JP6516705B2

JP6516705B2 - Ｈｂｖ感染に対する抗ウイルス剤としてのスルファモイルベンズアミド誘導体

Info

Publication number: JP6516705B2
Application number: JP2016143481A
Authority: JP
Inventors: グオ，ジュ−タオ; シュ，シャオドン; ブロック，ティモシー，エム．
Original assignee: Baruch S.Blumberg Institute; INSTITUTE FOR HEPATITIS AND VIRUS RESEARCH
Current assignee: Baruch S.Blumberg Institute; INSTITUTE FOR HEPATITIS AND VIRUS RESEARCH
Priority date: 2011-07-01
Filing date: 2016-07-21
Publication date: 2019-05-22
Anticipated expiration: 2032-06-29
Also published as: WO2013006394A1; US20210070703A1; EP2726459A1; JP2019151639A; CN103889953B; EP2726459A4; EP2726459B1; JP2014523901A; CN103889953A; JP5977347B2; US20160101074A1; US20140206666A1; US20170320818A1; US9399619B2; US9758477B2; CN106166157B; EP3085368A1; CN106166157A; US20190337891A1; JP2017014225A

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年７月１日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６１／５０３８３０の利益を請求し、これは全範囲において参照として本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本発明は、プレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤として有益な、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染および関連疾患の処置のために有用な化合物および方法を記載する。

発明の背景
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染は、依然として主要な公衆衛生問題のままである。現在、世界中で推計３億５千万人の人々および米国内で１４０万人が、慢性的にＨＢＶに感染している(McMahon, 2005)。処置せずに放置した場合、これらの個人の約３分の１が、肝硬変および肝細胞癌などの重篤な肝疾患により死亡するであろう(Lee, 1997; Lok, 2004)。

慢性Ｂ型肝炎の管理のために７種の医薬品が現在入手可能であり、これはアルファインターフェロン（標準品およびペグ型）の２種の配合物およびＨＢＶＤＮＡポリメラーゼを阻害する５種のヌクレオシ（チ）ド類似体（ラミブジン、アデフォビル、エンテカビル、テルビブジン、およびテノフォビル）を含む(Keeffe et al., 2008)。現在において、好ましい第１選択療法の選択は、エンテカビル、テノフォビルまたはペグ−インターフェロンアルファ−２ａである。しかしながら、第１選択療法オプションを用いても、ペグ−インターフェロンアルファ−２ａは、処置された患者の３分の１にのみわずかな血清学的マイルストーンを達成するのに有効であり、重篤な副作用を頻繁に伴う(Janssen et al., 2005; Lau et al., 2005; Perrillo, 2009)。エンテカビルおよびテノフォビルは極めて強力なＨＢＶ阻害剤であるが、長期間または場合により生涯にわたる処置が、ＨＢＶ複製を継続的に抑制するために要求され、これは薬剤抵抗性ウィルスの発生のために最終的に機能しなくなり得る(Dienstag, 2009)。ゆえに、国立アレルギー感染病研究所（ＮＩＡＩＤ）により最優先関心領域として列挙されている慢性Ｂ型肝炎の新規、安全かつ効果的な治療の導入についての差し迫った必要性がある。

ＨＢＶは、ヘパドナウイルス科に属する非細胞変性型、肝臓向性ＤＮＡウィルスである。プレゲノム（ｐｇ）ＲＮＡは、ＨＢＶＤＮＡの逆転写複製のためのテンプレートであり、ウィルス性ＤＮＡポリメラーゼを伴うヌクレオカプシドへのそのカプシド形成は、引き続くウィルスＤＮＡ合成に必須である。プレゲノムＲＮＡ（ｐｇ）カプシド形成の阻害は、ＨＢＶ複製を阻止し、ＨＢＶの処置への新規の治療手法を提供するであろう。

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臨床的に、プレゲノムＲＮＡ（ｐｇ）カプシド形成の阻害は以下の治療的利点を提供する：第１に、プレゲノムＲＮＡ（ｐｇ）カプシド形成の阻害は、現在の医薬に耐性がない、または現在の医薬から利益を享受しない患者の部分母集団のための追加の選択肢を提供することにより、現在の医薬を補完するであろう(Akbar et al., 2009; Liaw, 2009; Peters, 2009; Wiegand, van Bommel, およびBerg)。第２に、これらの特徴のある抗ウィルス機構に基づいて、プレゲノムＲＮＡ（ｐｇ）カプシド形成の阻害は、現在入手可能なＤＮＡポリメラーゼ阻害剤に耐性のあるＨＢＶ変異体に対し有効であろう(ZoulimおよびLocarnini, 2009)。第３に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染のための高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）のように(EsteおよびCihlar)、プレゲノムＲＮＡ（ｐｇ）カプシド形成の阻害剤のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤との併用治療は、ＨＶＢ複製を相乗的に抑制し、薬剤耐性の発生を回避し、およびしたがって慢性Ｂ型肝炎感染のためのより安全かつより効果的な処置を提供するであろう。

Ｂ型肝炎ウィルスに感染した患者の治療において疾患修飾するのみならず有効である新規の抗ウィルス薬についての長年にわたる要求がある。また、薬剤耐性Ｂ型肝炎ウィルスに感染した患者の治療において疾患修飾するのみならず有効である新規の抗ウィルス薬についての明確かつ目下の要求がある。本発明は、Ｂ型肝炎ウィルスに感染した患者の治療において疾患修飾するのみならず有効である新規の抗ウィルス薬についての要求を対処する。
発明の概要

本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染および関連疾患の処置のためのＨＢＶのプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤として有用な式（Ｉ）で表されるスルファモイルベンズアミド誘導体の使用の新規な方法に向けられる。
水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよびこれらの複合体を含み、ここで：
Ｒ^１は、水素である；
Ｒ^２は、水素、メチル、トリフルオロメチル、フッ素および塩素からなる群から選択される；
Ｒ^３は、水素、メチル、フッ素および塩素からなる群から選択される；
Ｒ^４は、水素、フッ素、塩素およびメチルからなる群から選択される；
Ｒ^５は、水素および塩素からなる群から選択される；
Ｒ^７は、水素、塩素、フッ素および臭素からなる群から選択される；
Ｒ^９は、水素、メチル、フッ素および塩素からなる群から選択される；
Ｒ^ｘは、ＮＨ_２,
からなる群から選択される；

本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染および関連疾患の処置のためのＨＢＶのプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤として有用な式（ＩＩ）で表されるスルファモイルベンズアミド誘導体の使用の新規な方法にさらに向けられる。
水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよびこれらの複合体を含み、ここで：
Ｒ^ｘは、
からなる群から選択される；

本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染および関連疾患の処置のためのＨＢＶのプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤として有用な式（ＩＩＩ）で表されるスルファモイルベンズアミド誘導体の使用の新規な方法にさらに向けられる。
水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよびこれらの複合体を含み、ここで：
Ｒ^１０は、水素、メチル、塩素および臭素からなる群から選択される；
Ｒ^ｙは、
からなる群から選択される；

本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染および関連疾患の処置のためのＨＢＶのプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤として有用な式（ＩＶ）で表されるスルファモイルベンズアミド誘導体の使用の新規な方法にさらに向けられる。
水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよびこれらの複合体を含む。

本発明は、さらに、有効量の１種または２種以上の本発明にかかる化合物および賦形剤を含む組成物に関する。

本発明は、また、例えばＨＢＶ感染を含むプレゲノムＲＮＡカプシド形成を伴う疾患を処置または予防するための方法に関し、ここで、前記方法は、有効量の本発明にかかる化合物または組成物を対象に投与することを含む。

本発明は、さらにまた、例えばＨＢＶ感染を含むプレゲノムＲＮＡカプシド形成を伴う疾患を処置または予防するための方法に関し、ここで、前記方法は、有効量の１種または２種以上の本発明にかかる化合物および賦形剤を含む組成物を対象に投与することを含む。

本発明は、また、ＨＢＶ感染と関連する疾病または疾患およびプレゲノムＲＮＡカプシド形成と関連する疾病を処置または予防するための方法に関する。ここで、前記方法は、有効量の本発明にかかる化合物または組成物を対象に投与することを含む。

本発明は、また、ＨＢＶ感染と関連する疾病または疾患およびプレゲノムＲＮＡカプシド形成と関連する疾病を処置または予防するための方法に関し、ここで、前記方法は、有効量の１種または２種以上の本発明にかかる化合物および賦形剤を含む組成物を対象に投与することを含む。

これらおよび他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲の解釈から当業者に明らかとなるであろう。本明細書中における全ての百分率、比率および割合は、他に規定されない限り、重量による。全ての温度は、他に規定されない限り、セ氏温度においてである。引用された全ての文献は、関連する部分において、参照により本明細書中に組み込まれ、どの文献の引用箇所も、本発明についての従来技術であるとの自白として解釈されるものではない。

図面の簡単な説明
図１：ＨｅｐＤＥＳ１９細胞におけるＨＢＶＤＮＡ複製についての本発明の選択された化合物の効果。ＨｅｐＤＥＳ１９細胞を、未処理のままにした（対照）または６日間、示された濃度の本開示の化合物で処理した。細胞内のヌクレオカプシド関連ＨＢＶＤＮＡを抽出し、電気泳動法により１．５％アガロースゲル中で分離させ、サザンブロットハイブリダイゼーションにより測定した。略語：ｒｃＤＮＡ：弛緩型環状ＤＮＡ；ｄｓｌＤＮＡ：線状二本鎖ＤＮＡ；ｓｓＤＮＡ：単鎖ＤＮＡ

