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JP6124261B2 - 活性調節剤、これを含有する医薬品、および抗ＣＤ３００ａ抗体 - Google Patents

活性調節剤、これを含有する医薬品、および抗ＣＤ３００ａ抗体 Download PDF

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Description

本発明は、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制または亢進するための活性調節剤、これを含有する医薬品、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用および抗ＣＤ３００ａ抗体に関する。
宿主（人体または動物体内）に病原体（細菌、ウイルス、寄生虫等）が侵入したり、内因性の起炎物質が発生したりすると、病原体の侵入部位または起炎物質の発生部位にて細動脈が一時的に収縮した後、拡張・充血に至って、病原体の侵入部位または起炎物質の発生部位の血流が局所的に緩慢になるといった炎症反応が発生する。
すると、白血球が血管壁に膠着し、さらに各種免疫系細胞から放出されるケミカルメディエーターの作用により、アメーバ様運動により血管壁を通過して遊走する。ケミカルメディエーターとしては、ヒスタミン、セロトニン、リンホカイン等が知られている。ヒスタミンやセロトニンを産生・放出するマスト細胞は、炎症反応において中心的な役割を果たしているリンパ球の一つである。また、マクロファージもマスト細胞と同様にＴＮＦ等のケミカルメディエーターを産生・放出する。
炎症反応によって、遊走させられた白血球が病原体等に誘引されると、病原体に抗原抗体反応を伴う体液性免疫や細胞障害性Ｔ細胞等が関与する細胞性免疫によって、病原体が体内から除去され（クリアランス）、感染拡大が防止される。このように、炎症反応およびそれに基づく免疫反応は、生体の恒常性を維持するためには極めて重要である。
一方で、炎症反応は、上述のような生体防御とともに、発赤、発熱、腫張、疼痛、機能障害といった不具合な徴候・症状を示してしまう。このような症状として、具体的には、アレルギー疾患、各種急性または慢性炎症が挙げられる。また、免疫学的寛容が適用されず、自己に対して免疫応等が生じてしまう自己免疫疾患が発生した場合も、炎症反応によって組織傷害が発生してしまう。
すなわち、炎症反応を伴う疾患を予防するには、炎症反応を惹起させる病原体を各種抗生物質（抗菌剤）によって死滅させることや、生体内の免疫機能を向上させる薬剤（免疫賦活剤）を投与して、炎症反応が過剰に亢進する前に、病原体を除去することが重要である。
一方、炎症反応を伴う疾患を改善・治療するには、たとえば、ケミカルメディエーターの放出を抑制するような、過剰に活性化した免疫機能を低下させる薬剤（抗炎症剤（免疫抑制剤））を投与して、炎症の鎮静化を図ることが知られている。
たとえば、特許文献１には、免疫活性剤として、抗原提示細胞として各種免疫系細胞の活性化を担う樹状細胞の機能賦活化剤が開示され、具体的には、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とすることを特徴とするものである。
特許文献２には、抗炎症剤（免疫抑制剤）として、ＳＰＡＲＣ（Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒоｔｅｉｎ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎ）ペプチドおよび薬理学的担体を含む薬剤が開示されている。
また、以下のような自己免疫疾患、アレルギー疾患などが知られている。
セリアック病またはシリアック病（Ｃｏｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅとも綴る）とは、小麦や大麦、ライ麦などに含まれるタンパク質の一種であるグルテンに対する免疫反応が引き金になって起こる自己免疫疾患であり、進行性の腸炎である。この病気は、英国、ヨーロッパ、米国において３００人に一人以上に罹患する。
２個のタンパク質、グリアジン及びグルテニンの混合物であるグルテンは、小麦、大麦、及びライ麦において見られる。グルテンは小腸と反応して、栄養及びビタミンを吸収するために必要である繊細な小腸上皮を攻撃する免疫システムを活性化することにより、損傷を引き起こす。
セリアック病の患者がグルテンを含有する食物などを摂取すると、ヒトの消化酵素では分解できない小麦に含まれる植物性タンパクのグルテンの一分画であるグリアジン由来ペプチドが、十二指腸粘膜下組織内でＴＧ２により脱アミノ化され、抗原となり、自己抗体が産生されることが原因となっている。
セリアック病は、ＨＬＡ−ＤＱＡ１およびＨＬＡ−ＤＱＢ１によりコードされるＨＬＡ−ＤＱ２（個体の約９０％を占める）、ＨＬＡ−ＤＱ２の変異体、またはＨＬＡ−ＤＱ８のいずれかを保有する遺伝的に感受性な個体において発症する。
かかる個体は、小麦粉の非水溶性タンパク質、グルテン、ならびにライムギおよびオオムギ中の関連タンパク質から誘導されるペプチドに対して、不適切なＨＬＡ−ＤＱ２および／またはＤＱ８に限定されたＣＤ４＋Ｔ細胞に媒介される免疫応答を惹起する。
この際の免疫反応がきっかけとなり、自己の免疫系が小腸の上皮組織を攻撃して炎症を起こすことで絨毛などを損傷し、また上皮細胞そのものの破壊にまで至る。この結果、小腸から栄養を吸収出来なくなり、食事の量などに関らず栄養失調の状態に陥る。
炎症性腸疾患の代表的な疾患である潰瘍性大腸炎（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ：ＩＢＤ）は、主として消化管に原因不明の炎症をおこす慢性疾患の総称であり、大腸に炎症が起こり潰瘍を形成する慢性疾患である。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、病因が未知である２つの胃腸障害（クローン病（ＣＤ）および潰瘍性結腸炎（ＵＣ））を記載するために使用される、集合的な用語である。
クローン病は、潰瘍性大腸炎に比べて病変部が広く、消化管のほぼ全域に炎症や潰瘍を生じる。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、世界的に発生し、そして２００万人もの多くの人々に罹患したことが報告されており、ＩＢＤの経過および予後は、広範に変動する。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、症状の良し悪しが変化しながら長期に渡って下痢、血便が続く。原因はまだ解明されておらず、有力な説としては、腸管免疫寛容の障害のために、食物や腸内細菌に対して免疫反応が起き、持続的な腸炎が起きると考えられている。
現在、根本的な治療法はなく、食事療法、下痢止め薬（抗コリン作用薬、ロペラミド又はジフェノキシレート等）又は抗炎症薬（アミノサルチル酸、スルファサラジン、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、プレドニゾロンなどのステロイド薬又はアミノサルチル酸等）、免疫抑制薬（アザチオプリン、メルカプトプリン、シクロスポリン等）の使用などが行われている。
ＩＢＤ罹病者全体の１０％〜１５％が１０年間にわたり外科手術を必要とし、腸癌の発症の危険性も高い。
クローン病では、細菌が、疾患の開始および進行に関与しており、クローン病における腸炎症は、その頻繁な抗生物質に対する応答性および細菌糞便流に対する感受性で有名である。一般的な腸内微生物および新規の病原体が、直接的な検出によってか、または疾患に関連した抗微生物免疫応答によって、クローン病に関連付けられている。
さらに、慢性結腸炎の遺伝学的に感受性の多くのモデルにおいて、管腔微生物は、疾患に必須の補助因子であり、微生物のいない環境に閉じ込められた動物は、結腸炎を発症しない。
遺伝的因子、外因性の誘因、および内因性の微生物叢の組合せが、炎症性腸疾患において見られる腸粘膜への免疫媒介性損傷に寄与し得る。
免疫細胞の表面に存在する受容体タンパク質をコードするＦＣＧＲ２Ａ遺伝子、塩素イオンおよび炭酸水素イオンのトランスポーターをコードするｓ８ＬＣ２６Ａ３、機能が未知の１３ｑ１２領域の遺伝子の３つの遺伝子領域で多型を持つ人が、潰瘍性大腸炎の発症と関連することも知られている（非特許文献３）。
しかし、クローン病における腸内微生物の役割についての多くの直接的証拠および間接的証拠にも関わらず、この疾患において見られる免疫調節不全に寄与する病原性生物および抗原は、同定されておらず、炎症性腸疾患（クローン病や炎症性腸炎）の病態解明に有用なツールや、治療等するための医薬品が望まれていた。
アトピー性皮膚炎は、アレルギー物質(抗原)が体内に入り、活性化した免疫細胞から分泌された物質（インターロイキン４，１３）が刺激となって作られたペリオスチンが、皮膚の角化細胞表面にある別のタンパク質「インテグリン」と結合することで炎症を起こすことが原因となっている。
ペリオスチンがインテグリンと結合することによって新たな炎症誘発性物質が産生され、抗原がなくても症状が継続して慢性化する。マウスを使った実験で、ペリオスチンとインテグリンの結合を阻害剤により阻害すると、アトピー性皮膚炎は起きないことが示されている（非特許文献４）。
アトピー性皮膚炎の主たる病因が明らかになったものの、アトピー性皮膚炎の病態のさらなる解明および他の炎症疾患との関連性の解析、上記阻害剤と併用可能なアトピー性皮膚炎用の医薬品等も望まれている。
一方、気管支喘息（Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ Ａｓｔｈｍａ）とはアレルギー反応や細菌・ウイルス感染などが発端となった気管支の炎症が慢性化することで気道過敏性の亢進、可逆性の気道狭窄をおこし、発作的な喘鳴、咳などの症状をきたす呼吸器疾患である。また、気管支喘息は、気道過敏性、アレルギー体質、環境の組合せでおこるとされている。ぜん鳴、無呼吸、胸部緊張および咳などの再発性の症状の発現の形で、特に夜または早朝に現れる。
多くの細胞および細胞成分、特に肥満細胞、好酸球、Ｔリンパ球、マクロファージ、好中球および上皮細胞は、気道の炎症に役割を演じている。炎症は、血漿の滲出、浮腫、平滑筋肥大、粘液填塞(mucus plugging)および上皮変化と関連している。また、炎症は、種々の刺激に対して存在する気管支過応答の関連する増大を引き起こす。
気道の炎症は、気道平滑筋の萎縮、微小血管の破裂および気管支過応答を導く。気道の反応性が高いと、症状はより重く、持続的になり、肺機能の日中の変動の規模がより大きくなる。気道の炎症が気管支の反応性に関連しているメカニズムは不明であり、喘息の病態解明に有用なツールや、医薬品等が望まれていた。
ところで、自然免疫系を担当するミエロイド系（骨髄系）細胞の細胞膜上には、ＭＡＩＲ（Myeloid Associated Ig like Receptors）と称されるレセプター分子群が発現していることが知られている（非特許文献１）。このうち、ＣＤ３００ａとしても知られている（その他「ＬＭＩＲ１」、「ＣＬＭ−８」と称されることもある）ＭＡＩＲ−Ｉは、マクロファージ、肥満細胞、顆粒球（好中球）、樹状細胞に発現しており、細胞内領域のＩＴＩＭ（Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif）配列を介して脱リン酸化酵素と会合し、抑制性シグナルを伝達する抑制性レセプターであることが知られている（非特許文献２）。しかしながら、当該受容体のリガンドは不明であり、いわゆるオーファンレセプターとなっていた。
特開２００７−２９７３７９号公報 特開２０１１−５１６６０９号公報
Yotsumoto et al.. J Exp Med 198 (2), 223-233, 2003 Okoshi Y et al, Int Immunol., 17, 65-72, 2005. Asano. K et al. Nature Genetics 41. 1325-1329(2009) Miho Masuoka et. al J Clin Invest. 2012; doi:10.1172/JC158978
本発明は、ＣＤ３００ａの抑制性シグナル伝達を介した自然免疫応答の活性化制御機構を解明し、当該抑制性シグナル伝達に関係するＣＤ３００ａ発現細胞の活性を調節するための手段、さらに当該活性が関与する疾病または病状を治療または予防するための手段、あるいはそれらの関連技術などを提供することを目的とする。
本発明者は、ＣＤ３００ａのリガンドおよびＣＤ３００ａの機能を解明すべく鋭意研究を重ねた結果、以下に示されるような知見を得た。
（ｉ）ＣＤ３００ａのリガンドは、ホスファチジルセリン（フォスファチジルセリン、ホスホファチジルセリン）（ＰＳ）である。
（ｉｉ）ＰＳがマスト細胞等のＣＤ３００ａへ結合すると、ＣＤ３００ａの抑制性シグナル伝達が亢進し、マスト細胞等の活性化も抑制される。
（ｉｉｉ）ホスファチジルセリン結合性物質またはＣＤ３００ａ結合性物質が共存することにより、マスト細胞等のＣＤ３００ａとＰＳとの結合が阻害されると、ＣＤ３００ａの抑制性シグナル伝達が抑制され、マスト細胞等の活性化も維持される。
（ｉｖ）上記の活性化の抑制または維持を通じて、炎症性感染症、アレルギー疾患、自己免疫疾患などを治療できる。
（ｖ）ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、アレルギー疾患、自己免疫疾などの病態解析や医薬品の有効成分のスクリーニングなどを行うためのツールとなり得る。
これらの知見に基づいてなされた本発明により、たとえば、下記［１］〜［２２］に示される活性調節剤、医薬品、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用、抗ＣＤ３００ａ抗体などが提供される。
［１］ ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質を含有することを特徴とする、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するための活性調節剤。
［２］ 前記ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質がホスファチジルセリン結合性物質である、［１］に記載の活性調節剤。
［３］ 前記ホスファチジルセリン結合性物質が、ＭＦＧ−Ｅ８、ＭＦＧ−Ｅ８変異体、Ｔ細胞免疫グロブリン、可溶型ＴＩＭ−１、可溶型ＴＩＭ−４、可溶型スタビリンおよび可溶型インテグリンαｖβ３からなる群から選択される少なくとも１種類である、［２］に記載の活性調節剤。
［４］ 前記ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質がＣＤ３００ａ結合性物質である、［１］に記載の活性調節剤。
［５］ 前記ＣＤ３００ａ結合性物質が、配列番号１９で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号２０で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗ヒトＣＤ３００ａ抗体である、［４］に記載の活性調節剤。
［６］ 前記ＣＤ３００ａ結合性物質が、配列番号１７で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号１８で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗マウスＣＤ３００ａ抗体である、［４］に記載の活性調節剤。
［７］ ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を亢進する物質を含有することを特徴とする、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進するための活性調節剤。
［８］ 前記ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を亢進する物質がホスファチジルセリンである、［７］に記載の活性調節剤。
［９］ ［１］〜［８］のいずれかに記載の活性調節剤を含有することを特徴とする、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達が関与する疾病または病状を、治療または予防するための医薬品。
［１０］ 前記ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達が関与する疾病または病状が、炎症性感染症、アレルギー疾患または自己免疫疾患である、［９］に記載の医薬品。
［１１］ ［１］〜［６］のいずれかに記載の活性調節剤を含有し、腹膜炎またはそれに起因する敗血症を治療または予防するための、［１０］に記載の医薬品。
［１２］ ［１］〜［６］のいずれかに記載の活性調節剤を含有し、炎症性腸疾患を治療するための、請求項１０に記載の医薬品。
［１３］ ［７］または［８］に記載の活性調節剤を含有し、セリアック病を治療するための、［１０］に記載の医薬品。
［１４］ ［１］〜［６］のいずれかに記載の活性調節剤を含有し、アトピー性皮膚炎を治療するための、［１０］に記載の医薬品。
［１５］ ［１］〜［６］のいずれかに記載の活性調節剤を含有し、喘息を治療するための、［１０］に記載の医薬品。
［１６］ アレルギー疾患または自己免疫疾患ついて、病態解析を行うための、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングするための、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用。
［１７］ 前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを、炎症性腸疾患を誘導させる物質を投与したときに炎症性腸疾患を誘発しにくいモデルマウスとして使用する、［１６］に記載の使用。
［１８］ 前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを、セリアック病を誘導する物質を投与したときにセリアック病を発症するモデルマウスとして使用する、［１６］に記載の使用。
［１９］ セリアック病を発症した前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに、セリアック病の治療薬の候補物質を投与して治療効果の有無を確認する工程、またはセリアック病を発症する前の前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに、前記セリアック病を誘導する物質と共にセリアック病の予防薬の候補物質を投与して予防効果の有無を確認する工程を含む、［１６］に記載の使用。
［２０］ 前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを、アトピー性皮膚炎を誘導する物質を投与したときにアトピー性皮膚炎を発症しにくいモデルマウスとして使用する、［１６］の使用。
［２１］ 前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを、喘息を誘導する物質を投与したときに喘息を発症しにくいモデルマウスとして使用する、［１６］の使用。
［２２］ 配列番号１９で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号２０で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗ヒトＣＤ３００ａ抗体。
［２３］ 配列番号１７で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号１８で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗マウスＣＤ３００ａ抗体。
また、上記発明の別の側面として、次の発明が提供される。
上記［１］に係る発明の別の側面として、ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害することを特徴とする、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制する方法が提供される。当該方法は、生体内（in vivo）、生体外（ex vivo, in vitro）を問わずに適用可能であり、また生体内で適用される場合、その生物種は、ヒトであるか、ヒト以外であるか（たとえばマウス等の哺乳類）であるかを問わない。
上記［１］に係る発明のさらなる側面として、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するための活性調節剤の製造における、ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質の使用が提供される。
当該方法または使用を実施するためのＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質として、上記［２］に記載されたホスファチジルセリン結合性物質、好ましくは上記［３］に記載されたＭＦＧ−Ｅ８等を用いることができる。同じく前記方法を実施するためのＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質として、上記［４］に記載されたＣＤ３００ａ結合性物質、好ましくは上記［５］に記載された所定のアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域を有する抗ヒトＣＤ３００ａ抗体や、上記［６］に記載された所定のアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域を有する抗マウスＣＤ３００ａ抗体を用いることができる。
上記［７］に係る発明の別の側面として、ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を亢進することを特徴とする、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進する方法が提供される。当該方法は、生体内（in vivo）、生体外（ex vivo, in vitro）を問わずに適用可能であり、また生体内で適用される場合、その生物種は、ヒトであるか、ヒト以外であるか（たとえばマウス等の哺乳類）であるかを問わない。
上記［７］に係る発明のさらなる側面として、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進するための活性調節剤の製造における、ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を亢進する物質の使用が提供される。
当該方法または使用を実施するためのＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を亢進する物質として、上記［８］に記載されたホスファチジルセリンを用いることができる。
上記［９］に係る発明の別の側面として、ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害または亢進し、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制または亢進することを特徴とする、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達が関与する疾病または病状を治療または予防する方法が提供される。当該方法は、生体内（in vivo）、生体外（ex vivo, in vitro）を問わずに適用可能であり、また生体内で適用される場合、その生物種は、ヒトであるか、ヒト以外であるか（たとえばマウス等の哺乳類）であるかを問わない。
上記［９］に係る発明のさらなる側面として、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達が関与する疾病または病状を治療または予防するための医薬品の製造における、ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害または亢進し、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制または亢進する活性調節剤の使用が提供される。
当該方法または使用における疾病または病状として、上記［１０］に記載された炎症性感染症、アレルギー疾患または自己免疫疾患が挙げられ、その具体例として、上記［１１］〜［１５］に記載された、腹膜炎またはそれに起因する敗血症、炎症性腸疾患、セリアック病、アトピー性皮膚炎、喘息が挙げられる。
上記［１６］に係る発明の別の側面として、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを使用することにより、アレルギー疾患または自己免疫疾患ついて、病態解析を行うための、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングする方法が提供される。当該方法に用いられるＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、上記［１７］、［１８］、［２０］および［２１］に記載された、炎症性腸疾患、セリアック病、アトピー性皮膚炎または喘息を誘導する物質を投与したときに、それぞれのアレルギー疾患または自己免疫疾患を発症するモデルマウスとなる。当該方法は特に、上記［１９］に記載された所定の工程を含む、セリアック病に関する方法とすることが好ましい。
本発明により、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制または亢進することのできる活性調節剤を調製することができ、さらに当該活性調節剤を有効成分として含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達が関与する疾病または病状を治療または予防するための医薬品を製造することができる。また、本発明により、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスのモデルマウス等としての使用や、中和作用に優れた抗ＣＤ３００ａ抗体の製造も可能となる。
