JP6546158B2 - 短いテロメアの存在量の測定 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１３年５月２２日に出願したＵ．Ｓ． Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．６１／８２６，４８４の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。

背景における記載は、引用文献における特性付けを裏付けすることが必ずしも意味されるわけではない。

テロメア、真核生物染色体の先端は、染色体を、核酸分解性の分解、末端間融合及び組換えから保護する。テロメアは、核酸配列（５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’）_ｎの反復によって特徴づけられる染色体の末端にある構造である。テロメアは、正常な細胞分裂の結果として短縮し、及び決定的に短いテロメアは、細胞の老化またはアポトーシスを引き起こす。過去１０年におけるヒトにおける疫学的及び臨床的研究の豊富な主体は、高リスクの老化に関連した疾患及び総死亡率に短いテロメア長を関連づけてきた（Ｐｕｔｅｒｍａｎ， Ｅ． ａｎｄ Ｅ． Ｅｐｅｌ， Ｓｏｃ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｐｓｙｃｈｏｌ Ｃｏｍｐａｓｓ， ２０１２． ６（１１） ８０７−８２５； Ｚｈｕ， Ｈ．， Ｍ． Ｂｅｌｃｈｅｒ， ａｎｄ Ｐ． ｖａｎ ｄｅｒ Ｈａｒｓｔ， Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ （Ｌｏｎｄ）， ２０１１． １２０（１０） ４２７−４０； ａｎｄ Ｆｙｈｒｑｕｉｓｔ， Ｆ． ａｎｄ Ｏ． Ｓａｉｊｏｎｍａａ． Ａｎｎ Ｍｅｄ， ２０１２． ４４ Ｓｕｐｐｌ １ Ｓ１３８−４２）。遺伝的、環境、生活様式及び行動因子は、ひとまとめにしてテロメア長に影響を与える。したがって、テロメア長は、全体の健康、疾患及び死亡リスクについての指標となってきた。

平均テロメア長は、公開されたほとんどすべての臨床試験において測定され、患者の疾患及び死亡リスクを層化する際の有用性を示しているが、マウスにおける最近の研究は、また短いテロメアの集団が老化またはアポトーシスへのシグナルを（Ｈｅｍａｎｎ， Ｍ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ ．Ｃｅｌｌ、２００１． １０７（１）６７−７７）、及びしたがって、疾患及び死亡リスクをトリガーすることを示している。Ｈｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌによって報告された研究では、短いテロメアをもつ第６世代テロメラーゼＲＮＡノックアウトマウス（ｍＴＲ−／−Ｇ６）を長いテロメアをもつテロメラーゼについて異種接合体であるマウス（ｍＴＲ＋／−）と交配させた。テロメラーゼヌル子孫の表現型は、これらのテロメアの半分が長いという事実にもかかわらずｍＴＲ−／−親のものを反映し、短いテロメアの量は、及び平均テロメア長ではなく、細胞生存度及び染色体安定度のために重要であることを示唆している。天然産物に由来したテロメラーゼ活性化因子（ＴＡ−６５（登録商標））を受け取る人々では、短い（＜３または＜４ｋｂｐ）テロメアの割合の有意な減少が白血球において検出されたが（定量的ＦＩＳＨ技術によって測定される；（Ｃａｎｅｌａ、Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ、２００７． １０４（１３）５３００−５を参照されたい）、平均テロメア長における変化はみられなかった（Ｈａｒｌｅｙ、Ｃ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ Ｒｅｓ． ２０１１． １４（１）４５−５６）。したがって、短いテロメアの存在量における割合の変化は、テロメアに対する生活様式及び薬理学的またはその他の介入の効果のより感受性が高い測定であると予想される。別の研究（Ｖｅｒａ ｅｔ ａｌ， “Ｔｈｅ Ｒａｔｅ ｏｆ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ Ｓｈｏｒｔ Ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ Ｐｒｅｄｉｃｔｓ Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｓ”， Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ （２０１２）， ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ ＵＲＬ： ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／］． ｃｅｌｒｅｐ．２０１２．０８．０２３）は、「短いテロメアの存在量の増加率は、寿命の前兆であった」ことを見いだした。

ゲノムＤＮＡにおけるテロメア長の測定のために、サザンブロッティング（Ｋｉｍｕｒａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ２０１０， ５： １５９６−１６０７）、Ｑ−ＦＩＳＨ（Ｒｕｆｅｒ， Ｎ． ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １９９８， １６：７４３−７４７）、フローＦＩＳＨ（Ｂａｅｒｌｏｃｈｅｒ、Ｇ． Ｍ． ｅｔ ａｌ、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、２００２、４７：８９−９９）及びｑＰＣＲ（Ｃａｗｔｈｏｎ、Ｒ． Ｍ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２００２、３０（１０）：ｅ４７）を含む種々の方法が開発されてきた。これらの方法の全ては、健康状態をモニターするために臨床状況において使用することができ、及び医師が個々の患者の必要な目的に合わせた予防的または治療的介入を処方することを可能にする。

短いテロメアの集団を測定するためには、定量的蛍光中期−伝播細胞のインサイチューハイブリダイゼーション（Ｑ−ＦＩＳＨ）が個々のテロメアの長さを表すテロメアシグナル強度のヒストグラムを生成するために使用されてきた（Ｐｏｏｎ、Ｓ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１９９９． ３６（４）２６７−７８）。この方法の限界は、生細胞が必要であり、コストが高く、及びスループットが低いことである。Ｑ− ＦＩＳＨアッセイのより高スループットの改変は（ＨＴＱ−ＦＩＳＨ；Ｃａｎｅｌａ、Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ、２００７． １０４（１３）５３００−５を参照されたい）、短いテロメアの割合を測定するために企業Ｌｉｆｅ Ｌｅｎｇｔｈ（Ｓｐａｉｎ）によって最近挑戦された。主張にもかかわらず、残念なことに、現在の技術では、このアッセイは、単一スポットにおけるテロメア、特に短いテロメアのクラスター形成のため、正確であり得ない（テロメアの会合；Ｐａｅｓｃｈｋｅ， Ｋ．， Ｋ．Ｒ． ＭｃＤｏｎａｌｄ， ａｎｄ Ｖ．Ａ． Ｚａｋｉａｎ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， ２０１０． ５８４（１７） ３７６０−７２を参照されたい）。この問題を混乱させるのは、短いテロメアが長いテロメアより頻繁に互いに会合する傾向がある事実である。加えて、ＦＩＳＨ技術は、生または固定細胞において高分子に対するプローブの非特異的結合を受けることが公知である。費用のかからず、及び生細胞を必要としない短いテロメアの割合を測定する高スループット方法は、疫学的及び臨床的条件の両方において適応することがより容易だろうし、及びＱ−ＦＩＳＨより優れた解析性能を有するだろう。

Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，７４１，６７７（Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．）は、テロメア長を測定するための方法に言及する。一つの方法は、リンカー配列が連結される、またはそうでなければ３’テロメアの末端に共有結合される状態下でリンカー配列とテロメアに接触することを含む。テロメア配列は、リンカー配列に対して特異的な第１のプライマー及び染色体のサブテロメア領域に対して特異的な第２のプライマーでの長いＰＣＲ増幅によって増幅される。もう一つの方法は、細胞のＤＮＡ抽出物を調製すること、テロメア反復配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブと共に抽出物をインキュベートすること、テロメア長の測定として結合したプローブの量を決定することを含む。加えて、固体相にゲノムＤＮＡを結合すること及び標識されたプローブと結合したＤＮＡをハイブリダイズすることによってテロメア長を測定する方法が記述されている。

Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００４／０２６５８１５（Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．）は、テロメア長を測定するための方法に言及する。Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．は、テロメアの集団の長さを検出するために以下の工程を記述する：ａ）一本鎖のオリゴヌクレオチドの３’末端（以下、テロレッテと記載する）を、Ｇリッチなテロメア鎖（ＴＴＡＧＧＧ反復配列を含む）を含み、及びＣリッチなテロメアの鎖（ＣＣＣＴＡＡ反復配列を有する）の５’末端にテロレッテを共有結合するテロメアの一本鎖のオーバーハングにアニーリングすること、ｂ）工程（ａ）において形成されたプライマー伸長産物を増幅してライゲーション産物を形成すること；及び（ｃ）工程（ｂ）のプライマー伸長産物の長さを検出すること。（Ｂａｉｒｄ， Ｄ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， ２００３， ３３（２）：２０３−７； ａｎｄ Ｂａｉｒｄ ＤＭ， Ｒｏｗｓｏｎ Ｊ， Ｗｙｎｆｏｒｄ−Ｔｈｏｍａｓ Ｄ， Ｋｉｐｌｉｎｇ Ｄ．； Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， ２００３， ３３（２）：２０３−７． Ｅｐｕｂ ２００３ Ｊａｎ ２１． ＰＭＩＤ： １２５３９０５０をまた参照されたい）。

Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，５１４，６９３（Ｌａｎｓｄｏｒｐ）は、形態学的に無処置の染色体、細胞または組織切片における核酸分子の反復配列の複数のコピーを検出するための方法であって：（ａ）プローブを核酸分子における反復配列にインサイチューでハイブリダイズすることが可能な、変性剤を利用する変性条件下で、核酸分子における反復配列にハイブリダイズし、かつ検出可能な物質によって標識されているＰＮＡプローブで核酸分子を処理すること；及び（ｂ）検出可能な物質を直接または間接的に検出することによって核酸分子における反復配列にハイブリダイズした前記プローブを同定することを含み、これにより、核酸分子における反復配列の複数のコピーを検出する方法に言及する。

短いテロメアの存在量を決定する方法は、サザンブロット解析、インサイチューハイブリダイゼーションにおける定量的蛍光（Ｑ−ＦＩＳＨ）（Ｐｏｏｎ、Ｓ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１９９９、３６（４）：２６７−７８）及びＱ−ＦＩＳＨの改変高スループットバージョン（ＨＴ−Ｑ−ＦＩＳＨ）（Ｃａｎｅｌａ、Ａ．， ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、２００７．， １０４（１３）：５３００−５）を含む。

Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．７，６９５，９０４（Ｃａｗｔｈｏｎ）は、非標的核酸依存的なプライミングイベントを制限するようにデザインされた核酸プライマーを使用して標的核酸を増幅するために方法を記述する。本方法は、テロメア反復単位の数などの反復性領域における反復単位の数を増幅すること、及び定量化することを可能にする。本特許は、またｑＰＣＲ法によって生物の平均テロメアの長さを決定することにも言及する。

したがって、テロメアに属する材料及び方法における進歩にもかかわらず、それぞれ、染色体の集団における短いテロメアの存在量の測定を決定するための改善された方法及び材料、テロメア長を増加する、または減少する、及びそれ故、健康を増加する、または減少する、または逆に将来の疾患または死のリスクを増加する、または減少する介入の健康及び効果の測定を決定するためのこれらの測定の使用に対する需要が残っている。これらの需要及びその他の需要は、本発明によって対処される。

一つの態様において、本発明は、核酸伸長産物を作製する方法であって： ｉ）二本鎖染色体ＤＮＡの３’オーバーハングにおけるテロメア反復配列に伸長プライマーをハイブリダイズすることであって：（１）二本鎖染色体ＤＮＡは、テロメア反復配列を含むテロメア領域及びサブテロメア配列を含むサブテロメア領域を有し；及び（２）伸長プライマーは：（Ａ）アニーリング条件下で３’オーバーハングにおけるテロメア反復配列にハイブリダイズする３’部分、及び（Ｂ）アニーリング条件下で３’オーバーハングにおけるテロメア反復配列にハイブリダイズしないアンカー配列を有する５’部分を含む、前記ハイブリダイズすること；及びｉｉ）時間が限られた伸長反応を行って二本鎖染色体ＤＮＡのサブテロメア領域の方へ伸長プライマーを伸張することであって、伸長反応は、予め定められた長さの範囲内のテロメア領域を有する二本鎖染色体ＤＮＡのみからテロメア反復配列及びサブテロメア配列の両方を含む伸長産物を産生するように調節される、前記伸張することを含む、前記方法を提供する。一つの態様において、二本鎖染色体ＤＮＡは、異なる長さのテロメアを有する染色体分子を含む。さらなる態様において、アンカー配列は、（１）３’オーバーハングを有する染色体ＤＮＡの鎖のサブテロメア領域；（２）３’オーバーハングの２０ｋｂ以内の染色体ＤＮＡのＧ−鎖；（３）３’オーバーハングの５０ｋｂ以内のまたは２０ｋｂ以内の染色体ＤＮＡのＧ−鎖；または（４）二本鎖染色体ＤＮＡにおける配列にハイブリダイズしない。さらなる態様において、伸長反応は、３０分未満、１０分未満、５分未満、４分未満、３分未満、２分未満、１分未満、３０秒未満、２０秒未満、１０秒未満、５秒未満または２秒未満に調節される。プライマー伸長のための速度は、高（１秒につき４００ヌクレオチド）から非常に低（たとえば、１秒につき５０ヌクレオチド）までの範囲であり得るので、広範な伸長時間により、広範なテロメア長の評価ができる（理論的には、約１００ヌクレオチドから何千ものヌクレオチドまで。さらなる態様において、伸長反応は、少なくとも３０分、少なくとも１０分、少なくとも５分、少なくとも４分、少なくとも３分、少なくとも２分、少なくとも１分または少なくとも３０秒に調節される。さらなる態様において、伸長反応は、少なくとも３０分、少なくとも１０分、少なくとも５分、少なくとも４分、少なくとも３分、少なくとも２分、少なくとも１分、または少なくとも３０秒に調節される。さらなる態様において、二本鎖染色体ＤＮＡは、固体、液体、半固体または気体試料から提供される。さらなる態様において、染色体ＤＮＡは、血液、唾液、尿、血漿、血清、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）または気管支肺胞洗浄液から選択される液体の試料から提供される。さらなる態様において、染色体ＤＮＡは、肺、筋肉または皮膚から選択される固体の試料から提供される。さらなる態様において、染色体ＤＮＡは、骨髄を含む半固体試料から提供される。さらなる態様において、染色体ＤＮＡは、呼気を含む気体試料から提供される。さらなる態様において、二本鎖染色体ＤＮＡは、脊椎動物のＤＮＡ、哺乳動物ＤＮＡまたはヒトＤＮＡである。さらなる態様において、３’伸長プライマーの部分は、ヒトテロメア反復配列にハイブリダイズする。さらなる態様において、伸長プライマーの３’部分は、配列５’−（ＣＣＣＴＡＡ）ｎ−３’またはその同じ順序置換を含み、式中ｎは、少なくとも１である。さらなる態様において、ｎは、少なくとも２である。さらなる態様において、伸長プライマーの５’部分は、配列：５’−ＴＧＣＴＣＧＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＣ−３’［配列番号：８］を含む。さらなる態様において、伸長プライマーは、配列：５’−ＴＧＣＴＣＧＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＴＡＡＣＣ−３’［配列番号：７］を含む。さらなる態様において、時間が限られた伸長反応は、鎖−置換活性、エキソヌクレアーゼ活性または鎖分解活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用する。さらなる態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ポリメラーゼ（たとえば、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ断片及びＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片及びＤｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（エキソヌクレアーゼ）をから選択される。さらなる態様において、第１の反応は、ＤＮＡポリメラーゼヘリカーゼと、または５’−３’エキソヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて行われる。

もう一つの態様において、本発明は、ａ）以下によって核酸伸長産物を作製すること：ｉ）３’二本鎖染色体ＤＮＡのオーバーハングにおけるテロメア反復配列に伸長プライマーをハイブリダイズすることであって：（１）二本鎖染色体ＤＮＡは、テロメア反復配列を含むテロメア領域及びサブテロメア配列を含むサブテロメア領域を有し；及び（２）伸長プライマーは：（Ａ）３’アニーリング条件下でオーバーハングにおけるテロメア反復配列にハイブリダイズする３’部分及び（Ｂ）アニーリング条件下で３’オーバーハングにおけるテロメア反復配列にハイブリダイズしないアンカー配列を有する５’部分を含む、前記ハイブリダイズすること；及びｉｉ）時間が限られた伸長反応を行って二本鎖染色体ＤＮＡのサブテロメア領域の方へ伸長プライマーを伸張することであって、伸長反応は、予め定められた長さの範囲内でテロメア領域を有する二本鎖染色体ＤＮＡのみからのテロメア反復配列及びサブテロメア配列の両方を含む伸長産物を産生するように調節される、前記作製すること；及びｂ）伸長産物の配列を増幅することを含み；これによりテロメア反復配列及びサブテロメア配列を有する核酸を含む長さの限られた増幅産物を産生する、前記方法を提供する。一つの態様において、配列は：（１）アニーリング条件下で伸長産物におけるサブテロメア領域に独特の配列にハイブリダイズする第１の増幅プライマー；及び（２）アニーリング条件下でアンカー配列にハイブリダイズする第２の増幅プライマー、を使用して増幅される。さらなる態様において、第１の増幅プライマーは：５’−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ−３’［配列番号：２］、５’− ＣＧＧＧＣＣＧＧＣＴＧＡＧＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡ−３’［配列番号：１０］（染色体１）、５’−ＧＣＴＡＡＴＧＣＡＣＴＣＣＣＴＣＡＡＴＡＣ−３’［配列番号：１１］（染色体５）、及び５’−ＣＡＴＴＣＣＴＡＡＴＧＣＡＣＡＣＡＴＧＡＴＡＣＣ−３’［配列番号：１２］（染色体９）から選択される配列を含む。さらなる態様において、第１の増幅プライマーは、配列５’−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ−３’［配列番号：２］を含み、及び第２のプライマーは、配列５’−ＴＧＣＴＣＧＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＣ−３’［配列番号：８］を含む。増幅されたテロメア産物の長さ範囲は、ＰＣＲ反応におい時間が限られた伸長時間を使用して決定することができる。さらなる態様において、方法は、対照配列を同時増幅することをさらに含む。さらなる態様において、対照配列は、複数の非テロメアの反復配列を含む。さらなる態様において、対照配列は、インビトロにおいて合成される、またはインビボにおいて（たとえば、細菌または真菌のクローンにおいて）産生される。