図２：ラミブジンおよびＢａｙ４１−４１０９とのＤＶＲ−２３の抗ウィルス活性の比較。ＨｅｐＤＥＳ１９細胞を、未処理のままにした（ＮＴ）または４日間、示された濃度（μＭ）のＤＶＲ−２３、ラミブジンまたはＢａｙ４１−４１０９で処理した。細胞質核関連ＨＢＶＤＮＡ複製中間体を抽出し、サザンブロットハイブリダイゼーションにより測定した。ＲＣ、ＬおよびＳＳは、それぞれ、弛緩型環状、線状二本鎖および単鎖ＨＢＶＤＮＡを示す。

図３：本発明の化合物の抗ウィルス機構。ＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞を未処理のままにした（ＮＴ）または２日間、示された濃度の開示の化合物ＤＶＲ−１、ＤＶＲ−５６およびＤＶＲ−２３で、それぞれ、処理した。Ｂａｙ−４１０９（５μＭ）またはＡＴ−６１（２５μＭ）を、陽性対照として供した。（Ａ）細胞内ウィルスＲＮＡをノーザンブロットハイブリダイゼイションにより測定した。（Ｂ）ヌクレオカプシドの合計量を粒子ゲルアッセイにより測定した。（Ｃ）カプシド化されたｐｇＲＮＡを抽出し、ノーザンブロットにより計測した。（Ｄ）膜上でのヌクレオカプシドのアルカリ処理、続いての粒子ゲルアッセイおよびＨＢＶ−特異的リボプローブを用いてハイブリダイズすることにより、ヌクレオカプシド関連ＨＢＶＤＮＡを定量した。（Ｅ）ＨＢＶＤＮＡ複製中間体を抽出し、サザンブロットハイブリダイゼーションにより測定した。発明の詳細な説明

本発明のプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤は、プレゲノムＲＮＡカプシド形成、例えばＨＢＶ感染に関連する疾病を処置および予防することが可能である。プレゲノム（ｐｇ）ＲＮＡは、ＨＢＶＤＮＡの逆転写複製のためのテンプレートであり、ウィルス性ＤＮＡポリメラーゼを伴うヌクレオカプシドへのそのカプシド形成は、引き続くウィルスＤＮＡ合成に必須である。理論により限定されることを望むことなく、プレゲノムＲＮＡカプシド形成の阻害は、プレゲノムＲＮＡカプシド形成、例えばＨＢＶ感染に関連する疾病を改善する、緩和するまたはさもなければ制御できるようにすることができると信じられている。本発明のプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤は、現在の臨床用途におけるＨＢＶ抗ウィルス薬から化学的におよび機構的に区別されるＨＢＶ感染の処置のための新規かつ安全な抗ウィルス剤を特定する明確かつ満たされていない要求に対処する。

臨床的に、本発明のプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤は、現在の医薬に耐性がない、または現在の医薬から利益を享受しない患者の部分母集団のための追加の選択肢を提供することにより、現在の医薬を補完する (Akbar et al., 2009; Liaw, 2009; Peters, 2009; Wiegand, van Bommel, およびBerg)。加えて、本発明のプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤は、現在入手可能なＤＮＡポリメラーゼ阻害剤に耐性のあるＨＢＶ変異体に対し有効であるかもしれない(Zoulim and Locarnini, 2009)。さらに、本発明のプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤との併用治療は、ＨＶＢ複製を相乗的に抑制し、薬剤耐性の発生を回避し得、慢性Ｂ型肝炎感染のためのより安全かつより効果的な処置を提供する(Billioud et al., 2011)。

本明細書を通じて、組成物が特定の成分（component）を有する(having)、含む(including)または含む(comprising)ものとして記載される場合、またはプロセスが具体的なプロセスステップを有する(having)、含む(including)または含む(comprising)ものとして記載される場合、本教示の組成物はまた、列挙された成分から本質的になる(consist essentially of)またはからなり(consist of)、プロセスは、列挙されたプロセスステップから本質的になる(consist essentially of)またはからなる(consist of)ことが期待される。

本願において、要素（element）または成分が含まれるおよび／または列挙された要素もしくは成分から選択されるといわれている場合、要素または成分は、列挙された要素または成分のいずれか１つであり得、２または３以上の列挙された要素または成分からなる群から選択され得ると理解されるべきである。

本明細書において、単数形の使用は、他に規定されない限り、複数形を包含する（逆の場合も同じ）。加えて、用語「約」の使用が定量値の前である場合、本教示は、また、他に具体的に規定されない限り、特定の定量値そのものを含む。

ステップの順序またはある動作を行うための順序は、本教示が使用可能である限り重要でないと理解されるべきである。さらに、２または３以上のステップまたは動作は、同時に実施され得る。

本明細書において、用語「ハロゲン」は、塩素、臭素、フッ素およびヨウ素を意味するものとする。

本明細書において、他に断りのない限り、単独で用いられても置換基の部分として用いられても、「アルキル」および／または「脂肪族」は、１〜２０個の炭素原子またはこの範囲内の任意の数、例えば１〜６個の炭素原子または１〜４個の炭素原子を有する直鎖または分岐炭素鎖をいう。炭素原子の指定された数（例えば、Ｃ_１〜６）は、独立してアルキル部位におけるまたはより大きなアルキル含有置換基への炭素原子の数をいう。アルキル基の非限定の例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどを含む。アルキル基は、任意に置換され得る。置換されたアルキル基の非限定の例は、ヒドロキシメチル、クロロメチル、トリフルオロメチル、アミノメチル、１−クロロエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジフルオロエチル、３−カルボキシプロピルなどを含む。（Ｃ_１〜６アルキル）_２アミノなどの複数のアルキル基を有する置換基において、アルキル基は同一であっても異なっていてもよい。

本明細書において、単独で用いられても置換基の部分として用いられても、「アルケニル」および「アルキニル」基は、２または３個以上の、好ましくは２〜２０個の炭素原子を有する直鎖または分岐炭素鎖をいい、ここでアルケニル鎖は鎖中に少なくとも１個の２重結合を有し、およびアルキニル鎖は鎖中に少なくとも１個の３重結合を有する。アルケニルおよびアルキニル基は、任意に置換され得る。アルケニル基の非限定の例は、エテニル、３−プロペニル、１−プロペニル（また２−メチルエテニル）、イソプロペニル（また２−メチルエテン−２−イル）、ブテン−４−イルなどを含む。置換されたアルケニル基の非限定の例は、２−クロロエテニル（また２−クロロビニル）、４−ヒドロキシブテン−１−イル、７−ヒドロキシ−７−メチルオクタ−４−エン−２−イル、７−ヒドロキシ−７−メチルオクタ−３，５−ジエン−２−イルなどを含む。アルキニル基の非限定の例は、エチニル、プロパ−２−イニル（またプロパルギル）、プロピン−１−イルおよび２−メチル−ヘキサ−４−イン−１−イルを含む。置換されたアルキニル基の非限定の例は、５−ヒドロキシ−５−メチルヘキサ−３−イニル、６−ヒドロキシ−６−メチルヘプタ−３−イン−２−イル、５−ヒドロキシ−５−エチルヘプタ−３−イニルなどを含む。

本明細書において、単独で用いられても置換基の部分として用いられても、「シクロアルキル」は、例えば３〜１４個の環炭素原子、好ましくは３〜７個もしくは３〜６個の環炭素原子または３〜４個の環炭素原子を有する環化アルキル、アルケニルおよびアルキニル基を含む非芳香族炭素含有環をいい、任意に１または２個以上（例えば、１、２、または３個）の２重または３重結合を含有する。シクロアルキル基は、単環式（例えばシクロヘキシル）または多環式（例えば縮合、架橋および／またスピロ環系を含有する）であり得、炭素原子は環系の内部または外部に配置される。シクロアルキルのいずれの適切な環の位置も、定義される化学構造に共有的に結合され得る。シクロアルキル環は、任意に置換され得る。シクロアルキル基の非限定の例は：シクロプロピル、２−メチル−シクロプロピル、シクロプロペニル、シクロブチル、２，３−ジヒドロキシシクロブチル、シクロブテニル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロオクタニル、デカリニル、２，５−ジメチルシクロペンチル、３，５−ジクロロシクロヘキシル、４−ヒドロキシシクロヘキシル、３，３，５−トリメチルシクロヘキサ−１−イル、オクタヒドロペンタレニル、オクタヒドロ−１Ｈ−インデニル、３ａ，４，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロ−３Ｈ−インデン−４−イル、デカヒドロアズレニル、ビシクロ［６．２．０］デカニル、デカヒドロナフタレニル、およびドデカヒドロ−１Ｈ−フルオレニルを含む。用語「シクロアルキル」はまた、２環式炭化水素環である炭素環を含み、この非限定的な例は、ビシクロ−［２．１．１］ヘキサニル、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル、ビシクロ［３．１．１］ヘプタニル、１，３−ジメチル［２．２．１］ヘプタン−２−イル、ビシクロ［２．２．２］オクタニルおよびビシクロ［３．３．３］ウンデカニルを含む。

