JP5804453B2 - 結晶性ポリオール微粒子及びその調製方法 - Google Patents

Description

本発明は結晶性ポリオール微粒子に関し、具体的には、表面にカチオン性ポリマーが固定された結晶性ポリオールのナノ粒子、及びその調製方法に関する。

ウイルスに匹敵する数十ｎｍスケールのナノ粒子は、哺乳動物内の腫瘍を狙って血流内を移動し、しかも血管壁を通過して健康な組織に入り込むことはほとんどなく、一方で、異常な血管の存在する腫瘍周辺に蓄積し易い傾向があることが知られている。このような作用を奏するナノ粒子の例として、本発明者らは特定のポリマーの自己組織化によって創り出されるポリマーミセルに抗腫瘍剤や核酸物質（遺伝子（プラスミドＤＮＡ）や遺伝子抑制ＲＮＡ鎖（ｓｉＲＮＡ））を効果的に内包させることに成功し、薬剤内包ポリマーミセルを提供してきた（例えば、特許文献１、特許文献２および特許文献３参照）。

ＵＳ ７，１２５，５４６Ａ ＥＰ １６２１５６９Ａ ＷＯ ２００６／０８５６６４

しかし、薬剤を送達すべき標的細胞もしくは組織の多様性を考慮するとさらに効果的な薬剤の送達に使用できる材料またはキャリヤーの開発は依然として必要であろう。

本発明者等は、医療用薬剤の各種製剤を調製する際に通常、賦形剤または補助剤として使用されている一定の化合物をカチオン性ポリマーと共存させた水溶液を凍結乾燥すると、ナノサイズで粒度分布が狭く、かつ、プラスの表面電位を有する微粒子が提供できることを、ここに、見出した。さらに、このような微粒子は例えばアニオン荷電性の薬剤を安定に担持でき、しかも、担持した薬剤を標的へと、例えば腫瘍細胞に効果的に送達できることを確認した。

したがって、本発明は、結晶性ポリオールとカチオン性ポリマーの共存する水性溶液を凍結乾燥する工程により得られる、表面にカチオン性ポリマーの固定された結晶性ポリオール微粒子の調製方法を提供する。

本発明は、また、結晶性ポリオール微粒子であって、該結晶表面にカチオン性ポリマーが固定化されている、上記微粒子も提供する。

このような微粒子は、限定されるものでないが、上述したとおり表面にアニオン荷電性の薬剤を安定、かつ、効果的に担持できるので各種医薬用薬剤のキャリヤーとして利用できる。

本発明の実施例１（１）に係るマンニトール／ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）ナノ粒子の粒子径（ａ）と表面電位（ｂ）を表すグラフである。 本発明の実施例１（２）に係るマンニトール／ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）／ｓｉＲＮＡナノ粒子の粒子径（ａ）と表面電位（ｂ）を表すグラフである。 本発明の実施例２（１）に係るマンニトール／ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）／ｓｉＲＮＡナノ粒子の粒子径（ａ）と表面電位（ｂ）を表すグラフである。 本発明の実施例２（２）に係るマンニトール／ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）／ｓｉＲＮＡナノ粒子のＲＮＡｉ活性を表すグラフである。 本発明の実施例３に係るトレハロース／ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）ナノ粒子の散乱光強度（ａ）と粒子径（ｂ）を表すグラフである。 本発明の実施例４に係るＰＥＧ／ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）ナノ粒子の粒子径（ａ）と表面電位（ｂ）を表すグラフである。 本発明の実施例５に係るマンニトール／ＰＬｙｓまたはマンニトール／ＰＥＩナノ粒子の散乱光強度（ａ）と粒子径（ｂ）を表すグラフである。 本発明の実施例６に係るマンニトール／ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）ナノ粒子の粒子径（ａ）と表面電位（ｂ）を表すグラフである。

本明細書で使用する場合、各用語は特記されない限り当該技術分野で通常使用されている意味内容を有する。したがって、各用語の意味内容は、当業者に日常的に使用され、または参考にされている標準的または権威のある辞典類により確認できる。