図１は、実施例１Ａで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。 図２Ａは、実施例１Ｂで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。 図２Ｂは、実施例１Ｂで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。 図２Ｃは、実施例１Ｃで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。 図２Ｄは、実施例１Ｄで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。 図２Ｅは、実施例１Ｄで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。 図２Ｆは、実施例１Ｅで得られたイムノブロット分析の結果を示す。 図３Ａは、野生型アレル中のＣＤ３００a遺伝子の構造、ＣＤ３００a欠損マウスを作成するために使用したターゲティングベクター、および標的化アレルを示すための模式図である。 図３Ｂは、野生型アレルおよび変異型アレルのＰＣＲ産物を示す電気泳動写真である。 図３Ｃは、野生型マウスおよびＣＤ３００a欠損マウスを用いたウェスタンブロット分析の結果を示す。 図３Ｄは、ＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスのフローサイトメトリー分析結果を示す。 図４Ａは、実施例２Ａで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。 図４Ｂは、実施例２Ｃで得られた光学顕微鏡の分析結果を示す。 図４Ｃは、実施例２Ｃで得られたレーザー走査型共焦点顕微鏡の分析結果を示す。 図４Ｄは、実施例２Ｃで得られた、胸腺細胞を細胞質内に取り込んだＮＩＨ３Ｔ３または各形質転換体における細胞数の比率を示す結果を示す。 図５Ａは、実施例２Ｂで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。 図５Ｂは、実施例２Ｂで得られたＲＴ−ＰＣＲの分析の結果を示す。 図６Ａは、実施例３Ａで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。 図６Ｂは、実施例２Ａで得られたβ―ヘキサミニダーゼアッセイの分析結果を示す。 図７Ａは、実施例３Ｂで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。 図７Ｂは、実施例３Ｃで得られた、各種サイトカインおよびケモカインの放出量の増加率の結果を示す。 図７Ｃは、実施例３Ｅで得られた、各種サイトカインおよびケモカインの放出量の増加率の結果を示す図である。 図７Ｄは、実施例３Ｆで得られた、イムノブロッティング分析の結果を示す。 図７Ｅは、実施例３Ｇで得られた、イムノブロッティング分析の結果を示す図である。 図７Ｆは、実施例３Ｇで得られた、ＴＮＦ−αの増加率を示す図である。 図８は、実施例３Ｄで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。 図９Ａは、実施例４Ｂで得られたデンシトメトリー分析の結果を示す。 図９Ｂは、実施例４Ｂで得られたデンシトメトリー分析の結果を示す。 図１０Ａは、実施例４Ｃで得られた抗気性細菌のＣＦＵの算出結果を示す図である。 図１０Ｂは、ＣＤ３００ａ好中球の誘導後、実施例４Ｃで得られた好中球およびマクロファージの細胞数を示す図である。 図１１は、実施例４Ｃで得られた、大腸菌を貪食した各マクロファージの細胞数の比率を示す図である。 図１２Ａは、実施例４Ｄで得られたフローサイトメトリー分析を示す図である。 図１２Ｂは、実施例４Ｄで得られた各マウスの生存率を示す図である。 図１２Ｃは、実施例４Ｄで各マウスの腸内の細菌クリアランスを細菌のＣＦＵで示した図である。 図１２Ｄは、実施例４Ｅで得られたフローサイトメトリー分析の結果等を示す図である。 図１２Ｅは、実施例４ＦでＴＸ４１を投与した後の各マウスの生存率を示す図である。 図１２Ｆは、実施例４Ｇで、ＴＸ４１を投与した後の腸内のクリアランスを示す図である。 図１２Ｇは、実施例４Ｇで、ＴＸ４１を投与した後の好中球の細胞数の変化を分析した結果を示す図である。 図１３Ａは、オボアルブミンで誘導喘息のプロトコールを示した図である。 図１３Ｂは、実施例５Ａについて、喘息誘導開始から25日目の各マウスの肺胞洗浄液中の総細胞数を示す。 図１３Ｃは、実施例５Ｂについて、喘息誘導開始から25日目の各マウスの肺胞洗浄液中の好酸球の割合を示す。 図１４は、実施例５Ｂについて、喘息誘導開始から１４日目の各マウスの血清ＩｇＥ値を示す。 図１５は、ＤＳＳ誘導の腸炎による各マウスの体重の経時変化を示す図である（実施例６Ａ）。 図１６Ａは、ＤＳＳ投与開始後６日目の各マウスの大腸の長さを示すグラフである（実施例６Ｂ）。 図１６Ｂは、図１６ＡのＷＴマウスとＣＤ３００ａ-/-の大腸の切片を示す図である（実施例６Ｃ）。 図１７は、ＤＳＳ投与６日目の各マウスの細胞障害の度合を臨床スコアで比較した図である（実施例６Ｄ）。 図１８Ａは、ＤＳＳ投与９日目の各マウスの大腸における各サイトカインの量を示した図である（実施例６Ｅ）。 図１８Ｂは、ＤＳＳ投与開始後、０日、２日、４日および６日の各マウスの各免疫細胞数を示す図である（実施例６Ｆ）。 図１９は、ＣＤ３００ａを発現している樹状細胞を特定するために行ったフローサイトメトリーの結果を示す図である（実施例６Ｇ）。 図２０は、各マウスの大腸におけるサイトカインの相対的な遺伝子発現量を示す図である（実施例６Ｈ）。 図２１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞における各サイトカインの相対的な遺伝子発現量を示す図である（実施例６Ｉ）。 図２２は、ＯＶＡ感作をした各マウスの３０分毎の擦過行動数の経時変化（日別）を示す図である（実施例７Ａ）。 図２３は、ＯＶＡ感作後、第３週末時点の各マウスの皮膚の切片を示す（実施例７Ｂ）。 図２４は、ＯＶＡ感作後、第３週末時点の各マウスの皮膚サンプルについてトルイジンブルー染色した結果を示す図である（実施例７Ｃ）。 図２５Ａは、ＯＶＡ感作後、第３週末時点の各マウスの表皮内の細胞層数を示すグラフである（実施例７Ｄ）。 図２５Ｂは、ＯＶＡ感作後、第３週末時点の各マウスの各皮膚サンプルについて真皮内に浸潤した好酸球数とマスト細胞数を示す（実施例７Ｅ）。 図２６は、ＯＶＡ感作後、第３週末時点の各マウスの各皮膚サンプルについてランゲリン免疫染色した結果を示す（実施例７Ｆ）。 図２７は、図２６の各サンプルのカウンター染色を示す。 図２８は、マスト細胞とランゲリン陽性皮膚細胞との相互作用している状態を示した図である（実施例７Ｈ）。 図２９は、ＴＸ４１による治療の効果を確認する試験のスケジュールを示す図である。 図３０は、ＴＸ７４またはＴＸ４１投与後の各ＷＴマウスについて、ＥＬＩＳＡ法により測定した血清総ＩｇＥ濃度を示す。 図３１は、ＴＸ７４またはＴＸ４１投与後の各ＷＴマウスについて、擦過行動数を示した図である。 図３２は、ＴＸ７４またはＴＸ４１投与後の各ＷＴマウスの皮膚切片について、Ｈ＆Ｅ染色を行った結果を示す図である。 図３３は、ＴＸ７４またはＴＸ４１投与後の各ＷＴマウスの皮膚切片について、トルイジンブルー染色でカウンター染色をした状態を示す図である。 図３４は、正常食または高グルテン食の給餌開始からモニターした体重（ＢＷ）の経時変化を示す図である。 図３５は、正常食または高グルテン食を摂食開始後、２０週目の各マウスの腸の病理組織学的解析の結果を示す写真である。 図３６は、正常食または高グルテン食を摂食開始後、20週の各マウスについての臨床スコアを示す図である。 図３７は、正常食または高グルテン食を摂食開始後、20週の各マウスについて、腸上皮細胞１００個あたりの上皮内リンパ球数を示す図である。 図３８は、正常食または高グルテン食を摂食開始後、20週間の各マウスの空腸の懸濁液中のトランスグルタミナーゼ2の量（TG2）を示す図である。 図３９は、ＣＤ４５＋ＰＩ−細胞集団でゲートされた粘膜固有層の細胞のＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃの発現をフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。 図４０は、正常食と高グルテン食で飼育したＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの空腸の粘膜固有層における各免疫細胞の頻度を示す図である。 図４１は、各マウスの粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージにおける各種サイトカインやケモカインの遺伝子発現量を示す図である。 図４２は、各免疫細胞におけるＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）の発現について、フローサイトメトリーで解析した結果を示す図である。 図４３は、各マウスの粘膜固有層（ＬＰ）のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞におけるサイトカインやケモカインの相対的な遺伝子発現量を示す図である。 図４４は、組換えマウスＭＦＧ−Ｅ８タンパク質の添加によるグリアジン誘発性のサイトカイン発現量の変化を示す図である。 図４５は、正常食または高グルテン食を与えているＢａｌｂ／ｃのＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおける大腸の病理組織学的解析の結果を示す図である。 図４６は、Ｂａｌｂ／ｃのＷＴまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の血清について、抗グリアジンＩｇＧおよびＩｇＡ抗体力価を示す図である。 図４７は、無グルテン食を与えられたＷＴマウスおよびＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおける体重変化率の経時変化（週別）を示す図である。 図４８は、ＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層（ＬＰ）における通常の状態でのＣＤ１１ｂ＋樹状細胞およびマクロファージのサイトカイン発現量を示す図である。 図４９は、グリアジンペプチドＰ３１−４３で刺激した後のチオグリコール酸誘発性腹腔滲出細胞のマクロファージにおけるサイトカイン発現量を示す図である。 図５０は、粘膜固有層のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞におけるＩＬ−６, ＩＬ−１５, ＴＮＦ−α，ＩＦＮ−β，ＭＣＰ１および ＭＣＰ５の遺伝子発現量を示す図である。 図５１は、グリアジン刺激後のＢ６のＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージにおけるＩＬ−６，ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βの発現量を示す図である。 図５２は、微生物叢を枯渇させたＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージ（グリアジンで刺激したもの）におけるサイトカインやケモカイン発現を示す図である。 図５３は、単離された粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージのホスファチジルセリン発現細胞の頻度を示す図である。 図５４は、ＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージにおけるαｖとβ３の各インテグリンサブユニットとの遺伝子発現量を示す図である。 図５５は、ホスファチジルセリン受容体（ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、Ｓｔａｂｉｌｎ−２、ＳＲ−ＰＳＯＸ、ＢＡＩ１とＭｅｒ）の遺伝子発現量を示す図である。 図５６は、ＴＸ４１とＴＸ４９のＨ鎖とＬ鎖とをそれぞれ相同性解析を行った結果である。
本発明に係る活性調節剤、これを含有する医薬品、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用、抗ＣＤ３００ａ抗体について、以下詳細に説明する。免疫機構およびＣＤ３００ａ等に関する従来の知見や公知の試験方法に言及する際に用いる文献を実施例の末尾に列挙した。
［活性調節剤］
本発明に係る活性調節剤は、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を、抑制するためのものと、亢進するためのものを包含する。
ここで、「ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞」には、マスト細胞（肥満細胞）、マクロファージ、好中球、樹状細胞などが含まれる。ＣＤ３００ａは、ヒト、マウス、その他の哺乳類に発現しているものを総称しており、生物種は特に限定されるものではない。
また、「抑制性シグナル伝達」とは、抑制性レセプターであるＣＤ３００ａが、細胞内領域のＩＴＩＭ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ）配列を介して脱リン酸化酵素と会合することにより生じるシグナル伝達である。
以下の説明において、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するための活性調節剤は、結果的に免疫機能を賦活化する作用を有する場合があるので、本発明において「免疫賦活化剤」と称することがある（たとえば、炎症性感染症に対する医薬品の有効成分として用いる場合）。一方、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進するための活性調節剤は、結果的に免疫機能を抑制する作用を有する場合があるので、本発明において「免疫抑制剤」と称することがある（たとえば、セリアック病に対する医薬品の有効成分として用いる場合）。
＜第１の活性調節剤＞
本発明による第１の活性調節剤は、ＣＤ３００ａを介した抑制性シグナル伝達を抑制する作用を有する成分を含有する。本発明ではそのような成分として、ホスファチジルセリンとＣＤ３００ａとの結合を阻害する物質、すなわちホスファチジルセリン結合性物質およびＣＤ３００ａ結合性物質を用いることができる。第１の活性調節剤は、これらの何れか一方を含んでいてもよいし、これら両方を含んでいてもよい。
（ホスファチジルセリン結合性物質）
第１の活性調節剤の一つであるホスファチジルセリン結合性物質は、ＣＤ３００ａのリガンドであるホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合して、ホスファチジルセリンとミエロイド系細胞に発現したＣＤ３００ａとの相互作用（結合）を阻害するものである限り特に限定されない。
ホスファチジルセリン結合性物質の具体例としては、ＭＦＧ−Ｅ８（Ｍｉｌｋ Ｆａｔ Ｇｌｏｂｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＧＦ−８）、Ｔ細胞免疫グロブリンや、可溶型ＴＩＭ−１、可溶型ＴＩＭ−４、可溶型スタビリンおよび可溶型インテグリンαｖβ３などの可溶型蛋白質が挙げられ、中でもＭＦＧ−Ｅ８が好ましい。
また、ホスファチジルセリン結合性蛋白質としては、ＭＦＧ−Ｅ８などのようなネイティブの蛋白質に限定されず、ホスファチジルセリンへの結合性を喪失しない限り、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するもの（変異体）であってもよい（たとえば、実施例における「Ｄ８９Ｅ ＭＦＧ−Ｅ８」等）。
これらの変異体は、部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）やランダム突然変異法などの公知の方法によって作製される。
また、上記「可溶型蛋白質」とは、膜蛋白質など、後述するような希釈剤や体液に対して不溶性である、ネイティブの蛋白質において、公知の遺伝子組み換えの技術によって、疎水性ドメインを削除したり、親水性のペプチドを付加したりして、希釈剤や体液に対して可溶性になるように改変した蛋白質を指す。
（ＣＤ３００ａ結合性物質）
第１の活性調節剤の一つであるＣＤ３００ａ結合性物質は、ＣＤ３００ａに結合して、ミエロイド系細胞に発現したＣＤ３００ａとホスファチジルセリンとの相互作用（結合）を阻害するものである限り特に限定されない。
ＣＤ３００ａ結合性物質の具体例としては、ＣＤ３００ａに対する中和抗体が挙げられる。中和抗体は、特定の一種類のモノクローナル抗体であってもよいし、二種類以上のモノクローナル抗体の組み合わせ（ないしポリクローナル抗体）であってもよい。また、中和抗体は、完全長の抗体であってもよいし、断片化された抗体（Ｆａｂ断片もしくはＦ（ａｂ'）2等）であってもよい。
中和抗体は、公知の手法によって作製することができる。モノクローナル抗体であれば、一般的には、ＣＤ３００ａを用いた免疫、ハイブリドーマの作製、スクリーニング、培養、回収といった手順で、抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体を作製することができる。それらの中から、好ましいＣＤ３００ａとホスファチジルセリンとの結合阻害能（中和作用）を有し、本発明の作用効果を奏する適切なモノクローナル抗体を選択すればよい。
（ＴＸ４１、ＴＸ４９およびこれらに類する抗体）
ＴＸ４１は抗マウスＣＤ３００ａモノクローナル抗体（ラットＩｇＧ２ａ）であり、ＴＸ４９は抗ヒトＣＤ３００ａモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ１）である。どちらも後記実施例において作成、使用されたモノクローナル抗体であり、ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンとの結合を阻害してシグナル伝達を抑制する機能に優れているため、本発明におけるＣＤ３００ａ結合性物質として好ましい。ただし、本発明に用いることのできる抗ＣＤ３００ａ抗体は、ＴＸ４１、ＴＸ４９およびこれらに類する（同等のアミノ酸配列からなる可変領域を有する）抗体に限定されるものではない。
ＴＸ４１のＨ鎖の可変領域は配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有し、ＴＸ４１のＬ鎖の可変領域は配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有し、ＴＸ４９のＨ鎖の可変領域は配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有し、ＴＸ４９のＬ鎖の可変領域は配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有する。なお、これらの可変領域には、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域が含まれる。ＴＸ４１およびＴＸ４９の可変領域（Ｈ鎖およびＬ鎖それぞれ）のアミノ酸配列同士の相同性を解析した結果を図５６に示す。
マウスのＣＤ３００ａに対する結合性物質としては、ＴＸ４１に基づいて、Ｈ鎖の可変領域が配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなり、Ｌ鎖の可変領域が配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる抗体を用いることが好ましい。
ヒトのＣＤ３００ａに対する結合性物質としては、ＴＸ４９に基づいて、Ｈ鎖の可変領域が配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなり、Ｌ鎖の可変領域として配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなる抗体を用いることが好ましい。
また、マウスのＣＤ３００ａに対する結合性物質としては、Ｈ鎖の可変領域が配列番号１７で表されるアミノ酸配列に対し１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなる抗体、またはＬ鎖の可変領域が配列番号１８で表されるアミノ酸配列に対し１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなる抗体を用いることもできる（Ｈ鎖およびＬ鎖の一方が上記の変異を有するものであってもよいし、それらの両方が上記の変異を有するものであってもよい）。
ヒトのＣＤ３００ａに対する結合性物質としては、Ｈ鎖の可変領域が配列番号１９で表されるアミノ酸配列に対し１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなる抗体、またはＬ鎖の可変領域が配列番号２０で表されるアミノ酸配列に対し１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなる抗体を用いることもできる（Ｈ鎖およびＬ鎖の一方が上記の変異を有するものであってもよいし、それらの両方が上記の変異を有するものであってもよい）。
このような変異を生じさせる部位は、可変領域のうちＣＤＲまたはその近傍の部位を避けることが好ましい。また、アミノ酸を置換する場合は、側鎖の構造および／または化学的な性質が類似するアミノ酸同士の間で行われる、保存的アミノ酸置換が好ましい。
抗ＣＤ３００ａ抗体の定常領域、すなわちＦａｂ領域のうちの上記のような可変領域以外の領域およびＦｃ領域の形態（アミノ酸配列、アミノ酸長）は、ＣＤ３００ａへの結合性、すなわち中和作用にほとんど影響しないため、本発明の作用効果を阻害しない範囲で適宜設計することができる。
すなわち、上記所定の可変領域のアミノ酸配列と、公知の各種の定常領域のアミノ酸配列からなる融合タンパク質として抗ＣＤ３００ａ抗体を作製することができる。
たとえば、ヒトの定常領域を利用することにより、ヒトキメラ抗体として抗ヒトＣＤ３００ａ抗体を作製することは、好ましい実施形態の一つである。このような抗ＣＤ３００ａ抗体は、公知の手法により作製することが可能である。
たとえば、上記所定の可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成し、定常領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよびその他の必要なＤＮＡ（転写因子等）と連結することにより、抗ＣＤ３００ａ抗体遺伝子の発現ベクターを構築することができる。このベクターを宿主細胞に導入して発現させるようにすれば、目的とする抗ＣＤ３００ａ抗体を産生することができる。
なお、上述したようなＴＸ４１、ＴＸ４９およびこれらに類する抗体は、本発明の作用効果に係る、ホスファチジルセリンとＣＤ３００ａとの結合により生じる抑制性シグナル伝達を阻害する目的以外にも使用できる可能性がある。
また、ＣＤ３００ａの遺伝子配列（ＤＤＢＪ/ＥＭＢＬ/ＧｅｎＢａｎｋ＝ＩＮＳＤ等のＤＮＡデータベースから入手可能）を元に設計されたｓｉＲＮＡにより、罹患部位におけるミエロイド系細胞におけるＣＤ３００ａの発現を抑制することで、ＣＤ３００ａ遺伝子を欠損させた状態またはＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害した状態と同様に、上記の各種疾患に対する治療効果を得ることができる。換言すれば、ＣＤ３００ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡも、本発明におけるＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質の一種といえる。
（第１の活性調節剤の用途）
本発明に係る第１の活性調節剤は、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するために使用することができる。この際、ミエロイド系細胞は、生体内にあるものであっても、生体外に分離されたものまたは生体外で培養されたものであってもよい。
上記の作用により、ミエロイド系細胞のＣＤ３００ａの活性シグナリングを維持または向上させることで、当該ミエロイド系細胞から放出されるケミカルメディエーターを介する細胞間の情報伝達も維持または向上され、それに連なるさらなる細胞間の情報伝達によって引き起こされる炎症、アレルギー反応等に影響を及ぼすことができる。したがって、第１の活性調節剤は、後述する所定の医薬品の有効成分として（たとえば免疫賦活化剤として）使用することができる。また、例えば、実験動物の喘息、アトピー性皮膚炎、炎症性腸疾患、敗血症の病態を改善させて比較解析するための比較解析ツールとしての薬剤の有効成分としても使用することができる。
なお、実施例に示したアトピー性皮膚炎等のように、ＣＤ３００ａ遺伝子を欠損させる（すなわちＣＤ３００ａとホスファチジルセリンとの結合を完全に生じさせない）ことで症状が緩和されることが確認された疾患に対しては、ＣＤ３００ａ結合性物質（ＴＸ４１、ＴＸ４９等の中和抗体）や、ホスファチジルセリン結合性物質（ＭＦＧ−Ｅ８等）が治療薬となりうることは、当業者にとって十分に推認可能である。
逆に、実施例に示したセリアック病のように、ＣＤ３００ａ遺伝子を欠損させる（すなわちＣＤ３００ａとホスファチジルセリンとの結合を完全に生じさせない）ことで発症ないし症状が悪化することが確認された疾患に対しては、ホスファチジルセリンが治療薬となりうることも、当業者にとって十分に推認可能である。
＜第２の活性調節剤＞
第２の活性調節剤は、ＣＤ３００ａを介した抑制性シグナル伝達を亢進する（つまり、ＣＤ３００ａの活性シグナリングを抑制する）作用を有する成分を含有する。本発明ではそのような成分として、ホスファチジルセリンとＣＤ３００ａとの結合を亢進する物質、特にＣＤ３００ａのリガンドであるホスファチジルセリンを用いることができる。
また、本発明の別の側面により提供されるＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを用いたスクリーニングにより、ホスファチジルセリンと同様の作用を有する、ＣＤ３００ａに対するアゴニスト（低分子化合物、抗体等）を発見できる可能性があり、それらもホスファチジルセリンとＣＤ３００ａとの結合を亢進する物質として用いることができる。
（ホスファチジルセリン）
ホスファチジルセリン（ＰＳ）は、ミエロイド系細胞に発現しているＣＤ３００ａのリガンドであり、ＰＳとＣＤ３００ａとの相互作用（結合）によって、ＣＤ３００ａ発現細胞の抑制性シグナリングが亢進する。たとえば、マスト細胞においては、この抑制性シグナリングを介して、ヒスタミンや、サイトカイン、ケモカインなどのケミカルメディエーターを放出するという、炎症反応に関連するマスト細胞の活性が抑制される。ＰＳは工業的に生産されており、容易に入手することができる。
なお、生体外にある（試験的な環境における）ＣＤ３００ａ発現細胞に対しては、ＰＳを提示した状態にあるアポトーシス細胞（ＰＳは、通常の細胞においては細胞の内側（脂質二重層のうち細胞質側の層）に存在するが、アポトーシスが起こると細胞の外側に提示されることが知られている）も第２の活性調節剤となり得る。また、外側にＰＳを含む脂質膜が形成されているリポソーム等も、第２の活性調節剤として用いることができる可能性がある。
（カルシウム塩）
ＰＳとマスト細胞におけるＣＤ３００ａとの相互作用は、カルシウムイオンを必要とすることから、第２の活性調節剤は、電離によってカルシウムイオンを発生するカルシウム塩（たとえば、塩化カルシウム等）を含有することが好ましい。
第２の活性調節剤中のカルシウム塩の含有量は、投与部位におけるカルシウムイオンの濃度や、第２の活性調節剤に含まれるＰＳの量等を考慮して、適宜決定することができる。
（第２の活性調節剤の用途）
本発明に係る第２の活性調節剤は、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進するために使用することができる。この際、ミエロイド系細胞は、生体内にあるものであっても、生体外に分離されたものまたは生体外で培養により生産したものであってもよい。
上記の作用により、ミエロイド系細胞のＣＤ３００ａの活性シグナリングを抑制することで、当該ミエロイド系細胞から放出されるケミカルメディエーターを介する細胞間の情報伝達も抑制され、それに連なるさらなる細胞間の情報伝達によって引き起こされる炎症、アレルギー反応等に影響を及ぼすことができる。したがって、第２の活性調節剤は、後述する所定の医薬品の有効成分（たとえば免疫抑制剤）として使用することができる。また、例えば、実験動物のセリアック病の病態を改善させて比較解析するための比較解析ツールとしての薬剤の有効成分としても使用することができる。
