JP6441219B2

JP6441219B2 - ｍＴＯＲ経路関連疾患を治療するための化合物

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Publication number: JP6441219B2
Application number: JP2015525692A
Authority: JP
Inventors: モハンマド・ホセイン・プールゴラミ; ディヴィッド・エル・モリス; ロジャー・アストン
Original assignee: ピットニー・ファーマシューティカルズ・ピーティーワイ・リミテッド
Priority date: 2012-08-06
Filing date: 2013-08-05
Publication date: 2018-12-19
Anticipated expiration: 2033-08-05
Also published as: CA2881325C; CN105496999A; HK1205502A1; EP2880014B1; KR20150081422A; EP3202397A1; CN104837812A; JP6509386B2; AU2016234924B2; ZA201501390B; PL2880014T3; EP2880014A4; US20170369435A1; EP3202397B1; CN104837812B; ES2627099T3; JP2015524446A; JP2018062526A; NZ729555A; EP2880014A1

Description

一般的に、本発明は、mTOR(哺乳類ラパマイシン標的)経路関連疾患を治療するための化合物に関する。具体的には、本発明は、mTOR経路関連疾患の治療におけるアミノアセトニトリル誘導体(AAD:aminoactonitrile derivative)の使用に関する。

アミノアセトニトリル誘導体(AAD)は、薬物耐性線虫に効果的な駆虫剤の1種である。線虫または回虫は、ヒトおよび飼育動物の病原体を多数含んでいる。捻転胃虫(Haemonchus contortus)などの胃腸管線虫は、世界的に家畜生産の重大な経済的損失を引き起こす反芻動物の主要な寄生虫である。

モネパンテル(MPL)(N-[(1S)-1-シアノ-2-(5-シアノ-2-トリフルオロメチル-フェノキシ)-1-メチル-エチル]-4-トリフルオロメチルスルファニル-ベンズアミド)は、このようなAADの一例であり、ヒツジの胃腸管寄生虫の治療のための抗線虫薬として承認されている。

MPLは、様々な種類の家畜病原線虫に有効であることが示されている。

抗線虫薬としてのMPLの作用機序は、リガンド開口性イオンチャンネルを介した、神経筋シナプスでのシグナル伝達の妨害の誘導である。その後、影響を受けた寄生虫は、筋肉収縮の調節異常、麻痺、壊死および脱皮異常を経験する。3種類のニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)関連遺伝子がMPLの主要な標的として同定され、3種類の遺伝子はすべて、線虫のみに存在するnAChRサブユニットのDEG-3サブファミリーを表すタンパク質をコードする。DEG-3遺伝子は、第2の膜貫通ドメインのα7サブユニットの遺伝子と類似点を有するnAChRα-サブユニットをコードする。

オーストラリア仮特許出願第2012901199号 PCT/AU2013/000290号欧州特許第1216053号米国特許第6,372,223号欧州特許第0399843号米国特許第7,029,678号 PCT公開第WO2007/006939号

H. Anselら、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (第6版、1995)196頁および1456〜1457頁 T. HiguchiおよびV. Stella、Pro-drugs as Novel Delivery Systems (1987) A.C.S. Symposium Seriesの14 Bioreversible Carriers in Drug Design、(1987) Edward B. Roche編、American Pharmaceutical Association and Pergamon Press A. Gennaro (編)、Remington's Pharmaceutical Sciences、18版、(1990)、Mack Publishing Co.、Easton、Pennsylvania Remington's Pharmaceutical Science、15版、Mack Publishing Company、Easton、Pa. Prescott(編)、(1976)「Methods in Cell Biology」第XIV巻、Academic Press、New York, N.Y.33頁以降 Gennaroら(編)、(1990)、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.、Easton、Pennsylvania、USA Gilmanら(編)、(1990)、「Goodman And Gilmah's:The Pharmacological Bases of Therapeutics」、Pergamon Press Finglら(1975)、「The Pharmacological Basis of Therapeutics」1章1頁

驚くべきことに、AADは、哺乳類細胞のmTOR経路標的(受容体)にも結合し、それ自体mTOR経路関連疾患の治療に効果的であることが発見された。

本発明の第1の態様によると、1種または複数のmTOR経路関連疾患を治療するための、式(I):

(式中、R¹、R²およびR³およびR⁵はそれぞれ独立してH、アルキル、ハロゲン、-CF₃または-CNから選択され、
R⁴およびR⁶はそれぞれ独立してH、アルキル、ハロゲン、アルコキシ、-CF₃、-OCF₃、-SO₂CF₃、-SOCF₃または-SCF₃から選択され、
Xはヘテロ原子、N(アルキル)またはNHであり、
nは1から20である)
の化合物、またはその代謝物、薬学的に許容される塩、溶媒和化合物もしくはプロドラッグが提供される。

本発明の第2の態様によると、1種または複数のmTOR経路関連疾患を治療するための方法であって、それを必要とする患者に、本発明の第1の態様による式(I)の化合物、またはその代謝物、薬学的に許容される塩、溶媒和化合物もしくはプロドラッグの治療有効量を投与する工程を含む方法が提供される。

本発明の第3の態様によると、1種または複数のmTOR経路関連疾患の治療のための医薬品を製造するための、本発明の第1の態様による式(I)の化合物、またはその代謝物、薬学的に許容される塩、溶媒和化合物もしくはプロドラッグの使用が提供される。

本発明の第4の態様によると、癌ではない1種または複数のmTOR経路関連疾患の治療で使用するための本発明の第1の態様による式(I)の化合物が提供される。

本発明の第5の態様によると、癌ではない1種または複数のmTOR経路関連疾患を治療するための方法であって、それを必要とする患者に、本発明の第1の態様による式(I)の化合物、またはその代謝物、薬学的に許容される塩、溶媒和化合物もしくはプロドラッグの治療有効量を投与する工程を含む方法が提供される。

本発明の第6の態様によると、癌ではない1種または複数のmTOR経路関連疾患の治療のための医薬品を製造するための、本発明の第1の態様による式(I)の化合物、またはその代謝物、薬学的に許容される塩、溶媒和化合物もしくはプロドラッグの使用が提供される。

好ましくは、R¹は-CN、Hまたはハロゲンである。より好ましくは、R¹は-CNである。好ましくは、R²はHまたはハロゲンであり、より好ましくは、Hである。好ましくは、R³は-CF₃またはハロゲンであり、より好ましくは、-CF₃である。好ましくは、R⁴は-SCF₃、-SOCF₃、-SO₂CF₃、-OCF₃または-CF₃である。より好ましくは、R⁴は-SCF₃または-SO₂CF₃である。好ましくは、R⁵はHである。好ましくは、R⁶はアルキルであり、より好ましくは、CH₃である。好ましくは、XはOである。好ましくは、nは1から15、1から10、1から5、1から2または1である。最も好ましくは、nは1である。好ましくは、R⁴はアミド部分に対してパラ位に配置されている。

式(I)の化合物は、(R)-もしくは(S)-エナンチオマーまたはラセミ体であってもよい。好ましくは、式(I)の化合物は、(S)-エナンチオマーである。

式(I)の化合物は、以下の化合物:

またはその代謝物、薬学的に許容される塩、溶媒和化合物もしくはプロドラッグのいずれか1つから選択することができ、上記化合物のそれぞれは、(R)-もしくは(S)-エナンチオマーまたはラセミ体である。

好ましくは、式(I)の化合物は、以下の化合物:

(特に記載しなければ)またはその代謝物、薬学的に許容される塩、溶媒和化合物もしくはプロドラッグのいずれか1つから選択することができ、上記化合物のそれぞれは、(R)-もしくは(S)-エナンチオマーまたはラセミ体である。

より好ましくは、式(I)の化合物は、MPL(N-[(1S)-1-シアノ-2-(5-シアノ-2-トリフルオロメチル-フェノキシ)-1-メチル-エチル]-4-トリフルオロメチルスルファニル-ベンズアミド):

またはその代謝物、薬学的に許容される塩、溶媒和化合物もしくはプロドラッグである。

さらに、本発明の化合物は、MPLの代謝物であるモネパンテルスルホン(MPL-SO₂):

またはその代謝物、薬学的に許容される塩、溶媒和化合物もしくはプロドラッグであってもよい。

好ましくは、1種または複数のmTOR経路関連疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン病、加齢性疾患、移植拒絶反応に関連する疾患、慢性炎症性疾患、グリコーゲン蓄積に関連する疾患、癌、転移、全身性エリテマトーデス、炎症および免疫活性化に関連する疾患、貧血、白血球減少症、血小板減少症、ステントのコーティングに関連する疾患、腎不全、肥満、糖尿病/インスリン抵抗性、非アルコール性脂肪肝に関連する疾患、多発性嚢胞腎疾患、パーキンソン病および線維症から選択される。好ましくは、mTOR経路関連疾患は、慢性炎症性疾患であり、関節リウマチであってもよい。好ましくは、線維症は、肝線維症、心臓線維症または肺線維症である。最も好ましくは、治療する疾患は、癌および転移である。好ましくは、癌はキナーゼと関係がある。好ましくは、キナーゼは、サイクリン依存性キナーゼであり、より好ましくは、cdk2またはcdk4である。

好ましくは、癌は、膀胱癌、乳癌、結腸癌、中皮腫癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、頭頸部癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌、および扁平上皮癌を含む皮膚癌を含む癌腫;白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、骨髄腫およびバーキットリンパ腫を含むリンパ系の造血器腫瘍;急性および慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群ならびに前骨髄球白血病を含む骨髄系の造血器腫瘍;線維肉腫および横紋筋肉腫を含む間葉由来の腫瘍;星状膠細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫およびシュワン細胞腫を含む中枢および末梢神経系の腫瘍;ならびに黒色腫、セミノーマ、奇形癌腫、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞癌およびカポジ肉腫を含むその他の腫瘍から選択される。

好ましくは、治療すべき癌は、卵巣癌、乳癌、前立腺癌または中皮腫癌から選択され、最も好ましくは、治療すべき癌は卵巣癌である。

本発明のさらなる態様では、式(I)の化合物は、癌ではない1種または複数のmTOR経路関連疾患の治療で使用することができる。

好ましくは、1種または複数のmTOR経路関連疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン病、加齢性疾患、移植拒絶反応に関連する疾患、慢性炎症性疾患、グリコーゲン蓄積に関連する疾患、転移、全身性エリテマトーデス、炎症および免疫活性化に関連する疾患、貧血、白血球減少症、血小板減少症、ステントのコーティングに関連する疾患、腎不全、肥満、糖尿病/インスリン抵抗性、非アルコール性脂肪肝に関連する疾患、多発性嚢胞腎疾患、パーキンソン病および線維症から選択される。