結晶性ポリオールは、後述する方法によって微粒子を形成できる水溶性の糖類、糖アルコール、ポリエチレングリコール等であり、本発明の目的を達成できるものであれば天然物、反合成品、合成品のいずれであってもよい。該当する場合には、医薬品の製造の許認可に関連する薬局法等により薬剤の賦形剤または補助剤として使用が認可されている水溶性の糖類、糖アルコール、ポリエチレングリコールが結晶性ポリオールとして好ましく使用できる。

本明細書にいう結晶性または結晶とは、常温以上の温度で非多孔質の固体状態となり得、一方、狭い融点を示しうる性質またはそのような性質を有する固体をいう。限定されるものでないが、結晶性ポリオールとしては、マンニトール、トレハロース、キシリトール、ソルビトール、イノシトール、グルコース、ガラクトース、スクロース、マンノース、フルクトース、リポース、キシロース、デキストリン及びオキシエチレン単位が１０〜２５００のポリエチレングリコール（これらは、商品名マクロゴールとして市販されてもいる）、ものを挙げることができる。これらの結晶性ポリオールは、いずれの立体異性体であっても本発明で使用できるが、好ましくは、既に、当該技術分野で医薬の賦形剤または補助薬として使用されている立体異性体を選ぶのがよい。このような立体異性体としては、限定されるものでないが、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、に準じた異性体または天然に産生されている異性体を挙げることができる。

他方、カチオン性ポリマーとしては、ポリリシン、ポリアルギニン、スペルミン、スペルミジン、キトサン、ポリエチレンイミン、ポリ（ポリアミン修飾アスパルタイド）及びポリ（ポリアミン修飾グルタメート）、並びにこれらに由来するポリマー鎖のブロックとポリエチレングリコールに由来するポリマー鎖のブロックを含むブロック共重合体を挙げることができる。これらのカチオン性ポリマーの分子量は、理論的には限定されるものでないが、従来、核酸分子のキャリヤーとして使用されていたものについては、それらの使用例に従って選ぶことができる。

薬剤の標的細胞への送達に使用することを考慮すると、これらのカチオン性ポリマーの中での好ましいものとしては、一般に細胞毒性の低いポリ（ポリアミン修飾アスパルタイド）、ポリ（ポリアミン修飾グルタメート）を挙げることができる。このようなカチオン性ポリアミノ酸としては、上述の特許文献２または３に記載されたポリアミノ酸誘導体を
具体的なものとしてあげることができるが、より好ましいものは下記式（１）で表されるポリマーである。

式中、
Ｒ^１は、ヒドロキシル基、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキルオキシ基、炭素数２〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルケニルオキシ基、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキニルオキシ基または炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキル置換イミノ基を表し、
Ｒ^２は、水素原子、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキル基または炭素数１〜２４の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキルカルボニル基を表し、
Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基を表し、
Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂは、相互に独立して、下記の基：
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｑ１−〕_ｒ１ＮＨ_２ （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ_２）_ｑ２−ＮＨ_２〕_２ （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ_２）_ｑ３−ＮＨ_２〕〔−（ＣＨ_２）_ｑ４−ＮＨ〕_ｒ２Ｈ｝ （ｉｉｉ）；及び
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ４−Ｎ｛〔−（ＣＨ_２）_ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ_２）_ｑ６−ＮＨ_２〕_２｝ （ｉｖ）
よりなる群の同一もしくは異なる基から選ばれ、
ここで、ｐ１〜ｐ４、ｑ１〜６、およびｒ１〜２は、それぞれ相互に独立して、１〜２０の整数であり、
ｎは、０〜５，０００の整数であり、
ｙは、０〜５，０００の整数であり、
但し、Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂがメチレン基の場合には、ｎは５以上であり、ｙはｎより小さい整数である。

また、これらのカチオン性ポリマーに由来するポリマー鎖のブロックとポリエチレングリコールに由来するポリマー鎖のブロックを含むブロックコポリマーの典型的なものとしては、下記式（２）で表されるポリマーを挙げることができる。