「ハロアルキル」は、特定数の炭素原子を有し、１または２個以上のハロゲンで置換された分岐または直鎖の両方の飽和脂肪族炭化水素基をいう。ハロアルキル基は、パーハロアルキル基を含み、ここで、アルキル基の全ての水素はハロゲンにより置換されている（例えば、−ＣＦ_３、−ＣＦ_２ＣＦ_３）。ハロアルキル基はハロゲンに加えて１または２個以上の置換基により任意に置換され得る。ハロアルキルの例は、これに限定されないが、フルオロメチル、ジクロロエチル、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、およびペンタクロロエチル基を含む。

用語「アルコキシ」は、基−Ｏ−アルキルをいい、ここで、アルキル基は上に定義した通りである。アルコキシ基は、任意に置換されてもよい。用語「Ｃ_３−Ｃ_６環状アルコキシ」は３〜６個の炭素原子および少なくとも１個の酸素原子を含有する環をいう（例えば、テトラヒドロフラン、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン）。Ｃ３〜Ｃ６環状アルコキシ基は任意に置換されてもよい。

単独で用いられても他の基の部分として用いられても、用語「アリール」は本明細書において６炭素員の不飽和芳香族単環式環としてまたは１０〜１４炭素員の不飽和芳香族多環式環と定義される。アリール環は、例えば、１または２個以上の水素原子を置換可能な１または２以上の部分によりそれぞれ任意に置換されたフェニルまたはナフチル環であり得る。アリール基の非限定の例は：フェニル、ナフチレン−１−イル、ナフチレン−２−イル、４−フルオロフェニル、２−ヒドロキシフェニル、３−メチルフェニル、２−アミノ−４−フルオロフェニル、２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）フェニル、２−シアノフェニル、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル、３−メトキシフェニル、８−ヒドロキシナフチレン−２−イル、４，５−ジメトキシナフチレン−１−イル、および６−シアノ−ナフチレン−１−イルを含む。アリール基はまた、例えば、１また２以上の飽和または部分飽和の炭素環（例えば、ビシクロ［４．２．０］オクタ−１，３，５−トリエニル、インダニル）と縮合したフェニルまたはナフチル環を含み、これは、芳香族および／または飽和もしくは部分飽和の環の１または２個以上の炭素原子において置換し得る。

用語「アリールアルキル」または「アラルキル」は、基−アルキル−アリールをいい、ここで、アルキルおよびアリール基は、本明細書において定義した通りである。本発明のアラルキル基は、任意に置換されている。アリールアルキル基の例は、例えば、ベンジル、１−フェニルエチル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、２−フェニルプロピル、フルオレニルメチルなどを含む。

単独で用いられても他の基の部分として用いられても、「複素環の(heterocyclic)」および／または「複素環(heterocycle)」および／または「ヘテロシクリル(heterocylyl)」は、本明細書において３〜２０原子を有する１または２以上の環、ここで、少なくとも１個の環中の１個の原子が窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）から選択されるヘテロ原子であり、かつ、ここでさらにヘテロ原子を含む環が非芳香族である、として定義される。２または３以上の縮合環を含む複素環基において、環を持つ非ヘテロ原子は、アリール（例えばインドリニル、テトラヒドロキノリニル、クロマニル）であってもよい。例となる複素環基は、その１〜５個が独立して窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）から選択されるヘテロ原子である３〜１４個の環原子を有する。複素環基中の１または２個以上のＮまたはＳ原子は、酸化され得る。複素環基は、任意に置換され得る。

１個の環を有する複素環単位の非限定の例は：ジアジリニル、アジリジニル、ウラゾリル、アゼチジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリニル、オキサチアゾリジノニル、オキサゾリジノニル、ヒダントイニル、テトラヒドロフラニル、ピロリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジン−２−オニル（バレロラクタム）、２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−アゼピニル、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール、および１，２，３，４−テトラヒドロ−キノリンを含む。２または３以上の環を有する複素環単位の非限定の例は、ヘキサヒドロ−１Ｈ−ピロリジニル、３ａ，４，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾリル、３ａ，４，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−インドリル、１，２，３，４−テトラヒドロキノリニル、クロマニル、イソクロマニル、インドリニル、イソインドリニルおよびデカヒドロ−１Ｈ−シクロオクタ［ｂ］ピロリルを含む。

単独で用いられても他の基の部分として用いられても、用語「ヘテロアリール」は、本明細書において５〜２０原子を有する１または２以上の環、ここで、少なくとも１個の環中の１個の原子が窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）から選択されるヘテロ原子であり、かつ、ここでさらにヘテロ原子を含む環が芳香族である、として定義される。２または３以上の縮合環を含むヘテロアリール基において、環を持つ非ヘテロ原子は、炭素環（例えば、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−シクロペンタピリミジンまたはアリール（例えばベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インドリニル）であってもよい。例となるヘテロアリール基は、５〜１４個の環原子を有し、１〜５個の独立して窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）から選択されるヘテロ原子を含有する。ヘテロアリール基中の１または２個以上のＮまたはＳ原子は、酸化され得る。ヘテロアリール基は、任意に置換され得る。１個の環を有するヘテロアリール環の非限定の例は：１，２，３，４−テトラゾリル、［１，２，３］トリアゾリル、［１，２，４］トリアゾリル、トリアジニル、チアゾリル、１Ｈ−イミダゾリル、オキサゾリル、フラニル、チオフェンイル、ピリミジニル、２−フェニルピリミジニル、ピリジニル、３−メチルピリジニルおよび４−ジメチルアミノピリジニルを含む。２または３以上の縮合環を含むヘテロアリール環の非限定の例は：ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンズチアゾリル、ベンズトリアゾリル、シンノリニル、ナフチリジニル、フェナントリジニル、７Ｈ−プリニル、９Ｈ−プリニル、６−アミノ−９Ｈ−プリニル、５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジニル、７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジニル、ピリド［２，３−ｄ］ピリミジニル、２−フェニルベンゾ［ｄ］チアゾリル、１Ｈ−インドリル、４，５，６，７−テトラヒドロ−１−Ｈ−インドリル、キノキサリニル、５−メチルキノキサリニル、キナゾリニル、キノリニル、８−ヒドロキシ-キノリニルおよびイソキノリニルを含む。

上述したヘテロアリール基の１つの非限定例は、１〜５個の炭素環原子および独立して窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）から選択されるヘテロ原子である少なくとも１個の環原子（好ましくは１〜４個のヘテロ原子である環原子）を有するＣ_１〜Ｃ_５ヘテロアリールである。Ｃ_１〜Ｃ_５ヘテロアリールの例は、これに限定されないが、トリアジニル、チアゾール−２−イル、チアゾール−４−イル、イミダゾール−１−イル、１Ｈ−イミダゾール−２−イル、１Ｈ−イミダゾール−４−イル、イソオキサゾリン−５−イル、フラン−２−イル、フラン−３−イル、チオフェン−２−イル、チオフェン−４−イル、ピリミジン−２−イル、ピリミジン−４−イル、ピリミジン−５−イル、ピリジン−２−イル、ピリジン−３−イル、およびピリジン−４−イルを含む。

他に断りのない限り、２個の置換基が一緒に用いられて特定数の環原子を有する環を形成する（例えば、Ｒ^２およびＲ^３が窒素（Ｎ）と一緒に用いられてこれらが結合して３〜７環員を有する環を形成する）場合、環は、炭素原子および任意に独立して窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）から選択される１または２個以上（例えば１〜３個）の追加のヘテロ原子を有し得る。環は、飽和しているか部分的に飽和し得、任意に置換され得る。

本発明の目的のために、１個のヘテロ原子を含む縮合環単位のみならずスピロ環状環、二環状環などは、ヘテロ原子含有環に対応する環ファミリーに属すると考えられる。例えば、以下の式：
を有する１，２，３，４−テトラヒドロキノリンは、本発明の目的のために、複素環単位と考えられる。以下の式：
を有する６，７−ジヒドロ−５Ｈ−シクロペンタピリミジンは、本発明の目的のために、ヘテロアリール単位と考えられる。縮合環単位がヘテロ原子を飽和およびアリール環の両方の中に含有する場合、アリール環は、優位であり、環が割り当てられるカテゴリーの種類を決定するであろう。例えば、以下の式：
を有する１，２，３，４−テトラヒドロ−［１，８］ナフチリジンは、本発明の目的のために、ヘテロアリール単位と考えられる。

置換基名において用語またはこれらの接頭辞、語基のいずれかが現れた場合いつでも、当該名前は本明細書において提供されたこれらの限定を含むものと解釈される。例えば、用語「アルキル」もしくは「アリール」またはこれらの接頭辞、語基のいずれかが置換基の名前（例えば、アリールアルキル、アルキルアミノ）中に現れた場合いつでも、名前は、「アルキル」または「アリール」について上で与えられたこれらの限定を含むものとして解釈される。