好ましくは、mTOR経路関連疾患は、慢性炎症性疾患であり、慢性炎症性疾患は、関節リウマチまたは移植後の臓器拒絶反応であってもよい。

MPLによる細胞増殖の阻害を示す図である。卵巣癌細胞系OVCAR-3、A2780およびSKOV-3ならびに正常HUVEC(対照)をすべて、MPL(0、1、5、10、25、50および100μmol/L)の存在下で72時間培養した。MPLの細胞増殖に対する効果は、SRBアッセイを使用して評価した。対照(媒体処理)細胞が100%増殖を示すと考え、MPL処理群を対照のパーセントとして表す。各薬物濃度を4連で試験して、各実験を少なくとも2回繰り返した。データ(平均±SEM)は、対照のパーセントとして示す。統計学的比較のために、各薬物処理群をスチューデントt検定を使用して対照群と比較した。 OVCAR-3細胞のコロニー形成活性に対するMPLの効果を示す図である。細胞をMPL(0、5、10および25μmol/L)で72時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、寒天プレートに移し、常用の成長培地で培養し、標準条件下で2週間インキュベートした。次に、細胞を100%メタノールで固定し、1%クリスタルバイオレットで染色した。コロニー(50個を上回る細胞の集団)を顕微鏡下で計数した(倍率5倍)。異なる実験群で計数したコロニーの数を対照のパーセントとして表す。 MPLが卵巣癌細胞系の細胞周期分布をどのように妨害するかを示す図である。OVCAR-3細胞を、MPL(0、5、10および25μmol/L)で48時間処理した。ヨウ化プロピジウムで染色した細胞のDNA含量を、フローサイトメトリー分析を使用して解析した。結果(表参照)は、G1、SおよびG2/M期における細胞のパーセントとして示す。各値は、2回の独立した実験の平均±SEMを表す。 MPLが卵巣癌細胞系の細胞周期分布をどのように妨害するかを示す図である。A2780細胞を、MPL(0、5、10および25μmol/L)で48時間処理した。ヨウ化プロピジウムで染色した細胞のDNA含量を、フローサイトメトリー分析を使用して解析した。結果(表参照)は、G1、SおよびG2/M期における細胞のパーセントとして示す。各値は、2回の独立した実験の平均±SEMを表す。 MPLが細胞周期調節タンパク質cdk2、cdk4ならびにサイクリンEおよびAの発現を妨害することを示す図である。細胞を、MPL(0、5、10および25μmol/L)で48時間処理した。全タンパク質抽出物を得、電気泳動で分離し、イムノブロットを指示した抗体で探索した。各抽出物中のこれらのタンパク質のレベルを示すウェスタンブロット分析は、関連する抗体を使用して分析した。画像は、読み取った放射線撮影フィルムを表す。ハウスキーピング遺伝子(GAPDH)を使用して、類似のタンパク質のローディングおよびブロット移動を確認した。 MPL処理細胞におけるPARPおよび切断PARPのイムノブロット分析を示す図である。細胞培養条件下で増殖したOVCAR-3およびA2780細胞を、様々な濃度のMPL[0、5、10、25μM]で24、48または72時間インキュベートした。次に細胞溶解物を調製し、PARPおよび切断PARPを測定するためにウェスタンブロッティングによって分析した。 A2780卵巣癌細胞のMPLによる処理またはU87神経膠腫細胞のMPL-SO₂による処理は、液胞の形成を引き起こすことを示し、MPLおよびMPL-SO₂がこれらの細胞において自己貪食を誘導することを示唆する図である。自己貪食は、mTOR阻害の特徴である。図6で示したことと矛盾せず、MPL処理が細胞自己貪食のもう1つの指標であるADP/ATPの細胞比を低下させることを示す図である。ヒト卵巣癌OVCAR-3細胞系におけるATPおよびADP/ATP比に対するMPLの効果を示す図である。標準的な細胞培養条件下で細胞をMPLに曝露すると、ATPレベルの低下、その結果ADP/ATP比の上昇が引き起こされる。培地中のADPおよびATPレベルは、市販のAbcam社製の比色/蛍光定量アッセイキットをLonza(Sydney、Australia subsidary)社製のApoGlowアッセイキットと一緒に使用して測定した。各値は、少なくとも2回の測定の平均+s.e.m.を表す。 MPLが細胞生存能を妨害することを示す図である。A)MPL(0、5、10、25μM)に72h曝露したOVCAR-3細胞の顕微鏡画像。ヒト卵巣癌細胞系OVCAR-3、A2780、SKOV-3、IGROV-1をMPL(0、5、10、25μmol/L)の存在下で72h培養した。MPLの細胞生存能に対する効果は、標準的トリパンブルーアッセイを使用して評価した。対照(媒体処理)細胞が100%生存を示すと考え、MPL処理群を対照のパーセントとして表す。各薬物濃度を4連で試験して、各実験を少なくとも2回繰り返した。データ(平均±SEM)は、%対照として示す。統計学的比較のために、各薬物処理群はスチューデントt検定を使用して対照群と比較し、0.5以下のp値は、有意差を示すと見なした(p<0.5)、^*=<0.05、^**<0.01、^***=p<0.001。正常細胞の生存能に対するMPLの効果を示し、MPLの抗増殖効果が癌細胞指向性であることを示す図である。正常細胞HOSE、CHO、HEKおよびHUVECをMPL(0、5、10、25μmol/L)の存在下で72h培養した。MPLの細胞生存能に対する効果は、標準的トリパンブルーアッセイを使用して評価した。結果は、対照(100%)と比較した平均±SEMとして示す。 MPLがどのように細胞増殖を阻害するかを示す図である。ヒト卵巣癌細胞系OVCAR-3、A2780、およびSKOV-3およびIGROV-1をすべて、MPL(0、5、10、25、50および100μmol/L)の存在下で72h培養した。MPLの細胞増殖に対する効果は、SRBアッセイを使用して評価した。対照(媒体処理)細胞が100%増殖を示すと考え、MPL処理群を対照のパーセントとして表す。各薬物濃度を4連で試験して、各実験を少なくとも2回繰り返した。データ(平均±SEM)は、%対照として示す。統計学的比較のために、各薬物処理群をスチューデントt検定を使用して対照群と比較した。(A):アトロピン:ムスカリン性Ach受容体アンタゴニスト、ツボクラリン:ニコチン性Ach受容体アンタゴニスト、メカミラミン:非選択的非競合的ニコチン性受容体アンタゴニスト;(B):カルバコール:ムスカリン性ニコチン性ach受容体アゴニスト、ニコチン:ニコチン性ach受容体アゴニスト、アルファ-ブンガロトキシン:選択的α7、ニコチン性ach受容体アゴニスト。 MPL抗増殖効果は、ニコチン性受容体とは独立していることを示す図である。細胞を漸増濃度のニコチン、カルバコールまたは受容体アンタゴニスト、アトロピン、メカミラミン、ツボクラリンおよびα-ブンガロトキシンで予め処理した(30分)。MPL(5μM)を添加し、細胞培養インキュベーターに72h入れた。各薬物濃度を4連で試験して、各実験を2回繰り返した。併記した値(平均±SEM)は、%対照として示す。 MPLがどのように神経膠腫細胞の増殖を阻害するかを示す図である。通常の細胞培養条件下において、SRB増殖アッセイを使用した、MPL処理(0、5、10、25、50μM;72h)のU87-MG、U251神経膠腫細胞系対正常な星状膠細胞の増殖に対する効果の比較である。データは、%対照として示す。 MPLがどのように自己貪食を誘導するかを示す図である。化学療法抵抗性U87神経膠腫細胞のMPLによる処理が自己貪食を引き起こし、このことは濃度に依存したLC3-IIの発現増加によって確認される。MPLで処理したU87-MGおよびU251神経膠腫細胞は、濃度依存型の自己貪食(液胞として示された)を示した。LC3-IからLC3-IIへの濃度依存性の変換によって、これらの細胞における自己貪食現象の増加が確認される。 OVCAR-3およびA2780細胞のコロニー形成活性に対するMPLの効果を示す図である。細胞をMPL(0、5、10、25μM)で72hインキュベートした後、細胞を洗浄し、その後寒天プレートに移し、常用の成長培地で培養し、標準条件下で2週間インキュベートした。次に、細胞を100%メタノールで固定し、1%クリスタルバイオレットで染色した。コロニー(50個を上回る細胞の集団)を顕微鏡下で計数した(倍率5倍)。異なる実験群で計数したコロニーの数を対照の%として表す。 MPLがどのように卵巣癌細胞系の細胞周期進行を妨害するかを示す図である。OVCAR-3またはA2780細胞をMPL(0、5、10、25μM)で48h処理し、細胞をPIで染色した後、フローサイトメトリー分析(FACS)によって調べた。図およびデータは、ここではG1、SおよびG2/M期における細胞のパーセントとして示した、細胞周期の様々な期における細胞分布のMPL誘導性の変化を示している。各値は、2回の独立した測定の平均±SEMを表す。 MPLがどのように細胞周期調節タンパク質cdk2、cdk4、サイクリンEおよびAの発現を妨害するかを示す図である。細胞を、MPL(0、5、10、25μM)で24、48hまたは72h処理した。全タンパク質抽出物を得、電気泳動で分離し、イムノブロットを指示した抗体で探索した。各抽出物中のこれらのタンパク質のレベルを示すウェスタンブロット分析は、関連する抗体を使用して分析した。画像は、読み取った放射線撮影フィルムを表す。ハウスキーピング遺伝子(GAPDH)を使用して、類似のタンパク質のローディングおよびブロット移動を確認した。 MPLがどのようにPARPを切断するかを示す図である。OVCAR-3またはA2780細胞をMPL(0、5、10、25μM)に24、48または72h曝露するとPARPの切断の原因となり、細胞の解体が引き起こされ、死滅する細胞のマーカーとして役立つ。 MPLがどのようにATPレベルを低下させるかを示す図である。OVCAR-3またはA2780細胞をMPL(0、5、10、25μM)に24、48または72h曝露するとPARPの切断の原因となり、細胞の解体が引き起こされ、死滅する細胞のマーカーとして役立つ。 MPLがどのようにATPレベルを低下させるかを示す図である。OVCAR-3またはA2780細胞をMPL(0、5、10、25μM)に24、48または72h曝露するとPARPの切断の原因となり、細胞の解体が引き起こされ、死滅する細胞のマーカーとして役立つ。ヌードマウスにおけるi.p.(腹腔内)投与したモネパンテルのs.c.(皮下)腫瘍成長に対する効果を示す図である。250万個の対数増殖期のOVCAR-3細胞を各マウスの左側腹部にs.c.注射した。腫瘍成長は、ノギスによる測定によってモニターし、腫瘍体積は直交直径を測定して決定した。推定した腫瘍体積は、式1/2(長さ×幅2)を基にして計算し、式中、幅は2つの直交測定値の短い方である。処理は、腫瘍細胞を注射して7日後に開始し、その前に、マウスを無作為化し、処理群または対照群(群当たり6匹)に割り当てた。0.5%HPMCに懸濁したモネパンテルを2.5または25mg/kgで週3回i.p.投与した。対照群は、媒体のみで処理した。ヌードマウスにおけるi.p.投与したモネパンテルのs.c.腫瘍成長に対する効果を示す図である。対数増殖期のOVCAR-3細胞を各マウスの左側腹部にs.c.注射した。腫瘍成長は、ノギスによる測定によってモニターし、腫瘍の体積は直交直径を測定して決定した。推定した腫瘍体積は、式1/2(長さ×幅2)を基にして計算し、式中、幅は2つの直交測定値の短い方である。処理は、腫瘍細胞を注射して7日後に開始し、その前に、マウスを無作為化し、処理群または対照群(群当たり6匹)に割り当てた。0.5%HPMCに懸濁したモネパンテルを25または50mg/kgで週3回i.p.投与した。対照群は、媒体のみで処理した。ヌードマウスにおける経口モネパンテルの腫瘍成長に対する効果を示す図である。OVCAR-3細胞を各マウスの左側腹部にs.c.注射した。腫瘍成長は、ノギスによる測定によってモニターし、腫瘍体積は直交直径から決定し、推定した腫瘍体積は、式1/2(長さ×幅2)を基にして計算し、式中、幅は2つの直交測定値の短い方である。処理は、腫瘍細胞を注射して7日後に開始し、その前に、マウスを無作為化し、処理群または対照群(群当たり6匹)に割り当てた。0.5%HPMCに懸濁したモネパンテルを50または100mg/kgで週3回経口的に(100μL)投与した。対照群は、媒体のみで経口的に処理した。図20〜図22は全般的に、雌ヌードマウスにおけるMPLのs.c.異種移植片に対する効果を示す図である。マウスの左側腹部に250万個の対数増殖期のヒトOVCAR-3細胞を接種した。腫瘍成長は、ノギスによる測定によってモニターし、腫瘍体積は直交直径を測定して決定した。推定した腫瘍体積は、式1/2(長さ×幅2)を基にして計算し、式中、幅は2つの直交測定値の短い方である。処理は、腫瘍細胞を注射して7日後に開始し、その前に、マウスを無作為化し、処理群または対照群(群当たり5〜6匹)に割り当てた。0.5%HPMCに懸濁したモネパンテルを2.5もしくは25mg/kg(図19)、25および50mg/kg(図20)でi.p.投与するか、または50および100mg/kgで経口的に投与し、いずれも週3回投与した。対照群のマウスには、ほぼ同じ方法および回数で同様の体積の0.5%HPMCを投与した。 MPLが腫瘍組織においてどのようにして壊死を誘導するかを示す図である。ヌードマウスの皮下異種移植片の腫瘍組織を、1日おきにMPLを50または100mg/kg/日で経口的に投与することにより処理した。腫瘍の組織学的画像をヘマトキシリンおよびエオジン染色(H&E;上部の列)で示すと、重度の薬物誘導性壊死が示される(黒い矢印;倍率10倍)。MPL処理マウスから切除した腫瘍の代表的な腫瘍組織画像は、高用量100mg/kg(s.c.腫瘍、経口処理、週3回を2週間)で広範囲の壊死を示す。指示した時点において、細胞培養条件下でMPL10μMで処理したOVCAR-3細胞を示す図である。細胞培養条件下でMPL10μMで1、4または24時間処理したOVCAR-3細胞から調製した細胞溶解物のウェスタンブロット分析である。結果は、mTORおよびその下流シグナル伝達経路p70S6K両方のリン酸化[活性化]の阻害を示す。インビトロにおいてMPLで処理したヒト卵巣OVCAR-3細胞におけるタンパク質発現を示す図である。細胞培養条件下でMPL0、5、10、15および25μMで48時間処理したOVCAR-3細胞から調製した細胞溶解物のウェスタンブロット分析である。結果は、c-MycおよびサイクリンD1発現の下方調節を示す。 MPL処理したOVCAR-3腫瘍におけるmTOR関連シグナル伝達の腫瘍発現に対するMPLの阻害効果を示す図である。雌ヌードマウスにおいてs.c.増殖したOVCAR-3腫瘍から調製した腫瘍溶解物のウェスタンブロット分析である。マウスは、細胞接種の8日後からMPL(0.5%HPMCに懸濁した25、50mg/kgをi.p.投与)または媒体(0.5%HPMC)で3週間i.p.処理した。最後の投与の24時間後、腫瘍を切除し、-80℃で凍結した。腫瘍のウェスタンブロット分析は、mTORシグナル伝達の抑制を示す。c-Myc、サイクリンD1およびE2ならびにCDK2および4と共にmTORのタンパク質発現は、MPL処理マウスから切除した腫瘍において抑制されていた。 NF-κBp65リン酸化に対するMPLの阻害効果を示す図である。 NF-κBp65リン酸化に対するMPLの阻害効果を示す図である。 IκB-αリン酸化に対するMPLの阻害効果を示す図である。 IKKリン酸化に対するMPLの阻害効果を示す図である。 MPLがIL-6発現の下方調節を引き起こすことを示す図である。 MPLがTGF-β発現の下方調節を引き起こすことを示す図である。 MPLがNO発現を抑止することを示す図である。

定義
「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素、好ましくはフッ素または塩素を意味する。

「アルキル」とは、直鎖または分枝鎖であってもよく、鎖内に約1個から約20個の炭素原子を含む脂肪族炭化水素基を意味する。好ましいアルキル基は、鎖内に約1個から約12個の炭素原子を含有する。より好ましいアルキル基は、鎖内に約1個から約6個の炭素原子を含有する。分枝は、メチル、エチルまたはプロピルなどの1個または複数の低級アルキル基が直鎖アルキル鎖に結合していることを意味する。「低級アルキル」とは、直鎖または分枝鎖であってもよい鎖内に約1個から約6個の炭素原子を有する基を意味する。「アルキル」は、非置換か、または同じかもしくは異なっていてもよい1個または複数の置換基で場合によって置換されていてもよく、各置換基は独立して、ハロ、アルキル、アリール、シアロアルキル、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、-NH(アルキル)、-NH(シクロアルキル)、-N(アルキル)₂、カルボキシおよび-C(O)O-アルキルからなる群から選択される。適切なアルキル基の非限定的な例としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピルおよびt-ブチルが挙げられる。

