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JP6057920B2 - Ａａｄ−１植物を含む雑草の制御方法、ならびに植え替えおよび／または出芽前の除草剤の散布 - Google Patents

Ａａｄ−１植物を含む雑草の制御方法、ならびに植え替えおよび／または出芽前の除草剤の散布 Download PDF

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Description

ａａｄ−１遺伝子（スフィンゴビウム・ハービシドボランス（Sphingobium herbicidovorans）を起源とする）は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１）タンパク質をコードする。この形質は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸およびアリールオキシフェノキシプロピオネート（一般的に、キザロホップ（quizalofop）のような「ホップ（fop）」除草剤とよばれる）除草剤に対する耐性を与え、植物形質転換中および育種養樹場における選択マーカーとして用いることができる。ａａｄ−１遺伝子自体は、植物の除草剤耐性について、ＷＯ２００５／１０７４３７において最初に開示された（ＵＳ２００９−００９３３６６も参照されたい）。
植物における異種または外来の遺伝子の発現は、外来遺伝子が染色体のどこに挿入されるかにより影響される。このことは、例えば、クロマチン構造（例えばヘテロクロマチン）または組み込み部位に近い転写調節要素（例えばエンハンサー）の近接さを原因とし得る（Weisingら、Ann. Rev. Genet 22:421〜477、1988）。
同じ型のトランスジェニック植物（またはその他の生物）における同じ遺伝子は、異なるイベント間で広く多様な発現レベルを示すことができる。発現の空間的または時間的なパターンにおける違いも存在することがある。例えば、種々の植物組織における導入遺伝子の相対的発現における相違は、導入された遺伝子構築物に存在する転写調節要素から予測されるパターンに対応しないことがある。
よって、多数のイベントがしばしば創出され、ある目的のために満足できるレベルで対象の導入された遺伝子を発現するイベントを同定するためにスクリーニングされる。商業的な目的のために、数百〜数千の異なるイベントを生成して、これらのイベントを、所望の導入遺伝子発現レベルおよびパターンを有する単一のイベントについてスクリーニングすることが一般的である。導入遺伝子発現の所望のレベルおよび／またはパターンを有するイベントは、導入遺伝子を、他の遺伝子背景に、従来の育種方法を用いる有性外交雑により遺伝子移入するために有用である。このような交雑の子孫は、元の形質転換体に特徴的な導入遺伝子発現を維持する。この方策を用いて、局所的な成長条件によく適合するいくつかの品種において確実に信頼できる遺伝子発現が得られる。
米国特許出願公開第２００２０１２０９６４Ａ１号および第２００４０００９５０４Ａ１号は、ワタイベントＰＶ−ＧＨＧＴ０７（１４４５）ならびにそれを検出するための組成物および方法に関する。ＷＯ０２／１００１６３は、ワタイベントＭＯＮＩ５９８５ならびにそれを検出するための組成物および方法に関する。ＷＯ２００４／０１１６０１は、トウモロコシイベントＭＯＮ８６３植物ならびにそれを検出するための組成物および方法に関する。ＷＯ２００４／０７２２３５は、ワタイベントＭＯＮ８８９１３ならびにそれを検出するための組成物および方法に関する。
ＷＯ２００６／０９８９５２は、トウモロコシイベント３２７２に関する。ＷＯ２００７／１４２８４０は、トウモロコシイベントＭＩＲ１６２に関する。
米国特許第７，１７９，９６５号は、ｃｒｙ１Ｆイベントおよびｃｒｙ１Ａｃイベントを有するワタに関する。
本明細書に開示される特定のイベントを有するＡＡＤ−１トウモロコシは、以前に開示されていなかった。
主題の発明は、ＡＡＤ−１イベントを含む種子を植えつけた領域または野外への植えつけ前および／または出芽前の除草剤の散布を含む。いくつかの好ましい実施形態において、種子は、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９を含む。いくつかの好ましい実施形態において、除草剤は、２，４−Ｄ有効成分を含む処方であり得る。このような除草剤および処方は、植えつけ前の散布において用いることもできる。グリホサートのようなさらなる除草剤を、植えつけ前の散布を含む組み合わせにおいて用いることができる。
ｐＤＡＳ１７４０のプラスミド地図を示す。 ＤＡＳ−４０２７８−９（ｐＤＡＳ１７４０）についての挿入断片の要素を示す。 ＤＡＳ−４０２７８−９（ｐＤＡＳ１７４０）についての挿入断片の制限地図および要素を示す。 ＤＡＳ−４０２７８−９についてのＤＮＡ挿入断片および境界についてのアンプリコン、プライマーおよびクローニング方策を示す。 ＤＡＳ−４０２７８−９についての挿入断片および境界に関するプライマーの位置を示す。 ＤＡＳ−４０２７８−９についての接合部領域および挿入を示す。 実施例７で言及する育種ダイアグラムである。
主題の発明は、ＡＡＤ−１イベントを含む種子を植えつけた領域または野外への植えつけ前および／または出芽前の除草剤の散布を含む。いくつかの好ましい実施形態において、種子は、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９を含む。いくつかの好ましい実施形態において、除草剤は、２，４−Ｄ有効成分を含む処方であり得る。このような除草剤および処方は、植えつけ前の散布において用いることもできる。グリホサートのようなさらなる除草剤を、植えつけ前の散布を含む組み合わせにおいて用いることができる。主題の発明は、トウモロコシに限定されないが、例えばａａｄ−１遺伝子を含むワタおよび／またはダイズの使用を含むことができる。
本明細書に含まれる実施例は、部分的に、植えつけ前および／または出芽前の除草剤の散布に向けられる。このような使用は、「２７８」イベントに限定されない。播種作付け禁止期間の短縮に関して、主題のＡＡＤ−１遺伝子によりもたらされる耐性の有用性をさらに説明できる。このことにより、栽培者は、バーンダウンに対する植えつけの計画についてより大きい柔軟性が得られる。主題の発明を用いずに、バーンダウン後、植えつけ前に７〜３０日間程度待つことは、著しい収率の損失をもたらし得る。よって、主題の発明は、この点において利点をもたらす。例えば、実施例１３を参照されたい。本明細書で例示もしくは示唆するいずれの植えつけ／除草剤散布間隔および除草剤（複数可）のいずれの濃度範囲／使用割合も、主題の発明に従って用いることができる。
よって、主題の発明は、除草剤を散布する新規な方法を含む。このような散布は、１より多い除草剤のタンクミックスを含むことができる。主題の発明に従って用いるためのいくつかの好ましい除草剤は、２，４−Ｄ、２，４−ＤＢ、ＭＣＰＡ、ＭＣＰＢのようなフェノキシオーキシン除草剤を含む。これらは、１または複数の追加の除草剤耐性遺伝子（複数可）および対応する除草剤（例えばグリホサートおよび／またはグルフォシネート）と掛け合わせることができる。１、２、３以上の除草剤を、主題の開示の利益を有する当業者にとって明確な有利な組み合わせにおいて用いることができる。１または複数の主題の除草剤を、野外／領域に、主題の発明の種子を植えつける前に散布できる。このような散布は、植えつけの例えば１４日以内であり得る。１または複数の主題の除草剤を、植えつけ時および／または出芽前であるが、植えつけ後に散布することもできる。１または複数の主題の除草剤を、地面（雑草を制御するため）または主題の発明の雑草および／もしくはトランスジェニック植物の上から散布することもできる。主題の３つの除草剤は、交代でまたは組み合わせて用いて、例えば、１つの除草剤に対して耐性であるが、別のものに対しては耐性でない雑草を制御または防止できる。主題の３つの型の除草剤について様々な散布時期を、当該技術において知られるように様々な様式で用いることができる。
よって、主題の発明は、ＡＡＤ−１イベントを含む種子を後で植えつけた領域または野外への植えつけ前の除草剤の散布も含む。いくつかの好ましい実施形態において、種子は、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９を含む。いくつかの好ましい実施形態において、除草剤は、２，４−Ｄ有効成分を含む処方であり得る。このような除草剤および処方は、植えつけ前の散布において用いることができる。グリホサートのようなさらなる除草剤を、植えつけ前の散布において組み合わせて用いることができる。トウモロコシ、ワタおよびダイズは、例えば、このような実施形態のいずれにおいても用いることができる。
ａａｄ−１遺伝子は、例えば、グリホサート耐性（例えば耐性植物または細菌のＥＰＳＰＳ、ＧＯＸ、ＧＡＴ）、グルフォシネート耐性（例えばＰａｔ、ｂａｒ）、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）阻害除草剤耐性（例えばイミダゾリノン［例えばイマゼタピル］、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド、ピルミジニルチオベンゾエート（pyrmidinylthiobenzoates）およびその他の化学物質［Ｃｓｒ１、ＳｕｒＡら］）、ブロモキシニル耐性（例えばＢｘｎ）、ＨＰＰＤ（４−ヒドロキシフェニル−ピルベート−ジオキシゲナーゼ）酵素の阻害剤に対する耐性、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）の阻害剤に対する耐性、光化学系ＩＩ阻害除草剤に対する耐性（例えばｐｓｂＡ）、光化学系Ｉ阻害除草剤に対する耐性、プロトポルフィリノゲン酸化酵素ＩＸ（ＰＰＯ）阻害除草剤に対する耐性（例えばＰＰＯ−１）、フェニル尿素除草剤に対する耐性（例えばＣＹＰ７６Ｂ１）、ジカンバ分解酵素（例えばＵＳ２００３０１３５８７９を参照されたい）をコードする形質と組み合わせることができ、その他のものを単独または複数の組み合わせで掛け合わせて、雑草のシフトおよび／もしくは上記のクラスの任意の除草剤に対する耐性を効果的に制御または妨げる能力を提供できる。
さらなる除草剤に関して、いくつかの追加の好ましいＡＬＳ（ＡＨＡＳとしても知られる）阻害剤は、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド（例えばクロランスラム−メチル、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラムおよびペノキススラム）、ピリミジニルチオベンゾエート（例えばビスピリバックおよびピリチオバック）、およびフルカルバゾンを含む。いくつかの好ましいＨＰＰＤ阻害剤は、メソトリオン、イソキサフルトールおよびスルコトリオンを含む。いくつかの好ましいＰＰＯ阻害剤は、フルミクロラック、フルミオキサジン、フルフェンピル、ピラフルフェン、フルチアセット、ブタフェナシル、カルフェントラゾン、スルフェントラゾンおよびジフェニルエーテル（例えばアシフルオオルフェン、フォメサフェン、ラクトフェンおよびオキシフルオルフェン）を含む。
主題の発明に従って用いるためのＡＡＤ−１遺伝子は、フェノキシ酢酸オーキシン除草剤（例えば２，４−ＤＢ、ＭＣＰＢなど）に変換される化合物に対する耐性を与えることもできる。２，４−ＤＢ除草剤に存在する酪酸部分は、β酸化を介して、植物毒性の２，４−ジクロロフェノキシ酢酸に変換される。同様に、ＭＣＰＢは、β酸化を介して、植物毒性のＭＣＰＡに変換される。ブタン酸除草剤は、それら自体で非除草性である。これらは、感受性の植物内でβ酸化によりそれぞれの酸に変換され、植物毒性であるのは、除草剤の酢酸形である。迅速にβ酸化を行うことができない植物は、ブタン酸除草剤により害を受けない。しかし、迅速にβ酸化を行うことができ、ブタン酸除草剤を酢酸形に変換できる植物は、後でＡＡＤ−１により保護される。
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−１０２４４で寄託された種子を有する、ＤＡＳ−４０２７８−９とよばれるＡＡＤ−１トウモロコシイベント、およびそれに由来する子孫が本開示に含まれる。他の態様は、子孫植物、種子および穀粒または植物の再生可能な部分ならびにトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の種子および子孫、ならびにこれらのいずれかから作製される食品または飼料製品を含む。本開示は、それらに限定されないが、花粉、胚珠、花、苗条、根および葉ならびに栄養細胞、花粉細胞および卵細胞の核を含むトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の植物部分も含む。さらに、フェノキシオーキシン型および／またはアリールオキシアルカノエート除草剤に対する耐性を有するトウモロコシ植物、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の新規な遺伝子組成およびトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９を含むトウモロコシ植物の農業経済学的性能の態様が開示される。
トウモロコシ細胞のゲノム内の特定の部位に挿入された、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列を含むトウモロコシ植物におけるａａｄ−１形質転換イベントを含む、植物育種の方法および除草剤耐性植物が、本明細書に含まれる。
いくつかの実施形態において、前記イベント／ポリヌクレオチド配列は、例えばその他の除草剤耐性遺伝子（複数可）および／または昆虫阻害タンパク質を含むその他の形質と「掛け合わせる」ことができる。単一イベントを有する植物も本明細書に記載される。
追加の形質は、植物ゲノムに、植物育種、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有するトランスジェニック植物の再形質転換、または相同組換えによる標的組み込みによる新しい形質の追加により掛け合わせることができる。
他の実施形態は、例えばｐａｔ遺伝子発現カセットを含むトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９を含むポリヌクレオチド配列の切り出しを含む。ポリヌクレオチド配列の切り出しにより、改変されたイベントは、特定の染色体の部位に再び標的にされ、ここで、追加のポリヌクレオチド配列は、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９と掛け合わせることができる。
一実施形態は、２００８ＤＡＳトウモロコシ連鎖地図上のおよそ２０ｃＭにてＳＳＲマーカーＵＭＣ１２６５（配列番号３０および配列番号３１を参照されたい）とＭＭＣ０１１１（配列番号３２および配列番号３３を参照されたい）との間のおよそ２０ｃＭにて第２染色体上にあるトウモロコシ染色体標的部位であり、ここで、標的部位は異種核酸を含む。別の実施形態は、配列番号２９においてまたはそれにより規定される場所を含むトウモロコシ染色体標的部位と、当業者により認識される、本明細書に記載されるその残基である。
一実施形態は、２００８ＤＡＳトウモロコシ連鎖地図上のおよそ２０ｃＭにてＳＳＲマーカーＵＭＣ１２６５（配列番号３０および配列番号３１を参照されたい）とＭＭＣ０１１１（配列番号３２および配列番号３３を参照されたい）との間のおよそ２０ｃＭにて第２染色体上の位置に異種核酸を挿入するステップを含む、トランスジェニックトウモロコシ植物を作製する方法である。さらに別の実施形態において、挿入された異種核酸は、配列番号２９を参照して本明細書で規定される５’フランキング配列の全てまたは一部と５’にて接し、配列番号２９を参照して本明細書で規定される５’フランキング配列の全てまたは一部と３’にて接する。
さらに、（例えばトウモロコシ穀粒の）試料中の主題のイベントの存在を検出するためのアッセイが本明細書に開示される。アッセイは、組換え構築物の、トウモロコシゲノムに挿入された、挿入部位を挟むゲノム配列上のＤＮＡ配列に基づく。アッセイを実行するために有用なキットおよび条件も提供される。
ＡＡＤ−１挿入断片全体のＤＮＡ配列およびその境界領域（トランスジェニックトウモロコシ系統における）のクローニングおよび解析も本明細書に開示される。これらの配列は、ユニークである。これらの挿入断片および境界配列に基づいて、イベント特異的プライマーを作製した。ＰＣＲ解析は、これらのイベントが、これらのイベント特異的プライマーセットを用いて生じるＰＣＲアンプリコンの解析により同定できることを証明した。したがって、これらのおよびその他の関連する手順は、このイベントを含むトウモロコシ系統を独自に同定するために用いることができる。
本開示は、植物育種および除草剤耐性植物の使用を含む。本発明は、トウモロコシ細胞のゲノム内の特定の位置に挿入された、本明細書に記載される主題のａａｄ−１ポリヌクレオチド配列を含むトウモロコシ植物（メイズ）の形質転換イベントの新規な使用を含む。いくつかの実施形態において、上記のポリヌクレオチド配列は、例えばその他の除草剤耐性遺伝子（複数可）および／または昆虫阻害タンパク質をコードする遺伝子（複数可）のようなその他の形質と「掛け合わせる」ことができる。いくつかの実施形態において、上記のポリヌクレオチド配列は、切り出して、その後、追加のポリヌクレオチド配列を用いて再び標的にすることができる。しかし、主題の発明は、本明細書に記載されるように単一イベントを有する植物を含む。
さらに、本開示は、試料中の主題のイベントの存在を検出するためのアッセイを提供する。態様は、本明細書において例示されるかまたは示唆される任意の診断用核酸分子、特に主題のフランキング配列に全体的または部分的に基づくものを設計および／または生成する方法を含む。
より具体的には、主題の発明は、部分的に、トランスジェニックトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９（ｐＤＡＳ１７４０−２７８としても知られる）、これらのイベントを含む植物系統の使用、ならびにこの挿入断片および／またはその境界領域のＤＮＡ配列のクローニングおよび解析に関する。主題の発明に従って用いるための植物系統は、本明細書に開示され、示唆される配列を用いて検出できる。いくつかの実施形態において、本発明は、除草剤耐性トウモロコシ系統およびその同定に関する。主題の発明は、部分的に、有性交雑の子孫が対象のイベントを含有しているかを決定するために、主題のイベントの存在を検出することに関する。さらに、イベントを検出するための方法が含まれ、例えば、市場に出す前の承認および組換え作物植物に由来する食物のラベル付けが必要とされる規制を遵守するために役に立つ。主題のイベントの存在は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または核酸プローブを用いるＤＮＡハイブリダイゼーションのような任意の公知の核酸検出法により検出できる。イベント特異的ＰＣＲは、例えば、Windelsら（Med. Fac. Landbouww、Univ. Gent 64/5b:459462、1999）で論じられている。これは、挿入断片とフランキングＤＮＡとの間の接合部に及ぶプライマーセットを用いるＰＣＲによる、グリホサート耐性ダイズイベント４０−３−２の同定に関する。より具体的には、１つのプライマーは挿入断片からの配列を含み、第２プライマーはフランキングＤＮＡからの配列を含んだ。
トウモロコシを、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１）タンパク質をコードするスフィンゴビウム・ハービシドボランス（Sphingobium herbicidovorans）からのａａｄ−１遺伝子の挿入により改変した。この形質は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸およびアリールオキシフェノキシプロピオネート（一般的に、キザロホップのような「ホップ」除草剤とよばれる）除草剤に対する耐性を与え、植物形質転換中および育種養樹場における選択マーカーとして用いることができる。プラスミドｐＤＡＳ１７４０からのＤＮＡ断片でのトウモロコシの形質転換を育種により行って、イベントＤＡＳ−４０２７８−９を生成した。
イベントＤＡＳ−４０２７８−９の５つの世代に由来する２０の個別のトウモロコシ植物および世代ごとの４つの植物から抽出したゲノムＤＮＡ試料を、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の分子特徴決定のために選択した。ＡＡＤ−１タンパク質発現を、ＡＡＤ−１特異的迅速テストストリップキットを用いて試験した。ＡＡＤ−１タンパク質発現について陽性と試験された植物だけを、その後の分子特徴決定のために選択した。サザンハイブリダイゼーションにより、ａａｄ−１遺伝子が、ＡＡＤ−１タンパク質発現について陽性と試験されたトウモロコシ植物に存在し、ａａｄ−１遺伝子が、ａａｄ−１遺伝子プローブとハイブリダイズした場合にこれらの植物中に単一のインタクトなコピーとして挿入されたことが確認された。
ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９における挿入されたＤＮＡの分子特徴決定も、本明細書に記載される。イベントは、プラスミドｐＤＡＳ１７４０のＦｓｐＩ断片を用いるウィスカー形質転換により生成した。サザンブロット解析を用いて、挿入されたＤＮＡ断片の組み込みパターンを確立し、イベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるａａｄ−１遺伝子の挿入断片／コピーの数を決定した。データを作製して、トウモロコシゲノムに挿入されたａａｄ−１導入遺伝子の組み込みおよび完全性を証明した。プロモーターおよびターミネーターのような非コード領域（コード領域を調節するように設計された）、マトリクス付着領域ＲＢ７ Ｍａｒ ｖ３およびＲＢ７ Ｍａｒ ｖ４の組み込みの特徴決定、ならびに世代にわたる導入遺伝子挿入断片の安定性を評価した。挿入されたＤＮＡの安定性は、植物の５つの異なる世代にわたって証明された。さらに、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｐｒ）領域を含む形質転換プラスミド主鎖配列が存在しないことを、プラスミドｐＤＡＳ１７４０の制限部位（ＦｓｐＩ）に接する主鎖領域のほぼ全体をカバーするプローブにより証明した。挿入の詳細な物理的な地図は、イベントＤＡＳ−４０２７８−９のこれらのサザンブロット解析に基づいて描いた。
ＡＡＤ−１タンパク質のレベルを、トウモロコシ組織において決定した。さらに、トウモロコシのフォレージ（forage）および穀粒について組成解析を行って、同質遺伝子非形質転換トウモロコシ系統とトランスジェニックトウモロコシ系統ＤＡＳ−４０２７８−９との間の等価性を調べた（噴霧なし、２，４−Ｄを噴霧、キザロホップを噴霧および２，４−Ｄとキザロホップとを噴霧）。同質遺伝子非形質転換トウモロコシ系統の農業経済学的特徴も、ＤＡＳ−４０２７８−９トウモロコシと比較した。
非トランスジェニック対照とアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−１（ＡＡＤ−１）を含有するハイブリッドトウモロコシ系統との野外での発現、栄養組成および農業経済学的試行を、Ｉｏｗａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（２箇所）、Ｉｎｄｉａｎａ、ＮｅｂｒａｓｋａおよびＯｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａにある６つの現場で同じ年に行った。発現レベルは、本明細書において、葉、花粉、根、フォレージ、植物全体および穀粒におけるＡＡＤ−１タンパク質、農業経済学的決定の結果、ならびに対照およびＤＡＳ−４０２７８−９ ＡＡＤ−１トウモロコシからのフォレージおよび穀粒試料の組成解析についてまとめる。
可溶性の抽出可能なＡＡＤ−１タンパク質を、トウモロコシの葉、花粉、根、フォレージ、植物全体および穀粒において、定量的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を用いて測定した。良好な平均発現値が、本明細書により詳細に論じられるように、根および花粉組織において観察された。発現値は、全ての噴霧処理、ならびに２，４−Ｄおよびキザロホップ除草剤を噴霧したプロットおよび噴霧しなかったプロットについて同様であった。
近成組成、ミネラル、アミノ酸、脂肪酸、ビタミン、抗栄養素、および２次代謝産物を含む組成解析を行って、対照に対するＤＡＳ−４０２７８−９ ＡＡＤ−１トウモロコシ（除草剤処置ありまたはなし）の等価性を調べた。ＤＡＳ−４０２７８−９ ＡＡＤ−１組成試料についての結果は、全て、対照系統および／または従来のトウモロコシに基づいて、対照およびＤＡＳ−４０２７８−９ ＡＡＤ−１トウモロコシプロットから収集された農業経済学的データの解析と同様であったか、またはそれよりも良好であった（生物学的および農業経済学的に）。
上記の背景技術の部分で言及したように、植物ゲノムへの導入遺伝子の導入および組み込みは、いくつかのランダムなイベントを含む（よって、発現される所定の挿入についての名称「イベント」）。つまり、アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換、「遺伝子銃」およびウィスカーのような多くの形質転換技術を用いると、ゲノム中のどこに導入遺伝子が挿入されるかを予測できない。したがって、挿入断片の両側でのフランキング植物ゲノムＤＮＡを同定することは、所定の挿入イベントを有する植物を同定するために重要になり得る。例えば、挿入断片と宿主ゲノムとの接合部領域にわたるＰＣＲアンプリコンを生じるＰＣＲプライマーを設計できる。このＰＣＲアンプリコンを用いて、ユニークなまたは別個の型の挿入イベントを同定できる。
「イベント」は、もともとランダムなイベントであるので、この開示の一部分として、イベントを含むトウモロコシ系統の少なくとも２５００の種子は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１１０に寄託されており、制限なく一般に利用可能である（但し、特許権下にある）。この寄託は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２４４（イエローデントメイズハイブリッド種子（ゼア・メイズ エル．（Zea Mays L.））：ＤＡＳ−４０２７８−９；Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣのために寄託；ＡＴＴＣによる種子／株（複数可）の受領日：２００９年７月１０日；生存確認日は２００９年８月１７日）とよばれる。この寄託は、特許手続上の種子の寄託に関するブダペスト条約に従い、この条約の下で行われ、維持される。寄託は、公共の寄託機関であるＡＴＣＣ寄託機関にて、制限なく、３０年または直近の要請後５年、または特許の有効期間のいずれかより長い期間にわたって維持され、その期間中に生存しなくなった場合は置き換えられる。
寄託された種子は、主題の開示の一部である。明らかに、トウモロコシ植物は、これらの種子から成長でき、このような植物は、主題の発明の一部である。主題の発明は、これらの植物およびその子孫を検出するために有用なこれらのトウモロコシ植物に含まれるＤＮＡ配列にも関する。主題の発明の検出方法およびキットは、試験の最終目的に応じてこれらのイベントのいずれか１つ、２つまたは３つ全てでさえも同定するようにできる。
本明細書において、本発明を説明することを補助し、当業者が本発明を行う手引きとなるように定義および実施例が提供される。そうでないと記載しない限り、用語は、関連する技術分野の当業者による従来の慣例に従って理解される。３７ＣＦＲ§１．８２２に記載されるＤＮＡ塩基についての命名法を用いる。
本明細書で用いる場合、用語「子孫」は、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９を含む親の植物の任意の世代の子のことをいう。