用語「置換された」は、本明細書を通じて用いられる。用語「置換された」は、本明細書において、非環式であれ環式であれ、１または２個以上の水素原子が本明細書において定義された１個の置換基またはいくつか（例えば１〜１０）の置換基で置き換えられた部分をいう。置換基は、１個の部分にある１または２個の水素原子を同時に置き換えることができる。加えて、これらの置換基は２個の隣接する炭素上の２個の水素原子を置き換えて前記置換基、新規な部分または単位を形成することができる。例えば、１個の水素原子の置き換えを必要とする置換された単位は、ハロゲン、ヒドロキシルなどを含む。２個の水素原子の置き換えは、カルボニル、オキシイミノなどを含む。隣接する炭素原子からの２個の水素原子の置き換えは、エポキシなどを含む。用語「置換された」は、置換基によって置き換えられた１または２個以上の水素原子を有する部分を示すために、本明細書を通じて用いられる。部分が「置換された」と記載された場合、任意の数の水素原子が置き換えられてもよい。例えば、ジフルオロメチルは置換されたＣ_１アルキルであり；トリフルオロメチルは置換されたＣ_１アルキルであり；４−ヒドロキシフェニルは、置換された芳香環であり；（Ｎ，Ｎ−ジメチル−５−アミノ）オクタニルは置換されたＣ_８アルキルであり；３−グアニジノプロピルは置換されたＣ_３アルキルであり；および２−カルボキシピリジニルは置換されたヘテロアリールである。

例えば本明細書において定義されるアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アリール、複素環およびヘテロアリール基などの本明細書において定義される可変の基は、任意に置換され得る。任意に置換された基は、このようにして示されるであろう。

本発明の目的のために、用語「化合物」、「類似体」および「物質の組成物」は、十分に等しく本明細書中で記載される全てのエナンチオマー形態、ジアステレオマー形態、塩などを含むプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤を表し、用語「化合物」、「類似体」および「物質の組成物」は、本明細書を通して互換的に用いられる。

本明細書中に記載される化合物は、不斉原子（またキラル中心ともいう）を含み得、化合物の幾つかは１または２個以上の不斉原子または中心を含み得、これはしたがって光学異性体（エナンチオマー）およびジアステレオマーを生じさせる。本明細書中において記載される本教示および化合物はこのようなエナンチオマーおよびジアステレオマー、ならびにラセミ体および分割された鏡像異性的に純粋なＲおよびＳ立体異性体、ならびにこれらの薬学的に許容可能な塩を含む。光学異性体を、当業者に知られた標準的な手順により純粋な形態で得ることができ、これは限定されることなくジアステレオマー塩形成、速度論的分割および不斉合成を含む。本教示はまた、アルケニル部位（例えば、アルケンおよびイミン）を含む化合物のシスおよびトランス異性体を包含する。本教示が全ての可能な位置異性体およびこの混合物を包含することはまた理解され、これは当業者に知られ、限定されることなくカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーを含む標準的な分離手順により純粋な形態で得ることができる。

酸性部分を有し得る本教示の化合物の薬学的に許容可能な塩は、有機および無機塩基を用いて形成され得る。脱プロトン化に利用可能な酸性水素の数に応じてモノおよびポリアニオン性塩の両方が考えられる。塩基と形成する適切な塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩などの金属塩、例えばナトリウム、カリウムまたはマグネシウム塩；モルホリン、チオモルホリン、ピペリジン、ピロリジン、モノ−、ジ−もしくはトリ−低級アルキルアミン（例えば、エチル−ｔｅｒｔ−ブチル−、ジエチル−、ジイソプロピル−、トリエチル−、トリブチル−またはジメチルプロピルアミン)またはモノ−、ジ−もしくはトリヒドロキシ低級アルキルアミン（例えば、モノ−、ジ−またはトリエタノールアミン）と形成したものなどのアンモニア塩および有機アミン塩を含む。無機塩基の具体的な非限定の例は、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＫＨＣＯ_３、Ｋ_２ＣＯ_３、Ｃｓ_２ＣＯ_３、ＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４およびＮａ_３ＰＯ_４を含む。分子内塩もまた形成し得る。同様に、本明細書中において開示される化合物が塩基部分を含む場合、塩は有機または無機酸を用いて形成し得る。例えば、塩は、以下の酸から形成し得る：酢酸、プロピオン酸、乳酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、ジクロロ酢酸、エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、馬尿酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレンスルホン酸、硝酸、シュウ酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、フタル酸、プロピオン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、トルエンスルホン酸およびカンファースルホン酸ならびに他の既知の薬学的に許容可能な酸。

本明細書において用語「処置する(treat)」および「処置すること(treating)」および「処置(treatment)」は、患者が患っていると疑われる疾患を部分的にまたは完全に緩和する、阻害する、改善するおよび／または軽減することをいう。

本明細書において「治療効果のある(therapeutically effective)」および「有効量(effective dose)」は、所望する生化学的活性または効果を生じさせる物質または量をいう。

言及される場合を除き、用語「対象」または「患者」は、互換的に用いられ、ヒト患者および非ヒト霊長類などの哺乳動物ならびにウサギ、ラット、ハツカネズミおよび他の動物などの実験動物をいう。したがって、本明細書において用語「対象」または「患者」は、本発明の化合物を投与可能な任意の哺乳動物の患者または対象を意味する。本発明の例となる態様において、本発明の方法にかかる処置のための対象患者を特定するために、一般に認められたスクリーニング方法が用いられて目標とされるもしくは疑われる疾病もしくは疾患に関連する危険因子を決定するまたは対象中の存在する疾病もしくは疾患の状況を決定する。これらのスクリーニング方法は、例えば、目標とされるもしくは疑われる疾病もしくは疾患に関連し得る危険因子を決定する従来の精密検査を含む。これらおよび他のルーチンの方法は臨床医に本発明の方法および化合物を用いて治療を必要とする患者を選択することを許容する。

プレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤

Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染および関連疾患の処置のために有用な本発明のプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤は式（Ｉ）を有するスルファモイルベンズアミド誘導体であり、全てのエナンチオマーおよびジアステレオマー形態ならびにこれらの薬学的に許容可能な塩を含む；
水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよびこれらの複合体を含み、ここで：
Ｒ^１は、水素である；
Ｒ^２は、水素、メチル、トリフルオロメチル、フッ素および塩素からなる群から選択される；
Ｒ^３は、水素、メチル、フッ素および塩素からなる群から選択される；
Ｒ^４は、水素、フッ素、塩素およびメチルからなる群から選択される；
Ｒ^５は、水素および塩素からなる群から選択される；
Ｒ^７は、水素、塩素、フッ素および臭素からなる群から選択される；
Ｒ^９は、水素、メチル、フッ素および塩素からなる群から選択される；
Ｒ^ｘは、ＮＨ_２,
からなる群から選択される；

本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染および関連疾患の処置のためのプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤として有用な式（ＩＩ）で表されるスルファモイルベンズアミド誘導体の使用の新規な方法にさらに向けられる。
水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよびこれらの複合体を含み、ここで：
Ｒ^ｘは、
からなる群から選択される；

本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染および関連疾患の処置のためのプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤として有用な式（ＩＩＩ）で表されるスルファモイルベンズアミド誘導体の使用の新規な方法にさらに向けられる。
水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよびこれらの複合体を含み、ここで：
Ｒ^１０は、水素、メチル、塩素および臭素からなる群から選択される；
Ｒ^ｙは、
からなる群から選択される；

本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染および関連疾患の処置のためのプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤として有用な式（ＩＶ）で表されるスルファモイルベンズアミド誘導体の使用の新規な方法にさらに向けられる。
水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよびこれらの複合体を含む。

本発明の化合物が名付けられ、本明細書に言及される方法を明示する目的のため、式：
を有する化合物は、化学名２−クロロ−５−スルファモイル−Ｎ−３−メチルフェニル−ベンズアミドを有する。

本発明の化合物が名付けられ、本明細書に言及される方法を明示する目的のため、式：
を有する化合物は、化学名５−（２−ブチルスルファモイル）−Ｎ−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−フルオロ−ベンズアミドを有する。

本発明の化合物が名付けられ、本明細書に言及される方法を明示する目的のため、式：
を有する化合物は、化学名Ｎ−ベンジル−４−ブロモ−３−ジエチルスルファモイル−ベンズアミドを有する。

本発明の化合物が名付けられ、本明細書に言及される方法を明示する目的のため、式：
を有する化合物は、化学名５，５，１１−トリオキソ−１０，１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］［１，４］チアゼピン−８−カルボン酸ベンジルアミドを有する。

本発明の目的のために、ラセミ化合物の式、例えば：
で描かれる化合物は、十分に等しく式：
もしくは式：
を有する２種のエナンチオマーのいずれかまたはそれらの混合物、あるいは第２のキラル中心が存在する場合には、全てのジアステレオマーを表す。

