JP5812361B2 - 遺伝子発現制御機構を含む新規Ａｄベクター - Google Patents

Description

本発明は、マイクロＲＮＡ（以下、「ｍｉＲＮＡ］という。）の標的配列を組み込んでなるアデノウイルス（以下、単に「Ａｄ」という。）ベクターに関し、生体内に存在するｍｉＲＮＡの標的配列を組み込むことによるＡｄベクターに組み込まれた遺伝子の発現を制御しうる遺伝子発現制御システムを搭載するＡｄベクターに関する。

近年、疾患に対する治療方法の一つとして、遺伝子治療の試みが多くなされている。例えば、癌細胞の増殖阻害方法として、特定の腫瘍マーカー（例えばeIF-4H）に特異的なsiRNAを活性成分として含有する遺伝子治療に関する医薬組成物について報告がある（特許文献１）。また、このような遺伝子治療のために使用可能なベクターについても各種報告があり、抗腫瘍剤として応用されることが期待されている（特許文献２、３）。

現在、遺伝子治療のベクターとして用いられるＡｄベクターは、サブグループＣ(sub-group C)に属した５型（あるいは２型）のヒトＡｄを基盤としている。ヒトＡｄはＡからＦまでのサブグループに分けられ、少なくとも５１種類の血清型(serotype)が知られているが、サブグループＢ(sub-group B)に属するウイルスを除き、多くのＡｄ（５型Ａｄを含む）はレセプターとしてcoxsackievirus and adenovirus receptor（CAR）を認識して細胞に感染する（非特許文献１）。

Ａｄベクターは、その優れた遺伝子導入特性から、遺伝子治療用ベクターとして各種疾患への適用が期待されている。しかしながら、Ａｄベクターを腫瘍局所へ投与した場合、一部のＡｄベクターは腫瘍から全身循環に漏出した後、主に肝臓に集積し、遺伝子発現を示すことがある。目的とする疾患部位以外で遺伝子が発現すると、好ましくない副作用が生じることが懸念される。例えば、治療遺伝子に自殺遺伝子など、遺伝子発現細胞に対して毒性を示すような遺伝子を用いた場合は、腫瘍のみならず肝臓などの腫瘍ではない組織に対しても毒性を示してしまう場合がある。目的とする細胞や組織のみで所望の遺伝子を発現させることができれば、副作用を伴うことなく、効果的な遺伝子治療が行うことができると考えられる。

生体に内在するｍｉＲＮＡに制御される部分を含むレンチウイルスベクターについて報告がある。しかしながら、レンチウイルスベクターの場合は、導入遺伝子が半永久的に発現するため、遺伝子治療の目的によっては好ましくない場合がある。所望の導入遺伝子が、所望の細胞や組織のみで、発現が必要な場合のみに発現可能な遺伝子治療用ウイルスベクターが望まれている。