もう一つの態様において、本発明は、短いテロメアの存在量を決定するための方法であって：ａ）被験体からの３’オーバーハングを含む二本鎖染色体ＤＮＡを含む試料を提供すること；ｂ）本明細書において（たとえば、上記）記述した本発明の染色体のテロメア反復配列及びサブテロメア配列を増幅する方法を使用して二本鎖染色体ＤＮＡから長さの限られた増幅産物を産生すること；及びｃ）長さの限られた増幅された産物から短いテロメアの存在量を決定することを含む前記方法を提供する。一つの態様において、方法は：ｄ）試料からの総テロメアの存在量と短いテロメアの存在量を比較することをさらに含む。さらなる態様において、短いテロメアは、約０．５ｋｂより、約１ｋｂより、約２ｋｂより、約３ｋｂより、約４ｋｂよりまたは約５ｋｂよりも長くない長さを有するテロメアである。さらなる態様において、比較することは、総テロメアの存在量の関数（たとえば、短いテロメアの存在量と総テロメアの存在量の比）として短いテロメアの存在量を決定することを含む。さらなる態様において、短いテロメアの存在量を決定することは、ｑＰＣＲを使用して行われる。さらなる態様において、ｑＰＣＲは、第１及び第２のプライマーを使用して行われ、（ｉ）前記第１のプライマーは、前記第１の鎖の少なくとも１つの反復単位にハイブリダイズし、及び前記第２のプライマーは、前記第２の鎖の少なくとも１つの反復単位にハイブリダイズし、（ｉｉ）前記ハイブリダイズしたプライマーは、これらのそれぞれの鎖にハイブリダイズしたときに、プライマー伸長ができる、及び前記第１のプライマーの少なくとも１つのヌクレオチドは、前記第１のプライマーが前記第１の鎖の少なくとも１つの反復単位にハイブリダイズしたときに、ヌクレオチドは前記第１のプライマーと前記反復単位との間に内部塩基対ミスマッチを生じ、（ｉｉｉ）前記第１のプライマーは、また第１及び第２のプライマーが互いにハイブリダイズするときに、前記第２のプライマーの３’末端ヌクレオチドとミスマッチを生じ、（ｉｖ）前記第２のプライマーの少なくとも１つのヌクレオチドは、前記第２のプライマーが前記第２の鎖の少なくとも１つの反復単位にハイブリダイズしたときに、前記第２のプライマーと前記反復単位のヌクレオチドとの間の内部塩基対ミスマッチを生じる。さらなる態様において、短いテロメアの存在量を決定することは、サザンブロット、ドットブロット法、スロットブロット、免疫化学、核酸シーケンシングまたはデジタルＰＣＲによって試料における平均テロメア長を測定することを含む。さらなる態様において、短いテロメアの存在量は、存在量比の測定である。さらなる態様において、総テロメアの存在量は、ゲノム参照配列の存在量に相対的に測定される。さらなる態様において、ゲノム参照配列は、単一コピー参照核酸配列（たとえば、ヒトβ‐グロビン）または非テロメア反復ＤＮＡ（たとえば、Ａｌｕ反復または動原体性反復）の存在量を含む。

もう一つの態様において、本発明は：ａ）被験体からの試料における短いテロメアの存在量を決定すること；及びｂ）短いテロメアの存在量を状態または疾患と関連づけることを含む方法を提供する。一つの態様において、短いテロメアの存在量の測定は、試料からの総テロメアの存在量と短いテロメアの存在量を比較することによって決定される。さらなる態様において、短いテロメアの存在量は、本明細書において（たとえば、上記の）記述した方法を使用して決定される。さらなる態様において、状態または疾患は、死亡リスクである。さらなる態様において、テロメアの存在量は、絶対存在量である。さらなる態様において、絶対存在量は、テロメア配列の長さとして測定される。さらなる態様において、テロメアの存在量を決定することは、ｑＰＣＲサザンブロット、ドットブロット法、スロットブロット、免疫化学、核酸シーケンシング及びデジタルＰＣＲによって試料における平均テロメア長を測定することを含む。さらなる態様において、状態または疾患の関連は、認知されたストレスの健康状況調査スコアである（たとえば、Ｃｏｈｅｎ， Ｓ； Ｋａｍａｒｃｋ Ｔ， ａｎｄ Ｍｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ Ｒ （１９８３） Ｊ． Ｈｅａｌｔｈ Ｓｏｃｉａｌ Ｂｅｈａｖ． ２４（４） ３８５−３９６を参照されたい）。さらなる態様において、病態のリスクは、疾患（たとえば、心臓血管疾患、糖尿病、癌、肝臓繊維増多及び鬱病）のリスクである。さらなる態様において、疾患は、老化の疾患である。さらなる態様において、老化の疾患は、心臓血管疾患であり、及び集団における平均より低い測定は、心臓血管疾患のリスクの増加と関連づけられる。さらなる態様において、方法は、集団の上記三分位値における測定と比較して心臓血管疾患に対しし有意に高いリスクをもつ集団の下位の２または３の三分位値の短いテロメアの存在量と関連づけることを含む。さらなる態様において、方法は、テロメア疾患と測定を関連づけることを含む。テロメア疾患は、先天性角化異常症、肺線維症、再生不良性貧血及び間質性肺炎を含むことができるが、限定されない。さらなる態様において、方法は、薬物応答性での測定を含む。たとえば、方法は、スタチンに薬物応答性（短い平均テロメア長は、個体の正常な白血球における薬物応答性と陽性に関連づけられる）またはイメテルスタトに反対に応答性（ＧＲＮ １６３Ｌ、制癌剤）（短いテロメア長は、血小板減少または好中球減少などの正常な白血球における有害作用と関連づけられる）である測定を含むことができる。さらなる態様において、方法は、疾患進行及びＨＩＶ、ＨＣＶ ＨＢＶ及びＣＭＶなどの慢性感染症における治療結果と測定を関連づけることを含む。さらなる態様において、方法は、関連を被験体に報告することをさらに含む。さらなる態様において、方法は、関連に基づいた診断または予後を被験体に提供することをさらに含む。さらなる態様において、方法は、関連に基づいて被験体を治療することをさらに含む。

もう一つの態様において、本発明は、被験体の状態をモニターするための方法であって：期間にわたって採取した複数の被験体試料のそれぞれにおける細胞から短いテロメアの存在量の測定を決定すること；測定における相違を決定すること；及びテロメア疾患の進行と相違を関連づけることを含み、測定における減少は、疾患の進行を示す、方法を提供する。一つの態様において、短いテロメアの存在量の測定は、試料からの総テロメアの存在量の測定と短いテロメアの存在量の測定を比較することによって決定される。

もう一つの態様において、本発明は：複数の被験体試料からの細胞における短いテロメアの存在量の測定における増減率を決定することであって、それぞれの試料は、異なる時に採取されること；及び：（１）健康の測定；（２）病態のリスク；（３）テロメア疾患または（４）薬物応答性と増減率を関連づけることを含む、方法を提供する。一つの態様において、短いテロメアの存在量の測定は、試料からの総テロメアの存在量の測定と短いテロメアの存在量の測定を比較することによって決定される。

もう一つの態様において、本発明は：（１）（Ａ）アニーリング条件下で二本鎖染色体ＤＮＡの３’オーバーハングにおけるテロメア反復配列にハイブリダイズする３’部分及び（Ｂ）染色体ＤＮＡにおけるテロメア領域における配列に、またはサブテロメア領域における配列にアニーリング条件下でハイブリダイズしないアンカー配列を有する５’部分を含む第１の増幅プライマー；及び（２）アニーリング条件下でサブテロメア配列にハイブリダイズする第２の増幅プライマーを含むキットを提供する。一つの態様において、キットは：（３）アニーリング条件下でアンカー配列に相補物にハイブリダイズする第３の増幅プライマーをさらに含む。さらなる態様において、キットは：（３）短いテロメア測定のハイブリダイゼーション、伸長、増幅及び定量化工程を実施する試薬を含む。さらなる態様において、キットは：（３）公知のテロメア長をもつ染色体ＤＮＡまたは公知の質量をもつテロメア反復をもつ合成オリゴヌクレオチドを含む対照試料及び参照試料をさらに含む。

参照による援用
この明細書において言及した全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれの個々の公開、特許または特許出願が参照により援用されることが具体的に、及び個々に示されたのと同じ程度に本明細書において参照により援用される。

短いテロメアアッセイ（ＳＴＡ）の全体のスキームを示す。 ＴＥＬＯＴＥＳＴ、ｑＰＣＲアッセイにおけるテロメア反復配列にハイブリダイズするミスマッチのプライマーを使用する平均テロメア長を測定するための試験による鎖置換の間の短いテロメア増幅の確認を示す。類似のタイプのアッセイは、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．７，６９５，９０４（Ｃａｗｔｈｏｎ）において記述される。 は、鎖−置換産物のサザンブロット解析を示す。Ｍ：分子重量マーカー；レーン１：膀胱癌株化細胞（ＵＭ−ＵＣ３）からの総ゲノムＤＮＡを修飾ＳＴＥＬＡ（単一テロメア伸張長さ分析）プロトコル（Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ， ２００３）によって増幅した；レーン２−５：プライマーとしてＳＵＳ及びＴｅｌｏＡｎｃｈｏｒを使用するＰＣＲ産物及び鎖−置換産物が鋳型である。鎖−置換反応時間を示してある（３０秒、１、３及び５分）。鎖長は：３０秒＝約１ｋｂ；１分＝約２ｋｂ；３分＝約５ｋｂ；５分＝約８ｋｂ。 異なる平均テロメア長をもつＤＮＡ試料における短いテロメア定量化のための概念の証明算出を示す。ＵＭ−ＵＣ３は、短い平均テロメアをもつ細胞集団であり、及びＵＭ−ＵＣ３／ｈＴＥＲは、しかしテロメラーゼ（ｈＴＥＲで）の過剰発現により伸張（伸張された）テロメアをもつ同一の細胞集団である。示したように、短いテロメアの存在量比は、ＵＭ−ＵＣ３／ｈＴＥＲにおいてよりＵＭ−ＵＣ３において非常に大きい。 サザンブロットによる（０．２−５ｋｂｐ範囲の末端制限断片の相対的シグナルを示してある）及び本発明の短いテロメアアッセイによる、ＵＭ−ＵＣ３及びＵＭ−ＵＣ３／ｈＴＥＲにおける短いテロメアの存在量比を比較する表であり、短いテロメアの割合は、短及び総テロメア測定の比である。両方の場合において、ＵＭ−ＵＣ３／ｈＴＥＲにおいてよりＵＭ−ＵＣ３においておよそ３倍短いテロメアがある。 短いテロメアアッセイのためのハイスループット工程を示す。 染色体Ａ、Ｂ及びＣでの時間制御されたプライマー伸長を示し、それぞれは、異なる長さのテロメアを有する。クロマチンは、破線によって表してある。サブテロメア独特の配列は、「ＳＵＳ」によって表してある。テロメアは、実線によって表してある。伸長産物は、破線によって表してある。図７Ａにおいて、プライマー伸長のための時間は、プライマーが染色体Ａ及びＢにおけるサブテロメア領域（サブテロメア独特の配列「ＳＵＳ」を有する）を通って伸張するように、しかしＣは通らずに選択される。 図７Ｂは、３つのプライマー伸長産物の第２の鎖合成を示す。図７Ｂにおいて、サブテロメア独特の配列を有するプライマー「ＳＵＳ」は、伸長産物Ａ及びＢにハイブリダイズすることができ、しかし伸長産物Ｃはできず、これは、本来の染色体における長いテロメア長のため、サブテロメア領域に伸張しなかった。したがって、第２の鎖合成は、Ｃからでなく、伸長産物Ａ及びＢにハイブリダイズしたＳＵＳプライマーから生じることができる。第２の鎖は、実線によって表してある。次いで、この産物は、本来の染色体ＤＮＡの「ショートテロメア」画分を表す。

定義

本明細書において使用される用語法は、特定の態様だけを記述するためであり、及び限定することを意図しないことを理解すべきである。

明細書及び請求の範囲に使用される、用語「含むこと」は、態様「からなる」及び「から本質的になる」を含むことができる。

本明細書に使用される、化合物のための名称は、有機化合物を含み、名称について一般名、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢＭＢまたはＣＡＳ推奨を使用して与えることができる。別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門的及び科学用語は、一般に本発明が属する技術における当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。この明細書において、及び続く請求項において、本明細書において定義したものとする多数の用語について言及がなされるだろう。

明細書及び添付の請求の範囲に使用されるように、「ある」、「ある」及び「その」は、単数形、状況が別途はっきり指示しない限り、複数の言及を含む。したがって、たとえば、「細胞」、「ヌクレオチド」または「プライマー」に対する言及は、このような細胞、ヌクレオチドまたはプライマー及び同様のもの２つ以上の混合物を含む。

範囲は、本明細書において「約」１つの特定の値から及び／または「約」もう一つの特定の値までとして表すことができる。このような範囲が表されるとき、さらなる態様は、１つの特定の値から、及び／またはその他の特定の値までを含む。同様に、値が近似として表されるときに、先行詞の「約」の使用により、特定の値がさらなる態様を形成することが理解されるだろう。範囲のそれぞれの終点は、他方の終点に関して両方有意であり及び独立して他方の終点であることがさらに理解されるだろう。本明細書において開示される多数の値があること、及びそれぞれの値は、また本明細書においてその特定の値に加えて「約」それ自体の値として開示されることがまた理解される。たとえば、値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。２つの特定の単位間のそれぞれの単位も開示されることが、また十分に理解される。たとえば、１０及び１５が開示される場合、１１、１２、１３及び１４も開示される。

本明細書に使用される、用語「約」及び「…または約」は、当該量または値がおよそまたは約同じいくつかのその他の値を示した値であることができる。本明細書に使用され、特に明記され、または推定されない限り、これは、±１０％の偏差を示した名目値であることが一般に十分に理解される。本用語は、類似の値が請求の範囲に詳述した均等な結果または効果を促進することを伝えることが意図される。すなわち、量、サイズ、製剤、パラメーター、並びにその他の量及び特徴は、正確ではなく、及びその必要はないが、近似の、及び／またはより大きな、またはより小さな、所望であるとおりの、反映する寛容性、変換因子、端数計算、測定誤差及び同様のもの、及び当業者に公知であるその他の要素であることができるものと理解される。一般に、量、サイズ、製剤、パラメーターまたはその他の量または特徴は、明白にそのようなものであると述べられるか否かを問わず、「約」、または「およそ」である。「約」が定量値の前に使用される場合、別途、具体的に明示されない限り、パラメーターがそれ自体具体的定量値をまた含むものと理解される。

特定の要素または組成物における成分の重量部に対する明細書及び締めくくりの請求の範囲における言及は、重量部が表される組成物または物品における要素または成分と任意のその他の要素または成分との間の重量関係を意味する。したがって、２重量部の成分Ｘ及び５重量部の成分Ｙを含む化合物において、Ｘ及びＹは、２：５の重量比にて存在し、及びさらなる成分が化合物に含まれるかどうかにかかわらず、このような比において存在する。

成分の重量パーセント（ｗｔ．％）は、反対に具体的に明示されていなければ、成分が含まれる製剤または組成物の総重量に基づく。

本明細書に使用される、用語「任意の」または「任意に」は、その後に記述されたイベントまたは環境が生じることができ、またはできないこと、並びに記述が前記イベントまたは環境が生じる場合を例証し、及びそれがない場合を例証することを含む。

本明細書に使用される、用語「有効量」は、組成物または方法の物理的、化学的または生物的性質の所望の変化を達成するために十分である量をいう。

本明細書に使用される、「キット」は、キットを構成する少なくとも２つの成分のコレクションを意味する。共に、構成要素は、所与の目的のための機能的単位を構成する。個々の構成要素は、共にまたは別々に、物理的にパッケージしてもよい。たとえば、キットを使用するための説明書を含むキットは、その他の個々の構成要素と共に説明書を物理的にを含んでいてもよく、または含まなくてもよい。その代わりに、説明書は、分離した構成要素として、コンピュータ読み取り可能なメモリ装置上に供給しても、またはインターネットウェブサイトからダウンロードしてもよい紙形式もしくは電子形式のいずれかで、または記録された提示法として供給することができる。

本明細書に使用される、「説明書（類）」は、キットに属する関連した材料または方法論を記述する書類を意味する。これらの材料は、以下の任意の組み合わせを含んでいてもよい：背景情報、構成要素の一覧及びこれらの在庫情報（購入情報その他）、キットを使用するための簡単な、または詳細なプロトコル、トラブルシューティング、参照文献、技術サポート及び任意のその他の関連ドキュメント。説明書は、キットと共に、または分離した構成要素として、コンピュータ読み取り可能なメモリ装置上に供給しても、またはインターネットウェブサイトからダウンロードしてもよい紙形式もしくは電子形式のいずれかで、または記録された提示法として供給することができる。説明書は、１つまたは複数の文書を含むことができ、将来のアップデートを含むことが意味される。

本明細書に使用される、用語「被験体」は、哺乳動物、魚、トリ、爬虫類または両生類などの脊椎動物であることができる。したがって、本明細書において開示された方法の被験体は、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、モルモットまたは齧歯類であることができる。本用語は、特定の年齢または性別を意味しない。したがって、雄または雌であるにせよ、成体及び新生児被験体、並びに胎児が包含されることが意図される。一つの態様において、被験体は、哺乳動物である。患者は、状態、疾患または障害で苦しめられる被験体をいう。用語「患者」は、ヒト及び獣医学的被験体を含む。開示された方法のいくつかの態様において、被験体は、短いテロメアの存在量における機能不全と関連する１つまたは複数の状態または疾患の治療のための必要があると診断されている。