トランスジェニック「イベント」は、植物細胞を異種ＤＮＡ、すなわち対象の導入遺伝子を含む核酸構築物で形質転換し、導入遺伝子を植物のゲノムに挿入することにより得られる植物の集団を再生し、特定のゲノムの場所への挿入を特徴とする特定の植物を選択することにより生成される。用語「イベント」は、元の形質転換体および異種ＤＮＡを含む形質転換体の子孫のことをいう。用語「イベント」は、形質転換体と、ゲノム／導入遺伝子ＤＮＡを含む別の品種との間の有性外交雑により作出される子孫のこともいう。反復親との繰り返しの戻し交雑の後でさえ、形質転換された親からの挿入された導入遺伝子ＤＮＡおよびフランキングゲノムＤＮＡ（ゲノム／導入遺伝子ＤＮＡ）は、交雑の子孫において、染色体上の同じ場所に存在する。用語「イベント」は、元の形質転換体、および挿入されたＤＮＡと、挿入されたＤＮＡを含む１つの親の系統（例えば元の形質転換体および自家生殖により得られる子孫）と挿入されたＤＮＡを含まない親の系統との有性交雑の結果としての対象の導入遺伝子を含む挿入されたＤＮＡを受ける子孫に伝達されると予測される挿入されたＤＮＡに直接隣接するフランキングゲノム配列とを含むその子孫からのＤＮＡのこともいう。
「接合部配列」は、ゲノムに挿入されたＤＮＡが、挿入点に接するトウモロコシの天然のゲノムからのＤＮＡと連結される点に及び、植物の遺伝子材料における一方または他方の接合部配列の同定または検出は、イベントに特徴的であるために十分である。本明細書に記載されるトウモロコシイベントにおける挿入と、類似の長さのフランキングＤＮＡとに及ぶＤＮＡ配列が含まれる。このような特徴的配列の具体的な例を本明細書に示す。しかし、挿入の接合部または挿入とゲノム配列との接合部とオーバーラップするその他の配列も特徴的であり、主題の発明に従って用いることができる。
主題の開示は、このようなフランキング配列、接合部配列および挿入断片配列の同定を含む。関連するＰＣＲプライマーおよびアンプリコンが、含まれる。挿入されたＤＮＡとその境界に及ぶアンプリコンを用いるＰＣＲ解析法を用いて、市場にあるトランスジェニックトウモロコシ品種または主題の所有権のあるトランスジェニックトウモロコシ系統に由来する系統を検出または同定することができる。
これらの挿入断片のそれぞれの配列全体を、それぞれのフランキング配列の部分と一緒に、本明細書において配列番号２９として示す。配列番号２９（全８５５７塩基対）に関するこのイベントについての挿入断片およびフランキング配列の座標を以下に記載する。このことは、例えば実施例３．８でより詳細に議論する。主題の発明の植えつけ前の実施形態は、配列番号２９の残基１８７４〜６６８９によりコードされるＡＡＤ−１タンパク質の使用を含む。
Figure 0006057920
この挿入イベントおよびそのさらなる要素を、図１および２にさらに示す。これらの配列（特にフランキング配列）は、ユニークである。これらの挿入断片配列および境界配列に基づいて、イベント特異的プライマーを作製した。ＰＣＲ解析により、これらのトウモロコシ系統が、異なるトウモロコシ遺伝子型において、これらのイベント特異的プライマーセットを用いて生じるＰＣＲアンプリコンの解析により同定できることが証明された。したがって、これらのおよびその他の関連する手順を用いて、これらのトウモロコシ系統を独自に同定できる。本明細書において同定される配列は、ユニークである。例えば、ＧＥＮＢＡＮＫデータベースに対するＢＬＡＳＴ検索は、クローニングされた境界配列と、データベース中の配列との間にいずれの著しい相同性も明らかにしなかった。
検出技術は、子孫において１または複数の追加の対象の形質を与えるための努力において対象のイベントを含む親の植物を別の植物系統と交雑させた後にどの子孫植物が所定のイベントを含むかを決定するために、植物育種と関連して特に有用である。これらのＰＣＲ解析法は、トウモロコシ育種プログラムならびに特に市場にあるトランスジェニックトウモロコシ種子についての品質管理に利益をもたらす。これらのトランスジェニックトウモロコシ系統についてのＰＣＲ検出キットも、今回、作製して用いることができる。このことも、製品の登録および製品の管理に利益をもたらし得る。
さらに、フランキングトウモロコシ／ゲノム配列を用いて、各挿入断片のゲノムでの場所を特異的に同定できる。この情報を用いて、各イベントに特異的な分子マーカーシステムを作製できる。これらは、育種方策を促進し、連鎖データを創出するために用いることができる。
さらに、フランキング配列情報を用いて、導入遺伝子組み込みプロセス、ゲノム組み込み部位の特徴、イベントの分類、導入遺伝子およびそれらのフランキング配列の安定性、ならびに遺伝子発現（特に遺伝子サイレンシング、導入遺伝子メチル化パターン、位置効果、およびＭＡＲＳ［マトリクス付着領域］などのような可能性のある発現関連要素に関する）を研究して特徴決定できる。
主題の開示は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２４４の下で利用可能な種子を含む。主題の発明は、受託番号ＰＴＡ−１０２４４の下でＡＴＣＣに寄託された種子から成長した除草剤耐性トウモロコシ植物の使用も含む。主題の発明は、葉のような上記の植物の一部分、組織試料、上記の植物により作出される種子、花粉などの使用をさらに含む。
さらに、主題の発明は、寄託された種子から成長した植物の子孫（descendant）および／または子孫（progeny）植物、好ましくは除草剤耐性トウモロコシ植物であって、上記の植物が、本明細書に記載される検出可能な野生型ゲノムＤＮＡ／挿入断片ＤＮＡ接合部配列を含むゲノムを有する植物の使用を含む。本明細書で用いる場合、用語「トウモロコシ」は、メイズ（ゼア・メイズ（Zea mays））を意味し、トウモロコシと育種できるその全ての品種を含む。
本発明は、主題の発明の植物を少なくとも一方の親として用いて交雑種を作製するプロセスも含むことができる。例えば、主題の発明は、本明細書に例示される植物のいずれかを一方または両方の親として有するＦ１ハイブリッド植物の使用を含む。主題の発明のこのようなＦ１ハイブリッドにより作出される種子の使用も、主題の発明に含まれる。本発明は、例示される植物を、異なる（例えば近交系の親）植物と交雑させ、得られるハイブリッド種子を収穫することによりＦ１ハイブリッド種子を作出する方法を含む。主題の発明は、雌性の親または雄性の親のいずれかである例示される植物の使用を含む。得られる植物の特徴は、親の植物を注意して考慮することにより改良できる。
除草剤耐性トウモロコシ植物は、本明細書で言及する系統のいずれか１つの種子から成長したトウモロコシ植物からなる第１の親のトウモロコシ植物と、第２の親のトウモロコシ植物とをまず有性交雑させ、それにより複数の第１子孫植物を作出し、次いで、除草剤に耐性がある第１子孫植物（または主題の発明のイベントの少なくとも１つを有するもの）を選択し、第１子孫植物を自家生殖し、それにより複数の第２子孫植物を作出し、次いで、第２子孫植物から、除草剤に耐性がある植物（または主題の発明のイベントの少なくとも１つを有するもの）を選択することにより育種できる。これらのステップは、第１子孫植物または第２子孫植物を、第２の親のトウモロコシ植物または第３の親のトウモロコシ植物と戻し交雑することをさらに含み得る。主題の発明のトウモロコシ種子を含むトウモロコシ作物またはその子孫を、次いで、植えることができる。
また、２つの異なるトランスジェニック植物を交配させて、２つの独立して分離した付加外因性遺伝子を含む子を作出することができることも理解されたい。適当な子孫の自家生殖は、両方の付加外因性遺伝子についてホモ接合の植物を作出できる。親の植物との戻し交雑および非トランスジェニック植物との外交雑も、栄養繁殖であるので、企図される。異なる形質および作物について一般的に用いられるその他の育種方法は、当該技術において知られている。戻し交雑育種は、単純に遺伝された高度に遺伝性の形質についての遺伝子を、反復親である所望のホモ接合の栽培変種または近交系統に伝達するために用いられている。伝達される形質の供給源は、ドナー親とよばれる。得られる植物は、反復親（例えば栽培変種）の属性と、ドナー親から伝達された所望の形質とを有すると予測される。最初の交雑の後に、ドナー親の表現型を有する個体を選択し、反復親と繰り返し交雑させる（戻し交雑）。得られる親は、反復親（例えば栽培変種）の属性と、ドナー親から伝達された所望の形質とを有すると予測される。
本明細書に開示されるＤＮＡ分子は、マーカー支援育種（ＭＡＢ）法において分子マーカーとして用いることができる。本発明のＤＮＡ分子は、当該技術において知られるように、遺伝子的に連結した農業経済学的に有用な形質を同定する方法において用いることができる（例えばＡＦＬＰマーカー、ＲＦＬＰマーカー、ＲＡＰＤマーカー、ＳＮＰおよびＳＳＲ）。除草剤耐性形質は、主題の発明のトウモロコシ植物との交雑の子孫（またはその子孫および任意のその他のトウモロコシ栽培変種または品種）において、ＭＡＢ法を用いて追跡できる。ＤＮＡ分子は、この形質についてのマーカーであり、当該技術において公知のＭＡＢ法を用いて、主題の発明の少なくとも１つのトウモロコシ系統またはその子孫は、親または祖先であったトウモロコシ植物における除草剤耐性形質（複数可）を追跡できる。本発明の方法を用いて、主題のイベントを有する任意のトウモロコシ品種を同定できる。
主題の発明の方法は、除草剤耐性トウモロコシ植物を作出する方法であって、主題の発明に用いるための植物を育種するステップを含む方法を含む。より具体的には、上記の方法は、主題の発明の２つの植物、または主題の発明の１つの植物と任意のその他の植物とを交雑するステップを含み得る。好ましい方法は、上記の交雑種の子孫を、主題の発明に従って検出可能なイベントについて上記の子孫を解析することにより選択するステップをさらに含む。例えば、主題の発明は、種々の実施例において本明細書で試験されるもののような農業経済学的形質のようなその他の所望の形質を含む植物との育種サイクル中に主題のイベントを追跡するために用いることができる。主題のイベントおよび所望の形質を含む植物は、例えば検出でき、同定でき、選択でき、さらなる回の育種において迅速に用いることができる。主題のイベント／形質は、昆虫耐性形質（複数可）および／またはさらなる除草剤耐性形質と育種により組み合わせ、主題の発明に従って追跡できる。後者のある好ましい実施形態は、除草剤ジカンバに対する耐性をコードする遺伝子と組み合わせた主題のイベントを含む植物である。
さらに、ＡＡＤ−１単独または１もしくは複数の追加のＨＴＣ形質を掛け合わせたものは、１または複数の追加の入力（例えば昆虫耐性、真菌耐性またはストレス耐性など）または出力（例えば収率の増加、油プロファイルの改善、繊維の質の改善など）形質と掛け合わせることができる。したがって、主題の発明を用いて、任意の数の農業経済学的害虫を柔軟にかつ経済的に効率よく制御する能力を有する、作物の質が改善された完全な農業経済学的パッケージを提供できる。
相同組換えにより植物細胞の特定の染色体部位内にポリヌクレオチド配列を組み込む方法は、当該技術において記載されている。例えば、米国特許出願公開第２００９／０１１１１８８Ａ１号に記載されるような部位特異的組み込みは、ドナーポリヌクレオチド配列の染色体標的への導入を媒介するためのリコンビナーゼまたはインテグラーゼの使用について記載する。さらに国際特許出願第ＷＯ２００８／０２１２０７号は、１または複数のドナーポリヌクレオチド配列を、ゲノムの特定の位置に組み込むためのジンクフィンガー媒介相同組換えについて記載している。米国特許第６７２０４７５号に記載されるＦＬＰ／ＦＲＴまたは米国特許第５６５８７７２号に記載されるＣＲＥ／ＬＯＸのようなリコンビナーゼの使用は、ポリヌクレオチド配列を特定の染色体部位に組み込むために利用できる。最後に、ドナーポリヌクレオチドを特定の染色体の場所を標的にさせるためのメガヌクレアーゼの使用は、Puchtaら、PNAS USA 93(1996)pp.5055〜5060に記載された。
植物細胞内の部位特異的組み込みのためのその他の種々の方法は、一般的に知られ、用いることができる（Kumarら、Trands in Plant Sci. 6(4)(2001)pp.155〜159）。さらに、いくつかの原核および下等真核生物で同定されている部位特異的組換え系を、植物で用いるために当てはめることができる。このような系の例は、それらに限定されないが、酵母ザイゴサッカロミセス・ロキシイ（Zygosaccharomyces rouxii）のｐＳＲ１プラスミドからのＲ／ＲＳリコンビナーゼ系（Arakiら(1985)J. Mol. Biol. 182:191〜203）およびファージＭｕのＧｉｎ／ｇｉｘ系（MaeserおよびKahlmann(1991)Mol. Gen. Genet. 230:170〜176）を含む。
本発明のいくつかの実施形態において、現存するトランスジェニックイベントの近傍において新しい導入遺伝子（複数可）を組み込むかまたは掛け合わせることが望ましいことがある。トランスジェニックイベントは、単一挿入部位、通常のメンデルの分離および安定な発現のような独自の特徴、ならびに除草剤耐性および複数の環境の場所における、そしてそれらにわたる農業経済学的性能を含む優れた効力の組み合わせに基づいて選択された好ましいゲノム遺伝子座と考えることができる。新しく組み込まれた導入遺伝子は、現存する形質転換体の導入遺伝子発現の特徴を維持する。さらに、新しく組み込まれたイベントの検出および確認のためのアッセイの開発は、新しく組み込まれたイベントのゲノムフランキング配列および染色体での場所が既に同定されているので、克服される。最後に、新しい導入遺伝子を、現存する導入遺伝子と連結された特定の染色体の場所に組み込むことは、導入遺伝子を、その他の遺伝子背景に、従来の育種方法を用いる有性外交雑により遺伝子移入することを促進する。
いくつかの実施形態において、トランスジェニックイベントからポリヌクレオチド配列を切り出すことが望ましいことがある。例えば、米国仮特許出願第６１／２９７，６２８号に記載されるような導入遺伝子の切り出しは、遺伝子発現カセットからなるポリヌクレオチド配列を、染色体に組み込まれたトランスジェニックイベントから除去するためのジンクフィンガーヌクレアーゼの使用について記載する。除去されるポリヌクレオチド配列は、選択マーカーであり得る。ポリヌクレオチド配列の切り出しおよび除去の際に、改変されたトランスジェニックイベントは、ポリヌクレオチド配列の挿入により再び標的にできる。ポリヌクレオチド配列の切り出しおよび改変されたトランスジェニックイベントのその後の再標的化は、選択マーカーの再使用または特定の遺伝子の発現に起因する植物トランスクリプトームへの意図しない変更を克服する能力のように、利点を提供する。
異種核酸の導入のために優れたトウモロコシゲノム中の第２染色体上の特定の部位が本明細書において開示される。第２染色体上の標的化部位の場所を同定するために有用な５’分子マーカー、３’分子マーカー、５’フランキング配列および３’フランキング配列も開示される。したがって、本開示は、対象の異種核酸を、この予め確立された標的部位またはこの標的部位の付近において導入するための方法を提供する。主題の発明は、開示される標的部位にてまたはそのような部位のほぼ付近において挿入された任意の異種ヌクレオチド配列を含むトウモロコシ種子および／またはトウモロコシ植物の使用も包含する。このような標的にされた組み込みを達成するためのある選択肢は、本明細書で例示するｐａｔ発現カセットを切り出し、かつ／またはその代わりに異なる挿入断片で置き換えることである。この一般的な点において、標的にされた相同組換えを、例えば、そして制限することなく、主題の発明に従って用いることができる。
本明細書で用いる場合、遺伝子、イベントまたは形質を「掛け合わせる」ことは、所望の形質を１つのトランスジェニック系統に組み合わせることである。植物育種家は、トランスジェニック形質を、それぞれが所望の形質を有する親同士の交雑種を作製し、次いでこれらの所望の形質の両方を有する子を同定することにより掛け合わせる。遺伝子を掛け合わせる別の方法は、２以上の遺伝子を、植物の細胞核に、形質転換中に同時に伝達することによる。遺伝子を掛け合わせる別の方法は、トランスジェニック植物を、対象の別の遺伝子で再形質転換することによる。例えば、遺伝子掛け合わせは、例えば２以上の異なる昆虫形質、昆虫耐性形質（複数可）および疾患耐性形質（複数可）、２以上の除草剤耐性形質、ならびに／または昆虫耐性形質（複数可）および除草剤耐性形質（複数可）を含む２以上の異なる形質を組み合わせるために用いることができる。対象の遺伝子に加えて選択マーカーを用いることは、遺伝子掛け合わせと考えることもできる。
「相同組換え」は、それにより２つのヌクレオチド配列が相互作用（組換え）して新しい組換えＤＮＡ配列を形成できる類似のヌクレオチド配列を含有する対応する部位を有するヌクレオチド配列の任意の対同士の反応のことをいう。類似のヌクレオチド配列の部位は、それぞれ、本明細書において、「相同配列」という。一般的に、相同組換えの頻度は、相同配列の長さが増加するにつれて増加する。したがって、相同組換えは、同一未満である２つのヌクレオチド配列間で生じ得るが、組換え頻度（または効率）は、２つの配列間の相違が増加するにつれて減少する。組換えは、ドナー分子および標的分子のそれぞれにある１つの相同配列を用いて達成され、それにより、「単一交差」組換え生成物が生じ得る。代わりに、２つの相同配列を、標的ヌクレオチド配列およびドナーヌクレオチド配列のそれぞれに配置できる。ドナー上の２つの相同配列と、標的上の２つの相同配列との組換えは、「二重交差」組換え生成物を生じる。ドナー分子上の相同配列が、操作される配列（例えば対象の配列）と接する場合、標的分子との二重交差組換えは、対象の配列が、標的分子上の相同配列の間にもともとあったＤＮＡ配列を置き換える組換え生成物をもたらす。標的とドナーとの間のＤＮＡ配列を二重交差組換えイベントにより交換することを、「配列置き換え」とよぶ。
主題のＡＡＤ−１酵素は、ほぼ全ての広葉雑草および禾本雑草を制御する除草剤の組み合わせに対する耐性をもたらすトランスジェニック発現を可能にする。ＡＡＤ−１は、例えばその他の除草剤耐性作物（ＨＴＣ）形質（例えばグリホサート耐性、グルフォシネート耐性、イミダゾリノン耐性、ブロモキシニル耐性など）および昆虫耐性形質（Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ３４／４５など）と掛け合わせるための優れたＨＴＣ形質として働くことができる。さらに、ＡＡＤ−１は、第２の遺伝子または遺伝子の群で遺伝子的に工学的に操作された植物の１次形質転換体の選択を助けるための選択マーカーとして働くことができる。
主題の発明のＨＴＣ形質は、その他のＨＴＣ形質（それに限定されないが、グリホサート耐性を含む）との新規な組み合わせにおいて用いることができる。形質のこれらの組み合わせにより、新しく獲得した耐性または除草剤（例えばグリホサート）に対する固有の耐性により、雑草（など）の種を制御する新規な方法が得られる。つまり、ＨＴＣ形質に加えて、除草剤を用いて雑草を制御するための新規な方法（除草剤耐性は、トランスジェニック作物における上記の酵素により確立された）は、本発明の範囲内である。
さらに、グリホサート耐性作物を世界的に成長させることが普及している。その他のグリホサート耐性作物との輪作が多数になると、グリホサート耐性の自生植物の制御は、輪作作物において困難になることがある。したがって、掛け合わされたかまたは作物に個別に形質転換された主題のトランスジェニック形質の使用は、その他のＨＴＣ自生作物の制御のためのツールを提供する。
主題の発明に用いるための好ましい植物または種子は、そのゲノムに、本明細書で同定される挿入配列を、本明細書で同定される挿入断片の両側の少なくとも２０〜５００またはそれより長い連続フランキングヌクレオチドとともに含む。そうでないと示さない限り、フランキング配列についての言及は、配列番号２９に関して同定されるもののことをいう（上記の表を参照されたい）。ここでもまた、配列番号２９は、元の形質転換体に挿入された異種ＤＮＡと、挿入されたＤＮＡに直接隣接する説明となるフランキングゲノム配列を含む。これらのフランキング配列の全てまたは一部分は、イベントを含む親の系統の有性交雑の結果として挿入されたＤＮＡを受ける子孫に伝達されると予測できる。
主題の発明は、主題の発明の植物の再生可能な細胞の組織培養物の使用を含む。このような組織培養から再生された植物の使用も含まれ、特に上記の植物は、例示される品種の全ての形態学的および生理的特性を発現できる。主題の発明に用いるための好ましい植物は、寄託された種子から成長した植物の全ての生理的および形態学的特徴を有することができる。本発明は、このような種子の子孫および対象の定性的形質を有する種子の使用をさらに含む。
植物もしくは種子またはその一部分の操作（例えば変異、さらなるトランスフェクションおよびさらなる育種）は、「従属」品種とよばれることがあるものの創出を導くことがある。植物新品種保護のための国際連合（ＵＰＯＶ）は、ある品種が保護された品種に従属するかを決定するための以下のガイドラインを提供している。
品種は、
（ｉ）それが、最初の品種に支配的に由来するか、またはそれ自体が最初の品種に支配的に由来する品種に由来するが、最初の品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせに起因する本質的な特徴の発現を保持し、
（ｉｉ）それが、最初の品種から明確に区別でき、
（ｉｉｉ）導出の働きに起因する相違を除いて、それが、最初の品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせに起因する必須の特徴の発現における最初の品種と同様になる
場合、別の品種（「最初の品種」）に従属するとみなされる。
ＵＰＯＶ、国際機関との第６回会議、ジュネーブ、１９９２年１０月３０日；連合の事務局により作製された文書。
本明細書で用いる場合、「系統」は、少なくとも１つの形質について個体間でほとんどまたは全く遺伝子的変動を示さない植物の群である。このような系統は、自家受粉および選択のいくつかの世代、または単一の親からの組織または細胞培養技術を用いる栄養繁殖により創出できる。
本明細書で用いる場合、用語「栽培変種」および「品種」は、同義であり、商業的な生産のために用いられる系統のことをいう。
「安定性」または「安定な」は、所定の要素に関して、その要素が世代から世代に維持され、好ましくは、少なくとも３世代にわたって実質的に同じレベル、例えば好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、最も好ましくは±５％維持されることを意味する。安定性は、植えつけの温度、場所、ストレスおよび時期により影響されることがある。野外条件下でのその後の世代の比較は、その要素を同様の様式で生成する。
「商用」は、良好な草勢および高い受精能を有して、作物が、従来の農業設備を用いて農業家により生産でき、記載される成分を有する油が、従来の粉砕および抽出装置を用いて種子から抽出できることと定義される。商業的に有用になるために、種子重量、油含量およびエーカーあたりに生産される全油により測定される収率は、同じ領域で成長した高い価値の形質を有さない、他の点では比較の商業的なカノーラ品種の平均収率の１５％以内である。
「農業経済学的にエリート」は、系統が、収率、成熟度、疾患耐性などのような所望の農業経済学的特徴を、主題のイベント（複数可）による昆虫耐性に加えて有することを意味する。以下の実施例に示すように、主題の発明のイベントを含む植物において個別または任意の組み合わせで考慮される農業経済学的形質は、主題の発明の範囲内である。これらの農業経済学的特徴およびデータ点のいずれかおよび全てを用いて、このような植物を規定するために用いる特徴の範囲における点として、または一端もしくは両端のいずれかとしてこのような植物を同定できる。
当業者は、本開示に鑑みて、例えば検出キットの好ましい実施形態が、「接合部配列」もしくは「移行部配列」（トウモロコシゲノムフランキング配列が挿入配列と出会うところ）に指向され、かつ／またはそれを含むプローブおよび／あるいはプライマーを含み得ることを認識する。例えば、これは、表１に示すような、一方もしくは両方の接合部配列（挿入断片がフランキング配列と出会うところ）を同定するように設計されたポリヌクレオチドプローブ、プライマーおよび／またはアンプリコンを含む。ある共通の設計は、フランキング領域でハイブリダイズする１つのプライマーと、挿入断片でハイブリダイズする１つのプライマーとを有することである。このようなプライマーは、それぞれ、しばしば、少なくとも約１５残基の長さである。この構成を用いて、プライマーは、主題の発明のイベントの存在を示す検出可能なアンプリコンを作製／増幅するために用いることができる。これらのプライマーを用いて、上記のように接合部配列に及ぶ（そしてそれを含む）アンプリコンを作製できる。
フランキング配列内で「つながる」プライマー（複数可）は、約２００塩基を超えてまたは接合部を超えてハイブリダイズするようには典型的に設計されない。つまり、典型的なフランキングプライマーは、挿入断片の始点からフランキング配列内に２００塩基以内のいずれかの鎖の少なくとも１５残基を含むように設計される。つまり、配列番号２９の残基約１６７４〜１８７３および／または約６６９０〜６８９０における適当なサイズの配列を含むプライマーは、主題の発明の範囲内である。挿入プライマーは、同様に、挿入断片上のいずれの場所でも設計できるが、例えば残基約１８７４〜２０７４および約６４８９〜６６８９は、このようなプライマー設計のために排他的でなく用いることができる。
当業者は、プライマーおよびプローブを、ある範囲の標準的なハイブリダイゼーションおよび／またはＰＣＲ条件の下で、配列番号２９（または相補鎖）のセグメントおよびその相補鎖とハイブリダイズするように設計でき、ここで、プライマーまたはプローブは、例示される配列と完全に相補的でないことも認識している。つまり、ある程度のミスマッチが許容できる。およそ２０ヌクレオチドのプライマーについて、例えば、典型的に、１または２などのヌクレオチドは、ミスマッチ塩基が内部にあるかまたはアンプリコンの反対にあるプライマーの末端にあるならば、反対の鎖と結合する必要はない。種々の適当なハイブリダイゼーション条件を、以下に示す。イノシンのような合成ヌクレオチド類似体もプローブに用いることができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブならびにＤＮＡおよびＲＮＡプローブも用いることができる。重要なことは、このようなプローブおよびプライマーは、主題の発明のイベントの存在について特徴的である（独自に同定して区別できる）ということである。
例えばマイナーな配列の誤りをもたらすと考えられるＰＣＲ増幅における誤りが生じ得ることに注意されたい。つまり、そうでないと記載しない限り、本明細書で列挙する配列は、トウモロコシゲノムＤＮＡから長いアンプリコンを作製し、次いで、アンプリコンをクローニングして配列決定することにより決定した。この様式で作製され決定された配列においてわずかな相違およびマイナーな不一致が見出されることは、ゲノムＤＮＡからの配列決定のために十分なアンプリコンを生じるために必要な多くの回の増幅に鑑みて、異常なことではない。当業者は、これらの型の一般的な配列決定の誤りまたは不一致により必要になるいずれの調整も、主題の発明の範囲内であることを認識し、そのように通知される。
例えば、配列をイベントの創出中に挿入する場合に、いくつかのゲノム配列が欠失されることは珍しくないことにも注意されたい。つまり、主題のフランキング配列と、例えばＧＥＮＢＡＮＫに列挙されたゲノム配列との間にもいくらかの相違が出現し得る。いくらかのこれらの相違（複数可）を、以下の実施例部分で論じる。プローブおよびプライマーへの調整は、しかるべく行うことができる。
