JP6454172B2 - Hepatocyte culture method - Google Patents
Hepatocyte culture method Download PDFInfo
- Publication number
- JP6454172B2 JP6454172B2 JP2015025866A JP2015025866A JP6454172B2 JP 6454172 B2 JP6454172 B2 JP 6454172B2 JP 2015025866 A JP2015025866 A JP 2015025866A JP 2015025866 A JP2015025866 A JP 2015025866A JP 6454172 B2 JP6454172 B2 JP 6454172B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fiber
- hepatocytes
- fiber assembly
- fibers
- laminin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 title claims description 135
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title description 9
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 233
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 51
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims description 47
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 47
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 39
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 22
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 50
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 50
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 41
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 30
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 29
- 239000012784 inorganic fiber Substances 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 19
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 19
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 18
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 17
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 14
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 12
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 10
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 8
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 8
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 8
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 8
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 102000004328 Cytochrome P-450 CYP3A Human genes 0.000 description 6
- 108010081668 Cytochrome P-450 CYP3A Proteins 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 6
- 239000004745 nonwoven fabric Substances 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 4
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000001523 electrospinning Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910018072 Al 2 O 3 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 2
- BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N Tetraethyl orthosilicate Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)OCC BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 2
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 108010015046 cell aggregation factors Proteins 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 239000008119 colloidal silica Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 238000010041 electrostatic spinning Methods 0.000 description 2
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 2
- 238000002149 energy-dispersive X-ray emission spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 2
- 150000002736 metal compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 2
- 239000012209 synthetic fiber Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- -1 ytterbium Chemical class 0.000 description 2
- 229920002972 Acrylic fiber Polymers 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 235000012766 Cannabis sativa ssp. sativa var. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000012765 Cannabis sativa ssp. sativa var. spontanea Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000049 Carbon (fiber) Polymers 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 229910052684 Cerium Inorganic materials 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 229910052691 Erbium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 description 1
- GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N Gallium Chemical compound [Ga] GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910005793 GeO 2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 229910001030 Iron–nickel alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910013641 LiNbO 3 Inorganic materials 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052765 Lutetium Inorganic materials 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229910052779 Neodymium Inorganic materials 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052777 Praseodymium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 229910052773 Promethium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000297 Rayon Polymers 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 229910052772 Samarium Inorganic materials 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910006404 SnO 2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002367 SrTiO Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052771 Terbium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052775 Thulium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910010413 TiO 2 Inorganic materials 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 229920002978 Vinylon Polymers 0.000 description 1
- 229910052769 Ytterbium Inorganic materials 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N Zirconium Chemical compound [Zr] QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006221 acetate fiber Polymers 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 150000004703 alkoxides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052787 antimony Inorganic materials 0.000 description 1
- WATWJIUSRGPENY-UHFFFAOYSA-N antimony atom Chemical compound [Sb] WATWJIUSRGPENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052788 barium Inorganic materials 0.000 description 1
- DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N barium atom Chemical compound [Ba] DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052790 beryllium Inorganic materials 0.000 description 1
- ATBAMAFKBVZNFJ-UHFFFAOYSA-N beryllium atom Chemical compound [Be] ATBAMAFKBVZNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052797 bismuth Inorganic materials 0.000 description 1
- JCXGWMGPZLAOME-UHFFFAOYSA-N bismuth atom Chemical compound [Bi] JCXGWMGPZLAOME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 235000009120 camo Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004917 carbon fiber Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- GWXLDORMOJMVQZ-UHFFFAOYSA-N cerium Chemical compound [Ce] GWXLDORMOJMVQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005607 chanvre indien Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- NDPNROHECXQBPK-UHFFFAOYSA-N dysprosium holmium Chemical compound [Dy][Ho] NDPNROHECXQBPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 1
- UYAHIZSMUZPPFV-UHFFFAOYSA-N erbium Chemical compound [Er] UYAHIZSMUZPPFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002573 ethenylidene group Chemical group [*]=C=C([H])[H] 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052733 gallium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052732 germanium Inorganic materials 0.000 description 1
- GNPVGFCGXDBREM-UHFFFAOYSA-N germanium atom Chemical compound [Ge] GNPVGFCGXDBREM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229910052735 hafnium Inorganic materials 0.000 description 1
- VBJZVLUMGGDVMO-UHFFFAOYSA-N hafnium atom Chemical compound [Hf] VBJZVLUMGGDVMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011487 hemp Substances 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010224 hepatic metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910052746 lanthanum Inorganic materials 0.000 description 1
- FZLIPJUXYLNCLC-UHFFFAOYSA-N lanthanum atom Chemical compound [La] FZLIPJUXYLNCLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- OHSVLFRHMCKCQY-UHFFFAOYSA-N lutetium atom Chemical compound [Lu] OHSVLFRHMCKCQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- QEFYFXOXNSNQGX-UHFFFAOYSA-N neodymium atom Chemical compound [Nd] QEFYFXOXNSNQGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052758 niobium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010955 niobium Substances 0.000 description 1
- GUCVJGMIXFAOAE-UHFFFAOYSA-N niobium atom Chemical compound [Nb] GUCVJGMIXFAOAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000098 polyolefin Polymers 0.000 description 1
- 229920006306 polyurethane fiber Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- PUDIUYLPXJFUGB-UHFFFAOYSA-N praseodymium atom Chemical compound [Pr] PUDIUYLPXJFUGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- VQMWBBYLQSCNPO-UHFFFAOYSA-N promethium atom Chemical compound [Pm] VQMWBBYLQSCNPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002964 rayon Substances 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 229910052701 rubidium Inorganic materials 0.000 description 1
- IGLNJRXAVVLDKE-UHFFFAOYSA-N rubidium atom Chemical compound [Rb] IGLNJRXAVVLDKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZUNJOHGWZRPMI-UHFFFAOYSA-N samarium atom Chemical compound [Sm] KZUNJOHGWZRPMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052706 scandium Inorganic materials 0.000 description 1
- SIXSYDAISGFNSX-UHFFFAOYSA-N scandium atom Chemical compound [Sc] SIXSYDAISGFNSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 229910052712 strontium Inorganic materials 0.000 description 1
- CIOAGBVUUVVLOB-UHFFFAOYSA-N strontium atom Chemical compound [Sr] CIOAGBVUUVVLOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 229910052715 tantalum Inorganic materials 0.000 description 1
- GUVRBAGPIYLISA-UHFFFAOYSA-N tantalum atom Chemical compound [Ta] GUVRBAGPIYLISA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052714 tellurium Inorganic materials 0.000 description 1
- PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N tellurium atom Chemical compound [Te] PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N terbium atom Chemical compound [Tb] GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052716 thallium Inorganic materials 0.000 description 1
- BKVIYDNLLOSFOA-UHFFFAOYSA-N thallium Chemical compound [Tl] BKVIYDNLLOSFOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052718 tin Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- LEONUFNNVUYDNQ-UHFFFAOYSA-N vanadium atom Chemical compound [V] LEONUFNNVUYDNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
- 239000002759 woven fabric Substances 0.000 description 1
- NAWDYIZEMPQZHO-UHFFFAOYSA-N ytterbium Chemical compound [Yb] NAWDYIZEMPQZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 1
- VWQVUPCCIRVNHF-UHFFFAOYSA-N yttrium atom Chemical compound [Y] VWQVUPCCIRVNHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052726 zirconium Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は肝細胞の培養方法に関する。 The present invention relates to a method for culturing hepatocytes.
生体内における薬剤の代謝のほとんどは肝臓で行なわれることから、創薬の非臨床試験では、生体から分離した正常肝細胞を用いて代謝試験を実施することが推奨されている。また、一般化学物質、食品中化学物質、新規素材などにおいても、有害性・安全性評価のために正常肝細胞を用いた評価が実施されている。 Since most of the metabolism of drugs in vivo is performed in the liver, it is recommended that non-clinical tests for drug discovery be conducted using normal hepatocytes isolated from the body. In addition, general chemical substances, chemical substances in foods, new materials, etc. are also evaluated using normal hepatocytes for hazard / safety evaluation.
このような正常肝細胞は新鮮状態で入手することが困難であるため、凍結保存されたものが多く用いられているが、凍結肝細胞は解凍後の寿命が短く、最も一般的なプロトコルとして推奨されている、Ｉ型コラーゲンコートプレートによる単層培養法では、培養２〜３日程度で、肝代謝試験に重要な酵素活性が失われてしまう、という問題があった。 Since these normal hepatocytes are difficult to obtain in a fresh state, frozen ones are often used, but frozen hepatocytes have a short life after thawing and are recommended as the most common protocol. In the monolayer culture method using a type I collagen-coated plate, there is a problem that enzyme activity important for liver metabolism test is lost in about 2 to 3 days of culture.
そのため、このような問題を解決するための方法として、細胞外基質のゲルで肝細胞を挟み込むサンドイッチ培養法（特許文献１）や、肝細胞の生存や機能維持を補助する異種細胞と共培養する方法（特許文献２）が提案されている。 Therefore, as a method for solving these problems, a sandwich culture method (Patent Document 1) in which hepatocytes are sandwiched between gels of extracellular matrix, or co-culture with heterogeneous cells that assist the survival and function maintenance of hepatocytes. A method (Patent Document 2) has been proposed.
しかしながら、前者のサンドイッチ培養法は、厳格な水素イオン指数や温度の管理や、肝細胞播種後に、再度、ゲルを重層する必要があるなど、作業工程が多く、培養するのが煩雑で、また、ハイスループット分析装置への適用が困難であった。また、ゲルでサンドイッチしているが故に、薬剤が肝細胞に到達しにくい、或いは肝細胞成分を抽出するのに手間がかかるなど、様々な問題点を有していた。 However, the former sandwich culture method requires strict control of the hydrogen ion index and temperature, and it is necessary to layer the gel again after hepatocyte seeding. It was difficult to apply to a high-throughput analyzer. In addition, since it is sandwiched by gels, it has various problems such that it is difficult for the drug to reach hepatocytes or it takes time to extract hepatocyte components.
一方、後者の共培養する方法は、予め異種細胞を培養するのに手間がかかる、異種細胞と共培養しているが故に、肝細胞の応答だけを解析するのが難しい、という問題を有していた。 On the other hand, the latter co-culture method has the problem that it takes time to cultivate foreign cells in advance, and it is difficult to analyze only the response of hepatocytes because it is co-cultured with foreign cells. It was.
なお、本願出願人らは、「平均繊維径３μｍ以下の無機系繊維からなる無機系繊維集合体の内部を含む全体が無機系接着剤で接着され、繊維表面に細胞機能性因子が付与され、空隙率が９０％以上の高機能繊維構造体を培養担体として用いる」ことを提案した（特許文献３）。しかしながら、この高機能繊維構造体が肝細胞の培養担体として有用であることは認識していなかった。 In addition, the applicants of the present application stated that “the whole including the inside of the inorganic fiber assembly composed of inorganic fibers having an average fiber diameter of 3 μm or less is adhered with an inorganic adhesive, and a cell functional factor is imparted to the fiber surface, It was proposed that a highly functional fiber structure having a porosity of 90% or more is used as a culture carrier (Patent Document 3). However, it has not been recognized that this highly functional fiber structure is useful as a culture carrier for hepatocytes.
本発明は上述のような問題点を解決するためになされたものであり、簡易に、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養でき、また、肝細胞を評価、解析しやすい、肝細胞の培養方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made to solve the above-described problems, and can easily culture hepatocytes capable of maintaining enzyme activity for a long period of time, and can easily evaluate and analyze hepatocytes. It is an object of the present invention to provide a culture method of
本発明の請求項１にかかる発明は、「単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体を細胞培養担体として用い、肝細胞を５日間以上培養する方法であり、前記繊維集合体を構成する繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを繊維表面積１ｃｍ ２ あたり０．２９μｇ〜４．２μｇ含有していることを特徴とする、肝細胞の培養方法。」である。
The invention according to
本発明の請求項１にかかる発明は、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上であり、しかも繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを繊維表面積１ｃｍ ２ あたり０．２９μｇ〜４．２μｇ含有している繊維集合体を細胞培養担体として用いて肝細胞を培養すると、凍結肝細胞であっても、簡易に、酵素活性を５日間以上という長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できるため、反復曝露などの実際の生体に近い代謝試験を実施できることを見出したものである。このように酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できる機構は明らかではないが、本発明者らは、単位体積あたりの表面積が広い繊維集合体を使用することによって、肝細胞が繊維集合体内部に入り込み、あるいは、繊維間に形成される孔に入り込み、立体的及び／又は多点的に接触することにより、細胞接着因子であるラミニン又はフィブロネクチンと肝細胞の接触面積が広くなるため、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できると考えている。つまり、このような肝細胞と細胞接着因子とが立体的及び／又は多点的に、広く接触した構造は、生体内の組織構造に類似しており、生体内で肝細胞を取り巻く微小環境を再現しているため、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できると考えている。
The invention according to
また、繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを繊維表面積１ｃｍ ２ あたり０．２９μｇ〜４．２μｇ含有している、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体を、単に細胞培養担体として使用すれば良く、厳格な水素イオン指数や温度の管理やゲルを重層する必要がなく、また、異種細胞を培養する必要もないため、簡易な培養方法であり、ハイスループット分析装置への適用も容易である。
In addition, a fiber assembly containing laminin or fibronectin on the fiber surface of 0.29 μg to 4.2 μg per 1 cm 2 of fiber surface area and having a surface area per unit volume of 0.01 m 2 / cm 3 or more is simply obtained as a cell culture carrier. This is a simple culture method and can be applied to high-throughput analyzers because there is no need for strict hydrogen ion index, temperature control, gel overlaying, or culturing of heterogeneous cells. Is also easy.