特開２００７−２７７２０４号公報 特開２００７−２０９３２８号公報 特開２００７−１９００２２号公報

Science 275: 1320-1323, 1997

本発明は、所望の導入遺伝子が、所望の細胞や組織のみで、発現が必要な場合のみに発現可能な遺伝子治療用ウイルスベクターを提供することを課題とする。具体的には遺伝子治療用ベクターとしてＡｄベクターを用いた場合に、所望の導入遺伝子を、所望の細胞や組織のみで発現しうるベクターを提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ａｄベクターにおいて、導入遺伝子の発現を望まない細胞や組織に特異的に存在する内在性ｍｉＲＮＡの標的配列をＡｄベクターに組み込むことにより、発現を望まない細胞や組織において、Ａｄベクターに組み込まれた導入遺伝子の発現が阻止されることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、以下よりなる。
１．正常細胞特異的に発現するｍｉＲＮＡの標的配列を組み込んでなる、遺伝子発現制御機構を含むＡｄベクター。
２．正常細胞特異的に発現するｍｉＲＮＡが、癌細胞では発現が抑制されているｍｉＲＮＡである前項１に記載のＡｄベクター。
３．正常細胞特異的に発現するｍｉＲＮＡが、肝細胞特異的に発現するｍｉＲＮＡである前項１または２に記載のＡｄベクター。
４．ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２２ａ，ｍｉＲ−１５，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５，ｌｅｔ−７，ｍｉＲ−１９９のいずれかより選択される前項１〜３のいずれか１に記載のＡｄベクター。
５．ｍｉＲＮＡの標的配列１単位の塩基長が、７〜２５塩基長である前項１〜４のいずれか１に記載のＡｄベクター。
６．ｍｉＲＮＡの標的配列１単位が、ｍｉＲＮＡの全部または一部に対して相補的な配列からなり、配列表の配列番号１〜７のいずれかの塩基配列の相補配列から選択される少なくとも７塩基長のオリゴヌクレオチドを含む配列からなる前項１〜５の何れか１に記載のＡｄベクター：
ｍｉＲ−１５ ；UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG （配列番号１）
ｍｉＲ−１６ ；UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG （配列番号２）
ｍｉＲ−１４３ ；UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC （配列番号３）
ｍｉＲ−１４５ ；GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU（配列番号４）
ｌｅｔ−７ ；UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU （配列番号５）
ｍｉＲ−１２２ａ；UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG （配列番号６）
ｍｉＲ−１９９ ；CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC（配列番号７）
７．ｍｉＲＮＡの標的配列が、配列表の配列番号８に示す配列からなる前項１〜５の何れか１に記載のＡｄベクター：
標的配列：ACAAACACCATTGTCACACTCCACAGCACAAACACCATTGTCACACTCCATTAATACAAACACCATTGTCACACTCCAGGACACAAACACCATTGTCACACTCCA（配列番号８）。
８．Ａｄベクターに組み込まれる所望の導入遺伝子の非翻訳領域に、遺伝子発現制御機構を含む前項１〜７の何れか１に記載のＡｄベクター。
９．前項１〜８の何れか１に記載のＡｄベクターを含む遺伝子治療用ベクター。
１０．ＨＳＶＴＫ(Herpes simplex virus thymidine kinase)遺伝子を導入遺伝子とし、該導入遺伝子の非翻訳領域に前項６又は７に記載のｍｉＲＮＡの標的配列を含むＡｄベクターを含む遺伝子治療用ベクター。
１１．前項１０に記載の遺伝子治療用ベクターとガンシクロビルを併用して用いる、抗腫瘍剤キット。
１２．以下の工程を含む、前項１〜９の何れかに記載のＡｄベクターの作製方法：
１）所望の導入遺伝子の非翻訳領域に、ｍｉＲＮＡの標的配列からなる遺伝子発現制御機構を含む遺伝子発現シャトルプラスミドを作製する工程；
２）Ａｄのゲノムを準備する工程；
３）Ａｄのゲノムを制限酵素で切断し、１）で作製した遺伝子発現シャトルプラスミドをＡｄのゲノムにライゲーションする工程。
１３．生体から分離した試料を検査する方法において、前項１〜９の何れか１に記載のＡｄベクターを用い、該Ａｄベクター上に組み込まれたレポーター遺伝子の発現を確認して、試料中の前記Ａｄベクター上に組み込まれた標的配列に対するｍｉＲＮＡの存在を分析することを特徴とする試料の検査方法。

本発明の特定の細胞または組織に特異的に発現するｍｉＲＮＡの標的配列を組み込んでなるＡｄベクターによれば、該特定の細胞または組織に発現するｍｉＲＮＡが、前記Ａｄベクター中の標的配列に作用することにより、特定の細胞または組織では、該Ａｄベクターに組み込んだ遺伝子の発現が阻害もしくは抑制されることとなる。
上記作用により、例えば遺伝子治療において、特定の細胞または組織の他で組み込んだ遺伝子が効果的に発現し、特定の細胞または組織での遺伝子の発現を防ぐことで、遺伝子治療による不要な副作用を軽減化することができ、効果的な治療方法とすることができる。係るＡｄベクターを用いることにより、遺伝子治療において、効果的に遺伝子デリバリーを行うことができる。