本明細書に使用される、用語「治療」は、疾患、病態または障害を治療する、寛解させる、安定させる、または予防する意図がある患者の医学的管理をいう。この用語は、能動的治療、すなわち具体的に疾患、病態または障害の改善の方向を目指す治療を含み、及びまた原因療法、すなわち関連する疾患、病態または障害の原因の除去の方向を目指す治療を含む。加えて、この用語は、対症療法、すなわち疾患、病態または障害の治癒よりもむしろ症候の軽減のために計画された治療；予防治療、すなわち関連する疾患、病態または障害の発症を最小限にする、または部分的に、もしくは完全に阻害することを対象とする治療；及び補助的治療、すなわち関連する疾患、病態または障害の改善の方向を目指すもう一つの具体的療法を補うために使用される治療を含む。種々の態様において、本用語は、哺乳動物（たとえば、ヒト）を含む被験体の任意の治療を包含し、及び：（ｉ）疾患が、疾患になり得るが、それを有するとまだ診断されていない被験体において生じることから予防すること；（ｉｉ）疾患を阻害すること、すなわちその発症を抑えること；または（ｉｉｉ）疾患を軽減すること、すなわち疾患の軽減を生じさせること。一つの態様において、被験体は、霊長類などの哺乳動物であり、及びさらなる態様において、被験体はヒトである。また、用語「被験体」は、家畜化された動物（たとえば、ネコ、イヌその他）、家畜（たとえば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギその他）及び実験動物（たとえば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、フルーツフライその他）を含む。

本明細書に使用される、用語「予防する」または「予防すること」は、特に事前の作用によって、何かが起こるのを妨げる、避ける、取り除く、前もって対処する、止める、または妨げることをいう。軽減する、阻害する、または予防するが本明細書に使用される場合、具体的に別途示されない限り、その他の２つの言葉の使用も明白に開示したものと理解される。

本明細書に使用される、用語「投与すること」及び「投与」は、医薬品製剤を被験体に提供する任意の方法をいう。このような方法は、当業者に周知であり、及び経口投与、経皮投与、吸入による投与、経鼻投与、局所的投与、腟内投与、眼内投与、内部聴覚投与、大脳内投与、直腸投与、舌下投与、頬側投与及び非経口投与を含むが、限定されず、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与及び皮下投与などの注射剤を含む。投与は、連続的で、または断続的であることができる。種々の態様において、製剤は、治療的に投与すること；すなわち、既存の疾患または条件を治療するために投与することができる。さらなる種々の態様において、製剤は、予防的に投与すること；すなわち、疾患または条件の予防のために投与することができる。

本明細書に使用される、用語「有効量」及び「有効な量」は、所望の結果を達成するため、または望まれない状態に対して効果を有するために十分である量をいう。たとえば、「治療上有効な量」は、所望の治療上の結果を達成するために、または望まれない症候に対して効果を有するために十分であるが、有害な副作用を生じさせるには一般に不十分である量をいう。任意の特定の患者のための具体的な治療的に有効な用量レベルは、治療される障害及び障害の重症度；使用される具体的組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康、性別及び食餌；投与の時間；投与経路；使用される具体的化合物の排出速度；治療の期間；使用される具体的化合物と組み合わせて、または同時に使用される薬物及び医学技術において周知の同様の因子を含む多様な因子に依存するだろう。たとえば、当該技術分野の技術内で、所望の治療効果を達成するために、及び所望の効果が達成されるまで徐々に投薬量を増加させるために必要とされるものより低いレベルにて化合物の開始用量には十分である。必要に応じて、有効な１日量は、投与の目的のために複数の用量に分割することができる。結果的に、単一用量組成物は、その１日量を構成するためにこのような量またはその約数を含むことができる。投薬量は、任意の禁忌の場合には、個々の医師によって調整することができる。投薬量は、変更することができ、及び１日または複数日の間、１つまたは複数用量投与において毎日投与することができる。ガイダンスは、医薬品製品の所与の分類のための適切な投薬量についての文献において見いだすることができる。さらなる種々の態様において、製剤は、「予防的に有効な量」；すなわち、疾患または症状の予防のために有効な量において投与することができる。

本明細書に使用される、「伸長プライマー」は、ＤＮＡポリメラーゼによって実施される時間が限られた伸長反応工程を行うために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを意味する。伸長プライマーは、３’部分及び５’部分を含むことができる。たとえば、３’部分は、アニーリング条件下で３’オーバーハングにおけるテロメア反復配列にハイブリダイズすることができ、５’部分は、アニーリング条件下で３’オーバーハングにおけるテロメア反復配列にハイブリダイズしないアンカー配列を有することができる。

本明細書に使用される、「テロメア領域」は、反復テロメア配列をもつ染色体の末端におけるＤＮＡセグメントを意味する。脊椎動物の場合において、それは、染色体の末端の（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ反復配列であることができる。

本明細書に使用される、「サブテロメア領域」は、テロメアの動原体末端にてテロメアにすぐ隣接するＤＮＡのセグメントを意味する。サブテロメア領域は、変性テロメア反復をたいてい含む。ヒトの場合において、ＴＧＡＧＧＧ及びＴＣＡＧＧＧの反復は、サブテロメア領域に存在し得る。

本明細書に使用される、「時間が限られた伸長反応」は、ヌクレオチドにおる反応の産物のサイズ、時間が限られた伸長産物は、反応において利用されるＤＮＡポリメラーゼの固有の伸長割合及び反応時間の関数であるＤＮＡポリメラーゼによって実施される酵素反応を意味する。

本明細書に使用される、「アンカー配列」は、ＰＣＲ反応において使用することができる鋳型ゲノムに存在しない、または２０ｋｂの意図された単位複製配列内に存在するプライマー内の独特の配列セグメントを意味する。たとえば、伸長プライマーの５’部分は、伸長プライマーの３’部分がハイブリダイズするＧ−鎖におけるテロメア反復配列にアニーリング条件下でハイブリダイズしないように構成されているアンカー配列であることができる。

本明細書に使用される、「染色体ＤＮＡのＧ−鎖」は、３’オーバーハングを有するテロメアの鎖を意味し、及びテロメア反復配列５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’を含む。たとえば、「染色体ＤＮＡのＧ−鎖」は、ヒト及びその他の脊椎動物における（ＴＴＡＧＧＧ）_ｎテロメア配列を含む染色体におけるＤＮＡ鎖をいうことができる。

本明細書に使用される、「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素をいう。一般に、酵素は、核酸鋳型配列にアニーリングしたプライマーの３’−末端にて合成を開始するだろう。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。公知のＤＮＡポリメラーゼは、たとえばパイロコッカスフリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ、（１９９１）Ｇｅｎｅ １０８：１）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｌｅｃｏｍｔｅ ａｎｄ Ｄｏｕｂｌｅｄａｙ （１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １１ ：７５０５）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５６：３１１２）、サーマスサーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ （１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：７６６１）、バシラスステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｅｎｅｓｈ ａｎｄ ＭｃＧｏｗａｎ （１９７７） Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ４７５：３２）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（また、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼともいわれる、Ｃａｒｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：４１９３）、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｉａｚ ａｎｄ Ｓａｂｉｎｏ （１９９８） Ｂｒａｚ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｒｅｓ ３１ ： １２３９）及びサームス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ，（１９７６）Ｊ． Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ １２７：１５５０）を含む。上記の酵素のいずれのポリメラーゼ活性も、当該技術分野において周知の手段によって決定することができる。

本明細書に使用される、「熱安定性」ＤＮＡポリメラーゼ活性は、たとえばＤＮＡポリメラーゼの非熱安定性形態と比較したときに、高温、たとえば４５〜１００℃、好ましくは５５〜１００℃、６５〜１００℃、７５〜１００℃、８５〜１００℃または９５〜１００℃にて熱及び機能に対して相対的に安定であるＤＮＡポリメラーゼ活性を意味する。

ＤＮＡポリメラーゼの鎖−置換活性は、合成の間に遭遇した下流のＤＮＡを置換する能力を記述する。たとえば、ＤＮＡポリメラーゼの鎖−置換活性は、ＤＮＡの二本鎖を２つの単一鎖に分離することができるポリメラーゼ能力をいう。鎖−置換活性をもつＤＮＡポリメラーゼの例は、ウイルス、原核生物、真核生物もしくはアルケー由来ホロ酵素またはレプリカーゼの部分、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウＤＮＡポリメラーゼエキソ、及びＢｓｔエキソ⁻と命名されたバチルスステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼである。「エキソ」は、対応する酵素が５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないことを示す。ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼの周知の例は、バクテリオファージｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである。本発明の方法において有用な鎖−置換活性をもつさらなる適切なＤＮＡポリメラーゼは、当業者に周知であり、及び修飾Ｔ７ポリメラーゼ（たとえば、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）などのＤＮＡポリメラーゼ大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ断片及びＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片及びＤｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）を含む。

あるいは、鎖−置換活性をもつＤＮＡポリメラーゼは、またそれぞれのＤＮＡポリメラーゼに加えて使用される触媒、たとえばタンパク質または酵素であることを条件として、鎖−置換活性のないものであることが理解され、これはＤＮＡの二本鎖を分離すること、またはＤＮＡの一本鎖を安定化することができる。これらのタンパク質は、たとえば、ヘリカーゼ、ＳＳＢタンパク質及び組換えタンパク質を含み、これは、レプリカーゼなどのより大きな酵素複合体の成分として存在することができる。本例において、鎖−置換活性をもつポリメラーゼは、ポリメラーゼそれ自体に加えて成分と共に産生される。鎖−置換活性をもつポリメラーゼは、熱不安定性または熱安定のいずれであることもできる。

本明細書に使用される、「プライマー」は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下で、たとえば４つの異なるヌクレオシド三リン酸及び伸長のための薬剤（たとえば、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下で、適切な緩衝液において、及び適切な温度にて、ＤＮＡ合成の開始の位置にて作用することができるオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは、鋳型核酸の完全系列を反映する必要はなく、しかし鋳型でハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。所与の標的配列の増幅のための適切なプライマーの設計は、当該技術分野において周知であり、及び本明細書において引用した文献において記述される。

本明細書に使用される、用語「ターゲット」、「ターゲット配列」、「ターゲット領域」及び「ターゲット核酸」は、同義であり、及び増幅され、または検出される核酸の領域または部分列をいう。

本明細書に使用される、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基対形成のための、２つの一本鎖の核酸による二重鎖構造の形成をいう。ハイブリダイゼーションは、完全に相補的な核酸鎖の間に、または軽微なミスマッチの領域を含む「実質的に相補的な」核酸鎖の間に生じることができる。完全に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイズするだろう条件は、「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」または「配列特異的ハイブリダイゼーション条件」といわれる。実質的に相補的な配列の安定な二重鎖は、よりストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件下で達成することができ；許容されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼーション条件の適切な調整によって制御することができる。核酸技術の当業者は、当業者によって提供されるガイダンスにしたがって、たとえばオリゴヌクレオチドの長さ及び塩基対組成、イオン強度及びミスマッチ塩基対の発生率を含む多数の変数を考慮して経験的に２重の安定度を決定することができる（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ− Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）； 及びＷｅｔｍｕｒ （１９９１） Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６ （３／４）：２２７−２５９を参照されたい；両方とも参照により本明細書に援用される）。

用語「増幅反応」は、鋳型核酸配列のさらなるコピーを生じ、または鋳型核酸の転写を生じる、酵素反応を含む任意の化学的反応をいう。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、より長い二本鎖ＤＮＡ分子の範囲内のＤＮＡ配列の指数関数的な増幅が可能な方法である。ＰＣＲは、ＤＮＡのそれぞれの２つの鎖上の定義された配列に相補的である一対のプライマーの使用を伴う。これらのプライマーは、コピーが指定された配列で作製されるようにＤＮＡポリメラーゼによって伸張される。このコピーを作製した後、同じプライマーを、入力ＤＮＡ鎖のもう一つのコピーだけでなく、また合成の第１のラウンドにおいて作製された短いコピーも作製するために再び使用することができる。これが、対数的増幅をまねく。増幅過程の各々のラウンドにおいて二重鎖ＤＮＡの２つの鎖を分離するために温度を上げる必要があるので、主要な工程の前進は、サームス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）；熱いプールにおいて成長する細菌から単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）の発見であったし；その結果、増幅のラウンド毎に新たなポリメラーゼを添加することが必要でない。増幅の数（たいてい約４０）ラウンドの後、ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で解析し、及び臭化エチジウム染色法で検出されるほど十分豊富である。

リアルタイムＰＣＲは、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ／ｑＰＣＲ）または動力学的なポリメラーゼ連鎖反応とも呼ばれ、ＰＣＲに基づいた実験技術であり、ターゲットされたＤＮＡ分子を増幅し、及び同時に定量化するために使用されることが理解される。ｑＰＣＲは、（ＤＮＡ入力またはさらなる規準化する遺伝子に規準化したときのコピーの絶対数または相対量として）ＤＮＡ試料における特異的配列の検出及び定量化を可能にする。

本明細書に使用される、プライマーは、十分にストリンジェントな条件下で使用したときにプライマーが標的核酸のみに主にハイブリダイズする場合、標的配列に対して「特異的」である。典型的には、プライマーは、プライマー−標的二重鎖安定度がプライマーと試料において見いだされる任意のその他の配列との間に形成される二重鎖の安定度を上回る場合、標的配列に対して特異的である。当業者は、塩条件、並びにプライマーの塩基組成及びミスマッチの位置などの種々の因子は、プライマーの特異性に影響を及ぼすだろうこと、及びプライマー特異性のルーチンの実験的な確認が大部分の場合において必要だろうことを認識するだろう。ハイブリダイゼーション条件は、プライマーが標的配列のみと安定な二重鎖を形成することができる下で選択することができる。したがって、適切にストリンジェントな増幅条件下での標的特異的なプライマーの使用は、標的プライマー結合部位を含むこれらの標的配列の特異的増幅を可能にする。配列特異的増幅条件の使用は、正確に相補的なプライマー結合部位を含むこれらの標的配列の特異的増幅を可能にする。

本明細書に使用される、「相補的な」は、相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチドとの間で従来のワトソンクリック型塩基対または（たとえば、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合）その他の非伝統的タイプの対形成によってもう一つの核酸分子と水素結合を形成することができる核酸分子をいう。

核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能である標的核酸配列に１００％相補的である必要がないことは、当該技術分野において十分に理解されている。すなわち、２つ以上の核酸分子は、完全に相補的より低くてもよく、及び第２の核酸分子と水素結合を形成することができる核酸分子に隣接する残基の割合によって示される。たとえば、第１の核酸分子が１０ヌクレオチドを有し、及び第２の核酸分子が１０ヌクレオチドを有する場合、それぞれ第１及び第２の核酸分子間の５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドの塩基対形成は５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％の相補性を表す。「完全に」または「完全に」相補的な核酸分子は、以下のものを意味する。第１の核酸分子の全ての隣接する残基は、第２の核酸分子における同じ数の隣接する残基と水素結合するだろうし、両方の核酸分子は、同じ数のヌクレオチドを有し（すなわち、同じ長さを有する）、または２つの分子は、異なる長さを有する。

本明細書に使用される、用語「非特異的増幅」は、標的配列以外の配列にハイブリダイズし、及び次いでプライマー伸長のための基質としての役割を担うプライマーから生じる標的配列以外の核酸配列の増幅をいう。対象外の配列に対するプライマーのハイブリダイゼーションは、「非特異的ハイブリダイゼーション」といわれ、及びより低温、減少したストリンジェンシー、プレ増幅状態の間に特に生じやすい。

本明細書に使用される、用語「プライマー二量体」は、鋳型独立した非特異的増幅産物をいい、これは別のプライマーが鋳型としての役割を担うプライマー伸長の結果として生じると考えられる。プライマー二量体は、頻繁に２つのプライマー（すなわち、二量体）の鎖状体であるようにみえるが、２つを超えるプライマーの鎖状体も生じる。用語「プライマー二量体」は、鋳型独立した非特異的増幅産物を包含するように一般的に本明細書において使用される。

本明細書に使用される、用語「反応混合物」は、所与の反応を実施するために必要な試薬を含む溶液をいう。「増幅反応混合物」は、増幅反応を実施するために必要な試薬を含む溶液をいい、適切な緩衝液におけるオリゴヌクレオチドプライマー及びＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼを典型的に含む。「ＰＣＲ反応混合物」は、適切な緩衝液においてオリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ（最も典型的には、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、ｄＮＴＰ及び二価金属カチオンを典型的に含む。反応混合物は、それが反応を可能にするために必要な全ての試薬を含む場合完全と、及びそれが必要な試薬のサブセットだけを含む場合不完全といわれる。反応成分は、便宜、貯蔵安定度のために、または成分濃度の適用依存的な調整が可能なように、それぞれが総成分のサブセットを含む別々の溶液としてルーチンで貯蔵されること、及び反応成分を反応の前に合わせて完全反応混合物を作製することが当業者には理解されるだろう。さらにまた、反応成分は、商業化のために別々にパッケージされること、及び有用な市販のキットは、開示のブロックされたプライマーを含む反応成分の任意のサブセットを含んでいてもよいことが当業者には理解されるだろう。

１． はじめに

この開示は、染色体の集団における短いテロメアの存在量の測定を決定するための、並びにテロメア長を増加する、または減少する、及びそれ故、健康を増加する、または減少する、または逆にそれぞれ将来の疾患または死のリスクを減少させる、または増加させる健康及び介入の効果の測定を決定するためにこれらの測定を使用する、方法及び材料を提供する。方法は、予め定義された長さの範囲内のテロメア（たとえば、一定の長さより長くない、たとえば約５ｋｂｐより短い全てのテロメア）を有する染色体のみから染色体断片のコピーの集団を産生することを含む。このアッセイは、試料のセットにおける短いテロメアテロメアの存在量比を表すために使用することができ、またはアッセイは、短いテロメアの絶対割合を生成するために総テロメア存在量の測定と組み合わせて使用することができる。