いくつかの態様において、Ｒ^１は、水素である。

いくつかの態様において、Ｒ^２は、水素である。

いくつかの態様において、Ｒ^２は、メチルである。

いくつかの態様において、Ｒ^２は、トリフルオロメチルである。

いくつかの態様において、Ｒ^２は、フッ素である。

いくつかの態様において、Ｒ^２は、塩素である。

いくつかの態様において、Ｒ^３は、水素である。

いくつかの態様において、Ｒ^３は、メチルである。

いくつかの態様において、Ｒ^３は、フッ素である。

いくつかの態様において、Ｒ^３は、塩素である。

いくつかの態様において、Ｒ^４は、水素である。

いくつかの態様において、Ｒ^４は、メチルである。

いくつかの態様において、Ｒ^４は、フッ素である。

いくつかの態様において、Ｒ^４は、塩素である。

いくつかの態様において、Ｒ^５は、水素である。

いくつかの態様において、Ｒ^５は、塩素である。

いくつかの態様において、Ｒ^７は、水素である。

いくつかの態様において、Ｒ^７は、塩素である。

いくつかの態様において、Ｒ^７は、フッ素である。

いくつかの態様において、Ｒ^７は、臭素である。

いくつかの態様において、Ｒ^９は、水素である。

いくつかの態様において、Ｒ^９は、メチルである。

いくつかの態様において、Ｒ^９は、フッ素である。

いくつかの態様において、Ｒ^９は、塩素である。

いくつかの態様において、Ｒ^ｘは、ＮＨ_２である。

いくつかの態様において、Ｒ^ｘは、
である。

いくつかの態様において、Ｒ^１０は、水素である。

いくつかの態様において、Ｒ^１０は、メチルである。

いくつかの態様において、Ｒ^１０は、塩素である。

いくつかの態様において、Ｒ^１０は、臭素である。

いくつかの態様において、Ｒ^ｙは、
である。

例による態様は、式（Ｖ）を有する化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩形態を含む：
式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^７およびＲ^９の非限定の例は、表１において以下に定義される。

例による態様は、式（ＶＩ）を有する化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩形態を含む：
式中、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^７、Ｒ^９およびＲ^ｘの非限定の例は、表２において以下に定義される。

例による態様は、式（ＩＩ）を有する化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩形態を含む：
式中、Ｒ^ｘの非限定の例は、表３において以下に定義される。

例による態様は、式（ＩＩＩ）を有する化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩形態を含む：
式中、Ｒ^ｙの非限定の例は、表４において以下に定義される。

例による態様は、式（ＩＶ）を有する化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩形態を含む：

本明細書において供された全ての態様において、適切な任意の置換基の例は、請求された発明の範囲を限定することを意図しない。本発明の化合物は、本明細書において供されたあらゆる置換基または置換基の組み合わせを含むことができる。

本教示の化合物は、当業者に知られた標準的な合成方法および手順を用いることにより、市販の出発材料、文献において知られた化合物または容易に調製される中間体から、本明細書において概説される手順に従い調製され得る。有機分子の調製ならびに官能基の転換および操作のための基準的な合成方法および手順は、関連科学文献からまたは当該分野における標準的な教科書から容易に得られることができる。典型的なまたは好ましい工程条件（すなわち、反応温度、時間、反応物質のモル比、溶媒、圧力など）が与えられた場合、他の工程条件もまた特に明記されない限り用いられ得る。最適な反応条件は、用いられる特定の反応物質または溶媒によって異なり得るが、しかしそのような条件はルーチンの最適化手順により当業者によって決定され得る。有機合成の分野における当業者は、提示された合成ステップの性質および順序は、本明細書において記載される化合物の構造を最適化する目的のために代わり得ることを理解するであろう。

本明細書において記載される工程は、当該分野に知られた任意の適切な方法に従い監視され得る。例えば、生成物の生成は、核磁気共鳴分光法（例えば^１Ｈまたは^１３Ｃ）、赤外線分光法、光度分析（例えばＵＶ−可視）などの分光学的手段によりまたは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）もしくは薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などのクロマトグラフィーにより監視され得る。

化合物の調製は、種々の化学基の保護および脱保護を伴い得る。保護および脱保護の必要性および適当な保護基の選択は、当業者により容易に決定され得る。保護基の化学は、例えば、Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed. (Wiley & Sons, 1991)において見出され得、この全体の開示を本明細書において全ての目的について参照により組み入れる。

本明細書に記載される反応または工程は、有機合成の分野における当業者により容易に選択され得る適切な溶媒中で実施され得る。適切な溶媒は典型的には、反応が行われる温度、すなわち溶媒の凝固点から溶媒の沸点に及ぶ温度にて実質的に反応物質、中間体および／または生成物と非反応性である。与えらえた反応は、１種の溶媒または１種以上の溶媒の混合物中で行われ得る。特定の反応ステップに応じて、特定の反応ステップのための適切な溶媒が選択され得る。

これらの教示の化合物は、有機化学の分野において知られた方法により調製され得る。これらの教示の化合物の調製において用いられる試薬は、商業的に得ることができる、または文献に記載される標準的な手順により調製され得る。

例

以下の例は、代表的な式（ＩＩ）で表される化合物を調製するための方法を提供する。熟練した実行者は、本発明の追加の化合物を調製するために、当業者に知られた適当な試薬、出発物質および精製方法をいかに置換するか理解するであろう。

例１：５−シクロペンチルスルファモイル−Ｎ−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−フルオロ−ベンズアミドの合成（ＤＶＲ−５６）：

ＣＨ_２Ｃｌ_２中の５−クロロスルホニル−２−フルオロ−安息香酸（Ａ、０．５０６ｇ、０．００２１ｍｏｌ）、シクロペンチルアミン（Ｂ、０．１８０６ｇ、０．００２１２ｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１．１ｍＬ、０．００６３６ｍｏｌ）を室温にて一晩攪拌した。溶媒を蒸発させ、粗成生物をシリカゲルクロマトグラフィー（（１０％ＡｃＯＨを含むＭｅＯＨ）／ＣＨ_２Ｃｌ_２）により精製し、５−シクロペンチルスルファモイル−２−フルオロ−安息香酸（Ｃ、０．５５ｇ、９０％）を与えた。真空下にて一晩乾燥させたのち、ＳＯＣｌ_２（５ｍＬ）中のＣ（０．４８ｇ、０．００１６ｍｏｌ）を８０℃にて３時間加熱し、この後、ＳＯＣｌ_２を蒸発させ、残渣を一晩乾燥した。残渣を次にテトラヒドロフラン（５ｍＬ）に溶解させ、３，４−ジフルオロフェニルアミン（Ｄ、０．２１６ｇ、０．００１６７ｍｏｌ）を添加し、その後にジイソプロピルエチルアミン（０．５ｍＬ）が続いた。混合物を７０℃まで一晩加熱した。溶媒を蒸発させ、その後に酢酸エチル抽出を行った。シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）による精製後、０．３ｇ（４５％）の５−シクロペンチルスルファモイル−Ｎ−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−フルオロ−ベンズアミド（ＤＶＲ−５６）を得た。

例２：５−ｓｅｃ−ブチルスルファモイル−Ｎ−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−フルオロ−ベンズアミド（ＤＶＲ−２３）の合成

ＣＨ_２Ｃｌ_２中の５−クロロスルホニル−２−フルオロ−安息香酸（Ａ、０．５０６ｇ、０．００２１ｍｏｌ）、ｓｅｃ−ブチルアミン（Ｅ、０．１５５ｇ、０．００２１２ｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１．１ｍＬ、０．００６３６ｍｏｌ）を室温にて一晩攪拌した。溶媒を蒸発させ、粗成生物をシリカゲルクロマトグラフィー（（１０％ＡｃＯＨを含むＭｅＯＨ）／ＣＨ_２Ｃｌ_２）により精製し、５−ｓｅｃ−ブチルスルファモイル−２−フルオロ−安息香酸（Ｆ、０．５６ｇ、９６％）を与えた。真空下にて一晩乾燥させたのち、ＳＯＣｌ_２（５ｍＬ）中のＦ（０．５６ｇ、０．００２０ｍｏｌ）を８０℃にて３時間加熱し、この後、ＳＯＣｌ_２を蒸発させ、残渣を一晩乾燥した。残渣を次にテトラヒドロフラン（５ｍＬ）に溶解させ、３，４−ジフルオロフェニルアミン（Ｄ、０．２６ｇ、０．００２０ｍｏｌ）を添加し、その後にＤＩＥＡ（０．８ｍＬ）が続いた。混合物を７０℃まで一晩加熱した。溶媒を蒸発させ、その後に酢酸エチル抽出を行った。シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）による精製後、０．４５ｇ（５７％）の５−ｓｅｃ−ブチルスルファモイル−Ｎ−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−フルオロ−ベンズアミド（ＤＶＲ−２３）を得た。

例３：５−シクロヘキシルスルファモイル−Ｎ−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−フルオロ−ベンズアミド（ＤＶＲ−４５）の合成

ＣＨ_２Ｃｌ_２中の５−クロロスルホニル−２−フルオロ−安息香酸（Ａ、０．５０８ｇ、０．００２１ｍｏｌ）、シクロヘキシルアミン（Ｇ、０．２１１ｇ、０．００２１２ｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１．１ｍＬ、０．００６３６ｍｏｌ）を室温にて一晩攪拌した。溶媒を蒸発させ、粗成生物をシリカゲルクロマトグラフィー（（１０％ＡｃＯＨを含むＭｅＯＨ）／ＣＨ_２Ｃｌ_２）により精製し、５−シクロヘキシルスルファモイル−２−フルオロ−安息香酸（Ｈ、０．６ｇ、９５％）を与えた。真空下にて一晩乾燥させたのち、ＳＯＣｌ_２（５ｍＬ）中のＨ（０．２２ｇ、０．７３７ｍｍｏｌ）を８０℃にて２時間加熱し、この後、ＳＯＣｌ_２を蒸発させ、残渣を一晩乾燥した。残渣を次にテトラヒドロフラン（５ｍＬ）に溶解させ、３，４−ジフルオロフェニルアミン（Ｄ、９５ｍｇ、０．７３７ｍｍｏｌ）を添加し、その後にＤＩＥＡ（０．８ｍＬ）が続いた。混合物を７０℃まで一晩加熱した。溶媒を蒸発させ、その後に酢酸エチル抽出を行った。シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）による精製後、０．１９２ｇ（６３％）の５−シクロヘキシルスルファモイル−Ｎ−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−フルオロ−ベンズアミド（ＤＶＲ−４５）を得た。