本発明のＡｄベクターを作製するためのシャトルプラスミド（(A)pCMVL1-mir122aT、(B)pCMVTK-mir122aT）を示す図である。（実施例１、２） 本発明のＡｄプラスミドの１例(pAdHM20-CMVL1-mir122aT-RL)を示す図である。（実施例２） 本発明のＡｄベクターを投与したときのIn vivoでの遺伝子導入結果を示す図である。（実験例１） 本発明のＡｄベクターを投与したときの癌治療効果を示す図である。（実験例２） 本発明のＡｄベクターを投与したときの肝臓に及ぼす影響（肝障害）を示す図である（ＧＰＴ）。（実験例３） 本発明のＡｄベクターを投与したときの肝臓に及ぼす影響（肝障害）を示す図である（組織染色）。（実験例４） 本発明のＡｄベクターを投与したときの体重に及ぼす影響を調べた図である。（実施例５）

本発明において、Ａｄとはアデノウイルスをさし、本発明において使用可能なＡｄは、in vivoまたはin vitroでＤＮＡやＲＮＡなどの核酸配列を種々のタイプの細胞へ導入するビヒクルとしての機能を達成しうるものであれば良く、特に限定されない。代表的には、ヒトを宿主とする２型、５型、１１型、３５型の各Ａｄ、ヒト以外を宿主とするサルＡｄ、チンパンジーＡｄ、マウスＡｄ、イヌＡｄ、ヒツジＡｄおよびトリＡｄなどが挙げられる。

本発明においてＡｄゲノムとは特に限定されないが、特定の細胞種でのみ複製できるようにしたＡｄのゲノム、具体的にはＥ１領域欠損型Ａｄや、制限増殖型Ａｄのゲノムなどが好適であり、特に好適にはＥ１領域欠損型のＡｄゲノムが挙げられる。特定の細胞種でのみ複製できるとは、例えばＥ１領域欠損型Ａｄについては２９３細胞で、制限増殖型Ａｄについては２９３細胞や癌細胞でのみ増殖できるＡｄをいう。２９３細胞は、ヒト胎児腎細胞を５型ＡｄのＥ１遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立された細胞株であり、Ｅ１タンパク質を恒常的に発現している。

Ｅ１領域欠損型Ａｄゲノムとは、Ｅ１領域を欠損するＡｄゲノムをいい、制限酵素によりＥ１領域を切断し、欠損させたＡｄゲノムをいう。Ｅ１領域欠損とは、Ｅ１タンパク質をコードする領域を機能的に欠損させることを意味する。機能的に欠損させるとは、例えば、宿主細胞内で機能するＥ１タンパク質を発現させないようにすることであり、Ｅ１タンパク質をコードする遺伝子のすべてを欠損している必要はない。
一般に、ＡｄにおいてＥ１領域を欠損させると、Ｅ１タンパク質を発現している細胞（例えば、２９３細胞）以外では増殖することができない。

５型Ａｄゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）の場合において、Ｅ１領域とは、具体的には３４２〜３５２３番目に相当する。したがって、本発明のＡｄゲノムは、宿主細胞内で機能するＥ１タンパク質を発現しないのであれば、３４２〜３５２３番目の領域の一部を有するものであってもよい。

本発明の改変型Ａｄベクターは、Ｅ１領域の他に、例えばＥ３領域を欠損させた５型Ａｄゲノムの一部または全部を用いてもよい。５型Ａｄゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）のＥ３領域とは、２８１３３〜３０８１８番目または２７８６５〜３０９９５番目に相当する部位をいう。

制限増殖型Ａｄは、Ｅ１タンパク質の発現が例えば癌細胞でのみ起こるＡｄであり、NATURE MEDICINE, 7, 781-787 (2001)に報告されているものを例示することができる。

本発明のＡｄベクターに備えられるプロモーターは、特に制限されない。例えば、ポリメラーゼII系（pol II系）またはポリメラーゼIII系（pol III系）のいかなるプロモーターであってもよい。具体的には、pol III系のプロモーターとしてＵ６プロモーターやＨ１プロモーターを例示することができ、pol II系のプロモーターとしてＣＭＶプロモーターを例示することができる。本発明において、Ａｄゲノムに対するプロモーターの導入位置は特に限定されない。プロモーターの導入位置は、Ａｄの複製に影響を及ぼさない位置であればいずれの位置でもよい。例えばＥ１欠損領域、Ｅ３領域やＥ４領域と３’ＩＴＲ(internal terminal repeat)の間の領域であってもよく、好適にはＥ１欠損領域が挙げられる。

