JP5939650B2

JP5939650B2 - 充填ベッド培養装置のための大規模な細胞採取方法

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Publication number: JP5939650B2
Application number: JP2014000648A
Authority: JP
Inventors: 崇仁李; 宏飛陳; 永▲しゅう▼ 陳; 駿▲逸▼ 劉; 正男傅; ▲いく▼麒王; 俊谷陳; 景明張; 玉書何
Original assignee: 賽宇細胞科技股▲ふん▼有限公司
Priority date: 2013-01-07
Filing date: 2014-01-06
Publication date: 2016-06-22
Anticipated expiration: 2034-01-06
Also published as: US9273278B2; CN104762251A; JP2014158461A; US20140193901A1

Description

本願発明は、大規模な細胞採取方法、特に、充填ベッド培養装置のための大規模な細胞採取方法に関する。

ここ何年かに亘り、細菌、酵母菌、および菌の成長のために大規模な細胞培養処理が幅広く開発されてきた。典型的には、細菌、酵母菌、および菌は全て、堅固な細胞壁、および／または細胞外物質を有しているので、破壊されにくい。これらの微生物細胞の構造的な破壊に対する耐性は、これらのタイプの細胞のための、効率性が高い細胞培養処理の急速な進歩に寄与している主要な要因である。例えば細菌性細胞は、成長を可能とする培養を維持しながら成長の間、良好な通気を達成するための激しい撹拌、培養のかき混ぜ、および気体の散布に関する技術を用いて、大容量の液体培地で成長させられ得る。対照的に、微生物細胞よりもはるかに繊細であり、かつ破壊されやすい真核細胞、動物細胞、哺乳類細胞、および／または組織などの細胞を培養するために用いられる技術は、より難しく複雑である。これらの細胞は、従来の生物反応器における微生物培養に要する激しい通気および撹拌により生じ得る過度のせん断力によって容易にダメージを受け得る。

図１は、従来技術に係る充填ベッド培養装置を示す概略図である。充填ベッド生物反応器１．１は、細胞成長のための多孔性マトリックス１．３を含み、細胞をせん断から保護する。マトリックスにより表面積が大きくなるので、細胞密度は他のシステムよりも高くなり得る。通常、５〜１０×１０^７個の細胞／ｍｌマトリックスの密度が容易に達成され得る。しかし、充填ベッドがデプスフィルタとして機能してしまい、液体が充填ベッドに浸入した後の混合が出来ないため、充填ベッドを通る流路に沿って接種材料が捕捉されてしまい、充填ベッドにおいて、細胞の不均一かつ勾配のある分布１．４が生じてしまう。

培養の間、栄養素および酸素が充填ベッドの流路に沿って消費され枯渇してしまい、酸素および栄養素は最初豊富であり、流路の終わりにおいて低いか、または枯渇してしまう。これらの理由全てによって、充填ベッド生物反応器内の細胞の不均一な成長が引き起こされ、従来の充填ベッド生物反応器の規模の拡大可能性が阻害されてしまう。

細胞採取は、充填ベッド生物反応器に関する他の重要な課題である。トリプシン処理の後に細胞をマトリックスから分離させるために必須であるマトリックスベッド内での攪拌は実行するのが非常に難しいため、通常、細胞は、充填ベッド生物反応器内の多孔性マトリックスから分離するのが難しい。よって通常、充填ベッド細胞培養システムのための接種材料などの細胞源には、組織培養瓶、ローラボトル、細胞工場（ｃｅｌｌｆａｃｔｏｒｙ）、マイクロキャリア撹拌槽システムなどの他の細胞培養装置が設けられる必要がある。充填ベッド生物反応器において播種するために十分な接種材料を回収するには多数の細胞培養装置が必要である。このことは手間がかかり、かつ、細胞採取処理の間の汚染を引き起こすリスクも伴う。

充填ベッドシステムの規模拡大をより効率的に行うために、１つの充填ベッドシステムから直接的に細胞を採取出来、それらを他の大規模の充填ベッドシステムへ移動させられる細胞採取システムを用いることにより、充填ベッドシステムを、容器間の移動が短いシステムを実現し得る。これにより、接種材料を用意するためのリスクを低減出来、労働コストを低下させられる。よって、充填ベッド生物反応器の規模拡大は、他の細胞培養装置に依存しないようになる。