［医薬品］
本発明に係る医薬品（医薬組成物）は、上述したような活性調節剤を有効成分（免疫賦活化剤、免疫抑制剤など）として含有し、必要に応じて薬学的に許容される各種の添加剤（たとえば担体）をさらに含有していてもよい。
このような医薬品は、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達が関与する疾病または症状（特に炎症反応）、たとえば、炎症性感染症、アレルギー疾患または自己免疫疾患を、治療または予防するためのものとして製剤化することができる。
なお、「治療」には疾病または症状を治癒することと共に、それを緩和（軽快）することも含まれ、また「予防」には、疾病または症状を未然に防ぐことと共に、疾病または症状の治癒後にその再発を防ぐことも含まれる。
より具体的には、前記第１の活性調節剤を有効成分として配合することにより、細菌性腹膜炎またはそれに起因する敗血症や、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎、喘息を治療または予防するための医薬品などを調製することができる。
また、前記第２の活性調節剤を有効成分として配合することにより、セリアック病を治療または予防するための医薬品などを調製することができる。
医薬品の投与部位は、適用対象とする疾病または病状に応じて、過剰な免疫機能（炎症反応）が生じている部位とすることができ、特に限定されるものではない。たとえば、腹腔内、気管内、皮下、皮内、泌尿生殖器内などの部位が挙げられる。
ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞は、通常、哺乳類の粘膜下組織や結合組織に存在するため、医薬品は、上記の部位の粘膜下組織や結合組織またはその付近に直接的に投与されることが好ましい。そのような投与は、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射等の注射投与によって行うことができる。たとえば、炎症性感染症（細菌性腹膜炎など）を治療または予防する場合は、腹腔内注射が好ましい。
医薬品（ないしそこに含まれる有効成分）の１回あたりの投与量および投与回数は、患者の年齢、性別、体重及び症状、必要とされる治療効果の程度、投与方法、処理時間、有効成分の種類などにより異なり、適宜調整されてもよい。投与回数は、たとえば、１日あたり１回〜数回である。
医薬品が第１の活性調節剤のうちホスファチジルセリン結合性物質を有効成分として含有する場合、当該医薬品は、投与されるヒトまたは動物１ｋｇあたり、ホスファチジルセリン結合性物質の１回あたりの投与量が通常３〜１５ｍｇ、好ましくは５〜１０ｍｇになるよう製剤化してもよい。
医薬品が第１の活性調節剤のうちＣＤ３００ａ結合性物質を有効成分として含有する場合、当該医薬品は、投与されるヒトまたは動物１ｋｇあたり、ＣＤ３００ａ結合性物質の１回あたりの投与量が通常５０〜１５０ｍｇ、好ましくは５０〜１００ｍｇになるよう製剤化してもよい。
医薬品が第２の活性調節剤を有効成分として含有する場合、免疫抑制効果を一層向上させるという観点から、当該医薬品は、投与されるヒトまたは動物１ｋｇあたり、ホスファチジルセリンの１回あたりの投与量が通常３〜１５０ｍｇ、好ましくは５〜１００ｍｇになるように製剤化してもよい。
（薬学的に許容され得る担体）
本発明に係る医薬品は、必要に応じて、薬学的に許容され得る担体を含んでいてもよい。
薬学的に許容され得る担体とは、医薬品の目的に反しないものである限り特に限定されず、たとえば、水性希釈剤や非水性希釈剤等の希釈剤、抗酸化剤（亜硫酸塩など）等の安定剤・保存剤、リン酸塩類等の緩衝剤、界面活性剤等の乳化剤、着色剤、粘稠剤、リドカインなどの局所麻酔剤、グリコール類などの溶解補助剤、塩化ナトリウムやグリセリン等の等張化剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。
たとえば、本発明の医薬品の剤形が注射剤である場合、所望の粘度や含有成分の濃度になるように希釈剤を配合することにより、有効成分を希釈剤に溶解または分散させることが好ましい。
このような希釈剤としては、生理食塩水または市販の注射用蒸留水等の水性希釈剤、ポリエチレングリコール、エタノール等のアルコール類等の非水性希釈剤が挙げられる。
剤形が注射剤である医薬品は、常法に従って、フィルターによる濾過滅菌されてもよいし、殺菌剤の配合等により無菌化されてもよい。
また、活性調節剤を注射剤により投与する場合、用時調製の形態としてもよい。たとえば、凍結乾燥法などによって活性調節剤を含む固体剤を調製し、使用前に希釈剤に溶解または分散させて注射剤を調製してから投与することができる。
＜炎症性感染症に関する医薬品＞
ＣＤ３００ａ発現細胞（マスト細胞）に対するホスファチジルセリンの結合を阻害すると、マスト細胞の活性を維持または向上させることができる。それにより、好中球の細胞数を増加させて、病原体（細菌、寄生虫など）への好中球による攻撃を活発化し、病原体の増殖抑制機能、病原体のクリアランス機能を向上させることができる。したがって、第１の活性調節剤（ホスファチジルセリン結合性物質またはＣＤ３００ａ結合性物質）を有効成分（免疫賦活化剤）として使用することにより、炎症性感染症に対する医薬品が得られる。
＜炎症性腸疾患に対する医薬品＞
ＣＤ３００ａ発現細胞（大腸粘膜固有層中のＣＤ１１ｂ陽性樹状細胞）に対するホスファチジルセリンの結合を阻害すると、炎症性Ｔ細胞の増殖誘導を抑制することが知られている、ＣＤ４＋細胞等によるＩＬ−１０の産生量が増加し、炎症性Ｔ細胞の活性化を抑制して腸管免疫系の恒常性を維持することができる。したがって、第１の活性調節剤を有効成分として使用することにより、炎症性腸疾患に対する医薬品が得られる。
＜アトピー性皮膚炎に対する医薬品＞
ＣＤ３００ａ発現細胞に対するホスファチジルセリンの結合を阻害すると、好酸球、マスト細胞（真皮内の皮膚ランゲリン陽性樹状細胞と相互作用し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化することが知られている）および単核球の細胞浸潤や、表皮（繊維芽細胞）の過形成を抑制し、総血清ＩｇＥ濃度を低減することができる。したがって、第１の活性調節剤を有効成分として使用することにより、アトピー性皮膚炎に対する医薬品が得られる。
＜喘息に対する医薬品＞
ＣＤ３００ａ発現細胞に対するホスファチジルセリンの結合を阻害すると、好酸球性気道炎症を抑制し、総血清ＩｇＥ濃度を低減することができる。したがって、第１の活性調節剤を有効成分として使用することにより、喘息に対する医薬品が得られる。
＜セリアック病に対する医薬品＞
ＣＤ３００ａ発現細胞（大腸粘膜固有層中のマクロファージ）に対するホスファチジルセリンの結合が維持されると、ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦを介した抑制性のグリアジンシグナル伝達経路によって、セリアック病の進行に保護的な役割が果たされる。したがって、第２の活性調節剤を有効成分（免疫抑制剤）として使用することにより、セリアック病に対する医薬品が得られる。
[ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用]
＜セリアック病に関する用途＞
本発明で得られた知見により、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに対して、セリアック病を誘導する物質として知られているグルテン由来のグリアジンペプチドを投与することでセリアック病を誘導した場合、セリアック病の病徴が野生マウスよりも悪化する。
すなわち、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、セリアック病を誘導する物質を投与したときにセリアック病を発症するモデルマウスとして使用することができる。
本発明に係るセリアック病のモデルマウスはＣＤ３００ａ遺伝子が不活化し且つ、マスト細胞やマクロファージから抗炎性サイトカインの放出が抑制解除されたマウスである。
当該マウスは、早期に（壮年期から）セリアック病を誘導する物質を与えると、セリアック病の症状（小腸の炎症）を示す。そのため、このマウスはセリアック病の原因解明に役立つとともに、セリアック病治療薬の開発に貴重な役割を果たす。
セリアック病の症状は、炎症誘導物質投与した後に、マウスの小腸上皮の切片を顕微鏡下で観察する公知の方法等により確認することができる。
また、本発明に係るセリアック病モデルマウスは、セリアック病治療薬をスクリーニングする際にも用いることができる。特に、確実にセリアック病の症状を示すため、セリアック病の症状発症後の治療薬だけではなく、セリアック病の予防薬の開発にも有用である。
さらに、既に治療効果が実証されているセリアック病の治療薬の評価にも有用である。
例えば、一定の範囲の濃度では治療効果を有するが、当該範囲の濃度以下では効果を有さず、当該範囲の濃度以上では毒性を示す様な治療薬の最適な濃度の検討にも有用である。
具体的には、セリアック病モデルマウスを被験マウス群及び対照マウス群に分け、被験マウス群にのみ試験する治療薬を投与し、小腸上皮の切片により各群を比較し、治療薬の効果を評価することができる。
さらに、被検マウス群に濃度の異なる治療薬を与えることにより、治療効果のある最適な治療薬の濃度の検討を行うこともできる。
すなわち、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、セリアック病を発症した前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに、セリアック病の治療薬の候補物質を投与して治療効果の有無を確認する用途、または、セリアック病を発症する前の前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに、前記セリアック病を誘導する物質と共にセリアック病の予防薬の候補物質を投与して予防効果の有無を確認する用途、さらにはセリアック病の病態解析用途に用いることができる。
また、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）受容体は、抗炎症性サイトカインの産生を抑制するシグナル伝達の上流を担っている。よって、抗炎症性サイトカインの産生を抑制するシグナルの伝達を維持または促進させるＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）の作動薬（アゴニスト）やシグナル伝達物質を投与することで、セリアック病の症状は改善することが期待される。
このことから、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、作動薬（アゴニスト）の探索、ＭＡＩＲ−Ｉ受容体より下流のシグナル伝達を相補するようなシグナル伝達物質やこれを誘導する物質の探索、さらには当該シグナル伝達物質等の産生に関与する遺伝子の探索の用のスクリーニングにも好適に用いることができる。
このスクリーニングは、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスとＷＴマウス間で、ＤＮＡマイクロアレイ解析や２次元蛋白質電気泳動等による差分解析により行うことができる。
＜アトピー性皮膚炎に関する用途＞
アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）とは、アレルギー反応と関連があるもののうち皮膚の炎症（湿疹など）を伴うもので過敏症の一種である。
アレルギー物質(抗原)が体内に入り、活性化した免疫細胞から分泌された物質（インターロイキン４，１３）が刺激となって作られたペリオスチンが、皮膚の角化細胞表面にある別のタンパク質「インテグリン」と結合することで炎症を起こすことが原因となっている。
ペリオスチンがインテグリンと結合することによって新たな炎症誘発性物質が産生され、抗原がなくても症状が継続して慢性化する。マウスを使った実験で、ペリオスチンとインテグリンの結合を阻害すると、アトピー性皮膚炎は起きないことが示されている（下記文献３１）。
本発明で得られた知見により、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに対して、アトピー性皮膚炎を誘導する物質（ダニ抗原、オボアルブミン等）を投与した場合、野生のマウスよりもアトピー性皮膚炎の症状が緩和される。
すなわち、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、アトピー性皮膚炎を発症しにくいモデルマウスとして使用することができる。さらには、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、ＩＬ−４、ＩＬ−１３産生との関係で、アトピー性皮膚炎に関わるシグナル伝達経路の解析、病態解析等に用いることができる。
＜喘息に関する用途＞
気管支喘息（Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ Ａｓｔｈｍａ）とはアレルギー反応や細菌・ウイルス感染などが発端となった気管支の炎症が慢性化することで気道過敏性の亢進、可逆性の気道狭窄をおこし、発作的な喘鳴、咳などの症状をきたす呼吸器疾患である。また、気管支喘息は、気道過敏性、アレルギー体質、環境の組合せでおこるとされている。
本発明で得られた知見により、ＣＤ３００ａ欠損マウスに対して、喘息を誘導する物質（ダニ抗原、オボアルブミン等）を投与して喘息を誘導させた場合、野生のマウスよりも喘息の症状が改善される。
すなわち、前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを、喘息を誘導する物質を投与したときに喘息を発症しにくいモデルマウスとして利用でき、さらには喘息を起こした際のシグナル伝達経路の解明、病態解析等に使用することができる。
＜炎症性腸疾患に関する用途＞
本発明により得られた知見により、ＣＤ３００ａ欠損マウスに対して、炎症誘導物質（ＤＳＳ等）を投与する等して公知の方法により炎症性腸疾患を誘導させた場合、野生のマウスよりも炎症性腸疾患の症状が改善される。
すなわち、前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを、炎症性腸疾患を誘導させる物質を投与したときに炎症性疾患を誘発しにくいモデルマウスとして利用でき、さらには上記病因遺伝子との関連等で、炎症性腸疾患の病態解析等に使用することができる。
（ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの作製方法）
本発明のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、染色体上のＣＤ３００ａ遺伝子が不活性型ＣＤ３００ａ遺伝子に置換されたことにより、ＣＤ３００ａタンパク質の機能が欠損したマウスである。
「不活性型ＣＤ３００ａ遺伝子」とは、ＣＤ３００ａ遺伝子の一部の欠損、ＣＤ３００ａ遺伝子のコード領域への他の塩基配列の挿入、ＣＤ３００ａ遺伝子内の点突然変異、ＣＤ３００ａ遺伝子の発現調節領域内の変異などにより、正常なＣＤ３００ａタンパク質を発現できない遺伝子をいう。欠損型ＣＤ３００ａ遺伝子としては、たとえば、ＣＤ３００ａ遺伝子に含まれるエクソン1〜6の少なくとも一つが欠損した遺伝子などが挙げられるが、これには限定されない。
「ＣＤ３００ａタンパク質の機能が欠損した」とは、本発明が関与する抑制性シグナル伝達に係るＣＤ３００ａタンパク質の機能の少なくとも一部が失われたことをいい（たとえば、ヘテロノックアウトマウスのように片方のアレルのみ不活性型に置換されて、ＣＤ３００ａタンパク質の機能が一部失われたような場合が含まれる。）、好ましくは当該機能が完全に失われたことを意味する。
遺伝子カセットを用いてＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを得るための一般的な方法は次の通りである。ただし、本発明のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスはこの方法により得られるものに限定されない。
野生型アレル中のＣｄ３００ａ遺伝子のエクソンを抗生物質耐性遺伝子（マーカー遺伝子）カセットで置き換えた標的化アレル（変異型アレル）を有するターゲティングベクターを調製する。常法に従い、当該ターゲティングベクターとＥＳ細胞を用いてキメラマウスを得る。当該キメラマウスと野生型マウスとを交配させて、子マウス（ヘテロ接合体（＋／−））を得、さらに子マウス同士を交配させて、孫マウスを得る。
孫マウスからゲノムＤＮＡを抽出し、該ゲノムＤＮＡをＰＣＲ法によって、ゲノムＤＮＡ中の野生型アレルおよび変異型アレルの存在の有無を確認し、変異型アレルのみを有する孫マウス（ホモ接合体（−／−））を得る。さらにＣＤ３００ａが発現していないことを確認するために、当該マウス由来の細胞を抗ＣＤ３００ａ抗体を用いたウエスタンブロット分析で確認し、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスとする。
以下、実施例に則して、本発明をより具体的に説明するが、下記の実施例は、本発明を限定するものではない。
１．調製例
（１）ＣＤ３００ａ−Ｆｃ融合タンパク質、ＭＦＧ−Ｅ８およびＤ８９Ｅ ＭＦＧ−Ｅ８の調製
（１−１） ヒトＩｇＧのＦｃ部位を有するＣＤ３００ａの融合タンパク質（ＣＤ３００ａ−Ｆｃ）を、下記文献２５に記載されているように、マウスまたはヒトＣＤ３００ａの細胞外ドメイン全体をコードする遺伝子のｃＤＮＡとヒトＩｇＧ１Ｆｃをコードする遺伝子のｃＤＮＡとを含むキメラｃＤＮＡから調製した。なお、上記融合タンパク質において、ＣＤ３００ａの細胞外ドメインが、マウス由来のものおよびヒト由来のものを、それぞれ「マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ」および「ヒトＣＤ３００ａ−Ｆｃ」と称する。
（１−２） ＭＦＧ−Ｅ８は、Ｍａｓａｔｏ Ｔａｎａｋａ氏（ＲＣＡＩ、日本国横浜市）から提供されたものである。
（１−３） Ｄ８９Ｅ ＭＦＧ−Ｅ８は、下記文献４に記載されているように、ＭＦＧ−Ｅ８のＲＧＤモチーフに部位特異的突然変異を導入して得られたＭＦＧ−Ｅ８の変異体である。
得られたＤ８９Ｅ ＭＦＧ−Ｅ８は、Ｎ末端から８９番目のアミノ酸がアスパラギン酸からグルタミン酸に置換されている。また、ＭＦＧ−Ｅ８（ネイティブ）は、フォスファチジルセリン（ＰＳ）とαｖβ３インテグリンとの両方に結合して、アポトーシス細胞とαｖβ３インテグリンを発現する貪食細胞とを架橋する（下記文献４）のに対して、Ｄ８９Ｅ ＭＦＧ−Ｅ８は、フォスファチジルセリン（ＰＳ）に結合するものの、αｖβ３インテグリンに結合しない。
（２）マウスおよび盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）
本実施例で使用されたノックアウトマウスは、以下のように作製あるいは提供されたものである。
（ｉ）ＣＤ３００ａ遺伝子欠損（Ｃｄ３００ａ-/-）マウス
野生型アレル中のＣｄ３００ａ遺伝子のエクソン１〜６を、細菌人工染色体（ＢＡＣ）システムを用いて、ネオマイシン耐性遺伝子カセット（ＰＧＫ−ＧＢ２−ｎｅｏ）で置き換え、標的化アレル（変異型アレル）を調製した（図３Ａ）。次いで、常法に従い、キメラマウスを得、さらに該キメラマウスと野生型マウスとを交配させて、子マウス（ヘテロ接合体（＋／−））を得、さらに子マウス同士を交配させて、孫マウスを得た。
孫マウスの中から、ＣＤ３００ａ欠損（Ｃｄ３００ａ-/-）マウスを選別するために、各孫マウスの尾部からゲノムＤＮＡを抽出し、該ゲノムＤＮＡをＰＣＲ法によって、ゲノムＤＮＡ中の、ＷＴアレルおよび変異型アレルの存在の有無を確認した。
なお、図３Ｂに示されるように、ＷＴアレルを示すＰＣＲ産物、変異型アレルを示すＰＣＲ産物は、それぞれ、約５４０ｂｐ、約７００ｂｐのバンドとして検出される。
さらにＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに、ＣＤ３００ａが発現していないことを確認するために、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の細胞を抗ＣＤ３００ａ抗体を用いたウエスタンブロット分析に供した。図３Ｃに示されるように、野生型マウスでは、約５０ｋＤａにＣＤ３００ａに由来するバンドが示される一方で、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでは、このバンドは検出されなかった。
（ｉｉ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｋｉｔW-sh/W-shマウス
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｋｉｔW-sh/W-shマウス（以下、「ｋｉｔW-sh/W-shマウス」または「マスト細胞欠損マウス」）は、理研バイオリソースセンター（日本国つくば市）から提供されたものである。なお、該マウスは、マスト細胞を欠損したマウスであること（下記文献２１）および、アポトーシス性のＤＮＡ断片化を経ずに、貪食細胞によってＤＮＡが取り込まれた後に、貪食細胞内でＤＮＡの分解が生じることが知られている（下記文献１２）。
（ｉｉｉ）ＣＡＤ欠損マウス
ＣＡＤ（カスパーゼ活性型ＤＮＡ分解酵素（Ｃａｓｐａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＤＮａｓｅ））欠損マウスは、下記文献１２に記載されたものである。
（ｖ）マクロファージおよび好中球のｉｎ ｖｉｖｏ除去
下記文献３０の記載に基づき、クロドン酸リポソームおよびコントロール用ＰＢＳリポソーム（Ｅｎｃａｐｓｕｌａ ＮａｎｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を調製した。次いで、ＣＬＰ後２４時間目に、これらのリポソーム０．５ｍＬをマウス腹腔内に注入して、マクロファージを除去した。
また、ＣＬＰ後２４時間目に、抗Ｇｒ−１抗体を、マウス腹腔内に注入して、好中球を除去した。
なお、本実施例におけるマウスを用いた調製および評価試験の実施は何れも、筑波大学生命科学動物資源センター動物倫理員会作製のガイドラインを遵守したものである。
（３）各種抗体
各種抗体の購入先および調製方法を下記表に示す。
Figure 0006124261
（４）各種細胞の調製
各種細胞は、以下のように調製されたものである。
（ｉ）骨髄由来マスト細胞（ＢＭＭＣ）
マウス骨髄細胞２×１０8個を、１０ｃｍｍディッシュにて、細胞増殖因子（ＳＣＦ）（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−３（４ｎｇ／ｍＬ）および仔牛血清（ＦＢＳ）（１０％）を含むコンプリートＲＰＭＩ１６４９メディウム中で５週間以上培養して骨髄由来マスト細胞（ＢＭＭＣ）を調製した。ＢＭＭＣは、毎週新しいメディウムで継代した。調製されたＢＭＭＣのうち、９５％超は、フローサイトメトリー分析によって、ｃ−Ｋｉｔ+ＦｃεＲＩ+細胞であることが示された。
（ｉｉ）骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭφ）
マウス骨髄細胞２×１０6細胞を、１０ｃｍｍディッシュにて、Ｍ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）および仔牛血清（ＦＢＳ）（１０％）を含むコンプリートＲＰＭＩ１６４９メディウム中で１週間培養して骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭφ）を調製した。
（ｉｉｉ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞形質転換体
常法に基づいて、Ｆｌａｇタグ付きＣＤ３００ａのｃＤＮＡまたはＦｌａｇタグ付きＣＤ３００ｄのｃＤＮＡを含むｐＭＸ−ｎｅｏレトロウイルスベクタープラスミドを調製した。
調製されたプラスミドをＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質導入（トランスフェクト）して、ＣＤ３００ａまたはＣＤ３００ｄを安定発現する形質転換体を得た。得られた、ＣＤ３００ａを安定発現する形質転換体およびＣＤ３００ｄを安定発現する形質転換体をそれぞれ、「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ａ）」および「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ｄ）」と称する。
また、ＴＩＭ−４を安定発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞形質転換体は、Ｔ．Ｋｉｔａｍｕｒａ氏（東京大学）から提供されたものである。なお、この形質転換体を、「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＴＩＭ−４）」と称する。
［評価方法］
以下に、評価方法の条件を記載する。なお、生存試験においては、カプラン・マイヤーログランク検定（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）を用い、その他の評価試験においては、アンペアード・スチューデントｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ ｔｅｓｔ）を用いて統計学分析を行った。Ｐ＜０．０５を統計学的有意差とみなした。
（５）結合アッセイ等
（ｉ）結合アッセイ
細胞を、２％ＦＢＳを含むリン酸緩衝液中、１ｍＭＣａＣｌ2の存在下または非存在下でＣＤ３００ａまたはコントロール用ヒトＩｇＧを用いて３０分間染色し、同一の緩衝液で２回洗浄して、ＦＩＴＣ結合型のヤギ抗ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ'）2フラグメントとともにインキュベートした。次いで、アネキシンＶで染色するために、細胞を、１４０ｍＭ ＮａＣｌおよび２．５ｍＭＣａＣｌ2を含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液中で、アネキシンＶとともに１５分室温でインキュベートした。
（ｉｉ）結合阻止アッセイ
細胞を、マウスＣＤ３００ａに対するモノクローナル抗体（ＴＸ４１）、コントロール用アイソタイプの抗体またはＭＦＧ−Ｅ８とともに、３０分間プレインキュベートした後、上記結合アッセイのように、ＣＤ３００ａ−Ｆｃで染色した。また、ＣＤ３００ａ−Ｆｃがリン脂質へ結合したか否かを分析するために、ＰＩＰストリップアッセイ（Ｅｃｈｅｌｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を製造元の取扱説明書に準拠して実施した。
（６）好気性細菌のＣＦＵ（コロニー形成単位）の測定
マウスの腹膜灌流液の段階希釈液をプレーティングして、該希釈液をブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天を含むプレート上で、３７℃、４８時間培養した。次いで、好気性細菌のＣＦＵを、下記文献２７に記載されているように、腹膜灌流液１ｍＬ中のコロニー数を計測して算出した。
［実施例１：ＣＤ３００ａのリガンドの同定］
［実施例１Ａ］
各種造血幹細胞系列細胞株または腫瘍細胞系列細胞株におけるマウスＣＤ３００ａリガンドの発現を確認するために、以下のような試験を行った。