更に、ゲルでサンドイッチする訳でもないため、薬剤が肝細胞へ浸透しやすく、肝細胞成分を抽出するためにゲルを消化分解するという処理も不要であり、更には、共培養している訳ではないため、肝細胞の応答だけを解析できるなど、肝細胞を評価、解析しやすい。 Furthermore, since the gel is not sandwiched, the drug easily penetrates into hepatocytes, and there is no need for digestion and degradation of the gel to extract hepatocyte components. Therefore, it is easy to evaluate and analyze hepatocytes, for example, only the response of hepatocytes can be analyzed.
本発明の肝細胞の培養方法において使用する細胞培養担体は、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体であり、その繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを有している。このように、単位体積あたりの表面積が広い繊維集合体を使用することによって、肝細胞が繊維集合体内部に入り込み、あるいは、繊維間に形成される孔に入り込み、立体的及び／又は多点的に接触することにより、細胞接着因子であるラミニン又はフィブロネクチンと肝細胞の接触面積が広く、ラミニン又はフィブロネクチンが効果的に肝細胞に作用し、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できると考えられるため、単位体積あたりの表面積は０．０５ｍ２／ｃｍ３以上であるのが好ましく、０．１ｍ２／ｃｍ３以上であるのがより好ましく、０．１２ｍ２／ｃｍ３以上であるのが更に好ましい。なお、単位体積あたりの表面積の上限は特に限定するものではないが、繊維の充填密度が高くなり過ぎると、肝細胞が繊維集合体内部に入り込みにくくなり、あるいは、繊維間に形成される孔に入り込みにくくなり、立体的及び／又は多点的に接触するのが難しくなる結果、細胞接着因子であるラミニン又はフィブロネクチンと肝細胞の接触面積が狭くなる傾向があるため、３０ｍ２／ｃｍ３以下であるのが好ましい。 The cell culture carrier used in the method for culturing hepatocytes of the present invention is a fiber assembly having a surface area per unit volume of 0.01 m 2 / cm 3 or more, and has laminin or fibronectin on the fiber surface. Thus, by using a fiber assembly having a large surface area per unit volume, hepatocytes enter the inside of the fiber assembly, or enter pores formed between the fibers, and are three-dimensional and / or multipoint. The contact area between laminin or fibronectin, which is a cell adhesion factor, and hepatocytes is wide, and laminin or fibronectin effectively acts on hepatocytes, and hepatocytes that can maintain enzyme activity over a long period can be cultured. it is considered, the surface area per unit volume is preferably at 0.05 m 2 / cm 3 or more, more preferably 0.1 m 2 / cm 3 or more, 0.12 m 2 / cm 3 or more Is more preferable. The upper limit of the surface area per unit volume is not particularly limited, but if the fiber packing density becomes too high, hepatocytes are less likely to enter the fiber assembly, or pores formed between the fibers. As a result, it becomes difficult to make a three-dimensional and / or multi-point contact, and as a result, the contact area between laminin or fibronectin, which is a cell adhesion factor, and hepatocytes tends to be narrowed. Therefore, at 30 m 2 / cm 3 or less Preferably there is.
この「単位体積あたりの表面積（＝Ｓ、単位：ｍ２／ｃｍ３）」は、平均繊維径（＝Ａ、単位：μｍ）、平均目付（＝Ｂ、単位：ｇ／ｍ２）、平均厚さ（＝Ｃ、単位：μｍ）及び繊維の密度（＝Ｄ、単位：ｇ／ｃｍ３）を用い、次の式から算出される値である。
Ｓ＝４Ｂ／（ＡＣＤ）
The “surface area per unit volume (= S, unit: m 2 / cm 3 )” is the average fiber diameter (= A, unit: μm), average basis weight (= B, unit: g / m 2 ), average thickness This is a value calculated from the following equation using the thickness (= C, unit: μm) and the density of the fiber (= D, unit: g / cm 3 ).
S = 4B / (ACD)
なお、この単位体積あたりの表面積は、次の考え方を根拠としている。
（１）平均繊維径がＡμｍで、繊維の密度がＤｇ／ｃｍ３である時、繊維の単位質量あたりの表面積は、４／（ＡＤ）（単位：ｍ２／ｇ）と表すことができる。
（２）平均目付Ｂｇ／ｍ２あたりの繊維のトータルの表面積は、４Ｂ／（ＡＤ）（単位：ｍ２）と表すことができる。
（３）１ｍ２（＝目付）あたり、厚さがＣμｍの繊維集合体の空隙も含めた体積は、１０−６Ｃ（単位：ｍ３）と表すことができる。
（４）単位体積あたりの表面積は、４×１０６Ｂ／（ＡＣＤ）（単位：ｍ２／ｍ３）＝４Ｂ／（ＡＣＤ）（単位：ｍ２／ｃｍ３）と表すことができる。
The surface area per unit volume is based on the following concept.
(1) When the average fiber diameter is A μm and the fiber density is Dg / cm 3 , the surface area per unit mass of the fiber can be expressed as 4 / (AD) (unit: m 2 / g).
(2) The total surface area of the fibers per average basis weight Bg / m 2 can be expressed as 4B / (AD) (unit: m 2 ).
(3) The volume including the voids of the fiber assembly having a thickness of C μm per 1 m 2 (= basis weight) can be expressed as 10 −6 C (unit: m 3 ).
(4) The surface area per unit volume can be expressed as 4 × 10 6 B / (ACD) (unit: m 2 / m 3 ) = 4 B / (ACD) (unit: m 2 / cm 3 ).
本発明の繊維集合体を構成する繊維の平均繊維径は、前記単位体積あたりの表面積を満たせば良く、特に限定するものではないが、表面積が広く、ラミニン又はフィブロネクチンが効果的に肝細胞に作用できるように、３μｍ以下であるのが好ましく、２μｍ以下であるのがより好ましく、１μｍ以下であるのが更に好ましく、０．８μｍ以下であるのが更に好ましい。なお、平均繊維径の下限は特に限定するものではないが、０．０１μｍ以上であるのが好ましい。本発明における「平均繊維径」は５０点における繊維径の算術平均値をいい、「繊維径」は１０本以上の繊維が写る視野で繊維集合体を撮影した電子顕微鏡写真をもとに測定した繊維の太さをいう。 The average fiber diameter of the fibers constituting the fiber assembly of the present invention is not particularly limited as long as it satisfies the surface area per unit volume, but the surface area is large and laminin or fibronectin effectively acts on hepatocytes. Therefore, it is preferably 3 μm or less, more preferably 2 μm or less, further preferably 1 μm or less, and further preferably 0.8 μm or less. The lower limit of the average fiber diameter is not particularly limited, but is preferably 0.01 μm or more. “Average fiber diameter” in the present invention refers to an arithmetic average value of fiber diameters at 50 points, and “fiber diameter” is measured based on an electron micrograph obtained by photographing a fiber assembly in a field of view of 10 or more fibers. The thickness of the fiber.
また、本発明の繊維集合体の平均目付は前記単位体積あたりの表面積を満たせば良く、特に限定するものではないが、表面積が広く、ラミニン又はフィブロネクチンが効果的に作用できるように、０．５ｇ／ｍ２以上であるのが好ましく、２ｇ／ｍ２以上であるのがより好ましく、５ｇ／ｍ２以上であるのが更に好ましい。なお、平均目付の上限は特に限定するものではないが、１００ｇ／ｍ２以下であるのが好ましい。本発明における「平均目付」は、最も面積の広い面の面積及び質量を測定し、この面積と質量から、面積１ｍ２当たりの質量に換算した値を目付とし、１８点における目付の算術平均値をいう。 Further, the average basis weight of the fiber assembly of the present invention is not particularly limited as long as the surface area per unit volume is satisfied. However, 0.5 g is used so that laminin or fibronectin can act effectively. / M 2 or more is preferable, 2 g / m 2 or more is more preferable, and 5 g / m 2 or more is still more preferable. The upper limit of the average basis weight is not particularly limited, but is preferably 100 g / m 2 or less. The “average basis weight” in the present invention is the average of the basis weights at 18 points by measuring the area and mass of the widest surface and using the area and mass as the basis weight converted to the mass per 1 m 2 area. Say.
更に、本発明の繊維集合体の平均厚さは前記単位体積あたりの表面積を満たせば良く、特に限定するものではないが、肝細胞が細胞培養担体に立体的及び／又は多点的に接触しているのが好ましいことから、肝細胞の直径２０μｍと同程度以上の平均厚さであるのが望ましいが、必要以上に厚いと培地の流動性又は循環性が悪くなる傾向があるため、２０〜２０００μｍであるのが好ましく、４０〜１０００μｍであるのがより好ましく、１００〜３００μｍであるのが更に好ましい。本発明における「平均厚さ」は、最も面積の広い面のマイクロメーター法［荷重：０．５Ｎ（測定面積：直径１４．３ｍｍ）］で測定した値を厚さとし、５４箇所における算術平均値をいう。 Further, the average thickness of the fiber assembly of the present invention is not particularly limited as long as it satisfies the surface area per unit volume, but hepatocytes come into contact with the cell culture carrier in three-dimensional and / or multipoint manner. It is preferable that the average thickness is equal to or more than 20 μm in diameter of hepatocytes, but if it is thicker than necessary, the fluidity or circulatory property of the medium tends to deteriorate. It is preferably 2000 μm, more preferably 40 to 1000 μm, and still more preferably 100 to 300 μm. The “average thickness” in the present invention is the value measured by the micrometer method [load: 0.5 N (measurement area: diameter 14.3 mm)] of the surface with the widest area, and the arithmetic average value at 54 locations is the thickness. Say.
更に、繊維の密度は前記単位体積あたりの表面積を満たせば良く、特に限定するものではないが、繊維の密度が細胞培養に使用する代表的な緩衝液である生理食塩水よりも低いと、培養操作時に取り扱いづらいため、１．００３〜１６ｇ／ｃｍ３であるのが好ましく、１．０５〜１０ｇ／ｃｍ３であるのがより好ましく、１．１〜６ｇ／ｃｍ３であるのが更に好ましい。本発明における「繊維の密度」は、繊維の元素分析を行い、９９％以上が同一素材から構成されていることが確認された場合には、素材そのものの比重を密度とし、９９％未満が同一素材で、二種類以上の素材から構成されていることが確認された場合には、ピクノメータ理論に基づき、定容積膨張法［例えば、乾式自動密度計（株式会社島津製作所製、アキュピックII）で測定可能］により測定した値を密度とする。 Further, the fiber density is not particularly limited as long as the fiber density satisfies the surface area per unit volume. If the fiber density is lower than physiological saline, which is a typical buffer used for cell culture, since difficult handling during operation, is preferably from 1.003~16g / cm 3, more preferably from 1.05~10g / cm 3, and even more preferably 1.1~6g / cm 3. The “fiber density” in the present invention is the density of the specific gravity of the material itself when the elemental analysis of the fiber is performed and it is confirmed that 99% or more is composed of the same material, and less than 99% is the same. If it is confirmed that the material is composed of two or more types of materials, based on the pycnometer theory, measure by the constant volume expansion method [for example, dry type automatic densimeter (manufactured by Shimadzu Corporation, Accupic II). The value measured in [Available] is the density.
本発明の繊維集合体は肝細胞を培養しやすいように、肝細胞の大きさの０．１〜２倍の平均孔径を有するのが好ましい。肝細胞の大きさは約２０μｍであるため、繊維集合体の平均孔径は２〜４０μｍであるのが好ましく、４〜２０μｍであるのがより好ましく、６〜１０μｍであるのが更に好ましい。なお、平均孔径は、ＡＳＴＭ−Ｆ３１６に規定されている方法により得られる平均流量孔径の値をいい、ポロメータ［Ｐｏｌｏｍｅｔｅｒ、コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）社製］を用いて、ミーンフローポイント法により測定される値をいう。 The fiber assembly of the present invention preferably has an average pore size 0.1 to 2 times the size of hepatocytes so that hepatocytes can be easily cultured. Since the size of the hepatocytes is about 20 μm, the average pore size of the fiber assembly is preferably 2 to 40 μm, more preferably 4 to 20 μm, and even more preferably 6 to 10 μm. The average pore diameter refers to the value of the average flow pore diameter obtained by the method prescribed in ASTM-F316, and is a value measured by the mean flow point method using a porometer [Polometer, manufactured by Coulter, Inc.]. Say.
本発明の繊維集合体の形態は肝細胞の培養に適用できる形態であれば良く、特に限定するものではないが、例えば、不織布、織物、編物のような二次元的形態、中空円筒形、円筒形などの三次元的形態であることができる。なお、三次元的形態の繊維集合体は、例えば、不織布形態等の二次元的形態の繊維集合体を成形することによって製造できる。 The form of the fiber assembly of the present invention is not particularly limited as long as it can be applied to the culture of hepatocytes. For example, a two-dimensional form such as a nonwoven fabric, a woven fabric, and a knitted fabric, a hollow cylindrical shape, a cylindrical shape It can be a three-dimensional form such as a shape. The three-dimensional fiber assembly can be manufactured, for example, by molding a two-dimensional fiber assembly such as a nonwoven fabric.