よって、主題のフランキングおよび／または挿入配列といくらかの範囲の同一性を有するポリヌクレオチドを含む植物の使用は、主題の発明の範囲内である。本発明の配列の同一性は、本明細書で例示または記載する配列と、少なくとも６５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列であり得る。本明細書で示すハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション条件は、主題の発明のこのような植物およびポリヌクレオチド配列を定義するために用いることもできる。フランキング配列と挿入配列との配列は、寄託された種子を参照して確認できる。
「挿入断片」のそれぞれの要素を、図１および２に示し、以下の実施例においてより詳細に論じる。これらの要素またはその断片のＤＮＡポリヌクレオチド配列は、本発明の方法においてＤＮＡプライマーまたはプローブとして用いることができる。
いくつかの実施形態において、植物および種子などにおけるトウモロコシ植物からの導入遺伝子／ゲノム挿入領域の存在を検出するための組成物および方法が提供される。本明細書で示す主題の導入遺伝子／ゲノム挿入領域接合部配列（配列番号２９の残基１８７３〜１８７４と６６８９〜６６９０の間）、そのセグメントならびに例示される配列の相補鎖およびその任意のセグメントを含むＤＮＡ配列が提供される。挿入領域接合部配列は、ゲノムに挿入された異種ＤＮＡと、挿入部位に接するトウモロコシ細胞からのＤＮＡとの接合部に及ぶ。このような配列は、所定のイベントについて特徴的であり得る。
これらの挿入断片および境界配列に基づいて、イベント特異的プライマーを作製できる。ＰＣＲ解析は、主題の発明のトウモロコシ系統が、これらのイベント特異的プライマーセットを用いて生じるＰＣＲアンプリコンの解析により異なるトウモロコシ遺伝子型において同定できることを証明した。これらのおよびその他の関連する手順は、これらのトウモロコシ系統を独自に同定するために用いることができる。つまり、このようなプライマー対に由来するＰＣＲアンプリコンは、ユニークであり、これらのトウモロコシ系統を同定するために用いることができる。
いくつかの実施形態において、新規な導入遺伝子／ゲノム挿入領域の連続する断片を含むＤＮＡ配列は、本発明のある態様である。導入遺伝子挿入断片配列の十分な長さのポリヌクレオチドと、上記の３つのトウモロコシ植物の１もしくは複数からのトウモロコシゲノム配列の十分な長さのポリヌクレオチドとを含むＤＮＡ配列、および／またはこれらのトウモロコシ植物の１もしくは複数について特徴的なアンプリコン生成物の生成のためのプライマー配列として有用な配列が含まれる。
関連する実施形態は、本明細書で同定されるＤＮＡ配列（例えば配列番号２９およびそのセグメント）の導入遺伝子部分の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれより多くの連続ヌクレオチドを含むＤＮＡ配列、またはその相補鎖、およびこれらの配列からの同様の長さのフランキングトウモロコシＤＮＡ配列、またはその相補鎖に関する。このような配列は、ＤＮＡ増幅法においてＤＮＡプライマーとして有用である。これらのプライマーを用いて生成されるアンプリコンは、本明細書で言及する任意のトウモロコシイベントについて特徴的である。よって、本発明は、このようなＤＮＡプライマーおよび相同的プライマーにより生成されるアンプリコンも含む。
本発明は、本明細書で言及するトウモロコシイベントに対応するＤＮＡの存在を試料中で検出する方法も含むことができる。このような方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、これらのトウモロコシイベントの少なくとも１つからのＤＮＡとの核酸増幅反応で用いる場合に、上記のイベント（複数可）について特徴的であるアンプリコンを生成するプライマーセットと接触させるステップと、（ｂ）核酸増幅反応を行って、それによりアンプリコンを生成するステップと、（ｃ）アンプリコンを検出するステップとを含み得る。
さらなる検出方法は、上記のイベントの少なくとも１つに対応するＤＮＡの存在を試料中で検出する方法であって、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、上記のトウモロコシイベントの少なくとも１つからのＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、対照トウモロコシ植物（対象のイベントでないＤＮＡ）とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしないプローブと接触させるステップと、（ｂ）試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に供するステップと、（ｃ）ＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションを検出するステップとを含む方法を含むことができる。
いくつかの実施形態は、主題の発明のａａｄ−１イベントを含むトウモロコシ植物を作出する方法であって、（ａ）第１の親のトウモロコシ系統（上記の系統の植物に除草剤耐性を与える、本発明の発現カセットを含む）と、第２の親のトウモロコシ系統（この除草剤耐性形質を欠く）とを有性交雑させ、それにより複数の子孫植物を作出するステップと、（ｂ）分子マーカーを用いて子孫植物を選択するステップとを含む方法を含む。このような方法は、子孫植物を第２の親のトウモロコシ系統と戻し交雑して、上記の昆虫耐性形質を含む優良種トウモロコシ植物を作出するさらなるステップを所望により含み得る。
本発明の別の態様によると、上記の３つのイベントのいずれか１つ（または複数）との交雑種の子孫の接合状態を決定する方法が提供される。上記の方法は、トウモロコシＤＮＡを含む試料を主題の発明のプライマーセットと接触させるステップを含み得る。上記のプライマーは、上記のトウモロコシイベントの少なくとも１つからのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応において用いる場合、上記のトウモロコシイベントの少なくとも１つについて特徴的である第１アンプリコンを生成する。このような方法は、核酸増幅反応を行って、それにより第１アンプリコンを生成するステップと、第１アンプリコンを検出するステップと、トウモロコシＤＮＡを含む試料を上記のプライマーセット（上記のプライマーセットは、トウモロコシ植物からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応において用いる場合、トウモロコシゲノム領域に相同的な天然トウモロコシゲノムＤＮＡを含む第２アンプリコンを生成する）と接触させるステップと、核酸増幅反応を行って、それにより第２アンプリコンを生成するステップとをさらに含む。方法は、第２アンプリコンを検出するステップと、試料中の第１アンプリコンと第２アンプリコンとを比較するステップであって、両方のアンプリコンの存在が、試料が導入遺伝子挿入についてヘテロ接合性であることを示すステップとをさらに含む。
ＤＮＡ検出キットは、本明細書に開示される組成物およびＤＮＡ検出の技術分野において公知の方法を用いて開発できる。キットは、試料中の主題のトウモロコシイベントＤＮＡを同定するために有用であり、このＤＮＡを含有するトウモロコシ植物を育種する方法に用いることができる。キットは、例えば、本明細書に開示されるアンプリコンまたは主題のイベントの導入遺伝子遺伝要素に含まれるＤＮＡに相同もしくは相補的なＤＮＡ配列に相同または相補的なＤＮＡ配列を含有する。これらのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ増幅反応において、またはＤＮＡハイブリダイゼーション法におけるプローブとして用いることができる。キットは、検出法の実行のために必要な試薬および材料も含有してよい。
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子（例えば放射活性同位体、リガンド、化学発光剤または酵素）と結合した単離核酸分子である。このようなプローブは、本発明の場合は標的核酸の鎖、上記のトウモロコシイベントの１つからのゲノムＤＮＡの鎖（トウモロコシ植物からまたはイベントからのＤＮＡを含む試料からのいずれか）に相補的である。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、ポリアミドおよび標的ＤＮＡ配列と特異的に結合し、その標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために用いることができるその他のプローブ材料を含む。
「プライマー」は、相補的標的ＤＮＡ鎖に、核酸ハイブリダイゼーションによりアニールして、プライマーと標的ＤＮＡ鎖とのハイブリッドを形成し、次いで、標的ＤＮＡ鎖に沿って、ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼにより伸長される単離／合成核酸である。本発明のプライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはその他の従来の核酸増幅方法による、標的核酸配列の増幅のためのそれらの使用のことをいう。
プローブおよびプライマーは、一般的に、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００ポリヌクレオチドまたはそれより長い長さである。このようなプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的配列と特異的にハイブリダイズする。好ましくは、本発明によるプローブおよびプライマーは、標的配列と完全な配列類似性を有するが、標的配列と異なり、標的配列とハイブリダイズする能力を保持するプローブを、従来の方法により設計できる。
プローブおよびプライマーを調製して用いる方法は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、1〜3巻、Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989に記載されている。ＰＣＲプライマー対は、例えばその目的を意図するコンピュータプログラムを用いることにより既知の配列から導くことができる。
本明細書に開示されるフランキングＤＮＡ配列および挿入断片配列に基づくプライマーおよびプローブは、開示された配列を、従来の方法、例えば再クローニングおよびそのような配列の配列決定により確認する（必要であれば修正する）ために用いることができる。
本発明の核酸プローブおよびプライマーは、標的ＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅法を用いて、試料中のトランスジェニックイベントからのＤＮＡの存在を同定できる。核酸分子またはその断片は、あるいくつかの状況の下でその他の核酸分子と特異的にハイブリダイズできる。本明細書で用いる場合、２つの核酸分子は、２つの分子が逆平行２本鎖核酸構造を形成できるならば、互いに特異的にハイブリダイズできるという。核酸分子は、それらが完全な相補性を示すならば、別の核酸分子の「相補鎖」であるという。本明細書で用いる場合、分子は、一方の分子の全てのヌクレオチドが他方のヌクレオチドと相補的である場合に、「完全な相補性」を示すという。２つの分子は、それらが互いに、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件の下で互いにアニールしたままであることができるような十分な安定性で互いにハイブリダイズできるならば、「最小限に相補的」であるという。同様に、分子は、それらが互いに、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールしたままであることができるような十分な安定性で互いにハイブリダイズできるならば、「相補的」であるという。従来のストリンジェンシー条件は、Sambrookら、1989により記載されている。完全な相補性からの逸脱は、よって、そのような逸脱が、二本鎖構造を形成する分子の能力を完全に妨げない限りは、許容される。核酸分子がプライマーまたはプローブとして働くためには、採用する特定の溶媒および塩濃度下で安定な２本鎖構造を形成できる配列において十分に相補的であることだけが必要である。
本明細書で用いる場合、実質的に相同な配列は、高ストリンジェンシー条件の下で比較される核酸配列の相補鎖と特異的にハイブリダイズする核酸配列である。用語「ストリンジェント条件」は、Sambrookら、1989において9.52〜9.55で論じられる特定のハイブリダイゼーション手順による標的核酸（すなわち対象の具体的な核酸配列）との核酸プローブのハイブリダイゼーションに関して機能的に定義される。Sambrookら、1989の9.47〜9.52および9.56〜9.58も参照されたい。よって、本発明のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ断片の相補的なひと続きとの二重分子を選択的に形成するそれらの能力について用いることができる。
構想する用途に応じて、標的配列に対するプローブの多様な程度の選択性を達成するために、多様なハイブリダイゼーション条件を用いることができる。高い選択性が要求される用途のために、ハイブリッドを形成するために比較的ストリンジェントな条件を典型的に採用し、例えば、約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍ ＮａＣｌで約５０℃〜約７０℃の温度により与えられるような比較的低い塩および／または高い温度の条件を選択する。例えば、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーションフィルタを、高ストリンジェンシー洗浄バッファー（０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）で少なくとも２回洗浄することを含み得る。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシー条件、例えば、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で約４５℃、その後に２．０×ＳＳＣで５０℃での洗浄は、当業者に知られている、６．３．１〜６．３．６。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、約２．０×ＳＳＣで５０℃の低ストリンジェンシーから約０．２×ＳＳＣで５０℃の高ストリンジェンシーまで選択できる。さらに、洗浄ステップにおける温度は、室温、約２２℃の低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで増加できる。温度および塩はともに変動できるか、または温度もしくは塩濃度のいずれかを一定に保持しながら他方の変数を変化させてよい。このような選択的条件は、プローブと鋳型または標的鎖との間のミスマッチがあったとすればそれにほとんど耐えない。ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列の検出は当業者に公知であり、米国特許第４，９６５，１８８号および第５，１７６，９９５号の教示は、ハイブリダイゼーション分析の方法の例である。
いくつかの実施形態において、本発明に用いるための核酸は、相補鎖およびその断片を含む本明細書で例示または示唆されるプライマー（またはアンプリコンもしくはその他の配列）の１または複数と、高ストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズする。一態様において、本発明のマーカー核酸分子は、配列番号３〜１４に示す核酸配列またはその相補鎖および／もしくは断片を有する。
別の態様において、本発明のマーカー核酸分子は、このような核酸配列と、８０％と１００％の間または９０％と１００％の間の配列同一性を有する。さらなる態様において、本発明に用いるためのマーカー核酸分子は、このような配列と、９５％と１００％の間の配列同一性を有する。このような配列は、植物育種法においてマーカーとして用いて、遺伝的交雑種の子孫を同定できる。標的ＤＮＡ分子とのプローブのハイブリダイゼーションは、当業者に知られる任意の数の方法により検出でき、これらは、それらに限定されないが、蛍光タグ、放射活性タグ、抗体に基づくタグおよび化学発光タグを含み得る。
特定の増幅プライマー対を用いる標的核酸配列の増幅（例えばＰＣＲによる）に関して、「ストリンジェントな条件」は、プライマー対が、対応する野生型配列（またはその相補鎖）を有するプライマーが結合し、好ましくはユニーク増幅産物であるアンプリコンを生成する標的核酸配列のみとハイブリダイズすることを許容する条件である。
用語「（標的配列）に特異的」は、プローブまたはプライマーが、標的配列を含む試料において標的配列のみとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを示す。
本明細書で用いる場合、「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリコン」は、核酸鋳型の一部分である標的核酸配列の核酸増幅の生成物のことをいう。例えば、有性交雑に起因するトウモロコシ植物が本発明のトウモロコシ植物からのトランスジェニックイベントゲノムＤＮＡを含有するかを決定するために、トウモロコシ植物組織試料から抽出されるＤＮＡを、挿入された異種ＤＮＡの挿入部位に隣接する植物のゲノムにおけるフランキング配列に由来するプライマーと、挿入された異種ＤＮＡに由来する第２プライマーとを含むプライマー対を用いて、イベントＤＮＡの存在について特徴的であるアンプリコンを生成する核酸増幅法に供することができる。アンプリコンは、ある長さのものであり、これもまたイベントについて特徴的である配列を有する。アンプリコンは、プライマー対＋１ヌクレオチド塩基対の組み合わさった長さから、および／またはプライマー対＋約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、もしくは５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、もしくはそれより多くのヌクレオチド塩基対（＋または−上で列挙する任意の増分）の組み合わさった長さの範囲であり得る。代わりに、プライマー対は、挿入ヌクレオチド配列全体を含むアンプリコンを生成するように、挿入されたＤＮＡの両側のフランキング配列に由来できる。植物ゲノム配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入されたＤＮＡ配列からのある距離に位置し得る。この距離は、１ヌクレオチド塩基対から約２万ヌクレオチド塩基対までの範囲であり得る。用語「アンプリコン」の使用は、ＤＮＡ熱増幅反応において形成されることがあるプライマーダイマーを特に除く。
核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む当該技術において知られる種々の核酸増幅法のいずれによっても達成できる。種々の増幅法は当該技術において知られており、なかでも、米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号に記載されている。ＰＣＲ増幅法は、２２ｋｂまでのゲノムＤＮＡを増幅するために開発されている。これらの方法およびＤＮＡ増幅の技術分野において知られるその他の方法を、本発明の実行において用いてよい。異種導入遺伝子ＤＮＡ挿入断片の配列または主題のトウモロコシイベントからのフランキングゲノム配列は、このような配列を、イベントから、本明細書で示される配列に由来するプライマーを用いて増幅し、その後、ＰＣＲアンプリコンまたはクローニングされたＤＮＡの標準的なＤＮＡ配列決定を行うことにより確認（そして、必要であれば修正）できる。
これらの方法により生成されるアンプリコンは、複数の技術により検出できる。アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウムでの染色は、ＤＮＡアンプリコンを検出するための一般的な公知の方法である。別のこのような方法は、隣接するフランキングゲノムＤＮＡ配列と挿入されたＤＮＡ配列との両方とオーバーラップするようにＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計される遺伝的ビット解析である。オリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェルに固定化される。対象の領域のＰＣＲの後に（挿入された配列内の１つのプライマーと、隣接するフランキングゲノム配列内の１つのプライマーとを用いる）、１本鎖ＰＣＲ生成物は、固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズでき、ＤＮＡポリメラーゼと予測される次の塩基に特異的な標識ｄｄＮＴＰとを用いる単一塩基伸長反応のための鋳型として働く。読出しは、蛍光またはＥＬＩＳＡに基づくことができる。シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一塩基伸長の成功による挿入断片／フランキング配列の存在を示す。
別の方法は、Winge（Innov. Pharma. Tech. 00:18〜24、2000）により記載されるピロシーケンス技術である。この方法において、オリゴヌクレオチドは、隣接するゲノムＤＮＡおよび挿入ＤＮＡ接合部とオーバーラップするように設計される。オリゴヌクレオチドを、対象の領域からの１本鎖ＰＣＲ生成物（挿入された配列内の１つのプライマーと、フランキングゲノム配列内の１つのプライマー）とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸およびルシフェリンの存在下でインキュベートする。ＤＮＴＰを個別に加え、組み込みは、光のシグナルをもたらし、これが測定される。光シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一または多重塩基伸長の成功による導入遺伝子挿入断片／フランキング配列の存在を示す。
蛍光分極は、本発明のアンプリコンを検出するために用いることができる別の方法である。この方法に従って、ゲノムフランキングおよび挿入されたＤＮＡ接合部とオーバーラップするオリゴヌクレオチドを設計する。オリゴヌクレオチドを、対象の領域からの１本鎖ＰＣＲ生成物（挿入されたＤＮＡ内の１つのプライマーと、フランキングゲノムＤＮＡ配列内の１つのプライマー）とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識ｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートする。単一塩基伸長は、ｄｄＮＴＰの組み込みをもたらす。組み込みは、蛍光計を用いて分極の変化として測定できる。分極の変化は、増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一塩基伸長の成功による導入遺伝子挿入断片／フランキング配列の存在を示す。
ＴＡＱＭＡＮ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）は、ＤＮＡ配列の存在を検出し、定量する方法である。簡単に述べると、ゲノムフランキングおよび挿入ＤＮＡ接合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列内の１つのプライマーと、フランキングゲノム配列内の１つのプライマー）を、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環させる。特異的増幅の間に、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは蛍光部分をＦＲＥＴプローブの消光部分から浄化して放出させる。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功によるフランキング／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。
分子ビーコンは、配列検出において用いるために記載されている。簡単に述べると、フランキングゲノムおよび挿入ＤＮＡ接合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブのユニーク構造により、これは、蛍光部分と消光部分とが近接したまま維持される２次構造を含有するようになる。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列内の１つのプライマーと、フランキングゲノム配列内の１つのプライマー）を、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環させる。ＰＣＲ増幅が成功した後に、標的配列へのＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションは、プローブ２次構造の除去と、蛍光部分および消光部分の空間的な分離をもたらす。蛍光シグナルが得られる。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功によるフランキングゲノム／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。
挿入のために優れたトウモロコシゲノムの場所を開示したが、主題の発明は、少なくとも１つの非ａａｄ１挿入断片を、おおよそこのゲノムの場所の付近に含むトウモロコシ種子および／またはトウモロコシ植物の使用も含む。あるオプションは、異なる挿入断片を、本明細書で例示されるａａｄ−１挿入断片の代わりに置換することである。一般的にこれらの点に関して、例えば標的にされた相同組換えを主題の発明に従って用いることができる。この型の技術は、例えばＷＯ０３／０８０８０９Ａ２および対応する公開されたＵ．Ｓ．出願（ＵＳ２００３０２３２４１０）の主題である。したがって、主題の発明は、本明細書で同定されるフランキング配列の全てまたは認識可能部分（例えば配列番号２９の残基１〜１８７３および６６９０〜８５５７）と接する異種挿入断片（ａａｄ−１のマルチコピーの代わりまたはそれとともに）を含む植物および植物細胞の使用を含む。
以下は、主題の発明のいくつかの実施形態に従って用いることができる植物、種子、ポリヌクレオチドおよび検出方法のいくつかの項目／実施形態である。
１．配列番号２９を含むゲノムを含む、トランスジェニックトウモロコシ植物。
２．アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−１０２４４の下で寄託された種子に存在するＡＡＤ−１イベントＤＡＳ−４０２７８−９を含むゲノムを含むトウモロコシ種子。
３．配列番号２９を含むゲノムを含む、項目２のトウモロコシ種子。
４．配列番号２９を含む、項目２の種子を成長させることにより作出されるトウモロコシ植物。
５．ＡＡＤ−１イベントＤＡＳ−４０２７８−９を含む、項目４のトウモロコシ植物の子孫植物。
６．配列番号２９を含む、項目１のトウモロコシ植物の除草剤耐性子孫植物。
７．配列番号３０および配列番号３１により部分的に増幅可能なＳＳＲマーカーＵＭＣ１２６５と、配列番号３２および配列番号３３により部分的に増幅可能なＳＳＲマーカーＭＭＣ０１１１との間のおよそ２０ｃＭにて第２染色体上にあるトウモロコシ染色体標的部位に導入遺伝子挿入断片を含むトランスジェニックトウモロコシ植物であって、標的部位が異種核酸を含む植物。
８．項目７のトランスジェニックトウモロコシ植物を作製する方法であって、配列番号３０および配列番号３１により部分的に増幅可能なＳＳＲマーカーＵＭＣ１２６５と、配列番号３２および配列番号３３により部分的に増幅可能なＳＳＲマーカーＭＭＣ０１１１との間のおよそ２０ｃＭにて第２染色体上の位置に異種核酸を挿入するステップを含む方法。
９．花粉、胚珠、花、さや、長繊維、苗条、根および葉からなる群から選択され、配列番号２９を含む、項目４の植物の一部分。
１０．導入遺伝子挿入断片を、配列番号２９の残基１〜１８７３および配列番号２９の残基６６９０〜８５５７からなる群から選択されるゲノム配列内に、またはそれに接して含む、項目７のトランスジェニックトウモロコシ植物。
