば、集光レンズ６の瞳径が１４．４ｍｍ（集光レンズ６のＮＡを０．４、倍率を１０Ｘとし、その場合に設計される瞳径である）である場合、集光レンズ６の偏芯量が０．１ｍｍ発生したとするならば、集光レンズ６の瞳径に対する集光レンズ６の偏芯量の割合は、０．１/７．２で算出され、１．４％程でしかない。即ち、本来の光束の角度（ＮＡによって定まる角度）に対するミラー８への光束の入射角度のズレの割合は微小なものとなる。そのため、集光レンズ６の移動に伴って生じるミラー８への光束の入射角度のズレによる、標本Ｓでの集光位置のズレへの影響は小さくなる。従って、第１の実施形態と同様に、大きなＮＡを有する程（集光レンズ６の瞳径が大きい程）、標本Ｓでの集光位置のズレへの影響が小さくなると言い換えることができる。
以上を踏まえると、集光レンズ６によって集光されるある程度の角度を有する光束（収束光または発散光）を反射するミラー８を有し、ミラー８と集光レンズ６の間の光学的距離が変更される本構成では、集光レンズ６の偏芯による標本Ｓでの集光位置のＺ軸方向のズレへの影響を抑制し、Ｚ軸方向の分解能を損なうことなく、光シートを形成することができる。特に、上記のようにＮＡが０．４程であれば、集光レンズ６の偏芯による、標本Ｓでの集光位置のズレを効果的に抑制できる。

また、本構成によれば、集光レンズ６に角度ズレが生じたとしても光束が集光レンズ６の瞳位置に入射していれば、ミラー８への入射位置は変更されない。従って、集光レンズ６に角度ズレが生じても、標本Ｓでの集光位置のＺ軸方向へのズレは発生せず、Ｚ軸方向の分解能を損なうことなく、光シートを形成することができる。

また、シート照明装置４０においても、シート照明装置１０と同様、ミラー８から標本Ｓまでの間の照明光学系４２が拡大光学系で構成され、尚且つ、ミラー８が集光レンズ６からの光束を反射して集光レンズ６に再入射させる構成を有している。即ち、上記構成によれば、少ないミラー８の移動量で標本Ｓを大きく走査することが可能であり、迅速な光シートの形成を可能とする。また、ミラー８を大きく移動させる必要が無いことから、ミラー８の移動に起因する角度ズレ等を実質減少し得るため、より標本Ｓの集光位置のズレの発生を低下させ得る。

以上から、シート照明装置４０においても、観察時の分解能を劣化させずに光シートを形成することができる。

以下、第４の実施形態におけるシート照明装置５０について説明する。図６は、シート照明装置５０の構成を示す図である。シート照明装置５０では、駆動モータ１４の代わりに駆動モータ５１を備え、さらに、集光レンズ６とミラー８との間に配置されるディスク５２を備えている点で、シート照明装置１０と異なる。

ディスク５２は、集光レンズ６の光軸と垂直な方向の平面上の領域毎に厚みの異なる平行平面板を有するディスクである。ディスク５２は、駆動モータ５１によって軸５３を中心に回転移動し、集光レンズ６とミラー８との間に配置される、上記領域を変更する。また、駆動モータ５１は、制御装置１５によって制御される。

以上の構成によれば、ディスク５２を回転させることで、集光レンズ６とミラー８との間に配置されるディスク５２の領域の厚みが変わり、光学的距離が変更されるため、集光レンズ６からの光束の集光位置、ひいては照明光学系５４の集光位置が変更される。従って、標本Ｓ上での励起光の集光位置を変更することができる。尚、シート照明装置５０は、集光レンズ６とミラー８との間の物理的距離を変更することなく、光学的距離を変更することで、標本Ｓでの集光位置を変更する。

また、本構成では、ディスクを回転させるという動作により光学的距離を変更しているため、ミラー８や集光レンズ６を、モータを駆動させることで移動させるよりもより高速に標本Ｓ上での集光位置を変更することができる。