「１．調製例」において得られた、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭφ）、骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）またはＩＬ−３依存性造血細胞株（ＢａＦ／３細胞）（各細胞数２Ｘ１０5個）を、ＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１μｇ）、および塩化カルシウム（１ｍＭ）を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で２０℃、３０分間インキュベートし、次いでＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧ抗体（０．１μｇ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１μｇ）を含む緩衝液を用いて染色した。
染色された各細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した。
また、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃの代わりにコントロール用ヒトＩｇＧ（１μｇ）を用いたこと以外は上記試験方法と同様にして、対照試験も実施した。
ＢＭＭφ、ＢＭＤＣおよびＢａＦ／３細胞を用いた場合のフローサイトメトリーの分析結果を、それぞれ図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃに示す（なお、対照試験は、「Ｃｔｒｌ Ｉｇ」に示す。）。
図１Ａ〜図１Ｃに示されるように、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、塩化カルシウムを含む場合、ＰＩ-細胞（生細胞）に結合する一方、ＰＩ+細胞（死細胞）には結合しないことが分かった。つまり、マウスＣＤ３００ａリガンドは、死細胞において発現していることが示唆される。
［実施例１Ｂ］
マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃが、死細胞の一種であるアポトーシス細胞に結合するか否かを検証するために、以下のような試験を行った。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型マウス）由来の胸腺細胞に、ＲＰＭＩメディウム中でデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）（１０μＭ）とともにインキュベートして、胸腺細胞のアポトーシス細胞を調製した。
得られたアポトーシス細胞（細胞数２Ｘ１０5）を、ＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１μｇ）、ＡＰＣ結合型アネキシンＶ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）（１μｌ）および塩化カルシウム（１ｍＭ）を含むメディウム（ＰＢＳ）中で２０℃、３０分間インキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧ抗体（０．１μｇ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１μｇ）を含む緩衝液を用いて染色した。
染色された各細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いて分析した（結果：図２Ａ）。
また、塩化カルシウムを含むメディウムの代わりに塩化カルシウムを含まないメディウムを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリーを用いた分析に供した（結果：図２Ｂ）。
図２Ａによると、塩化カルシウムの存在下では、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、アネキシンＶで染色されない（アネキシンＶ-）胸腺細胞に結合しないのに対して、アネキシンＶで染色される胸腺細胞に結合することが分かる。すなわち、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、アポトーシスした胸腺細胞に結合することが示される。
一方で、図２Ｂに示されるように、塩化カルシウムの非存在下では、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、アポトーシスした胸腺細胞へ結合しないことが分かる。
本試験結果から、マウスＣＤ３００ａは、カルシウムイオン依存的に、アポトーシス細胞に結合することが理解できる。
［実施例１Ｃ］
実施例１Ｂで得られたアポトーシス細胞（細胞数２Ｘ１０5）を、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１μｇ）、ＡＰＣ結合型アネキシンＶ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）（１μｌ）、コントロール用ヒトＩｇＧ１（１μｇ）および塩化カルシウム（１ｍＭ）を含むメディウム（ＰＢＳ）中で２０℃、３０分間インキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧ抗体（０．１μｇ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１μｇ）を含む緩衝液を用いて染色した。
染色された各細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図２Ｃ「ＨｕＩｇＧ１」）。
また、コントロール用ヒトＩｇＧ１の代わりに、モノクローナル抗体である「ＴＸ４１」またはマクロファージに発現する蛋白質「ＭＦＧ−Ｅ８」を用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリーを用いて分析した（結果：図２Ｃ「ＴＸ４１」および「ＭＦＧ−Ｅ８」）。
ここで使用された「ＴＸ４１」は、上述したように、抗マウスＣＤ３００ａモノクローナル抗体であり、マウスＣＤ３００ａとリガンドとの結合を阻止するものである。
また、「ＭＦＧ−Ｅ８」は、フォスファチジルセリン（ＰＳ）とαｖβ３インテグリンとの両方に結合し、アポトーシス細胞とαｖβ３インテグリンを発現する貪食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｅ）とを架橋することが知られている（下記文献４）。
図２Ｃの各フローサイトメトリーの結果を対比すると分かるように、ＴＸ４１またはＭＦＧ−Ｅ８の存在下では、マウスＣＤ３００ａは、アポトーシス細胞へ結合しないことが理解できる。
この点を鑑みると、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、ＰＳに対する結合性を有すること（ＣＤ３００ａのリガンドはＰＳであること）が示唆される。
［実施例１Ｄ］
ヒトＣＤ３００ａも、マウスＣＤ３００ａと同様に、アポトーシス細胞に結合するのか否かを検証すべく、以下の試験を行った。
まず、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞系列）を、ＲＰＭＩ１６４０メディウムに懸濁させ、該メディウムに紫外線を６０分間照射して、Ｊｕｒｋａｔ細胞のアポトーシス細胞を調製した。
アポトーシス細胞として、野生型マウス胸腺細胞由来のアポトーシス細胞の代わりに、上記「Ｊｕｒｋａｔ細胞由来のアポトーシス細胞」を用い、「マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ」の代わりに「ヒトＣＤ３００ａ−Ｆｃ」を用いたこと以外は、実施例１Ａの試験条件と同様にして、フローサイトメトリーを用いて分析した（結果：図２Ｄ）。
また、アポトーシス細胞として、野生型マウス胸腺細胞由来のアポトーシス細胞の代わりに、上記「Ｊｕｒｋａｔ細胞由来のアポトーシス細胞」を用い、「マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ」の代わりに「ヒトＣＤ３００ａ−Ｆｃ」を用い、さらに、「ＴＸ４１」の代わりに「ＴＸ４９」または「コントロール用ヒトＩｇＧ１」を用いたこと以外は、実施例１Ｂの試験条件と同様にして、フローサイトメトリーを用いて分析した（結果：図２Ｅ「ＴＸ４９」または「ＨｕＩｇＧ１」）。なお、「ＴＸ４９」とは、抗ヒトＣＤ３００ａ抗体（モノクローナル抗体）であり、ＣＤ３００ａとリガンドとの結合を阻止するものである。
図２Ｄ〜図２Ｅに示されるように、ヒトＣＤ３００ａ−Ｆｃも、アネキシンＶ+細胞に結合する一方で、抗ヒトＣＤ３００ａ抗体の存在下では結合しないことが分かる。
すなわち、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃと同様に、ヒトＣＤ３００ａもアポトーシス細胞に結合することが示唆される。
［実施例１Ｅ］
メンブレン（ＰＩＰ−ｓｔｒｉｐ（Ｅｃｈｅｌｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製））に、各種リン脂質（ＰＳ、ＰＣ、ＰＥ）（１００ ｐｍｏｌ）を含む液（試料液）をスポットして、該メンブレン上に各種リン脂質を吸着させた。
次いで、該メンブレンを、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１．５μｇ／ｍＬ）を含む塩化カルシウム（１ｍＭ）及びＢＳＡを加えたＴＢＳＴ緩衝液（ｐＨ ８．０）中に２０℃で２時間浸漬した。
浸漬後、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃを含まないＴＢＳＴ緩衝液（ｐＨ８．０）で、３回洗浄して、メンブレン上の各リン脂質に未結合のＣＤ３００ａ−Ｆｃを除去した後、ＨＲＰ結合型抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎ社製）を含むＢＳＡを加えたＴＢＳＴ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて検出した（結果：図２Ｆ）
図２Ｆ中、「ＰＥ」、「ＰＣ」および「ＰＳ」は、それぞれホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルセリンがメンブレン上にスポットされた部分を指し、「Ｂｌａｎｋ」は、何れのリン脂質もメンブレン上にスポットされていない部分を指す。
図２Ｆによれば、ＣＤ３００ａは、ＰＥおよびＰＣの何れにも結合しない一方、ＰＳに特異的に結合したことを示している。
実施例１Ａ〜１Ｅの結果から、ＣＤ３００ａは、カルシウムイオン依存的にホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合すること（ＣＤ３００ａのリガンドはＰＳであること）が理解できる。
［実施例２：ＣＤ３００ａの機能解析（２）］
一部のＰＳ結合性受容体は、貪食細胞において発現し、生理学的および病理的状況下で、アポトーシス細胞の除去に関与することが知られている（下記文献４〜９）。
また、ＰＳは、ＣＤ３００ａを発現する細胞である貪食細胞（マクロファージ等）において、いわゆる「ｅａｔ ｍｅ」シグナルを介在することが知られている（下記文献１０〜１１）。この点を鑑みて、下記実施例２Ａ〜Ｃに記載の試験を行って、ＣＤ３００ａが、アポトーシス細胞の貪食作用に関与するか否かを検証した。
［実施例２Ａ］
ＣＡＤ欠損マウスに由来する胸腺細胞を、実施例１Ｂと同様にして、アポトーシス胸腺細胞を調製した。
次いで、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のマクロファージ（チオグリコレート誘発性腹腔マクロファージ）（２×１０5細胞）を、８穴Ｌａｂ−ＴｅＫＩＩチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ社製）内で、ＣＡＤ欠損マウスに由来するアポトーシス胸腺細胞とともに、１：５（マクロファージ：アポトーシス胸腺細胞（細胞数））の比率で、３７℃、１時間共培養した。
次いで、下記文献５または２６に記載されているように、共培養したマクロファージを冷ＰＢＳで洗浄し、パラホルムアルデヒド（１％）を含む固定液で固定した後、ＦＩＴＣ標識化ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含む緩衝液を用いたＴＵＮＥＬ染色に供した。
染色された５０細胞数以上のマクロファージをランダムにレーザー走査型共焦点顕微鏡（オリンパス社製、「ＦＶ１０ｉ」、型番：１Ｂ２２３５８）で分析し、マクロファージ１細胞に含まれるＴＵＮＥＬポジティブ細胞（アポトーシス細胞）の数を計測した。全マクロファージの個数を１００％として、０〜８個の各アポトーシス細胞を含むマクロファージの比率（貪食率）を算出した（結果：図４Ａ「Ｃｄ３００ａ-/-」）。
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のマクロファージの代わりに、野生型マウス由来のマクロファージを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、貪食率を計測した（結果：図４Ａ「ＷＴ」）。
図４Ａに示されるように、マクロファージがＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに由来する場合であっても、野生型マウスに由来する場合であっても、貪食率には明確な差異は見られなかった。
［実施例２Ｂ］
マスト細胞は、公知のＰＳ受容体（ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、スタビリン２、インテグリンαｖβ３）を発現するか否かを検証するために、以下の試験を行った。
骨髄由来マスト細胞（ＢＭＭＣ）（細胞数２Ｘ１０5個）と、ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）結合型抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体（０．１μｇ）、ＡＰＣ結合型抗ＴＩＭ−４モノクローナル抗体（０．１μｇ）およびＡｌｅｘａ結合型抗マウスＣＤ３００ａモノクローナル抗体（ＴＸ４１）（０．５μｇ）を含むメディウム（ＰＢＳ）中で２０℃、３０分間インキュベートした。
次いで、ＰＢＳを用いて、２回洗浄した後、染色された各細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図５Ａ「ＢＭＭＣｓ」）。
また、ＢＭＭＣのかわりに、腹腔マクロファージおよびＢＭ由来マクロファージを用いたこと以外は上記試験方法と同様にして、フローサイトメトリー分析も実施した（結果：図５Ａ「Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ」および「ＢＭ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ」）。
さらに、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、腹腔マクロファージおよびＢＭＭＣからｃＤＮＡを調製し、調製された各ｃＤＮＡを用いて、スタビリン２、ＢＡｌ−１、αｖインテグリン、Ｃｄ３００ａおよびβアクチン（ローディングコントロール））の発現量を、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した（結果：図５Ｂ）。
図５Ａおよび図５Ｂを参照すると、マクロファージの場合とは異なって、マスト細胞は、ＣＤ３００ａおよびαｖβ３インテグリンを発現するものの、貪食作用に関与するＰＳ受容体であるＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４およびスタビリン２を低いレベルでしか発現していないことが分かる。
［実施例２Ｃ］
ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ａ）（細胞数６Ｘ１０4）を、ＦＩＴＣで標識化した細胞（アポトーシス胸腺細胞または胸腺細胞（生細胞））とともに、２時間共培養し、ＰＢＳで洗浄した後、光学顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製、ＢＺ−９０００）で分析した（結果：図４Ｂ）。
また、共培養および洗浄後の細胞を、パラフォルムアルデヒドを含む固定液Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）で固定して、レーザー走査型共焦点顕微鏡によって分析した（結果：図４Ｃ）。なお、図４Ｃにおいて、緑色部分（矢印で示す。）は、包摂された細胞（アポトーシス胸腺細胞または胸腺細胞（生細胞））を示す。
また、ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ａ）の代わりに、ＮＩＨ３Ｔ３未形質転換細胞（ネガティブコントロール）または「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＴＩＭ−４）」（ポジティブコントロール）を用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、光学顕微鏡およびレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて分析した。
図４Ｂおよび図４Ｃにおける「ＮＩＨ−３Ｔ３」および「ＮＩＨ−３Ｔ３／Ｔｉｍ４」は、それぞれ、「ＮＩＨ３Ｔ３」（未形質転換細胞）および「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＴＩＭ−４）」を用いた光学顕微鏡およびレーザー走査型共焦点顕微鏡のイメージを示す。
また、レーザー走査型共焦点顕微鏡のイメージから、アポトーシス胸腺細胞を細胞質内に取り込んだ、未形質転換細胞または各形質転換体の細胞数の比率（共培養された未形質転換細胞または各形質転換体の細胞数を１００％とする。）を計測した（結果：図４Ｄ「ａｐｏｐｔｏｔｉｃ」）。
また、同様にして、胸腺細胞（生細胞）を細胞質内に取り込んだＮＩＨ３Ｔ３または各形質転換体の細胞数の比率（共培養された未形質転換細胞または各形質転換体の細胞数を１００％とする。）を計測した（結果：図４Ｄ「Ｌｉｖｅ」）。
図４Ｂに示されるように、ＮＩＨ３Ｔ３とは異なって、上記の形質変換体は、両方ともアポトーシス胸腺細胞に付着した。しかしながら、図４Ｃおよび図４Ｄから判断すると、ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＴＩＭ−４）のみがアポトーシス胸腺細胞を取り込み、貪食作用を発揮したことがわかる。
また、データを示さないが、ＮＩＨ３Ｔ３と同様に、ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ａ）は、生細胞（胸腺細胞）を貪食しないことが観察された。
実施例２Ａ〜Ｃの結果から、ＣＤ３００ａは、マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食作用に関与しないことが理解できる。
［実施例３：ＣＤ３００ａの機能解析（２）］
図５に示すように、マスト細胞は、ＣＤ３００ａを発現するものの、マクロファージとは異なって、ＰＳ受容体であるＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、スタビリンを発現しない。
これらのＰＳ受容体には、ＰＳが直接的にまたは間接的に結合することが知られており、アポトーシス細胞の取り込みに寄与することが知られている（下記文献１３）。そこで、ＣＤ３００ａもこのような機能を有しているのか否か（アポトーシス細胞を取り込む機能的重複があるのか否か）を検証すべく、下記実施例３Ａ〜Ｃに示す試験を行った。
［実施例３Ａ］
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの骨髄細胞（ＢＭ細胞）２×１０8個を１０ｃｍｍディッシュにて、細胞増殖因子（ＳＣＦ）（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−３（４ｎｇ／ｍＬ）および仔牛血清（ＦＢＳ）（１０％）を含むコンプリートＲＰＭＩ１６４９メディウム中で４週間培養して、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの骨髄由来のマスト細胞（ＢＭＭＣ）を調製した。なお、ＢＭＭＣは、毎週新しいメディウムで継代した。
次いで、得られたＢＭＭＣを、ＦＩＴＣ結合型抗ＦｃεＲＩα抗体（０．１μｇ）およびＰＥ結合型抗ｃ−Ｋｉｔ抗体（０．１μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４９メディウム中で、４℃、３０分インキュベートし、フローサイトメトリーで分析した（結果：図６Ａ「ＣＤ３００-/-」）。
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の骨髄細胞の代わりに野生型マウス由来の骨髄細胞を用いて、ＢＭＭＣを調製したこと以外は、上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリーで分析した（結果：図６Ａ「ＷＴ」）なお、図６Ａの数字は、ボックス中の細胞の比率を指し、各試験は独立して３回行った。
また、各ＢＭＭＣを用いてβ−ヘキソサミニダーゼ放出アッセイ（脱顆粒アッセイ）を以下のように実施した（詳細な条件は下記文献２９に記載されている）。
まず、対数増殖期における各ＢＭＭＣ１×１０5細胞〜２×１０5細胞を、ゼラチン（Ｓｉｇｍａ社製）でコートされた２４穴プレート中で３７℃、一昼夜培養し、ビオチン結合型マウス抗トリニトロフェノールＩｇＥ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を含み、サプリメントを含まないメディウム中において、３７℃、１時間インキュベートした。
次いで、上記メディウム中にストレプトアビジンを添加して、ビオチン結合型マウス抗トリニトロフェノールＩｇＥ同士をクロスリンクさせて、３７℃、４５分間培養した後、上清を採取した。
採取された上清に、ｐ−ニトロフェニルーＮ−アセチルーβーＤ−グルコサミド（Ｓｉｇｍａ社製）およびクエン酸（０．４Ｍ）およびリン酸ナトリウム（０．２Ｍ）を含む緩衝液（ｐＨ４．５）を加え、３７℃、３時間インキュベートして、放出されたβ−ヘキソサミニダーゼによってｐ−ニトロフェニルーＮ−アセチルーβーＤ−グルコサミドを加水分解反応させ、該反応を、０．２Ｍグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１０．７）を添加して、停止した後、ｐ−ニトロフェニルーＮ−アセチルーβーＤ−グルコサミドの加水分解によって生じる波長４１５ｎｍの吸光度を測定し、β−ヘキソサミニダーゼの放出量を定量した。さらに、上記処理をしていない各ＢＭＭＣに対する、β−ヘキソサミニダーゼの放出量の増加率（％）を図６Ｂに示した。
図６Ｂは、β−ヘキソサミニダーゼを放出したＢＭＭＣの比率を示す。図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、ＢＭＭＣがＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の場合と野生型マウス由来との場合とで、ＦｃεＲＩαやｃ−Ｋｉｔの発現（マスト細胞のマーカー蛋白質）や、β−ヘキソサミニダーゼの放出量の増加率には、有意な差異は見られなかった。
すなわち、骨髄細胞からの分化やＦｃｅＲＩ介在性の脱顆粒化には、ＣＤ３００ａは影響を与えるものではないことが分かる。
［実施例３Ｂ］
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣおよび、実施例１Ｂで得られたアポトーシス細胞（ＢＭＭＣ：アポトーシス細胞＝１０：１（細胞数比））を、塩化カルシウム（１ｍＭ）、ＡＰＣ結合型アネキシンＶ（１μｌ）、ＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１μｇ／ｍＬ）およびＭＦＧ−Ｅ８（５μｇ）を含むＰＢＳ中で２０℃、３０分間インキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧ抗体（０．１μｇ／ｍＬ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１μｇ）を含む緩衝液を用いて染色した。
染色された細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図７Ａ「ＭＦＧ−Ｅ８」）。
また、ＭＦＧ−Ｅ８の代わりにコントロール用ＩｇＧを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリー分析を行った（結果：図７Ａ「Ｃｔｒｌ Ｉｇ」）。
図７Ａに示される結果から、コントロール用ＩｇＧの存在下では、ＣＤ３００ａ−Ｆｃはアポトーシス細胞（アネキシンＶ+）に結合するのに対して、ＭＦＧ−Ｅ８（ＰＳ結合性物質）の存在下では、この結合が特異的に阻害されていることが分かる。
なお、この混合試料の上清において、サイトカインおよびケモカインの濃度は、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６）およびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製（ＭＩＰ−２、ＭＣＰ−１，ＩＬ−１３およびＭＩＰ−１α）のＥＬＩＳＡキットを用いてサイトカインやケモカインの定量を試みたところ、サイトカインやケモカインは検出されなかった。
［実施例３Ｃ］
ＢＭＭＣおよびアポトーシス細胞が共存する場合、ＬＰＳ（リポポリサッカリド）の刺激によって、各種サイトカインの放出量が変化するか否かを検証すべく、以下のような試験を行った。
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣおよびアポトーシス細胞（ＢＭＭＣ：アポトーシス細胞＝１０：１（細胞数比））を、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ中で４時間インキュベートした後、メディウムの上清を採取した。
次いで、サイトカインおよびケモカインの濃度を、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６）およびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製（ＭＩＰ−２、ＭＣＰ−１，ＩＬ−１３およびＭＩＰ−１α）のＥＬＩＳＡキットを用いて３回測定し、上記のＬＰＳ処理が実施されていないＢＭＭＣの各サイトカインおよびケモカインの放出量の増加率を算出した（結果：図７Ｂ「Ｃｄ３００ａ-/-」）。
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、野生型マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は上記試験条件と同様にして、サイトカインおよびケモカインの増加率を算出した（結果：図７Ｂ「ＷＴ」）。