本発明のＡｄベクターにおいて、遺伝子発現制御機構を含むとは、特定の細胞や組織特異的に発現するｍｉＲＮＡの標的配列を含むことをいう。ｍｉＲＮＡは細胞内に存在するタンパク質に翻訳されない長さ約１９〜２５塩基ほどの２本鎖ＲＮＡをいい、他の遺伝子の発現を調節する機能を有するといわれている。ｍｉＲＮＡがその標的配列と結合すると、遺伝子の翻訳が阻害される。例えばＲＮＡｉ分子のように、所望のｍＲＮＡの分解を引き起こす、若しくは翻訳を阻害する。従って、Ａｄベクターに、所望の遺伝子を組み込んで発現させようとする場合、上記ｍｉＲＮＡの標的配列を含むＡｄベクターであれば、特定の細胞や組織特異的に発現するｍｉＲＮＡが存在する場合に、該ｍｉＲＮＡとその標的配列が結合することにより、Ａｄベクターに組み込まれた所望の遺伝子の発現を制御することができる。ここで、上記標的配列は、Ａｄベクターに組み込まれる所望の導入遺伝子の非翻訳領域に組み込むのが好適である。

ｍｉＲＮＡは、ヒトを含む生物に多数存在することが公知である。本発明におけるｍｉＲＮＡは、特定の細胞または組織において特異的に発現するものであればよい。例えば、正常細胞に特異的に発現するｍｉＲＮＡ、癌細胞では発現が抑制されるｍｉＲＮＡ、また肝臓細胞特異的に発現するｍｉＲＮＡなどが好ましい。正常細胞でのみ特異的に発現するｍｉＲＮＡの標的配列をＡｄベクターに組み込むことで、例えば正常細胞では、Ａｄベクターに組み込んだ遺伝子の発現を抑制することができ、正常細胞に対する発現遺伝子による毒性等を軽減化させることができる。同様に、肝臓細胞特異的に発現するｍｉＲＮＡの標的配列をＡｄベクターに組み込むことで、例えば肝臓細胞では、Ａｄベクターに組み込んだ遺伝子の発現を抑制することができ、肝毒性を軽減化させることができる。また、癌細胞では発現が抑制されるｍｉＲＮＡの標的配列をＡｄベクターに組み込むことで、癌細胞が存在する場合に、Ａｄベクター上の導入遺伝子を発現させることができ、癌細胞特異的に遺伝子治療を行うこともできるし、癌細胞の存在の有無をレポータータンパク質の発現を指標として、確認することもできる。癌細胞では発現が抑制されるｍｉＲＮＡの例として、具体的にはｍｉＲ−１５，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５，ｌｅｔ−７，ｍｉＲ−１９９が挙げられる。また、肝臓細胞特異的に発現するｍｉＲＮＡの例として、具体的にはｍｉＲ−１２２ａが挙げられる。ｍｉＲＮＡの配列や由来は、ｍｉＲＮＡを掲載するデータベース、例えばmiRBase sequence database (http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml)を検索して確認することができる。

各ｍｉＲＮＡの塩基配列は、以下のとおりである。
ｍｉＲ−１５ ；UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG （配列番号１）
ｍｉＲ−１６ ；UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG （配列番号２）
ｍｉＲ−１４３ ；UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC （配列番号３）
ｍｉＲ−１４５ ；GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU（配列番号４）
ｌｅｔ−７ ；UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU （配列番号５）
ｍｉＲ−１２２ａ；UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG （配列番号６）
ｍｉＲ−１９９ ；CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC（配列番号７）

本発明において、ｍｉＲＮＡの標的配列１単位はｍｉＲＮＡの全部または一部に対して相補的な配列からなり、塩基長が７〜２５塩基長であり、好ましくは１５〜２５塩基長，より好ましくは１９〜２５塩基長である。ここで、ｍｉＲＮＡの標的配列１単位とは、あるｍｉＲＮＡが標的としうる配列の最低限の単位のものをいう。具体的には、配列表の配列番号１〜７のいずれかの塩基配列の相補配列から選択される少なくとも７塩基長のオリゴヌクレオチドをいい、更にいずれかの箇所に置いて１〜複数個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加、挿入されているものであってもよい。