１１．少なくとも１５ヌクレオチドを含み、配列番号２９の残基１〜１８７３、配列番号２９の残基６６９０〜８５５７およびその相補鎖からなる群から選択される核酸配列とのストリンジェントな洗浄条件下でのハイブリダイゼーションを維持し、
配列番号１〜３３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、かつ／または
配列番号２９の残基１８６３〜１８７５、配列番号２９の残基６６７９〜６７００およびその相補鎖からなる群から選択されるヌクレオチド配列とストリンジェントな洗浄条件下でハイブリダイズする、
単離ポリヌクレオチド分子。
１２．配列番号１〜３３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、項目１１の単離ポリヌクレオチド。
１３．配列番号２９の残基１８６３〜１８７５、配列番号２９の残基６６７９〜６７００およびその相補鎖からなる群から選択されるヌクレオチド配列とストリンジェントな洗浄条件下でハイブリダイズする、項目１１の単離ポリヌクレオチド。
１４．ポリメラーゼ連鎖反応により生じるアンプリコンである、項目１３のポリヌクレオチド。
１５．トウモロコシＤＮＡを含む試料においてトウモロコシイベントを検出する方法であって、前記試料を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−１０２４４の下で寄託された種子に存在するＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９について特徴的である少なくとも１つのポリヌクレオチドと接触させるステップを含む方法。
１６．前記試料を、
ａ．配列番号２９の残基１〜１８７３、配列番号２９の残基６６９０〜８５５７およびその相補鎖からなる群から選択されるフランキング配列と結合する第１プライマー、および
ｂ．配列番号２９の残基１８７４〜６６８９を含む挿入配列と結合する第２プライマーまたはその相補鎖
と接触させるステップと、前記試料をポリメラーゼ連鎖反応に供するステップと、前記プライマー間に生じるアンプリコンについてアッセイするステップとを含む、項目１５の方法。
１７．前記プライマーが、配列番号１〜２８からなる群から選択される、項目１６の方法。
１８．前記ポリヌクレオチドが、少なくとも３０ヌクレオチドを含み、配列番号２９の残基１８６３〜１８７５、配列番号２９の残基６６７９〜６７００およびその相補鎖からなる群から選択される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記方法が、前記試料および前記ポリヌクレオチドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供するステップと、前記ＤＮＡとの前記ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションについて前記試料をアッセイするステップとをさらに含む、項目１５の方法。
１９．項目１７による第１プライマーおよび第２プライマーを含むＤＮＡ検出キット。
２０．項目１８の方法を行うためのＤＮＡ検出キット。
２１．項目１３で定義するポリヌクレオチドを含むＤＮＡ検出キット。
２２．配列番号２９を含む、項目１２のポリヌクレオチド。
２３．項目２２のポリヌクレオチドを生成する方法。
２４．トウモロコシゲノムのＤＮＡセグメントに導入遺伝子を挿入するステップを含み、前記ＤＮＡセグメントが、配列番号２９のヌクレオチド残基１〜１８７３を含む５’末端と、配列番号２９のヌクレオチド残基６６９０〜８５５７を含む３’末端とを含む、項目１０のトランスジェニック植物を作出する方法。
２５．配列番号２９を含む第１トウモロコシ植物を第２トウモロコシ植物と交雑させて、ゲノムを含む第３トウモロコシ植物を作出するステップと、前記第３トウモロコシ植物を前記ゲノムにおける配列番号２９の存在についてアッセイするステップとを含む方法。
２６．トウモロコシ植物を育種し、かつ／またはトウモロコシ植物に除草剤耐性形質を遺伝子移入するために用いる、項目２５の方法。
本明細書で言及したかまたは引用した全ての特許、特許出願、仮出願および刊行物は、それらが本明細書の明示的な教示と矛盾しない程度でその全体が参照により組み込まれている。
以下の実施例は、本発明を実行するための手順を説明し、本発明のあるいくつかの好ましい実施形態を示すために含まれる。これらの実施例は、限定すると解釈されるべきでない。以下の実施例に開示される技術は、好ましい形態をその実行のために説明するために用いられる具体的なアプローチを表すことが当業者により認識される。しかし、当業者は、本開示に鑑みて、これらの具体的な実施形態において多くの変更を行いながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をまだ得ることができることを認識している。そうでないと記載しない限り、全てのパーセンテージは重量により、全ての溶媒混合比率は、そうでないと記載しない限り容量による。
以下の実施例は、植えつけ前および／または出芽前の使用を含む。このような使用は、「２７８」イベントに限定されない。播種作付け禁止期間の短縮に関して、主題のＡＡＤ−１遺伝子によりもたらされる耐性の有用性をさらに説明できる。このことにより、栽培者は、バーンダウンに対する植えつけの計画についてより大きい柔軟性が得られる。主題の発明を用いずに、バーンダウン後、植えつけ前に７〜３０日間程度待つことは、著しい収率の損失をもたらし得る。よって、主題の発明は、この点において利点をもたらす。例えば、実施例１３を参照されたい。本明細書で例示もしくは示唆するいずれの植えつけ／除草剤散布間隔および除草剤（複数可）のいずれの濃度範囲／使用割合も、主題の発明に従って用いることができる。
そうでないと示さない限り、以下の略語を用いる。
ＡＡＤ−１ アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−１
ｂｐ 塩基対
℃ セ氏度
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＤＩＧ ジゴキシゲニン
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ｋｂ キロベース
μｇ マイクログラム
μＬ マイクロリットル
ｍＬ ミリリットル
Ｍ モル質量
ＯＬＰ オーバーラッププローブ
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＴＵ 植物転写単位
ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＯＰ 標準操作手順
ＳＳＣ 塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムの混合物を含有するバッファー溶液、ｐＨ７．０
ＴＢＥ Ｔｒｉｓベース、ホウ酸およびＥＤＴＡの混合物を含有するバッファー溶液、ｐＨ８．３
Ｖ ボルト
〔実施例１〕 ＡＡＤ１イベントｐＤＡＳ１７４０−２７８の形質転換および選択
ＡＡＤ１イベントであるｐＤＡＳ１７４０−２７８を、メイズ系統Ｈｉ−ＩＩのウィスカー媒介形質転換により生成した。用いる形質転換法は、米国特許出願公開第２００９００９３３６６号に記載されている。プラスミドｐＤＡＳ１７４０（ｐＤＡＢ３８１２ともよばれる）のＦｓｐＩ断片（図１）を、メイズ系統に形質転換した。このプラスミド構築物は、ＲＢ７ ＭＡＲｖ３：：ゼア・メイズ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターｖ２／／ＡＡＤ１ ｖ３／／ゼア・メイズＰＥＲ５ ３’ＵＴＲ：：ＲＢ７ ＭＡＲｖ４植物転写ユニット（ＰＴＵ）を含有する植物発現カセットを含有する。
多数のイベントを生成した。生存し、健常で、ハロキシホップ耐性カルス組織を生成したイベントに、推定上の形質転換イベントを表すユニーク識別コードを割り当て、新鮮な選択培地に継続して移した。植物は、各ユニークイベントに由来する組織から再生し、温室に移した。
葉の試料を、分子解析のために採取して、ＡＡＤ−１導入遺伝子の存在を、サザンブロット、ＤＮＡ境界の確認およびゲノムマーカーにより支援される確認により検証した。陽性のＴ０植物を、近交系統と受粉してＴ１種子を得た。イベントｐＤＡＳ１４７０−２７８−９（ＤＡＳ−４０２７８−９）のＴ１植物を選択し、自家受粉し、５世代にわたって特徴決定した。その間に、Ｔ１植物を戻し交雑し、エリート生殖質（ＸＨＨ１３）に、マーカーにより支援される選択により数世代にわたって遺伝子移入した。このイベントは、独立した形質転換単離体から作製した。イベントを、単一挿入部位、標準メンデル分離および安定的な発現のようなそのユニークな特徴、ならびに広い遺伝子型背景におけるおよび複数の環境の場所にわたる除草剤耐性および農業経済学的性能を含む優れた効率の組み合わせに基づいて選択した。以下の実施例は、イベントｐＤＡＳ−１７４０−２７８−９を特徴づけるために用いたデータを含有する。
〔実施例２〕 サザンブロットによるｐＤＡＳ１７４０−２７８−９イベントの特徴決定
サザンブロット解析を用いて、挿入されたＤＮＡ断片の組み込みパターンを確立し、イベントｐＤＡＳ−１７４０−２７８−９（ＤＡＳ−４０２７８−９）におけるａａｄ−１遺伝子の挿入断片／コピーの数を決定した。データを得て、トウモロコシゲノムに挿入されたａａｄ−１導入遺伝子の組み込みおよび完全性を証明した。
サザンブロットデータは、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩ断片挿入が、プラスミドｐＤＡＳ１７４０からのａａｄ−１ ＰＴＵの単一のインタクトなコピーの単純な組み込みとして生じたことを示唆した。詳細なサザンブロット解析を、プラスミド領域に含有される遺伝子、プロモーター、ターミネーターおよびその他の調節要素に特異的なプローブと、プラスミド内にある切断部位を有し、プラスミドの内部のハイブリダイズする断片またはトウモロコシゲノムＤＮＡとのプラスミドの接合部に及ぶ断片（境界断片）を生成する説明的な制限酵素とを用いて行った。制限酵素とプローブとの組み合わせについてサザンハイブリダイゼーションから示された分子量は、イベントについてユニークであり、その同定パターンを確立した。これらの解析は、プラスミド断片が、ａａｄ−１ ＰＴＵの再構成なしにトウモロコシゲノムＤＮＡに挿入されたことも示した。同一のハイブリダイゼーション断片が、トランスジェニックトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の異なる５つの世代において観察され、このことは、世代にわたるａａｄ−１ ＰＴＵ挿入の遺伝形質の安定性を示す。プラスミドｐＤＡＳ１７４０上のＦｓｐＩの制限部位の外側に位置する３つの主鎖プローブの混合物とのハイブリダイゼーションは、いずれの特定のＤＮＡ／遺伝子断片も検出せず、このことは、トランスジェニックトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるアンピシリン耐性遺伝子の不在と、プラスミドｐＤＡＳ１７４０のＦｓｐＩ制限部位に直接隣接するその他のベクター主鎖領域の不在とを示した。ａａｄ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９における挿入断片の説明のための地図を、図２〜３に示す。
（実施例２．１）
トウモロコシの葉の試料の回収およびゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の単離
ｇＤＮＡを、ａａｄ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の個別の植物の葉から調製した。ｇＤＮＡを、ａａｄ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９を有する個別の植物から収穫した葉組織から抽出した。イベントＤＡＳ−４０２７８−９の５つの異なる世代からのトランスジェニックトウモロコシ種子を用いた。世代あたり４つの植物に由来する、イベントＤＡＳ−４０２７８−９についての２０の個別のトウモロコシ植物を選択した。さらに、ｇＤＮＡを、従来のトウモロコシ植物ＸＨＨ１３から単離したが、これは、本質の系統の代表である遺伝子背景を含有し、ａａｄ−１遺伝子は存在しない。
ｇＤＮＡを単離する前に、葉の押し抜きを各植物から採取して、ａａｄ−１タンパク質発現を、迅速テストストリップキット（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｎｏｓｔｉｃａ、Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ、ＮＪ）を製造者が推奨する手順に従って用いて試験した。それぞれの葉の押し抜き試料には、ａａｄ−１の存在または不在について、それぞれ＋または−の評点を与えた。イベントＤＡＳ−４０２７８−９の５つの世代からの陽性植物だけを、さらなる特徴決定に供した。
トウモロコシの葉の試料を、イベントＤＡＳ−４０２７８−９および従来の対照ＸＨＨ１３の個別の植物から回収した。葉の試料を液体窒素中で迅速に凍結し、使用時までおよそ−８０℃にて貯蔵した。
個別のゲノムＤＮＡを、凍結トウモロコシ葉組織から、標準的なＣＴＡＢ法に従って抽出した。必要な場合に、いくらかのゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ−Ｔｉｐ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を、製造者により推奨される手順に従って用いてさらに精製した。抽出の後に、ＤＮＡを、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて分光蛍光的に定量した。ＤＮＡを、次いで、アガロースゲル上で視覚化して、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ解析からの値を確認し、ＤＮＡの質を決定した。
（実施例２．２）
ＤＮＡ消化および分離
ＤＮＡの分子特徴決定のために、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９ ＤＮＡ試料および従来の対照からの９マイクログラム（９μｇ）のゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ１μｇあたりに選択された制限酵素をおよそ５〜１１単位と各ＤＮＡ試料に対応する反応バッファーとを加えることにより消化した。各試料を、およそ３７℃にて一晩インキュベートした。制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＳａｃＩ、ＦｓｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを消化物のために用いた（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。陽性のハイブリダイゼーション対照試料を、プラスミドＤＮＡであるｐＤＡＳ１７４０（ｐＤＡＢ３８１２）を、従来の対照からのゲノムＤＮＡと、トウモロコシゲノムあたり１コピーの導入遺伝子にほぼ等しい比率で組み合わせることにより調製し、試験試料と同じ手順および制限酵素を用いて消化した。従来のトウモロコシ対照（ＸＨＨ１３）からのＤＮＡを、試験試料と同じ手順および制限酵素を用いて消化して、陰性対照とした。
消化したＤＮＡ試料を、Ｑｕｉｃｋ−Ｐｒｅｃｉｐ（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて沈殿させ、１×Ｂｌｕｅ Ｊｕｉｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に再懸濁して、ゲルローディングのための所望の容量を達成した。ＤＮＡ試料および分子サイズマーカーを、次いで、０．８％アガロースゲルに１×ＴＢＥバッファー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を５５〜６５ボルトでおよそ１８〜２２時間用いて電気泳動して、断片の分離を達成した。ゲルを、臭化エチジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で染色し、ＤＮＡを紫外（ＵＶ）光の下で視覚化した。
（実施例２．３）
サザントランスファーおよびメンブレン処理
サザンブロット解析を、Memelinkら(1994) Southern, Northern, and Western Blot Analysis. Plant Mol. Biol. Manual F1:1〜23に記載されるようにして本質的に行った。簡単に述べると、ＤＮＡ断片の電気泳動分離および視覚化の後に、ゲルを、０．２５Ｎ ＨＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）をおよそ１５分間用いて脱プリン化し、次いで、変性溶液（ＡｃｃｕＧＥＮＥ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）におよそ３０分間、その後中和溶液（ＡｃｃｕＧＥＮＥ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に少なくとも３０分間曝露した。サザントランスファーを、ナイロンメンブレン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）上に、灯心システムを１０×ＳＳＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とともに用いて一晩行った。トランスファーの後に、メンブレンを２×ＳＳＣ溶液中で洗浄し、ＤＮＡをメンブレンにＵＶ架橋により結合させた。このプロセスにより、ハイブリダイゼーションのための準備ができたサザンブロットメンブレンが得られた。
（実施例２．４）
ＤＮＡプローブ標識およびハイブリダイゼーション
ナイロンメンブレンと結合したＤＮＡ断片を、標識プローブを用いて検出した。この研究のために用いたプローブは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ヌクレオチドである［ＤＩＧ−１１］−ｄＵＴＰのＰＣＲに基づく組み込みにより、プラスミドｐＤＡＳ１７４０からの遺伝子要素とその他の領域に特異的なプライマーにより作製された断片から作製した。ＰＣＲ合成によるＤＮＡプローブの作製は、ＰＣＲ ＤＩＧプローブ合成キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、製造者が推奨する手順に従って用いて行った。この研究に用いたプローブのリストを、表１に記載する。
Figure 0006057920
標識プローブを、アガロースゲル電気泳動により解析して、それらの質および量を決定した。所望の量の標識プローブを、次いで、ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）について記載される手順を用いる特定の断片の検出のために、ナイロンメンブレン上で標的ＤＮＡへのハイブリダイゼーションのために用いた。簡単に述べると、ＤＮＡを固定したナイロンメンブレンブロットを、２×ＳＳＣ中で短く洗浄し、２０〜２５ｍＬの予め温めたＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液を用いて、ハイブリダイゼーション瓶中でおよそ５０℃にて最短で３０分間、ハイブリダイゼーションオーブン中でプレハイブリダイゼーションした。プレハイブリダイゼーション溶液を、次いで、デカントし、水中で５分間煮沸することにより予め変性させた所望の量の特異的プローブを含有する２０ｍＬの予め温めたＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液で置き換えた。ハイブリダイゼーションステップを、次いで、およそ４０〜６０℃にて一晩、ハイブリダイゼーションオーブン中で行った。
（実施例２．５）
検出
プローブハイブリダイゼーションの最後に、プローブを含有するＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液をきれいなチューブにデカントし、−２０℃にて貯蔵した。これらのプローブは、製造者が推奨する手順に従って２〜３回再使用できた。メンブレンブロットを短くすすぎ、きれいなプラスチック容器中で、低ストリンジェンシー洗浄バッファー（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）でおよそ５分間室温にて２回洗浄し、その後、高ストリンジェンシー洗浄バッファー（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で１５分間、それぞれおよそ６５℃にて２回洗浄した。メンブレンブロットを、次いで、別のきれいなプラスチック容器に移し、ＤＩＧ洗浄およびブロックバッファーセット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）からの１×洗浄バッファーでおよそ２分間短く洗浄し、１×ブロッキングバッファー中で最短で３０分間のブロッキングと、その後の１×ブロッキングバッファー中での抗ＤＩＧ−ＡＰ（アルカリホスファターゼ）抗体（１：５，０００希釈、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）との最短で３０分間のインキュベーションに進んだ。１×洗浄バッファーで２〜３回洗浄した後に、特異的ＤＮＡプローブは、メンブレンブロットに結合したままであり、ＤＩＧ標識ＤＮＡ標準物質を、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ化学発光核酸検出システム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を製造者の推奨に従って用いて視覚化した。ブロットを化学発光フィルム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に、１または複数の時点で露光して、ハイブリダイズしている断片を検出して、分子サイズ標準物質を視覚化した。フィルムを、次いで、Ａｌｌ−Ｐｒｏ １００ Ｐｌｕｓフィルム現像器（Ｋｏｎｉｃａ ＳＲＸ−１０１）で現像し、画像を報告のために走査した。検出されたバンドの数およびサイズを、各プローブについて文書化した。記載されるようなＤＩＧ検出後に視覚化されるＤＩＧ標識ＤＮＡ分子量マーカーＩＩ（ＭＷＭ ＤＩＧ ＩＩ）を用いて、サザンブロット上のハイブリダイズしている断片のサイズを決定した。
（実施例２．６）
プローブ脱着
ＤＮＡプローブを、サザンハイブリダイゼーションデータが得られた後にメンブレンブロットから脱着させ、メンブレンブロットは、製造者の推奨する手順に従って（DIG Application Manual for Filter Hybridization、(2003). Roche Diagnostics）、異なるＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションのために再使用できた。簡単に述べると、シグナル検出およびフィルム曝露の後に、メンブレンブロットをＭｉｌｌｉ−Ｑ水で十分にすすぎ、脱着バッファー（０．２Ｎ ＮａＯＨ、０．１％ＳＤＳ）中でおよそ１５分間、室温または３７℃で２回洗浄した。メンブレンブロットを、次いで、２×ＳＳＣ中で短く洗浄し、プレハイブリダイゼーションおよび別のＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの準備ができた。メンブレンブロットを、新しい化学発光フィルムに露光して、全てのＤＮＡプローブを、次のハイブリダイゼーションに進む前に確実に脱着させた。再露光したフィルムを、記録のための研究ファイルに以前のハイブリダイゼーションデータパッケージとともに保存した。
（実施例２．７）
サザンブロットの結果
ｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩ断片の既知の制限酵素部位に基づいて、特定の消化物およびプローブで予測される断片サイズおよび観察された断片サイズを、表２に示す。２つの型の断片をこれらの消化物およびハイブリダイゼーションから同定した：既知の酵素部位がプローブ領域と接し、ｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩ断片内に完全に含まれる内部断片と、既知の酵素部位がプローブ領域の一端にあり、第２の部位がトウモロコシゲノム中に予測される境界断片。境界断片のサイズはイベントにより変動した。なぜなら、ほとんどの場合、ＤＮＡ断片組み込み部位は各イベントについてユニークであるからである。境界断片は、組み込まれたＤＮＡに対して制限酵素部位の場所を決定し、ＤＮＡ挿入の数を評価するための手段を提供する。この研究で完了したサザンブロット解析に基づいて、プラスミドｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩからのインタクトなａａｄ−１ ＰＴＵの単一コピーが、挿入断片地図に詳細に示されるように、イベントＤＡＳ−４０２７８−９のトウモロコシゲノムに挿入されたと結論付けた（図２〜３）。
Figure 0006057920
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プラスミドｐＤＡＳ１７４０中にユニーク制限部位を有する制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＳａｃＩ、ＦｓｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを選択して、イベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるａａｄ−１遺伝子挿入断片を特徴決定した。＞３３８２ｂｐ、＞２７６４ｂｐ、＞４３８９ｂｐの境界断片は、それぞれＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ消化の後にａａｄ−１遺伝子プローブとハイブリダイズすると予想された（表２）。約１２０００ｂｐ、約４０００ｂｐおよび約１６０００ｂｐの単一のａａｄ−１ハイブリダイゼーションバンドが、それぞれＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩを用いた場合に観察され、このことは、イベントＤＡＳ−４０２７８−９のトウモロコシゲノムにおけるａａｄ−１遺伝子挿入の単一の部位を示した。ＦｓｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる二重消化を選択して、ａａｄ−１植物転写単位（ＰＴＵ、プロモーター／遺伝子／ターミネーター）を含有する３３６１ｂｐの断片を放出した（表２）。予想される３３６１ｂｐの断片が、ＦｓｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化の後にａａｄ−１遺伝子プローブを用いて観察された。ＤＡＳ−４０２７８−９試料の４つ全ての酵素／酵素の組み合わせでの消化とその後のａａｄ−１遺伝子プローブハイブリダイゼーションで得られた結果は、プラスミドｐＤＡＳ１７４０からのインタクトなａａｄ−１ ＰＴＵの単一コピーが、イベントＤＡＳ−４０２７８−９のトウモロコシゲノムに挿入されたことを示した。