異なる培養の原理を用いる複数の異なる培養システムで細胞が培養される場合には、細胞の特性が変化してしまうという他の課題がある。同様の培養原理を用いる規模拡大処理により細胞の挙動を変化させてしまう恐れを低減し得るが、これにより、細胞培養処理から得られる結果が影響を受け得る。

よって、細胞採取を可能とする充填ベッド細胞培養デバイス、およびその方法を開発しなければならないという課題が現在ある。

本願発明は、実際的な生産規模へ容易に拡大可能な、充填ベッドシステムから細胞を採取する方法を提供することを目的とする。

本願発明の一実施形態において、大規模な細胞採取方法は、細胞成長空間が内部に画定された培養室を有する充填ベッド培養装置を準備する工程と、培養室を振盪させる、または回転させることを少なくとも有する細胞分離工程を実行する工程と、複数の細胞を採取する工程とを備え、細胞成長空間には、複数の多孔性マトリックスが低密度で充填され、複数の細胞は複数の多孔性マトリックス上で成長し、細胞成長空間内の複数の多孔性マトリックスが画定する占有されない空間である空隙容量は、複数の多孔性マトリックスが互いに、または培養室に衝突し、複数の細胞を複数の多孔性マトリックスから分離させる運動量が生成されるために十分な大きさである。

本願発明の他の実施形態において、大規模な細胞採取方法は、細胞成長空間が内部に画定された培養室を有する充填ベッド培養装置を準備する工程と、培養室を振盪させる、または回転させることを少なくとも有する細胞分離工程を実行する工程と、複数の細胞を採取する工程とを備え、細胞成長空間には、複数の多孔性マトリックスを含む、多孔性の複数のマトリックス手段が低密度で充填され、複数の細胞は複数の多孔性マトリックス上で成長し、複数のマトリックス手段が画定する占有されない空間である空隙容量は、複数のマトリックス手段が互いに、若しくは培養室に衝突し、または、液体により流され、複数の細胞を複数の多孔性マトリックスから分離させる運動量が生成されるために十分な大きさである。

本願発明の他の利点は、添付の図面と併せて、本願発明の特定の実施形態が例示的に明記されている以下の説明から明らかとなるであろう。

前述した態様、および、本願発明の付随する利点の多くは、以下の詳細な説明を添付の図面と併せて参照することにより、さらに深くより容易に理解されよう。
従来技術に係る充填ベッド培養装置を示す概略図である。本願発明の好ましい実施形態に係る充填ベッド培養室を示す概略図である。本願発明の好ましい実施形態に係る充填ベッド培養室を示す、図２ａの拡大図である。本願発明に係る分布勾配プロファイルを有する本願発明に係る固定ベッド細胞培養装置を示す概略図である。充填室に複数の球形のマトリックス手段が低密度で充填された、本願発明に係る固定ベッド細胞培養装置を示す概略図である。充填室に複数の円筒形のマトリックス手段が低密度で充填された、本願発明に係る固定ベッド細胞培養装置を示す概略図である。充填室に複数の長い円筒形のマトリックス手段が低密度で充填された、本願発明に係る固定ベッド細胞培養装置を示す概略図である。本願発明に係る細胞採取装置を示す概略図である。本願発明の好ましい一実施形態に係る、内部再循環型の細胞培養装置を示す概略図である。本願発明の好ましい一実施形態に係る、外部循環型の細胞培養装置を示す概略図である。本願発明の好ましい一実施形態に係る、浸水および露出を交互に行う細胞培養装置を示す概略図である。本願発明の好ましい一実施形態に係る細胞回収率を示す概略図である。

本願発明の実施形態は、大規模な充填ベッド細胞培養装置から細胞を採取するために用いられ得る。本願発明は、微生物細胞よりもはるかに繊細であり、かつ破壊されやすいという理由により培養がより難しく複雑である真核細胞、動物細胞、哺乳類細胞および／または組織などの細胞を培養するための技術に関する。