「アリール」はそれ自体、または別の置換基の一部として、芳香族環の炭化水素基を意味する。好ましいアリール基は、6個から10個の炭素原子を有する。用語「アリール」には、複数の環系ならびに単一の環系が含まれる。本発明で使用するために好ましいアリール基には、フェニルおよびナフチルが含まれる。用語「アリール」にはまた、部分的に芳香族の(すなわち、縮合環の1個が芳香族で、もう一方が非芳香族である)縮合した環状炭化水素環が含まれる。例示的な、部分的に芳香族のアリール基は、インダニルである。

「ヘテロアリール」はそれ自体、または別の置換基の一部として、C、N、OおよびSから選択される5個から12個の環原子を有する環状基または多環式基を意味し、少なくとも1個の環ヘテロ原子がO、NまたはSであり、構成環の少なくとも1個が芳香族である。本発明で使用するための例示的なヘテロアリール基には、カルバゾリル、カルボリニル、クロメニル、シノリニル、フラニル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、イソベンゾフラニル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズイミダゾロニル、インダゾリル、インドリル、イソインドリル、インドリニル、インドラジニル、インジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、イソオキサゾリル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ベンゾピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリル、キノリル、イソキノリル、テトラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、チエニル、ベンゾチオエニル、ベンゾチアゾリル、キノキサリニル、トリアジニルおよびトリアゾリルならびにそれらのN-オキシドが含まれる。

ヘテロアリール基の1サブグループは、5個の環原子を有する。この実施形態の例示的なヘテロアリール基は、ピラゾリル、ピリジル、チアゾリルおよびイミダゾリルである。

ヘテロアリール基のもう1つのサブグループは、6個の環原子を有する。この実施形態の例示的なヘテロアリール基は、ピリジニルおよびピリミジニルである。

用語「ヘテロアリール」にはまた、部分的に芳香族の(すなわち、縮合環の1個が芳香族で、もう一方が非芳香族である)縮合した環状複素環が含まれる。例示的な、部分的に芳香族のヘテロアリール基は、ベンゾジオキソールである。

本明細書で定義したヘテロアリール基が置換されている場合、置換基は、置換を可能にする原子価を有する、ヘテロアリール基の環炭素原子または環ヘテロ原子(すなわち、窒素、酸素もしくは硫黄)に結合していてもよい。好ましくは、置換基は、環炭素原子に結合している。同様に、ヘテロアリール基が本明細書で置換基として定義される場合、結合点は、結合を可能にする原子価を有する、ヘテロアリール基の環炭素原子または環ヘテロ原子(すなわち、窒素、酸素もしくは硫黄)であってもよい。好ましくは、環炭素原子で結合する。

「ヘテロ原子」とは、N、O、PおよびSから選択される原子を意味する。必要に応じて、特に指定されていない原子価は、独立してH、OH、カルボニル、n-アルキルまたはアルコキシから選択される。

「n」は1から20であってもよく、好ましくは、1から10、より好ましくは、1から6、最も好ましくは、1から4であってもよい。

「アルコキシ」は、アルキル-O-基を意味し、アルキル基は以前に記載された通りである。適切なアルコキシ基の非限定的な例には、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシおよびn-ブトキシが含まれる。親部分への結合は、エーテル酸素による。

「薬学的に許容される塩」とは、式(I)の化合物の生物学的有効性および特性を保持し、適切な非毒性の有機もしくは無機酸または有機もしくは無機塩基から形成される従来の酸付加塩または塩基付加塩を意味する。酸付加塩の例としては、塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸および硝酸などの無機酸から得られた塩およびp-トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸などの有機酸から得られた塩が挙げられる。塩基付加塩の例としては、アンモニア、カリウム、ナトリウム、および、例えば、水酸化テトラメチルアンモニウムなどの4級水酸化アンモニウムから得られた塩が挙げられる。医薬化合物(すなわち、薬物)の塩への化学的改変は、化合物の改善された物理的および化学的安定性、吸湿性、流動性および溶解性を得るための、製薬化学者にとって周知の技術である。例えば、H. Anselら、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (第6版、1995)196頁および1456〜1457頁を参照のこと。

薬学的に許容される担体、賦形剤などの「薬学的に許容される」とは、特定の化合物を投与する対象にとって、薬理学的に許容され、実質的に無毒であることを意味する。

置換されたアルキルにおけるような「置換された」とは、置換が1個または複数の位置で生じることができ、特に他の指示がない限り、それぞれの置換部位の置換基が独立して、指定された選択肢から選択されることを意味し、複数の置換基が様々な部位で同時に存在していてもよいことを意味する。

本発明の化合物の「プロドラッグ」および「溶媒和化合物」も本明細書で検討する。プロドラッグの考察は、T. HiguchiおよびV. Stella、Pro-drugs as Novel Delivery Systems (1987) A.C.S. Symposium Seriesの14およびBioreversible Carriers in Drug Design、(1987) Edward B. Roche編、American Pharmaceutical Association and Pergamon Pressに提供されている。用語「プロドラッグ」とは、インビボで転換されて、式(I)の化合物、またはその化合物の代謝物、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物を生成する化合物(例えば、薬物前駆体)を意味する。転換は、様々な機構によって(例えば、代謝的または化学的プロセスによって)生じ得る。プロドラッグの使用の考察は、T. HiguchiおよびW. Stella、「Prodrugs as Novel Delivery Systems」、A.C.S. Symposium Seriesの第14巻およびBioreversible Carriers in Drug Design、Edward B. Roche編、American Pharmaceutical Association and Pergamon Press、1987によって提供されている。

本発明の化合物の「代謝物」は、代謝の中間体および生成物を意味する。

式(I)の化合物は、非対称性またはキラル中心を含有していてもよく、したがって、様々な立体異性体で存在してもよい。式(I)の化合物の全立体異性体ならびにラセミ混合物を含むそれらの混合物は、本発明の一部を形成するものとする。さらに、本発明は、幾何および位置異性体すべてを包含する。ジアステレオマー混合物は、例えば、クロマトグラフィーおよび/または分別再結晶などの当業者に周知の方法によって、それらの物理化学的な違いに基づいて個々のジアステレオマーに分離することができる。エナンチオマーは、適切な光学活性化合物(例えば、キラルアルコールまたはモッシャー酸塩化物などのキラル補助剤)との反応によって、エナンチオマー混合物をジアステレオマー混合物に変換し、ジアステレオマーを分離し、個々のジアステレオマーを対応する純粋なエナンチオマーに変換(例えば、加水分解)することによって分離することができる。エナンチオマーはまた、キラルHPLCカラムを使用することによって分離することができる。本発明のキラル中心は、IUPAC 1974によって定義されたように、SまたはR配置を有し得る。

用語「塩」、「溶媒和化合物」または「プロドラッグ」などの使用は、本発明の化合物のエナンチオマー、立体異性体、回転異性体、互変異性体、位置異性体、ラセミ体またはプロドラッグの塩、溶媒和化合物およびプロドラッグに同等に適用されるものとする。

本出願で使用したように、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈で特に明確に記載していなければ、複数の参照物を含む。

本明細書で使用したように、用語「含む(comprising)」は、「含む(including)」を意味する。「含む(comprise)」および「含む(comprises)」などの語句「含む(comprising)」の変形は、同様に変化した意味を有する。したがって、例えば、式(I)の化合物を「含む」医薬組成物は、専らその化合物のみから構成される場合もあり、または1種または複数の追加的な成分(例えば、薬学的に許容される担体、賦形剤および/または希釈剤)を含む場合もある。

本明細書で使用したように、用語「複数」は、1つより多くを意味する。ある特定の態様または実施形態では、複数とは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51またはそれ以上、およびそれらから派生する任意の整数およびそれらから派生する任意の範囲を意味してもよい。

「治療有効量」とは、少なくとも1種の式(I)の化合物、またはその代謝物、薬学的に許容される塩、溶媒和化合物もしくはプロドラッグの、ヒト腫瘍細胞系を含むヒト腫瘍細胞の増殖を実質的に阻害し、かつ/または分化を防止する量を意味する。本明細書で使用した用語「治療有効量」には、その意味の範囲で、非毒性であるが所望する治療効果をもたらすのに十分な、本発明で使用するための薬剤または組成物の量が含まれる。必要とされる正確な量は、治療する種、対象の年齢および全身状態、治療する状態の重症度、投与する特定の薬剤、投与形式などの要素に応じて、対象毎に変化する。したがって、全実施形態に適用可能な正確な「有効量」を具体的に述べることはできない。しかし、所与のいかなる場合でも、適切な「有効量」は、通常の実験のみを使用して当業者が決定することが可能である。

詳細な説明
AAD(例えば、式(I))は、有機合成法の一般的な知識を使用して合成することができる化合物の1種である。例えば、AADは、フェノールをクロロアセトンで誘導体化し、ストレッカー反応を行い、得られたアミンをアロイルクロリドでアシル化することによって合成することができる(スキーム1に示した通り)。必要に応じて、その後、特定のエナンチオマーを、例えばキラル分割によって得ることができる(スキーム2に示した通り)。

AADは、以前に薬物耐性線虫の処理に使用されたことがある化学物質の1種である。今までの研究は、線虫においてニコチン性アセチルコリン受容体を標的とするMPLに焦点が当てられてきており、反芻動物における寄生虫の処理のために幅広く使用されてきた。

ラパマイシンまたはFK506結合タンパク質12-ラパマイシン関連タンパク質1(FRAP1)の機構的標的としても知られているmTOR(哺乳類ラパマイシン標的)は、ヒトではFRAP1遺伝子によってコードされるタンパク質である。mTORは、細胞成長、細胞増殖、細胞運動性、細胞生存、タンパク質合成および転写を調節するセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ(特にホスファチジルイノシトール3-キナーゼ-関連キナーゼタンパク質ファミリーに属する)である。mTORは、2分子複合体mTORC1およびmTORC2の触媒サブユニットである。MPLはmTOR経路の妨害においてラパマイシンに類似しているという事実にもかかわらず、ラパマイシンは通常駆虫性はなく、MPLは、公知のmTOR阻害剤とは非常に異なっていることを示している。しかし、ラパマイシンのように、AADは免疫抑制性および抗癌活性の両方を備えている。

TORファミリーのタンパク質は、多面的な機能を有し、アミノ酸およびその他の必須栄養素の細胞内濃度に応答したmRNA転写およびタンパク質翻訳の開始の調節、アクチン細胞骨格の組織化、膜輸送、タンパク質分解、PKCシグナル伝達およびリボソーム生合成に関与する。さらに、mTOR経路は、多くの主要な細胞プロセスを調節し、癌、肥満、2型糖尿病および神経変性を含む増え続ける病態に関わっている。

2つのmTOR経路含有複合体:アクセサリータンパク質Raptor(mTORの調節関連タンパク質)との相互作用によって定義されるラパマイシン感受性複合体(mTORC1);およびRICTOR(mTORのラパマイシン非感受性コンパニオン)との相互作用によって定義されるラパマイシン非感受性複合体(mTORC2)がある。mTORC1は、よく特徴付けられたmTORエフェクターS6キナーゼ1(S6K1、p70S6Kとしても知られている)および真核細胞開始因子4E(elF4E)結合タンパク質1(4EBP1、インスリン1によって調節される熱および酸に安定性のリン酸化されたタンパク質(PHAS1)の遺伝子によってコードされる)をリン酸化する。mTORC2は、アクチン細胞骨格ならびにAKT/PKBを制御する。

mTORは、重要なシグナル伝達経路を調節し、成長刺激と細胞周期進行の結びつけに関与する。成長誘導シグナルに応答して、静止状態の細胞は、そのタンパク質生成物が細胞周期のG1期からの進行に必要なmRNAの一部の翻訳を増加させる。PI3KおよびAKTは、成長因子受容体のライゲーションをmTORのリン酸化および活性化状態に関連づける上流経路の重要な要素である。癌細胞の発生および増殖におけるPI3K/AKT/mTOR経路の役割に関して、PI3K/AKT/mTOR経路の要素は、表面受容体の赤芽球性白血病ウイルス性癌遺伝子相同体(ERB)ファミリー、インスリン様成長因子受容体(IGFR)および癌遺伝子Rasによって活性化されることが示された。インスリン様成長因子1受容体(IGF1R)およびそのリガンド、インスリン成長因子1(IGF1)の過剰発現は、いくつかの癌でよく生じる。さらに、PI3K/AKT/mTOR経路のいくつかの要素は、悪性腫瘍で構成的に活性化されることが示された。PTEN欠損悪性腫瘍においてPI3K/AKT/mTORシグナル伝達要素が過剰に活性化していることは、癌が、成長および持続するためにしばしばこの経路に依存していることを示唆する。

リン酸化の後、mTORは、S6K1および4EBP1を含むmRNAの特定の部分の翻訳を制御する2種類の異なる下流シグナル伝達経路を調整する。PI3Kおよび/またはAKTの活性化、ならびに/またはPTEN抑制因子機能の欠如は、mTORによるS6K1および4EBP1両方のリン酸化を誘導するために必要であり、十分である。したがって、ラパマイシン誘導体は、活性化したPI3KもしくはAKTを発現するか、またはPTENを欠如している細胞において、S6K1および4EBP1のリン酸化をブロックする。mTORがシグナルを伝達するプロセスは、mTORと複合体を形成し、4EBP1およびS6K1の両方にも結合する150kDaの進化的に保存されたタンパク質、Raptorとの相互作用に依存する。Raptor自体はキナーゼではないが、mTOR経路が4EBP1およびS6K1のリン酸化を媒介するために必要である。