一つの態様において、短いテロメア産物の存在量を測定する方法は、２つの工程を含む。第１の工程は、伸長プライマーを使用して二本鎖染色体ＤＮＡ鋳型から伸長産物を生成することを含む。伸長プライマーは、その３’末端にてテロメアのＧ−鎖におけるテロメア反復配列に相補的な配列及びその５’末端にて「アンカー」配列を有する。このように、伸長プライマーは、試料における染色体の３’オーバーハングにおけるテロメア反復配列にハイブリダイズするのに適し、及びその後のＰＣＲ反応をプライミングするための５’−アンカー配列を利用する。伸長産物は、時間が限られた伸長反応において産生される。伸長反応は、それが限られた時間であるので、一定の長さの伸長産物しか産生しないように構成され得る。伸長産物が限定される長さであるので、これらは、十分に短い染色体のみにおいてサブテロメア領域に伸張するだろう。第２の工程は、伸長産物、サブテロメア配列及びアンカー配列によって囲まれている配列から増幅することを含む。

定義された反応時間によって産生される伸長産物の長さは：（ａ）鎖置換酵素の重合割合（Ｒ）かける伸長時間によって：（ｂ）サザンゲル上のＰＣＲ産物のサイズを解析することによって；及び（ｃ）シーケンシングによって純粋なＴＴＡＧＧＧ領域のサイズを解析することによって、少なくとも３つの異なる方法によって測定することができる。シーケンシング方法は、反復ＤＮＡの長い伸長を正確にシーケンスする能力によって限定される。

伸長反応が限られた時間であるので、サブテロメア配列は、伸長プライマーがハイブリダイズした３’オーバーハングにおける位置からサブテロメア領域までの距離が、伸長の予め定められた長さの範囲内である染色体からの伸長産物のみにおいて存在するだろう。予め定められた長さは、実行者によって選ばれる任意の長さの範囲であり、及びそれまでであることができる。たとえば、長さ範囲は、予め定められた長さまでの長さであることができる。一定の態様において、長さ範囲は、短いテロメア、たとえば５ｋｂまでの長さを包含する。その他の態様において、長さ範囲は、予め定められた距離より短い長さである。それで、たとえば、テロメアの長さが定義された伸長長より長くない染色体において（たとえば、短いテロメアをもつ染色体）、時間が限られた伸長反応は、染色体のサブテロメア領域にプライマーを伸張するだろう。テロメアの長さが予定されている伸長長より長い染色体において（たとえば、長いテロメアをもつ染色体）、時間が限られた伸長反応は、染色体のサブテロメア領域にプライマーを伸張しないだろうし、及び伸長産物は、第２の増幅工程のために必要なサブテロメア配列を有しないだろう。したがって、伸長産物の集団は、一定のサイズより短いテロメアを有する染色体のみからテロメア配列を含むよう制御され得る。長さ範囲が、たとえば、４ｋｂである場合、伸長産物は、たとえばテロメアが４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、その他である産物を含む。

伸長産物がサブテロメア配列及びアンカー配列によって囲まれている配列を増幅するように適応される一対の増幅プライマーを使用して増幅されるとき、サブテロメア配列を有する伸長産物のみが増幅される。それらは、定義された伸長長より短いテロメアを有する染色体、たとえば短いテロメアをもつ染色体から生成される伸長産物である。したがって、伸張産物は、試料における染色体からの総テロメア配列からでなく、定義済み長さより大きくないテロメアを有する染色体からのテロメア配列のみから増幅される。このような増幅された産物は、本明細書において、「長さの限られたテロメア増幅産物」または状況に応じて「短いテロメア増幅産物」と時としていわれる。このＰＣＲ増幅工程において限られた伸長時間を使用することによって、短いテロメアは、さらに濃縮されるだろう。したがって、この限られた伸長時間のＰＣＲ工程は、アッセイの特異性を増加させて短いテロメア集団のみを増幅するだろう。

長さの限られたテロメア増幅産物におけるテロメア配列の量または存在量は、本明細書において、「長さの限られたテロメアの存在量」または状況に応じて「短いテロメアの存在量」と時としていわれる。長さの限られたテロメア増幅産物におけるテロメア配列の存在量は、総テロメア配列の産物におけるテロメア配列の存在量を決定するのに使用される任意の方法によって測定され得る。

この開示の方法は、二本鎖ＤＮＡ、たとえばこれらの天然の状態における染色体で始める。総テロメア配列を測定する比較法において、特にこれは、ｑＰＣＲを使用して、一本鎖の、または変性した核酸の試料を提供することを含み得る。

２． 長さの限られたテロメア増幅産物

２．１試料

その天然の、二本鎖の状態における染色体ＤＮＡは、核酸を含む固体、液体、半固体または気体試料から、たとえば、血液、唾液、尿、血漿、血清、ＣＳＦ、気管支肺胞洗浄液などの液体の組織から；肺、筋肉、皮膚などの固体の組織から；骨髄などの半固体組織から；及び呼気などの気体試料から得ることができる。染色体ＤＮＡを得る生物は、３’オーバーハングをもつ直鎖状の染色体をもつ任意の生物であり得る。鋳型二本鎖染色体ＤＮＡは、フェノール／クロロホルム抽出、塩化セシウム勾配及びシリコーン膜を結合する技術、選択的な洗浄剤媒介されたＤＮＡ沈澱方法を使用する市販のキットを含む高分子量ゲノムＤＮＡ（２０ｋｂを上回る）を得る任意のＤＮＡ精製方法を使用して得ることができる。ＤＮＡ精製市販キットの例は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＤＮＡｄｖａｎｃｅ ａｎｄ Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｇｅｎｆｉｎｄ （Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＱＩＡａｍｐ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＱＩＡａｍｐ ｂｌｏｏｄ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）、ＱＩＡａｍｐ ＦＦＰＥ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ ＱＩＡＧＥＮ）、ＡＨＰｒｅｐ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ａｎｄ ＧｅｎｅＣａｔｃｈｅｒ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＷｉｚａｒｄ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む。

この開示の方法における使用のための試料は、３’末端一本鎖オーバーハングをもつ任意のゲノムＤＮＡであり得る。一定の態様において、試料は、高分子量ゲノムＤＮＡ（たとえば、＞２０ｋｂ）を含む。高分子量天然ゲノムＤＮＡを得る任意の方法が使用され得る。

テロメアを有する二本鎖染色体において、テロメア反復配列をもつ３’末端を有する一本のＤＮＡ鎖（「３’オーバーハング」）は、５’末端を有する対の一本鎖の末端を越えて伸張する。３’オーバーハングを有するテロメアの鎖は、「Ｇ鎖」といわれ、及びテロメア反復配列５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’を含む。同じ順序置換は、文字が組み換えられない置換であるが、同じ配列における異なる位置、たとえば、反転（たとえば、ＹＸＺよりむしろＸＹＺ、ＹＺＸ、ＺＸＹ）にて始める。この配列の同じ順序置換は：５’−ＴＡＧＧＧＴ−３’、５’−ＡＧＧＧＴＴ−３’、５’−ＧＧＧＴＴＡ−３’、５’−ＧＧＴＴＡＧ−３’及び５’−ＧＴＴＡＧＧ−３’を含む。５’末端を有する鎖は、「Ｃ鎖」といわれ、及びテロメア反復配列５’−ＣＣＣＴＡＡ−３’を含む。

テロメアの長さは、たとえばキロベースにおいて、染色体の末端からサブテロメア領域までの距離であり得る。正常なヒト成人の細胞において、テロメアは、１ｋｂ〜１２ｋｂより小さい、またはいくつかの場合、＞２０ｋｂまでの長さの範囲であり得る。テロメア長は、異なる細胞型において変化することが公知である（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０１０， ３１：３５２（１−２）：７１ − ８０）。このようなことから、短いテロメア集団の有効長範囲は、臨床有用性に基づいて広くなり得る。したがって、一定の態様において、短いテロメアは、約５ｋｂより大きくない、４ｋｂより大きくない、３ｋｂより大きくない、２ｋｂより大きくない、１ｋｂより大きくないまたは約０．５ｋｂより大きくない長さを有する。この開示の方法は、これらの長さのそれぞれまでテロメアを検出するように構成され得る。

短いテロメア産物は、単一のテロメア、単一の染色体、単細胞からの染色体の集団または複数の細胞からの染色体の集団から生成され得る。

２．２伸長産物を産生すること

伸長反応において、プライマーは、アニーリング条件下で二本鎖染色体ＤＮＡの３’オーバーハングにアニールされる。適切なアニーリング条件は、典型的には鎖伸長のためにまたはＰＣＲのために核酸鎖をハイブリダイズするのに使用したものなど、当業者に公知である。このような条件は、加熱ブロックにおいて１０分間６５°Ｃにてのインキュベーション及び次いで１時間の期間にわたって室温までの冷却を含むが、限定されない。その他の条件は、５分〜３０分間３７°Ｃ〜６５°Ｃの範囲の温度にてのインキュベーション及び次いで１時間〜３時間の期間にわたって室温までの冷却を含んでいてもよい。

２．２．１伸長プライマー

伸長プライマーは、３’部分及び５’部分を含む。

２．２．１．１ ３’部分

３’部分は、テロメアのＧ−鎖におけるテロメア反復配列をハイブリダイズするように適応される配列を有する。３’部分における配列は、テロメアの反復に相補的でありえる、またはミスマッチがプライマー伸長のためにアニーリング条件下でハイブリダイゼーションが可能な限り、それは上記のように一定のミスマッチを有し得る。たとえば、３’部分は、テロメアの反復配列の少なくとも８連続したヌクレオチド（すなわち、テロメアのＣ−鎖の配列）を有し得る。連続したヌクレオチドは、テロメア反復配列の任意の置換においてあり得る。その他の態様において、３’部分の配列は、テロメア反復配列の少なくとも９連続したヌクレオチド、少なくとも１０連続したヌクレオチド、少なくとも１１連続したヌクレオチドまたは少なくとも１２連続したヌクレオチドを有し得る。その他の態様において、３’部分の配列は、任意の同じ順序置換における２つ以上、３つ以上または４つ以上のテロメア反復ユニットを有し得る。

２．２．１．１５’部分

伸長プライマーの５’部分（また「アンカー配列」と呼ばれる）は、３’部分がハイブリダイズするＧ−鎖におけるテロメア反復配列にアニーリング条件下でハイブリダイズしないように構成されている。好ましくは、アンカー配列は、Ｇ−鎖のサブテロメア領域における配列にアニーリング条件下でハイブリダイズしない。また、アンカー配列は、Ｇ−鎖の３’オーバーハングの末端の１０ｋｂ以内、２０ｋｂ以内または５０ｋｂ以内の標的Ｇ−鎖の任意の配列に、または標的染色体における任意の独特の配列にハイブリダイズしないように構成され得る。アンカー配列は、その相補体がテロメアまたはサブテロメア領域もしくはテロメアのＣ−鎖の末端の１０ｋｂ以内、２０ｋｂ以内または５０ｋｂ以内における染色体のＣ−鎖における任意の配列にハイブリダイズしないように構成され得る。たとえば、アンカー配列は、試験されている染色体において見いだされない独特の配列であり得る。

２．２．２伸長反応

染色体ＤＮＡに伸長プライマーをアニールした後に、伸長反応は、鎖置換活性及び／またはエキソヌクレアーゼ活性をもつポリメラーゼを使用して行われる。鎖置換ポリメラーゼの例は、Ｔ７ポリメラーゼ（たとえば、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ断片及びＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＬａｒｇｅ断片及びＤｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−）を含むが、限定されない。加えて、また、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性をもつポリメラーゼは、使用され得る。

伸長反応は、時間が限られている。すなわち、伸長反応は、予め定められた量の時間進行することを可能にする。時間は、予め定められた長さより長くない平均を有する伸長産物を産生するために較正される。鎖−置換酵素によって伸長産物を産生するのに使用される時間は、選ばれた条件及び反応物下で経験的に決定されて、予め定められた長さの伸長産物を産生することができる。本発明において有用な種々のポリメラーゼの伸長割合は、前もって決定され、及び伸長割合は、所望の伸長産物を達成するのに必要なおおよその時間を算出するのに使用され得る。例示的なポリメラーゼのための伸長割合を下の表に示す。

^＊その他の情報の非存在下で関連する参照において特定されている条件または標準的な反応条件下において。

伸長反応の開始は、反応チューブに鎖置換酵素を添加することによって達成される。反応は、２０分間８０°Ｃに反応チューブを置くことによって、またはＥＤＴＡを添加することによって止められ得る。さらにまた、反応は、より低い、またはより高い温度、たとえば２５°Ｃまたは３０°Ｃにてインキュベートすることによって制御され得る（速度を落とした、または速度を上げた）。例として、３７°Ｃにて鎖置換ポリメラーゼＳｅｑｕｅｎａｓｅの置換速度は、毎秒約２８ｂｐである。３０°Ｃにて、それは、サザンブロット解析に基づいて、約３倍遅い。３７°Ｃにて、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅは、３０秒で約１ｋｂ；１分で約２ｋｂ；３分で約５ｋｂ；及び５分で約８ｋｂの伸長産物を産生することができる。種々のポリメラーゼシステム及び種々の試料供与源で予め定められた長さの伸長産物を産生するために必要なタイミングは、経験的に決定され、たとえば、サザンブロット解析が続く、類似の時間経過実験は、伸長時間を較正するために行われることができる。したがって、伸長反応は、３０分より多くない、１０分より多くない、５分より多くない、４分より多くない、３分より多くない、２分より多くない、１分より多くないまたは３０秒より多くない時間を決められ得る。

２．３増幅反応

次いで、時間が限られた伸長産物における配列は、たとえば、ＰＣＲによって増幅される。より具体的には、１つの側におけるアンカー配列及びその他の側におけるサブテロメア配列によって囲まれている配列は、増幅される。プライマーは、それがその標的（アンカー配列またはサブテロメア配列）にアニールすること及び伸長を可能にする限り、正確に相補的であり得る、またはミスマッチの配列を有することができる。

アンカー配列は、変化することができる。一定の態様において、アンカー配列は、テロメア量が測定されている生物のゲノムにおいて存在しない特異的配列であり、またはアンカー配列がゲノムの他の部分において見いだされた場合、その配列がＳＵＳ配列から有意な距離である場合、それはまだ有用でありえ、その結果、増幅は、テロメアアンカー配列とテロメアＳＵＳ配列との間以外ＰＣＲ工程の間に生じない。

ＰＣＲ条件は、最善の分析性能を得るために最適化される。ＰＣＲ条件における伸長時間は、短いテロメアの意図されたサイズ範囲が濃縮されることを保証するためにサザンブロットにおける産物プロフィールを調べることによって、予め決定される。

開示の方法において使用されるサブテロメアプライマーは、全てまたは大部分の染色体において見いだされるＧ鎖上の配列、たとえば、テロメア配列の変異体（ＴＧＡＧＧＧ）_３−６（Ｘｕ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ， ２８：３１５−３２７， ２００７） または（ＴＴＧＧＧＧ）_３−６（Ａｌｌｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １７：４６１１−４６２７， １９８９）もしくは（ＴＣＡＧＧＧ）_３−６（Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ， ＥＭＢＯ Ｊ．， １４（２１）：５４３３−５４４３， １９９５）を含み得る。あるいは、サブテロメアプライマーは、特異的染色体（群）上で見いだされるセグメント、たとえば、Ｘｕ ｅｔ ａｌにおいて記述されるＸｐＹｐＥ２プライマー（５’−ＧＴＴＧＴＣＴＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＧＴＧ−３’［配列番号：ｌ］）であり得る（Ｘｕ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ， ２８：３１５− ３２７， ２００７）。一つの態様において、サブテロメア配列のためのプライマーは：
５’−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ−３’［配列番号：２］
５’−ＣＧＧＧＣＣＧＧＣＴＧＡＧＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡ−３’［配列番号：１０］（染色体１）
５’−ＧＣＴＡＡＴＧＣＡＣＴＣＣＣＴＣＡＡＴＡＣ−３’［配列番号：１１］（染色体５）
５’−ＣＡＴＴＣＣＴＡＡＴＧＣＡＣＡＣＡＴＧＡＴＡＣＣ−３’［配列番号：１２］（染色体９）
を含む、本質的にからなる、またはからなる。

短いテロメアアッセイが開示の方法を使用してヒト以外の生物に適用されるとき、サブテロメアプライマーの特定の配列は、生物のゲノム配列に基づいてデザインされ得る。サブテロメアプライマーの配列は、３’オーバーハングをもつ鎖と一致するはずである。

増幅産物は、一定の長さの範囲内のテロメアの反復配列を有する核酸の集団を含み、及びこの範囲より長い配列を除外する。したがって、集団は、閾値長より短いテロメアを有する染色体のみからの配列を含むように構成され得る。

伸長反応効率のための制御に対する内部制御配列は、伸長反応工程において含まれ得る。この内部制御配列は、１つの末端にてサブテロメアプライマー配列をもつ二本鎖ＤＮＡ及びテロメア配列のＧ鎖をもつ３’オーバーハングであり得る。サブテロメアプライマー配列とテロメア配列との間は、独特の非テロメア配列の伸展であり得る。たとえば、１つのこのような配列は、ｈＴＥＲＴ遺伝子またはＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子であり得る。この内部制御のための伸長反応の効率は、たとえばｈＴＥＲＴ遺伝子またはＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子を定量化するためのＴａｑｍａｎに基づいたアッセイによって測定され得る。

３． テロメアの存在量を測定する方法

テロメア配列を含む試料におけるテロメアの存在量を測定するのに使用される任意の方法は、長さの限られたテロメア試料におけるテロメアの存在量を測定するのに使用され得る。