図７Ｂに示されるように、何れのＢＭＭＣにおいても、ＬＰＳによって、各種サイトカインの放出量が増加した。しかしながら、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣにおいては、野生型マウス由来のＢＭＭＣに比べてＴＮＦ−α、ＩＬ−１３、およびＭＣＰ−１が有意に増加した。
［実施例３Ｄ］
さらに、各ＢＭＭＣの細胞内中の各種サイトカインおよびケモカインの増加率を検証すべく、以下の試験を行った。
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣおよび、実施例１Ｂで得られたアポトーシス細胞（ＢＭＭＣ：アポトーシス細胞＝１０：１（細胞数比））を、ＬＰＳ（リポポリサッカリド）（１μｇ／ｍＬ）を含むメディウム（ＲＰＭＩ）中で４時間インキュベートした後、上記インキュベート後のＢＭＭＣおよびアポトーシス細胞を、各種サイトカインおよびケモカインに対する各種蛍光標識化抗体と、ホルムアルデヒドを含むメディウム（ＦＩＸ ＆ ＰＥＲＭ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で４℃、２０分インキュベートし、染色された細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図８矢印（１））。また、各種サイトカインおよびケモカインに対する各種蛍光標識化抗体の代わりに、コントロール用抗体を用いたことは上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリー分析を行った（コントロール試験（結果：図８矢印（２）））。
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、野生型マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリー分析を行った（結果：図８矢印（３））。さらに、各種サイトカインおよびケモカインに対する各種蛍光標識化抗体の代わりに、コントロール用抗体を用いたことは上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリー分析を行った（コントロール試験（結果：図８矢印（４）））。
また、図８のグラフは、各ＢＭＭＣにおける各サイトカイニンおよびケモカインに関するＭＦＩ値（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を測定し、ＬＰＳ未処理のＢＭＭＣに対するＭＦＩの増加量を示す。
図８によれば、何れのＢＭＭＣの細胞質中においても、ＬＰＳ未処理の場合に比べてサイトカイニンおよびケモカインの量が増加したことを示しているが、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの細胞質中では、野生型マウス由来のＢＭＭＣの細胞質中と比べても、ＴＮＦ−α等が有意に増加したことが分かる。
［実施例３Ｅ］
Ｄ８９Ｅ ＭＦＧ−Ｅ８は、ＲＧＤモチーフにおいて点変異（Ｄ８９Ｅ）を含むＭＦＧ−Ｅ８のバリアント（変異体）であり、ＰＳに結合するが、αｖβ３インテグリンに結合しないという結合特性を有する。
そこで、Ｄ８９Ｅ ＭＦＧ−Ｅ８の存在下において、各ＢＭＭＣのサイトカインおよびケモカインの放出量が変化するか否かを検証すべく、以下のような試験を行った。
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣおよびアポトーシス細胞を含むメディウム中に、ＬＰＳとともにＤ８９Ｅ ＭＦＧ−Ｅ８（５μｇ／ｍＬ）を添加したこと以外は、実施例３Ｃと同様にして、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１３、ＭＣＰ−１およびＩＬ−６を定量した（結果：図７Ｃ「ＣＤ３００ａ-/-」）。
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、野生型マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は上記試験条件と同様にして、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１３、ＭＣＰ−１およびＩＬ−６を定量した（結果：図７Ｃ「ＷＴ」）。
図７Ｃに示されるように、Ｄ８９Ｅ ＭＦＧ−Ｅ８の存在下では、ＢＭＭＣがＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の場合と野生型マウス由来との場合とで、各種サイトカインの濃度には、有意な差異が見られなかった。
［実施例３Ｆ］
ＣＤ３００ａは、細胞内部位において免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、抗ＣＤ３００ａ抗体で架橋されると、ＳＨＰ−１が誘導されることが知られている（下記文献１４）。
そこで、ＣＤ３００ａとＳＨＰ−１とが相互作用するのか否かを検証すべく、以下のような試験を実施した。試験例３Ｃのように、ＬＰＳの存在下でアポトーシス細胞と４時間共培養したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスまたは野生型マウス由来のＢＭＭＣの細胞破砕物を、抗ＣＤ３００ａ抗体（ＴＸ４１）で免疫沈降させた。
得られた免疫沈降物を用いて、下記文献１４に記載されているように、抗ＳＨＰ−１抗体または抗ＣＤ３００ａ抗体によるイムノブロットを行った（結果：図７Ｄ）。
この結果からも分かるように、ＢＭＭＣがアポトーシス細胞と共培養された場合、ＬＰＳ刺激に応答して、ＳＨＰ−１を誘導（リクルート）することが分かる。しかしながら、Ｄ８９Ｅ ＭＦＧ−Ｅ８の存在下においては、ＣＤ３００ａはＳＨＰ−１をリクルートしなかった。
すなわち、ＬＰＳ刺激の応答に対するＣＤ３００ａによるＳＨＰ−１の誘導（リクルート）には、ＰＳがＣＤ３００ａへ結合することが必要であると考えられる。
［実施例３Ｇ］
ＳＨＰ−１が、ＣＤ３００ａ介在性のシグナリングに関与しているかどうかを調べるために、まず、野生型マウス由来のＢＭＭＣにおいて、ｓｉＲＮＡでＰｔｐｎ６（ＳＨＰ−１遺伝子）をノックアウトして、ＳＨＰ−１欠損（Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）野生型マウス由来のＢＭＭＣを以下の条件で作製した。また、同様にして、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来ＢＭＭＣからＳＨＰ−１欠損（Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣを作製した。
ＢＭＭＣ中のＳＨＰ−１遺伝子（Ｐｔｐｎ６遺伝子）をターゲットとしたｓｉＲＮＡ（ＳＨＰ−１ ｓｉＲＮＡ）（ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｈａｒｍａｃｏｍ）０．５ｍＭを、Ｘ−ｔｒｅｍｅ Ｇｅｎｅ ｓｉＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）１ｍＬと混合し、下記文献２８に記載されているように、５×１０5細胞のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣに形質導入（トランスフェクト）して、ＳＨＰ−１がノックダウンされたＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣ（ＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ-/-・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ））を作製した。
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、野生型マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、ＳＨＰ−１がノックダウンされた野生型マウス由来のＢＭＭＣ（ＢＭＭＣ（ＷＴ・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ））を作製した。
ここで、ＳＨＰ−１ ｓｉＲＮＡが各ＢＭＭＣに形質導入され、ＳＨＰ−１の発現量が低減していることを確認するために、ＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ-/-・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）またはＢＭＭＣ（ＷＴ・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）のライセートを用いて、抗ＳＨＰ−１抗体、抗ＳＨＰ−２抗体および抗βアクチン抗体によるイムノブロッティング分析を行った（結果：図７Ｅ）。
図７Ｅに示されるように、ＳＨＰ−１ ｓｉＲＮＡを形質導入したＢＭＭＣでは、ＳＨＰ−１の発現量が低減されていることが確認できる。なお、「Ｃｔｒｌ」は、ＳＨＰ−１ ｓｉＲＮＡの代わりに、コントロール用ｓｉＲＮＡを形質導入したＢＭＭＣを用いたイムノブロッティング分析の結果を示す。
次に、ＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ-/-・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）またはＢＭＭＣ（ＷＴ・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）および実施例１Ｂで得られたアポトーシス細胞（ＢＭＭＣ：アポトーシス細胞＝１０：１（細胞数比））を、塩化カルシウム（１ｍＭ）およびＬＰＳ（リポポリサッカリド）（１μｇ／ｍＬ）含むＲＰＭＩ中で４時間インキュベートした後、実施例３Ｂと同様にして、ＴＮＦ−αの放出量を測定した（結果：図７Ｆ）。
図７Ｆ（左グラフ）に示されるように、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣは野生型マウス由来のＢＭＭＣよりも有意にＴＮＦ−αを産生した。一方で、図７Ｆ（右グラフ）に示されるように、野生マウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣは、ＳＨＰ−１ ｓｉＲＮＡが形質導入された場合、野生由来ＢＭＭＣもＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来ＢＭＭＣも、ＴＮＦ−αの放出量は同程度であり、両者に有意な差異は見られなかった。
これらの結果は、ＰＳがＣＤ３００ａに結合すると、ＣＤ３００ａはＳＨＰ−１を誘導して、ＢＭＭＣの活性化抑制シグナルを介在し、結果として、ＴＮＦ−αの分泌の抑制をすることを示唆している。
実施例３の結果から、ＰＳとＣＤ３００ａとの相互作用は、ＢＭＭＣから炎症誘発性の（ＬＰＳ誘導性の）サイトカインおよびケモカインの産生を阻害すること、およびこの相互作用はＳＨＰ−１をリクルートして、ＴＮＦ−αの分泌の抑制をすることが理解される。
［実施例４：ＣＤ３００ａの機能解析（３）］
マスト細胞が産生するＴＮＦ−α、ＩＬ−３およびＭＣＰ−１は、好中球の化学誘引物質であり、ＣＬＰ腹膜炎マウスにおいて、細菌クリアランスに重要な役割を果たすことが知られている（下記文献１５〜１９）。
そこで、ＣＤ３００ａが細菌クリアランス機能を有するか否かを検討するために、下記実施例４Ａ〜４Ｈを行った。
［実施例４Ａ］
野生型マウスの盲腸（腹側域）上において、１〜２ｃｍの正中線切開を実施し、その末端部を結紮した。次いで、結紮部位において、２７ゲージ針を用いて２回穿刺した後、該盲腸を腹部に戻し、無菌食塩水１ｍＬを皮下注射して補水した後、切開部を縫合して切開部分を閉じた。なお、上記のＣＬＰの詳細内容・条件は、下記文献１６に記載されている。
ＣＬＰの実施前またはＣＬＰの実施後４時間目において、腹膜灌流液を採取した。次いで、該腹膜灌流液にＡＰＣ結合型アネキシンＶ（１μｇ）およびＣＤ３００−Ｆｃ（１μｇ）を添加した後、ＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧおよびＰＩ（ヨウ化プロピジウム）で染色し、フローサイトメトリーで分析した（結果：図１２Ａ）。
図１２Ａは、下記文献２０に記載されているように、腹膜炎部位は、多数の細胞がアポトーシスに至る部位であることを確認できる結果となっている。
すなわち、ＣＤ３００ａは、膜炎部位のマスト細胞の免疫制御に影響を与えることが示唆される。
［実施例４Ｂ］
ＣＤ３００ａとマスト細胞の免疫制御との関係を検証すべく、以下のようにプロテオーム解析を行った。
まず、野生型マウスおよびマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）に、実施例４Ａと同様にしてＣＬＰを実施した。
ＣＬＰ実施から４時間経過後、各マウスの腹膜灌流液を採取して、採取された腹膜灌流液を、製造元の説明書に準拠して、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｒｒａｙ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてサイトカインおよびケモカインのプロテオーム解析に供した。
図９Ａは、野生型マウスおよびマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）の腹膜灌流液を用いたデンシトメトリー分析（プロテオーム分析）の結果を示す（図９Ａ中「ＰＣ」はポジティブコントロールを示す。）。
また、図９Ｂは、図９Ａで示される各シグナルをデンシトメトリー像から得られた、各ケモカインやサイトカインのシグナルのピクセル密度を示す。
図９Ｂに示されるように、ＣＬＰ後４時間目において、腹腔内のケモカインの濃度は、野生型マウスよりもｋｉｔW-sh/W-shマウスにおいて高いことが分かる。なお、本試験は、２回実施しても同様の結果が得られた。
［実施例４Ｃ］
実施例４Ｂと同様にして、野生型マウスおよびマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）から腹膜灌流液を採取した（各ｎ＝３）。
次いで、各腹膜灌流液から段階希釈液系列を調製し、調製された腹膜灌流液の各段階希釈液をプレーティングし、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天を含むプレート上で、３７℃、４８時間培養した。次いで、好気性細菌のＣＦＵを、下記文献２７に記載されているように、腹膜灌流液１ｍＬ中のコロニー数を計測して好気性細菌のＣＦＵを算出した（結果：図１０Ａ）。
また、各腹膜灌流液中の好中球およびマクロファージの細胞数も計測し、結果をそれぞれ図１０Ｂの「ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ」および「ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ」に示す。
さらに、野生型マウスまたはマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）からＢＭ由来マクロファージを調製した。これらのマクロファージ（細胞数：１Ｘ１０6）を、フルオレセイン標識化大腸菌を含むメディウム中で、２４穴プレートで１時間共培養し、フローサイトメトリーで大腸菌を貪食した各マクロファージの細胞数を測定し、貪食しているマクロファージの比率を算出した（結果：図１１「ＢＭ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ」）。
野生型マウスまたはマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）由来のＢＭ由来マクロファージの代わりに、野生型マウスまたはマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）由来のＰＥＣマクロファージを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、貪食しているマクロファージの比率を算出した（結果：図１１「ＰＥＣ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ」）。
図１０Ａに示されるように、ＣＬＰ後４時間目のマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）では、野生型マウスに比べて、腹腔内における細菌ＣＦＵが少なく、好中球の細胞数が多いことが分かる。対して、図１０Ｂおよび図１１に示されるように、マクロファージの細胞数および貪食作用は、両遺伝子型間で有意差が無いものであった。
［実施例４Ｄ］
ＣＤ３００ａが好中球の誘導（リクルート）に関与するか否かを検証するために、以下の実施例を行った。
マスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）に、野生型マウス由来のＢＭＭＣ（細胞数１Ｘ１０6）を含むＰＢＳ緩衝液を腹腔内注射で投与した（ｎ＝２０）。次いで、投与してから２８日間経過後、実施例４Ａと同様にしてＣＬＰを実施し、マウスの生存率を測定した（結果：図１２Ｂ「ＷＴ ＢＭＭＣｓ→ＫｉｔW-sh/ＫｉｔW-sh」）。
また、野生型マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、マウスの生存率を測定した（結果：図１２Ｂ「ＣＤ３００ａ-/- ＢＭＭＣｓ→ＫｉｔW-sh/ＫｉｔW-sh」）。なお、図１２Ｂにおける「ＫｉｔW-sh/ＫｉｔW-sh」は、ＢＭＭＣを投与しないで、ＣＬＰを実施したマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）の生存率を示す。
図１２Ｂによれば、ＣＬＰ後であっても、野生型マウス由来のＢＭＭＣが供されたマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）では、ＢＭＭＣを投与されなかった場合と比べて、高い生存率が示された。
しかしながら、ＣＬＰの後において、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣが供されたマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）では、野生型マウス由来のＢＭＭＣやＢＭＭＣが投与されなかったマウスと比べて、ＣＬＰ後であっても生存率が有意に高かったことが分かる（図１２Ｂ）。
さらに、ＣＬＰ後４時間目の上記各マウスの腹膜灌流液を用いて、実施例４Ｃと同様にして細菌のＣＦＵを測定したところ、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣが供されたマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）では、他のマウスに比べて、細菌クリアランスも大きいことが示された（結果：図１２Ｃ）。
［実施例４Ｅ］
ＢＭＭＣをマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）の腹腔内に投与することで、ＴＮＦ−αの放出量が増加するか否かを検証するために、以下の実施例を行った。
ＣＬＰの２４時間前において、マスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）の腹腔内に、ＣＦＳＥ標識化した混合ＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣ：野生マウス由来のＢＭＭＣ＝１：１（細胞数比））を腹腔内注射で投与した。
該混合ＢＭＭＣが注射されたマウスに実施例４Ａと同様にしてＣＬＰを実施し、ＣＬＰ後４時間目に、腹膜灌流液を採取した。該腹膜灌流液中に含まれる各ＢＭＭＣをフローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図１２Ｄ）。
図１２Ｄに示されるように、ＣＬＰから４時間後において、ＣＤ３００Ｄ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ-ＣＦＳＥ+細胞）は、野生型マウス由来のＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ+ＣＦＳＥ+細胞）よりも有意に大量のＴＮＦ−αを産生していることが分かる。
［実施例４Ｆ］
抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体（ＴＸ４１）を投与した場合、ＣＤ３００ａにおいてどのような影響があるのかを検証するために、以下のような実施例を行った。
まず、ＣＬＰの１時間前または１８時間前において、野生型マウスに、５００μｇの抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体（ＴＸ４１）（ｎ＝１３）を腹腔内注射したこと以外は、実施例４Ａと同様にしてＣＬＰを実施して、実施例４Ｄと同様にして、マウスの生存率を測定した（結果：図１２Ｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ＣＤ３００ａ」）。
また、コントロールとして、ＴＸ４１（ｎ＝１３）の代わりに、アイソタイプコントロール用抗体（ｎ＝１１）を用いたこと以外は上記試験条件と同様にして、マウスの生存率を測定した（結果：図１２Ｅ「Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ」）。
図１２Ｅに示されるように、ＣＬＰ実施の１時間または１８時間前において野生型マウスに腹腔内注射によってＴＸ４１を投与した後にＣＬＰを実施した場合、コントロール用抗体を投与した場合と比べて、生存期間が長くなることが分かった。
［実施例４Ｇ］
実施例４Ｆにおける、ＣＬＰ後４時間目の各マウスから腹膜灌流液を採取した。得られた腹膜灌流液を用いて、実施例４Ｃと同様にして、細菌ＣＦＵおよび好中球の細胞数を測定した（コントロール用抗体：ｎ＝５および、抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体：ｎ＝５）（それぞれ図１２Ｆおよび図１２Ｇ）。
なお、ＴＸ４１が腹腔内注射で投与されても、各マウスのマスト細胞を含めたミエロイド系細胞が欠損することはなかった。
図１２Ｆおよび図１２Ｇに示されるように、ＣＬＰ実施の１時間または１８時間前において野生型マウスに腹腔内注射によってＴＸ４１を投与した場合、腹腔内において、有意に好中球の細胞数は増加し、細菌クリアランスも向上した。
実施例４の結果から、ＰＳとＣＤ３００ａとの相互作用を、たとえばＴＸ４１などで阻止することで、腹膜炎誘発性の敗血症を予防できることが理解される。
なお、生理的状況下においては、多くの細胞がアポトーシスに至っている。ここで、アポトーシス細胞の取り込みには、ＰＳ受容体は中心的な役割を果たし、自己免疫疾患の進展を防ぐのに必須なものである（下記文献２２）。
一方で、微生物感染のような病理的状況では、顕著にアポトーシスによる細胞死が増加し、病原関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）に対する受容体（たとえばＴｏｌｌ様受容体）を介し、マスト細胞による炎症反応を引き起こすことが知られている（下記文献１５，２３および２４）。また、マスト細胞は、病原体に対する免疫反応において重要な役割を果たすことも知られている。
以上から、上記実施例における結果は、ＰＳが、数種類のＰＳ受容体を介して貪食細胞へ取り込みシグナルを提供することのみならず、今回新たな知見として得られたように、ＣＤ３００ａを介したマスト細胞による炎症反応を有効に抑制する効果を有することが理解できる。
したがって、ホスファチジルセリン結合性物質（ＭＦＧ−Ｅ８等）やＣＤ３００ａ結合性物質（ＣＤ３００ａに対する中和抗体等）が、ＰＳとマスト細胞におけるＣＤ３００ａとの相互作用を阻止して、マスト細胞を活性化させるまたは該活性を維持させることが理解される。
すなわち、これらの物質は、たとえばＬＰＳ誘発性の各種炎症性感染症（さらにはそれによる敗血症）の予防に用いられる免疫賦活化剤の有効成分として有用であることが理解できる。
また、ＰＳは、ＣＤ３００ａの活性シグナリングを抑制させてマスト細胞の活性化を抑制することから、たとえば、アレルギー疾患や自己免疫疾患における炎症反応を抑制して（たとえば、ヒスタミン等のケミカルメディエーターの放出を抑制して）、アレルギー疾患や自己免疫疾患の症状を緩和または治療する（過剰な免疫機能を抑制する）ために用いられる免疫抑制剤の有効成分として有用であることが理解できる。
＜喘息＞
(材料と方法)
(マウス)
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスはクレア日本社より購入した。ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス（ＣＤ３００ａ-/-マウス）は、当研究室で作成したＢａｌｂ／ｃのＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスと、購入したＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとを１２世代交配し、バッククロスを行うことにより得た。喘息の誘導開始時にはいずれも8-10週の雄または雌マウスを用いた。
（ＯＶＡ誘導喘息）
図１３Ａに、オボアルブミンで誘導喘息のプロトコールを示す。喘息誘導開始から０、７、１４日目に、１００μgのオボアルブミン(ＯＶＡ、鶏卵のアルブミン, シグマ社製)と１００μＬのアルミニウム水酸化物ゲル （ＡＬＵＭ、ＡＬｈｙｄｒｏｇｅｌ ２％， インビトロジェン社製）を混和したものを各マウスに腹腔内注射した。
また、喘息誘導開始から２１，２２，２３日目に、ＰＢＳで１０%に希釈したオボアルブミンを超音波ネブライザー（ＮＥ−Ｕ１７，Ｏｍｕｒｏｎ）で各マウスに３０分間吸入させた。そして、喘息誘導開始から２５日目に各マウスの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）と、各マウスから血清の回収を行った。
［実施例５Ａ］（図１３Ａ、図１３Ｂ）
（気管支肺胞洗浄ＢＡＬ）
マウスの気管を切開し、１ｍＬの２％ＦＢＳ／ＰＢＳで３回洗浄し、洗浄液を回収し、細胞数を測定した。図１３Ａおよび図１３Ｂに示すように、喘息誘導開始から２５日目の各マウスの肺胞洗浄液（ＢＡＬ液）中の細胞数は、総細胞数について、好酸球数についても、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの方がＷＴマウスよりも有意に少なかった。この結果は、ＣＤ３００ａが卵白アルブミン（ＯＶＡ）による好酸球性気道炎症を増悪させており、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは好酸球性気道炎症の症状が改善されることを示している。
［実施例５Ｂ］（肺胞洗浄液液中の細胞の解析）（図１３Ｃ）
回収した気管支肺胞洗浄液から１×１０6個の細胞をＣＤ４５.２−ＦＩＴＣ、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｆ−ＰＥ、ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣＣｙ７、ＣＤ１１ｃ−ＰＥＣＣｙ７、Ｆ４／８０−Ａｌｅｘａ（いずれも購入，ＢＤ）で染色し、 ＣＤ４５＋ＳｉｇｌｅｃＦ−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ−Ｆ４／８０−を好酸球分画としてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）にて解析した。
