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JP6470705B2 - 除草剤耐性植物及びそれを識別するための方法 - Google Patents

除草剤耐性植物及びそれを識別するための方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は2010年7月23日に出願された米国仮特許出願61/367,251号;2009年11月23日に出願された米国仮特許出願61/263,707号;及び2009年11月23日に出願された欧州特許出願EP09014565.7号の優先権を主張し、これらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、各々ダイズゲノムの特異的箇所において、特異的形質転換イベントの少なくとも2つを保有することにより、特に、除草剤耐性を付与する蛋白をコードする遺伝子の少なくとも2セットの存在により特徴付けられる、トランスジェニックダイズ植物、植物性物質及び種子に関する。本発明のダイズ植物は除草剤の非存在下における非形質転換ダイズ系統と同等の種々異なる遺伝子的背景における作物学的性能、遺伝子的安定性及び機能に除草剤耐性表現型を組み合わせている。本発明は更に生物学的試料中に形質転換イベントEE−GM3及びEE−GM2又はEE−GM1を特に含む植物性物質の存在を識別するための方法及びキットを提供する。
植物における導入遺伝子の表現型発現は遺伝子の構造又は遺伝子そのもの及び植物ゲノム中のそれ又はそれらの箇所の両方により決定される。同時に、ゲノム中の種々異なる箇所における導入遺伝子、即ち「外来性DNA」の存在が種々異なる態様において植物の全体的表現型に影響することになる。遺伝子操作による植物中の商業的価値のある特質の作物学的又は工業的に成功する導入は種々異なる要因に依存する長い手順となる場合がある。遺伝子的に形質転換された植物の実際の形質転換及び再生は、広範な遺伝子特性化、繁殖、及び圃場試験における評価を包含し、そして最終的には優良イベントの選択に至る一連の選択工程の最初のものに過ぎない。
優良イベントの明確な識別はNovel Food/Feedにおける考察、GMOと非GMO産物の分離、及び専売物質の識別を鑑みれば、よりいっそう重要になりつつある。理想的には、そのような識別方法は迅速かつ簡素であり、広範な実験設備を必要としない。更に又、方法は専門的な解釈を要せず優良イベントの明確な決定を可能にするが、必要に応じて専門的な精査検討の下にあり続ける結果をもたらすはずである。生物学的試料中の優良イベントEE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM1の識別において使用するための特異的ツールを本明細書に記載する。
本明細書において、EE−GM3は、4−ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ(HPPD)阻害剤に対する耐性を付与する遺伝子と組み合わせてグリホセート耐性をコードする遺伝子を各々植物発現可能なプロモーターの制御下に含む除草剤耐性ダイズ(Glycine max)の開発において、トランスジェニックダイズ植物の集団から優良イベントとして識別されている。
EE−GM1及びEE−GM2はグルホシネート耐性をコードする遺伝子を共に植物発現可能なプロモーターの制御下に含む除草剤耐性ダイズ(Glycine max)の開発において、トランスジェニックダイズ植物の集団から優良イベントとして識別されており、そして国際特許出願WO2006/108674及びWO2006/108675に記載されている(共に参照により本明細書に組み込まれる)。
除草剤耐性遺伝子を含むダイズ植物は当該分野で開示されている。しかしながら従来技術の開示の何れも本発明を教示又は示唆するものではない。
許容できる作物学的性能を有し、収量を障害せず、そして確実に3種の異なるクラスの除草剤に対して十分な除草剤耐性をもたらすダイズ植物における商業的除草剤耐性優良形質転換イベントを得ることは決して単純ではない。
実際、除草剤耐性を有する市販の最初のダイズイベント(イベント40−3−2は(近)同遺伝子系の系統と比較して顕著な収量障害があることが報告されている(Elmore et.al.,(2001)Agron.J.93:408-412)。
更に又、OptimumTMGATTMダイズ(イベント356043)はグリホセートへの耐性をALS除草剤に対する耐性と組み合わせるように開発されているが、これらのダイズはそれ自体ではグリホセート耐性に関する基準に合致しないと報告されている(別のグリホセート耐性ダイズイベント(例えばイベント40−3−2)と組み合わせない場合(例えばwww.bloomberg.com/apps/news?pid=newsaixhive&sid=ad4L0hH9MKWE参照))。
国際特許出願WO2006/108674 国際特許出願WO2006/108675
Elmore et.al.,(2001)Agron.J.93:408-412
本発明は2mEPSPS遺伝子のコーディング配列を含む除草剤耐性遺伝子及びHPPD−PfW336のコーディング配列を含む別の除草剤耐性遺伝子(共に本明細書の実施例1.1において記載されており、そして配列番号1において示される通りである)を含む発現カセット、並びに、本明細書において実施例1に記載するとおり、そして配列番号11に示すホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼのコーディング配列を含む除草剤耐性遺伝子を含む第2の発現カセットを、自身のゲノム内に安定に組み込まれた状態で含んでいる、トランスジェニックダイズ植物、又はその種子、細胞又は組織に関する。トランスジェニックのダイズ植物、又はその種子、細胞又は組織は、グリホセートに基づく、グルホシネートに基づく除草剤、及びHPPD阻害剤除草剤、例えばイソキサフルトールに対して耐性であり、そして、除草剤の非存在下においては、非トランスジェニック同遺伝子系の系統と実質的に同等の作物学的性能を有する。付与された耐性に対する除草剤1つ以上の適用の後、植物は非トランスジェニック植物と比較して優れた作物学的表現型を有することになる。
本発明によれば、ダイズ植物又はその種子、細胞又は組織は優良イベントEE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM3及びEE−GM2を含む。
より特定すれば、本発明は、それぞれEE−GM3のEE−GM3の5’又は3’フランキング領域及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAに指向された2つのプライマーを用いて本明細書に記載したPCR識別プロトコルにおいて分析した場合に、EE−GM3に特異的なフラグメントを与え、そしてEE−GM1又はEE−GM2の5’又は3’フランキング領域及びグルホシネート耐性遺伝子を含む外来性DNAに指向されたプライマーの2つを用いて本明細書に記載したPCR識別プロトコルにおいて分析した場合に、EE−GM1又はEE−GM2に特異的なフラグメントを与えるという事実により自身のゲノムDNAが特徴付けられる、トランスジェニックのダイズ植物、その種子、細胞又は組織に関する。EE−GM3の検出のためのプライマーは配列番号2内部の5’フランキング領域及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAにそれぞれ指向させて良い。EE−GM3の検出のためのプライマーは又配列番号3内部の3’フランキング領域及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAにそれぞれ指向されて良く、例えばプライマーはそれぞれ配列番号5及び配列番号4又は配列番号7のヌクレオチド配列を含むか、(実質的に)それらよりなり、そして100〜800bpのDNAフラグメント、例えば約263bp又は706bpのフラグメントをもたらす。EE−GM1の検出のためのプライマーは配列番号12内部の5’フランキング領域及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAにそれぞれ指向させて良い。EE−GM1の検出のためのプライマーは配列番号13内部の3’フランキング領域及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAにそれぞれ指向されて良く、例えばプライマーはそれぞれ配列番号16及び配列番号17のヌクレオチド配列を含むか、(実質的に)それらよりなり、そして100〜500bpのDNAフラグメント、例えば約183bpのフラグメントをもたらす。EE−GM2の検出のためのプライマーは配列番号14内部の5’フランキング領域及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAにそれぞれ指向させて良い。EE−GM2の検出のためのプライマーは配列番号15内部の3’フランキング領域及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAにそれぞれ指向されて良く、例えばプライマーはそれぞれ配列番号18及び配列番号19のヌクレオチド配列を含むか、(実質的に)それらよりなり、そして100〜500bpのDNAフラグメント、例えば約151bpのフラグメントをもたらす。
本発明の優良イベントEE−GM3を含むレファレンス種子はアクセッション番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されている。本発明の優良イベントEE−GM1を含むレファレンス種子はアクセッション番号NCIMB41658の下にNCIMBに寄託されている。本発明の優良イベントEE−GM2を含むレファレンス種子はアクセッション番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されている。本発明の優良イベントEE−GM3及びEE−GM1を含むレファレンス種子はアクセッション番号PTA−11041の下にATCCに寄託されている。本発明の優良イベントEE−GM3及びEE−GM2を含むレファレンス種子はアクセッション番号PTA−11042の下にATCCに寄託されている。
本発明の1つの実施形態は優良イベントEE−GM3(アクセッション番号NCIMB41659としてNCIMBに寄託されている該イベントを含むレファレンス種子)を含み、そして更に優良イベントEE−GM1(アクセッション番号NCIMB41658としてNCIMBに寄託されている該イベントを含むレファレンス種子)を含む種子、又はイベントEE−GM3及びEE−GM1を含む種子(アクセッション番号PTA−11041の下にATCCに寄託されている該イベントを含むレファレンス種子)を含む種子であり、これは除草剤に対して耐性である、特にグリホセート及び/又はHPPD阻害剤、例えばイソキサフルトール及び/又はグルタミン合成酵素阻害剤、例えばグルホシネートに対して耐性であるダイズ植物に成長することになる。
本発明の1つの実施形態は優良イベントEE−GM3(アクセッション番号NCIMB41659としてNCIMBに寄託されている該イベントを含むレファレンス種子)を含み、そして更に優良イベントEE−GM2(アクセッション番号NCIMB41660としてNCIMBに寄託されている該イベントを含むレファレンス種子)を含む種子、又はイベントEE−GM3及びEE−GM2を含む種子(アクセッション番号PTA−11042の下にATCCに寄託されている該イベントを含むレファレンス種子)を含む種子であり、これは除草剤に対して耐性である、特にグリホセート及び/又はHPPD阻害剤、例えばイソキサフルトール及び/又はグルタミン合成酵素阻害剤、例えばグルホシネートに対して耐性であるダイズ植物に成長することになる。
NCIMB寄託番号NCIMB41659の種子は、成長して除草剤耐性植物となる優良イベントEE−GM3を含むトランスジェニック種子の少なくとも約95%よりなる種子ロットであり、ここで植物はグリホセート及び/又はイソキサフルトール耐性となる。寄託した種子から得ることが可能か得られている種子又は子孫種子(例えば異なる遺伝子的背景を有する他のダイズ植物との交雑の後)を播種することができ、そして成長植物を本明細書に記載する通りグリホセート又はHPPD阻害剤、例えばイソキサフルトールで処理することにより優良イベントEE−GM3を含むグリホセート又はイソキサフルトール耐性植物を得ることができる。NCIMB寄託番号NCIMB41658及びNCIMB41660の種子は、成長して除草剤耐性植物となる優良イベントEE−GM1又はEE−GM2をそれぞれ含むトランスジェニック種子の少なくとも約95%よりなる種子ロットである。種子は播種することができ、そして成長植物を本明細書に記載する通りグルホシネートで処理することにより優良イベントEE−GM1及びEE−GM2を含むグルホシネート耐性植物を得ることができる。ATCC寄託番号PTA−11041の種子は、成長して除草剤耐性植物となる優良イベントEE−GM3及び優良イベントEE−GM1をホモ接合型において含むトランスジェニック種子の少なくとも約95%よりなる種子ロットであり、ここで植物はグリホセート、グルホシネート及び/又はイソキサフルトール耐性となる。寄託した種子から得ることが可能か得られている種子又は子孫種子(例えば異なる遺伝子的背景を有する他のダイズ植物との交雑の後)を播種することができ、そして成長植物を本明細書に記載する通りグリホセート、グルホシネート又はHPPD阻害剤、例えばイソキサフルトールで処理することにより優良イベントEE−GM3及びEE−GM1を含むグリホセート、グルホシネート及び/又はイソキサフルトール耐性植物を得ることができる。ATCC寄託番号PTA−11042の種子は、成長して除草剤耐性植物となる優良イベントEE−GM3及び優良イベントEE−GM2をホモ接合型において含むトランスジェニック種子の少なくとも約95%よりなる種子ロットであり、ここで植物はグリホセート、グルホシネート及び/又はイソキサフルトール耐性となる。寄託した種子から得ることが可能か得られている種子又は子孫種子(例えば異なる遺伝子的背景を有する他のダイズ植物との交雑の後)を播種することができ、そして成長植物を本明細書に記載する通りグリホセート、グルホシネート又はHPPD阻害剤、例えばイソキサフルトールで処理することにより優良イベントEE−GM3及びEE−GM2を含むグリホセート、グルホシネート及び/又はイソキサフルトール耐性植物を得ることができる
本発明は更に、優良イベントEE−GM3を含み、そして更に優良イベントEE−GM1を含む細胞、組織、子孫、及び後継物に関する。そしてこれらをPTA−11041としてATCCに寄託されている優良イベントEE−GM3及びEE−GM1を含む植物を生育させるか、アクセッション番号NCIMB41659を有するNCIMBに寄託されている種子から生育させた優良イベントEE−GM3を含む植物を生育させ、そして該植物をアクセッション番号NCIMB41658を有するNCIMBに寄託されている種子から生育させた優良イベントEE−GM1を含む植物と交雑させることにより得てよい。本発明は又、優良イベントEE−GM3を含む、細胞、組織、子孫、及び後継物に関する。そしてこれらを更に優良イベントEE−GM2を含み、そしてPTA−11042としてATCCに寄託されている優良イベントEE−GM3及びEE−GM2を含む植物を生育させるか、アクセッション番号NCIMB41659を有するNCIMBに寄託されている種子から生育させた優良イベントEE−GM3を含む植物を生育させ、そして該植物をアクセッション番号NCIMB41660を有するNCIMBに寄託されている種子から生育させた優良イベントEE−GM2を含む植物と交雑させることにより得てよい。本発明は更に直前に記載したダイズ植物又はダイズ種子から(例えばその増殖及び/又はそれとの繁殖によって)得ることが可能な植物に関する。本発明は又優良イベントEE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM3及びEE−GM2を含むダイズ植物に関する。
本発明は更に優良イベントE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM3及びEE−GM2を含むトランスジェニック植物、又はその細胞又は組織を識別するための方法に関し、その方法は、トランスジェニック植物、細胞又は組織における、特徴的DNA配列又はそのようなDNAによりコードされるアミノ酸の存在を識別することに基づいている。本発明の好ましい実施形態によれば、そのような特徴的DNA配列は、少なくとも15bp、15bp、少なくとも20bp、20bp、又は30bp以上の配列であり、これはイベントの挿入部位、即ち除草剤耐性遺伝子を含む挿入された外来性DNAの一部及びそれに隣接するダイズゲノムの一部(5’又は3’フランキング領域の何れか)の両方を含み、これにより優良イベントの特異的識別が可能になる。
本発明は更に、生物学的試料中の優良イベントE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM3及びEE−GM2を識別するための方法に関し、その方法はE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM3及びEE−GM2の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’及び/又は3’フランキング配列を特異的に認識するプライマー又はプローブに基づいている。
より特定すれば、本発明は、各々がプライマーの少なくとも2つによる2つのポリメラーゼ連鎖反応又は、プライマーの少なくとも4つによるポリメラーゼ連鎖反応の1つを用いて生物学的試料中に存在する2つの核酸の配列を増幅することを含む方法に関し、第1のプライマーはEE−GM3の除草剤耐性遺伝子を含む除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’又は3’フランキング領域を認識し、第2のプライマーはEE−GM3の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNA内部の配列を認識し、第3のプライマーはEE−GM3又はEE−GM2の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’又は3’フランキング領域を認識し、そして第4のプライマーはEE−GM1又はEE−GM2の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNA内部の配列を認識し、これにより好ましくは100bp〜800bpのDNAフラグメントが得られる。EE−GM3を識別するためのプライマーはEE−GM3の5’フランキング領域内部(配列番号2、1位から1451位まで)又はEE−GM3の3’フランキング領域内部(配列番号3の241位から1408位までの相補体)の配列及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNA内部の配列(配列番号2の1452から1843位までの相補体又は配列番号3の1位から240位まで、又は配列番号3のヌクレオチド位置1452からヌクレオチド位置16638まで又はその相補体)をそれぞれ認識してよい。3’フランキング領域を認識するプライマーは配列番号5のヌクレオチド配列を含んでよく、そして、除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNA内部の配列を認識するプライマーは本明細書に記載する配列番号4又は配列番号7のヌクレオチド配列を含んでよい。EE−GM1を識別するためのプライマーはEE−GM1の5’フランキング領域内部(配列番号12、1位から209位まで)又はEE−GM1の3’フランキング領域内部(配列番号13の569位から1000位までの相補体)の配列及びEE−GM1の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNA内部の配列(配列番号12の210から720位までの相補体又は配列番号13の1位から568位まで)をそれぞれ認識してよい。EE−GM1の5’フランキング領域を認識するプライマーは配列番号16のヌクレオチド配列を含んでよく、そして、EE−GM1の外来性DNA内部の配列を認識するプライマーは本明細書に記載する配列番号17のヌクレオチド配列を含んでよい。EE−GM2を識別するためのプライマーはEE−GM2の5’フランキング領域内部(配列番号14、1位から311位まで)又はEE−GM2の3’フランキング領域内部(配列番号15の508位から1880位までの相補体)の配列及びEE−GM1の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNA内部の配列(配列番号14の312から810位までの相補体又は配列番号15の1位から507位まで)をそれぞれ認識してよい。EE−GM2の3’フランキング領域を認識するプライマーは配列番号18のヌクレオチド配列を含んでよく、そして、EE−GM2の外来性DNA内部の配列を認識するプライマーは本明細書に記載する配列番号19のヌクレオチド配列を含んでよい。PCR増幅は同時又は逐次的に行ってよい。
本発明は生物学的試料中の優良イベントEE−GM3及びEE−GM1を識別するための方法により特定的に関連しており、その方法は、約263bpのDNAフラグメントを得るためのそれぞれ配列番号4及び配列番号5のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に)なる2つのプライマーによるか、又は約706bpのDNAフラグメントを得るためのそれぞれ配列番号5及び配列番号7のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に)なる2つのプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応及び約183bpのDNAフラグメントを得るためのそれぞれ配列番号16及び配列番号17のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に)なる2つのプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いて生物学的試料中に存在する核酸の少なくとも2つの配列を増幅することを含む。2つのポリメラーゼ連鎖反応は同時又は逐次的に行ってよい。
本発明は生物学的試料中の優良イベントEE−GM3及びEE−GM2を識別するための方法により特定的に関連しており、その方法は、約263bpのDNAフラグメントを得るためのそれぞれ配列番号4及び配列番号5のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に)なる2つのプライマーによるか、又は約706bpのDNAフラグメントを得るためのそれぞれ配列番号5及び配列番号7のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に)なる2つのプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応及び約151bpのDNAフラグメントを得るためのそれぞれ配列番号18及び配列番号19のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に)なる2つのプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いて生物学的試料中に存在する核酸少なくとも2つの配列を増幅することを含む。2つのポリメラーゼ連鎖反応は同時又は逐次的に行ってよい。
本発明は更に生物学的試料中のEE−GM3及びEE−GM1の同時存在に関する特異的識別方法を開発するために使用できるEE−GM1の特異的フランキング配列と組み合わせた本明細書に記載したEE−GM3の特異的フランキング配列に関する。そのような複合的な特異的フランキング配列は識別アッセイにおいてレファレンス対照物質として使用してよい。より特記すれば、本発明は本明細書において更に記載する特異的プライマー及びプローブの開発のために使用できるEE−GM1の5’及び/又は3’フランキング領域と組み合わせたEE−GM3の5’及び/又は3’フランキング領域に関する。レファレンス物質として類似に適するものは、配列番号16及び配列番号17のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に)なるプライマーにより増幅できる配列を含む核酸分子と組み合わせて配列番号7及び配列番号5又は配列番号4及び配列番号5のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に)なるプライマーにより増幅できる配列を含む、好ましくは約150〜850bpの核酸分子であり、特にそのような核酸分子はEE−GM3及びEE−GM1を含む物質中でそのようなプライマーを使用して得られる。
本発明は更に又、生物学的試料中のEE−GM3及びEE−GM2の同時存在に対する特異的識別方法を開発するために使用できるEE−GM2の特異的フランキング配列と組み合わせた本明細書に記載したEE−GM3の特異的フランキング配列に関する。そのような複合的な特異的フランキング配列は識別アッセイにおいてレファレンス対照物質として使用してよい。より特記すれば、本発明は本明細書において更に記載する特異的プライマー及びプローブの開発のために使用できるEE−GM2の5’及び/又は3’フランキング領域と組み合わせたEE−GM3の5’及び/又は3’フランキング領域に関する。レファレンス物質として類似に適するものは、配列番号18及び配列番号19のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に)なるプライマーにより増幅できる配列を含む核酸分子と組み合わせて配列番号7及び配列番号5又は配列番号4及び配列番号5のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に)なるプライマーにより増幅できる配列を含む、好ましくは約150〜850bpの核酸分子であり、特にそのような核酸分子はEE−GM3及びEE−GM2を含む物質中でそのようなプライマーを使用して得られる。
本発明は更にこのような特異的プライマー又はプローブの使用に基づく生物学的試料中のEE−GM3及びEE−GM1の同時存在に対する識別方法に関する。EE−GM3検出のためのプライマーは、配列番号1のヌクレオチド配列から選択される17から約200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列、例えば配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までのヌクレオチド配列の相補体又はヌクレオチド1からヌクレオチド240までの配列番号3のヌクレオチド配列から選択される17から約200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、それよりなるか、又はそれより本質的になるプライマーと組み合わせられた、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列又は配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までのヌクレオチド配列の相補体から選択される連続ヌクレオチド17から約200のヌクレオチド配列を含むか、それよりなるか、又はそれより本質的になる。EE−GM1検出のためのプライマーは、配列番号11のヌクレオチド配列から選択される17から約200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列、例えば配列番号12のヌクレオチド219からヌクレオチド720までのヌクレオチド配列の相補体又は配列番号13のヌクレオチド1からヌクレオチド568までのヌクレオチド配列から選択される17から約200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、それよりなるか、又はそれより本質的になるプライマーと組み合わせられた、配列番号12のヌクレオチド1からヌクレオチド209までのヌクレオチド配列又は配列番号13のヌクレオチド569からヌクレオチド1000までのヌクレオチド配列の相補体から選択される連続ヌクレオチド17から約20のヌクレオチド配列を含むか、それよりなるか、又はそれより本質的になる。プライマーは又、それらの3’最末端に所在するこれらのヌクレオチド配列を含んでよく、そして更に無関係の配列又は記載したヌクレオチド配列から誘導されるが、ミスマッチを含む配列を含んでもよい。
本発明は更にこのような特異的プライマー又はプローブの使用に基づく生物学的試料中のEE−GM3及びEE−GM2の同時存在に対する識別方法に関する。EE−GM3検出のためのプライマーは、前パラグラフに記載する通り17から約200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、それよりなるか、又はそれより本質的になってよい。EE−GM2検出のためのプライマーは、配列番号11のヌクレオチド配列から選択される17から約200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列、例えば配列番号14のヌクレオチド312からヌクレオチド810までのヌクレオチド配列の相補体又は配列番号15のヌクレオチド1からヌクレオチド507までのヌクレオチド配列から選択される17から約200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、それよりなるか、又はそれより本質的になるプライマーと組み合わせられた、配列番号14のヌクレオチド1からヌクレオチド311までのヌクレオチド配列又は配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までのヌクレオチド配列の相補体から選択される連続ヌクレオチド17から約20のヌクレオチド配列を含むか、それよりなるか、又はそれより本質的になる。プライマーは又、それらの3’最末端に所在するこれらのヌクレオチド配列を含んでよく、そして更に無関係の配列又は記載したヌクレオチド配列から誘導されるが、ミスマッチを含む配列を含んでもよい。
