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JP6457387B2 - 誘導性共発現系 - Google Patents

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JP6457387B2 JP2015526598A JP2015526598A JP6457387B2 JP 6457387 B2 JP6457387 B2 JP 6457387B2 JP 2015526598 A JP2015526598 A JP 2015526598A JP 2015526598 A JP2015526598 A JP 2015526598A JP 6457387 B2 JP6457387 B2 JP 6457387B2
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Description

関連出願への参照
本出願は、２０１２年８月５日出願の米国仮出願第６１／６７９，７５１号、および２０１２年１２月２９日出願の米国仮出願第６１／７４７，２４６号の利益を主張し、その全体の開示が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表への参照
本出願は、電子的に提出された配列表を含み、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、分子生物学および生物工学的生産の一般的な技術分野におけるものである。より具体的には、本発明は、組換えタンパク質発現の技術分野におけるものである。
生物工学的な物質の産生は、所望の産物が、２つまたはそれ以上の異なるポリペプチドから形成される多量体タンパク質のような、異なる遺伝子によりコードされる分子の組み合わせである場合にいっそう複雑なプロセスである。複合的な遺伝子産物の成功的な共発現は、１以上の遺伝子産物の同時の発現により混ざり合ういくつかの課題を克服することを必要とする。克服しなければならない問題は、１以上のタイプのベクターが使用される場合に適合性のある発現ベクターを作成すること、産物の正しい化学量論比を得ることと、正しく折り畳まれて、パートナーと結合することに関して適切な立体構造におけるものである、遺伝子産物を産生することと、所望の産物を、細胞および誤って折り畳まれたおよび／または不適当な立体構造におけるタンパク質のような望ましくないタンパク質から精製することと、および所望の産物（複数を含む）の収率の最大化の一態様として、封入体の形成を最小化することを含む。多くの異なるアプローチが、これらの課題を扱うためにとられてきたが、まだ、よりよい共発現方法についての必要性がある。
ｌａｃおよびａｒａプロモーターを含むプラスミドを含む、いくつかの誘導性の細菌性タンパク質発現系が、個々のタンパク質を発現させるために考案されてきた。これらの系は、それらが野生型大腸菌における増殖培養集団の全体の中で均質にタンパク質を誘導し損なうため、発現が難しいタンパク質の共発現における有用性を限定していた（Khlebnikov and Keasling, "Effect of lacY expression on homogeneity of induction from the Ptac and Ptrc promoters by natural and synthetic inducers", Biotechnol Prog 2002 May-Jun; 18(3): 672-674）。誘導物質についての輸送タンパク質の発現が誘導物質の存在に依存する場合、野生型大腸菌ｌａｃおよびａｒａ系の場合のように、誘導物質の細胞濃度は、輸送タンパク質の産生を開始するために閾値レベルに達しなければならないが、いったん閾値に達すると、制御されていないポジティブフィードバックループが生じ得、細胞内で高レベルの誘導物質となり、そして同様に誘導性プロモーター由来の高レベルの発現：「全か無かの」現象となる結果を伴う。増殖培地における誘導物質の濃度を増加させることは、高い発現モードにある集団における細胞の割合を増加させる。このタイプの系は、集団の規模で、タンパク質発現の濃度依存性誘導をもたらすが、毒性があり、可溶性に乏しく、または他の理由のために特定の濃度を必要とするものを含む、発現の厳密な制御を必要とする、タンパク質の発現および産生についての最適下限である。
誘導物質の誘導物質依存性輸送を排除することにより、単一のプロモーター発現系における「全か無かの」誘導現象を扱うためにいくつかの努力がなされてきた。一例は、ラクトースパーミアーゼ遺伝子（ｌａｃＹａｍ）における無発現変異を有しており、トランスポーターの不存在化である程度まで細胞膜を通り抜けることができるＩＰＴＧ（イソプロピル−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）のようなｌａｃプロモーターの代わりの誘導物質を用いている（Jensen et al., "The use of lac-type promoters in control analysis", Eur J Biochem 1993 Jan 15; 211(1-2): 181-191）。他のアプローチは、アラビノーストランスポーター遺伝子において欠損された系統における、アラビノース誘導性プロモーターの使用であるが、アラビノースを細胞内に輸送することを可能にする、ラクトースパーミアーゼ遺伝子、ｌａｃＹ（Ａ１１７Ｃ）における突然変異を有する（Morgan-Kiss et al., "Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coli araBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity", Proc Natl Acad Sci U S A 2002 May 28; 99(11): 7373-7377）。
個々のタンパク質発現の構成要素は、異なる誘導物質プロモーター系間の「相互干渉」の影響により有害な影響を及ぼし、または相互に排他的なゲノムの変更を必要とし、または一般的な代謝調節に供されるかもしれないため、共発現系においてそれらの使用を不可能にする、不適合である場合が多い。ｌａｃおよびａｒａ誘導性プロモーター系間の「相互干渉」問題を扱うための試みは、ＩＰＴＧ、ｌａｃプロモーターの誘導物質の存在下で、ａｒａＢＡＤプロモーターを誘導するためにその性能を向上させるためのＡｒａＣ転写活性化因子の定向進化を含んだ（Lee et al., "Directed evolution of AraC for improved compatibility of arabinose- and lactose-inducible promoters", Appl Environ Microbiol 2007 Sep; 73(18): 5711-5715; Epub 2007 Jul 20）。しかしながら、ａｒａおよびｌａｃ誘導性プロモーターに基づく発現ベクター間の適合性は、相互に排他的なゲノムの変更：アラビノースによるａｒａＢＡＤプロモーターの均質な誘導のためのｌａｃＹ点突然変異（ｌａｃＹ（Ａ１１７Ｃ））、およびＩＰＴＧによるｌａｃプロモーターの均質な誘導のためのヌルｌａｃＹ遺伝子の必要性により、未だに制限されている。一般的な代謝調節、例えば、炭素カタボライト抑制は、また、誘導性プロモーターの適合性に影響を及ぼし得る。ＣＣＲは、他の糖の前のグルコースの優先的な使用にみられるように、より好ましい化合物が存在する場合に、炭素含有化合物の利用に必要とされる遺伝子の抑圧により特徴づけられる。ａｒａおよびｐｒｐ誘導性プロモーター系の場合、アラビノースの存在は、ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターから発現を誘導するためのプロピオネートの性能、ＣＣＲを伴うと考えられている効果を低減させる（Park et al., "The mechanism of sugar-mediated catabolite repression of the propionate catabolic genes in Escherichia coli", Gene 2012 Aug 1; 504(1): 116-121, Epub 2012 May 3）。
これらの問題を克服する誘導性共発現系の必要性が明らかである。
本発明は、各遺伝子産物の構成要素の制御誘導が可能である誘導性共発現系を提供する。
本発明の一実施形態は、２つまたはそれ以上のタイプの発現コンストラクトを含む宿主細胞であって、各タイプの発現コンストラクトは、誘導性プロモーターと遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列とを含み、前記ポリヌクレオチド配列は該誘導性プロモーターから転写され；（１）少なくとも１つの前記誘導性プロモーターは、別の前記誘導性プロモーターの誘導物質ではない誘導物質に対して応答性があり、少なくとも１つの前記遺伝子産物は、別の前記遺伝子産物と多量体を形成し、または（２）少なくとも１つの前記遺伝子産物は、（ａ）シグナルペプチドを欠き、少なくとも３つのジスルフィド結合を形成するポリペプチド、（ｂ）アラビノース利用酵素およびキシロース利用酵素からなる群から選択されるポリペプチド、並びに（ｃ）リグニン分解ペルオキシダーゼからなる群から選択されるポリペプチド、からなる群から選択される。本発明の別の実施形態は、２つまたはそれ以上のタイプの発現コンストラクトを含む宿主細胞であって、各タイプの発現コンストラクトが、誘導性プロモーターと遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列とを含み、前記ポリヌクレオチド配列は該誘導性プロモーターから転写され；各誘導性プロモーターはラクトース誘導性プロモーターではなく、および少なくとも１つの前記遺伝子産物は、少なくとも２のジスルフィド結合を形成し、または少なくとも２であって１７より少ないジスルフィド結合を形成し、または少なくとも２であって１０より少ないジスルフィド結合を形成し、または２、３、４、５、６、７、８、および９からなる群から選択されるいくつかのジスルフィド結合を形成するポリペプチドである。本発明のいくつかの実施形態では、この宿主細胞は原核細胞であり、いくつかの例では、それは大腸菌細胞である。本発明の他の実施形態では、宿主細胞は真核細胞であり、いくつかの例では、それは酵母細胞であり、さらにいくつかの例では、それはサッカロマイセス・セレビシエ細胞である。さらなる実施形態では、宿主細胞により含まれる発現コンストラクトのそれぞれは、少なくとも１つの誘導性プロモーターを含み、誘導性プロモーターは、Ｌ−アラビノース誘導性プロモーターもしくはプロピオネート誘導性プロモーターであり、または、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｐｒｐＢＣＤＥプロモーター、ｒｈａＳＲプロモーター、およびｘｌｙＡプロモーターからなる群から選択され、または、誘導性プロモーターはラクトース誘導性プロモーターではない。追加の実施形態では、宿主細胞により含まれる少なくとも１つの発現コンストラクトは、誘導性プロモーターに結合する転写制御因子をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、いくつかの実施形態では、転写制御因子および該転写制御因子が結合する誘導性プロモーターをコードするポリヌクレオチド配列は、同じ発現コンストラクトにおけるものであり、およびさらなる例では、転写制御因子は、ＡｒａＣ、ＰｒｐＲ、ＲｈａＲ、およびＸｙｌＲからなる群から選択され、またはとりわけＡｒａＣ、もしくはＰｒｐＲである。ある実施形態では、宿主細胞により含まれる少なくとも１つの発現コンストラクトは、ポリヌクレオチド配列を、ｐＢＡＤ１８、ｐＢＡＤ１８−Ｃｍ、ｐＢＡＤ１８−Ｋａｎ、ｐＢＡＤ２４、ｐＢＡＤ２８、ｐＢＡＤ３０、ｐＢＡＤ３３、ｐＰＲＯ１８、ｐＰＲＯ１８−Ｃｍ、ｐＰＲＯ１８−Ｋａｎ、ｐＰＲＯ２４、ｐＰＲＯ３０、およびｐＰＲＯ３３からなる群から選択されるプラスミド内に、または特にｐＢＡＤ２４もしくはｐＰＲＯ３３内に挿入する工程を含む方法により産生された。本発明の他の実施例は、２つまたはそれ以上のタイプの発現コンストラクトを含む宿主細胞であって、各タイプの発現コンストラクトは、誘導性プロモーターと遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列とを含み、少なくとも１つの遺伝子産物は、ポリペプチドであり、または（ａ）免疫グロブリン重鎖；（ｂ）免疫グロブリン軽鎖；および（ｃ）（ａ）から（ｂ）のいずれかのフラグメント、からなる群から選択され、または免疫グロブリン軽鎖であり、または免疫グロブリン重鎖であり；またはインフリキシマブ重鎖もしくは軽鎖もしくはそのフラグメントであり、または配列番号３０もしくは配列番号３１の長さの少なくとも５０％もしくは８０％にわたって配列番号３０もしくは配列番号３１と少なくとも８０％もしくは９０％アミノ酸配列同一性をそれぞれ有し、または配列番号３０もしくは配列番号３１のアミノ酸配列を有する、宿主細胞を含む。
本発明の追加の実施形態では、宿主細胞は、２つまたはそれ以上のタイプの発現コンストラクトを含み、各タイプの発現コンストラクトは、誘導性プロモーターと遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列とを含み、前記ポリヌクレオチド配列は該誘導性プロモーターから転写され；少なくとも１つの遺伝子産物は、シグナルペプチドを欠くポリペプチドであり、少なくとも３つのジスルフィド結合、もしくは少なくとも３であって１７よりも少ないジスルフィド結合、もしくは少なくとも１８であって１００より少ないジスルフィド結合、もしくは少なくとも３であって１０より少ないジスルフィド結合、もしくは少なくとも３であって８より少ないジスルフィド結合を形成し；または３、４、５、６、７、８、および９からなる群から選択されるいくつかのジスルフィド結合を形成し、または（ａ）免疫グロブリン重鎖、（ｂ）免疫グロブリン軽鎖、（ｃ）マンガンペルオキシダーゼ、および（ｄ）（ａ）から（ｃ）のいずれかのフラグメント、からなる群から選択されるポリペプチドであり；またはインフリキシマブ重鎖もしくは軽鎖もしくはそのフラグメントであり、または配列番号３０もしくは配列番号３１の長さの少なくとも５０％もしくは８０％にわたって配列番号３０もしくは配列番号３１と少なくとも８０％もしくは９０％アミノ酸配列同一性をそれぞれ有し、または配列番号３０もしくは配列番号３１のアミノ酸配列を有し、または配列番号１３、配列番号１５、もしくは配列番号２３の長さの少なくとも５０％もしくは８０％にわたって配列番号１３、配列番号１５、もしくは配列番号２３と少なくとも８０％もしくは９０％アミノ酸配列同一性をそれぞれ有し、または配列番号１３、配列番号１５、もしくは配列番号２３のアミノ酸配列を有し；またはキシロースイソメラーゼのようなアラビノース利用酵素およびキシロース利用酵素からなる群から選択されるポリペプチドであり；またはマンガンペルオキシダーゼもしくは汎用性のあるペルオキシダーゼのようなリグニン分解ペルオキシダーゼからなる群から選択されるポリペプチドである。
本発明のさらなる実施形態では、２つのタイプの発現コンストラクトを含む宿主細胞が提供され、ある例では、１つのタイプの発現コンストラクトはｐＢＡＤ２４ポリヌクレオチド配列内にポリヌクレオチド配列を挿入する工程を含む方法により産生され、他のタイプの発現コンストラクトはｐＰＲＯ３３ポリヌクレオチド配列内にポリヌクレオチド配列を挿入する工程を含む方法により産生される。
本発明の別の例は、２つまたはそれ以上のタイプの発現コンストラクトを含む宿主細胞であって、各タイプの発現コンストラクトが誘導性プロモーターを含み、宿主細胞が少なくとも１つの前記誘導性プロモーターの誘導物質についての輸送タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の変異を有し、および別の例として、輸送タンパク質をコードする遺伝子は、ａｒａＥ、ａｒａＦ、ａｒａＧ、ａｒａＨ、ｒｈａＴ、ｘｙｌＦ、ｘｙｌＧ、およびｘｙｌＨからなる群から選択され、または特にａｒａＥである。さらなる実施形態として、宿主細胞は、２つまたはそれ以上のタイプの発現コンストラクトを含んで提供され、各タイプの発現コンストラクトが誘導性プロモーターを含み、宿主細胞は、少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の低減されたレベルを有し、さらなる実施例として、少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする遺伝子は、ａｒａＡ、ａｒａＢ、ａｒａＤ、ｐｒｐＢ、ｐｒｐＤ、ｒｈａＡ、ｒｈａＢ、ｒｈａＤ、ｘｙｌＡ、およびｘｙｌＢからなる群から選択される。追加の実施例として、宿主細胞は、２つまたはそれ以上のタイプの発現コンストラクトを含んで提供され、各タイプの発現コンストラクトが誘導性プロモーターを含み、宿主細胞は、少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質の生合成を伴うタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の低減されたレベルを有し、さらなる実施形態では、ｓｃｐＡ／ｓｂｍ、ａｒｇＫ／ｙｇｆＤ、ｓｃｐＢ／ｙｇｆＧ、ｓｃｐＣ／ｙｇｆＨ、ｒｍｌＡ、ｒｍｌＢ、ｒｍｌＣ、およびｒｍｌＤからなる群から選択される。
また、本発明は、２つまたはそれ以上のタイプの発現コンストラクトを含む宿主細胞を提供し、各タイプの発現コンストラクトが誘導性プロモーターを含み、宿主細胞は、該宿主細胞の細胞質の還元／酸化環境に影響を及ぼす、遺伝子の変異した遺伝子機能を有し、いくつかの実施例では、ｇｏｒおよびｇｓｈＢからなる群から選択され、または宿主細胞は、還元酵素をコードする遺伝子の低減されたレベルの遺伝子機能を有し、いくつかの実施形態ではｔｒｘＢであり、または宿主細胞は、少なくとも１つのジスルフィド結合イソメラーゼタンパク質をコードする少なくとも１つの発現コンストラクトを含み、いくつかの実施形態ではＤｓｂＣであり、または宿主細胞は、シグナルペプチドを欠くＤｓｂＣの形態をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、または宿主細胞は、Ｅｒｖ１ｐをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
本発明の他の態様では、２つまたはそれ以上のタイプの発現コンストラクトを含む宿主細胞を提供し、各タイプの発現コンストラクトが誘導性プロモーターを含み、各タイプの発現コンストラクトは、各他のタイプの発現コンストラクトの誘導性プロモーターではない該誘導性プロモーターを含み、または各タイプの前記発現コンストラクトは、各他のタイプの前記発現コンストラクトの複製起点と異なる複製起点を含む。
本発明の特定の実施例として、２つのタイプの発現コンストラクトを含む大腸菌宿主細胞が提供され、１つのタイプの発現コンストラクトは、ｐＢＡＤ２４ポリヌクレオチド配列内にポリヌクレオチド配列を挿入する工程を含む方法により産生され、他のタイプの発現コンストラクトは、ｐＰＲＯ３３ポリヌクレオチド配列内にポリヌクレオチド配列を挿入する工程を含む方法により産生され、および宿主細胞は、２つまたはそれ以上の以下の、（ａ）ａｒａＢＡＤ遺伝子の欠失；（ｂ）変異した遺伝子機能のａｒａＥおよびａｒａＦＧＨ遺伝子；（ｃ）ｌａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）遺伝子；（ｄ）低減された遺伝子機能のｐｒｐＢおよびｐｒｐＤ遺伝子；（ｅ）ｙｇｆＩ遺伝子の発現を変更しない、低減された遺伝子機能のｓｂｍ／ｓｃｐＡ−ｙｇｆＤ／ａｒｇＫ−ｙｇｆＧＨ／ｓｃｐＢＣ遺伝子；（ｆ）低減された遺伝子機能のｇｏｒおよびｔｒｘＢ遺伝子；（ｇ）低減された遺伝子機能のＡｓｃＧ遺伝子；（ｈ）シグナルペプチドを欠くＤｓｂＣの形態をコードするポリヌクレオチド；および（ｉ）Ｅｒｖ１ｐ、ＣｈｕＡ、またはシャペロンをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、およびある実施例では、宿主細胞は、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記ポリヌクレオチド配列は誘導性プロモーターから転写され、少なくとも１つの発現コンストラクトをさらに含み、いくつかの例では、遺伝子産物は、（ａ）免疫グロブリン重鎖、（ｂ）免疫グロブリン軽鎖、（ｃ）マンガンペルオキシダーゼ、および（ｄ）（ａ）から（ｃ）のいずれかのフラグメント、からなる群から選択され；またはインフリキシマブ重鎖もしくは軽鎖もしくはそのフラグメントであり、または配列番号３０もしくは配列番号３１の長さの少なくとも５０％もしくは８０％にわたって配列番号３０もしくは配列番号３１と少なくとも８０％もしくは９０％アミノ酸配列同一性をそれぞれ有し、または配列番号３０もしくは配列番号３１のアミノ酸配列を有し；または配列番号１３、配列番号１５、もしくは配列番号２３の長さの少なくとも５０％もしくは８０％にわたって配列番号１３、配列番号１５、もしくは配列番号２３と少なくとも８０％もしくは９０％アミノ酸配列同一性をそれぞれ有し、または配列番号１３、配列番号１５、もしくは配列番号２３のアミノ酸配列を有し；またはキシロースイソメラーゼのようなアラビノース利用酵素およびキシロース利用酵素からなる群から選択されるポリペプチドであり；またはマンガンペルオキシダーゼもしくは汎用性のあるペルオキシダーゼのようなリグニン分解ペルオキシダーゼからなる群から選択されるポリペプチドである。
また、産物を産生する方法は、上記のような本発明の宿主細胞の培養を増殖させ、培養に少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質を添加することによるような、本発明により提供され、この方法により産生される遺伝子産物または多量体産物もまた本発明により提供され、いくつかの実施形態では、抗体であり、より具体的な例では、アグリコシル化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。
また、宿主細胞を含むキットが、本発明の系および方法により提供され、宿主細胞は２つまたはそれ以上のタイプの発現コンストラクトを含み、各タイプの発現コンストラクトが誘導性プロモーターを含み、およびキットは、本発明の宿主細胞を増殖させて培養に少なくとも１つの誘導物質を添加することにより産生される遺伝子産物または多量体産物を含み、いくつかの実施形態では、多量体産物は抗体であり、より具体的な例では、アグリコシル化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。
図１は、誘導性共発現系の概略図であり、誘導物質（５）の適用で異なる遺伝子産物を発現し、多量体産物（６）を形成する、２つの異なる誘導性発現ベクター（３）および（４）を含む宿主細胞（１）を含む。 図２は、誘導性共発現系の特定の使用の概略図であり、大腸菌宿主細胞ゲノム（２）が、シグナルペプチドを欠くジスルフィドイソメラーゼＤｓｂＣの細胞質の形態をコードし、発現ベクターｐＢＡＤ２４（３）が免疫グロブリン重鎖のＬ−アラビノース誘導性発現を提供し、発現ベクターｐＰＲＯ３３（４）が免疫グロブリン軽鎖のプロピオネート誘導性発現を提供し、多量体抗体産物（６）を誘導（５）で形成する。 図３は、細菌性細胞における免疫グロブリン重鎖および軽鎖の共発現の結果を示す。ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）ＥｘｐｒｅｓｓおよびｐＢＡＤ２４−ＨＣおよびｐＰＲＯ３３−ＬＣ誘導性発現ベクターの両方を含むＢＬ２１細胞が、Ｌ−アラビノースおよびプロピオネートにおける増殖により誘導された。誘導された細胞および非誘導の対照から抽出される可溶性のタンパク質が、４から１２％のビス−トリスゲル上で還元条件下でＳＤＳゲル電気泳動により分離された。レーン１：誘導されたＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ。レーン２：非誘導のＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ。レーン３：誘導されたＢＬ２１。レーン４：非誘導のＢＬ２１。矢印は、５１ｋＤａでタンパク質バンド（ＩｇＧ１重鎖）および２６ｋＤａで他のタンパク質バンド（ＩｇＧ１軽鎖）を示し、これらのバンドは、誘導された細胞では存在するが、非誘導の細胞では存在しない。 図４は、細菌性の細胞における免疫グロブリン重鎖および軽鎖の共発現の結果を示す。同じ可溶性のタンパク質は、図３に記載されるように、誘導されたおよび非誘導のＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）ＥｘｐｒｅｓｓおよびｐＢＡＤ２４−ＨＣおよびｐＰＲＯ３３−ＬＣ誘導性発現ベクターの両方を含むＢＬ２１細胞から抽出し、１０から２０％トリス−グリシンゲル上で天然の（非還元）条件下でゲル電気泳動により分離された。レーン１：誘導されたＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ。レーン２：非誘導のＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ。レーン３：誘導されたＢＬ２１。レーン４：非誘導のＢＬ２１。矢印は、１５４ｋＤａでタンパク質バンド（重鎖および軽鎖を含むＩｇＧ１抗体）を示し、このバンドは、誘導されたＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞では存在するが、誘導されたＢＬ２１細胞および非誘導の細胞では有意に低減されまたは存在しない。 図５は、ヘムの存在下で、細菌性の細胞における、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の共発現の結果を示す。ｐＰＲＯ３３−ＭｎＰ−ＣｈｕＡおよびｐＢＡＤ２４−ＰＤＩ誘導性発現ベクターの両方を含む、ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞は、Ｌ−アラビノースおよびプロピオネートにおける増殖により誘導された。非誘導および誘導された細胞から抽出された可溶性のタンパク質が、１０％ビス−グリシンゲル上で還元条件下でゲル電気泳動により分離された。 マーカー：Bio-Rad Precision Plus Protein（商標）スタンダード（前染色された） レーン１：誘導されていない（ヘミンなし、プロピオネートなし、アラビノースなし） レーン２：５０ｍＭプロピオネート ０．００２％アラビノース レーン３：２５ｍＭプロピオネート ０．００２％アラビノース レーン４：１２．５ｍＭプロピオネート ０．００２％アラビノース レーン５：５０ｍＭプロピオネート ０．０１％アラビノース レーン６：２５ｍＭプロピオネート ０．０１％アラビノース レーン７：１２．５ｍＭプロピオネート ０．０１％アラビノース レーン８：５０ｍＭプロピオネート ０．０５％アラビノース レーン９：２５ｍＭプロピオネート ０．０５％アラビノース レーン１０：１２．５ｍＭプロピオネート ０．０５％アラビノース 矢印は、３９ｋＤａでＭｎＰ、および５３ｋＤａでＰＤＩのタンパク質バンドを示し、これらのバンドは、最も強い所定の誘導条件下で誘導されたＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞では存在するが、非誘導の細胞では有意に低減される。 図６は、ヘムの存在下で、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ＿ＦＴ）およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の代替的な成熟形態の、細菌性の細胞における、共発現の結果を示す。ｐＢＡＤ２４−ＭｎＰ＿ＦＴ−ＣｈｕＡおよびｐＰＲＯ３３−ＰＤＩ誘導性発現ベクターの両方を含む、ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞は、０．１％Ｌ−アラビノースおよび５０ｍＭプロピオネートでの増殖により誘導された。非誘導および誘導細胞から抽出される可溶性のタンパク質が、１０％ビス−グリシンゲル上で還元条件下でゲル電気泳動により分離された。 レーン１：分子量マーカー Bio-Rad Precision Plus Protein（商標）スタンダード（前染色された） レーン２：誘導された共発現（０．１％Ｌ−アラビノース、５０ｍＭプロピオネート） レーン３：非誘導（ヘミンなし、Ｌ−アラビノースなし、プロピオネートなし） レーン４：誘導された対照（タンパク質をコードする挿入なし） レーン５：非誘導の対照（タンパク質をコードする挿入なし）
相互に不適合な共発現系構成要素の問題には、相互適合性のある均質的に誘導性をもったプロモーター系を別々の発現コンストラクト上に配置して、いくつかの実施形態では種々の誘導物質によって活性化して、利用する、整合性の取れた細菌共発現系の開発によって取り組む。本発明の利点としては、以下に限定するものではないが、
１）誘導性共発現系内の構成要素の相互適合性向上、
２）多量体を一緒に形成する遺伝子産物又は遺伝子産物のその他の組み合わせの、誘導性発現（２つ以上の遺伝子産物の共発現）、
３）独立的滴定可能な誘導による、遺伝子産物共発現の制御向上、
４）多量体産物及び、ジスルフィド結合を形成する産物等、発現させることが困難な遺伝子産物複合体及び他の産物の発現向上、
５）遺伝子産物共発現の最新式最適化、
が挙げられる。
共発現遺伝子産物 本発明の誘導性共発現系は、所望の産物に役立つ２つ以上の異なる遺伝子産物を共発現するように設計する。所望の産物は共発現遺伝子産物から形成する多量体であってもよく、又は、共発現を用いて、所望の産物と、所望の産物の発現を助ける追加的１つの産物又は複数の産物とを組み合わせたものを産生してもよい。
「多量体産物」は、共に会合して多量体産物の機能を果たす一式の遺伝子産物を指し、遺伝子産物と他の分子の間の一過性会合物、例えば修飾酵素（キナーゼ、ペプチダーゼ及び同種のもの）、シャペロン、トランスポーター等は指さない。本発明の所定の実施形態では、多量体産物はヘテロ多量体である。多くの実施形態では、共発現遺伝子産物は、多量体タンパク質のサブユニットであるポリペプチドであってもよい。しかしながら、本発明の誘導性共発現系を使って、複数の異なる非コードＲＮＡ分子又は、ポリペプチド及び非コードＲＮＡ遺伝子産物の組み合わせを共発現することもまた可能である。非タンパク質コードＲＮＡ（ｎｐｃＲＮＡ）とも称される非コードＲＮＡ分子、非メッセンジャーＲＮＡ（ｎｍＲＮＡ）及び機能ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）には多くの異なる種類のＲＮＡ分子が含まれ、例えば、メッセンジャーＲＮＡでない、したがって翻訳を通してポリペプチドを形成するための鋳型でないマイクロＲＮＡが含まれる。
多くの生物学的に重要な産物は複数の異なるポリペプチド鎖の組み合わせから形成される。抗体及び抗体断片に加えて、本発明の誘導性共発現方法によって産生することができる他の多量体産物としては、Ｇ結合タンパク質受容体及びリガンド開口型イオンチャネル、例えば、ニコチン性アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡＡ受容体、グリシン受容体、セロトニン受容体、グルタミン酸受容体と、Ｐ２Ｘ受容体等のＡＴＰゲーティッド（ＡＴＰ−ｇａｔｅｄ）受容体とが挙げられる。ボツリヌス神経毒素（しばしばＢｏＴＮ、ＢＴＸ、又は市販されている形式のひとつであるＢＯＴＯＸ（登録商標）（オナボツリヌス毒素Ａ）と称される）は、ジスルフィド結合によって連結される重鎖及び軽鎖から形成される（Simpson et al., "The role of the interchain disulfide bond in governing the pharmacological actions of botulinum toxin", J Pharmacol Exp Ther 2004 Mar; 308(3): 857-864, Epub 2003 Nov 14）。複数の異なるポリペプチド鎖から形成される産物の別の例はインスリンで、これは真核生物においてまず単一ポリペプチド鎖として翻訳され、折り畳まれ、次いで切断されて、最終的にはジスルフィド結合によって結合された２つのポリペプチド鎖になる。単一宿主細胞においてボツリヌス神経毒素又は成熟インスリンを効率的に産生することは、本発明の誘導性共発現方法の使用例である。
本発明の方法は、遺伝子産物を産生するように設計しており、この遺伝子産物は、機能的産物の中に正確に折り畳まれかつ／又は会合し、そのような機能的産物の中で所望の位置において所望の数のジスルフィド結合を有するものである（これは、実施例１１等の方法によって測定することができる）。ポリペプチド等の遺伝子産物のジスルフィド結合の数は、その遺伝子産物が所望の機能的産物の中に存在するときにその産物によって形成される分子内及び分子間結合の総数である。例えば、ヒトＩｇＧ抗体の軽鎖は典型的に３つのジスルフィド結合（２つの分子内結合及び１つの分子間結合）を有し、ヒトＩｇＧ抗体の重鎖は典型的に７つのジスルフィド結合（４つの分子内結合及び３つの分子間結合）を有する。いくつかの実施形態では、所望の遺伝子産物は、所望の遺伝子産物の産生に有益なシャペロン等の他の遺伝子産物で共発現される。シャペロンは、他の遺伝子産物の非共有結合フォールディング若しくはアンフォールディング及び／又は会合若しくは分解を助けはするが、結果として生じる単量体又は多量体遺伝子産物構造が（フォールディング及び／又は会合のプロセスを完了した後）その通常の生体機能を遂行しているときにはその構造中には現れないタンパク質である。シャペロンは、発現コンストラクト内で誘導性プロモーター又は構成的プロモーターから発現することができ、あるいは宿主細胞染色体から発現することができ、好ましくは、宿主細胞におけるシャペロンタンパク質（複数を含む）の発現は、所望の産物の中へ適切にフォールディング及び／又は会合する共発現遺伝子産物を産生するのに十分高いレベルにある。大腸菌宿主細胞に存在するシャペロンの例としては、フォールディング因子のＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ、ＤｓｂＣ／ＤｓｂＧ、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ、ＩｂｐＡ／ＩｂｐＢ、Ｓｋｐ、Ｔｉｇ（トリガー因子）、及びＦｋｐＡが挙げられ、これらを用いて細胞質又は周辺質タンパク質のタンパク質凝集を防いできた。ＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ、及びＣｌｐＢは、タンパク質フォールディングを助ける上で相乗的に機能することができ、したがってこれらのシャペロンを組み合わせて発現することは、タンパク質発現に有益であることが示されている（Makino et al., "Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria", Microb Cell Fact 2011 May 14; 10: 32）。原核生物宿主細胞において真核生物タンパク質を発現するとき、同じ又は関連の真核生物種に由来するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）等の真核生物シャペロンタンパク質は、本発明の所定の実施形態では所望の遺伝子産物と共発現又は誘導的共発現をする。
誘導性プロモーター 以下は、発現コンストラクトにおいて遺伝子産物の共発現に用いることのできる誘導性プロモーターについて、そのような発現コンストラクトを含有する宿主細胞に対して行える遺伝子修飾のいくつかとともに記載したものである。これらの誘導性プロモーター及び関連遺伝子の例は、他に断りがなければ、エシェリキア・コリ（大腸菌）菌株ＭＧ１６５５（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託ＡＴＣＣ ７００９２６）に由来するものであり、これは大腸菌Ｋ−１２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託ＡＴＣＣ １０７９８）の亜株である。表１は、誘導性プロモーター及び関連遺伝子のこれらの例について、大腸菌ＭＧ１６５５におけるヌクレオチド配列の遺伝子位置を列記する。ヌクレオチド及び他の遺伝子の配列で、表１にある遺伝子位置に従って参照されるものは、本明細書に明示的に援用されるものとする。本明細書に記載される大腸菌のプロモーター、遺伝子、及び菌株に関する追加情報は、オンラインでｅｃｏｌｉｗｉｋｉ．ｎｅｔに位置するＥｃｏｌｉＷｉｋｉの情報源等、多くの公開情報源に見つけることができる。