喘息誘導開始から２５日目のマウスの肺胞洗浄液中の細胞をＦＡＣＳ解析したところ、ＣＤ４５陽性細胞中の好酸球の割合（ＣＤ４５＋ＳｉｇｌｅｃＦ−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ−Ｆ４／８０−）を示した。ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスはＷＴマウスに比べ、有意にＢＡＬ液中の好酸球の浸潤割合が低かった。
［実施例５Ｃ］（血清ＩｇＥ値の測定）（図１４）
血清ＩｇＥの測定はラット抗マウスＩｇＥ（ＢＤ）とビオチン化抗マウスＩｇＥ（ＢＤ）を用いて、ＥＬＩＳＡ法にて測定した。
図１４に示すように、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスはオボアルブミンで誘導した喘息の感作の時期に、血清のＩｇＥ値を有意に低下させた。
ＯＶＡで誘導した喘息モデルの１４病日目のＷＴマウスで、各マウスの血清ＩｇＥ値を比較すると、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでは、ＷＴマウスに比べ有意に、アレルギーの程度を示す指標の血清ＩｇＥ値が低かった。
ＣＤ３００ａのシグナル伝達を抑制する抗ＣＤ３００ａ抗体を投与することにより、オボアルブミンにより誘導した喘息において、血清ＩｇＥが有意に抑制されると考えられる。
＜腸炎＞
（材料および方法）
（マウス）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＷＴマウス）はＣｌｅａより購入した。ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、当研究室でＢａｌｂ／ｃＡ由来ＥＳ細胞より樹立したものをＣ５７ＢＬ／６に戻し交配し、１２世代以降のマウスを使用した。
実験に用いたマウスは筑波大学生命科学動物資源センター内にて特定病原体未感作（ＳｐｅｃｉｆｉｃＰａｔｈｏｇｅｎ−Ｆｒｅｅ、ＳＰＦ）環境下で飼育した。
（腸炎の誘導）
１０〜１２週齢Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスにＤｅｘｔｒａｎ ＳｕｌｆａｔｅＳｏｄｉｕｍ Ｓａｌｔ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｇｒａｄｅ（ＤＳＳ，ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ（ＭＷ）= ３６０００〜５００００)を２．５％（ｗ／ｖ）８日間連続で飲水させ、腸炎を誘発した。
（抗体）
ＢＤ ビオチン抗ＣＤ３００ａ（ＴＸ４１）は当研究室で作製したものを使用した。
それ以外の下記抗体はＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅより購入した。
・精製した抗マウスＴＮＦ−α、
・ビオチン標識化抗マウスTNF-α、
・精製したマウスＩＬ−６、
・ビオチン標識化抗マウスＩＬ−６、
・精製した抗マウスＩＬ−１０、
・ビオチン標識化抗マウスＩＬ−１０、
・アロフィコシアニン−Ｃｙ７（ＡＰＣ−Ｃｙ７）標識化抗マウスＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、
・フィコエリトリン−Ｃｙ７（ＰＥ−Ｃｙ７）標識化抗マウスＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）、
・フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化抗マウスＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）
（大腸組織培養液）
ＤＳＳ又は水の投与後の９日後のマウスより大腸を摘出後、リン酸緩衝液で洗浄し、糞便を除去した。大腸を長軸に切開した後、肛門より３ｍｍの部分から３ｍｍ ずつ５つの組織片を切り出し、１０%ＦＢＳＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ社製)で１２時間培養後、その上清を回収したものを大腸組織培養液とした。培養液中に含まれるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０をサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて測定した。
（大腸粘膜固有層細胞の単離）
マウスを屠殺し、その大腸を採取した。まず、大腸をハサミで４ピースに切断し、リン酸緩衝液で洗浄し、糞便を取り除いた。残った組織を１ｍＭ ＤＴＴ／５ｍＭ ＭＥＤＴＡ／Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社製)に入れ、３７℃恒温槽（シェイカー式）で３０分間インキュベートした。
その後、組織を再びリン酸緩衝液で洗浄し、剥がれた上皮や夾雑物を取り除いた。残った組織をハサミで細切し、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ タイプ３（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製造）／０．１ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）／５%Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ／Ｈａｎｋｓ’ｓｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎに入れ、３７℃恒温槽（シェイカー式）で２時間インキュベートし、完全に融解させた。
細胞懸濁液を７０μｍのナイロンに通し、遠心した。得られた細胞を４０％Ｐｅｒｃｏｌｌに懸濁し、７０％Ｐｅｒｃｏｌｌの上に重層し、遠心後に得られる中間層の細胞を回収し、大腸粘膜固有層細胞としてフローサイトメトリー法に用いた。
（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞の単離）
単離した大腸粘膜固有層細胞をＡＰＣ−Ｃｙ７標識化抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＰＥ−Ｃｙ７標識化抗ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）およびＦＩＴＣ標識化抗マウスＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）で標識した。標識された細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ）にてソーティングし、それぞれＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞とした。
（ｍＲＮＡ量の測定）
ＦＡＣＳＡｒｉａにてソーティングした細胞をＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（ニッポンジーン）で融解した。融解した細胞からｍＲＮＡ抽出キットを用いてｍＲＮＡを抽出し、逆転写キットを用いてｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡを各種プライマー（配列表の配列番号１〜１６参照）及びＰｏｗｅｒ Ｃｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と混和し、７５００ＦａｓｔＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓ）を用いてｍＲＮＡ量を測定した。
[実施例６Ａ] 体重変化率（図１５）
２．５％（ｗ／ｖ）Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ（ＤＳＳ）をＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにそれぞれ８日間連続で飲水させ、腸炎を誘発し、体重を毎日測定した。
マウスは１０〜１２週齢のメスを用い、ＷＴマウスおよびＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスそれぞれ１５匹の体重変化率を観察した。スチューデントｔ検定を用いて有意差を求めた（**：ｐ＜０．０１、***：ｐ＜０．００１）。
図１５に示すように、２．５％ＤＳＳを飲水させて誘導した腸炎による体重減少は、ＭＡＩＲ−Ｉを有しないＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス（□）の方がＷＴマウス（●）と比較して体重減少が有意に軽度であった。
[実施例６Ｂ] 大腸の長さの測定（図１６Ａ）
ＤＳＳ投与６日目にＷＴマウスおよびＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスそれぞれ７匹ずつから大腸を採取し、肛門部より盲腸部までの長さを測定した。スチューデントt 検定を用いて有意差を求めた（**：ｐ＜０．０１）。
図１６Ａに示すように、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの大腸の方が長く、ＤＳＳで誘導した腸炎による大腸の萎縮は、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの方がＷＴマウスと比較して軽度であった。
[実施例６Ｃ] 大腸の長さの測定（図１６Ｂ）
同時に大腸の組織学的評価をおこなったところ、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスではＷＴマウスの大腸と比較して組織学的変化が軽度であることが観察された（図１６Ｂ）。
[実施例６Ｄ] 細胞障害活性測定（図１７）
ＤＳＳ投与６日目のＷＴマウスおよびＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの大腸組織をＨＥ (ヘマトキシリン・エオジン)染色にて染色後、スコア０〜５（０： 変化なし、１：陰窩（Ｃｒｙｐｔ）の肥大や構造変化、２：杯細胞の著しい減少、３：陰窩（Ｃｒｙｐｔ）は認められるが、ほとんど構造を保っていない、４：陰窩（Ｃｒｙｐｔ）の消失が認められるが、上皮の剥離は認められない、５：陰窩（Ｃｒｙｐｔ）の消失、上皮の剥離、著しい細胞浸潤が認められる)でスコアリングした。
ＷＴマウスおよびＣＤ３００a遺伝子欠損マウスの各７匹ずつの大腸について、それぞれを肛門側より強視野で１０区画撮影したものをスコア化し、スチューデントｔ検定を用いて有意差を求めた（***：ｐ＜０．００１）。その結果を図１７に示す。
図１７に示すように、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスではＤＳＳ腸炎による組織傷害が軽度であった。
[実施例６Ｅ] ＩＬ−１０の計測（図１８Ａ）
ＤＳＳもしくは水(コントロール群)を投与し、ＤＳＳ投与から９日後の各マウスより大腸を取り出し、リン酸緩衝液で洗浄後、肛門側より３ｍｍ3ピースに細切した。
細切した大腸の組織を１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）で１２時間培養後、その上清を回収し、その培養上清中をサンドイッチＥＬＩＳＡ法に供して各サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０）の蛋白量を測定した。スチューデントt 検定を用いて有意差を求めた（*：ｐ＜０．０５）。
図１８Ａに示すように、ＤＳＳ誘導で腸炎を起こした大腸組織において、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αは、ＷＴマウス、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスで差は見られなかったものの、ＩＬ−１０の産生がＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスで高値であることが明らかとなった（図１８Ａ）。
Ｍｒｅｇ細胞でＩＬ−１０が炎症性Ｔ細胞の活性化に必要な蛋白質のＣＤ８０やＣＤ８６の発現を抑制していることが知られている（下記文献３３）。
図１８Ａに示すように、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおいて、５％の有意差で、ＩＬ−１０の産生量が増加していることから、炎症性Ｔ細胞の増殖誘導を抑制して、炎症性Ｔ細胞の活性化を抑制し、腸管免疫系の恒常性維持に寄与すると考えられる。
[実施例６Ｆ] 各細胞数の計測（図１８Ｂ）
ＤＳＳ投与、０日目、２日目、４日目および６日目の各マウスについて、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび樹状細胞について細胞集団の変化を調べた。
その結果、図１８Ｂに示すように、ＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスで大腸に集まってくる細胞集団の数に違いは認められなかった。
[実施例６Ｇ] ＣＤ３００ａの発現解析（図１９）
大腸より単離した細胞をＡＰＣ-Ｃｙ７標識化ａｎｔｉＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＰＥ−Ｃｙ７標識化ａｎｔｉＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）、Ｂｉｏｔｉｎ−ａｎｔｉＣＤ３００ａ（ＴＸ４１）で染色した。ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ−分画、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ−分画、ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ＋分画、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋分画の細胞に関して、ＣＤ３００ａの発現をフローサイトメトリー法にて測定した。この結果を図１９に示す。
図１９に示すように、大腸粘膜固有層において、ＣＤ３００ａは特殊な細胞といえるＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞に発現していた。
[実施例６Ｈ] ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞における発現定量（図２０）
各マウスの大腸より単離したＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞をＦＡＣＳＡｒｉａにてソーティングした後、細胞よりｍＲＮＡを抽出した。抽出したｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、定量ＰＣＲ法にてＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６のｍＲＮＡ量を測定した。
その結果、図２０に示すように、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞では、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６のｍＲＮＡ量は、ＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスで差が認められなかった。
[実施例６Ｉ]ＣＤ４＋Ｔ細胞における発現定量（図２１）
ＤＳＳ投与した各マウスの大腸より単離したＣＤ４＋細胞をＦＡＣＳＡｒＡｉａにてソーティングした後、細胞よりｍＲＮＡ抽出した。抽出したｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、ＡＢＩ７５００ｆａｓｔを用いて、ＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦ-β、Ｔ−ｂeｔ、ＧＡＴＡ−３、ＲОＲγｔのｍＲＮＡ量を定量ＰＣＲ法にて測定した。スチューデントt 検定を用いて有意差を求めた（*：ｐ＜０．０５、**：ｐ＜０．０１）。
図２１に示すように、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−１０、Ｆｏｘｐ３、ＴｇｆβのｍＲＮＡ量がＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおいて高かった。
（考察）
実施例６Ａ〜６Ｉの結果から、ＤＳＳにより腸炎を誘導したマウスではＭＡＩＲ−Ｉが欠損すると、ＩＬ−１０等の抗炎症性の各種サイトカインが産生され（図２１）、腸炎の病態が改善される。
このことは、何らかの細胞集団の増加ではなく（図１８Ｂ）、ＣＤ１１ｂ陽性樹状細胞自身、もしくはこの樹状細胞がいずれかの細胞に働きかけてＩＬ―１０の産生を、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）を介して制御していると考えられる。
つまり、ＣＤ１１ｂ陽性樹状細胞を介したＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）のシグナル伝達を抑制、もしくは阻害することにより腸炎の病態が改善することが予測される。
＜アトピー性皮膚炎＞
ＣＤ３００ａがアトピー性皮膚にどのように関与しているのか、調べた。
以下、材料と方法、および各実施例を示す。
（実験動物）
Ｂａｌｂ／ｃマウスは、Ｃｌｅａ社から、購入し、承認された飼育舎条件下、発明者らの実験室で飼育した。本研究に用いたマウスのうち、８匹はＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）遺伝子欠損であり、他の８匹のマウスはＢａｌｂ／ｃ種の野生型（ＷＴ：Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）のマウスであった。実験期間中、各マウスは餌および水を自由に与えられ、通常の実験室条件で維持された。
（経皮感作）
各マウスに対し、イソフルラン（マイラン制約株式会社、大阪、日本）により穏やかに麻酔を行った後、電気シェーバーで背部の剃毛を行った。各マウスにつき背面皮膚の一箇所（１ｃｍ2）に、粘着性セロファンテープを用いて、少なくとも１０回テープストリッピングを行った。
１００μＬのリン酸緩衝食塩水中１００μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）をバンドエイド（登録商標）テープのガーゼに配置し、テープストリッピングを行った各群のマウスのうち５匹の体に貼り付けた。残りの３匹のマウスには、ＰＢＳをテープで貼り付けた。テープは、２日目に一度更新され、１週間、テープで毎日、ＯＶＡ感作を行った。
各マウスは、第２週にはＯＶＡ感作から開放した。第３週に、再度、上記と同じＯＶＡ感作に供した。第３週の終わりに、各マウスを犠牲にして、組織学とＥＬＩＳＡのためのサンプルを採取した。
（擦過行動数）
擦過行動数は、第１〜３週の各週の終わりに各マウスを注意深く観察することにより、３０分間カウントすることにより計測した。
（組織学）
組織学的観察のために、各マウスのＯＶＡ感作部位の皮膚を採取した。採取した全ての皮膚のサンプルを小さな組織ブロックにカットし、４％のパラホルムアルデヒドに４℃で２４時間浸漬した。
この固定化に続いて、脱水工程を行なった。その後、全ての皮膚のサンプルをドライアイス入の容器内のアセトン中で急速冷凍した。各サンプルは使用するまで−３０℃で保存した。
その後、凍結切片作製装置であるＣｏｌｄｔｏｍｅＨＭ５６０Ｅ（カールツァイス社製、イエナ、ドイツ）を用いて、皮膚のサンプルを４μｍ厚の切片にカットし、ニューシランＩＩＩ（武藤化学株式会社、東京、日本）でプレコートしたスライドグラスにのせた。
組織切片に対して、ヘマトキシリン・エオシン（サクラファインインデックジャパン株式会社製）で染色、並びにトルイジンブルー（サンタクルーズバイオテクノロジー社）で染色を行った。
組織初見の評価は、表皮厚（細胞層）、好酸球、単核細胞およびマスト細胞の浸潤、繊維芽細胞の過形成のレベルについて行った。
［実施例７Ａ］擦過行動数（図２２）
図２２に各マウスの３０分毎の擦過行動数を示す。そう痒症（発疹がないのに、かゆみだけがある疾患）は、アトピー性皮膚炎の一般的な条件である。したがって、ＯＶＡ感作時に擦過行動数を慎重に３０分間、それぞれの動物を観察することによってカウントし、これに基づいて評価している。
図２２に示すように、ＯＶＡ感作をしたＷＴマウス（◆）では、ＯＶＡ感作後に重度の擦過行動の状態を示し、擦過行動数はＯＶＡ感作をしたＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス（▲）よりも高かった、最も多い擦過行動数は、第４のＯＶＡ感作の終了時に観察された。
ＯＶＡ感作の間、ＷＴマウスにおいて最も高い擦過行動の症状が観察された（図２２）。擦過行動の症状が高度に発現することは、アトピー性皮膚炎の最も一般的な病理特徴の一つである。したがって、このことから、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）陽性細胞がアトピー性皮膚炎において重要な役割に関わっていることが明らかになる可能性がある。
［実施例７Ｂ］観察（図２３参照）
ＯＶＡ感作をした各マウスの皮膚について観察した。
図２３（Ａ）にＷＴマウスでＯＶＡ感作をしなかったマウスの皮膚を示す。オボアルブミン感作を行わなかったＷＴマウス未処理では、真皮で細胞浸潤は見られず、薄い表皮が観察される。なお、図２３の下側のパネルは、上段の矩形領域の拡大図を示している。また、太いバーの長さは、１０μｍを示す。
一方、図２３（Ｂ）に示すように、ＯＶＡ感作を行ったＷＴマウスの皮膚では、表皮の過形成と線維芽細胞の過形成が観察された。ＷＴマウスでオボアルブミンの感作を行ったマウスの皮膚の真皮で、好酸球（白抜矢印参照）と単核細胞の浸潤が明確に見られた。
図２３（Ｃ）に示すように、ＯＶＡ感作を行わなかったＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの表皮では、細胞浸潤が観察されず、図２３（Ａ）と同様に、薄い皮膚が観察された。
図２３（Ｄ）に示すように、ＯＶＡ感作後のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの皮膚では、驚くべきことに、表皮の厚さは増加したが、表皮の過形成は観察されなかった。さらに、その真皮では、細胞浸潤や線維芽細胞の過形成が認められなかった。
［実施例７Ｃ］マスト細胞染色（図２４参照）
図２４に示すように、すべてのマウスの皮膚サンプルでトルイジンブルー染色を行った。トルイジンブルー染色は、マスト細胞の細胞内顆粒を好適に染色する染色法である。
図２４の（Ａ）にＯＶＡ感作をしなかったＷＴマウスの皮膚を示す。図２４の（Ｂ）にＯＶＡ感作を行ったＷＴマウスの皮膚を示す。図２４の（Ｃ）にＯＶＡ感作をしなかったＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの皮膚を示す。図２４の（Ｄ）にＯＶＡ感作を行ったＷＴマウスの皮膚を示す。なお、染色されたマスト細胞が白抜矢印で示されている。
図２４に示すように、ＯＶＡ感作後、ＷＴマウスの皮膚でマスト細胞の数の増加が観察され、表皮もＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに比較してより厚くなった。
［実施例７Ｄ］細胞層数の計測（図２５Ａ）
すべてのマウスの皮膚サンプルで表皮内の細胞層数を計数した（図２５Ａ参照）。ＯＶＡ感作後、ＷＴマウスで最も多い細胞層数を示した。これに対して、ＯＶＡ感作を行ったＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでは、その半数以下であった。
［実施例７Ｅ］好酸球数とマスト細胞数の計測（図２５Ｂ）
図２５Ｂに示すように、全てのマウスの表皮サンプルで真皮内に浸潤したアトピー性皮膚炎の指標である好酸球数とマスト細胞数の計測を行った。オボアルブミン感作後のＷＴマウスの表皮で最も多い細胞数が観測された。
これに対して、ＯＶＡ感作をしたＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでは、好酸球数およびマスト細胞の増加がＷＴマウスのものより軽減された。ＯＶＡ感作の後、表皮過形成および過形成線維芽細胞が、ＷＴマウスにおいて最も高く発現した（図２３および図２５Ａ）。表皮および線維芽細胞の過形成は、いずれも、アトピー性皮膚炎のもう一つの主要な病理特徴である。
また、ＯＶＡ感作をしたＷＴマウスの皮膚では、好酸球，肥満細胞および単核細胞の浸潤が高く発現した（図２３〜図２５Ｂ）。浸潤した好酸球と過形成の繊維芽細胞との相互作用により、ＩＬ−３１が分泌される。このＩＬ−３１は、かゆみ惹起性サイトカインである（下記文献３４：Ｗｏｎｇ ＣＫら，２０１２）。
したがって、ＯＶＡ感作の後において、ＷＴマウスは、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスと比べて、アトピー性皮膚炎の特徴がより重度に表れる。
（免疫組織学）
連続皮膚切片上のＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）およびランゲリン抗原の検出を行うために、酵素免疫組織化学の１工程または２工程の方法を行った。まず、全ての切片を０．０５％Ｔｗｅｅｎ添加リン酸緩衝食塩水（ＴＰＢＳ，ｐＨ７．４）で３回すすいだ。その後、これらを冷無水メタノールおよび０．５％Ｈ2Ｏ2にそれぞれ３０分ずつ浸漬した。
ＴＰＢＳ中での洗浄の後、切片に対し、ブロッキング ワン Ｈｉｓｔｏ試薬（ナカライテスク株式会社，京都，日本）によるブロッキング処理を１０分間行い、ＴＰＢＳで洗浄した。皮膚切片を、抗ランゲリンヤギＩｇＧ（サンタクルーズバイオテクノロジー社，サンタクルーズ，カリフォルニア，米国）およびビオチン化抗ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）ラットＩｇＧ ２ａλ（発明者らの実験室で調製した。）の存在下で４℃にて１８時間培養し、ランゲリンの第２抗体としてビオチン化ロバ抗ヤギＩｇＧ存在下で室温にて１時間培養した。
最後に、これらを、ＤＡＢ／金属 濃縮物（サーモサイエンティフィック社，ウォルサム，マサチューセッツ，米国）の存在下で培養し、ヘマトキシリンで対比染色した。陰性対照切片については、第１抗血清に代えて、ＴＰＢＳまたはアイソタイプコントロール抗体の存在下で培養した。
［実施例７Ｆ］ランゲリン免疫染色（図２６）
各マウスの表皮について、免疫染色時の樹状細胞マーカーであるランゲリンについて、陽性であるか否かを調べた。ランゲリンは、ランゲルハンス細胞に発現するＣ型レクチンの１つであり，真皮樹状細胞の一部にも発現し、抗原認識と取り込み、細胞内の抗原輸送を担うバーベック顆粒（Ｂｉｒｂｅｃｋ ｇｒａｎｕｌｅｓ）の形成に関与する。
（結果）