本発明は更に生物学的試料中の優良イベントEE−GM3及びEE−GM1を識別するためのキットに関し、該キットはEE−GM3の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’又は3’フランキング領域を特異的に認識するプライマー又はプローブの少なくとも1つ及びEE−GM1の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’又は3’フランキング領域を特異的に認識するプライマー又はプローブの少なくとも1つを含む。
本発明は更に生物学的試料中の優良イベントEE−GM3及びEE−GM2を識別するためのキットに関し、該キットはEE−GM3の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’又は3’フランキング領域を特異的に認識するプライマー又はプローブの少なくとも1つ及びEE−GM2の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’又は3’フランキング領域を特異的に認識するプライマー又はプローブの少なくとも1つを含む。
本発明のキットは、PCR識別プロトコルにおける使用のために、EE−GM3の5’又は3’フランキング領域及びEE−GM1の5’又は3’フランキング領域を特異的に認識するプライマーに加えて、EE−GM3の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNA内部の配列を特異的に認識する更なるプライマー、及び、EE−GM1の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNA内部の配列を特異的に認識する更なるプライマーを含んでよい。
本発明のキットは、PCR識別プロトコルにおける使用のために、EE−GM3の5’又は3’フランキング領域及びEE−GM2の5’又は3’フランキング領域を特異的に認識するプライマーに加えて、EE−GM3の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNA内部の配列を特異的に認識する更なるプライマー、及び、EE−GM2の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNA内部の配列を特異的に認識する更なるプライマーを含んでよい。
EE−GM3の3’フランキング領域を認識するプライマーは配列番号5のヌクレオチド配列を含んでよく、そして導入遺伝子即ちEE−GM3の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAを認識するプライマーは配列番号4又は7のヌクレオチド配列を含んでよく、或いは、本明細書に記載する何れかの他のプライマー又はプライマーの組み合わせは、配列番号16のヌクレオチド配列を含んでよいEE−GM1の5’フランキング領域を認識するプライマー、及び、EE−GM1の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの導入遺伝子を認識するプライマーと組み合わせられて、配列番号17のヌクレオチド配列を含んでよい。
EE−GM3の3’フランキング領域を認識するプライマーは配列番号5のヌクレオチド配列を含んでよく、そして導入遺伝子即ちEE−GM3の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAを認識するプライマーは配列番号4又は7のヌクレオチド配列を含んでよく、或いは、本明細書に記載する何れかの他のプライマー又はプライマーの組み合わせは、配列番号18のヌクレオチド配列を含んでよいEE−GM2の5’フランキング領域を認識するプライマー、及び、EE−GM2の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの導入遺伝子を認識するプライマーと組み合わせられて、配列番号19のヌクレオチド配列を含んでよい。
本発明は更に、EE−GM3/EE−GM1PCRに基づく識別における使用のための、配列番号5及び配列番号4のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に)なるPCRプライマー及び配列番号16及び配列番号17のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に)なるPCRプライマーをキットが含んでいる、生物学的試料中の優良イベントEE−GM3及びEE−GM1を識別するための該キットに関する。
本発明は更に、EE−GM3/EE−GM2PCRに基づく識別における使用のための、配列番号5及び配列番号4のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に)なるPCRプライマー及び配列番号18及び配列番号19のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に)なるPCRプライマーをキットが含んでいる、生物学的試料中の優良イベントEE−GM3及びEE−GM2を識別するための該キットに関する。
本発明は又、EE−GM3の特異的領域との80%〜100%配列同一性を有する配列に相当する(又はそれに相補な)配列を含むかそれより(本質的に)なる第1のプローブ及びEE−GM1の特異的領域との80%〜100%配列同一性を有する配列に相当する(又はそれに相補な)配列を含むかそれより(本質的に)なる第2のプローブをキットが含む、生物学的試料中の優良イベントEE−GM3及びEE−GM1を識別するための該キットに関する。好ましくは、第1のプローブの配列はEE−GM3の5’又は3’フランキング領域の部分を含む特異的領域に相当し、そして第2のプローブの配列はEE−GM1の5’又は3’フランキング領域の部分を含む特異的領域に相当する。より好ましくは、EE−GM3特異的プローブは配列番号2のヌクレオチド1441から1462の配列と80%〜100%の配列同一性を有する配列又は配列番号3のヌクレオチド220から260の配列と80%〜100%の配列同一性を有する配列含むかそれより(本質的に)なり(又はそれに相補であり)、そしてEE−GM1特異的プローブは配列番号12のヌクレオチド199から220の配列と80%〜100%の配列同一性を有する配列又は配列番号13のヌクレオチド558から579の配列と80%〜100%の配列同一性を有する配列含むかそれより(本質的に)なる(又はそれに相補である)。
本発明は又、EE−GM3の特異的領域との80%〜100%配列同一性を有する配列(又はそれに相補な)に相当する配列を含むかそれより(本質的に)なる第1のプローブ及びEE−GM2の特異的領域との80%〜100%配列同一性を有する配列に相当する(又はそれに相補な)配列を含むかそれより(本質的に)なる第2のプローブをキットが含む、生物学的試料中の優良イベントEE−GM3及びEE−GM2を識別するための該キットに関する。好ましくは、第1のプローブの配列はEE−GM3の5’又は3’フランキング領域の部分を含む特異的領域に相当し、そして第2のプローブの配列はEE−GM2の5’又は3’フランキング領域の部分を含む特異的領域に相当する。より好ましくは、EE−GM3特異的プローブは配列番号2のヌクレオチド1441から1462の配列と80%〜100%の配列同一性を有する配列又は配列番号3のヌクレオチド220から260の配列と80%〜100%の配列同一性を有する配列含むかそれより(本質的に)なり(又はそれに相補であり)、そしてEE−GM2特異的プローブは配列番号14のヌクレオチド301から322の配列と80%〜100%の配列同一性を有する配列又は配列番号15のヌクレオチド497から518の配列と80%〜100%の配列同一性を有する配列含むかそれより(本質的に)なる(又はそれに相補である)。
本発明の別の側面によれば、イベントのジャンクション部位、及び、各イベントのダイズゲノムDNA及び除草剤耐性遺伝子(導入遺伝子)を含む外来性DNAの両方のポリヌクレオチドの十分な長さを含み、これにより、EE−GM3及びEE−GM1の検出のためのプライマーとして有用であるDNA配列が開示される。そのような配列はEE−GM3又はEE−GM1のダイズゲノムDNAのヌクレオチドの少なくとも9つ、及び、除草剤耐性遺伝子(導入遺伝子)を含む外来性DNAのヌクレオチドの類似数を、それぞれジャンクション部位の各側に含んでよい。最も好ましくは、そのようなDNA配列は配列番号2又は配列番号3のジャンクション部位に隣接するダイズゲノムDNAのヌクレオチドの少なくとも9つ及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAのヌクレオチドの類似数、及び、配列番号12又は配列番号13のジャンクション部位に隣接するダイズゲノムDNAのヌクレオチドの少なくとも9つ及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAのヌクレオチドの類似数を含む。
本発明の更に別の側面によれば、イベントのジャンクション部位、及び、各イベントのダイズゲノムDNA及び除草剤耐性遺伝子(導入遺伝子)を含む外来性DNAの両方のポリヌクレオチドの十分な長さを含み、これにより、EE−GM3及びEE−GM2の検出のためのプライマーとして有用であるDNA配列が開示される。そのような配列はEE−GM3又はEE−GM2のダイズゲノムDNAのヌクレオチドの少なくとも9つ、及び、除草剤耐性遺伝子(導入遺伝子)を含む外来性DNAのヌクレオチドの類似数を、それぞれジャンクション部位の各側に含んでよい。最も好ましくは、そのようなDNA配列は配列番号2又は配列番号3のジャンクション部位に隣接するダイズゲノムDNAのヌクレオチドの少なくとも9つ及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAのヌクレオチドの類似数、及び、配列番号14又は配列番号15のジャンクション部位に隣接するダイズゲノムDNAのヌクレオチドの少なくとも9つ及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAのヌクレオチドの類似数を含む。
本発明により包含される方法及びキットは種々の目的、例えば限定しないが、植物、植物性物質又は製品、例えば限定しないが、植物性物質を含むかこれより誘導された食品又は飼料製品(生鮮品又は加工品)の中のEE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM3及びEE−GM2の存在を識別するかその(下限)閾値を決定するために使用することができ;追加的又は代替的に、本発明の方法及びキットはトランスジェニック及び非トランスジェニックの物質の間の分離を目的としてトランスジェニック植物を識別するために使用することができ;追加的又は代替的に、本発明の方法及びキットはEE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM3及びEE−GM1を含む植物性物質の品質(即ちパーセンテージ純物質)を決定するために使用できる。
本発明は更に、EE−GM1又はEE−GM2の5’及び/又は3’フランキング配列から開発された特異的プライマー及びプローブと組み合わせたEE−GM3の5’及び/又は3’フランキング領域、並びにEE−GM1又はEE−GM2の5’及び/又は3’フランキング配列から発生させた特異的プライマー及びプローブと組み合わせたEE−GM3の5’及び/又は3’フランキング配列から開発された特異的プライマー及びプローブに関する。
本発明は又、優良イベントEE−GM3及びEE−GM1を含む植物又は優良イベントEE−GM3及びEE−GM2を含む植物から得られるゲノムDNAに関する。そのようなゲノムDNAは本明細書に記載する識別アッセイにおけるレファレンス対照物質として使用してよい。
ここでまた提供されるものは、優良イベントの少なくとも2つを各々が含むトランスジェニックの除草剤耐性ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子又は子孫であり、該第1の優良イベントは下記:
i)植物発現可能なプロモーターの制御下にグリホセート耐性EPSPS酵素をコードするトウモロコシ(Zea mays)に由来する修飾されたepsps遺伝子を含む第1のキメラ遺伝子;及び、
ii)植物発現可能なプロモーターの制御下にHPPD阻害剤除草剤耐性酵素をコードするシュードモナスフルオレスセンス(Pseudomonas fluorescens)に由来する修飾されたhppd遺伝子を含む第2のキメラ遺伝子;
を含む外来性DNAを含み、そして該第2の優良イベントは植物発現可能なプロモーターの制御下にグルホシネート(又はホスフィノスリシン)アセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするストレプトミセスビリドクロモゲンス(Streptomyces viridochromogenes)から誘導された修飾されたグルホシネート耐性遺伝子を含む(第3の)キメラ遺伝子を含む。
1つの実施形態において、該第1の優良イベントは該外来性DNAの直近上流にありそれに隣接している配列番号2のヌクレオチド1から1451及び該外来性DNAの直近下流に有りそれに隣接している配列番号3のヌクレオチド241から1408を含み、そして該第2の優良イベントは該外来性DNAの直近上流にありそれに隣接している配列番号12のヌクレオチド1から209及び該外来性DNAの直近下流に有りそれに隣接している配列番号13のヌクレオチド569から1000を含むか、又は、該第2の優良イベントは該外来性DNAの直近上流にありそれに隣接している配列番号14のヌクレオチド1から311及び該外来性DNAの直近下流に有りそれに隣接している配列番号15のヌクレオチド508から1880を含む。
その他の実施形態においては、該優良イベントは、寄託番号PTA−11041又はPTA−11042の下にATCCに寄託されている該イベントを含むレファレンス種子から生育させたダイズ植物と繁殖させることにより得ることができ、或いは、アクセッション番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されている該第1のイベントを含むレファレンス種子から得ることができ、そして、アクセッション番号NCIMB41658及びNCIMBアクセッション番号41660の下にNCIMBに寄託されている該第2のイベントを含むレファレンス種子から得ることができる。
別の実施形態において、該ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子又は子孫のゲノムDNAは、それぞれ配列番号4及び配列番号5のヌクレオチド配列を含む2つのプライマーにより該第1の優良イベントに関する優良イベント識別プロトコルを用いて分析した場合に、約263bp又は263bpのDNAフラグメントを与え、そして、該第2の優良イベントに関する優良イベント識別プロトコルを用いて分析した場合に、それぞれ配列番号16及び配列番号17のヌクレオチド配列を含む2つのプライマーによれば約183bp又は183bpのDNAフラグメントを与えるか、それぞれ配列番号18及び配列番号19のヌクレオチド配列を含む2つのプライマーによれば約151bp又は151bpのDNAフラグメントを与える。
ここでまた提供されるものは、2つの優良イベントを含むトランスジェニックダイズ植物、又はその細胞、部分、種子又は子孫を識別するための方法であり、ここで該植物、細胞、種子又は子孫は生物学的試料中のグリホセート、グルホシネートおよびHPPD阻害剤除草剤(例えばイソキサフルトール)に対して耐性であり、該方法は、少なくとも2つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて生物学的試料中に存在する該第1のイベントの核酸から100〜500bpのDNAフラグメントを増幅すること、ただしここで該プライマーの一方は、上記特定した第1の優良イベントの5’フランキング領域、ここで該5’フランキング領域は配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列を含む、又は、該第1の優良イベントの3’フランキング領域、ここで該3’フランキング領域は配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体のヌクレオチド配列を含む、を認識し、該プライマーの他方のプライマーは、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体のヌクレオチド配列又は配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列を含む該第1のイベントの外来性DNAの配列を認識する、を含み、そして、少なくとも2つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて生物学的試料中に存在する該第2のイベントの核酸から50〜1000bp、又は100〜500bpのDNAフラグメントを増幅すること、ただしここで該プライマーの一方は、上記特定した第2の優良イベントの5’フランキング領域、ここで該5’フランキング領域は配列番号12のヌクレオチド1から209までのヌクレオチド配列を含む、又は、該第2の優良イベントの3’フランキング領域、ここで該3’フランキング領域は配列番号13のヌクレオチド569から1000までの相補体のヌクレオチド配列を含む、を認識し、該プライマーの他方のプライマーは、配列番号12のヌクレオチド210からヌクレオチド720までの相補体のヌクレオチド配列又は配列番号13のヌクレオチド1からヌクレオチド568までのヌクレオチド配列を含む該第2のイベントの外来性DNA内部の配列を認識する、を含む。
ここでまた提供されるものは、2つの優良イベントを含むトランスジェニックダイズ植物、又はその細胞、部分、種子又は子孫を識別するための方法であり、ここで該植物、細胞、種子又は子孫は生物学的試料中のグリホセート、グルホシネートおよびHPPD阻害剤除草剤(例えばイソキサフルトール)に対して耐性であり、該方法は少なくとも2つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて生物学的試料中に存在する該第1のイベントの核酸から50〜1000又は100〜500bpのDNAフラグメントを増幅すること、ただしここで該プライマーの一方は、上記特定した第1の優良イベントの5’フランキング領域、ここで該5’フランキング領域は配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列を含む、又は、該第1の優良イベントの3’フランキング領域、ここで該3’フランキング領域は配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体のヌクレオチド配列を含む、を認識し、該プライマーの他方のプライマーは、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体のヌクレオチド配列又は配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列を含む該第1のイベントの外来性DNA内部の配列を認識する、を含み、そして、少なくとも2つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて生物学的試料中に存在する該第2のイベントの核酸から50〜1000bp、又は100〜50bpのDNAフラグメントを増幅すること、ただしここで該プライマーの一方は上記特定した第2の優良イベントの5’フランキング領域、ここで該5’フランキング領域は配列番号14のヌクレオチド1から311までのヌクレオチド配列を含む、又は、該第2の優良イベントの3’フランキング領域、ここで該3’フランキング領域は配列番号15のヌクレオチド508から1880までの相補体のヌクレオチド配列を含む、を認識し、該プライマーの他方のプライマーは、配列番号14のヌクレオチド312からヌクレオチド810までの相補体のヌクレオチド配列又は配列番号15のヌクレオチド1からヌクレオチド507までのヌクレオチド配列を含む該第2のイベントの外来性DNA内部の配列を認識する、を含む。
ここでまた提供されるものは、2つの優良イベントを含みそして生物学的試料中のグリホセート、グルホシネート及びHPPD阻害剤(例えばイソキサフルトール)に対して耐性なトランスジェニックダイズ植物、又はその細胞、部分、種子又は子孫を識別するためのキットであり、該キットは上記特定した第1の優良イベントの5’フランキング領域を認識する1つのプライマー、ここで該5’フランキング領域は配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列を含む、又は、上記第1の優良イベントの3’フランキング領域を認識する1つのプライマー、ここで該3’フランキング領域は配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体のヌクレオチド配列を含む、及び、該第1の外来性DNA内部の配列を認識する1つのプライマー、ここで該外来性DNAは配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体のヌクレオチド配列又は配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列を含む、を含み、そして、該キットは、上記特定した第2の優良イベントの5’フランキング領域を認識する1つのプライマー、ここで該5’フランキング領域は配列番号12のヌクレオチド1から209までのヌクレオチド配列を含む、又は、上記第2の優良イベントの3’フランキング領域を認識する1つのプライマー、ここで該3’フランキング領域は配列番号13のヌクレオチド569から1000までの相補体のヌクレオチド配列を含む、及び、配列番号12のヌクレオチド210からヌクレオチド720までの相補体のヌクレオチド配列又は配列番号13のヌクレオチド1からヌクレオチド568までのヌクレオチド配列を含む該第2のイベントの外来性DNA内部の配列を認識する該プライマーの他のプライマー、を含む。
ここでまた提供されるものは、2つの優良イベントを含みそして生物学的試料中のグリホセート、グルホシネート及びHPPD阻害剤(例えばイソキサフルトール)に対して耐性なトランスジェニックダイズ植物、又はその細胞、部分、種子又は子孫を識別するためのキットであり、該キットは上記特定した第1の優良イベントの5’フランキング領域を認識する1つのプライマー、ここで該5’フランキング領域は配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列を含む、又は、上記第1の優良イベントの3’フランキング領域を認識する1つのプライマー、ここで該3’フランキング領域は配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体のヌクレオチド配列を含む、及び、該第1の外来性DNA内部の配列を認識する1つのプライマー、ここで該外来性DNAは配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体のヌクレオチド配列又は配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列を含む、を含み、そして、該キットは、上記特定した第2の優良イベントの5’フランキング領域、ここで該5’フランキング領域は配列番号14のヌクレオチド1から311までのヌクレオチド配列を含む、又は、上記第2の優良イベントの3’フランキング領域、ここで該3’フランキング領域は配列番号15のヌクレオチド508から1880までの相補体のヌクレオチド配列を含む、を認識する1つのプライマー、及び、配列番号14のヌクレオチド312からヌクレオチド810までの相補体のヌクレオチド配列又は配列番号15のヌクレオチド1からヌクレオチド507までのヌクレオチド配列を含む該第2のイベントの外来性DNA内部の配列を認識する該プライマーの他のプライマー、を含む。
ここでまた提供されるものは、配列番号20のヌクレオチド位置1452からヌクレオチド位置16638までのヌクレオチド配列との少なくとも97、98又は少なくとも99%配列同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号20のヌクレオチド位置2257からヌクレオチド位置16601までのヌクレオチド配列又はその相補体、又は配列番号20との少なくとも97、98又は少なくとも99%又は99.5%配列同一性を有するヌクレオチド配列、又はその相補体を含む核酸分子を自身のゲノム中に含み、そしてEE−GM1又はEE−GM2のヌクレオチド配列との少なくとも97、98又は少なくとも99%又は99.5%配列同一性を有するヌクレオチド配列、又はその相補体を含む核酸分子を自身のゲノム中に含む、ダイズ植物、植物細胞、組織又は種子、寄託番号NCIMB41658の下に寄託されているEE−GM1を含むレファレンス種子、及び寄託番号NCIMB41660の下に寄託されているEE−GM2を含むレファレンス種子である。本発明の1つの実施形態において、該植物、植物細胞、組織又は種子におけるEE−GM1又はEE−GM2のヌクレオチド配列は、配列番号12又は13中のDNA配列(例えば外来性DNA配列)、又は配列番号14又は15中のDNA配列(例えば外来性DNA配列)、又は配列番号12の配列の第1のヌクレオチドと配列番号13の配列の最後のヌクレオチドの間にある配列番号12及び13を含む植物ゲノム(例えば本発明のEE−GM1又はEE−GM2を含む寄託された種子)中のDNA配列、又は配列番号14の配列の第1のヌクレオチドと配列番号15の配列の最後のヌクレオチドの間にある配列番号14及び15を含む植物ゲノム中のDNA配列である。
本発明の1つの実施形態は、配列番号20のヌクレオチド位置1452からヌクレオチド位置16638までのヌクレオチド配列又はその相補体にハイブリダイズするか、又は、配列番号20のヌクレオチド配列又はその相補体にハイブリダイズする核酸分子を自身のゲノム内に含み、そして、EE−GM1又はEE−GM2のヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸分子を自身のゲノム内に含む、ダイズ植物、植物細胞、組織又は種子、寄託番号NCIMB41658の下に寄託されているEE−GM1を含むレファレンス種子、及び寄託番号NCIMB41660の下に寄託されているEE−GM2を含むレファレンス種子である。本発明の1つの実施形態において、該植物、植物細胞、組織又は種子におけるEE−GM1又はEE−GM2のヌクレオチド配列は、配列番号12又は13中の外来性DNA配列、又は配列番号14又は15中の外来性DNA配列、又は配列番号12の配列の第1のヌクレオチドと配列番号13の配列の最後のヌクレオチドの間にある配列番号12及び13を含む植物ゲノム(例えば本発明のEE−GM1又はEE−GM2を含む寄託された種子)中の外来性DNA配列、又は配列番号14の配列の第1のヌクレオチドと配列番号15の配列の最後のヌクレオチドの間にある配列番号14及び15を含む植物ゲノム中の外来性DNA配列である。
以下の実施例は記載した特異的実施形態に本発明を限定する意図はなく、以下に示す参照により本明細書に組み込まれる添付の図面との関連において理解してよい。
図1は優良イベントEE−GM3に関する引用したヌクレオチド配列とプライマーの間の関係の模式図である。黒色バー:外来性DNA;線影バー:植物起源のDNA;チェッカー柄の矢印(a):キメラHPPD PFW366コード遺伝子(キメラ遺伝子の組成については表1参照);線影矢印(b):キメラ2mEPSPSコード遺伝子(キメラ遺伝子の組成については表1参照);黒矢印:オリゴヌクレオチドプライマー、バー下の数字はヌクレオチド位置を示す;(c)は示したヌクレオチド配列の相補体を指す;注記:スキームは正確な縮尺で描かれていない。 図2はEE−GM3に関して開発されたPCR識別プロトコルにより得られた結果を示す。ゲルにロードした配列:レーン1:分子量マーカー(100bpラダー);レーン2及び3:トランスジェニックイベントEE−GM3を含むダイズ植物に由来するDNA試料;レーン4〜7:優良イベントEE−GM3を含まないが同じ除草剤耐性遺伝子を含む(他の形質転換イベント)トランスジェニックダイズ植物に由来するDNA試料;レーン8:野生型ダイズに由来するDNA試料;レーン9:無鋳型DNA対照;レーン10:分子量マーカー。 図3は優良イベントEE−GM1に関する引用したヌクレオチド配列とプライマーの間の関係の模式図である。黒色バー:外来性DNA;線影バー:植物起源のDNA;水平ストライプ矢印(d):キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子(キメラ遺伝子の組成に関しては配列番号11参照);黒矢印:オリゴヌクレオチドプライマー、バー下の数字はヌクレオチド位置を示す;(c)は示したヌクレオチド配列の相補体を指す;注記:スキームは正確な縮尺で描かれていない。 図4は優良イベントEE−GM2に関する引用したヌクレオチド配列とプライマーの間の関係の模式図である。黒色バー:外来性DNA;線影バー:植物起源のDNA;水平ストライプ矢印(d):キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子(キメラ遺伝子の組成に関しては配列番号11参照);黒矢印:オリゴヌクレオチドプライマー、バー下の数字はヌクレオチド位置を示す;(c)は示したヌクレオチド配列の相補体を指す;NA:適用外;注記:スキームは正確な縮尺で描かれていない。 図5はEE−GM1に関して開発されたPCR 識別を示す。ゲルにロードした配列:レーン1:トランスジェニックイベントEE−GM1を含むダイズ植物に由来するDNA試料;レーン2:優良イベントEE−GM1を含まないトランスジェニックダイズ植物に由来するDNA試料;レーン3:野生型ダイズ植物に由来する対照DNA試料;レーン4:無鋳型対照;レーン5:分子量マーカー。 図6はEE−GM2に関して開発されたPCR 識別を示す。ゲルにロードした配列:レーン1:トランスジェニックイベントEE−GM2を含むダイズ植物に由来するDNA試料;レーン2:優良イベントEE−GM2を含まないトランスジェニックダイズ植物に由来するDNA試料;レーン3:野生型ダイズ植物に由来する対照DNA試料;レーン4:無鋳型対照;レーン5:分子量マーカー。