本発明のＡｄベクターに組み込まれる標的配列全体としては、ｍｉＲＮＡと標的配列の相互作用を効果的に発揮させるために、複数単位（複数コピー）のものであってもよい。ベクターに組み込む標的配列全体の長さは、ベクターに組み込み可能な長さであればよく、特に制限されないが、例えば標的配列１単位を１０コピー含んでいてもよく、好適には２〜６コピー含んでいてもよい。標的配列全体の中に含まれる標的配列１単位の配列と配列の間には、適当な長さのオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。適当な長さのオリゴヌクレオチドの長さは特に制限されないが、標的配列全体としてベクターに組み込み可能な長さであればよく、例えば０〜８塩基長のオリゴヌクレオチドであってもよい。

本発明のＡｄベクターの作製は、作製工程において１または複数の制限酵素の認識配列を各々制限酵素で消化し、導入遺伝子を、シャトルベクターを介して、またはシャトルベクターを介することなく、インビトロライゲーションにより導入することができる。

本発明Ａｄベクターは、以下の工程を含む製造方法により作製することができる。
１）導入遺伝子の非翻訳領域に目的ｍｉＲＮＡの標的配列からなる遺伝子発現制御機構を含む遺伝子発現シャトルプラスミドを作製する工程；
２）Ａｄゲノムを準備する工程；
３）Ａｄゲノムを制限酵素で切断し、１）で作製した遺伝子発現シャトルプラスミドをＡｄゲノムにライゲーションする工程。

上記により得られたＡｄプラスミドは、上記プラスミド両末端を、制限酵素を用いて線状にし、これを例えば２９３細胞（Ｅ１欠損型Ａｄベクターや制限増殖型Ａｄベクターの場合）、または癌細胞（制限増殖型Ａｄベクターの場合）にトランスフェクションすることで、上記遺伝子発現制御機構を含むＡｄベクターを作製することができる。

本発明において、Ａｄベクターに組み込まれた所望の導入遺伝子とは、例えば遺伝子治療等に用いられる薬剤としての機能を有する遺伝子が挙げられる。遺伝子治療は、正常な遺伝子を細胞に補ったり、遺伝子の欠陥を修復・修正することで疾患を治療する場合に利用されるが、例えば癌に対しては癌に特異的な免疫反応をおこすサイトカインを発現させる遺伝子治療を挙げることができる。このように、遺伝子治療は生命活動の根幹を制御する治療法であり、遺伝子疾患だけでなく、癌やエイズ、そして難病など、様々な病気の治療への可能性が検討されている。具体的には、ＨＳＶＴＫ(Herpes simplex virus thymidine kinase)遺伝子と抗ウイルス剤であるガンシクロビル（ＧＣＶ）を用いた自殺遺伝子治療の検討が進められている。ＨＳＶＴＫ遺伝子が発現することにより、ＧＣＶを活性化体に変換し、細胞死を誘導することで抗腫瘍作用を示す治療方法である。しかしながら、かかる自殺遺伝子が、癌細胞以外の場所で作用することにより、強い副作用を生じる危惧がある。本発明のＡｄベクターに組み込まれた所望の遺伝子は、前述の遺伝子治療に用いられるような遺伝子を挙げることができる。本発明のＡｄベクターを遺伝子治療に用いることで、必要とする細胞や組織以外の部位で、例えば前記自殺遺伝子が発現しないように遺伝子発現制御機構を含むことで、効果的な遺伝子治療を行うことができる。

本発明は、例えばＨＳＶＴＫ(Herpes simplex virus thymidine kinase)遺伝子を導入遺伝子とし、該導入遺伝子の非翻訳領域にｍｉＲＮＡの標的配列を含むＡｄベクターを含む遺伝子治療用ベクターにも及ぶ。また、本発明の遺伝子治療用ベクターは、ガンシクロビルと併用して使用することで、より効果的な抗腫瘍剤として使用できることから、本発明は、遺伝子治療用ベクターとガンシクロビルを各々薬剤として含む抗腫瘍剤キットにも及ぶ。