テロメアの存在量の測定は、絶対的または相対的であり得る。たとえば、テロメアの存在量の絶対測定は、たとえば、ヌクレオチドの数によって測定されるゲノムにおけるテロメア配列の全長を含む。より典型的には、テロメアの存在量は、参照に相対的に測定される。テロメア配列の検出は、アッセイにおいて産生されたシグナル強度に換算して測定され得る。このシグナル強度は、アッセイにおける参照配列によって産生されるシグナル強度と比較され得る。相対的シグナル強度は、標準化の方法として機能することができる。標準化された方法は、アッセイ間でより容易に比較され得る。たとえば、テロメア配列の検出によって産生されるシグナルは、対照配列の測定によって産生されるシグナルと比較され得る。対照配列は、たとえば、ベータ‐グロビン遺伝子の一部であり得る。したがって、使用したアッセイ方法に関係なく、参照配列に対するテロメア配列の相対的シグナルは、たとえば、比として表現され得る。この比は、テロメア配列存在量測定の結果を比較するのに使用され得る。

その他の態様において、短いテロメアの存在量の測定は、総テロメアの存在量と比較される。総テロメアの存在量は、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．７，６９５，９０４（Ｃａｗｔｈｏｎ）及びＬｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ． ２０１０， ３５２（ｌ−２）：７１−８０）に記載されているように後にｑＰＣＲ方法が続く、鎖置換反応における、及び増幅反応における長い伸長時間によって測定され得る。短いテロメアの割合を決定するために、短いテロメア対総テロメアの比は、決定され得る。たとえば、短いテロメア測定のシグナル強度は、総テロメア測定のシグナル強度で割られ得る。

３．１ｑＰＣＲ

短いテロメアの存在量を定量化する１つの方法は、Ｃａｗｔｈｏｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２００２， ３０（１０）：ｅ４７；Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．７，６９５，９０４；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０１０， ３５２（ｌ−２）：７１−８０）；またはＣａｗｔｈｏｎ ２００９ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００９ ３７（３）：ｅ２１．）によって記載されているように、定量的ＰＣＲである。

様々な当該技術分野において公知の方法は、本開示において使用されて、平均テロメア長またはテロメアの存在量を決定することができる。好ましくは、リアルタイム動力学的定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）は、Ｃａｗｔｈｏｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２００２， ３０（１０）：ｅ４７； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ７，６９５，９０４）によってテロメア長検出のために特異的に修飾されたように利用される。方法は、単純であり、及び数多くのＤＮＡ試料の迅速高スループットプロセシングを可能にする。ｑＰＣＲ方法は、ポリメラーゼ連鎖反応が進むにつれて増加するリポーター分子によって産生される蛍光の検出に基づいている。蛍光におけるこの増加は、増幅のそれぞれのサイクルでＰＣＲ産物の蓄積のため生じる。これらの蛍光リポーター分子は、二本鎖ＤＮＡ（たとえば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎまたは臭化エチジウム）または配列特異的プローブ（たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｅａｃｏｎｓまたはＴＡＱＭＡＮ Ｐｒｏｂｅｓ）に結合する色素を含む。あるいは、Ｃａｗｔｈｏｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００９， ３７（３）：ｅ２１）によって記述されるｑＰＣＲ方法は、使用され得る。方法は、テロメア反復が高存在量種である、及び単一のコピー遺伝子が低存在量種であるとき、実験的な状況を含み、多重化を経た単一の試料におけるＴ／Ｓ比の決定を可能にする。

本開示の方法において、反復テロメア配列（ＴＴＡＧＧＧ）_ｎに特異的なプライマープローブが使用される。一般的に、プライマーのサイズは、使用、必要とされた特異性及び増幅技術に応じて、５〜５００ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチドの間、１２〜７５ヌクレオチドの間または１５〜５０ヌクレオチドの間の長さに変化してもよい。本開示において、一つの態様は、標的テロメア配列の第１の一本鎖にハイブリダイズする第１のプライマー及び標的テロメア配列の第２の一本鎖にハイブリダイズする第２のプライマーを利用し、第１及び第２の鎖は、実質的に相補的である。この態様において、たとえば、ｔｅｌｌ（５’−ＧＧＴＴＴＴＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴ−３’）［配列番号：３］及びｔｅｌ２（５’−ＴＣＣＣＧＡＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡ−３’）［配列番号：４］からなる対のプライマーセットが使用され得る。１つの態様において、プライマーの少なくとも１つは、少なくとも１つの変更された、または変異させられたヌクレオチド残基を含み、それは、プライマーが互いにハイブリダイズするときに、変更された残基とその他のプライマーの３’末端ヌクレオチドとの間にミスマッチを産生する。３’末端ヌクレオチドにてのミスマッチの存在は、ポリメラーゼよる伸長を遮断し、したがって、ターゲットではない核酸依存的伸長反応を限定する。この態様において、たとえば、ｔｅｌ ｌｂ ５’− ＣＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴ−３’［配列番号番号：５］；及びｔｅｌ ２ｂ ５’−ＧＧＣＴＴＧＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴ−３’［配列番号番号：６］からなる対のプライマーセットが使用され得る。さらなる態様において、たとえば、ｔｅｌｇ ５’− ＡＣＡＣＴＡＡＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＡＧＴＧＴ−３’［配列番号番号：１３］；及びｔｅｌc ５’−ＴＧＴＴＡＧＧＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＡＣＡ−３’ ［配列番号番号：１４］からなる対のプライマーセットが使用され得る。当業者は、プライマーのその他の実質的に相補的な、またはミスマッチのセットがこの開示において使用され得ることを認識するだろう。このようなプライマーは、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．７，６９５，９０４（Ｃａｗｔｈｏｎ ｅｔ ａｌ）において記述される。

増幅反応は、当該技術分野において周知の手順に従って実施される。ＰＣＲのための手順は、広く使用され、及び記述される（たとえば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，６８３，１９５及び４，６８３，２０２を参照されたい）。簡単に言うと、二本鎖標的核酸は、一般に鎖を変性するのに十分に高い温度にてインキュベートすることによって変性され、及び次いで、過剰なプライマーの存在においてインキュベートされ、それは一本鎖標的核酸にハイブリダイズ（アニール）する。ＤＮＡポリメラーゼは、ハイブリダイズしたプライマーを伸張し、標的核酸の新たなコピーを生成する。生じる二重鎖は変性され、及びハイブリダイゼーション及び伸長工程は繰り返される。相補的標的鎖のための第２のプライマーの存在における変性、アニーリング及び伸長の工程を繰り返すことによって、２つのプライマーによって包囲される標的核酸は、指数的に増幅される。プライマー伸長工程の時間及び温度は、ポリメラーゼ、増幅されている標的核酸の長さ及び増幅のために使用されたプライマー配列に依存するだろう。標的核酸を十分に増幅するために必要とされる反復する工程の数は、増幅の効率に依存するだろう。当業者は、本開示が時間、温度、緩衝液条件及び増幅過程において適用された増幅サイクルにおける変化によって限定されないことを理解するだろう。

増幅の産物は、当該技術分野において周知の方法によって検出され、及び解析される。増幅された産物は、産物の分離及び／または精製の後、または増幅反応において形成される産物の直接測定によって解析されてもよい。検出については、産物は、蛍光化合物、たとえば、臭化エチジウムまたはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎで、または標識された核酸プローブでハイブリダイゼーションによって間接的に同定されてもよい。あるいは、標識されたプライマーまたは標識されたヌクレオチドは、増幅産物を標識する増幅反応において使用される。標識は、任意の検出可能部分を含み、蛍光標識、放射性標識、電子標識及びビオチンまたはジゴキシゲニンなどの間接的な標識を含む。

本開示のｑＰＣＲ反応を行うのに適切な計測手段は、多数の市販の供与源から利用可能である（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ； ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ ４８０， Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩΝ； Ｅｃｏ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ； ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ ４０， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｃｅｄａｒ Ｃｒｅｅｋ， ＴＸ）。

リアルタイム定量的ＰＣＲが増幅産物を検出し、及び測定するのに使用されるとき、種々のアルゴリズムは、試料における標的テロメアの数を算出するのに使用される。（たとえば、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．７； Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３を参照されたい）。定量化は、テロメア核酸の公知のコピー数をもつ標準試料の使用及び標準の対数及び閾値（Ｃ_ｔ）のサイクルからの標準曲線の生成を含んでいてもよい。一般に、Ｃ_ｔは、増幅産物によって生成された蛍光がベースライン蛍光より上のいくつかの偏差であるＰＣＲサイクルまたは断片のＰＣＲサイクルである。

３．２その他の方法

増幅反応からの短いテロメアの存在量は、当該技術分野において公知のその他の方法によって測定されてもよい。このような方法は、直接核酸シーケンシング及びサザンブロット法並びにドットブロット法またはスロットブロットハイブリダイゼーション及びデジタルＰＣＲを含むが、限定されない。

単離されたＤＮＡにおける核酸配列の直接測定のための従来の技術は、本開示において使用されてもよい。たとえば：「ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，」Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊ． Ｋｅｎｄｒｅｗ， ｅｄ．， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ， １９９５， ｐｐ． ２８３−２８６を参照されたい。ダイターミネーター自動シーケンシングは、核酸シーケンスのために現在最も一般に使用される（ワールドワイドウェブＵＲＬ ｌａｂｍａｎａｇｅｒ．ｃｏｍ／？ａｒｔｉｃｌｅｓ．ｖｉｅｗ／ａｒｔｉｃｌｅＮｏ／３３６４／ａｒｔｉｃｌｅ／ＤＮＡ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇにて「ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」， Ｌａｂ Ｍａｎａｇｅｒ）。自動シーケンシング設備は、都合よく使用され、及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ及びＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．などの企業から購入されてもよい。一旦ＤＮＡ試料の配列が決定されると、次いで、いずれかの末端にてのテロメア核酸配列（ＴＴＡＧＧＧ）のコピーの数は、計数され得る。本開示のこの方法は、テロメア配列の直接測定によって絶対テロメアの存在量の測定を提供する。

また、サザンブロッティング（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｅ． Ｍ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， １９７５， ９８（３）： ５０３−５１７）は、本開示において利用されて、ヒトテロメア核酸配列（ＴＴＡＧＧＧ）_ｎの特異的存在を検出することによって、テロメアの存在量を決定してもよい。本開示において、Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＴＦＲ）サザンブロット法は、フィルター膜に電気泳動によって分離されたＤＮＡ断片の転送を組み合わせ、続いて（ＴＴＡＧＧＧ）配列に特異的なプローブへのハイブリダイゼーションによって断片の検出をする（Ａｌｌｓｈｉｒｅ， Ｒ． Ｃ． ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９８９， １７， ４６１１−４６２７）。このようなプローブは、テロメア配列に相補的な配列を有する。検出の容易さについては、プローブは、蛍光または発色性色素で放射能で標識される、またはタグを付けられる。次いで、存在する放射活性または蛍光の量は、試料におけるテロメアの存在量を示すように定量化されてもよい。Ｍ．Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ２０１０， ５： １５９６−１６０７）は、テロメア長を決定するための適切なサザンブロット手順を記述する。

サザンブロッティング法の変化は、ドットブロット法またはスロットブロット法を含み、ＤＮＡは、フィルター膜上の点またはスロットとしてスポットされ、続いて（ＴＴＡＧＧＧ）配列に特異的なプローブにハイブリダイゼーションによって断片の検出をする（Ｋｉｍｕｒａ Ｍ， Ａｖｉｖ Ａ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２０１１， ３９（１２）：ｅ８４． ｄｏｉ： １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ２３５． Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ ２７）。

本開示の上の態様において、蛍光は、相対的蛍光ユニット（ＲＦＵ）において測定されてもよい。蛍光は、電気泳動を使用することによってキャピラリー内で分離される標識された断片がレーザ光によって活性化され、及び検出窓全体に移動するとき、帯電接続された装置（ＣＣＤ）アレイを使用して検出される。コンピュータプログラムは、結果を測定して、蛍光強度のレベルから、それぞれのデータポイントにて、テロメア含有断片の量またはサイズを決定する（「Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｕｎｉｔ （ＲＦＵ）」， ＤＮＡ．ｇｏｖ： Ｇｌｏｓｓａｒｙ， Ａｐｒｉｌ ２０１１，ワールドワイドウェブＵＲＬ ｄｎａ．ｇｏｖ／ｇｌｏｓｓａｒｙ／）。

テロメアの存在量の測定は、ＤＮＡシーケンシング方法論を使用して測定され得る。このような方法は、テロメア反復を含む試料における分子をシーケンシングすること及びテロメア反復配列の存在量を決定することを含むことができる。ＤＮＡシーケンシング方法は、シーケンシングの任意の公知の方法、たとえば、ＳａｎｇｅｒシーケンシングまたはＭａｘａｍ Ｇｉｌｂｅｒｔシーケンシングなどの古典的なシーケンシング方法及びライゲーションシーケンシング、ナノ細孔シーケンシング、ピロシーケンシング、超ピロシーケンシング、プロトン検出によるシーケンシング、合成によるシーケンシング及び単一分子シーケンシングなどの次世代シーケンシング方法を含むことができる。また、短いテロメアの存在量は、デジタルＰＣＲによって測定され得る。このような技術プラットホームは、たとえば、ＲＡＩＮＤＲＯＰ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒａｉｎｄａｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）またはＱＸ２００ ＤＲＯＰＬＥＴ ＤＩＧＩＴＡＬ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含むデジタルＰＣＲ、微少溶液デジタルＰＣＲ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＯＰＥＮＡＲＲＡＹ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ．， Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ）を含むが、限定されない。種々のさらなる態様において、短いテロメアの存在量は、適切なハイブリダイゼーション技術、たとえばＮＣＯＵＮＴＥＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｓｅａｔｔｌｅ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）によって測定され得る。

４． キット

また、この開示は、この開示の方法において有用なキットを提供する。このようなキットは、この開示の伸長プライマー及びサブテロメア配列に、または伸長プライマーのアンカー配列の相補的なものにハイブリダイズする増幅プライマーを含むことができる。あるいは、キットは、この開示の伸長プライマー及びサブテロメア配列よって囲まれた核酸における配列を増幅するのに適応される一対の増幅プライマー及び伸長プライマーにおけるアンカー配列を含むことができる。キットは、伸長プライマーを含む容器及び増幅プライマーの一方または両方を含むもう一つの容器を含むことができる。また、キットは、プライマー伸長のための試薬及び核酸増幅のための、たとえば、ＰＣＲのための試薬を含むことができる。また、キットは、公知の値をもつ対照及び参照試料を含むことができる。一定の態様において、キットは、伸長プライマー及び一対の増幅プライマーを含む。一定の態様において、伸長プライマーは、アニーリング条件下で二本鎖染色体ＤＮＡの３’オーバーハングにおけるテロメア反復配列にハイブリダイズする３’部分及びテロメアの、またはサブテロメア領域における配列にハイブリダイズしない５’アンカー部分を含む。

５． テロメアの存在量、短いテロメアの存在量及びテロメアの存在量の増減率または短いテロメアの存在量の増減率と関連づけられる条件

一般に、テロメアの存在量と関連する条件は、本明細書に記述したように、平均テロメア長の測定を使用して典型的には得た。しかし、上で議論したように、新生のデータは、短いテロメアの存在量及びまたは短いテロメアの存在量の増減率を測定することが、より多くのセンシティブ及び平均テロメア長または平均テロメア長の増減率の測定であるより潜在的により正確な臨床的に意味がある結果（たとえば疾患または死亡リスク）の予測値でもよいことを示唆する。それゆえに、短いテロメアの存在量の高感度及び正確な測定を有することは、重要である。決定的に短いテロメアの存在が細胞生存度及び組織機能の喪失を生じさせたことは報告されており、非常に短いテロメアと細胞老化との間に因果関係があることを示した（Ｈｅｍａｎｎ， Ｍ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ， ２００１． １０７（１） ６７−７７）。

短い平均テロメア長（後述するように）は、臨床結果の確立された、優れた予測値であるが、短いテロメアの存在量の正確な測定がテロメア動態における介入の効果のためのより高感度の測定であり得ることが予想される（Ｃａｎｅｌａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ２００７． １０４（１３） ５３００−５）。Ｈａｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ Ｒｅｓ． ２０１１． １４（１） ４５−５６）は、テロメラーゼ、ＴＡ−６５（登録商標）の相対的に弱い活性化因子を持つヒトが短いテロメアの割合の減少を示したが、平均テロメア長に有意なシフトがなかったことを示した。Ｖｅｒａ ｅｔ ａｌ． ｓｕｐｒａ．において、短いテロメアの存在量の増加率は、マウスの別々の２つのコホートにおける増加した寿命を予測した「Ｔｈｅ Ｒａｔｅ ｏｆ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ Ｓｈｏｒｔ Ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ Ｐｒｅｄｉｃｔｓ Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｓ， Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ （２０１２）， ワールドワイドウェブＵＲＬ：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／］．ｃｅｌｒｅｐ．２０１２．０８．０２３）。短いテロメアの存在量を測定するための正確な、コスト効率の良い、高いスループット方法の欠如のため、短いテロメアの存在量または短いテロメアの存在量の増減率を使用して、短いテロメアの存在量を測定する臨床有用性を確立する大きなヒト治験がこれまでなかった。

また、Ｖｅｒａ ｅｔ ａｌ，からの動物研究における概念の証明は、短いテロメアの割合の時間とともに高上昇率をもつマウスが、時間とともに短いテロメアの低上昇率をもつマウスと比較して、生存を減少させたことを示す。野生型マウスにおいて、高上昇率（たとえば１％／月）をもつマウスと比較して低上昇率（たとえば、０．４％／月）を有したマウスの生存における相違は、約１００週または野生型マウスにおける最大生存のほぼ２／３であった。

したがって、本明細書に記述したように正確及び精密なアッセイによって測定されるように短いテロメアの高い割合をもつヒトは、短いテロメアの低い割合をもつヒトと比較して、疾患または死亡リスクをより起こしやすいだろう。％短いテロメアの定量的評価は、健康モニタリングのみでなく疾患診断法、予後及びコンパニオン診断法における有意な診断の有用性も有するだろう。