式中、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４ａ、Ｒ^４ｂ、ｎ及びｙは、上記の式（１）について定義したのと同義であり、
Ｌ^１は−Ｓ−Ｓ−または原子価結合であり、
Ｌ^２は−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐ１−ＮＨ−、または−Ｌ^２ａ−（ＣＨ_２）_ｑ１−Ｌ^２ｂ−であり、ここで、ｐ１及びｑ１は、相互に独立して、１〜２０の整数であり、Ｌ^２ａはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、Ｌ^２ｂはＮＨまたはＯであり、
Ｒ^５は、水素原子、または未置換もしくは置換された炭素数１〜１２の直鎖もしくは分枝状のアルキル基であり、そして
ｍは、３０〜２０，０００の整数を表す。

上記式（１）及び（２）における、アミン酸の反復単位の個数を表す、ｎ及びｙは、相互に独立して０〜５，０００であることができるが、合成上の便宜を考慮すると、３０〜３００、好ましくは６０〜１５０であることができる。

また、式（２）で表されるブロックコポリマーも提供できる。式（２）において、式中、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４ａ、Ｒ^４ｂ、ｎ及びｙは、上記式（１）について定義し、上述したのと同義である。

また、Ｌ^１は−Ｓ−Ｓ−または原子価結合である。一方、Ｌ^２は−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐ１−ＮＨ−、または−Ｌ^２ａ−（ＣＨ_２）_ｑ１−Ｌ^２ｂ−であり、ここで、ｐ１及びｑ１は、相互に独立して、１〜２０の整数であり、Ｌ^２ａはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、Ｌ^２ｂはＮＨまたはＯである。上記定義において、Ｌ^１及びＬ^２は、一緒になって一つの連結基となり得るように組み合わされる必要がある。例えば、Ｌ^２が−ＮＨ−である場合、Ｌ^１は−Ｓ−Ｓ−でなく、原子価結合である。−Ｌ^１−Ｌ^２−で好ましいのは、Ｌ^１は−Ｓ−Ｓ−である場合の連結基を形成するものである。

Ｒ^５は、水素原子、または未置換もしくは置換された炭素数１〜１２の直鎖もしくは分枝状のアルキル基であり、これらの例示は、上記Ｒ^１について説明したものが適用される。エチレングリコール（またはオキシエチレン）の反復単位の数を表すｍは、３０〜２０，０００、好ましくは２００〜２０００、より好ましくは、５００〜１０００の整数を表す。なお、上記式中の各基、部分は記載されている方向性で以って結合しているものとする。

上記のようなカチオン性ポリアミノ酸は、カチオン性基を含む部分に異なる複数のアミン官能基を有する側鎖を担持していることにより複数段階の酸解離定数（ｐＫａ）値を示し、例えば、生理条件であるｐＨ７．４においては複数のアミン官能基が部分的にプロトン化状態にあり、例えば、核酸分子とポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を形成することができる。また、こうして形成されたＰＩＣはエンドソーム内（ｐＨ５．５）へ取り込
まれてｐＨが下がるとカチオン性ポリアミノ酸のプロトン化がさらに進行し、バッファー効果（プロトンスポンジ効果）、またはエンドソーム膜選択的膜傷害により効率よくエンドソームから細胞質へと移行することができ、低い細胞毒性での薬剤デリバリーを可能にするものと理解できる。したがって、このような複数段階のｐＫａ値を示すカチオン性ポリマーが好ましく使用できる。

理論により本発明の内容または技術的範囲が拘束されるものでないが、上記のような結晶性ポリオールと上記のようなカチオン性ポリマーを水性媒体中で共存させて前者を結晶化可能な状態におくと、結晶性ポリオール由来の結晶の表面（これは、ポリオールのヒドロキシル基の脱プロトン化によるアニオン荷電性を帯びる傾向にある）にカチオン性ポリマーが吸着されて当該結晶の成長が制御または阻害され、結果としてナノメーター（ｎｍ）オーダーでかつ、粒子の分散度が狭く、単分散状態にあるとも称しうる微粒子が提供できるものと理解されている。また、カチオン性ポリマーが上記のようなカチオン性ポリマーに由来するポリマー鎖のブロックとポリエチレングリコールに由来するポリマー鎖のブロックを含むブロックコポリマーであるとき、結晶性ポリオールと親和性であるポリエチレングリコール鎖の一部、または大部分が結晶性ポリオールの結晶内に取り込まれ、微結晶表面にはカチオン性ポリマーに由来するポリマー鎖が配置されている形態にあるものと理解できる。