アラビノースプロモーター （本明細書で使用される場合、「アラビノース」はＬ−アラビノースを意味する。）アラビノース利用に関係するいくつかの大腸菌オペロンは、アラビノース − ａｒａＢＡＤ、ａｒａＣ、ａｒａＥ及びａｒａＦＧＨ − によって誘導性となるが、「アラビノースプロモーター」及び「ａｒａプロモーター」という用語は典型的に、ａｒａＢＡＤプロモーターを指して用いられる。Ｐａｒａ、ＰａｒａＢ、ＰａｒａＢＡＤ及びＰＢＡＤ等、大腸菌ａｒａＢＡＤプロモーターを指して、いくつか別の用語も用いている。「ａｒａプロモーター」又は上に記載の代替用語のいずれも、本明細書で使う場合、大腸菌ａｒａＢＡＤプロモーターを意味する。別の用語「ａｒａＣ−ａｒａＢＡＤプロモーター」が使われることからも分かるように、ａｒａＢＡＤプロモーターは双方向性プロモーターの一部と考えられ、一方向にａｒａＢＡＤがａｒａＢＡＤオペロンの発現を制御し、他方向にａｒａＣプロモーターが、ａｒａＢＡＤプロモーターに隣接してかつａｒａＢＡＤプロモーターとは反対側の鎖上でａｒａＣコード配列の発現を制御する。ＡｒａＣタンパク質は、ａｒａＢＡＤプロモーターの正負両方の転写制御因子である。アラビノースの不存在下でＡｒａＣタンパク質はＰＢＡＤからの転写を抑制するが、アラビノースの存在下でＡｒａＣタンパク質はアラビノースに結合するとそのコンフォーメーションを変異させるので、ＰＢＡＤからの転写を可能とする正の調節要素になる。ａｒａＢＡＤオペロンはＬ−アラビノースを代謝するタンパク質をコードし、この代謝は、Ｌ−アラビノースを中間体であるＬ−リブロース及びＬ−リブロース−リン酸を経てＤ−キシルロース−５−リン酸に変換することによる。アラビノース誘導性プロモーターからの発現の誘導をできるだけ大きくする目的で、ＡｒａＡの機能を削除又は低減することは有用であり、ＡｒａＡはＬ−アラビノースのＬ−リブロースへの変換を触媒し、任意でＡｒａＢ及びＡｒａＤの少なくとも１つの機能を削除又は低減することができる。宿主細胞における有効濃度のアラビノースを減少させることができるその細胞の能力を削除又は低減すると、その細胞がアラビノースを他の糖に変換できる能力を削除又は低減することによって、アラビノース−誘導性プロモーターの誘導のためにより多くのアラビノースが得られるようになる。アラビノースを宿主細胞中へ移動させるトランスポーターをコードする遺伝子はａｒａＥ及びａｒａＦＧＨオペロンで、ａｒａＥは低親和性Ｌ−アラビノースプロトンシンポーターをコードし、ａｒａＦＧＨオペロンはＡＢＣスーパーファミリー高親和性Ｌ−アラビノーストランスポーターのサブユニットをコードする。Ｌ−アラビノースを細胞質中へ輸送できる他のタンパク質は、ＬａｃＹラクトース・ペルメアーゼの所定の突然変異体である、ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）及びＬａｃＹ（Ａ１７７Ｖ）タンパク質であり、位置１７７でアラニンの代わりにシステイン又はバリンをそれぞれ有する（Morgan-Kiss et al., "Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coli araBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity", Proc Natl Acad Sci U S A 2002 May 28; 99(11): 7373-7377）。アラビノース誘導性プロモーターの均質的誘導を達成するために、アラビノースによる調節からは独立して細胞質へのアラビノースの輸送を行うことが有用である。これは、ＡｒａＦＧＨ輸送タンパク質の活性を削除又は低減し、ａｒａＥの発現を変異させて、ａｒａＥのみが構成的プロモーターから転写されるようにすることによって、成し遂げることができる。ａｒａＥの構成的発現は、天然ａｒａＥ遺伝子の機能を削除又は低減すること及び、構成的プロモーターから発現されたＡｒａＥタンパク質のためのコード配列を含む発現コンストラクトを細胞中に導入することによって達成できる。あるいは、ＡｒａＦＧＨ機能を欠く細胞において、宿主細胞の染色体ａｒａＥ遺伝子の発現を制御するプロモーターは、アラビノース誘導性プロモーターから構成的プロモーターへ変化させることができる。同様に、アラビノース誘導性プロモーターの均質的誘導のための更なる代替方法として、ＡｒａＥ機能を欠く宿主細胞は、構成的プロモーターから発現された細胞中に存在する機能的ＡｒａＦＧＨコード配列を有することができる。別の代替方法として、宿主染色体において天然ａｒａＥ及びａｒａＦＧＨプロモーターを構成的プロモーターで置き換えることによって、ａｒａＥ遺伝子及びａｒａＦＧＨオペロンの両方を構成的プロモーターから発現することが可能である。ＡｒａＥ及びＡｒａＦＧＨアラビノーストランスポーターの両方の活性を削除又は低減し、その状況で、ＬａｃＹラクトース・ペルメアーゼによるアラビノース輸送を可能とするそのタンパク質における突然変異を用いることもまた可能である。ｌａｃＹ遺伝子の発現はアラビノースによって正常に調節されないので、アラビノース誘導性プロモーターがアラビノースの存在によって誘導されるとき、ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）又はＬａｃＹ（Ａ１７７Ｖ）等のＬａｃＹ突然変異体の使用は、「全か無か」の誘導現象にはならない。ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）タンパク質はアラビノースを細胞中に輸送する点でより有効であるように思われるので、ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用は、ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｖ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用より好ましい。
プロピオネートプロモーター 「プロピオネートプロモーター」又は「ｐｒｐプロモーター」は大腸菌ｐｒｐＢＣＤＥオペロンのプロモーターであり、ＰｐｒｐＢとも称する。ａｒａプロモーターと同様、ｐｒｐプロモーターは双方向プロモーターの一部であり、一方向にｐｒｐＢＣＤＥオペロンの発現を制御し、他方向にはｐｒｐＲプロモーターがｐｒｐＲコード配列の発現を制御する。ＰｒｐＲタンパク質はｐｒｐプロモーターの転写制御因子であり、ＰｒｐＲタンパク質が２−メチルシトレート（「２−ＭＣ」）に結合するときにｐｒｐプロモーターからの転写を活性化する。プロピオネート（プロパノエイトとも称する）はプロピオン酸（即ち「プロパン酸」）のイオン、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯ−であり、一般式Ｈ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨを有する「脂肪」酸の中で最も小さいものであり、この分類の分子がもつ所定の特性、即ち、水から塩析すると油状の層を生成して石鹸状カリウム塩を生成できるという特性を共有する。市販されるプロピオネートは概して固体であり、プロピオン酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯＮａ）等のプロピオン酸一価カチオン塩又は、プロピオン酸カルシウム（Ｃａ（ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯ）２）等の二価カチオン塩である。プロピオネートは膜透過性であり、ＰｒｐＥ（プロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ）によってプロピオネートをプロピオニル−ＣｏＡに変換し、次いでＰｒｐＣ（２−メチルシトレートシンターゼ）によってプロピオニル−ＣｏＡを２−ＭＣに変換することによって、２−ＭＣに代謝される。ｐｒｐＢＣＤＥオペロン、ＰｒｐＤ（２−メチルシトレートデヒドラターゼ）及びＰｒｐＢ（２−メチルイソシトレートリアーゼ）がコードする他のタンパク質は、ピルビン酸及びコハク酸等のより小さい産物への２−ＭＣのさらなる異化作用に関与する。細胞増殖培地に加えたプロピオネートによってプロピオネート誘導性プロモーターの誘導をできるだけ大きくするためには、したがって、ＰｒｐＣ及びＰｒｐＥ活性をもった宿主細胞を有して、プロピオネートを２−ＭＣへ変換することが望ましいが、また、ＰｒｐＤ活性を削除又は低減し、任意でＰｒｐＢ活性も削除又は低減して、２−ＭＣが代謝されるのを防ぐことが望ましい。２−ＭＣ生合成に関与するタンパク質をコードする別のオペロンはｓｃｐＡ−ａｒｇＫ−ｓｃｐＢＣオペロンで、ｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨオペロンとも称する。これらの遺伝子は、コハク酸をプロピオニル−ＣｏＡへ変換し、次いでＰｒｐＣによって２−ＭＣに変換するのに必要とされるタンパク質をコードする。これらのタンパク質の機能の削除又は低減は、２−ＭＣ誘導物質の産生のための平行経路を除去することがあり、従って、プロピオネート誘導性プロモーターの発現のバックグラウンドレベルを低減し、外因的に供給されるプロピオネートに対するプロピオネート誘導性プロモーターの感度を増加させることがある。ｓｂｍ−ｙｇｆＤ−ｙｇｆＧ−ｙｇｆＨ−ｙｇｆＩの欠失を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して菌株ＪＳＢを作成すること（Lee and Keasling, "A propionate-inducible expression system for enteric bacteria", Appl Environ Microbiol 2005 Nov; 71(11): 6856-6862）は、外因的に供給された誘導物質の不存在下でバックグラウンド発現を低減する際に役立っており、この欠失はまた菌株ＪＳＢにおけるｐｒｐプロモーターからの全体的発現を低減した。しかしながら、欠失ｓｂｍ−ｙｇｆＤ−ｙｇｆＧ−ｙｇｆＨ−ｙｇｆＩはまたｙｇｆＩに影響を与えると思われ、これは機能の不明な推定上のＬｙｓＲ−ファミリー転写制御因子をコードするということに留意されたい。遺伝子ｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨは１つのオペロンとして転写され、ｙｇｆＩは反対側の鎖から転写される。ｙｇｆＨとｙｇｆＩのコード配列の３’末端はいくつかの塩基対でオーバーラップするので、ｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨオペロンの全てを取り除く欠失はｙｇｆＩコード機能をも明らかに取り除く。ＹｇｆＧ（ＳｃｐＢ、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼとも称す）等のｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨ遺伝子産物のサブセットの機能を削除又は低減すること、又は、ｙｇｆＩの発現が影響されないようにｙｇｆＨ（ｏｒｓｃｐＣ）遺伝子の十分な３’末端を残しながらｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨ（ｏｒｓｃｐＡ−ａｒｇＫ−ｓｃｐＢＣ）オペロンの大部分を欠失させることは、最大レベルの誘導発現を低減することなくプロピオネート誘導性プロモーターからバックグラウンド発現を低減するのに十分であると思われる。
ラムノースプロモーター （本明細書で使用される場合、「ラムノース」はＬ−ラムノースを意味する）「ラムノースプロモーター」即ち「ｒｈａプロモーター」、又はＰｒｈａＳＲは大腸菌ｒｈａＳＲオペロンのためのプロモーターである。ａｒａプロモーター及びｐｒｐプロモーターと同様、ｒｈａプロモーターは双方向プロモーターの一部であり、一方向にｒｈａＳＲオペロンの発現を制御し、他方向にはｒｈａＢＡＤプロモーターがｒｈａＢＡＤオペロンの発現を制御する。しかしながら、ｒｈａプロモーターは、発現の調節に関与する２つの転写制御因子、即ちＲｈａＲ及びＲｈａＳを有する。ＲｈａＲタンパク質はラムノースの存在下でｒｈａＳＲオペロンの発現を活性化し、一方ＲｈａＳタンパク質はＬ−ラムノース異化及び輸送オペロンであるそれぞれｒｈａＢＡＤ及びｒｈａＴを活性化する（Wickstrum et al., "The AraC/XylS family activator RhaS negatively autoregulates rhaSR expression by preventing cyclic AMP receptor protein activation", J Bacteriol 2010 Jan; 192(1): 225-232）。ＲｈａＳタンパク質はまたｒｈａＳＲオペロンの発現を活性化することができるけれども、実際ＲｈａＳはこの発現を、ＲｈａＲとの発現を非常により大きなレベルに同時活性化できるサイクリックＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ）の能力に干渉することによって、負に自己調節する。ｒｈａＢＡＤオペロンは、Ｌ−ラムノースをＬ−ラムヌロースに変換するラムノース異化タンパク質ＲｈａＡ（Ｌ−ラムノースイソメラーゼ）と、Ｌ−ラムヌロースをリン酸化してＬ−ラムヌロース−１−Ｐを形成するＲｈａＢ（ラムヌロキナーゼ）と、Ｌ−ラムヌロース−１−ＰをＬ−ラクトアルデヒド及びＤＨＡＰ（リン酸ジヒドロキシアセトン）に変換するＲｈａＤ（ラムヌロース−１−リン酸アルドラーゼ）とをコードする。ラムノース誘導性プロモーターからの発現を誘導するために得られる細胞内ラムノースの量をできるだけ多くするためには、ＲｈａＡの機能又は、任意でＲｈａＡとＲｈａＢ及びＲｈａＤの少なくとも１つとの機能を削除又は低減することによって、触媒作用が分解するラムノースの量を低減することが望ましい。大腸菌細胞質はまた、ｒｍｌＢＤＡＣＸ（又はｒｆｂＢＤＡＣＸ）オペロンがコードするタンパク質ＲｍｌＡ、ＲｍｌＢ、ＲｍｌＣ及びＲｍｌＤ（それぞれＲｆｂＡ、ＲｆｂＢ、ＲｆｂＣ及びＲｆｂＤとも称する）の活性を通して、Ｌ−ラムノースをα−Ｄ−グルコース−１−Ｐから合成することができる。ラムノース誘導性プロモーターからのバックグラウンド発現を低減し、外因的に供給されるラムノースによるラムノース誘導性プロモーターの誘導の感度を高めるためには、ＲｍｌＡ、ＲｍｌＢ、ＲｍｌＣ及びＲｍｌＤタンパク質の１つ又は複数の機能を削除又は低減することが有益であると考えられる。Ｌ−ラムノースは、ＲｈａＴ、ラムノースパーミアーゼ又はＬ−ラムノース：プロトンシンポーターによって細胞内に輸送される。上に記される通り、ＲｈａＴの発現は転写制御因子ＲｈａＳによって活性化される。ラムノース（ＲｈａＳの発現を誘導する）による誘導からは独立してＲｈａＴの発現を行うためには、宿主細胞を変異させて、細胞内の全ての機能ａｌＲｈａＴコード配列が構成的プロモーターから発現されるようにすることができる。加えて、ＲｈａＳのコード配列は欠失又は不活性化させて、機能的ＲｈａＳが産生されないようにすることができる。細胞内のＲｈａＳの機能を削除又は低減することにより、ｒｈａＳＲプロモーターからの発現のレベルを、ＲｈａＳによる負の自己調節の不存在に基づいて増加させ、ラムノース触媒的オペロンｒｈａＢＡＤの発現のレベルを減少させ、ｒｈａプロモーターからの発現を誘導できるラムノースの能力をさらに増加させる。
キシロースプロモーター （本明細書で使用される場合、「キシロース」はＤ−キシロースを意味する）キシロースプロモーター又は「ｘｙｌプロモーター」又はＰｘｙｌＡは、大腸菌ｘｙｌＡＢオペロンのプロモーターを意味する。キシロースプロモーター領域は、ｘｙｌＡＢオペロンとｘｙｌＦＧＨＲオペロンの両方が、隣り合うキシロース誘導性プロモーターから大腸菌染色体上で反対方向に発現されるという意味において、組織の点で他の誘導性プロモーターに類似している（Song and Park, "Organization and regulation of the D-xylose operons in Escherichia coli K-12: XylR acts as a transcriptional activator", J Bacteriol. 1997 Nov; 179(22): 7025-7032）。ＰｘｙｌＡ及びＰｘｙｌＦプロモーターの両方の転写制御因子はＸｙｌＲであり、キシロースの存在下でこれらのプロモーターの発現を活性化する。ｘｙｌＲ遺伝子はｘｙｌＦＧＨＲオペロンの一部として発現されるか又はそれ自身の弱いプロモーターから発現され、このプロモーターはキシロースによる誘導性はなく、ｘｙｌＨ及びｘｙｌＲのタンパク質コード配列間に位置する。Ｄ−キシロースはＸｙｌＡ（Ｄ−キシロースイソメラーゼ）によって異化され、これはＤ−キシロースをＤ−キシルロースに変換し、これは次いでＸｙｌＢ（キシルロキナーゼ）によってリン酸化されてＤ−キシルロース−５−Ｐを形成する。キシロース誘導性プロモーターからの発現を誘導するために得られる細胞内キシロースの量をできるだけ多くするためには、少なくともＸｙｌＡの機能又は、任意でＸｙｌＡとＸｙｌＢの両方の機能を削除又は低減することによって、触媒作用が分解するキシロースの量を低減することが望ましい。ｘｙｌＦＧＨＲオペロンは、ＡＢＣスーパーファミリー高親和性Ｄ−キシローストランスポーターのサブユニットであるＸｙｌＦ、ＸｙｌＧ及びＸｙｌＨをコードする。ｘｙｌＥ遺伝子は、大腸菌低親和性キシロース−プロトンシンポーターをコードするもので、分離オペロンの代表的なものであり、このオペロンの発現はまたキシロースによって誘導性となっている。キシロースによる誘導からは独立してキシローストランスポーターの発現を行うためには、宿主細胞を変異させて、全ての機能キシローストランスポーターが構成的プロモーターから発現されるようにすることができる。例えば、ｘｙｌＦＧＨコード配列が欠失するようにｘｙｌＦＧＨＲオペロンを変異させ、ＸｙｌＲをキシロース−誘導性ＰｘｙｌＦプロモーターから発現される唯一の活性タンパク質としておき、ｘｙｌＥコード配列はその天然プロモーターからではなく構成的プロモーターから発現されるようにすることも可能である。別の例として、ｘｙｌＲコード配列は発現コンストラクトにおいてＰｘｙｌＡ又はＰｘｙｌＦプロモーターから発現され、一方、ｘｙｌＦＧＨＲオペロンが欠失してｘｙｌＥが構成的に発現されるか、あるいは、ｘｙｌＦＧＨオペロン（ｘｙｌＲコード配列は発現コンストラクトに存在するので欠けている）が構成的プロモーターから発現されてｘｙｌＥコード配列が活性タンパク質を産生しないように欠失又は変異をされるか、する。
ラクトースプロモーター 「ラクトースプロモーター」という用語は、ｌａｃＺｐ１とも称されるプロモーターである、ｌａｃＺＹＡオペロンのためのラクトース誘導性プロモーターを指し、このラクトースプロモーターは、大腸菌Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿０００９１３．２，１１−ＪＡＮ−２０１２）のゲノム配列において約３６５６０３〜３６５５６８（負鎖であり、ＲＮＡポリメラーゼ結合（「−３５」）部位が約３６５６０３〜３６５５９８、プリブノーボックス（「−１０」）が３６５５７９〜３６５５７３、転写開始点が３６５５６７）に位置する。いくつかの実施形態では、本発明の誘導性共発現系はｌａｃＺＹＡプロモーター等のラクトース誘導性プロモーターを含んでいてもよい。他の実施形態では、本発明の誘導性共発現系は、ラクトース誘導性プロモーターでない１つ又は複数の誘導性プロモーターを含む。
表１注：
［１］ ゲノム配列位置は全て、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）によってＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿０００９１３．２，１１−ＪＡＮ−２０１２として提供される大腸菌Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５のゲノム配列を指す。
［２］ プロモーター領域の５’（又は「上流」）末端の位置は近似値である；「双方向」プロモーターについては、転写開始点間がおおよそ等距離にあるヌクレオチド配列位置が、個々のプロモーターの両方に対して指定５’「末端」として選択される。実際には、発現コンストラクトのプロモーター部分は、それが下流のコード配列の転写を誘導可能なように推進する能力を保持している限りは、その５’末端で、表に示されるプロモーター配列よりも幾分少ない配列を有していてもよく、あるいは、表に示されるプロモーター配列の領域５’（又は「上流」）からのさらなる配列を含むヌクレオチド配列を有していてもよい。
［３］ Smith and Schleif, "Nucleotide sequence of the L-arabinose regulatory region of Escherichia coli K12", J Biol Chem 1978 Oct 10; 253(19): 6931-6933。
［４］ 「ＲＮＡ ｐｏｌ」は表中、ＲＮＡポリメラーゼを示す。
［５］ Miyada, et al., "DNA sequence of the araC regulatory gene from Escherichia coli B/r", Nucleic Acids Res 1980 Nov 25; 8(22): 5267-5274。
［６］ Stoner and Schleif, "E. coli araE regulatory region araE codes for the low affinity L-arabinose uptake protein", GenBank Database Accession X00272.1, revision date 06-JUL-1989。
［７］ Hendrickson et al., "Sequence elements in the Escherichia coli araFGH promoter", J Bacteriol 1992 Nov; 174(21): 6862-6871。
［８］ 米国特許第８１７８３３８Ｂ２号；May 15 2012; Keasling, Jay；図９。
［９］ Wickstrum et al., "The AraC/XylS family activator RhaS negatively auto-regulates rhaSR expression by preventing cyclic AMP receptor protein activation", J Bacteriol 2010 Jan; 192(1): 225-232。
［１０］ Via et al., "Transcriptional regulation of the Escherichia coli rhaT gene", Microbiology 1996 Jul; 142(Pt 7): 1833-1840。
［１１］ Song and Park, "Organization and regulation of the D-xylose operons in Escherichia coli K-12: XylR acts as a transcriptional activator", J Bacteriol. 1997 Nov; 179(22): 7025-7032。
［１２］ Davis and Henderson, "The cloning and DNA sequence of the gene xylE for xylose-proton symport in Escherichia coli K12", J Biol Chem 1987 Oct 15; 262(29): 13928-13932。
発現コンストラクト 発現コンストラクトは目的の１つ又は複数の遺伝子産物を発現するように設計したポリヌクレオチドで、したがって天然の分子ではない。発現コンストラクトは宿主細胞染色体の中に組み込むか又は、プラスミド若しくは人工的染色体等の宿主細胞染色体から独立して複製するポリヌクレオチド分子として宿主細胞内に維持することができる。発現コンストラクトの例としては、１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を宿主細胞染色体の中に挿入して得られるポリヌクレオチドが挙げられ、挿入されたポリヌクレオチド配列は染色体コード配列の発現を変異させる。発現ベクターは、特に１つ又は複数の遺伝子産物の発現に用いられるプラスミド発現コンストラクトである。１つ又は複数の発現コンストラクトは宿主細胞染色体の中に組み込むか又は、プラスミド若しくは人工的染色体等の染色体外ポリヌクレオチド上に維持することができる。以下、遺伝子産物の共発現のために発現コンストラクトにおいて用いることができる特定のタイプのポリヌクレオチド配列に関する記載である。
複製起点 発現コンストラクトは、独立して複製するポリヌクレオチドとして宿主細胞内に維持されるためには、レプリコンとも称される複製起点を含まねばならない。複製のために同じメカニズムを用いる複数の異なるレプリコンは、繰り返される細胞分裂を通して単一の宿主細胞中に一緒に維持することができない。表２に示す通り結果としてプラスミドは、それが含有する複製起点によっては不和合性グループに分類することができる。
表２注：
［１］ www.bio.davidson.edu/courses/Molbio/Protocols/ORIs.html、及びSambrook and Russell, "Molecular Cloning: A laboratory manual", 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001から応用。
［２］ Kues and Stahl, "Replication of plasmids in gram-negative bacteria", Microbiol Rev 1989 Dec; 53(4): 491-516。
［３］ ｐＰＲＯ３３プラスミド（米国特許第８１７８３３８Ｂ２号；May 15 2012; Keasling, Jay）がＡｄｄｇｅｎｅプラスミド１７８１０としてＡｄｄｇｅｎｅ（www.addgene.org）から市販されている。
［４］ openwetware.org/wiki/CH391L/S12/Origins_of_Replication;accessed 03 Aug 2013。
複製起点は、発現コンストラクトにおける使用のために、他の基準とも併せて不和合性グループ、複製数及び／又は宿主範囲に基づいて選択することができる。上に記載の通り、２つ又は複数の異なる発現コンストラクトを複数遺伝子産物の共発現のために同じ宿主細胞において用いる場合、その異なる発現コンストラクトは、例えば、１つの発現コンストラクトにはｐＭＢ１レプリコン、別の発現コンストラクトにはｐ１５Ａレプリコンといったように、異なる不和合性グループの複製起点を含有していれば最も良い。宿主染色体分子数との関係における、細胞における発現コンストラクトの平均複製数は、発現コンストラクトに含有される複製起点によって決まる。複製数は、細胞当たり数個から数百個の範囲であり得る（表２）。本発明の一実施形態では、同じ誘導物質によって活性化されるが異なる複製起点を有する誘導性プロモーターを含む複数の異なる発現コンストラクトを用いる。細胞中にそれぞれ異なる発現コンストラクトを所定のおおよその複製数で維持する複製起点を選択することによって、１つの発現コンストラクトから発現される遺伝子産物の全体的産生レベルを、異なる発現コンストラクトから発現される別の遺伝子産物との関連において調整することが可能である。一例として、多量体タンパク質のサブユニットＡ及びＢを共発現するために、ｃｏｌＥ１レプリコンと、ａｒａプロモーターと、ａｒａプロモーターから発現されるサブユニットＡのコード配列とを含む発現コンストラクト：「ｃｏｌＥ１−Ｐａｒａ−Ａ」を作成する。別のものとしては、ｐ１５Ａレプリコン、ａｒａプロモーター及び、サブユニットＢのコード配列を含む発現コンストラクト：「ｐ１５Ａ−Ｐａｒａ−Ｂ」を作成する。これらの２つの発現コンストラクトは、同じ宿主細胞中に一緒に維持することができ、サブユニットＡ及びＢの両方の発現は１つの誘導物質、アラビノースを増殖培地に加えることによって誘導する。２つのサブユニットの発現量の化学量論比を所望の比率に近づけるために、サブユニットＡの発現レベルをサブユニットＢの発現レベルに対して大きく増加させる必要がある場合、例えば、ｐＵＣ９プラスミドの複製起点（「ｐＵＣ９ｏｒｉ」）にあるような修飾ｐＭＢ１レプリコンを有する新しいサブユニットＡ用発現コンストラクト：ｐＵＣ９ｏｒｉ−Ｐａｒａ−Ａを作成できると考えられる。ｐＵＣ９ｏｒｉ−Ｐａｒａ−Ａ等の高複製数発現コンストラクトからサブユニットＡを発現することは、ｐ１５Ａ−Ｐａｒａ−ＢからサブユニットＢを発現することに比べて、産生されるサブユニットＡの量を増加させる筈である。同様に、低複製数で発現コンストラクトを維持するｐＳＣ１０１等の複製起点の使用は、コンストラクトから発現される遺伝子産物の全体的レベルを低減し得ると考えられる。複製起点の選択はまた、レプリコンを含む発現コンストラクトをどの宿主細胞が維持できるかを決定する。例えば、ｃｏｌＥ１複製起点を含む発現コンストラクトは比較的狭い範囲の利用可能な宿主、即ち腸内細菌ファミリー内の種を有し、一方、ＲＫ２レプリコンを含む発現コンストラクトは大腸菌、緑膿菌、プチダ菌、アゾトバクター・ビネランジー及びアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）に維持することができ、発現コンストラクトがＲＫ２レプリコン及び、ＲＫ２プラスミドからのいくつかの調節遺伝子を含む場合は、それをシノリゾビウム・メリロティ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、カウロバクター・クレセンタス、アシネトバクター・カルコアセティカス及びロドバクター・スフェロイデス等、多種多様な宿主細胞に維持することができる（Kues and Stahl, "Replication of plasmids in gram-negative bacteria", Microbiol Rev 1989 Dec; 53(4): 491-516）。
類似の考え方を用いて、真核生物細胞における誘導性共発現のために発現コンストラクトを作成することができる。例えば、サッカロマイセス・セレビシエの２ミクロン環状プラスミドは、他の酵母からのプラスミド、例えばｐＳＲ１（ＡＴＣＣ寄託番号４８２３３及び６６０６９；Araki et al., "Molecular and functional organization of yeast plasmid pSR1", J Mol Biol 1985 Mar 20; 182(2): 191-203) and pKD1 (ATCC Deposit No. 37519; Chen et al., "Sequence organization of the circular plasmid pKD1 from the yeast Kluyveromyces drosophilarum", Nucleic Acids Res 1986 Jun 11; 14(11): 4471-4481）と和合性がある。
選択マーカー 発現コンストラクトは通常、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含み、これは、選択培養培地において宿主細胞の残存又は増殖に必要なタンパク質をコードするものである。選択遺伝子を含む発現コンストラクトを含有しない宿主細胞質は培養培地において残存しないことになる。典型的な選択遺伝子は、抗生物質若しくは他の毒素に耐性を与えるタンパク質又は、宿主細胞の栄養要求性欠陥を補完するタンパク質をコードする。選択スキームの一例では、抗生物質等の薬剤を利用して宿主細胞の増殖を妨げる。選択マーカーを含む発現コンストラクトを含有するそれらの細胞は、薬物耐性を与えるタンパク質を産生し、選択レジメン後も残存する。選択マーカーの選択に概ね用いられる抗生物質のいくつかの例（及び、抗生物質耐性表現型を提供する遺伝子表示略語）としては、アンピシリン（ＡｍｐＲ）、クロラムフェニコール（ＣｍｌＲ又はＣｍＲ）、カナマイシン（ＫａｎＲ）、スペクチノマイシン（ＳｐｃＲ）、ストレプトマイシン（ＳｔｒＲ）及びテトラサイクリン（ＴｅｔＲ）が挙げられる。表２の代表的プラスミドの多くは、ｐＢＲ３２２（ＡｍｐＲ、ＴｅｔＲ）、ｐＭＯＢ４５（ＣｍＲ、ＴｅｔＲ）、ｐＡＣＹＣ１７７（ＡｍｐＲ、ＫａｎＲ）及びｐＧＢＭ１（ＳｐｃＲ、ＳｔｒＲ）等の選択マーカーを含む。選択遺伝子の天然プロモーター領域は通常、その遺伝子産物のコード配列とともに、発現コンストラクトの選択マーカー部分の一部として含まれる。あるいは、選択遺伝子のコード配列は、構成的プロモーターから発現させることができる。
誘導性プロモーター 本明細書に記載される通り、本発明の誘導性共発現系の一部として発現コンストラクトに含めることができるいくつかの異なる誘導性プロモーターがある。好ましい誘導性プロモーターは、表１に記載する通り、大腸菌Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５ゲノム配列を参照して、プロモーターポリヌクレオチド配列の少なくとも３０（より好ましくは少なくとも４０及び最も好ましくは少なくとも５０）の連続する塩基に対して少なくとも８０％ポリヌクレオチド配列同一性（より好ましくは少なくとも９０％同一性及び最も好ましくは少なくとも９５％同一性）を共有し、ポリヌクレオチド配列同一性のパーセントは実施例１３の方法を用いて測定する。「標準的」誘導条件（実施例５参照）の下では、好ましい誘導性プロモーターは、Ｄｅ Ｍｅｙらの定量ＰＣＲ法（実施例８）を用いて測定して、大腸菌Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５の対応する「野生型」誘導性プロモーターの強度の少なくとも７５％（より好ましくは少なくとも１００％及び最も好ましくは少なくとも１１０％）を有する。発現コンストラクト内で誘導性プロモーターは、誘導発現される遺伝子産物のコード配列の５’（即ち、「上流」）に配置され、誘導性プロモーターの存在は、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドのコード鎖に対して、遺伝子産物コード配列の転写を５’から３’の方向へ向かわせる。
リボソーム結合部位 ポリペプチド遺伝子産物については、誘導発現されるべき遺伝子産物のコード配列の転写開始点と開始コドンとの間の領域のヌクレオチド配列は、ポリペプチド遺伝子産物のｍＲＮＡの５’非翻訳領域（「ＵＴＲ」）に相当する。好ましくは、発現コンストラクトで５’ＵＴＲに相当する領域は、宿主細胞の種にあるコンセンサスリボソーム結合部位（ＲＢＳ、シャイン・ダルガノ配列とも称する）に類似のポリヌクレオチド配列を含む。原核生物（古細菌及び細菌）においてはＲＢＳコンセンサス配列はＧＧＡＧＧ又はＧＧＡＧＧＵであり、大腸菌等の細菌においてはＲＢＳコンセンサス配列はＡＧＧＡＧＧ又はＡＧＧＡＧＧＵである。ＲＢＳは典型的に、５〜１０の介在ヌクレオチドによって開始コドンから隔てられる。発現コンストラクトにおいて、ＲＢＳ配列は、ＡＧＧＡＧＧＵコンセンサス配列に対して好ましくは少なくとも５５％同一、より好ましくは少なくとも７０％同一、最も好ましくは少なくとも８５％同一であり、５〜１０介在ヌクレオチドによって、より好ましくは６〜９介在ヌクレオチドによって、最も好ましくは６又は７介在ヌクレオチドによって開始コドンから分けられる。所与のＲＢＳが望ましい翻訳開始速度を生じさせることのできる能力は、ウェブサイトのｓａｌｉｓ．ｐｓｕ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＲＢＳＬｉｂｒａｒｙＣａｌｃｕｌａｔｏｒＳｅａｒｃｈＭｏｄｅで、ＲＢＳＣａｌｃｕｌａｔｏｒを用いて計算することができ、同じツールを用いて、１００，０００倍以上の範囲の翻訳速度で合成ＲＢＳを最適化することができる（Salis, "The ribosome binding site calculator", Methods Enzymol 2011; 498: 19-42）。
マルチクローニングサイト マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）は、ポリリンカーとも称され、お互いに隣接するか又はオーバーラップする多数の制限酵素認識部位を含有するポリヌクレオチドである。ＭＣＳにおける制限酵素認識部位は典型的に、ＭＣＳ配列内で一度生じ、好ましくはプラスミドの残りの内で又は他のポリヌクレオチドコンストラクト内では生じず、制限酵素がＭＣＳ内でのみプラスミド又は他のポリヌクレオチドコンストラクトを切断することを可能とする。ＭＣＳ配列の例としては、ｐＢＡＤシリーズの発現ベクターにあるもので、ｐＢＡＤ１８、ｐＢＡＤ１８−Ｃｍ、ｐＢＡＤ１８−Ｋａｎ、ｐＢＡＤ２４、ｐＢＡＤ２８、ｐＢＡＤ３０及びｐＢＡＤ３３等（Guzman et al., "Tight regulation, modulation, and high-levelexpression by vectorscontaining the arabinose PBADpromoter", J Bacteriol 1995 Jul; 177(14): 4121-4130); or those in the pPRO series of expression vectors derived from the pBAD vectors, such as pPRO18, pPRO18-Cm, pPRO18-Kan, pPRO24, pPRO30, and pPRO33 (US Patent No. 8178338 B2; May 15 2012; Keasling, Jay）が挙げられる。マルチクローニングサイトは発現コンストラクトの作成において用いることができ、即ち、プロモーター配列の３’（即ち、下流）にマルチクローニングサイトを配置することにより、遺伝子産物のコード配列の転写が生じるようにプロモーターとの関連において適切な位置でＭＣＳを用いてコード配列を挿入し、その遺伝子産物をコンストラクト中に共発現させることができる。ＭＣＳ内でどの制限酵素を用いて切断を行うかにより、コード配列又は他のポリヌクレオチド配列が発現コンストラクト中に挿入された後、ＭＣＳ配列の一部が発現コンストラクト内に残る可能性がある。残るＭＣＳ配列があれば、挿入する配列の上流、又は下流、又は両方にあり得る。リボソーム結合部位は、ＭＣＳの上流、好ましくはＭＣＳに直接隣接するか、又はＭＣＳからヌクレオチド数個だけ離れて配置されていてもよく、この場合にＲＢＳはＭＣＳに挿入される何らのコード配列の上流にあることになる。別の代替方法は、リボソーム結合部位をＭＣＳ内に含むことで、この場合には、ＭＣＳ内で切断を行うために用いる制限酵素の選択は、ＲＢＳが保持されるかどうか、挿入される配列にどのように関係するかを決定する。さらなる代替方法は、発現コンストラクトの中にＭＣＳにおいて挿入するべきポリヌクレオチド配列内にＲＢＳを含むことで、好ましくは、転写されるメッセンジャーＲＮＡから翻訳の開始を刺激するように、任意のコード配列に適切な関係で、含むことである。