4EBP1は、elF4F複合体のmRNAキャップ結合サブユニットであるelF4Eと関係することによって、タンパク質翻訳の開始を抑える小さなタンパク質である。elF4Eのみを過剰発現することは、細胞形質転換を誘導するのに十分である。4EBPのelF4Eへの結合は、4EBP1のリン酸化状態に左右される。

静止状態の細胞における、成長因子が欠乏した条件下でのmTORと翻訳タンパク質との相互作用に関して、リン酸化されていない4EBP1はelF4Eに密接に結合し、タンパク質翻訳の開始を阻害する。ホルモン、成長因子、分裂促進因子、サイトカインおよびGタンパク質結合アゴニストが引き金となる増殖刺激に応答して、4EBP1は、mTORおよびその他のキナーゼの作用によっていくつかのセリン/スレオニン部位でリン酸化されるようになり、4EBP1からelF4Eの解離が促進される。次に、遊離のelF4EがelF4G(大きな足場タンパク質)、elF4A(ATP依存性RNAヘリカーゼ)およびelF4Bに結合することができ、多サブユニットのelF4F複合体を形成し、キャップ依存性タンパク質翻訳を促進する。この事象のカスケードは、c-MYC、サイクリンD1およびオルニチンデカルボキシラーゼをコードするmRNAを含む、5'-非翻訳末端領域(5'-UTR)に調節因子を有するmRNAの翻訳の増加を誘導する。対照的に、成長因子欠乏またはラパマイシンによる処理は、4EBP1の脱リン酸化、elF4E結合の増加、およびそれに伴う細胞周期のG1からS期への移行に必要な5'-UTRを有するmRNAの障害を引き起こす。

mTORが直接、4EBP1のリン酸化および様々な分裂促進刺激によって誘導されるelF4Eの活性化の原因となることを示す多数の実験的な証拠がある。例えば、インスリンで処理した細胞における4EBP1のリン酸化は、mTOR阻害剤によって効果的にブロックされることが示されている。実際に、elF4Eに対する4EBP1の細胞比が低いことは、mTOR阻害剤に対する抵抗性の原因となり得る。さらに、mTORによってリン酸化される4EBP1の部位は、インスリン処理によって誘導される部位と同一であり、mTOR阻害剤への曝露後、迅速に脱リン酸化される。mTORが、タンパク質セリン/スレオニンホスファターゼの阻害剤として間接的にも作用し、条件がG1からS期への移行に適している場合、4EBP1を脱リン酸化する機能を果たすことをいくつかの所見が示している。

MPLは、線虫ではアセチルコリン受容体に結合し、哺乳類細胞では活性を失うことを示すかなりの証拠がある。しかし、前述したように、今では驚くべきことに、MPLが哺乳類細胞のmTOR受容体に選択的に結合することが発見された。

本発明の化合物は、哺乳類細胞において、mTOR受容体に結合することによって選択的mTORキナーゼ阻害剤として作用し、したがって、任意のmTOR経路関連疾患の治療に使用することができる。

ラパマイシンおよびその類似体などの多くの癌用薬物は、触媒部位から離れたドメインを介してmTORに結合するため、mTOR機能の一部だけをブロックする。このような薬物は、治療不成功を招くmTOR経路依存性の生存経路を活性化し得る。

対照的に、本発明の化合物は、ATP(アデノシン三リン酸)と同様の大きさであるため、mTORの触媒部位でATPと競合することができる。本発明の化合物のmTORの触媒部位でのこのような相互作用は、mTORC1およびmTORC2のキナーゼ依存性の機能すべてを阻害し、生存経路が活性する危険性はないと予想される。図8では、MPLは卵巣癌細胞におけるATPレベルを減少させることが示され、このことは、MPLがmTORの触媒部位に結合することを強く示している。

MPLは、mTORの高度に選択的な阻害をもたらすようであり、駆虫薬として使用した場合、その低い毒性のために、動物の場合の忍容性は用量中最高2000mg/kgである。動物モデルにおいて、本発明者らは、MPLの抗癌効果は、5〜50mg/kgの間の驚くほど低用量で認められることを示した。

mTORシグナル伝達は、癌において上方調節されることが多い。MPLと哺乳類mTOR受容体との相互作用は、腫瘍細胞に選択的で、腫瘍成長の阻害を引き起こすことができる(参照により本明細書に組み込まれるオーストラリア仮特許出願第2012901199号およびPCT/AU2013/000290号を参照のこと)。

例えば、本発明者らは、驚くべきことに、MPLおよびMPL-SO₂などの式(I)の化合物が抗癌活性を有することを発見した。より具体的には、MPLおよびMPL-SO₂を含む式(I)の化合物は、癌細胞系の細胞増殖およびコロニー形成を阻害することが示された。例えば、卵巣癌細胞系は、式(I)の化合物に対して非常に感受性であることが示され、その他の細胞系も感受性が高いことが明らかである。それらには、乳癌、中皮腫、前立腺癌および神経膠芽腫細胞系が含まれる。MPLは、化学療法抵抗性、アンドロゲン非感受性のPC-3およびDU145前立腺癌細胞に対して非常に効果的である。同様に、化学療法にも抵抗性の高い、PETおよびYOU細胞(中皮腫)ならびにU87細胞(神経膠芽腫)の複製は、MPLによって著しく抑制される。

本発明者らは、MPLおよびその類似体が以下のmTOR依存性疾患に適用されることを示した:
・mTORシグナル伝達は、アルツハイマー病(AD)の病理といくつかの面で共通点があることから、疾患の進行の誘因として役割を有する可能性が示唆される。全般的に、所見は、ADの脳ではmTORシグナル伝達が機能亢進していることを示している。例えば、ヒトADの脳の死後研究によって、PTEN、Akt、S6KおよびmTORの調節異常が明らかである。
・ハンチントン病のマウスモデルを使用した研究は、ラパマイシンによる治療が、ハンチントン凝集体のクリアランスを促進することを示す。MPLは、同様に、このような凝集体を除去することができ、この状態の新たな治療法となる。
・加齢性疾患
・移植拒絶反応
・慢性炎症性疾患(例えば、関節リウマチ)
・グリコーゲン蓄積疾患
・ある種の癌に選択的
・全身性エリテマトーデス:mTORシグナル伝達はSLEのT細胞で増加し、ラパマイシンによるmTORシグナル伝達の阻害は、ヒトSLEの治療に効果的であることが示された。ラパマイシンで治療されたSLE患者は、基準カルシウムレベルの低下およびTCR刺激後のカルシウム流入の減少を示すが、ミトコンドリア機能の変化は示さず、疾患のこの徴候に対するラパマイシン治療の特異性を示している。
・炎症および免疫活性化
・貧血
・白血球減少症
・血小板減少症
・ステントのコーティング
・腎不全
・肥満
・糖尿病/インスリン抵抗性
・非アルコール性脂肪肝
・多発性嚢胞腎疾患
・パーキンソン病:mTORC1阻害剤ラパマイシンは、L-DOPAの治療有効性に影響を及ぼすことなく、運動異常の発症を防止した。したがって、mTORC1シグナル伝達カスケードは、抗パーキンソン病療法を計画するための標的となる。
・線維症(肝臓、心臓および肺の線維症など)。線維芽細胞のMPL対する感受性、PI3K/mTORとTGFベータの間の関係およびリジル酸化酵素(LOX)発現/活性に対する効果のため、MPLは線維症の治療で使用することができる。心臓LOX発現の増加が、心不全/線維症の患者で認められ、同様に、いくつかの肺および腎疾患/LOX/線維芽細胞で認められる。さらに、線維症は、乳癌および膵臓癌などの数種類の癌において、重要な要因である。

理論に拘束はされないが、本発明の化合物の活性は、mTORの触媒部位に結合することによって作用すると考えられる。

組成物、医薬品およびキット
本発明は、少なくとも1種の式(I)の化合物、または前記化合物の代謝物、薬学的に許容される塩、溶媒和化合物もしくはプロドラッグおよび少なくとも1種の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物、医薬品およびキットを提供する。本発明によって記載された化合物から医薬組成物を調製するために、不活性な、薬学的に許容される担体は、固体または液体のいずれかであってもよい。固形調製物には、散剤、錠剤、分散可能な顆粒剤、カプセル剤、カシェ剤および座剤が含まれる。散剤および錠剤の約5から約95パーセントが、活性成分から構成されていてもよい。適切な固形担体は、当業界では公知であり、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖または乳糖である。錠剤、散剤、カシェ剤およびカプセル剤は、経口投与に適した固形剤形として使用することができる。薬学的に許容される担体の例および様々な組成物の製造方法は、A. Gennaro(編)、Remington's Pharmaceutical Sciences、18版、(1990)、Mack Publishing Co.、Easton、Pennsylvaniaに見いだすことができる。

液状の調製物には、溶液、懸濁液およびエマルジョン、例えば、非経口注射用の水もしくは水-プロピレングリコール溶液または経口溶液、懸濁液およびエマルジョン用に甘味剤および乳白剤を添加したものが含まれる。液状の調製物にはまた、鼻腔内投与用の溶液を含めることができる。

吸入に適したエアロゾル調製物には、不活性圧縮ガス、例えば、窒素などの薬学的に許容される担体と組み合わせることができる溶液および粉末形態の固形物を含めることができる。また、経口または非経口投与のために使用直前に液状の調製物に変換するように企図された固形の調製物も含まれる。このような液体の形態には、溶液、懸濁液およびエマルジョンが含まれる。

本発明の化合物はまた、経皮的に送達することができる。経皮組成物は、クリーム剤、ローション剤、エアロゾルおよび/またはエマルジョンの形態を取ることができ、この目的のために当業界で通常のマトリックスまたはリザーバー型の経皮パッチに含めることができる。

本発明の化合物はまた、皮下に送達することができる。

好ましくは、式(I)の化合物は経口的に投与される。

本発明の組成物および医薬品は、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤および/または希釈剤を含んでいてもよい。担体、希釈剤、賦形剤およびアジュバントは、組成物または医薬品のその他の成分と適合するという点に関して「許容され」なければならず、一般的に、それらのレシピエントにとって有害ではない。薬学的に許容される担体または希釈剤の非限定的な例は、ミネラル除去した、または蒸留した水、生理食塩水、ピーナツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油などの植物をベースにした油、ピーナツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、落花生油またはココナツ油などのゴマ油、メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサンおよびメチルフェニルポリソルポキサン(polysolpoxane)などのポリシロキサンを含むシリコーン油、揮発性シリコーン、流動パラフィン、軟パラフィンまたはスクワランなどの鉱物油、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体、低級アルカノール、例えば、エタノールまたはイソプロパノール、低級アラルカノール、低級ポリアルキレングリコールまたは低級アルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコールまたはグリセリン、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピルまたはオレイン酸エチルなどの脂肪酸エステル、ポリビニルピロリドン、寒天、トラガカントゴムまたはアカシアゴムおよびワセリンである。典型的に、1種または複数の担体は、組成物または医薬品の約10重量%から約99.9重量%を構成する。

本発明の組成物および医薬品は、注射(例えば、皮下、筋肉内または静脈内注射を含む非経口投与用)、経口投与(例えば、カプセル剤、錠剤、カプレットおよびエリキシルなど)、局所投与(例えば、軟膏剤、クリーム剤もしくはローション剤の形態、または点眼剤として送達するために適した形態)、または鼻腔内吸入(例えば、エアロゾルの形態)による投与に適した形態であってもよい。

注射可能な溶液または懸濁液として投与するために、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または担体には、リンゲル溶液、等張生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノールおよび1,2プロピレングリコールを含めることができる。非経口的に投与可能な組成物および医薬品の調製方法は、当業者には明らかであり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science、15版、Mack Publishing Company、Easton、Pa.により詳細に記載されている。

経口投与のために、適切な担体、希釈剤、賦形剤およびアジュバントのいくつかの例としては、ピーナツ油、流動パラフィン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アカシアゴム、トラガカントゴム、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ゼラチンおよびレシチンが挙げられる。さらに、これらの経口配合物は、適切な矯臭剤および着色剤を含有していてもよい。カプセル剤の形態で使用する場合、カプセル剤は、崩壊を遅延させるモノステアリン酸グリセリルまたはステアリン酸グリセリルなどの化合物でコーティングすることができる。アジュバントは、典型的に、軟化剤、乳化剤、増粘剤、保存剤、殺菌剤および緩衝剤を含む。

経口投与用の固形剤形は、ヒトおよび動物の医療行為に許容される結合剤、甘味剤、崩壊剤、希釈剤、矯臭剤、コーティング剤、保存剤、潤沢剤および/または時間遅延剤(time delay agent)を含有していてもよい。適切な結合剤には、アカシアゴム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースまたはポリエチレングリコールが含まれる。適切な甘味剤には、スクロース、乳糖、グルコース、アスパルテームまたはサッカリンが含まれる。適切な崩壊剤には、コーンスターチ、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グアーガム、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸または寒天が含まれる。適切な希釈剤には、乳糖、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウムまたはリン酸二カルシウムが含まれる。適切な矯臭剤には、ペパーミント油、ウィンターグリーンの油、サクランボ、オレンジまたはラズベリーの矯臭剤が含まれる。適切なコーティング剤には、アクリル酸および/またはメタクリル酸および/またはそれらのエステルのポリマーまたはコポリマー、ワックス、脂肪アルコール、ゼイン、シェラックまたはグルテンが含まれる。適切な保存剤には、安息香酸ナトリウム、ビタミンE、アルファ-トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベンまたは亜硫酸水素ナトリウムが含まれる。適切な潤沢剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたはタルクが含まれる。適切な時間遅延剤には、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルが含まれる。