植物ゲノム中の組み換えDNA分子の取り込みは典型的には細胞又は組織の形質転換から生じる。取り込みの特異的部位は通常はランダムな組み込みによる。
組み換えDNA又は「形質転換DNA」による植物の細胞又は組織の形質転換の結果として植物ゲノム中に導入され、そしてそのような形質転換DNAを起源とするDNAを本明細書においては、以後、「導入遺伝子」の1つ以上を含む「外来性DNA」と称する。EE−GM3の導入遺伝子はグリホセート及びHPPD阻害剤の除草剤耐性遺伝子である。本発明の文脈における「植物DNA」は形質転換された植物を起源とするDNAを指すことになる。植物DNAは通常は相当する野生型植物中の同じ遺伝子座に存在することになる。外来性DNAは植物ゲノム中の組み換えDNA分子の取り込みの部位における箇所及び配置により特徴付けることができる。組み換えDNAが挿入されている植物ゲノム中の部位はまた、「挿入部位」又は「標的部位」とも称される。「前挿入植物DNA」と称される植物ゲノムの領域内への組み換えDNAの挿入は、「標的部位欠失」と称される植物DNAの欠失に関連する場合がある。「フランキング領域」又は「フランキング配列」とは本明細書においては、導入されたDNAとは異なるDNA、好ましくは外来性DNAの直近上流にありそれに隣接して、又は直近下流にありそれと隣接して所在している植物ゲノム由来のDNAの少なくとも20bp、好ましくは少なくとも50bp、そして5000bpまでの配列を指す。外来性DNAのランダムな組み込みをもたらす形質転換操作法は各形質転換体に特徴的でありユニークな、異なるフランキング領域を有する形質転換体をもたらすことになる。組み換えDNAを伝統的な交雑を介して植物中に導入する場合、その植物ゲノム内の挿入部位、又はそのフランキング領域は一般的には変化しない。
「単離された核酸(配列)」又は「単離されたDNA(配列)」とは、本明細書においては、既に天然環境にはない核酸又はDNA(配列)を指し、それは、例えば別の細菌宿主中、又は植物ゲノム中の核酸配列、又は別の起源のDNA又は核酸に融合された核酸又はDNAからは単離されている。
イベントは遺伝子工学の結果として、目的の遺伝子のコピー又は目的の遺伝子少なくとも1つを含む外来性DNA又は導入遺伝子を担持する(人工の)遺伝子座として定義される。イベントの典型的な対立遺伝子状態は外来性DNAの存在又は非存在である。イベントは導入遺伝子の発現により表現型として特徴化される。遺伝子レベルにおいては、イベントは植物の遺伝子メイクアップの部分である。分子レベルにおいては、イベントは制限地図(例えばサザンブロッティングにより決定される)により、導入遺伝子の上流及び/又は下流のフランキング配列、分子マーカーの箇所及び/又は導入遺伝子の分子配置により特徴付けることができる。通常は目的の遺伝子の少なくとも1つを含む形質転換DNAを用いた植物の形質転換は各々がユニークである別個のイベントの多くを含む形質転換体の集団をもたらす。イベントは外来性DNA及び少なくとも1つのフランキング配列により特徴付けられる。
優良イベントとは、本明細書においては、導入遺伝子の発現及び安定性、及び、それを含む植物の最適な作物学的特性とのその適合性に基づいて、同じ形質転換DNAを用いた形質転換により得られるイベントの群から選択されるイベントである。即ち、優良イベント選択の基準は下記、即ち:
a)外来性DNAの存在が、植物の他の所望の特性、例えば作物学的性能に関するもの又は商業的価値を犠牲にしないこと;
b)安定に受け継がれ、そしてそのアイデンティティーの管理のための適切なツールを開発することのできる十分定義された分子配置によりイベントが特徴付けられること;
c)イベントを担持する植物が通常の作物学的使用において曝露される可能性のある環境条件の範囲において商業的に許容できるレベルで、イベントのヘテロ接合(又は半接合)及びホモ接合条件の両方において、正確、適切及び安定な空間的及び時間的な表現型の発現を目的の遺伝子が示すこと;
の1つ以上、好ましくは2つ以上、好都合には全てである。
外来性DNAは、所望の商業的遺伝子背景内への容易な遺伝子移入を可能にする植物ゲノム中の位置に会合していることが好ましい。
優良イベントとしてのイベントのステータスは種々異なる関連遺伝子背景における優良イベントの遺伝子移入及び上記したa)、b)及びc)等の基準等の1つ、2つ又は全てへの準拠が見られることにより、確認される。
即ち「優良イベント」は上記した基準に合致する外来性DNAを含む遺伝子座を指す。植物、植物性物質又は子孫、例えば種子は、そのゲノム中に優良イベント1つ以上を含むことができる。
優良イベント又は優良イベントを含む植物又は植物性物質を識別するために開発されたツール、又は、優良イベントを含む植物性物質を含む製品は、優良イベントの特異的ゲノム特性、例えば外来性DNA、分子マーカー又は外来性DNAのフランキング領域の配列を含むゲノムの領域の特異的制限地図に基づく。
外来性DNAのフランキング領域の一方又は両方が配列決定された後、分子生物学的手法を用いて試料の核酸(DNA又はRNA)中のこの(これらの)配列を特異的に認識するプライマー及びプローブを開発することができる。例えば、生物学的試料(例えば植物、植物性物質又は植物性物質を含む製品のような試料)中の優良イベントを識別するためにPCR法を開発することができる。そのようなPCRは、一方が優良イベントの5’又は3’フランキング領域内部の配列を認識し、そして他方が外来性DNA内部の配列を認識する少なくとも2つの特異的「プライマー」に基づく。プライマーは好ましくは、最適化されたPCR条件下において、優良イベントの5’又は3’フランキング領域内部の配列及び優良イベントの外来性DNAをそれぞれ「特異的に認識する」、15〜35ヌクレオチドの配列を有することにより、特異的フラグメント(「組み込みフラグメント」又は判別アンプリコン)が優良イベントを含む核酸試料から増幅される。このことは、ターゲティングされた組み込みフラグメントのみが、植物ゲノム又は外来性DNA中の如何なる他の配列をも排して、最適PCR条件下に増幅されることを意味している。
EE−GM3の識別のために適するPCRプライマーは以下の通りである。即ち:
− 自身の3’末端において5’フランキング配列(配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451まで)における植物DNAから選択される少なくとも17連続ヌクレオチド、好ましくは20連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む17ntから約200ntまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド(5’フランキング配列を認識するプライマー);又は、
− 自身の3’末端において3’フランキング配列(配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体)における植物DNAから選択される少なくとも17連続ヌクレオチド、好ましくは20連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む17ntから約200ntまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド(3’フランキング配列を認識するプライマー);又は、
− 自身の3’末端において挿入されたDNA配列(配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体)から選択される少なくとも17連続ヌクレオチド、好ましくは20連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む17ntから約200ntまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド(外来性DNAを認識するプライマー);又は、
− 挿入されたDNA配列(配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240まで)から選択される少なくとも17連続ヌクレオチド、好ましくは20連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む17ntから約200ntまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド;又は、
− 挿入されたDNAフラグメント又はその相補体(配列番号1又は配列番号20のヌクレオチド位置1452から16638まで)から選択される少なくとも17連続ヌクレオチド、好ましくは20連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む17ntから約200ntまでの長さの範囲の適当なオリゴヌクレオチド。
プライマーは当然ながら記載した17連続ヌクレオチドより長くてもよく、そして例えば20、21、30、35、50、75、100、150、200nt又は更に長くてもよい。プライマーはフランキング配列及び外来性DNAの配列の記載したヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列より完全になるものであってよい。しかしながら、自身の5’末端(即ち3’にある17連続ヌクレオチドの外側)のプライマーのヌクレオチド配列の厳密性はより低い。即ち、プライマーの5’配列は、適宜、外来性DNAのフランキング配列から選択されるヌクレオチド配列を含むか、それよりなってよいが、数個(例えば1、2、5又は10個)のミスマッチを含んでよい。プライマーの5’配列は寧ろ完全に、外来性DNAのフランキング配列とは無関係のヌクレオチド配列、例えば制限酵素認識部位の1つ以上を示すヌクレオチド配列であってよい。そのような無関係の配列又はミスマッチを有するフランキングDNA配列は好ましくは100を超えない、より好ましくは50、更には25ヌクレオチドより長くならないはずである。
更に又、適当なプライマーは植物DNA由来配列と外来性DNA配列の間の接合領域(EE−GM3に関しては配列番号2のヌクレオチド1451〜1452及び配列番号3のヌクレオチド240〜241に所在する)に渡る自身の3’末端におけるヌクレオチド配列を含むかそれより本質的になってよいが、ただし、記載した3’にある17連続ヌクレオチドは配列番号2又は3における外来性DNA又は植物由来配列の何れかからのみに由来するものではない。
当業者にはまた明らかであるが、適切に選択されたPCRプライマー対は相互に相補である配列を含んではならない。
本発明の目的のためには「配列番号Xに示すヌクレオチド配列の相補体」とはChargaffの規則に従ってヌクレオチドをその相補ヌクレオチドと置き換えること(A⇔T;G⇔C)、及び、配列を5’から3’の方向に、即ち示されたヌクレオチド配列の逆方向に読むことにより、示されたヌクレオチド配列から誘導できるヌクレオチド配列である。
EE−GM3のため適当なプライマーの例は、配列番号5(3’フランキング配列認識プライマー)、配列番号4(3’フランキング配列認識プライマーと共に使用するための外来性DNA認識プライマー)、又は配列番号7(3’フランキング配列認識プライマーと共に使用するための外来性DNA認識プライマー)のオリゴヌクレオチド配列である。
EE−GM3のための適当なオリゴヌクレオチドプライマーの他の例は、自身の3’末端に次の配列を含むか、又はそのような配列より(本質的に)なるものである。
a.5’フランキング配列認識プライマー:
− 配列番号2のヌクレオチド264からヌクレオチド283までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド266からヌクレオチド285までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1240からヌクレオチド1259までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド265からヌクレオチド285までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド265からヌクレオチド283までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1239からヌクレオチド1259までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1241からヌクレオチド1259までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1244からヌクレオチド1263までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1248からヌクレオチド1267までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1250からヌクレオチド1269までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド262からヌクレオチド279までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド263からヌクレオチド279までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド264からヌクレオチド285までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド266からヌクレオチド283までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1238からヌクレオチド1259までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1242からヌクレオチド1259までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1243からヌクレオチド1263までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1245からヌクレオチド1263までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1247からヌクレオチド1267までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1249からヌクレオチド1269までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1249からヌクレオチド1267までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド263からヌクレオチド285までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド267からヌクレオチド283までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1242からヌクレオチド1263までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1243からヌクレオチド1259までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1246からヌクレオチド1267までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1246からヌクレオチド1263までのヌクレオチド配列
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b.5’フランキング配列認識プライマーと共に使用するための外来性DNA配列認識プライマー
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− 配列番号2のヌクレオチド1726からヌクレオチド1745までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1726からヌクレオチド1744までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1726からヌクレオチド1746までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1726からヌクレオチド1747までのヌクレオチド配列の相補体
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− 配列番号2のヌクレオチド1481からヌクレオチド1497までのヌクレオチド配列の相補体
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− 配列番号2のヌクレオチド1666からヌクレオチド1686までのヌクレオチド配列の相補体
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− 配列番号2のヌクレオチド1692からヌクレオチド1710までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1481からヌクレオチド1500までのヌクレオチド配列の相補体
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− 配列番号2のヌクレオチド1672からヌクレオチド1690までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1672からヌクレオチド1691までのヌクレオチド配列の相補体
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− 配列番号2のヌクレオチド1687からヌクレオチド1706までのヌクレオチド配列の相補体
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− 配列番号2のヌクレオチド1678からヌクレオチド1694までのヌクレオチド配列の相補体
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− 配列番号2のヌクレオチド1678からヌクレオチド1696までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1687からヌクレオチド1703までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1687からヌクレオチド1704までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1692からヌクレオチド1711までのヌクレオチド配列の相補体
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− 配列番号2のヌクレオチド1488からヌクレオチド1506までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1491からヌクレオチド1511までのヌクレオチド配列の相補体
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− 配列番号2のヌクレオチド1495からヌクレオチド1511までのヌクレオチド配列の相補体
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− 配列番号2のヌクレオチド1666からヌクレオチド1687までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1667からヌクレオチド1688までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1672からヌクレオチド1692までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1673からヌクレオチド1693までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1687からヌクレオチド1707までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1472からヌクレオチド1490までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1472からヌクレオチド1491までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1481からヌクレオチド1501までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1489からヌクレオチド1509までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1495からヌクレオチド1515までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1670からヌクレオチド1691までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1673からヌクレオチド1694までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1678からヌクレオチド1698までのヌクレオチド配列の相補体
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− 配列番号2のヌクレオチド1667からヌクレオチド1689までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1687からヌクレオチド1708までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1688からヌクレオチド1710までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1691からヌクレオチド1711までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1472からヌクレオチド1492までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1489からヌクレオチド1510までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1666からヌクレオチド1688までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1687からヌクレオチド1709までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1692からヌクレオチド1712までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1467からヌクレオチド1488までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1469からヌクレオチド1490までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1488からヌクレオチド1509までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1489からヌクレオチド1511までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1678からヌクレオチド1699までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1472からヌクレオチド1493までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1472からヌクレオチド1494までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1481からヌクレオチド1502までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1670からヌクレオチド1692までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1469からヌクレオチド1491までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1488からヌクレオチド1510までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1691からヌクレオチド1712までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1692からヌクレオチド1713までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1692からヌクレオチド1714までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1467からヌクレオチド1489までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1678からヌクレオチド1700までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1481からヌクレオチド1503までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1691からヌクレオチド1713までのヌクレオチド配列の相補体
c.3’フランキング配列認識プライマー:
− 配列番号3のヌクレオチド828からヌクレオチド847までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド830からヌクレオチド849までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド828からヌクレオチド846までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド828からヌクレオチド848までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド830からヌクレオチド848までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド830からヌクレオチド850までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド828からヌクレオチド845までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド830からヌクレオチド847までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド828からヌクレオチド849までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド830からヌクレオチド851までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド828からヌクレオチド844までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド830からヌクレオチド846までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド828からヌクレオチド850までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド830からヌクレオチド852までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド992からヌクレオチド1009までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド731からヌクレオチド752までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド776からヌクレオチド795までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド731からヌクレオチド753までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド776からヌクレオチド794までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド776からヌクレオチド796までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド776からヌクレオチド793までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド776からヌクレオチド797までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド776からヌクレオチド792までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド776からヌクレオチド798までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド733からヌクレオチド752までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド733からヌクレオチド753までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド733からヌクレオチド754までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド733からヌクレオチド755までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド838からヌクレオチド854までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド246からヌクレオチド263までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド838からヌクレオチド855までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド245からヌクレオチド264までのヌクレオチド配列の相補体