マトリックスベッドが固定されおり、特定の空間に制限され、容器が細胞接種を不可能とするガラス、またはステンレス鋼などの金属で構成されるので、殆どの充填ベッド細胞培養装置は細胞回収が不可能である。容器が可撓性のプラスチックで構成される、ＣＥＳＣＯＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏ．，Ｌｔｄ．（ｗｗｗ．ｃｅｓｃｏｂｉｏ．ｃｏｍ．ｔｗ）により提供されるＢｅｌｌｏＣｅｌｌ（登録商標）などの数少ない市販の充填ベッド細胞培養装置は細胞回収が可能である。容器内には、１００ｍｌのマトリックスが囲われている。トリプシン処理後に、およびプラスチックを軽く打つことにより、プラスチック容器に加えられる弾性力がマトリックスに伝達され、細胞をマトリックスから飛び出させて採取する。しかし同様の構造を１リットル以上に規模拡大すると、ベッドの深い部分へ力を伝達させられなくなり、回収率は劇的に低くなる。

この課題を解決すべく、空隙容量がより大きくなるよう容器内にマトリックスを低密度で充填し、液体と共に、若しくは液体なしでマトリックス自体を振盪させることにより、または、液体と共に容器を回転させることにより、容器の壁から力を伝達させるのではなく、各マトリックス自体に力を伝達させることが出来る。

マトリックスベッドが規模拡大され続けると、マトリックス自体が細胞を再捕捉するフィルタとして機能しまい、細胞のほぼ全体を採取するには洗浄工程を追加的に実行する必要性が生じるという課題がある。しかし採取の時間が長くなると、細胞は、マトリックスに再付着しやすくなる。マトリックスを内部に囲うマトリックス手段を加えることにより、マトリックスは複数のグループに区切られ、細胞が流れ出る空間が生じ、それら細胞が再捕捉されてしまう可能性が低くなる。これにより、細胞採取する際の効率が向上する。よって本願発明は上記課題を解決すること、または、５×１０^９〜２×１０^１２の細胞を回収する際の効率を５００ｍｌから１００Ｌのマトリックス容量へ向上させることを目的とする。マトリックス容量が５Ｌ未満の場合、マトリックスベッドの空隙容量を大きくすることによってのみ、細胞回収率を向上させられる。マトリックス容量が５Ｌよりも大きい場合、マトリックス手段を採用することにより細胞回収率をより効率的に向上させられ、マトリックス自体に細胞が再捕捉されてしまうことを避けられる。

図２ａおよび図２ｂはそれぞれ、本願発明の好ましい実施形態に係る充填ベッド培養室を示す概略図、および図２ａの拡大図である。充填ベッド培養室２．１は、空気の吸入および排出のための開口２．６と、室の頂部にある、細胞、培地、または緩衝液を取り込むための開口２．７を有する。空気の吸入および排出のための開口２．６は、空気フィルタを含む。充填ベッド培養室内には、多孔性マトリックス２．３／多孔性マトリックス手段２．２が配置されている。

図１と図２ｃとを比較すると、充填ベッドがより大きなものであることによって液体の流れに沿って大きな勾配の降下が引き起こされ、これにより規模の拡大が制限される従来の充填ベッドシステムと比較し、分布勾配プロファイル２．５は本願発明において大幅に改善される。

マトリックス手段２．２は剛性材料により形成され、栄養素および細胞が浸透し自由に行き来するための孔が設けられている。それぞれのマトリックス手段２．２は、異なるジオメトリおよび形状を有し得る。より好ましくは、マトリックス手段２．２は、球形、円筒形、棒形、または卵形であり得る。より詳細には、マトリックス手段２．２は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、または他の生体適合性材料などの剛性材料により形成される。マトリックス手段２．２はそれら自体が多孔性マトリックス２．３であり得、または、多孔性マトリックス２．３を内部に封入した多孔性かつ剛性のカプセルまたはカートリッジであり得る。マトリックス手段２．２のサイズは、直径０．５〜１０ｃｍであり得る。より好ましくは、マトリックス手段２．２のサイズは、直径０．５〜５ｃｍであり得る。

一実施形態において、マトリックス手段２．２は、組み立てられてマトリックス手段２．２を形成し得る２つの部品からなり得る。多孔性マトリックス２．３は、組み立てられマトリックス手段２．２により囲まれる前に複数の部品内に配置され得る。