経口投与用の液体剤形は、上記の薬剤に加えて、液体担体を含有することができる。適切な液体担体には、水、オリーブ油、ピーナツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、ベニバナ油、落花生油、ココナツ油などの油、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール、トリグリセリドまたはそれらの混合物が含まれる。

経口投与用の懸濁液はさらに、分散剤および/または懸濁剤を含んでいてもよい。適切な懸濁剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウムまたはアセチルアルコールが含まれる。適切な分散剤には、レシチン、ステアリン酸などの脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、モノもしくはジオレイン酸、ステアリン酸またはラウリン酸ポリオキシエチレンソルビトール、モノもしくはジオレイン酸、ステアリン酸またはラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどが含まれる。

経口投与用の配合物は、1種または複数の乳化剤を含んでいてもよい。適切な乳化剤には、上記で例示したような分散剤またはグアーガム、アカシアゴムまたはトラガカントゴムなどの天然のガムが含まれる。

本発明の局所用配合物は、活性成分と一緒に1種または複数の許容される担体、場合によっては任意のその他の治療成分を含んでいてもよい。局所投与に適した配合物には、リニメント剤、ローション剤、クリーム剤、軟膏剤またはペースト剤などの、皮膚から治療が必要な部位に浸透するために適した液体または半液体調製物および眼、耳または鼻への投与に適した滴剤が含まれる。

本発明による滴剤には、滅菌した水性または油性の溶液または懸濁液を含めることができる。これらは、殺菌剤および/または殺真菌剤および/または任意のその他の適切な保存剤、場合によっては表面活性剤を含む水溶液に活性成分を溶解することによって調製することができる。得られた溶液は、その後、濾過によって清澄にし、適切な容器に移し、滅菌することができる。滅菌は、オートクレーブするか、または90℃〜100℃に30分間維持するか、または濾過して実行してもよく、その後、無菌的技術によって容器に移す。滴剤に含めるために適した殺菌剤および殺真菌剤の例は、硝酸または酢酸フェニル水銀(0.002%)、塩化ベンザルコニウム(0.01%)および酢酸クロルヘキシジン(0.01%)である。油性溶液の調製に適した溶媒には、グリセロール、希釈アルコールおよびプロピレングリコールが含まれる。

本発明によるローション剤には、皮膚または眼への適用に適したものが含まれる。眼用ローション剤は、場合によっては殺菌剤を含有する滅菌水溶液を含んでいてもよく、滴剤の調製に関して前述したものと類似の方法によって調製してもよい。皮膚に適用するためのローション剤またはリニメント剤はまた、アルコールまたはアセトンなどの乾燥を早め、皮膚を冷却するための薬剤および/あるいはグリセロールまたはヒマシ油もしくは落花生油などの油などの保湿剤を含んでいてもよい。

本発明によるクリーム剤、軟膏剤またはペースト剤は、外用のための活性成分の半固形配合物である。それらは、微粉化した、または粉末形態の活性成分を、単独で、または水性もしくは非水性の流体による溶液もしくは懸濁液に、グリース状または非グリース状の基剤と混合することによって作製することができる。基剤には、硬、軟もしくは流動パラフィンなどの炭化水素、グリセロール、ビーズワックス、金属石けん、粘漿剤、アーモンド油、コーン油、落花生油、ヒマシ油もしくはオリーブ油などの天然由来の油、羊毛脂もしくはその誘導体、またはプロピレングリコールもしくはマクロゴールなどのアルコールと一緒にしたステアリン酸もしくはオレイン酸などの脂肪酸を含めることができる。

本発明の組成物および医薬品は、ソルビタンエステルまたはそれらのポリオキシエチレン誘導体などのアニオン、カチオンまたは非イオン性界面活性剤などの任意の適切な界面活性剤を組み込むことができる。天然ゴムなどの懸濁剤、セルロース誘導体またはケイ酸質シリカなどの無機材料およびラノリンなどのその他の成分も含めることができる。

本発明の組成物および医薬品は、リポソームの形態で投与することができる。リポソームを形成するために適切な方法は当業界では公知であり、このことに関して、特に参考となるのはPrescott(編)、(1976)「Methods in Cell Biology」第XIV巻、Academic Press、New York、N.Y.33頁以降である。

アジュバントまたは生物学的応答修飾剤などの補助的な活性成分も、本発明の組成物および医薬品に組み込むことができる。

任意の適切なアジュバントを、本発明の組成物および医薬品に含めることができる。例えば、アルミニウムをベースにしたアジュバントを利用してもよい。適切なアルミニウムをベースにしたアジュバントには、これらに限定されないが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびそれらの組み合わせが含まれる。利用可能なアルミニウムをベースにしたアジュバントのその他の具体例は、欧州特許第1216053号および米国特許第6,372,223号に記載されている。その他の適切なアジュバントには、フロインドの不完全アジュバントおよび完全アジュバント(Difco Laboratories社、Detroit、Mich.);Merckアジュバント65(Merck and Company, Inc.社、Rahway、N.J.); AS-2(SmithKline Beecham社、Philadelphia、Pa.);水酸化アルミニウムゲル(alum)またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩;カルシウム、鉄または亜鉛の塩;アセチル化チロシンの不溶性懸濁液;アシル化糖;陽イオン性または陰イオン性に誘導体化された多糖類;ポリホスファゼン;生分解性小球体;モノホスホリルリピドAおよびクイルA(quil A);欧州特許第0399843号、米国特許第7,029,678号およびPCT公開第WO2007/006939号に記載されたものを含む水中油エマルジョン;および/またはGM-CSFもしくはインターロイキン-2、-7または-12、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)などの追加のサイトカイン、モノホスホリルリピドA(MPL)、コレラ毒素(CT)またはその構成サブユニット、熱に不安定なエンテロトキシン(LT)またはその構成サブユニット、リポ多糖(LPS)およびその誘導体(例えば、モノホスホリルリピドAおよび3-脱アシル化モノホスホリルリピドA)などのtoll様受容体リガンドアジュバント、ムラミルジペプチド(MDP)および呼吸器多核体ウイルス(RSV)のFタンパク質が含まれる。

本発明の別の態様は、少なくとも1種の式(I)の化合物または前記化合物の代謝物、薬学的に許容される塩、溶媒和化合物もしくはプロドラッグの治療有効量および薬学的に許容される担体、媒体または希釈剤を含むキットである。

本発明の別の態様は、少なくとも1種の式(I)の化合物または前記化合物の代謝物、薬学的に許容される塩、溶媒和化合物もしくはプロドラッグのある量および少なくとも1種の抗癌療法薬および/または上記に挙げた抗癌剤のある量を含むキットであって、2種以上の成分の量が所望する治療効果を引き起こすキットである。

本発明のキットは、例えば、投与装置、緩衝液および/または希釈剤などの本発明の方法の実行を支援する構成成分を含んでいてもよい。キットは、様々な構成成分を収容するための容器および本発明の方法においてこのキット構成成分を使用するための指示書を含んでいてもよい。

ある種の実施形態では、キットは組み合わせたキットであり得る。

その他の実施形態では、キットは細分化されたキットであり得る。

投薬量および投与経路
薬剤、組成物および医薬品は、これらに限定されないが、非経口(例えば、静脈内、脊髄内、皮下または筋肉内)、経口、局所または粘膜経路(例えば、鼻腔内)を含む標準的経路によって、レシピエントに投与することができる。いくつかの実施形態では、それらは、単独で、またはその他の追加的治療剤と組み合わせてレシピエントに投与してもよい。このような実施形態では、投与は、同時または逐次的であってもよい。

一般的に、薬剤、組成物および医薬品は、投与経路およびレシピエントの身体的特徴(健康状態を含む)に適合する様式で、所望する効果が誘導されるような方法で(すなわち、治療上有効で、免疫原性を有し、かつ/または防御的に)投与することができる。例えば、適切な投薬量は、これらに限定されないが、対象の身体的特徴(例えば、年齢、体重、性別)、薬剤、組成物または医薬品が単一の薬剤またはアジュバント療法として使用されているかどうか、治療する癌の進行(すなわち、病理状態)および当業者に容易に明らかなその他の要素を含む様々な要素に左右され得る。

薬剤、組成物および医薬品の適切な投薬量を決定するときの様々な一般的考察は、例えば、Gennaroら(編)、(1990)、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.、Easton、Pennsylvania、USA;およびGilmanら(編)、(1990)、「Goodman And Gilmah's:The Pharmacological Bases of Therapeutics」、Pergamon Pressに記載されている。

本発明の驚くべき利点は、式(I)の化合物が全般的に低毒性を表すことである。例えば、MPLは体重1kg当たり2000mgを超えると単回投与毒性を有する。このように、本発明で使用するための薬剤、組成物または医薬品は、体重1kg当たり活性成分を最高2000mg含む量の単回用量として患者に投与することができる。さらに、癌を治療するために、本発明を使用するもう一つの驚くべき利点は、式(I)の化合物の臨床的忍容性が全般的に高いことである。例えば、24時間当たり体重1kg当たり1000mgのMPLの投薬量は、哺乳類において十分に忍容される。このように、本発明で使用するための薬剤、組成物または医薬品は、24時間当たり体重1kg当たり活性成分を最高1000mg含む量で患者に投与することができる。

一般的に、有効な投薬量は、活性成分が24時間当たり体重1kg当たり約0.0001mgから約1000mg、典型的に24時間当たり体重1kg当たり約0.001mgから約750mg、24時間当たり体重1kg当たり約0.01mgから約500mg、24時間当たり体重1kg当たり約0.1mgから約500mg、24時間当たり体重1kg当たり約0.1mgから約250mg、または24時間当たり体重1kg当たり約1.0mgから約250mgの範囲であると予想される。より典型的には、有効な用量の範囲は、24時間当たり体重1kg当たり約1.0mgから約200mg、24時間当たり体重1kg当たり約1.0mgから約100mg、24時間当たり体重1kg当たり約1.0mgから約50mg、24時間当たり体重1kg当たり約1.0mgから約25mg、24時間当たり体重1kg当たり約5.0mgから約50mg、24時間当たり体重1kg当たり約5.0mgから約20mg、または24時間当たり体重1kg当たり約5.0mgから約15mgの範囲であると予想される。

例えば、好ましい投薬量は、式(I)の化合物が24時間当たり体重1kg当たり約10〜100mgであってもよい。さらに、好ましい投薬量は、式(I)の化合物が24時間当たり体重1kg当たり約50mgであってもよい。

典型的に、治療適用において、治療は、癌の持続期間中であってもよい。さらに、最適な量および個々の投薬の間隔は、治療する疾患状態または状態の性質および程度、投与の形態、経路および部位、ならびに治療する特定の対象の性質によって決定できることは当業者には明らかであろう。最適な投薬量は、従来の技術を使用して決定することができる。

多くの場合(例えば、予防的適用)、本発明の薬剤、組成物または医薬品は数回または多数回投与することが望ましい可能性があり、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の回数で投与してもよい。投与は、約1週間から約12週間の間隔であってもよく、ある種の実施形態では、約1週間から約4週間の間隔であってもよい。周期的な再投与も考慮される。

最適な投与計画は、従来の治療計画決定試験を使用して確認することができることも当業者には明らかであろう。

2種類以上の実体(例えば、薬剤または医薬品)を「併用して」対象に投与する場合、単一の組成物で同時に、または別々の組成物で同時に、または別々の組成物で別々の時間に投与することができる。

本発明のある種の実施形態には、多数の別々の用量の薬剤、組成物または医薬品の投与が含まれる。したがって、本明細書で記載した予防的および治療的処置のための方法には、例えば、規定された期間にわたって、対象に対する多数の別々の用量の投与が包含される。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、初回用量の投与を含み、それに続いて追加投与がなされてもよい。追加投与は、再ワクチン接種のためであってもよい。様々な実施形態では、薬剤、組成物または医薬品は、少なくとも1回、2回、3回またはそれ以上投与する。

薬剤、組成物および医薬品は、一般的に、企図する目的を実現するために有効な量で投与することができる。より具体的には、標的となる疾患もしくは状態の発症の防止または既存の症状の軽減のために有効な量を意味する治療有効量で投与することができる。有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、薬剤、組成物および医薬品の治療有効用量は、最初は細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、細胞培養で測定したIC50を含む循環濃度範囲が達成されるように動物モデルで用量を処方してもよい。このような情報は、ヒトおよびその他の哺乳類対象で有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。

治療有効用量とは、治療中の対象の症状の発症を防止し、症状を回復させ、かつ/または生存を延長させる薬剤、組成物または医薬品の量を意味する。薬剤、組成物および医薬品の毒性および治療有効性は、細胞培養および/または実験動物における(例えば、LD50(集団の50%が致死する用量)およびED50(集団の50%において治療的に有効な用量)の測定による)標準的な薬学的アッセイによって測定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は、LD50とED50の間の比として表現することができる治療指数である。高い治療指数を示す薬剤、組成物および医薬品が好ましい。このような細胞培養アッセイおよび/または動物研究から得られたデータを使用して、ヒトまたはその他の哺乳類で使用するための様々な投薬量を配合することができる。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないかまたは全くないED50を含む様々な循環濃度の範囲内である。投薬量は、使用する剤形および利用する投与経路に応じてこの範囲内で変化させることができる。正確な配合、投与経路および投薬量は、対象の状態を考慮して、個々の医師によって難なく選択することができる(例えば、Finglら(1975)、「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、1章1頁参照)。投薬の量および間隔は、所望する治療効果かつ/または最小限有効濃度(MEC)を実現し、維持するために十分な活性剤の血漿レベルを提供するために、個々に調整することができる。MECを実現するために必要な投薬量は、投与経路およびその他の個々の特徴に左右されよう。生物検定法および/またはHPLCアッセイを使用して血漿濃度を測定することができる。