d.3’フランキング配列認識プライマーと共に使用するための外来性DNA配列認識プライマー
− 配列番号3のヌクレオチド173からヌクレオチド192までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド22からヌクレオチド41までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド172からヌクレオチド192までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド174からヌクレオチド192までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド191からヌクレオチド210までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド171からヌクレオチド192までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド175からヌクレオチド192までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド190からヌクレオチド210までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド192からヌクレオチド210までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド176からヌクレオチド192までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド189からヌクレオチド210までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド193からヌクレオチド210までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド188からヌクレオチド210までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド194からヌクレオチド210までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド199からヌクレオチド218までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド200からヌクレオチド218までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド197からヌクレオチド218までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド201からヌクレオチド218までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド201からヌクレオチド220までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド200からヌクレオチド220までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド199からヌクレオチド220までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド200からヌクレオチド221までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド199からヌクレオチド221までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド150からヌクレオチド172までのヌクレオチド配列
EE−GM1の識別のために適するPCRプライマーは国際特許出願WO2006/108674、特に8ページ4行目から26ページ7行目に記載されている(参照により本明細書に組み込まれる)。
EE−GM2の識別のために適するPCRプライマーは国際特許出願WO2006/108675、特に8ページ4行目から33ページ4行目に記載されている(参照により本明細書に組み込まれる)。
本明細書においては、「X位からY位までの配列番号Zのヌクレオチド配列」とは両方のヌクレオチド終点を包含するヌクレオチド配列を指す。
好ましくは、増幅されたフラグメントは50〜500ヌクレオチドの長さ、例えば100〜350ヌクレオチドの長さを有する。特異的プライマーはそれぞれ優良イベントの5’又は3’フランキング領域及び優良イベントの外来性DNA内部の配列と80〜100%同一である配列を有してよいが、ただし、ミスマッチはなお、最適なPCR条件下これらのプライマーによる優良イベントの特異的な識別を可能としなければならない。しかしながら許容可能なミスマッチの範囲は実験的に容易に決定でき、そして当該分野で知られている。
組み込みフラグメントの検出は種々の態様において、例えばゲル分析後のサイズ推定を介して行うことができる。組み込みフラグメントは又直接配列決定してもよい。増幅されたDNAフラグメントの検出のための他の配列特異的方法も当該分野で知られている。
プライマーの配列及びそれらのゲノム内の相対的箇所は優良イベントにユニークであるため、組み込みフラグメントの増幅は優良イベント(の核酸)を含む生物学的試料においてのみ起こることになる。好ましくは、未知試料中のEE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM3及びEE−GM2の存在を識別するためのPCRを実施する場合、イベントの植物種の「ハウスキーピング遺伝子」内のフラグメントが増幅できるプライマーのセットの対照品を含める。ハウスキーピング遺伝子は大部分の細胞型内で発現され、そして全ての細胞に共通した基礎代謝活動に関与する遺伝子である。好ましくは、ハウスキーピング遺伝子から増幅されるフラグメントは増幅される組み込みフラグメントよりも大型のフラグメントである。分析すべき試料に応じて他の対照品も包含させることができる。
標準PCRプロトコルは当該分野において、例えば「PCR Application Manual」(Roche Molecular Biochemicals, 2nd Edition, 1999)及び他の参考文献に記載されている。特異的プライマーの配列を包含するPCRのための最適条件は各優良イベントに関する「PCR(またはPolymerase Chain Reaction)識別プロトコル」中に特定されている。しかしながら、PCR識別プロトコル中のパラメーターの数は特異的実験室条件に対して調節する必要がある場合があり、そして、類似の結果を得るためには僅かに変更してよいと理解される。例えばDNAの調製のための異なる方法の使用は、例えばプライマーの量、ポリメラーゼ及び使用するアニーリング条件の調節を必要とする場合がある。同様に他のプライマーの選択はPCR識別プロトコルのための他の最適条件を支配する場合がある。しかしながらこれらの調節は当業者には明らかであり、そして上記引用したもののような現在のPCRアプリケーションマニュアルに更に詳述されている。
或いは、生物学的試料中のEE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM3及びEE−GM2を識別するための「特異的プローブ」として使用できる組み込みフラグメントを増幅するために特異的プライマーを用いることができる。生物学的試料中の核酸を、核酸中の相当するフラグメントとのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でプローブに接触させることにより、核酸/プローブハイブリッドの形成がもたらされる。このハイブリッドの形成は検出可能であり(例えば核酸又はプローブの標識を介して)、これによりこのハイブリッドの形成がEE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM3及びEE−GM2の存在を示す。特異的プローブとのハイブリダイゼーションに基づくこのような識別方法(固相担体上又は溶液中の何れか)は当該分野で知られている。特異的プローブは好ましくは、最適条件下、優良イベントの5’又は3’フランキング領域内部であり、そして好ましくはそれに隣接する外来性DNAの部分も含んでいる領域に特異的にハイブリダイズする配列である。好ましくは、特異的プローブは特異的領域のヌクレオチド配列に対して少なくとも80%、好ましくは80〜85%、より好ましくは85〜90%、特に好ましくは90〜95%、最も好ましくは95%〜100%同一(又は相補)である50〜500bp、好ましくは100〜350bpの配列を含む。好ましくは、特異的プローブは優良イベントの特異的領域に同一(又は相補)である約15から約100の隣接ヌクレオチドの配列を含むことになる。
更に又、PCR系増幅方法とは異なる優良イベントEE−GM3及びEE−GM1又は優良イベントEE−GM3及びEE−GM2に特異的な検出方法もまた本明細書に記載した優良イベント特異的配列情報を用いて開発できる。そのような代替的な検出方法はInvaderTMテクノロジーとしても知られている特異的核酸構造の侵襲的切断に基づくリニアシグナル増幅検出方法を包含する(例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許5、985、557号 "Invasive Cleavage of Nucleic Acids", 6、001、567号 "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage"に記載)。この方法によるEE−GM3検出のために、標的配列はヌクレオチド1452からヌクレオチド1469までの配列番号2のヌクレオチド配列又はその相補体を含む標識された第1の核酸オリゴヌクレオチド、又はヌクレオチド223からヌクレオチド240までの配列番号3のヌクレオチド配列又はその相補体を含む該標識核酸プローブにハイブリダイズされ、そして更に、ヌクレオチド1434からヌクレオチド1451までの配列番号2のヌクレオチド配列又はその相補体を含む標識された第2の核酸オリゴヌクレオチド、又はヌクレオチド241からヌクレオチド258までの配列番号3のヌクレオチド配列又はその相補体を含む該標識核酸プローブにハイブリダイズされ、ここで、第1及び第2のオリゴヌクレオチドはヌクレオチドの少なくとも1つで重複する。このハイブリダイゼーションにより生じるデュプレックス又はトリプレックスの構造は標的配列を未損傷としたまま酵素(Cleavase(登録商標))による選択的プローブ切断を可能とする。切断された標識プローブはその後、潜在的には更なるシグナル増幅をもたらす中間的工程を介して検出される。この方法によるEE−GM1検出のために、標的配列はヌクレオチド210からヌクレオチド227までの配列番号12のヌクレオチド配列又はその相補体を含む標識された第1の核酸オリゴヌクレオチド、又はヌクレオチド561からヌクレオチド568までの配列番号13のヌクレオチド配列又はその相補体を含む該標識核酸プローブにハイブリダイズされ、そして更に、ヌクレオチド192からヌクレオチド209までの配列番号12のヌクレオチド配列又はその相補体を含む標識された第2の核酸オリゴヌクレオチド、又はヌクレオチド569からヌクレオチド586までの配列番号13のヌクレオチド配列又はその相補体を含む該標識核酸プローブにハイブリダイズされ、ここで、第1及び第2のオリゴヌクレオチドはヌクレオチドの少なくとも1つで重複する。このハイブリダイゼーションにより生じるデュプレックス又はトリプレックスの構造は標的配列を未損傷としたまま酵素(Cleavase(登録商標))による選択的プローブ切断を可能とする。切断された標識プローブはその後、潜在的には更なるシグナル増幅をもたらす中間的工程を介して検出される。この方法によるEE−GM2検出のために、標的配列はヌクレオチド312からヌクレオチド329までの配列番号14のヌクレオチド配列又はその相補体を含む標識された第1の核酸オリゴヌクレオチド、又はヌクレオチド490からヌクレオチド507までの配列番号15のヌクレオチド配列又はその相補体を含む該標識核酸プローブにハイブリダイズされ、そして更に、ヌクレオチド294からヌクレオチド311までの配列番号14のヌクレオチド配列又はその相補体を含む標識された第2の核酸オリゴヌクレオチド、又はヌクレオチド508からヌクレオチド525までの配列番号15のヌクレオチド配列又はその相補体を含む該標識核酸プローブにハイブリダイズされ、ここで、第1及び第2のオリゴヌクレオチドはヌクレオチドの少なくとも1つで重複する。このハイブリダイゼーションにより生じるデュプレックス又はトリプレックスの構造は標的配列を未損傷としたまま酵素(Cleavase(登録商標))による選択的プローブ切断を可能とする。切断された標識プローブはその後、潜在的には更なるシグナル増幅をもたらす中間的工程を介して検出される。
「キット」とは本明細書においては、本発明の方法、より特記すれば生物学的試料中の優良イベントEE−GM3の識別、又はEE−GM3含有植物性物質の接合生殖性の測定を実施する目的のための試薬のセットを指す。より特記すれば、本発明のキットの好ましい実施形態は優良イベントの識別のための上記した少なくとも1つ又は2つの特異的プライマー、又は、接合生殖性ステータスの測定のための3つの特異的プライマーを含む。場合により、キットはPCR識別プロトコルにおいて本明細書に記載した何れかの他の試薬を更に含むことができる。あるいは、本発明の別の実施形態によれば、キットは生物学的試料の核酸に特異的にハイブリダイズしてその中のEE−GM3の存在を識別する上記した特異的プローブを含むことができる。場合により、キットは更に、特異的プローブを用いる生物学的試料中のEE−GM3の識別のための何れかの他の試薬(例えば限定しないがハイブリダイゼーション緩衝液、標識)を含むことができる。
品質管理(例えば種子ロットの純度)、植物性物質、又は例えば限定しないが食品又は飼料製品のような植物性物質を含むかそれより誘導された物質の中の優良イベントの存在又は非存在の検出を目的として、本発明のキットを使用することができ、そしてその成分を特別に調節することができる。
本明細書においては、ヌクレオチド配列(DNA又はRNA)に関する「配列同一性」とは配列の2つのうち短い方のヌクレオチドの数で同じヌクレオチドを有する位置の数を割ったものを指す。ヌクレオチド配列の2つのアライメントはWilbur and Lipmannのアルゴリズム(Wilbur and Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:726)により、ウインドウサイズ20ヌクレオチド、ワードレングス4ヌクレオチド及びギャップペナルティー4を用いて実施される。上記した配列アライメントを包含する配列データのコンピューター支援の分析及び解釈は、例えばGenetics Computer Group (GCG, University of Wisconsin Biotechnology Center)の配列分析ソフトウエアパッケージを用いながら簡便に実施してよい。配列は、その配列が少なくとも約75%、特に少なくとも約80%、より特記すれば少なくとも約85%、非常に特記すれば少なくとも約90%、とりわけ少なくとも約95%、よりとりわけ少なくとも約98%、又は少なくとも約99%の配列同一性を有する場合に、「本質的に類似」と示される。RNA配列がDNA配列と本質的に類似であるか、又はある程度の配列同一性を有すると言われる場合、DNA配列中のチミジン(T)はRNA配列中のウラシル(U)と等しいと考えられることは明らかである。更に又、僅かな相違又は突然変異は経時的にDNA配列中に生じる場合があること、そして、一部のミスマッチは本発明のイベント特異的プライマー又はプローブに関しては許容できることは明らかであり、そのため、本発明の何れかの3’又は5’フランキングDNAに関する、又は何れかのインサート又は外来性DNA又はプライマー又はプローブに関する本発明の何れかの実施形態において本明細書に示した何れかのDNA配列もまた、本明細書に提示した配列と本質的に類似の配列、例えば本発明の何れかの3’又は5’フランキングDNAについて、又は何れかのプライマー又はプローブについて、又は、何れかのインサート又は外来性DNAについて与えられる配列に、ハイブリダイズするか、又はそれと少なくとも90%、95%、96%、97%、98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列も包含する。
「プライマー」という用語は、本明細書においては、PCRのような鋳型依存性のプロセスにおいて新生核酸の合成をプライミングすることができる如何なる核酸も包含する。典型的には、プライマーは10から30ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列も使用できる。プライマーは1本鎖型が好ましいが、2本鎖型で提供しても良い。
プローブはプライマーとして使用できるが、標的DNA又はRNAに結合するように設計され、そして増幅プロセスにおいて使用しなくても良い。
「認識する」という用語は本明細書においては、特異的プライマーが、方法において示される条件(PCR識別プロトコルの条件等)の下に、優良イベント中の核酸配列に特異的にハイブリダイズし、これにより陽性および陰性対照の存在により特異性を決定できるという事実を指す。
「ハイブリダイズする」という用語は本明細書においては、特異的プローブに言及している場合は、プローブが、標準的なストリンジェンシー条件下に優良イベントの核酸配列中の特異的領域に結合するという事実を指す。標準的なストリンジェンシー条件とは、本明細書においては、本明細書に記載するハイブリダイゼーションのための条件、又は、Sambrook et.al.,1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)により記載されるような従来のハイブリダイズ条件を指し、それは例えば以下の工程、即ち:1)フィルター上に植物ゲノムDNAフラグメントを固定化すること、2)1から2時間、42℃において、50%ホルムアミド、5×SSPE、2×Denhardt試薬及び0.1%SDS中、又は1から2時間、68℃において6×SSC、2×Denhardt試薬及び0.1%SDS中、フィルターを予備ハイブリダイズすること、3)標識してあるハイブリダイゼーションプローブを添加すること、4)16から24時間インキュベートすること、5)20分間室温で1×SSC、0.1%SDS中でフィルターを洗浄すること、6)20分間、各々68℃において0.2×SSC、0.1%SDS中でフィルターを3回洗浄すること、及び、7)フィルターを24から48時間、×線フィルムに−70℃において増感紙を用いて露光することを含むことができる。
本明細書においては、生物学的試料は植物、植物性物質又は植物性物質を含む製品の試料である。「植物」という用語は、何れかの段階の成熟度にあるダイズ(Glycine max)植物組織、並びに何れかのそのような植物から採取した、或いは誘導した何れかの細胞、組織、又は器官、例えば限定しないが、何れかの種子、葉、幹、花、根、単細胞、配偶子、細胞培養物、組織培養物又はプロトプラストを包含することを意図している。「植物性物質」とは、本明細書においては、植物から得られる、又は誘導される物質を指す。植物性物質を含む製品は、植物性物質を用いて生産されるか、又は植物性物質により汚染される場合がある食品、飼料又は他の製品に関する。本発明の文脈においては、そのような生物学的試料は試料中の核酸の存在を意味するEE−GM3、EE−GM1及びEE−GM2に対して特異的な核酸の存在に関して試験される。即ち生物学的試料中の優良イベントEE−GM3及びEE−GM2又はEE−GM3及びEE−GM1を識別するための本明細書において言及する方法は、優良イベントを含む核酸の生物学的試料中の識別に関する。
本明細書においては、「含む」とは、明示された特徴、整数、工程、試薬又は成分を示されるとおりに特定するものとして解釈されるべきであるが、1つより多い特徴、整数、工程又は成分、又はその群の存在又は追加を排除するものではない。即ち、例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸の配列を含む核酸又は蛋白は実際に挙げられているものよりも多くのヌクレオチド又はアミノ酸を含んでよく、即ち、より大きい核酸又は蛋白に包埋されていて良い。機能的又は構造的に定義されているDNA配列を含むキメラ遺伝子は、追加的なDNA配列、例えばプロモーター及び転写終止配列を含んでよい。
本発明は又、ダイズにおける優良イベントEE−GM3及び優良イベントEE−GM1又は優良イベントEE−GM3及び優良イベントEE−GM2のスタック(stack)の発生、これらのイベントのスタックを含む植物、これらの植物から得られる子孫、及び、これらのスタックを含む植物から誘導された植物性物質に関する。優良イベントEE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM3及びEE−GM2を含む植物は実施例1に記載する通り得ることができる。スタックは従来の繁殖方法を用いて単独イベントを含む植物を交雑すること、及び、2つの異なるイベントを含むその子孫を識別することにより得られる。
EE−GM3及びEE−GM1を含むダイズ植物又は植物性物質は実施例2におけるEE−GM3及びEE−GM1に関して記載したPCR識別プロトコルに従って識別できる。簡潔に言えば、生物学的試料中に存在するダイズゲノムDNAを、配列番号5の配列番号を有するプライマーのようなEE−GM3の5’又は3’フランキング配列内部の配列を特異的に認識するプライマー及び配列番号4の配列番号を有するプライマーのような外来性DNAの配列を特異的に認識するプライマーを用い、そして更に、配列番号16の配列を有するプライマーのようなEE−GM1の5’又は3’フランキング配列内部の配列を特異的に認識するプライマー及び配列番号17の配列を有するプライマーのような外来性DNAの配列を特異的に認識するプライマーを用いたPCRにより増幅する。
EE−GM3及びEE−GM2を含むダイズ植物又は植物性物質は実施例2におけるEE−GM3及びEE−GM2に関して記載したPCR識別プロトコルに従って識別できる。簡潔に言えば、生物学的試料中に存在するダイズゲノムDNAを、配列番号5の配列番号を有するプライマーのようなEE−GM3の5’又は3’フランキング配列内部の配列を特異的に認識するプライマー及び配列番号4の配列番号を有するプライマーのような外来性DNAの配列を特異的に認識するプライマーを用い、そして更に、配列番号18の配列を有するプライマーのようなEE−GM2の5’又は3’フランキング配列内部の配列を特異的に認識するプライマー及び配列番号19の配列を有するプライマーのような外来性DNAの配列を特異的に認識するプライマーを用いたPCRにより増幅する。
内因性ダイズ配列の部分を増幅するDNAプライマーをPCR増幅のための陽性対照として使用する。PCR増幅時に物質が予測されたサイズのフラグメントをもたらす場合、物質は優良イベントEE−GM3及びEE−GM1を保有しているダイズ植物に由来するか、又は優良イベントEE−GM3及びEE−GM2を保有しているダイズ植物に由来する植物性物質を含有する。
EE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM3及びEE−GM2を保有している植物はそれらのグリホセート耐性並びにイソキサフルトールのようなHPPD阻害剤に対するそれらの耐性によりそして更にグルホシネートに対するそれらの耐性により、特徴付けられる。イベントスタックを保有している植物は又、除草剤適用の非存在下でダイズの市販品種と同等の作物学的特性を有することにより特徴付けられる。本明細書に記載したダイズ植物ゲノムの挿入領域における外来性DNAの存在は、このイベントを含む植物に対して、特に有利な表現型及び分子の特性を付与する。
本発明の1つの実施形態は、ダイズゲノム中の特異的箇所における導入遺伝子の挿入により得ることができるダイズ植物中の優良イベントEE−GM3及びEE−GM1及び/又はEE−GM2の組み合わせをもたらし、その優良イベントはそのようなダイズ植物に対して、グリホセート、グルホシネート及びイソキサフルトールのようなHPPD阻害剤除草剤に対する耐性を与え、そしてその場合、そのような優良イベントは同遺伝子系の系統と比較してそのようなダイズ植物の収量に悪影響するそのダイズの作物学的性能に対する如何なる作用も誘発しない(本明細書においては、「同遺伝子系の系統」又は「近同遺伝子系の系統」とは、同じ遺伝子的背景であるが導入遺伝子を欠いているダイズの系統、例えば形質転換のために使用される植物と同じ遺伝子的背景の植物、又は導入遺伝子を失っている分離姉妹系統である)。特に、本発明は、ダイズ植物のゲノム中の優良イベントEE−GM3及びEE−GM1及び/又はEE−GM2の挿入又は存在が、同遺伝子系の系統と比較してそのようなダイズ植物において増大した易罹患性を誘発せず、収量障害を誘発せず、又は増大した倒伏を誘発しない、そのダイズ植物中の該優良イベントの組み合わせを提供する。従って、本発明は同遺伝子系の系統と比較してダイズ植物の収量に悪影響を及ぼすことなくグリホセート、グルホシネート及びHPPD阻害剤除草剤の適用(同時又は別途)に耐性できるそのようなダイズ植物をもたらすEE−GM3およびEE−GM1及び/又はEE−GM2と標記されるダイズ植物中の優良イベントの組み合わせを提供し、そのダイズ植物は同遺伝子系のダイズ植物とそれらの易罹患性又は倒伏性において統計学的有意差を有さない。これらの特性は本発明の優良イベントの組み合わせをダイズ圃場におけるグリホセート耐性雑草の抑制のために極めて有利なものとしており、そしてダイズ圃場における更なるグリホセート抵抗性の発生を防止又は遅延させる手法においても使用できる(例えばダイズ圃場に対して適用される除草剤の作用の少なくとも2つ又は更には3つの異なる様式を確保する、グリホセート及びイソキサフルトール及び/又はグルホシネートの適用によるか、又は、イソキサフルトール及びグリホセート及び/又はグルホシネートの適用によるか、又は、グルホシネート及びグリホセート及び/又はイソキサフルトールの適用による)。
本明細書においてまた提供されるものは、イベントEE−GM3を含む代表的なダイズ種子がNCIMBアクセッション番号41659の下に寄託されている、優良イベントEE−GM1を含む代表的なダイズ種子がアクセッション番号NCIMB41658の下にNCIMBに寄託されている、優良イベントEE−GM2を含む代表的な種子がアクセッション番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されている、イベントEE−GM3及びEE−GM1を含む代表的なダイズ種子がアクセッション番号PTA−11041の下にATCCに寄託されている、そして、イベントEE−GM3及びEE−GM2を含む代表的なダイズ種子がアクセッション番号PTA−11042の下にATCCに寄託されている、イベントEE−GM3及び優良イベントEE−GM1又はEE−GM2を含むダイズ植物又はその部分である。
EE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM3及びEE−GM2を含むダイズ植物又はその部分は、当該分野で知られている何れかの手段を介してそれぞれの寄託種子中に検出できるそれぞれの優良イベントを組み合わせることにより、例えば寄託種子由来の植物を交雑させ、その子孫を収集し、そして優良イベントの適切な組み合わせを含む子孫植物を識別することにより得てよい。
本明細書において更に提供されるものは、そのようなイベントを含むそのような植物の種子、並びにそのような種子から生産されるダイズ製品であり、ここで該ダイズ製品はイベントEE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM2を含む。そのようなダイズ製品は穀粉、粉砕種子、粉末食品、フレーク等であるか、それを含むことができる。特にそのようなダイズ製品はイベントEE−GM3及び優良イベントEE−GM1又はEE−GM2に対して診断的なアンプリコンを生産する核酸を含み、そのようなアンプリコンは配列番号2又は3、配列番号14又は15、及び/又は配列番号12又は13を含む。また本明細書において提供されるものはイベントEE−GM3及び優良イベントEE−GM1又はEE−GM2を含むダイズ種子を得ること、及び、それからダイズ製品を生産することを含む、そのようなダイズ製品を製造するための方法である。
また本明細書において提供されるものは、上記ダイズ植物の何れかの子孫であり、そしてイベントEE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM2を含む、ダイズ植物である。