制限酵素ＮｃｏＩ、ＳａｃＩおよびＦｓｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを選択して、イベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるａａｄ−１についてのプロモーター（ＺｍＵｂｉ１）領域を特徴決定した。ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ消化物は、ＺｍＵｂｉ１プロモーター領域に特異的なＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた場合に、それぞれ＞３４７２ｂｐおよび＞４３８９ｂｐの境界領域断片を生じると予測される（表２）。約６３００ｂｐおよび約３６００ｂｐの２つのハイブリダイゼーションバンドが、ＮｃｏＩ消化の後にＺｍＵｂｉ１プロモータープローブを用いて検出された。しかし、約３６００ｂｐのバンドは、従来の対照を含む全ての試料のレーンにわたって存在し、このことは、この約３６００ｂｐのバンドが、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター（ＺｍＵｂｉ１）プローブがトウモロコシ内因性ｕｂｉ遺伝子と相同結合することによる非特異的シグナルバンドであることを示唆した。これとは対照的に、約６３００ｂｐのシグナルバンドは、試験されたＤＡＳ−４０２７８−９試料で検出されたが従来の対照では検出されず、このことは、この約６３００ｂｐのバンドが、プラスミドｐＤＡＳ１７４０からのＺｍＵｂｉ１プロモータープローブに特異的であり、よって、これが表２に示す予測されたＮｃｏＩ／ＺｍＵｂｉ１バンドであることを示した。同様に、約３８００ｂｐおよび約１６０００ｂｐの２つのハイブリダイゼーションバンドが、ＳａｃＩ消化の後にＺｍＵｂｉ１プロモータープローブを用いて検出された。約３８００ｂｐのバンドは、従来の対照を含む全ての試料のレーンにおいて出現し、よって、トウモロコシ内因性ｕｂｉ遺伝子へのＺｍＵｂｉ１プロモータープローブの非特異的ハイブリダイゼーションであると考えられる。ＤＡＳ−４０２７８−９試料にのみ存在する約１６０００ｂｐのハイブリダイゼーションバンドは、予測されたＳａｃＩ／ＺｍＵｂｉ１バンドと考えられる。ＦｓｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでの二重消化は、ＺｍＵｂｉ１プロモータープローブとハイブリダイズする３３６１ｂｐのａａｄ−１ ＰＴＵ断片を遊離すると予測される（表２）。この３３６１ｂｐのバンドおよび約６４００ｂｐの非特異的ハイブリダイゼーションバンドが、ＦｓｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化の後のＺｍＵｂｉ１プロモータープローブにより検出された。約６４００ｂｐバンドは、トウモロコシ内因性ｕｂｉ遺伝子とのＺｍＵｂｉ１プロモータープローブの非特異的結合と考えられる。なぜなら、このバンドは、従来の対照を含む全ての試料レーンに存在するからである。さらに、約６４００ｂｐに非常に近い別のバンドが、従来の対照、ＢＣ３Ｓ１およびいくつかのＢＣ３Ｓ２試料で観察された。約６４００ｂｐに非常に近いこの追加のバンドも、非特異的であるとみなされる。なぜなら、これは、従来の対照ＸＨＨ１３試料レーンに存在し、ＸＨＨ１３の遺伝子背景と関連する可能性が高いからである。
同じ制限酵素／酵素の組み合わせＮｃｏＩ、ＳａｃＩおよびＦｓｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを選択して、イベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるターミネーター（ＺｍＰｅｒ５）領域を特徴決定した。ＮｃｏＩ消化は、ＺｍＰｅｒ５ターミネーター領域に特異的なＤＮＡプローブとハイブリダイズする場合に、＞２７６４ｂｐの境界領域断片を生じると予測される（表２）。約４０００ｂｐおよび約３９００ｂｐの２つのハイブリダイゼーションバンドが、ＮｃｏＩ消化の後にＺｍＰｅｒ５ターミネータープローブを用いて検出された。約３９００ｂｐのバンドは、従来の対照を含む全ての試料レーンにわたって存在し、このことは、この約３９００ｂｐのバンドが、おそらく、トウモロコシ由来ペルオキシダーゼ遺伝子ターミネーター（ＺｍＰｅｒ５）プローブがトウモロコシ内因性ｐｅｒ遺伝子と相同結合することによる非特異的シグナルバンドであることを示唆した。これとは対照的に、約４０００ｂｐのシグナルバンドは、試験されたＤＡＳ−４０２７８−９試料で検出されたが従来の対照では検出されず、このことは、この約４０００ｂｐのバンドが、プラスミドｐＤＡＳ１７４０からのＺｍＰｅｒ５ターミネータープローブに特異的であり、よって、これが表２に示す予測されたＮｃｏＩ／ＺｍＰｅｒ５バンドであることを示した。＞１８４７ｂｐの境界断片は、ＳａｃＩ消化の後にＺｍＰｅｒ５ターミネータープローブとハイブリダイズすると予測される。約１９００ｂｐおよび約９０００ｂｐの２つのハイブリダイゼーションバンドが、ＳａｃＩ消化の後にＺｍＰｅｒ５ターミネータープローブを用いて検出された。約９０００ｂｐのバンドは、従来の対照を含む全ての試料レーンにわたって存在し、よって、トウモロコシ内因性ｐｅｒ遺伝子へのＺｍＰｅｒ５ターミネータープローブの非特異的ハイブリダイゼーションであると考えられた。ＤＡＳ−４０２７８−９試料にのみ存在した約１９００ｂｐのハイブリダイゼーションバンドは、予測されたＳａｃＩ／ＺｍＰｅｒ５バンドであると考えられる。ＦｓｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでの二重消化は、ＺｍＰｅｒ５ターミネータープローブとハイブリダイズする３３６１ｂｐのａａｄ−１ ＰＴＵ断片を遊離すると予測される（表２）。この３３６１ｂｐのバンドおよび約２１００ｂｐの追加の非特異的ハイブリダイゼーションバンドが、ＦｓｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化の後のＺｍＰｅｒ５ターミネータープローブにより検出された。追加の約２１００ｂｐのバンドは、トウモロコシ内因性遺伝子へのＺｍＰｅｒ５ターミネータープローブの非特異的結合である。なぜなら、このバンドは、陰性対照を含む全ての試料レーンに存在するからである。ＤＡＳ−４０２７８−９試料のこれらの消化とその後のＺｍＵｂｉ１プロモーターおよびＺｍＰｅｒ５ターミネータープローブのハイブリダイゼーションで得られた結果により、プラスミドｐＤＡＳ１７４０からのインタクトなａａｄ−１ ＰＴＵの単一コピーが、イベントＤＡＳ−４０２７８−９のトウモロコシゲノムに挿入されたことがさらに確認された。
制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｃＩを選択して、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩ断片からの残りの要素について特徴決定した（表２）。要素ＲＢ７ Ｍａｒ ｖ３およびＲＢ７ Ｍａｒ ｖ４のＤＮＡ配列は、９９．７％を超える同一性を有し、よって、ＲＢ７ Ｍａｒ ｖ３またはＲＢ７ Ｍａｒ ｖ４に特異的なＤＮＡプローブは、ＲＢ７ Ｍａｒのいずれかのバージョンを含有するＤＮＡ断片とハイブリダイズすると予測された。＞２７６４ｂｐおよび＞３４７２ｂｐの２つの境界断片は、ＮｃｏＩ消化の後にＲＢ７ Ｍａｒ ｖ４およびＲＢ７ Ｍａｒ ｖ３プローブとハイブリダイズすると予測された（表２）。約４０００ｂｐおよび約６３００ｂｐの２つのハイブリダイゼーションバンドが、ＤＡＳ−４０２７８−９試料におけるＮｃｏＩ消化の後にＲＢ７ Ｍａｒ ｖ４またはＲＢ７ Ｍａｒ ｖ３プローブのいずれかを用いて観察された。同様に、＞１８４７ｂｐおよび＞４３８９ｂｐの２つの境界断片が、ＳａｃＩ消化の後にＲＢ７ Ｍａｒ ｖ４およびＲＢ７ Ｍａｒ ｖ３プローブを用いて予想された（表２）。約１９００ｂｐおよび約１６０００ｂｐのハイブリダイゼーションバンドが、ＤＡＳ−４０２７８−９試料において、ＳａｃＩ消化の後にＲＢ７ Ｍａｒ ｖ４またはＲＢ７ Ｍａｒ ｖ３プローブを用いて検出された。
まとめると、これらの要素プローブを用いて得られたサザンハイブリダイゼーションの結果は、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９に挿入されたＤＮＡが、インタクトなａａｄ−１ ＰＴＵを、挿入断片のそれぞれ５’末端および３’末端のマトリクス付着領域ＲＢ７ Ｍａｒ ｖ３およびＲＢ７ Ｍａｒ ｖ４とともに含有することを示した。
（実施例２．８）
主鎖配列の不在
プラスミドｐＤＡＳ１７４０のほぼ全体のＦｓｐＩ主鎖領域（プラスミドｐＤＡＳ１７４０の４８６７〜７１４３ｂｐ）をカバーする３つのＤＮＡ断片（表１）の等モル比率の組み合わせを主鎖プローブとして用いて、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の特徴決定をした。プラスミドｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩ断片を用いて、イベントＤＡＳ−４０２７８−９を作製したので、主鎖プローブの組み合わせを用いて、いずれの制限酵素消化の後にも特異的ハイブリダイゼーションシグナルは予測されなかった（表２）。全てのＤＡＳ−４０２７８−９試料において、ＮｃｏＩまたはＳａｃＩ消化の後に主鎖プローブを用いて特異的ハイブリダイゼーションシグナルが検出されなかったことが確認された。陽性対照レーンは、予測されたハイブリダイズするバンドを含有し、このことは、プローブが、試料中に存在するならばいずれの相同ＤＮＡ断片ともハイブリダイズできたことを証明した。このデータは、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の挿入が、プラスミドｐＤＡＳ１７４０からのＦｓｐＩ領域の外側のいずれのベクター主鎖配列も含まなかったことを示唆した。
イベントＤＡＳ−４０２７８−９の５つの異なる世代からの葉の試料を用いて、分子特徴決定のためのサザンブロット解析を行った。組み込みパターンを、選択された制限酵素消化物およびプローブの組み合わせを用いて調べて、挿入された遺伝子であるａａｄ−１、ならびに遺伝子発現のプロモーター、ターミネーターを含む非コード領域およびマトリクス付着領域の特徴を決定した。
イベントＤＡＳ−４０２７８−９に挿入されたＤＮＡのサザンブロット特徴決定は、ａａｄ−１ ＰＴＵの単一のインタクトなコピーが、イベントＤＡＳ−４０２７８−９に組み込まれたことを示す。制限酵素の組み合わせおよびプローブについてのサザンハイブリダイゼーションにより示された分子量はイベントについてユニークであり、その同定パターンを確立した。ハイブリダイゼーションパターンは、５つ全ての世代にわたって同一であり、このことは、挿入断片がトウモロコシゲノム中で安定であることを示す。プラスミドｐＤＡＳ１７４０からのｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩ形質転換断片を超える主鎖領域をカバーするプローブとのハイブリダイゼーションにより、ベクター主鎖配列がイベントＤＡＳ−４０２７８−９に組み込まれていないことが確認される。
〔実施例３〕 トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の挿入断片およびフランキング境界領域におけるＤＮＡ配列のクローニングおよび特徴決定
挿入されたＤＮＡを特徴決定し、ゲノム挿入部位を示すために、イベントＤＡＳ−４０２７８−９の挿入断片および境界領域のＤＮＡ配列を決定した。合計で、８５５７ｂｐのイベントＤＡＳ−４０２７８−９ゲノム配列が確認され、これは、１８７３ｂｐの５’フランキング境界配列、１８６８ｂｐの３’フランキング境界配列および４８１６ｂｐのＤＮＡ挿入断片を含んだ。４８１６ｂｐのＤＮＡ挿入断片は、インタクトなａａｄ−１発現カセット、５’末端に２５９ｂｐの部分ＭＡＲ ｖ３および３’末端に１０９６ｂｐの部分ＭＡＲ ｖ４を含有した。配列解析により、５’組み込み接合部での２１ｂｐの挿入と、トウモロコシゲノムの挿入遺伝子座からの２塩基対の欠失とが明らかになった。１塩基対の挿入が、トウモロコシゲノムとＤＡＳ−４０２７８−９挿入断片との間の３’組み込み接合部にて見出された。また、単一塩基変化（ＴからＣ）が、挿入断片中に、３’ＵＴＲの非コード領域内の５２１２位にて見出された。これらの変化はいずれも、ａａｄ−１発現カセットのオープンリーディングフレーム組成に影響しない。
イベントＤＡＳ−４０２７８−９挿入断片および境界配列に基づくＰＣＲ増幅により、境界領域がトウモロコシ起源であり、接合部領域を、ＤＡＳ−４０２７８−９のイベント特異的同定に用いることができたことが確認された。接合部領域にわたる配列の解析は、新規なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ＞＝２００コドン）が、イベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるＤＮＡ挿入から得られず、ゲノムのオープンリーディングフレームは、天然トウモロコシゲノムへのＤＡＳ−４０２７８−９の組み込みにより遮られなかったことを示した。全体として、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の挿入断片および境界配列の特徴決定は、ａａｄ−１発現カセットの単一のインタクトなコピーが、天然トウモロコシゲノムに組み込まれたことを示した。
（実施例３．１）
ゲノムＤＮＡ抽出および定量
ゲノムＤＮＡを、凍結乾燥したかまたは新しく粉砕した葉の組織から、ＣＴＡＢ変法を用いて抽出した。ＤＮＡ試料を、１×ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）（Ｆｌｕｋａ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に溶解し、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ法を製造者の使用説明（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）に従って用いて定量した。ＰＣＲ解析のために、ＤＮＡ試料を分子生物学グレードの水（５ＰＲＩＭＥ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて希釈して、１０〜１００ｎｇ／μＬの濃度を得た。
（実施例３．２）
ＰＣＲプライマー
表３に、イベントＤＡＳ−４０２７８−９のＤＮＡ挿入断片およびフランキング境界領域をクローニングするために用いたプライマー配列を、図４に示す位置および記載とともに列挙する。表４に、挿入断片および境界配列を確認するために用いたプライマー配列を列挙する。プライマーの位置は、図４および５にそれぞれ示す。全てのプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）で合成した。プライマーを水（５ＰＲＩＭＥ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に、貯蔵溶液のために１００μＭの濃度まで溶解し、作業溶液のために１０μＭの濃度まで水で希釈した。
Figure 0006057920
Figure 0006057920
Figure 0006057920
（実施例３．３）
ゲノムウォーキング
ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ユニバーサルキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の５’および３’フランキング境界配列をクローニングした。製造者の使用説明に従って、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９からの約２．５μｇのゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＶ、ＳｔｕＩ（ともにキットにより提供される）またはＳｃａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて一晩消化した。消化したＤＮＡを、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）２５（ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ）を用いて精製した後に、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）アダプタにライゲーションして、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ライブラリーを構築した。各ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ライブラリーを、キットで提供されるアダプタプライマーＡＰ１と、各構築物特異的プライマー５Ｅｎｄ３８１２＿Ａおよび３Ｅｎｄ３８１２＿Ｃとを用いる１次ＰＣＲ増幅のためのＤＮＡ鋳型として用いた。１マイクロリットルの１：２５希釈の１次ＰＣＲ反応物を、次いで、ネステッドアダプタプライマーＡＰ２と、各ネステッド構築物特異的プライマー５Ｅｎｄ３８１２＿Ｂと３Ｅｎｄ３８１２＿Ｄとを用いる２次ＰＣＲ増幅のための鋳型として用いた。ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（商標）ＨＳ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）をＰＣＲ増幅において用いた。５０μＬのＰＣＲ反応中に、１μＬのＤＮＡ鋳型、８μＬの２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス、０．２μＭの各プライマー、２．５単位のＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（商標）ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、５μｌの１０×ＬＡ ＰＣＲバッファーＩＩ（Ｍｇ２＋プラス）、および１．５μＬの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２を用いた。具体的なＰＣＲ条件を表５に列挙する。
Figure 0006057920
（実施例３．４）
従来のＰＣＲ
標準的なＰＣＲを用いて、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるＤＮＡ挿入断片および境界配列をクローニングして確認した。ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（商標）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）またはＥａｓｙ−Ａ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲクローニング酵素＆マスターミックス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を、製造者が推奨する手順に従う従来のＰＣＲ増幅のために用いた。具体的なＰＣＲ条件およびアンプリコンの説明を、表６に列挙する。
Figure 0006057920
（実施例３．５）
ＰＣＲ生成物の検出、精製、ＰＣＲ生成物のサブクローニングおよび配列決定
ＰＣＲ生成物を、製品の使用説明に従って、１．２％または２％Ｅ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いる電気泳動により調査した。断片サイズを、ＤＮＡマーカーとの比較により見積もった。必要であれば、ＰＣＲ断片を、臭化エチジウムで染色した１×ＴＢＥ中の１％アガロースゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて断片を切り出すことにより精製した。
ＰＣＲ断片を、ｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）中に、配列決定のためのＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を製品の使用説明に従って用いることによりサブクローニングした。具体的には、２〜５マイクロリットルのＴＯＰＯ（登録商標）クローニング反応を、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ化学的コンピテントＴＯＰ１０細胞に、製造者の使用説明に従って形質転換した。クローニングされた断片は、プラスミドＤＮＡ（ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット、Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の少量調製と、その後のＥｃｏＲＩでの制限消化またはキットで提供されるＴ３およびＴ７プライマーを用いる直接のコロニーＰＣＲにより確認した。プラスミドＤＮＡまたは選択されたコロニーのグリセロールストックを、次いで、配列決定に送った。
サブクローニングの後に、推定標的ＰＣＲ生成物を、まず配列決定して、予測されるＤＮＡ断片がクローニングされていることを確認した。適当なＤＮＡ配列を含有するコロニーを、プライマーウォーキングのために選択して、完全なＤＮＡ配列を決定した。配列決定は、Ｃｏｇｅｎｉｃｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）により行った。
挿入断片および境界配列の最終的な組み立てを、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェア（バージョン４．８ Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて完了した。トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の挿入断片および境界配列のアノテーションは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（バージョン１０および１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて行った。
相同性検索は、ＢＬＡＳＴプログラムをＧｅｎＢａｎｋデータベースに対して用いて行った。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（バージョン１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）解析を行って、完全な挿入断片およびフランキング境界配列におけるＯＲＦ（＞＝２００コドン）を同定した。
（実施例３．６）
５’末端境界配列
ＤＮＡ断片を、各トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ライブラリーから、導入遺伝子の５’末端についての特異的ネステッドプライマーセットを用いて増幅した。およそ８００ｂｐのＰＣＲ生成物が、イベントＤＡＳ−４０２７８−９ ＥｃｏＲＶおよびＳｔｕＩ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ライブラリーの両方から観察された。ＳｃａＩ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ライブラリーは、約２ｋｂの生成物を生じた。断片をｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローニングし、各ライブラリーからの６つのコロニーを、末端の配列決定のために無作為に採取して、挿入断片が予測される配列を含有することを確認した。挿入断片のプライマーウォーキングによる完全な配列決定により、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９ ＳｔｕＩ、ＥｃｏＲＶおよびＳｃａＩ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ライブラリーから増幅される断片が、それぞれ７９３、８２２および２１３２ｂｐであったことが明らかになった。ＳｔｕＩおよびＥｃｏＲＶ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ライブラリーから作製したＤＮＡ断片は、ＳｃａＩ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ライブラリーから作製したＤＮＡ断片と１００％一致し、このことは、これらのＤＮＡ断片が、導入遺伝子挿入断片の５’領域から増幅されたことを示唆した。得られた１８７３ｂｐのトウモロコシゲノム配列のＢＬＡＳＴ検索は、トウモロコシＢＡＣクローンの配列と高い類似性を示した。さらに、挿入接合部の配列解析は、９１７ｂｐのＭＡＲ ｖ３が、その５’末端領域にて、プラスミドｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩ断片と比較して切断され、ａａｄ−１発現カセットの５’領域にて２５９ｂｐの部分ＭＡＲ ｖ３が残っていることを示した。
（実施例３．７）
３’末端境界配列
およそ３ｋｂのサイズのＤＮＡ断片を、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９ ＳｔｕＩ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ライブラリーから、導入遺伝子の３’末端についての特異的ネステッドプライマーセットを用いて増幅した。ＤＮＡ断片を、ｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローニングし、１０のコロニーを、末端の配列決定のために無作為に採取して、予測される配列の挿入を確認した。予測される挿入断片を有する３つのクローンを完全に配列決定し、２９９７ｂｐのＤＮＡ断片を産出した。このＤＮＡ断片の配列解析により、部分ＭＡＲ ｖ４要素（その５’領域の７０ｂｐを欠く）および１８６７ｂｐのトウモロコシゲノム配列が明らかになった。ＢＬＡＳＴ検索は、１８６７ｂｐのゲノムＤＮＡ配列が、５’境界配列で同定されたのと同じトウモロコシＢＡＣクローンにおける配列と１００％一致したことを示した。
（実施例３．８）
ＤＮＡ挿入断片および接合部配列
ＤＮＡ挿入断片および接合部領域を、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９から、以前に記載したようなＰＣＲに基づく方法を用いてクローニングした。５つのプライマー対を、５’および３’フランキング境界配列と予測される導入遺伝子配列とに基づいて設計した。合計で、５つのオーバーラップＤＮＡ断片（１７６７ｂｐのアンプリコン１、１７０３ｂｐのアンプリコン２、１７００ｂｐのアンプリコン３、１９８４ｂｐのアンプリコン４および１４８４ｂｐのアンプリコン５）をクローニングし、配列決定した（図４）。全体の挿入断片およびフランキング境界配列を、５つの断片のうちのオーバーラップ配列に基づいて組み立てた。最終的な配列では、ｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩに由来する４８１６ｂｐのＤＮＡ挿入断片、１８７３ｂｐの５’フランキング境界配列および１８６８ｂｐの３’フランキング境界配列の存在が確認される。４８１６ｂｐのＤＮＡ挿入断片は、インタクトなａａｄ−１発現カセット、５’末端に２５９ｂｐの部分ＭＡＲ ｖ３および３’末端に１０９６ｂｐの部分ＭＡＲ ｖ４を含有する（配列番号２９）。
各プライマー対について少なくとも２つのクローンを、プライマーウォーキングのために用いて、ＤＮＡ挿入断片およびその境界配列についての完全な配列情報を得た。配列解析は、５’組み込み接合部にて、トウモロコシゲノムＤＮＡとｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩからの組み込まれた部分ＭＡＲ ｖ３との間に２１ｂｐの挿入を示した。ＢＬＡＳＴ検索およびＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ解析の結果は、２１ｂｐの挿入ＤＮＡが、いずれの植物種のＤＮＡまたはｐＤＡＳ１７４０プラスミドＤＮＡとも相同性を示さなかったことを示した。単一塩基対挿入が、３’組み込み接合部にて、トウモロコシゲノムＤＮＡとｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩからの部分ＭＡＲ ｖ４との間に見出された。ＤＮＡの組み込みは、トウモロコシゲノムの挿入遺伝子座にて２塩基対の欠失ももたらした（図６）。さらに、５２１２ｂｐの位置にて１つのヌクレオチドの相違（ＴからＣ）が、ＤＮＡ挿入断片の非翻訳３’ＵＴＲ領域において観察された（配列番号２９）。しかし、これらの変化のいずれも、ａａｄ−１発現にとって重要でなく、ＤＡＳ−４０２７８−９の挿入断片において接合部にわたっていずれの新しいＯＲＦ（＞＝２００コドン）も創出しないとみられる。