投薬間隔はまた、MEC値を使用して決定することができる。一般的に、薬剤、組成物および医薬品は、期間の約10%〜90%の間、好ましくは30%〜90%の間、より好ましくは約50%〜90%の間、MECを上回る血漿レベルを維持する治療レジメンを使用して投与することができる。局所投与または選択的摂取を利用する実施形態では、薬物の効果的な局所濃度は、血漿濃度と関係がなくてもよい。

本発明の化合物はまた、放射線療法などの1種または複数の抗癌治療法、および/または細胞分裂阻害剤、細胞傷害性薬剤(例えば、これらに限定されないが、DNA相互作用剤(シスプラチンまたはドキソルビシンなど));タキサン(例えば、タキソテール、タキソール);トポイソメラーゼII阻害剤(エトポシドなど);トポイソメラーゼI阻害剤(イリノテカン(もしくはCPT-11)、カンプトスター(camptostar)またはトポテカンなど);チューブリン相互作用剤(パクリタキセル、ドセタキセルまたはエポチロンなど);ホルモン剤(タモキシフェンなど);チミジル酸合成酵素阻害剤(5-フルオロウラシルなど);抗代謝物(メトトレキセートなど);アルキル化剤(テモゾロミド(Schering-Plough Corporation社、Kenilworth、New Jerseyの(TEMODAR(商標)、シクロホスファミドなど);ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤(SARASAR(商標)(4-[2-[4-[(11R)-3,10-ジブロモ-8-クロロ-6,11-ジヒドロ-5H-ベンゾ[5,6]シクロヘプタ[1,2-b]ピリジン-11-イル-]-1-ピペリジニル]-2-オキソエチル]-1-ピペリジンカルボキサミドまたはSchering-Plough Corporation社、Kenilworth、New JerseyのSCH66336など)、ティピファニブ(Janssen Pharmaceuticals社のZamestra(登録商標)またはR115777)、L778.123(Merck & Company社、Whitehouse Station、New Jerseyのファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤)、BMS214662(Bristol-Myers Squibb Pharmaceuticals社、Princeton、New Jerseyのファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤);シグナル伝達阻害剤(イレッサ(Astra Zeneca Pharmaceuticals社製、England)、Tarceva(EGFRキナーゼ阻害剤)、EGFRに対する抗体(例えば、C225)、GLEEVEC(商標)(Novartis Pharmaceuticals社、East Hanover、New JerseyのC-ablキナーゼ阻害剤);例えば、イントロン(Schering-Plough Corporation社製)、ペグイントロン(Schering-Plough Corporation社製)などのインターフェロン;ホルモン療法の組み合わせ;アロマターゼの組み合わせ;ara-C、アドリアマイシン、シトキサンおよびゲムシタビンからなる群から選択される1種または複数の抗癌剤と組み合わせて(一緒に、または逐次的に投与して)有用であり得る。

対象
本発明の予防的および治療的方法は、任意の適切な対象に適用することができる。いくつかの実施形態では、対象は哺乳類対象である。例えば、対象は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマまたは任意のその他の社会的、経済的もしくは研究的に重要な哺乳類であってもよい。したがって、対象は、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳類などの哺乳類であってもよい。

幅広く記載した本発明の精神および範囲を逸脱することなく、特定の実施形態で開示したように、本発明に数多くの変更および/または改変を行うことができることは当業者には理解されよう。したがって、本実施形態は、すべての点で例示であって、制限するものではないと考えるべきである。

ここで特定の実施例を参照ながら本発明を説明するが、これらはどのような形であれ限定と解釈されないものとする。

材料および方法
細胞系
ヒト卵巣癌細胞系OVCAR-3、SKOV-3およびA2780ならびに初代細胞ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)ならびにその他の全細胞系は、アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)から入手し、それらの指示に従って維持した。星状膠細胞および神経膠腫細胞系は、Lowy Cancer Research Centre、University of New South Wales、AustraliaのDr. Kerry McDonaldから恵与された。星状膠細胞および神経膠腫細胞系は、Lowy Cancer Research Centre、University of New South Wales、AustraliaのDr. Kerry McDonaldから恵与された。

細胞増殖アッセイ
細胞増殖は、スルホローダミンB(SRB)アッセイを使用して評価した。96ウェルプレートに接種した細胞(2,000〜3,000細胞/ウェル)をMPL(0、1、5、10、25、50および100μmol/L)で72h処理した。次に、細胞を固定し、洗浄し、1%酢酸に溶解した0.4%(w/v)SRB100μlで染色した。1%酢酸で5回洗浄することによって、結合していない色素を除去してから、空気乾燥した。結合したSRBは、10mMトリス塩基(pH10.5)100μlで可溶化し、570nmでの吸光度を読み取った。全く同じ手法を使用してMPL-SO₂を評価した。両薬剤をエタノールに溶解し、培地で希釈して、細胞培養アッセイに必要な最終濃度を得た。

細胞生存能アッセイ
生存能実験のために、6ウェルプレートに接種した細胞をモネパンテル(MPL)に0、1、10、50および100μMの濃度で24、48または72h曝露した。モネパンテル(Novartis社、Basel、Switzerlandから恵与された)を100%エタノールに溶解し、その後細胞培養培地で希釈した。処理期間の最後に、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、トリパンブルーおよび血球計数計を使用して計数した。実験点はすべて4連で設定して、各実験を少なくとも2回行った。

コロニー形成アッセイ
コロニー形成アッセイのために、OVCAR-3またはA2780細胞などの5×10⁶個の細胞を100mmのペトリ皿に入れ、一晩付着させた。培地を吸引除去し、対数増殖期の細胞を様々な濃度のMPLで72hインキュベートした。この時点で培地を吸引し、皿をPBSで洗浄し、薬物を含まない培地を各皿に添加した。培地を週に2回、3週間交換した。この後、プレートをPBSで丁寧に洗浄し、細胞を100%エタノールで固定し、濾過したクリスタルバイオレットの0.5%溶液で染色した。50個を上回る細胞からなるコロニーを倒立顕微鏡下で計数した。

細胞周期分析
MPLの細胞周期に対する効果は、標準的なフローサイトメトリー分析のプロトコールおよび手法を使用して測定した。簡単に説明すると、0.7×10⁶個の細胞を25cm³フラスコに接種し、一晩付着させ、MPLで24または48h処理した。細胞をトリプシン処理して収集し、培地中に浮遊する細胞と共にプールした。細胞懸濁液を遠心して、PBSで洗浄し、メタノールで固定した。その後、細胞を洗浄し、PBS中のヨウ化プロピジウムおよびリボヌクレアーゼA中に30分間室温で再懸濁し、フローサイトメトリー(Becton Dickinson FACSort)によって分析した。

ウェスタンブロット分析
細胞におけるタンパク質発現は、ウェスタンブロット分析を使用して測定した。指示した濃度のMPLで処理した後、細胞溶解物を調製し、抗体でcdk2、cdk4、サイクリンA、サイクリンE、PARP-1(1:1000希釈;Cell Signalling Technology社)およびp53(1:200希釈;Santa Cruz Biotechnology社)について探索した。ゲル上にタンパク質が比較用にローディングされていることを、GAPDH抗体(1:30000希釈;Sigma-Aldrich社)でブロットを再度探索することによって確認した。

さらなる実験では、指示した濃度のMPLで処理した後、細胞溶解物を調製し、抗体でc-Myc、サイクリンD1、サイクリンE、cdk2、cdk4、IGF-1R(Cell Signalling Technology社)および(Santa Cruz Biotechnology社、Australia)について探索した。ゲル上にタンパク質が比較用にローディングされていることを、GAPDH抗体(Sigma-Aldrich社、Sydney、Australia)でブロットを再度探索することによって確認した。

インビボ実験
雌ヌードマウス(6週齢)は、生物資源部門(Faculty of Medicine、University of New South Wales)から購入した。マウスに実施された全手法は動物実験倫理会によって承認された。簡単に説明すると、2.5×10⁶個の対数増殖期のOVCAR-3細胞を各マウスの左側腹部にs.c.注射した。動物の体重は週に1回測定し、一方、腫瘍体積は週に2回測定した。腫瘍増殖は、ノギスによる直交直径の測定によってモニターし、推定した腫瘍体積は、式1/2(長さ×幅²)(式中、幅は2つの直交測定値の短い方である)に基づいて計算した。動物実験倫理会の承認に基づいて、腫瘍体積が500mm³に達する前にマウスを安楽死させた。マウスを無作為化し、処理群または対照群(群当たり6匹)に割り当てて、処理は腫瘍細胞を注射して8日後に開始した。モネパンテルは、滅菌した0.5%(w/v)ヒドロペルオキシメチルセルロース(HPMC)に懸濁した。薬物は、週3回25または50mg/kgでi.p.投与した。対照群は、滅菌した媒体(0.5%HPMC)で処理した。マウスは、3週間の間処理した。最後の薬物投与の24時間後、マウスを安楽死させ、腫瘍を切除し、分析するまで-80℃で凍結した。

代替実験では、マウスを無作為化し、MPLまたは媒体処理群(群当たりマウス5〜6匹)の1群に割り当てて、処理は腫瘍細胞接種の8日後に開始した。MPLは、ヒドロペルオキシメチルセルロース(0.5%w/vHPMC)に懸濁し、超音波発生装置によって滅菌し、腹腔内(i.p)または胃管栄養法で経口的に(100μL)、1日おきに投与した。最初のパイロット試験では、薬物は2.5または25mg/kg体重で、週3回、2週間i.p.投与した。結果に従って、次の動物群で、用量を25および50mg/kg、週3回に増加した。最後の(3回目)パイロット試験では、マウスを経口的に処理した。投与した用量は、50および100mg/kg、週3回であった。これらのすべての試験では、対照群のマウスには、同様の体積の媒体(0.5%HPMC)を与えた。ホルマリン固定した腫瘍切片に、標準的手順に従って、腫瘍の組織学/免疫組織化学的検査を実施した。

統計学的解析
データをすべて、少なくとも2回の独立した実験による平均±標準誤差(S.E.M.)として報告する。MPL処理群対対照群の間の腫瘍体積の差は、ポストホックダネット検定による一元配置ANOVAを使用して解析した。定量的変数は、スチューデントt検定を使用して比較した。統計学的有意差は、P<0.05で規定された。

結果
MPLは細胞増殖を阻害する
MPLの効果は、OVCAR-3、A2780およびSKOV-3の卵巣癌細胞系の増殖に対して調べた。SRBアッセイを使用することによって、MPLの細胞増殖に対する効果を調べた。MPLは、OVCAR-3、A2780およびSKOV-3細胞の増殖を濃度依存的に阻害し、Table 1(表1)によるとIC50値はそれぞれ、6.3、10.0および29.3であった。これらの結果から、卵巣癌細胞系は、MPLの抗増殖効果に対して感受性であることは明らかである。SKOV-3細胞は、感受性が最も低かった。SRB増殖アッセイを使用して、MPL-SO₂も同様の方法で試験した。MPL-SO₂は、MPLと同等の効力を有していることが見いだされた。MPL-SO₂は、培養で増殖する癌細胞系の生存能を低下させ、細胞増殖を阻害した。MPL-SO₂のIC50値をTable 1(表1)に示す。

MPLの細胞増殖に対する阻害効果はまた、乳房、前立腺および中皮腫細胞などの様々な細胞で試験した。得られた結果をTable 1(表1)に示す。さらなる結果をTable 2(表2)に示す。

Table 3(表3)によると、「MPL-(R)」は、N-[(1R)-1-シアノ-2-(5-シアノ-2-トリフルオロメチル-フェノキシ)-1-メチル-エチル]-4-トリフルオロメチルスルファニル-ベンズアミドを意味し、「MPL-(S)」は、N-[(1S)-1-シアノ-2-(5-シアノ-2-トリフルオロメチル-フェノキシ)-1-メチル-エチル]-4-トリフルオロメチルスルファニル-ベンズアミドを意味する。

Table 3(表3)で示された結果によると、AAD907、1336、1470および2224(MPL-(R))のIC50値の比(正常細胞/癌細胞)は、特に高い活性を示している。さらに、AAD2224(MPL-(R))およびAAD1566(MPL-(S))は、効力が等しいことが見いだされた。(R)-エナンチオマーMPL-(R)は、以前に駆虫活性を有さないことが示されたことがある。

簡単に説明すると、MPLおよびMPL-SO2を非常に様々な疾患の特性を有する多種多様な癌細胞系に対してインビトロで試験した。さらに詳細な研究のために、ヒト卵巣癌細胞系OVCAR-3およびA2780を選択した。さらに、正常ヒト卵巣表面上皮細胞(HOSE)をMPL(0、5、10、25、50および100μM)の存在下で72h培養した。細胞生存能は、トリパンブルーアッセイを使用して評価した(図9)。同様に、MPLの正常上皮、内皮、胚性および胎生細胞の成長に対する効果を調査し(図10)、一方、細胞増殖は、SRBアッセイを使用して評価した(図11)。対照(媒体による処理)細胞が100%増殖を示すと考え、MPL処理群を対照のパーセント±SEMとして表す。各薬物濃度を4連で試験して、各実験を少なくとも2回繰り返した。統計学的比較のために、各薬物処理群をスチューデントt検定を使用して対照群と比較する。濃度依存性薬物効果を調べるために、分散分析(ANOVA)を使用した。P値は:^*=<0.05;^**<0.01および^***=<0.001、^****p<0.0001である。Table 2(表2)で示した結果によって、MPLは癌細胞系では高い抗増殖活性を発揮する一方、正常細胞はほとんど影響を受けないことが明らかである。MPLの効果が、ニコチン性アセチルコリン受容体、特にnACHR7サブタイプによって媒介されるかどうかを明らかにするために、細胞をアンタゴニストで予め処理し、次いでMPLに曝露した(図12)。