本明細書において更に提供されるものは、特に、イベントEE−GM3を含む第1のダイズ植物をEE−GM1及び/又はEE−GM2を含むダイズ植物と交雑すること、及び、グリホセート及び/又はグルホシネート及び/又はイソキサフルトールに対して耐性である子孫植物を選択することにより、イベントEE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM2をダイズ植物のゲノム内に導入することを含む、グリホセート及び/又はグルホシネート及び/又はイソキサフルトール除草剤に対して耐性であるそのような植物を製造するための方法である。
また本明細書において提供されるものは、特に収量障害を伴わず、そして2mEPSPS、HPPD及びPAT蛋白を含む許容可能な作物学的特性を有し、そしてイベントEE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM3及びEE−GM2に対して診断的なアンプリコンを生成することができるグリホセート及びグルホシネート及び/又はイソキサフルトール耐性植物である。
本明細書において更に提供されるものは、圃場をイソキサフルトール系、グリホセート系、及び/又は、グルホシネート系の除草剤の有効量で処理することを含む、イベントEE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM3及びEE−GM2を含むダイズ植物の圃場又はそのようなダイズ植物を植栽するべき圃場における雑草を抑制するための方法であり、この場合、そのような植物はそのような除草剤に対して耐性である。
本明細書において更に提供されるものは、配列番号2のヌクレオチド1431から1472までと少なくとも80%、90%、95%又は100%の配列同一性を有する核酸配列及び配列番号3のヌクレオチド220から261までと少なくとも80%、90%、95%又は100%の配列同一性を有する核酸配列、又は該配列の相補体、そして更に配列番号12のヌクレオチド119から220までと少なくとも80%、90%、95%又は100%の配列同一性を有する核酸配列及び配列番号13のヌクレオチド558から579までと少なくとも80%、90%、95%又は100%の配列同一性を有する核酸配列、又は該配列の相補体を自身の細胞のゲノム内に含むことにより特徴付けられる、EE−GM3及びEE−GM1を含むダイズ植物、細胞、組織又は種子である。
本明細書において更に提供されるものは、配列番号2のヌクレオチド1431から1472までと少なくとも80%、90%、95%又は100%の配列同一性を有する核酸配列及び配列番号3のヌクレオチド220から261までと少なくとも80%、90%、95%又は100%の配列同一性を有する核酸配列、又は該配列の相補体、そして更に配列番号14のヌクレオチド301から322までと少なくとも80%、90%、95%又は100%の配列同一性を有する核酸配列及び配列番号15のヌクレオチド497から518までと少なくとも80%、90%、95%又は100%の配列同一性を有する核酸配列、又は該配列の相補体を自身の細胞のゲノム内に含むことにより特徴付けられる、EE−GM3及びEE−GM2を含むダイズ植物、細胞、組織又は種子である。
「イソキサフルトール」という用語は本明細書においては、除草剤イソキサフルトール[即ち(5-シクロプロピル−4−イソキサゾリル)[2-(メチルスルホニル)-4-(トリフルオロメチル)フェニル]メタノン]、その活性代謝産物、ジケトニトリル、及び該化合物を含む何れかの混合物又は溶液を指す。本発明のイベントを含む植物への適用のために有用なHPPD阻害剤除草剤はジケトニトリル、例えば2−シアノ−3−シクロプロピル−1−(2−メチルスルホニル−4−トリフルオロメチルフェニル)−プロパン−1,3−ジオン及び2−シアノ−1−l4−(メチルスルホニル)−2−トリフルオロメチルフェニル]−3−(1−メチルシクロプロピル)プロパン−1,3−ジオン;他のイソキサゾール類;及びピラゾリネート類、例えばトプラメゾン[即ち[3−(4,5−ジヒドロ−3−イソキサゾリル)−2−メチル−4−(メチルスルホニル)フェニル](5−ヒドロキシ−1−メチル−1H−ピラゾル−4−イル)メタノン]、及びピラスルホトール[(5−ヒドロキシ−1,3−ジメチルピラゾル−4−イル(2−メシル−4−トリフルオロメチルフェニルフェニル)メタノン];又はピラゾフェン[2−[4−(2,4−ジクロロベンゾイル)−1,3−ジメチルピラゾル−5−イルオキシ]アセトフェノン]である。
本発明の1つの実施形態においてEE−GM3イベントを含有するダイズ植物を植栽するべき圃場は、ダイズ植物を植栽するか、又は種子を播く前に、イソキサフルトール(IFT)のようなHPPD阻害剤除草剤で処理することができ、これによりHPPD阻害剤により殺傷される雑草を圃場から駆逐し、これにより無耕作業が可能となり、続いて、同じ予備処理された圃場に後日ダイズを植栽するか播種できるようになる(HPPD阻害剤除草剤を用いたバーンダウン適用)。IFTの残存活性もまた早期生育段階において雑草による競合から出芽成長中のダイズ植物を保護することになる。ダイズ植物があるサイズを有し、そして雑草が再出現の傾向を見せるようになった後、グリホセート又はHPPD阻害剤−グリホセート混合物を植物の上面に出芽後除草剤として適用することができる。
本発明の別の実施形態においては、EE−GM3イベントを含有する種子を播種する圃場を、ダイズ植物が出芽する前であるが種子を播種した後に、IFTのようなHPPD阻害剤除草剤で処理することができ(圃場は他の手段、典型的には鍬入れ、鋤き入れ、又は種子床作成のような従来の耕作作業を用いて播種前に無雑草とすることができる)、その場合、残存活性により圃場は除草剤により殺傷された雑草が存在しない状態に維持されることになり、これにより出芽成長中のダイズ植物は雑草と競合しない(HPPD阻害剤除草剤の出芽前適用)。ダイズ植物があるサイズを有し、そして雑草が再出現の傾向を見せるようになった後、グリホセート又はHPPD阻害剤−グリホセート混合物を植物の上面に出芽後除草剤として適用することができる。
本発明の別の実施形態においては、EE−GM3イベントを含有するダイズ植物は播種された種子から出芽しているダイズ植物の上面にIFTのようなHPPD阻害剤除草剤で処理することができ、これによりHPPD阻害剤により殺傷される雑草を圃場から駆逐し、この適用は植物の上面への出芽後除草剤としてグリホセートの処理と共に(例えばスプレータンクミックス中で)、その後、又はそれに先立って行うことができる(HPPD阻害剤除草剤の出芽後適用(グリホセート併用又は無併用))。
更に又本発明によれば、EE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM2を保有するダイズ植物は以下の殺虫剤、除草剤又は殺カビ剤で処理してよく、或いは、EE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM2を保有するダイズ種子は以下の殺虫剤、除草剤又は殺カビ剤を含む種子コーティング剤でコーティングして良い。
ダイズ除草剤:
アラクロル、ベンタゾン、トリフラリン、クロリムロン−エチル、クロランスラム−メチル、フェノキサプロプ、フォメサフェン、フルアジホップ、グリフォセート、イマザモックス、イマザキン、イマゼタピル、(S)メトラクロル、メトリブジン、ペンジメタリン、テプラロキシジム、イソキサフルトール、グルホシネート。
ダイズ殺虫剤:
ラムダ−シハロスリン、メトミル、パラチオン、チオカルブ、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、リナキシピル、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマネクチン−ベンゾエート、フィプロニル、エチプロール、デルタメトリン、β−シフルスリン、ガンマおよびラムダシハロスリン、4-[[(6-クロルピリジン-3-イル)メチル](2,2-ジフルオロエチル)アミノ]フラン-
2(5H)-オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、ベータ−シフルスリン。
ダイズ殺カビ剤:
アゾキシストロビン、シプロコナゾール、エポキシコナゾール、フルトリアフォル、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、プロチオコナゾール、テトラコナゾール。
以下の実施例は優良イベントEE−GM3、EE−GM1及びEE−GM2及びイベントEE−GM3とEE−GM1又はEE−GM3とEE−GM2のスタックを含有する植物の識別、及び、生物学的試料中の優良イベントEE−GM3、EE−GM1又はEE−GM2及びこれらのスタックの特異的識別のためのツールの開発を記載している。
実施例においては、特段の記載が無い限り、全ての組み換え手法は「Sambrook 1 and Russell DW (eds.) (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York" and in "Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K (eds.) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York」に記載されているような標準的なプロトコルに従って実施した。
標準物質及びレファレンスは「Croy RDD (ed.) (1993) Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford and Blackwell Scientific Publications, Oxford" and in "Brown TA, (1998) Molecular Biology LabFax, 2nd Edition, Academic Press, San Diego」に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のための標準物質及び方法は「McPherson MJ and M¢ller SG (2000) PCR (The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford" and in "PCR Applications Manual, 3rd Edition (2006), Roche Diagnostics GmbH, Mannheim or www.roche-applied-science.com」に記載されている。
以下の実施例におけるPCRプロトコルのようないずれかの実験室プロトコルにおける多くのパラメーターは特異的実験室条件に合わせることが必要な場合があり、そして類似の結果を得るために僅かに変更してよいと理解しなければならない。例えばDNAの調製のための異なる方法の使用又はPCR法における他のプライマーの選択が、PCRプロトコルに関する他の最適な条件を支配する場合がある。しかしながらこれらの調節は当業者には明らかであり、そして現在のPCR適用マニュアルに更に詳述されている。
説明及び例においは以下の配列を参照する。
配列番号1:ベクターpSF10のSalIフラグメントヌクレオチド配列
配列番号2:EE−GM3の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAにフランキングしている5’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号3:EE−GM3の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAにフランキングしている3’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号4:プライマーSOY028
配列番号5:プライマーSOY029
配列番号6:プライマーSMP187
配列番号7:プライマーSTV019
配列番号8:アンプリコンのヌクレオチド配列
配列番号9:対照フラグメントの増幅のためのプライマー1(SOY01)
配列番号10:対照フラグメントの増幅のためのプライマー2(SOY02)
配列番号11:pB2/P35SAcKのヌクレオチド配列
配列番号12:EE−GM1の外来性DNAにフランキングしている5’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号13:EE−GM1の外来性DNAにフランキングしている3’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号14:EE−GM2の外来性DNAにフランキングしている5’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号15:EE−GM2の外来性DNAにフランキングしている3’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号16:プライマーSOY06
配列番号17:プライマーSOY07
配列番号18:プライマーSOY09
配列番号19:プライマーSOY010
配列番号20:EE−GM3の外来性DNA及び植物フランキング配列のヌクレオチド配列
配列番号21:プライマーSHA130
配列番号22:プライマーSHA178
1. 除草剤耐性遺伝子によるGlycine maxの形質転換
1.1 2mEPSPS及びHPPD-Pf-W336キメラ遺伝子を含む外来性DNAの説明
プラスミドpSF10は約7,3kbのSalIフラグメント上に所在するキメラ2mepsps遺伝子及びキメラhppd-Pf-W336遺伝子を含有するpUC19由来クローニングベクターである。2つのSal1制限部位の間に含まれるDNAの完全な説明を以下の表1に示す。ヌクレオチド配列は配列番号1に示す。
Figure 0006470705
1.2 イベントEE−GM3
約7.3kbのHPLC精製SalI線状化pSF10フラグメント(2mEPSPSグリホセート耐性遺伝子及びHPPD阻害剤耐性遺伝子HPPD−Pf−W336を含有する)を用いてダイズJack種の細胞内への直接遺伝子転移(Nickell, C. D., G. R. Noel, D. J. Thomas, and R. Waller. Registration of 'Jack' soybean. Crop Sci 1365. 30.1990)、ついで、形質転換された植物細胞をトランスジェニック繁殖性ダイズ植物に再生することにより、形質転換されたダイズ植物を得た。
1.2.1 エリートイベントEE−GM3の同定
優良イベントEE−GM3は除草剤耐性遺伝子の良好な発現及び安定性に基づいて広範な選択手順に基づいて選択し、そして、植物の草丈、節までの高さ、起立性、活力、種子収量のような最適な作物学的特性とのその適合性を評価した。このイベントを含有するダイズ植物は同じキメラ遺伝子を用いて得られた種々異なる形質転換イベントの広範な範囲から選択した。本イベントの選択において使用したパラメーターは、以下の通り、即ち:a)圃場試験におけるイソキサフルトール除草剤適用への許容可能な耐性、b)圃場試験におけるグリホセート除草剤適用への許容可能な耐性、c)圃場試験におけるイソキサフルトール及びグリホセートの複合適用への許容可能な耐性、d)ベクター骨格の非存在下におけるダイズ植物ゲノムの単一の遺伝子座における除草剤耐性導入遺伝子の挿入、e)形質転換のために使用する親植物と類似の全体的作物性(成熟性、倒伏性、易罹患性等)、及び、f)形質転換DNAの挿入により生じる顕著な収量障害が無いこと(同じ条件下に生育させた形質転換に使用した植物系統のようなイベントを有さない同遺伝子系の系統と比較して)とした。
T3世代において、ダイズ形質転換優良イベントEE−GM3のホモ接合系統を種子生産用に選択した。多箇所反復の作物学的圃場試験を親品種であるJackの順応の領域において実施した。圃場評価は除草剤耐性及び作物学的性能を包含させた。EE−GM3を含む植物の作物学的性能はJackに匹敵することがわかった(除草剤を適用しない場合)。圃場評価は又、EE−GM3イベントを担持する植物が以下のもの:
− Jackと比較して類似の植物形態及び種子特性、
− Jackと比較してダイズの病気に対して変化が無いこと、及び、
− Jackと比較して種子の発芽又は休眠に変化が無いこと、
を有することを示していた。
グリーンハウス中初回形質転換体(T0)植物(イベントEE−GM3を生産するようにコンストラクトで形質転換された植物)から収穫した種子(T1又はS1世代)を圃場に植栽した。3ブロックに植栽し、そして0、2又は4kg/haのグリホセートを噴霧した。除草剤グリホセートに対して所望のレベルの耐性を呈している植物から種子を収穫した。
圃場に生育した自己受粉したT1植物から収穫した種子(T2世代)を「一個体一列(plant to row)」となるように播種した。列の分離データ(完全又は部分的に耐性)及び列内部の個体植物(耐性性又は感受性)のカイ自乗分析は、EE−GM3の単一の挿入の予測されたメンデル遺伝を示している。
選択及び種子増大は、系統が形質転換イベントEE−GM3に関してホモ接合であると決定され、そして第4世代におけるコア種子生産のために選択されるまで継続した。次に、T5世代の種子を種々の品種の開発のための候補として使用した。第6世代(T6世代)の植物を、商業用ダイズ生殖質により広範にイベントを移動させるように設計された遺伝子移入プログラムにおいて従来のダイズ繁殖系統と交雑させた。F1雑種植物(EE−GM3系統x従来系統)を成熟するまで生育させ、そしてF2種子を植栽した。901F2植物の葉試料をEE−GM3インサートの接合生殖性を識別するために設計されたPCRプライマーにより分析した。メンデルの法則による単一挿入分離に関する1:2:1の予測比が観察された。
選択されたイベントEE−GM3を種々異なる商業的遺伝子背景において導入し、そして種々異なる箇所における圃場試験の結果を比較した。種々異なる処理を用いながらグリホセート除草剤及び/又はイソキサフルトール除草剤で植物を攻撃した。植物は良好な除草剤耐性を示した。イベントEE−GM3を含有する数百種の異なるダイズ栽培品種を遺伝試験において使用し、そして除草剤を適用した。この試行から選択された系統を後に圃場で増大させ、そして類似に除草剤で処理した。その試行から、50の選択された系統を増大させ、そしてこれらもまた除草剤処理した。イソキサ フルトール及びグリホセートを噴霧した後者の系統に関する植物毒性評点は応答においてある程度の変動性を示したが、系統間の応答の範囲は同じ処理及び環境の条件下に生育させた元のJackの背景におけるEE−GM3イベントの4反復に渡って観察されたとおり類似の変動性を示していた。従って広範な生殖質に渡る該当除草剤に対する耐性がEE−GM3を含む植物で観察された。
更に又、イベントEE−GM3を含有する植物は正常な葉、花及び鞘の形態、優れた繁殖性を示し、そして多数の遺伝子的背景において疾患又は異常な昆虫への感受性を示さなかった。多数の遺伝子的背景内への遺伝子移入の間、異変の問題や異常は観察されなかった。
1季節において、10箇所の試験を設計することにより、形質転換親品種Jack及び幾つかの非トランスジェニックのダイズ栽培品種への形質転換イベントEE−GM3を含む二重除草剤耐性ダイズの作物学的性能を比較した。無作為完全ブロック設計を用いながら、EE−GM3植物を従来の雑草制御によるか、又は意図する除草剤であるグリホセート及びイソキサフルトールを用いながら、重複の区画において生育させた。形質転換イベントEE−GM3を含有するダイズ植物の区画にイソキサフルトール除草剤を目標比率70グラムai/Haで、そしてグリホセート除草剤を目標比率1060グラムai/Haで噴霧した。除草剤適用は、概ねV4−V5の植物成長段階において葉面噴霧としてこれらの植物に対して行った。作物学的観察は、季節の早期、中期及び後期の季節に実施した。植物密度(パラメーター;起立数)はJack及び非トランスジェニックの品種の区画のほうが、イベントEE−GM3区画よりも、1標準偏差分高値であった。早期の起立数の差は種子ロットの品質の結果であったと考えられ、その理由は、EE−GM3植栽種子は逆季節苗床において生産され、非トランスジェニック品種の種子は隣接した合衆国通常生産季節に生産されたためである。しかしながら、50%出芽及び植物活力格付けを達成するための日数は同じであり、種子ロットがそれらの性能パラメーターに関しては同等であることを示していた。後期の季節の起立数においては、Jack及び非トランスジェニック品種はEE−GM3植物とは1標準偏差分異なったままであった。EE−GM3イベント植物の区画収量はやはり1標準偏差分Jackのものよりも低値であり、恐らくはEE−GM3イベント区画の低い植物密度の結果であると考えられた。非トランスジェニック品種の収量は、より最近の品種において観察される収穫力における進歩から予測される通り、Jackよりも高値であった。
1つの試行において、植物健康状態格付けは3つの生育段階、即ちV4−5、R1及び完全成熟において行った。初回評価は意図する除草剤適用後、早期に実施した。最終植物健康状態評価の時点において、両方の除草剤を噴霧されたEE−GM3含有植物は未噴霧Jack植物、又はEE−GM3を含む未噴霧植物と同じ評点を有していた。作物学的担当者による格付けにおいて、除草剤噴霧植物はV4−5及びR1の植物生育段階において3〜4(中等度の傷害)の健康状態格付けを受けた。未噴霧の植物(未形質転換Jack又はEE−GM3含有ダイズ植物)は4.6〜4.8に格付けされた(格付け5は無傷害を意味する)。最終植物健康状態格付け時には、全ての区画が同じ格付け5(無傷害)を受けた。
1試行季節は並外れた降雨の季節であり、意図する除草剤の後のEE−GM3植物における作物傷害は他の季節で観察されたものより明白であった。圃場評価は又、健常性(繁殖、疾患抵抗性、肥沃度、種子分散性、休眠状態、永続性)のモニタリングを包含していた。繁殖特性、即ち出芽までの日数、50%開花までの日数、及び90%鞘成熟までの日数に関しては、EE−GM3及びJack植物は差がなかった。植物疾患及び害虫の天然の蔓延に対する反応においては差は観察されなかった。EE−GM3はJackより低値の究極的収量をもたらしたが、肥沃度(100種重量)における差は観察されなかった。種子分散パラメーターの検定(鞘崩壊及び植物倒伏)においては、EE−GM3及びJackは同じ鞘崩壊評点を有していたが、EE−GM3植物が倒伏しにくかった。10箇所から収穫された種子の評価では発芽又は休眠状態の試験により生じた懸念はなかった。
並外れた降雨のあった季節の間のこれらの試行の間、EE−GM3植物の最終収量は雑草抑制処理に関わらず1標準偏差分Jackより低値であった(恐らくはEE−GM3イベント区画のより低値の植物密度の結果)。並外れた湿潤季節においては、作物傷害(作物区域の10〜30%において白化)がグリホセート及びイソキサフルトール除草剤の葉面適用後6週間までEE−GM3区画では報告された。しかしながら、成熟時までに、「無傷害」の植物の健康状態の格付けは全ての区画に割り付けられた。優良ダイズ栽培品種背景において遺伝子移入されたEE−GM3を用いた重複多数箇所圃場試行は、導入遺伝子を含有しない近−同遺伝子系の姉妹系統と比較して、イベントEE−GM3を含有する植物と近−同遺伝子系の系統の間に収量の差がないことを示すと期待される(除草剤処理の非存在下)。
更に又、重複圃場試行において、IFT(70グラムai/ha+0.5%NIS,Agridex)で出芽前又は出芽後に処理した場合に、顕著な作物耐性(10%未満の白化)がEE−GM3を含むダイズ植物で観察されたが、別のHPPD阻害剤除草剤であるピラスルフォトール(35グラムai/ha+0.5%NIS,Agridex)の出芽後適用により処理した場合に、EE−GM3を含むダイズ植物でまた顕著な作物耐性(10%未満の白化)が観察された。
1.2.2 フランキング領域及び優良イベントEE−GM3の外来性DNAの識別
EE−GM3優良イベントにおける除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAにフランキングする領域の配列を以下の通り決定した。
1.2.2.1. 右(5’)フランキング領域
5’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列を配列番号2に示す。ヌクレオチド1〜1451の配列は植物DNAに相当し、ヌクレオチド1452〜1843の配列は外来性DNAに相当する。
1.2.2.2. 左(3’)フランキング領域
3’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列を配列番号3に示す。ヌクレオチド1〜240の配列は外来性DNAに相当し、ヌクレオチド241〜1408の配列は植物DNAに相当する。
1.2.2.3. EE−GM3の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNA
種々異なる分子手法を用いて除草剤耐性遺伝子を含む優良イベントEE−GM3の外来性DNAがヘッドトゥーヘッド(head to head)方向の2つの部分的3’ヒストンAt配列とそれに続くヘッドトゥーテイル(head to tail)方向に配置したpSF10のSalIフラグメントの2つのほぼ完全なコピーを含有することが決定されている(図1参照)。
即ち、EE−GM3の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAは順次以下の配列を含有する。
−ヌクレオチド1からヌクレオチド199まで:配列番号1のnt6760からnt6958までのヌクレオチド配列の相補体に相当するヌクレオチド配列;
−ヌクレオチド200からヌクレオチド624まで:配列番号1のnt6874からnt7298までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列;
−ヌクレオチド625からヌクレオチド7909まで:配列番号1のnt7からnt7291までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列;
−ヌクレオチド7910からヌクレオチド15163まで:配列番号1のnt12からnt7265までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列;及び、
−ヌクレオチド15164からヌクレオチド15187まで:配列番号3のnt217からnt240までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列(この配列はpSF10プラスミドDNA又はwt植物DNAの何れにも相当せず、従ってフィラーDNAと標記する)。
本外来性DNAは、直近上流において外来性DNAと隣接して、配列番号2のヌクレオチド1から1451までの5’フランキング配列により先行されており、そして、直近下流において外来性DNAと隣接して、配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの3’フランキング配列により後続されている。
EE−GM3中の外来性DNA及びフランキングDNA配列の確認された完全DNA配列決定によれば、配列番号20に報告されている配列が得られている。この配列において、挿入されたDNAはヌクレオチド位置1452からヌクレオチド位置16638であり、そしてヘッドトゥーテイル方向に配置したpSF10由来の2つのほぼ完全なコピーはヌクレオチド位置2257からヌクレオチド位置16601である。配列番号20の5’フランキングDNA配列は配列番号20のヌクレオチド位置1からヌクレオチド位置1451までの配列であり、配列番号20の3’フランキングDNA配列は配列番号20のヌクレオチド位置16639からヌクレオチド位置17806までの配列である。
1.3.ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼキメラ遺伝子を含む外来性DNAの説明
プラスミドpB2/P35SAcKはキメラpat遺伝子を含有するpUC19誘導クローニングベクターである。ベクターの説明は以下の表2に示す。そのヌクレオチド配列は配列番号11に示す。
Figure 0006470705
1.4 イベントEE−GM1
1.4.1 EE−GM1の識別
除草剤抵抗性ダイズは直接遺伝子転移を用いながらベクターpB2/P35SAcKを用いる大豆の形質転換により発生させた。
優良イベントEE−GM1は除草剤抵抗性遺伝子の良好な発現及び安定性及び最適作物学的特性とのその適合性に基づいて広範な選択手順に基づいて選択した。
1.4.2 優良イベントEE−GM1のフランキング領域及び外来性DNAの識別
1.4.2.1. 右(5’)フランキング領域
5’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列を配列番号12に示す。ヌクレオチド1〜209の配列は植物DNAに相当し、ヌクレオチド210〜720の配列は外来性DNAに相当する。
1.4.2.2. 左(3’)フランキング領域
3’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列を配列番号13に示す。ヌクレオチド1〜568の配列は外来性DNAに相当し、ヌクレオチド569〜1000の配列は植物DNAに相当する。
1.4.2.3. EE−GM1の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNA
種々異なる分子手法を用いて除草剤耐性遺伝子を含む優良イベントEE−GM1の外来性DNAが直接リピート構造においてキメラpat遺伝子のコピー2つを含むことが決定されている(図3参照)。
即ち、EE−GM1の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAは順次以下の配列を含有する。
−ヌクレオチド1からヌクレオチド3122まで:配列番号11のnt340からnt3461までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列;
−ヌクレオチド3123からヌクレオチド3458まで:配列番号11のnt1からnt336までのヌクレオチド配列の相補体に相当するヌクレオチド配列;