本発明のＡｄベクターに組み込まれる所望の導入遺伝子は、使用の目的に応じ、例えばルシフェラーゼやＧＦＰなどのレポータータンパク質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、生体から分離した試料を検査する場合、試料において、特定の疾患に応じて試料中の特定のｍｉＲＮＡの発現量が増減する場合がある。このような試料中に内在する特定のｍｉＲＮＡの増減を調べる場合に、ｍｉＲＮＡと本発明のＡｄベクター上のｍｉＲＮＡの標的配列が結合することで、レポータータンパク質の発現が制御される。そこで、レポータータンパク質の発現を確認することで、試料中のｍｉＲＮＡの存在を確認することができる。このように、該Ａｄベクター上に組み込まれたレポーター遺伝子の発現を確認して、試料中の前記Ａｄベクター上に組み込まれた標的配列に対するｍｉＲＮＡの存在を分析することによる試料の検査方法も本発明の範囲に含めることができる。また、Ａｄベクターに組み込まれる所望の遺伝子は、その発現を確認することができれば、使用する目的に応じて、どのような遺伝子であってもよい。さらに、本発明のＡｄベクターに組み込まれる所望の導入遺伝子は、上述のように遺伝子治療等に使用可能な遺伝子と、上述のレポータータンパク質をコードする遺伝子を組み合わせたものであってもよい。

以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。

（実施例１）遺伝子発現制御システムを搭載したホタルルシフェラーゼ遺伝子発現カセットの作製
肝臓細胞で遺伝子発現が抑制されるような遺伝子発現カセットを作製した。ＣＭＶプロモーターにホタルルシフェラーゼ遺伝子と、その３’非翻訳領域に肝臓で特異的に発現するｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１２２ａ）の標的配列を挿入し、シャトルプラスミドpCMVL1-mir122aTを作製した（図１（Ａ）参照）。ｍｉＲＮＡの標的配列として、ｍｉＲ−１２２ａに完全相補な配列（標的配列１単位）を４コピー含む、配列表の配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを挿入した。また遺伝子発現効率の補正を目的として、ウミシイタケルシフェラーゼ発現シャトルプラスミドpCMV-RL1を作製した。
標的配列：ACAAACACCATTGTCACACTCCACAGCACAAACACCATTGTCACACTCCATTAATACAAACACCATTGTCACACTCCAGGACACAAACACCATTGTCACACTCCA（配列番号８）
上記において、下線を施した部分は、配列表の配列番号６に記載する配列の相補配列と完全に一致する配列である。

（実施例２）遺伝子発現制御システムを搭載したＨＳＶＴＫ遺伝子遺伝子発現カセットの作製
特定のｍｉＲＮＡを発現している細胞で遺伝子発現が抑制されるような遺伝子発現カセットを作製した。ＣＭＶプロモーターにＨＳＶＴＫ遺伝子と、その３’非翻訳領域に、実施例１と同様に肝臓で特異的に発現するｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１２２ａ）の標的配列を挿入し、シャトルプラスミドpCMVTK-mir122aTを作製した（図１（Ｂ）参照）。

（実施例３）Ａｄベクターの作製
ＡｄゲノムのＥ３欠損領域に、遺伝子発現効率補正用にウミシイタケルシフェラーゼ発現カセットを挿入するため、実施例１で作製したシャトルプラスミドpCMV-RL1をCsp45Iで、ＡｄプラスミドpAdHM20をClaIで切断し、両者の切断フラグメントを直接ライゲーションした。ライゲーション産物を大腸菌（DH5a）にトランスフォーメーションした。独立大腸菌クローンを培養し、プラスミドＤＮＡを回収した。制限酵素解析を行い、ウミシイタケルシフェラーゼ発現単位が挿入されたプラスミドpAdHM20-RLを得た。

さらに、ＡｄゲノムのＥ１欠損領域に、実施例１のｍｉＲＮＡの標的配列による遺伝子発現制御システムを搭載したホタルルシフェラーゼ発現カセットを挿入するため、pCMVL1-mir122aTおよびpAdHM20-RLをそれぞれI-CeuIおよびPI-SceIで消化した。その後、得られたフラグメントをライゲーションし、pAdHM20-CMVL1-mir122aT-RLを作製した（図２）。