MPL-SO2について得られた結果も示す。MPL-SO2は、親薬物MPLと同程度で作用することを確認することができる。IC50値の範囲は非常に近く、MPL-SO2は、癌細胞増殖の抑制においてMPLと同等に効果的であることが示唆される(Table 2(表2))。

MPLはコロニー形成を阻害する
MPLが増殖恒常性およびコロニーを確立する細胞系の能力も妨げるかどうかを調査するために、MPLに曝露した細胞のクローン形成活性を調査した。様々な濃度のMPLに72h曝露した後、細胞を洗浄し、次いで薬物を含まない培地で2週間インキュベートした。MPLは、これらの細胞によるコロニー形成を著しく妨げることが見いだされた。高い濃度のMPLでは、クローン形成能力のほとんど完全な喪失が引き起こされた(図2)。

細胞の完全性に対するMPLの効果ならびに薬物曝露および休薬後の薬物効果を取り除く能力を測定するために、細胞をMPL(0、5、10、25μM)で72hインキュベートし、PBSで洗浄し、寒天プレートに移し、成長培地で培養し、標準的条件下で2週間インキュベートした。次に、細胞を100%メタノールで固定し、1%クリスタルバイオレットで染色した。コロニー(50個を上回る細胞の集団)を顕微鏡下で計数した(倍率5倍)。異なる実験群で計数したコロニーの数を対照のパーセントとして表す(図15)。これらの結果は、MPLによるコロニー形成の濃度依存的阻害を示している。

MPLは、サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼの発現を下方調節することによって細胞周期を停止する
MPLが細胞増殖およびコロニー形成を阻害する機構を調査するために、MPLの細胞周期に対する効果をフローサイトメトリーを用いて調べた。MPLが細胞周期進行を妨害することが見いだされた(図3)。MPLに曝露した細胞の進行は、濃度および時間に依存してG1期で停止した。G1期の細胞の蓄積には、SおよびG2-M期の細胞のパーセントの急低下が付随した。MPL誘導性細胞周期停止に関与する分子機構を研究するために、細胞周期調節タンパク質cdk2、cdk4、サイクリンAおよびEの発現を調べた。MPL処理細胞が発現するcdk2、cdk4、サイクリンAおよびEは低レベルであった(図4)。

MPLは、サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼの発現を下方調節し、PARP-1切断の誘導を引き起こすことによって細胞周期を停止する。
MPLが細胞増殖およびコロニー形成を阻害する機構を見いだすために、MPLの細胞周期に対する効果をフローサイトメトリー(FACS)を用いて調べた。MPLが細胞周期進行を妨害することが見いだされた(図22)。MPLに曝露した細胞では、細胞周期は、濃度および時間に依存してG1期で停止した。G1期の細胞の蓄積には、SおよびG2-M期の細胞のパーセントの急低下が付随した。MPL誘導性細胞周期停止に関与する分子機構を研究するために、細胞周期調節タンパク質cdk2、cdk4、サイクリンAおよびEの発現を調べた。MPL処理細胞が発現するcdk2、cdk4、サイクリンEおよびサイクリンAは低レベルであった(図4および図16)。

MPLはPARP-1切断を誘導する
MPL誘導性細胞死がPARPの切断に関与するかどうかを調査するために、MPL処理細胞の溶解物のPARP-1および切断PARP-1のウェスタンブロット分析を実施した。PARP-1の切断は、DNAの修正によって誘導される生存を防止することによって、アポトーシスを促進する。PARPは、細胞が生存能を維持するのを助け、したがって、PARPの切断は、細胞の解体を容易にし、アポトーシスを受ける細胞のマーカーとして役立つ。図5は、PARPは、MPL処理細胞において切断されたことを示している。

MPLはPARP切断を誘導する
PARP切断の強い誘導が、細胞死を表すことを示すMPL処理OVCAR-3およびA2780細胞から調製した細胞溶解物のウェスタンブロット分析(図18)。

MPLは細胞のATPレベルを低下させる
図19Aおよび図19Bに示したように、OVCAR-3またはA2780細胞のMPLによる処理は、細胞において見いだされるATPレベルの低下の原因となる。

MPLは自己貪食を誘導する
図6は、細胞のMPLによる処理が、液胞の形成を引き起こすことを示しており、MPLがこれらの細胞において自己貪食を誘導し得ることを示唆している。図7は、MPL処理が細胞自己貪食のもう1つの指標であるADP/ATPの細胞比を低下させることを示している。

MPLは、ヌードマウスにおけるs.c.異種移植片成長の速度を抑制する
図20〜図22は、ヌードマウスにおける、MPLのインビボ試験を示している。OVCAR-3腫瘍を有するマウスを最初にi.p.で、または最後の実験のように経口的に処理した。得られた結果から、投与した用量、特に50mg/kg用量(i.p.および経口の両方)では、これらの動物の腫瘍成長を顕著に遅らせる活性が明らかである。腫瘍の組織学から、腫瘍細胞死の広範な領域が明らかになった(図23)。

コロニー形成の抑制と相俟った細胞増殖の阻害およびインビボにおける結果は、MPLの成長調節効果を示している。MPL妨害は、細胞周期調節タンパク質AおよびE2と共にそれらのキナーゼcdk2およびcdk4の発現低下による細胞周期進行で示される。正常細胞では、1つの期から別の期への移行は、様々なタンパク質によって良好に調節されて規則正しく生じる。サイクリン依存性キナーゼ(CDK)は、細胞周期の特定の点で活性化され、したがって、細胞周期進行において重要な役割を担う鍵となる調節タンパク質である。これらには、周期の様々な期で、様々なサイクリンが必要である。サイクリンA、DおよびEは、細胞周期のG1およびG1からS期への移行に必要である。今まで同定された様々なCDKの中で、CDK2およびCDK4は、G1への進入およびG1-S移行に必須であると考えられる。サイクリンAおよびEはCDK2に結合し、一方、サイクリンDはCDK4およびCDK6に結合する。癌は、細胞周期関連現象と考えられるいくつかの疾患の1つである。

図20〜図22に示した結果は、雌ヌードマウスでのs.c.腫瘍増殖の抑制におけるMPL活性を示している。最初の試験で、i.p.MPL投与の用量依存活性が明らかになった。25mg/kgの用量は特に効果的であった。これをベースにして、次の試験は、以前と同じ条件下で、25および50mg/kgの用量を使用して実施した。50mg/kgの用量は、これらの動物において腫瘍増殖を遅らせるのにより効果的であった。抗寄生虫剤として、MPLはいくつかの動物モデルにおいて経口的に効果的であることが示されたことがある。MPLの50および100mg/kg用量の経口治療活性を試験した。3回のパイロット試験すべてにおいて、MPLは0.5%HPMC中で調製し、懸濁液として投与した。これらのインビボ試験において、腫瘍組織を調べることによって、MPL処理腫瘍における広範囲の壊死領域が明らかになった(図23)。

Table 1(表1)およびTable 2(表2)に示したように、観察された効果は卵巣癌に限定されず、MPLは神経膠腫、前立腺、乳房、中皮腫、脂肪肉腫、線維肉腫を含む様々な癌を示す多様な細胞系において、インビトロで細胞増殖を効果的に抑制する(Table 1(表1)およびTable 2(表2)参照)。

別の重要な所見は、化学療法抵抗性細胞系に対するMPLの活性である。卵巣の化学療法抵抗性細胞、神経膠腫のテモゾロミド抵抗性細胞および乳癌のタモキシフェン抵抗性細胞はすべて、MPL抗増殖作用に感受性であった。

結論として、結果は、癌細胞系において、MPLおよび可能性のあるその代謝物および類似体(AAD)は:
1- 細胞増殖を阻害する;
2- MPL誘導性阻害は、ニコチン性アゴニストまたはアンタゴニストで予め処理することによって正負いずれにも影響を受けず、作用様式はニコチン受容体媒介性ではないことを示す;
2- コロニー形成を阻害する;
3- 細胞周期[G1期]を停止する;
4- 細胞周期調節タンパク質(CdK2、CdK4、サイクリンA、サイクリンE)を下方調節する;
5- 細胞へのチミジン取り込みをブロックし、したがってDNA合成を阻害する;
6- 細胞のATPレベルを低下させる;
7- LC3B-IのLC3B-IIへの変換によって確認されるように、進行性の自己貪食を引き起こす;
8- 自己貪食は、卵巣癌細胞系および神経膠腫癌細胞系の両方において顕微鏡的に明らかであった;
9- MPLはまた、PARP-1の切断、したがって細胞死を誘導する;
10- これは、s.c.腫瘍を有するヌードマウスにおいて、腫瘍の用量依存的抑制を示すインビボにおけるデータによって確認される;
11- i.p.および経口の両方の投与経路が効果的であったことを示す。
さらに、MPLは、いくつかの標準的化学療法に対して抵抗性の細胞の増殖を阻害する。

mTORおよび自己貪食
本出願の別の態様は、癌および神経変性疾患における自己貪食の役割である。神経変性の原因となる異常に迅速なアポトーシスを起こす神経細胞において、自己貪食は、加速した細胞死から神経細胞を防御するための機構として役立つ。

自己貪食、または細胞自己消化は、タンパク質および細胞内小器官分解に関与する細胞経路であり、ヒトの疾患および生理機能に驚くほど多く関わっている。例えば、自己貪食機能障害は、癌、神経変性、微生物感染および加齢に関係する。逆説的に、自己貪食は主として細胞の保護プロセスであるが、癌細胞における細胞死においても役割を担うことができる。

mTORは、自己貪食の主要な負の調節軸である。mTORの直接的な阻害剤およびmTORを活性化する経路の阻害剤は、その後自己貪食を誘導する。mTORキナーゼは、成長因子および栄養素レベルに応答して、細胞成長および自己貪食を調節する。mTORの阻害は自己貪食の原因となる。自己貪食は、神経変性を引き起こす損傷から細胞を保護する。

細胞内小器官および長寿命のタンパク質の主要な分解経路である自己貪食は、神経細胞の生存に必須である。次々と出てくる証拠は、いくつかの主要な神経変性疾患、特にアルツハイマー病(AD)の病理において、自己貪食が不全であることを意味している。研究の考察から見いだされたことは、自己貪食は疾患の初期段階で変化し、自己貪食の機能障害が、ADの病理過程において重要な役割を担う可能性があることを示唆している。

自己貪食は、神経変性を導く損傷から細胞を防御する。
神経変性疾患におけるmTOR/自己貪食
アルツハイマー病
Abetaおよびtauの蓄積は、アルツハイマー病に特徴的な進行性の認知障害の直接的な原因となるか、または寄与すると考えられている。mTORは、Abetaおよびtau誘導性神経変性において役割を担う可能性があることが示された。

mTOR経路は、タンパク質の恒常性の制御、したがって神経機能において中心的な役割を担う。実際に、mTORシグナル伝達は、様々な形態の学習および記憶を調節する。ラパマイシンは、自己貪食を増加させることによって、認知障害を救済し、AbetaおよびTau病理を回復させる。同様に、いくつかのmTORシグナル伝達成分は、ADの臨床診断において、認知障害の可能性のあるバイオマーカーとなり得る。したがって、自己貪食-リソソームタンパク質分解を制御することよって、mTOR関連薬剤(MPLなど)は、ADの重要な治療剤となることが予測される。

ハンチントン病
ハンチントン病は、ポリグルタミン鎖伸長によって引き起こされる9種類の遺伝性神経変性障害の1つである。伸長したポリグルタミンタンパク質は、細胞内の凝集体中に異常に蓄積する。mTORは、細胞モデル、トランスジェニックマウスおよびヒト脳において、ポリグルタミン凝集体に隔離されることが示されている。mTORの隔離は、そのキナーゼ活性を弱め、突然変異ハンチンチン断片の重要なクリアランス経路である自己貪食を誘導する。これによってポリグルタミン毒性から防御し、特異的mTOR阻害剤ラパマイシンはハンチントン病の細胞モデルにおいてハンチンチン蓄積および細胞死を減衰させるので、自己貪食の阻害は逆の効果を有する。

mTORはまた、炎症、免疫抑制および神経変性疾患に関与する。

MPLの炎症経路NF-κBおよびその下流標的に対する活性
転写因子NF-κBはそもそも、いくつかのメディエータおよびサイトカインがこの転写因子の活性化の原因となっているので、炎症媒介応答にとって興味深い。さらに、NF-κB転写ファミリーの活性化は、炎症誘発性遺伝子の転写を誘導するその能力によって、炎症において中心的な役割を担う。NF-κBの活性化と炎症の間の関係は、様々なヒト疾患および疾患の動物モデルにおいて示された。さらに、炎症の媒介におけるNF-κBの役割は、遺伝的アプローチを使用してまたは化学的阻害剤を用いて確立された。

NF-κBは、細胞基質中に、阻害性タンパク質IκBαに結合した不活性型として存在している。適切な細胞外シグナルIκBαにより刺激されると、IκBαはIKKによりリン酸化され、プロテアソーム媒介による分解が生じる。次に、NF-κBの活性複合体が遊離し、核に移動して、その標的遺伝子の転写を媒介する。IKK複合体は、リポ多糖(LPS)、IL-1β、腫瘍壊死因子(TNF)-αおよびTGF-βなどの多岐にわたる刺激に応答して、自己リン酸化または一連の分裂促進因子活性化キナーゼ(MAP3K)によるリン酸化のいずれかによって活性化される。

図27から図32は、NF-κBシグナル伝達経路に対するMPLの影響を示している。LPSによって刺激したRAW264.7細胞マクロファージを、炎症のインビトロモデル系として使用した。