−ヌクレオチド3459からヌクレオチド4073まで:配列番号11のnt3462からnt4076までのヌクレオチド配列の相補体に相当するヌクレオチド配列;
−ヌクレオチド4074からヌクレオチド6780まで:配列番号11のnt337からnt3043までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列;及び、
−ヌクレオチド6781からヌクレオチド6790まで:配列番号13のnt559からnt568までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列(この配列はプラスミドDNA又はwt植物DNAの何れにも相当せず、従ってフィラーDNAと標記する)。
EE−GM1の本外来性DNAは、直近上流において外来性DNAと隣接して、配列番号12のヌクレオチド1から209までの5’フランキング配列において先行されており、そして、直近下流において外来性DNAと隣接して、配列番号13のヌクレオチド569からヌクレオチド1000までの3’フランキング配列において後続されている。
1.5.イベントEE−GM2
除草剤抵抗性ダイズは直接遺伝子転移を用いながらベクターpB2/P35SAcKを用いる大豆の形質転換により発生させた。
優良イベントEE−GM2は除草剤抵抗性遺伝子の良好な発現及び安定性及び最適作物学的特性とのその適合性に基づいて広範な選択手順に基づいて選択した。
1.5.1 優良イベントEE−GM2のフランキング領域及び外来性DNAの識別
1.5.1.1. 右(5’)フランキング領域
5’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列を配列番号14に示す。ヌクレオチド1〜311の配列は植物DNAに相当し、ヌクレオチド312〜810の配列は外来性DNAに相当する。
1.5.1.2. 左(3’)フランキング領域
3’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列を配列番号15に示す。ヌクレオチド1〜507の配列は外来性DNAに相当し、ヌクレオチド569〜1880の配列は植物DNAに相当する。
1.5.1.3. EE−GM2の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNA
種々異なる分子手法を用いて除草剤耐性遺伝子を含む優良イベントEE−GM2の外来性DNAがキメラpat遺伝子のコピー1つを含むことが決定されている(図4参照)。
即ち、EE−GM2の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAは順次以下の配列を含有する。
−ヌクレオチド1からヌクレオチド391まで:配列番号11のnt3458からnt3848までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列;及び、
−ヌクレオチド392からヌクレオチド3436まで:配列番号11のnt413からnt3457までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列。
EE−GM2の本外来性DNAは、直近上流において外来性DNAと隣接して、配列番号14のヌクレオチド1から311までの5’フランキング配列において先行されており、そして、直近下流において外来性DNAと隣接して、配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までの3’フランキング配列において後続されている。
2.EE−GM3に関するポリメラーゼ連鎖反応識別プロトコルの開発
2.1. プライマー
優良イベント内部の配列を認識する特異的プライマーを開発した。
EE−GM3の3’フランキング領域内部の配列を認識するプライマーを開発した。次に第2のプライマーを、外来性DNAの配列内部において、プライマーが約263ヌクレオチドの配列に渡るように選択した。以下のプライマーがEE−GM3DNA上のPCR反応において特に明確で再現性のある結果をもたらすことがわかった。
SOY028: 5'-ATC.gCT.TTA.ACg.TCC.CTC.Ag -3 (配列番号 4)(標的:インサートDNA)
SOY029: 5' -CAA.ggC.CTC.gAg.ATT.ATC -3'(配列番号 5)(標的: 植物DNA)
内因性配列をターゲティングするプライマーは好ましくはPCRカクテルに包含される。これらのプライマーは未知試料において、そしてDNA陽性対照において、内部対照として使用される。内因性プライマー対を用いた場合の陽性結果(413bpのPCR増幅フラグメントの存在)は発生させるべきPCR産物のためのゲノムDNA調製において十分な品質のアンプルDNAがあることを示している。内因性プライマーは以下の内因性アクチンダイズ遺伝子を認識するように選択した。
SOY01 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT -3' (配列番号 9)
SOY02 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC -3' (配列番号 10)
2.2.増幅されるフラグメント
PCR反応で予測される増幅されるフラグメントは以下の通りである。
プライマー対SOY01-SOY02の場合:413bp(内因性対照)
プライマー対SOY028-SOY029の場合:263bp(EE−GM3優良イベント)
2.3.鋳型DNA
鋳型DNAはEdwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991)に従ってリーフパンチ葉片から調製した。他の方法で調製したDNAを使用する場合、鋳型の種々異なる量を利用するテストランを実施しなければならない。通常はゲノム鋳型DNA50ngが最良の結果をもたらす。
2.4.割り付ける陽性及び陰性対照
誤った陽性又は陰性を回避するためには以下の陽性及び陰性対照がPCRランに包含されなければならない。
− マスターミックス対照(DNA陰性対照)。これは反応にDNAを加えないPCRである。予測される結果であるPCR産物無しが観察される場合、これはPCRカクテルに標的DNAが混在していなかったことを指す。
− DNA陽性対照(トランスジェニック配列を含有することがわかっているゲノムDNA試料)。この陽性対照の増幅の成功は標的配列の増幅を可能にする条件下にPCRがランされたことを示す。
− 野生型DNA対照。これは与えられた鋳型DNAが非トランスジェニック植物から調製されたゲノムDNAであるPCRである。予測される結果であるトランスジェニックPCR産物の増幅無し、ただし内因性PCR産物の増幅有りが観察される場合、これはゲノムDNA試料中に検出可能な導入遺伝子のバックグラウンド増幅が無いことを示している。
2.5.PCR条件
最適な結果は以下の条件下に得られた(最適な結果のための種々の条件を記載する場合、そのような条件の例を与えることを意味する。当然ながら当業者は条件、試薬及びパラメーターを変更する場合があり、例えば他のTaqポリメラーゼを用いて所望の結果を達成しても良い)。
−25μl反応用PCRミックスは下記のものを含有する。
20ng鋳型DNA
2.5μLの10x増幅緩衝液(Taqポリメラーゼの製造元により供給)
0.5μLの10mMdNTP類
0.4μLのSOY01(10ピコモル/μL)
0.4μLのSOY02(10ピコモル/μL)
0.7μLのSOY028(10ピコモル/μL)
0.7μLのSOY029(10ピコモル/μL)
0.1μLのTaqDNAポリメラーゼ(5単位/μL)
25μL定容とする水
−最適な結果のために従うべき熱サイクリングプロファイルは以下の通りである。
95℃4分間
次いで: 95℃1分間
57℃1分間
72℃2分間
5サイクル
次いで: 92℃30秒
57℃30秒
72℃1分間
25サイクル
次いで: 72℃10分間
2.6.アガロースゲル分析
PCRの結果を最適に可視化するために、PCR試料10〜20μLを適切な分子量マーカー(例えば100bpラダーPharmacia)と共に1.5%アガロースゲル(Trisホウ酸塩緩衝液)上にアプライしなければならないとした。
2.7.結果の検証
単一のPCRラン及び単一のPCRカクテルの内部におけるトランスジェニック植物DNA試料から得られたデータは、1)DNA陽性対照が予測されたPCR産物(トランスジェニック及び内因性のフラグメント)を示し、2)DNA陰性対照がPCR増幅に関して陰性(フラグメント無し)であり、そして3)野生型DNA対照が予測された結果(内因性フラグメント増幅)を示すことが成立しない限り許容してはならないとした。
上記したEE−GM3に関するPCR識別プロトコルに従った場合、予測されるサイズのトランスジェニック及び内因性PCR産物の目視可能な量を示すレーンは、ゲノム鋳型DNAの調製元の相当する植物がEE−GM3優良イベントを受け継いでいることを示している。トランスジェニックPCR産物の何れかの目視可能な量を示さず、そして内因性PCR産物の目視可能な量を示しているレーンは、ゲノム鋳型DNAの調製元の相当する植物が優良イベントを含まないことを示している。内因性およびトランスジェニックのPCR産物の目視可能な量を示さないレーンはゲノムDNAの質及び/又は量がPCR産物を発生させることができなかったことを示している。これらの植物は採点することができない。ゲノムDNA調製は繰り返されなければならず、そして適切な対照を用いながら新たなPCRランを実施しなければならない。
2.8.EE−GM3を識別するための判別PCRプロトコルの使用
未知物のスクリーニングを試みる前に、全ての適切な対照を用いたテストランを実施する。開発されたプロトコルは実験室間で異なる要素のために最適化も必要とするかもしれない(鋳型DNA調製、TaqDNAポリメラーゼ、プライマーの品質、dNTP類、サーモサイクラー等)。
内因性配列の増幅はプロトコルにおける重要な役割を果たす。1つは既知トランスジェニックゲノムDNA鋳型における内因性及びトランスジェニックの配列の両方の等モル量を増幅するPCR及び熱サイクリングの条件を得ることである。ターゲティングされる内因性フラグメントが増幅されない場合、又は、ターゲティングされる配列がアガロースゲル電気泳動で判断した場合に同じ臭化エチジウム染色強度で増幅されない場合は、PCR条件の最適化が必要な場合がある。
一部がEE−GM3を含む多くのダイズ植物に由来する葉材料を上記したプロトコルに従って試験した。優良イベントEE−GM3由来及びダイズ野生型由来の試料をそれぞれ陽性及び陰性対照として採取した。
図2は多くのダイズ植物試料上のEE−GM3に関して、優良イベントPCR識別プロトコルを用いて得られた結果を示す。レーン2及び3の試料は263bpのバンドが検出されていることから優良イベントEE−GM3を含有することがわかり、レーン4〜8の試料はEE−GM3を含んでいない。レーン6及び7は同じ除草剤耐性キメラ遺伝子を用いて得られた他のダイズ形質転換イベントに由来する試料を含み;レーン8は野生型ダイズ植物由来のDNAを含有し、そしてレーン9は陰性対照(水)試料を示し、レーン1及び10は分子量マーカー(100bpラダー)を示す。
2.9.バルク化種子におけるEE−GM3検出のためのdPCRアッセイ
判別PCR(dPCR)アッセイをバルク化種子中のEE−GM3の低レベルの存在を検出するためにセットアップする。非トランスジェニック種子のバルク中のトランスジェニック種子の0.4%(w/w)の最低レベルが反復可能な条件下に良好に検出できた。従って検出限界を0.4%(w/w)と決定した。
以下のプライマーをこの標的PCR反応に適用する。
T−DNA配列にターゲティングされたフォワードプライマー:
SHA130 5'- CTA.TAT.TCT.ggT.TCC.AAT.TTA.TC -3' (配列番号l2)
3’フランキング配列にターゲティングされたリバースプライマー:
SMP178 5'- TgA.ggC.ACg.TAT.TgA.TgA.CC- 3'(配列番号13)
これらのプライマーからPCR反応において予測される増幅されたフラグメントは115bpである。
変更したGentra PuregeneDNA精製抽出キット(Qiagen)に従って粉砕バルク化種子から調製した鋳型DNA約200ngに対して標的PCR反応を実施した。他の方法で調製したDNAを使用する場合、EE−GM3の既知相対レベルを有する試料を用いたテストランを実施しなければならない。
内因性配列にターゲティングした検証されたレファレンス系のPCR反応は、理想的には、誤った陰性結果を回避するためにPCR分析に対するDNA試料の適性を検証するために、別個のPCRランにおいて実施しなければならない。
未知試験試料に関しては、PCR実験は理想的には適切な陽性及び陰性対照試料、即ち如何に記載するものを包含しなければならない。
− マスターミックス対照(DNA陰性対照)。これは反応にDNAを加えないPCRである。標的及びレファレンス系の反応の両方に関して予測される結果(PCR産物無し)が観察される場合、これはPCRカクテルに標的DNAが混在していなかったことを指す。
− DNA陽性対照(トランスジェニック配列を含有することがわかっているゲノムDNA試料)。この陽性対照の増幅の成功は標的配列の増幅を可能にする条件下にPCRがランされたことを示す。
− 類似に野生型DNA対照をこのPCRに加えることができる。これは与えられた鋳型DNAが非トランスジェニック植物から調製されたゲノムDNAであるPCRである。予測される結果であるトランスジェニックPCR産物の増幅無し、ただし内因性PCR産物の増幅有りが観察される場合、これはゲノムDNA試料中に検出可能な導入遺伝子のバックグラウンド増幅が無いことを示している。
最適な結果は以下の条件下に得られる。
−25μl反応用PCRミックスは下記のものを含有する。
200ngの鋳型DNA
5μLの5x反応緩衝液
0.25μLの20mMdNTP類
0.7μLのSHA130(10ピコモル/L)
0.4μLのSMP178(10ピコモル/L)
0.1μLのGO−TaqDNAポリメラーゼ(5単位/L)
25μL定容とする水
−最適な結果のために従うべき熱サイクリングプロファイルは以下の通りである。
95℃4分間
次いで: 95℃1分間
57℃1分間
72℃2分間
5サイクル
次いで: 92℃30秒
57℃30秒
72℃1分間
30サイクル
次いで: 72℃10分間
PCRの結果を最適に可視化するために、PCR産物25μLを適切な分子量マーカー(例えば50bpラダー)と共に1.5%アガロースゲル(Trisホウ酸塩緩衝液)上にアプライしなければならないとした。
上記したPCR法に従う場合、予測されるサイズの標的及びレファレンス系のPCR産物の目視可能な量を示すレーンはゲノム鋳型DNAの調製元の被験試料が標的反応の検出限界より高いEE−GM3優良イベントのレベルを含有していたことを示す。
標的PCR産物の目視可能な量を示さないが、レファレンス系PCR産物の目視可能な量を示すレーンはゲノム鋳型DNAの調製元の被験試料が標的反応の検出限界より低いEE−GM3のレベル優良イベントを含有していたことを示す。
内因性及びトランスジェニックのPCR産物の目視可能な量を示さないレーンはゲノムDNAの質及び/又は量がPCR産物を発生させることができなかったことを示している。これらの植物は採点することができない。ゲノムDNA調製は繰り返されなければならず、そして適切な対照を用いながら新たなPCRランを実施しなければならない。
3.EE−GM3を含む物質の検出のためのプローブとしての特異的組み込みフラグメントの使用
EE−GM3の特異的組み込みフラグメントは、配列番号8のヌクレオチド配列を有するアンプリコンをもたらす特異的プライマーSOY028(配列番号4)及びSOY029(配列番号5)を用いたPCR増幅によるか、又は、化学合成により得られ、そして標識される。この組み込みフラグメントを、生物学的試料中のEE−GM3の検出のための特異的プローブとして使用する。核酸は標準的操作法に従って試料から抽出される。次にこの核酸をハイブリッドの形成を可能にするように最適化されたハイブリダイゼーション条件下に特異的プローブと接触させる。次にハイブリッドの形成が検出され、試料中のEE−GM3核酸の存在を示す。場合により、試料中の核酸は、特異的プローブとの接触よりも前に特異的プライマーを用いて増幅される。或いは、組み込みフラグメントの代わりに特異的プローブと接触させる前に核酸を標識する。場合により試料との接触の前に特異的プローブを固体担体(例えば限定しないがフィルター、ストリップ又はビーズ)に結合させる。
4.EE−GM1に関するポリメラーゼ連鎖反応識別プロトコル
4.1.プライマー
優良イベント内部の配列を認識する特異的プライマーを開発した。より特記すれば、EE−GM1の5’フランキング領域内部の配列を認識するプライマーを開発した。次に第2のプライマーを、外来性DNAの配列の内部で、プライマーが約183ヌクレオチドの配列に渡るように選択した。以下のプライマーがEE−GM1DNA上のPCR反応において特に明確で再現性のある結果をもたらすことがわかった。
SOY06 5'-ggC.gTT.CgT.AgT.gAC.TgA.gg-3'(配列番号16)
(標的:植物DNA)
SOY07 5'-gTT.TTA.CAA.CgT.CgT.gAC.Tgg-3'(配列番号17)
(標的:インサートDNA)
内因性配列をターゲティングするプライマーは好ましくはPCRカクテルに包含される。これらのプライマーは未知試料において、そしてDNA陽性対照において、内部対照として使用される。内因性プライマー対を用いた場合の陽性結果は発生させるべきPCR産物のためのゲノムDNA調製において十分な品質のアンプルDNAがあることを示している。内因性プライマーはGlycine maxにおけるハウスキーピング遺伝子を認識するように選択した。
SOY01 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT -3' (配列番号 9)
(Glycine maxアクチン1遺伝子に所在(アクセッションJ01298))
SOY02 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC -3' (配列番号 10)
(Glycine maxアクチン1遺伝子に所在(アクセッションJ01298))
4.2.増幅されるフラグメント
PCR反応で予測される増幅されるフラグメントは以下の通りである。
プライマー対SOY01-SOY02の場合:413bp(内因性対照)
プライマー対SOY06-SOY07の場合:183bp(EE−GM1優良イベント)
4.3.鋳型DNA
鋳型DNAはEdwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991)に従ってリーフパンチ葉片から調製した。他の方法で調製したDNAを使用する場合、鋳型の種々異なる量を利用するテストランを実施しなければならない。通常はゲノム鋳型DNA50ngが最良の結果をもたらす。
4.4.割り付ける陽性及び陰性対照
誤った陽性又は陰性を回避するためには以下の陽性及び陰性対照がPCRランに包含されなければならない。
− マスターミックス対照(DNA陰性対照)。これは反応にDNAを加えないPCRである。予測される結果であるPCR産物無しが観察される場合、これはPCRカクテルに標的DNAが混在していなかったことを指す。
− DNA陽性対照(トランスジェニック配列を含有することがわかっているゲノムDNA試料)。この陽性対照の増幅の成功は標的配列の増幅を可能にする条件下にPCRがランされたことを示す。
− 野生型DNA対照。これは与えられた鋳型DNAが非トランスジェニック植物から調製されたゲノムDNAであるPCRである。予測される結果であるトランスジェニックPCR産物の増幅無し、ただし内因性PCR産物の増幅有りが観察される場合、これはゲノムDNA試料中に検出可能な導入遺伝子のバックグラウンド増幅が無いことを示している。
4.5.PCR条件
最適な結果は以下の条件下に得られた。
−25μl反応用PCRミックスは下記のものを含有する。
2.5μL鋳型DNA
2.5μLの10x増幅緩衝液(Taqポリメラーゼと共に供給)
0.5μLの10mMdNTP類
0.5μLのSOY06(10ピコモル/μL)
0.5μLのSOY07(10ピコモル/μL)
0.25μLのSOY01(10ピコモル/μL)
0.25μLのSOY02(10ピコモル/μL)
0.1μLのTaqDNAポリメラーゼ(5単位/μL)
25μL定容とする水
−最適な結果のために従うべき熱サイクリングプロファイルは以下の通りである。
95℃4分間
次いで: 95℃1分間
57℃1分間
72℃2分間
5サイクル
次いで: 92℃30秒
57℃30秒
72℃1分間
25サイクル
次いで: 72℃5分間
4.6.アガロースゲル分析
PCRの結果を最適に可視化するために、PCR試料10〜20μLを適切な分子量マーカー(例えば100bpラダーPharmacia)と共に1.5%アガロースゲル(Trisホウ酸塩緩衝液)上にアプライしなければならないとした。
4.7.結果の検証
単一のPCRラン及び単一のPCRカクテルの内部におけるトランスジェニック植物DNA試料から得られたデータは、1)DNA陽性対照が予測されたPCR産物(トランスジェニック及び内因性のフラグメント)を示し、2)DNA陰性対照がPCR増幅に関して陰性(フラグメント無し)であり、そして3)野生型DNA対照が予測された結果(内因性フラグメント増幅)を示すことが成立しない限り許容してはならないとした。
上記したEE−GM1に関するPCR識別プロトコルに従った場合、予測されるサイズのトランスジェニック及び内因性PCR産物の目視可能な量を示すレーンは、ゲノム鋳型DNAの調製元の相当する植物がEE−GM1優良イベントを受け継いでいることを示している。トランスジェニックPCR産物の何れかの目視可能な量を示さず、そして内因性PCR産物の目視可能な量を示しているレーンは、ゲノム鋳型DNAの調製元の相当する植物が優良イベントを含まないことを示している。内因性およびトランスジェニックのPCR産物の目視可能な量を示さないレーンはゲノムDNAの質及び/又は量がPCR産物を発生させることができなかったことを示している。これらの植物は採点することができない。ゲノムDNA調製は反復しなければならず、そして適切な対照を用いながら新たなPCRランを実施しなければならない。
4.8.EE−GM1を識別するための判別PCRプロトコルの使用
未知物のスクリーニングを試みる前に、全ての適切な対照を用いたテストランを実施する。開発されたプロトコルは実験室間で異なる要素のために最適化を必要とするかもしれない(鋳型DNA調製、TaqDNAポリメラーゼ、プライマーの品質、dNTP類、サーモサイクラー等)。
内因性配列の増幅はプロトコルにおける重要な役割を果たす。1つは既知トランスジェニックゲノムDNA鋳型における内因性及びトランスジェニックの配列の両方の等モル量を増幅するPCR及び熱サイクリングの条件を得ることである。ターゲティングされる内因性フラグメントが増幅されない場合、又は、ターゲティングされる配列がアガロースゲル電気泳動で判断した場合に同じ臭化エチジウム染色強度で増幅されない場合は、PCR条件の最適化が必要な場合がある。
一部がEE−GM1を含む多くの植物に由来するGlycine max葉材料を上記したプロトコルに従って試験した。優良イベントEE−GM1由来及びGlycine max野生型由来の試料をそれぞれ陽性及び陰性対照として採取した。
図5は多くのダイズ植物試料上のEE−GM1に関して、優良イベントPCR識別プロトコルを用いて得られた結果を示す(レーン1〜14)。レーン1の試料は185bpのバンドが検出されていることから優良イベントを含有することがわかり、レーン2、3及び4の試料はEE−GM1を含んでいない。レーン2は別のダイズ優良イベントを含み、レーン3は非トランスジェニックのGlycine max対照をあらわし;レーン4は陰性対照(水)試料を示し、そしてレーン5は分子量マーカー(100bp)を示す。
5.EE−GM3を含む物質の検出のためのプローブとしての特異的組み込みフラグメントの使用
EE−GM1の特異的組み込みフラグメントは、特異的プライマーSOY06(配列番号16)及びSOY07(配列番号17)を用いたPCR増幅によるか、又は、化学合成により得られ、そして標識される。この組み込みフラグメントを、生物学的試料中のEE−GM1の検出のための特異的プローブとして使用する。核酸は標準的操作法に従って試料から抽出される。次にこの核酸をハイブリッドの形成を可能にするように最適化されたハイブリダイゼーション条件下に特異的プローブと接触させる。次にハイブリッドの形成が検出され、試料中のEE−GM1核酸の存在を示す。場合により、試料中の核酸は、特異的プローブとの接触よりも前に特異的プライマーを用いて増幅される。或いは、組み込みフラグメントの代わりに特異的プローブと接触させる前に核酸を標識する。場合により試料との接触の前に特異的プローブを固体担体(例えば限定しないがフィルター、ストリップ又はビーズ)に結合させる。
6.EE−GM2に関するポリメラーゼ連鎖反応識別プロトコル
6.1.プライマー
優良イベント内部の配列を認識する特異的プライマーを開発した。より特記すれば、EE−GM2の3’フランキング領域内部の配列を認識するプライマーを開発した。次に第2のプライマーを、外来性DNAの配列の内部で、プライマーが約150ヌクレオチドの配列に渡るように選択した。以下のプライマーがEE−GM2DNA上のPCR反応において特に明確で再現性のある結果をもたらすことがわかった。
SOY09 5'-TgT.ggT.TAT.ggC.ggT.gCC.ATC-3'(配列番号18)
(標的:植物DNA)
SOY010 5'-TgC.TAC.Agg.CAT.CgT.ggT.gTC-3'(配列番号19)
(標的:インサートDNA)
内因性配列をターゲティングするプライマーは好ましくはPCRカクテルに包含される。これらのプライマーは未知試料において、そしてDNA陽性対照において、内部対照として使用される。内因性プライマー対を用いた場合の陽性結果は発生させるべきPCR産物のためのゲノムDNA調製において十分な品質のアンプルDNAがあることを示している。内因性プライマーはGlycine maxにおけるハウスキーピング遺伝子を認識するように選択した。
SOY01 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT -3' (配列番号 9)
(Glycine maxアクチン1遺伝子に所在(アクセッションJ01298))
SOY02 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC -3' (配列番号 10)
(Glycine maxアクチン1遺伝子に所在(アクセッションJ01298))
6.2.増幅されるフラグメント
PCR反応で予測される増幅されるフラグメントは以下の通りである。
プライマー対SOY01-SOY02の場合:413bp(内因性対照)
プライマー対SOY09-SOY010の場合:151bp(EE−GM2優良イベント)
6.3.鋳型DNA
鋳型DNAはEdwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991)に従ってリーフパンチ葉片から調製した。他の方法で調製したDNAを使用する場合、鋳型の種々異なる量を利用するテストランを実施しなければならない。通常はゲノム鋳型DNA50ngが最良の結果をもたらす。
6.4.割り付ける陽性及び陰性対照
誤った陽性又は陰性を回避するためには以下の陽性及び陰性対照がPCRランに包含されなければならない。
− マスターミックス対照(DNA陰性対照)。これは反応にDNAを加えないPCRである。予測される結果であるPCR産物無しが観察される場合、これはPCRカクテルに標的DNAが混在していなかったことを指す。
− DNA陽性対照(トランスジェニック配列を含有することがわかっているゲノムDNA試料)。この陽性対照の増幅の成功は標的配列の増幅を可能にする条件下にPCRがランされたことを示す。
− 野生型DNA対照。これは与えられた鋳型DNAが非トランスジェニック植物から調製されたゲノムDNAであるPCRである。予測される結果であるトランスジェニックPCR産物の増幅無し、ただし内因性PCR産物の増幅有りが観察される場合、これはゲノムDNA試料中に検出可能な導入遺伝子のバックグラウンド増幅が無いことを示している。
6.5.PCR条件
最適な結果は以下の条件下に得られた。
−25μl反応用PCRミックスは下記のものを含有する。
2.5μL鋳型DNA
2.5μLの10x増幅緩衝液(Taqポリメラーゼと共に供給)
0.5μLの10mMdNTP類
0.5μLのSOY09(10ピコモル/μL)
0.5μLのSOY010(10ピコモル/μL)
0.25μLのSOY01(10ピコモル/μL)
0.25μLのSOY02(10ピコモル/μL)
0.1μLのTaqDNAポリメラーゼ(5単位/μL)
25μL定容とする水
−最適な結果のために従うべき熱サイクリングプロファイルは以下の通りである。
95℃4分間
次いで: 95℃1分間
57℃1分間
72℃2分間
5サイクル
次いで: 92℃30秒
57℃30秒
72℃1分間
25サイクル
次いで: 72℃5分間
6.6.アガロースゲル分析
PCRの結果を最適に可視化するために、PCR試料10〜20μLを適切な分子量マーカー(例えば100bpラダーPharmacia)と共に1.5%アガロースゲル(Trisホウ酸塩緩衝液)上にアプライしなければならないとした。
6.7.結果の検証
単一のPCRラン及び単一のPCRカクテルの内部におけるトランスジェニック植物DNA試料から得られたデータは、1)DNA陽性対照が予測されたPCR産物(トランスジェニック及び内因性のフラグメント)を示し、2)DNA陰性対照がPCR増幅に関して陰性(フラグメント無し)であり、そして3)野生型DNA対照が予測された結果(内因性フラグメント増幅)を示すことが成立しない限り許容してはならないとした。