また、ＨＳＶＴＫ発現プラスミドpAdHM20-HSVTK-mir122aTについては、同様に実施例２のｍｉＲＮＡの標的配列による遺伝子発現制御システムを搭載したＨＳＶＴＫ発現カセットを挿入するため、pAdHM20およびpCMVTK-mir122aTをI-CeuIとPI-SceIで消化し、得られたフラグメントをライゲーションすることにより作製した。

次に作製したプラスミドを、ウイルスゲノム末端に制限酵素認識部位が存在するPacIで切断することにより線状にし、Superfect^(R)（Qiagen社）を用いて２９３細胞にトランスフェクションした。約１０日間培養後、ｍｉＲＮＡ標的配列（配列番号８）を含む遺伝子発現制御システムを搭載したホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ発現Ａｄベクター、Ad-L-mir122aT、およびＨＳＶＴＫ発現Ａｄベクター、Ad-tk-mir122aTを得た。これらのベクターを増幅させ、塩化セシウムを用いた定法により精製した。精製したＡｄベクターの物理化学的力価は分光学的方法により測定した。

コントロールＡｄベクターとして、今回使用したｍｉＲ−１２２ａ標的配列と逆方向の配列を挿入したAd-L-mirConTおよびAd-tk-mirConT、およびｍｉＲ−１２２ａ標的配列を挿入していないAd-Lも同様に作製した。

（実験例１）In vivo遺伝子導入実験
C57Bl6マウス（５−６週令、メス）の下腹部にB16メラノーマ細胞を5×10⁵ cells/50μlで皮下移植した。腫瘍の大きさが５−８ｍｍに達した後、実験に用いた。実施例３で作製したホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの発現Ａｄベクター(Ad-L-mir122aT)並びにコントロールＡｄベクター(Ad-L, Ad-L-mirConT)を、各々3×10⁹, 3×10¹⁰ vector particle (VP)/マウスの投与量で腫瘍に局所投与し、４８時間後、腫瘍および各臓器を回収した。溶解緩衝液でホモジネートした腫瘍および各臓器を３回凍結融解したのち、15000rpm、１０分間遠心処理し、上清を回収した。回収した上清中のホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を、Dual luciferase^(R) Assay kit (Promega社)を用いて測定した。タンパク質量の定量は、Bio-Rad^(R) assay kit (Bio-Rad社)を用いて行った。

Ad-L-mir122aTおよびAd-L-mirConTによるマウスの肝臓および腫瘍でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量を、Ad-Lによる発現量を１としたときの相対比で示した（図３）。その結果、肝臓での遺伝子発現量は、Ad-Lによる発現量に比べて1/90〜1/100に減少した。一方で腫瘍での遺伝子発現量においては、ｍｉＲＮＡ標的配列を挿入することによる大きな影響は観察されず、Ad-Lと同程度の遺伝子発現量が維持されることを確認した。

（実験例２）癌治療効果の検討
実験例１と同様に作製した皮下腫瘍モデルマウスに対し、ｍｉＲＮＡ標的配列を含むＨＳＶＴＫ発現Ａｄベクター（Ad-tk-mir122aT）、ｍｉＲＮＡ標的配列とは逆方向の配列を挿入したＨＳＶＴＫ発現Ａｄベクター（Ad-tk-mirConT）およびｍｉＲ−１２２ａの標的配列を含まないAd-Lを、各々3×10⁹および3×10¹⁰ VP/腫瘍の各投与量で腫瘍内投与した。Ａｄベクター投与翌日より毎日、ガンシクロビル（GCV）を75 mg/kgの投与量で腹腔内投与するとともに、腫瘍サイズを測定し、計算式よりその体積を求めた（腫瘍体積(mm³)＝（長径）×（短径）２×0.5236）。

その結果、Ad-tk-mir122aTを腫瘍内投与した場合は、Ad-tk-mirConTと同程度の優れた抗腫瘍効果を示すことが確認され、ｍｉＲＮＡ標的配列を含むベクターを投与した場合であっても、抗腫瘍効果には悪影響を及ぼさないことが確認された（図４）。