多孔性マトリックス２．３はマトリックス手段２．２内に囲まれてもよい。多孔性マトリックス２．３は好ましくは、親水性となるよう表面処理が施された不織布の繊維製マトリックスである。より詳細には、多孔性マトリックス２．３は、５０〜２００μｍの孔サイズを有し多孔率が７０％より大きなマクロ多孔性のものである。より詳細には、多孔性マトリックス２．３は、細胞の捕捉、付着、成長、および酸素との結合のために表面積が大きい。

多孔性マトリックス２．３／マトリックス手段２．２が互いに、若しくは培養室に衝突し、または、液体により流され、細胞を多孔性マトリックス２．３および／またはマトリックス手段２．２から分離させる運動量を生成すべく、細胞成長空間には、複数の多孔性マトリックス２．３／マトリックス手段２．２が低密度で充填される。

「低密度で充填」というフレーズは、細胞成長空間内の空隙容量の割合が高い状態を指す。詳細には、多孔性マトリックス２．３が充填された細胞成長空間の場合、空隙容量は細胞成長空間の２５％ｖ／ｖよりも大きく、好ましくは３３％ｖ／ｖよりも大きい。マトリックス手段２．２が充填された細胞成長空間の場合、空隙容量は細胞成長空間の１０％ｖ／ｖよりも大きく、好ましくは３３％ｖ／ｖよりも大きい。

図３は、多孔性マトリックスが内部に埋め込まれた複数のマトリックス手段が培養室に低密度で充填された、本願発明の固定ベッド細胞培養装置を示す概略図である。マトリックス手段は球形であり、剛性材料により形成され、栄養素および細胞が浸透し自由に行き来出来るよう孔が設けられている。

図４は、多孔性マトリックスが内部に埋め込まれた複数のマトリックス手段が培養室に低密度で充填された、本願発明の固定ベッド細胞培養装置を示す概略図である。マトリックス手段は円筒形であり、剛性材料により形成され、栄養素および細胞が浸透し自由に行き来出来るよう孔が設けられている。

図５は、多孔性マトリックスが内部に埋め込まれた複数のマトリックス手段が培養室に低密度で充填された、本願発明の固定ベッド細胞培養装置を示す概略図である。マトリックス手段は長い円筒形であり、剛性材料により形成され、栄養素および細胞が浸透し自由に行き来出来るよう孔が設けられている。

図７は、本願発明の好ましい実施形態に係る細胞培養装置を示す。充填ベッドシステムは、培養室７．１が換気口７．２を含む内部再循環型の細胞培養システムであり得る。マトリックス手段７．３は、マトリックス手段７．３の動きを抑制し得るバスケット７．４内部に充填されている。培養室７．１の下方には、液体を再循環させるプロペラ７．５がある。充填ベッド全体が培地７．６に浸かり、培地７．６は、矢印により示されるように培養室７．１内を再循環する。

図８は、充填ベッドシステムが、培養室８．１がマトリックス手段８．４を収容する外部循環型の細胞培養システムであり得る、本願発明の好ましい一実施形態の細胞培養装置を示す概略図である。混合容器８．２は、換気口８．３と、吸収／排出口８．７としてのポートとを含む。培地８．５は、蠕動ポンプ８．８または他の手段により、培養室８．１と混合容器８．２との間を再循環させられる。混合容器８．２は、培養の間、培地８．５を均質化させるためのプロペラ８．６を有する。培地８．５は、矢印により示されるように培養室８．１と混合容器８．２との間を再循環させられる。

図９は、本願発明の好ましい実施形態に係る細胞培養装置を示す概略図である。充填ベッドシステムは、培養室９．１が換気口９．３を含みマトリックス手段９．４で充填される、２方向の、交互に浸水および露出を行う細胞培養システムであり得る。混合容器９．２は、換気口９．３、および、培養室９．１と混合容器９．２との間を接続するポート９．７を有する。培地９．５は、圧力および真空、または他の手段により、培養室９．１と混合容器９．２との間を移動させられる。培地９．５は、培地９．５が混合容器９．２から培養室９．１へ流れるとマトリックス手段９．４を浸し得、培地９．５が培養室９．１から混合容器９．２へ流れるとマトリックス手段９．４を露出させ得る。混合容器９．２は、培養の間、培地９．５を均質化させるためのプロペラ９．６を有する。培地９．５の流路は、培養室９．１と混合容器９．２との間の矢印により示される。