短いテロメアの存在量をモニターすることは、短いテロメア（典型的にｌｋｂｐより小さいまたは２ｋｐｂより小さい次いでまたは３ｋｂｐより小さい）が細胞の老化をトリガーすることが知られているので（Ｈｅｍａｎｎ， Ｍ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ， ２００１． １０７（１） ６７−７７）、健康モニタリングについて即時の有用性を有し、及び細胞の老化は、組織機能の喪失及び最後に疾患及び死亡を導くことが公知である。したがって、正常な個体の年齢がマッチした参照集団と比較した短いテロメアの平均より大きい存在量をもつ個体は、罹患率または死亡率のリスクが高い。このような人は、より優れた生活様式及び短いテロメアのより低い存在量の方へこれらの挙動を変えることを動機づけられるだろう、一方で参照集団と比較して短いテロメアの平均より低い存在量をもつ個体は、これらの細胞の健康がおそらく平均よりよいということを知っているだろう、及びそれ故、もしさらに改善しなければ、これらの生活様式習慣を少なくとも維持して、これらの優れた健康を維持するよう動機づけされるだろう。

ゲノムＤＮＡから決定される染色体末端あたりの平均テロメア長は、全体のテロメアの存在量の尺度であり、及びこれは、いくつかの重要な生物学的指標と関連づけることを示した。たとえば、これらの指標は、種々の疾患状態のリスク、たとえば、心臓血管のリスク、癌リスク、肺線維症リスク、感染性疾患リスク及び死亡のリスクを含む。また、テロメアの存在量は、暦年齢、体格指数、臀部／重量比及び認知されたストレスと関連づける。テロメア長の１つの測定は、テロメア／単一コピー（「Ｔ／Ｓ」）比である。所与の集団におけるこのような比は、分位数に、たとえば、三分位値へ分けられることができる。より低い２つの三分位値におけるＴ／Ｓ比によるテロメアの存在量をもつ個体が、テロメア長について繁殖性の上部におけるものより心臓血管疾患のリスクが有意に高いことが分かっている。

一般に、テロメアの存在量の百分順位の値、たとえば、参照集団（典型的にはテロメア長の繁殖性の最高のものまたは四分位数）の百分率として表されるＴ／Ｓ値は、集団において疾患のリスクとネガティブに関連する。すなわち、より短い平均テロメア長は、健康の改善された尺度と関連し、その一方で、より低い百分位数スコアは、減少した健康の尺度、増加した疾患リスクまたはテロメア疾患の存在と関連する。

集団において、テロメア長は、経年的に減少する。したがって、個体についてのテロメア長の測定は、集団における同じ年齢範囲における人、すなわち、年齢がマッチした集団についての測定と比較され得る。たとえば、３０歳の人は、３０歳についての集団平均に大体同等、または２０歳または４０歳についての集団平均に同等であるテロメアの存在量の測定を有し得る。健康の測定とテロメアの存在量の測定の関連づけは、年齢がマッチした集団についての測定と比較したときに、より正確である。年齢がマッチした集団についての範囲は、たとえば、１年、２年、３年、４年、５年、７年または１０年であることができる。

５．１健康の測定

本開示の方法によって被験体試料から決定される短いテロメアの存在量は、健康の尺度と関連づけることができる。特に興味深いのは、認知されたストレスを含む健康の測定である。テロメア短縮は、酸化損傷、生化学的なストレス要因、慢性炎及びウイルス感染などのストレスの複数の形態を含む、遺伝的及び環境因子によって促進され得る（Ｅｐｅｌ， Ｅ．Ｓ． ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ， ２００４， ４９： １７３１２−１５）。一般的な健康状態の便利な測定は、Ｊｏｈｎ Ｗａｒｅ によって開発されたＳＦ−３６（登録商標）Ｈｅａｌｔｈ Ｓｕｒｖｅｙである（たとえば、ワールドワイドウェブＵＲＬ ｓｆ−３６．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ＳＦ３６．ｓｈｔｍｌを参照されたい）。ＳＦ−３６は、好ましくは訓練された個人によって、患者に提起される３６の質問のみでの多目的、簡易健康調査である。それは、機能健康及び幸福スコアの８−スケールプロフィール並びに精神測定法に基づいた身体的及び精神的健康簡易測定及び優先度に基づいた健康効用指数を提供する。ＳＦ−３６調査は、疾患負担を測定し、及び一般的な集団基準と疾患特異的なベンチマークを比較するのに使用される。最も頻繁に研究された疾患及び健康状態は、関節炎、背痛、癌、心臓血管疾患、慢性閉塞性肺疾患、鬱病、糖尿病、消化器系統の病気、片頭痛、ＨＩＶ／ａｉｄｓ、高血圧、過敏性腸症候群、腎疾患、腰痛、多発性硬化症、筋骨格疾患、神経筋疾患、骨関節炎、精神医学的な診断、慢性関節リウマチ、睡眠障害、脊髄損傷、脳卒中、薬物乱用、外科的処置、移植及び外傷（（Ｔｕｒｎｅｒ−Ｂｏｗｋｅｒ ｅｔ ａｌ， ＳＦ−３６（登録商標） Ｈｅａｌｔｈ Ｓｕｒｖｅｙ ＆ 「ＳＦ」 Ｂｉｂｌｉｏｇｒａｐｈｙ： Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８８−２０００）， ＱｕａｌｉｔｙＭｅｔｒｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ， Ｌｉｎｃｏｌｎ， ＲＩ， ２００２）を含む。当業者は、一般的な健康状態のその他の調査方法、たとえば、ＲＡＮＤ−３６が本開示における使用を見いだされ得ることを認識するだろう。

本開示の一つの態様において、被験体試料は時間とともに収集し、及び短いテロメアの存在量の測定は、試料から決定される。複数の試料の収集のための適切な期間は、１ヵ月、３ヵ月、６ヵ月、１年、２年、５年及び１０年（たとえば、最も初期と最後の試料との間の時間は、大体これらの期間であり得る）を含むが、限定されない。この方法は、患者の全般的な健康状態を改善しようとする努力、及び／またはかれらの健康状態及び／または疾患リスクをモニターしようとする努力のモニタリングを可能にする。短いテロメアが細胞死をトリガーするので、個体内で短いテロメア長の割合が低下している、または時間とともに維持されているという所見は、健康改善を示し、その一方で、短いテロメアの割合の増加は、健康の低下または悪化していることを表す。

５．２病態のリスク

５．２．１疾患

テロメアの反復単位の数を測定することは、疾患リスク、疾患予後及び治療などの医学的な診断に非常に様々な応用を有する。特に、テロメア長の測定は、疾患のリスクをまねく病態を評価することに応用される。本開示の一つの態様において、疾患は、老化、たとえば心臓血管疾患、糖尿病、癌、肝線維症及び鬱病と関連するものであるが、限定されない。

一つの態様において、本開示は、心臓血管疾患の評価及びモニタリングにおける使用を見いだす。白血球におけるテロメア長は、それが血管造影法によって測定されたときに正常な冠動脈をもつ個体より重篤な三枝冠動脈疾患をもつ患者において（Ｓａｍａｎｉ、Ｎ． Ｊ． ｅｔ ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ、２００１、３５８：４７２− ７３）、及びまた、このような変遷のない年齢及び性別がマッチした個体と比較して５０歳未満で早発性心筋梗塞を経験する患者において（Ｂｒｏｕｉｌｅｔｔｅ Ｓ． ｅｔ ａｌ， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｅ． Ｂｉｏｌ， ２００３， ２３：８４２−４６）短いことを示した。Ｂｒｏｕｉｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ（Ｌａｎｃｅｔ， ２００７， ３６９： １０７−１４）は、冠動脈心疾患を起こしやすい人々におけるより短い白血球テロメアが、テロメア長においてその他の心血管系リスク因子の累積効果を示し得ることを示唆した。また、増加した酸化的ストレスは、アテローム硬化症に寄与し、及び増加した酸化体ストレスは、インビトロにおけるテロメア消耗の速度を増加することが示された（Ｈａｒｒｉｓｏｎ， Ｄ．， Ｃａｎ． Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｌ， １９９８， １４（ｓｕｐｐｌ Ｄ）：３０Ｄ−３２Ｄ； ｖｏｎ Ｚｇｌｉｎｉｃｋｉ， Ｔ．， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ２０００， ９０８：９９− １１０）。横断的調査において、また、喫煙、体格指数及び１型真性糖尿病は、より短い白血球テロメア長と関連すると報告された（Ｖａｌｄｅｓ， Ａ．， ｅｔ ａｌ， Ｌａｎｃｅｔ， ２００５， ３６６：６６２−６４； Ｊｅａｎｃｌｏｓ， Ｅ． ｅｔ ａｌ， Ｄｉａｂｅｔｅｓ， １９９８， ４７：４８２−８６）。増加した生活ストレス、冠動脈心疾患のリスクを増加させることが公知の因子は、おそらく増加した酸化ストレスの結果として、より短いテロメアと関連することが示された（Ｅｐｅｌ， ２００４，同書）。したがって、喫煙者及び高体格指数、糖尿病及び／または増加した生活ストレスをもつ患者全ては、本開示の方法に従ったかれらのテロメアの存在量の測定及び継続したモニタリングから利益を得るだろう。

２型糖尿病は、より短いテロメアによって特徴づけられる（Ｓａｌｐｅａ， Ｋ． ａｎｄ Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ， Ｓ． Ｅ．， Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ， ２０１０， ２０９（ｌ）：３５−３８）。また、より短いテロメアは、１型糖尿病患者において観察された（Ｕｚｉｅｌ Ｏ． ｅｔ ａｌ， Ｅｘｐｅｒ． Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ， ２００７， ４２：９７１−９７８）。１型糖尿病における疾患の病因は、２型におけるものといくらか異なるが、そうはいっても両方の場合において、ベータ細胞不全は、最も悪化した疾患のための最終的なトリガーである。したがって、テロメア長は、それが疾患の進行と関連するので、糖尿病のための有用なマーカーである。Ａｄａｉｋａｌａｋｏｔｅｓｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ， ２００７， １９５：８３−８９）は、テロメアが対照と比較して前糖尿病性耐糖能障害をもつ患者においてより短いことを示した。加えて、テロメア短縮は、糖尿病性腎障害（Ｖｅｒｚｏｌａ Ｄ． ｅｔ ａｌ， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２００８， ２９５：Ｆ １５６３− １５７３）、ミクロアルブミン尿症（Ｔｅｎｔｏｌｏｕｒｉｓ， Ｎ． ｅｔ ａｌ， Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ， ２００７， ３０：２９０９−２９１５）及び上皮癌（Ｓａｍｐｓｏｎ， Ｍ． Ｊ． ｅｔ ａｌ， Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ， ２００６， ４９： １７２６−１７３１）などの糖尿病合併症と連結した一方で、テロメア短縮は、よく制御された糖尿病をもつ患者において減弱されるようである（Ｕｚｉｅｌ， ２００７，同書）。本開示の方法は、前糖尿病性及び糖尿病患者の状態をモニターしてこれらの合併症及びその他のために初期警告を提供することにおいて、特に有用である。

本開示は、テロメラーゼ活性の活性化が細胞の不死化と関連するので、種々のタイプの癌細胞のテロメア長を決定するのに有用である。正常なヒト体細胞がテロメラーゼを発現しないか、一過性に発現し、及びしたがって、それぞれの細胞分裂でこれらのテロメアを短縮する一方、大部分のヒト癌細胞は、典型的には高レベルのテロメラーゼを発現し、及び無制限の細胞増殖を示す。高テロメラーゼ発現は、細胞が増殖し、及び長期に拡大し、及びしたがって、腫瘍成長を支持することを可能にする（Ｒｏｔｈ， Ａ． ｅｔ ａｌ， ｉｎ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｕ． Ｍ． Ｍａｒｔｅｎｓ （ｅｄ．）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， ２０１０， ｐｐ． ２２１−２３４）。より短いテロメアは、癌のリスク、特に膀胱及び肺、喫煙関連、消化器系及び泌尿生殖系の癌に有意に関連する。過剰なテロメア短縮は、腫瘍発症及び進行を促進する役割をおそらく果たす（Ｍａ Ｈ． ｅｔ ａｌ， ＰＬｏ ＳＯＮＥ， ２０１１， ６（６）： ｅ２０４６６． ｄｏｉ： １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２０４６６）。研究は、乳がんリスクにおける短縮されるテロメアの効果が、閉経前女性及び乏しい抗酸化能をもつ女性などの一定の集団サブグループについて有意であることをさらに示した（Ｓｈｅｎ Ｊ．， ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ２００９， １２４： １６３７−１６４３）。一般に癌を評価し、及びモニターすることに加えて、本開示は、唾液試料に由来するゲノムＤＮＡが利用される場合、口腔癌のモニタリングに特に有用である。

肝硬変は、たいてい有意な炎症性の浸潤と関連する器官の増加する線維症によって特徴づけられる。Ｗｉｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２００２， １６（９）：９３５−９８２）は、テロメア短縮がヒトにおける肝硬変の疾患及び年齢非依存的な徴候であることを示した。テロメア短縮は、ウイルス性肝炎（慢性Ａ型肝炎とＢ型肝炎）、毒性肝臓障害（アルコール症）、自己免疫及び胆汁鬱帯（ＰＢＣ及びＰＳＣ）によって誘導される肝硬変に存在し、テロメアは、患者の年齢に非依存的に肝硬変において一様に短い。テロメア短縮及び老化は、硬化性肝臓における肝細胞に特異的に影響を及ぼし、及び両方のパラメーターが肝硬変の間、線維症の進行と強く関連する。したがって、本開示の方法は、肝線維症を診断し、及びモニターすることにおける使用を見いだす。

鬱病は「促進老化」の状態に例えられ、及び鬱状態の個体は、心臓血管及び脳血管疾患、代謝症候群及び認知症などの老化の種々の疾患のより高い発病率を有する。再発性鬱病をもつ人々または慢性ストレスに曝露した人々は、白血球においてより短いテロメアを示す。より短いテロメア長は、慢性ストレスへの曝露を指し示す再発性鬱病及びＣｏｒｔｉｓｏｌレベルと関連する（Ｗｉｋｇｒｅｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｌ． Ｐｓｙｃｈ．， ２０１１， ＤＯＩ： １０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｐｓｙｃｈ．２０１１．０９．０１５）。しかし、全ての鬱状態の個体は、生涯にわたる抑鬱の発症における大きな変動のため、短縮したテロメアを同程度に示すというわけではない。長期間鬱病に罹患した人々は、対照集団と比較したときに、心理的ストレスによって誘導される酸化ストレス及び炎症に対するより長い曝露のために有意により短いテロメアを有する（Ｗｏｌｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ， ＰＬｏｓ Ｏｎｅ， ２０１１， ６（３）：ｅｌ７８３７）。したがって、本開示の方法は、鬱病をモニターすることにおける使用を見いだされ得る。

慢性感染症

異常なテロメア長は、ＨＩＶ（Ｅｆｆｒｏｓ ＲＢ ｅｔ ａｌ， ＡＩＤＳ． １９９６ Ｊｕｌ； １０（８）：Ｆ１７−２２， Ｐｏｍｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． １９９７， ２３１（１）： １４８− ５４）及びＨＢＶ、ＨＣＶ及びＣＭＶ（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ／ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｅｓｓ． （Ｅｆｆｒｏｓ ＲＢ， Ｅｘｐ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ． ２０１１ Ｆｅｂ−Ｍａｒ；４６（２−３）： １３５−４０． Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ Ｒｅｓ． ２０１１ Ｆｅｂ； １４（ｌ）：４５−５６． ｄｏｉ： １０．１０８９ｒｅｊ．２０１０．１０８５． Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｓｅｐ ７．）を含む慢性感染症と関連する。

Ｈａｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（「Ａ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ａｓ ｐａｒｔ ｏｆ ａ ｈｅａｌｔｈ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｐｒｏｇｒａｍ」， Ｈａｒｌｅｙ ＣＢ， Ｌｉｕ Ｗ， Ｂｌａｓｃｏ Ｍ， Ｖｅｒａ Ｅ， Ａｎｄｒｅｗｓ ＷＨ， Ｂｒｉｇｇｓ ＬＡ， Ｒａｆｆａｅｌｅ ＪＭ， Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ Ｒｅｓ． ２０１１ Ｆｅｂ； １４（ｌ）：４５−５６）において、ＣＭＶ陽性であった個人が、ＣＭＶ陰性であったものより短いテロメアを有し、及びその上、ＣＭＶ陽性被験体は、ＴＡ−６５、その他の補助食品と一緒の天然物由来テロメラーゼ活性化因子の栄養補助剤プログラムに応答する傾向が強かったことが発見され、老化ＣＤ８＋／ＣＤ２８−細胞の存在量を減少させることにおいて、テロメラーゼ活性化因子の投与と組み合わせて、平均テロメア長または短いテロメアの存在量を測定するためのコンパニオン診断法応用を示唆する。

短いテロメア集団の測定は、予後疾患進行及び治療結果の指標として使用され得る。

１つの研究は、ＣＤ４＋細胞におけるテロメア長が炎症等級、線維症段階、重症度の研究室指標、その後の肝臓代償不全及び慢性ＨＣＶ感染をもつ患者における治療結果に関連すると報告した（Ｈｏａｒｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌ， ２０１０， ５３（２）：２５２−２６０）。

もう一つの報告において、より長い白血球テロメア長は、Ｂ型肝炎ウイルス関連肝細胞癌の増加したリスクを予測する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ， ２０１１， １１７（１８）：４２４７−５６．）。

ＨＩＶの場合において、テロメア短縮は、ウイルスの感染によって生じる。加えて、ＨＩＶを治療するのに使用されるヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤は、テロメラーゼ阻害剤である（Ｓｔｒａｈｌ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， １９９６， １６（ｌ）：５３−６５； Ｈｕｋｅｚａｌｉｅ ｅｔ ａｌ， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２０１２， ７（１１）：ｅ４７５０５）。短いテロメアの存在量の測定は、ＨＡＡＲＴ治療の副作用及び有効性を決定するのを補助し得る。