本発明の繊維集合体は繊維集合体の内部及び／又は繊維間に形成される孔に、肝細胞が入り込み、繊維表面のラミニン又はフィブロネクチンが有効に作用しやすいように、空隙率が９０％以上であるのが好ましく、９１％以上であるのがより好ましく、９２％以上であるのが更に好ましく、９３％以上であるのが更に好ましく、９４％以上であるのが更に好ましい。空隙率の上限は特に限定するものではないが、形態安定性に優れるように、９９．９％以下であるのが好ましい。 The fiber assembly of the present invention has a porosity of 90% or more so that hepatocytes can enter into the pores formed between and / or between the fiber assemblies and laminin or fibronectin on the fiber surface can easily act effectively. Preferably, it is 91% or more, more preferably 92% or more, still more preferably 93% or more, and still more preferably 94% or more. The upper limit of the porosity is not particularly limited, but is preferably 99.9% or less so as to be excellent in form stability.
本発明の「空隙率」は、次の式から算出した値である。
Ｐ＝［１−Ｍｓ／（Ｖ×ＳＧ）］×１００
ここで、Ｐは空隙率（単位：％）、Ｍｓは繊維集合体の質量（単位：ｇ）、Ｖは繊維集合体の占める見掛上の体積（単位：ｃｍ３）、ＳＧは繊維集合体構成繊維の密度（単位：ｇ／ｃｍ３）をそれぞれ表す。
The “porosity” of the present invention is a value calculated from the following equation.
P = [1-Ms / (V × SG)] × 100
Here, P is the porosity (unit:%), Ms is the mass of the fiber assembly (unit: g), V is the apparent volume occupied by the fiber assembly (unit: cm 3 ), and SG is the fiber assembly. Represents the density (unit: g / cm 3 ) of the constituent fibers.
例えば、繊維集合体が不織布のように厚さが均一なシート形態の場合は、次の式から算出することができる。
Ｐ＝［１−Ｍｎ／（ｔ×ＳＧ）］×１００
ここで、Ｐは空隙率（％）、Ｍｎは繊維集合体の平均目付（ｇ／ｍ２）、ｔは繊維集合体の平均厚さ（μｍ）、ＳＧは繊維集合体構成繊維の密度（単位：ｇ／ｃｍ３）をそれぞれ表す。
For example, when the fiber assembly is in the form of a sheet having a uniform thickness such as a nonwoven fabric, it can be calculated from the following equation.
P = [1-Mn / (t × SG)] × 100
Here, P is the porosity (%), Mn is the average basis weight (g / m 2 ) of the fiber assembly, t is the average thickness (μm) of the fiber assembly, and SG is the density (unit) of the fiber assembly constituent fibers. : G / cm 3 ) respectively.
本発明で使用する繊維集合体が二次元的形態（特に不織布）の場合、形態安定性に優れ、充分な強度を有するように、引張破断強度が０．２ＭＰａ以上であるのが好ましく、０．３ＭＰａ以上であるのがより好ましく、０．４ＭＰａ以上であるのが更に好ましく、０．５ＭＰａ以上であるのが更に好ましく、０．５５ＭＰａ以上であるのが更に好ましい。 When the fiber aggregate used in the present invention is in a two-dimensional form (particularly non-woven fabric), the tensile strength at break is preferably 0.2 MPa or more so that it has excellent form stability and sufficient strength. It is more preferably 3 MPa or more, further preferably 0.4 MPa or more, further preferably 0.5 MPa or more, and further preferably 0.55 MPa or more.
この「引張破断強度」は切断荷重を繊維集合体の断面積で除した商である。なお、切断荷重は次の条件で測定した値であり、断面積は測定時の試験片の幅（＝５ｍｍ）と平均厚さの積から得られる値である。 The “tensile breaking strength” is a quotient obtained by dividing the cutting load by the cross-sectional area of the fiber assembly. The cutting load is a value measured under the following conditions, and the cross-sectional area is a value obtained from the product of the width (= 5 mm) and average thickness of the test piece at the time of measurement.
製品名：小型引張試験機
型式：ＴＳＭ−０１−ｃｒｅ サーチ株式会社製
試験サイズ：５ｍｍ幅×４０ｍｍ長
チャック間間隔：２０ｍｍ
引張速度：２０ｍｍ／ｍｉｎ．
初荷重：５０ｍｇ／１ｄ
Product name: Small tensile tester Model: TSM-01-cre Search Co., Ltd. Test size: 5 mm width x 40 mm length Chuck spacing: 20 mm
Tensile speed: 20 mm / min.
Initial load: 50mg / 1d
本発明の繊維集合体の繊維単位質量あたりの水酸基量は特に限定するものではないが、ラミニン又はフィブロネクチンを繊維表面に付与する際の、ラミニン又はフィブロネクチンを含有する水溶液との親和性に優れるように、ある程度の量の水酸基が必要である一方で、水酸基量が過剰で親水性が高すぎると、繊維表面を水分子が取り巻き、ラミニン又はフィブロネクチンの繊維表面への吸着が阻害される場合があるため、５〜５００μｍｏｌ／ｇであるのが好ましく、１５〜３００μｍｏｌ／ｇであるのがより好ましく、３０〜１００μｍｏｌ／ｇであるのが更に好ましい。 The amount of hydroxyl group per fiber unit mass of the fiber assembly of the present invention is not particularly limited, but it is excellent in affinity with an aqueous solution containing laminin or fibronectin when laminin or fibronectin is applied to the fiber surface. On the other hand, while a certain amount of hydroxyl group is required, if the amount of hydroxyl group is excessive and the hydrophilicity is too high, water molecules surround the fiber surface, and adsorption of laminin or fibronectin to the fiber surface may be inhibited. 5 to 500 μmol / g is preferable, 15 to 300 μmol / g is more preferable, and 30 to 100 μmol / g is still more preferable.
この繊維単位質量あたりの水酸基量は、繊維集合体の水酸基量を水酸基量測定に用いた繊維集合体の繊維量（単位：ｇ）で除した商である。なお、「水酸基量」は、中和滴定法を用いて定量した値である。つまり、繊維集合体を２０ｖｏｌ％の塩化ナトリウム水溶液５０ｍＬ中に分散させた後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を中和点まで滴下し、中和に必要な水酸化ナトリウム滴下量から、繊維集合体の水酸基量を決定する（参考文献参照）。
（参考文献）
George W S.,Determination of Specific Sufface Area of Colloidal Silica by Titration with Sodium Hydroxide,Anal.Cheam.;28,1981-1983,(1956)
The amount of hydroxyl groups per unit mass of the fiber is a quotient obtained by dividing the amount of hydroxyl groups of the fiber assembly by the amount of fibers (unit: g) of the fiber assembly used for measuring the amount of hydroxyl groups. The “hydroxyl amount” is a value quantified using a neutralization titration method. That is, after dispersing the fiber assembly in 50 mL of a 20 vol% sodium chloride aqueous solution, a 0.1N sodium hydroxide aqueous solution was dropped to the neutralization point, and the fiber assembly was calculated from the amount of sodium hydroxide dropped required for neutralization. Determine the amount of hydroxyl groups (see references).
(References)
George W S., Determination of Specific Sufface Area of Colloidal Silica by Titration with Sodium Hydroxide, Anal.Cheam .; 28, 1981-1983, (1956)
本発明の繊維集合体を構成する繊維は前記単位体積あたりの表面積を満たす限り、特に限定するものではないが、例えば、ナイロン繊維、ビニロン繊維、ビニリデン繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ポリエステル繊維、アクリル繊維、ポリオレフィン繊維、ポリウレタン繊維、フッ素樹脂繊維などの合成繊維；レーヨン繊維などの再生繊維；アセテート繊維などの半合成繊維；金属酸化物成分を１種類以上含む繊維、炭素繊維などの無機系繊維；綿、麻、羊毛、絹などの天然繊維；を挙げることができ、単独で、又は２種類以上の繊維から構成することができる。これらの中でも、無機系繊維は剛性があり、培地中においても繊維集合体の形態を維持し、繊維集合体の広い表面積を有効に利用できるため好適であり、特に、金属酸化物成分を１種類以上含む繊維表面は生体親和性に優れ、ラミニン又はフィブロネクチンといった生体分子、並びに肝細胞との親和性に優れているため好適である。 The fiber constituting the fiber assembly of the present invention is not particularly limited as long as it satisfies the surface area per unit volume. For example, nylon fiber, vinylon fiber, vinylidene fiber, polyvinyl chloride fiber, polyester fiber, acrylic fiber Synthetic fibers such as polyolefin fibers, polyurethane fibers and fluororesin fibers; recycled fibers such as rayon fibers; semi-synthetic fibers such as acetate fibers; fibers containing one or more metal oxide components; inorganic fibers such as carbon fibers; cotton Natural fibers such as hemp, wool, silk, etc., and may be composed of one or more kinds of fibers. Among these, inorganic fibers are preferable because they have rigidity, maintain the shape of the fiber assembly even in the culture medium, and can effectively use the wide surface area of the fiber assembly. In particular, one type of metal oxide component is used. The fiber surface contained above is suitable because it is excellent in biocompatibility and excellent in affinity with biomolecules such as laminin or fibronectin and hepatocytes.
なお、好適である金属酸化物成分を１種類以上含む繊維の場合、ゲル状、乾燥ゲル状又は焼結した繊維であることができる。ゲル状繊維は溶媒を含む状態の繊維であり、乾燥ゲル状繊維はゲル状繊維中に含まれる溶媒などが抜けた多孔質の繊維であり、焼結繊維は乾燥ゲル状繊維が焼結した無孔質の繊維である。これらの中でも、焼結繊維は剛性に優れ、細胞培養時に形態安定性に優れているため好適である。このような金属酸化物成分を１種類以上含む繊維は保形性に優れているように、繊維集合体の３０ｍａｓｓ％以上を占めているのが好ましく、５０ｍａｓｓ％以上を占めているのがより好ましく、７０ｍａｓｓ％以上を占めているのが更に好ましく、１００ｍａｓｓ％を占めているのが最も好ましい。 In addition, in the case of the fiber containing 1 or more types of suitable metal oxide components, it can be a gel-like, dry gel-like, or sintered fiber. Gel-like fibers are fibers containing a solvent, dry gel-like fibers are porous fibers from which the solvent contained in the gel-like fibers has been removed, and sintered fibers are non-sintered dry gel fibers. It is a porous fiber. Among these, sintered fibers are preferable because they are excellent in rigidity and excellent in form stability during cell culture. The fibers containing one or more kinds of such metal oxide components preferably occupy 30 mass% or more of the fiber assembly, and more preferably occupy 50 mass% or more so as to have excellent shape retention. 70 mass% or more is more preferable, and 100 mass% is most preferable.
また、好適である金属酸化物成分を１種類以上含む繊維を構成する金属酸化物としては、例えば、リチウム、ベリリウム、ホウ素、炭素、ナトリウム、マグネシウム、アルミニウム、ケイ素、リン、硫黄、カリウム、カルシウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ガリウム、ゲルマニウム、ヒ素、セレン、ルビジウム、ストロンチウム、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、カドミウム、インジウム、スズ、アンチモン、テルル、セシウム、バリウム、ランタン、ハフニウム、タンタル、タングステン、水銀、タリウム、鉛、ビスマス、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、又はルテチウムなどの金属酸化物を挙げることができ、より具体的には、ＳｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、Ｂ２Ｏ３、ＴｉＯ２、ＺｒＯ２、ＣｅＯ２、ＦｅＯ、Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、ＶＯ２、Ｖ２Ｏ５、ＳｎＯ２、ＣｄＯ、ＬｉＯ２、ＷＯ３、Ｎｂ２Ｏ５、Ｔａ２Ｏ５、Ｉｎ２Ｏ３、ＧｅＯ２、ＰｂＴｉ４Ｏ９、ＬｉＮｂＯ３、ＢａＴｉＯ３、ＰｂＺｒＯ３、ＫＴａＯ３、Ｌｉ２Ｂ４Ｏ７、ＮｉＦｅ２Ｏ４、ＳｒＴｉＯ３などを挙げることができる。なお、一成分の金属酸化物から構成されていても、二成分以上の金属酸化物から構成されていても良い。例えば、ＳｉＯ２−Ａｌ２Ｏ３の二成分の金属酸化物から構成されていても良い。
Moreover, as a metal oxide which comprises the fiber containing 1 or more types of suitable metal oxide components, for example, lithium, beryllium, boron, carbon, sodium, magnesium, aluminum, silicon, phosphorus, sulfur, potassium, calcium, Scandium, titanium, vanadium, chromium, manganese, iron, cobalt, nickel, copper, zinc, gallium, germanium, arsenic, selenium, rubidium, strontium, yttrium, zirconium, niobium, molybdenum, cadmium, indium, tin, antimony, tellurium, Cesium, barium, lanthanum, hafnium, tantalum, tungsten, mercury, thallium, lead, bismuth, cerium, praseodymium, neodymium, promethium, samarium, europium, gadolinium, terbium, dysprosium Holmium, erbium, thulium, there may be mentioned metal oxides such as ytterbium, or lutetium, and more specifically, SiO 2, Al 2 O 3 , B 2 O 3,
更に、本発明の繊維集合体構成繊維は連続繊維であるのが好ましい。培養条件下の肝細胞は生育に最適な環境を形成するために、細胞同士が接触して相互作用することが知られており、繊維が不連続であると、肝細胞が移動し、接触する確率が低下しやすい傾向があるためである。なお、「連続繊維」とは、繊維集合体の５,０００倍の電子顕微鏡写真を撮影した場合に、構成繊維の端部を確認できないことを意味する。 Furthermore, the fiber assembly constituting fiber of the present invention is preferably a continuous fiber. Hepatocytes under culture conditions are known to interact with each other in order to form an optimal environment for growth. If the fibers are discontinuous, hepatocytes migrate and contact. This is because the probability tends to decrease. “Continuous fiber” means that the end of the constituent fiber cannot be confirmed when a 5,000-fold electron micrograph of the fiber assembly is taken.