また、シート照明装置５０においても、シート照明装置１０と同様、ミラー８から標本Ｓまでの間の照明光学系５４が拡大光学系で構成され、尚且つ、ミラー８が集光レンズ６からの光束を反射して集光レンズ６に再入射させる構成を有している。即ち、上記構成によれば、少ないミラー８の移動量で標本Ｓを大きく走査することが可能であり、迅速な光シートの形成を可能とする。また、ミラー８を大きく移動させる必要が無いことから、ミラー８の移動に起因する角度ズレ等を実質減少し得るため、より標本Ｓの集光位置のズレの発生を低下させ得る。

従って、シート照明装置５０においても、観察時の分解能を劣化させずに光シートを形成することができる。

また、標本Ｓでの集光位置のＺ軸方向の変更は、図示しないステージをＺ軸方向に移動させることで行なってもよいが、ＰＢＳ５を図６のＹ軸方向を軸として回転させることで行なってもよい。ＰＢＳ５を回転させることで、光束が照明光学系５４の光軸に対して垂直な方向に偏芯し、標本Ｓの集光位置をＺ軸方向に変更することができる。

また、シート照明装置５０は、照明光学系５４中のレンズ等を動かさない構成であるため、光学設計上のシミュレーションを容易に行なうことができる。

以下、第５の実施形態におけるシート照明装置６０について説明する。図７は、シート照明装置６０の構成を示す図である。シート照明装置６０では、駆動モータ１４の代わりに駆動モータ６１を備え、さらに、集光レンズ６とミラー８との間に配置される平行平面板６２を備えている点で、シート照明装置１０と異なる。

駆動モータ６１は、平行平面板６２を集光レンズ６の光軸と垂直な軸上で回転させる。尚、駆動モータ６１は、制御装置１５によって制御される。

本構成では、平行平面板６２を回転させて、平行平面板に入射する光の屈折角を変えることにより、光束が通過する光学的距離を変更する。即ち、集光光学系６の焦点面を変更することなく、光学的距離を変更することで、標本Ｓでの集光位置を変更する。

また、平行平面板６２を回転させるとき、平行平面板６２が集光レンズ６の光軸と垂直な状態を０度として、回転角度が４０度以下であり０度以上であるときには、０度のときと比べて、集光位置が集光レンズ６の光軸方向に遠くへシフトする。即ち、標本Ｓの集光位置をＸ軸方向に変更することができる。従って、シート照明装置１０と同様にＸ軸方向の励起光の集光位置の変更を行ない、光シートを形成することができる。

平行平面板６２を回転させたとしても、集光光束はミラー８に対して垂直に入射するため、集光レンズ６へ折り返し入射する光束の角度変化は微小である。

また、平行平面板６２が角度をもつことで、非点収差が発生するが、ミラー８によって光路が折り返されることにより、非点収差は打ち消される。

従って、シート照明装置６０においても、観察時の分解能を劣化させずに光シートを形成することができる。

以下、第６の実施形態におけるシート照明装置７０について説明する。図８は、シート照明装置７０の構成を示す図である。シート照明装置７０は、照明光学系７１中に、シリンドリカルレンズ７２を備えている点で、シート照明装置１０と異なっているがそれ以外の点は同様である。

シリンドリカルレンズ７２は、図８のＸＹ平面上で屈折力をもつレンズである。即ち、シート照明装置７０では、励起光の光束は、ＸＹ平面上においてシリンドリカルレンズ７２によって標本Ｓの手前で集光される。

図９（Ａ）は、シート照明装置７０によって標本Ｓに励起光が照射される様子をＸＹ平面上から見た図であり、図９（Ｂ）は、シート照明装置７０によって標本Ｓに励起光が照射される様子をＸＺ平面上から見た図である。ここで両図は、標本Ｓ内に励起光（照明光）を吸収するような異物Ａが存在する場合を示している。図９（Ａ）、（Ｂ）では、異物Ａは、ＸＺ平面上から見たときの集光位置の手前に存在している。