５．２．２その他の病態

また、本開示は、老化の早発性に関連した疾患の診断における使用を見いだす。たとえば、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｇｉｌｆｏｒｄ早老症疾患をもつ個体は、テロメアの長さの喪失と関連する繊維芽細胞における増殖性潜在能力において早老及び減少を示す（Ａｌｌｓｏｐｐ， Ｒ． Ｃ． ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９２， ８９： １０１１４−１０１１８）。この開示の方法に従ったテロメア反復の数の増幅及び定量化は、上記の通りに疾患リスクまたは予後を決定し、及び適切な介入性工程を取るのに有用である。

５．３テロメア疾患

本開示の一つの態様において、テロメアの特異的疾患の存在及び進歩の両方は、試料を使用して決定され得る。テロメア疾患は、テロメアの異常な、または早発性短縮と関連し、それは、たとえば、テロメラーゼ活性における欠損の結果として生じ得る。テロメラーゼは、真核生物におけるテロメアＤＮＡの複製及び保護のために必要とされるリボ核タンパク質複合体である。テロメラーゼを欠いている細胞は、生存度の喪失及びゲノム不安定性における随伴性の増加を生じるテロメアＤＮＡの進行性の喪失を経験する。これらの疾患は、受け継がれ得るし、及び先天性再生不良性貧血の一定の形態を含み得るし、骨髄の幹細胞における不十分な細胞分裂は、重篤な貧血を導く。また、皮膚及び肺の一定の遺伝性疾患は、テロメラーゼ欠損によって生じる。テロメア疾患については、Ｔ／Ｓ＜０．５の閾値は、いくつかの症状に適切である。また、一般に使用される測定基準は、＜１０％未満または好ましくは、正常な集団に対して＜１％の年齢補正百分位テロメアスコアである。

先天性角化異常症（ＤＫＣ）、別名Ｚｉｎｓｓｅｒ−Ｅｎｇｍａｎ−Ｃｏｌｅ症候群は、粘膜皮膚異常によって特徴づけられるまれな、進行性の骨髄不全症候群である：網状皮膚色素過剰症、爪ジストロフィー及び口腔白斑症（Ｊｙｏｎｏｕｃｈｉ Ｓ． ｅｔ ａｌ， Ｐｅｄｉａｔｒ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２０１１， ２２（３）：３１３−９； Ｂｅｓｓｌｅｒ Ｍ．， ｅｔ ａｌ， Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ， ２００７， ９２（８）： １００９−１２）。この障害におけるテロメラーゼ機能不全、リボソーム欠損及びタンパク質合成機能不全についての証拠が存在する。初期の死亡率は、骨髄不全、感染症、致命的な肺合併症または悪性腫瘍とたいてい関連する。疾患は、３つの型の１つにおいて受け継がれる：常染色体優性、常染色体劣性または最も一般的な形態、Ｘ連鎖性劣性（ＤＣの原因である遺伝子が、Ｘ染色体の上に運ばれる）。この開示の方法を使用する疾患進歩の早めの診断及び測定は、筋肉増強剤または骨−髄刺激薬物での早期治療が骨髄不全を予防するのを補助することができるように、これらの遺伝的特徴をもつファミリーに非常に有益である。本開示の非侵襲的、患者の親しみやすい唾液−試験方法は、乳児及び小さな子供が試験及び継続したモニタリングを必要とするので、ＤＫＣについて特に有用である。

特発性間質性肺炎は、線維症及び炎症の組み合わせによる肺柔組織への損傷によって特徴づけられる。特発性肺繊維症（ＩＰＦ）は、肺の進行性の瘢痕を生じさせるこれらの疾患の例である。繊維の瘢痕組織は時間とともに肺において蓄積し、十分な酸素を体に提供するこれらの能力に影響を及ぼす。テロメラーゼ遺伝子、ＴＥＲＴ及びＴＥＲＣのコード領域におけるヘテロ接合変異は、特発性間質性肺炎の家系性及び散発性の場合において見いだされた。突然変異をもつ全ての影響を受けた患者は、短いテロメアを有する。ＩＰＦをもつ個体の有意な画分は、テロメラーゼにおいて突然変異をコードすることによって、説明されることができない短いテロメア長を有する（Ｃｒｏｎｋｈｉｔｅ， Ｊ． Ｔ．， ｅｔ ａｌ， Αｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．， ２００８， １７８：７２９− ７３７）。したがって、テロメア短縮は、この年齢に関連した疾患に対して増加した素因のためのマーカーとして使用され得る（Ａｌｄｅｒ， Ｊ． Ｋ．， ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ， ２００８， １０５（３５）： １３０５１−１３０５６）。さらに、ＩＰＦの経過は、人により変化する。ある人びとについては、疾患は、長年にわたってゆっくり及び徐々に進行し得るが、その一方で、その他の人びとについては、それは迅速に進行し得る。存在する方法は、上記のように肺線維症の経過をモニターする、及び適切な介入性工程をとるのに都合よく使用され得る。

再生不良性貧血は、骨髄が体に十分な赤血球、白血球及び血小板を作製するのを止める疾患である。骨髄が作製する任意の血液細胞は正常である、しかし、これらの十分な量がない。再生不良性貧血は、適度でありえ、重篤でありえ、または非常に重篤であり得る。重篤な、または非常に重篤な再生不良性貧血をもつ人々は、生命を脅かす感染症または出血のリスクにある。テロメラーゼ突然変異をもつ再生不良性貧血をもつ患者は、脊髄形成異常を発症する増加したリスクを有する。テロメラーゼ欠損は、造血幹細胞における不定の程度のテロメア短縮を生じさせ得るし、及び染色体不安定性及び悪性形質転換を導き得る（Ｃａｌａｄｏ， Ｒ． Ｔ． ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， Ｎ． Ｓ．， Ｔｈｅ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｓｔ， ２０１０ワールドワイドウェブＵＲＬ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｓｔ／２０１０／４８４９．ａｓｐｘ）。より短いテロメアをもつ再生不良性貧血患者は、より低い生存割合を有し、及びより長いテロメアをもつものより免疫療法後に再発する可能性が非常に高い。Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（ＪＡＭＡ， ２０１０， ３０４（１２）： １３５８−１３６４）は、テロメア長が増加するにつれて再発率が下がることを見いだした。また、最も短いテロメアをもつ患者の群は、骨髄癌への転換についてのより大きなリスクにあり、及び最も低い全生存割合を有した。本開示の方法は、個体の臨床管理がそれに応じて調整され得るように、再生不良性貧血患者において主要な合併症を発症するリスクをモニターするのに使用され得る。

５．４の薬物応答性

もう一つの態様において、本開示は、治療のモニタリング有効性において、またはテロメア長またはテロメラーゼ活性に影響を及ぼす薬物候補についてのスクリーニングにおいて有用である。テロメア特徴をモニターする能力は、特定の療法及び薬物の有効性を調べるためのウィンドウを提供することができる。個体における特定の療法に対する疾患状態の薬物応答性は、本開示の方法によって決定され得る。たとえば、本開示は、細胞の増殖性潜在能力がテロメア統合性の維持に関連があるので、癌療法の有効性をモニターすることにおける使用を見いだす。上記のように、正常なヒト体細胞がテロメラーゼを発現しない、または一過性にのみ発現する、及びしたがって、それぞれの細胞分裂でこれらのテロメアを短縮する一方で、大部分のヒト癌細胞は、典型的には高レベルのテロメラーゼを発現し、及び無制限の細胞増殖を示す。Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ，（同書， ２０１０）は、これらの腫瘍において非常に短いテロメア（大部分の細胞において最も短いテロメアが、テロメア機能不全に近い）及び高テロメラーゼ活性を有する癌をもつ個体が、抗癌テロメラーゼ阻害薬物から最も多く利益を得ることができることを示唆した。大部分の正常な細胞においてテロメラーゼが発現されない、または一過性に及び非常に低いレベルにて発現されるかのいずれかなので、テロメラーゼ阻害療法は、正常な細胞に対して従来の化学療法より毒性を少なくし得る。このような薬物の例は、短いオリゴヌクレオチドベースのテロメラーゼ阻害剤イメテルスタト（ＧＲＮ１６３Ｌと以前に命名された）である。イメテルスタトは、第一世代のオリゴヌクレオチドＧＲＮ１６３の新規の脂質ベースの抱合体である（Ａｓａｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ２００３， ６３：３９３１−３９３９）。しかし、正常な血液細胞（特にこれらの顆粒球）において非常に短いテロメアを有する癌患者は、骨髄などの増殖性組織におけるイメテルスタトの有害作用のより高いリスクにある。Ｒａｔｔａｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）は、短い顆粒球テロメア長をもつこのような被験体が、好中球減少または血小板減少などの骨髄不全症候を有する可能性がより高いことを見いだした。この状況において、医師は、イメテルスタトのより低い用量、異なる薬物または骨髄問題についてより頻繁にモニターすることを処方するかもしれない。

その他の態様において、老化の疾患、たとえば限定されなが、心臓血管疾患、糖尿病、肺線維症、肝線維症、間質性肺炎及び鬱病の治療における薬物有効性。心臓血管疾患の場合において、Ｂｒｏｕｉｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．は、対照群より短いテロメア長をもつ中年の男性が、プラバスタチンで脂質を低くする療法から最も多く利益を得ると報告した（Ｂｒｏｕｉｌｅｔｔｅ， Ｓ． Ｗ． ｅｔ ａｌ， Ｌａｎｃｅｔ， ２００７， ３６９： １０７−１１４）。Ｓａｔｏｈ ｅｔ ａｌ（Ｃｌｉｎ． Ｓｃｉ， ２００９， １１６：８２７−８３５）は、集中的な脂質−低下療法が、適度なプラバスタチン療法で治療された患者と比較したときに、アトルバスタチンで治療された患者においてより優れて浸食からテロメアを保護したことを示す。本開示の方法は、治療された患者におけるスタチンの有効性をモニターするのに使用され得るし、短いテロメア長は、より優れた薬物有効性と関連づける。最も長いテロメアをもつ被験体が予防的スタチンから平均の利益を得なかったので、医師は、患者が特にこれらの治療プログラムの部分として優れた生活様式習慣に従順であることを示唆するかもしれない。逆に、慢性のスタチン使用の副作用を恐れる短いテロメアをもつ患者は、スタチンから利益を得るこれらのより高い確率に基づいてスタチンを摂取するよう説得されるかもしれない。使用され得るスタチンの例は、ナイアシン（ＡＤＶＩＣＯＲ、ＳＩＭＣＯＲ）、ロバスタチン（ＡＬＴＯＰＲＥＶ、ＭＥＶＡＣＯＲ）、ａｍｏｌｏｐｉｄｉｎｅ（ＣＡＤＵＥＴ）、ロスバスタチン（ＣＲＥＳＴＯＲ）、シタグリプチン／シンバスタチン（ＪＵＶＩＳＹＮＣ）、フルバスタチン（ＬＥＳＣＯＬ）、プラバスタチン（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ）、アトルバスタチン（ＬＩＰＩＴＯＲ）、ピタバスタチン（ＬＩＶＡＬＯ）及びエゼチミベ／シンバスタチン（ＶＹＴＯＲＩＮ）を含む。

さらなる態様において、テロメア疾患、たとえば先天性角化異常症、肺線維症及び再生不良性貧血の治療における薬物有効性は、測定され得るが制限されない。たとえば、先天性角化異常症及び肺線維症の両方は、高用量ステロイドで治療され、それは多数の有害な副作用を有することが周知である。したがって、最も少ない可能性のステロイド用量の使用は、本開示の方法をこれらの患者をモニターするための有益なツールとして、高度に望ましい。

５．５薬物候補スクリーニング

もう一つの態様において、本開示は、候補薬物、栄養補助食品及びテロメラーゼ活性などのテロメア長を調節する生物学的経路に影響を及ぼす生活様式変化を含むその他の介入についてのスクリーニングの一般的な方法としての使用を見いだす。定量的様式においてテロメア反復を迅速に及び特異的に増幅する能力は、細胞におけるテロメア動態に影響を及ぼす小分子、候補核酸及びペプチド薬剤及びその他の産物または介入を同定するための高スループットスクリーニング方法を提供する。正常な細胞における正の、テロメアを長くする効果を有する薬物またはその他の産物候補は、変形性またはテロメア短縮（またはテロメラーゼ阻害）効果をもつものにおいて細胞老化関連の症状の治療において好ましい、他の全てが同等であるだろう。癌の治療の場合において、特に癌細胞における負のテロメア短縮効果を有する薬物は、好ましいだろう。

実施例１ 短いテロメア配列の増幅

ここで、我々は、短いテロメアの割合を測定するための精製したゲノムＤＮＡを使用する定量的ＰＣＲに基づいた方法を記述する。この方法は、非ヒトプライマー「ＴｅｌｏＰｒｉｍｅｒ」の非共有結合を脊椎動物のゲノムＤＮＡの３’オーバーハングに、伸長反応の間にテロメアのＣ−鎖を置換する、または分解する酵素をもつサブテロメア独特の配列「ＳＵＳ」の方への時間制御されたＴｅｌｏＰｒｉｍｅｒの伸長を組み込み、その後にＳＵＳ及びＴｅｌｏＰｒｉｍｅｒの非ヒト配列部分を利用する増幅反応が続く。伸張ＴｅｌｏＰｒｉｍｅｒ産物がＳＵＳ配列に到達するように、十分に短いテロメアのみを増幅する。したがって、鎖置換反応の制御されたタイミングは、テロメア長の特定された閾値より短いテロメアの検出を可能にする。加えて、ＳＵＳ及びＴｅｌｏＡｎｃｈｏｒプライマーによるＰＣＲ工程において伸長時間を制御することにより、短いテロメア集団は、さらに短いテロメアを測定するこのアッセイの特異性を増加させて、選択的に増幅されるだろう。短いテロメアの存在量をＴｅｌｏＴｅｓｔのＴ−ｒｕｎにおいて定量化する。

材料及び方法

プライマー

全てのプライマーを標準的な脱塩された、またはＨＰＬＣ精製された形でＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。プライマーの配列を下に収載した：
ＴｅｌｏＰｒｉｍｅｒ：５’−ＴＧＣＴＣＧＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＴＡＡＣＣ− ３’［配列番号：７］
ＴｅｌｏＡｎｃｈｏｒ：５’−ＴＧＣＴＣＧＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＣ−３’［配列番号：８］
ＳＵＳ（ＨＰＬＣ精製された）：５’−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ−３’［配列番号：２］
ＴｅｌｏＰｒｏｂｅ（ＨＰＬＣ精製された）：５’−ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡ− ３’［配列番号：９］

ゲノムＤＮＡに対するＴｅｌｏＰｒｉｍｅｒのアニーリング

ヒトゲノムＤＮＡを５０ｕＬ反応中２０ｎｇ／ｕＬ ＤＮＡ 及び１ｕＭ ＴｅｌｏＰｒｉｍｅｒの最終濃度にてＴｅｌｏＰｒｉｍｅｒと混合し、加熱ブロックにおいて１０分間６５℃にてインキュベートし、及び次いで１時間の期間にわたって室温まで冷却した。アニールされた試料を鎖置換反応まで氷において保存する。

鎖置換

鎖置換反応を５０ｎｇのアニールされたＤＮＡ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣ１２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ（ＰＮ ７０７２６， Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ， ＵＳＡ）、１００ｕｇ／ｍＬ ＢＳＡ（Ｃａｔ＃ Ｂ９００１ Ｓ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）、５００ｕＭ ｄＮＴＰ（Ｃａｔ＃ １７０８８７４， Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）、５ｕＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇタンパク質（ＳＳＢ， Ｃａｔ＃７００３２Ｙ １００ ＵＧ， Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）及び４００ｎＭ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０（ｃａｔ ＃ ７０７７５Ｙ ２００ ＵＮ， Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅの濃度は１３Ｕ／ｕｌである）を伴う５ｕＬ容積において実施した。Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０無しの混合物を１分間３７℃にて予熱し、及び次いでｓｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０が混合物に添加された後に３０秒〜１０分間３７℃にてインキュベートした。反応を２０分間８０℃にて熱失活によって止めた。

鎖置換産物のＰＣＲ増幅

鎖置換ＤＮＡ反応からの産物をＤＮＡ懸濁緩衝液（Ｃａｔ＃ Ｔ０２２７， Ｔｅｋｎｏｖａ， Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ， ＣＡ）中に５０倍に希釈した。ＰＣＲを１．５ｍＭ ＭｇＣ１２、３００ｕＭ ｄＮＴＰ（Ｃａｔ＃ １７０８８７４， Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）、０．５ｕＭ ＳＵＳプライマー、０．５ｕＭ ＴｅｌｏＡｎｃｈｏｒプライマー、２ｕｌ希釈ＤＮＡ、５ユニットＰＬＡＴＩＮＵＭ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃａｔ ＃ １０９６６−０８３， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）を含む４０ｕＬ反応容積において実施した。

サイクリングプログラムは、以下のとおりである：９４℃にて２分、９４℃にて１５秒の３５サイクル、６５℃にて３０秒、７２℃にて３０秒〜１０分、続いて７２℃にて１０分の延長であった。ＰＣＲ反応をＢｉｏ−Ｒａｄ Ｃ１０００ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）において実施した。

ＴｅｌｏＴｅｓｔによる増幅されたＰＣＲ産物の定量化

ＰＣＲ産物をＤＮＡ懸濁緩衝液中に１０〜１０００倍希釈した。ＴＥＬＯＴＥＳＴのＴ−ｒｕｎをＰＣＲ産物を定量化するのに使用した。６０〜６００ｂｐの完全なテロメア反復の間に含むＰＣＲ断片をそれぞれの試料のＤＮＡ濃度を算出するのに標準的なように使用した。ＴＴＡＧＧＧ３’オーバーハング及び５’の近くのＳＵＳ配列をもつ約２ｋｂ ＤＮＡ断片の内標準は、置換反応からｑＰＣＲ工程へのそれぞれの試料に含まれるだろう。それぞれの試料の反応効率は、内標準内で非ヒト配列のｑＰＣＲによって測定されるだろう。それぞれの試料のための規準化因子は、反応効率に基づいて生成されるだろう。