本発明の繊維集合体（特に不織布の場合）は接着剤で接着されているのが好ましい。形態安定性に優れ、細胞培養時に変形しにくいためである。特に、繊維集合体の内部を含む全体において、繊維同士間に被膜を形成することなく接着剤で接着していると、表面積が広いため、ラミニン又はフィブロネクチンを効率的に作用させることができ、また、肝細胞に必要な栄養素や酸素などを効率的に供給できるため好適である。 The fiber assembly of the present invention (particularly in the case of a nonwoven fabric) is preferably bonded with an adhesive. This is because it has excellent morphological stability and is difficult to deform during cell culture. In particular, laminin or fibronectin can be allowed to act efficiently because the surface area is large when the adhesive is bonded without forming a film between the fibers in the whole including the inside of the fiber assembly. It is preferable because it can efficiently supply nutrients and oxygen necessary for hepatocytes.
この接着剤は有機系接着剤であっても、無機系接着剤であっても、或いは有機系接着剤と無機系接着剤との併用であっても良いが、形態安定性に優れているように、無機系接着剤を含む接着剤で接着されているのが好ましく、無機系接着剤のみによって接着されているのがより好ましい。 This adhesive may be an organic adhesive, an inorganic adhesive, or a combined use of an organic adhesive and an inorganic adhesive, but seems to have excellent shape stability. Further, it is preferably bonded with an adhesive containing an inorganic adhesive, and more preferably bonded only with an inorganic adhesive.
また、本発明の繊維集合体は細胞培養時における形態安定性に優れているように、前述のような接着剤による接着に替えて、又は加えて、繊維同士が部分的に融着した状態にあるのが好ましい。部分的に融着している場合、ドット状又はライン状であることができ、前者のドット状である場合、その形状は、例えば、長方形などの矩形、円形、楕円形、長円形などの丸形、又はこれらの組合せであることができ、後者のライン状である場合、直線、曲線又はこれらの組合せであることができる。特に、繊維集合体の外縁において、繊維同士がライン状又はドット状に融着していると、形態安定性に優れ、細胞培養時に変形しにくいため好適である。 In addition, the fiber assembly of the present invention is in a state in which the fibers are partially fused in place of or in addition to the adhesion by the adhesive as described above so that the shape stability at the time of cell culture is excellent. Preferably there is. When it is partially fused, it can be dot-shaped or line-shaped, and when it is the former dot-shaped, the shape is, for example, a rectangle such as a rectangle, a circle, an ellipse, an oval, or the like. It can be a shape, or a combination thereof, and if it is the latter, it can be a straight line, a curve, or a combination thereof. In particular, it is preferable that the fibers are fused in a line shape or a dot shape at the outer edge of the fiber assembly because the shape stability is excellent and deformation is difficult during cell culture.
このように外縁において繊維同士が融着している場合、形態安定性に優れているように、外縁部における厚さ方向の内部においても、繊維同士が融着しているのが好ましい。具体的には、外縁部における融着部を含む厚さ方向断面の電子顕微鏡写真において、粒状の塊（融着部）の占める面積が、繊維集合体の断面積の５％以上を占めているのが好ましく、より好ましくは１０％以上占めており、更に好ましくは１５％以上占めており、更に好ましくは２０％以上占めている。なお、前記粒状の塊（融着部）の占める面積が５％未満であっても、融着部の数が５ヶ所以上であるように融着していれば、形態安定性に優れている。 Thus, when the fibers are fused at the outer edge, it is preferable that the fibers are fused even in the thickness direction at the outer edge portion so that the form stability is excellent. Specifically, in the electron micrograph of the cross section in the thickness direction including the fused portion at the outer edge portion, the area occupied by the granular lump (fused portion) occupies 5% or more of the sectional area of the fiber assembly. More preferably, it occupies 10% or more, more preferably 15% or more, and still more preferably 20% or more. In addition, even if the area occupied by the granular lump (fused portion) is less than 5%, the shape stability is excellent as long as the number of fused portions is five or more. .
この外縁部における厚さ方向断面における、粒状の塊（融着部）の占める面積の比率及び融着部の数は、次の操作により得られる値をいう。
（１）繊維集合体の融着部を含む厚さ方向断面の電子顕微鏡写真を撮影する。
（２）前記電子顕微鏡写真において、融着部における厚さを一辺（短辺）とし、前記厚さの５倍の長さを一辺（長辺）とする長方形の枠を任意の箇所に設定し、測定領域を確定する。
（３）前記測定領域内における粒状の塊（融着部）の占める面積、又は融着部の数を測定する。なお、粒状の塊（融着部）の占める面積の比率（Ａｒｃ）は、次の式から算出する。
Ａｒｃ＝（Ａｔｃ／Ａｍｃ）×１００
ここで、Ａｔｃは測定した融着部の面積の総和、Ａｍｃは測定領域の面積、をそれぞれ意味する。
The ratio of the area occupied by the granular lump (fused portion) and the number of fused portions in the cross section in the thickness direction at the outer edge portion are values obtained by the following operation.
(1) An electron micrograph of the cross section in the thickness direction including the fused part of the fiber assembly is taken.
(2) In the above-mentioned electron micrograph, a rectangular frame having one side (short side) as the thickness at the fused portion and one side (long side) as long as 5 times the thickness is set at an arbitrary position. Determine the measurement area.
(3) The area occupied by the granular mass (fused portion) in the measurement region or the number of fused portions is measured. In addition, the ratio (Arc) of the area which a granular lump (fusion part) occupies is calculated from the following formula.
Arc = (Atc / Amc) × 100
Here, Atc means the total area of the measured fusion part, and Amc means the area of the measurement region.
なお、繊維集合体が接着剤で接着していない場合には、形態安定性に優れるように、繊維集合体の外縁がライン状又はドット状に融着しているとともに、繊維集合体の主面における融着した外縁よりも内側においても、ドット状又はライン状に部分的に融着しているのが好ましい。このように内側においても融着している場合、融着した外縁よりも内側における融着部の総面積が、主面における融着した外縁に囲まれた面積の５％以上を占めるように融着しているのが好ましく、１０％以上を占めるように融着しているのがより好ましい。なお、繊維集合体の主面における融着部は１点以上であるのが好ましく、５点以上であるのがより好ましい。また、主面における融着した外縁に囲まれた領域に２点以上融着している場合、任意の箇所で融着していることができるが、融着部が分散して融着していると、より形態安定性に優れている。 In addition, when the fiber assembly is not bonded with an adhesive, the outer edge of the fiber assembly is fused in a line shape or a dot shape so that the shape stability is excellent, and the main surface of the fiber assembly. Also, it is preferable to be partially fused in a dot shape or a line shape on the inner side of the fused outer edge. When the inner side is fused as described above, the fused area on the inner side of the fused outer edge accounts for 5% or more of the area surrounded by the fused outer edge on the main surface. It is preferable to wear, and it is more preferable to fuse so that it may occupy 10% or more. In addition, it is preferable that the melt | fusion part in the main surface of a fiber assembly is 1 point or more, and it is more preferable that it is 5 points or more. In addition, when two or more points are welded to the region surrounded by the fused outer edge on the main surface, it can be fused at any point, but the fused part is dispersed and fused. In this case, the form stability is more excellent.
なお、繊維集合体の主面における融着した外縁よりも内側において、粒状の塊（融着部）の占める面積の比率及び融着部の数は、次の操作により得られる値をいう。
（１）繊維集合体の主面全体の電子顕微鏡写真を撮影する。
（２）繊維集合体の主面における外縁の粒状の塊（融着部）により囲まれた領域の面積を測定する。
（３）繊維集合体の主面における外縁の粒状の塊（融着部）により囲まれた領域における、粒状の塊（融着部）の占める面積、又は融着部の数を測定する。なお、粒状の塊（融着部）の占める面積の比率（Ａｒｓ）は、次の式から算出する。
Ａｒｓ＝（Ａｔｓ／Ａｍｓ）×１００
ここで、Ａｔｓは繊維集合体の主面における融着部の占める面積の総和、Ａｍｓは繊維集合体の主面における外縁の粒状の塊（融着部）により囲まれた領域の面積、をそれぞれ意味する。
The ratio of the area occupied by the granular lump (fused portion) and the number of fused portions on the inner side of the fused outer edge of the main surface of the fiber assembly are values obtained by the following operation.
(1) An electron micrograph of the entire main surface of the fiber assembly is taken.
(2) The area of the region surrounded by the granular lump (fused portion) at the outer edge on the main surface of the fiber assembly is measured.
(3) The area occupied by the granular lump (fused portion) or the number of fused portions in the region surrounded by the granular lump (fused portion) on the outer edge of the main surface of the fiber assembly is measured. In addition, the ratio (Ars) of the area which a granular lump (fusion part) occupies is calculated from the following formula.
Ars = (Ats / Ams) × 100
Here, Ats is the sum of the area occupied by the fusion part in the main surface of the fiber assembly, Ams is the area of the region surrounded by the granular lump (fusion part) of the outer edge in the main surface of the fiber assembly, respectively. means.
本発明における「融着」とは、繊維集合体構成繊維が溶融し、繊維集合体構成繊維の横断面積の２倍以上の大きさを有する粒状の塊の状態で固着し、繊維間に介在していることをいう。このような状態は、繊維集合体の厚さ方向における断面電子顕微鏡写真、及び／又は繊維集合体の主面における電子顕微鏡写真から確認することができる。なお、「繊維集合体構成繊維の横断面積」は粒状の塊に隣接する箇所における繊維の横断面積をいう。また、「繊維集合体構成繊維が溶融して粒状の塊の状態で固着している」ことは、ＥＤＸ（エネルギー分散型Ｘ線分析：Energy dispersive X-ray spectrometry）などの微小領域を分析可能な元素分析により、繊維集合体構成繊維を構成する元素と粒状の塊を構成する元素とが同じであることによって確認できる。 “Fusion” in the present invention means that the fibers constituting the fiber assembly are melted and fixed in the form of a granular lump having a size more than twice the cross-sectional area of the fibers constituting the fiber assembly. It means that Such a state can be confirmed from a cross-sectional electron micrograph in the thickness direction of the fiber assembly and / or an electron micrograph on the main surface of the fiber assembly. The “cross-sectional area of the fiber assembly-constituting fibers” refers to the cross-sectional area of the fiber at a location adjacent to the granular lump. In addition, the fact that the fibers constituting the fiber assembly are melted and fixed in the form of a granular lump enables analysis of minute regions such as EDX (Energy Dispersive X-ray spectrometry). It can be confirmed by elemental analysis that the elements constituting the fiber assembly constituting fiber and the elements constituting the granular lump are the same.
このような本発明の単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体は、例えば、静電紡糸法、特開２００９−２８７１３８号公報に開示されているような、液吐出部から吐出された紡糸液に対してガスを平行に吐出し、紡糸液に１本の直線状に剪断力を作用させて繊維化する方法、メルトブロー法、スパンボンド法、フラッシュ紡糸法などにより製造することができるが、空隙率が９０％以上であるのが好ましいため、特開２００４−２３８７４９号公報に記載の方法により製造するのが好ましく、特には、前記公報に記載の方法により繊維を集積した後に、接着剤で接着するのが好ましい。より具体的には、（１）紡糸溶液を静電紡糸法により繊維を紡糸する工程（紡糸工程）、（２）前記繊維とは反対極性のイオンを照射し、集積させ、繊維ウエブを形成する工程（集積工程）、及び（３）前記繊維ウエブを結合（特に接着剤で接着）して繊維集合体とする工程（結合工程）、により製造することができる。 Such a fiber assembly having a surface area per unit volume of 0.01 m 2 / cm 3 or more according to the present invention is, for example, liquid ejection as disclosed in an electrostatic spinning method, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2009-287138. Manufactured by a method of discharging a gas in parallel to the spinning solution discharged from the section and applying a shearing force to the spinning solution in a straight line to form a fiber, a melt blow method, a spunbond method, a flash spinning method, etc. However, since it is preferable that the porosity is 90% or more, it is preferable to manufacture by the method described in JP-A No. 2004-238749. In particular, the fibers are accumulated by the method described in the above-mentioned publication. Then, it is preferable to bond with an adhesive. More specifically, (1) a process of spinning a fiber by an electrospinning method (spinning process), (2) irradiation with ions having a polarity opposite to that of the fiber, and accumulation to form a fiber web It can be manufactured by a step (stacking step) and (3) a step (bonding step) in which the fiber web is bonded (particularly bonded with an adhesive) to form a fiber assembly.
特に、本発明の繊維集合体構成繊維として好適である、金属酸化物成分を１種類以上含む繊維を含む繊維集合体は、特開２０１０−１８５１６４号公報に記載の方法により製造することができる。つまり、（１）金属元素の酸化物を含む紡糸用ゾル溶液を用いて、静電紡糸法により無機系繊維を紡糸する工程（紡糸工程）、（２）前記無機系繊維とは反対極性のイオンを照射し、集積させ、無機系繊維ウエブを形成する工程（集積工程）により、無機系繊維ウエブを繊維集合体として製造することができる。 In particular, a fiber assembly containing fibers containing one or more types of metal oxide components, which is suitable as the fiber assembly constituting fiber of the present invention, can be produced by the method described in JP 2010-185164 A. That is, (1) a step of spinning an inorganic fiber by an electrospinning method using a spinning sol solution containing an oxide of a metal element (spinning step), (2) ions having a polarity opposite to that of the inorganic fiber The inorganic fiber web can be manufactured as a fiber assembly by a step (stacking step) in which the inorganic fiber web is irradiated and accumulated to form an inorganic fiber web.