構成的プロモーターからの発現 本発明の発現コンストラクトはまた、構成的プロモーターから発現されるコード配列を含んでもよい。誘導性プロモーターとは異なり、構成的プロモーターは大抵の増殖条件下で連続的遺伝子産物産生を開始する。構成的プロモーターの一例としては、Ｔｎ３ｂｌａ遺伝子の例が挙げられ、これはβラクタマーゼをコードし、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３１３４４）、ｐＡＣＹＣ１７７（ＡＴＣＣ３７０３１）及びｐＢＡＤ２４（ＡＴＣＣ８７３９９）を含む多くのプラスミドが宿主細胞に与えるアンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）表現型の原因である。発現コンストラクトに用いることができる別の構成的プロモーターとしては、大腸菌ｌｉｐｏタンパク質遺伝子、ｌｐｐ、のプロモーターが挙げられ、これは大腸菌Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５において位置１７５５７３１〜１７５５４０６（正鎖）に位置する（Inouye and Inouye, "Up-promoter mutations in the lpp gene of Escherichia coli", Nucleic Acids Res 1985 May 10; 13(9): 3101-3110）。大腸菌における異種遺伝子発現に用いた構成的プロモーターのさらなる例としてはｔｒｐＬＥＤＣＢＡプロモーターが挙げられ、これは大腸菌Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５において位置１３２１１６９〜１３２１１３３（負鎖）に位置する（Windass et al., "The construction of a synthetic Escherichia coli trp promoter and its use in the expression of a synthetic interferon gene", Nucleic Acids Res 1982 Nov 11; 10(21): 6639-6657）。本明細書に記載される通り、構成的プロモーターは、選択マーカーの発現のため、また、所望の産物の共発現に有用な他の遺伝子産物の構成的発現のために、発現コンストラクトにおいて用いることができる。例えば、ＡｒａＣ、ＰｒｐＲ、ＲｈａＲ及びＸｙｌＲ等の誘導性プロモーターの転写制御因子は、双方向誘導性プロモーターから発現しなければ、代わりに構成的プロモーターから、それが調節する誘導性プロモーターと同じ発現コンストラクト又は異なる発現コンストラクト上で、発現することができる。同様に、ＰｒｐＥＣ、ＡｒａＥ若しくはＲｈａ等の誘導物質の産生若しくは輸送に有用な遺伝子産物、又は細胞の還元酸化環境を改変するタンパク質を数例として、発現コンストラクト内で構成的プロモーターから発現することができる。共発現される遺伝子産物の産生に有用な遺伝子産物及び得られる所望の産物としてはまた、シャペロンタンパク質、補助因子トランスポーター等が挙げられる。
シグナルペプチド 本発明の方法によって共発現するポリペプチド遺伝子産物は、そのような遺伝子産物が宿主細胞の細胞質から周辺質に運び出されるのが望ましいのか、細胞質に保持されるのが望ましいのか、それぞれに従ってシグナルペプチドを含んでいても欠いていてもよい。シグナルペプチド（シグナル配列、リーダー配列又はリーダーペプチドとも称す）は、単一αヘリックスを形成する傾向を有する一続きの疎水性アミノ酸で、アミノ酸が約５〜２０個の長さであり、しばしばアミノ酸が約１０〜１５個の長さであることを構造的な特徴とする。この疎水性の一続きはしばしばその直前が、正電荷をもつアミノ酸（特にリジン）中に濃縮されるさらに短い一続きである。成熟ポリペプチドから切断されるシグナルペプチドは典型的に、シグナルペプチダーゼによって認識され切断される一続きのアミノ酸となって終わる。シグナルペプチドは、原核生物の原形質膜（又は大腸菌のようなグラム陰性菌の内膜）を通してか又は真核生物細胞の小胞体の中へか、共翻訳的又は翻訳後にポリペプチドの輸送を方向づける能力を機能的な特徴とし得る。シグナルペプチドが大腸菌のような宿主細胞の細胞膜周辺腔中へ輸送されるのを可能とできる程度は、例えば、実施例１２に記載するような方法を用いて、周辺質タンパク質を細胞質に保持されるタンパク質から分離することによって測定することができる。
宿主細胞 本発明の誘導性共発現系は複数遺伝子産物を発現するように設計し、本発明の所定の実施形態では、遺伝子産物は宿主細胞において共発現される。多量体産物の構成要素の効率的で費用効果的な誘導性共発現を可能とする宿主細胞の例を提供する。宿主細胞としては、培養中単離した細胞に加えて、多細胞生物の一部である細胞又は、異なる生物内若しくは生物系内で増殖する細胞が挙げられる。加えて、本発明の誘導性共発現系の発現コンストラクトは、コムギ胚芽抽出物又は細菌細胞抽出物に基づく系、大腸菌抽出物及びＲＴＳ ＰｒｏｔｅｏＭａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ；Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）等のインキュベーション装置を用いた連続交換無細胞（ＣＥＣＦ）タンパク質合成系等、無細胞系において用いることができる（Jun et al., "Continuous-exchange cell-free protein synthesis using PCR-generated DNA and an RNase E-deficient extract", Biotechniques 2008 Mar; 44(3): 387-391）。
原核生物宿主細胞 本発明のいくつかの実施形態では、遺伝子産物の共発現のために設計する発現コンストラクトは、宿主細胞、好ましくは原核生物宿主細胞において提供する。原核生物宿主細胞としては、古細菌（ハロフェラックス・ボルカニ、スルホロブス・ソルファタリカス等）、グラム陽性菌（枯草菌、リケニホルミス菌、ブレビバチルス・チョウシネンシス、ラクトバチルス・ブレビス、ブーフナー菌、ラクトコッカス・ラクティス及びストレプトマイセス・リビダンス等）、又はグラム陰性菌、例えばアルファプロテオバクテリア（アグロバクテリウム・ツメファシエンス、カウロバクター・クレセンタス、ロドバクター・スフェロイデス及びシノリゾビウム・メリロティ）、ベータプロテオバクテリア（アルカリゲネス・ユートロフス）及びガンマプロテオバクテリア（アシネトバクター・カルコアセティカス、アゾトバクター・ビネランジー、大腸菌、緑膿菌及びプチダ菌）、が挙げられる。好ましい宿主細胞としては、エンテロバクター、エルウィニア、大腸菌（大腸菌を含む）、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ（ネズミチフス菌を含む）、セラチア菌（霊菌を含む）及び赤痢菌等のファミリー腸内細菌科のガンマプロテオバクテリアが挙げられる。
真核生物宿主細胞 酵母菌（カンジダ・シェハタエ、クルイベロミセス・ラクチス、クリベロマイセス・フラジリス、他のクリベロマイセス種、ピキア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・パストリアヌス別名ビール酵母、分裂酵母、デッケラ／ブレタノマイセス種、及びヤロウイア・リポリティカ）；他の真菌（アスペルギルス・ニズランス、アスペルギルス・ニガー、ニューロスポラ・クラッサ、アオカビ類、トリポクラディウム、トリコデルマ・リーシア）；昆虫セルライン（キイロショウジョウバエ・シュナイダー２細胞及びヨトウガＳｆ９細胞）；不死化セルラインを含む哺乳動物セルライン（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ、２９３、又はＨＥＫ−２９３）細胞、及びヒト肝細胞がん細胞（ＨｅｐＧ２））等、真核生物細胞を含むさらに多くのタイプの宿主細胞を本発明の誘導性共発現系に用いることができる。上記宿主細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。
宿主細胞遺伝子機能への変異 誘導物質によって宿主細胞集団の効率的で均質的な誘導を促進するよう、誘導性発現コンストラクトを含む宿主細胞の遺伝子機能に所定の変異を行ってもよい。好ましくは、発現コンストラクト、宿主細胞遺伝子型及び誘導条件の組み合わせによっては、誘導された各プロモーターから遺伝子産物を発現する培養において、実施例８に記載のＫｈｌｅｂｎｉｋｏｖらの方法によって測定して少なくとも７５％（より好ましくは少なくとも８５％及び最も好ましくは少なくとも９５％）の細胞を生じることになる。大腸菌以外の宿主細胞については、これらの変異は、大腸菌遺伝子に構造的に似た遺伝子、又は、宿主細胞内で大腸菌遺伝子に似た機能を果たす遺伝子の、機能の関与を必要とする。宿主細胞遺伝子機能への変異としては、遺伝子タンパク質コード配列を全て欠失させることによって遺伝子機能を削除又は低減すること、又は、遺伝子の十分大きな部分を欠失させること、あるいはそれ以外では、減少させたレベルの機能遺伝子産物が遺伝子から作られるようにその遺伝子の配列を変異させること、が挙げられる。宿主細胞遺伝子機能への変異としてはまた、遺伝子のより高レベルの転写を指示するさらに強いプロモーターを作成するように天然プロモーターを変異させること等によって遺伝子機能を増加させること、又は、より活性の高い遺伝子産物を生じるタンパク質コード配列にミスセンス突然変異を導入すること、が挙げられる。宿主細胞遺伝子機能への変異としては、遺伝子機能のどのような変異の仕方も挙げられ、例えば、構成的に活性化したプロモーターを作成するように天然誘導性プロモーターを変異させることも挙げられる。誘導性プロモーターに関連して本明細書に記載される、誘導物質の輸送及び代謝のための遺伝子機能の変異、及び、シャペロンタンパク質の発現の変異に加えて、宿主細胞の炭素異化代謝産物抑制（ＣＣＲ）制御系及び／又は還元酸化環境を変異させることも可能である。
炭素異化代謝産物抑制（ＣＣＲ） 宿主内における活発なＣＣＲ制御系の存在は、誘導物質が誘導性プロモーターから転写を活性化できる能力に影響を与える可能性がある。例えば、大腸菌等の宿主細胞がグルコースを含有する培地で増殖される場合、アラビノース誘導物質又はプロピオネート誘導物質も増殖培地に存在していたとして、他の炭素源の利用に必要なａｒａＢＡＤオペロン及びｐｒｐＢＣＤＥオペロン等の遺伝子は仮に発現されるとしても低レベルで発現される。グルコース以外の炭素源の利用順位もあり、例えば、ａｒａ及びｐｒｐ誘導性プロモーター系の場合、アラビノースの存在が、ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターから発現を誘導するプロピオネートの能力を低減する（Park et al., "The mechanism of sugar-mediated catabolite repression of the propionate catabolic genes in Escherichia coli", Gene 2012 Aug 1; 504(1): 116-121; Epub 2012 May 3）。したがって、細胞のＣＣＲメカニズムにより、誘導性共発現系において２つ以上の炭素源誘導物質を用いることがより困難となり、これは、好適な炭素源である誘導物質の存在がそれほど好適でない炭素源による誘導を阻害するからである。Ｐａｒｋらの著者は、ｃＡＭＰからは独立して機能することが可能な変異ｃＡＭＰ受容体タンパク質を産生する突然変異体ｃｒｐ遺伝子か又は、ＣＣＲの調節に関与するＰＴＳ（ホスホトランスフェラーゼ系）遺伝子の欠失か、いずれかを用い、アラビノースによるｐｒｐプロモーターの抑制を軽減しようと試みたが、どちらの方法もほとんど不成功であった。しかしながら、Ｐａｒｋらの著者が用いたＰＴＳノックアウトは菌株ＴＰ２８１１に基づき、これは、大腸菌ｐｔｓＨＩ−ｃｒｒオペロンの欠失したものである（Hernandez-Montalvo et al., "Character-ization of sugar mixtures utilization by an Escherichia coli mutant devoid of the phosphotransferase system", Appl Microbiol Biotechnol 2001 Oct; 57(1-2): 186-191）。ｐｔｓＨＩ−ｃｒｒオペロン全体の欠失は、ｃｒｒ遺伝子だけの欠失よりも、ｃＡＭＰ合成総体に大きく影響を及ぼすことがわかっている（Levy et al., "Cyclic AMP synthesis in Escherichia coli strains bearing known deletions in the pts phosphotransferase operon", Gene 1990 Jan 31; 86(1): 27-33）。異なった方法では、宿主細胞におけるｐｔｓＧ遺伝子の機能を削除又は低減し、この遺伝子は、大腸菌におけるＣＣＲの重要要素であるグルコース特異的ＥＩＩ Ａ（ＥＩＩ Ａｇｌｃ）をコードするものである（Kim et al., "Simultaneous consumption of pentose and hexose sugars: an optimal microbial phenotype for efficient fermentation of lignocellulosic biomass", Appl Microbiol Biotechnol 2010 Nov; 88(5): 1077-1085, Epub 2010 Sep 14）。大腸菌等の宿主細胞のゲノムにおける別の変異で、ｐｒｐプロモーターの転写を増加させることになる変異は、ＡｓｃＧをコードするａｓｃＧ遺伝子の遺伝子機能を削除又は低減することである。ＡｓｃＧは通常の増殖条件下でβ−Ｄ−グルコシド−利用オペロンａｓｃＦＢの抑制因子であり、また、ｐｒｐプロモーターの転写を抑制し、ＡｓｃＧコード配列の分裂はｐｒｐプロモーターからの転写を増加させることが示されている（Ishida et al., "Participation of regulator AscG of the beta-glucoside utilization operon in regulation of the propionate catabolism operon", J Bacteriol 2009 Oct; 191(19): 6136-6144; Epub 2009 Jul 24）。さらなる代替方法は、それほど好適ではない炭素源誘導物質によって誘導性であるプロモーターの転写制御因子の発現を、それを強い構成的プロモーターの制御下か、より好適な炭素源誘導物質の制御下か、どちらかに置くことによって増加させることである。例えば、より好適であるアラビノースの存在下でそれほど好適でない炭素源キシロースの利用に必要な遺伝子の誘導を増加させるためには、ＸｙｌＲのコード配列を大腸菌ａｒａＢＡＤオペロンの中へ入れる（Groff et al., "Supplementation of intracellular XylR leads to coutilization of hemicellulose sugars", Appl Environ Microbiol 2012 Apr; 78(7): 2221-2229, Epub 2012 Jan 27）。したがって、誘導性共発現コンストラクトを含む宿主細胞は、好ましくは、それほど好適でない炭素源誘導物質（複数を含む）によって誘導性であるプロモーターの転写制御因子の遺伝子機能レベルが高められていること、及び、ＣＣＲ系中で関与するｃｒｒ及び／又はｐｔｓＧ及び／又はａｓｃＧ等の遺伝子の遺伝子機能が削除又は低減されていること、を内包する。
ヘム及び他の補助因子の細胞性輸送 本発明の誘導性共発現系を用いて、機能のための補助因子を必要とする酵素を産生するとき、利用可能な前駆体から補助因子を合成することができるか又は、環境からそれを取り出すことができる宿主細胞を用いることが役立つ。一般的な補助因子としては、ＡＴＰ、コエンザイムＡ、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ及びヘムが挙げられる。ヘム基は、ポルフィリンと呼ばれる大きな複素環式有機化合物の中心に鉄イオンを含む。最も一般的なタイプのヘム基はヘムＢであり、他の主要なタイプはヘムＡ、ヘムＣ及びヘムＯで、これらはポルフィリンの側鎖が異なる。ヘミンはヘムＢの塩化物塩であり、ヘムの源として細菌増殖培地に加えることができる。他に可能性のあるヘムの源としては、チトクロム、ヘモグロビン及び、血等のヘモグロビン含有物質が挙げられる。大腸菌Ｋ１２から誘導される大腸菌の実験室株は典型的に外膜ヘム受容体を欠き、したがってヘムを細胞中へ輸送せず、ヘムが唯一の鉄源である培地中で増殖できない。Ｏ１５７：Ｈ７及びＣＦＴ０７３等、大腸菌の病原性菌株は、大腸菌Ｋ１２には存在しないゲノム分節を約９−ｋｂ含有し、これは、ヘム取り込み及び利用に係わるタンパク質をコードする２つの多岐に転写されるオペロン、即ちｃｈｕＡＳオペロン、及びｔｈｅｃｈｕＴＷＸＹＵｈｍｕＶオペロンを含有する。このゲノム分節は、大腸菌ＣＦＴ０７３の中に見られ、ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００４４３１．１（２０−ＪＡＮ−２０１２）の位置４，０８４，９７４〜４，０９３，９７５を含む。外膜ヘミン特異的受容体をコードするｃｈｕＡ遺伝子（実施例用、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ Ｎｏ．１０３７１９６）を使った形質転換が、鉄源としてのヘミン上で増殖する能力をＫ１２由来大腸菌株に与えるのに十分である（Torres and Payne, "Haem iron-transport system in entero-haemorrhagic Escherichia coli O157:H7", Mol Microbiol 1997 Feb; 23(4): 825-833）。ＣｈｕＡに加えて、いくつかの他の異種ヘム受容体は、大腸菌Ｋ１２−由来菌株が以下のヘムを取り込むことを可能とする：エンテロコリチカ菌ＨｅｍＲ、霊菌ＨａｓＲ、及び志賀赤痢菌ＳｈｕＡ、並びにグラム陰性菌由来のものとして百日咳菌及びＢ．ブロンキセプチカＢｈｕＲ、緑膿菌ＰｈｕＲ、及びＰ．フロレッセンスＰｆｈＲ。ＣｈｕＳタンパク質はまたヘムの利用に関与し、それはヘム分解オキシゲナーゼである。大腸菌ａｒｏＢ菌株は、鉄キレート分子エンテロバクチンの合成においては不十分であるが、その菌株において、ｃｈｕＳを使った形質転換は、エンテロバクチンの不存在下ヘミン上での増殖が引き起こす細胞毒性を低減するのに有用であった。ｃｈｕＡＳ及びｃｈｕＴＷＸＹＵｈｍｕＶオペロン、並びに鉄代謝に関与し大腸菌Ｋ１２菌株に存在するいつくかの他のオペロンの転写は、大腸菌Ｆｕｒ転写制御因子により、ＦｕｒがＦｅ２＋と会合するときに抑制され、従ってこれらの遺伝子の転写は、鉄イオンの細胞内濃度に低下があると活性化される。
大腸菌Ｋ１２由来菌株等の宿主細胞は、それらの形質転換を、少なくともｃｈｕＡを含有するｃｈｕＡＳ−ｃｈｕＴＷＸＹＵｈｍｕＶ領域の全て又は一部で行うか、又は、ｃｈｕＴＷＸＹＵｈｍｕＶオペロンからの追加の遺伝子を含んでいてもよいｃｈｕＡＳオペロンで行って、それらがヘムを取り込むことを可能にするように変異させることができる。ｃｈｕＡ転写を指示するプロモーターがＦｕｒによって抑制可能である実施形態においては、Ｆｕｒ抑制イオンの削除又は低減を、Ｆｕｒをコードする宿主細胞遺伝子を欠失させることによるか、遊離鉄の不存在下で宿主細胞を増殖させることによるか、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等の遊離鉄イオンのキレート剤の存在下で宿主細胞を増殖させることによるか、又は、Ｆｕｒ結合部位の複数複製を含むポリヌクレオチドコンストラクト（高い複製数で維持されるプラスミド等）で細胞を形質転換させることによるかして行い、鉄代謝オペロンの抑制のために得られるＦｕｒ−Ｆｅ２＋複合体の量を低減することができる。好適な実施形態では、発現コンストラクトを宿主細胞に導入し、発現コンストラクトは、構成的プロモーターの転写制御下、ＣｈｕＡをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドはＣｈｕＳをもコードしてよい。
宿主細胞還元酸化環境 抗体等の多くの多量体遺伝子産物はジスルフィド結合を含有する。大腸菌の細胞質及び他の多くの細胞は通常、チオレドキシン及びグルタレドキシン／グルタチオン酵素系により、還元状態で維持される。これは、細胞質においてジスルフィド結合の形成を妨げ、ジスルフィド結合を必要とするタンパク質は周辺質へ運び出されて、周辺質でジスルフィド結合の形成と異性化が、ＤｓｂＡＢＣＤ及びＤｓｂＧを含むＤｓｂ系によって触媒される。システインオキシダーゼＤｓｂＡ、ジスルフィドイソメラーゼＤｓｂＣ又は、Ｄｓｂタンパク質の組み合わせは、通常全て周辺質へ輸送され、それらの発現の増加は、ジスルフィド結合を必要とする異種タンパク質の発現において利用されている（Makino et al., "Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria", Microb Cell Fact 2011 May 14; 10: 32）。これらのＤｓｂタンパク質の細胞質型、例えばＤｓｂＣ（「ｃＤｓｂＣ」）の細胞質版を発現することも可能で、これはシグナルペプチドを欠き、したがって周辺質へ輸送されない。ｃＤｓｂＣ等の細胞質Ｄｓｂタンパク質は、宿主細胞の細胞質をより酸化性にし、従って、細胞質に産生される異種タンパク質におけるジスルフィド結合の形成をより促すものとするために有益である。宿主細胞の細胞質はまた、チオレドキシン及びグルタレドキシン／グルタチオン酵素系を直接変異させることによってさらに酸化性にすることができ、グルタチオン還元酵素（ｇｏｒ）又はグルタチオンシンテターゼ（ｇｓｈＢ）に欠ける突然変異体菌株は、チオレドキシン還元酵素（ｔｒｘＢ）とともに、細胞質を酸化性にする。これらの菌株は、リボヌクレオチドを還元することはできず、したがってジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の外因的還元体の不存在下において増殖することができない。ペルオキシレドキシンＡｈｐＣをコードする遺伝子ａｈｐＣにおける抑制因子突然変異体（ａｈｐＣ＊）はそれを、還元されたグルタチオンを生成するジスルフィド還元酵素に変換し、電子が酵素リボヌクレオチド還元酵素上に運ばれるようにし、ｇｏｒ及びｔｒｘＢに欠けるか又はｇｓｈＢ及びｔｒｘＢに欠ける細胞質がＤＴＴの不存在下で増殖することを可能とする。別の分類の突然変異型のＡｈｐＣは、γグルタミルシステインシンテターゼ（ｇｓｈＡ）の活性とｔｒｘＢとに欠ける菌株がＤＴＴの不存在下で増殖することを可能にでき、これらとしては、ＡｈｐＣ Ｖ１６４Ｇ、ＡｈｐＣ Ｓ７１Ｆ、ＡｈｐＣ Ｅ１７３／Ｓ７１Ｆ、ＡｈｐＣ Ｅ１７１Ｔｅｒ、及びＡｈｐＣ ｄｕｐ１６２〜１６９が挙げられる（Faulkner et al., "Functional plasticity of a peroxidase allows evolution of diverse disulfide-reducing pathways", Proc Natl Acad Sci U S A 2008 May 6; 105(18): 6735-6740, Epub 2008 May 2）。酸化性の細胞質をもったかかる菌株において、露出したタンパク質システインは、それらの生理的機能の逆行という形で、チオレドキシンによって触媒されるプロセスで容易に酸化され、ジスルフィド結合の形成を生じる。
宿主細胞に行うことのできる別の変異は、宿主細胞の細胞質において酵母ミトコンドリアの内膜腔（ｉｎｎｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｐａｃｅ）からスルフヒドリルオキシダーゼＥｒｖ１ｐを発現することで、これは、ｇｏｒ又はｔｒｘＢに突然変異体が不存在でも、大腸菌の細胞質で種々の真核生物起源の複合体・ジスルフィド結合タンパク質の産生を増加させることが示されている（Nguyen et al., "Pre-expression of a sulfhydryl oxidase significantly increases the yields of eukaryotic disulfide bond containing proteins expressed in the cytoplasm of E. coli" Microb Cell Fact 2011 Jan 7; 10: 1）。誘導性共発現コンストラクトを含む宿主細胞は、好ましくはまた、ｃＤｓｂＣ及び／又はＥｒｖ１ｐを発現し、ｔｒｘＢ遺伝子機能に欠け、ｇｏｒ、ｇｓｈＢ又はｇｓｈＡのいずれかの遺伝子機能に欠け、並びに、宿主細胞がＤＴＴの不存在下で増殖できるようにＡｈｐＣの適切な突然変異型を発現する。
ポリペプチド遺伝子産物のグリコシル化 宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化するその能力を変異させてもよい。例えば、真核生物宿主細胞では、グリコシルトランスフェラーゼ及び／又はオリゴサッカリルトランスフェラーゼ遺伝子の遺伝子機能を削除又は低減し、ポリペプチドの通常の真核生物グリコシル化が糖タンパク質を形成するのを低減することが可能である。大腸菌等の原核生物宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化するのが通常とは限らず、グリコシル化機能を提供する一連の真核生物遺伝子及び原核生物遺伝子を発現するよう変異させることもあり得る（DeLisa et al., "Glycosylated protein expression in prokaryotes", WO2009089154A2, 2009 Jul 16）。
遺伝子機能を変異させた利用可能な宿主細胞菌株 本発明の誘導性共発現系及び方法において用いる宿主細胞の好適菌株を作成するために、所望の遺伝子変異を既に含む菌株から始めることは有益である（表３）。
宿主細胞遺伝子機能を変異させる方法 当技術分野には遺伝子機能を削除、低減又は変更するために宿主細胞遺伝子を変異させる多くの方法がある。大腸菌及び他の原核生物等の宿主細胞の遺伝子を標的破壊する方法については記載がなされており（Muyrers et al., "Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination", Nucleic Acids Res 1999 Mar 15; 27(6): 1555-1557; Datsenko and Wanner, "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products", Proc Natl Acad Sci U S A 2000 Jun 6; 97(12): 6640-6645）、類似のＲｅｄ／ＥＴ組換え方法を使うためのキットが市販されている（例えば、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙから市販されるｔｈｅ Ｑｕｉｃｋ ＆ Ｅａｓｙ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ）。本発明の一実施形態では、宿主細胞の１つ又は複数の遺伝子の機能の削除又は低減は、配列の遺伝子位置への参照によって本明細書に援用される大腸菌Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５コード配列の１つ等、分解する遺伝子のコード配列内にヌクレオチド配列を特定すること、より具体的にはそのコード配列内にそれぞれ５０個のヌクレオチドをもつ２つの隣接する続きを選択することによって、行なう。次いで、Ｔｈｅ Ｑｕｉｃｋ＆Ｅａｓｙ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔを製造者の指示に従って用い、選択マーカーを含有するポリヌクレオチドコンストラクトを、選択した隣接するコード配列の続きの間に挿入し、遺伝子の通常の機能を削除又は低減する。また、Ｒｅｄ／ＥＴ組換え方法を用いて、プロモーターの配列を異なるプロモーター、例えば、所定の転写レベルを促進すると予想される構成的プロモーター又は人工的プロモーターのそれに置き換えることもできる（De Mey et al., "Promoter knock-in: a novel rational method for the fine tuning of genes", BMC Biotechnol 2010 Mar 24; 10: 26）。また、宿主細胞遺伝子の機能は、ＲＮＡサイレンシング方法によって削除又は低減することができる（Man et al., "Artificial trans-encoded small non-coding RNAs specifically silence the selected gene expression in bacteria", Nucleic Acids Res 2011 Apr; 39(8): e50, Epub 2011 Feb 3）。さらに、宿主細胞遺伝子機能を変異させる既知の突然変異を、伝統的な遺伝学的手法によって宿主細胞に導入することもできる。
本発明の誘導性共発現系 本発明の誘導性共発現系は、２つ以上の発現コンストラクトを含む宿主細胞が関与し、発現コンストラクトは遺伝子産物の発現を指示する誘導性プロモーターを含み、宿主細胞は、遺伝子産物の均質的誘導性発現を可能とする変異した遺伝子機能を有する。図１は、本発明の誘導性共発現系の略図を示し、次の構成要素をもつ：（１）宿主細胞、（２）宿主ゲノム（遺伝子変異を含む）、（３）遺伝子産物の発現を指示する誘導性プロモーターを含む発現ベクター「Ｘ」、（４）別の遺伝子産物の発現を指示する誘導性プロモーターを含む異なる発現ベクター「Ｙ」、（５）発現の化学的誘導物質、及び（６）多量体共発現産物。
図２は、均質的誘導性発現を可能とする適切なゲノム変異の入った大腸菌宿主細胞において、ｐＰＲＯ３３発現ベクター上プロピオネート誘導性プロモーター（ｐｒｐＢＣＤＥプロモーター）と組み合わせてｐＢＡＤ２４発現ベクター上ａｒａＢＡＤプロモーターを利用する（米国特許第８１７８３３８Ｂ２号；May 15 2012; Keasling, Jay）、本発明の誘導性共発現系の一特定例の略図を示す。この方法では、多量体産物の各構成要素の発現を厳密に制御し最適化することを、いくつかの共発現用途で用いて達成することができる。この実施形態では、宿主細胞（１）は、タンパク質発現用に当技術分野で一般的に用いられるグラム陰性菌大腸菌である。宿主ゲノム（２）は、シグナルペプチドを欠くジスルフィドイソメラーゼＤｓｂＣの細胞質型の発現等、均質的誘導性タンパク質共発現を容易にする突然変異又は他の変異をもった、宿主細胞生物のゲノムである。一実施形態では、ゲノム変異は、ａｒａＢＡＤオペロンノックアウト突然変異と、構成的プロモーターからのａｒａＥ及びａｒａＦＧＨの発現か又はａｒａＥＦＧＨ−欠損バックグラウンドにおけるｌａｃＹ遺伝子（Ａ１１７Ｃ）中の点突然変異かいずれかとの両方を含んで、外因的適用のＬ−アラビノースでプラスミド系ａｒａプロモーターの均質的誘導を容易にし、また、不活性化プロピオネート代謝遺伝子、ｐｒｐＤを含んで、外因的適用のプロピオネートでプラスミド系プロピオネートプロモーターの均質的誘導を容易にし、プロピオネートは生体内で２−メチルシトレートに変換される。誘導性共発現系に有用で宿主細胞に導入できる他のゲノム変異としては以下が挙げられ、但しこれらに制限されるものではない：
ｓｃｐＡ−ａｒｇＫ−ｓｃｐＢＣオペロンの標的不活性化で、これはｐｒｐＢＣＤＥプロモーターからバックグラウンド発現を低減する；
ａｒａＢＡＤプロモーター等のＬ−アラビノース誘導性プロモーターからそれほど好適でない炭素源（プロピオネート）の転写制御因子（ｐｒｐＲ）を発現すること、及び／又は、ｃｒｒ及び／又はｐｔｓＧ等、ＣＣＲ系に関与する遺伝子の遺伝子機能を削除又は低減することで、これはＬ−アラビノースの存在下プロピオネートによる誘導をＣＣＲ系が抑制することを避ける；
チオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）とともにグルタチオンレダクターゼ（ｇｏｒ）又はグルタチオンシンテターゼ（ｇｓｈＢ）の遺伝子機能のレベルを低減すること、及び／又は、宿主細胞細胞質において酵母菌ミトコンドリアスルフヒドリルオキシダーゼＥｒｖ１ｐを発現することで、これは比較的強くない還元環境を宿主細胞細胞質に提供し、ジスルフィド結合形成を促進する；
例えば、強い構成的プロモーターからの、シャペロンタンパク質、例えば、ＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ、ＤｓｂＣ／ＤｓｂＧ、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ、ＩｂｐＡ／ＩｂｐＢ、Ｓｋｐ、Ｔｉｇ（トリガー因子）、及び／又はＦｋｐＡの発現のレベルを増強すること；及び、
内在性プロテアーゼ活性（Ｌｏｎ及びＯｍｐＴプロテアーゼ等の活性）及びリコンビナーゼ活性を低減する他の突然変異。
図２に示す通り、２つの相互に適合する発現ベクター（３、４）は、宿主細胞中に維持し、２つの異なる遺伝子産物の同時発現（共発現）を可能とする。この実施形態では、１つの発現ベクター（「Ｌ−アラビノース誘導された発現ベクター」）は、Ｌ−アラビノース誘導されたプロモーターを含有し、ｐＢＡＤ又は関連プラスミドと類似又は同等で、これにおいて、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）にクローン化される挿入発現配列の発現をａｒａＢＡＤプロモーターが推し進める。Ｌ−アラビノース誘導発現ベクターはまた、抗生物質耐性遺伝子（例えば、βラクタマーゼをコードし、アンピシリンに耐性を与えるＴｎ３ｂｌａ遺伝子）のコード配列を含有し、インタクトな発現ベクターを含有する宿主細胞（細菌コロニー）の選択を容易にする。複製起点（ＯＲＩ）は細菌宿主細胞内でプラスミドを増殖するのに必要とされる。Ｌ−アラビノース誘導発現プラスミドはまたａｒａＢＡＤプロモーターのＬ−アラビノース誘導を可能とし、非誘導状態で「漏出性」バックグラウンド発現を転写抑制を通して低減する転写制御因子であるａｒａＣをコードする、ポリヌクレオチド配列を含有する。他の発現ベクター（「プロピオネート誘導発現ベクター」）は、ｐＰＲＯ又は関連プラスミドと類似又は同等で、これにおいてプロピオネート誘導プロモーターが、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）にクローン化される挿入発現配列の発現を推し進める。そのプラスミドはまた、抗生物質耐性遺伝子（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードし、クロラムフェニコールに耐性を与えるＴｎ３ｂｌａ遺伝子）のコード配列を含有し、インタクトな発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を容易にする。複製起点（ＯＲＩ）が、細菌宿主細胞内でプラスミドの増殖に必要とされる。加えて、プロピオネート誘導発現ベクターは、ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターのプロピオネート（２−メチルシトレート）誘導を可能とし、非誘導状態で「漏出性」バックグラウンド発現を低減する転写制御因子であるｐｒｐＲをコードする、ポリヌクレオチド配列を含有する。誘導の分離ティトラテイション（ｔｉｔｒａｔａｔｉｏｎ）、プラスミド和合性及び、発現ベクターの共増殖を容易にするために、発現ベクターが異なる誘導物質、和合複製起点及び異なる抗生物質耐性マーカーに応答性のあるプロモーターを含むことは有益である。本発明の一実施形態では、Ｌ−アラビノース誘導性ａｒａＢＡＤプロモーターを含有するｐＢＡＤ２４又は関連発現ベクター（ｐＭＢ１又は「ｐＢＲ３２２」ＯＲＩ、ＡｍｐＲ）は、宿主細胞において、プロピオネート誘導性ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターを含有するｐＰＲＯ３３又は関連発現ベクター（ｐ１５ＡＯＲＩ、ＣｍＲ）と化合する。発現ベクターは、アンピシリン及びクロラムフェニコールを補充した増殖培地を用いて共増殖し維持する。一実施形態では、１つの発現ベクターは、完全長抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含み、他の発現ベクターは、完全長抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含み、各コード配列はそれぞれの発現ベクターのＭＣＳの中へインフレームにクローン化される。抗体等の所定の遺伝子産物の産生のためには、宿主生物の最適化（他の検討事項と併せて、コドンバイアス及びＧＣ含量のための調製を含む）が、共発現系の発現コンストラクトの中に挿入されるコード配列を決定することになる。
再度図２を参照すると、遺伝子産物の共発現は、廉価な外因的適用性化学的代謝産物であるＬ−アラビノース及びプロピオネート（５）によって誘導する。各遺伝子産物発現の誘導のレベルは、それ自身の化学的誘導物質で独立して滴定し、それによってタンパク質共発現の最適化を容易にする。これは、安定化のための結合パートナーを必要とするタンパク質複合体及びタンパク質の発現に有益であり、そうしなければ発現の困難なタンパク質、例えば、乏しい溶解性又は細胞毒性をもったタンパク質等の発現を容易にし得る。この例では、誘導後に抗体重鎖及短鎖はそれぞれ別々に発現し、次いで、タンパク質が連結し、重鎖及び軽鎖を含む完全長抗体の形成と安定化を可能とする鎖間ジスルフィド架橋（細菌宿主の細胞質内に）を形成する。タンパク質は、宿主生物の種々の区画へと向かわせることができる。例えば、大腸菌においては、タンパク質は細胞質、細胞膜、周辺質で発現し、媒介物へと分泌できる。適切なインキュベーション時間の後、細胞と媒介物を回収し、タンパク質全部を抽出すると、これは共発現遺伝子産物（６）を含む。抽出の後、所望の産物は、共発現系で産生される遺伝子産物の性質に従って、当技術分野で周知のいくつかの方法を用いて精製することができる（例えば、液体クロマトグラフィー）。図２に示される実施例では、多量体産物（完全長抗体）を抽出し、クロマトグラフィー方法を用いて精製する。精製されるインタクトな抗体を、タンパク質結合色素又は免疫組織化学等、標準的な技術を用いて非変性ゲル上で視覚化する。次いで、完全長抗体産物をいくつかの研究、診断、その他用途に用いることができる。
本発明の方法によって作られる産物
多くの共発現用途での本発明の誘導性共発現系の利用及び、産物の特性においては、幅広い多用途性がある。
グリコシル化 本発明の方法による遺伝子産物共発現はグリコシル化しても非グリコシル化してもよい。本発明の一実施形態では、共発現遺伝子産物はポリペプチドである。グリコシル化ポリペプチドは、共有結合したグリコシル基を含むポリペプチドであり、それとしては、そのポリペプチドの特定の残基に通常通り結合した全てのグリコシル基を含むポリペプチド（完全にグリコシル化されるポリペプチド）、部分的にグリコシル化されるポリペプチド、グリコシル化が起こるとは限らない１つ又は複数の残基でのグリコシル化（変異グリコシル化）を有するポリペプチド、及び、１つ又は複数の特定残基に通常通り結合するグリコシル基とは構造で異なる少なくとも１つのグリコシル基でグリコシル化（修飾グリコシル化）されるポリペプチド、も挙げられる。修飾グリコシル化の一例としては、「脱フコシル化」即ち「フコース欠損」ポリペプチド、即ち、ポリペプチドに結合するグリコシル基にフコース成分がないポリペプチドを、ポリペプチドをフコシル化する能力を欠く宿主細胞内でのポリペプチドの発現によって、産生させることが挙げられる。非グリコシル化ポリペプチドは、共有結合グリコシル基を含まないポリペプチドである。非グリコシル化されるポリペプチドはポリペプチドの脱グリコシル化の結果、又はアグリコシル化されるポリペプチドの産生の結果であり得る。脱グリコシル化ポリペプチドは、グリコシル化ポリペプチドを酵素的に脱グリコシル化することによって得られ、他方、アグリコシル化ポリペプチドは、原核生物細胞又は、少なくとも１つのグリコシル化酵素の機能が削除若しくは低減された細胞等、ポリペプチドをグリコシル化する能力を有さない宿主細胞にポリペプチドを発現することによって産生できる。特定の実施形態では、共発現ポリペプチドをアグリコシル化し、より具体的な実施形態ではアグリコシル化ポリペプチドを大腸菌等の原核生物細胞で共発現する。