配合物

本発明はまた、本発明にかかるプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤を含む組成物または配合物に関する。一般に、本発明の組成物は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染および関連疾患の処置に有用であるために有効な有効量の１種または２種以上の本発明にかかるスルファモイルベンズアミド誘導体およびそれらの塩および１種または２種以上の賦形剤を含む。

本発明の目的のために「賦形剤」および「担体」は本発明の記載を通して互換的に用いられ、前記用語は本明細書において「安全かつ有効な医薬組成物を配合する実務において用いられる成分」と定義される。

配合者は、賦形剤が安全、安定および機能的な医薬の送達に役立つために主に用いられ、送達のための全体のビヒクルの部分としてのみならず、活性成分の受容者による有効な吸収を達成する手段として役立つことを理解するであろう。賦形剤は、不活性なフィラーであるものとして単純かつ直接的に役割を果たすことができ、または本明細書において用いられる賦形剤は、ｐＨ安定化系または成分の胃へ安全に送達することを確実にする被覆材であることができる。配合者は、また本発明の化合物が向上した細胞有効性、薬物動態特性ならびに向上した経口バイオアベイラビリティーを有するという事実を活用し得る。

本教示は、また、少なくとも１種の本明細書に記載された化合物および１種または２種以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。このような担体の例は、当業者に周知であり、および許容可能な医薬手順、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th edition, ed. Alfonoso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA (1985)において記載されたものに従い調製され得、この全体の開示を全ての目的について本明細書に参照により組み込む。本明細書において用いられるように、「薬学的に許容可能」とは、毒物学的観点から薬学的用途において使用が許容される物質をいう。したがって、薬学的に許容可能な担体は、配合物において他の成分と混合可能であり、生物学的に許容可能なものである。補足の活性成分が、また、医薬組成物中へ取り込まれ得る。

本教示の化合物は経口的にまたは非経口的に、ニートでまたは従来の薬学的担体と組み合わせて投与され得る。適用可能な固体担体は、風味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、フィラー、流動促進剤、圧縮補助剤（compression aid）、結合剤または錠剤崩壊剤または封入材料としてまた作用し得る１種または２種以上の物質を含み得る。化合物は従来の方法、例えば、既知の抗ウィルス剤に用いられるものと同様の方法で、配合され得る。本明細書に開示された化合物を含む経口配合物は、錠剤、カプセル、口腔形態(buccal forms)、トローチ、ロゼンジおよび経口液、懸濁液または溶液を含む任意の従来用いられた経口形態を含み得る。粉末において、担体は微粉化した固体であり得、これは微粉化した化合物との混合剤である。錠剤において、本明細書において開示された化合物は、必要な圧縮特性を有する担体と適切な割合で混合され、所望する形状および寸法に圧縮され得る。粉末および錠剤は、９９％までの化合物を含有し得る。

カプセルは、本明細書において開示された１種または２種以上の化合物と、薬学的に許容可能なデンプン（例えばトウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、糖、人口甘味剤、粉末セルロース（例えば、結晶および微結晶セルロース）、小麦粉、ゼラチン、ガムなどの不活性フィラーおよび／または希釈剤との混合物を含有し得る。

有用な錠剤配合物は、従来の圧縮、湿式造粒法または乾式造粒法により製造され得、限定されないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ポリビニルピロリドン、アルギン酸、アカシアガム、キサンタンガム、クエン酸ナトリウム、複合ケイ酸塩、炭酸カルシウム、グリシン、スクロース、ソルビトール、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、ラクトース、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂を含む薬学的に許容可能な希釈剤、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、表面改質剤（界面活性剤を含む）、懸濁または安定化剤を利用し得る。表面改質剤は、ノニオン性およびアニオン性表面改質剤を含む。表面改質剤の代表例は、限定されないが、ポロキサマー１８８、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ろう、ソルビタンエステル、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、ケイ酸アルミニウム・マグネシウムおよびトリエタノールアミンを含む。本明細書における経口配合物は、化合物の吸収を変更するための標準の遅延または徐放性配合剤を利用し得る。経口配合物は、また、本明細書において開示される化合物を必要に応じ適当な可溶化剤または乳化剤を含む水または果汁中に投与することからなることもできる。

液体担体は、溶液、懸濁液、エマルション、シロップ、エリキシル剤の調製においておよび吸入送達のために用いられ得る。本教示の化合物は、水、有機溶媒、もしくは両方の混合物または薬学的に許容可能な油もしくは油脂などの薬学的に許容可能な液体担体に溶解するまたは懸濁し得る。液体担体は、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存料、甘味料、風味剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定化剤、浸透調節剤などの他の適切な薬学的添加剤を含み得る。経口および非経口投与のための液体担体の例は、限定されないが、水（部分的に本明細書において記載した添加剤を含む、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液などのセルロース誘導体）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）およびこれらの誘導体並びに油（分画されたココナッツ油およびラッカセイ油）を含む。非経口投与のために、担体はオレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油状エステルであり得る。無菌の液体担体は、非経口投与のための組成物を形成する無菌液体中において用いられる。加圧型の組成物のための液体担体は、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容可能な高圧ガスであり得る。

無菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、腹腔内または皮下注射により利用され得る。無菌溶液もまた、静脈内投与され得る。経口投与のための組成物は、液体か固体形態のいずれかであり得る。

好ましくは、医薬組成物は、単位剤形、例えば、錠剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁液、乳液、顆粒または座薬の形態である。このような形態において、医薬組成物は、適当な量の化合物を含有する単位用量に細分化され得る。単位剤形は、包装された組成物、例えば、小包粉末、バイアル、アンプル、充填済シリンジまたは液体を含有する小袋であり得る。あるいは、単位剤形形態はカプセルまたは錠剤そのものであるか、またはそれは包装形態にある適切な数のこのような組成物であり得る。このような単位剤形は、約１ｍｇ／ｋｇの化合物〜約５００ｍｇ／ｋｇの化合物を含有し得、単一の用量でまたは２または３以上の用量で与えられ得る。このような用量は、経口、インプラント経由、非経口（筋肉内、腹腔内および皮下注射を含む）、経直腸、経膣および経皮を含む化合物を受容者の血流に向かわせるのに有用な任意の方法において投与され得る。

特定の疾病状態または障害の処置または阻害のために投与される場合、有効用量は、用いられる特定の化合物、投与方法、処置される疾患の重症度、ならびに処置される個体に関連する種々の物理的要因に応じて変わりうることが理解される。治療用途において、本教示の化合物は、治療するのにまたは疾病の症状およびその合併症を少なくとも部分的に改善するのに十分な量で疾病をすでに患っている患者に提供され得る。特定の個体の処置において用いられる用量は典型的に主観的に担当医によって決定されなければならない。伴う変数は、特定の疾患およびその状態ならびに患者の大きさ、年齢および反応パターンを含む。

ある場合には、限定されないが、定量吸入器、呼吸駆動性吸入器、多用量型粉末吸入器、ポンプ、圧搾作動（squeeze−actuated）噴霧スプレーディスペンサー、エアロゾルディスペンサー、エアロゾルネブライザーなどの機器を用いて、患者の気道に直接化合物を投与することが望ましい可能性がある。鼻腔内または気管支内吸入による投与のために、本教示の化合物は液体組成物、固体組成物またはエアロゾル組成物に配合され得る。液体組成物は、例として、薬学的に許容可能な溶媒中に溶解した、部分的に溶解した、または懸濁した１種または２種以上の本教示の化合物を含み得、例えばポンプまたは圧搾作動噴霧スプレーディスペンサーにより投与され得る。溶媒は、例えば、等張食塩水または静菌水であり得る。固体組成物は、例により、ラクトースまたは気管支使用に許容可能な他の不活性粉末と混合された１種または２種以上の本教示の化合物を含む粉末製剤であり得、例えば、エアロゾルディスペンサーまたは固体組成物を包み込むカプセルを破壊または破裂させて固体組成物を吸入のために輸送するデバイスにより投与され得る。エアロゾル組成物は、例により１種または２種以上の本教示の化合物、高圧ガス、界面活性剤および共溶媒を含み得、例えば、定量デバイスにより投与され得る。高圧ガスは、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、ヒドロフルオロアルカン（ＨＦＡ）または生理学的におよび環境的に許容可能な他の高圧ガスであり得る。

本明細書において記載される化合物は、非経口的にまたは腹腔内投与され得る。これらの化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩、水和物もしくはエステルの溶液または懸濁液は、ヒドロキシル−プロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中において調製され得る。分散液もまた、油中のグリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物中において調製され得る。貯蔵および使用の通常の条件下において、これらの製剤は典型的に微生物の成長を抑制する保存剤を含有する。

注射のために適切な医薬形態は、無菌水性溶液または分散液および即時の注射可能な溶液または分散液の調製のための無菌粉末を含み得る。いくつかの態様において、形態は、無菌であり、その粘度はシリンジを流れることを許容する。形態は好ましくは製造および貯蔵の条件下において安定であり、細菌および菌類などの微生物の汚染作用に対して保護され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）、これらの適切な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。