なお、（２）の集積工程の後に、熱処理する工程を実施して、無機系繊維同士を接着すると、形態安定性に優れ、細胞培養時に変形しにくいため好適である。特に、２００℃以上、好ましくは３００℃以上で熱処理を実施し、無機系繊維同士の交点で接着すると、形態安定性に優れているため好適である。なお、無機系繊維が水酸基を有する場合、熱処理温度によって水酸基量を調節することもでき、例えば、熱処理温度を３００℃とすることによって、水酸基量を約３００μｍｏｌ／ｇとすることができ、熱処理温度を５００℃とすることによって、水酸基量を約１００μｍｏｌ／ｇとすることができる。 In addition, it is preferable to carry out a heat treatment step after the accumulation step (2) to bond the inorganic fibers to each other because they are excellent in morphological stability and hardly deform during cell culture. In particular, it is preferable to perform heat treatment at 200 ° C. or higher, preferably 300 ° C. or higher, and bond at an intersection between inorganic fibers because the shape stability is excellent. When the inorganic fiber has a hydroxyl group, the amount of hydroxyl group can be adjusted by the heat treatment temperature. For example, by setting the heat treatment temperature to 300 ° C., the amount of hydroxyl group can be about 300 μmol / g. By setting the temperature to 500 ° C., the amount of hydroxyl group can be about 100 μmol / g.
また、（２）の集積工程の後（熱処理する場合には熱処理後）に、形態安定性に優れ、細胞培養時に変形しにくいように、（３）前記無機系繊維ウエブを結合して繊維集合体とする工程（結合工程）を含んでいるのが好ましい。この結合工程としては、例えば、接着剤による接着、部分的な融着などを挙げることができる。 In addition, after the accumulation step (2) (after heat treatment in the case of heat treatment), (3) the inorganic fiber web is bonded to form a fiber assembly so that it has excellent shape stability and is not easily deformed during cell culture. It is preferable to include a process of forming a body (bonding process). Examples of the bonding step include adhesion with an adhesive and partial fusion.
この接着剤によって接着する場合、金属元素の酸化物を含むゾル溶液（特には、金属アルコキシド加水分解縮合物が好ましい）を接着剤として使用すると、繊維集合体の形態安定性に優れ、無機系繊維が離脱しにくいため好適である。特に、無機系繊維を構成する金属酸化物と同じ金属元素の酸化物を含むゾル溶液を接着剤として使用すると、接着力に優れ、更に繊維集合体の形態安定性に優れ、無機系繊維が離脱しにくいため好適である。この接着剤による接着は無機系繊維ウエブ表面のみなど、一部の無機系繊維のみを接着しても良いが、形態安定性及び繊維脱落性に優れているように、無機系繊維ウエブの内部を含む全体を接着するのが好ましい。このように無機系繊維ウエブの内部を含む全体を接着するには、例えば、無機系繊維ウエブを金属元素の酸化物を含むゾル溶液に浸漬することによって実施できる。なお、無機系繊維ウエブの全体を接着剤で接着する際に無機系繊維ウエブの嵩が潰れないように、接着剤付与後の余剰の接着剤は、通気により除去するのが好ましい。通気により除去することによって、無機系繊維間に被膜を形成することもない。更に、室温で自然乾燥するか、熱処理により接着剤の溶媒を除去して、接着することができる。 When bonding with this adhesive, if a sol solution containing an oxide of a metal element (especially, a metal alkoxide hydrolysis condensate is preferred) is used as the adhesive, the shape stability of the fiber aggregate is excellent, and inorganic fibers Is suitable because it is difficult to leave. In particular, when a sol solution containing an oxide of the same metal element as the metal oxide constituting the inorganic fiber is used as an adhesive, the adhesive strength is excellent, the shape stability of the fiber aggregate is excellent, and the inorganic fiber is detached. It is suitable because it is difficult to do. This adhesive may be used to bond only some inorganic fibers such as the surface of the inorganic fiber web, but the inside of the inorganic fiber web is used so that it is excellent in form stability and fiber detachment. It is preferable to bond the whole. In order to bond the whole including the inside of the inorganic fiber web in this way, for example, the inorganic fiber web can be immersed in a sol solution containing an oxide of a metal element. In addition, it is preferable to remove the excess adhesive after applying the adhesive by aeration so that the bulk of the inorganic fiber web is not crushed when the entire inorganic fiber web is bonded with the adhesive. By removing by aeration, a film is not formed between the inorganic fibers. Furthermore, it can be naturally dried at room temperature, or can be bonded by removing the solvent of the adhesive by heat treatment.
更に、（３）結合工程の後に、無機系繊維を無機化及び／又は金属元素の酸化物を含むゾル溶液（接着剤）を無機化し、無機系繊維の強度及び剛性、無機系繊維同士の接着強度、及び繊維集合体の形態安定性を向上させるために、焼成処理を行なうのが好ましい。なお、無機系繊維が水酸基を有する場合、焼成温度によって水酸基量を調節することもでき、例えば、焼成温度を３００℃とすることによって、水酸基量を約３００μｍｏｌ／ｇとすることができ、焼成温度を５００℃とすることによって、水酸基量を約１００μｍｏｌ／ｇとすることができる。 Further, (3) after the bonding step, the inorganic fiber is mineralized and / or the sol solution (adhesive) containing the metal element oxide is mineralized, the strength and rigidity of the inorganic fiber, and the adhesion between the inorganic fibers. In order to improve the strength and the shape stability of the fiber assembly, it is preferable to perform a baking treatment. When the inorganic fiber has a hydroxyl group, the amount of hydroxyl group can be adjusted by the firing temperature. For example, by setting the firing temperature to 300 ° C., the amount of hydroxyl group can be about 300 μmol / g. By setting the temperature to 500 ° C., the amount of hydroxyl group can be about 100 μmol / g.
前述の結合工程（３）を、接着剤で接着するのに替えて、又は加えて、部分的に融着し、形態安定性及び繊維脱落防止性を付与することができる。なお、接着剤での接着と部分的融着の両方を実施する場合には、どの順序で行っても構わない。また、部分的に融着する方法としては、例えば、集光した光やレーザーを照射する方法、ガスバーナーを使用する方法、放電を使用する方法、電子ビームを使用する方法、などを挙げることができ、特にレーザーによる方法は、所望箇所のみを融着させることができ、また、非接触状態で融着させることができることから、小さい歪で融着させることができ、嵩高性を損なわないため好適である。 In place of or in addition to bonding with the adhesive, the above-mentioned bonding step (3) can be partially fused to give form stability and fiber drop-off prevention. In addition, when performing both adhesion | attachment with an adhesive agent and partial melt | fusion, you may carry out in any order. Examples of the method of partial fusion include a method of irradiating condensed light and laser, a method of using a gas burner, a method of using discharge, and a method of using an electron beam. In particular, the laser method can be fused only at a desired location, and since it can be fused in a non-contact state, it can be fused with a small strain, and is preferable because it does not impair the bulkiness. It is.
本発明の肝細胞の培養方法においては、上述のような繊維集合体を構成する繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを有する細胞培養担体を使用することによって、凍結肝細胞であっても、簡易に、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できるため、反復曝露などの実際の生体に近い代謝試験を実施できることを見出したものである。その機構は明らかではないが、本発明者らは、単位体積あたりの表面積が広い繊維集合体を使用することによって、肝細胞が繊維集合体内部に入り込み、あるいは、繊維間に形成される孔に入り込み、立体的及び／又は多点的に接触することにより、細胞接着因子であるラミニン又はフィブロネクチンと肝細胞の接触面積が広くなるため、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できると考えている。つまり、このような肝細胞と細胞接着因子とが立体的及び／又は多点的に、広く接触した構造は、生体内の組織構造に類似しており、生体内で肝細胞を取り巻く微小環境を再現しているため、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できると考えている。 In the method for culturing hepatocytes of the present invention, by using a cell culture carrier having laminin or fibronectin on the surface of the fibers constituting the fiber assembly as described above, even a frozen hepatocyte can be easily treated with an enzyme. The present inventors have found that hepatocytes capable of maintaining activity over a long period of time can be cultured, so that metabolic tests close to the actual living body such as repeated exposure can be performed. Although the mechanism is not clear, the present inventors use a fiber assembly having a large surface area per unit volume, so that hepatocytes can enter the fiber assembly or in pores formed between the fibers. The contact area between laminin or fibronectin, which is a cell adhesion factor, and hepatocytes is widened by intrusion, steric and / or multipoint contact, so it is considered that hepatocytes capable of maintaining enzyme activity for a long period can be cultured. ing. In other words, such a structure in which hepatocytes and cell adhesion factors are widely contacted in a three-dimensional and / or multipoint manner is similar to a tissue structure in a living body, and a microenvironment surrounding hepatocytes in a living body. Since it has been reproduced, it is believed that hepatocytes that can maintain enzyme activity over a long period of time can be cultured.
本発明において、繊維集合体を構成する繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを有する細胞培養担体の調製方法は特に限定するものではないが、例えば、繊維集合体を培養容器等の底面に配置した後、ラミニン又はフィブロネクチンを含有する溶液を供給し、該溶液中に繊維集合体を浸漬して自然吸着する方法、繊維集合体を培養容器等の底面に配置した後、ラミニン又はフィブロネクチンを含有する溶液を繊維集合体に塗布又はスプレーして自然吸着する方法などを挙げることができる。 In the present invention, the method for preparing a cell culture carrier having laminin or fibronectin on the surface of the fibers constituting the fiber assembly is not particularly limited. For example, after arranging the fiber assembly on the bottom surface of a culture vessel or the like, laminin Alternatively, a solution containing fibronectin is supplied and the fiber aggregate is immersed in the solution to be naturally adsorbed. After the fiber aggregate is placed on the bottom surface of the culture container or the like, the solution containing laminin or fibronectin is assembled into the fiber assembly. Examples include a method of natural adsorption by applying or spraying on the body.
前記ラミニン又はフィブロネクチンを含有する溶液における、ラミニン又はフィブロネクチンの含有量は特に限定するものではないが、繊維表面の単位面積に対して含有量が少ないと、肝細胞との接触が少なくなり、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養しにくくなる傾向があるため、繊維表面積１ｃｍ２あたり、０．０５μｇ以上含有しているのが好ましく、０．１５μｇ以上含有しているのがより好ましく、０．２５μｇ以上含有しているのが更に好ましい。また、含有量の上限に関しては特に限定するものではないが、繊維表面の単位面積に対して必要以上の含有量があっても、ラミニン又はフィブロネクチンを含有していることの効果が上限に達しており、それ以上の効果は得られない傾向があるため、繊維表面積１ｃｍ２あたり、３０μｇ以下含有しているのが好ましい。 The content of laminin or fibronectin in the solution containing laminin or fibronectin is not particularly limited, but if the content is small relative to the unit area of the fiber surface, contact with hepatocytes is reduced and enzyme activity is reduced. In the amount of 0.05 μg or more per 1 cm 2 of the fiber surface area, more preferably 0.15 μg or more. More preferably, it is contained in an amount of 25 μg or more. Moreover, the upper limit of the content is not particularly limited, but the effect of containing laminin or fibronectin reaches the upper limit even if there is more content than necessary for the unit area of the fiber surface. In addition, since there is a tendency that no further effect is obtained, it is preferable to contain 30 μg or less per 1 cm 2 of the fiber surface area.
なお、ラミニン又はフィブロネクチンを含有する溶液は、ラミニンとフィブロネクチンの両方を含有していても構わず、更に、その他の生理活性物質（例えば、ラミニン、フィブロネクチン以外の細胞外基質、細胞増殖因子など）を含有していても構わない。このように、ラミニンとフィブロネクチンの両方を含有している場合、その合計含有量が０．０５〜３０μｇ／ｃｍ２であるのが好ましく、１．５〜３０μｇ／ｃｍ２であるのがより好ましく、０．２５〜３０μｇ／ｃｍ２であるのが更に好ましい。 The solution containing laminin or fibronectin may contain both laminin and fibronectin, and other physiologically active substances (for example, extracellular substrates other than laminin and fibronectin, cell growth factors, etc.) You may contain. Thus, when containing both laminin and fibronectin, the total content is preferably from 0.05~30μg / cm 2, more preferably from 1.5~30μg / cm 2, More preferably, it is 0.25-30 microgram / cm < 2 >.
本発明の肝細胞の培養方法は、上述のようなラミニン又はフィブロネクチンを有する繊維表面に有する繊維集合体を細胞培養担体として使用する方法であり、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体とラミニン又はフィブロネクチンとを組合せた細胞培養担体を用いて肝細胞を培養すると、凍結肝細胞であっても、簡易に、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養でき、反復曝露などの実際の生体に近い代謝試験を実施できるという、予測できない優れた効果を見出したものである。つまり、凍結肝細胞は凍結、解凍等の低温保存する過程において、損傷を受けやすく、培養するのが非常に難しい細胞であるが、このような凍結肝細胞であっても、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養でき、反復曝露などの実際の生体に近い代謝試験を実施できるということは、驚くべき優れた効果である。 The method for culturing hepatocytes of the present invention is a method of using a fiber assembly having laminin or fibronectin on the fiber surface as described above as a cell culture carrier, and the surface area per unit volume is 0.01 m 2 / cm 3. When culturing hepatocytes using a cell culture carrier that combines the above fiber assembly and laminin or fibronectin, even if it is frozen hepatocytes, hepatocytes that can maintain enzyme activity over a long period of time can be easily cultured, It has been found that it is possible to carry out metabolic tests close to the actual living body such as repeated exposure, and that it has an excellent and unexpected effect. In other words, frozen hepatocytes are easily damaged in the process of cryopreservation such as freezing and thawing, and are extremely difficult to culture. Even such frozen hepatocytes have long-term enzyme activity. It is a surprisingly good effect that hepatocytes that can be maintained over a long period of time can be cultured and metabolic tests close to the actual living body such as repeated exposure can be performed.