遺伝子産物の他の修飾 本発明の方法によって共発現される遺伝子産物は他のタイプの分子に共有結合していてもよい。共発現遺伝子産物に共有結合され得る分子の例としては、本発明の範囲を限定することなく、以下が挙げられる：ポリペプチド（例えば、受容体、リガンド、サイトカイン、増殖因子、ポリペプチドホルモン、ＤＮＡ結合ドメイン、ＰＤＺドメイン等のタンパク質相互作用ドメイン、キナーゼドメイン、抗体、及び、そのようなポリペプチドの断片）；水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチル化ポリオール（グリセロール等）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、及び類似の化合物、誘導体、又はその混合物）；及び、細胞毒性剤（例えば、化学療法剤、増殖阻害、毒素（例えば、細菌起源、真菌起源、植物起源又は動物起源の酵素活性毒素、又はその断片）、及び放射性同位体）。
加えて、本発明の方法によって共発現する遺伝子産物は、遺伝子産物の精製及び／又は検出において補助となる分子成分を含むように設計することができる。多くのそのような成分が当技術分野で知られており、一例として、ポリペプチド遺伝子産物は、ポリヒスチジン「タグ」配列 − ６つ以上のヒスチジン、好ましくは６〜１０のヒスチジン残基、最も好ましくは６つのヒスチジンの列 − を、そのＮ−又はＣ−末端で含むように設計することができる。ポリペプチドの末端にポリヒスチジン配列が存在することにより、それがコバルト系又はニッケル系親和性媒介物によって結合して他のポリペプチドから分離できるようになる。ポリヒスチジンタグ配列はエキソペプチダーゼによって除去できる。別の一例として、蛍光タンパク質のアミノ酸配列が好ましくはポリペプチド遺伝子産物のアミノ酸配列のＮ−又はＣ−末端で加えられたポリペプチド遺伝子産物の一部として、蛍光タンパク質配列を発現することができる。得られる融合タンパク質は、所定の波長の光が当てられると蛍光発光し、融合タンパク質の存在が視覚的に検出できるようになる。周知の蛍光タンパク質はオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質であり、多くの他の蛍光タンパク質が、それらをコードするヌクレオチド配列とともに市販されている。
抗体 本発明の一実施形態では、共発現遺伝子産物は抗体である。「抗体」という用語は最も広い意味で用いられ、具体的には、「天然」抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多選択性抗体（二重特異性抗体等）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、及び、抗原に結合可能な抗体から誘導される他のポリペプチドが挙げられる。本明細書で他に記載がなければ、免疫グロブリン重鎖における残基の番号付け（「ＥＵ番号付け」）は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, 1991, National Institute of Health, Bethesda, MarylandにあるＥＵインデックス（ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付け）のそれである。
「天然」抗体は通常、２つの同じ軽（Ｌ）鎖と２つの同じ重（Ｈ）鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有結合ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、一方、鎖間ジスルフィド架橋の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖に従って変わる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に間隔をあけて並べられた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、そのＮ末端に可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続くいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖はそのＮ−末端（ＶＬ）で可変ドメインを、そのＣ−末端で定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと一線に並び、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと一線に並ぶ。「可変」という用語は、可変ドメインの所定の部分は抗体によって配列が大きく異なり、抗原に対する各特定抗体の結合及び特異性の点から用いられる、という事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全域に均等に分布されている訳ではない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方における超可変領域（ＨＶＲｓ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのよりよく保存される部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、３つのＨＶＲによってつながれた４つのＦＲ領域を含み、他の鎖からのＨＶＲで、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。
「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ−末端領域を指し、天然Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るけれども、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基からか又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシル−Ｃ末端へ伸長するものと規定できる。あるいは、Ｆｃ領域は、保存ＣＨ２免疫グロブリン領域のＮ末端残基（Ａｌａ２３１）からＣ−末端まで伸長するものと規定することもでき、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４等の多重保存ドメインが挙げられる。天然Ｆｃ領域のＣ−末端リジン（ＥＵ番号付けシステムに従って、残基４４７）は、例えば、抗体の産生若しくは精製の間に除去するか又は、抗体の重鎖をコードする核酸を組み替えエンジニアリングすることによって除去してもよい。したがって、インタクトな抗体の組成としては、全てのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、及び、Ｋ４４７残基のある抗体とない抗体の混ざったものを有する抗体集団、を含み得る。抗体のＦｃ領域は、免疫学的細胞のリクルートメント及び抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）に決定的に重要である。特に、抗体によって誘発されるＡＤＣＣ応答の性質は、多くの細胞タイプの表面に位置する受容体（ＦｃＲｓ）とＦｃ領域との相互作用に左右される。ヒトは少なくとも５つの異なる分類のＦｃ受容体を含有する。抗体のＦｃＲｓへの結合は、他の免疫学的細胞をリクルートするその能力と、リクルートされる細胞のタイプを決定する。そのため、抗体を、所定の種類の細胞のみをリクルートできる変異Ｆｃ領域とエンジニアリングする能力は、治療に決定的に重要である（米国特許出願第２００９０１３６９３６Ａ１号、05-28-2009, Georgiou, George）。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は典型的に、一般にＮ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に結合する分岐型二分岐オリゴ糖を含む。所定の実施形態では、本発明の方法によって産生される抗体は、たとえば、Ｆｃ領域の残基２９７での置換、又は、ポリペプチドをグリコシル化する能力を有しない宿主細胞での発現のために、グリコシル化しないか、又はアグリコシル化する。変異ＡＤＣＣ応答のために、非グリコシル化抗体はより低レベルの炎症反応、例えば神経炎症を刺激する。また、アグリコシル化Ｆｃ領域を有する抗体は、Ｆｃ受容体に対して非常に低い結合親和性を有するので、そのような抗体は、これらの受容体をもつ多数の免疫細胞に結合しないと考えられる。それは、非特異的結合を低減し、また、生体内での抗体の半減期を増加させ、治療におけるこの属性を非常に有益なものとするので、これは重要な利点である。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」という用語は互換的に使用され、以下に定義するように、抗体断片でない実質的にインタクトな「天然」形式の抗体を指す。それらの用語は特に、可変ドメイン及びＦｃ領域をそれぞれが含む重鎖をもつ抗体を指す。「抗体断片」はインタクトな抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｃ、Ｆｄ、及びＦｖ断片；二特異性抗体；線状抗体；ｓｃＦｖ等の単一鎖抗体分子；及び、抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を持つものである。「キメラ」抗体はその重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から誘導される抗体又は特定の抗体分類若しくは下位分類に属する抗体における対応する配列と同一か、所定のアミノ酸配列同一性を共有する抗体であり、一方、鎖（複数を含む）の残りは別の種から誘導される抗体又は別の抗体分類若しくは下位分類に属する抗体及びそのような抗体の断片と同一か、所定の程度のアミノ酸配列同一性を共有する。「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリン分子から誘導される最小アミノ酸残基を含有するキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（受容抗体）において受容抗体のＨＶＲ残基がマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類等の非ヒト種の免疫グロブリンＨＶＲ（ドナー抗体）からの残基によって置き換えられたものである。いくつかの場合には、ヒト受容抗体のＦＲ残基は対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、受容抗体又はドナー抗体に見られない残基を含んでいてもよい。「モノクローナル抗体」という用語は、少量で存在し得る天然の突然変異体等、あり得る突然変異体を除いて、抗体の集団を含む個々の抗体は同一であるという点で実質的に均質的な抗体の集団から得られる抗体を指す。したがって、修飾因子「モノクローナル」は、個々別々の抗体の混合物ではないという、抗体の特徴を示す。複数の異なる決定基（エピトープ）に対して向かう複数の異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体の調製とは対照的に、モノクローナル抗体調製の各モノクローナル抗体は、抗原上の同じ単一の決定基に対して向かう。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製は、通常他の免疫グロブリンによって汚染されないという点で有利である。
抗体等の分子の「結合親和性」は一般的に、分子の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗体とそれが結合する抗原）との間の非共有結合性相互作用の全体の強さを指す。他に示されていなければ、「結合親和性」は結合対（例えば抗体と抗原）の要素間の１：１の相互作用を反映する内因性結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般的に解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。低親和性抗体（Ｋｄがより高い）は一般的にゆっくりと抗原に結合し簡単に解離する傾向があり、一方、高親和性抗体（Ｋｄがより低い）は一般的に抗原により速く結合しより長く結合を維持する傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が当技術分野で知られており、そのいずれもが本発明の目的のために使用できる。結合親和性を測定する具体的な例示的方法を実施例１０に記載する。本発明の方法によって産生及び／又は使用する抗体及び抗体断片は、実施例１０に記載の表面プラズモン共鳴法アッセイによって測定して好ましくは１００ｎＭ未満の結合親和性を有し、より好ましくは１０ｎＭ未満の結合親和性を有し、最も好ましくは２ｎＭ未満の結合親和性を有する。
アグリコシル化抗体を認識する抗体（二次） 大腸菌又はその他に基づく原核生物発現系においてグリコシル化酵素なしで抗体を産生すると、一般的にアグリコシル化抗体が得られ、一次抗体として用いることができる。本発明の誘導性共発現系を用いてアグリコシル化一次抗体を産生することに加えて、本発明の誘導性共発現系を用いて特異的にアグリコシル化一次抗体を認識する二次抗体を効率的に産生することもできる。本発明の一態様は、研究、分析、診断又は治療目的のために非グリコシル化即ちアグリコシル化一次抗体を検出できる二次抗体系である。一例として、二次抗体系は次の構成要素とともに提供される：エピトープ、一次抗体、二次抗体及び検出系。エピトープは抗原（通常タンパク質）の一部であり、生きた動物に導入されるか別の方法で抗体によって認識されると免疫応答を生じさせる抗原決定基である。実際には、目的のエピトープは混合物又は組織の中に存在し得る。一実施形態では、エピトープはヒトの組織のがん細胞において発現されるタンパク質である。一次抗体は抗体断片、単一完全長抗体（モノクローナル）又は、複数の異なる完全長抗体（ポリクローナル）の混合物であり、エピトープを認識してこれに結合し、好ましくは特異的にエピトープに結合する。この例における完全長抗体は２つの重ポリペプチド鎖と２つの軽ポリペプチド鎖とがジスルフィド架橋で連結されたものを含む。鎖のそれぞれは、定常領域（Ｆｃ）及び可変領域（Ｆｖ）を含む。完全長抗体には２つの抗原結合部位がある。本発明の一実施形態では、一次抗体は目的のエピトープを認識してこれに結合する完全長アグリコシル化抗体（大腸菌に基づく発現系において産生されるもの等）である。二次抗体は抗体断片、単一完全長抗体（モノクローナル）又は、複数の異なる完全長抗体（ポリクローナル）の混合物であり、アグリコシル化一次抗体を認識してこれに結合し、好ましくは特異的にアグリコシル化一次抗体に結合する。本発明の一実施形態では、二次抗体は、完全長一次抗体のアグリコシル化Ｆｃ部分を認識してこれに結合する完全長抗体である。この場合に、抗体結合部位はアグリコシル化一次抗体のＦｃ部分を特異的に認識するよう選択及び／又はエンジニアリングし、Ｃ−末端リジン残基はあってもなくてもよい。他の実施形態では、二次抗体はアグリコシル化一次抗体のさらなる領域（エピトープ）又は、一次抗体に共有結合するポリペプチド配列を含み但しそれに限定されないエンジニアリングされたさらなるエピトープ、を認識するようにエンジニアリングすることも考えられる。二次抗体は完全長アグリコシル化抗体分子（ＩｇＧ、ＩｇＡ等の種々の免疫グロブリン分類を含む）又は、Ｆｃ若しくはＦａｂ等の抗体断片上に存在する、単一若しくは複数部位（エピトープ）に向けることができる。したがって、この方法で生成されるいくつかの二次抗体はどのようなアグリコシル化完全長抗体に対しても広い特異性を有すると考えられる。本発明の一次及び二次抗体としてはまた、伝統的な方法（免疫化ウサギを用いたポリクローナル抗体産生又はマウスハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体産生）及び、抗原結合ポリペプチドを特定するファージディスプレイ方法等の組換えＤＮＡ技術によって産生するものも挙げられる。
検出系は一般的に、二次抗体に連結又は結合して二次抗体の検出、視覚化、及び／又は定量化を可能とする剤を含む。種々の検出系が当技術分野で周知であり、蛍光色素、酵素、放射性同位体又は重金属を含み、但しこれらに限定されない。これらは、さらなるポリペプチドを二次抗体に直接物理的に連結させることを含んでいてもいなくてもよい。この二次抗体系の応用としては、免疫組織化学的測定、ウエスタンブロッティング及び酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、免疫組織化学的測定における使用の一実施形態では、目的のエピトープは組織の薄片に存在し、次いでアグリコシル化一次抗体を組織に作用させ、エピトープに結合させる。非結合の一次抗体を除去し、次いでアグリコシル化一次抗体に特異的に結合できる二次抗体を組織に作用させ、一次抗体に結合させる。非結合二次抗体を除去し、次いで検出系試薬を作用させる。例えば、二次抗体を酵素に結合させる場合、色がきれいに出る酵素基質を組織に作用させ反応させる。次いで、直接顕微鏡又は蛍光透視によって反応酵素基質を視覚化することを実施する。他の検出方法も当技術分野で周知である。
アグリコシル化抗体を認識する二次抗体を用いた系の利点としては以下が挙げられ、それらに限定されない：
１）アグリコシル化しなければ真核生物組織に存在しない一次抗体のＦｃ部分をアグリコシル化してそれに二次抗体が結合するよう設計しているので免疫組織化学的測定の特異性が向上する；
２）一次抗体に対する特異性の向上によりバックグラウンドの染色が低減される；
３）一次及び／又は二次抗体を大腸菌等の原核生物で生成できるので二次抗体系産生のコストが低減される；
４）抗体開発のプロセス全体を大腸菌等の原核生物で実施するので、マウス及びウサギ等の哺乳動物を不必要に利用することが避けられる。
産業用途で用いられる酵素 多くの産業プロセスは本発明の方法によって産生できる酵素を利用する。これらのプロセスとしては、廃水処理並びに他のバイオレメディエーション及び／又は解毒プロセス；製紙・繊維産業における材料漂白；バイオ燃料へと効率的発酵可能な材料にするバイオマスの分解が挙げられる。多くの場合、微生物宿主細胞、好ましくは細菌宿主細胞におけるこれらの用途で酵素を産生することが望ましいと考えられるが、活性酵素は酵素フォールディング及び／又は補助因子必要性の問題により大量に発現することが困難である。本発明の以下の実施形態では、本発明の誘導性共発現方法を用いて産業用途に関する酵素を産生する。
アラビノース利用酵素及びキシロース利用酵素 Ｄ−キシロースは植物バイオマス中に最も豊富にある五炭糖で、多糖類、ヘミセルロース及びペクチンの中に見られ、Ｌ−アラビノースが次に最も豊富にある五炭糖である。バイオ燃料及び他のバイオ産物の開発及び産生のためには、Ｄ−キシロース及びＬ−アラビノースをグルコース及びフルクトース等の六炭糖に変換することが有益で、これは六炭糖がエタノール等のバイオ燃料に効率的に発酵されるからである。上に記載の通り、大腸菌ａｒａＢＡＤオペロンは、Ｌ−アラビノースを次の通り代謝するタンパク質をコードする：Ｌ−アラビノースをＬ−アラビノースイソメラーゼ（ＡｒａＡ、ＥＣ５．３．１．４）によってＬ−リブロースへ；Ｌ−リブロースをＬ−リブロキナーゼ（ＡｒａＢ、ＥＣ２．７．１．１６）によってＬ−リブロース−リン酸へ；Ｌ−リブロース−リン酸をＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼ（ＡｒａＤ、ＥＣ５．１．３．４）によって、フルクトース及びグルコース形成の五炭糖リン酸経路の一部であるＤ−キシルロース−５−リン酸（Ｄ−キシルロース−５−Ｐとも称す）へ。Ｌ−アラビノースをキシリトールに変換し、次いでキシリトールをＤ−キシルロース−５−Ｐに変換できる他の酵素経路（「オキソ還元性経路」）は次の通りである：Ｌ−アラビノースをＬ−アラビノース／Ｄ−キシロース還元酵素（ＥＣ１．１．１．２１）によってＬ−アラビニトールへ；Ｌ−アラビニトールをＬ−アラビニトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１２）によってＬ−キシルロースへ；Ｌ−キシルロースをＬ−キシルロース還元酵素（ＥＣ１．１．１．１０）によってキシリトールへ。大腸菌ｘｙｌＡＢオペロンは次の通り、Ｄ−キシロースを利用する一酵素経路（「イソメラーゼ経路」）をコードする：Ｄ−キシロースをＤ−キシロースイソメラーゼ（ＸｙｌＡ、ＥＣ５．３．１．５）によってＤ−キシルロースへ；Ｄ−キシルロースをキシルロキナーゼ（ＸｙｌＢ、ＥＣ２．７．１．１７）によってＤ−キシルロース−５−Ｐへ。Ｄ−キシロースをＤ−キシルロース−５−Ｐへ変換する別の一酵素経路（「オキソ還元性経路」）は次の通りである：Ｄ−キシロースをＤ−キシロース還元酵素（ＥＣ１．１．１．２１）によってキシリトールへ；キシリトールをキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．９）によってＤ−キシルロースへ；Ｄ−キシルロースをキシルロキナーゼ（ＸｙｌＢ、ＥＣ２．７．１．１７）によってＤ−キシルロース−５−Ｐへ。ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ−及びＡＴＰ等、オキソ還元性経路において必要とされる種々の補助因子及び、これらの補助因子を利用するに当たってどの程度入手できるかにより、不均衡が副産物によるキシリトールの過剰産生を生じる可能性がある。Ｄ−キシルロース−５−Ｐに４−リン酸エリトロースをプラスしたものを、トランスケトラーゼ（ＥＣ２．２．１．１）によって、３−リン酸グリセルアルデヒドに６−リン酸フルクトースをプラスしたものへと変換できる。
本発明の誘導性共発現方法を用いてアラビノース−利用酵素及びキシロース−利用酵素を産生することができ、これらは、前出の段落でＥＣ番号によって列記されている酵素であると定義される。各酵素のＥＣ（即ち「酵素委員会（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）」）番号は、国際生化学・分子生物学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ＩＵＢＭＢ）によって確立される。これらの酵素及びそれらの具体例に関するさらなる情報は、ＵｎｉＰｒｏｔタンパク質データベース（www.uniprot.org/uniprot）及びＢＲＥＮＤＡデータベース（www.brenda-enzymes.org/index）を通じて容易に入手でき、ＢＲＥＮＤＡ及びＵｎｉＰｒｏｔデータベースのアラビノース−利用酵素及びキシロース−利用酵素の記載項目は参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、アラビノース−利用酵素又はキシロース−利用酵素は、シャペロンタンパク質とともに共発現され；本明細書のさらなる実施形態では、アラビノース−利用酵素又はキシロース−利用酵素は、補助因子のトランスポーターとともに共発現される。所定の実施形態では、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（ＡｒａＡ、ＥＣ５．３．１．４）又はＬ−アラビノース還元酵素（ＥＣ１．１．１．２１）は本明細書の方法によって産生され；これらの実施形態では、誘導物質のＬ−アラビノースがＬ−リブロース又はＬ−アラビニトールにそれぞれ変換されるので、アラビノース誘導性プロモーターは発現コンストラクトにおいて利用されない。宿主細胞がａｒａＡ突然変異体等、ＥＣ５．３．１．４及び／又はＥＣ１．１．１．２１に欠け、Ｌ−アラビノースを異化できない場合、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（ＡｒａＡ、ＥＣ５．３．１．４）又はＬ−アラビノース還元酵素（ＥＣ１．１．１．２１）以外のアラビノース−利用酵素の産生には、アラビノース誘導性プロモーターを利用することができる。同様に、Ｄ−キシロースイソメラーゼ（ＸｙｌＡ、ＥＣ５．３．１．５）又はＤ−キシロース還元酵素（ＥＣ１．１．１．２１）が本明細書の方法によって産生される実施形態では、誘導物質であるＤ−キシロースがＤ−キシルロース又はキシリトールにそれぞれ変換されることが考えられるので、キシロース誘導性プロモーターはいずれの発現コンストラクトでも利用されない。Ｄ−キシロースイソメラーゼ（ＸｙｌＡ、ＥＣ５．３．１．５）又はＤ−キシロース還元酵素（ＥＣ１．１．１．２１）以外のキシロース利用酵素の産生のためには、ｘｙｌＡ突然変異体等、ＥＣ５．３．１．５及び／又はＥＣ１．１．１．２１に欠ける宿主細胞がＤ−キシロースを異化できない場合、キシロース誘導性プロモーターを利用することができる。
キシロースイソメラーゼ（ＸｙｌＡ、ＥＣ５．３．１．５）は微生物、嫌気性真菌及び植物に見られる酵素で、アルド糖（Ｄ−キシロース）のケト糖（Ｄ−キシルロース）への相互変換を触媒する。それはまた、Ｄ−リボースをＤ−リブロースへ、Ｄ−グルコースをＤ−フルクトースへ異性化する。この酵素は、イソメラーゼ、具体的にはアルドース及びケトースを相互変換する分子内酸化還元酵素のファミリーに属する。この酵素分類の系統名はＤ−キシロース・アルドース−ケトース−イソメラーゼである。他の一般的な名称としては、Ｄ−キシロースイソメラーゼ、Ｄ−キシロースケトイソメラーゼ、Ｄ−キシロースケトール−イソメラーゼ、及びグルコースイソメラーゼが挙げられる。酵素は産業的に用いて、高フルクトースコーンシロップの製造においてグルコースをフルクトースに変換し、上に記載の通り、バイオ燃料生産のために五炭糖の六炭糖への変換において用いることができる。キシロースイソメラーゼはホモ四量体であり、２つの二価カチオン − Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋及び／又はＣｏ２＋ − を最大活性のために必要とする。キシロースイソメラーゼ活性は、ＮＡＤＨ−結合アラビトールデヒドロゲナーゼアッセイ（Smith et al., "D-Xylose (D-glucose) isomerase from Arthrobacter strain N.R.R.L. B3728. Purification and properties", Biochem J 1991 Jul 1; 277 (Pt 1): 255-261）を用いて測定することができ、これでは１単位のキシロースイソメラーゼ活性は、１マイクロモルのＤ−キシロースをＤ−キシルロースに１分で変換する酵素の量である。少なくともいくつかの種においては、キシロースイソメラーゼはその活性のためにマグネシウム（植物の場合はマンガン）を必要とし、一方、酵素の四量体構造を安定化させるためにコバルトが必要なことがある。各キシロースイソメラーゼサブユニットは、他の二価金属依存性ＴＩＭ（トリオースリン酸イソメラーゼ）バレル酵素に類似のα／βバレルフォールディングを含有し、Ｃ末端のより小さい部分は、多量体化に関係する拡張らせんフォールディングを形成する。全ての既知のキシロースイソメラーゼにおける保存残基は、酵素のＮ末端部分にあって酵素の触媒メカニズムへの関与を示すヒスチジンであり、並びに、マグネシウム、コバルト、又はマンガンのイオンに結合するものであって、２つのグルタミン酸残基、ヒスチジン及び、２つの金属結合部位を形成する４つのアスパラギン酸残基、のそれぞれである（Katz et al., "Locating active-site hydrogen atoms in D-xylose isomerase: time-of-flight neutron diffraction", Proc Natl Acad Sci USA 2006 May 30; 103(22): 8342-8347; Epub 2006 May 17）。
本発明のいくつかの実施形態では、誘導性共発現を用いてキシロースイソメラーゼタンパク質を発現し、所定の実施形態では、キシロースイソメラーゼ（「ＸＩ」）は、アルスロバクター種菌株ＮＲＲＬ Ｂ３７２８ ＸＩ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１２０７０）；バクテロイデス・ステルコリスＸＩ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｂ０ＮＰＨ３）；ビフィオバクテリアム・ロンガムＸＩ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ８Ｇ３Ｑ１）；バークホルデリア・セノセパシアＸＩ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１ＢＧ９０）；ユウレイボヤＸＩ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｆ６ＷＢＦ５）；クロストリジウム・ファイトファーメンタンスＸＩ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ａ９ＫＮ９８）；オルピノマイセス種ｕｋｋ１ ＸＩ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｂ７ＳＬＹ１）；ピロミセス種Ｅ２ ＸＩ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９Ｐ８Ｃ９）；ストレプトマイセス・リビダンスＸＩ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９ＲＦＭ４）；ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４ ＸＩ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｄ６ＥＳＩ７）；サーモアナエロバクター・エタノリカス ＪＷ ２００ ＸＩ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｄ２ＤＫ６２）；サーモアナエロバクター・ヨンセイイＸＩ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９ＫＧＵ２）；サーモトガ・ネアポリタナＸＩ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ４５６８７）；サーマス・サーモフィラスＸＩ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ２６９９７）；及びビブリオ種菌株ＸＹ−２１４ ＸＩ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃ７Ｇ５３２）からなる群より選択される。特定の実施形態では、キシロースイソメラーゼはＣｏｒＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０ＡＢＩ４）等の二価トランスポーターとともに誘導的に共発現され、誘導性プロモーターを用いてイオンの輸送のタイミングと範囲を制御することは、宿主細胞に対するＣｏ２＋等の金属イオンからの毒性を低減する上で有益である。さらなる実施形態では、ＸＩモノマーの対の間の相互作用に影響するキシロースイソメラーゼタンパク質に突然変異を導入し、例えば、システイン残基を導入して、モノマーの対の間にジスルフィド結合が形成されるようにする（以下参照、Varsani et al., "Arthrobacter D-xylose isomerase: protein-engineered subunit interfaces", Biochem J 1993 Apr 15; 291 (Pt 2): 575-583）。この例では、システイン残基は２つのモノマーの中の相互的ではあるが同一ではない位置に導入されるので、２つの異なるタイプの変異モノマーが産生され、本明細書の誘導性共発現系を用いて２つのタイプのモノマーの相対的発現を滴定し、所望の化学量論比を達成する。
リグニン分解ペルオキシダーゼ ペルオキシダーゼは酸化還元酵素の下位グループであり、これを用いて種々の産業プロセスを触媒する。酸化還元酵素は、リグニンを分解することができ、即ち、セルロース及びヘミセルロースの分解において還元酵素として働くことができ、植物バイオマスの処理において用いられる酵素がエタノール等のバイオ燃料の生産の間にサッカライド残基に容易に近づくことを可能とする。酸化還元酵素はオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼであってもよい。オキシダーゼは電子アクセプターとして分子酸素を用い、一方、デヒドロゲナーゼはＨ−基をＮＡＤ／ＮＡＤＰ＋又はフラビン依存性酵素等のアクセプターに移すことによって基質を酸化させる。ペルオキシダーゼは過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）等のペルオキシドの還元を触媒する。他のタイプの酸化還元酵素としては、オキシゲナーゼ、ヒドロキシラーゼ及び還元酵素が挙げられる。酸素、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）並びに、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドであるＮＡＤ及びＮＡＤＰに加えて、酸化還元酵素の補助因子の可能性としては、チトクロム及びヘム、ジスルフィド並びに鉄硫黄タンパク質が挙げられる。
リグニン分解ペルオキシダーゼは、リグニン、工業用染料、殺虫剤等の高酸化還元電位化合物を含む種々の芳香族化合物を酸化させる。次の４つのタイプのリグニン修飾酵素が同定され特徴付けられている：リグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ、ＥＣ１．１１．１．１４）、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ、ＥＣ１．１１．１．１３）、汎用ペルオキシダーゼ（ＶＰ、ＥＣ１．１１．１．１６）及びラッカーゼ（ＥＣ１．１０．３．２）。ＬｉＰ、ＭｎＰ及びＶＰは、４つ又は５つのジスルフィド結合と、構造的Ｃａ２＋イオンに対する２つの結合部位とをもったヘムタンパク質であり、高酸化還元電位ペルオキシダーゼであり、これは高酸化還元電位基質及び／又はＭｎ２＋を直接酸化することができる。ＭｎＰのペルオキシダーゼ活性は、下の実施例４第Ｅ項に記載の２，６−ジメトキシフェノール（２，６−ＤＭＰ）酸化アッセイを用いて測定することができ、ＬｉＰ活性はＨ２Ｏ２の存在下におけるベラチルアルコールのベラチルアルデヒドへの酸化によって測定することができる（Orth et al., "Overproduction of lignin-degrading enzymes by an isolate of Phanerochaete chrysosporium", Appl Environ Microbiol 1991 Sep; 57(9): 2591-2596）。ラッカーゼは、ヘムと会合せず、銅イオン（通常ラッカーゼタンパク質当たり４つの銅イオン）と会合し、低酸化還元電位の酸化還元酵素であり、これは酸化還元媒介物の存在下で高酸化還元電位基質のみを酸化させることができる。ラッカーゼの活性は、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｗｈｉｔｅ ｌａｃｃａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅ ｆｕｎｇｕｓ Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ ＮＦ−０５ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｃｏｌｏｕｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｙｅｓ”，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１２；７（６）：ｅ３８８１７に記載のＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））酸化アッセイを用いて測定することができ、１単位の活性は１分当たり１マイクロモルの産物の産生と定義される。
本明細書の誘導性共発現方法を用いてリグニン分解ペルオキシダーゼを産生することができ、これは前出の段落にあるＥＣ番号によって列記される酵素であると定義され；リグニン分解ペルオキシダーゼに関するＢＲＥＮＤＡ及びＵｎｉＰｒｏｔデータベース項目記載は参照によって本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、リグニン分解ペルオキシダーゼはシャペロンタンパク質とともに共発現され、本発明のさらなる実施形態では、リグニン分解ペルオキシダーゼはヘム等の補助因子のトランスポーターとともに共発現される。