仮に、シリンドリカルレンズ７２が構成として存在しない場合に、図９（Ｂ）のようにコンデンサレンズ１３の集光位置の手前に異物Ａがあるような場合、異物Ａの後方に光が届かず影が生じることがある。

一方で本構成のシート照明装置７０によれば、図９（Ａ）のようにシリンドリカルレンズ７２によって、標本Ｓの手前で励起光が集光し、標本ＳにＸＹ平面上で発散光束が照射される。この状態で、ガルバノスキャナ１２によりＹ軸方向に標本Ｓを走査することで、シリンドリカルレンズ７２によって形成される発散光束が異物Ａの後方においても照射される。従って、異物Ａが存在することで、ＸＹ平面上で光シートを形成する際に異物Ａの後方に励起光が照射されない領域（影が生じる領域）が生じる場合であっても、Ｙ軸方向に標本Ｓを走査することにより励起光を異物Ａの後方においても照射することができ、影の発生を抑制できる。

また、シート照明装置７０は、シリンドリカルレンズ７２を有する点以外は、シート照明装置１０と同様であるため、第１の実施形態と同様に、観察時の分解能を劣化させずに光シートを形成することができる。

以下、第７の実施形態におけるシート照明装置８０について説明する。図１０は、シート照明装置８０の構成を示す図である。シート照明装置８０は、アキシコンレンズ８１を備えている点でシート照明装置１０と異なっているがそれ以外の点は同様である。

アキシコンレンズ８１により、アキシコンレンズ８１と、コレクタレンズ２との間に直線状に集光するベッセルビームが形成される。即ち、シート照明装置８０によれば、励起光は、点ではなく、直線状に標本Ｓ上に集光される。従って、本構成によれば、励起光が点で集光される構成と比べて、より少ないＸ軸方向への集光位置の変更、即ち、光学的距離変更手段が行なうミラー８と集光レンズ６の間の光学的距離の少ない変更によってＸＹ平面上で光シートを形成することができ、光シートの形成をより高速に行なうことができる。

また、シート照明装置８０は、アキシコンレンズ８１を有する点以外は、シート照明装置１０と同様であるため、第１の実施形態と同様に、観察時の分解能を劣化させずに光シートを形成することができる。

以下に、上述した実施形態のシート照明装置を用いて標本Ｓ上に光シートを形成し、蛍光画像を得る手順を、図面を用いて説明する。図１１は、光シートを形成して蛍光画像を取得する一連の手順を示すフローチャートである。図１２は、光シートを形成する方法の一つである第１の光シート形成方法の手順を示すフローチャートである。図１３は、図１２とは異なる光シートを形成する方法である、第２の光シート形成方法の手順を示すフローチャートである。尚、蛍光画像を取得するフローチャート、及び、第１、２の光シート形成方法は、制御装置１５が上述したシート照明装置を制御することで実行される。以下、図１１の蛍光画像を取得する手順を示したフローチャートを説明する。

図１１のステップＳ１では、標本Ｓに対して励起光を照射する空間領域を決定する。ここでいう励起光を照射する空間領域とは、標本Ｓ内のＸ軸Ｙ軸Ｚ軸で決定される３次元空間上における任意の領域である。

ステップＳ２では、ステップＳ１で決定された空間領域内のＺ軸方向における照射領域を設定する。尚、ここでいうＺ軸方向における照射領域とは、空間領域内のあるＺ位置でのＸＹ平面上の領域を示す。また、ステップＳ２は、後述するループ処理に際してステップＳ１で設定されている空間領域内で、Ｚ軸方向に照射領域を変更する。