このように、本発明の肝細胞の培養方法は、前述のような繊維集合体の繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを有する細胞培養担体を使用すること以外は、従来と全く同様にして、肝細胞を培養する方法である。つまり、前述の細胞培養担体を用い、肝細胞を播種し、培養する方法である。例えば、前述の細胞培養担体を培養容器等に入れ、培地に懸濁した肝細胞を静かに播種し、適宜、培地交換を行うことによって培養できる。 Thus, the method for culturing hepatocytes according to the present invention is the same as the conventional method except that a cell culture carrier having laminin or fibronectin is used on the fiber surface of the fiber assembly as described above. It is a method of culturing. That is, it is a method of seeding and culturing hepatocytes using the aforementioned cell culture carrier. For example, the above-mentioned cell culture carrier can be placed in a culture vessel or the like, and hepatocytes suspended in a medium can be gently seeded and cultured by appropriately changing the medium.
本発明においては、接着性を有する肝細胞を使用するのが好ましい。凍結肝細胞においては、肝臓からの細胞単離処理時のダメージにより、接着性が失活する場合があるが、このような接着性が失活した肝細胞は本発明の細胞培養担体を使用しても、培養するのが困難な傾向があるためである。なお、本発明の培養方法によれば、凍結肝細胞であっても、簡易に、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できるという優れた効果を奏するが、新鮮肝細胞であっても、使用することができる。また、肝細胞の由来する動物種は特に限定されず、例えば、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモットといったげっ歯類、更には、イヌ、ウサギ、ブタなど、創薬の非臨床試験や化学物質などの安全性評価に用いられる哺乳動物の肝細胞を使用することができる。 In the present invention, it is preferable to use hepatocytes having adhesiveness. In frozen hepatocytes, the adhesiveness may be inactivated due to damage during cell isolation from the liver. For such hepatocytes inactivated, the cell culture carrier of the present invention is used. However, it tends to be difficult to culture. In addition, according to the culture method of the present invention, even if it is a frozen hepatocyte, there is an excellent effect that it is possible to easily culture a hepatocyte that can maintain enzyme activity over a long period of time. Can be used. The animal species from which hepatocytes are derived is not particularly limited. For example, primates such as humans and monkeys, rodents such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, and dogs, rabbits, pigs, etc. Mammalian hepatocytes used for safety evaluation of non-clinical tests and chemical substances can be used.
なお、本発明において肝細胞の播種密度は特に限定するものではないが、細胞培養担体の播種面の見掛面積に対して、過剰な肝細胞を播種すると、肝細胞と繊維が十分に接触できず、ラミニン又はフィブロネクチンが十分に作用できない場合があるため、播種密度は細胞培養担体播種面の見掛面積１ｃｍ２あたり、３．０×１０５viable cells以下あるのが好ましく、２．０×１０５viable cells以下であるのがより好ましく、１．５×１０５viable cells以下であるのが更に好ましい。一方で、肝細胞の播種密度が少なすぎると、肝細胞同士の相互作用が低下し、成育に必要な微小環境の構築に不具合が生じやすい傾向があるため、播種密度は細胞培養担体播種面の見掛面積１ｃｍ２あたり、０．１×１０５viable cells以上であるのが好ましく、０．２×１０５viable cells以上であるのがより好ましく、０．５×１０５viable cells以上であるのが更に好ましい。 In the present invention, the seeding density of hepatocytes is not particularly limited. However, when excessive hepatocytes are seeded with respect to the apparent area of the seeding surface of the cell culture carrier, hepatocytes and fibers can be sufficiently contacted. In addition, since laminin or fibronectin may not sufficiently act, the seeding density is preferably 3.0 × 10 5 viable cells or less per 1 cm 2 apparent area of the cell culture carrier seeding surface, and 2.0 × 10 6 It is more preferably 5 viable cells or less, and further preferably 1.5 × 10 5 viable cells or less. On the other hand, if the seeding density of hepatocytes is too low, the interaction between hepatocytes decreases and the microenvironment necessary for growth tends to be defective. The apparent area per cm 2 is preferably 0.1 × 10 5 viable cells or more, more preferably 0.2 × 10 5 viable cells or more, and 0.5 × 10 5 viable cells or more. Is more preferable.
また、培地は各細胞メーカー又は試薬メーカーから肝細胞培養用として販売されている培地を使用することができる。 Moreover, the culture medium which can be used as a culture medium for hepatocyte culture from each cell maker or reagent maker can be used.
以上、説明した通り、本発明の肝細胞の培養方法は、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体の繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを有する細胞培養担体として単に使用すれば良く、厳格な水素イオン指数の管理、温度の管理、ゲルの重層、或いは異種細胞の培養といった煩雑な操作の必要性がなく、簡易な培養方法であり、ハイスループット分析装置への適用も容易である。更に、ゲルでサンドイッチする訳でもなく、肝細胞が露出した状態で培養することができるため、薬剤が肝細胞へ浸透しやすく、肝細胞成分を抽出するためにゲルを消化分解する手間も不必要で、更には、共培養する必要がなく、肝細胞のみで培養できるため、肝細胞の応答だけを解析できるなど、評価、解析しやすい培養方法である。 As described above, the method for culturing hepatocytes of the present invention can be simply used as a cell culture carrier having laminin or fibronectin on the fiber surface of a fiber assembly having a surface area per unit volume of 0.01 m 2 / cm 3 or more. No need for complicated operations such as strict control of hydrogen ion index, temperature control, gel overlay, or culturing of heterogeneous cells, simple culture method and easy application to high-throughput analyzer It is. Furthermore, it is not sandwiched between gels, and can be cultured with exposed hepatocytes, so that the drug can easily penetrate into hepatocytes, and there is no need to digest and decompose the gel to extract hepatocyte components. Furthermore, it is a culture method that is easy to evaluate and analyze because, for example, only the response of hepatocytes can be analyzed because it is not necessary to co-culture and can be cultured only with hepatocytes.
以下、本発明の肝細胞の培養方法について具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、繊維単位重量あたりの水酸基量は繊維集合体の水酸基量を水酸基量測定に用いた繊維集合体質量（単位：ｇ）で除した商であり、水酸基量は中和滴定法を用いて定量した値である。つまり、繊維集合体を２０ｖｏｌ％の塩化ナトリウム水溶液５０ｍＬ中に分散させた後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を中和点まで滴下し、中和に必要な水酸化ナトリウム滴下量から、繊維集合体の水酸基量を決定した（参考文献参照）。
（参考文献）
George W S.,Determination of Specific Surface Area of Colloidal Silica by Titration with Sodium Hydroxide,Anal.Cheam.;28,1981-1983,(1956)
Hereinafter, although the culture | cultivation method of the hepatocyte of this invention is demonstrated concretely, these do not limit the scope of the present invention. The hydroxyl group amount per unit weight of the fiber is a quotient obtained by dividing the hydroxyl group amount of the fiber assembly by the mass of the fiber assembly (unit: g) used for measuring the hydroxyl group amount. The hydroxyl group amount is determined by neutralization titration. It is the value. That is, after dispersing the fiber assembly in 50 mL of a 20 vol% sodium chloride aqueous solution, a 0.1N sodium hydroxide aqueous solution was dropped to the neutralization point, and the fiber assembly was calculated from the amount of sodium hydroxide dropped required for neutralization. The amount of hydroxyl groups was determined (see references).
(References)
George W S., Determination of Specific Surface Area of Colloidal Silica by Titration with Sodium Hydroxide, Anal.Cheam .; 28, 1981-1983, (1956)
（繊維集合体の作製）
金属化合物としてのテトラエトキシシラン、溶媒としてのエタノール、加水分解のための水、及び触媒として１規定の塩酸を、１：５：２：０．００３のモル比で混合し、温度７８℃で１０時間の還流操作を行い、次いで、溶媒をロータリーエバポレーターにより除去して濃縮した後、温度６０℃に加熱して、粘度が２ポイズのゾル溶液を形成した。
(Fabric assembly)
Tetraethoxysilane as a metal compound, ethanol as a solvent, water for hydrolysis, and 1N hydrochloric acid as a catalyst are mixed at a molar ratio of 1: 5: 2: 0.003, and the temperature is 10 ° C. at 78 ° C. After refluxing for a period of time, the solvent was removed by a rotary evaporator and concentrated, and then heated to a temperature of 60 ° C. to form a sol solution having a viscosity of 2 poise.
得られたゾル溶液を用いて、静電紡糸法によりゲル状シリカ連続繊維を紡糸する（紡糸工程）とともに、前記ゲル状シリカ連続繊維とは反対極性のイオンを照射し、集積させ、ゲル状シリカ連続繊維ウエブを形成（集積工程）した。つまり、特開２００５−２６４３７４号公報の実施例８と同じ紡糸条件でゲル状シリカ連続繊維ウエブを形成した。より具体的には、図１の対向電極５として、図２の対向電極（沿面放電素子２５）を紡糸容器室内に収納した紡糸装置を使用し、次の条件で紡糸した。 The obtained sol solution is used to spin a gel-like silica continuous fiber by an electrospinning method (spinning process), and irradiate and accumulate ions having a polarity opposite to that of the gel-like silica continuous fiber. A continuous fiber web was formed (stacking process). That is, a gel-like silica continuous fiber web was formed under the same spinning conditions as in Example 8 of JP-A-2005-264374. More specifically, as the counter electrode 5 in FIG. 1, a spinning device in which the counter electrode (creeping discharge element 25) in FIG. 2 was housed in a spinning vessel chamber was used, and spinning was performed under the following conditions.
（１）紡糸ノズル：内径０．４ｍｍの金属製注射針（先端カット）
（２）紡糸ノズルと対向電極との距離：２００ｍｍ
（３）対向電極及びイオン発生電極（両電極を兼ねる）：ステンレス板（誘起電極）上に厚さ１ｍｍのアルミナ膜（誘電体基板）を溶射し、その上に直径３０μｍのタングステンワイヤ（放電電極）を１０ｍｍの等間隔で張った沿面放電素子（タングステンワイヤ面を紡糸ノズルと対向させると共に接地し、ステンレス板とタングステンワイヤ間に交流高電圧電源により５０Ｈｚの交流高電圧を印加）
（４）第１高電圧電源：−１６ｋＶ
（５）第２高電圧電源：±５ｋＶ（交流沿面のピーク電圧：５ｋＶ、５０Ｈｚ）
（６）気流：水平方向（紙面上、左から右方向）２５ｃｍ／ｓｅｃ、鉛直方向（紙面上、捕集部材４の上から下方向）１５ｃｍ／ｓｅｃ
（７）紡糸容器内の雰囲気：温度２５℃、湿度４０％ＲＨ以下
(1) Spinning nozzle: Metal injection needle with 0.4mm inner diameter (tip cut)
(2) Distance between spinning nozzle and counter electrode: 200 mm
(3) Counter electrode and ion generation electrode (also serving as both electrodes): A 1 mm thick alumina film (dielectric substrate) is sprayed onto a stainless steel plate (induction electrode), and a 30 μm diameter tungsten wire (discharge electrode) Creeping discharge elements stretched at equal intervals of 10 mm (tungsten wire surface is opposed to the spinning nozzle and grounded, and an AC high voltage of 50 Hz is applied between the stainless steel plate and the tungsten wire by an AC high voltage power source)
(4) First high voltage power supply: -16 kV
(5) Second high voltage power supply: ± 5 kV (peak voltage along the AC surface: 5 kV, 50 Hz)
(6) Airflow: Horizontal direction (on the paper, left to right) 25 cm / sec, Vertical direction (on the paper, downward from the top of the collecting member 4) 15 cm / sec
(7) Atmosphere in the spinning container:
次に、前記ゲル状シリカ連続繊維ウエブを、温度８００℃で３時間の熱処理をすることにより乾燥し、乾燥シリカ連続繊維同士の交点で接着した乾燥シリカ連続繊維ウエブを作製した。 Next, the gel-like silica continuous fiber web was dried by heat treatment at a temperature of 800 ° C. for 3 hours to produce a dry silica continuous fiber web adhered at the intersection of the dry silica continuous fibers.
続いて、金属化合物としてテトラエトキシシラン、溶媒としてエタノール、加水分解のための水、及び触媒として硝酸を、１：７．２：７：０．００３９のモル比で混合し、温度２５℃、攪拌条件３００ｒｐｍで１５時間反応させた後、酸化ケイ素の固形分濃度が０．２５％となるようにエタノールで希釈してシリカゾル溶液を調製し、接着剤とした。 Subsequently, tetraethoxysilane as a metal compound, ethanol as a solvent, water for hydrolysis, and nitric acid as a catalyst were mixed at a molar ratio of 1: 7.2: 7: 0.0039, and stirred at a temperature of 25 ° C. After reacting at 300 rpm for 15 hours, a silica sol solution was prepared by diluting with ethanol so that the solid content concentration of silicon oxide was 0.25%, and an adhesive was obtained.