免疫細胞化学およびウェスタンブロット分析によって評価すると、MPLはこれらの細胞におけるNF-κB活性化を減少させることが認められた。この効果は、NF-κBp65のリン酸化および核移動の阻害ならびにIKKおよびIκB-αのリン酸化の阻害によっても確認することができた。MPLの阻害効果は、いずれもNF-κBによって調節される炎症メディエータであるIL-6、TGF-βおよび一酸化窒素(NO)の発現に対しても認められた。

結果によって、MPLは細胞機構を阻害し、これは炎症の軽減に重要で、MPLは癌に関係のない重要な病理経路に影響を及ぼしていることが示される。

結果によって、MPLは細胞機構を阻害し、これは炎症に対する応答に重要で、MPLは癌に関係のない重要な病理経路に影響を及ぼしていることが明らかに示される。

考察
哺乳類ラパマイシン標的であるmTORは、ラパマイシンの標的としてFKBP12、Tor1およびTor2を同定したサッカロマイセス・セレビシエ(saccharomyces cerevisiae)のラパマイシン抵抗性突然変異体の遺伝的および分子的研究によってTORが最初に発見され、FKBP12-ラパマイシン複合体がTor1およびTor2に結合し、それらの細胞機能を阻害することを強く支持する先例に基づいて命名された。

ラパマイシンは、細胞周期のG1期で真菌の活性を停止させた。ラットでは、ラパマイシンはTリンパ球のG1からS期への移行をブロックすることによって免疫系を抑制する。ヒトでは、臓器移植後の免疫抑制剤として使用される。mTORは、インスリン、成長因子(IGF-IおよびIGF-2など)およびアミノ酸を含む上流経路からの入力を統合する。mTORはまた、細胞栄養素、酸素およびエネルギーレベルを探知する。mTOR経路は、糖尿病、肥満、鬱病およびある種の癌などのヒト疾患では調節異常の状態である。ラパマイシンは、細胞内受容体FKBP12との関係によってmTORを阻害することができる細菌生成物である。FKBP12-ラパマイシン複合体は、mTORのFKBP12-ラパマイシン結合(FRB)ドメインに直接結合し、その活性を阻害する。

mTOR経路は、癌を含む多くの疾患において重要な要素として同定されてきたが、ラパマイシンは90年代に市場に出されたにもかかわらず、今までラパマイシンのみが幅広く臨床に使用されており、新たなmTOR製品の臨床使用は限定的である。同様に、ラパマイシンにはmTOR経路を妨害する能力があるにもかかわらず、未だに臓器拒絶反応の治療のために唯一有用である。本発明は、ラパマイシンに対するmTOR経路の様々な成分を標的とするmTOR阻害剤の新たな種類を同定し、それによっていくつかの主要な疾患の治療の選択肢の幅を広げる。

Table 1(表1)に示したように、MPLはまた、HUVECで試験した。IC50値はOVCAR-3におけるIC50値より約10倍高いことが見いだされ、非癌細胞よりも癌細胞に対するMPLの細胞傷害性効力が高いことを反映している。

コロニー形成アッセイでは、MPLは寒天プレートで増殖している卵巣癌細胞系によるコロニーの形成を濃度依存的に抑制し、したがって、癌細胞の増殖を阻害するMPLの有効性がさらに示される。

さらに、[OVCAR-3(突然変異)、SKOV-3(ヌル)およびA2780(野生型)]細胞のp53状態にかかわらず、MPLはその抗癌効果を発揮することが示された(様々な効力ではあるが)。このことは、MPLは腫瘍のp53状態にかかわらず、上皮卵巣癌に効果的であることを示唆する。この発見は、p53突然変異は多種多様な癌において非常によく見られるので、重要であり得る。

MPLによって示された効果は、卵巣癌に加えてその他の種類の癌にも応用が可能であることが理解されよう。

哺乳類の細胞周期は、Cdkの逐次的な活性化によって統御されている。G1期からS期に進入する進行は、サイクリンAおよびサイクリンEと共に複合体化したCdk2によって調節される。したがって、これらの調節タンパク質の発現を抑制すると、細胞周期進行が中断する。

細胞増殖およびコロニー形成の阻害は、MPLに対して濃度依存的である。MPLが細胞周期進行を中断する可能性のある機構は、細胞周期調節タンパク質EおよびAならびにサイクリン依存性キナーゼCdk4およびCdk2の下方調節であり、G1停止の原因となる。G1停止の結果として、SおよびG2-M期における細胞が時間と共に激減することによって示されるように、細胞は周期の次の段階に進行しない。媒体処理群のG2-M期の細胞のパーセントは、MPL25μMで処理した群の細胞よりも3倍以上高かった。

さらに、MPLで処理した癌細胞系の自己貪食の証拠は、G0期での細胞周期停止によって、細胞が不可逆的に細胞周期から逸脱していることを強く示唆する。

さらなる考察
証拠が積み重なることによって、mTORは細胞の異化および同化の「マスタースイッチ」として作用し、細胞が膨張し、成長し、かつ増殖するために細胞にシグナルを送るという仮説が支持される。mTORは実質的にすべての哺乳類細胞において見いだされるが、増殖し、侵襲的に侵入する腫瘍細胞において特に重要である。

細胞のシグナル伝達経路を標的とする治療は、固形腫瘍および造血悪性腫瘍の管理において有望であることが示された。mTORは、ホスファチジルイノシトール3キナーゼ(PI3K)の活性化の下流で作用する重要なキナーゼであることが示された。

mTORを特異的に阻害する薬剤は、見込みのある抗腫瘍薬として現在開発されている。

mTOR阻害剤は、G1期停止を誘導することによって本質的に細胞周期進行を妨げる。ラパマイシンは、mTOR阻害剤の原型である。

mTORの生物学的特徴は、様々な癌におけるmTORの役割を知る手がかりとなる。活性のあるmTORは、細胞周期調節因子に対するその効果によって直接的に、栄養素輸送体の産生およびまた血管新生の促進によって細胞への栄養素の供給を持続することによって間接的に、細胞成長における応答を秩序立てる。mTORが細胞増殖に対してその調節効果を発揮する主な方法は、サイクリンD1の産生を制御することによる。mTORは、異常な細胞成長および増殖を持続するために、適切な栄養素の補給を行う。mTOR経路がいくつかの癌で調節解除されているならば、mTOR阻害剤は、広い抗癌治療効果を発揮することが予想される。

代替分子マーカーを使用して、ラパマイシン誘導体などのmTOR阻害剤の生物学的効果をモニターし、患者における生物学的に活性のある用量を絞り込むことができる。これらには、サイクリンD1、サイクリンEの発現、P70S6Kのリン酸化またはカスパーゼ3およびc-Mycの発現を含めることができる。サイクリンD1は、腫瘍細胞においてその遺伝子増幅およびタンパク質の過剰発現が頻繁に認められる原腫性癌遺伝子である。サイクリンD1は、細胞周期のG1からSへの進行を誘導する。

MPLは、細胞周期進行をG1期で停止させることが示された。本発明によると、MPLで処理された腫瘍を有するマウスがサイクリンD1の劇的な下方調節を示すデータが示される。さらに、mTORシグナル伝達経路および細胞周期進行のもう1つの重要な中間体であるサイクリンEの腫瘍発現はまた、MPLで処理された腫瘍では抑制される。G1サイクリンとして知られるサイクリンDおよびEは、それぞれCDK4およびCDK2に結合し、G1からS期への移行を促進する。卵巣癌細胞におけるサイクリンD1の欠如は、G1細胞周期停止の誘導に十分であり、この戦略は、サイクリンE2の存在によって邪魔されない。サイクリンD1は、卵巣癌細胞における十分な治療標的であることも示唆された。c-Mycは、サイクリンD1に結合し、サイクリンE-Cdk2の活性化の大きさを低下させるサイクリン依存性キナーゼ4および6を含む細胞周期に多数の時点で影響を与えることはよく立証されている。

原腫性癌遺伝子c-MYCの発現調節解除は、広範なヒト癌において生じ、予後の悪さと関係することが多く、腫瘍の進行においてこの癌遺伝子が細胞増殖、成長およびアポトーシスを調節する転写因子を通じて重要な役割を果たすことを示している。調節異常のc-Mycの発現または機能は、ヒトの悪性腫瘍における最も一般的な異常の1つである。本発明では、MPLは細胞周期移行(G1からS)のこれらのメディエータ、すなわちサイクリンD1およびc-Mycの両方に作用することが明らかである。

mTORキナーゼは、アミノ酸および成長因子に応答して、p70リボソーム性S6キナーゼ(p70S6K)の活性化およびelF-4E結合タンパク質(4E-BP1)の阻害を介して、翻訳の仕組みを制御する。

mTORの重要な下流エフェクターとして、S6Kは、細胞成長および代謝を媒介するタンパク質の転写および翻訳を含むいくつかの細胞プロセスに関与する。このことに基づいて、mTOR-S6Kは、特定のシグナル(成長因子、栄養素およびホルモン)を細胞応答に翻訳する重要な軸となる。mTORによるp70のリン酸化はまた、リボソーム生合成に必須である。

図9から図11で示された結果は、MPLが誘導するmTOR活性化の阻害がp-mTOR、c-Myc[癌遺伝子]、サイクリンD1、サイクリンE2、サイクリン依存性キナーゼ2および4[細胞周期進行に必須である]およびp-P70S6Kの下方調節を引き起こすことを示す。

要約すると、本発明は、MPLがmTOR経路を介して自己貪食を引き起こし、血管新生および自己貪食を調節することが知られているmTORシグナル伝達経路の下流部分であるp-P70S6K(Thr389)を特に阻害することを示している。

本発明はまた、細胞周期進行に必要で、多くの重大な癌において過剰発現しているサイクリンD1をMPLが阻害することを示している。P70S6K下方調節がリン酸化、したがってサイクリンD1の活性を阻害することがその他によって示されたことは、本発明の発見に合致する。P70S6Kはまた、転移および浸潤に重要なPDCD4、接着斑キナーゼ、Eカドヘリン、Bカテニンおよび組織トランスグルトミネート(transglutominate)2を調節する。

本発明によるMPL/自己貪食効果は、MPLおよび類似のAADが、脳卒中、神経変性疾患、α1アンチトリプシン欠乏症、リソソーム蓄積症、心筋症、免疫異常および自己免疫疾患、細菌およびウイルス感染、寄生虫、脂質障害などの自己貪食が不十分な疾患の治療ならびに加齢にさえも有用であることを示す。さらに、例として、アルツハイマー病、ハンチントン病、加齢性疾患、移植拒絶反応に関連する疾患、慢性炎症性疾患、グリコーゲン蓄積に関連する疾患、転移、全身性エリテマトーデス、炎症および免疫活性化に関連する疾患、貧血、白血球減少症、血小板減少症、ステントのコーティングに関連する疾患、腎不全、肥満、糖尿病/インスリン抵抗性、非アルコール性脂肪肝に関連する疾患、多発性嚢胞腎疾患、パーキンソン病および線維症が挙げられる。

本発明は、MPLが自己貪食(mTOR経路を介して)を引き起こし、したがって、これは、癌以外に有用な療法であり得ることを明らかに示している。

Claims

1種または複数のmTOR経路関連疾患の治療に使用するための、
式(I):
(式中、R¹は-CNであり、
R²およびR³およびR⁵はそれぞれ独立してH、アルキル、ハロゲン、-CF₃または-CNから選択され、
R⁴およびR⁶はそれぞれ独立してH、アルキル、ハロゲン、アルコキシ、-CF₃、-OCF₃、-SO₂CF₃、-SOCF₃または-SCF₃から選択され、
Xはヘテロ原子、N−アルキルまたはNHであり、
nは1から20である)
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物を含む組成物であって、
1種または複数のmTOR経路関連疾患が、神経変性疾患、加齢性疾患、移植拒絶反応に関連する疾患、慢性炎症性疾患、グリコーゲン蓄積に関連する疾患、全身性エリテマトーデス、炎症および免疫活性化に関連する疾患、貧血、白血球減少症、血小板減少症、腎不全、肥満、糖尿病/インスリン抵抗性、非アルコール性脂肪肝に関連する疾患、多発性嚢胞腎疾患、および線維症から選択される、組成物。

R²がHまたはハロゲンであり、
R³が-CF₃またはハロゲンであり、
R⁴が-SCF₃、-SOCF₃、-SO₂CF₃、-OCF₃または-CF₃であり、
R⁵がHであり、
R⁶がアルキルであり、
XがOであり、
nが1から5である、請求項1に記載の組成物。

R⁴がアミド部分に対してパラ位である、請求項1または2に記載の組成物。

式(I)の化合物が、(R)-もしくは(S)-エナンチオマーまたはラセミ体である、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物。

式(I)の化合物が、(S)-エナンチオマーである、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。

式(I)の化合物が、以下の化合物:
またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物のいずれか1つから選択され、前記化合物のそれぞれが、(R)-もしくは(S)-エナンチオマーまたはラセミ体である、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。

式(I)の化合物が、以下の化合物:
またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物である、請求項1に記載の組成物。

式(I)の化合物が、MPL(N-[(1S)-1-シアノ-2-(5-シアノ-2-トリフルオロメチル-フェノキシ)-1-メチル-エチル]-4-トリフルオロメチルスルファニル-ベンズアミド):
またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和化合物である、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。

1種または複数のmTOR経路関連疾患が、慢性炎症性疾患である、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。

慢性炎症性疾患が、関節リウマチまたは移植後の臓器拒絶反応である、請求項9に記載の組成物。

線維症が、肝線維症、心臓線維症または肺線維症である、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。

神経変性疾患が、アルツハイマー病、ハンチントン病またはパーキンソン病である、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。

神経変性疾患がパーキンソン病である、請求項12に記載の組成物。

神経変性疾患がハンチントン病である、請求項12に記載の組成物。

神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項12に記載の組成物。