（実施例３．９）
トウモロコシゲノム配列の確認
トウモロコシゲノムにおけるイベントＤＡＳ−４０２７８−９導入遺伝子の挿入部位を確認するために、ＰＣＲ増幅を、異なるプライマー対を用いて行った（図４）。イベントＤＡＳ−４０２７８−９およびその他のトランスジェニックまたは非トランスジェニックトウモロコシ系統からのゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。２つのａａｄ−１特異的プライマーであるＡＩ５Ｅｎｄ０１およびＡＩ５Ｅｎｄ０２と、５’末端境界配列に基づいて設計した２つのプライマーである１Ｆ５Ｅｎｄ０１および１Ｆ５Ｅｎｄ０２とを用いて、ａａｄ−１遺伝子が５’末端境界領域に及ぶＤＮＡ断片を増幅した。同様に、ａａｄ−１が３’末端境界配列に及ぶＤＮＡ断片を増幅するために、３’末端境界配列に由来する１Ｆ３Ｅｎｄ０５プライマーと、ａａｄ−１特異的ＡＩ３Ｅｎｄ０１プライマーとを用いた。予測されるサイズのＤＮＡ断片は、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９のゲノムＤＮＡからのみ、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９のフランキング境界にある一方のプライマーと、他方のａａｄ−１特異的プライマーとからなる各プライマー対を用いて増幅された。対照ＤＮＡ試料は、同じプライマー対を用いてＰＣＲ生成物を生じず、このことは、クローニングされた５’末端および３’末端の境界配列が、実際に、挿入されたａａｄ−１遺伝子構築物のそれぞれ上流および下流の配列であることを示した。約８ｋｂのサイズのかすかなバンドが、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０４７４および非トランスジェニックトウモロコシ系統ＸＨＨ１３を含む全てのトウモロコシ試料から、１Ｆ５Ｅｎｄ０１およびＡＩ５Ｅｎｄ０１のプライマー対をＰＣＲ増幅に用いた場合に観察されたことに注意されたい。観察されたかすかなバンド（調製したゲル上で）は、このプライマー対を用いてのトウモロコシゲノムにおける非特異的増幅の結果であり得る。
トウモロコシゲノムにおけるＤＮＡ挿入をさらに確認するために、５’末端境界配列にある２つのプライマー１Ｆ５Ｅｎｄ０３および１Ｆ５Ｅｎｄ０４と、３’末端境界配列にある２つのプライマー１Ｆ３Ｅｎｄ０３および１Ｆ３Ｅｎｄ０４とを用いて、挿入遺伝子座に及ぶＤＮＡ断片を増幅した。プライマー対１Ｆ５Ｅｎｄ０３／１Ｆ３Ｅｎｄ０３またはプライマー対１Ｆ５Ｅｎｄ０４／１Ｆ３Ｅｎｄ０４のいずれかを用いたＰＣＲ増幅により、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９のゲノムＤＮＡからおよそ８ｋｂの予測されるサイズを有する断片が得られた。これとは対照的に、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０４７４−７または非トランスジェニックトウモロコシ系統ＸＨＨ１３のゲノムＤＮＡからは、ＰＣＲ生成物は得られなかった。ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９およびイベントＤＡＳ−４０４７４−７がＨｉＩＩの形質転換と、その後の元のトランスジェニックイベントのトウモロコシ系統ＸＨＨ１３との戻し交雑により作製されたことに鑑みて、これらの２つのイベントのそれぞれにおけるゲノムの大部分は、トウモロコシ系統ＸＨＨ１３に理論的に由来する。ａａｄ−１導入遺伝子に近いフランキング境界配列だけが、元のゲノムＤＮＡから持ち越され、ＡＡＤ−１イベント遺伝子移入プロセス中に保存されたが、ゲノム配列のその他の領域は、ＸＨＨ１３のゲノム配列により置き換えられたと考えられる。したがって、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０４７４−７およびＸＨＨ１３のゲノムＤＮＡから、プライマー対１Ｆ５Ｅｎｄ０３／１Ｆ３Ｅｎｄ０３またはプライマー対１Ｆ５Ｅｎｄ０４／１Ｆ３Ｅｎｄ０４のいずれを用いても断片が増幅されなかったことは、驚くことではない。およそ３．１および３．３ｋｂの断片が、プライマー対１Ｆ５Ｅｎｄ０３／１Ｆ３Ｅｎｄ０３および１Ｆ５Ｅｎｄ０４／１Ｆ３Ｅｎｄ０４をそれぞれ用いて、トウモロコシ系統ＨｉＩＩおよびＢ７３のゲノムＤＮＡから増幅されたが、トウモロコシ系統Ａ１８８では増幅されなかった。この結果は、境界配列がトウモロコシ系統Ｂ７３のゲノムを起源とすることを示す。
Ｂ７３／ＨｉＩＩからのトウモロコシゲノムＤＮＡのさらなるクローニングを行って、フランキング境界配列の正当性を確実にした。ＰＣＲ増幅断片を配列決定して、Ｂ７３／ＨｉＩＩゲノムＤＮＡの特定の場所に組み込まれた挿入ＤＮＡ領域を証明した。プライマーは、得られた配列に基づいて設計した。プライマーセットＡｍｐ１Ｆ／Ａｍｐ５Ｒを用いて、天然Ｂ７３／ＨｉＩＩゲノムからの５’から３’の接合部に及ぶ、挿入ＤＮＡを有さない２２１２ｂｐの断片を増幅した。配列解析により、導入遺伝子挿入遺伝子座において天然Ｂ７３ゲノムから２塩基対の欠失があったことが明らかになった。クローニングされた天然Ｂ７３ゲノム断片からのＤＮＡ配列の解析は、１つのＯＲＦ（＞＝２００コドン）が３’組み込み接合部領域の下流にあることを同定した。さらに、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９が組み込まれた元の遺伝子座にわたって、その他のＯＲＦは存在しない。ＢＬＡＳＴ検索によっても、イベントＤＡＳ４０２７８−９からの５’末端および３’末端の両方の境界配列が、同じトウモロコシＢＡＣクローン上で隣同士にあることが確認された。
ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の５’組み込み接合部の独自性に鑑みて、特異的ＰＣＲプライマーの２つの対である１Ｆ５ＥｎｄＴ１Ｆ／１Ｆ５ＥｎｄＴ１ＲおよびＣｏｒｎ２７８−Ｆ／Ｃｏｒｎ２７８−Ｒを設計して、この挿入断片から植物ゲノムへの接合部を増幅した。予想されたように、所望のＤＮＡ断片は、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９のゲノムＤＮＡでのみ生じたが、いずれのその他のトランスジェニックまたは非トランスジェニックトウモロコシ系統では生じなかった。したがって、これらの２つのプライマー対は、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９イベント特異的な識別子として用いることができる。
〔実施例４〕 ＤＡＳ−４０２７８−９のフランキングＳＳＲマーカーによるゲノムの特徴決定
ゲノム挿入部位を特徴決定して示すために、挿入断片の近傍にあるマーカー配列を決定した。多形ＳＳＲマーカーのパネルを用いて、導入遺伝子の場所を同定して地図にした。イベントｐＤＡＳ１７４０−２７８は、第２染色体上で、２００８ＤＡＳトウモロコシ連鎖地図上のおよそ２０ｃＭにてＳＳＲマーカーであるＵＭＣ１２６５とＭＭＣ０１１１との間のおよそ２０ｃＭにある。表６に、導入遺伝子ｐＤＡＳ１７４０−２７８の近傍にあると見出されるこれらの２つのマーカーについてのプライマー情報をまとめる。
Figure 0006057920
（実施例４．１）
ｇＤＮＡ単離
ｇＤＮＡを、葉の押し抜きからＤＮＥａｓｙ ９６植物テストキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて抽出した。プロトコールを改変して、自動化のために適応させた。単離されたｇＤＮＡを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）からのＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）色素を用いて定量した。ｇＤＮＡの濃度を、全ての試料について５ｎｇ／μｌに、滅菌脱イオン水を用いて希釈した。
（実施例４．２）
マーカーを用いるｇＤＮＡのスクリーニング
希釈したｇＤＮＡの遺伝子型を、単純配列反復（ＳＳＲ）マーカーのサブセットを用いて決定した。ＳＳＲマーカーを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で、６−ＦＡＭ、ＨＥＸ／ＶＩＣまたはＮＥＤ（それぞれ青、緑および黄色）の蛍光タグで標識したフォワードプライマーを用いて合成した。マーカーをそれらの蛍光タグおよびアンプリコンサイズに基づいて群またはパネルに分けて、ＰＣＲ後の多重化および分析を容易にした。
ＰＣＲを、３８４ウェルアッセイプレートにおいて、５ｎｇのゲノムＤＮＡ、１．２５×ＰＣＲバッファー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、０．２０μＭの各フォワードおよびリバースプライマー、１．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１５ｍＭの各ｄＮＴＰならびに０．３単位のＨｏｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含有する各反応で行った。増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム９７００において、３８４−二重ヘッドモジュール（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて行った。増幅プログラムは、次のとおりであった：（１）９５℃にて１２分間のＴａｑの最初の活性化、（２）９４℃にて３０秒、（３）５５℃にて３０秒、（４）７２℃にて３０秒、（５）ステップ２〜４を４０サイクル反復、そして（６）７２℃にて３０分間の最終伸長。各ＳＳＲマーカーパネルについてのＰＣＲ生成物を、同じ植物からの２μｌの各ＰＣＲ生成物を合計容量６０μｌの滅菌脱イオン水に加えることにより一緒に多重化した。多重化したＰＣＲ生成物のうち、０．５μｌを、１：１００比率のＧｅｎｅＳｃａｎ５００塩基対ＬＩＺサイズ標準物質およびＡＢＩ ＨｉＤｉホルムアミド（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含む５μｌのローディングバッファーを含有する３８４ウェルローディングプレートにスタンプした。試料を、次いで、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７３０ｘｌ ＤＮＡアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に、製造者の推奨を用いて３６分間の全運転時間でキャピラリー電気泳動のために載せた。マーカーのデータは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７３０ｘｌ自動化シーケンサーデータ収集ソフトウェアバージョン４．０により収集し、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ４．０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、対立遺伝子特徴決定および断片サイズ標識について抽出した。
（実施例４．３）
ＳＳＲマーカーの結果
導入遺伝子の近傍で同定されたフランキングマーカーについてのプライマーデータを、表６に列挙する。２つの緊密に関連するマーカーであるＵＭＣ１２６５およびＭＭＣ０１１１は、第２染色体上の導入遺伝子挿入断片からおよそ２０ｃＭ離れて配置される。
〔実施例５〕 イベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるａａｄ−１タンパク質の特徴決定
トランスジェニックメイズイベントＤＡＳ−４０２７８−９に由来する組換えａａｄ−１タンパク質の生化学的特性を、特徴決定した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルーで染色、および糖タンパク質検出法）、ウェスタンブロット、免疫診断テストストリップアッセイ、マトリクス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）およびタンデムＭＳによるタンパク質配列決定解析を用いて、タンパク質の生化学的特性を特徴決定した。
（実施例５．１）
免疫診断ストリップアッセイ
ＤＡＳ−４０２７８−９の葉の組織におけるａａｄ−１タンパク質の存在を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｎｏｓｔｉｃａからの商業的に調製された免疫診断テストストリップを用いて確認した。ストリップは、葉の粗抽出物を試験することにより、トランスジェニック植物と非トランスジェニック植物とを区別できた（データは示さず）。非トランスジェニック抽出物（ＸＨＨ１３）は、検出可能な量の免疫反応性タンパク質を含有しなかった。この結果は、ウェスタンブロット解析によっても確認された。
ａａｄ−１タンパク質の発現を試験するために、免疫診断ストリップ解析を行った。４つの葉の押し抜きを、ＸＨＨ１３（対照植物）およびイベントＤＡＳ−４０２７８−９のそれぞれの植物から、個別の標識された１．５ｍＬのマイクロフュージチューブのスナップキャップの蓋の間に組織を挟むことにより回収した。実験室で受け取る際に、０．５ｍＬのａａｄ−１抽出バッファー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｎｏｓｔｉｃａ、Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ、ＮＪ）を各チューブに加え、組織を、使い捨て乳棒を用い、その後、試料を約１０秒間振とうすることによりホモジナイズした。ホモジナイゼーションの後に、テストストリップをチューブに入れ、約５分間展開させた。植物抽出物中のａａｄ−１タンパク質の存在または不在は、免疫診断ストリップ上にテストラインが出現する（または出現しない）ことに基づいて確認された。ａａｄ−１タンパク質の発現がトランスジェニックイベントについて一旦確認されると、メイズの茎の組織を収穫し、凍結乾燥し、使用時までおよそ−８０℃で貯蔵した。
（実施例５．２）
トウモロコシからのａａｄ−１タンパク質の精製
免疫精製されたメイズ由来のａａｄ−１タンパク質（分子量：約３３ｋＤａ）またはトウモロコシ茎組織からの水性粗抽出物を調製した。全ての葉および茎の組織を収穫し、実験室まで次のようにして輸送した。葉を、ハサミで植物から切断し、布の袋に入れ、将来の使用のためにおよそ−２０℃で貯蔵した。別に、茎を土壌の線のすぐ上で切断し、布の袋に入れ、およそ−８０℃にて約６時間、すぐに凍結させた。茎を、次いで、凍結乾燥器に５日間入れて水分を除去した。組織が一旦完全に乾燥したら、これらを微細な粉末にドライアイスを用いて粉砕し、必要になるまでおよそ−８０℃にて貯蔵した。
メイズ由来のａａｄ−１タンパク質を、凍結乾燥した茎の組織から、リン酸塩ベースのバッファー（バッファー成分について表７を参照されたい）中で、約３０グラムの凍結乾燥組織を、冷却した１０００ｍＬのガラスブレンダーに秤量し、５００ｍＬの抽出バッファーを加えることにより抽出した。組織を、ハイで６０秒間ブレンドし、可溶性タンパク質を、試料を３０，０００×ｇにて２０分間遠心分離することにより採集した。ペレットを記載されるようにして再抽出し、上清を併せ、０．４５μフィルタを通して濾過した。濾過した上清を、およそ＋４℃にて、；ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）にコンジュゲートされた、Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉｎｃ．（ＭＡｂ ４７３Ｆ１ ８５．１；精製プロテインＡ；ロット＃：６０９．０３Ｃ−２−４；６．５ｍｇ／ｍＬ（合計約３５．２ｍｇ））（Ｗｉｎｄｈａｍ、ＭＥ）により調製されたモノクローナル抗体とコンジュゲートされた抗ａａｄ−１免疫親和性カラムに載せた。未結合タンパク質を回収し、カラムを予め冷却した２０ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファーｐＨ８．０で十分に洗浄した。結合したタンパク質は、３．５Ｍ ＮａＳＣＮ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ８．０バッファーを用いて溶出された。７つの５ｍＬ画分を回収し、画分番号２→７を一晩、およそ＋４℃にて１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０バッファーに対して透析した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにより調べ、残りの試料をおよそ＋４℃にて、その後の解析に用いるまで貯蔵した。
Figure 0006057920
免疫親和性カラムと結合したタンパク質をＳＤＳＰＡＧＥにより調べ、結果は、溶出された画分が、ａａｄ−１タンパク質を、３３ｋＤａのおおよその分子量で含有したことを示した。さらに、ウェスタンブロットも行って、これは、ａａｄ−１タンパク質について陽性であった。メイズ由来ａａｄ−１タンパク質を、約３０ｇの凍結乾燥茎材料から単離した。
（実施例５．３）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット
イベントＤＡＳ−４０２７８−９およびＸＨＨ１３の茎からの凍結乾燥組織（約１００ｍｇ）を２ｍＬマイクロフュージチューブに秤量し、１０％植物プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する約１ｍＬのＰＢＳＴ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で抽出した。抽出は、４つの小さいボールベアリングを加え、試料を１分間Ｇｅｎｏ粉砕することにより容易にした。粉砕の後に、試料を２０，０００×ｇにて５分間遠心分離し、上清を４：１で５×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（２％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、０．２ｍｇ／ｍＬブロモフェノールブルー、１０％の新しく加えた２−メルカプトエタノールを含有する５０％（ｗ／ｗ）グリセロール）と混合し、約１００℃にて５分間加熱した。短い遠心分離の後に、４５μＬの上清を、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎセルゲルモジュールに装着されたＢｉｏＲａｄ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に直接載せた。微生物由来ａａｄ−１の陽性の参照標準物質を、１ｍｇ／ｍＬにてＰＢＳＴ ｐＨ７．４に再懸濁し、ＰＢＳＴでさらに希釈した。試料を、次いで、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｅｍｍｌｉバッファーと５％２−メルカプトエタノールとともに混合し、前に記載するようにして処理した。電気泳動は、Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて、１５０〜２００Ｖの電圧で、前方の色素がゲルの端に到達するまで行った。分離の後に、ゲルを半分に切断し、一方の半分を、Ｐｉｅｒｃｅ ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅタンパク質染色を用いて染色し、他方の半分を、ニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に、Ｍｉｎｉトランスブロット電気トランスファーセル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を６０分間、１００ボルトの一定電圧の下で用いてエレクトロブロットした。トランスファーバッファーは、２０％メタノールおよびＢｉｏ−ＲａｄからのＴｒｉｓ／グリシンバッファーを含有していた。免疫検出のために、メンブレンを、ａａｄ−１特異的ポリクローナルウサギ抗体（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ、プロテインＡ精製ウサギポリクローナル抗体ロット＃：ＤＡＳ Ｆ１ １９７−１５ １、１．６ｍｇ／ｍＬ）でプローブ付加した。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）とアルカリホスファターゼ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）とのコンジュゲートを２次抗体として用いた。ＳｉｇｍａＦａｓｔ ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を、免疫反応性タンパク質バンドを現像して視覚化するために用いた。メンブレンを水で十分に洗浄して反応を停止させ、結果の記録を、デジタルスキャナ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて取得した。
Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）により生成されるａａｄ−１において、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて視覚化される主なタンパク質バンドは、およそ３３ｋＤａであった。予測されたように、対応するメイズ由来ａａｄ−１タンパク質（イベントＤＡＳ−４０２７８−９）は、微生物により発現されるタンパク質と同一のサイズであった。予想されたように、植物の精製された画分は、ａａｄ−１タンパク質に加えて、マイナーな量の非免疫反応性不純物を含有した。同時精製されたタンパク質は、カラムマトリクスとの弱い相互作用によりカラムに保持されているか、厳しい溶出条件下でカラムからモノクローナル抗体を浸出させると考えられた。他の研究者も、臭化シアン活性化セファロース４Ｂ免疫吸着剤上でのペプチドおよびアミノ酸の非特異的吸着について報告している（KennedyおよびBarnes、1983;Holroydeら、1976;PodlaskiおよびStern、2008）。
シュードモナス（Pseudomonas）由来ａａｄ−１タンパク質は、ポリクローナル抗体ウェスタンブロット解析により、予測されるサイズの陽性シグナルを示した。これは、ＤＡＳ−４０２７８−９トランスジェニックメイズ茎抽出物においても観察された。ａａｄ−１ウェスタンブロット解析において、免疫反応性タンパク質は、対照ＸＨＨ１３抽出物において観察されず、代替のサイズのタンパク質（凝集体または分解生成物）は、トランスジェニック試料において観察されなかった。
（実施例５．４）
翻訳後グリコシル化の検出
免疫親和性クロマトグラフィーにより精製されたメイズ由来ａａｄ−１タンパク質（画分＃３）を、４：１で５×Ｌａｅｍｍｌｉバッファーと混合した。微生物由来ａａｄ−１、ダイズトリプシン阻害剤、ウシ血清アルブミンおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼを、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で、植物由来ａａｄ−１のおおよその濃度まで希釈し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｅｍｍｌｉバッファーと混合した。タンパク質を、次いで、約９５℃にて５分間加熱し、２００００×ｇにて２分間遠心分離して、清澄化された上清を得た。得られた上清を、Ｂｉｏ−ＲａｄＣｒｉｔｅｒｉｏｎゲルに直接アプライし、ＸＴ ＭＥＳ泳動バッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で、電気泳動を１７０Ｖにて約６０分間運転した以外は本質的に上で記載したようにして電気泳動した。電気泳動の後に、ゲルを半分に切断し、一方の半分を、全タンパク質について、製造者のプロトコールに従ってＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ染料で染色した。染色が完了した後に、ゲルを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ濃度計で走査して、ゲルの永続的な視覚的記録を得た。ゲルの他方の半分は、ＧｅｌＣｏｄｅ糖タンパク質染色キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を、製造者のプロトコールに従って用いて染色して、糖タンパク質を視覚化した。糖タンパク質（検出限界はバンドあたり０．６２５ｎｇほど低い）を、淡いピンクの背景の上にマゼンタのバンドとして視覚化した。糖タンパク質染色が完了した後に、ゲルをＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄデジタルスキャナで走査して、ゲルの永続的な視覚的記録を得た。グリコシル化染色の画像を取得した後に、ゲルをＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅで染色して、非グリコシル化タンパク質の存在について確認した。結果は、メイズ由来および微生物由来のａａｄ−１タンパク質がともに、検出可能な共有結合された炭水化物を有さないことを示した。この結果は、ペプチド質量フィンガープリンティングによっても確認された。
（実施例５．５）
メイズ由来およびシュードモナス（Pseudomonas）由来のａａｄ−１の質量分析ペプチド質量フィンガープリンティングおよび配列決定
シュードモナス（Pseudomonas）由来およびメイズ由来のａａｄ−１の質量分析解析を行った。トランスジェニックトウモロコシの茎に由来するａａｄ−１タンパク質（イベントＤＡＳ−４０２７８−９）を、トリプシンによる溶液消化に供し、その後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよびＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳに供した。検出されたペプチドの質量を、メイズ由来ａａｄ−１タンパク質の配列における可能性のあるプロテアーゼ切断部位に基づいて推定したものと比較した。理論的切断は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、Ｐｒｏｔｅｏｍｅｔｒｉｃｓ ＬＬＣからのＰｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｗｏｒｋｓｈｅｅｔ（ＰＡＷＳ）フリーウェアを用いて作製した。一旦変性させたａａｄ−１タンパク質は、プロテアーゼにより容易に消化され、多数のペプチドピークを生じる。
トランスジェニックメイズ由来ａａｄ−１タンパク質（イベントＤＡＳ−４０２７８−９）のトリプシン消化において、検出されたペプチド断片は、タンパク質のＣ末端にて１つの小さいトリプシン断片であるＦ２４８〜Ｒ２５３と、１つの短い（２アミノ酸）ペプチド断片とだけを欠いて、ほぼ完全なタンパク質配列をカバーした。この解析により、メイズ由来タンパク質アミノ酸配列が、微生物由来ａａｄ−１タンパク質のものと一致したことが確認された。これらの解析の結果は、メイズ由来ａａｄ−１タンパク質のアミノ酸配列が、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）発現タンパク質と等価であったことを示す。