次いで、前記乾燥シリカ連続繊維ウエブを前記シリカゾル溶液（接着剤）に浸漬した後、吸引により余剰のシリカゾル溶液を除去した後、温度５００℃で３時間焼成して、内部を含む全体における焼結シリカ連続繊維同士を、被膜を形成することなくシリカで接着した、焼結シリカ連続繊維のみからなる、不織布形態を有するシート状の焼結シリカ連続繊維集合体（平均目付：７．４２ｇ／ｍ２、平均厚さ：０．１４２ｍｍ、空隙率：９５％、平均孔径：７μｍ、水酸基量：５０μｍｏｌ／ｇ、焼結シリカ連続繊維の平均繊維径：０．７３μｍ、焼結シリカの密度：２．２ｇ／ｃｍ３、引張破断強度：０．５６８ＭＰａ、単位体積あたりの表面積：０．１３ｍ２／ｃｍ３）を作製した。 Next, after immersing the dry silica continuous fiber web in the silica sol solution (adhesive), the excess silica sol solution is removed by suction, and then fired at a temperature of 500 ° C. for 3 hours to sinter the entire sintered silica including the inside. A sheet-like sintered silica continuous fiber aggregate having a nonwoven fabric form consisting only of sintered silica continuous fibers bonded with silica without forming a film between continuous fibers (average basis weight: 7.42 g / m 2 , Average thickness: 0.142 mm, porosity: 95%, average pore diameter: 7 μm, hydroxyl group amount: 50 μmol / g, average fiber diameter of sintered silica continuous fiber: 0.73 μm, density of sintered silica: 2.2 g / cm 3 , tensile breaking strength: 0.568 MPa, surface area per unit volume: 0.13 m 2 / cm 3 ).
（実施例１〜２、比較例１）
前記焼結シリカ連続繊維集合体を直径６．２５ｍｍの円形となるように打ち抜いた後、細胞低接着性９６ウェルプレートの各ウェルに、前記円形の焼結シリカ連続繊維集合体を挿入し、各ウェルの底面に配置した。
(Examples 1-2, Comparative Example 1)
After punching the sintered silica continuous fiber aggregate into a circular shape having a diameter of 6.25 mm, the circular sintered silica continuous fiber aggregate is inserted into each well of a low cell adhesion 96-well plate, Located on the bottom of the well.
次いで、４７９．５２μｇ／ｍＬのラミニン１１１溶液［＝実施例１、マウスＥＨＳ細胞株由来（Ｗａｋｏ製、１２０−０５７５１）］、４７９．５２μｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液［＝実施例２、ヒト血漿由来（ＢＤ,３５４００８）］、又は４７９．５２μｇ／ｍＬのＩ型コラーゲン溶液［＝比較例１、ラット尾由来（ＢＤ,３５４２３６）］のコート液を、それぞれ１ウェルあたり５０μＬ注液した後、一晩、室温下で静置し、自然吸着により、各焼結シリカ連続繊維表面にラミニン、フィブロネクチン又はコラーゲンを有する細胞培養担体をそれぞれ調製した。なお、細胞低接着性９６ウェルプレートにはタンパク質は吸着しないものと見なした場合、いずれの細胞培養担体も繊維表面積１ｃｍ２あたりの含有量は４．２μｇであった。 Next, a 479.52 μg / mL laminin 111 solution [= Example 1, derived from mouse EHS cell line (Wako, 120-05751)], a 479.52 μg / mL fibronectin solution [= Example 2, derived from human plasma ( BD, 354008)], or 479.52 μg / mL type I collagen solution [= Comparative Example 1, rat tail derived (BD, 354236)], each after injecting 50 μL / well, overnight, The cell culture carrier having laminin, fibronectin or collagen on the surface of each sintered silica continuous fiber was prepared by standing at room temperature and spontaneously adsorbing. When it was assumed that no protein was adsorbed on the low-cell adhesion 96-well plate, the content per 1 cm 2 of the fiber surface area of any cell culture carrier was 4.2 μg.
その後、各コート液を除去した後、１ウェルあたり１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水によって、細胞培養担体をそれぞれ２回ずつ洗浄した。 Then, after removing each coating solution, each cell culture carrier was washed twice with 150 μL of phosphate buffered saline per well.
そして、細胞培養担体上で、１４日間、肝細胞を培養した。なお、培養条件は次の通りとした。 Then, hepatocytes were cultured for 14 days on a cell culture carrier. The culture conditions were as follows.
ＳＤラット凍結肝細胞（Ｌｏｎｚａ,ＡＣ−６００９）を解凍後、２％牛胎児血清を含む肝細胞培養培地（Ｌｏｎｚａ，ＣＣ−３１９８）に分散し、遠心洗浄（５０ｘｇ，９０ｓｅｃ，４℃）を一回行った。次いで、同培地を用いて肝細胞を再懸濁させ、トリパンブルー法によって肝細胞の生存率を算出した。 SD rat frozen hepatocytes (Lonza, AC-6609) were thawed, dispersed in hepatocyte culture medium (Lonza, CC-3198) containing 2% fetal calf serum, and centrifuged (50 × g, 90 sec, 4 ° C.). I went twice. Subsequently, hepatocytes were resuspended using the same medium, and the viability of hepatocytes was calculated by the trypan blue method.
その後、細胞培養担体の播種面の見掛面積１ｃｍ２あたり播種密度１．０×１０５viable cells、１ウェルあたりの培地量１００μＬで、それぞれのウェルに生肝細胞を播種し、温度３７℃、ＣＯ２分圧５％の加湿インキュベータ内で培養を開始した。そして、播種４時間後に、牛胎児血清を含まない肝細胞培養培地に交換を行い、その後、同培地を用いて１日１回の頻度で培地交換を行った。 Thereafter, seeding density of 1.0 × 10 5 viable cells per 1 cm 2 apparent area of the seeding surface of the cell culture carrier was seeded with 100 μL of medium per well, and each well was seeded with live hepatocytes at a temperature of 37 ° C. Cultivation was started in a humidified incubator with 5% CO 2 partial pressure. Then, 4 hours after seeding, the medium was replaced with a hepatocyte culture medium not containing fetal calf serum, and then the medium was replaced once a day using the same medium.
（比較例２〜４）
細胞接着性９６ウェルプレートの各ウェルに、３３．３μｇ／ｍＬのラミニン１１１溶液［＝比較例２、マウスＥＨＳ細胞株由来（Ｗａｋｏ製、１２０−０５７５１）］、３３．３μｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液［＝比較例３、ヒト血漿由来（ＢＤ,３５４００８）］、又は３３．３μｇ／ｍＬのＩ型コラーゲン溶液［＝比較例４、ラット尾由来（ＢＤ,３５４２３６）］のコート液を、それぞれ１ウェルあたり５０μＬ注液した後、一晩、室温下で静置し、自然吸着により、各ウェル底面をラミニン、フィブロネクチン又はコラーゲンでコートした。なお、いずれも底面積１ｃｍ２あたりの含有量は５μｇであった。
(Comparative Examples 2 to 4)
Cell adhesion To each well of a 96-well plate, 33.3 μg / mL laminin 111 solution [= Comparative Example 2, derived from mouse EHS cell line (Wako, 120-05751)], 33.3 μg / mL fibronectin solution [ = Comparative Example 3, derived from human plasma (BD, 354008)], or 33.3 μg / mL type I collagen solution [= Comparative Example 4, rat tail derived (BD, 354236)] After injecting 50 μL, the solution was allowed to stand overnight at room temperature, and the bottom surface of each well was coated with laminin, fibronectin or collagen by natural adsorption. In all cases, the content per 1 cm 2 of the bottom area was 5 μg.
その後、各コート液を除去した後、１ウェルあたり１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水によって、各ウェルをそれぞれ２回ずつ洗浄した。 Then, after removing each coating solution, each well was washed twice with 150 μL of phosphate buffered saline per well.
そして、実施例１〜２と同じ操作で、１４日間、肝細胞を培養した。 And hepatocytes were cultured for 14 days by the same operation as Examples 1-2.
（実施例３）
前記焼結シリカ連続繊維集合体を直径６．２５ｍｍの円形となるように打ち抜いた後、細胞低接着性９６ウェルプレートの各ウェルに、前記円形の焼結シリカ連続繊維集合体を挿入し、各ウェルの底面に配置した。
Example 3
After punching the sintered silica continuous fiber aggregate into a circular shape having a diameter of 6.25 mm, the circular sintered silica continuous fiber aggregate is inserted into each well of a low cell adhesion 96-well plate, Located on the bottom of the well.
次いで、３３．３μｇ／ｍＬのラミニン１１１溶液［マウスＥＨＳ細胞株由来（Ｗａｋｏ製、１２０−０５７５１）］のコート液を、１ウェルあたり５０μＬ注液した後、一晩、室温下で静置し、自然吸着により、焼結シリカ連続繊維表面にラミニンを有する細胞培養担体を調製した。なお、細胞低接着性９６ウェルプレートにはタンパク質は吸着しないものと見なした場合、細胞培養担体の繊維表面積１ｃｍ２あたりの含有量は０．２９μｇであった。 Next, a 33.3 μg / mL laminin 111 solution [derived from mouse EHS cell line (manufactured by Wako, 120-05751)] was injected with 50 μL per well and allowed to stand overnight at room temperature. A cell culture support having laminin on the surface of the sintered silica continuous fiber was prepared by natural adsorption. In addition, when it was assumed that protein was not adsorbed to the low-cell adhesion 96-well plate, the content per 1 cm 2 of the fiber surface area of the cell culture carrier was 0.29 μg.
その後、コート液を除去した後、１ウェルあたり１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水によって、各細胞培養担体をそれぞれ２回ずつ洗浄した。 Thereafter, after removing the coating solution, each cell culture carrier was washed twice with 150 μL of phosphate buffered saline per well.
そして、実施例１〜２と同じ操作で、細胞培養担体上で、１４日間、肝細胞を培養した。 And hepatocytes were cultured for 14 days on a cell culture carrier by the same operation as in Examples 1 and 2.
（比較例５）
細胞接着性９６ウェルプレートの各ウェルに、４７９．５２μｇ／ｍＬのラミニン１１１溶液［マウスＥＨＳ細胞株由来（Ｗａｋｏ製、１２０−０５７５１）］のコート液を、１ウェルあたり５０μＬ注液した後、一晩、室温下で静置し、自然吸着により、ウェル底面をラミニンでコートした。なお、底面積１ｃｍ２あたりの含有量は７２．７μｇであった。
(Comparative Example 5)
After injecting 50 μL / well of a coating solution of a 479.52 μg / mL laminin 111 solution [derived from mouse EHS cell line (Wako, 120-05751)] into each well of a cell adhesion 96-well plate, In the evening, it was left to stand at room temperature, and the bottom surface of the well was coated with laminin by natural adsorption. The content per 1 cm 2 of the bottom area was 72.7 μg.
その後、コート液を除去した後、１ウェルあたり１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水によって、各ウェルをそれぞれ２回ずつ洗浄した。 Then, after removing the coating solution, each well was washed twice with 150 μL of phosphate buffered saline per well.
そして、実施例１〜２と同じ操作で、１４日間、肝細胞を培養した。 And hepatocytes were cultured for 14 days by the same operation as Examples 1-2.
（アルブミン分泌量の測定）
培地交換時の培養上清を全量回収（各ウェル１００μＬ）し、凍結保存を行った。全培養日程終了後、これらを解凍し、培養上清中に分泌されたラット由来アルブミン量を、ＥＬＩＳＡ法 （Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）によって測定した。検出には、一次抗体として抗ラットアルブミンウサギ抗血清（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，５５７１１）、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラットアルブミンヒツジＩｇＧ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，５５７７６）を使用した。なお、測定値の取得には、マイクロプレートリーダー（コロナ電気，ＳＨ−９０００）を使用し、付属のソフトウェアで解析した。この結果を示すグラフを図３（実施例１〜２及び比較例１〜４）及び図４（実施例１、３、比較例２、５）に示した。なお、グラフは４ウェルの平均値と標準偏差を示している。
(Measurement of albumin secretion)
The whole culture supernatant at the time of medium exchange was collected (100 μL per well) and cryopreserved. After completion of the entire culture schedule, these were thawed, and the amount of rat-derived albumin secreted into the culture supernatant was measured by ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay). For detection, anti-rat albumin rabbit antiserum (MP Biomedicals, 55711) was used as the primary antibody, and peroxidase-labeled anti-rat albumin sheep IgG (MP Biomedicals, 55776) was used as the secondary antibody. In addition, the microplate reader (Corona Electric, SH-9000) was used for acquisition of the measured value, and it analyzed with attached software. The graphs showing the results are shown in FIG. 3 (Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 to 4) and FIG. 4 (Examples 1 and 3 and Comparative Examples 2 and 5). In addition, the graph has shown the average value and standard deviation of 4 wells.
（肝代謝酵素の誘導実験）
実施例１と比較例２の肝細胞の培養において、３日又は５日間培養した後に、肝細胞の培養培地を除去し、肝細胞培養培地（図５〜８中、「定常状態」と表記）、０．１ｖｏｌ％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む肝細胞培養培地（図５〜８中、「溶媒のみ」と表記）、又は５０ｍＭデキサメサゾン（Ｄｅｘ）を溶解したＤＭＳＯを０．１ｖｏｌ％混和した肝細胞培養培地（Ｄｅｘ終濃度：５０μＭ、図５〜８中、「誘導薬剤あり」と表記）を、各ウェルに１００μＬ添加した。
(Induction experiment of liver metabolic enzyme)
In the culture of the hepatocytes of Example 1 and Comparative Example 2, after culturing for 3 days or 5 days, the culture medium of hepatocytes was removed, and hepatocyte culture medium (referred to as “steady state” in FIGS. 5 to 8). , 0.1 vol% dimethyl sulfoxide (DMSO) -containing hepatocyte culture medium (referred to as “solvent only” in FIGS. 5 to 8), or hepatocytes mixed with 0.1 vol% DMSO dissolved in 50 mM dexamethasone (Dex) 100 μL of culture medium (Dex final concentration: 50 μM, shown as “with inducer” in FIGS. 5 to 8) was added to each well.