ステップＳ３では、ステップＳ２で設定された照射領域内のＹ軸方向における照射範囲を設定する。尚、ここでいう照射範囲とは、照射領域内のＹ軸方向のある位置におけるＸ軸方向の範囲を示す。また、ステップＳ３では、後述するループ処理に際してステップＳ２で設定されている照射領域内で、Ｙ軸方向に照射範囲を変更する。

ステップＳ４では、光シートを形成し、蛍光の情報を含む信号を取得する。ステップＳ４の具体的な処理は、後述する図１２の第１の光シート形成方法のフローチャートと、図１３の第２の光シート形成方法のフローチャートで説明する。ステップＳ４を終了すると、処理をステップＳ５へ移行する。

ステップＳ５では、ＸＹ平面の所定の領域、即ち、ステップＳ２で設定された照射領域を走査済みかどうか判定する。ステップＳ５の判定がＮｏである場合、ステップＳ３へ移行し、Ｙ軸方向における照射範囲をステップＳ２で設定されている照射領域内で変更する。この後、ステップＳ５でＹｅｓと判定されるまで、ステップＳ３からＳ５をループする。ステップＳ５の判定がＹｅｓである場合、処理をステップＳ６へ移行する。

ステップＳ６では、Ｚ軸方向の所定の領域、即ち、ステップＳ１で設定された空間領域を、全て走査済みかどうかを判定する。ステップＳ６の判定がＮｏである場合、ステップＳ２へ以降し、Ｚ軸方向における照射領域をステップＳ１で設定されている空間領域内で変更する。この後、ステップＳ６でＹｅｓと判定されるまで、ステップＳ２からＳ６をループする。ステップＳ６の判定がＹｅｓである場合、ステップＳ７へ移行する。

ステップＳ７では、画像処理手段２５によって、蛍光画像を生成する。このとき、標本Ｓにおいて励起光で走査して得た空間領域の蛍光の信号を積算して蛍光画像を生成する。ステップＳ７を終えると、本フローチャートを終了する。

以下、図１１のステップＳ４の処理として行なう第１の光シート形成方法の手順を、図１２を用いて説明する。

図１２のステップＳ１１では、励起光を標本Ｓ上に照射する。このとき励起光は、照明光学系によって標本Ｓ上に集光される。

ステップＳ１２では、観察光学系制御手段２４がカメラ１７を露光させた状態で、光学的距離変更手段（各実施形態における光学的距離変更手段）を制御し、図１１のステップＳ３で決定された照射範囲内で、Ｘ軸上に励起光の集光位置を変更させていく。カメラ１７の露光中に励起光で標本Ｓを走査することで、励起光が照射された照射範囲からの蛍光の信号を取得することができ、擬似的に光シートを形成した領域からの蛍光の信号を取得したこととなる。

次に、図１１のステップＳ４の処理として行なう第２の蛍光画像取得方法の手順を、図１３を用いて説明する。

ステップＳ２１では、励起光を標本Ｓ上に照射する。このとき励起光は、照明光学系によって標本Ｓ上に集光される。

ステップＳ２２では、励起光が標本Ｓに照射されている状態で観察光学系制御手段２４がカメラ１７を露光させる。即ち、ステップＳ２２では、標本Ｓ上に集光された励起光により生じる蛍光の信号を取得する。

次に、ステップＳ２３では、光学的距離変更手段（各実施形態における光学的距離変更手段）を制御し、図１１のステップＳ３で決定された照射範囲内で、Ｘ軸上に励起光の集光位置を変更させる。またこのとき、カメラ１７は露光させていない状態である。

ステップＳ２４では、観察光学系制御手段２４が再びカメラ１７を露光させ、ステップＳ２３で変更された集光位置からの蛍光画像を取得する。

ステップＳ２５では、Ｘ軸方向に所定の領域を走査したかどうかを判断する。ここでいう所定の領域とは、図１１のステップＳ３で決定された照射範囲を示す。これは、例えば、光学的距離変更手段である駆動モータ等を制御する制御装置１５の第１制御手段２１が行なう。ステップＳ２５の判定がＮｏならば、ステップＳ２３に戻り、ステップＳ２５の判定がＹｅｓとなるまでステップＳ２３からＳ２５を繰り返す。