図６は、本願発明の細胞採取装置を示す概略図である。培養室６．１には、内部に低密度で充填されたマトリックス手段６．３と、場合によっては換気口６．２とが設けられる。細胞培養が完了した後、培養室６．１は、全体的な細胞の消化／回収処理のための必要な試薬および容器を収容する試薬キットに接続される。試薬パッケージは、限定されるわけではないが、リン酸緩衝食塩水６．６、トリプシン／ＥＤＴＡ６．７、トリプシン阻害剤６．８、培地６．９、廃棄物容器６．５、および細胞採取容器６．１０を含み得る。各容器は、吸入／排出口６．１２、および場合によっては換気口６．２を有する。各容器は、重さを測定し制御するために、はかり、天秤、または他の手段に載置される。流体の流れは、蠕動ポンプまたは他の駆動手段６．４により制御される。

当業者であれば、液体と併せての振盪または液体と併せての回転など細胞採取手順をよく理解されよう。液体と併せての回転は、１０〜５００ｒｐｍの回転速度で、時計方向および反時計方向の回転が交互に行われる。好ましい回転速度は１００〜３００ｒｐｍである。

一実施形態において、細胞採取手順は以下のように実行され得る。

工程１
細胞培養の後、ポンプ式での採取タンクへの流し込みによる試薬パッケージとの接続の前に、培養室６．１内の培地が破棄される。

工程２
チューブ６．１２を介して培養室６．１を試薬パッケージと接続する。

工程３
蠕動ポンプ６．４または他の手段によりリン酸緩衝食塩水６．６を容器６．６から培養室６．１へ取り込む。移動させられる緩衝液の量は、天秤６．１１または他の手段により制御される。その後、培養室６．１は、何らかの手段により静かに回転または振盪させられて、マトリックス手段６．３をすすぎ得る。その後、リン酸緩衝食塩水は、蠕動ポンプまたは他の駆動手段６．４により培養室６．１から廃棄物容器６．５へ移動させられ得る。この工程は２回または３回繰り返され得る。

工程４
その後、トリプシン／ＥＤＴＡ６．７溶液が、蠕動ポンプまたは他の駆動手段６．４により容器６．７から培養室６．１へ移動させられる。移動させられる試薬の量は、天秤６．１１または他の手段により制御される。その後、培養室６．１は、何らかの手段により、回転または振盪させられてマトリックス手段６．３をすすぎ得る。トリプシンが細胞を消化する５〜２０分の培養が行われ得る。その後、トリプシン溶液は、蠕動ポンプまたは他の駆動手段６．４により、培養室６．１から廃棄物容器６．５へ移動させられ得る。トリプシン溶液が培養室６．１から取り除かれてから培養がさらに行われ得る。

工程５
場合によっては、トリプシン阻害剤６．８が、蠕動ポンプまたは駆動手段６．４により容器６．８から培養室６．１へ取り込まれ得る。移動させられる試薬の量は、天秤６．１１などの手段により制御され得る。その後、培養室６．１は何らかの手段により回転または振盪させられて、マトリックス手段６．３をすすぎ得る。その後、トリプシン阻害剤溶液は、蠕動ポンプまたは他の駆動手段６．４により、培養室６．１から廃棄物容器６．５へ移動させられ得る。

工程６
消化の後に、マトリックス手段６．３が互いに衝突するよう、または、混合溶液により洗い流されるよう、液体と併せて、または液体なしで激しい振盪および／または回転が行われ得る。このことにより、多孔性マトリックスからの細胞の除去が促され得る

工程７
その後、容器６．９内の培地６．９が、蠕動ポンプ、または液体なしで振盪させられた場合、他の駆動手段６．４により容器６．９から培養室６．１へ取り込まれ得る。移動させられる培地の量は、天秤６．１１または他の手段により制御され得る。その後、培養室６．１は何らかの手段により激しく振盪させられて、マトリックス手段６．１がすすがれ、細胞が多孔性マトリックスから離れるよう洗浄され得る。その後、細胞を含有する培地溶液は、蠕動ポンプまたは他の駆動手段６．４により、培養室６．１から細胞採取容器６．１０へ移動させられ得る。

マトリックス手段６．３から殆どの細胞を回収するべく工程６および７を繰り返す。

本願発明について、限定を意味しない以下の実施例を参照して説明する。

実施例１
多孔性マトリックス手段、つまり、１０％未満の空隙を有する２００ｇのＢｉｏＮＯＣＩＩキャリアを含む２Ｌ充填ベッド培養室
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）をポンプ式で流し込み、３分間、ＰＢＳですすぐことにより細胞採取手順を実行し、ＰＢＳはポンプ式で取り出し廃棄物容器へ破棄した。この工程を３回繰り返し、その後、０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡをポンプ式で流し込み、１０分間、キャリアを浸した。ポンプ式で廃棄物容器へ流れ込ませることによりトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を破棄し、その後さらに１０分間、細胞を培養した。１分間、１６０ｒｐｍで上下の振盪を実行し、多孔性マトリックスから細胞を除去した。１．５Ｌの培地をポンプ式で流し込み、細胞をすすぎ、洗浄するべく、培養室を１００ｒｐｍの速度で時計回りおよび反時計回りに交互に回転させた。その後、培地はポンプ式で取り出され、採取容器に回収した。振盪、回転、および培地採取工程は５回繰り返した。採取された細胞の数をカウントし、１０個のキャリアからの細胞の数を平均化することにより推測される最初の細胞密度と比較した。
表１
１０％未満の空隙を有する多孔性マトリックス手段を含む培養室

第１実施例における全体的な細胞採取率は８．２６％のみであった。振盪および回転の間、多孔性マトリックスから細胞を押し出すために十分な運動量を生成するために利用可能である空間が少なかったため、殆どの細胞は多孔性マトリックスに残った。

実施例２
多孔性マトリックス、つまり、６７％の空間を占有し、およそ３３％の空隙を有する１１０ｇのＢｉｏＮＯＣＩＩキャリアを含む２Ｌの充填ベッド培養室
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）をポンプ式で流し込み、３分間、ＰＢＳですすぐことにより細胞採取手順を実行し、ＰＢＳはポンプ式で取り出し廃棄物容器へ破棄した。この工程を３回繰り返し、その後、０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡをポンプ式で流し込み、１０分間、キャリアを浸した。ポンプ式で廃棄物容器へ流れ込ませることによりトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を破棄し、その後さらに１０分間、細胞を培養した。１分間、１６０ｒｐｍで上下の振盪を実行し、多孔性マトリックスから細胞を除去した。１．５Ｌの培地をポンプ式で流し込み、細胞をすすぎ、洗浄するべく、培養室を１００ｒｐｍの速度で時計回りおよび反時計回りに交互に回転させた。その後、培地はポンプ式で取り出され、採取容器に回収した。振盪、回転、および培地採取工程は５回繰り返した。採取された細胞の数をカウントし、１０個のキャリアからの細胞の数を平均化することにより推測される最初の細胞密度と比較した。
表２
およそ３３％の空隙を有する多孔性マトリックス手段を含む培養室

図１０を参照すると、空隙を増加させることにより、振盪および回転の間のマトリックス同士の、およびマトリックスと室との間の、またはマトリックスと液体との間の相対的な動きを劇的に増大させることが出来た。前述の実施例の８．２６％の細胞回収率とは対照的に、回収率を８６．６５％まで高めることが出来た。

実施例３
培養室空間のおよそ５０％を占有する多孔性円筒形マトリックス手段を含む２Ｌ充填ベッド培養室
多孔性マトリックス、つまり１１０ｇのＢｉｏＮＯＣ
ＩＩキャリアを多孔性円筒形マトリックス手段内に均等に充填した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）をポンプ式で流し込み、３分間、ＰＢＳですすぐことにより細胞採取手順を実行し、ＰＢＳはポンプ式で取り出し廃棄物容器へ破棄した。この工程を３回繰り返し、その後、０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡをポンプ式で流し込み、１０分間、キャリアを浸した。ポンプ式で廃棄物容器へ流れ込ませることによりトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を破棄し、その後さらに１０分間、細胞を培養した。１分間、１６０ｒｐｍで上下の振盪を実行し、多孔性マトリックスから細胞を除去した。１．５Ｌの培地をポンプ式で流し込み、細胞をすすぎ、洗浄するべく、培養室を１００ｒｐｍの速度で時計回りおよび反時計回りに交互に回転させた。その後、培地はポンプ式で取り出され、採取容器に回収した。振盪、回転、および培地採取工程は５回繰り返した。採取された細胞の数をカウントし、１０個のキャリアからの細胞の数を平均化することにより推測される最初の細胞密度と比較した。
表３
およそ５０％の空隙を有する多孔性マトリックス手段を含むベッド培養室

およそ５０％の空隙容量により、総回収率は８７．０４％に達した。

本願発明には様々な修正が加えられ得、本願発明は代替の形態をとり得るが、その特定の例を図面に示し、本明細書において詳細に説明してきた。しかし、本願発明は開示される特定の形態に限定されるわけではなく、むしろ本願発明は添付の請求項の思想および態様に含まれる全ての修正、同等物、代替物を網羅することが理解されるべきである。

Claims

細胞採取方法であり、
細胞成長空間が内部に画定された培養室を有する充填ベッド培養装置を準備する工程であって、前記細胞成長空間には、複数の多孔性マトリックスが充填され、空隙容量とは前記細胞成長空間内の前記複数の多孔性マトリックスによって占有されない空間であり、前記空隙容量と前記複数の多孔性マトリックスによって占有されている空間との間には妨害する障害物が無く、前記空隙容量は、前記細胞成長空間の３３％ｖ／ｖより大きい、準備する工程と、
前記細胞成長空間における前記複数の多孔性マトリックスで複数の細胞を成長させる工程と、
前記培養室を振盪させる、または回転させることを少なくとも有する、第１の細胞分離工程を実行する工程であって、前記空隙容量は、前記複数の多孔性マトリックスが互いに、または前記培養室に衝突し、前記複数の細胞を前記複数の多孔性マトリックスから分離させる運動量が生成される大きさである、第１の細胞分離工程を実行する工程と、
培地を取り込み、前記培地と共に前記培養室を振盪させる、または回転させることを少なくとも有する、第２の細胞分離工程を実行する工程と、
前記複数の細胞と共に前記培地を採取する工程と
を備える、細胞採取方法。
前記複数の細胞は動物細胞である、請求項１に記載の細胞採取方法。
前記細胞成長空間は５００ｍｌより大きい、請求項１または２に記載の細胞採取方法。
細胞採取方法であり、
細胞成長空間が内部に画定された培養室を有する充填ベッド培養装置を準備する工程であって、前記細胞成長空間には、複数の多孔性マトリックスを含む、多孔性の複数のマトリックス手段が充填され、空隙容量は、前記細胞成長空間内の前記複数のマトリックス手段が画定する占有されない空間であり、前記空隙容量と前記複数のマトリックス手段によって占有されている空間との間には妨害する障害物が無く、前記空隙容量は、前記細胞成長空間の３３％ｖ／ｖより大きい、準備する工程と、
前記細胞成長空間における前記複数の多孔性マトリックスで複数の細胞を成長させる工程と、
前記培養室を振盪させる、または回転させることを少なくとも有する、第１の細胞分離工程を実行する工程であって、前記空隙容量は、前記複数のマトリックス手段が互いに、若しくは前記培養室に衝突し、または、液体により流され、前記複数の細胞を前記複数の多孔性マトリックスから分離させる運動量が生成される大きさである、第１の細胞分離工程を実行する工程と、
培地を取り込み、前記培地と共に前記培養室を振盪させる、または回転させることを少なくとも有する、第２の細胞分離工程を実行する工程と、
前記複数の細胞と共に前記培地を採取する工程と
を備える、細胞採取方法。
前記複数の細胞は動物細胞である、請求項４に記載の細胞採取方法。
前記複数のマトリックス手段は、球形、円筒形、棒形、または卵形を有する、請求項４または５に記載の細胞採取方法。
前記細胞成長空間は５００ｍｌより大きい、請求項４から６のいずれか１項に記載の細胞採取方法。
前記空隙容量は、前記細胞成長空間の３３％ｖ／ｖより大きく５０％ｖ／ｖ以下である、請求項１から７のいずれか１項に記載の細胞採取方法。