（実験例３）肝障害の検討（ＧＰＴ）
実験例２と同手法によりＡｄベクターを投与し、６日後に眼窩採血を行い、血清中のグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）濃度を測定した。

その結果、Ad-tk-mirConTを投与した場合に比べ、Ad-tk-mir122aTの場合は、ＧＰＴ活性が低く抑えられ、肝障害が低く抑えられていることが確認された（図５）。

（実験例４）肝障害の検討（組織学的検討）
実験例２と同手法によりＡｄベクターを投与し、６日後に肝臓を回収し、組織切片を作製した。組織は、通常の方法に従って固定し、パラフィン包埋し、薄切切片を作製したものをヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。組織切片を顕微鏡下観察し、肝障害の程度を評価した。

その結果、Ad-tk-mirConTを投与した場合では、広範囲における肝細胞の変性や炎症性細胞の浸潤など肝障害を有意に認めたが（図６Ａ）、Ad-tk-mir122aT（図６Ｂ）の場合は、生理食塩水（図６Ｃ）と同様に肝障害を認めなかった。

（実験例５）体重に及ぼす影響
実験例２と同手法によりＡｄベクターを投与し、１０日後の体重を測定した。

その結果、Ad-tk-mirConTを投与した場合では、大きく体重の減少を認めたが、Ad-tk-mir122aTの場合は、生理食塩水投与の場合と比べて有意差を認めなかった（図７）。

以上詳述したように、本発明の特定の細胞または組織に特異的に発現するｍｉＲＮＡの標的配列を組み込んでなるＡｄベクターを用いると、例えば遺伝子治療において、特定の細胞または組織とは異なる部位で、Ａｄベクターに組み込んだ遺伝子の発現を効果的に抑制することができる。特定の細胞や組織での遺伝子の発現を防ぐことで、例えば正常細胞や肝細胞などの特定の細胞や組織において、遺伝子治療による不要な副作用を軽減化することができ、効果的な遺伝子治療方法とすることができる。係るＡｄベクターを用いることにより、遺伝子治療において、効果的に遺伝子デリバリーを行うことができる。

このように、本発明のＡｄベクターは、遺伝子治療に有効に利用することができる。その他、特定のｍｉＲＮＡと本発明のＡｄベクターが作用することから、本発明のＡｄベクターを用いると、試料中のｍｉＲＮＡの有無を検出することができ、これにより、試料中のｍｉＲＮＡをマーカーとして試料の検査を行うことができる。例えば、特定の癌のみで発現抑制されるｍｉＲＮＡが公知である場合に、このようなｍｉＲＮＡ標的配列とレポータータンパク質を含むＡｄベクターを用いて試料中のｍｉＲＮＡ標的配列をマーカーとして検出した場合、特定の癌の場合はｍｉＲＮＡが抑制されることから、癌が存在する場合にのみレポータータンパク質が発現することとなる。このように、癌の検査などにも用いることができる。

Claims (5)

1. 遺伝子発現制御機構とレポーター遺伝子が組み込まれた制限増殖型アデノウイルスベクターを用いて、生体から分離した試料を検査する方法であって、生体から分離した試料中のレポーター遺伝子の発現を確認することを含む検査方法であり、遺伝子発現制御機構は、標的配列１単位が、正常細胞に発現するマイクロＲＮＡの全部または一部に対して相補的な１９〜２５塩基長の塩基配列である標的配列を組み込んでなる、試料の検査方法。
2. 正常細胞に発現するマイクロＲＮＡの標的配列が、特定の組織または細胞に発現するものである、請求項１に記載の試料の検査方法。
3. 制限増殖型アデノウイルスベクターが、特定の細胞種において増殖可能な制限増殖型アデノウイルスベクターである、請求項１または２に記載の試料の検査方法。
4. 制限増殖型アデノウイルスベクターが、癌細胞で増殖可能なものである、請求項１〜３のいずれか１に記載の試料の検査方法。
5. 制限増殖型アデノウイルスベクターが、レポーター遺伝子の非翻訳領域に、遺伝子発現制御機構が組み込まれてなるベクターである、請求項１〜４のいずれか１に記載の試料の検査方法。