ＬｉＰは本発明の誘導性共発現系を用いて発現することができ、所定の実施形態では、ＬｉＰは、ファネロケーテ・クリソスポリウム（スポロトリクム・プルイノスム）ＬｉＰアイソザイム「リグナーゼＡ」（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ３１８３７）、「リグナーゼＢ」（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ３１８３８）、「リグナーゼＨ２」（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１１５４２）、「リグナーゼＨ８」（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０６１８１）、「リグナーゼＬＧ２」（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ４９０１２）、「リグナーゼＬＧ３」（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ２１７６４）、「リグナーゼＬＧ５」（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１１５４３）、及び「リグナーゼＬＧ６」（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ５０６２２）；フレビア・ラジアータ「リグナーゼ−３」（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ２００１０）；トラメテス・ベルシカラー（コリオラス・ベルシカラー）ＬｉＰアイソザイム「リグナーゼＣ」（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ２００１３）、ＬＰ７（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９９０５７）、及びＬＰ１２（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ７ＬＨＹ３）；及びトラメトプシス・セルビナＬｉＰ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ３Ｃ１Ｒ８）及び（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ６０ＦＤ２）からなる群より選択される。
本発明のいくつかの実施形態では、誘導性共発現を用いてＭｎＰを発現し、所定の実施形態では、ＭｎＰはツクリタケＭｎＰ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ５ＴＪＣ２）；フミヅキタケＭｎＰ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｇ４ＷＧ４１）；レイシＭｎＰ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃ０ＩＭＴ８）；レンジテス・ギッボサＭｎＰ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃ３Ｖ８Ｑ９）；ファネロケーテ・クリソスポリウムＭｎＰアイソザイムＭＮＰ１（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ０２５６７）；Ｈ３（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ７８７３３）；及びＨ４（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１９１３６）；フレビア・ラジアータＭｎＰアイソザイムＭｎＰ２（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ７０ＬＭ３）及びＭｎＰ３（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９６ＴＳ６）；フレビア・ラジアータ種ｂ１９ＭｎＰ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｂ２ＢＦ３７）；フレビア・ラジアータ種ＭＧ６０ＭｎＰアイソザイムＭｎＰ１、ＭｎＰ２、ＭｎＰ３（それぞれＵｎｉＰｒｏｔ Ｂ１Ｂ５５４、Ｂ１Ｂ５５５、Ｂ１Ｂ５５６）；ヒラタケＭｎＰ３（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｂ９ＶＲ２１）；ウスラヒラタケＭｎＰ５（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ２ＶＴ１７）；スポンジペリス種ＦＥＲＭ Ｐ−１８１７１ＭｎＰ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ２ＨＷＫ０）；及びトラメテス・ベルシカラー（コリオラス・ベルシカラー）ＭｎＰアイソザイム（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９９０５８、Ｑ６Ｂ６Ｍ９、Ｑ６Ｂ６Ｎ０、Ｑ６Ｂ６Ｎ１、及びＱ６Ｂ６Ｎ２）からなる群より選択される。ヘムの存在下におけるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとのＭｎＰの共発現は実施例４に記載する。
ラッカーゼは、本発明の誘導性共発現系を用いて発現することができ、所定の実施形態では、ラッカーゼは、灰色かび病菌（灰色かび病）ラッカーゼアイソザイム（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１２５７０、Ｑ９６ＵＭ２、及びＱ９６ＷＭ９）；セレナ種ＷＲ１ラッカーゼアイソザイム（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｅ７ＢＬＱ８、Ｅ７ＢＬＱ９、及びＥ７ＢＬＲ０）；ミダレアミタケ（ミダレアミタケ）ラッカーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｂ８ＹＱ９７）；レイシラッカーゼアイソザイム（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６ＲＹＡ２、Ｂ５Ｇ５４７、Ｂ５Ｇ５４９、Ｂ５Ｇ５５０、Ｂ５Ｇ５５１、及びＢ５Ｇ５５２）；メラノカルプス・アルボマイセスラッカーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ７０ＫＹ３）；ヒラタケラッカーゼアイソザイム（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１２７２９、Ｑ１２７３９、Ｑ６ＲＹＡ４、Ｑ６ＲＹＡ４及びＧ３ＦＧＸ５）；シュタケラッカーゼアイソザイム（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ５９８９６、Ｑ９ＵＶＱ２、Ｄ２ＣＳＧ０、Ｄ２ＣＳＧ１、Ｄ２ＣＳＧ４、Ｄ２ＣＳＧ６及びＤ２ＣＳＧ７）；ヒイロタケラッカーゼアイソザイム（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｄ２ＣＳＦ２、Ｄ２ＣＳＦ５、Ｄ２ＣＳＦ６、Ｄ２ＣＳＭ７及びＤ７Ｆ４８４）；アラゲカワラタケ（アラゲカワラタケ）ラッカーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ０２４９７）；トラメテス・マキシマ（セレナ・マキシマ）ラッカーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｄ０ＶＷＵ３）；トラメテス・ベルシカラー（コリオラス・ベルシカラー）ラッカーゼアイソザイム（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１２７１７、Ｑ１２７１８及びＱ１２７１９）；及びトラメテス・ビローサラッカーゼアイソザイム（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９９０４４、Ｑ９９０４６、Ｑ９９０４９、Ｑ９９０５５及びＱ９９０５６）からなる群より選択される。
白色腐朽菌の３つの主要なリグニン修飾酵素はＬｉＰ、ＭｎＰ及びラッカーゼである一方、別のタイプのペルオキシダーゼである汎用ペルオキシダーゼ（ＶＰ）がヒラタケ属及びカワラタケ属のいくつかの種に見られる。ＶＰはその触媒的汎用性のために興味深く、それはＬｉＰ基質、ベラチルアルコール、メトキシ−ベンゼン及び非フェノールリグニンモデル化合物、並びにＭｎＰ基質Ｍｎ２＋を酸化させることができる。ＶＰの汎用活性はＭｎＰ２，６−ＤＭＰアッセイ、又はＬｉＰベラチルアルコールアッセイ、又はラッカーゼＡＢＴＳアッセイを用いて試験することができる（上記参照）。本発明のいくつかの実施形態では、誘導性共発現を用いてＶＰを発現し、所定の実施形態では、ＶＰは、ヤケイロタケＶＰ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ａ５ＪＴＶ４）；エリンギＶＰアイソザイム（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｏ９４７５３、Ｑ９ＵＲ１９及びＱ９ＵＶＰ６）；及びウスラヒラタケＶＰ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｉ６ＴＬＭ２）からなる群より選択される。
実施例１
細菌性の細胞における全長の抗体を産生するためのＩｇＧ１重鎖および軽鎖の誘導性共発現
Ａ．発現ベクターの構造
誘導性共発現系は、細菌性の細胞で、全長の抗体、特にマウスの抗ヒトＣＤ１９ＩｇＧ１抗体を産生するために用いられた。マウスの抗ヒトＣＤ１９ＩｇＧ１重鎖（「ＩｇＧ１重鎖」、「ＩｇＧ１ＨＣ」、「重鎖」、または「ＨＣ」）についてのコード配列は、配列番号１として提供され、ジェンバンク受入番号ＡＪ５５５６２２．１、特に塩基１３から１４０７のジェンバンクＡＪ５５５６２２．１ヌクレオチド配列のそれと同じである。対応する全長のマウスの抗ヒトＣＤ１９ＩｇＧ１重鎖アミノ酸配列は、配列番号２（およびジェンバンク受入番号ＣＡＤ８８２７５．１と同じである）として提供される。マウスの抗ヒトＣＤ１９ＩｇＧ１軽鎖（「ＩｇＧ１軽鎖」、「ＩｇＧ１ＬＣ」、「軽鎖」、または「ＬＣ」）のコード配列は、配列番号３として提供され、ジェンバンク受入番号ＡＪ５５５４７９．１、特に塩基２３から７４２のジェンバンクＡＪ５５５４７９．１ヌクレオチド配列のそれと同じである。対応する全長のマウスの抗ヒトＣＤ１９ＩｇＧ１軽鎖アミノ酸配列は、配列番号４として提供される（およびジェンバンク受入番号ＣＡＤ８８２０４．１と同じである）。
ＩｇＧ１重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドの合成および大腸菌における発現の最適化が、GenScript（Piscataway, NJ）により行われた。GenScript's OptimumGene（商標）Gene Designシステムが、アルゴリズム、タンパク質発現の異なる段階に伴われる種々の因子を考慮するOptimumGene（商標）アルゴリズム、例えば、コドン使用頻度のバイアス、ＧＣ含有量、ＣｐＧジヌクレオチド含有量、予測されるｍＲＮＡ構造、および転写および翻訳における種々のシス要素を用いる。ＩｇＧ１重鎖および軽鎖の最適化された配列は、配列番号５および配列番号６としてそれぞれ提供され、これらの最適化された配列は、コード配列の上流および下流にいくつかの追加のヌクレオチドを含み、コード配列は、配列番号５の塩基２５から１４１９、および配列番号６の塩基２５から７４７である。ＩｇＧ１軽鎖についての配列番号１０における最適化されたコード配列は、追加のアミノ酸、配列番号４のＩｇＧ１軽鎖アミノ酸配列に関連する、コードされたアミノ酸配列の位置２でのアラニン残基をコードする。最適化された重鎖および軽鎖配列はともに、ＴＡＡ停止コドン、および開始コドンの１４から９の塩基の上流に配置される、好ましい大腸菌のリボソーム結合配列（ＡＧＧＡＧＧ）を含む。さらに、ＩｇＧ１重鎖最適化配列（配列番号５）は、ＡＴＧ開始コドンを含むＮｃｏＩ制限部位、およびＴＡＡ停止コドンのすぐ下流にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含み、一方、ＩｇＧ１軽鎖最適化配列（配列番号６）は、リボソーム結合配列のすぐ上流にＮｈｅＩ制限部位、またＴＡＡ停止コドンのすぐ下流にＨｉｎｄＩＩＩ制限を含む。
ＩｇＧ１重鎖および軽鎖についての最適化されたコード配列は、ポリヌクレオチドインサートがｐＵＣ５７内でクローン化され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから得られた。ｐＢＡＤ２４ベクターは、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）からＡＴＣＣ８７３９９として得られ、ジェンバンクデータベース受入番号Ｘ８１８３７．１（２５−ＯＣＴ−１９９５）に示されるヌクレオチド配列を有し、ｐＰＲＯ３３ベクターは、カリフォルニア大学（Berkeley,California）から得られ、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有する。Guzman et al., "Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter" J Bacteriol 1995 Jul; 177(14): 4121-4130、および米国特許第８１７８３３８Ｂ２号; May 15 2012; Keasling, Jayに記載されているように、ｐＰＲＯ３３のヌクレオチド配列は、ｐＢＡＤ１８ベクター（ジェンバンク受入番号Ｘ８１８３８．１）、ｐｒｐＲ−ＰｐｒｐＢ領域の大腸菌ゲノム配列、およびｐＢＡＤ３３ベクターの配列からコンパイルされた。ＩｇＧ１重鎖をｐＢＡＤ２４ベクター内で、およびＩｇＧ１軽鎖をｐＰＲＯ３３ベクター内でクローン化するために、ｐＵＣ５７−ＨＣおよびｐＵＣ５７−ＬＣコンストラクトは、まず大腸菌ＢＬ２１細胞（New England Biolabs（または「ＮＥＢ」），Ipswich, Massachusetts）内でヒートショック方法を用いて形質転換された。これらのベクターのそれぞれについてのプラスミドＤＮＡが、ミニプレップ方法によりその後得られた。特記しない限り、液体培養における大腸菌細胞の増殖は、２５０ＲＰＭの回転振盪により３７℃であった。プラスミドを含む大腸菌細胞株（ｐＵＣ５７−ＨＣを含むＢＬ２１、ｐＵＣ５７−ＬＣを含むＢＬ２１、およびｐＢＡＤ２４を含むＤＨ５アルファ）は、１４時間または一晩、８ｍＬのＬＢ＋アンピシリン（「ＡＭＰ」）培地でそれぞれ増殖され、ｐＰＲＯ３３を含む大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞（Life Technologies, Grand Island, New York）は、５ｍＬのＬＢ＋クロラムフェニコール（「ＣＡＭ」）培地で増殖され、その後、細胞は、ペレットにされ、溶解され、プラスミドＤＮＡがＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）スピンカラム(QIAGEN, Germantown, MD)を用いて製造者の手順に従って分離された。収率の増加のために、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）スピンカラム手順は、ＰＥバッファに添加された１００％エタノールで行われ、上清は１回の代わりに２回カラムを通して送られた。
ＩｇＧ１重鎖をｐＢＡＤ２４内でクローン化するために、精製されたｐＵＣ５７−ＨＣおよびｐＢＡＤ２４プラスミドが、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（ＮＥＢ）により消化され、その後、ＩｇＧ１ＨＣ ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントおよびＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ｃｕｔ ｐＢＡＤ２４プラスミドが、ゲル電気泳動により他のポリヌクレオチドフラグメントから分離され、ゲルから切り取られ、イラストラGFX Gel Band Purificationキット（GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ）を用いて製造者の説明書に従って精製された。ＩｇＧ１ＨＣ ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、その後、ｐＢＡＤ２４−ＨＣ発現コンストラクトを形成するためのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ｃｕｔ ｐＢＡＤ２４プラスミドに連結された（１６℃で一晩）。ＩｇＧ１ＨＣ ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントにおけるＮｃｏＩ制限部位が、ＩｇＧ１ＨＣコード配列のＡＴＧ開始コドンを含むため、ＩｇＧ１ＨＣ ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントがＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ｃｕｔ ｐＢＡＤ２４ベクターに挿入される場合には、ＩｇＧ１ＨＣコード配列が、ｐＢＡＤ２４ベクターに存在する好ましい大腸菌リボソーム結合配列ＡＧＧＡＧＧの下流に配置される（Guzman et al., "Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter", J Bacteriol 1995 Jul; 177(14): 4121-4130の図１参照）。結果として得られたｐＢＡＤ２４−ＨＣ発現コンストラクトでは、リボソーム結合配列がＩｇＧ１ＨＣ開始コドンの１４から９塩基の上流で配置される。
ｐＰＲＯ３３内でＩｇＧ１軽鎖をクローン化するために、精製されたｐＵＣ５７−ＬＣおよびｐＰＲＯ３３プラスミドが、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（ＮＥＢ）により消化された。ｐＰＲＯ３３プラスミドが２つのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有しているため、ｐＰＲＯ３３ ＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化からゲル精製される２つのフラグメント、４．４ｋｂフラグメントおよび１．５ｋｂフラグメントがあった。イラストラGFX Gel Band Purificationキット（上記参照）を用いて、所望のフラグメントの全てのゲル精製後に、精製された４．４ｋｂｐＰＲＯ３３フラグメントが、アルカリホスファターゼ（仔ウシの腸のホスファターゼまたはＣＩＰともよばれる）（ＮＥＢ）により、製造者の説明書に従って処理された。ＣＩＰ−処理された４．４ｋｂのｐＰＲＯ３３フラグメントが、イラストラGFX Gel Band Purificationキット（上記参照）を用いてホスファターゼ反応混合物から精製され、その後、１．５ｋｂのｐＰＲＯ３３フラグメントに結合された（１６℃で１０．５時間）。結果として得られたＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ｃｕｔ ｐＰＲＯ３３プラスミドが、ｐＰＲＯ３３−ＬＣ発現コンストラクトを形成するために、ＩｇＧ１ＬＣ ＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに連結された（１６℃で一晩）。ＩｇＧ１ＬＣ ＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントにおけるＮｈｅＩ制限部位は、最適化された軽鎖配列（配列番号６）におけるリボソーム結合配列ＡＧＧＡＧＧのすぐ上流であるため、ＩｇＧ１ＬＣ ＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントがＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ｃｕｔ ｐＰＲＯ３３ベクター内に挿入される場合には、ＩｇＧ１ＬＣ配列がその好ましい大腸菌リボソーム結合配列を保持する。
Ｂ．細菌性の細胞におけるＩｇＧ１重鎖および軽鎖の誘導性共発現
ｐＢＡＤ２４−ＨＣ発現コンストラクトおよびｐＰＲＯ３３−ＬＣ発現コンストラクトは、大腸菌ＢＬ２１内におよび大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞（ＮＥＢ）内に、ヒートショック方法を用いて、同時形質転換された。形質転換されたＢＬ２１（ｐＢＡＤ２４−ＨＣ／ｐＰＲＯ３３−ＬＣ）およびＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ｐＢＡＤ２４−ＨＣ／ｐＰＲＯ３３−ＬＣ）細胞は、３０マイクログラム／ｍＬのＣＡＭおよび１００マイクログラム／ｍＬのＡＭＰの５ｍＬのＬＢ培地中で一晩３７℃で増殖された。ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞が、ＢＬ２１細胞よりもよりゆっくりと増殖するようであるため、２％（１００マイクロリットル）の一晩培養のＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ｐＢＡＤ２４−ＨＣ／ｐＰＲＯ３３−ＬＣ）、および１％の（５０マイクロリットル）一晩培養のＢＬ２１（ｐＢＡＤ２４−ＨＣ／ｐＰＲＯ３３−ＬＣ）が、カザミノ酸および０．２％グリセロール入りの５ｍＬのＭ９最少培地、プラス３０マイクログラム／ｍＬのＣＡＭおよび１００マイクログラム／ｍＬのＡＭＰを播種するために使用された。これらの培養が、ＯＤ６００が約０．５になるまで増殖され、ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ｐＢＡＤ２４−ＨＣ／ｐＰＲＯ３３−ＬＣ）細胞については３．１時間、ＢＬ２１（ｐＢＡＤ２４−ＨＣ／ｐＰＲＯ３３−ＬＣ）細胞については２．５時間であった。誘導前に、対照のサンプルが、誘導なく増殖される各培養から採取された。残りのＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ(ｐＢＡＤ２４−ＨＣ／ｐＰＲＯ３３−ＬＣ）およびＢＬ２１（ｐＢＡＤ２４−ＨＣ／ｐＰＲＯ３３−ＬＣ）細胞培養は、その後、０．２％アラビノースおよび５０ｍＭプロピオネートを追加することにより誘導され、６時間非誘導の対照サンプルと並行してそれらを増殖した。その時間の最後に、全ての細胞培養が、細胞をペレットにするために遠心分離され、−８０℃のフリーザに配置された。細胞のペレットは、氷上で溶かされ、細胞が、Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablet (Roche, Indianapolis, Indiana)が、リゾチームおよびヌクレアーゼを添加する前に１０ｍＬの天然の溶解バッファに添加された場合、並びに、サンプルが４℃の代わりに２５℃で遠心分離される場合を除いて、Qproteome Bacterial Lysisキット(QIAGEN）を用いて、製造者の説明書に従って溶解された。
誘導された細胞および非誘導の対照から抽出される可溶性のタンパク質が、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４から１２％のビス−トリスゲル(Life Technologies, Grand Island, New York)上で還元条件下でＳＤＳゲル電気泳動により分離された。ゲルは、ＲＡＰＩＤステイン（商標）(G-Biosciences, St. Louis, Missouri)を用いて染色された。図３に示されるように、タンパク質のバンド（重鎖）は、５１ｋＤａでおよび他のタンパク質のバンド（軽鎖）が２６ｋＤａで移動がみられ、これらのバンドが誘導された細胞では存在したが、非誘導細胞では存在しない。同じ可溶性のタンパク質が、誘導および非誘導のＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓから抽出され、ｐＢＡＤ２４−ＨＣおよびｐＰＲＯ３３−ＬＣ誘導性発現ベクターの両方を含むＢＬ２１細胞が、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）１０から２０％トリス−グリシンゲル(Life Technologies)上で、天然（非還元）の条件下で、ゲル電気泳動により分離された。ゲルは、ＲＡＰＩＤステイン（商標）（G-Biosciences）を用いて染色された。図４に示されるように、タンパク質バンド（重鎖および軽鎖を含むＩｇＧ１抗体）は、１５４ｋＤａで移動し、このバンドは誘導されたＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞では存在するが、誘導されたＢＬ２１細胞および非誘導細胞では有意に低減されまたは存在しない。
実施例２
細菌性の細胞で産生されるＩｇＧ１全長の抗体および発現コンストラクトの特徴づけ
Ａ．発現ベクターの特徴づけ
ｐＢＡＤ２４−ＨＣおよびｐＰＲＯ３３−ＬＣ発現コンストラクトの配列は、必要に応じて設計された他のプライマーとともに、ジデオキシチェインターミネーションシーケンス反応（chain-termination sequencing reaction）を開始するために、以下の表に示されるプライマーを使用することが確認される。米国特許第８１７８３３８Ｂ２号の図１Ｃに示されるように、ｐｒｐＢＣＤＥプロモーターのヌクレオチド配列およびＭＣＳの上流のｐＰＲＯ２４ベクターの領域が、ｐＰＲＯ発現ベクターのＭＣＳ内にクローン化される配列をコードする配列に対する少なくとも１つのフォワードオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために使用される。
Ｂ．ウエスタンブロットでのマウスＩｇＧ１全長の抗体の検出
実施例１に示されるように、電気泳動により抽出する可溶性のタンパク質を分離するために使用されるタンパク質ゲル（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４から１２％ビス−トリスゲルまたはＮｏｖｅｘ（登録商標）１０から２０％トリス−グリシンゲル）は、XCell II（商標）Blot Module (Life Technologies, Grand Island, New York)内に配置される。電流は、製造者の説明書に従って、ゲルにアプライされ、ゲルからニトロセルロース膜へのタンパク質の転写をもたらす。ニトロセルロース膜は、その後、一次抗体、抗マウスＩｇＧを用いて、４℃で一晩インキュベートされる。ニトロセルロース膜は、その後、非結合抗体を取り除くために洗浄され、二次抗体、アルカリホスファターゼに結合されたヤギ抗マウスＩｇＧを用いて、室温で１時間インキュベートされる。ニトロセルロース膜は、その後、非結合二次抗体を取り除くために洗浄され、タンパク質のバンド（複数を含む）染色するために、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−インドリル−ホスフェート（ＢＣＩＰ）を含む溶液を用いてインキュベートされ、その後、過剰な染色液を取り除くために洗浄される。
実施例３
共発現を促進するための宿主細胞内へのゲノム変異の導入
上記のように、宿主細胞の遺伝子発現におけるある変化は、所望の遺伝子産物（複数を含む）の共発現を向上し得る。以下の欠失および変異が、ゲノム配列をシームレスに取り除く、対抗選択による欠失として記載される、リコンビニアリング方法を用いて、Gene Bridges GmbH (Heidelberg, Germany)により、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ宿主細胞ゲノムにおいてなされた。宿主細胞のａｒａＢＡＤオペロンの欠失が、アラビノース誘導物質のより多くが、ａｒａＢＡＤプロモーターを含む発現コンストラクトから共発現される遺伝子産物の誘導を可能にするように、宿主細胞によるアラビノース異化反応を低減するためになされた。この欠失は、いくつかのコドンのＡｒａＤコード領域以外の全てを通る天然のａｒａＢＡＤプロモーターのほとんどが除去されるように、大腸菌ゲノム（ゲノムヌクレオチド配列内の位置は、表１におけるように全て付与される）の７０，１３５から６５，８６７（マイナス鎖）の位置に対応する、ａｒａＢＡＤオペロンの４２６９塩基対を除去する。欠失接合部（位置７０，１３６｜位置６５，８６６）の周囲のヌクレオチド配列（マイナス鎖）は、ＴＴＡＴ｜ＴＡＣＧである。別の欠失が、ｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨ（ｓｃｐＡ−ａｒｇＫ−ｓｃｐＢＣともよばれる）オペロン内でなされ、外因的に供給されたプロピオネートに対して、宿主細胞のプロピオネート誘導性プロモーターの感受性を増加させるために、２−メチルシトレートの生合成を伴う遺伝子の機能を排除した。ｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨ欠失は、５５４２塩基対（大腸菌ゲノムの位置３，０５８，７５４から３，０６４，２９５）を除去し、ｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨプロモーターおよびｙｇｆＨコード配列の最後のコドン以外の全てのオペロンを取り出し、一方、隣接するｙｇｆＩコード配列および停止コドンをそのまま残す。欠失接合部（位置３，０５８，７５３｜位置３，０６４，２９６）の周囲のヌクレオチド配列（プラス鎖）は、ＡＣＡＡ｜ＧＧＧＴである。大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ宿主細胞ゲノムでなされるこれらの欠失に加えて、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨは、位置３，４７２，５７４から３，４７２，２００までのマイナス鎖上に延びる、ゲノムｒｐｓＬ遺伝子コード配列における点突然変異を導入し、位置３，４７２，４４７でＡをＧに変更し、Ｌｙｓ４３のコドンをＡｒｇのコドンに変化させ、突然変異体ｒｐｓＬ−Ａｒｇ４３遺伝子が発現されるときにストレプトマイシン耐性表現型をもたらす。上記のような、より厳密な制御誘導性の発現を可能にする、宿主細胞ゲノムに対する別の変異は、アラビノースに応答性があるよりもむしろ常時発現のａｒａＥプロモーターを作成することである。ＣＲＰ−ｃＡＭＰおよびＡｒａＣ結合部位を含む、ほとんどの天然のａｒａＥプロモーターは、９７塩基対（位置２，９８０，３３５から２，９８０，２３９（マイナス鎖））を欠失させ、および常時発現のＪ２３１０４プロモーターの３５塩基対の配列を有するその配列を置換することにより取り除かれ、接合部の部位の配列、ＴＧＡＡ｜ＴＴＧＡ←Ｊ２３１０４プロモーター→ＴＡＧＣ｜ＴＴＣＡをもたらした。大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ宿主細胞のような大腸菌宿主細胞は、あらゆるこれらのゲノム変異、またはあらゆるそれらの組み合わせとともに、遺伝子産物の誘導性共発現において採用され得る。
実施例４
ヘムの存在下における、マンガンペルオキシダーゼおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの誘導性共発現
Ａ．発現ベクターの構造
マンガンペルオキシダーゼ（「ＭｎＰ」、マンガン依存性ペルオキシダーゼともよばれる）は、いくつかのタイプの真菌類が、リグニンを二酸化炭素に分解し、多種多様な有機汚染物質の酸化を媒介することを可能にする酵素である。マンガンペルオキシダーゼの一例は、白色腐朽菌類ファネロケーテ・クリソスポリウム（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１９１３６）のＨ４アイソザイム（本明細書では「ＭｎＰ−Ｈ４」と記載する）である。その機能的な形態では、ＭｎＰ−Ｈ４は、マンガンイオン（Ｍｎ２＋）、鉄を含有するヘム分子、および２つのカルシウムイオン（Ｃａ２＋）を伴い、また、ＭｎＰ−Ｈ４は、５つのジスルフィド結合を有する（Sundaramoorthy et al., "The crystal structure of manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium at 2.06-Åresolution", J Biol Chem 1994 Dec 30; 269(52): 32759-32767）。ＭｎＰ−Ｈ４酵素の熱失活は、ＭｎＰ−Ｈ４およびカルシウムイオン間の相互作用の喪失を伴う。ＭｎＰ−Ｈ４ Ａ４８Ｃ／Ａ６３Ｃ変異体のように、末端のカルシウム相互作用部位付近の２つの位置で別のアミノ酸にシステインを置換するために、アミノ酸配列ＭｎＰ−Ｈ４を変更することによりＭｎＰ−Ｈ４における追加のジスルフィド結合を作成することは、結果としてもたらされる、熱失活に対してより耐性のあるＭｎＰ−Ｈ４ Ａ４８Ｃ／Ａ６３Ｃ酵素を作成する（Reading and Aust, "Engineering a disulfide bond in recombinant manganese peroxidase results in increased thermostability", Biotechnol Prog 2000 May-Jun; 16(3): 326-333）。ジスルフィド結合の形成を促進する方法においてＭｎＰ−Ｈ４を発現するために、タンパク質が宿主細胞（大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ）の酸化する細胞環境で変化しないように、発現コンストラクトがシグナルペプチドを欠くＭｎＰ−Ｈ４酵素をコードして作成された。
シグナルペプチドがないＭｎＰ−Ｈ４のアミノ酸配列が配列番号１３として示され、Pease et al., "Manganese-dependent peroxidase from Phanerochaete chrysosporium. Primary structure deduced from cDNA sequence", J Biol Chem 1989 Aug 15; 264(23): 13531-13535に記載されるように、ＭｎＰ−Ｈ４タンパク質のこの形態は、全長のアミノ酸配列のＡ１４で開始する、予測される成熟したアミノ酸配列に結合される最初のメチオニン残基を有する。他の参照文献では、Sundaramoorthy et al., "The crystal structure of manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium at 2.06-Åresolution", J Biol Chem 1994 Dec 30; 269(52): 32759-32767のように、成熟したＭｎＰ−Ｈ４アミノ酸配列は、全長のアミノ酸配列のＡ２５で開始することが示される。配列番号１３のアミノ酸１３から３７０を含むタンパク質（より短い成熟したアミノ酸配列に対応する）は、また、本発明の方法により産生され、ある実施形態では、配列番号１３のアミノ酸１３から３７０に結合される最初のメチオニン残基を有し、よって、配列番号２３として示されるアミノ酸配列を有する。大腸菌におけるＭｎＰ−Ｈ４を形成する配列番号１３の発現について最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１４として示され、配列番号１４を含む発現コンストラクトは、ＭｎＰ−Ｈ４を発現するために本発明の方法において使用された。配列番号１４のヌクレオチド３７から１１１０は、より短いＭｎＰ−Ｈ４成熟アミノ酸配列（全長のアミノ酸配列のＡ２５で開始する）をコードし、配列番号１４のヌクレオチド３７から１１１０を含むポリヌクレオチドは、ＭｎＰ−Ｈ４タンパク質の産生について本発明のいくつかの実施形態で使用され、ある実施形態では、配列番号１４のヌクレオチド３７から１１１０のヌクレオチド配列の５’末端に結合される最初のメチオニン残基についてのＡＴＧコドンを含む。
同様の発現コンストラクトが、Ａ４８Ｃ／Ａ６３Ｃ ＭｎＰ−Ｈ４タンパク質に対応し、シグナルペプチド（配列番号１５として示されるアミノ酸配列、配列番号１６として示される最適化コード配列）を欠く、ＭｎＰ−Ｈ４タンパク質の発現のために作成される。より短い成熟したＭｎＰ−Ｈ４アミノ酸配列と比較して、配列番号１５における追加の１２のアミノ酸に起因して、アラニンからシステインへの変異が、配列番号１５にＡ６０Ｃ／Ａ７５Ｃとして示される。本発明の方法で使用される発現コンストラクトの追加の例は、配列番号１５を含むタンパク質、または配列番号１５のアミノ酸１３から３７０、または配列番号１５のアミノ酸１３から３７０と結合された最初のメチオニン残基をコードする。ある実施形態では、本発明の方法で使用される発現コンストラクトは、配列番号１６、または配列番号１６のヌクレオチド３７から１１１０、または配列番号１６のヌクレオチド配列３７から１１１０の５’末端に結語される最初のメチオニン残基についてのＡＴＧコドンを含む。ＭｎＰ−Ｈ４アミノ酸配列の別の変異は、全長アミノ酸配列の位置１０５で生じ、セリンがアスパラギンに変化する。本発明の方法は、配列番号１４または配列番号１６の位置２７８でＧがＡに変更されて、セリンについてのＡＧＣコドンがアスパラギンについてのＡＡＣコドンに変化しているヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトにより、この変異（配列番号１３または配列番号１５の位置９３でアスパラギンに変化するセリン）を有するＭｎＰ−Ｈ４タンパク質を産生するために使用される。
ＭｎＰ−Ｈ４におけるジスルフィド結合の形成を促進することに加えて、十分に活性化したＭｎＰ−Ｈ４酵素を産生するために、酵素は、ヘムの存在下で最適に発現される。大腸菌宿主細胞が、培地からヘミンのようなヘムを含有する分子を吸収することを可能にするために、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ ＣｈｕＡ外膜ヘミン−特異的受容体をコードするヌクレオチド配列もまた、ＭｎＰ−Ｈ４発現コンストラクトに含まれる。ＣｈｕＡポリペプチドは、大腸菌宿主細胞の外膜内に挿入されるように、天然の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株ＥＣ４１１３ ＣｈｕＡタンパク質（配列番号１７）のような、シグナルペプチドを含む、同じＮ末端アミノ酸配列を有する。ＣｈｕＡポリペプチド（配列番号１７）についての最適化されたコード配列は、配列番号１９の位置６８から２０４７で示される。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株ＥＣ４１１３由来の、配列番号１７に示されるＣｈｕＡアミノ酸配列は、配列番号１７の位置１０６でイソロイシン（ＣＦＴ０７３）に代えてバリン（ＥＣ４１１３）を有することにより、大腸菌ＣＦＴ０７３（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号１０３７１９６）由来のＣｈｕＡアミノ酸配列のそれとは異なる。ＣｈｕＡアミノ酸配列におけるＶ１０６Ｉの変化は、配列番号１９の位置３８３から３８５で、ＧＴＧ ＶａｌコドンにおけるＡＴＴまたはＡＴＣ Ｉｌｅコドンへの変化によりコードされ得る。ヘム関連タンパク質の発現において使用されるＣｈｕＡタンパク質のアミノ酸配列における他の変異は、例えば、配列番号１７の位置２５９でのグルタミン酸からグリシンへの変化（配列番号１９の位置８４２から８４４で、ＧＡＧ ＧｌｕコドンにおけるＧＧＴまたはＧＧＣ Ｇｌｙコドンへの変化によりコードされる）、または配列番号１７の位置２６２でグルタミン酸からアスパラギンへの変化（配列番号１９の位置８５１から８５３でＧＡＧ ＧｌｕコドンにおけるＧＡＴまたはＧＡＣ Ａｓｐコドンへの変化によりコードされる）を含む。