（実施例５．５．１）
トリプシンペプチド断片配列決定
ペプチド質量フィンガープリンティングに加えて、メイズ由来ａａｄ−１タンパク質（メイズイベントＤＡＳ−４０２７８−９から免疫親和性精製された）のＮおよびＣ末端のアミノ酸残基を配列決定し、微生物由来タンパク質の配列と比較した。タンパク質配列を、タンデム質量分析により、微生物由来およびメイズ由来タンパク質の最初の１１残基について得た（表８）。両方のタンパク質についてのアミノ酸配列は、Ａ’ＨＡＡＬＳＰＬＳＱＲ”（配列番号３０）であり、Ｎ末端のメチオニンは、アミノペプチダーゼにより除去されていることが示された（表８）。Ｎ末端ａａｄ−１タンパク質配列は、Ｍ’ＡＨＡＡＬＳＰＬＳＱＲ’２（配列番号３１）と予測された。これらの結果は、メイズおよびＰ．フルオレセンス（P. fluorescens）における翻訳の間またはその後に、Ｎ末端メチオニンが、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）により切断されることを示唆する。ＭＡＰは、タンパク質の２番目の残基がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＶａｌのように小さい場合、メチオニル残基を迅速に切断する（Walsh、2006）。メチオニンが除去されていることに加えて、ａａｄ−１タンパク質のＮ末端ペプチドの小さい部分が、Ｎ末端メチオニンが切断された後にアセチル化されたことが示された（表８）。この結果は、真核生物（植物）発現タンパク質でしばしば遭遇する。なぜなら、およそ８０〜９０％のＮ末端残基が改変されるからである（PolevodaおよびSherman、2003）。また、セリンおよびアラニンをＮ末端に有するタンパク質は、最も頻繁にアセチル化されることが示されている（PolevodaおよびSherman、2002）。２つの同時翻訳プロセス、Ｎ末端メチオニン残基の切断およびＮ末端アセチル化は、はるかに最も一般的な改変であり、大多数の真核生物タンパク質（約８５％）で生じる（PolevodaおよびSherman、2002）。しかし、Ｎ末端アセチル化に関連する生物学的重要性を証明する例は希である（PolevodaおよびSherman、2000）。
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Ｎ−アセチル化に加えて、メイズ由来ａａｄ−１タンパク質の精製中に、わずかなＮ末端切断も出現した（表８）。これらの「不揃いの末端」は、メイズ由来タンパク質からのアミノ酸Ａ２、Ｈ３およびＡ４（多様な形態および量で）の喪失をもたらした。この切断は、ａａｄ−１タンパク質の精製中に生じたと考えられる。なぜなら、葉の粗抽出物のウェスタンブロットプローブは、微生物由来ａａｄ−１タンパク質と同じＭＷにて単一のはっきりしたバンドを含有したからである。ウェスタンブロットした試料についての抽出バッファーは、過剰のプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有し、これは、セリン、システイン、アスパラギン酸およびメタロプロテアーゼならびにアミノペプチダーゼの阻害について広い特異性を有するプロテアーゼ阻害剤の混合物を含有する。
メイズ由来および微生物由来ａａｄ−１タンパク質のＣ末端配列を上記のようにして決定し、予測されるアミノ酸配列と比較した（表９）。結果は、測定された配列が、予測された配列と同一であり、メイズ由来および微生物由来ａａｄ−１タンパク質がともに同一でＣ末端において変更がないことを示した。
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〔実施例６〕 イベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有するハイブリッドメイズ系統の野外での発現、栄養組成解析および農業経済学的特徴
この研究の目的は、トウモロコシ組織において見出されるＡＡＤ−１タンパク質のレベルを決定することであった。さらに、トウモロコシのフォレージおよび穀粒に対して組成解析を行って、同質遺伝子非形質転換トウモロコシ系統とトランスジェニックトウモロコシ系統ＤＡＳ−４０２７８−９との間の等価性を調べた（噴霧なし、２，４−Ｄを噴霧、キザロホップを噴霧および２，４−Ｄとキザロホップとを噴霧）。同質遺伝子非形質転換トウモロコシ系統の農業経済学的特徴も、ＤＡＳ−４０２７８−９トウモロコシと比較した。野外発現、組成および農業経済学的試行は、米国およびカナダの主要なトウモロコシ生産地域内にある６つの試験現場で行った。これらの現場は、多様な農業経済学的実施と環境条件の地域を表す。試行は、Ｉｏｗａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（２箇所）、Ｉｎｄｉａｎａ、ＮｅｂｒａｓｋａおよびＯｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａで行った。
対照、噴霧なしＡＡＤ−１、ＡＡＤ−１＋キザロホップ、ＡＡＤ−１＋２，４−ＤおよびＡＡＤ−１＋両方の参加項目試料についての全ての現場の平均値は、トウモロコシについての文献の範囲内であった。噴霧なしＡＡＤ−１、ＡＡＤ−１＋キザロホップ、ＡＡＤ−１＋２，４−ＤまたはＡＡＤ−１＋両方のトウモロコシと対照との間での限定数の著しい相違が観察されたが、相違は、生物学的に意味があると考えられなかった。なぜなら、これらは小さく、結果は、商業的なトウモロコシで見出される範囲内であったからである。組成の結果のプロットは、噴霧なしＡＡＤ−１、ＡＡＤ−１＋キザロホップ、ＡＡＤ−１＋２，４−ＤまたはＡＡＤ−１＋両方のトウモロコシおよび対照トウモロコシ系統のうちでのいずれの生物学的に意味がある処置に関連する組成の相違も示さない。結果として、噴霧なしＡＡＤ−１、ＡＡＤ−１＋キザロホップ、ＡＡＤ−１＋２，４−ＤおよびＡＡＤ−１＋両方のトウモロコシの組成の結果により、ＡＡＤ−１（イベントＤＡＳ４０２７８−９）トウモロコシが従来のトウモロコシ系統と等価であることが確認される。
（実施例６．１）
試験したトウモロコシ系統
ＤＡＳ−４０２７８−９イベントを含有するハイブリッド種子および本質の試験系統と同じ遺伝子背景の従来のハイブリッド種子であるがＤＡＳ−４０２７８−９イベントを含有しない対照植物を、表１０に列挙する。
Figure 0006057920
上記のトウモロコシ植物を、米国およびカナダの主要なトウモロコシ成長地域内の場所で成長させた。６つの野外試験施設、Ｒｉｃｈｌａｎｄ、ＩＡ；Ｃａｒｌｙｌｅ、ＩＬ；Ｗｙｏｍｉｎｇ、ＩＬ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＩＮ；Ｙｏｒｋ、ＮＥ；およびＢｒａｎｃｈｔｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ（ＩＡ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＮ、ＮＥおよびＯＮという）は、トウモロコシについての多様な農業経済学的実施と環境条件の地域を表す。
試験および対照のトウモロコシ種子は、１列あたりおよそ２４の種子で、各列内の種子の間隔がおよそ１０インチ（２５ｃｍ）の播種比率で植えた。各現場において、各処置の４つの反復プロットを確立し、各プロットは、２〜２５ｆｔの列からなった。プロットを、完全乱塊法（ＲＣＢ）で配置し、各現場にて独自の無作為化を行った。各トウモロコシプロットは、同様の成熟度の非トランスジェニックメイズハイブリッドの２列を境界とした。試行現場全体は、同様の相対的成熟度の非トランスジェニックメイズハイブリッドの最小限で１２列（または３０ｆｔ）で囲まれていた。
適当な昆虫、雑草および疾患を管理する実施を用いて、農業経済学的に許容され得る作物を生産した。月の最高および最低気温と、降水量および潅漑は、現場について平均的であった。これらの範囲は、トウモロコシ生産において典型的に遭遇するものである。
（実施例６．２）
除草剤散布
除草剤処理を、エーカーあたりおよそ２０ガロン（１８７Ｌ／ｈａ）の噴霧容量で行った。これらの散布は、商業的実施の最大限のラベル割合を反復するように設計した。表１１に、用いた除草剤を列挙する。
Figure 0006057920
２，４−Ｄ（Ｗｅｅｄａｒ６４）を、３回のオーバーザトップ散布として試験参加項目４および５に用いた（季節合計３ｌｂ ａｅ／Ａ）。個別の散布は出芽前であり、およそＶ４およびＶ８〜Ｖ８．５段階であった。個別の目標散布割合は、Ｗｅｅｄａｒ６４について１．０ｌｂ ａｅ／Ａ、または１１２０ｇ ａｅ／ｈａであった。実際の散布割合は、１０９６〜１２３１ｇ ａｅ／Ａの範囲であった。
キザロホップ（ＡｓｓｕｒｅＩＩ）は、単一のオーバーザトップ散布として試験参加項目３および５に用いた。散布時期は、およそＶ６成長段階であった。目標散布割合は、ＡｓｓｕｒｅＩＩについて０．０８２５ｌｂ ａｉ／Ａ、または９２ｇ ａｉ／ｈａであった。実際の散布割合は、９０．８〜１０３ｇ ａｉ／ｈａの範囲であった。
（実施例６．３）
農業経済学的データ収集および結果
農業経済学的特徴を、各場所でのブロック２、３および４内の全ての試験参加項目について記録した。表１２に、測定された以下の特徴を列挙する。
Figure 0006057920
対照、ａａｄ−１噴霧なし、ａａｄ−１＋２，４−Ｄ、ａａｄ−１＋キザロホップおよびａａｄ−１＋両方の参加項目から収集した農業経済学的データの解析を行った。現場間解析について、場所間サマリー解析における早期個体群（Ｖ１およびＶ４）、活力、最終個体群、作物損傷、シルキング時期、花粉落下時期、茎倒伏、根倒伏、疾患発生、昆虫被害、成熟日数、植物高さおよび花粉生存度（形状および色）の値についての統計学的に有意な相違は観察されなかった（表１３）。緑度保持および雌穂高さについて、有意な対応のあるｔ検定が、対照とａａｄ−１＋キザロホップ参加項目との間で観察されたが、有意な全体的な処理効果または偽発見率（ＦＤＲ）調整ｐ値を伴わなかった（表１３）。
Figure 0006057920
Figure 0006057920
（実施例６．４）
試料回収
発現および組成解析のための試料を、表１４に列挙するようにして回収した。
Figure 0006057920
（実施例６．５）
トウモロコシ試料中のａａｄ−１タンパク質の決定
トウモロコシの試料を、ａａｄ−１タンパク質の量について解析した。可溶性で抽出可能なａａｄ−１タンパク質を、Ｂｅａｃｏｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）から購入した酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを用いて定量した。
トウモロコシ組織の試料を、試験植物から単離し、粗粉砕、凍結乾燥およびＧｅｎｏ／粉砕機（Ｃｅｒｔｉｐｒｅｐ、Ｍｅｔｕｃｈｅｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を用いる微粉砕（必要であれば）により発現解析のために調製した。花粉について、追加の調製は必要でなかった。ａａｄ−１タンパク質を、トウモロコシ組織から、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する、洗浄剤Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）を用いて抽出した。花粉について、１ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウムおよび２％プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する０．５％ＰＢＳＴ／ＢＳＡバッファーを用いてタンパク質を抽出した。植物組織および花粉抽出物を遠心分離した。水性の上清を回収し、必要であれば適当なバッファーで希釈し、サンドイッチフォーマットのａａｄ−１ ＥＬＩＳＡキットを用いて解析した。キットは、以下のステップを用いた。希釈試料の分割量と、ビオチン化抗ａａｄ−１モノクローナル抗体とを、固定化抗ａａｄ−１モノクローナル抗体で被覆したマイクロタイタープレートのウェル中でインキュベートする。これらの抗体は、ウェル中のａａｄ−１タンパク質と結合して、可溶性抗体と固定化抗体との間のａａｄ−１タンパク質で「サンドイッチ」を形成する。未結合の試料およびコンジュゲートは、次いで、ＰＢＳＴで洗浄することによりプレートから除去する。過剰量のストレプトアビジン−酵素（アルカリホスファターゼ）コンジュゲートを、インキュベーションのためにウェルに加える。インキュベーション期間の最後に、未結合の試薬を、洗浄によりプレートから除去した。酵素基質をその後加えることにより、着色生成物が得られた。ａａｄ−１は抗体サンドイッチ中に結合しているので、発色のレベルは、試料中のａａｄ−１の濃度と関連した（すなわち、より低い残存濃度は、より低い発色をもたらす）。４０５ｎｍでの吸光度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｖ−ｍａｘまたはＳｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ １９０プレートリーダーを用いて測定した。検量曲線を作製し、未知試料中のａａｄ−１濃度を、プレートリーダーと適合するＳｏｆｔ−ＭＡＸ Ｐｒｏ（商標）ソフトウェアを用いて多項回帰等式から算出した。試料を、報告した二重ウェルの平均濃度を有する二重ウェル中で解析した。
多様なトウモロコシマトリクスにおけるａａｄ−１タンパク質濃度のまとめ（現場間で平均した）を、表１５に示す。ａａｄ−１平均タンパク質濃度は、Ｒ１段階の根における２．８７ｎｇ／ｍｇ乾燥重量から、花粉中の１２７ｎｇ／ｍｇの範囲であった。噴霧なしおよび噴霧ありのプロットについての発現の結果は、同様であった。ａａｄ−１タンパク質は、Ｉｎｄｉａｎａの現場からの１つの対照の根試料を除いて、いずれの対照試料からも検出されなかった。
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（実施例６．６）
組成解析
トウモロコシのフォレージおよび穀粒の試料を、種々の試験を用いて栄養素含量について解析した。フォレージについて行った解析は、灰分、全脂質、水分、タンパク質、炭水化物、粗繊維、酸性デタージェント繊維、中性デタージェント繊維、カルシウムおよびリンを含んだ。穀粒について行った解析は、近成組成（灰分、全脂質、水分、タンパク質、炭水化物、粗繊維、酸性デタージェント繊維）、中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）、ミネラル、アミノ酸、脂肪酸、ビタミン、２次代謝産物および抗栄養素を含んだ。トウモロコシのフォレージおよび穀粒についての栄養素解析の結果を、文献で報告されている値と比較した（Watson、1982(4);Watson、1984(5);ILSI Crop Composition Database、2006(6);OECD Consensus Document on Compositional Considerations for maize、2002(7);およびCodex Alimentarius Commission 2001(8)を参照されたい）。
（実施例６．６．１）
フォレージの近成組成、繊維およびミネラルの解析
対照、噴霧なしａａｄ−１、ａａｄ−１＋キザロホップ、ａａｄ−１＋２，４−Ｄおよびａａｄ−１＋両方の参加項目からのトウモロコシフォレージ試料中のタンパク質、脂質、灰分、水分、炭水化物、ＡＤＦ、ＮＤＦ、カルシウムおよびリンの解析を行った。全ての場所にわたる結果のまとめを表１６に示す。現場間および現場個別の解析について、全ての近成組成、繊維およびミネラルの平均値は、文献の範囲内であった。対照とトランスジェニック参加項目との間に、現場間解析において、水分、ＡＤＦ、ＮＤＦ、カルシウムおよびリンについて統計学的な相違は観察されなかった。タンパク質および灰分について、有意な対応のあるｔ検定が、噴霧なしＡＡＤ−１（タンパク質）、ａａｄ−１＋キザロホップ（タンパク質）およびａａｄ−１＋両方（灰分）について観察されたが、有意な全体的な処理効果またはＦＤＲ調整ｐ値を伴わなかった。脂質について、有意な対応のあるｔ検定および調整ｐ値がともに、ａａｄ−１＋キザロホップについて対照と比較して観察されたが、有意な全体的な処理効果は観察されなかった。炭水化物について、統計的に有意な全体的な処理効果、対応のあるｔ検定およびＦＤＲ調整ｐ値が、ａａｄ−１＋キザロホップと対照との間に観察された。炭水化物についても、有意な対応のあるｔ検定が噴霧なしａａｄ−１参加項目について観察されたが、有意なＦＤＲ調整ｐ値は観察されなかった。これらの相違は、生物学的に意味がない。なぜなら、これらの分析項目についての全ての現場間の結果は、トウモロコシについて報告された文献の範囲内であり、対照からの差は小さかったからである（＜２３％）。
Figure 0006057920
（実施例６．６．２）
穀粒の近成組成および繊維の解析
全ての場所にわたるトウモロコシ穀粒における近成組成（タンパク質、脂質、灰分、水分、コレステロールおよび炭水化物）および繊維（ＡＤＦ、ＮＤＦおよび全食物繊維）に関する結果のまとめを、表１７に示す。近成組成および繊維についての全ての結果は、文献の範囲内であり、現場間解析において、対照とトランスジェニック参加項目との間に、脂質、灰分、ＮＤＦおよび全食物繊維について有意な相違は観察されなかった。水分について、有意な全体的な処理効果が観察されたが、有意な対応のあるｔ検定またはＦＤＲ調整ｐ値を伴わなかった。ＡＤＦについて、有意な対応のあるｔ検定がａａｄ−１＋両方について観察されたが、有意な全体的な処理効果またはＦＤＲ調整ｐ値はみられなかった。タンパク質および炭水化物の両方について、有意な対応のある検定、調整ｐ値および全体的な処理効果が、噴霧なしａａｄ−１、ａａｄ−１＋キザロホップおよびａａｄ−１＋両方についてみられた。これらの相違は小さく（＜１２％）、全ての値は文献の範囲内であったので、相違は生物学的に意味があるとは考えられない。
Figure 0006057920
（実施例６．６．３）
穀粒のミネラル解析
ミネラルであるカルシウム、クロム、銅、ヨウ素、鉄分、マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、セレン、ナトリウムおよび亜鉛についてのトウモロコシ穀粒試料の解析を行った。全ての場所にわたる結果のまとめを、表１８に示す。全ての結果は、報告される文献の範囲内であった。現場間解析について、カルシウム、銅、鉄分およびカリウムについて有意な相違は観察されなかった。クロム、ヨウ素、セレンおよびナトリウムについての平均の結果は、方法の定量限界未満であった。マグネシウムおよびリンについて、有意な対応のあるｔ検定が、噴霧なしａａｄ−１およびａａｄ−１＋キザロホップ参加項目について観察されたが、有意な全体的な処理効果またはＦＤＲ調整ｐ値を伴わなかった。マンガンおよびモリブデンについて、有意な対応のあるｔ検定が噴霧なしａａｄ−１について観察されたが、有意なＦＤＲ調整ｐ値および全体的な処理効果はみられなかった。ａａｄ−１＋両方の参加項目について、有意な対応のあるｔ検定が、亜鉛について観察されたが、有意なＦＤＲ調整ｐ値または全体的な処理効果は存在しなかった。さらに、対照からのこれらの相違は小さく（＜１３％）、全ての値は、入手可能である場合は文献の範囲内であった。
Figure 0006057920
（実施例６．６．４）
穀粒のアミノ酸解析
トウモロコシ試料を、アミノ酸含量について、対照、噴霧なしａａｄ−１、ａａｄ−１＋キザロホップ、ａａｄ−１＋２，４−Ｄおよびａａｄ−１＋両方のトウモロコシについて解析し、全ての場所にわたるおよび個別の野外の現場による結果のまとめを、表１９に示す。全てのアミノ酸のレベルは報告された文献の範囲内であり、現場間解析における有意な相違は、アルギニン、リジンおよびチロシンについて観察されなかった。いくつかのアミノ酸について、現場間解析において有意な相違が観察された。これらの場合において、対照のアミノ酸含量は、ａａｄ−１トランスジェニック系統よりも低く、これは、ａａｄ−１系統と比較して、対照穀粒における全体的により低いタンパク質含量と関連すると考えられる。噴霧なしａａｄ−１参加項目について、有意な全体的な処理効果とともに有意な対応のあるｔ検定およびＦＤＲ調整ｐ値が、アルギニン、グリシン、リジン、トリプトファンおよびチロシン以外の全てのアミノ酸についてみられた。ａａｄ−１＋キザロホップ参加項目について、有意な全体的な処理効果とともに有意な対応のあるｔ検定およびＦＤＲ調整ｐ値が、アルギニン、システイン、グリシン、リジン、トリプトファンおよびチロシン以外の全てのアミノ酸についてみられた。ａａｄ−１＋２，４−Ｄ参加項目について、有意な全体的な処理効果とともに有意な対応のあるｔ検定（有意なＦＤＲ調整ｐ値とともに）が、アルギニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、リジン、チロシンおよびバリン以外の全てのアミノ酸についてみられた。ａａｄ−１＋両方の参加項目について、有意な全体的な処理効果とともに有意な対応のあるｔ検定およびＦＤＲ調整ｐ値が、アルギニン、グリシン、リジン、セリン、トリプトファンおよびチロシン以外の全てのアミノ酸についてみられた。アミノ酸について観察された多くの相違があったが、相違は小さく（＜１５％）、全ての現場にわたって観察されず、全ての平均値は、報告された文献の範囲内であった。
Figure 0006057920
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（実施例６．６．５）
穀粒の脂肪酸解析
脂肪酸についてのトウモロコシ穀粒試料の解析を行った。全ての場所にわたる結果のまとめを、表２０に示す。これらの脂肪酸について解析した対照、噴霧なしａａｄ−１、ａａｄ−１＋キザロホップ、ａａｄ−１＋２，４−Ｄおよびａａｄ−１＋両方のトウモロコシ穀粒試料についての全ての結果は、発表された文献の範囲内であった。カプリル酸（８：０）、カプリン酸（１０：０）、ラウリン酸（１２：０）、ミリスチン酸（１４：０）、ミリストレイン酸（１４：１）、ペンタデカン酸（１５：０）、ペンタデセン酸（１５：１）、ヘプタデカン酸（１７：０）、ヘプタデセン酸（１７：１）、ガンマリノレン酸（１８：３）、エイコサジエン酸（２０：２）、エイコサトリエン酸（２０：３）およびアラキドン酸（２０：４）についての結果は、方法の定量限界（ＬＯＱ）未満であった。現場間解析において、１６：０パルミチン酸、１６：１パルミトレイン酸、１８：０ステアリン酸、１８：２リノール酸、１８：３リノレン酸および２０：０アラキジン酸について有意な相違は観察されなかった。１８：１オレイン酸および２０：１エイコセイン酸について、有意な対応のあるｔ検定が、噴霧なしａａｄ−１（１８：１）およびａａｄ−１＋２，４−Ｄ（１８：１および２０：１）参加項目について観察されたが、有意な全体的な処理効果またはＦＤＲ調整ｐ値は伴わなかった。２２：０ベヘン酸について、有意な全体的な処理効果および有意な対応のあるｔ検定が、ａａｄ−１＋２，４−Ｄおよびａａｄ−１＋両方についてみられたが、有意なＦＤＲ調整ｐ値は存在しなかった。
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（実施例６．６．６）
穀粒のビタミン解析
対照、噴霧なしａａｄ−１、ａａｄ−１＋キザロホップ、ａａｄ−１＋２，４−Ｄおよびａａｄ−１＋両方のトウモロコシ参加項目からのトウモロコシ穀粒試料におけるビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ナイアシンおよび葉酸のレベルを決定した。全ての場所にわたる結果のまとめを、表２１に示す。ビタミンＢ１２、ＤおよびＥは、用いた解析方法によって定量可能でなかった。ビタミンについて報告される全ての平均の結果は、利用可能である場合は報告された文献の値と同様であった。報告された文献の範囲がないビタミン（ビタミンＢ５およびＣ）の結果は、得られた対照の値と同様であった（対照から＜２２％の相違）。現場間解析について、ビタミンＢ１、Ｃおよびナイアシンを除いて、統計学的相違は観察されなかった。ビタミンＢ１についての有意な対応のあるｔ検定が、対照と噴霧なしａａｄ−１、ａａｄ−１＋キザロホップおよびａａｄ−１＋両方との間に観察されたが、有意な全体的な処理効果またはＦＤＲ調整ｐ値を伴わなかった。ビタミンＣについて、有意な全体的な処理効果が、有意な対応のあるｔ検定およびＦＤＲ調整ｐ値とともに、ａａｄ−１＋キザロホップおよびａａｄ−１＋２，４−Ｄについて観察された。ナイアシンについても同様に、有意な全体的な処理効果が、有意な対応のあるｔ検定およびＦＤＲ調整ｐ値とともに、ａａｄ−１＋キザロホップおよびａａｄ−１＋両方について観察された。ａａｄ−１＋２，４−Ｄについての有意な対応のあるｔ検定も、ａａｄ−１＋２，４−Ｄ参加項目についてナイアシンについて見出されたが、有意な全体的な処理効果またはＦＤＲ調整ｐ値を伴わなかった。相違は現場にわたって観察されず、値は文献の範囲内であった（入手可能である場合）ので、相違は、生物学的に意味があるとは考えられない。
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（実施例６．６．７）
穀粒の抗栄養素および２次代謝産物の解析
対照、噴霧なしａａｄ−１、ａａｄ−１＋キザロホップ、ａａｄ−１＋２，４−Ｄおよびａａｄ−１＋両方のトウモロコシ参加項目からのトウモロコシ穀粒試料における２次代謝産物（クマル酸、フェルラ酸、フルフラールおよびイノシトール）および抗栄養素（フィチン酸、ラフィノースおよびトリプシン阻害剤）のレベルを決定した。全ての場所にわたる結果のまとめを、表２２および２３に示す。現場間解析について、全ての値は、文献の範囲内であった。ａａｄ−１参加項目と対照参加項目との間で、イノシトールおよびトリプシン阻害剤について現場間解析において、有意な相違は観察されなかった。フルフラールおよびラフィノースについての結果は、方法の定量限界未満であった。有意な対応のあるｔ検定が、クマル酸（噴霧なしａａｄ−１、ａａｄ−１＋２，４−Ｄおよびａａｄ−１＋両方）およびフェルラ酸（ａａｄ−１＋キザロホップおよびａａｄ−１＋両方）について観察された。これらの相違は、有意な全体的な処理効果またはＦＤＲ調整ｐ値を伴わず、対照と同様であった（＜１０％の相違）。有意な全体的な処理効果、対応のあるｔ検定およびＦＤＲ調整ｐ値は、フィチン酸（噴霧なしａａｄ−１）について見出された。全ての結果は、文献の範囲内であり、対照と同様であったので（＜１１％の相違）、これらの相違は、生物学的に意味があるとは考えられない。
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〔実施例７〕 追加の農業経済学的試行
近同質遺伝子系統のトウモロコシ系統と比較したトウモロコシ系統４０２７８の農業経済学的特徴を、多様な環境にわたって評価した。処理は、合計２１の場所で試験された４つの遺伝子的に異なるハイブリッドとそれらの適当な近同質遺伝子系統対照ハイブリッドとを含んだ。
４つの試験ハイブリッドは、９９〜１１３日の相対的成熟度の範囲の中〜後期成熟度ハイブリッドであった。実験Ａは、遺伝子背景近交系Ｃ×ＢＣ３Ｓ１転換におけるイベントＤＡＳ−４０２７８−９を試験した。このハイブリッドは、１０９日の相対的成熟度を有し、１６の場所において試験された（表２４）。実験Ｂは、１１３日の相対的成熟度のハイブリッドであるハイブリッド背景近交系Ｅ×ＢＣ３Ｓ１転換を試験した。このハイブリッドは１４の場所で試験され、実験Ａとはわずかに異なる場所のセットを用いた（表２４）。実験ＣおよびＤは、ハイブリッド背景ＢＣ２Ｓ１転換×近交系ＤおよびＢＣ２Ｓ１転換×近交系Ｆをそれぞれ試験した。これらのハイブリッドはともに、９９日の相対的成熟度を有し、同じ１０の場所で試験された。
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各試行について、完全乱塊法を、場所あたり２つの反復および２列プロットで用いた。列の長さは２０フィートであり、各列は、列あたり３４の種子が播種された。標準的な地域の農業経済学的実施を用いて、試行を管理した。