図２６（Ａ）は、未処理（ＯＶＡ感作なし）のＷＴマウスの表皮を示す。図２６（Ｂ）は、ＯＶＡ感作をしたＷＴマウスの表皮を示す。図２６（Ｃ）は、未処理のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの表皮を示す。図２６（Ｄ）は、ＯＶＡ感作をしたＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの表皮を示す。なお、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、それぞれ上段の図面の矩形領域を拡大した図である。
ＯＶＡ感作後、ＷＴマウスの表皮で、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの表皮よりも有意により多くのランゲリン陽性細胞を示した。なお、矢印は、ランゲリン陽性細胞を示す。スケールバーは１０μｍを表す。
［実施例７Ｇ］ランゲリン免疫染色のカウンター染色（図２７）
ランゲリン抗体の免疫陽性をトルイジンブルーによるカウンター染色で評価した。ＷＴマウスの皮膚は、真皮内のランゲリン陽性細胞数の増加を示した。真皮では、いくつかのランゲリン陽性細胞はマスト細胞と相互作用していた。マスト細胞は紫色に染色されている。スケールバーは１０μｍを示す。
ランゲルハンス細胞および皮膚樹状細胞は、皮膚における主要な抗原提示細胞である。ランゲルハンス細胞はその細胞膜においてランゲリン抗原陽性であり、皮膚樹状細胞の中にも、ランゲリン抗原陽性のものが存在する（下記文献３５：Ｎａｋａｊｉｍａ Ｓ. ら，２０１２）。
皮膚ランゲリン陽性樹状細胞は、マスト細胞と相互作用し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化する（下記文献３６：Ｏｔｓｕｋａ Ａ. ら，２０１１）。ＯＶＡ感作モデルでは、皮膚中のマスト細胞（図２４および図２５Ｂ）およびランゲリン陽性細胞（図２６参照）の数は、ＯＶＡ感作の後のＷＴマウスの皮膚において大きく増加している（図２６白矢印対比参照）。
ＯＶＡ感作の後のＷＴマウスの皮膚においては、マスト細胞とランゲリン陽性皮膚細胞との相互作用が確認された（図２７）。
（考察）
したがって、このことから、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの皮膚と比べてＷＴマウスの皮膚においてアトピー性皮膚炎が重度に発現することを導き出すことができる。これらの結果から、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）がアトピー性皮膚炎において重要な働きを有していることが示唆される。
ＷＴ皮膚の真皮において、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）陽性細胞は、ＯＶＡ感作の後に大きく増加している（図２７）。この結果によって、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）陽性細胞がアトピー性皮膚炎において重要な働きをしていることが更に確認される。
（アトピー性皮膚炎の治療）
（抗ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）抗体での処置）
本実験では、６匹の７週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用した。図２９に示したプロトコールに従い、６動物のうち３動物については、抗ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）ラットＩｇＧ ２ａλ（ＴＸ４１）を静注し、残りの３動物については、ラットＩｇＧ ２ａλコントロール抗体（ＴＸ７４）を静注した。これらの抗体は、両方とも、発明者らの実験室で調製しチェックした。「ＴＸ７４」は、TX41のアイソタイプコントロール抗体であり、以下に示すように中和作用を有さない抗体である。抗体の稀釈は滅菌ＰＢＳを用いて行い、抗体濃度１６００μｇ／ｍＬにて１５０μＬを一度に注射した。
＜ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）抗体の注射によるＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）抗原のブロック＞
図２９に、Ｂａｌｂ／ｃＷＴマウスでＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）抗原をブロックする手順を示す。太い線は、ＯＶＡ感作の期間を示す。矢印は、各抗体の注射の日程を示す。
血清総ＩｇＥは感作をした各週の終わりに評価した。組織学的試料は、連続した感作の後に回収した。抗ラットＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）抗体ＩｇＧ２ａλ（ＴＸ４１）とそのアイソタイプであるコントロール抗体（ＴＸ７４）を静脈内注射に使用した。
（ＥＬＩＳＡ）
末梢血を、プレーン（ｐｌａｉｎ）のガラス製ヘマトクリット管（ドラモンド サイエンティフック カンパニー，ブルームオール，ペンシルバニア，米国）を用いて後眼窩洞 （ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｃａｖｉｔｙ）から採取し、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。
管をカットすることにより血清を集め、血清全体を、ＥＬＩＳＡに用いる前にブロッキング血清で稀釈した。ＥＬＩＳＡ実験は、米国カリフォルニアのＢＤバイオサイエンス社による全ＩｇＥについての標準的なプロトコールに従って行った。
［実施例７Ｈ］抗ＣＤ３００ａ抗体の免疫反応（受容体の存在確認）（図２８）
抗ＣＤ３００ａ抗体の免疫陽性を、各マウスの皮膚サンプルで評価した。図２８の（A）は、ＷＴマウスの表皮で非処理のものを示し、（Ｂ）は、ＷＴマウスでＯＶＡ感作の表皮を示す。
ＷＴマウスの表皮はＯＶＡ感作後に有意に免疫陽性の細胞を示した。ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの表皮は免疫陽性反応を示さなかった。（Ｂ）の矢印は、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）陽性の細胞を示す。また、スケールバーは１０μmを示す。
［実施例７Ｉ］ＣＤ３００ａ抗体の投与による治療（図３０）
（ＥＬＩＳＡ）
図２９に示すようにＷＴマウスに対して、それぞれＴＸ４１とＴＸ７４を上述した手順に従って投与し、アトピー性皮膚炎の指標であるＩｇＥ濃度を測定した。
図３０に、ＥＬＩＳＡ法により測定した血清総ＩｇＥ濃度を示す。ＯＶＡ感作後のＩｇＥ値は、ＴＸ４１を注射したマウスより、ＴＸ７４を注射したマウスの方が高かった。
［実施例７Ｊ］抗ＣＤ３００ａ抗体の投与による治療（図３１）
図３１に示すように、ＯＶＡ感作後、ＴＸ７４を注射したＷＴマウスは、ＴＸ４１を注射したＷＴマウスより高い擦過行動の症状を示した。
［実施例７Ｋ］Ｈ＆Ｅ染色（図３２）
図３２に示すように、実施例７Ｉの各ＷＴマウスの皮膚切片でＨ＆Ｅ染色を行った。ＯＶＡ感作後、ＴＸ７４を注射されたＷＴマウスの皮膚は、ＴＸ４１を注射されたＷＴマウスの皮膚よりも表皮の過形成および単核細胞の浸潤を示した。なお、図３２の各写真右下のスケールバーは１０μｍを示す。
［実施例７Ｌ］トルイジンブルー染色（図３３）
図３３に示すように、各ＷＴマウスの皮膚について、トルイジンブルー染色を行った。ＯＶＡ感作後、ＴＸ４１を注射したＷＴマウスよりも、ＴＸ７１を注射したＷＴマウスの皮膚の方が、相対的に多くのマスト細胞が観測された。図３２と同様に、スケールバーは１０μmを示す。
（考察）
全ＩｇＥおよび擦過行動数は、ＴＸ４１を注射されたマウスよりもＴＸ７４を注射されたマウスの方が高かった（図３０および図３１参照）。表皮厚、浸潤細胞数、線維芽細胞数および肥満細胞数もまた、ＴＸ４１を注射されたマウスよりもＴＸ７４を注射されたマウスの方が高かった（図３２および図３３参照）。
これらの結果から、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）がアトピー性皮膚炎において重要な働きを有していることがより一層確認され、抗ＣＤ３００ａ抗体であるＴＸ４１のアトピー性皮膚炎の治療薬としての効果が確認された。
＜セリアック病＞
セリアック病（ＣＤ）は、食餌グルテンタンパク質に対する免疫応答によって引き起こされ、進行性の腸炎である。グルテン由来のグリアジンペプチドに特異的な適応免疫応答は、セリアック病の進行に関与している。病因の根底にある自然免疫応答は完全には解明されていない。
ここでは、我々は、粘膜固有層のマクロファージ（粘膜固有層のマクロファージ）に発現している、骨髄関連免疫グロブリン様受容体ファミリーのメンバーであるＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）が、食餌グルテン誘発腸疾患の進行に調節的役割を果たしていることを実証する。
高グルテン食を与えているＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）が欠損したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、セリアック病様の病徴変化を示した。高グルテン食を与えている野生型（ＷＴ）マウスと比較して、軽度の体重増加、高い臨床スコア、多量のトランスグルタミナーゼ２、空腸の粘膜固有層のマクロファージの蓄積を示した。
高グルテン食を与えられたＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおける粘膜固有層のマクロファージは、高グルテン食を与えられたＷＴマウスと比較して、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＭＣＰ１およびＭＣＰ５を高発現した。
中毒性グリアジンペプチド（Ｐ３１−４３）の試験管内での刺激後に、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のマクロファージは、上記サイトカインをより強く発現した。
ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βの増強された発現は、ＭｙＤ８８欠損およびＴＲＩＦ欠損の各遺伝的背景を有するＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）のないＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のマクロファージで引き起こされた。
さらに、アポトーシス細胞上のＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）のリガンドであるホスファチジルセリンとＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）との結合の遮断は、ＷＴマウスの粘膜固有層のマクロファージでのサイトカイン産生を促進した。
総括すれば、これらの結果は、腸内の粘膜固有層のマクロファージとアポトーシス細胞上のＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）の相互作用が、ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦを介した抑制性のグリアジンシグナル伝達経路によってセリアック病の進行に保護的な役割を果たしていることを示している。
（材料と方法）
（マウス）
９〜１４週齢の雄であるＢａｌｂ／ｃ野生型（ＷＴ）マウスと、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）を有しないＢａｌｂ／ｃのＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの同腹子を用意し、正常食（ＮＤ）、高グルテン食（ＨＧＤ）、または無グルテン食（ＧＦＤ）を与える実験等に使用した。
試験管内での実験のために、Ｂａｌｂ／ｃＷＴマウスと、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）を有しないＢａｌｂ／ｃ又はＣ５７ＢＬ／６Ｂ６のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスとを、性別と年齢を一致させて用いた。ＭｙＤ８８遺伝子欠損Ｂ６マウスとＴＲＩＦ遺伝子欠損Ｂ６マウスは、オリエンタルバイオサイエンス（京都、日本）から購入した。すべてのマウスは、特定病原体フリーの条件下で飼育した。
（給餌試験）
ＷＴマウスとＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）マウスは、２％未満のグルテンを含む正常食の粉末（ＭＦ、オリエンタル酵母、東京、日本）（ＮＤ）で飼育した。また、ＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、ＭＦ中にグルテンの３０％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州）を含む高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育した。いくつかの実験では、マウスはＮＤのペレット（ＭＦ）および無グルテン食（ＧＦＤ；ＡＩＮ−７６Ａ、リサーチダイエット、ニューブランズウィック、ニュージャージー州）を給餌した。
（微生物叢の枯渇）
抗生物質による微生物叢の枯渇は、[下記文献３７]のように行った。微生物叢の枯渇は、ブレインハートインフュージョン培地のアガロースプレートを使用して個々のマウスから糞便中にプラーク形成単位の観察によって確認した。
（病理組織学的解析）
マウスの病理組織学的変化は後述する特定の週で、ＮＤ，ＨＧＤまたはＧＦＤを給餌した後に観察した。空腸および結腸の標本を単離してホルマリンで固定し、ヘマトキシリン-エオシンで染色した。
空腸における臨床スコアの基準は、[下記文献３８]に記載したように定義した。簡単に言えば、陰窩と絨毛の比のスコアを、陰窩と絨毛（０〜３点）の平均深さによって算出した。また、単核細胞浸潤のスコア（０〜３点）を絨毛固有層と陰窩の直径平均によって算出した。そして、最終的な臨床スコアを合計０〜６点として表した。
空腸の腸管上皮細胞（ＩＥＬ）における上皮内リンパ球数が計測され、腸管上皮細胞１００個当たりのＩＥＬ数として表した（[下記文献３９]）。空腸におけるトランスグルタミナーゼ2（ＴＧ２）の定量は、空腸の組織懸濁液を使用した。ＴＧ２−ＣｏｖＴｅｓｔ（Ｚｅｄｉｒａ、ダルムシュタット、ドイツ）をそのメーカーの手順書に従って行った。
（グリアジンに対するＩｇＧおよびＩｇＡ抗体力価測定）
マウスの血清中のグリアジンに対するＩｇＧおよびＩｇＡの抗体力価を酵素免疫測定法により決定した。これは、[下記文献４０]に記載されているものを、少し改変して行った。
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケア、リトルチャルフォント、イギリス）とＨＲＰで標識した抗マウスＩｇＡ抗体（サザンバイオテック、バーミンガム、アラバマ州）は、抗グリアジンＩｇＧおよびＩｇＡの検出抗体としてそれぞれ使用した。また、ＯＰＤ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を比色分析のＨＲＰの基質として使用した。
（粘膜固有層のマクロファージや樹状細胞の単離）
粘膜固有層のマクロファージ（ＬＰ Ｍφ）と樹状細胞（ＤＣ）の単離は、いくつかの変更を加えて、[下記文献４１]に沿って行った。
空腸は、腸間膜およびパイエル板を除去した後、小片に切り出し、２ｍＭＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と２０％ＦＣＳを含むＰＢＳ緩衝液で振とうしながら３７℃で１５分間、合計３回洗浄した。
残りの組織をホモジナイズし、タイプＶＩＩＩのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１．５ ｍｇ/ｍＬ、ＦＣＳを２０％で含むＰＢＳ緩衝液で、振とうしながら３７℃で２０分間消化した。
組織懸濁液中のＣＤ４５を発現している粘膜固有層のマクロファージと粘膜固有層の樹状細胞とを、ビオチン化抗マウスＣＤ４５（３０−Ｆ１１、ＢＤバイオサイエンス、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）とストレプトアビジン粒子プラスＩＭＡＧ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して濃縮した。
粘膜固有層のＣＤ４５発現細胞を、フルオレセインイソチオシアネート結合抗マウスのＣＤ１１ｂ（Ｍ１/７０）、フィコエリトリン結合のＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）、プロピジウムヨウ素、Ａｌｅｘａ６４７標識ＴＸ４１（抗マウスＣＤ３００ａ（抗マウスＭＡＩＲ−Ｉ）、ラットＩｇＧ２ａ）またはＡｌｅｘａ６４７標識ＴＸ７４（抗−ＦＬＡＧ、ＴＸ４１のアイソタイプコントロール）、ビオチン化抗マウスＣＤ４５およびストレプトアビジンアロフィコエリトリンＣｙ７（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−Ｃｙ７）で染色した。
なお、すべての蛍光標識抗体とストレプトアビジンアロフィコエリトリン−Ｃｙ７はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した。
ＣＤ４５＋ＰＩ−細胞の数でゲートされたＣＤ１１ｂ+ＣＤ１１ｃlow 細胞とＣＤ１１ｃ+細胞は、それぞれ、粘膜固有層のマクロファージおよび粘膜固有層の樹状細胞として、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して単離された。
フローサイトメトリーデータ解析の重要な原理は、不必要な粒子（死細胞および残渣など）を除きながら、目的の粒子を選択的に可視化することであり、この操作を、ゲーティング（ゲート）と呼ぶ。
（フローサイトメトリー解析）
ＣＤ４５+ＰＩ-である粘膜固有層の細胞におけるマクロファージ、ＣＤ１１ｂ+樹状細胞、およびＣＤ１１ｂ-樹状細胞がＣＤ１１ｂ+ＣＤ１１ｃlow, ＣＤ１１ｂ+ＣＤ１１ｃ+, およびＣＤ１１ｂ-ＣＤ１１ｃ+の細胞数によりそれぞれゲートされた。
上皮内リンパ球と腸管上皮細胞を2 ｍＭでＥＤＴＡ、２０％でＦＣＳを含むＰＢＳ緩衝液で空腸の小片を洗浄することにより得た。この懸濁液中の上皮内リンパ球と腸管上皮細胞は、ＣＤ４５+ＰＩ-細胞数と、ｃｄ４５-ＰＩ-細胞数によってそれぞれゲートした。
粘膜固有層のマクロファージ、ＣＤ１１ｂ+樹状細胞、ＣＤ１１ｂ-樹状細胞、上皮内リンパ球および腸上皮細胞におけるＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）の発現を、Ａｌｅｘａ６４７で標識したＴＸ４１（抗マウスＭＡＩＲ−Ｉ、ラットＩｇＧ２ａ）またはＡｌｅｘａ６４７で標識したＴＸ７４（ＴＸ４１の抗ＦＬＡＧ、アイソタイプコントロール）で解析した。
ホスファチジルセリン（ＰＳ）を表示するアポトーシス細胞について、アロフィコシアニン共役アネキシンVを用いて分析した。フローサイトメトリー解析をＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。
（定量的ＲＴ−ＰＣＴ法）
１００００〜２００００個の粘膜固有層のマクロファージと粘膜固有層の樹状細胞を中毒性グリアジンペプチドＰ３１−４３で刺激したものと、刺激しないものを、ＩｓｏｇｅｎＬＳ（ニッポンジーン、東京、日本）に再懸濁し、手順書に従って全ＲＮＡを単離した。
一本鎖ＤＮＡは、ｃＤＮＡの逆転写キット（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いて全ＲＮＡから合成した。使用した定量的逆転写酵素媒介ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ-ＲＴ−ＰＣＲ）用のプライマーセットはＰｒｉｍｅｒＢａｎｋによって設計した（ｈｔｔｐ：//ｐｇａ.ｍｇｈ.ｈａｒｖａｒｄ.ｅｄｕ/ｐｒｉｍｅｒｂａｎｋ/）[下記文献４２]。
Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲは、プラチナＳＹＢＲグリーンスーパーミックスＵＤＧ（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）、ＡＢＩ７５００ファスト（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。そのデータをＤＤＣＴ（ｄｅｌｔａ ｄｅｌｔａ ＣＴ）法により分析した。
この研究で試験された全遺伝子を発現するコントロールのサンプルは、リポ多糖刺激した脾臓細胞（１０００ｎｇ/ ｍＬで、６時間）から調製し、一本鎖ＤＮＡであった。各サンプルの遺伝子発現を示した試料と比較定量することにより表した。
（グリアジン刺激）
グルテンに由来する中毒性α-グリアジンペプチドＰ３１−４３ [下記文献４３]と、コントロールとしてのオボアルブミンペプチドＰ３２３−３３９とを、オペロンバイオテクノロジー（ハンツヴィル、アラバマ州）に依頼して合成した。
これらのペプチドの純度は９５％以上であり、０．００１未満のエンドトキシン単位／ｍＬで含まれている。このことは、カブトガニ色ＫＹテストワコー（和光純薬、大阪）を用いて確認した。
Ｂ６マウスから調製したチオグリコール酸誘発性腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）のマクロファージを、１００μｇ / ｍＬのグリアジンペプチドＰ３１−４３、または、オボアルブミンＰ３２３−３３９を用いて、[下記文献４４]に記載されているように刺激した。
ＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の粘膜固有層のマクロファージやＣＤ１１ｂ＋樹状細胞の１００００〜２００００個を、９６ウェル平底プレートのウェル内で、１０％ＦＣＳ、グルタミン／ストレプトマイシン/ペニシリン、ＨＥＰＥＳ、非必須アミノ酸を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
Ｂａｌｂ / ｃマウスまたはＢ６マウスの粘膜固有層のマクロファージを、それぞれ、１０時間または３時間、１００μｇ／ｍＬのグリアジンペプチドＰ３１−４３で刺激した。いくつかの実験において、粘膜固有層のマクロファージは、組換えマウスのＭＦＧ−Ｅ８（終濃度５μｇ／ｍＬ）を用いて４℃、３０分間処理し、または処理しないようにし、さらにグリアジンペプチドＰ３１−４３で、３７℃で３時間、刺激した。
（統計分析）
全ての統計分析は、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を用いて行った。 Ｐ＜０．０５を統計学的に有意であると考えた。
［実施例８Ａ］体重（ＢＷ）の変化（図３４）
ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）がセリアック病（ＣＤ）の進行に関与しているか否かを調べるために、Ｂａｌｂ／ｃのＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスまたは野生型（ＷＴ）マウスを2％未満のグルテン（ＮＤ）を含む正常食または３０％のグルテン（ＨＧＤ）を含む高グルテン食で飼育した。正常食または高グルテン食の給餌開始から、体重（ＢＷ）の変化をモニターした。
なお、「○」は、「ＷＴマウス正常食、ｎ＝７」、「●」は「ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス、正常食、ｎ＝９」、「□」は、「ＷＴマウス、高グルテン食、ｎ＝１０」そして、「■」は「ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス、高グルテン食、ｎ＝１４）」を示す。
高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＷＴマウス（図３４）よりも有意に少ない体重（ＢＷ）増加を示した。ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでは、高グルテン食を摂食した後にセリアック病様腸症が進行することが確認された。これらの結果は、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）は高グルテン食を摂食した後の空腸における腸疾患の進行に防御的な役割を果たしていることを示唆している。
［実施例８Ｂ］Ｈ＆Ｅ染色（図３５）
正常食または高グルテン食（ＨＧＤ）を摂食した後の、２０週目のマウスの腸の病理組織学的解析を行った。各マウスの空腸をホルマリンで固定し、ヘマトキシリン−エオシンで染色した。図３５に、各グループのマウスの代表的なデータを示す。
高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでは、高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＷＴマウスと比較して、空腸における腸疾患の進行していた（図３５参照）。
［実施例８Ｃ］上皮内リンパ球数（図３６、図３７）
上述した方法に従い、臨床スコアとマウスの空腸の腸上皮細胞（ＩＥＣ）１００個当たりの上皮内リンパ球（ＩＥＬ）の数について、正常食または高グルテン食を摂食した後、２０週の時点でカウントされた。なお、「*, **」は、それぞれ ｐ＜０．０５,０．０１を示す。
上述したように、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、空腸内の絨毛萎縮を示し（図３５）、また、有意に高い臨床スコアを示した（図３６参照）。また、ＦＤで飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスと同様に高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＷＴマウスと比較して、小腸の腸上皮細胞（ＩＥＣ）における上皮内リンパ球（ＩＥＬ）の増加を示した（図３７参照）。
［実施例８Ｄ］ＴＧ２−ＣｏｖＴｅｓｔ（特定ＴＧ２架橋活性の定量測定ための比色分析）（図３８）
トランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）の量は、腸の炎症の徴候であることが知られている。ＴＧ２は、セリアック病の進行の鍵となる酵素である。ＷＴマウスおよびＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスについて、少なくとも２０週間、正常食または高グルテン食を摂食した後の、各マウスの空腸の懸濁液中のトランスグルタミナーゼ２の量（ＴＧ２）をＴＧ２−ＣｏｖＴｅｓｔによって定量化した。
その結果、高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの腸内では、ＴＧ２の量が各マウスのグループの中で、最大であった（図３８参照）。
［実施例８Ｅ］フローサイトメトリー（図３９）