次の日、同様の培地交換を行い、計４８時間の酵素誘導を行って、誘導後の培養５日又は７日目に相当する肝細胞のラットＣＹＰ３Ａ活性を測定した。なお、ラットＣＹＰ３Ａ活性の測定は、ＣＹＰ３Ａ４活性測定キット（プロメガ，Ｖ９００１）を使用し、マイクロプレートリーダー（コロナ電気，ＳＨ−９０００）によって実施した。この結果を示すグラフを図５（誘導後の培養５日目）及び図６（誘導後の培養７日目）に示した。なお、グラフは３ウェルの平均値と標準偏差で示した。 On the next day, the same medium was changed and enzyme induction was performed for a total of 48 hours, and the rat CYP3A activity of hepatocytes corresponding to the 5th or 7th day of culture after the induction was measured. The rat CYP3A activity was measured using a CYP3A4 activity measurement kit (Promega, V9001) and a microplate reader (Corona Electric, SH-9000). The graphs showing the results are shown in FIG. 5 (culture day 5 after induction) and FIG. 6 (culture day 7 after induction). The graph shows the average value and standard deviation of 3 wells.
更に、ラットＣＹＰ３Ａ活性測定後に、ウェルの生肝細胞の相対的細胞密度の測定を行なった。なお、生肝細胞の相対的細胞密度の測定は、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所，３４１−０７７６１）を使用し、マイクロプレートリーダー（コロナ電気，ＳＨ−９０００）によって行なった。この結果を示すグラフを図７（誘導後の培養５日目）及び図８（誘導後の培養７日目）に示した。なお、グラフは３ウェルの平均値と標準偏差で示した。 Furthermore, after measuring the rat CYP3A activity, the relative cell density of the live hepatocytes in the wells was measured. The relative cell density of live hepatocytes was measured using Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, 341-07761) with a microplate reader (Corona Electric, SH-9000). The graphs showing the results are shown in FIG. 7 (culture day 5 after induction) and FIG. 8 (culture day 7 after induction). The graph shows the average value and standard deviation of 3 wells.
実施例１〜２の肝細胞の培養方法と比較例１〜４の肝細胞の培養方法により培養した肝細胞のアルブミン分泌量を示す図３から、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体の繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを有する細胞培養担体を使用すると、１０〜１４日間程度、高い活性を維持できる肝細胞を培養できることが分かった。 From FIG. 3 showing the amount of albumin secreted by the hepatocytes cultured by the method for culturing hepatocytes of Examples 1 and 2 and the method for culturing hepatocytes of Comparative Examples 1 to 4, the surface area per unit volume is 0.01 m 2 / cm. It has been found that when a cell culture carrier having laminin or fibronectin on the fiber surface of three or more fiber assemblies is used, hepatocytes capable of maintaining high activity can be cultured for about 10 to 14 days.
また、創薬の非臨床試験および化学物質などの安全性評価で重要な酵素の誘導活性についても、図５、６から理解できるように、同様の傾向が見られ、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体の繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを有する細胞培養担体を使用した場合は、このような繊維集合体を使用しなかった場合では活性がほぼ消失してしまう培養７日目においても、高い薬剤応答性を有していることが示された。 In addition, as can be understood from FIGS. 5 and 6, the same tendency is observed for the inducing activity of enzymes important in drug non-clinical trials and safety evaluations such as chemical substances, and the surface area per unit volume is 0. When a cell culture carrier having laminin or fibronectin is used on the fiber surface of a fiber assembly of 0.01 m 2 / cm 3 or more, the culture in which the activity is almost lost if such a fiber assembly is not used. Even on the 7th day, it was shown to have high drug responsiveness.
更に、肝代謝酵素の誘導実験後の生肝細胞の相対的細胞密度の計測からは、図７、８から理解できるように、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体の繊維表面にラミニン又はフィブロネクチンを有する細胞培養担体を使用した場合と使用しなかった場合では、生残細胞数には殆ど差がなかったことが分かった。 Furthermore, from the measurement of the relative cell density of the living hepatocytes after the induction experiment of hepatic metabolic enzymes, as can be understood from FIGS. 7 and 8, the fiber assembly having a surface area per unit volume of 0.01 m 2 / cm 3 or more. It was found that there was almost no difference in the number of surviving cells when the cell culture carrier having laminin or fibronectin was used on the fiber surface of the body and when it was not used.
これらの結果から、本発明は、ラミニン又はフィブロネクチンを付与することによって肝細胞の接着性を向上させるという単純なものではなく、個々の肝細胞の機能が高められており、肝細胞の生体内の微小環境が正しく再現されていることを示唆する結果であった。このことは、接着性向上のための因子として最も一般的なＩ型コラーゲンの付与では効果がみられなかったこと（比較例１）からも支持され、細胞外基質ならどれでも同様の効果が得られるわけではないことから、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体とラミニン又はフィブロネクチンとを組合わせた細胞培養担体が有する、肝細胞に対する接着性向上以外の作用によって、個々の肝細胞の機能が高められるという、予測できない、優れた効果を奏することがわかった。 From these results, the present invention is not a simple one that improves the adhesion of hepatocytes by applying laminin or fibronectin, the function of individual hepatocytes is enhanced, the in vivo of hepatocytes This result suggests that the microenvironment is correctly reproduced. This is supported by the fact that the most common type I collagen was not applied as a factor for improving adhesion (Comparative Example 1), and the same effect was obtained with any extracellular matrix. Therefore, the cell culture carrier in which a fiber aggregate having a surface area per unit volume of 0.01 m 2 / cm 3 or more and laminin or fibronectin has a function other than the improvement in adhesion to hepatocytes. As a result, it was found that the function of individual hepatocytes was enhanced, and an excellent and unexpected effect was achieved.
また、実施例１〜２の肝細胞の培養方法と比較例１〜４の肝細胞の培養方法とでは、単位表面積あたりのラミニン又はフィブロネクチンの含有量をほぼ同量に揃えていることから、ラミニン又はフィブロネクチンの絶対含有量で１４．４倍もの差がある。そのため、この絶対含有量の差によって、培養した肝細胞の活性に差が生じたのではないか、とも考えられたが、図４に示すように、実施例３の肝細胞の培養方法と、比較例５の肝細胞の培養方法により培養した肝細胞のアルブミン分泌量の比較から、絶対含有量の影響よりも、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体とラミニン又はフィブロネクチンとを組合わせた細胞培養担体を使用することによって、高い活性を維持できる肝細胞を培養できることが分かった。 In addition, in the method for culturing hepatocytes in Examples 1 and 2 and the method for culturing hepatocytes in Comparative Examples 1 to 4, the contents of laminin or fibronectin per unit surface area are almost equal. Or there is a difference of 14.4 times in absolute content of fibronectin. Therefore, it was thought that the difference in the absolute content caused a difference in the activity of the cultured hepatocytes, but as shown in FIG. 4, the method for culturing hepatocytes in Example 3, From the comparison of the albumin secretion amount of the hepatocytes cultured by the hepatocyte culture method of Comparative Example 5, the fiber aggregate and laminin whose surface area per unit volume is 0.01 m 2 / cm 3 or more than the influence of the absolute content Alternatively, it was found that hepatocytes capable of maintaining high activity can be cultured by using a cell culture carrier in combination with fibronectin.
つまり、比較例５におけるラミニンの絶対量は実施例３における１４．４倍であるにも関わらず、活性を維持できなかったのに対して、実施例３においては、１０日間程度、高い活性を維持できる肝細胞を培養できたことから、単位体積あたりの表面積が０．０１ｍ２／ｃｍ３以上の繊維集合体とラミニン又はフィブロネクチンを組合わせた細胞培養担体を使用することが有用であることが明確となった。 That is, although the absolute amount of laminin in Comparative Example 5 was 14.4 times that in Example 3, the activity could not be maintained, whereas in Example 3, the activity was high for about 10 days. Since hepatocytes that can be maintained could be cultured, it is useful to use a cell culture carrier in which a fiber aggregate having a surface area per unit volume of 0.01 m 2 / cm 3 or more and laminin or fibronectin are combined. It became clear.
本発明の肝細胞の培養方法によれば、簡易に、酵素活性を長期間にわたって維持できる肝細胞を培養できる。また、肝細胞を評価、解析しやすい、肝細胞の培養方法である。 According to the method for culturing hepatocytes of the present invention, hepatocytes that can maintain enzyme activity over a long period of time can be easily cultured. In addition, it is a method for culturing hepatocytes that facilitates evaluation and analysis of hepatocytes.
１ 静電紡糸装置
２ 紡糸ノズル
３ 繊維回収容器
４ 捕集部材
５ 対向電極
５ａ イオン
６ ゾル溶液供給機
７ 第１高電圧電源
８ 第２高電圧電源
９ 吸引機
２５ 沿面放電素子
２６ 誘電体基板
２７ 放電電極
２８ 誘起電極
２９ 交流電源
DESCRIPTION OF
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015025866A JP6454172B2 (en) | 2015-02-12 | 2015-02-12 | Hepatocyte culture method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015025866A JP6454172B2 (en) | 2015-02-12 | 2015-02-12 | Hepatocyte culture method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2016146785A JP2016146785A (en) | 2016-08-18 |
| JP6454172B2 true JP6454172B2 (en) | 2019-01-16 |
Family
ID=56690830
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015025866A Expired - Fee Related JP6454172B2 (en) | 2015-02-12 | 2015-02-12 | Hepatocyte culture method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6454172B2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018061131A1 (en) * | 2016-09-28 | 2018-04-05 | オリンパス株式会社 | Cell status assessment device |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4336399A1 (en) * | 1993-10-26 | 1995-04-27 | Augustinus Dr Med Bader | Process for improving the matrix conditions of bipolar adhered hepatocytes and for producing a suitably configured cell culture kit |
| JP2008142004A (en) * | 2006-12-08 | 2008-06-26 | Tokyo Univ Of Pharmacy & Life Science | Hepatocyte culture substrate |
| JP5747341B2 (en) * | 2010-07-09 | 2015-07-15 | 日本バイリーン株式会社 | High performance fiber structure |
| JP6157070B2 (en) * | 2012-07-16 | 2017-07-05 | 日本バイリーン株式会社 | Primary cell culture method |
| JP6058994B2 (en) * | 2012-12-06 | 2017-01-11 | 日本バイリーン株式会社 | Cell culture carrier and method of use thereof |
-
2015
- 2015-02-12 JP JP2015025866A patent/JP6454172B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2016146785A (en) | 2016-08-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tylek et al. | Precisely defined fiber scaffolds with 40 μm porosity induce elongation driven M2-like polarization of human macrophages | |
| Park et al. | Nanosize and vitality: TiO2 nanotube diameter directs cell fate | |
| Xiao et al. | Microfabricated perfusable cardiac biowire: a platform that mimics native cardiac bundle | |
| Ong et al. | Biomaterial-free three-dimensional bioprinting of cardiac tissue using human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes | |
| Sun et al. | Self-organization of skin cells in three-dimensional electrospun polystyrene scaffolds | |
| KR101681972B1 (en) | Inorganic fiber structure and process for producing same | |
| Park et al. | Creation of a hybrid scaffold with dual configuration of aligned and random electrospun fibers | |
| Grenier et al. | Polyurethane biomaterials for fabricating 3D porous scaffolds and supporting vascular cells | |
| Xu et al. | Combined chemical and structural signals of biomaterials synergistically activate cell-cell communications for improving tissue regeneration | |
| Gandhimathi et al. | Mimicking nanofibrous hybrid bone substitute for mesenchymal stem cells differentiation into osteogenesis | |
| Chen et al. | Optimizing microenvironment by integrating negative pressure and exogenous electric fields via a flexible porous conductive dressing to accelerate wound healing | |
| JP6877540B2 (en) | Method for manufacturing cell laminate | |
| US11543404B2 (en) | Nerve cell device and method for evaluating neural activity | |
| Yu et al. | Effects of aligned electrospun fibers with different diameters on hemocompatibility, cell behaviors and inflammation in vitro | |
| Hodde et al. | Characterisation of cell–substrate interactions between Schwann cells and three‐dimensional fibrin hydrogels containing orientated nanofibre topographical cues | |
| JP6454172B2 (en) | Hepatocyte culture method | |
| Mochizuki et al. | Tissue engineering based on electrochemical desorption of an RGD‐containing oligopeptide | |
| Matsunaga et al. | Microscopic study on resorption of β-tricalcium phosphate materials by osteoclasts | |
| JP5912716B2 (en) | INORGANIC FIBER STRUCTURE AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME | |
| Denecke et al. | Human endothelial colony‐forming cells expanded with an improved protocol are a useful endothelial cell source for scaffold‐based tissue engineering | |
| JP2012016323A (en) | High-function fibrous structure | |
| Okudaira et al. | Fabrication of a fiber-type hepatic tissue by bottom-up method using multilayer spheroids | |
| JP6058994B2 (en) | Cell culture carrier and method of use thereof | |
| JP6157070B2 (en) | Primary cell culture method | |
| Jia et al. | RETRACTED: Gas-foaming three-dimensional electrospun nanofiber scaffold improved three-dimensional cartilage regeneration |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20171107 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20180906 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181009 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181128 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20181211 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20181214 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6454172 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |