JP5822247B1 - エレクトロポレーター用電気パルス発生器及び前記電気パルス発生器を備えたエレクトロポレーター装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、多段階方式エレクトロポレーター装置であって、対象物のインピーダンスの違いに応じてポアーリングパルスの電圧切り替えを数十〜数千ボルトという広範囲で調整でき、且つ連続的に複数回のポアーリングパルスの安定発生を可能とするエレクトロポレーター装置を、効率良く製造可能な仕様にて製造することを目的とする。本発明は、ポアーリングパルス発生手段として、；（Ａ）ｎ段のコッククロフト・ウォルトン回路、；並びに、前記回路の出力側に、（Ｂ）（ｂ１）高電圧モードの時にはスイッチオフとなり低電圧モードの時にはスイッチオンとなる切替スイッチ、及び、その出力側に（ｂ２）ｍ１個直列ｍ２並列コンデンサが直列された回路、を含む分岐合流回路、；を有することを特徴とする、エレクトロポレーター用電気パルス発生器を提供する。

Description

本発明は、ポアーリングパルス発生手段及びトランスファーパルス発生手段を有する多段階方式エレクトロポレーター用電気パルス発生器であって、対象物のインピーダンスの違いに応じて、ポアーリングパルスの電圧切り替えを数十〜数千ボルトという極めて広範囲で調整でき、且つ複数回のポアーリングパルスの安定発生が可能となるエレクトロポレーター用パルス発生器に関する。
また、本発明は、前記パルス発生器を備えたエレクトロポレーター装置、及び前記装置を用いた遺伝子導入法に関する。

エレクトロポレーターは、電気刺激によって対象細胞の細胞膜に微細孔を開け、ＤＮＡ等核酸分子や薬剤成分などを、簡便且つ効率的に細胞内に導入すること（電気穿孔法、エレクトロポレーション法）を実現するための装置である。
特に、生命科学分野の研究開発現場では、外来ＤＮＡやＲＮＡ等を細胞内に導入するための装置として極めて重要な装置と認識されており、多くの分野で需要が拡大しつつある装置である。また、装置操作のハンドリングが容易である点、比較的低費用で設備導入できる装置である点など、極めて利用価値が高い装置であることも、エレクトロポレーターの需要拡大の大きな要因となっている。

しかし、エレクトロポレーターの産業技術分野での需要が増大するにつれて、各分野それぞれの現場において適用可能なエレクトロポレーター装置の登場が要望されるようになってきた。即ち、エレクトロポレーション法の使用対象が多用化する伴い、生物種や組織等の違いによって導入対象に適した溶液（特に溶液の電気抵抗）の相違、細胞学的性質（セルサイズ、細胞膜特性など）が大きく異なり、それぞれの導入対象ごとに好適化した条件の電気パルスを与えることが可能な装置の登場が要望されるようになってきた。

特に対象物の電気抵抗（インピーダンス）の相違は、エレクトロポレーションの電気条件に大きな影響を与える。例えば、哺乳類細胞等に電気パルス処理を行う場合、通常のエレクトロポレーションバッファーや培養溶液に塩や緩衝成分が含まれているため、電気パルスを与える対象物のインピーダンスが比較的低くなる。そのため、哺乳類細胞等にエレクトロポレーションを行う場合には、比較的「低い電圧」の電気パルス（細胞に微細孔を開けることが可能なエネルギー量を有し且つ比較的低電圧である数十〜数百ボルト程度の電気パルス）を与えることが必要となる。
一方、バクテリアや酵母等に電気パルス処理を行う場合では、細胞の障害抑制やコンピテンシー（形質転換効率）を維持するためにグリセロールや糖類等を添加した高インピーダンスの溶液（電気抵抗が高い溶液）中でエレクトロポレーション処理を行うことが必要である。そのため、バクテリア等に対するエレクトロポレーションでは、「高い電圧」の電気パルス（数百〜数千ボルト程度の高電圧パルス）を与えることが必要となる。

高インピーダンス対象に対する「数千ボルトでの電気パルス」を発生させてエレクトロポレーションを実現するためには、入力電圧を昇圧してコンデンサに蓄積して高電圧パルス発生させるための電源及び専用回路が必要となる。
通常、コンデンサに電荷を蓄積させて高電圧電気パルスを発生させるためには、所望の電圧帯に応じた専用の直流電源及び充電用回路（コンデンサ回路の充電のために必要な回路：スイッチング回路、昇圧回路、整流回路などの一連の回路構成）が必要となる。

ここで、高電圧を発生させるためにコンデンサを直列させた回路では、電気容量が小さくなるため、出力パルスの電圧波高値の減衰が大きくなる低インピーダンス対象物にエレクトロポレーションをする場合に、十分な電気容量を確保できないという問題が生じる。即ち、単なる高電圧発生回路を採用しただけでは、抵抗の低い対象物に対して電圧パルスを与える場合に、複数回のパルス発生が安定して十分にできないという課題が生じる。
従って、低電圧パルス発生と高電圧パルス発生とを同一の装置で実現しようとする場合、「電気容量が十分に確保された数十〜数百ボルトという低電圧パルス用の直流電源及び充電回路」と同時に、これとは別に「数百〜数千ボルトという高電圧用の直流電源及び充電用回路」が別途に必要となり、製造コストが大幅に増大するという課題が生じる。
また、高耐電圧コンデンサとしては、コストの面を考慮するとケミカルコンデンサを用いることが一般的であるが、市販のケミカルコンデンサでは、耐電圧４５０Ｖ・電気容量５６０μＦ程度のものがせいぜいであり、耐電圧５００Ｖを超えるものを低コストで調達することは困難な現状である。

特に、この高低の電圧帯に応じてそれぞれの電源回路が必要となるという課題は、「多段階式エレクトロポレーター装置」の製造において大きな問題となる。
ここで、多段階式エレクトロポレーターとは、導入対象への導入効率と生存率の両方を、飛躍的に向上させる多段階の電気パルスの発生を実現するための装置である。
具体的には、高電圧で短時間の電気パルス（以下、ポアーリングパルス又はＰｐという）と、低電圧でパルス幅の長い電気パルス（以下、トランスファーパルス又はＴｐという）を、連続して与えるエレクトロポレーション法を可能とする装置を指すものである。
このような多段階方式のエレクトロポレーター装置としては、複数メーカーから装置が製造販売されている。例えばネッパジーン株式会社製のＮＥＰＡ２１エレクトロポレーターを挙げることができる。また、エレクトロポレーター電源に関する特許文献としては特許文献１を挙げることができる。（なお、特許文献１では、ポアーリングパルスがポレーションパルス、トランスファーパルスがドライビングパルス、と表現されている。）

しかしながら、多段階方式のエレクトロポレーター装置では、「ポアーリングパルス用電源回路」および「トランスファーパルス用電源回路」という少なくとも２種類の電源回路が、既に積装された装置態様となっている。
そのため、多段階方式のエレクトロポレーター装置として、数十ボルトの低電圧から〜数千ボルトの高電圧のパルス発生が可能な装置を実現しようとした場合、これら２種類の電源回路（数十〜数百ボルト用のポアーリングパルス用電源回路、トランスファーパルス用電源回路）に加えて、さらに「数百〜数千ボルト用のポアーリングパルス用高電圧電源回路」を増設することが必要となる。
この点、専用の電源回路（直流電源及び充電用回路）をさらに増設することは、製造コストの観点で大きな問題となる。電源自体が高価であることに加えて、一連のコンデンサ充電用回路及び所望のコンデンサ回路からなる回路構成が別途に必要となるためである。
さらに装置筐体内の省スペース化（製品装置の小型化）の観点からも、別途の電源回路の増設は回避すべき問題である。

なお、現行の多段階方式エレクトロポレーター装置としては、低電圧（数十〜数百ボルト）用のポアーリングパルスの発生が可能な装置しか存在しない。即ち、高インピーダンス対象（バクテリア、酵母等）への多段階式エレクトロポレーションに最適な電気パルス処理が可能であるエレクトロポレーター装置は、実現されていない。

特開２０１３−１９８６３７号公報

本発明は、上記課題を解決し、低インピーダンス対象の生物種や細胞だけでなく、高インピーダンス対象であるバクテリア・真核微生物等を含む幅広い生物種や細胞に対しても、好適に使用可能である多段階方式エレクトロポレーター装置を、効率良く製造可能な仕様にて提供することを目的とする。
具体的に、本発明は、多段階方式エレクトロポレーター装置であって、対象物のインピーダンスの違いに応じてポアーリングパルスの電圧切り替えを数十〜数千ボルトという広範囲で調整でき、且つ連続的に複数回のポアーリングパルスの安定発生を可能にするエレクトロポレーター装置を、効率良く製造可能な仕様にて製造することを目的とする。

本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ポアーリングパルス発生用電源回路として、「ｎ段のコッククロフト・ウォルトン回路」、並びに、前記回路の出力側に「高電圧モードの時にはスイッチオフとなり低電圧モードの時にはスイッチオンとなる切替スイッチ、及び、その出力側にｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサが直列された回路、を含む分岐合流回路」を接続した回路にすることによって、；直流電源及びコンデンサ用充電回路を１セットしか用いない場合でも、数十〜数千ボルトという極めて広範囲でのポアーリングパルスを、安定して連続的に複数回出力可能な、ポアーリングパルス発生用電源回路を実現できることを見出した。

本発明は、上記知見に基づいて想到されたものであり、具体的には以下の発明に関する。
［１］
ポアーリングパルス発生手段及びトランスファーパルス発生手段を有するエレクトロポレーター用電気パルス発生器であって、
ポアーリングパルス発生手段として、
（Ａ）ｎ段のコッククロフト・ウォルトン回路（ｎは２以上のいずれかの整数を示す）、並びに、
（Ｂ）前記（Ａ）に記載の回路の出力側の配線の分岐点から分岐した回路であって、
（ｂ１）高電圧モードと低電圧モードの切替電圧値が２００〜１４００Ｖの範囲にあるいずれかの電圧値であって、高電圧モードの時にはスイッチオフとなり低電圧モードの時にはスイッチオンとなる切替スイッチ、及び、
（ｂ２）コンデンサをｍ_１個直列させたものをｍ_２並列させた回路（ｍ_１は１以上のいずれかの整数、ｍ_２は２以上のいずれかの整数を示す）、
を含み、前記（ｂ１）に記載のスイッチ及び前記（ｂ２）に記載の回路が直列関係になるように接続され、前記（ｂ２）に記載の回路の出力側の配線が、前記分岐点より出力側にて前記（Ａ）に記載の回路の出力側の配線に合流してなる回路、
を有し、且つ、
前記ポアーリングパルス発生手段を構成する回路が、高電圧モードにおいては前記（Ａ）に記載の回路の耐電圧が１５００〜５０００Ｖの範囲にあるいずれかの値である、
ことを特徴とする、エレクトロポレーター用電気パルス発生器。
［２］
前記（Ｂ）に記載の回路が、当該回路内の前記（ｂ２）に記載の回路の出力側に、出力側に電流が流れる向きで接続されたダイオードを含むものである、前記［１］に記載の電気パルス発生器。
［３］
前記パルス発生器を構成する回路要素のコンデンサが、耐電圧５００Ｖ以下のコンデンサである、前記［１］又は［２］に記載の電気パルス発生器。
［４］
前記高電圧モードと前記低電圧モードの切替電圧値が、５００〜１０００Ｖの範囲にあるいずれかの電圧値である、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の電気パルス発生器。
［５］
前記ポアーリングパルス発生手段を構成する回路が、ポアーリングパルス発生用の直流電源及びコンデンサ充電用回路を１セットのみ有し、且つ、低電圧モードにおいては前記（Ａ）に記載の回路と前記（ｂ２）に記載の回路との合計電気容量が５００〜４０００μＦの範囲にあるいずれかの値である、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の電気パルス発生器。
［６］
前記（Ａ）に記載の回路における整数ｎが４〜１３の範囲にあるいずれかの整数であり、且つ、前記（ｂ２）に記載の回路における整数ｍ_１が２〜６の範囲にあるいずれかの整数であり、且つ、前記（ｂ２）に記載の回路における整数ｍ_２が２〜１０の範囲にあるいずれかの整数である、前記［１］〜［５］のいずれかに記載の電気パルス発生器。
［７］
前記パルス発生器が、出力電圧の極性切替制御手段を有するものである、前記［１］〜［６］のいずれかに記載の電気パルス発生器。
［８］
前記パルス発生器が、出力パルスのパルス制御手段を有するものである、前記［１］〜［７］のいずれかに記載の電気パルス発生器。
［９］
前記［１］〜［８］のいずれかに記載の前記電気パルス発生器を備えたエレクトロポレーター装置。

本発明により、多段階方式エレクトロポレーター装置であって、対象物のインピーダンスの違いに応じてポアーリングパルスの電圧切り替えを数十〜数千ボルトという広範囲で調整でき、且つ連続的に複数回のポアーリングパルスの安定発生を可能にするエレクトロポレーター装置を、効率良く製造可能な仕様にて製造することが可能となる。
これにより本発明は、低インピーダンス対象の生物種や細胞だけでなく、高インピーダンス対象であるバクテリア・真核微生物等を含む幅広い生物種や細胞に対しても、好適に使用可能である多段階方式エレクトロポレーター装置を、効率良く製造可能な仕様にて提供することが可能となる。

また、本発明に係るポアーリングパルス発生用電源回路が簡素な回路構成であるにも関わらず、高性能な多段階式エレクトロポレーター装置を製造することが可能となる。また、省スペース化による小型化も期待される。
また、本発明に係る装置を用いることにより、低インピーダンスと高インピーダンス対象の両方の生物種や細胞に対しても、遺伝子導入効率が極めて良好な外来遺伝子導入を実現することが可能となる。

本発明に係る電源回路の一態様を示した構成図である。

２段コッククロフト・ウォルトン回路の回路構成を示した図である。Ｃ：コンデンサ。Ｄ：ダイオード。

倍電圧整流回路の回路構成を示した図である。Ｃ：コンデンサ。Ｄ：ダイオード。

本発明に係るポアーリングパルス用コンデンサ回路の一例（８段コッククロフト・ウォルトン回路および２個直列４並列コンデンサ回路を使用した例）を示した回路図である。Ｃ：コンデンサ。Ｄ：ダイオード。Ｓ：切替スイッチ。Ｒ：抵抗。

本発明のトランスファーパルス用コンデンサ回路の一例を示した回路図である。Ｃ：コンデンサ。

本発明に係るエレクトロポレーターの出力波形の一例を示す模式図である。ポアーリングパルス３回、極性切替ポアーリングパルス３回、トランスファーパルス３回、及び極性切替トランスファーパルス３回、を出力した４段階パルスの出力例。

製造例１において製作したエレクトロポレーター装置を用いて、高電圧モードにてポアーリングパルスを出力したオシログラムを示した図である。当該図は３段階パルスを出力した結果である。

製造例１において製作したエレクトロポレーター装置を用いて、高電圧モードにてポアーリングパルスを出力したオシログラムを示した図である。当該図は４段階パルスを出力した結果である。

製造例１において製作したエレクトロポレーター装置を用いて、低電圧モードにてポアーリングパルスを出力したオシログラムを示した図である。当該図は３段階パルスを出力した結果である。

製造例１において製作したエレクトロポレーター装置を用いて、低電圧モードにてポアーリングパルスを出力したオシログラムを示した図である。当該図は４段階パルスを出力した結果である。

キュベット電極の外観を撮影した写真像図である。３１：１ｍｍギャップキュベット電極。３２：２ｍｍギャップキュベット電極。３３：４ｍｍギャップキュベット電極。

本出願は、２０１４年７月２８日に日本国に本出願人により出願された特願２０１４−１５２７３０に基づくものであり、その全内容は参照により本出願に組み込まれる。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。以下の説明における符号番号は、図面中に使用した符号番号を意味する。
本発明は、ポアーリングパルス発生手段及びトランスファーパルス発生手段を有する多段階方式エレクトロポレーター用電気パルス発生器であって、対象物のインピーダンスの違いに応じて、ポアーリングパルスの電圧切り替えを数十〜数千ボルトという極めて広範囲で調整でき、且つ連続的に複数回のポアーリングパルスの安定発生が可能となるエレクトロポレーター用パルス発生器に関するものである。また、本発明は、前記パルス発生器を備えたエレクトロポレーター装置、及び前記装置を用いた遺伝子導入法に関するものである。

［多段階式エレクトロポレーション法］
多段階式エレクトロポレーション法とは、高電圧でパルス幅の短い電気パルス（以下、ポアーリングパルス又はＰｐという）と、低電圧でパルス幅の長い電気パルス（以下、トランスファーパルス又はＴｐという）を、連続して与える多段階のエレクトロポレーション法を指すものである。
特に、哺乳類等の細胞に対する遺伝子導入法として、導入対象への遺伝子導入効率を飛躍的に向上可能な優れた手法であることが知られている。
しかし、従来技術においては、高電圧電源回路を扱う製造技術上の課題から、高インピーダンス対象に適用可能であり且つ多段階方式のエレクトロポレーター装置は、実現されていなかった。
また、エレクトロポレーション法の電気パルス処理では、生物種や細胞種の違いによって、導入対象に適した溶液の相違、細胞学的性質（セルサイズ、細胞膜特性など）が大きく異なるため、それぞれの導入対象ごとに好適化した条件の電気パルス処理が必要となる。
そのため、高電圧パルス処理が必要な高インピーダンス対象の生物種（バクテリア、真核微生物等）に対しては、当該多段階方式のエレクトロポレーション法が実際に有効であるかどうか不明であった。また、高インピーダンス対象の生物種や細胞に対して実際にエレクトロポレーション処理を行うにあたり、どのような電気パルス条件等に設定すべきかの情報についても、一切不明であった。

［ポアーリングパルス発生手段］
本発明に係るエレクトロポレーター用パルス発生器とは、「ポアーリングパルス発生用手段」を含むものである。
「ポアーリングパルス」（Poring pulse）とは、多段階式エレクトロポレーション法において、導入対象の細胞膜に微細孔を開ける作用を有する高電圧にて短いパルス幅の電気パルスを指す。
ポアーリングパルスの波形形状としては、スクエアーパルスの場合と、エクスポネンシャルスクエアーパルスのいずれであっても良い。
導入対象が低インピーダンス対象物の場合は、必要な電場強度（Ｖ／ｃｍ）を得るために、数十〜数百ボルトオーダーでの出力手段があれば十分であるが、一方、高インピーダンス対象物の場合、数千ボルトオーダーの出力手段が必要となる場合がある。

本発明に係るパルス発生器のポアーリングパルス発生手段は、ポアーリングパルス発生用の直流電源、コンデンサ充電用回路、及びコンデンサ回路、を実質な構成要素としてなる電源回路である。なお、当該電源回路においては、当該回路の機能を阻害しない限り、その他の回路要素や機能回路を含む構成となる態様を、排除するものではない。
また、当該ポアーリングパルス発生手段では、直流電源及びコンデンサ充電用回路を１セット含む態様であれば、数十〜数千ボルトという広範囲のポアーリングパルスを連続的に複数回発生させることが実現可能となるが、但し、別途の電源や充電用回路を使用する態様を排除するものではない。

ここで、ポアーリングパルス発生用の直流電源（ＤＣ電源：符号１）とは、ポアーリングパルス発生のための電圧波高値を得るために専用に制御された直流電源である。当該直流電源（符号１）の出力側には、「コンデンサ充電用回路」が接続されてなるものである。

当該コンデンサ充電用回路としては、直流電源（符号１）から出力される直流を矩形波（交流）に変換する回路、矩形波（交流）を昇圧するための回路、などを挙げることができる。
例えば、直流電源（符号１）の出力側に、スイッチング回路（符号２）が接続され、その出力側にはパルストランス（符号３）が直列関係にて接続される構成を挙げることができる。ここで、スイッチング回路（符号２）は、直流電源（符号１）から出力される直流を、矩形波（交流）に変換する回路である。また、パルストランス（符号３）は、矩形波（交流）を昇圧するための回路である。

当該回路構成によって、ポアーリングパルス用の「コンデンサ充電用回路」からの出力電圧は、ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）に入力される前の電圧波高値として、相応しい値となるように調整されたものとなる。
なお、当該回路構成では、「コンデンサ回路」となるｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）自身に整流作用があるため、パルストランス（符号３）出力後の別途の整流回路の使用が不要となる。この点、コッククロフト・ウォルトン回路を採用する利点である。

［コッククロフト・ウォルトン回路］
当該コンデンサ充電用回路からの出力は、ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）に入力される。
当該ポアーリングパルス発生用電源回路におけるｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）は、高電圧モードの際の「コンデンサ回路」として機能する。また、低電圧モードにおいては、「コンデンサ回路」と「コンデンサ充電用回路」の両方の機能を発揮する。（後述するが、本発明に係るポアーリングパルス発生用回路の特徴として、ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）も、低電圧モード用の際にはコンデンサ充電用回路の一部としても機能するものとなる。）

ここで、「コッククロフト・ウォルトン回路」（以下、ＣＷ回路という場合あり。）とは、回路要素コンデンサとダイオードを組み合わせて構成された昇圧整流回路の一種である。ｎ段のコッククロフト・ウォルトン回路の場合、ｎ個直列のコンデンサを２並列した回路において、ダイオードを介して接続した回路構成となる。ここで、ｎは２以上の整数を示す。（図２は、２段コッククロフト・ウォルトン回路、図４（符号４）は８段コッククロフト・ウォルトン回路である。）

当該コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）の回路要素となるコンデンサとしては、特に制限はないが、装置製造上の生産性の向上を踏まえると、市販のケミカルコンデンサを用いることが好適である。特に、耐電圧５００Ｖ以下、好ましくは耐電圧４５０Ｖ以下のものが好適である。
一方、下限としては、入力電圧の２倍以上の耐電圧を挙げることができるが、耐電圧の高いものを用いることが好適である。例えば、耐電圧１００Ｖ以上、好ましくは耐電圧２００Ｖ以上、より好ましくは３００Ｖ以上、特に好ましくは３６０Ｖ以上のものが好適である。
具体的には、耐電圧３００Ｖ〜４５０Ｖ、より好ましくは３６０〜４５０Ｖ、のものが市販品として入手しやすく、好適に用いることができる。
なお、市販低耐電圧コンデンサ（及びダイオード）を使用して、このような高電圧発生回路を実現できることは、ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）を使用する利点である。

ここで、ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路の耐電圧は、耐電圧及び電気容量が同一の要素コンデンサを用いて回路を組んだ場合、当該要素コンデンサ耐電圧の「ｎ倍」のとなる。また、ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路の電気容量は、当該要素コンデンサ電気容量の「２／ｎ倍」の電気容量となる。
なお、当該コッククロフト・ウォルトン回路に用いる要素コンデンサとしては、耐電圧及び電気容量が同一の要素コンデンサを用いることが好適であるが、耐電圧及び電気容量が異なるコンデンサを組み合わせて用いる態様も含まれるものである。

当該ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）としては、ポアーリングパルスとしての出力電圧を逸脱しない範囲の耐電圧であり、且つ、十分な電気容量が確保できるものであれば、「ｎ段」の数として如何なる整数の値を採用することができる。
当該「ｎ段」の数としては、２以上のいずれかの整数であれば良いが、好ましくは下記した耐電圧及び電気容量を確保できる範囲の値であれば、如何なる段数でも好適に採用することができる。
具体的には、ｎ段数の値として４以上、好ましくは５以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは７以上、特に好ましくは８以上、を挙げることができる。
上限としては例えば、４８以下、好ましくは３６以下、より好ましくは２４以下、さらに好ましくは２０以下、特に好ましくは１６以下、より好ましくは１５以下、さらに好ましくは１４以下、特に好ましくは１３以下、より好ましくは１２以下、さらに好ましくは１１以下、を挙げることができる。
例えば、４〜１３、好ましくは４〜１２、より好ましくは５〜１１、さらに好ましくは６〜１０、特に好ましくは７〜９、を挙げることができる。

当該ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）の耐電圧としては、例えば１５００Ｖ以上、好ましくは１８００Ｖ以上、より好ましくは２０００Ｖ以上、さらに好ましくは２２００Ｖ以上、特に好ましくは２４００Ｖ以上、であることが好適である。
上限としては、高電圧モードのポアーリングパルスとしての出力電圧として逸脱しない範囲であれば良いが、例えば５０００Ｖ以下、好ましくは４６００Ｖ以下、より好ましくは４２００Ｖ以下、さらに好ましくは４０００Ｖ以下、特に好ましくは３８００Ｖ以下、より好ましくは３６００Ｖ以下、さらに好ましくは３４００Ｖ以下、特に好ましくは３２００Ｖ以下、を挙げることできる。

また、当該ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）の電気容量としては、ポアーリングパルスとして上記耐電圧の範囲の電圧を出力しようとする場合であれば、例えば２０μＦ以上、好ましくは３０μＦ以上、より好ましくは４０μＦ以上、さらに好ましくは５０μＦ以上、特に好ましくは５５μＦ以上、が必要である。対象物が高インピーダンス対象物である場合は、出力パルスの電圧波高値の減衰が生じにくいが、十分な回数の複数回パルスを連続発生させるためには、ある程度以上の電気容量が必要だからである。
当該電気容量の上限は高い程良いが、例えば、５００μＦ以下、好ましくは４７０μＦ以下、より好ましくは４５０μＦ以下、さらに好ましくは４００μＦ以下、特に好ましくは３００μＦ以下、より好ましくは２２０μＦ以下、さらに好ましくは２００μＦ以下、特に好ましくは１５０μＦ以下、より好ましくは１２０μＦ以下、さらに好ましくは１００μＦ以下、特に好ましくは８０μＦ以下、を挙げることができる。

また、一例として、要素コンデンサとして下記表で示したものを用いた場合のコッククロフト・ウォルトン回路を組んだ場合の耐電圧値及び電気容量の関係を示した。
なお、下記表１，２に示した各数値は、数値範囲の上限下限の根拠記載とすることが可能である数値である。（表中の「ＣＷ回路」は、「コッククロフト・ウォルトン回路」の略である。）

［分岐合流回路］
当該ポアーリングパルス発生用電源回路は、ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）の出力側に、所定の分岐合流回路を有することを特徴とするものである。

当該「分岐合流回路」とは、具体的には、ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）の出力側の配線の分岐点から分岐した回路であって、所定の「切替スイッチ」（符号５）及び「ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路」（符号６）を含み、これらが直列関係になるように接続され、「ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路」（符号６）の出力側の配線が、前記分岐点より出力側において、ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）の出力側の配線に再び合流してなる回路、を指すものである。
なお、当該回路においては、当該回路の機能を阻害しない限り、その他の回路要素や機能回路を含む回路構成となる態様を、除外するものではない。

当該分岐合流回路は、本発明の電源回路において特徴的な部分である。なお、上記ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）とｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ（符号６）とを、単に併用して組み合わせた回路構成としただけでは、所定の電圧を得ることができず、コンデンサへの充電を達成することができない。
例えば、パルストランス（符号３）からの出力を、ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）を介さずに、ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ（符号６）に直接バイパスしただけでは、当該コンデンサの充電を達成することができない。この場合、低電圧モードの電圧発生に必要な電圧を得るために、別途に昇圧回路が必要となる。また、必要に応じて高電圧用の直流電源が必要となる場合もある。さらに、矩形波を整流するための整流回路も別途に必要となる。

・高電圧モード／低電圧モード切替スイッチ
当該回路における「切替スイッチ」（符号５）とは、ポアーリングパルスの高電圧モードと低電圧モードの切替機能に関するスイッチである。具体的には、高電圧モードにはスイッチオフとなり、当該切替電圧値以下（又は未満）の低電圧モードにはスイッチオンとなる、切替スイッチである。
当該切替スイッチ（符号５）は、ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路（符号６）の入力側に接続された回路構成であることを要する。もし、ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路（符号６）の入力側に当該切替スイッチ（符号５）を配置しなかった場合、本発明に係る電源回路の機能を発揮させることができない。

・ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路
「ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路」（符号６）は、ポアーリングパルスの低電圧モードの時の「コンデンサ回路」として機能する回路である。要素コンデンサをｍ_１個直列させたものをｍ_２並列させた回路、を指すものである。
なお、当該回路（符号６）に入力される電圧は、前記ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）から出力された直流電圧であり、パルストランス（符号３）からの矩形波（交流）が、既に整流された後のものである。

当該回路（符号４）の回路要素となるコンデンサとしては、特に制限はないが、装置製造上の生産性の向上を踏まえると、市販のケミカルコンデンサを用いることが好適である。特に、耐電圧５００Ｖ以下、好ましくは耐電圧４５０Ｖ以下のものが好適である。一方、下限としては、耐電圧の高いものを用いることが好適であるが、耐電圧１００Ｖ以上、好ましくは耐電圧２００Ｖ以上、より好ましくは３００Ｖ以上、特に好ましくは３６０Ｖ以上のものが好適である。
具体的には、耐電圧３００Ｖ〜４５０Ｖ、より好ましくは３６０〜４５０Ｖ、のものが市販品として入手しやすく、好適に用いることができる。

ここで、ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路（符号６）の耐電圧に用いる要素コンデンサとしては、耐電圧及び電気容量が同一の要素コンデンサを用いることが好適であるが、耐電圧及び電気容量が異なるコンデンサを組み合わせて用いる態様も許容するものである。

当該ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路（符号６）としては、低電圧モードのポアーリングパルスとしての出力電圧を逸脱しない範囲の耐電圧であり、且つ、十分な電気容量が確保できるものであれば、直列数である「ｍ_１」及び並列数「ｍ_２」の数として、如何なる整数値を採用することができる。
当該直列数を示す「ｍ_１」の数として具体的には、１以上のいずれかの整数であれば良いが、好ましくは２以上、を挙げることができる。特に好ましくは２〜６、より好ましくは２〜５、さらに好ましくは２〜４を挙げることができる。（なお、ｍ_１が１の時とは、要素コンデンサの耐電圧が十分に大きい場合に可能な形態であるが、この場合単なる並列コンデンサ回路となる。）

また、当該並列数を示す「ｍ_２」の数として具体的には、２以上のいずれかの整数であれば良いが、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、特に好ましくは４以上、を挙げることができる。
上限としては、例えば、２０以下、好ましくは１５以下、より好ましくは１２以下、さらに好ましくは１０以下、特に好ましくは８以下、より好ましくは７以下、さらに好ましくは６以下、を挙げることができる。
例えば、２〜２０、好ましくは２〜１５、より好ましくは２〜１０、さらに好ましくは２〜９、特に好ましくは３〜８、さらに好ましくは４〜７、特に好ましくは４〜６を挙げることができる。

ここで、低電圧モードの耐電圧としては、例えば、２００Ｖ以上、好ましくは３００Ｖ以上、特に好ましくは４００Ｖ以上、より好ましくは５００Ｖ以上、さらに好ましくは６００Ｖ以上、が好適である。
上限としては、低電圧モードのポアーリングパルスとしての出力電圧として逸脱しない範囲であれば良いが、１４００Ｖ以下、好ましくは１２００Ｖ以下、好ましくは１０００Ｖ以下、好ましくは９００Ｖ以下、を挙げることができる。

また、当該ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路（符号６）の電気容量としては、低電圧モードにおける低インピーダンス対象に電気パルスを出力する際に、連続的に複数回のパルスを発生させるために十分な電気容量（後述するｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）とｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路（符号６）の合計電気容量）として、十分な電気容量であれば良い。
当該電気容量としては、例えば５００μＦ以上、さらに好ましくは６００μＦ以上、特に好ましくは７００μＦ以上、より好ましくは８００μＦ以上、を挙げることができる。
また、電気容量の上限は高い程良いが、例えば、４０００μＦ以下、好ましくは３０００μＦ以下、より好ましくは２５００μＦ以下、さらに好ましくは２０００μＦ以下、特に好ましくは１５００μＦ以下、より好ましくは１２００μＦ以下、を挙げることができる。

なお、当該ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路（符号６）においては、当該回路の機能を阻害しない限り、その他の回路要素や機能回路を含む回路構成となる態様を、除外するものではない。例えば、抵抗などを組み込んだ回路とすることもできる。
また、当該ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路（符号６）は、用途に応じて所定の配置にてダイオードを組み込んだ態様にして、低段数のコッククロフト・ウォルトン回路に変形した回路とすることも可能である。ここで、低段数のコッククロフト・ウォルトン回路としては、段数が２〜４、好ましくは２〜３程度のものを挙げることができる。

・電流制御用回路要素
また、当該分岐合流回路には、ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路の出力側に、電流制御用回路要素を含むものであることが望ましい。ここで、電流制御用回路要素として具体的には、出力側に電流が流れる向きで接続された「ダイオード」（符号７）を挙げることができる。
当該ダイオード（符号７）として、半導体ダイオード（ＰＮ接合型ダイオード、ショットキー接合型ダイオードなど）を指すものである。また、ダイオードの耐電圧を確保するために、２個以上のダイオードを直列関係に接続して用いても良い。
当該ダイオード（符号７）の作用によって、低電圧モードにおいて、ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路（符号６）とｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）との印加電圧の畳重出力が実現される。

［高電圧モード／低電圧モードの切替］
当該ポアーリングパルス発生用電源回路では、高電圧モード／低電圧モード切替手段を備えたものである。当該回路において、高電圧モード／低電圧モード切替を具体的に実現している回路素子は、上記した切替スイッチ（符号５）である。

高電圧モード／低電圧モードの切替指標となる電圧値は、装置の仕様に応じて所定の電圧値を設定することができる。
例えば、２００〜１４００Ｖ、好ましくは３００〜１２００Ｖ、特に好ましくは４００〜１１００Ｖ、より好ましくは５００〜１０００Ｖ、さらに好ましくは６００〜９００Ｖ、一層好ましくは７００〜９００Ｖ、の範囲にあるいずれかの電圧値を、高電圧モード／低電圧モードの切替電圧値として設定することができる。
例えば、８００Ｖを切替電圧値として設定した場合、当該値を超える（又は当該値以上）の電圧を出力する場合は高電圧モードとなる。また、当該値以下（又は当該未満）の電圧を出力する場合は低電圧モードでの出力となる。

・高電圧モードでの出力
高電圧モードでは、切替スイッチ（符号５）はオフの状態になる。この場合、ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路（符号６）は充電されずに、ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）のみが充電される。そのため、高電圧モードでは、ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）に蓄積された電荷を利用して電気パルスが出力される。

ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路に入力された矩形波（交流）は、当該回路（符号４）の出力端では、入力波高値の「２ｎ倍」の直流電圧が昇圧整流して出力される。
例えば、パルストランス（符号３）からの５０〜２００Ｖの矩形波（交流）が入力された場合、８段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）からの出力は、８００〜３２００Ｖの直流電圧が得られることになる。

高電圧モードで出力可能な電圧の上限値としては、上記したｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）の耐電圧での電圧の出力が可能である。特に上限の電圧値としては、１５００〜５０００Ｖ、好ましくは１８００〜４６００Ｖ、より好ましくは２０００〜４０００Ｖ、さらに好ましくは２２００〜３６００Ｖ、特に好ましくは２４００〜３２００Ｖ、の範囲にあるいずれかの電圧値を、高電圧モードで出力可能な上限値とすることができる。
一方、高電圧モードでの出力下限値は、必然的に上記した高電圧モード／低電圧モードの切替指標である電圧値となる。

高電圧モードで出力可能なパルス幅としては、０．０１〜１００ミリ秒、好ましくは０．０５〜７５ミリ秒、より好ましくは０．１〜５０ミリ秒、さらに好ましくは０．１〜２５ミリ秒、特に好ましくは０．１〜２０ミリ秒、より好ましくは０．１〜１５ミリ秒、のパルス出力が可能である。
また、パルス連続発生回数としては、上記コンデンサ容量によって、高インピーダンスの対象に対して１〜３０回、好ましくは１〜２０回、より好ましくは１〜１５回、さらに好ましくは１〜１２回、特に好ましくは１〜１０回、より好ましくは１〜９回、を出力できる。なお、パルスを発生させない（０回とする）ことも可能である。

当該高電圧モードの出力パルスは、高電圧パルスであるにも関わらず、設定電圧と実行電圧値が極めて近く、安定した波形の高電圧電気パルスが出力される。

・低電圧モードでの出力
低電圧モードでは、切替スイッチ（符号５）はオンの状態になる。この場合、ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）からの出力は、切替スイッチ（符号５）を経由してｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路（符号６）に入力される。
ここでは、ダイオード（符号７）の働きによって、ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）とｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路（符号６）の両方のコンデンサ回路に、電荷が蓄積し充電がされることになる。即ち、ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）がｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路（符号６）の充電源となる。
当該回路構成によって、低電圧モードでは「ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路」（符号４）と「ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路」（符号６）の両方に蓄積された電荷を利用して電気パルスが出力される。

ここで、「ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路」（符号４）と「ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路」（符号６）の両方に蓄積された合計の電気容量としては、低インピーダンス対象に電気パルスを出力する際に、連続的に複数回のパルスを発生させるために十分な電気容量であれば良い。低インピーダンス対象に対して電気パルスをかけるには、十分な電気容量が確保できないと、十分な回数の電気パルスを発生させることができないためである。
当該合計の電気容量としては、例えば５００μＦ以上、さらに好ましくは６００μＦ以上、特に好ましくは７００μＦ以上、より好ましくは８００μＦ以上、を挙げることができる。
また、電気容量の上限は高い程良いが、例えば、４０００μＦ以下、好ましくは３０００μＦ以下、より好ましくは２５００μＦ以下、さらに好ましくは２０００μＦ以下、特に好ましくは１５００μＦ以下、より好ましくは１２００μＦ以下、を挙げることができる。
具体的には、５００〜４０００μＦ、好ましくは５００〜３０００μＦ、より好ましくは６００〜２５００μＦ、さらに好ましくは６００〜２０００μＦ、特に好ましくは７００〜１５００μＦ、より好ましくは８００〜１２００μＦ、を挙げることができる。

低電圧モードの具体例としては、例えば、要素コンデンサとして電気容量４７０μＦのものを用いて、８段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）と２個直列４並列コンデンサ（符号６）を組んだ例を挙げることができる。この場合、回路全体のコンデンサ容量は、８段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）の電気容量が５５μＦ、２個直列４並列コンデンサ（符号６）の電気容量が９４０μＦとなり、合計９９５μＦの電気容量が得られる。
また、回路全体として耐電圧値は、２個直列４並列コンデンサ回路の耐電圧値になる。例えば、要素コンデンサとして耐電圧４５０Ｖのものを用いて２個直列４並列コンデンサ回路を組んだ場合、出力される電圧としては、９００Ｖまでのポアーリングパルスの出力が可能となる。

低電圧モードで出力可能な電圧の上限としては、ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路（符号６）の耐電圧以下での電圧の出力が可能である。実際には、上記した高電圧モード／低電圧モードの切替指標である電圧値が上限となる。
当該出力の下限としては０Ｖを超える電圧であれば出力可能であるが、特に１Ｖ以上であれば出力可能である。特に下限の電圧値としては、０〜２００Ｖ（０Ｖを除く）、好ましくは１〜１７５Ｖ、より好ましくは１０〜１５０Ｖ、さらに好ましくは２０〜１２５Ｖ、特に好ましくは３０〜１２０Ｖ、より好ましくは４０〜１１０Ｖ、さらに好ましくは５０〜１００Ｖ、の範囲にあるいずれかの電圧値を、低電圧モードで出力可能な下限値とすることができる。

低電圧モードで出力可能なパルス幅としては、０．０１〜５００ミリ秒、好ましくは０．０５〜３００ミリ秒、より好ましくは０．１〜２００ミリ秒、さらに好ましくは０．１〜１００ミリ秒、特に好ましくは０．１〜７５ミリ秒、より好ましくは０．１〜５０ミリ秒、のパルス出力が可能である。
また、パルス連続発生回数としては、上記コンデンサ容量によって、低インピーダンスの対象に対して１〜３０回、好ましくは１〜２０回、より好ましくは１〜１５回、さらに好ましくは１〜１２回、特に好ましくは１〜１０回、より好ましくは１〜９回、を出力できる。なお、パルスを発生させない（０回とする）ことも可能である。

［トランスファーパルス発生手段］
また、本発明に係るエレクトロポレーター用パルス発生器とは、「トランスファーパルス発生用手段」を含むものである。
「トランスファーパルス」（Transfer pulse）とは、多段階式エレクトロポレーション法において、前記ポアーリングパルスの直後に与える電気パルスであって、低い電圧での短いパルス幅の電気パルスを指す。
当該トランスファーパルスの作用によって、ポアーリングパルスによって開いた細胞膜の微細孔から、目的の導入物質（核酸等）を細胞内に効率良く取り込ませることが可能となる。

トランスファーパルスとして必要な電場強度（Ｖ／ｃｍ）は、比較的低い値であるため、数十〜数百ボルトオーダーでの出力手段があれば十分である。
また、トランスファーパルスの波形形状としては、スクエアーパルスの場合と、エクスポネンシャルスクエアーパルスのいずれであっても良い。

当該トランスファーパルス発生手段は、トランスファーパルス発生用の直流電源、コンデンサ充電用回路、及びコンデンサ回路、を実質な構成要素としてなる電源回路である。
なお、当該回路においては、当該回路の機能を阻害しない限り、その他の回路要素や機能回路を含む構成となる態様を、除外するものではない。

ここで、トランスファーパルス発生用の直流電源（ＤＣ電源：符号１１）は、トランスファーパルス発生のための電圧波高値を得るために専用に制御された直流電源である。
当該直流電源（符号１１）の出力側には、「コンデンサ充電用回路」が接続されてなる。当該コンデンサ充電用回路としては、直流電源（符号１１）から出力される直流を矩形波（交流）に変換する回路、矩形波（交流）を昇圧するための回路、矩形波（交流）を整流するための回路、などを挙げることができる。

ここで、出力電圧が十分に高い直流電源（符号１１）を採用した場合、例えば、直流電源（符号１１）の出力側にスイッチング回路（符号１２）を接続して、その出力側に整流回路（符号１４）を直列関係で接続する回路構成とすることができる。
ここで、スイッチング回路（符号１２）とは、直流電源（符号１１）から出力される直流を、矩形波（交流）に変換する回路である。また、整流回路（符号１４）とは、矩形波（交流）を直流に整流するための回路である。
なお、スイッチング機能と整流機能を併せ持った回路を、スイッチング回路（符号１２）及び整流回路（符号１４）として用いることもできる。

一方、出力電圧が低い直流電源（符号１１）を採用した場合、スイッチング回路（符号１２）の出力側に、矩形波（交流）を昇圧する手段が必要である。
当該昇圧手段としては、例えばスイッチング回路（符号１２）と整流回路（符号１４）の間に「パルストランス」（符号１３）を接続する手段を挙げることができる。当該パルストランス（符号１３）の作用によって、スイッチング回路（符号１２）からの出力矩形波を昇圧させることができる。
また、当該昇圧手段としては、パルストランス（符号１３）とは別途に、整流回路（符号１４）として「倍電圧整流回路」（図３参照）を採用する手段を挙げることができる。
ここで、倍電圧整流回路とは、入力電圧を２倍に昇圧して直流に整流する作用を有する高電圧発生回路である。即ち、倍電圧整流回路を採用する態様では矩形波（交流）が直流電圧に整流されて出力され、入力電圧が２倍に昇圧された直流として出力される。

多段階エレクトロポレーションにおけるトランスファーパルスとしては、要求される出力電圧値が比較的低い電気パルスで良いので、直流電源（符号１１）の種類の選択によっては、昇圧手段を不要となる。また、昇圧手段が必要な場合であっても、パルストランス（符号１３）や倍電圧整流回路（図３）を採用するだけで、目的の入力電圧を得ることが可能となる。また、パルストランス（符号１３）と倍電圧整流回路（符号１４）は、併用して用いることも可能である。
なお、当該トランスファーパルス用の電圧発生手段においては、パルストランス（符号１３）や倍電圧整流回路（図３）以外の他の高電圧発生回路（例えばコッククロフト・ウォルトン回路等）の採用及び／又は併用を、排除するものではない。

当該回路構成によって、トランスファーパルス用の「コンデンサ充電用回路」からの出力電圧は、トランスファーパルス用コンデンサ（符号１５）に入力される前の電圧波高値として、相応しい値となるように調整されたものとなる。

・トランスファーパルス用コンデンサ回路
トランスファーパルス用コンデンサ回路（符号１５）としては、装置製造上の生産性の向上を踏まえると、耐電圧５００Ｖ以下、好ましくは耐電圧４５０Ｖ以下の市販のケミカルコンデンサが好適である。一方、下限としては、耐電圧の高いものを用いることが好適であるが、耐電圧１００Ｖ以上、好ましくは耐電圧２００Ｖ以上、より好ましくは３００Ｖ以上、特に好ましくは３６０Ｖ以上のものが好適である。
具体的には、耐電圧３００Ｖ〜４５０Ｖ、より好ましくは３６０〜４５０Ｖ、のものが市販品として入手しやすく、好適に用いることができる。

トランスファーパルスは、要求される出力電圧値が比較的低い電気パルスのみで、目的の作用を達することが可能である。
そのため、当該回路（符号１５）としては、要素コンデンサを並列接続した回路で十分であるが、要素コンデンサの耐電圧・容量によって、直列及び／又は並列コンデンサ回路に組んだものを使用することができる。トランスファーパルスは、要求される出力電圧値が比較的低い電気パルスのみで、目的の作用を達することが可能である。
例えば、耐電圧３００〜５００Ｖ程度、好ましくは３６０〜４５０Ｖのコンデンサを用いれば、並列接続のみで所望の耐電圧を得ることができる。
なお、当該回路に用いる要素コンデンサとしては、耐電圧及び電気容量が同一の要素コンデンサを用いることが好適であるが、耐電圧及び電気容量が異なるコンデンサを組み合わせて用いる態様も許容するものである。

当該回路（符号１５）のコンデンサ並列数としては、回路（符号１５）全体で十分な電気容量が担保される数であれば特に制限はないが、例えば、２〜２０、好ましくは４〜１６、より好ましくは６〜１４、さらに好ましくは７〜１５の範囲にあるいずれかの並列数を挙げることできる。

ここで、当該トランスファーパルスコンデンサ回路（符号１５）の全体の耐電圧としては、例えば、１００Ｖ以上、好ましくは１５０Ｖ以上、より好ましくは２００Ｖ以上、さらに好ましくは２５０Ｖ以上、特に好ましくは３００Ｖ以上、が好適である。
上限としては、トランスファーパルスとしての出力電圧として逸脱しない範囲であれば良いが、６００Ｖ以下、好ましくは５００Ｖ以下、より好ましくは４５０Ｖ以下、さらに好ましくは４００Ｖ以下、を挙げることができる。

また、当該回路（符号１５）の電気容量としては、電圧波高値の減衰が激しい低インピーダンス対象を想定した場合であっても、連続的な複数回パルス発生が十分に担保できる電気容量であれば良い。例えば１０００μＦ以上、好ましくは１２００μＦ以上、より好ましくは１５００μＦ以上、特に好ましくは１８００μＦ以上、を挙げることができる。
また、電気容量の上限は高い程良いが、例えば、５０００μＦ以下、好ましくは４０００μＦ以下、より好ましくは３５００μＦ以下、さらに好ましくは３０００μＦ以下、特に好ましくは２５００μＦ以下、を挙げることができる。

・トランスファーパルス出力
トランスファーパルスの発生には、上記トランスファーパルス用コンデンサ回路に蓄積された電荷を利用して電気パルスが出力される。
トランスファーパルスの出力電圧としては、当該トランスファーパルス用コンデンサ回路の耐電圧に応じた出力が可能である。例えば、６００Ｖ以下、好ましくは５００Ｖ以下、より好ましくは４００Ｖ以下、さらに好ましくは３５０Ｖ以下、特に好ましくは３００Ｖ以下、での出力が可能である。出力の下限としては０Ｖを超える電圧であれば出力可能であるが、特に１Ｖ以上であれば出力可能である。

トランスファーパルスとして出力可能なパルス幅としては、０．０１〜１０００ミリ秒、好ましくは０．０５〜７５０ミリ秒、より好ましくは０．１〜５００ミリ秒、さらに好ましくは０．１〜２５０ミリ秒、特に好ましくは０．１〜２００ミリ秒、より好ましくは０．１〜１５０ミリ秒、さらに好ましくは０．１〜１００ミリ秒、のパルス出力が可能である。
また、パルス連続発生回数としては、上記コンデンサ容量によって、電圧波高値の減衰が激しい低インピーダンス対象を想定した場合であっても、１〜５０回、好ましくは１〜４０回、より好ましくは１〜３０回、さらに好ましくは１〜２５回、特に好ましくは１〜２０回、を出力できる。なお、パルスを発生させない（０回とする）ことも可能である。

［制御手段］
本発明のパルス発生器としては、多段階方式エレクトロポレーションに使用可能なパルス発生を実現するために、上記電源回路を制御するための制御手段を備えることが望ましい。

・極性切替回路
当該パルス発生器は、出力電圧の正極性（＋：プラス）／負極性（−：マイナス）の切替を可能とする制御手段（極性切替制御手段）を有するものであることが好適である。当該手段は、極性切替回路（符号８，１６）によって実現することが可能となる。
なお、多段階方式エレクトロポレーション法では、正極性電気パルスを与えた後に、極性を切り替えた負極性電気パルスを与えることによって、エレクトロポレーション効率をさらに向上させることが可能となる。特に、正極性トランスファーパルスを与えた後に、負極性トランスファーパルスを与える出力波形パターンは、細胞内への外来物質の取り込み効率をさらに向上できると言われている。

極性切替回路の接続位置としては、ポアーリングパルス発生用電源回路の出力側およびトランスファーパルス発生電源回路の出力側のそれぞれに接続する態様を挙げることができる。当該態様の場合、極性反転制御が二カ所それぞれで行われることとなる。
当該態様の場合、ポアーリングパルス発生用電源回路の出力側（上記分岐合流回路の合流点の出力側）には、ポアーリングパルス用の極性切替回路（符号８）が接続される。一方、トランスファーパルス発生用電源回路の出力側（トランスファーパルス用コンデンサ回路の出力側）には、トランスファーパルス用の極性切替回路（符号１６）が接続される。

また、極性切替回路の接続位置としては、ポアーリングパルス／トランスファーパルス切替制御回路（符号２１）の出力側に接続する態様を挙げることもできる。当該態様の場合、極性反転制御が一カ所のみで行われることとなる。

・ポアーリングパルス／トランスファーパルス切替回路
当該パルス発生器は、ポアーリングパルス発生用電源回路からの配線とトランスファーパルス発生用電源回路からの配線を合流させ、出力を切替制御するための手段を有するものであることが好適である。当該手段は、ポアーリングパルス／トランスファーパルス切替回路（符号２１）によって実現することが可能となる。
ポアーリングパルス／トランスファーパルス切替回路（符号２１）の接続位置としては、ポアーリングパルス発生用電源回路及びトランスファーパルス発生用電源回路の両方の電源回路の出力側であれば良い。

・パルス制御回路
本発明のパルス発生器は、パルス制御回路（符号２２）により、出力されるパルスの全体的な制御を実現するものであることが望ましい。例えば、出力される電気パルスのパルス幅、パルス間隔、パルス数等は、当該制御回路によって制御することが好適である。
また、対象のインピーダンス測定、実行電圧値、実行電流値の測定部を含む場合であれば、これらの測定値から情報をフィードバックし、適正なパルス発生（出力値、波形形状等）が担保されるように、自律制御させることも可能である。

［エレクトロポレーター装置］
本発明に係るパルス発生器は、エレクトロポレーター装置のパルス発生源として用いることができる。
エレクトロポレーター装置には、パルス発生器への入力情報等の制御を行う電源制御部を設けることが望ましい。例えば、装置操作時における高電圧モード／低電圧モード切替、電圧の極性切替、各種電気パルス条件設定などの入力情報からのパルス電源回路の制御は、当該電源制御部によって行うことができるようにすることが望ましい。
当該電源制御部としては、設定操作を可能とするような所定の回路構成を採用することが可能である。

また、装置の仕様等に応じて、対象のインピーダンス（抵抗）測定、実行電圧値、実行電流値などの測定機器を搭載し、表示部に表示させる機能を有する装置とすることもできる。また、測定結果から、電気パルスエネルギーの発生量を熱量（Ｊ）として算出して、モニター等の表示部に表示させる機能を有する装置とすることもできる。また、出力されたパルス波形の形状を表示部に表示可能な装置とすることもできる。
ここで、出力表示の表示手段としては、モニター、液晶、ＬＥＤ表示部等の表示部を装置に内蔵させることもできるが、外付けの表示手段に出力するための外部出力端子を有する仕様とすることもできる。また、一部の情報を内蔵表示手段で表示し、他の情報を外部出力して表示させる仕様とすることも可能である。例えば、オシロスコープ等に接続する態様も可能である。
また、ＵＳＢ等の端子やブルートゥース機能を有する仕様として、パソコンやハードディスク等各種ＰＣ関連機器に、データの出力や保存を可能とすることもできる。

当該エレクトロポレーター装置では、高電圧発生に関して、安全装置としてリミッター機能を搭載させる仕様も好適である。

当該エレクトロポレーター装置は、ポアーリングパルス発生用の直流電源及びコンデンサ充電用回路を１セットのみ有する回路構成であるにも関わらず、対象物のインピーダンスの違いに応じて、ポアーリングパルスの電圧切替を数十〜数千ボルトという極めて広範囲で行うことを可能とする装置にすることができる。また、同時に、低電圧モードにおける大規模な電気容量を実現しているため、低インピーダンス対象に対しても十分な回数の複数回パルス発生が可能である。
これにより、当該エレクトロポレーター装置は、様々な対象の生物種や細胞に対して、多段階方式エレクトロポレーターでのエレクトロポレーション法の適用が可能となる。
なお、当該エレクトロポレーター装置に係る当該ポアーリングパルス用電源回路は、高性能且つ簡素な回路構成であるため、製造工程において効率良く製造可能な仕様とすることが可能となる。そして、当該仕様により省スペース化による小型化も実現される。

・出力パルス
パルス制御回路（符号２２）からは、高電圧モード又は低電圧モードに対応したポアーリングパルス、及び、トランスファーパルスが連続して出力される。また、極性反転させたパルス発生も可能である。また、ポアーリングパルス、及び、トランスファーパルスは、それぞれを複数回連続して発生させることが可能である（図６〜１０参照）。

ここで、当該電気パルス発生器を用いて出力可能なパルス波形パターンとしては、多段階方式エレクトロポレーションに使用可能な全ての波形を出力可能である。
例えば、ポアーリングパルスとトランスファーパルスを連続して出力する２段階方式の出力が可能である。
また、ポアーリングパルス、トランスファーパルス、及び極性切替トランスファーパルス、を連続して出力する３段階方式の出力が可能である。
また、ポアーリングパルス、極性切替ポアーリングパルス、トランスファーパルス、及び極性切替トランスファーパルス、を連続して出力する４段階方式の出力が可能である。
また、極性切替を頻繁に行って、ポアーリングパルス、極性切替ポアーリングパルス、トランスファーパルス、及び極性切替トランスファーパルスの順番を任意に組み替えて出力することも可能である。
勿論であるが、ポアーリングパルス及びトランスファーパルスは、それぞれのパルスを複数回連続して発生させることが可能である。

当該出力パルスは、スクエアー形状にて出力することも可能であるが、接続した電極や対象物のインピーダンスの種類によって、パルス波高値が減衰曲線を描くエクスポネンシャルスクエアーパルス形状となる場合がある。また、複数回パルスを発生させた場合、２回目以降の波高値が、直前のパルスの減衰後の波高値と同じ高さ（極性切替した場合は、逆の極性で同じ絶対値の波高値）になる場合がある。
当該減衰現象は、コンデンサに蓄積された電荷を物質に印加することによって生じる現象（自然減衰）によるものである。当該減衰の程度は、接続した電極や対象物のインピーダンスによって異なるが、高インピーダンス対象の場合、減衰の度合は緩やかとなる。

なお、本発明においては、パルス制御手段として、パルス波高値を制御する手段を組み込むことで、スクエアー形状を保持したパルスとすることも可能である。また、複数回パルスの全てを同じ波高値にて出力することも可能である。
さらに本発明では、当該パルス波高値の減衰度合を制御して、所望の減衰曲線を描くパルス波形にすることも可能である。

なお、発生するパルスどうしの間隔（パルス間隔：Ｐｐどうしの間隔、Ｔｐどうしの間隔、ＰｐとＴｐの間隔など）としては、特に制限はないが、例えば、０．０５ミリ秒〜１００秒、好ましくは０．５ミリ秒〜５０秒、より好ましくは５ミリ秒〜１０秒、さらに好ましくは１０ミリ秒〜５秒、一層好ましくは２５ミリ秒〜２．５秒、特に好ましくは５０ミリ秒〜１秒、を挙げることができる。

・エレクトロポレーション
当該エレクトロポレーター装置においては、パルス制御回路（符号２２）からの出力側の配線に、用途に応じた所望の形状・材質の電極を接続することで、様々な生物種や細胞種に応じた多段階エレクトロポレーション法への使用が可能となる。得られる出力パルスは、一連のシーケンス制御により連続的に対象物に与えられる。
接続可能な電極としては、現在使用可能なエレクトロポレーション用電極の全てが使用可能であるが、例えば、キュベット電極、プレート電極、脚付き電極、針電極、ピンセット型電極、ロッド型電極、シャーレ型電極などの、あらゆる電極の使用が可能である。
従って、当該エレクトロポレーター装置は、In Vitro、In Vivo、Ex Vivo、In Ovoなど、あらゆるエレクトロポレーション用途において使用可能な装置である。
特には、当該エレクトロポレーター装置は、従来技術では不可能であった高インピーダンス対象（バクテリア、真核微生物等）への多段階エレクトロポレーション法を実現可能とする装置であることから、キュベット電極（図１１参照）を用いた使用態様において、格別顕著な効果が期待される装置である。

高インピーダンス対象のエレクトロポレーション用の試料としては、エレクトロポレーション時に用いる溶液として、細胞障害抑制やコンピテンシー（形質転換効率）維持の観点から、グリセロールや糖類等を含む水溶液（電気抵抗の高い溶液）を用いてエレクトロポレーションを行う生物種や細胞を指すものである。
例えば、バクテリア（具体的には、真正細菌、古細菌、シアノバクテリア等の原核生物）、真核微生物等（特に、酵母，原虫などの単細胞真核生物、カビ等の糸状菌類など）を含む、試料溶液を挙げることができる。
特に、その細胞学的又は菌学的性質に起因する原因により、従来の装置を用いた高電圧エレクトロポレーション法でも良好な遺伝子導入効率を得ることが困難な試料において、当該多段階方式エレクトロポレーターを用いることによって、極めて高効率な遺伝子導入が実現可能となる。

高インピーダンスの範囲としては、例えば０．５ｋΩ以上、好ましくは０．８ｋΩ以上、より好ましくは１ｋΩ以上、さらに好ましくは２ｋΩ以上、特に好ましくは３ｋΩ以上、より好ましくは４ｋΩ以上、さらに好ましくは５ｋΩ以上の溶液は、電気抵抗が高い溶液と言える。
上限としては、当該電気パルスの電圧で十分な電場強度が発生可能な範囲であれば特にないが、例えば、５０ｋΩ以下、好ましくは４０ｋΩ以下、より好ましくは３０ｋΩ以下、さらに好ましくは２５ｋΩ以下、を挙げることができる。

なお、高インピーダンス対象に対する十分なポアーリングパルスの電場強度としては、例えば、５〜３０ｋＶ／ｃｍ、好ましくは８〜２７ｋＶ／ｃｍ、より好ましくは９〜２５ｋＶ／ｃｍ、さらに好ましくは１０〜２４ｋＶ／ｃｍ、特に好ましくは１１〜２３ｋＶ／ｃｍ、より好ましくは１２〜２２ｋＶ／ｃｍ、さらに好ましくは１３〜２１ｋＶ／ｃｍ、特に好ましくは１４〜２０ｋＶ／ｃｍ、を挙げることができる。
また、高インピーダンス対象に対するトランスファーパルスの電場強度としては、例えば、０．０１〜４ｋＶ／ｃｍ、好ましくは０．０５〜３．５ｋＶ／ｃｍ、より好ましくは０．１〜３ｋＶ／ｃｍ、さらに好ましくは０．２〜２．５ｋＶ／ｃｍ、特に好ましくは０．２〜２ｋＶ／ｃｍ、最も好ましくは０．５〜２ｋＶ／ｃｍ、を挙げることができる。

なお、当該エレクトロポレーター装置では、低インピーダンス対象の生物種の組織や細胞等（例えば、動物細胞、植物細胞等）に電気パルス出力を行って、低電圧モードでの多段階方式エレクトロポレーションを行うことも可能である。
ここで、低インピーダンスの範囲としては、例えば５００Ω未満、好ましくは４５０Ω以下、より好ましくは４００Ω以下、さらに好ましくは３００Ω以下、特に好ましくは２００Ω以下、より好ましくは１００Ω以下、を挙げることができる。
この場合、従来法の電気パルス条件等を参照にして、多段階方式のエレクトロポレーションを行うことが可能である。

なお、当該エレクトロポレーター装置により細胞内に導入する物質としては、外来ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸分子を特に挙げることができるが、核酸類似物質、蛋白質、薬剤、蛍光物質などの他の化合物等についても、効率良く細胞内へ導入することが可能である。
特には、当該エレクトロポレーター装置は、外来遺伝子導入法による、形質転換、形質導入、機能欠失、相同組み換え、ゲノム編集などに、好適に用いることができる。具体的には、プラスミドＤＮＡ，コンストラクトＤＮＡ、ウイルスベクター、アンチセンス核酸、sｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチドなどの導入にも好適に使用できる。また、核酸類似物質（例えばモルフォリノ重合体など）の導入にも好適に使用可能である。

以下、実施例を挙げて本発明の実施形態を説明するが、本発明の範囲は当該実施例に限定されるものではない。

［製造例１］『本発明に係るエレクトロポレーター装置』
本発明に係るパルス発生器を有するエレクトロポレーターとして、図１に示す電源回路のパルス発生器を備えたエレクトロポレーター装置を製造した。

（１）「ポアーリングパルス発生用電源回路」
当該製造例のポアーリングパルス用電源回路を説明する。ポアーリングパルス用に制御されたＤＣ電源（符号１）からの直流は、スイッチング回路（符号２）で矩形波に変換され、パルストランス（符号３）で昇圧され、「８段コッククロフト・ウォルトン回路」（符号４）に入力される回路となっている。
当該８段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）の出力側には、切替スイッチ（符号５）を介して「２個直列４並列コンデンサ」（符号６）に接続されているが、当該２個直列４並列コンデンサ（符号６）を含む回路は、８段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）からの配線に対して分岐合流回路となっている。
８段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）と２個直列４並列コンデンサ（符号６）からの配線は合流点で接続され、その合流点の出力側には極性切替回路（符号８）が接続された回路構成となっている。

(i) 高電圧モード
当該実施形態では８００Ｖを超える電圧の場合に高電圧モードとなり、切替スイッチ（符号５）はオフの状態になる。この場合、８段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）のみが充電される（２個直列４並列コンデンサ（符号６）は充電されない）。
当該８段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）は、当該８段直結コンデンサは、２式並列接続された構成となっており、内蔵されるこれらのコンデンサに電荷が蓄積して充電される。
８段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）に入力された電圧は、当該回路の作用によって昇圧整流され、その出力端では入力矩形波の波高値の２×８倍の直流電圧が出力される。

本実施形態における当該８段コッククロフト・ウォルトン回路では、構成する１個あたりのコンデンサとして、耐電圧（Ｖｃ）は４５０Ｖのものを用いたので、当該８段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）の耐電圧は、４５０Ｖ×８＝３６００Ｖとなる。
また、当該回路（符号４）では、１個のコンデンサの容量（Ｃｃ）は２２０μＦのものを用いたので、８段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）に蓄積されるコンデンサ容量は、２２０μＦ／８×２＝５５μＦとなる。
従って、当該実施形態においては、８段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）は、耐電圧３６００Ｖ及びコンデンサ容量５５μＦのコンデンサ回路として機能するものとなる。

この結果、当該高電圧モードでは、８段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）の電気容量５５μＦに蓄積された電荷が、ポアーリングパルス用パルスとして使用される。
当該回路（符号４）の耐電圧は３６００Ｖであるので、３０００Ｖのポアーリングパルスの発生には十分に耐えることが可能となる。
また、当該コンデンサ容量を考慮すると、１〜９回までの連続パルスの発生が可能となる。なお、パルスを発生させない（０回とする）ことも可能である。

(ii) 低電圧モード
８段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）の出力電圧が、低電圧モードの上限電圧以下値（ここでは、８００Ｖ以下）である時は、切替スイッチ（符号５）はオンの状態となる。
この場合、８段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）からの出力は、切替スイッチ（符号５）を経由して２個直列４並列コンデンサ（符号６）が充電される。
即ち、低電圧モードでは、「８段コッククロフト・ウォルトン回路」（符号４）と「２個直列４並列コンデンサ」（符号６）の両方のコンデンサ回路に電荷が蓄積し、充電がされることになる。
そして、ダイオード（符号７）の働きによって、「８段コッククロフト・ウォルトン回路」（符号４）の出力と「２個直列４並列コンデンサ」（符号６）の出力が重畳され、両方のコンデンサの荷電がポアーリングパルス用の電荷となる。

当該２個直列４並列コンデンサ回路（符号６）では、構成する１個あたりのコンデンサとして耐電圧（Ｖｐ）が４５０Ｖのものを用いたので、当該回路（符号６）の耐電圧は、４５０Ｖ×２＝９００Ｖとなる。
また、当該回路では、１個のコンデンサの容量（Ｃｐ）が４７０μＦのものを用いたので、当該回路（符号６）に蓄積されるコンデンサ容量は、４７０μＦ／２×４＝９４０μＦとなる。

この結果、当該低電圧モードでは、８段コッククロフト・ウォルトン回路（符号４）の容量５５μＦと、当該２個直列４並列コンデンサ回路（符号６）の容量９４０μＦを合わせた合計９９５μＦが、回路全体のコンデンサ容量となる。また、耐電圧は、耐電圧９００Ｖであるので、８００Ｖの電圧に十分耐えることができる。
また、当該コンデンサ容量を考慮すると、１〜９回までの連続パルスの発生が可能となる。なお、パルスを発生させない（０回とする）ことも可能である。

（２）「トランスファーパルス発生用電源回路」
次に、当該製造例におけるトランスファーパルス用電源回路について説明する。トランスファーパルスの発生手段では、ポアーリングパルス用に制御されたＤＣ電源（符号１）とは別電源である「トランスファーパルス用に制御されたＤＣ電源（符号１１）」が用いられている。
トランスファーパル用ＤＣ電源（符号１１）からの直流は、スイッチング回路（符号１２）で矩形波に変換され、整流回路（符号１４）で整流された後、トランスファーパルス用コンデンサ（符号１５）に入力される回路構成になっている。当該コンデンサ（符号１５）に蓄積した電荷は、トランスファーパルス用の電気パルスとして利用される。
トランスファーパルス用コンデンサ回路（符号１５）の出力側には、極性切替回路（符号１６）が接続されている。

当該実施形態におけるトランスファーパルスは、比較的出力電圧が低い電気パルスである。また、トランスファーパルス用ＤＣ電源（符号１１）として、３００Ｖの出力が可能なものを用いているため、電圧の昇圧手段を使用することなく、目的の入力電圧を得ることが可能となる。
当該実施形態では、トランスファーパルス用コンデンサ回路（符号１５）に使用した１個のコンデンサ（耐電圧４００Ｖ・電気容量２７０μＦ）を、直列接続することなくコンデンサ容量を増加させるために並列接続して使用している。
そのため、トランスファーパルス用コンデンサ回路（符号１５）全体の耐電圧は要素コンデンサの耐電圧と同じ４００Ｖのままであるが、８個のコンデンサを並列しているので（図４参照）、当該回路全体でのコンデンサ容量は、２７０μＦ×８＝２１６０μＦとなる。
当該コンデンサ容量を考慮すると、１〜２０回までの連続パルスの発生が可能となる。なお、パルスを発生させない（０回とする）ことも可能である。

（３）「出力電圧の極性切替」
上記ポアーリングパルス用電源回路のコンデンサ回路によって出力された電圧は、極性切替回路（符号８）にて、正極性（＋）又は負極性（−）のいずれを出力するかの切替を行うことが可能となる。極性の切替は、入力のプラス・マイナスを反転させることで行う。
また、トランスファーパルス用電源回路のコンデンサ回路によって出力された電圧についても、極性切替回路（符号１６）にて、正極性（＋）又は負極性（−）のいずれを出力するかの切替を行うことが可能となる。

（４）「ポアーリングパルス／トランスファーパルス切替」
当該実施形態のパルス発生器においては、ポアーリングパルス発生用電源回路とトランスファーパル用電源回路の合流点に、「ポアーリングパルス／トランスファーパルス切替制御回路」（符号２１）が接続されている。
当該パルス発生器では、「ポアーリングパルス／トランスファーパルス切替制御回路」（符号２１）において、ポアーリングパルスとトランスファーパルスのいずれかを出力するかを制御している。

（５）「パルス制御」
当該実施形態のパルス発生器では、「ポアーリングパルス／トランスファーパルス切替制御回路」（符号２１）の出力側に、「パルス制御回路」（符号２２）が接続され、出力されるパルスの全体的な制御がされる。なお、各種入力情報に応じた制御等は、電源制御部（特には図示せず）によって、所定の制御が行われる。

（６）「装置仕様」
当該実施形態のパルス発生器を内蔵したエレクトロポレーター装置を製造した。当該エレクトロポレーター装置の仕様概略は、表３に示す通りである。

（７）「パルス波形の出力例」
当該エレクトロポレーター装置にオシロスコープを接続して、出力波形パターンを検出した。波形パターンの検出結果（オシログラム）を図７〜１０に示した。

・高電圧モードでの出力波形
図７及び８は、１ｋΩの対象に対して所定の設定条件（Ｐｐ：電圧３０００Ｖ，パルス幅２．５ｍ秒，回数３回，Ｔｐ：電圧３００Ｖ，パルス幅５０ｍ秒，回数３回）にてパルス出力した例である。
図７は、３段階方式の出力例であり、ポアーリングパルス３回、トランスファーパルス３回、及び極性切替トランスファーパルス３回、を出力した例である。図７の例において測定したＰ−Ｐ値（peak to peak value）は３２４０Ｖ、最大電圧値は２９２０Ｖ、最小電圧値は−３２０Ｖ、Ｐｐパルス幅は２．４４２ｍ秒、Ｔｐパルス幅は４９．９７ｍ秒であった。
また、図８は、４段階方式の出力例であり、ポアーリングパルス３回、極性切替ポアーリングパルス３回、トランスファーパルス３回、及び極性切替トランスファーパルス３回、を出力した例である。図８の例において測定したＰ−Ｐ値（peak to peak value）は５４００Ｖ、最大電圧値は２９２０Ｖ、最小電圧値は−２４８０Ｖ、Ｐｐパルス幅は３．１６０ｍ秒、Ｔｐパルス幅は４９．６４ｍ秒であった。
図７及び８の両例において、ポアーリングパルスの実測最大電圧値は２９２０Ｖであった。この点、高電圧パルスの出力であるにも関わらず、設定電圧と実行電圧値が極めて近い値であり、安定した高電圧電気パルスの出力が可能であることが示されている。

・低電圧モードでの出力波形
図９及び１０は、５０Ωの対象に対して所定の設定条件（Ｐｐ：電圧１８０Ｖ，パルス幅５ｍ秒，回数３回，Ｔｐ：電圧５０Ｖ，パルス幅５０ｍ秒，回数３回）にてパルス出力した例である。
図９は、３段階方式の出力例であり、ポアーリングパルス３回、トランスファーパルス３回、及び極性切替トランスファーパルス３回、を出力した例である。図９の例において測定したＰ−Ｐ値（peak to peak value）は１９２Ｖ、最大電圧値は１８０Ｖ、最小電圧値は−１２．０Ｖ、Ｐｐパルス幅は５．２１１ｍ秒、Ｔｐパルス幅は５０．０１ｍ秒であった。
また、図１０は、４段階方式の出力例であり、ポアーリングパルス３回、極性切替ポアーリングパルス３回、トランスファーパルス３回、及び極性切替トランスファーパルス３回、を出力した例である。図１０の例において測定したＰ−Ｐ値（peak to peak value）は３１０Ｖ、最大電圧値は１８０Ｖ、最小電圧値は−１３０Ｖであった。
図９及び１０の両例において、ポアーリングパルスの実測最大電圧値は１８０Ｖであった。

・出力波形知見
図７〜１０のオシログラムが示すように、当該エレクトロポレーター装置では、高電圧及び低電圧の両方のモードにおいて、ポアーリングパルス及びトランスファーパルスを連続的に与える多段階パルス発生が可能となることが示された。
特に、高インピーダンス対象に対する高電圧モードでは、スクエアー形状に近い綺麗なパルス発生が可能であることが示された。

［実施例１］『高インピーダンス対象への遺伝子導入例』
大腸菌（グラム陰性菌）懸濁液に対して、製造例１にて製作したエレクトロポレーターを用いて多段階エレクトロポレーションによる遺伝子導入試験を行った。

（１）「実験手順」
大腸菌（ＤＨ５α）のＥＰ用コンピテントセルを調製した。コンピテントセルの調製は対数増殖期の細胞を集菌し常法により行った。
当該ＥＰ用コンピテントセル（１サンプルあたり菌数１０^９〜１０^１１ １０％グリセロール溶液）、ｐＵＣ１９ベクター（１サンプルあたり１０ｐｇ）を混合し、当該混合液２０μＬを１ｍｍギャップキュベット電極（ネッパジーン社製）内に注入した。なお、当該一連の操作は、氷上にて冷却しながら行った。

当該菌及びＤＮＡ混合液を注入したキュベット電極を、製造例１にて製造したエレクトロポレーターに接続したキュベット電極用チャンバーに挿入し、表４に示した電気パルス条件にて３段階方式のエレクトロポレーション処理（高電圧ポアーリングパルス１回→トランスファーパルス５回→極性切替トランスファーパルス５回）を行った。なお、各パルス間の間隔は５０ｍ秒に設定した。
一方、比較実験として、エクスポネンシャル出力でのエレクトロポレーター装置（ＥＣＭ６３０, ＢＴＸ社製）を用いたこと以外は同様にして、表４に示した電気パルス条件でのエレクトロポレーション処理（高電圧エクスポネンシャルパルス１回）を行った。

その後、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地上にプレーティングし、ｐＵＣ１９ＤＮＡの導入により薬剤耐性を獲得して生育したコロニー数をカウントした。プラスミド１μｇあたりのコロニー数を算出し、遺伝子導入効率（ｃｆｕ／μｇ）として評価した。なお、当該遺伝子導入実験は２反復で行い、平均値を算出した。

（２）「結果」
その結果、表５に示すように、高インピーダンス対象である大腸菌の懸濁液（サンプル抵抗値＝約７．７ｋΩ）に対して、製造例１で製作した多段階方式エレクトロポレーターを用いて電気パルス処理を行うことによって、極めて高い遺伝子導入効率が実現できることが示された。
具体的には、２０００Ｖのポアーリングパルスを与えた後、トランスファーパルス５回、及び極性切替トランスファーパルス５回を与える電気処理を行った場合（実験１−１）、従来のエクスポネンシャル出力でのエレクトロポレーター装置を用いて同電圧の高電圧パルス処理を行った場合（実験１−３）よりも、約４．９倍も高い遺伝子導入効率が達成できることが示された。
また、当該多段階方式エレクトロポレーターを用いて１８００Ｖのポアーリングパルスを与えた後同様のトランスファーパルスを与えた場合（実験１−２）でも、従来のエレクトロポレーター装置を用いた場合（実験１−３）よりも、約３．１倍も高い遺伝子導入効率が達成できることが示された。
なお、実験１−３で用いた比較装置で電圧値２０００Ｖを採用した理由は、予備実験において、当該値でエレクトロポレーションを行う場合の好適条件だったためである。

これらのことから、製造例１で製作したエレクトロポレーターを用いることによって、従来では不可能であった大腸菌のコンピテントセルのような高インピーダンスの対象物に対しても、多段階方式のエレクトロポレーション処理が可能となり、極めて高効率な遺伝子導入が実現可能となることが示された。

［実施例２］『低インピーダンス対象への遺伝子導入例』
動物細胞の懸濁液に対して、製造例１にて製作したエレクトロポレーターを用いて、多段階エレクトロポレーションによる遺伝子導入試験を行った。

（１）「実験手順」
ＨＴ１０８０細胞（ヒト線維肉腫細胞：付着細胞）を培養し、トリプシン処理を行って付着状態の細胞を剥離させた。細胞が剥がれることを確認した後、トリプシンを除去し、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（血清及び抗生物質フリー）で洗浄し、同液体培地に再懸濁させた。
当該ＨＴ１０８０細胞（１サンプルあたり１０^６細胞 Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（血清及び抗生物質フリー））、ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰベクター（１サンプルあたり１０μｇ）を混合し、当該混合液１００μＬを２ｍｍギャップキュベット電極（ネッパジーン社製）内に注入した。なお、当該細胞を扱う操作は、室温にて行った。

当該細胞及びＤＮＡ混合液を注入したキュベット電極を、製造例１で製造したエレクトロポレーターに接続したキュベット電極用チャンバーに挿入し、表６に示した電気パルス条件にて３段階方式のエレクトロポレーション処理（高電圧ポアーリングパルス１〜２回→トランスファーパルス５回→極性切替トランスファーパルス５回）を行った。なお、各パルス間の間隔は５０ｍ秒に設定した。
また、キュベット注入を行ったのみで、エレクトロポレーション処理を行わなかったサンプルを対照（コントロール）とした。

その後、ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて各細胞を通常の培養条件にて２４時間培養し、ＦＡＣＳ解析により生存率と導入率を算出した。「生存率」は、２４時間培養後における‘全細胞数’に対する‘生細胞数’の割合で表した。具体的には、ＦＡＣＳ解析で正常な形態を有する細胞を生細胞とした。ＦＡＣＳ解析で算出した生細胞は、トリパンブルー染色およびコロニー形成試験で算出した生細胞の結果と一致した。
また、遺伝子の「導入率」は、‘生細胞数’に対する‘遺伝子導入されたＥＧＦＰ遺伝子が発現している細胞数’の割合を、ＦＡＣＳ解析にて算出することで求めた。

（２）「結果」
その結果、表７に示すように、低インピーダンス対象である動物細胞を懸濁した溶液（サンプル抵抗値＝約４１．６Ω）に対して、製造例１で製作した多段階方式エレクトロポレーターを用いて１３０〜１８０Ｖのポアーリングパルスを与える電気パルス処理を行うことによって、生存率と導入率の両方が良好な遺伝子導入が達成できることが示された。
当該結果から、製造例１で製作したエレクトロポレーターは、低インピーダンス対象の細胞溶液に対しても、多段階方式エレクトロポレーションによる高効率遺伝子導入が可能な装置であることが示された。
なお、エクスポネンシャル方式でのエレクトロポレーターを使用して、減衰波電気パルス法での標準的条件での電気パルス処理（例えば、１００〜２００Ｖでのエクスポネンシャルパルス１回処理）を行った場合では、このような高い効率は達成できない。

なお、当該実験においては、対照サンプルの極僅かな細胞（生細胞の0.4％）で蛍光が検出された。この原因としては、(i) ＨＴ１０８０細胞は自家蛍光が強い細胞であること、(ii) ＤＭＥＭ培地がＧＦＰ蛍光と同波長の蛍光をやや発すること、(iii) 一部細胞がプラスミドを貪食した可能性、などが考えられたが、いずれにしろ全体量から見ると僅かであり、当該実施例の本論には影響しない結果である。

［実施例１，２からの知見］
製造例１で製作した本発明に係る多段階方式エレクトロポレーターを用いることのよって、高インピーダンス対象である生物種や細胞に対しても極めて高い遺伝子導入効率が実現できることが示された。
また、当該結果から、高インピーダンス対象の生物に対しても、多段階方式エレクトロポレーション法が実際に有効であることが、実証例として示された。

また、製造例１で製作した本発明に係る多段階方式エレクトロポレーターは、低インピーダンス対象である生物種や細胞に対しても良好な多段階方式エレクトロポレーションを行うことが可能な装置であることが示した。

以上の結果から、本発明に係る多段階方式エレクトロポレーターは、低インピーダンスと高インピーダンス対象の両方の生物種や細胞に対して、極めて良好な外来遺伝子導入を実現することが可能な装置であることが示された。

本発明により、エレクトロポレーター需要の拡大と用途の多様化に対応可能な、幅広い生物種や細胞に対して好適に施用可能であるエレクトロポレーター装置を、効率良く製造可能な仕様にて提供することが可能となる。
これにより本発明は、生命科学全般（分子生物、遺伝子、微生物、医薬、飲食品、農芸化学、畜産など）の研究開発分野、および、治療分野において、極めて有効に利用されることが期待される。

１． ポアーリングパルス用ＤＣ電源
２． ポアーリングパルス用スイッチング回路
３． ポアーリングパルス用パルストランス
４． ｎ段コッククロフト・ウォルトン回路
５． 切替スイッチ
６． ｍ_１個直列ｍ_２並列コンデンサ回路
７． ダイオード
８． 極性切替回路

１１． トランスファーパルス発生用ＤＣ電源
１２． トランスファーパルス用スイッチング回路
１３． トランスファーパルス用パルストランス
１４． 整流回路
１５． トランスファーパルス用コンデンサ回路
１６． 極性切替回路

２１． ポアーリングパルス／トランスファーパルス切替回路
２２． パルス制御回路

３１． １ｍｍギャップキュベット電極
３２． ２ｍｍギャップキュベット電極
３３． ４ｍｍギャップキュベット電極

Claims (9)

1. ポアーリングパルス発生手段及びトランスファーパルス発生手段を有するエレクトロポレーター用電気パルス発生器であって、
   ポアーリングパルス発生手段として、
   （Ａ）ｎ段のコッククロフト・ウォルトン回路（ｎは２以上のいずれかの整数を示す）、並びに、
   （Ｂ）前記（Ａ）に記載の回路の出力側の配線の分岐点から分岐した回路であって、
   （ｂ１）高電圧モードと低電圧モードの切替電圧値が２００〜１４００Ｖの範囲にあるいずれかの電圧値であって、高電圧モードの時にはスイッチオフとなり低電圧モードの時にはスイッチオンとなる切替スイッチ、及び、
   （ｂ２）コンデンサをｍ_１個直列させたものをｍ_２並列させた回路（ｍ_１は１以上のいずれかの整数、ｍ_２は２以上のいずれかの整数を示す）、
   を含み、前記（ｂ１）に記載のスイッチ及び前記（ｂ２）に記載の回路が直列関係になるように接続され、前記（ｂ２）に記載の回路の出力側の配線が、前記分岐点より出力側にて前記（Ａ）に記載の回路の出力側の配線に合流してなる回路、
   を有し、且つ、
   前記ポアーリングパルス発生手段を構成する回路が、高電圧モードにおいては前記（Ａ）に記載の回路の耐電圧が１５００〜５０００Ｖの範囲にあるいずれかの値である、
   ことを特徴とする、エレクトロポレーター用電気パルス発生器。
2. 前記（Ｂ）に記載の回路が、当該回路内の前記（ｂ２）に記載の回路の出力側に、出力側に電流が流れる向きで接続されたダイオードを含むものである、請求項１に記載の電気パルス発生器。
3. 前記パルス発生器を構成する回路要素のコンデンサが、耐電圧５００Ｖ以下のコンデンサである、請求項１又は２に記載の電気パルス発生器。
4. 前記高電圧モードと前記低電圧モードの切替電圧値が、５００〜１０００Ｖの範囲にあるいずれかの電圧値である、請求項１〜３のいずれかに記載の電気パルス発生器。
5. 前記ポアーリングパルス発生手段を構成する回路が、ポアーリングパルス発生用の直流電源及びコンデンサ充電用回路を１セットのみ有し、且つ、低電圧モードにおいては前記（Ａ）に記載の回路と前記（ｂ２）に記載の回路との合計電気容量が５００〜４０００μＦの範囲にあるいずれかの値である、請求項１〜４のいずれかに記載の電気パルス発生器。
6. 前記（Ａ）に記載の回路における整数ｎが４〜１３の範囲にあるいずれかの整数であり、且つ、前記（ｂ２）に記載の回路における整数ｍ_１が２〜６の範囲にあるいずれかの整数であり、且つ、前記（ｂ２）に記載の回路における整数ｍ_２が２〜１０の範囲にあるいずれかの整数である、請求項１〜５のいずれかに記載の電気パルス発生器。
7. 前記パルス発生器が、出力電圧の極性切替制御手段を有するものである、請求項１〜６のいずれかに記載の電気パルス発生器。
8. 前記パルス発生器が、出力パルスのパルス制御手段を有するものである、請求項１〜７のいずれかに記載の電気パルス発生器。
9. 請求項１〜８のいずれかに記載の前記電気パルス発生器を備えたエレクトロポレーター装置。

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