配列番号１８、１９、および２２に対応するポリヌクレオチドの合成および大腸菌における発現についての最適化が、ＤＮＡ２．０（Menlo Park, CA）により行われた。配列番号１８は、ＭｎＰ−Ｈ４タンパク質をコードし、誘導性プロモーターのようなプロモーターのすぐ下流に挿入されるように設計される。配列番号１８のヌクレオチド配列は、ＧＣＴＡＧＣ ＮｈｅＩ制限部位を有するその５’末端で開始し、配列番号１８のヌクレオチド７から１２でＡＧＧＡＧＧリボソーム結合部位、続いて、最適化された配列番号１８のヌクレオチド２１から１１３０でＭｎＰ−Ｈ４コード配列を有する。ＭｎＰ−Ｈ４停止コドンの下流は、配列番号１８の位置１１４２から１２７０の位置Ｂ００１５ダブルターミネーターであり、ＴＣＴＡＧＡ ＸｂａＩ制限部位が続く。Ｂ００１５ダブルターミネーターのヌクレオチド配列は、partsregistry.orgのウェブサイトから得られた。配列番号１９はＣｈｕＡをコードし、構成的プロモーターを含み、そのためＣｈｕＡについてのこの発現コンストラクトは、あらゆる発現ベクターにまたは宿主細胞ゲノム内に配置され得、ＣｈｕＡコード配列は、Ｊ２３１０４構成的プロモーターの制御下で配置されたので、その転写はもはやＦｕｒによる抑制に供されなかった。本実施形態では、配列番号１９は、ＴＣＴＡＧＡ ＸｂａＩ制限部位によりその５’末端で開始し、配列番号１８の配列に対する発現ベクター３’内に配置されるように設計される。配列番号１９のヌクレオチド７から４１はＪ２３１０４構成的プロモーターであり、配列番号１９のヌクレオチド５０から６１はＢ００３４リボソーム結合部位であり、両方が配列番号１９のヌクレオチド６８から２０４７でＣｈｕＡのコード配列の上流に配置され、Ｊ２３１０４およびＢ００３４のヌクレオチド配列は、partsregistry.orgのウェブサイトから得られた。配列番号１９は、ＧＴＣＧＡＣ ＳａｌＩ制限部位により終了する。配列番号１８および配列番号１９におけるＸｂａＩ部位は、これらのヌクレオチド配列がＸｂａＩ部位でとともに結合されることを可能にし、結果として得られるＭｎＰ−Ｈ４ ＣｈｕＡ発現コンストラクトのヌクレオチド配列が配列番号２０に示される。配列番号１８および配列番号１９におけるＮｈｅＩおよびＳａｌＩ部位は、それぞれ、および配列番号２０において、ＭｎＰ−Ｈ４ ＣｈｕＡ発現コンストラクトが、そのマルチクローニングサイトでＮｈｅＩおよびＳａｌＩ制限部位を用いてｐＰＲＯ３３のような発現ベクター内に挿入されることを可能にする。
正しく折り畳まれたＭｎＰ−Ｈ４酵素の産生を促進するために、ＭｎＰ−Ｈ４は、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、好熱性、セルロース分解性、および腐生性土壌糸状菌（saprophytic soil hyphomycete）(軟腐カビ（soft-rot fungus）)由来のシャペロンタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（「ＰＤＩ」）により共発現された。ＰＤＩのアミノ酸配列は、配列番号２１に示されるように、共発現され、ＭｎＰ−Ｈ４ポリペプチドが産生されるときに、宿主細胞の細胞質に残るように、天然のタンパク質のシグナルペプチドを欠く。ＰＤＩをコードするヌクレオチド配列は、また、大腸菌における発現のために最適化され、ＰＤＩの発現コンストラクトは、配列番号２２として示される。配列番号２２は、その５’末端にＧＣＴＡＧＣ ＮｈｅＩ制限部位、ヌクレオチド７から１２でＡＧＧＡＧＧリボソーム結合部位、ヌクレオチド２１から１４７８でＰＤＩコード配列、およびその３’末端でＧＴＣＧＡＣ ＳａｌＩ制限部位を含む。配列番号２２のヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターのように、プロモーターのすぐ下流で挿入されるように設計された。配列番号２２におけるＮｈｅＩおよびＳａｌＩ制限部位は、ｐＢＡＤ２４発現ベクターのマルチクローニングサイト内に挿入するために使用された。
配列番号２０および配列番号２２、並びにｐＰＲＯ３３およびｐＢＡＤ２４ベクターを含む合成された発現コンストラクトは、ＮｈｅＩおよびＳａｌＩ制限酵素により切断され、合成された発現コンストラクトフラグメントは、すぐ上におよび実施例１に記載されているように、ｐＰＲＯ３３−ＭｎＰ−ＣｈｕＡおよびｐＢＡＤ２４−ＰＤＩを作成するためにベクター内で結合された。大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞（New England Biolabs (または「ＮＥＢ」), Ipswich, Massachusetts）は、結果としてもたらされる発現ベクター（ｐＰＲＯ３３−ＭｎＰ−ＣｈｕＡおよびｐＢＡＤ２４−ＰＤＩ）で、ヒートショック方法を用いて、同時形質転換された。
Ｂ．細菌性の細胞におけるマンガンペルオキシダーゼおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの誘導性共発現
ｐＰＲＯ３３−ＭｎＰ−ＣｈｕＡおよびｐＢＡＤ２４−ＰＤＩ発現ベクターにより同時形質転換される宿主細胞（ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ｐＰＲＯ３３−ＭｎＰ−ＣｈｕＡ／ｐＢＡＤ２４−ＰＤＩ）細胞）が、それぞれ、５ｍｌのＬＢ培地プラス３４マイクログラム／ｍＬＣＡＭおよび１００マイクログラム／ｍＬＡＭＰを含む、４つの振盪チューブに播種されるために使用された。１６時間のインキュベーション後（３０℃、２５０ＲＰＭでの回転振盪）、細胞は、４℃で１０分間、４０００ｒｐｍでスピンされ、ＬＢ培地がデカントして出され、細胞は、カザミノ酸および０．２％グリセロールを有する４×４００マイクロリットルのＭ９最少培地、プラス３４マイクログラム／ｍＬのＣＡＭおよび１００マイクログラム／ｍＬのＡＭＰ（「Ｍ９−ＣＡ−ｇｌｙ＋ＣＡＭ＋ＡＭＰ」）で、再懸濁された。その後、組み合わされた量の１．６ｍｌの再懸濁された細胞のうち７５マイクロリットルが、５ｍｌのＭ９−ＣＡ−ｇｌｙ＋ＣＡＭ＋ＡＭＰを含む１０の振盪チューブにそれぞれ添加され、得られた培養のＯＤ６００が０．６となるように測定された。ヘミン（Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri）が、チューブ１、非誘導の対照以外の全てのチューブにおいて、最終濃度の８マイクロモル濃度に添加された。Ｌ−アラビノースおよびプロピオネート誘導物質が、以下の濃度におけるチューブ２から１０に添加された。
チューブ１：非誘導（ヘミンなし、プロピオネートなし、アラビノースなし）
チューブ２：５０ｍＭプロピオネート ０．００２％アラビノース
チューブ３：２５ｍＭプロピオネート ０．００２％アラビノース
チューブ４：１２．５ｍＭプロピオネート ０．００２％アラビノース
チューブ５：５０ｍＭプロピオネート ０．０１％アラビノース
チューブ６：２５ｍＭプロピオネート ０．０１％アラビノース
チューブ７：１２．５ｍＭプロピオネート ０．０１％アラビノース
チューブ８：５０ｍＭプロピオネート ０．０５％アラビノース
チューブ９：２５ｍＭプロピオネート ０．０５％アラビノース
チューブ１０：１２．５ｍＭプロピオネート ０．０５％アラビノース
細胞は、回転振盪しながら２５℃で１２時間誘導され、その後、スピンダウンされて、−８０℃のフリーザに置かれた。細胞のペレットは、氷上で溶かされ、細胞がQproteome Bacterial Lysisキット(QIAGEN）を用いて、製造者の説明書に従って溶解され、プロテアーゼインヒビター反応混液（Protease Inhibitor Cocktail）は添加されず、サンプルは４℃で遠心分離された。誘導された細胞および非誘導の対照から抽出する可溶性のタンパク質は、１０％ビス−トリスゲル（Life Technologies, Grand Island, New York）上で、還元条件下でＳＤＳゲル電気泳動により分離された。ゲルは、ＲＡＰＩＤステイン（商標）（G-Biosciences）を用いて染色された。図５に示されるように、誘導された細胞由来のライセートは、ＰＤＩ（５３ｋＤａ）およびＭｎＰ−Ｈ４（３９ｋＤａ）に対応するタンパク質を含み、これらのタンパク質が、細菌性の細胞における可溶性のタンパク質として発現されることを示した。可溶性のＭｎＰ−Ｈ４の最大量は、５０ｍＭプロピオネートおよび０．００２％アラビノース（レーン２）を用いる誘導により産生された。
Ｃ．タンパク質ジスルフィドイソメラーゼとともにマンガンペルオキシダーゼの代替的な成熟形態の誘導性共発現、およびＭｎＰ−Ｈ４活性の測定
発現ベクターは、ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴとして言及され、Sundaramoorthy et al., 1994（上記に引用される）に記載されるようにＭｎＰ−Ｈ４タンパク質の成熟したバージョンに対応する、より十分に切断されたバージョンのＭｎＰ−Ｈ４を発現するために調製された。ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴアミノ酸配列は、よって、配列番号１３のアミノ酸１３から３７０に結合される最初のメチオニン残基を有し、配列番号２３として提供される。本実験においては、大腸菌における発現のために最適化されたＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴコード配列（上記のように、最適化されたＭｎＰ−Ｈ４コード配列由来）、およびＣｈｕＡコード配列は、ｐＢＡＤ２４ベクターで発現され、ＰＤＩコード配列（上記のように、同様に大腸菌における発現のために最適化された）は、ｐＰＲＯ３３ベクターで発現された。ｐＢＡＤ２４−ＭｎＰ＿ＦＴ−ＣｈｕＡ発現コンストラクトが、配列番号２４および２５のフォワードおよびリバースプライマーをそれぞれ用いて、ＭｎＰ−Ｈ４コード配列および配列番号１８のヌクレオチド配列を含むテンプレート由来のターミネーターをＰＣＲ増幅することにより調製された。配列番号２４のフォワードプライマーの使用は、配列番号１３のアミノ酸１３から３７０についてのコード配列のすぐ上流にＮｃｏＩ制限部位およびＡＴＧコドンを配置し、その後、配列番号２３のＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴアミノ酸配列についてのコード配列を作成する。ＣｈｕＡ発現コンストラクトの配列は、配列番号２６および２７のフォワードおよびリバースプライマーをそれぞれ用いて、配列番号１９のヌクレオチド配列を含むテンプレートからＰＣＲ増幅された。ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴおよびＣｈｕＡのＰＣＲ産物は、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで、並びにＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでそれぞれ切断され、ゲル精製されて、ｐＢＡＤ２４ベクター内にともに結合され、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断され、ＣＩＰ処理され、およびゲル精製された。結合されたｐＢＡＤ２４−ＭｎＰ＿ＦＴ−ＣｈｕＡ産物は、ｐＢＡＤプロモーターから発現されるＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴコード配列を含み、Ｂ００１５ダブルターミネーター、Ｊ２３１０４常時発現プロモーター、Ｂ００３４リボソーム結合部位、およびＣｈｕＡタンパク質コード配列が続いた。このｐＢＡＤ２４−ＭｎＰ＿ＦＴ−ＣｈｕＡ発現コンストラクトは、配列番号２８で提供されるヌクレオチド配列を有する。
ｐＰＲＯ３３−ＰＤＩ発現コンストラクトは、上記のような大腸菌における発現のために最適化され、配列番号２２のヌクレオチド配列を含む、ｐＰＲＯ３３ベクターおよびＰＤＩ発現コンストラクトをＮｈｅＩおよびＳａｌＩにより切断すること、切断されたｐＰＲＯ３３ベクターをＣＩＰで処理すること、フラグメントをゲル精製すること、およびともにそれらを結合することにより作成された。結果として得られたｐＰＲＯ３３−ＰＤＩ発現コンストラクトは、配列番号２９で提供されるヌクレオチド配列を有する。ｐＢＡＤ２４−ＭｎＰ＿ＦＴ−ＣｈｕＡおよびｐＰＲＯ３３−ＰＤＩ発現コンストラクトは、ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ｐＢＡＤ２４−ＭｎＰ＿ＦＴ−ＣｈｕＡ／ｐＰＲＯ３３−ＰＤＩ）細胞を形成するために、３７℃で一晩、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞（ＮＥＢ）を同時形質転換するために使用された。
ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ｐＢＡＤ２４−ＭｎＰ＿ＦＴ−ＣｈｕＡ／ｐＰＲＯ３３−ＰＤＩ）および対照ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ｐＢＡＤ２４／ｐＰＲＯ３３）細胞が、５ミリリットルのＬＢ培地＋ＣＡＭ（３４マイクログラム／ミリリットル）＋ＡＭＰ（１００マイクログラム／ミリリットル）を播種するために使用され、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。細胞は、４℃で１０分間、４０００ｒｐｍでスピンダウンされ、まず、４００マイクロリットルのＭ９最小（ＣＡ＿グリセロールなし：炭素源としてのカザミノ酸はあるが、グリセロールなし）＋ＣＡＭ＋ＡＭＰ培地で再懸濁され、その後、７５マイクロリットルのそれが、５ミリリットルのＭ９（ＣＡ＿グリセロールなし）最少培地＋ＣＡＭ＋ＡＭＰに添加された。培養後に、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で増殖され、０．６のＯＤ６００に達すると、１０の一定分量のＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ｐＢＡＤ２４−ＭｎＰ＿ＦＴ−ＣｈｕＡ／ｐＰＲＯ３３−ＰＤＩ）細胞が採取されて、ヘミンの濃度並びにアラビノースおよびプロピオネート誘導物質の濃度を異ならせて誘導された。サンプル１、対照は、ヘミンなし、誘導物質なしであり、残りの９つのサンプルは、最終濃度が８マイクロモル濃度に添加されたヘミン、０．０２５％、０．０５％、または０．１％のアラビノース濃度、および１２．５ｍＭ、２５ｍＭ、または５０ｍＭのプロピオネート濃度を有した。対照のＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ｐＢＡＤ２４／ｐＰＲＯ３３）細胞（挿入なし）は、また、「誘導」サンプルおよび非誘導の対照サンプルとともに、誘導プロセスに含まれた。細胞は、２５０ｒｐｍで振盪しながら２５℃で１２時間誘導され、その後、スピンダウンされて、−８０℃で保存された。誘導された共発現により産生されたタンパク質を可視化するために、凍結された細胞ペレットは、説明書に従って、Qproteome Bacterial Lysisキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて溶かされて溶解されたが、溶解バッファの３５マイクロリットルを細菌培養の各１マイクロリットルに使用した。ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ｐＢＡＤ２４−ＭｎＰ＿ＦＴ−ＣｈｕＡ／ｐＰＲＯ３３−ＰＤＩ）誘導細胞および非誘導の対照から抽出された可溶性のタンパク質は、１０％ビス−トリスゲル上で、還元条件下でＳＤＳゲル電気泳動により分離され、サンプルは、ゲル上にロードされる前に、７０℃で１０分間加熱された。ＲＡＰＩＤ染色（商標）（ゲルは示されない）によるゲル染色後に、非誘導の対照以外の全ての誘導されたサンプルにおけるＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴおよびＰＤＩに対応する可視的なバンドがあり、ゲル上の明らかな密度のバントが、０．１％アラビノースおよび５０ｍＭプロピオネートの組み合わせが最もＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴタンパク質を産生すること、およびより高いアラビノース濃度が、概して、より多くのＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴを産生するが、より低いアラビノース濃度は、概して、より多くのＰＤＩを産生し、おそらくアラビノースによるプロピオネートプロモーターのカタボライト抑制に起因することを示した。
誘導性共発現により産生されるＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴの活性化レベルを測定するために、０．１％アラビノースおよび５０ｍＭプロピオネートでの、ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴタンパク質の共発現由来の、０．５ミリリットルの可用性細胞の溶解分画が、０．５ミリリットルの２０，０００ＭＷＣＯ（分画分子量）Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham MA)を用いて、１０ミリモル濃度の酢酸ナトリウム、５ミリモル濃度のＣａＣｌ２、ｐｈ４．５に対して透析された。サンプルは、４℃で２時間透析され、バッファを新鮮なバッファに替えて、透析を４℃で一晩継続した。透析の最後にタンパク質の析出があるが、ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴタンパク質は、ゲル電気泳動により、および比色酵素活性分析により示されるように、可溶性で活性化したままであった。ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ｐＢＡＤ２４−ＭｎＰ＿ＦＴ−ＣｈｕＡ／ｐＰＲＯ３３−ＰＤＩ）非誘導の対照細胞から、および非挿入のＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ｐＢＡＤ２４／ｐＰＲＯ３３）誘導および非誘導の対照細胞から得られる、可溶性タンパク質分画とともにＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴを含む、透析されたタンパク質サンプルは、１０％ビス−トリスゲル上で還元条件下でＳＤＳゲル電気泳動により分離され、サンプルは、ゲル上にロードする前に１０分間７０℃で加熱された。図６に示されるように、ＲＡＰＩＤステイン（商標）によりゲルを染色した後に、ＰＤＩ（５４ｋＤａ）およびＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴ（３８ｋＤａ）に対応するバンドが、０．１％アラビノースおよび５０ｍＭプロピオネートにおける共発現により産生される、透析されたタンパク質サンプルにおいて明らかに可視的であり（図６、レーン２）、対照サンプル（レーン３のＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ(ｐＢＡＤ２４−ＭｎＰ＿ＦＴ−ＣｈｕＡ／ｐＰＲＯ３３−ＰＤＩ）非誘導対照、レーン４の非挿入の誘導された対照、レーン５の非挿入の非誘導対照のいずれも可視的ではない。誘導性共発現により産生されるＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴタンパク質の酵素活性は、以下の実施例４のセクションＥで記載される、比色マンガンペルオキシダーゼ分析を用いて分析され、共発現されたＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴタンパク質は、陽性対照ＭｎＰサンプルのそれに対して比較可能なマンガンペルオキシダーゼ活性を有することが示された。
Ｄ．マンガンペルオキシダーゼの産生および精製
ＭｎＰ−ＣｈｕＡおよびＰＤＩ発現ベクターにより同時形質転換された宿主細胞は、クロラムフェニコールおよびアンピシリンを含むＬＢプレートに画線される。単一のコロニーが選択され、それぞれが１５ｍｌのＬＢ＋ＣＡＭ＋ＡＭＰ培地を含む振盪チューブに播種するために使用される。固定相培養を生成するための十分な長さの時間のインキュベーション（３０〜３７℃で、２５０ＲＰＭで回転振盪とともに）後に、成功的な増殖を有する各チューブから５ｍｌが、１００ｍｌのＬＢ＋ＣＡＭ＋ＡＭＰ培地を含むＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振盪フラスコに播種するために使用される。固定相培養を生成するのに十分なさらなるインキュベーション（３０〜３７℃で、２５０ＲＰＭで回転振盪とともに）後に、各振盪フラスコからのサンプルが、適切な細胞密度かについて確認される。振盪フラスコからの適切な量が、滅菌されてｐＨ較正されたバイオリアクタ内に導入され、攪拌しながら３０〜３７℃で増殖させ、一定期間の増殖後に、細胞が約０．５のＯＤ６００に達するまで、ヘミンまたは他のヘムのソースを含む培地で細胞が増殖される。細胞は、その後、アラビノースおよびプロピオネート、例えば、０．０２％アラビノースおよび５０ｍＭプロピオネートを添加することにより、または実施例７の滴定方法により測定されるように、誘導され、攪拌しながら２５から３０℃で増殖が継続される。インキュベーション後に、細胞は、増殖培地から回収され、溶解され、溶解上清（可溶性タンパク質抽出物）が収集される。ＭｎＰ−Ｈ４タンパク質は、サイズ排除カラムまたはイオン交換カラムとともに高速蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）のような方法を用いて可溶性タンパク質抽出物から精製される。
Ｅ．マンガンペルオキシダーゼ活性についての分析
サンプルにおけるマンガンペルオキシダーゼ活性の量、従って、活性化マンガンペルオキシダーゼの濃度は、マンガンおよび過酸化水素の存在下で、コエルリグノン（coerulignone）に２，６−ジメトキシフェノール（２，６−ＤＭＰ）を酸化するための性能についてそれを試験することにより測定され得る。以下の分析が１０マイクロリットルのサンプルについてであり、１マイクロリットルサンプルの代替量は括弧中に示される。以下の０．５９０ｍｌのｄＨ２Ｏ（０．５９９ｍｌのｄＨ２Ｏ）；０．１ｍｌマロン酸ジナトリウム塩一水和物（ＭＤＳＨ）溶液（６０ｍｌのｄＨ２Ｏ，ｐＨ４．５における５ｇのＭＤＳＨ）；および０．１ｍｌのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ溶液（９０ｍｌのｄＨ２Ｏにおける０．０６ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ）が、サンプルの添加前に、分光光度計キュベットに添加される。測定の直前に、０．１ｍｌの２，６−ＤＭＰ溶液（９０ｍｌのｄＨ２Ｏにおける０．０１４ｇの２，６−ジメトキシフェノール）および１０マイクロリットル（１マイクロリットル）サンプルがキュベットに添加される。キュベットは、分光光度計に配置され、４６９ｎｍでゼロに合わせられ、０．１ｍｌの新鮮なＨ２Ｏ２（３０ｍｌのｄＨ２Ｏにおける３．４マイクロリットル３０％Ｈ２Ｏ２）が、その後、キュベットに添加される。キュベットの内容物は、３回のピペッティングの上下により混合される。Ｈ２Ｏ２の追加後の１分で、４６９ｎｍでＯＤが測定される。ＯＤが０．２より大きい場合、サンプルのサイズは１マイクロリットルに減少され、または測定されるサンプルは希釈され、ＯＤが０．００５未満である場合、サンプルサイズは０．１ｍｌに増加され、ｄＨ２Ｏの量は０．５００ｍｌに減少され、全ての他の量は同じままにし、分析は、その後、繰り返される。
測定された吸光度は、以下の式に従って、ユニット／Ｌにおける酵素濃度（ＥＣ）を算出するために使用される：
ＥＣ［Ｕ／Ｌ］＝（吸光度）（分析量［ｍｌ］）（１０６μｍｏｌ／ｍｏｌ）（１ｃｍ）／［（ε１ｃｍ）＊（サンプル量［ｍｌ］）］
ここで、ε１ｃｍ＝４９６００吸光度／Ｍ・ｃｍ・ｍｉｎおよび経路長＝１ｃｍである。上記で計算された酵素濃度は、以下の式に従って、ｍｇ／Ｌに換算される：ＥＣ［ｍｇ／Ｌ］＝酵素濃度［Ｕ／Ｌ］／酵素特異的活性［Ｕ／ｍｇ］、
ここで、ＭｎＰについての標準的な酵素特異的活性は、１６０Ｕ／ｍｇである。酵素特異的活性は、ｍｇ／Ｌで、サンプルにおけるタンパク質の濃度を個別に測定することにより、例えば、２８０ｎｍで分光光度的な分析により、あらゆるＭｎＰサンプルについて算出される。酵素濃度（ＥＣ）が上記２，６−ＤＭＰ酸化分析を用いて測定され、Ｕ／ｍｇでの特異的活性が、ＥＣ［Ｕ／Ｌ］／濃度［ｍｇ／Ｌ］＝特異的活性［Ｕ／ｍｇ］として算出される。
実施例５
インフリキシマブの誘導性共発現
インフリキシマブは、ＴＮＦアルファ、炎症性サイトカインに結合するキメラモノクローナル抗体であり、自己免疫疾患（クローン病、リウマチ性関節炎、乾癬等）のようなＴＮＦアルファを伴う症状の治療において使用される。インフリキシマブは、重鎖（配列番号３０として示されるアミノ酸配列）および軽鎖（配列番号３１として示されるアミノ酸配列）から形成され、これらの鎖のそれぞれは、マウス抗ＴＮＦアルファ抗体の可変ドメイン配列、およびヒト定常ドメインを有する。大腸菌における発現のためのコドン最適化および配列番号３０および３１をコードするポリヌクレオチドの合成は、ＤＮＡ２．０（Menlo Park, CA）により行われた。ｐＢＡＤ２４発現ベクターのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）内にインフリキシマブ重鎖についての最適化コード配列を結合することにより形成される発現コンストラクトは、ｐＢＡＤ２４−インフリキシマブ＿ＨＣであり、配列番号３２として示されるヌクレオチド配列を有する。ｐＰＲＯ３３発現ベクターのＭＣＳ内にインフリキシマブ軽鎖についての最適化コード配列を結合することにより形成される発現コンストラクトは、ｐＰＲＯ３３−インフリキシマブ＿ＬＣであり、配列番号３３で示されるヌクレオチド配列を有する。ｐＢＡＤ２４−インフリキシマブ＿ＨＣおよびｐＰＲＯ３３−インフリキシマブ＿ＬＣ発現コンストラクトは、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞（ＮＥＢ）を、３７℃で一晩形質転換するために使用され、ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ｐＢＡＤ２４−インフリキシマブ＿ＨＣ／ｐＰＲＯ３３−インフリキシマブ＿ＬＣ）細胞を作成する。これらの細胞は、概して、実施例１および４に記載されるように増殖され、鉄が好ましいが、任意に、例えば、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏの形態で１リットル当たり３．０ミリグラムの濃度でＬＢ増殖培地に添加される場合を除いて、必要に応じて、アンピシリンおよび／またはクロラムフェニコールのような選択的な化合物の追加を含む。細胞は、スピンダウンされて、Ｍ９培地で再懸濁され、好ましいが任意に、カザミノ酸（炭素源となるとともに、必須アミノ酸を提供する）とともに炭素源として追加されるアセテート（例えば、０．２７％酢酸ナトリウム（Ｃ２Ｈ３Ｏ２Ｎａ））を伴い、また、好ましいが任意に、上記のような培地の鉄補充を伴い、培養の光学的密度（ＯＤ６００）が０．８に達するまで増殖させる（Paliy and Gunasekera, "Growth of E. coli BL21 in minimal media with different gluconeogenic carbon sources and salt contents", Appl Microbiol Biotechnol 2007 Jan; 73(5): 1169-1172; Epub 2006 Aug 30; Erratum in: Appl Microbiol Biotechnol 2006 Dec; 73(4): 968参照）。そのポイントで、細胞が、アラビノース（最初に、０．１％を含む濃度で）およびプロピオネート（最初に、５０ｍＭを含む濃度で）の添加により誘導される。アラビノースおよびプロピオネートの濃度の調節が、実施例７に記載されるようになされ得、産生されるインフリキシマブ抗体は、実施例９から実施例１１に記載されるように精製されまたは特徴づけられる。
実施例６
酵母細胞におけるタンパク質の誘導性共発現
ＰＤＩを有するＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴの酵母宿主細胞における誘導性共発現についての発現コンストラクトおよびマウスの抗ヒトＣＤ１９ＩｇＧ１抗体重鎖および軽鎖の発現コンストラクトは、GenWay Biotech Inc.（San Diego CA）により行われた以下の方法により作成された。ｐＪ１２３１−０３ＣおよびｐＪ１２３４−０３Ｃベクター（ＤＮＡ２．０, Menlo Park, CA）が、それらが、ｐＪ１２３１−０３ＣにおけるＫａｎＲ（大腸菌）およびＬｅｕ２（酵母）；ｐＪ１２３４−０３ＣにおけるＡｍｐＲ（大腸菌）およびＵｒａ３（酵母）のいずれかにおいて有用な選択的なマーカーとともに、大腸菌（ｐＵＣ複製起点）またはサッカロマイセス・セレビシエの（２ミクロンサークルの複製起点）のいずれかの宿主におけるプラスミド保持のために必要な要素を含む場合に、酵母発現コンストラクトの主鎖部分として使用された。ｐＪ１２３１−０３ＣおよびｐＪ１２３４−０３Ｃベクターのヌクレオチド配列は、配列番号３４および３５としてそれぞれ示される。ｐＪ１２３１−０３ＣおよびｐＪ１２３４−０３Ｃベクターは、ＢｆｕＡ１制限エンドヌクレアーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｒ０７０１Ｓ）で処理され、ＢｆｕＡ１消化後に保持されなかったベクターのフラグメントは、発現プロモーター、ＤａｓｈｅｒＧＦＰコード配列、およびＣＹＣ１ターミネーター配列を含む。ＰＣＲが、ＢｆｕＡ１−ｃｕｔ ｐＪ１２３１−０３ＣおよびｐＪ１２３４−０３Ｃベクター内にその後結合される配列を作成するために発現されるポリペプチドについてのコード配列の生成を含む４つの発現コンストラクトで行われた。全てのＰＣＲ反応が、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Life Technologies,Grand Island, New York,カタログ番号１１７０８０２１）を用いて行われ、ＱＩＡＥＸＩＩ ＤＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，カタログ番号２００５１）が、製造者の説明書にしたがって、ＰＣＲ産物およびベクターフラグメントの精製のために使用された。
ＡｒａＣコード配列、ｐＢＡＤアラビノース誘導性プロモーター、並びにＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴおよびＣｈｕＡコード配列を含む、ｐＢＡＤ２４−ＭｎＰ＿ＦＴ−ＣｈｕＡ発現コンストラクト（配列番号２８）は、ベクター内のクローニングのためのＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴコード配列およびＣｈｕＡコード配列、並びにＢｓａＩ制限部位のＣ末端で６ｘＨｉｓタグを追加するために、２つの別個のＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用される。（好ましいが任意に、ＣｈｕＡコード配列が、そのＣ末端でＨｉｓタグを添加することで変異されない；これは、配列番号３９のそれであるが、配列番号３９の塩基２１から３８がないものに対する配列に似ているプライマーを用いることにより達成され得る。）これらの２つのＰＣＲ反応で使用されるプライマーは、（１）ＢｓａＩ−ＡｒａＣ−ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴプライマー（配列番号３６）およびＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴ−６ｘＨｉｓ−リバースプライマー（配列番号３７）、並びに（２）ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴ−６ｘＨｉｓ−フォワードプライマー（配列番号３８）およびＣｈｕＡ−６ｘＨｉｓ−ＢｓａＩプライマー（配列番号３９）である。さらなるＰＣＲ反応が、その後、ＢｓａＩ（ＮＥＢ，カタログ番号Ｒ０５３５Ｓ）で精製されて切断され、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１５２２４０２５）を用いてＢｆｕＡ１−ｃｕｔ ｐＪ１２３１−０３Ｃベクター内に結合されて、単一の産物（ＡｒａＣ−ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴ−ＣｈｕＡ、配列番号４０）を作成するために、ＢｓａＩ−ＡｒａＣ−ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴおよびＣｈｕＡ−６ｘＨｉｓ−ＢｓａＩプライマーを用いて、２つの精製されたＰＣＲ産物上で行われ、ｐＪ１２３１−ＡｒａＣ−ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴ−ＣｈｕＡ発現コンストラクトを作成する。（好ましくは、ＢｓａＩ−ｃｕｔ ＡｒａＣ−ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴ−ＣｈｕＡフラグメントは、また、ＢｆｕＡ１−ｃｕｔ ｐＪ１２３４−０３Ｃベクター内に結合されて、ｐＪ１２３４−ＡｒａＣ−ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴ−ＣｈｕＡ発現コンストラクトを作成する。）
ＰｒｐＲコード配列、ｐＰＲＯプロピオネート誘導性プロモーター、およびＰＤＩコード配列を含む、ｐＰＲＯ３３−ＰＤＩ発現コンストラクト（配列番号２９）が、ＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用され、ＰＤＩコード配列のＣ末端で５ｘＨｉｓタグ、およびベクター内でクローニングするためのＢｓａＩ制限部位を加えた。（好ましいが任意に、ＰＤＩコード配列は、そのＣ末端でＨｉｓを添加することで変異されない；これは、配列番号４２のそれであるが、配列番号４２の塩基２１から３５がないものに対する配列に似ているプライマーを用いることにより達成され得る。）このＰＣＲ反応で使用されるプライマーは、ＢｓａＩ−ＰｒｐＲ−ＰＤＩプライマー（配列番号４１）およびＰＤＩ−５ｘＨｉｓ−ＢｓａＩプライマー（配列番号４２）であって、ｐＪ１２３１−ＰｒｐＲ−ＰＤＩ発現コンストラクトを作成するために、精製され、ＢｓａＩで切断され、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてＢｆｕＡ１−ｃｕｔ ｐＪ１２３１−０３Ｃベクター内に結合されたＰＣＲ産物（ＰｒｐＲ−ＰＤＩ，配列番号４３）を作成した。（好ましくは、ＢｓａＩ−ｃｕｔ ＰｒｐＲ−ＰＤＩフラグメントは、また、ｐＪ１２３４−ＰｒｐＲ−ＰＤＩ発現コンストラクトを作成するためにＢｆｕＡ１−ｃｕｔ ｐＪ１２３４−０３Ｃベクター内に結合される。）
マウスの抗ヒトＣＤ１９ＩｇＧ１重鎖およびマウスの抗ヒトＣＤ１９ＩｇＧ１軽鎖−ｐＢＡＤ２４−ＨＣおよびｐＰＲＯ３３−ＬＣをコードする発現コンストラクトは、各コード配列からシグナル配列を取り除くため、およびベクター内でクローニングするＢｓａＩ制限部位を追加するために、２つの別個の各ＰＣＲ反応において、テンプレートとしてそれぞれ使用された。ｐＢＡＤ２４−ＨＣに関し、これらの２つのＰＣＲ反応において使用されるプライマーは、（１）ＢｓａＩ−ＡｒａＣ−ＨＣ−フォワードプライマー（配列番号４４）およびＨＣ−リバースプライマー（配列番号４５）、並びに（２）ＨＣ−フォワードプライマー（配列番号４６）およびＨＣ−ＢｓａＩ−リバースプライマー（配列番号４７）であった。ｐＰＲＯ３３−ＬＣに関し、これらの２つのＰＣＲ反応において使用されるプライマーは、（１）ＢｓａＩ−ＰｒｐＲ−ＬＣ−フォワードプライマー（配列番号４８）およびＬＣ−リバースプライマー（配列番号４９）、並びに（２）ＬＣ−フォワードプライマー（配列番号５０）およびＬＣ−ＢｓａＩ−リバースプライマー（配列番号５１）であった。これらの反応におけるＢｓａＩ−ＡｒａＣ−ＨＣ−フォワードプライマー（配列番号４４）およびＢｓａＩ−ＰｒｐＲ−ＬＣ−フォワードプライマー（配列番号４８）の使用は、ＨＣ＿ＮＳ（シグナルなし）およびＬＣ＿ＮＳとして言及される、シグナル配列を欠くＨＣおよびＬＣコード配列をもたらし、変更されたＨＣ＿ＮＳコード配列は、配列番号２のアミノ酸２０から４６４がその後に続く、最初のメチオニン残基を有するＨＣ＿ＮＳポリペプチドをもたらし、変更されたＬＣ＿ＮＳコード配列は、アラニン残基およびその後の配列番号４のアミノ酸２１から２３９がその後に続く、最初のメチオニン残基を有するＬＣ＿ＮＳポリペプチドをもたらす。さらなるＰＣＲ反応が、その後、ＢｓａＩ−ＡｒａＣ−ＨＣ−フォワードおよびＨＣ−ＢｓａＩ−リバースプライマーをそれぞれ用いて、それぞれ精製され、ＢｓａＩで切断され、およびＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてＢｆｕＡ１−ｃｕｔ ｐＪ１２３１−０３Ｃベクター（ＰｒｐＲ−ＬＣ＿ＮＳ）またはＢｆｕＡ１−ｃｕｔ ｐＪ１２３４−０３Ｃベクター（ＡｒａＣ−ＨＣ＿ＮＳ）内に結合された、２つの個々の産物（ＡｒａＣ−ＨＣ＿ＮＳ，配列番号５２、およびＰｒｐＲ−ＬＣ＿ＮＳ，配列番号５３）を作成するために、２つの精製されたＰＣＲ産物の各セットで行われ、ｐＪ１２３１−ＰｒｐＲ−ＬＣ＿ＮＳおよびｐＪ１２３４−ＡｒａＣ−ＨＣ＿ＮＳ発現コンストラクトを作成した。
リガーゼ混合物が大腸菌ＤＨ５アルファ細胞内に形質転換され、ＤＨ５アルファ細胞においてプラスミドを維持するために十分な量のカナマイシンまたはアンピシリンを含むＬＢ寒天平板培地に配置される。プラスミドＤＮＡの調製は、標準的な方法に従って行われた。（任意であるが好ましくは、調製されたプラスミドＤＮＡは、プラスミドインサートの配列を確認するためのシーケンス反応において使用される。）