本明細書において記載される化合物は経皮的に、すなわち体の表面および上皮および粘膜組織を含む肉体の管の内壁を越えて投与され得る。このような投与は、ローション、クリーム、フォーム、パッチ、懸濁液、溶液および座薬（経直腸的および経膣的）中の薬学的に許容可能な塩、水和物またはエステルを含む本教示の化合物を用いて行われ得る。

経皮投与は、本明細書において開示された化合物などの化合物および化合物に対して不活性であり得、皮膚に対して無毒であり得、および皮膚を介した血流への体内吸収のための化合物の配送を可能とし得る担体を含む経皮パッチの使用を通じて達成し得る。担体は、クリームおよび軟膏、ペースト、ゲル、および閉鎖デバイスなどの任意の数の形態をとり得る。クリームおよび軟膏は、粘性のある液体または水中油もしくは油中水型のいずれかの半固体エマルションであり得る。化合物を含む石油または親水性石油中に分散された吸収性の粉末からなるペーストもまた、適切である。担体を伴うまたは伴わない化合物を含むリザーバーを覆う半透膜、化合物を含むマトリックスなどの種々の閉鎖デバイスが化合物を血流に放出するために用いられる。他の閉鎖デバイスは、文献において知られている。

本明細書において記載される化合物は、経直腸的にまたは経膣的に、従来の座薬の形態で投与され得る。座薬配合物は、座薬の融点を変更するためのワックスの追加を伴うまたは伴わないココアバターおよびグリセリンを含む従来の材料から製造され得る。種々の分子量のポリエチレングリコールなどの水溶性座薬基剤もまた使用され得る。

脂質配合物またはナノカプセルは、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏのいずれかで本教示の化合物を宿主細胞へ導入するために用いられ得る。脂質配合物およびナノカプセルは、当該分野に知られた方法により調製される。

本教示の化合物の有効性を向上させるために、化合物を標的疾病の処置に有効な他の剤と組み合わせることが望ましい場合がある。例えば、標的疾病を処置するのに有効な他の活性化合物（すなわち、他の活性成分または剤）は、本教示の化合物とともに投与され得る。他の剤は、本明細書において開示される化合物と同時にまたは異なる時間で投与され得る。

本教示の化合物は、哺乳動物、例えばヒト患者における病理学的な疾患または疾病の処置または阻害に有用であり得る。本教示はしたがって、哺乳動物にその薬学的に許容可能な塩を含む本教示の化合物または薬学的に許容可能な担体と組み合わせたもしくは共同した本教示の化合物を含む医薬組成物を提供することにより、病理学的な疾患または疾病の処置するまたは阻害する方法を提供する。本教示の化合物は単独でまたは病理学的な疾患もしくは疾病の処置もしくは阻害のための他の治療的に有効な化合物もしくは治療と組み合わせて投与され得る。

本発明にかかる化合物の非限定の例は、約０．００１ｍｇ〜約１０００ｍｇの１種または２種以上の本発明にかかるプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤および１種または２種以上の賦形剤；約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇの１種または２種以上の本発明にかかるプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤および１種または２種以上の賦形剤；約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの１種または２種以上の本発明にかかるプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤および１種または２種以上の賦形剤を含む。

手順

以下の手順が、ＨＢＶのプレゲノムＲＮＡカプシド形成阻害剤として化合物を評価し、選択するのに用いられ得る。

本発明のＨＢＶ複製阻害剤は、ＨＢＶ感染に関連する疾病を処置し、予防することができる。表５〜９において提示された結果は、標準ＭＴＴアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することにより５０μＭまで測定可能な細胞毒性を有することなく、テトラサイクリンを誘発させる形で強いＨＢＶ複製を支援する不死化マウス肝細胞（ＡＭＬ１２）−由来安定細胞株（ＡＭＬ１２ＨＢＶ１０）において、本発明の化合物がＨＢＶ複製を阻害することを実証した。

表５、６、７、８および９において提示されるように、本開示の化合物の抗ウィルス効果をＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞において測定した。ＡＭＬ１２ＨＢＶ１０は、テトラサイクリンを誘発させる形で強いＨＢＶ複製を支援する不死化マウス肝細胞（ＡＭＬ１２）−由来安定細胞株である(Xu et al.)。細胞をウェルあたり２×１０^４細胞の密度で９６ウェルプレートに播種し、テトラサイクリンの不在下で１０％ウシ胎仔血清とともにＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養して、ｐｇＲＮＡ複製およびＨＢＶＤＮＡ複製をさせた。播種１日後、細胞を５０μＭ〜０．３９μＭにおよぶ試験化合物の連続希釈法を用いて４８時間未処理または処理した。その後各ウェルに１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣｌおよび１％ＮＰ−４０を含有する１００μｌの溶解緩衝液を添加することにより細胞を溶解させ、３７℃で３０分間インキュベートした。各ウェルからの半量（５０μｌ）の細胞溶解物を等量の０．５ＭＮａＯＨおよび１．５ＭＮａＣｌを含有する変性溶液と併せた。５分のインキュベーションの後、１００μｌの中和溶液（１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１．５ＭＮａＣｌ）を各ウェルに添加した。変性細胞溶解物（全体として２００μｌ）を９６−ウェルドット−ブロットマニュフォールド（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてナイロン膜に適用した。細胞溶解物中のＨＢＶＤＮＡをＨＢＶマイナス鎖ＤＮＡに特異的なアルファ−^３２Ｐ−ＵＴＰ−標識リボプローブを用いたドット−ブロットハイブリダイゼーションにより測定した。本開示の化合物の抗ウィルス効果を５０％までＨＢＶＤＮＡの量が減少した濃度（ＥＣ_５０）として示した。

ＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞における本開示の化合物の細胞毒性の測定：化合物の細胞毒性を測定するために、ＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞をウェルあたり２×１０^４細胞の密度で９６ウェルプレートに播種し、テトラサイクリンの不在下で１０％ウシ胎仔血清とともにＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養して、ｐｇＲＮＡ複製およびＨＢＶＤＮＡ複製をさせた。播種１日後、細胞を５０μＭ〜０．３９μＭにおよぶ試験化合物の連続希釈法を用いて４８時間未処理または処理した。製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）により提供された手順に従い、ＭＴＴアッセイにより細胞の生存率を測定した。化合物の細胞毒性を５０％まで細胞の生存率が減少した濃度（ＣＣ_５０）として示した。

図１、図２および表１０に示される、ヒト肝細胞がん細胞株における本開示の化合物の抗ウィルス活性の測定：ヒト肝細胞がん細胞における本開示の化合物のＨＢＶに対する抗ウィルス活性をさらに確認するために、ＨｅｐＤＥＳ１９細胞、テトラサイクリンを誘発させる形でＨＢＶ複製を支援するヒト肝細胞がん細胞株(Guo et al., 2007)を１２−ウェルプレートにウェルあたり５×１０^５細胞の密度で９６ウェルプレートに播種し、１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび１０％ウシ胎仔血清とともにＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した。播種２日後、細胞を１０μＭ〜０．０１８μＭにおよぶ試験化合物の連続希釈法を用いて６日間、テトラサイクリンの不在下で偽処理または処理した。処理を完了し、１２−ウェルプレートの各ウェルに１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０および２％スクロースを含有する０．５ｍｌの溶解緩衝液を添加することにより細胞を溶解させ、３７℃で１０分間インキュベートした。細胞残屑および核を遠心分離により除去し、上澄みを１．５ＭＮａＣｌを含有する１３０μｌの３５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００と混合した。氷中の１時間のインキュベーション後、ウイルスヌクレオカプシドを６０００×ｇ、５分間、４℃における遠心分離によりペレット化し、続いて０．５ｍｇ／ｍｌプロナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、０．５％ＳＤＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１０ｍＭＥＤＴＡを含有する４００μｌの消化緩衝液中で３７℃にて１時間消化した。消化混合物をフェノールで２回抽出し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ８．０；０．１ｍＭＥＤＴＡ）中に溶解させた。各ウェルからのＤＮＡ試料の半分を１．５％アガロースゲルへの電気泳動により分離した。その後ゲルを０．５ＭＮａＯＨおよび１．５ＭＮａＣｌを含有する溶液中での変性に供し、続いて１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および１．５ＭＮａＣｌを含有する緩衝液中で中和した。ＤＮＡを２０ＸＳＳＣ緩衝液中でＨｙｂｏｎｄ−ＸＬｍｅｍｂｒａｎｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）上へブロットした。細胞質のＨＢＶ核関連ＨＢＶＤＮＡの量をサザンブロットハイブリダイゼーションにより測定し、化合物の抗ウィルス活性を５０％（ＥＣ_５０）または９０％（ＥＣ_９０）までＨＢＶＤＮＡの量が減少した濃度として表した。

ヒト肝細胞がん細胞における本開示の化合物の細胞毒性の測定：ＨｅｐＤＥＳ１９細胞をウェルあたり６×１０^４細胞の密度で９６ウェルプレートに播種し、テトラサイクリンの不在下で１０％ウシ胎仔血清とともにＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した。播種１日後、細胞を５０μＭ〜０．３９μＭにおよぶ試験化合物の連続希釈法を用いて６日間未処理または処理した。製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）により提供された手順に従い、ＭＴＴアッセイにより細胞の生存率を測定した。化合物の細胞毒性を５０％まで細胞の生存率が減少した濃度（ＣＣ_５０）として示した。