上記したEE−GM2に関するPCR識別プロトコルに従った場合、予測されるサイズのトランスジェニック及び内因性PCR産物の目視可能な量を示すレーンは、ゲノム鋳型DNAの調製元の相当する植物がEE−GM2優良イベントを受け継いでいることを示している。トランスジェニックPCR産物の何れかの目視可能な量を示さず、そして内因性PCR産物の目視可能な量を示しているレーンは、ゲノム鋳型DNAの調製元の相当する植物が優良イベントを含まないことを示している。内因性およびトランスジェニックのPCR産物の目視可能な量を示さないレーンはゲノムDNAの質及び/又は量がPCR産物を発生させることができなかったことを示している。これらの植物は採点することができない。ゲノムDNA調製は繰り返されなければならず、そして適切な対照を用いながら新たなPCRランを実施しなければならない。
6.8.EE−GM2を識別するための判別PCRプロトコルの使用
未知物のスクリーニングを試みる前に、全ての適切な対照を用いたテストランを実施する。開発されたプロトコルは実験室間で異なる要素のために最適化を必要とするかもしれない(鋳型DNA調製、TaqDNAポリメラーゼ、プライマーの品質、dNTP類、サーモサイクラー等)。
内因性配列の増幅はプロトコルにおける重要な役割を果たす。1つは既知トランスジェニックゲノムDNA鋳型における内因性及びトランスジェニックの配列の両方の等モル量を増幅するPCR及び熱サイクリングの条件を得ることである。ターゲティングされる内因性フラグメントが増幅されない場合、又は、ターゲティングされる配列がアガロースゲル電気泳動で判断した場合に同じ臭化エチジウム染色強度で増幅されない場合は、PCR条件の最適化が必要な場合がある。
一部がEE−GM2を含む多くの植物に由来するGlycine max葉材料を上記したプロトコルに従って試験した。優良イベントEE−GM2由来及びGlycine max野生型由来の試料をそれぞれ陽性及び陰性対照として採取した。
図6は多くのダイズ植物試料上のEE−GM2に関して、優良イベントPCR識別プロトコルを用いて得られた結果を示す(レーン1〜14)。レーン1の試料は185bpのバンドが検出されていることから優良イベントを含有することがわかり、レーン2、3及び4の試料はEE−GM2を含んでいない。レーン2は別のダイズ優良イベントを含み、レーン3は非トランスジェニックのGlycine max対照をあらわし;レーン4は陰性対照(水)試料を示し、そしてレーン5は分子量マーカー(100bp)を示す。
7.EE−GM2を含む物質の検出のためのプローブとしての特異的組み込みフラグメントの使用
EE−GM2の特異的組み込みフラグメントは、特異的プライマーSOY09(配列番号18)及びSOY10(配列番号19)を用いたPCR増幅によるか、又は、化学合成により得られ、そして標識される。この組み込みフラグメントを、生物学的試料中のEE−GM2の検出のための特異的プローブとして使用する。核酸は標準的操作法に従って試料から抽出される。次にこの核酸をハイブリッドの形成を可能にするように最適化されたハイブリダイゼーション条件下に特異的プローブと接触させる。次にハイブリッドの形成が検出され、試料中のEE−GM2核酸の存在を示す。場合により、試料中の核酸は、特異的プローブとの接触よりも前に特異的プライマーを用いて増幅される。或いは、組み込みフラグメントの代わりに特異的プローブと接触させる前に核酸を標識する。場合により試料との接触の前に特異的プローブを固体担体(例えば限定しないがフィルター、ストリップ又はビーズ)に結合させる。
8.EE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM3及びEE−GM2を含むダイズ植物の発生及びそのような植物の作物学的性能のアセスメント
優良イベントEE−GM3及びEE−GM1の組み合わせを含有するダイズ植物は、EE−GM3を含む親ダイズ植物とEE−GM1を含む親ダイズ植物の間の従来の交雑により得られている。両方のイベントを含む子孫植物は、本明細書に記載するとおり、EE−GM1及びEE−GM3に関するPCR識別プロトコルを用いながら識別される。具体的には、EE−GM3及び幾つかのEE−GM1系統を含有する植物を用いて交雑を行った。得られたF1植物を生育させ、グリホセート及びグルホシネートを噴霧した。F2種子をF1植物から収穫し、そして植栽した(F2植物には噴霧しなかった)。F2単独植物を引き抜いた。F2:F3植物の列を生育させ、そしてグリホセート及びグルホシネートを噴霧した。EE−GM3及びEE−GM1の両方に関してホモ接合である列を識別し、そして後に収穫した。本試行から得られた分離データは予測されたメンデルのイベント分離を呈していた。
優良イベントEE−GM3及びEE−GM2の組み合わせを含有するダイズ植物は、EE−GM3を含む親ダイズ植物とEE−GM2を含む親ダイズ植物の間の従来の交雑により得られている。両方のイベントを含む子孫植物は、本明細書に記載するとおり、EE−GM2及びEE−GM3に関するPCR識別プロトコルを用いながら識別される。具体的には、EE−GM3を含有する植物及びEE−GM2を含有する植物を用いて交雑を行った。得られたF1植物を4つの従来系統に交雑させた。これらの交雑から得られたF1を圃場で生育させ、そしてグリホセート及びグルホシネートを噴霧した。次に両方の除草剤に対して抵抗性であるF1植物から収穫したF2種子を植栽した。F2植物にグリホセート及びグルホシネートの両方を噴霧した。両方の除草剤に対して耐性である900個の植物を収穫し、そして圃場試験において植栽した。本試行において予測されたイベントに関するメンデル分離データが得られた。両方の除草剤に対する耐性に関してホモ接合である約40系統を後の試験のために作物学的均一性に関して選択した。これらの系統は両方除草剤に対して良好な耐性及び良好な作物学的特性を有していた。
商業的生殖質の種々に異なる型において複合イベントを含んでいるこのようなダイズ植物を用いた圃場試験は多数の箇所において実施中であり、そして植物の種々の作物学的パラメーター、例えば植物の草丈、節までの高さ、起立性、活力、種子収量、及びグリホセート、イソキサフルトール及びグルホシネート耐性レベルが評価中である。
9.好ましい栽培植物内へのEE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM2の遺伝子移入
優良イベントEE−GM3及び優良イベントEE−GM1又はEE−GM2は反復逆交雑により、商業的なダイズ栽培品種、例えば限定しないがダイズ栽培品種(Soybean Cultivar)7631014 (US2009252860); ダイズ栽培品種 7431014 (US2009252859); ダイズ栽培品種7925084 (US2009252858); ダイズ栽培品種 7311153 (US2009252857); ダイズ栽培品種 S070159 (US2009252856); ダイズ栽培品種 7535357 (US2009246353); ダイズ栽培品種 S070160 (US2009246352); ダイズ栽培品種 26074414 (US2009249508); ダイズ栽培品種 7509171 (US2009249507); ダイズ栽培品種 S070158 (US2009246351); ダイズ栽培品種 7511119 (US2009249506); ダイズ栽培品種 7113111 (US2009238945); ダイズ栽培品種S06-02RM018047 (US7592518); ダイズ栽培品種 7013345 (US2009232957); ダイズ栽培品種 7041461 (US2009235376); ダイズ栽培品種 7549450 (US2009232956); ダイズ栽培品種7317090 (US2009232955); ダイズ栽培品種 2N2V58015 (US2009226597); ダイズ栽培品種 7243182 (US2009226596); ダイズ栽培品種 7143182 (US2009226595); ダイズ栽培品種7043182 (US2009220673); ダイズ栽培品種 S070157 (US2009222950); ダイズ栽培品種 306924721 (US2009220672); ダイズ栽培品種 7614385 (US2009220671); ダイズ栽培品種 7925118 (US2009214750); ダイズ栽培品種 7821295 (US2009214749); ダイズ栽培品種 7811336 (US2009214748); ダイズ栽培品種 S070150 (US2009214747); ダイズ栽培品種 6214260 (US2009214746); ダイズ栽培品種 S070152 (US2009214745); ダイズ栽培品種7429331 (US2009214751); ダイズ栽培品種 26034631 (US2009208634); ダイズ栽培品種 S07-03JR108674 (US7560621); ダイズ栽培品種 S07-03KL016279 (US7560620); ダイズ栽培品種S06-CL959411 (US7554017); ダイズ栽培品種 SG3870NRR (US2009158453); ダイズ栽培品種 HFPR-G (CA2645702); ダイズ栽培品種 S06-02JR423016 (US7521606); ダイズ栽培品種 S06-01JR119814 (US7518039); ダイズ栽培品種 S06-01JR119448 (US7518038); ダイズ栽培品種 6540220 (US2009055960); ダイズ栽培品種 S060292 (US2009055959); ダイズ栽培品種 S050228 (US2009055958); ダイズ栽培品種 S06-02JR423003 (US7491873); ダイズ栽培品種S06-02JR423005 (US7491872); ダイズ栽培品種 S06-02JR409114 (US7485782); ダイズ栽培品種 S06-SJ144056 (US7473823);
ダイズ栽培品種(US7470835); ダイズ栽培品種 6910450 (US2008282369); ダイズ栽培品種 6223012 (US7446246); ダイズ栽培品種 6549250 (US7446245); ダイズ栽培品種 17731225 (US2008271204); ダイズ栽培品種 6928285 (US2008271203); ダイズ栽培品種6736054 (US2008271169); ダイズ栽培品種 S060299 (US2008271199); ダイズ栽培品種 S060294 (US2008271202); ダイズ栽培品種 6943322 (US2008271201); ダイズ栽培品種 5343260 (US2008263719); ダイズ栽培品種 6439359 (US2008263704); ダイズ栽培品種 6238359 (US2008263703); ダイズ栽培品種 6547272 (US2008263702); ダイズ栽培品種 6929431 (US2008263701); ダイズ栽培品種 6703392 (US2008263700); ダイズ栽培品種6044483 (US2008263699); ダイズ栽培品種 S050224 (US2008263698); ダイズ栽培品種 6719022 (US2008263697); ダイズ栽培品種 5826056 (US2008263696); ダイズ栽培品種 6265047 (US2008263724); ダイズ栽培品種 6928331 (US2008263695); ダイズ栽培品種 6719331 (US2008263694); ダイズ栽培品種 6636454 (US2008263693); ダイズ栽培品種 6226454 (US2008263718); ダイズ栽培品種 Q0073801 (US2008256657); ダイズ栽培品種6326393 (US2008256652); ダイズ栽培品種 6408448 (US2008256651); ダイズ栽培品種 6449315 (US2008250524); ダイズ栽培品種 S060296 (US2008250523); ダイズ栽培品種 6012078 (US2008250522); ダイズ栽培品種 6342078 (US2008250521); ダイズ栽培品種 6419156 (US2008250520); ダイズ栽培品種 5723264 (US2008250519); ダイズ栽培品種 S050225 (US2008250518); ダイズ栽培品種 S060298 (US2008244783); ダイズ栽培品種6935331 (US2008244782); ダイズ栽培品種 6819456 (US2008244787); ダイズ栽培品種 S060297 (US2008244781); ダイズ栽培品種 6135319 (US2008244786); ダイズ栽培品種 6819331 (US2008244780); ダイズ栽培品種 6137445 (US2008244779); ダイズ栽培品種 6917445 (US2008244778); ダイズ栽培品種 6111333 (US2008244777); ダイズ栽培品種 S050229 (US2008244776); ダイズ栽培品種 6114011 (US2008244775); ダイズ栽培品種 6900358 (US2008244784); ダイズ栽培品種 6345184 (US2008244774); ダイズ栽培品種 6836085 (US2008244773); ダイズ栽培品種 6635047 (US2008244772); ダイズ栽培品種 6139105 (US2008244771); ダイズ栽培品種 6434385 (US2008244770); ダイズ栽培品種 S060295 (US2008244769); ダイズ栽培品種 6035184 (US2008244768); ダイズ栽培品種 S060293 (US2008209590); ダイズ栽培品種 6733322 (US2008209594); ダイズ栽培品種 6421326 (US2008209593); ダイズ栽培品種 S060077 (US2008209589); ダイズ栽培品種 6600375 (US2008209592); ダイズ栽培品種 S06-CL821457 (US7420104); ダイズ栽培品種 S07-02KG294306 (US7414178); ダイズ栽培品種S06-BA046119 (US7414175); ダイズ栽培品種 S07-02KG294307 (US7411114); ダイズ栽培品種 SG3865N (US2008189802); ダイズ栽培品種 6701475 (US7408097); ダイズ栽培品種 1335025 (US2008178316); ダイズ栽培品種 1686017 (US2008178315); ダイズ栽培品種 2388028 (US2008178314); ダイズ栽培品種 2387029 (US2008178313); ダイズ栽培品種 S06-WW152330 (US7388129); ダイズ栽培品種 6424090 (US7385118); ダイズ栽培品種 6723322 (US7385115); ダイズ栽培品種 SG4377NRR (US7385114); ダイズ栽培品種 S06-02JR111334 (US7381864); ダイズ栽培品種 6141287 (US7378577);
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これらの栽培植物内への優良イベントの遺伝子移入はこれらの栽培植物の所望の表現型又は作物学的な特性の何れにも大きく影響しない(収量障害無し)のに対し、グリホセート及び/又はイソキサフルトール又はグルホシネート耐性により測定される導入遺伝子の発現は商業的に許容できるレベルに合致していることがわかる。
スタックは市販されているその他のダイズイベントの1つ以上、例えば限定しないが他の除草剤耐性イベント、例えばUSDA−APHIS申立書:09−349−01p、09−201−01p、09−183−01p、09−082−01p、09−015−01p、06−354−01p、06−271−01p、06−178−01p、98−238−01p、98−014−01p、97−008−01p、96−068−01p、95−335−01p、93−258−01pに記載のイベント(例えばwww.aphis.usda.gov/brs/not_reg.html参照)、又はUS2006−282915に記載のイベントMON89788(グリホセート耐性)、WO2008/054747に記載のイベントDP−305423−1(高オレイン酸/ALS阻害剤耐性)、US2009130071に記載のMON87701、US2009036308に記載のイベント3560.4.3.5、US2008312082に記載のイベントDP−305423−1、又はWO2010/080829のイベントBPS−CV127−9(Event127)と好都合に更に組み合わせてよい。
以下の請求項において使用する場合、特段の記載が無い限り、「植物」という用語は何れかの成熟段階の植物組織、並びに何れかのそのような植物から採取されるか誘導された何れかの細胞、組織、又は器官、例えば限定しないが、何れかの種子、葉、幹、花、根、単細胞、配偶子、細胞培養物、組織培養物又はプロトプラストを包含することを意図している。
優良イベントEE−GM3を含むレファレンス種子はNCIMBアクセッション番号NCIMB41659の下2009年10月12日にNCIMB(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Scotland)に32−RRMM−0531として寄託されており、そしてその品種は確認されている。EE−GM3の別名はイベントFG−072、又はイベントMST−FGφ72−3である。
優良イベントEE−GM1を含むレファレンス種子はNCIMBアクセッション番号NCIMB41658の下2009年10月12日にNCIMB(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Scotland)に32RRMM0368として寄託されている。EE−GM1の別名はLL27、A2704−12、又はACS−GMφφ5−3である。
優良イベントEE−GM2を含むレファレンス種子はNCIMBアクセッション番号NCIMB41660の下2009年10月12日にNCIMB(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Scotland)に32CON0688として寄託されている。EE−GM2の別名はLL55、A5547−127、又はACS−GMφφ6−4である。
優良イベントEE−GM3及びEE−GM1を含むレファレンス種子はATCCアクセッション番号PTA−11041の下2010年6月11日に
ATCC(American Type Culture Collection, 10801 University Blvd.,Manassas, Va.20110-2209,USA)に111606ダイズとして寄託されている。
優良イベントEE−GM3及びEE−GM2を含むレファレンス種子はATCCアクセッション番号PTA−11042の下2010年6月11日に
ATCC(American Type Culture Collection, 10801 University Blvd.,Manassas, Va.20110-2209,USA)に05SHX2XEBダイズとして寄託されている。
本発明の上記記載は例示であって、限定的なものではない。
記載した実施形態における種々の変化又は変更は当業者が想到し得るものである。これらは本発明の精神又は範囲を逸脱することなく行うことができる。

Claims (38)

  1. 第1の核酸分子が配列番号2のヌクレオチド1431からヌクレオチド1462までのヌクレオチド配列またはその相補体を含み、第2の核酸分子が配列番号14のヌクレオチド301からヌクレオチド322までのヌクレオチド配列またはその相補体を含む、核酸分子の対。
  2. 第1の核酸分子が配列番号3のヌクレオチド220からヌクレオチド261までのヌクレオチド配列またはその相補体を含み、第2の核酸分子が配列番号15のヌクレオチド497からヌクレオチド518までのヌクレオチド配列またはその相補体を含む、核酸分子の対。
  3. 第1の核酸分子が配列番号2のヌクレオチド配列またはその相補体を含み、第2の核酸分子が配列番号14のヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項1に記載の核酸分子の対。
  4. 第1の核酸分子が配列番号3のヌクレオチド配列またはその相補体を含み、第2の核酸分子が配列番号15のヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項2に記載の核酸分子の対。
  5. 第1の核酸分子が、配列番号20のヌクレオチド配列または配列番号20と少なくとも99%配列同一性を有する核酸配列を含み、該第1の核酸分子はHPPD阻害剤除草剤および/またはグリホセートに対する耐性をもたらす、ならびに
    第2の核酸分子が、以下のヌクレオチド配列:
    a)配列番号14のヌクレオチド1から311までのヌクレオチド配列、
    b)配列番号11のヌクレオチド3458からヌクレオチド3848までのヌクレオチド配列、
    c)配列番号11のヌクレオチド413からヌクレオチド3457までのヌクレオチド配列、および
    d)配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までのヌクレオチド配列
    を順次含むか、または前記配列a)〜d)と少なくとも99%配列同一性を有する核酸配列を含み、グルホシネートに対する耐性をもたらす、
    核酸分子の対。
  6. 請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸分子の対を含む、ダイズゲノムDNAであって、
    ここで第1の核酸分子はEE−GM3遺伝子座にあり、第2の核酸分子はEE−GM2遺伝子座にあり、
    前記EE−GM3遺伝子座は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    前記EE−GM2遺伝子座は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
    前記ダイズゲノムDNA。
  7. ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫であって、それぞれがHPPD阻害剤除草剤及び/又はグルホシネート及び/又はグリホセートに対して耐性であり、それぞれが以下のヌクレオチド配列:
    ・EE−GM3遺伝子座において配列番号2のヌクレオチド1431からヌクレオチド1462までのヌクレオチド配列を、
    ・EE−GM3遺伝子座において配列番号3のヌクレオチド220から261までのヌクレオチド配列を、
    ・EE−GM2遺伝子座において配列番号14のヌクレオチド301からヌクレオチド322のヌクレオチド配列を、および
    ・EE−GM2遺伝子座において配列番号15のヌクレオチド497から518のヌクレオチド配列を
    そのゲノム中に含み、
    前記EE−GM3遺伝子座は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    前記EE−GM2遺伝子座は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
    前記ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫。
  8. 配列番号2、3、14および15の配列を含む、請求項7記載のダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫。
  9. 請求項7記載のダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫であって、
    配列番号20のヌクレオチド配列、ならびに
    順次以下のヌクレオチド配列:
    a)配列番号14のヌクレオチド1から311までのヌクレオチド配列、
    b)配列番号11のヌクレオチド3458からヌクレオチド3848までのヌクレオチド配列、
    c)配列番号11のヌクレオチド413からヌクレオチド3457までのヌクレオチド配列、および
    d)配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までのヌクレオチド配列
    を含む、前記ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫。
  10. ダイズ植物、細胞、部分、又は種子であって、それぞれがHPPD阻害剤除草剤及び/又はグルホシネート及び/又はグリホセートに対して耐性であり、そしてそれぞれが優良イベントEE−GM3及び優良イベントEE−GM2をそのゲノム中に含み、
    ここで前記優良イベントEE−GM3は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    前記優良イベントEE−GM2は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
    前記ダイズ植物、細胞、部分、又は種子。
  11. 請求項10記載のダイズ植物、細胞、部分、又は種子の子孫植物、細胞、部分、又は種子であって、
    それぞれがHPPD阻害剤除草剤及び/又はグルホシネート及び/又はグリホセートに対して耐性であり、
    配列番号2のヌクレオチド1431からヌクレオチド1462までのヌクレオチド配列、配列番号3のヌクレオチド220から261までのヌクレオチド配列、配列番号14のヌクレオチド301からヌクレオチド322のヌクレオチド配列、および配列番号15のヌクレオチド497から518のヌクレオチド配列を含む、
    前記子孫植物、細胞、部分、又は種子。
  12. 請求項10記載のダイズ植物、細胞、部分、又は種子であって、
    そのゲノムDNAが、それぞれ配列番号4及び配列番号5のヌクレオチド配列を含む2つのプライマーによるPCRを使用して分析した場合に、263bpのDNAフラグメントを与え、かつ
    そのゲノムDNAが、それぞれ配列番号18及び配列番号19のヌクレオチド配列を含む2つのプライマーによるPCRを使用して分析した場合に、151bpのDNAフラグメントを与える、前記ダイズ植物、細胞、部分、又は種子。
  13. 請求項7〜12のいずれか一項に記載のダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫から製造される、ダイズ製品。
  14. ダイズ穀粉、粉砕種子、ダイズ粉末、若しくはダイズフレークであるか、又はそれを含む、請求項13記載のダイズ製品。
  15. イベントEE−GM3に対して特異的であるアンプリコンを生成する核酸及びイベントEE−GM2に対して特異的であるアンプリコンを生成する核酸を含む、請求項13又は14記載のダイズ製品。
  16. 請求項7〜12のいずれか一項記載のダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫を得ること、及びそれからダイズ製品を製造することを含む、ダイズ製品を製造する方法。
  17. 前記ダイズ製品が、ダイズ穀粉、粉砕種子、ダイズ粉末、若しくはダイズフレークであるか、又はそれを含む、請求項16記載の方法。
  18. 前記ダイズ製品が、イベントEE−GM3に対して特異的であるアンプリコンを生成する核酸及びイベントEE−GM2に対して特異的であるアンプリコンを生成する核酸を含む、請求項16又は17記載の方法。
  19. 請求項7〜12のいずれか一項記載のダイズ植物又は種子を植栽又は播種した圃場において雑草を抑制する方法であって、
    該圃場を、有効量のHPPD阻害剤除草剤系及び/又はグルホシネート系及び/又はグリホセート系の除草剤で処理することを含み、
    前記植物又は種子は、前記HPPD阻害剤除草剤系、グルホシネート系及びグリホセート系の除草剤に耐性である、
    前記方法。
  20. 発芽成長中の請求項7〜12のいずれか一項記載のダイズ植物を雑草による競合から保護する方法であって、前記ダイズ植物を植栽すべき圃場を、前記ダイズ植物を植栽するか又は種子を播く前に、HPPD阻害剤除草剤で処理し、続いて、予備処理された前記圃場に前記ダイズ植物を植栽するか又は種子を播くことを含む、前記方法。
  21. 雑草を抑制する方法であって、
    請求項7〜12のいずれか一項記載のダイズ種子を播種した圃場を、ダイズ植物が出芽する前であるが種子を播種した後に、有効量のHPPD阻害剤除草剤で処理することを含み、
    前記種子及び前記植物は、前記HPPD阻害剤除草剤に耐性である、
    前記方法。
  22. 請求項7〜12のいずれか一項記載のダイズ植物又は種子を植栽又は播種すべき圃場において雑草を抑制する方法であって、
    前記植物又は種子を植栽又は播種すべき圃場を、有効量のHPPD阻害剤除草剤及び/又はグリホセート及び/又はグルホシネートで処理し、続いて、前記圃場に前記植物又は種子を植栽又は播種することを含み、
    前記植物又は種子は、前記HPPD阻害剤除草剤及びグリホセート及びグルホシネートに耐性である、
    前記方法。
  23. 前記HPPD阻害剤除草剤がイソキサフルトールであり、ここで前記処理の後、グリホセート及び/又はグルホシネートあるいはHPPD阻害剤とグリホセート及び/又はグルホシネートとの混合物を植物の上面から出芽後除草剤として適用する、請求項20又は22記載の方法。
  24. グルホシネート、HPPD阻害剤除草剤およびグリホセートに耐性であるダイズ植物を製造する方法であって、
    (i)優良イベントEE−GM3を含むダイズ植物を優良イベントEE−GM2を含むダイズ植物と交雑させることにより、グルホシネートに対して耐性である植物に、HPPD阻害剤除草剤およびグリホセートに対する耐性を導入すること、
    ここで優良イベントEE−GM3は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    優良イベントEE−GM2は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、および