形質転換受容性のあるＩＮＶＳｃ−１ Ｓ．セレビシエ細胞が、Ｓ．ｃ．ＥａｓｙＣｏｍｐ（商標）形質転換キット（Life Technologies,カタログ番号Ｋ５０５０−０１）を用いて、製造者の説明書に従って調製された。ＩＮＶＳｃ−１ Ｓ．セレビシエ株は、以下の、遺伝子型（ＭＡＴａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２ｔｒｐ１−２８９ ｕｒａ３−５２／ＭＡＴα ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１−２８９ ｕｒａ３−５２）および表現型：Ｈｉｓ−、Ｌｅｕ−、Ｔｒｐ−、Ｕｒａ−を有する。簡単に言うと、ＩＮＶＳｃ−１株由来の単一のコロニーが、１０ミリリットルのＹＰＤ培地（１リットルあたり、１０ｇ酵母抽出物、２０ｇペプトン、２０ｇグルコースを含む）に播種され、２５０ｒｐｍの振盪インキュベーターにおいて、３０℃で一晩増殖させた。翌日、一晩の培養が、０．３のＯＤ６００へと１０ミリリットルの新鮮なＹＰＤ培地で希釈され、ＯＤ６００が０．８に達するまで増殖させた。細胞は、室温で５分間の１５００ｒｐｍの遠心分離により収集された。その後、細胞は１０ミリリットルの溶液１（洗浄液）に再懸濁され、室温で５分間の１５００ｒｐｍの遠心分離により収集された。上清が破棄され、細胞が１ミリリットルの溶液２（再懸濁液）に再懸濁され、５０マイクロリットルの一定分量に分けられ、−８０℃で保存された。形質転換受容性のある酵母細胞を発現コンストラクトで形質転換するために、５０マイクロリットルのＩＮＶＳｃ−１形質転換受容性のある細胞が、１．２マイクログラムの各発現ベクターまたは対照ベクターおよび５００マイクロリットルの溶液３（形質転換液）と混合された。その後、細胞は勢いよく混合され、３０℃のウォーターバスで１時間インキュベートされ、１５分ごとに１０秒間ボルテックスされた。１００および４００マイクロリットルの一定分量の形質転換混合物が、適切な選択的試薬の不存在下で、ＳＣ最小寒天平板培地上に播種された。ＳＣ最小培地は、１リットルあたり、６．７ｇ酵母窒素塩基、２０ｇグルコース、０．０５ｇアスパラギン酸、０．０５ｇヒスチジン、０．０５ｇイソロイシン、０．０５ｇメチオニン、０．０５ｇフェニルアラニン、０．０５ｇプロリン、０．０５ｇセリン、０．０５ｇチロシン、０．０５ｇバリン、０．１ｇアデニン、０．１ｇアルギニン、０．１ｇシステイン、０．１ｇロイシン（Ｌｅｕ選択的培地を除く）、０．１ｇリジン、０．１ｇスレオニン、０．１ｇトリプトファン、および０．１ｇウラシル（Ｕｒａ選択的培地を除く）を含む。ｐＪ１２３１−ＰｒｐＲ−ＰＤＩで、ｐＪ１２３１−ＰｒｐＲ−ＬＣ＿ＮＳで、およびｐＪ１２３１−０３Ｃ対照ベクターで形質転換されたＩＮＶＳｃ−１細胞が、４８から７２時間、３０℃でロイシンのないプレート上で選択された。ｐＪ１２３４−ＡｒａＣ−ＨＣ＿ＮＳでおよびｐＪ１２３４−０３Ｃ対照ベクターで形質転換されたＩＮＶＳｃ−１細胞が、ウラシルなしのＳＣ最小寒天平板培地上で同じ条件下で増殖された。（好ましくは、ｐＪ１２３１−ＡｒａＣ−ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴ−ＣｈｕＡで、ｐＪ１２３４−ＡｒａＣ−ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴ−ＣｈｕＡで、およびｐＪ１２３４−ＰｒｐＲ−ＰＤＩで形質転換されたＩＮＶＳｃ−１細胞も、ウラシルなしのＳＣ最小寒天平板培地上で同じ条件下で増殖される。）ｐＪ１２３４−ＡｒａＣ−ＨＣ＿ＮＳおよびｐＪ１２３１−ＰｒｐＲ−ＬＣ＿ＮＳと同時に同時形質転換されるＩＮＶＳｃ−１細胞は、ロイシンまたはウラシルなしのＳＣ最小寒天平板培地上で同じ条件下で選択された。（好ましくは、ｐＪ１２３１−ＡｒａＣ−ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴ−ＣｈｕＡおよびｐＪ１２３４−ＰｒｐＲ−ＰＤＩで、またはｐＪ１２３４−ＡｒａＣ−ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴ−ＣｈｕＡおよびｐＪ１２３１−ＰｒｐＲ−ＰＤＩで、同時に同時形質転換されるＩＮＶＳｃ−１細胞は、ロイシンまたはウラシルなしのＳＣ最小寒天平板培地上で同じ条件下で選択される。）
各形質転換からの全てのコロニー由来の細胞は、スクレープされ、適切な選択的な試薬および炭素源が存在しない、４ミリリットルの液体最小ＳＣ培地に再懸濁された。各培養におけるＯＤ６００が測定され、０．４光学ユニットに正規化された。タンパク質発現が、ｐＪ１２３４−ＡｒａＣ−ＨＣ＿ＮＳで形質転換された培養に２％の滅菌フィルタを通されたアラビノース（Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, カタログ番号Ａ３２５６−２５Ｇ）の添加により誘導された。ｐＪ１２３１−ＰｒｐＲ−ＰＤＩでおよびｐＪ１２３１−ＰｒｐＲ−ＬＣ＿ＮＳで形質転換された細胞において、タンパク質発現が、２％の滅菌フィルタを通されたプロピオネート（Sigma-Aldrich, カタログ番号Ｐ１８８−１００Ｇ）の添加により誘導された。および、対応する培養におけるｐＪ１２３４−ＡｒａＣ−ＨＣ＿ＮＳおよびｐＪ１２３１−ＰｒｐＲ−ＬＣ＿ＮＳの共発現は、１％アラビノースおよび１％プロピオネートの添加により誘導された。（好ましくは、ｐＪ１２３１−ＡｒａＣ−ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴ−ＣｈｕＡで形質転換された細胞によるタンパク質発現のための、およびｐＪ１２３１−ＡｒａＣ−ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴ−ＣｈｕＡで、およびｐＪ１２３４−ＰｒｐＲ−ＰＤＩで、またはｐＪ１２３４−ＡｒａＣ−ＭｎＰ−Ｈ４＿ＦＴ−ＣｈｕＡおよびｐＪ１２３１−ＰｒｐＲ−ＰＤＩで同時形質転換された細胞のための誘導培地は、最終濃度の８マイクロモル濃度に添加されるヘミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号Ｈ９０３９または５１２８０）も含む。）タンパク質発現のタイムコースは、２５０ｒｐｍで振盪しているインキュベータにおいて、３０℃で２４時間であった。それぞれの予め誘導された培養の０．５ミリリットルからの細胞が、遠心分離により採取され、１ミリリットルの脱イオン水で洗浄され、−８０℃で保存された。誘導後培養由来のサンプルは、同じ方法で調製された。総タンパク質抽出物が、誘導前および誘導後の培養から調製され、４から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解され、ＰＤＶＦ膜に転写された。標的タンパク質の発現レベルが、抗６×Ｈｉｓタグおよび抗ヒトＩｇＧ抗体を用いてウエスタンブロットにより分析された。
実施例７
誘導物質を変化させることによる共発現の滴定
本発明の誘導性共発現系を用いて多量体産物の産生を最適化するために、誘導物質の濃度を独立して調節または滴定することができる。Ｌ−アラビノース誘導性およびプロピオネート誘導性の発現コンストラクトを含む宿主細胞は、適切な抗生物質を含むＭ９最小培地で、所望の濃度（例えば、約０．５のＯＤ６００）に増殖され、その後、細胞は、少量のＭ９最小培地に等分され、任意にグリセロールのような炭素源を含まずに調製され、適切な抗生物質を含み、各誘導物質の濃度を変化させる。発現を誘導するために必要なＬ−アラビノースの濃度は、典型的には２％以下である。滴定実験では、Ｌ−アラビノースの試験された濃度は、２％から１．５％、１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００５％、０．００２％、および０．００１％の範囲であり得る。Ｌ−ラムノース誘導性またはＤ−キシロース誘導性プロモーターの発現を誘導するために必要なＬ−ラムノースまたはＤ−キシロースの濃度は、５％から０．０１％の範囲の試験濃度で同様に試験される。試験されるＬ−アラビノース（またはＬ−ラムノースまたはＤ−キシロース）の各濃度「ｘ」について、最初の誘導物質の濃度「ｘ」を含むチューブのそれぞれに添加される、プロピオネートのような異なる誘導物質の濃度が、各一連のサンプルで変更され、プロピオネートの場合、１Ｍから７５０ｍＭ、５００ｍＭ、２５０ｍＭ、１００ｍＭ、７５ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、および１ｍＭの範囲である。代替的に、滴定実験は、誘導物質濃度の「スタンダード」な組み合わせで開始し得、０．００２％のＬ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、もしくはＤ−キシロースのいずれか、および／または５０ｍＭプロピオネートであり、「スタンダード」な組み合わせのそれから変化する誘導物質濃度の新たな組み合わせを試験する。同様の滴定実験が、本発明の誘導性共発現系で使用される、Ｌ−アラビノース、プロピオネート、Ｌ−ラムノース、およびＤ−キシロースを含むがこれらに限定されない誘導物質のあらゆる組み合わせで行われ得る。６時間の誘導物質の存在下で増殖された後に、細胞は、ペレットにされ、所望の産物が細胞から抽出され、細胞の質量値あたりの産物の収率が、ＥＬＩＳＡのような定量的免疫学的分析により、または、産物の精製および２８０ｎｍでのＵＶ吸光度による定量化により測定される。
また、ハイスループットアッセイを用いて誘導物質濃度を滴定することも可能であり、発現されるタンパク質は、ｍＫａｔｅ２赤色蛍光タンパク質（Evrogen, Moscow, Russia）またはオワンクラゲおよびバチルス・セレウス由来の増強緑色蛍光タンパク質により提供されるもののような、蛍光タンパク質部分を含むように操作される。ハイスループット滴定実験における誘導物質の異なる濃度により産生される遺伝子産物の量と活性を測定するための別のアプローチは、表面プラスモン共鳴を検出するセンサーまたはバイオレイヤー干渉法（bio-layer interferometry）（ＢＬＩ）（例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫシステム、forteBIO, Menlo Park, CAより）を採用するセンサーのような、生体分子の結合相互作用を測定することが可能なセンサーを用いることである。
実施例８
プロモーターの強度の測定および誘導性発現の均質性
プロモーターの強度が、適切な対照に対して相対的な、そのプロモーターで開始される遺伝子産物の転写の量として測定される。発現コンストラクトにおける遺伝子産物の発現を方向づける構成的プロモーターについて、適切な対照は、「野生型」バージョンのプロモーター、または「ハウスキーピング」遺伝子由来のプロモーターが、試験されるプロモーターの代わりに使用されることを除いて、同じ発現コンストラクトを使用し得た。誘導性プロモーターについて、プロモーター由来の遺伝子産物の発現は、誘導および非誘導条件下で比較され得る。
Ａ．プロモーターから転写されたＲＮＡのレベルを測定するために定量的ＰＣＲを用いてプロモーター強度を測定する
De Mey et al.の方法（"Promoter knock-in: a novel rational method for the fine tuning of genes", BMC Biotechnol 2010 Mar 24; 10: 26）が、培養で増殖され得る宿主細胞におけるプロモーターの相対的な強度を測定するために使用される。試験されるプロモーターを有する発現コンストラクトを含む宿主細胞、および対照の発現コンストラクトを含む対照宿主細胞は、３通りに培養で増殖される。１ｍｌサンプルが、ｍＲＮＡおよびタンパク質収集のためにＯＤ６００＝１．０で収集される。総ＲＮＡ抽出物が、ＲＮｅａｓｙミニキット（QIAGEN, The Netherlands）を用いてなされる。ＲＮＡの純度が、ＱＩＡＧＥＮにより推奨されるように、ＦＡアガロースゲル上で確認され、ＲＮＡ濃度が２６０ｎｍで吸光度を計測することにより測定される。２マイクログラムのＲＮＡが、ランダムプライマーおよびＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｍ−ＭｕｌＶリバース転写酵素（Fermentas, Glen Burnie, Maryland）を用いて、ｃＤＮＡを合成するために使用される。プロモータの強度は、プロモーターから産生される転写物に対応するｃＤＮＡを増幅するために設計されたフォワードおよびリバースプライマーを用いて、ｉＣｙｃｌｅｒ ＩＱ（登録商標）（Bio-Rad, Eke, Belgium）で行われるＲＴ−ｑＰＣＲにより測定される。（この目的のために、De Mey et al.著者は、Ｆｗ−ｐｐｃ−ｑＰＣＲおよびＲｖ−ｐｐｃ−ｑＰＣＲプライマー、並びに対照ハウスキーピング遺伝子ｒｐｏＢ由来のＦｗ−ｒｐｏＢ−ｑＰＣＲおよびＲｖ−ｒｐｏＢ−ｑＰＣＲプライマーを使用した。）ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＥＲ ｑＰＣＲスーパーミックス（supermix）（Life Technologies, Grand Island, New York）が、簡潔にＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）インキュベーション（５０℃で２分間）を行うために使用され、すぐにＰＣＲ増幅（９５℃で８．５分；９５℃で１５秒および６０℃で１分の４０サイクル）および融解曲線分析（９５℃で１分、５５℃で１分、および１０秒の５５℃＋０．５℃／サイクルの８０サイクル）が続き、プライマー二量体の存在を確認し、反応の特異性を分析する。ＰＣＲサイクル前のこのＵＤＧインキュベーション工程は、前の反応由来のあらゆる混入ｄＵ含有産物を破壊する。ＵＤＧは、その後、ＰＣＲサイクル中の高温により不活化され、これにより、真の標的配列の増幅を可能にする。各サンプルは、３通りで行われる。相対的な発現の比は、PE Applied Biosystems（PerkinElmer, Forster City, California）の「デルタデルタＣＴ法（Delta-delta ct method）」を用いて算出される。
Ｂ．蛍光レポーター遺伝子を用いて、誘導の均一性および誘導性プロモーター強度を測定する
これらの実験は、Khlebnikov et al.の方法を用いて行われる（"Regulatable arabinose-inducible gene expression system with consistent control in all cells of a culture", J Bacteriol 2000 Dec; 182(24): 7029-7034）。誘導性プロモーターの誘導を測定する実験は、炭素源として３．４％グリセロールで補充されたＣ培地で行われる（Helmstetter, "DNA synthesis during the division cycle of rapidly growing Escherichia coli B/r", J Mol Biol 1968 Feb 14; 31(3): 507-518）。蛍光レポーター遺伝子の発現を制御する少なくとも１つの誘導性プロモーターを含む発現コンストラクトを含む、大腸菌株は、０．６〜０．８の６００ｎｍ（ＯＤ６００）での光学的密度に対する抗生物質選択下で３７℃で増殖される。細胞は、遠心分離（１５，０００×ｇ）により収集され、炭素源のないＣ培地で洗浄され、ＯＤ６００の０．１から０．２に対する抗生物質、グリセロール、および／または誘導物質（遺伝子発現の誘導のための）を含む新鮮なＣ培地で再懸濁され、６時間インキュベートされる。分析のための増殖中に、サンプルがルーチン的に採取される。培養の蛍光が、３６０／４０ｎｍの波長の励起および５２０／１０ｎｍの波長のエミッションフィルターで、Versafluor Fluorometer（Bio-Rad Inc., Hercules, California）で測定される。誘導での誘導性プロモーター由来の発現の強度が、誘導された細胞の最大個体群の平均化された蛍光（蛍光／ＯＤの比）の対照（例えば、非誘導）細胞のそれに対する比として発現され得る。細胞の個体群内の誘導の均質性を測定するために、フローサイトメトリーが、アルゴンレーザー（１５ｍＷおよび４８８ｎｍの波長で放射）および５２５ｎｍの波長バンドパスフィルターを備える、Beckman-Coulter EPICS XLフローサイトメーター（Beckman Instruments Inc., Palo Alto, California）で行われる。分析前に、サンプリングされた細胞は、フィルター（フィルターのポアサイズ、０．２２マイクロメーター）を通したリン酸緩衝食塩水で洗浄され、０．０５のＯＤ６００に希釈され、氷上に置かれる。各サンプルについて、５００から１，０００イベント（event）／ｓの間の割合で３０，０００イベントが収集される。各サンプルにおける誘導された（蛍光）細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーデータから算出され得る。
実施例９
抗体の精製
本発明の誘導性共発現系により産生された抗体は、あらゆる細胞および破片を取り除くために、１０分間、１０，０００×ｇで溶解された宿主細胞の遠心分離サンプルにより精製される。上清は、０．４５マイクロメーターのフィルターを通してフィルターにかけられる。１ｍＬの組換えタンパク質Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラム（Life Technologies, Grand Island, New York）は、１ｍｌ／ｍｉｎの流量に達するように設定され、以下のバッファ：バインディングバッファ、ｐＨ７．０の０．０２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ２．７の０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、および中和バッファ：ｐＨ９．０の１Ｍトリス−ＨＣｌで使用される。カラムは、５カラム分の量（５ｍｌ）のバインディングバッファで平衡化され、その後、サンプルがカラムにアプライされる。不純物および非結合材料を取り除くために、カラムは、５〜１０カラム分の量のバインディングバッファで洗浄され、タンパク質が溶出液に検出されなくなるまで継続する（２８０ｎｍでＵＶ吸光度により測定）。カラムは、その後、５カラム分の量の溶出バッファで溶出され、カラムは、５〜１０カラム分の量のバインディングバッファですぐに再平衡化される。
実施例１０
抗体結合親和性の測定
「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」として表される、抗体結合親和性は、以下の分析により記載される対象の抗体およびその抗原のＦａｂバージョンで行われる放射標識された抗原の結合分析（ＲＩＡ）により測定される。Ｆａｂバージョンの全長抗体の産生は、当該技術分野でよく知られる。抗原についてのＦａｂの溶液−結合親和性は、非標識抗原の滴定のシリーズの存在下で最小濃度の（１２５Ｉ）標識された抗原でＦａｂを平衡化することにより測定され、その後、抗Ｆａｂ抗体をコートされたプレートで結合された抗原をとらえる（例えば、Chen et al., "Selection and analysis of an optimized anti-VEGF antibody: crystal structure of an affinity-matured Fab in complex with antigen", J Mol Biol 1999 Nov 5; 293(4): 865-881参照）。分析のための条件を確立するために、マイクロタイタープレート（DYNEX Technologies, Inc., Chantilly, Virginia）が、５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）における５マイクログラム／ｍｌのキャプチャリング抗Ｆａｂ抗体（Cappel Labs, West Chester, Pennsylvania）で、一晩コートされ、その後、室温（約２３℃）で２から５時間、ＰＢＳにおける２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンでブロックされる。非吸着プレート（Nunc #269620; Thermo Scientific, Rochester, New York）において、１００ｐＭまたは２６ｐＭ［１２５Ｉ］−抗原が、対象のＦａｂの段階希釈と混合される（例えば、Presta et al., "Humanization of an anti-vascular endothelial growth factor monoclonal antibody for the therapy of solid tumors and other disorders", Cancer Res 1997 Oct 15; 57(20): 4593-4599における、抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。対象のＦａｂは、その後、一晩インキュベートされるが、インキュベーションは、平衡化に達していることを確実にするために、より長い期間（例えば、約６５時間）継続することとしてもよい。その後、混合物は、室温でのインキュベーション（例えば、約１時間）のためにキャプチャープレートにうつされる。溶液はその後取り除かれ、プレートは、ＰＢＳにおける０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（商標）界面活性剤で８回洗浄される。プレートが乾燥したとき、１５０マイクロリットル／ウェルのシンチラント（scintillant）（MICROSCINT-20（商標）; PerkinElmer, Waltham, Massachusetts）が添加され、プレートは、１０分間、ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（PerkinElmer）上でカウントされる。最大の結合の２０％以下である各Ｆａｂの濃度が、競合結合測定で使用するために選択される。
代替的に、ＫｄまたはＫｄ値は、約１０反応ユニット（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップとともに２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００機器（BIAcore, Inc., Piscataway, New Jersey）を用いて、表面プラズモン共鳴分析を用いることにより測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、BIAcore Inc.）が、サプライヤーの説明書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性化される。抗原は、約１０ＲＵの結合タンパクに達するように、５マイクロリットル／分の流量での注入前に、ｐＨ４．８の１０ｍＭ酢酸ナトリウムで５マイクログラム／ｍｌ（約０．２マイクロモル濃度）に希釈される。抗原の注入後に、１Ｍエタノールアミンが未反応基をブロックするために注入される。動力学測定のために、Ｆａｂ（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）の２倍の段階希釈が、約２５マイクロリットル／分の流量で、２５℃で、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０（商標）界面活性剤（ＰＢＳＴ）でＰＢＳ中に注入される。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）が、会合および解離センサーグラムを同時に適合させることにより、単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）（BIAcore（登録商標）Evaluation Software version 3.2）を用いて算出される。平衡解離定数（Ｋｄ）が、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出される。オンレート（on-rate）が、上記表面プラズモン共鳴分析により１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、その後、オンレートは、撹拌キュベットで、流動停止を備えた分光光度計（stop-flow-equipped spectrophotometer）（Aviv Instruments）または８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ThermoSpectronic）のような、分光計で測定される、抗原の濃度の増加の存在下で、２５℃、ｐＨ７．２のＰＢＳにおける２０ｎＭ抗−抗原抗体（Ｆａｂ形態）の蛍光−発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）での増加または減少を測定する、蛍光クエンチング技術を用いることにより測定され得る。
実施例１１
共発現産物に存在するジスルフィド結合の特徴づけ
共発現されたタンパク質産物におけるジスルフィド結合の数および位置が、非還元条件下で、トリプシンのようなプロテアーゼによるタンパク質の消化、および結果として得られたペプチドフラグメントを連続的電子移動解離（sequential electron transfer dissociation）（ＥＴＤ）および衝突誘起解離（ＣＩＤ）ＭＳステップ（ＭＳ２，ＭＳ３）を組み合わせる質量分析（ＭＳ）に供することにより測定され得る（Nili et al., "Defining the disulfide bonds of insulin-like growth factor-binding protein-5 by tandem mass spectrometry with electron transfer dissociation and collision-induced dissociation", J Biol Chem 2012 Jan 6; 287(2): 1510-1519; Epub 2011 Nov 22）。
共発現されたタンパク質の消化。ジスルフィド結合の再配列を防止するために、あらゆる遊離システイン残基が、まずアルキル化によりブロックされ、共発現されたタンパク質は、４Ｍ尿素入りのバッファ中で、２０℃で３０分振盪しながら、アルキル化剤ヨードアセトアミド（５ｍＭ）で光から保護されインキュベートされ、その後、プレキャストゲルを用いる非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離される。代替的に、共発現されたタンパク質は、ヨードアセトアミドで、または対照としてでなく、電気泳動後のゲルでインキュベートされる。タンパク質バンドが染色され、２倍の脱イオン水で脱染され、切除され、および、２０℃で３０分間浸透しながら、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの５００マイクロリットルで２回インキュベートされる。タンパク質サンプルが、１００％アセトニトリルで約２分間脱水され、真空遠心分離により乾燥され、および氷上で１５分間、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムおよび５ｍＭ塩化カルシウムを含むバッファにおける１０ｍｇ／ｍｌのトリプシンまたはキモトリプシンで再水和される。過剰なバッファが取り除かれ、酵素のない５０マイクロリットルの同じバッファで置換され、その後、振盪しながら、トリプシンおよびキモトリプシンについて、それぞれ、３７℃または２０℃で、１６時間インキュベートされる。消化は、短時間のボルテックス後に、３マイクロリットルの８８％ギ酸の添加により停止され、上清が取り除かれて、分析まで−２０℃で保存される。
質量分析によるジスルフィド結合の局在性。ペプチドは、０．１％ギ酸を含む移動相にて、２０マイクロリットル／分で、１ｍｍ×８ｍｍトラップカラム（Michrom BioResources, Inc., Auburn, CA）上に注入される。トラップカートリッジは、その後、５ｍｍのＺｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８固定相（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を含む、０．５ｍｍ×２５０ｍｍカラムに従って配置され、ペプチドが、１１００シリーズキャピラリーＨＰＬＣ（Agilent Technologies）により、１０マイクロリットル／分で、９０分にわたって、２から３０％アセトニトリル勾配により分離される。ペプチドは、ＥＴＤソースによりＬＴＱ Ｖｅｌｏｓリニアイオントラップ（Thermo Scientific, San Jose, CA）を用いて分析される。エレクトロスプレイイオン化は、Ｃａｐｔｉｖｅ Ｓｐｒａｙソースを用いて行われる（Michrom Bioresources, Inc.）。サーベイＭＳスキャンは、サーベイスキャンにおける最も強いイオン上でＣＩＤおよびＥＴＤ ＭＳ２スキャンを含む、７つのデータに依存する走査がその後に続き、その後に、ＥＴＤ ＭＳ２スキャンにおける、１から５番目の最も強いイオンで５つのＭＳ３ ＣＩＤスキャンが続く。ＣＩＤスキャンは、正規化された３５の衝突エネルギーを使用し、ＥＴＤスキャンは、可能とされる追加の活性化で、１００ｍｓの活性化時間を使用する。ＭＳ２ ＣＩＤおよびＥＴＤスキャンを開始するための最小のシグナルは１０，０００であり、ＭＳ３ ＣＩＤスキャンの開始の最小シグナルは１０００であり、全てのＭＳ２およびＭＳ３スキャンの分離幅は、３．０ｍ／ｚである。ソフトウェアの動的排除（dynamic exclusion）の特徴は、１の繰返し回数、１００の排除リストサイズ、および３０秒の排除期間で可能である。ＥＴＤ ＭＳ２スキャンの収集のための標的特異的架橋種に対する包含リストが使用される。ＭＳ２およびＭＳ３スキャンについての分離データファイルが、ＺＳＡ電荷状態分析を用いるＢｉｏｗｏｒｋｓ３．３（Thermo Scientific）により作成される。ペプチド配列に対するＭＳ２およびＭＳ３スキャンのマッチングが、Ｓｅｑｕｅｓｔ（V27, Rev 12, Thermo Scientific）により行われる。分析は、酵素特異性、２．５親イオン質量許容差、１．０のフラグメント質量許容差、および酸化したメチオニン残基についての＋１６の変動質量なしに実行される。結果はその後、使用される９５および９９％の最小のペプチドおよびタンパク質の見込みでプログラムＳｃａｆｆｏｌｄ（V3_00_08, Proteome Software, Portland, OR）を用いて分析される。ＭＳ３由来のペプチドは、スキャン数によりソートされ、ペプチドを含むシステインは、ＥＴＤ ＭＳ２スキャンから観察される５つの最も強いイオンから産生されるＭＳ３スキャンのグループから同定される。ジスルフィド結合された種に関与するシステインペプチドの同一性が、サーベイスキャンおよびＥＴＤ ＭＳ２スキャンで観察される親イオン質量の手動の実験によりさらに確認される。
実施例１２
細菌性の細胞ペリプラズム由来、スフェロプラスト由来、細胞全体由来の共発現産物の分離
本発明の誘導性共発現系は、細胞質またはペリプラズムのような、細胞の異なるコンパートメントに蓄積する遺伝子産物を発現するために使用され得る。大腸菌またはＳ．セレビシエのような宿主細胞は、外側の細胞膜または細胞壁を有し、外膜または壁が取り除かれる場合にスフェロプラストを形成し得る。このような宿主で作成される共発現されたタンパク質は、以下の方法を用いて、特に、ペリプラズムから、またはスフェロプラストから、または細胞全体から精製され得る（Schoenfeld, "Convenient, rapid enrichment of periplasmic and spheroplasmic protein fractions using the new PeriPreps TM Periplasting Kit", Epicentre Forum 1998 5(1): 5; www.epibio.com/newsletter/f5_1/f5_ 1pp.asp参照）。ＰｅｒｉＰｒｅｐｓ（商標）Ｐｅｒｉｐｌａｓｔｉｎｇキット（Epicentre（登録商標）Biotechnologies,Madison WI; www.epibio.com/ pdftechlit/107pl0612.pdfで実行可能な手順）を用いるこの方法は、大腸菌および他のグラム陰性菌について設計されるが、一般的なアプローチは、Ｓ．セレビシエのような他の宿主細胞のために変更され得る。
１．細菌性の宿主細胞培養は、より古い細胞培養が、通常リゾチーム処理にいくらかの耐性を示す固定期に増殖するため、後期の対数期のみに増殖される。組換えタンパク質の発現が過剰である場合、細胞が早期に溶解する可能性があり、よって、細胞培養は、富栄養培地で、又は過剰なタンパク質合成を誘導する可能性のあるより高い増殖温度で増殖されない。タンパク質発現は、その後誘導され、細胞は、対数期または早期の固定期におけるものであるべきである。
２．細胞培養は、室温で、１０分間、最小の１０００×ｇでの遠心分離によりペレットにされる。注記：細胞は、フレッシュでなければならず、凍結してはならない。細胞ペレットの湿潤重量は、本手順のために必要とされる試薬の量を算出するために測定される。
３．細胞は、細胞の各グラムについて、細胞懸濁が均質になるまで、ボルテックス混合により、またはピペッティングによるいずれかで、最小の２ｍｌのPeriPreps Periplastingバッファ（ｐＨ７．５の２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２０％スクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、および３０Ｕ／マイクロリットルのReady-Lyse Lysozyme）で徹底的に再懸濁される。注記：過剰な撹拌は、細胞質タンパク質を有するペリプラズム分画の濃度をもたらすスフェロプラストの早期の溶解を引き起こすかもしれない。
４．室温で５分間のインキュベート。Ready-Lyse Lysozymeが、室温で最適に活性化される。より低い温度（０℃から４℃）での溶解は、追加のインキュベーション時間を必要とし、このような温度では、インキュベーション時間は２から４倍に延びる。
５．もとの細胞のペレット重量の各グラムについて４℃での３ｍｌの精製水を添加し（ステップ２）および倒置により混合する。
６．１０分間の氷上でインキュベートする。
７．溶解された細胞が、室温で１５分間、最小の４０００ｇで遠心分離によりペレットにされる。
８．ペリプラズム分画を含む上清が、きれいなチューブに移される。
９．混入している核酸を分解するために、ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅエンドヌクレアーゼがＰｅｒｉＰｒｅｐｓ溶解バッファに任意に添加される。ヌクレアーゼの包含は、概して、タンパク質の収率およびライセートの操作の容易性を向上させるが、ヌクレアーゼの追加は、いくつかの場合で望ましくなく、例えば、ヌクレアーゼの使用は、残りのヌクレアーゼ活性またはマグネシウム補助因子に対する一次的な露出が、その後の分析または精製されたタンパク質の使用と干渉する場合には、避けるべきである。ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅエンドヌクレアーゼを不活化するためのライセートへのＥＤＴＡの追加は、同様に、その後の分析または精製されたタンパク質の使用と干渉するかもしれない。ヌクレアーゼが添加される場合、２マイクロリットルのＯｍｎｉＣｌｅａｖｅエンドヌクレアーゼおよび１０マイクロリットルの１．０ＭのＭｇＣｌ２が、ステップ１０で必要とされる各ミリリットルの溶解バッファについて、ＰｅｒｉＰｒｅｐｓ溶解バッファ（ｐＨ７．５、の１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、および０．１％デオキシコール酸塩）で１ｍｌまで希釈される。
１０．ペレットは、各グラムのオリジナルの細胞ペレット重量について、５ｍｌのＰｅｒｉＰｒｅｐｓ溶解バッファに再懸濁される。
１１．ペレットは、室温で１０分間インキュベートされる（含まれる場合には、ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅエンドヌクレアーゼ活性が、粘度における有意な減少をもたらし、インキュベーションは、細胞の懸濁液が一貫性のある水分を有するまで継続される。）。
１２．細胞の破片が、４℃で１５分間の最小の４０００×ｇでの遠心分離によりペレットにされる。
１３．スフェロプラスト分画を含む上清が、きれいなチューブに移される。
１４．ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅエンドヌクレアーゼがＰｅｒｉＰｒｅｐｓ溶解バッファに添加され、２０マイクロリットルの５００ｍＭのＥＤＴＡが結果として得られるスフェロプラスト分画の各ミリリットルについて添加され、マグネシウムをキレート化する（ライセートにおけるＥＤＴＡの最終濃度は１０ｍＭである。）。ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅエンドヌクレアーゼによる核酸の加水分解後に、ライセートが、相当量のモノまたはオリゴヌクレオチドを含むかもしれない。これらの分解産物の存在は、ライセートのさらなる処理に影響を及ぼすかもしれず、例えば、ヌクレオチドは、レジンと相互作用することにより陰イオン交換樹脂の結合性能を低減させるかもしれない。
上記の手順は、以下の変更により総細胞性タンパク質を調製するために使用され得る。ステップ２でペレットにされた細胞は、フレッシュまたは凍結されたものであり得、ステップ４では、細胞は１５分間インキュベートされ、ステップ５から８が省略され、ステップ１０では、オリジナルの細胞ペレット重量の各グラムについて、３ｍｌのＰｅｒｉＰｒｅｐｓ溶解バッファが添加される。