８つの農業経済学的特徴についてデータを収集して、解析した；植物高さ、雌穂高さ、茎倒伏、根倒伏、最終個体群、穀粒水分、試験重量および収率。植物高さおよび雌穂高さのパラメータは、ハイブリッドの外観についての情報を提供する。パーセント茎倒伏および根倒伏の農業経済学的特徴は、ハイブリッドの収穫しやすさを決定する。最終個体群のカウントは、収率に影響する種子の質および季節成長条件を測定する。収穫時のパーセント穀粒水分は、ハイブリッドの成熟度を規定し、収率（湿度について調整したブッシェル／エーカー）および試験重量（１５．５％湿度に調整した１ブッシェルのトウモロコシのポンドでの重量）は、ハイブリッドの生殖能を表す。
分散分析を、線形モデルを用いて野外現場にわたって行った。参加項目および場所を、固定された影響としてモデルに含めた。場所および無作為な影響としての参加項目による場所を含む混合モデルを探索したが、参加項目による場所は、分散の小さい部分だけを説明し、その分散の要素は、しばしば、ゼロから大きくは異ならなかった。茎および根の倒伏について、対数変換を用いて分散を安定させたが、平均および範囲は元の尺度について報告する。有意な相違は、９５％信頼レベルにて得られる。全体的な処理効果の有意性は、ｔ検定を用いて見積もった。
これらの農業経済学的特徴決定の試行からの結果を、表２において見出すことができる。統計的に有意な相違は、雌穂高さ、茎倒伏、根倒伏、穀粒水分、試験重量および収率のパラメータについて、同質遺伝子系統対照と比較して４つの４０２７８ハイブリッドのいずれについてもみられなかった（ｐ＜０．０５にて）。最終個体群カウントおよび植物高さは、実験ＡおよびＢにおいてそれぞれ統計的に相違したが、試験したその他の４０２７８ハイブリッドとの比較において同様の相違はみられなかった。ばらつきのいくらかは、エリート近交系統へのＤＡＳ−４０２７８−９イベントの戻し交雑から残っている遺伝的変異性のレベルが低いことによる可能性がある。測定されたパラメータについての値の全体的な範囲は、伝統的なトウモロコシハイブリッドについて得られた値の範囲内であり、雑草性の増加という結論は導かれない。まとめると、農業経済学的特徴のデータは、４０２７８トウモロコシが、従来のトウモロコシと生物学的に等価であることを示す。
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〔実施例８〕 標的にされた組み込みのためのトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９挿入部位の使用
野外条件下で数世代にわたってトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の導入遺伝子の農業経済学的性能が安定していることは、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９挿入部位の周囲のこれらの同定された領域が、対象のその他のトランスジェニック遺伝子の標的にされた組み込みについての良好なゲノムの場所を提供することを示唆する。このような標的にされた組み込みは、いわゆる「位置効果」および導入遺伝子を宿主に組み込む際にゲノムに変異を創出する危険性の問題を克服する。このような標的にされた組み込みのさらなる利点は、それらに限定されないが、宿主ゲノムの重要な遺伝子座に導入遺伝子を偶発的に挿入することに起因する異常をも示すことなく所望のレベルの導入遺伝子の発現を示すトランスジェニック植物を得る前にスクリーニングして試験されなければならない多数の形質転換イベントを減らすことを含む。さらに、このような標的にされた組み込みは、両方の遺伝子を有するエリート植物系統の育種をより効率的にする、導入遺伝子の掛け合わせを可能にする。
開示される教示を用いて、当業者は、対象の標的ポリ核酸を、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるものと同じ第２染色体上の挿入部位、またはトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９における挿入部位に近い部位に標的させることができる。あるこのような方法は、国際特許出願第ＷＯ２００８／０２１２０７号（本明細書に参照によりその全体が組み込まれている）に開示される。
簡単に述べると、挿入部位の５’に接する２０Ｋｂまでのゲノム配列および挿入部位の３’に接する２０Ｋｂまでのゲノム配列（その部分は、配列番号２９を参照して同定される）は、相同組換えにより第２染色体上のゲノム位置に挿入しようとする１または複数の対象の遺伝子に接して用いられる。１または複数の対象の遺伝子は、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９挿入部位におけるものと全く同じように配置できるか、またはトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９挿入部位の周囲の２０Ｋｂ領域内のいずれかの場所に配置して、植物に有害な影響を与えることなく導入遺伝子発現の一定のレベルを与えることができる。１または複数の対象の遺伝子およびフランキング配列を含有するＤＮＡベクターは、それらに限定されないが、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換を含む当業者に知られるいくつかの方法の１つにより植物細胞に送達できる。ドナーＤＮＡベクターをトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９標的部位に挿入することは、それらに限定されないが、組換え増進遺伝子の同時発現もしくは上方制御または内因性組換え抑制遺伝子の下方制御を含むいくつかの方法の１つによりさらに増進できる。さらに、ゲノム内の特定の配列の２本鎖切断を用いて、相同組換え頻度を増加させることができ、よってトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９挿入部位およびそのフランキング領域への挿入を、これらの配列を切断するための天然もしくは設計された配列特異的エンドヌクレアーゼの発現により増進できることが当該技術において知られている。つまり、本明細書で提供される教示を用いて、任意の異種核酸を、トウモロコシ第２染色体上に、実施例４で論じた５’分子マーカーと実施例４で論じた３’分子マーカーとの間にある標的部位、好ましくは配列番号２９内のもの、および／または本明細書の他の所で論じるその領域にて挿入できる。
〔実施例９〕 トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９からのｐａｔ遺伝子発現カセットの切り出し
選択マーカー遺伝子発現カセットの除去は、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９のゲノム遺伝子座への標的にされた挿入にとって有利である。ｐａｔ選択マーカーをトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９から除去することにより、ポリ核酸をトウモロコシのその後の世代において第４染色体を標的にして組み込むためにｐａｔ選択マーカーを再使用することが可能になる。
開示された教示を用いて、当業者は、対象のポリ核酸を、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９から切り出すことができる。あるこのような方法は、米国仮特許出願第６１／２９７，６２８号（本明細書に参照によりその全体が組み込まれている）に開示される。
簡単に述べると、遺伝子発現カセットを挟む特定のＤＮＡ配列を認識し、結合して切断するジンクフィンガーヌクレアーゼのような配列特異的エンドヌクレアーゼを設計する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、トランスジェニックジンクフィンガーヌクレアーゼ発現カセットを含有する親の植物を、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有する第２の親の植物と交雑させることにより植物細胞に送達される。得られる子孫を成熟まで成長させ、ｐａｔ発現カセットの喪失を、グルフォシネートを含有する除草剤を用いる葉の塗装により解析する。除草剤に耐性でない子孫植物を、分子的に確認し、自家繁殖に進む。ｐａｔ発現カセットの切り出しおよび除去は、自家繁殖から得られる子孫において分子的に確認される。本明細書で提供される教示を用いて、任意の異種核酸を、トウモロコシの第２染色体から、実施例４で論じた５’分子マーカーと３’分子マーカーとの間にある標的部位、好ましくは配列番号２９内にあるもの、またはその示された領域にて切り出すことができる。
〔実施例１０〕 ブリトルスナップ（brittlesnap）への耐性
ブリトルスナップとは、通常、迅速成長期中の成長調節除草剤の散布後に強風によりトウモロコシの茎がくずれることをいう。強風による被害をシミュレートするためにトウモロコシを物理的に押す棒を用いる機械的「プッシュ」試験を、イベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有するハイブリッドトウモロコシおよびイベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有しない対照植物について行った。処理は、４つの地理的に異なる場所で完了し、４回反復した（例外として３回だけ反復した１つの試行があった）。プロットは、８列からなった：２列はイベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有し、２列はイベントを含有しない、２つのハイブリッドのそれぞれの４列。各列は２０フィートの長さであった。トウモロコシ植物は、Ｖ４発達段階まで成長させ、２，４−Ｄを含有する市販の除草剤（Ｗｅｅｄａｒ ６４、Ｎｕｆａｒｍ Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｒ Ｒｉｄｇｅ、ＩＬ）を、１１２０ｇ ａｅ／ｈａ、２２４０ｇ ａｅ／ｈａおよび４４８０ｇ ａｅ／ｈａの割合で用いた。除草剤を用いた７日後に、機械的プッシュ試験を行った。ブリトルスナップについての機械的プッシュ試験は、風被害をシミュレートするために、４フィートの棒で２列のトウモロコシを引き倒すことからなった。棒の高さおよび移動の速さは、未処理の植物を用いて低レベルの茎の破壊（１０％以下）をもたらすように設定して、処理間で相違が証明されるのに十分に試験が厳しいことを確実にした。ブリトルスナップ処理の指向性は、もたれかかったトウモロコシに対して用いた。
試行場所のうち２つは、強風および雷雨を、２，４−Ｄ除草剤を用いた２〜３日後に経験した。２日連続で、雷雨がＨｕｘｌｅｙ ＩＡで始まった。高速で３３ｍ ｓ−１で２〜１７ｍ ｓ−１の風速が、野外プロットの現場で報告された。風の方向は、変動した。雷雨がＬａｎｅｓｂｏｒｏ ＭＮで１日間報告された。高速の風が、この野外プロットの現場で報告された。さらに、両方の嵐は、雨を伴った。雨と風の組み合わせは、報告されたブリトルスナップ被害のせいであった。
機械的プッシュ試験（および悪天候）に起因するブリトルスナップ被害の評価を、損傷のパーセンテージを視覚的に評価することにより行った。ブリトルスナップの機械的な棒による処理の前に、植物の立木のカウントを、イベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有するハイブリッドトウモロコシおよび対照について行った。ブリトルスナップの棒での処理の数日後に、プロット立木カウントを再評価した。プロット内のもたれかかりのパーセンテージおよび立木のパーセンテージの減少を決定した（表２６）。試行からのデータは、イベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有するハイブリッドトウモロコシが、２，４−Ｄを用いた後に、ヌル植物と比較してブリトルスナップの傾向がより低いことを証明した。
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〔実施例１１〕 穀粒のタンパク質解析
イベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有するハイブリッドトウモロコシから、イベントを含有しない対照植物と比較して全タンパク質含量が増加した穀粒を作出した。２つの連続する多点野外試行を行ったが、これは、噴霧なしおよび除草剤処理を、３つの異なる除草剤の組み合わせで含んだ。８つの統計学的比較のうち７つにおいて、ＤＡＳ−４０２７８−９イベントは、有意により高い全タンパク質含量を有する穀粒を作出した（表２７）。このデータは、個別のアミノ酸の解析により確証される。
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〔実施例１２〕 追加の農業経済学的形質
近同質遺伝子系統トウモロコシと比較した、イベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有するハイブリッドトウモロコシの農業経済学的特徴を、成長季節についての多様な地理的環境にわたって複数の野外試行から回収した。データを、実施例７に記載されるような農業経済学的特徴について収集して解析した。ヌル植物と比較した、イベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有するハイブリッドトウモロコシ系統についての結果を、表２８に列挙する。さらに、発達のＶ３段階にて除草剤キザロホップ（２８０ｇ ａｅ／ｈａ）および発達のＶ６段階にて噴霧された２，４−Ｄ（２，２４０ｇ ａｅ／ｈａ）を噴霧したイベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有するハイブリッドトウモロコシ系統およびヌル植物についての農業経済学的特徴を、表２９に記載する。
Figure 0006057920
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〔実施例１３〕 植えつけ前および／または出芽前の散布
植えつけ前のバーンダウン除草剤散布は、冬または早春に出芽した雑草を、所定の作物の植えつけ前に死滅させることを意図する。典型的に、これらの散布は、植えつけ前に雑草の物理的な除去が完了しない、不耕起または節減耕起管理体系において用いられる。除草剤プログラムは、よって、植えつけ時に存在する非常に広いスペクトルの広葉および禾本雑草を制御しなければならない。グリホサート、グラモキソンおよびグルフォシネートは、植えつけ前のバーンダウン除草剤散布のために広く用いられる非選択的で非残留性の除草剤の例である。
いくつかの雑草は、しかし、以下の１または複数の理由により、この季節に制御することが困難である：除草剤に対する雑草種または生物型の固有の非感受性、冬の１年生雑草の比較的大きいサイズ、および除草剤の取り込みおよび活性を制限する寒冷気候条件。これらの除草剤とタンクで混合して、非選択的除草剤が弱い雑草に対するスペクトルおよび活性を増加させるために、いくつかの除草剤の選択肢が利用可能である。ある例は、コニザ・カナデンシス（Conyza canadensis）（ヒメムシカヨモギ）の制御を支援するグリホサートとの２，４−Ｄタンクミックス散布である。グリホサートは、存在するほとんどの雑草の植えつけ前のバーンダウン制御のために４２０から１６８０ｇ ａｅ／ｈａまで、より典型的に５６０から８４０ｇ ａｅ／ｈａまでで用いることができるが、２８０〜１１２０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄを散布して、多くの広葉雑草種（例えばヒメムシカヨモギ）の制御を支援できる。
２，４−Ｄは、非常に広い範囲の広葉雑草に対して効果的であり、低温でも効果的であり、非常に安価であるので、選択される除草剤である。しかし、後の作物が感受性双子葉作物であるならば、土壌中の２，４−Ｄ残渣（短寿命であるが）は、作物に負の影響を与え得る。ａａｄ−１遺伝子を含有する作物は、２，４−Ｄに耐性であり、土壌中の２，４−Ｄ残渣による負の影響を受けない。タンクミックス（または商業的なプレミックス）パートナーの柔軟性が増加し、コストが低減されることは、雑草制御の選択肢を改善し、重要な不耕起および節減耕起の状況におけるバーンダウン散布の堅牢性を増加させる。
ａａｄ−１トウモロコシ
アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１）タンパク質をコードするａａｄ−１遺伝子を含有するトランスジェニックハイブリッドトウモロコシ（ｐＤＡＳ１７４０−２７８）を、野外における２，４−Ｄの出芽前の散布への耐性について評価した。試行は、Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ、ＩｎｄｉａｎａおよびＭｉｎｎｅｓｏｔａの複数の場所で、各現場にておよそ６ｍの長さの２列プロットの３つの反復を用いる完全乱塊法を用いて行った。除草剤処理プロットを、未処理プロットと対にして、出芽および初期成長の正確な評価を行った。１１２０、２２４０および４４８０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄアミンの除草剤処理を、植えつけのすぐ後であるが、作物出芽の前（植えつけの０〜２日後）に行った。これらの試行についての土壌および降水の情報は、表３０に含まれる。
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植えつけおよび２，４−Ｄの散布のおよそ１６〜２１日後に、従来の対照ハイブリッドについて損傷は平均で１２から３１％であり、割合は、２，４−Ｄアミンの１１２０から４４８０ｇ ａｅ／ｈａまで増加した。同じ割合範囲にわたって、ｐＤＡＳ１７４０−２７８を含有するハイブリッドトウモロコシへの損傷は、３から９％までの範囲であった。ａａｄ−１遺伝子を含有するトランスジェニックハイブリッドトウモロコシ（ｐＤＡＳ１７４０−２７８）についての現在提案されている２，４−Ｄの目標散布割合は、２，４−Ｄについて１，１２０ｇ ａｅ／ｈａ以下である。野外試験の結果は、ｐＤＡＳ１７４０−２７８を含有するハイブリッドトウモロコシが、最小限の被害をもたらす提案された目標使用割合の２〜４倍を超える割合での２，４−Ｄ除草剤処理の堅固な耐性をもたらしたことを示す（表３１）。
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２，４−Ｄアミンの出芽前散布は、ａａｄ−１遺伝子を含有するハイブリッドトウモロコシおよび従来の対照ハイブリッドの植えつけの７日、１５日または３０日前に、１１２０、２２４０、４４８０ｇ ａｅ／ｈａの割合で行う。出芽前散布は、当技術分野において承認されている手順を用いて、地理的に異なる場所にある野外プロットに対して行う。除草剤処理プロットを、未処理プロットと対にして、出芽および初期成長の正確な評価を行う。植えつけおよび植えつけの７、１５または３０日前の２，４−Ｄ散布のおよそ１６〜２１日後に、従来の対照ハイブリッドおよびａａｄ−１を含有するハイブリッドトウモロコシの損傷を測定する。野外試験の結果は、ａａｄ−１を含有するハイブリッドトウモロコシが、植えつけの７、１５または３０日前の２，４−Ｄ除草剤の出芽前処理への堅固な耐性をもたらすことを示す。
ａａｄ−１ワタ
アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１）タンパク質をコードするａａｄ−１遺伝子を含有するトランスジェニックワタを、野外における２，４−Ｄの出芽前の散布に対する耐性について評価した。試行は、３つの反復からなり、Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＴｅｎｎｅｓｓｅｅおよびＡｒｋａｎｓａｓの複数の場所で行った。およそ１０フィート（Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ試行について２０フィート）の長さの、ガード列により分けられた単一列の完全乱塊法を用いた。種子を、１フィートあたり８の種子を用いて播種し、植物を、次いで、列１フィートあたり３．５の植物に手で間引いた。除草剤処理プロットを、未処理プロットと対にして、出芽および初期成長の正確な評価を行った。全てのプロットは、散布の２４時間以内に、少なくとも１／２インチの雨または潅漑水を受けた。植えつけのすぐ後であるが、作物出芽前に、５６０、１１２０、２２４０および４４８０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄアミン（ＷＥＥＤＡＲ６４、Ｎｕｆａｒｍ、Ｂｕｒｒ Ｒｉｄｇｅ、Ｉｌ）の除草剤処理を行った。これらの試行についての土壌および降水の情報は、表３２に含まれる。
Figure 0006057920
５６０、１１２０および２２４０ｇｍ ａｅ／ｈａでの２，４−Ｄの出芽前散布は、未処理のプロットと比較して、ａａｄ−１遺伝子を含有するトランスジェニックワタの植物の立木にそれほど影響しなかった。
植えつけならびに５６０、１１２０、２２４０および４４８０ｇｍ ａｅ／ｈａの濃度での２，４−Ｄの出芽前散布のおよそ７〜８日後に、未処理対照の立木の低減と比較して、ａａｄ−１含有ワタについてそれぞれ３％、低減なし、１９％および３４％の立木の低減が報告された。植えつけならびに５６０、１１２０、２２４０および４４８０ｇｍ ａｅ／ｈａの濃度での２，４−Ｄの散布の１１〜１４日後に、未処理対照の立木の低減と比較して、ａａｄ−１含有ワタについてそれぞれ５％、２％、１４％および２５％の立木の低減が報告された。
５６０、１１２０、２２４０および４４８０ｇｍ ａｅ／ｈａの濃度での２，４−Ｄの出芽前散布は、上偏成長を引き起こさなかった。白化は、２２４０および４４８０ｇｍ ａｅ／ｈａ処理について散布の７〜８日後に視覚評価で＜５％観察された。白化は、散布の７〜８日後に、５６０および１１２０ｇｍ ａｅ／ｈａ処理について検出されなかった。さらに、白化は、残りの季節について、５６０、１１２０、２２４０および４４８０ｇｍ ａｅ／ｈａの濃度で処理したａａｄ−１含有ワタのいずれにおいても検出されなかった。
５６０および１１２０ｇｍ ａｅ／ｈａの濃度での２，４−Ｄの出芽前散布は、２％未満の最小限の成長阻害をもたらした（これは、未処理対照プロットから統計的に有意でない）。これらの結果は、試行全体を通して、散布の７〜８日後、１１〜１４日後、２７〜３０日後および５２〜５７日後に一貫していた。２２４０ｇｍ ａｅ／ｈａの濃度での２，４−Ｄの出芽前散布は、＜１０％の成長阻害をもたらした。４４８０ｇｍ ａｅ／ｈａの濃度での２，４−Ｄの出芽前散布は、散布の７〜８日後、１１〜１４日後、２７〜３０日後および５２〜５７日後に評価した場合に、２７％、２８％、１７％および８．３％の成長阻害をもたらした。
５６０および１１２０ｇｍ ａｅ／ｈａの濃度での２，４−Ｄの出芽前散布により引き起こされた損傷は、未処理対照プロットとそれほど相違しなかった。２２４０ｇｍ ａｅ／ｈａの濃度の２，４−Ｄで処理したａａｄ−１ワタ植物の損傷評価は、試行の経過にわたって３％から１５％までの範囲であった。４４８０ｇｍ ａｅ／ｈａの濃度の２，４−Ｄで処理したａａｄ−１ワタ植物の損傷評価は、試行の経過にわたって８％から３４％までの範囲であった。
植物高さ、結実パターンおよび収率における相違は、５６０、１１２０、２２４０および４４８０ｇｍ ａｅ／ｈａの濃度での２，４−Ｄの出芽前散布で処理したａａｄ−１ワタにおいて検出されなかった。
２，４−Ｄアミンの出芽前散布は、ａａｄ−１遺伝子を含有するワタおよび対照ワタの植えつけの７日、１５日または３０日前に、５６０、１１２０、２２４０、４４８０ｇ ａｅ／ｈａの割合で行う。出芽前散布は、当技術分野において承認されている手順を用いて、地理的に異なる場所にある野外プロットに対して行う。除草剤処理プロットを、未処理プロットと対にして、出芽および初期成長の正確な評価を行う。植えつけおよび植えつけの７、１５または３０日前の２，４−Ｄ散布の後に、ａａｄ−１遺伝子を含有するワタおよび対照の損傷を測定する。野外試験の結果は、ａａｄ−１遺伝子を含有するワタが、植えつけの７、１５または３０日前の２，４−Ｄ除草剤の出芽前処理の耐性をもたらすことを示す。
本実施例は、利用可能な多くの選択肢のうちのいくつかについて論じる。雑草制御の技術分野における当業者は、例えば、連邦除草剤標示(CPR、2003)に記載される製品およびAgriliance Crop Protection Guide(2003)に記載される使用を利用することによる、それらに限定されないが、グラモキソン＋２，４−Ｄまたはグルフォシネート＋２，４−Ｄを含む様々なその他の応用を認識する。当業者は、上記の例を、安定的に形質転換された場合にＡＡＤ−１（ｖ３）遺伝子により保護される任意の２，４−Ｄ−感受性（またはその他のフェノキシオーキシン除草剤）作物に用いることができることも認識する。
配列番号１〜２８は、本明細書に記載されるプライマーである。
配列番号２９は、主題のイベントＤＡＳ−４０２７８−９についての挿入断片およびフランキング配列を示す。
配列番号３０〜３３は、実施例４に記載されるフランキングマーカーについてのプライマーである。

Claims (10)

  1. 雑草を制御する方法であって、前記方法が、領域内に種子を植えつけるステップと、アリールオキシアルカノエート除草剤を、前記領域に、前記領域への種子の植えつけ前３０日以内に散布するステップとを含み、前記種子が、配列番号２９によりコードされるアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１）タンパク質と少なくとも７５％の同一性を有するＡＡＤ−１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む方法。
  2. 前記除草剤が、２，４−Ｄ、２，４−ＤＢ、ＭＣＰＡ、ＭＣＰＢおよびアリールオキシフェノキシプロピオネートからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 第２の除草剤を前記領域に散布するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記第２の除草剤が、グルフォシネート、グリホサートおよびジカンバからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記方法が、前記領域におけるグリホサート耐性雑草を制御するために用いられ、前記種子が、グリホサート耐性形質をさらに含む植物に成長し、前記方法が、アリールオキシアルカノエート除草剤を、前記領域の少なくとも一部分に散布するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記除草剤が、グリホサートとのタンクミックスから散布される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記雑草が、栽培中の領域にあり、前記領域が、前記種子から成長した複数の植物を含み、前記方法が、さらに、植物の上からアリールオキシアルカノエート除草剤を散布するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  8. 除草剤を、出芽前、出芽後、または出芽前および出芽後に、植物、植物の部分および／または栽培中の領域に散布するステップを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号２９を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記種子が、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−１０２４４の下で寄託された種子に存在するＡＡＤ−１イベントＤＡＳ−４０２７８−９を含むゲノムを含む、請求項１に記載の方法。
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