    優良イベントEE−GM3およびEE−GM2を含む子孫を選択すること、または
    (ii)HPPD阻害剤除草剤、グリホセートおよびグルホシネートに対する耐性を欠く異なる遺伝的背景を有するダイズ植物に、優良イベントEE−GM3およびEE−GM2を含むダイズ植物を交雑させることにより、HPPD阻害剤除草剤、グリホセートおよびグルホシネートに対する耐性を導入すること、
    ここで優良イベントEE−GM3は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    優良イベントEE−GM2は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、および
    優良イベントEE−GM3およびEE−GM2を含む子孫を選択すること
    を含む、前記方法。
  25. 生物学的試料中の優良イベントEE−GM3及びEE−GM2の同時存在又は非存在を検出する方法であって、
    前記方法は、少なくとも2つの特異的プライマーを用いたEE−GM3特異的領域の検出、ここで該少なくとも2つの特異的プライマーの一方は、EE−GM3中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’又は3’フランキング領域内の配列を特異的に認識し、他方のプライマーは、EE−GM3の前記5’又は3’フランキング領域に隣接する外来性DNA内の配列を特異的に認識する、及び
    2つの特異的プライマーを用いたEE−GM2特異的領域の検出、ここで該2つの特異的プライマーの一方は、EE−GM2中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’又は3’フランキング領域内の配列を特異的に認識し、他方のプライマーは、EE−GM2の前記5’又は3’フランキング領域に隣接する外来性DNA内の配列を特異的に認識する、
    を含み、
    ここでEE−GM3の前記5’フランキング領域は、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列を含み、
    EE−GM3の前記3’フランキング領域は、配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
    前記5’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記3’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列を含むか、または前記5’もしくは3’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号20のヌクレオチド1452からヌクレオチド16638までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含み、
    EE−GM2の前記5’フランキング領域は、配列番号14のヌクレオチド1からヌクレオチド311までのヌクレオチド配列を含み、
    EE−GM2の前記3’フランキング領域は、配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
    前記5’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号14のヌクレオチド312からヌクレオチド810までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記3’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号15のヌクレオチド1からヌクレオチド507までのヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記5’または3’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号11のヌクレオチド3458からヌクレオチド3848までのヌクレオチド配列および配列番号11のヌクレオチド413からヌクレオチド3457のヌクレオチド配列、またはそれらの相補体を含み、
    ここで前記優良イベントEE−GM3は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    前記優良イベントEE−GM2は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
    前記方法。
  26. 請求項25記載の方法であって、
    少なくとも2つのプライマーを用いた第1のポリメラーゼ連鎖反応、ここで前記プライマーの一方は、EE−GM3中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’または3’フランキング領域を認識し、前記プライマーの他方のプライマーは、前記5’または3’フランキング領域に隣接するEE−GM3の外来性DNA内の配列を認識する、および
    少なくとも2つのプライマーを用いた第2のポリメラーゼ連鎖反応、ここで前記プライマーの一方は、EE−GM2中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’または3’フランキング領域を認識し、前記プライマーの他方のプライマーは、前記5’または3’フランキング領域に隣接するEE−GM2の外来性DNA内の配列を認識する、
    を使用して、前記生物学的試料中に存在する核酸から50〜1000bpの2つのDNAフラグメントを増幅させることを含み、ここで前記第1および第2のポリメラーゼ反応は逐次的であっても同時であってもよい、前記方法。
  27. 請求項26記載の方法であって、
    EE−GM3の5’フランキング領域を認識する前記プライマーが、その最3’末端において、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
    EE−GM3の3’フランキング領域を認識する前記プライマーが、その最3’末端において、配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
    EE−GM3の外来性DNA内の配列を認識する前記プライマーが、その最3’末端において、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体のヌクレオチド配列、または配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列、または配列番号20のヌクレオチド1452からヌクレオチド16638までのヌクレオチド配列もしくはその相補体から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドを含み、
    EE−GM2の5’フランキング領域を認識する前記プライマーが、その最3’末端において、配列番号14のヌクレオチド1からヌクレオチド311までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
    EE−GM2の3’フランキング領域を認識する前記プライマーが、その最3’末端において、配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までの相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
    EE−GM2の外来性DNA内の配列を認識する前記プライマーが、その最3’末端において、配列番号14のヌクレオチド312からヌクレオチド810までの相補体のヌクレオチド配列、または配列番号15のヌクレオチド1からヌクレオチド507までのヌクレオチド配列、または配列番号11のヌクレオチド3458からヌクレオチド3848までのヌクレオチド配列および配列番号11のヌクレオチド413からヌクレオチド3457までのヌクレオチド配列もしくはそれらの相補体から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドを含む、
    前記方法。
  28. 前記EE−GM3特異的プライマーが、それぞれ配列番号5および配列番号4の配列、またはそれぞれ配列番号7および配列番号5の配列を含み、前記EE−GM2特異的プライマーが、それぞれ配列番号18および配列番号19の配列を含む、請求項27記載の方法。
  29. EE−GM3およびEE−GM2の特異的検出における使用に適する2つのプライマー対であって、
    EE−GM3およびEE−GM2のそれぞれは、5’フランキング領域、外来性DNAおよび3’フランキング領域を含み、5’フランキング領域は外来性DNAの直近上流にありそれに隣接しており、3’フランキング領域は外来性DNAの直近下流にありそれに隣接しており、
    第1のプライマー対の一方のプライマーは、EE−GM3中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’または3’フランキング領域内の配列を認識する配列を含み、第1のプライマー対の他方のプライマーは、EE−GM3中の前記5’または3’フランキング領域に隣接する外来性DNA内の配列を認識する配列を含み、
    第2のプライマー対の一方のプライマーは、EE−GM2中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’または3’フランキング領域内の配列を認識する配列を含み、第2のプライマー対の他方のプライマーは、EE−GM2の前記5’または3’フランキング領域に隣接する外来性DNA内の配列を認識する配列を含み、
    EE−GM3の前記5’フランキング領域は、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列を含み、
    EE−GM3の前記3’フランキング領域は、配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
    前記5’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記3’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列を含むか、または前記5’もしくは3’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号20のヌクレオチド1452からヌクレオチド16638までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含み、
    EE−GM2の前記5’フランキング領域は、配列番号14のヌクレオチド1からヌクレオチド311までのヌクレオチド配列を含み、
    EE−GM2の前記3’フランキング領域は、配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
    前記5’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号14のヌクレオチド312からヌクレオチド810までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記3’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号15のヌクレオチド1からヌクレオチド507までのヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記5’または3’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号11のヌクレオチド3458からヌクレオチド3848までのヌクレオチド配列および配列番号11のヌクレオチド413からヌクレオチド3457のヌクレオチド配列、またはそれらの相補体を含み、
    ここでEE−GM3は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    EE−GM2は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
    前記プライマー対。
  30. 請求項29記載のプライマー対であって、
    前記第1のプライマー対の一方のプライマーが、その最3’末端において、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列または配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
    前記第1のプライマー対の他方のプライマーが、その最3’末端において、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列または配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
    前記第2のプライマー対の一方のプライマーが、その最3’末端において、配列番号14のヌクレオチド1からヌクレオチド311までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列または配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までの相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
    前記第2のプライマー対の他方のプライマーが、その最3’末端において、配列番号14のヌクレオチド312からヌクレオチド810までのヌクレオチド配列の相補体または配列番号15のヌクレオチド1からヌクレオチド507までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、
    前記プライマー対。
  31. 請求項29記載のプライマー対であって、
    前記第1のプライマー対の一方が、その最3’末端において、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列から選択される17〜200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列または配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までのヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列から選択される17〜200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
    前記第2のプライマー対の一方が、その最3’末端において、配列番号14のヌクレオチド1からヌクレオチド311までのヌクレオチド配列から選択される17〜200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列または配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までのヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列から選択される17〜200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、
    前記プライマー対。
  32. 請求項29記載のプライマー対であって、以下の4つのプライマー:
    配列番号5の配列をその最3’末端に含む第1のプライマー;
    配列番号4の配列をその最3’末端に含む第2のプライマー;
    配列番号18の配列をその最3’末端に含む第3のプライマー;および、
    配列番号19の配列をその最3’末端に含む第4のプライマー;
    を含む、前記プライマー対。
  33. ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫由来の生物学的試料中の優良イベントEE−GM3およびEE−GM2の同時存在を識別する方法であって、
    生物学的試料の核酸を、EE−GM3の5’または3’フランキング領域の部分およびそれに隣接する外来性DNAの部分を含む領域に特異的にハイブリダイズするEE−GM3に対する第1の特異的プローブとハイブリダイズさせること、および
    生物学的試料の核酸を、EE−GM2の5’または3’フランキング領域の部分およびそれに隣接する外来性DNAの部分を含む領域に特異的にハイブリダイズするEE−GM2に対する第2の特異的プローブとハイブリダイズさせることを含み、
    前記第1の特異的プローブの配列は、EE−GM3の5’フランキング領域または3’フランキング領域の部分およびそれに隣接する外来性DNAの配列の部分を含む配列と少なくとも90%配列同一性を有し、
    前記第2の特異的プローブの配列は、EE−GM2の5’フランキング領域または3’フランキング領域の部分およびそれに隣接する外来性DNAの配列の部分を含む配列と少なくとも90%配列同一性を有し、
    EE−GM3の前記5’フランキング領域は、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列を含み、
    EE−GM3の前記3’フランキング領域は、配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
    前記5’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記3’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列を含むか、または前記5’もしくは3’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号20のヌクレオチド1452からヌクレオチド16638までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含み、
    EE−GM2の前記5’フランキング領域は、配列番号14のヌクレオチド1からヌクレオチド311までのヌクレオチド配列を含み、
    EE−GM2の前記3’フランキング領域は、配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
    前記5’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号14のヌクレオチド312からヌクレオチド810までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記3’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号15のヌクレオチド1からヌクレオチド507までのヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記5’または3’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号11のヌクレオチド3458からヌクレオチド3848までのヌクレオチド配列および配列番号11のヌクレオチド413からヌクレオチド3457のヌクレオチド配列、またはそれらの相補体を含み、
    ここで前記優良イベントEE−GM3は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    前記優良イベントEE−GM2は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
    前記方法。
  34. 請求項33記載の方法であって、
    前記第1の特異的プローブの配列が、配列番号2のヌクレオチド1431から1472もしくは配列番号3のヌクレオチド220から261、またはその相補体と少なくとも90%配列同一性を有し、
    前記第2の特異的プローブの配列が、配列番号14のヌクレオチド301から322もしくは配列番号15のヌクレオチド497から518、またはその相補体と少なくとも90%配列同一性を有する、
    前記方法。
  35. 生物学的試料中の優良イベントEE−GM3および優良イベントEE−GM2の同時存在を識別するための一対の特異的プローブであって、
    EE−GM3およびEE−GM2のそれぞれは、5’フランキング領域、外来性DNAおよび3’フランキング領域を含み、5’フランキング領域は外来性DNAの直近上流にありそれに隣接しており、3’フランキング領域は外来性DNAの直近下流にありそれに隣接しており、
    EE−GM3中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’フランキング領域もしくは3’フランキング領域の部分およびそれに隣接する外来性DNAの部分を含む配列と少なくとも90%配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む第1のプローブ、ならびにEE−GM2中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’フランキング領域もしくは3’フランキング領域の部分およびそれに隣接する外来性DNAの部分を含む配列と少なくとも90%配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む第2のプローブを含み、例えば前記第1のプローブは、配列番号2のヌクレオチド1441から1462もしくは配列番号3のヌクレオチド230から251、またはその相補体と少なくとも90%配列同一性を有し、前記第2の特異的プローブの配列は、配列番号14のヌクレオチド301から322もしくは配列番号15のヌクレオチド497から518、またはその相補体と少なくとも90%配列同一性を有し、
    EE−GM3の前記5’フランキング領域は、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列を含み、
    EE−GM3の前記3’フランキング領域は、配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
    前記5’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記3’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列を含むか、または前記5’もしくは3’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号20のヌクレオチド1452からヌクレオチド16638までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含み、
    EE−GM2の前記5’フランキング領域は、配列番号14のヌクレオチド1からヌクレオチド311までのヌクレオチド配列を含み、
    EE−GM2の前記3’フランキング領域は、配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
    前記5’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号14のヌクレオチド312からヌクレオチド810までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記3’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号15のヌクレオチド1からヌクレオチド507までのヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記5’または3’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号11のヌクレオチド3458からヌクレオチド3848までのヌクレオチド配列および配列番号11のヌクレオチド413からヌクレオチド3457のヌクレオチド配列、またはそれらの相補体を含み、
    ここで前記優良イベントEE−GM3は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    前記優良イベントEE−GM2は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
    前記一対の特異的プローブ。
  36. EE−GM3およびEE−GM2を特異的に認識するプライマー対またはプローブを含むキットであって、
    前記プライマー対は、請求項29〜32のいずれか一項に記載のプライマー対であり、
    前記プローブは、請求項35に記載のプローブである、
    前記キット。
  37. 請求項25または33記載の方法であって、
    前記生物学的試料が種子試料であり、
    種子の純度を確認するか、または優良イベントEE−GM3およびEE−GM2の存在または非存在に関して種子をスクリーニングするためであり、
    前記種子試料における、特異的プライマー対またはプローブ対によるEE−GM3およびEE−GM2特異的領域の検出を含む、
    前記方法。
  38. 実質的に相補な標識された核酸プローブとのハイブリダイゼーションを介してダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫由来の生物学的試料中の優良イベントEE−GM3およびEE−GM2の存在を検出する方法であって、
    標的核酸配列の再利用を介して該標的核酸配列の検出シグナルが増幅され、
    下記工程:
    a)前記標的核酸配列を、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1469までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第1の核酸オリゴヌクレオチド、または配列番号3のヌクレオチド223からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第1の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせること;
    b)前記標的核酸配列を、配列番号2のヌクレオチド1434からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第2の核酸オリゴヌクレオチド、または配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド258までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第2の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせること、ここで前記第1および第2のオリゴヌクレオチドは少なくとも1つのヌクレオチドで重複しており、そしてここで前記第1または該第2のオリゴヌクレオチドのいずれかが標識されて前記標識された核酸プローブとなる;
    c)デュプレックス解離をもたらす選択的プローブ切断を起こす酵素により、プローブ:標的核酸配列デュプレックス内の標識されたプローブのみを切断し、標的配列は未損傷のままとすること;
    d)工程(a)から(c)を反復することにより標的核酸配列を再利用すること;および
    e)切断された標識されたプローブを検出することにより、標的核酸配列の存在を決定すること;ならびに
    f)前記標的核酸配列を、配列番号14のヌクレオチド312からヌクレオチド329までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第3の核酸オリゴヌクレオチド、または配列番号15のヌクレオチド490からヌクレオチド507までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第3の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせること;
    g)前記標的核酸配列を、配列番号14のヌクレオチド294からヌクレオチド311までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第4の核酸オリゴヌクレオチド、または配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド525までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第4の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせること、ここで前記第3および第4のオリゴヌクレオチドは少なくとも1つのヌクレオチドで重複しており、そしてここで前記第3または該第4のオリゴヌクレオチドのいずれかが標識されて前記標識された核酸プローブとなる;
    h)デュプレックス解離をもたらす選択的プローブ切断を起こす酵素により、プローブ:標的核酸配列デュプレックス内の標識されたプローブのみを切断し、標的配列は未損傷のままとすること;
    i)工程(f)から(h)を反復することにより標的核酸配列を再利用すること;および
    e)切断された標識されたプローブを検出することにより、標的核酸配列の存在を決定すること;
    を含み、
    ここで前記優良イベントEE−GM3は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    前記優良イベントEE−GM2は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
    前記方法。
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