サザンブロット

サザンブロット解析を置換されたテロメアＤＮＡのサイズを確認するために実施した。ＳＵＳ 及びＴｅｌｏＡｎｃｈｏｒプライマーによって増幅された鎖置換産物を０．５％アガロースゲル上で実行し、正に荷電したＮｙｌｏｎ膜へ移し、及び４つのＴＴＡＧＧＧ反復をもつＤＩＧ標識されたオリゴプローブに３７℃にて一晩ハイブリダイズした。化学発光検出をシグナル検出のために使用した。

結果

全体のスキーム

ここで記述される短いテロメアアッセイ（ＳＴＡ）は、定量的ＰＣＲが後に続く鎖−置換または鎖分解によって、ヒトゲノムＤＮＡ試料における短いテロメアの量を定量化する。アッセイの全体のスキームを図１に図示する。

アッセイをヒトゲノムＤＮＡへの第１のアニーリングＴｅｌｏＰｒｉｍｅｒによって実施した。ＴｅｌｏＰｒｉｍｅｒは、５’末端にて非ヒト配列の１９のヌクレオチド及び３’末端にてテロメア配列の８のヌクレオチドを含む。天然ゲノムＤＮＡを使用することは、ＴｅｌｏＰｒｉｍｅｒが二本鎖領域でないテロメアの３’一本鎖テール（オーバーハング）にのみアニールするだろうことを保証する。ＴｅｌｏＰｒｉｍｅｒの伸長は、鎖置換または鎖分解反応によって達成される。限られた時間で、反応は、短いテロメアをもつこれらの染色体上のテロメア変異領域に到達することができるのみだろうが、その一方で、長いテロメアをもつ染色体上で鎖−置換された産物は、完全なテロメア反復領域内で止まるだろう。次いで、置換された短いテロメアをＳＵＳプライマー及びＴｅｌｏＡｎｃｈｏｒプライマーでＰＣＲによって濃縮する。ＳＵＳプライマーは、サブテロメア領域及び真のテロメア反復の間の接合部で、またはその近くで、テロメア変異領域において大部分の染色体上で見つけられるＴＧＡＧＧＧ配列の３つの反復を含む。ＴｅｌｏＡｎｃｈｏｒプライマーは、ＴｅｌｏＰｒｉｍｅｒと同じ非ヒト配列を共有し、及びテロメア配列を含まない。ＳＵＳ及びＴｅｌｏＡｎｃｈｏｒの一対は、鎖−置換された短いテロメアを特異的に増幅するようにデザインされている。最後に、ＴＥＬＯＴＥＳＴ Ｔ−ｒｕｎを短いテロメアの量を定量化するために使用する。

鎖置換産物の定量化

鎖置換増幅は、遭遇する下流のＤＮＡが合成の間にポリメラーゼによって置換されるＤＮＡ合成反応である。全ゲノム増幅及び法医学的分析を含む多くのプロトコルは、鎖置換を使用して微量の鋳型ＤＮＡを増幅する。ＤＮＡポリメラーゼの鎖−置換活性のため、ニックまたは一本鎖テールをもつＤＮＡを変性工程なしで鋳型として使用することができる。我々は、テロメアの一本鎖テールが鎖−置換酵素のために天然鋳型として役に立つ、及びｉｎｔｅｒｓｔｉａｌテロメア様配列の非特異的増幅を生じさせ得るゲノムにおけるギャップを作製する５’−３’エキソヌクレアーゼ（分解酵素）ほど可能性が高くないので、我々の実験計画において鎖−置換酵素を使用することを選択した。天然のゲノムＤＮＡ上のテロメアの一本鎖テールに対するＴＥＬＯＰＲＩＭＥＲのアニーリングは、Ｃ−鎖の５’末端に隣接してＴｅｌｏＰｒｉｍｅｒを置く（図１）。このデザインにおいて、鎖−置換された産物の長さは、テロメアの長さを正確に反映するだろう。鎖−置換時間を制御することによって、反応は、短いテロメアをもつこれらの染色体上のテロメアに変異領域にのみ到達することができるだろう。我々は、高特異性及び処理能力をもつ直鎖状の鋳型上でＤＮＡを合成することが報告されているため（Ｊｏｎｅｊａ， Ａ． ａｎｄ Ｘ． Ｈｕａｎｇ， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， ２０１１． ４１４（１） ５８−６９）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０、エキソヌクレアーゼ活性のないＴ７ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子改変の形態を使用することを選択した。我々は、鎖置換反応が３０秒〜５分かかった時間経過実験を行った。膀胱癌株化細胞ＵＭ−ＵＣ３からのゲノムＤＮＡをＴｅｌｏＰｒｉｍｅｒにアニールして、及び鎖−置換反応を材料及び方法に詳述されるように行った。

図２は、増加した鎖置換反応時間をもつＴＥＬＯＴＥＳＴ ｑＰＣＲのＴ−ｒｕｎによって測定される増加したテロメア産物を示した。直線状の回帰直線は、時間増幅産物の存在量の間の強力な関係を示した（Ｒ^２＝０．９９）。さらにまた、負の対照において、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０が添加されなかった場合、ＰＣＲ産物は、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０を含む反応の最低測定濃度より１５９倍低いＴＥＬＯＴＥＳＴ Ｔ−ｒｕｎ（クロッシングポイント（Ｃｐ）＝２５、算出濃度１．８５Ｅ−０７）において検出されなかった。また、ＴＥＬＯＴＥＳＴ Ｓ−ｒｕｎにおける単一のコピー遺伝子（ベータ‐グロビン）プライマーを使用する平行反応は、増幅産物を示さず、Ｔ−ｒｕｎにおいて測定されるテロメア産物が総ゲノムＤＮＡからでなく、鎖−置換反応に由来することをさらに確認した。

我々がここで提唱する実験計画は、短い置換反応時間で、短いテロメアからの産物のみがＳＵＳ及びＴｅｌｏＡｎｃｈｏｒプライマーで増幅されるだろうと予測した。我々は、サザンブロット解析によってこれを確認するために探求した。ＳＵＳ 及びＴｅｌｏＡｎｃｈｏｒプライマーによって増幅された鎖置換産物を０．５％アガロースゲル上で実行し、正に荷電したＮｙｌｏｎ膜へ移して、４つのＴＴＡＧＧＧ反復をもつＤＩＧ標識されたオリゴプローブにハイブリダイズした。図３は、増幅されたＰＣＲ産物の長さが増加する鎖置換時間と共に増加することを示す。ＰＣＲ産物の測定されたモード（強度のピーク）は、それぞれ ０．５分、１分、３分及び５分の置換時間で、およそ０．６ｋｂ、０．９ｋｂ、１．２及び１．４ｋｂである。１分の置換時間で、産物の大部分は、２ｋｂ以下である。独立した比較テストにおいて、我々は、修飾された単一のテロメア伸長の長さの解析（ＳＴＥＬＡ）（Ｂａｉｒｄ， Ｄ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．， ２００３． ３３（２） ２０３−７）プロトコルを使用して、同じ癌細胞系統ＵＭ−ＵＣ３から総ゲノムＤＮＡのテロメア長プロフィールを解析した。ＴｅｌｏＰｒｉｍｅｒは、Ｃ鎖の５’末端に連結され、及びＸｐＹｐＥ２及びＴｅｌｏＡｎｃｈｏｒプライマーをテロメアを増幅するのに使用した。ＰＣＲ産物をゲル上で実行した（図３においてレーン１）。これは、ＵＭ−ＵＣ３テロメアのモードが以前の報告と一致して、約１．８ｋｂであることを明らかにした（Ｘｕ， Ｌ． ａｎｄ Ｅ．Ｈ． Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ， ２００７． ２８（２） ３１５−２７）。

短いテロメアアッセイをさらに確認するために、我々は、２つの異なるゲノムＤＮＡ試料でこのアッセイを実施した。ＵＭ−ＵＣ３ ＤＮＡに加えて、我々は、テロメラーゼｈＴＥＲのＲＮＡ遺伝子を発現するレンチウイルスベクターによって感染されたＵＭ−ＵＣ３からのゲノムＤＮＡを使用し、テロメアの伸長を生じた（Ｘｕ， Ｌ． ａｎｄ Ｅ．Ｈ． Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ， ２００７． ２８（２） ３１５−２７）。ＵＭ−ＵＣ３／ｈＴＥＲにおけるｑＰＣＲによって測定された平均テロメア長は、ＵＭ−ＵＣ３についての０．５６と比較して２．１である（Ｔｅｌｏｍｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｃ． ｄａｔａ）。ＵＭ−ＵＣ３／ｈＴＥＲ細胞は、サザンブロット解析によって判断されるように（図５）、短いテロメアのより低い割合を有する。これと一致して、ＵＭ−ＵＣ３における短いテロメアの計算された量は、ＵＭ−ＵＣ３／ｈＴＥＲと比較して３倍高い（図４）。

我々は、短いテロメアアッセイが短いテロメアの相対的な割合を特異的に測定すると結論する。さらにまた、鎖置換反応時間を制御することによって、このアッセイにおいて測定されるだろうテロメア長カットオフは、異なることができ、及び予め決定されることができる。

上で言及された短いテロメアアッセイは、自動化された高いスループットフォーマットに容易に適応することができる。図６は、このようなフォーマットにおける個々の工程を示す。

本発明の好ましい態様が本明細書において示され、及び記載された一方、このような態様が例としてのみ提供されることは当業者にとって明らかだろう。多数の差異、変更及び代用は、ここで本開示を逸脱しない範囲で当業者に生じるだろう。本明細書において記述した本発明の態様の種々の選択肢が本発明の実施において使用されてもよいことを理解すべきである。以下の請求項が本発明の範囲を定義し、及びこれらの請求項及びこれらの同等のものの範囲内で方法及び構造がこれによりカバーされることが意図される。

Claims (28)

1. 染色体のテロメア反復配列及びサブテロメア配列を増幅する方法であって、前記方法は：
   ａ）以下によって核酸伸長産物を作製すること：
   ｉ）二本鎖染色体ＤＮＡの３’オーバーハングにおけるテロメア反復配列に伸長プライマーをハイブリダイズすることであって：
   （１）二本鎖染色体ＤＮＡは、テロメア反復配列を含むテロメア領域及びサブテロメア配列を含むサブテロメア領域を有し；及び
   （２）伸長プライマーは：
   （Ａ）アニーリング条件下で３’オーバーハングにおけるテロメア反復配列にハイブリダイズする３’部分及び
   （Ｂ）アニーリング条件下で３’オーバーハングにおけるテロメア反復配列にハイブリダイズしないアンカー配列を有する５’部分
   を含む、前記ハイブリダイズすること；及び
   ｉｉ）時間制御された鎖−置換伸長反応を行って二本鎖染色体ＤＮＡのサブテロメア領域の方へ伸長プライマーを伸張することであって、伸長反応は、予め定められた長さの範囲内でテロメア領域を有する二本鎖染色体ＤＮＡのみからのテロメア反復配列及びサブテロメア配列の両方を含む伸長産物を産生するように調節される、前記伸長すること；及び
   ｂ）その後のＰＣＲ反応によって伸長産物の配列を増幅すること、
   を含み；これによりテロメア反復配列及びサブテロメア配列を有する核酸を含む長さの限られた増幅産物を産生し、
   時間制御された伸長反応は、予め定められた長さの伸長産物を産生するように調節され、
   前記時間制御された伸長反応は、０．１〜３０分、０．１〜１０分、０．１〜５分、０．１〜４分、０．１〜３分、０．１〜２分、０．１〜１分、または０．１〜０．５分であるように調節される、前記方法。
2. 配列は：
   （１）アニーリング条件下で伸長産物におけるサブテロメア領域に独特の配列にハイブリダイズする第１の増幅プライマー；及び
   （２）アニーリング条件下でアンカー配列にハイブリダイズする第２の増幅プライマー、
   を使用して増幅される、請求項１に記載の方法。
3. 第１の増幅プライマーは、配列５’−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ−３’［配列番号：２］、５’−ＣＧＧＧＣＣＧＧＣＴＧＡＧＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡ−３’［配列番号：１０］（染色体１）、５’−ＧＣＴＡＡＴＧＣＡＣＴＣＣＣＴＣＡＡＴＡＣ−３’［配列番号：１１］（染色体５）または５’−ＣＡＴＴＣＣＴＡＡＴＧＣＡＣＡＣＡＴＧＡＴＡＣＣ−３’［配列番号：１２］（染色体９）を含む、請求項２に記載の方法。
4. 第１の増幅プライマーは、配列５’−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ−３’［配列番号：２］を含み、及び第２のプライマーは、配列５’−ＴＧＣＴＣＧＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＣ−３’［配列番号：８］を含む、請求項２に記載の方法。
5. 増幅されたテロメア産物の長さ範囲は、ＰＣＲ反応において時間制御された伸長時間を使用して決定することができる、請求項１に記載の方法。
6. 対照配列を同時増幅することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
7. 対照配列は、複数の非テロメア反復配列を含む、請求項６に記載の方法。
8. 短いテロメアの存在量を決定するための方法であって：
   ａ）被験体から３’オーバーハングを含む二本鎖染色体ＤＮＡを含む試料を得ること；
   ｂ）請求項１の方法を使用して二本鎖染色体ＤＮＡから長さの限られた増幅産物を産生すること；及び
   ｃ）長さの限られた増幅された産物から短いテロメアの存在量を決定すること、
   を含む前記方法。
9. ｄ）試料からの総テロメアの存在量の測定と短いテロメアの存在量を比較することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
10. 工程ｄ）は、総テロメアの存在量の関数として短いテロメアの存在量を決定することを含む、請求項９に記載の方法。
11. 短いテロメアの存在量を決定することは、ｑＰＣＲを使用して行われる、請求項８に記載の方法。
12. ｑＰＣＲは、第１及び第２のプライマーを使用して行われ、
    ｉ）前記第１のプライマーは、第１の鎖の少なくとも１つの反復単位にハイブリダイズし、及び前記第２のプライマーは、第２の鎖の少なくとも１つの反復単位にハイブリダイズし、
    ｉｉ）前記ハイブリダイズしたプライマーは、これらのそれぞれの鎖にハイブリダイズしたときに、プライマー伸長ができる、及び前記第１のプライマーの少なくとも１つのヌクレオチドは、前記第１のプライマーが前記第１の鎖の少なくとも１つの反復単位にハイブリダイズしたときに、前記第１のプライマーと前記反復単位のヌクレオチドとの間に内部塩基対ミスマッチを生じ、
    ｉｉｉ）前記第１のプライマーは、また第１及び第２のプライマーが互いにハイブリダイズするときに、前記第２のプライマーの３’末端ヌクレオチドとミスマッチを生じ、
    ｉｖ）前記第２のプライマーの少なくとも１つのヌクレオチドは、前記第２のプライマーが前記第２の鎖の少なくとも１つの反復単位にハイブリダイズしたときに、前記第２のプライマーと前記反復単位のヌクレオチドとの間の内部塩基対ミスマッチを生じる、請求項１１に記載の方法。
13. 短いテロメアの存在量を決定することは、サザンブロット、ドットブロット法、スロットブロット、免疫化学、核酸シーケンシング、またはデジタルＰＣＲによって試料における平均テロメア長を測定することを含む、請求項８に記載の方法。
14. 短いテロメアの存在量は、存在量比の測定である、請求項８に記載の方法。
15. 総テロメアの存在量は、ゲノム参照配列の存在量に相対的に測定される、請求項９に記載の方法。
16. ゲノム参照配列は、単一コピー参照核酸配列または非テロメア反復ＤＮＡ配列を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 単一のコピー参照核酸配列は、ヒトβ‐グロビンである、請求項１６に記載の方法。
18. 非テロメア反復ＤＮＡ配列は、Ａｌｕ反復配列または動原体性反復配列である、請求項１６に記載の方法。
19. ａ）単離された試料において、請求項８〜９および１０〜１６に記載のいずれかの方法を使用して短いテロメアの存在量を決定すること；及び
    ｂ）短いテロメアの存在量を状態または疾患と関連づけること、
    を含む、方法。
20. 短いテロメアの存在量の測定は、試料からの総テロメアの存在量と短いテロメアの存在量を比較して決定される、請求項１９に記載の方法。
21. 症状または疾患は、死亡リスクの増加を示す、請求項１９に記載の方法。
22. テロメアの存在量は、絶対存在量である、請求項１９に記載の方法。
23. 絶対存在量は、テロメア配列の長さとして測定される、請求項２２に記載の方法。
24. 症状は、疾患のリスクである、請求項１９に記載の方法。
25. 疾患のリスクは、年齢に関連した疾患である、請求項２４に記載の方法。
26. 年齢に関連した疾患は、心臓血管疾患であり；及び集団における平均より低い測定は、心臓血管疾患のリスクの増加を関連づけられる、請求項２５に記載の方法。
27. ａ）単離された複数の試料を得ることであって、それぞれの単離された試料は、異なる時に得られる、前記得ること；
    ｂ）請求項８〜９および１０〜１６に記載のいずれかの方法を使用してそれぞれの複数の試料における短いテロメアの存在量を決定すること；
    ｃ）短いテロメアの存在量の測定における増減率を決定すること；及び
    ｄ）（１）健康の測定；（２）病態のリスク；（３）テロメア疾患または（４）薬物応答性と増減率を関連づけること、
    を含む、方法。
28. 短いテロメアの存在量は、短いテロメアの存在量を試料からの総テロメアの存在量と比較することによって決定される、請求項２７に記載の方法。

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