ＨｅｐＤＥＳ１９細胞における本開示の選択的な化合物の抗ウィルス効果を図１に示す。ＤＶＲ２３と２種の既知の抗ＨＢＶ化合物、ラミブジンおよびＢａｙ４１−４１０９との間における抗ウィルス効果の対象比較を図２に示す。ＡＭＬ１２ＨＢＶ１０およびＨｅｐＤＥＳ１９における本開示の代表的な化合物の抗ウィルス効果および細胞毒性の概要を表１０に示す。これらの結果により、マウス肝細胞由来細胞株（ＡＭＬ１２ＨＢＶ１０）においてのみならず、ヒト肝細胞がん細胞株（ＨｅｐＤＥＳ１９）において本開示の化合物が選択的にＨＢＶを阻害することが明確に実証された。また結果により、ＤＶＲ−２６がラミブジンおよびＢａｙ４１−４１０９と同様の有効性でＨＢＶＤＮＡウィルスを阻害することが実証された。

本発明の化合物のＨＢＶに対する機構的洞察を得るために、１２−ウェルプレートにおいて培養されたＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞をテトラサイクリンの不在下、２日間、一連の濃度のＤＶＲ−１、ＤＶＲ−５６またはＤＶＲ−２３で処理した(Guo et al., 2007)。また、陽性対照として、ＨＢＶコアタンパク質２量体と結合してその相互作用を誤った方に導き、カプシド形成を防ぐ（Ｂａｙ４１−４１０９）(Deres et al., 2003; Stray and Zlotnick, 2006)か、コアアセンブリ中間体と相互作用し、中空カプシドの形成を促進するか（ＡＴ−６１）(Feld et al., 2007; Katen et al., ; King et al., 1998)のいずれかの既知のＨＢＶヌクレオカプシドアセンブリエフェクター、Ｂａｙ４１−４１０９（５μＭ）またはＡＴ−６１（２５μＭ）で細胞を処理した。細胞内のウィルスｍＲＮＡ、カプシド化ｐｇＲＮＡおよびヌクレオカプシド関連ＨＢＶＤＮＡの量を以下に詳述する方法で分析した。

ＨＢＶｍＲＮＡの分析のための手順：処理の完了後、全体の細胞ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抽出した。全体のＲＮＡの５マイクログラムを２．２Ｍホルムアルデヒドを含有する１．５％アガロースゲル中に溶解させ、２０ＸＳＳＣ緩衝液中でＨｙｂｏｎｄ−ＸＬｍｅｍｂｒａｎｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）上へ輸送した。ＨＢＶｍＲＮＡの量をＨＢＶゲノムのプラス鎖に特異的なアルファ−^３２Ｐ−ＵＴＰ−標識リボプローブを用いたノーザンブロットハイブリダイゼイションにより測定した。

カプシド化ｐｇＲＮＡの測定：６００μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０）を１２−ウェルプレートの各ウェルに添加することにより、ＡＭＬ１２ＨＢＶ１０細胞を溶解させた。核を、５０００ｇで１０分間の遠心分離により除去した。試料の半分を６Ｕのミクロコッカス・ヌクレアーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および１５μｌの１００ｍＭＣａＣｌ_２と混合し、１５分間３７℃にてインキュベートして遊離核酸を消化した。反応を６μｌの０．５ＭＥＤＴＡで停止させ、１２５μｌの１．７５ＭＮａＣｌ中の３５％ポリエチレングリコール８０００を反応に添加することによりカプシドを沈殿させ、氷中で３０分間インキュベートし、続いて４℃にて１０分間６０００ｇで遠心分離を行った。ペレットを５０μｌのＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８］、１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。ｐｇＲＮＡを１ｍｌのＴｒｉｚｏｌの添加により抽出した。カプシド化ｐｇＲＮＡを２．２Ｍホルムアルデヒド−１％アガロースゲル中を通して電気泳動させ、ナイロン膜に輸送し、ＵＶ架橋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により固定した。ハイブリダイゼーションは、ＨＢＶゲノムのプラス鎖に特異的なアルファ−^３２Ｐ−ＵＴＰ−標識リボプローブで行った。

ウイルスカプシドおよびヌクレオカプシド関連ＤＮＡ分析の手順：１２−ウェルプレートの各ウェルに１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡおよび１％ＮＰ−４０を含む３００μｌの緩衝液を添加することによりＨｅｐＤＥＳ１９細胞を溶解させた。細胞残屑を５０００ｇ、１０分間での遠心分離により除去した。１０マイクロリットルの清澄化した細胞溶解物を非変性１％アガロースゲル中を通した電気泳動により分画し、ＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６；１５０ｍＭＮａＣｌおよび１ｍＭＥＤＴＡ）でブロットすることによりニトロセルロースフィルターへ輸送した。ＨＢＶ核タンパク質に対する抗体（ＤＡＫＯ）で膜をプローブすることによりＨＢＶカプシドを検出した。結合した抗体をＩＲＤｙｅ二次抗体により明らかにし、Ｌｉ−ＣＯＲＯｄｙｓｓｅｙｓｙｓｔｅｍにより可視化した。カプシド関連ＨＢＶＤＮＡを検出するために、膜を０．５ＮＮａＯＨおよび１．５ＭＮａＣｌを含有する緩衝液で５分間処理し、続いて１ＭＴＲＩＳ−ＨＣｌおよび１．５ＭＮａＣｌを含有する緩衝液で５分間中和した。ウイルスＤＮＡをα−^３２Ｐ−ＵＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）標識マイナス鎖特異的完全長ＨＢＶリボプローブを用いたハイブリダイゼーションにより検出した(Xu et al.)。

ＨＢＶＤＮＡ複製中間体を分析するために、１２−ウェルプレートの各ウェルに１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０および２％スクロースを含有する０．５ｍｌの溶解緩衝液を添加することにより細胞を溶解させた。細胞残屑および核を遠心分離により除去し、上澄み液を１３０μｌの１．５ＭＮａＣｌを含有する３５％ポリエチレングリコール８０００と混合した。氷中の１時間のインキュベーション後、ウィルスヌクレオカプシドを６０００×ｇ、５分間、４℃の遠心分離によりペレット化し、続いて０．５ｍｇ／ｍｌプロナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、０．５％ＳＤＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１０ｍＭＥＤＴＡを含有する４００μｌの消化緩衝液中で３７℃にて１時間消化した。消化混合物をフェノールで２回抽出し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ８．０；０．１ｍＭＥＤＴＡ）中に溶解させた。各ウェルからのＤＮＡ試料の半分を１．５％アガロースゲルへの電気泳動により分離した。その後ゲルを０．５ＭＮａＯＨおよび１．５ＭＮａＣｌを含む溶液中での変性に供し、続いて１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および１．５ＭＮａＣｌを含有する緩衝液中で中和した。その後ＤＮＡを２０ＸＳＳＣ緩衝液中でＨｙｂｏｎｄ−ＸＬｍｅｍｂｒａｎｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）上へブロットした。ＨＢＶＤＮＡ複製中間体をＨＢＶゲノムのマイナス鎖に特異的なアルファ−^３２Ｐ−ＵＴＰ標識リボプローブを用いてプローブした。

図３に示されるようにＤＶＲ−１、ＤＶＲ−５６およびＤＶＲ−２３は、ウイルスｍＲＮＡの量に影響を与えず（パネルＡ）、しかし用量に依存してカプシド化ｐｇＲＮＡの水準を低減させた（パネルＣ）。しかしながら、提案された機構と一致して、粒子ゲルアッセイにより、Ｂａｙ４１−４１０９処理が完全にカプシド形成（パネルＢ）およびしたがってｐｇＲＮＡカプシド化およびＤＮＡ合成（パネルＣ、ＤおよびＥ）を消失させ、ＡＴ−６１処理がカプシド形成に影響を与えない（パネルＢ）が、しかし用量に依存してカプシド化ｐｇＲＮＡ（パネルＣ）およびカプシド関連ＨＢＶＤＮＡの量を低減させること（パネルＤおよびＥ）が明らかになった。ＡＴ−６１と同様に、ＤＶＲ化合物は、カプシド形成に有意な影響を与えず（パネルＢ）、しかし用量に依存する形でカプシド化ｐｇＲＮＡおよびカプシド関連ＨＢＶＤＮＡの量を低減させた（パネルＣ、ＤおよびＥ）。上記の結果はＡＴ−６１と表現型として同様であり、ＤＶＲ化合物がヌクレオカプシドへのｐｇＲＮＡカプシド化を抑制し、および中空カプシドの形成をもたらしたことを示唆する。結果として、引き続くＨＢＶＤＮＡ複製が生じ得なかった。

Claims

（Ｒ）−５−ｓｅｃ−ブチルスルファモイル−Ｎ−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−フルオロ−ベンズアミドまたはその塩。
（Ｓ）−５−ｓｅｃ−ブチルスルファモイル−Ｎ−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−フルオロ−ベンズアミドまたはその塩。
請求項１または２に記載の少なくとも１種の化合物またはその塩と、少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物であって、プレゲノムＲＮＡカプシド形成を伴う疾患の症状を、処置、阻害、予防または改善するための、前記医薬組成物。
請求項１または２に記載の少なくとも１種の化合物またはその塩と、少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物であって、ＨＢＶ感染と関連する疾病または疾患の症状を、処置、阻害、予防または改善するための、前記医薬組成物。