ペリプラズム、またはスフェロプラスト、または細胞全体のタンパク質サンプルの調製後に、サンプルは、いくつかの特徴化および／または定量化方法のいずれかにより分析され得る。一例では、成功的なペリプラズムおよびスフェロプラストタンパク質の分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるペリプラズムおよびスフェロプラスト分画の両方の一定分量を分析することにより確認される（２マイクロリットルの各分画が、概して、クーマシーブリリアントブルーで染色することにより可視化のために十分である。）。特有のタンパク質の存在または所与の分画における特定のタンパク質の濃縮は、成功的な分画を示す。例えば、宿主細胞が、アンピシリン耐性マーカーで高い複製数のプラスミドを含む場合、その後、主にペリプラズム分画におけるβ−ラクタマーゼ（３１．５ｋＤａ）の存在が、成功的な分画を示す。ペリプラズムスペースでみられる他の大腸菌タンパク質は、アルカリホスファターゼ（５０ｋＤａ）および伸長因子Ｔｕ（４３ｋＤａ）を含む。所与の分画でみられるタンパク質の量は、いくつかの方法のいずれかを用いて定量化され得る（例えば、とりわけ、染色されたもしくは標識されたタンパク質バンドのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびデンシトメトリー分析、放射標識されたタンパク質のシンチレーション測定、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、またはシンチレーション近接アッセイ）。スフェロプラスト分画と比較されるペリプラズム分画でみられるタンパク質の量と比較することは、タンパク質が、細胞質からペリプラズム内にエクスポートされた程度を示す。
実施例１３
ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列類似性の測定
ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列同一性のパーセンテージが、配列される記号、つまり、両方の配列された配置と同じであり、ギャップを含む、２つの配列の配置で、符号の総数により除される、ヌクレオチドまたはアミノ酸の数として定義される。２つの配列間の類似性の程度（同一性のパーセンテージ）は、ウェブサイトのblast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiを通じて利用可能である、Needleman-Wunschグローバル配列アライメントツールにて国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）により実現されるように、Needleman and Wunsch（J. Mol. Biol. 48:443, 1970）のグローバルな配置法を用いて配列を配置することにより測定されることとしてもよい。一実施形態では、Needleman-Wunschアライメントパラメーターが、デフォルトの値に設定される（それぞれ２および−３のマッチ／ミスマッチスコア、並びにそれぞれ５および２のＥｘｉｓｔｅｎｃｅおよびＥｘｔｅｎｓｉｏｎのＧａｐ Ｃｏｓｔ）。配列比較の分野における当業者により使用される他のプログラムは、また、例えば、blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiウェブサイトに記載されるデフォルトのパラメーターセッティングを用いて、ＮＣＢＩにより実行されるような、ベーシックなローカルアライメントサーチツールまたはＢＬＡＳＴ（登録商標）プログラム（Altschul et al., "Basic local alignment search tool", J Mol Biol 1990 Oct 5; 215(3): 403-410）のような配列を配置するために使用されることとしてもよい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、以下のように使用されることとしてもよい、２つを含む複合的な任意のパラメーターを有し、（Ａ）低い組成上の複雑性を有するクエリー配列のセグメント、または好ましくは使用されないまたは「オフ」に設定される、短周期性の内部反復からなるセグメントをマスクするためのフィルターの包含、および（Ｂ）「エクスペクト」またはＥ−スコアとよばれる、データベース配列に対してマッチすることを報告するための統計的に有意な閾値（単に偶然にみいだされるマッチの期待される確率、マッチに帰される統計学的有意性は、このＥ−スコア閾値よりも大きい場合、マッチは報告されないであろう。）この「エクスペクト」またはＥ−スコア値が、デフォルトの値（１０）から調節される場合、好ましい閾値は０．５、または、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、０．００００１、および０．０００００１の順で優先性が増加する。
本発明を実施することにおいて、分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術における多くの従来の技術が、任意に使用される。このような従来の技術は、ベクター、宿主細胞、および組換え方法に関する。これらの技術は、十分に知られ、例えば、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Mc, San Diego, CA; Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2000; およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (2006年を通して提供される)で説明される。例えば、細胞の分離および培養について、およびその後の核酸またはタンパク質分離についての他の有用な参照文献は、Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York およびその中で挙げられる参照文献; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (Eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer- Verlag (Berlin Heidelberg New York);並びに Atlas and Parks (Eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FLを含む。核酸を作成する方法（例えば、インビトロ増幅、細胞からの精製、または化学合成による）、核酸を操作するための方法（例えば、部位特異的突然変異、制限酵素の消化、ライゲーション等による）、並びに核酸を操作および作成するのに有用な種々のベクター、細胞株等が、上記参考文献に記載される。さらに、本質的に、あらゆるポリヌクレオチド（標識されたまたはビオチン化されたポリヌクレオチドを含む）は、あらゆる種々の市販のソースからオーダーされたカスタムまたはスタンダードであり得る。
本発明の実施についての一定の形態を含むために見出されるまたは提案される特定の実施形態の見地から、本発明は記載される。本開示に照らして、種々の変更および変化が、本発明の意図される範囲から逸脱することなく、例証される特定の実施形態においてなされ得ることが当業者により理解されるであろう。特許公開公報を含む、全ての挙げられた参考文献は、それらの全体において、参照により本明細書に組み込まれる。公開されている遺伝子座決定または他の記載により言及される、ヌクレオチドおよび他の遺伝子配列もまた、参照により本明細書に明白に組み込まれる。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］２つまたはそれ以上のタイプの発現コンストラクトを含む宿主細胞であって、
各タイプの前記発現コンストラクトは、誘導性プロモーターおよび該誘導性プロモーターから転写されるための遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含み、
少なくとも１つの前記誘導性プロモーターは、別の前記誘導性プロモーターの誘導物質と異なる誘導物質に対して応答性があり、
少なくとも１つの前記遺伝子産物は、別の前記遺伝子産物と多量体を形成する、宿主細胞。
［態様２］２つまたはそれ以上のタイプの発現コンストラクトを含む宿主細胞であって、
各タイプの前記発現コンストラクトは、誘導性プロモーターおよび該誘導性プロモーターから転写されるための遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含み、
少なくとも１つの前記遺伝子産物は、
（ａ）シグナルペプチドを欠き、少なくとも３つのジスルフィド結合を形成するポリペプチド、
（ｂ）アラビノース利用酵素およびキシロース利用酵素からなる群から選択されるポリペプチド、
（ｃ）リグニン分解ペルオキシダーゼからなる群から選択されるポリペプチド、
からなる群から選択される、宿主細胞。
［態様３］少なくとも１つの誘導性プロモーターがＬ‐アラビノース誘導性プロモーターである、態様１または２の宿主細胞。
［態様４］少なくとも１つの誘導性プロモーターがプロピオネート誘導性プロモーターである、態様１または２の宿主細胞。
［態様５］少なくとも１つの誘導性プロモーターが、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｐｒｐＢＣＤＥプロモーター、ｒｈａＳＲプロモーター、およびｘｌｙＡプロモーターからなる群から選択される、態様１または２の宿主細胞。
［態様６］各誘導性プロモーターがラクトース誘導性プロモーターではない、態様１または２の宿主細胞。
［態様７］少なくとも１つの発現コンストラクトが、誘導性プロモーターに結合する転写制御因子をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、態様１または２の宿主細胞。
［態様８］転写制御因子をコードする前記ポリヌクレオチド配列および前記転写制御因子が結合する前記誘導性プロモーターが同じ発現コンストラクトにある、態様７の宿主細胞。
［態様９］前記転写制御因子がＡｒａＣ、ＰｒｐＲ、ＲｈａＲ、およびＸｙｌＲからなる群から選択される、態様７の宿主細胞。
［態様１０］少なくとも１つの発現コンストラクトが、ｐＢＡＤ１８、ｐＢＡＤ１８−Ｃｍ、ｐＢＡＤ１８−Ｋａｎ、ｐＢＡＤ２４、ｐＢＡＤ２８、ｐＢＡＤ３０、ｐＢＡＤ３３、ｐＰＲＯ１８、ｐＰＲＯ１８−Ｃｍ、ｐＰＲＯ１８−Ｋａｎ、ｐＰＲＯ２４、ｐＰＲＯ３０、およびｐＰＲＯ３３からなる群から選択されるプラスミド内に、ポリヌクレオチド配列を挿入する工程を含む方法により生産された、態様１または２の宿主細胞。
［態様１１］少なくとも１つの遺伝子産物がポリペプチドである、態様１の宿主細胞。
［態様１２］少なくとも１つの遺伝子産物が、（ａ）免疫グロブリン重鎖、（ｂ）免疫グロブリン軽鎖、および（ｃ）（ａ）から（ｂ）のいずれかのフラグメント、からなる群から選択される、態様１または２の宿主細胞。
［態様１３］前記遺伝子産物が免疫グロブリン軽鎖である、態様１２の宿主細胞。
［態様１４］前記遺伝子産物が免疫グロブリン重鎖である、態様１２の宿主細胞。
［態様１５］少なくとも１つの遺伝子産物が、シグナルペプチドを欠くポリペプチドであり、少なくとも３つのジスルフィド結合を形成する、態様１または２の宿主細胞。
［態様１６］前記ポリペプチドが、（ａ）少なくとも３であって１７よりも少ないジスルフィド結合、および（ｂ）少なくとも１８であって１００より少ないジスルフィド結合からなる群から選択される、いくつかのジスルフィド結合を形成する、態様１５の宿主細胞。
［態様１７］前記ポリペプチドが、少なくとも３であって１０より少ないジスルフィド結合を形成する、態様１５の宿主細胞。
［態様１８］前記ポリペプチドが、少なくとも３であって８より少ないジスルフィド結合を形成する、態様１５の宿主細胞。
［態様１９］前記ポリペプチドが、（ａ）免疫グロブリン重鎖、（ｂ）免疫グロブリン軽鎖、（ｃ）マンガンペルオキシダーゼ、および（ｄ）（ａ）から（ｃ）のいずれかのフラグメント、からなる群から選択される、態様１５の宿主細胞。
［態様２０］少なくとも１つの遺伝子産物は、アラビノース利用酵素およびキシロース利用酵素からなる群から選択されるポリペプチドである、態様２の宿主細胞。
［態様２１］前記ポリペプチドはキシロースイソメラーゼである、態様２０の宿主細胞。
［態様２２］少なくとも１つの遺伝子産物は、リグニン分解ペルオキシダーゼからなる群から選択されるポリペプチドである、態様２の宿主細胞。
［態様２３］前記ポリペプチドはマンガンペルオキシダーゼである、態様２２の宿主細胞。
［態様２４］少なくとも１つの追加の遺伝子産物は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼである、態様２２の宿主細胞。
［態様２５］前記ポリペプチドは汎用性のあるペルオキシダーゼである、態様２２の宿主細胞。
［態様２６］前記宿主細胞は、２つのタイプの発現コンストラクトを含む、態様１または２の宿主細胞。
［態様２７］１つのタイプの発現コンストラクトが、ｐＢＡＤ２４プラスミド内にポリヌクレオチド配列を挿入する工程を含む方法により産生され、他のタイプの発現コンストラクトが、ｐＰＲＯ３３プラスミド内にポリヌクレオチド配列を挿入する工程を含む方法により産生される、態様２６の宿主細胞。
［態様２８］前記宿主細胞は、少なくとも１つの前記誘導性プロモーターの誘導物質についての輸送タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の変異を有する、態様１または２の宿主細胞。
［態様２９］輸送タンパク質をコードする前記遺伝子は、ａｒａＥ、ａｒａＦ、ａｒａＧ、ａｒａＨ、ｒｈａＴ、ｘｙｌＦ、ｘｙｌＧ、およびｘｙｌＨからなる群から選択される、態様２８の宿主細胞。
［態様３０］前記宿主細胞は、少なくとも１つの前記誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の低減されたレベルを有する、態様１または２の宿主細胞。
［態様３１］少なくとも１つの前記誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする前記遺伝子は、ａｒａＡ、ａｒａＢ、ａｒａＤ、ｐｒｐＢ、ｐｒｐＤ、ｒｈａＡ、ｒｈａＢ、ｒｈａＤ、ｘｙｌＡ、およびｘｙｌＢからなる群から選択される、態様３０の宿主細胞。
［態様３２］前記宿主細胞は、少なくとも１つの前記誘導性プロモーターの誘導物質の生合成を伴うタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の低減されたレベルを有する、態様１または２の宿主細胞。
［態様３３］少なくとも１つの前記誘導性プロモーターの誘導物質の生合成を伴うタンパク質をコードする前記遺伝子は、ｓｃｐＡ／ｓｂｍ、ａｒｇＫ／ｙｇｆＤ、ｓｃｐＢ／ｙｇｆＧ、ｓｃｐＣ／ｙｇｆＨ、ｒｍｌＡ、ｒｍｌＢ、ｒｍｌＣ、およびｒｍｌＤからなる群から選択される、態様３２の宿主細胞。
［態様３４］前記宿主細胞が原核細胞である、態様１または２の宿主細胞。
［態様３５］前記宿主細胞が大腸菌である、態様３４の宿主細胞。
［態様３６］前記宿主細胞は、該宿主細胞の細胞質の還元／酸化環境に影響を及ぼす遺伝子の変異した遺伝子機能を有する、態様１または２の宿主細胞。
［態様３７］前記宿主細胞の細胞質の還元／酸化環境に影響を及ぼす前記遺伝子は、ｇｏｒおよびｇｓｈＢからなる群から選択される、態様３６の宿主細胞。
［態様３８］前記宿主細胞は、還元酵素をコードする遺伝子の低減されたレベルの遺伝子機能を有する、態様１または２の宿主細胞。
［態様３９］還元酵素をコードする前記遺伝子はｔｒｘＢである、態様３８の宿主細胞。
［態様４０］前記宿主細胞は、少なくとも１つのジスルフィド結合イソメラーゼタンパク質をコードする少なくとも１つの発現コンストラクトを含む、態様１または２の宿主細胞。
［態様４１］少なくとも１つの発現コンストラクトは、ジスルフィド結合イソメラーゼタンパク質ＤｓｂＣをコードする、態様４０の宿主細胞。
［態様４２］前記宿主細胞は、シグナルペプチドを欠くＤｓｂＣの形態をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、態様１または２の宿主細胞。
［態様４３］前記宿主細胞は、Ｅｒｖ１ｐをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、態様１または２の宿主細胞。
［態様４４］各タイプの前記発現コンストラクトは、各他のタイプの発現コンストラクトの前記誘導性プロモーターと異なる誘導性プロモーターを含む、態様１または２の宿主細胞。
［態様４５］各タイプの前記発現コンストラクトは、各他のタイプの前記発現コンストラクトの複製起点と異なる複製起点を含む、態様１または２の宿主細胞。
［態様４６］２つのタイプの発現コンストラクトを含む、大腸菌の宿主細胞であって、１つのタイプの発現コンストラクトは、ｐＢＡＤ２４プラスミド内にポリヌクレオチド配列を挿入する工程を含む方法により産生され、他のタイプの発現コンストラクトは、ｐＰＲＯ３３プラスミド内にポリヌクレオチド配列を挿入する工程を含む方法により産生され、２つまたはそれ以上の以下の、（ａ）ａｒａＢＡＤ遺伝子の欠失；（ｂ）変異した遺伝子機能のａｒａＥおよびａｒａＦＧＨ遺伝子；（ｃ）ｌａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）遺伝子；（ｄ）低減された遺伝子機能のｐｒｐＢおよびｐｒｐＤ遺伝子；（ｅ）好ましくはｙｇｆＩ遺伝子の発現に影響を及ぼさない、低減された遺伝子機能のｓｂｍ／ｓｃｐＡ−ｙｇｆＤ／ａｒｇＫ−ｙｇｆＧＨ／ｓｃｐＢＣ遺伝子；（ｆ）低減された遺伝子機能のｇｏｒおよびｔｒｘＢ遺伝子；（ｇ）低減された遺伝子機能のＡｓｃＧ遺伝子；（ｈ）シグナルペプチドを欠くＤｓｂＣの形態をコードするポリヌクレオチド；（ｉ）Ｅｒｖ１ｐをコードするポリヌクレオチド；（ｊ）タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードするポリヌクレオチド；（ｊ）ＣｈｕＡをコードするポリヌクレオチド；および（ｌ）シャペロンをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、宿主細胞。
［態様４７］少なくとも１つの発現コンストラクトが、誘導性プロモーターから転写されるための遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、態様４６の宿主細胞。
［態様４８］前記遺伝子産物は、（ａ）免疫グロブリン重鎖、（ｂ）免疫グロブリン軽鎖、および（ｃ）（ａ）から（ｂ）のいずれかのフラグメント、からなる群から選択される、態様４７の宿主細胞。
［態様４９］遺伝子産物を産生する方法であって、態様１または２の前記宿主細胞の培養を増殖させることと、前記培養に少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質を添加することを含む、方法。
［態様５０］態様４９の方法により産生される、遺伝子産物。
［態様５１］前記遺伝子産物は多量体産物である、態様５０に記載の遺伝子産物。
［態様５２］前記多量体産物は抗体である、態様５１に記載の多量体産物。
［態様５３］前記多量体産物はアグリコシル化抗体である、態様５２に記載の多量体産物。
［態様５４］前記多量体産物はヒト抗体である、態様５２に記載の多量体産物。
［態様５５］態様１または２の前記宿主細胞を含む、キット。
［態様５６］態様５０の前記遺伝子産物を含む、キット。
［態様５７］態様５１の前記多量体産物を含む、キット。

Claims (24)

  1. ２つまたはそれ以上のタイプの発現コンストラクトを含む宿主細胞であって、
    各タイプの前記発現コンストラクトは、誘導性プロモーターおよび該誘導性プロモーターから転写されるための遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含み、
    少なくとも１つの前記誘導性プロモーターは、別の前記誘導性プロモーターの誘導物質と異なる誘導物質に対して応答性があり、各誘導性プロモーターは炭素源誘導物質によって誘導性であり、且つラクトース誘導性プロモーターではなく、
    前記宿主細胞は、少なくとも１つの前記誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の低減されたレベルを有し、
    少なくとも１つの前記遺伝子産物は、別の前記遺伝子産物と多量体を形成する遺伝子産物からなる群より選択され、少なくとも２つのジスルフィド結合を形成するポリペプチドである、宿主細胞。
  2. 少なくとも１つの誘導性プロモーターがプロピオネート誘導性プロモーターである、請求項１に記載の宿主細胞。
  3. 少なくとも１つの誘導性プロモーターがＬ−アラビノース誘導性プロモーターである、請求項１又は２に記載の宿主細胞。
  4. 少なくとも１つの誘導性プロモーターが、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｐｒｐＢＣＤＥプロモーター、ｒｈａＳＲプロモーター、およびｘｌｙＡプロモーターからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  5. 少なくとも１つの遺伝子産物が、（ａ）免疫グロブリン重鎖、（ｂ）免疫グロブリン軽鎖、および（ｃ）（ａ）から（ｂ）のいずれかのフラグメント、からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  6. 少なくとも１つの遺伝子産物が、シグナルペプチドを欠くポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  7. 少なくとも１つの遺伝子産物が、シグナルペプチドを欠くポリペプチドであり、少なくとも３つのジスルフィド結合を形成する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  8. 少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする遺伝子が、ａｒａＡ、ａｒａＢ、ａｒａＤ、ｐｒｐＢ、ｐｒｐＤ、ｒｈａＡ、ｒｈａＢ、ｒｈａＤ、ｘｙｌＡ、およびｘｙｌＢからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  9. 少なくとも１つの遺伝子産物が、成熟インスリンのポリペプチド鎖を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  10. 宿主細胞が、少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質についての輸送タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の変異を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  11. 輸送タンパク質をコードする遺伝子が、ａｒａＥ、ａｒａＦ、ａｒａＧ、ａｒａＨ、ｒｈａＴ、ｘｙｌＦ、ｘｙｌＧ、およびｘｙｌＨからなる群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
  12. 宿主細胞が、少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質の生合成を伴うタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の低減されたレベルを有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  13. 少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質の生合成を伴うタンパク質をコードする遺伝子が、ｓｃｐＡ／ｓｂｍ、ａｒｇＫ／ｙｇｆＤ、ｓｃｐＢ／ｙｇｆＧ、ｓｃｐＣ／ｙｇｆＨ、ｒｍｌＡ、ｒｍｌＢ、ｒｍｌＣ、およびｒｍｌＤからなる群から選択される、請求項１２に記載の宿主細胞。
  14. 宿主細胞が、該宿主細胞の細胞質の還元／酸化環境に影響を及ぼす遺伝子の変異した遺伝子機能を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  15. 宿主細胞の細胞質の還元／酸化環境に影響を及ぼす遺伝子が、ｇｏｒおよびｇｓｈＢからなる群から選択される、請求項１４に記載の宿主細胞。
  16. 宿主細胞が、還元酵素をコードする遺伝子の低減されたレベルの遺伝子機能を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  17. 還元酵素をコードする遺伝子がｔｒｘＢである、請求項１６に記載の宿主細胞。
  18. 宿主細胞が、少なくとも１つのジスルフィド結合イソメラーゼタンパク質をコードする少なくとも１つの発現コンストラクトを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  19. 宿主細胞が、シグナルペプチドを欠くＤｓｂＣの形態をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  20. 宿主細胞が、Ｅｒｖ１ｐをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  21. 宿主細胞が原核細胞である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  22. 宿主細胞が大腸菌である、請求項２１に記載の宿主細胞。
  23. 請求項１〜２０のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養すること、及び該培養に少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質を添加することを含む、インビトロで遺伝子産物を産生する方法。
  24. 請求項１〜２０のいずれか１項に記載の宿主細胞を含む、キット。
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Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6463672B2 (ja) 2012-05-25 2019-02-06 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｔｃｒアルファ欠損ｔ細胞を増殖させるためのプレｔアルファまたはその機能性変種の使用
US20150353940A1 (en) 2013-08-05 2015-12-10 Absci, Llc Vectors for use in an inducible coexpression system
US12157766B2 (en) * 2012-08-05 2024-12-03 Absci Corporation Cytoplasmic expression system
US11077144B2 (en) 2013-05-13 2021-08-03 Cellectis CD19 specific chimeric antigen receptor and uses thereof
JP6788255B2 (ja) * 2015-11-19 2020-11-25 国立大学法人信州大学 新規ベクター及びこれを用いた可溶化タンパク質の製造方法
CN106190940B (zh) * 2016-07-19 2019-06-14 北京三元基因药业股份有限公司 表达抗TNF抗体Fab片段的重组大肠杆菌工程菌
HUE046449T2 (hu) 2016-09-13 2020-03-30 Allergan Inc Stabilizált, nem fehérje eredetû, clostridiális toxin készítmények
EP3765077A4 (en) * 2018-03-14 2022-01-05 Technion Research & Development Foundation Limited PROGNOSTIC BIOMARKER IN CANCER
JP7174990B2 (ja) * 2018-07-23 2022-11-18 国立大学法人山口大学 原核生物用発現ベクター
BR112021005634A2 (pt) 2018-09-25 2021-06-29 Absci, Llc métodos de purificação de proteína
SG11202104493WA (en) 2018-11-08 2021-05-28 Sutro Biopharma Inc E coli strains having an oxidative cytoplasm
CN109371049A (zh) * 2018-11-14 2019-02-22 天津大学 分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用
CN111269294B (zh) * 2018-12-05 2023-03-28 广州中国科学院先进技术研究所 纤维寡糖转运蛋白LacY的突变位点、突变转运蛋白LacY及其制备方法和应用
WO2020198830A1 (en) * 2019-04-04 2020-10-08 Braskem S.A. Metabolic engineering for simultaneous consumption of xylose and glucose for production of chemicals from second generation sugars
CN110616181A (zh) * 2019-09-27 2019-12-27 北京理工大学 一株基于大肠杆菌改造的工程菌株
CN112980891B (zh) * 2019-12-16 2023-12-12 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一种基于CRISPR-Cas的大肠杆菌基因组编辑工具
CN113122552B (zh) * 2021-04-21 2022-07-26 西北农林科技大学 黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX4及其灰霉菌感病性的应用
IL311389A (en) 2021-09-17 2024-05-01 Absci Corp Transfer RNA composition and use in the production of proteins containing non-standard amino acids
WO2024006269A1 (en) * 2022-06-29 2024-01-04 Absci Corporation Affinity screening method
EP4573553A1 (en) 2022-08-15 2025-06-25 ABSCI Corporation Quantitative affinity activity specific cell enrichment
US20240239854A1 (en) 2022-12-21 2024-07-18 Donald Danforth Plant Science Center Antimicrobial peptides and modifications thereof
CN116875524B (zh) * 2023-09-08 2024-03-26 清华大学 一种在微生物中调控多基因表达的方法及其应用
WO2025058962A1 (en) 2023-09-11 2025-03-20 Absci Corporation High-throughput methods for kinetic characterization, quantifying and optimizing antibodies and antibody fragments expression in bacteria
US20250109209A1 (en) 2023-10-03 2025-04-03 Absci Corporation Tl1a associated antibody compositions and methods of use
WO2025122885A1 (en) 2023-12-08 2025-06-12 Absci Corporation Anti-her2 associated antibody compositions designed by artificial intelligence and methods of use
CN118064437B (zh) * 2024-04-24 2024-09-10 山东福洋生物科技股份有限公司 一种多启动子结构元件及其构建方法和应用
CN119410683B (zh) * 2025-01-08 2025-05-23 北京化工大学 一种生物发酵-全细胞催化级联生产己二酸的方法

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2660397A (en) 1996-04-05 1997-10-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells
US6083715A (en) * 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
CN1064052C (zh) * 1997-09-29 2001-04-04 中国科学院微生物研究所 甲状旁腺素相关蛋白人源化抗体及其制备方法
US6872563B1 (en) * 1999-10-05 2005-03-29 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for production of disulfide bond containing proteins in host cells
DK1268823T3 (da) 2000-03-24 2008-03-10 Xoma Technology Ltd Fremgangsmåder og celler til ekspression af rekombinante proteinprodukter
US6979556B2 (en) * 2000-12-14 2005-12-27 Genentech, Inc. Separate-cistron contructs for secretion of aglycosylated antibodies from prokaryotes
DE60224291T2 (de) * 2001-08-27 2008-12-11 Genentech, Inc., South San Francisco System zur antikörperexpression und- synthese
AU2003228084A1 (en) * 2002-05-28 2003-12-12 Omrix Biopharmaceuticals Inc. Method for obtaining anti-idiotype antibodies
DE60325611D1 (de) * 2002-07-03 2009-02-12 Dow Global Technologies Inc Benzoat- und antranilatinduzierbare promotoren
ES2288630T3 (es) * 2002-12-02 2008-01-16 Basf Aktiengesellschaft Sistema de expresion, que puede ser inducido por medio de la l-ramnosa.
EP1888763B1 (en) * 2005-06-06 2015-08-12 Pfenex Inc. Mannitol induced promoter systems in bacterial host cells
US7351563B2 (en) 2005-06-10 2008-04-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cell-free extracts and synthesis of active hydrogenase
US8178338B2 (en) 2005-07-01 2012-05-15 The Regents Of The University Of California Inducible expression vectors and methods of use thereof
JP4270466B2 (ja) * 2005-09-02 2009-06-03 国立大学法人福井大学 ＮＡＤａｓｅ、ＳＮＩおよびＳＬＯ遺伝子を含むオペロンから発現するタンパク質の製造方法、それにより得られるタンパク質およびその使用
US7816117B2 (en) 2006-04-26 2010-10-19 President And Fellows Of Harvard College Prokaryotic host cells for expressing proteins rich in disulfide bonds
EP2155868A2 (en) * 2007-04-19 2010-02-24 Codon Devices, Inc Engineered nucleases and their uses for nucleic acid assembly
WO2008137475A2 (en) 2007-05-01 2008-11-13 Research Development Foundation Immunoglobulin fc libraries
JP5667880B2 (ja) 2008-01-03 2015-02-12 コーネル リサーチ ファンデーション インコーポレイテッド 原核生物におけるグリコシル化されたタンパク質の発現方法
FI20095615A0 (fi) * 2009-06-02 2009-06-02 Oulun Yliopisto Menetelmä luonnollisesti laskostuneiden proteiinien tuottamiseksi prokaryootti-isännässä
WO2011116184A2 (en) * 2010-03-17 2011-09-22 Cornell University Methods and compositions for targeted mutagenesis in bacteria
EP2386641A1 (en) * 2010-05-11 2011-11-16 Université Catholique De Louvain Method for extracellular production of recombinant biomolecules in a microorganism
FI20115115A0 (fi) 2011-02-04 2011-02-04 Oulun Yliopisto Menetelmä disulfidisidoksia sisältävien proteiinien tuottamiseksi prokaryoottisytoplasmassa

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