上述した実施形態は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。上述したシート照明装置は、特許請求の範囲に記載した本発明を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。

１０、３０、４０、５０、６０、７０、８０ シート照明装置
１ 光源
２ コレクタレンズ
３、８２ 光源ユニット
４、３２、４２、５４、７１ 照明光学系
５、３１ ＰＢＳ
６ 集光レンズ
７ １／４λ板
８ ミラー
９、１１ リレーレンズ
１２ ガルバノスキャナ
１３ コンデンサレンズ
１４、４１、５１、６１ 駆動モータ
１５ 制御装置
１６ 観察光学系
１７ カメラ
１８ モニタ
２１ 第１制御手段
２２ 第２制御手段
２３ 光源調整手段
２４ 観察光学系制御手段
２５ 画像処理手段
５２ ディスク
５３ 軸
６２ 平行平面板
７２ シリンドリカルレンズ
８１ アキシコンレンズ
Ｓ 標本
Ａ 異物

Claims (9)

1. 標本からの光を結像する観察光学系の光軸と垂直な方向から、前記標本に励起光を入射させるシート照明装置であって、
   前記励起光を前記標本へ導光する照明光学系と、
   前記照明光学系内の光路の光学的距離を変更する光学的距離変更手段と、を含み、
   前記照明光学系は、
   該照明光学系の光路中で前記励起光を集光させる第１の集光光学系と、
   前記第１の集光光学系によって集光される収束光または発散光を、前記第１の集光光学系へ再入射させる反射光学素子と、含み、
   前記光学的距離変更手段は、前記第１の集光光学系と前記反射光学素子との間の光学的距離を変更し、
   前記照明光学系は、前記第１の集光光学系の集光位置における像を前記標本へ拡大投影する
   ことを特徴とするシート照明装置。
2. 請求項１に記載のシート照明装置であって、
   前記光学的距離変更手段は、前記第１の集光光学系と前記反射光学素子との間の物理的距離を変更する
   ことを特徴とするシート照明装置。
3. 請求項２に記載のシート照明装置であって、
   前記光学的距離変更手段は、前記反射光学素子を前記第１の集光光学系の光軸方向に移動させる
   ことを特徴とするシート照明装置。
4. 請求項２に記載のシート照明装置であって、
   前記光学的距離変更手段は、前記第１の集光光学系を前記第１の集光光学系の光軸方向に移動させる
   ことを特徴とするシート照明装置。
5. 請求項１に記載のシート照明装置であって、さらに、
   前記第１の集光光学系と前記反射光学素子との間に平行平面板を含み、
   前記光学的距離変更手段は、前記第１の集光光学系の光軸と垂直な軸上で前記平行平面板を回転させる
   ことを特徴とするシート照明装置。
6. 請求項１に記載のシート照明装置であって、さらに、
   前記第１の集光光学系と前記反射光学素子との間に配置される、領域毎に厚みの異なる平行平面板を含み、
   前記光学的距離変更手段は、前記第１の集光光学系と前記反射光学素子との間の光路中に配置する前記平行平面板の前記領域を変更する
   ことを特徴とするシート照明装置。
7. 請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載のシート照明装置であって、さらに、
   前記励起光を出力する光源ユニットと、
   前記光源ユニットからの前記励起光を前記第１の集光光学系の光軸方向であって、前記反射光学素子へ向かう方向へ偏向させる偏向光学素子と、を含む
   ことを特徴とするシート照明装置。
8. 請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載のシート照明装置であって、
   前記反射光学素子は、前記第１の集光光学系の集光位置近傍に配置される
   ことを特徴とするシート照明装置。
9. 請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載のシート照明装置であって、
   前記照明光学系の開口数は、０．５未満である
   ことを特徴とするシート照明装置。

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