ＣＤ４５＋ＰＩ−細胞集団でゲートされた粘膜固有層の細胞のＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃの発現を、フローサイトメトリーによって分析した。正常食または高グルテン食を供給されたＢａｌｂ／ｃ種のＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層（ＬＰ）細胞をフローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ４５発現ＬＰ細胞は、Ｉ−Ｍａｇのテクノロジ（磁気ビーズを利用した細胞分離システム）を使用して濃縮した。
ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃlow細胞は粘膜固有層のマクロファージであり、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋およびＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ＋は粘膜固有層（ＬＰ）の樹状細胞(ＤＣ)である。
［実施例８Ｆ］免疫細胞の量的、質的な変化（図４０）
ＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの各マウスにおいて、粘膜固有層（ＬＰ）のマクロファージ（白抜）の頻度、粘膜固有層（ＬＰ）のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞（黒塗）の頻度、粘膜固有層（ＬＰ）のＣＤ１１ｂ−樹状細胞（網掛）の頻度を計測した。
すなわち、正常食（ＮＤ）と高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの空腸の粘膜固有層における免疫細胞の量的、質的な変化を調べた。
高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおけるＣＤ１１ｂ＋ ＣＤ１１ｃlowを発現する粘膜固有層のマクロファージ（ｌｐ Ｍf）の頻度は、高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＷＴマウスと正常食（ＮＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの両方のそれよりも有意に大きかった（それぞれ、図３９の右下パネルの５．８、左下パネルの２．３、右上パネルの２．２の細胞集団を対比して参照、図４０参照）。
腸内の粘膜固有層のマクロファージは、末梢血中でＣＣＲ２を発現する炎症性単球から分化したものである[下記文献４５]。
ＣＣＲ２がＭＣＰ１とＭＣＰ５の受容体であることを考慮すると、グリアジン刺激後に、粘膜固有層のマクロファージでの、これらのケモカインの発現上昇は、高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおける粘膜固有層のマクロファージの高い頻度と一致している（図４０参照）。
［実施例８Ｈ］サイトカインおよびケモカインの遺伝子発現量（図４１）
各マウスから単離された粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージにおける、サイトカインおよびケモカインの遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。なお、図４１において、各遺伝子発現量は、正常食のＷＴマウスのものを標準の「１」として、相対量で表されている。
高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のマクロファージは、炎症性サイトカイン（ＩＬ−６, ＩＬ−１５, ＴＮＦ−a，ＩＦＮ−bおよびＭＣＰ１）およびＭＣＰ５といったいくつかのケモカインについて、高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＷＴマウスのものと比較して、有意に高い量を示した（図４１参照）。
高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のマクロファージからの炎症性サイトカインおよびケモカインの発現増強は、各マウスで観察された腸疾患に起因していると考えられる。
また、興味深いことに、正常食（ＮＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のマクロファージは、ＮＤで飼育したＷＴマウスと比較して、ＩＬ−１５およびｐ１９を高発現した（図４８）。
［実施例８Ｉ］（図４２）
粘膜固有層細胞のマクロファージ、ＣＤ１１ｂ＋の樹状細胞、ＣＤ１１ｂ−の樹状細胞、腸上皮細胞および上皮内リンパ球におけるにおけるＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）の発現をフローサイトメトリーにより解析した。
ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）は、ＴＸ４１（抗ＭＡＩＲ−Ｉマウスモノクローナル抗体）を用いて検出した。なお、粘膜固有層細胞のマクロファージ（Ｍφ）、ＣＤ１１ｂ＋樹状細胞およびＣＤ１１ｂ−樹状細胞は、ＣＤ４５＋ＰＩ−の粘膜固有層の細胞数でゲートした。
上皮内リンパ球（ＩＥＬ）および腸上皮細胞（ＩＥＣ）は、ＣＤ３＋ＣＤ４５＋ＰＩ−およびＣＤ４５−ＰＩ−の分画（ｆｒａｃｔｉｏｎｓ)にそれぞれゲートした。
ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ ？ Ｉ）は、マクロファージ、顆粒球、マスト細胞と樹状細胞を含む骨髄細胞の大部分に発現する（[下記文献４６]）。
上述のように、発明者らは、粘膜固有層上のマクロファージ、粘膜固有層のＣＤ１１ｂ＋炎症性樹状細胞、ＣＤ１１ｂ−寛容原性の樹状細胞、腸管上皮細胞（ＩＥＬ）および腸上皮細胞（ＩＥＣ）、粘膜固有層のマクロファージについて、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）の発現を解析し、さらに、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）を発現した粘膜固有層のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞および粘膜固有層のＣＤ１１ｂ−樹状細胞の亜集団を調べた。その結果、腸管上皮細胞（ＩＥＬ）および腸上皮細胞（ＩＥＣ）では、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）を発現していなかった（図４２）。
［実施例８Ｊ］（図４３）
グリアジンペプチドの受容体が同定されていないが、以前の研究では、グリアジンＰ３１−４３ペプチドは初期エンドソームに蓄積し、それらの成熟を阻害することを報告している[下記文献４７、４８]。
粘膜固有層（ＬＰ）のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞をＢａｌｂ／ｃのＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスから単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで１０時間１００ｍｇ／ｍＬの中毒性グリアジンペプチドＰ３１−４３で刺激した。
グリアジン刺激後のＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層（ＬＰ）のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞のサイトカインやケモカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＭＣＰ１およびＭＣＰ５）の遺伝子発現量を定量的ＲＴ-ＰＣＲ法に解析した。なお、それら遺伝子の発現レベルは、相対的な量で表されており、非処理のＷＴマウスの遺伝子発現量を基準の「１」としている。
遺伝子発現量を調べた結果、グリアジンペプチドＰ３１−４３による刺激後、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のマクロファージは、ＷＴマウスの粘膜固有層のマクロファージと比較して、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＭＣＰ１、及びＭＣＰ５をより有意に高発現した（図４３）。
正常食（ＮＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層の炎症性のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞は、正常食（ＮＤ）で飼育したＷＴマウスと比較して、ＩＬ−１５を高発現した。
［実施例８Ｋ］グリアジン誘発性のサイトカイン発現の抑制（図４４）
発明者らは、組換えマウスＭＦＧ−Ｅ８タンパク質を添加することにより、粘膜固有層のマクロファージ上のＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）と、アポトーシス細胞に呈示されているホスファチジルセリン（ＰＳ）との間の相互作用を遮断できるか否かを検討した。
Ｂ６のＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の粘膜固有層細胞のマクロファージが、５ｍｇ／ｍＬのマウスＭＦＧ−Ｅ８を用いて、または用いないで前処理され、その後、中毒性グリアジンペプチドＰ３１−４３により試験管内で１０時間、刺激された。
その後、刺激したマクロファージのＩＬ−６, ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βの遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。遺伝子発現量は、非処理のＷＴマウスの遺伝子発現量を「１」として比較定量した。
その結果、非処理ＷＴマウスの粘膜固有層のマクロファージと比較して、ＭＦＧ−Ｅ８で処理したＷＴマウスの粘膜固有層のマクロファージは、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βの発現を有意に増強させた（図４４）。
これらの結果は、粘膜固有層のマクロファージ上のＣＤ３００ａ（ＭＡＩR−Ｉ）と、アポトーシス細胞上のホスファチジルセリンとの間の相互作用が， ＭｙＤ８８媒介およびＴＲＩＦ媒介のグリアジンシグナル伝達経路を抑制することで、栄養グルテンに対する過剰な炎症反応を調節することを示している。
これらの結果は、粘膜固有層のマクロファージ上のＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）とアポトーシス細胞上のホスファチジルセリンとの間の相互作用により、ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦを介したグリアジンシグナル伝達経路を抑制して、食餌グルテンに対する過剰な炎症反応を調節することを示唆している。
［実施例８Ｌ］（図４５）
正常食または高グルテン食を与えているＢａｌｂ／ｃのＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスについて大腸の病理組織学的解析を行った。
その結果、高グルテン食（ＨＧＤ）で飼育したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおける萎縮性変化は、腸では観察されなかった（図４５）。
［実施例８Ｍ］（図４６）
正常食または高グルテン食を与えているＢａｌｂ／ｃのＷＴまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の血清について、抗グリアジンＩｇＧおよびＩｇＡ抗体力価を上記方法に従って調べた。
図４６において、上段のパネルは各マウスのデータを表している。そして、下段のパネルは、その平均値を表している。
その結果、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、高グルテン食を摂食した後に腸症を示したが、グリアジンに対するＩｇＧおよびＩｇＡの力価の増加は認められなかった。
［実施例８Ｎ］病理学的分析（図４７）
無グルテン食を与えられたＷＴマウスおよびＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおける病理学的分析を行った。
Ｂａｌｂ／ｃのＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに無グルテン食を与えた。無グルテン食の給餌開始から、各マウスの体重（ＢＷ）の変化を経時的にモニターした。
その結果、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスはＷＴマウスに対して有意に低い体重増加率を示した。
［実施例８Ｏ］サイトカイン発現量（図４８）
ＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層（ＬＰ）における通常の状態でのＣＤ１１ｂ＋樹状細胞とマクロファージのサイトカイン発現量について調べた。
粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージをＢａｌｂ／ｃのＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスから単離し、ｐ１９の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。遺伝子発現量はＷＴマウスを「１」として相対定量で表した。
また、同様に、粘膜固有層（ＬＰ）のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞をＢａｌｂ／ｃマウスから単離し、ＩＬ−１５の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。発現レベルはＷＴマウスのものを「１」として相対定量で表された。
図４８に示すように、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、ＷＴマウスと比較して、ｐ１９およびＩＬ−１５の遺伝子発現量が有意に多かった。
［実施例８Ｐ］（図４９）
中毒性グリアジンペプチドＰ３１−４３で刺激した後のチオグリコール酸誘発性腹腔滲出細胞のマクロファージにおけるサイトカイン発現を調べた。
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおける粘膜固有層のマクロファージだけ高グルテン食（ＨＧＤ）の授乳後に炎症性サイトカインを大量に生産することを考え、発明者らは、グルテン由来中毒性グリアジンペプチドＰ３１−４３がマクロファージの炎症性サイトカインの発現を刺激するか否かを調べた。
チオグリコール酸誘発性腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）のマクロファージは、Ｂ６のＷＴマウスから調製した。そして、１００ｍｇ／ｍＬの中毒性グリアジンペプチドＰ３１−４３またはネガティブコントロール刺激としてのＯＶＡペプチドＰ３２３−３３９でｉｎ ｖｉｔｒｏで３時間刺激した。
刺激を受けた腹腔滲出細胞マクロファージにおけるＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βの遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。遺伝子の発現レベルはＯＶＡペプチドで感作をしたマクロファージを「１」として相対定量で表された。
グリアジンペプチドＰ３１−４３の刺激後、チオグリコール酸誘発性腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）のマクロファージは、コントロールのオボアルブミンＰ３２３−３３９ペプチドで感作・刺激したマクロファージと比較して、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−β、およびＩＦＮ−αを有意に高発現した（図４９）。
［実施例８Ｑ］（図５０）
ＣＤ１１ｂ＋樹状細胞をＢａｌｂ／ｃのＷＴマウスおよびＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスから単離し、１００ｍｇ／ｍＬ中毒性のグリアジンペプチドＰ３１−４３で１０時間、試験管内で刺激した。
刺激した粘膜固有層のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞におけるＩＬ−６, ＩＬ−１５, ＴＮＦ−α, ＩＦＮ−β, ＭＣＰ１およびＭＣＰ５の遺伝子発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。なお。遺伝子の発現レベルはＷＴマウスを「１」として相対定量で表した。
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞は、ＷＴマウスの粘膜固有層のＣＤ１１ｂ＋樹状細胞より、これらサイトカインＩＬ−６, ＩＬ−１５, ＴＮＦ−α, ＩＦＮ−βとＭＣＰ１をより多く発現した（図５０）。
［実施例８Ｒ］（図５１）
グリアジン刺激後のｂ６のＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージにおけるサイトカインやケモカイン発現について調べた。
ｂ６のＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージを１００ｍｇ／ｍＬの中毒性グリアジンペプチドＰ３１−４３によりｉｎ ｖｉｔｒｏで３時間、刺激した。
刺激した粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージのＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βの遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。遺伝子の発現量をＷＴマウスのものを「１」として相対定量で表した。
その結果、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のマクロファージは、ＷＴマウスのものより、ＩＬ−６，ＴＮＦ−α, ＩＦＮ−βを有意に高発現した（図５１）。
粘膜固有層のマクロファージのＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）とアポトーシス細胞上のホスファチジルセリンの間の相互作用は、ＭｙＤ８８を媒介およびＴＲＩＦ媒介としたグリアジンシグナル伝達経路を抑制した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでグリアジンペプチドＰ３１−４３で刺激した後、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のマクロファージは、炎症性サイトカインやＩ型ＩＦＮの両方を高度に発現した（図４３と図５１）。
これらの結果は、空腸内の粘膜固有層のマクロファージ上のＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）が、食餌グルテン由来の中毒性グリアジンペプチドＰ３１−４３に対する応答により増強された炎症性サイトカインおよびケモカインの発現を抑制することを実証している。
［実施例８Ｓ］（図５２）
微生物叢を枯渇させたＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージ（グリアジンに刺激したもの）におけるサイトカインやケモカイン発現を調べた。
抗生物質処理した、Ｂａｌｂ／ｃのＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスから粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージを単離し、１００ｍｇ／ｍＬの中毒性グリアジンペプチドＰ３１−４３によりｉｎ ｖｉｔｒｏで１０時間で刺激した。
刺激した粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージのＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＭＣＰ１およびＭＣＰ５の遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。遺伝子発現量はＷＴマウスのものを「１」として相対定量で表された。
グリアジンにＰ３１−４３で刺激したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの固有層のマクロファージにおけるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βの高発現は、ｂ６のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスだけでなく（図５１）、微生物叢を枯渇させたＢａｌｂ／ｃのＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでも観察された（図５２）。
［実施例８Ｔ］（図５３）
単離された粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージのホスファチジルセリン発現細胞の頻度を調べた。
ＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージをアネキシンＶで染色または染色せずに、ホスファチジルセリン発現している粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージを、ｃｄ４５＋ＰＩ−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃlowでゲートした集団集団について検出した。なお、アネキシンＶにより、アポトーシスによる細胞膜内のホスファチジルセリンの分布の変化を検出することができる。
発明者らは，ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）は新しいホスファチジルセリン（ＰＳ）の受容体であり、細菌に対する炎症反応を調節していることを実証した。単離した粘膜固有層のマクロファージは、アネキシンＶ＋細胞を１０％未満、含んでいた（図５３）。
［実施例８Ｕ］（図５４）
チオグリコール酸誘発性腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）のマクロファージをＷＴマウスから調製し、粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージは、ＷＴマウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスから単離した。
ＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層（ＬＰ）マクロファージにおけるαｖとβ３の各インテグリンサブユニットとホスファチジルセリン受容体の発現を調べた。
［実施例８Ｖ］（図５５）
これらのマクロファージ中のαｖβ３インテグリンとホスファチジルセリン受容体（ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、Ｓｔａｂｉｌｎ−２、ＳＲ−ＰＳＯＸ、ＢＡＩ１とＭＥＲ）の遺伝子発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。遺伝子の発現量は、ＷＴマウスのチオグリコール酸誘発性腹腔滲出細胞のマクロファージを「１」として相対定量で表された。
粘膜固有層のマクロファージ及びチオグリコール酸誘発性腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）のマクロファージでは、Ｔｉｍ−１を発現しなかった（図５４）。
ＰＳ受容体として知られているＴｉｍ−４, ｓｔａｂｉｌｉｎ−２, ＳＲ−ＰＳＯＸ, ＢＡＩ１およびＭａｒについても、ＷＴマウスの粘膜固有層のマクロファージとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層のマクロファージ間でそれほど有意な差がなかった（図５４、図５５）。
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本発明により、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制または亢進することのできる活性調節剤、当該活性調節剤を有効成分として含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達が関与する疾病または病状を治療または予防するための医薬品、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスのモデルマウス等としての使用、中和作用に優れた抗ＣＤ３００ａ抗体等が提供される。

Claims (6)

  1. ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質として、配列番号１９で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号２０で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗ヒトＣＤ３００ａ抗体を含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するための活性調節剤。
  2. ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質として、配列番号１７で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号１８で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗マウスＣＤ３００ａ抗体を含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するための活性調節剤。
  3. ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を亢進する物質としてホスファチジルセリンを含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進するための活性調節剤。
  4. ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する抗ＣＤ３００ａ抗体であって、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗ヒトＣＤ３００ａ抗体、または配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗マウスＣＤ３００ａ抗体、あるいは請求項１または２に記載の活性調節剤を含有し、アトピー性皮膚炎を治療するための医薬品。
  5. 配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗ヒトＣＤ３００ａ抗体。
  6. 配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗マウスＣＤ３００ａ抗体。
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