本発明にいう水性媒体または水性溶液の溶媒は、水、純水、脱イオン水、必要により水と混和性の有機溶媒（エタノール、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、等）または緩衝剤を含む溶液であることができる。

上記のような結晶性ポリオールの結晶表面にカチオン性ポリマーが「固定化されている」または「担持されている」とは、該結晶表面の性質がカチオン性ポリマーにより改変された性質が、純水中での穏和な撹拌処理では実質的に変化されず、つまり例えば、カチオン性ポリマーによりもたらされた該結晶または微粒子表面のゼータ（ζ）電位が実質的ないし有意な程度には変化せず、または一定のアニオン荷電性核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）を水性媒体中で結合できる状態にあることを意味する。こうして、該結晶または微粒子は、純水中で測定した場合に微粒子の平均粒子径が数μｍ以下、好ましくは、１０〜１０００ｎｍ、より好ましくは２０〜５００ｎｍであり、特に好ましくは５０〜２００ｎｍであり、表面のζ電位がプラス、好ましくは＋１０ｍＶ以上である。

上記の如く本発明の微粒子は表面にカチオン荷電性を有するので、水性媒体中でアニオン荷電性の化合物または薬剤とポリイオンコンプレックスを形成できる。このようなアニオン荷電性化合物には、水性媒体中で該微粒子とポリイオンコンプレックスを形成でき、生体または臓器もしくは器官の特定部位に送達または結合したときそれら標的に何らかの有意な作用を及ぼす薬剤等であれば純粋な化合物もしくは複合体等の化合物の状態、またはタンパク質、脂質、ペプチド、核酸等の化合物の種類に関係なくいずれも包含される。特に、本発明で該微粒子に結合させることを強く企図するものは、限定されるものでないが、核酸およびその誘導体である。本発明の微粒子は、上述したように、上記特許文献１〜３に記載されるようなポリマーミセルのコア部分に実質的に薬剤が内包されるものでなく、微粒子表面に薬剤が吸着ないし結合されると理解できる。このように薬剤は、実質的に微粒子表面に存在すると理解できるにもかかわらず、薬剤が仮に小分子量の核酸であっても本発明の微粒子と生理的条件下で安定な会合体またはＰＩＣを提供できる。このような核酸は、プリンまたはピリミジン塩基、ペントース、リン酸からなるヌクレオチドを基本単位とするポリもしくはオリゴヌクレオチドを意味し、オリゴもしくはポリ二本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ二本鎖ＤＮＡ、オリゴもしくはポリ一本鎖ＤＮＡおよびオリゴもしくはポリ一本鎖ＲＮＡを挙げることができ、また同一の鎖にＲＮＡとＤＮＡが混在したオリゴもしくはポリ２本鎖核酸、オリゴもしくはポリ１本鎖核酸も含まれる。また核酸に
含有されるヌクレオチドは天然型であっても、化学修飾された非天然型のものであってもよく、またアミノ基、チオール基、蛍光化合物などの分子が付加されたものであってもよい。限定されるものでないが、該核酸は、４〜２０，０００塩基、好ましくは１０〜１０，０００塩基、さらに好ましくは１８〜３０塩基からなるものであることができる。また、機能もしくは作用を考慮すると、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマー及びリボザイムを挙げることができる。

例えば、ｓｉＲＮＡは標的とする遺伝子またはポリヌクレオチドに対し、公知の方法で設計されたすべてのものが本発明の微粒子と会合体またはＰＩＣを形成することができる。ｓｉＲＮＡの鎖長は、二重鎖を構成する部分の長さが好ましくは１５〜５０塩基、より好ましくは１８〜３０塩基であることができ、当該技術分野で公知の化合物、また、それらと同様な作用または機能を有するすべてのヌクレオチドを包含する。限定されるものでないが、ｓｉＲＮＡの具体例は、遺伝子療法の対象となりうる遺伝子を参照して設計することができる。このような遺伝子としては、限定されるものでないが、非小細胞肺癌等に関係のあるＰＫＣα、悪性黒色腫等に関係のあるＢＣＬ−２、クローン病に関係のあるＩＣＡＭ−１、Ｃ型肝炎に関係のあるＨＣＶ、関節リュウマチもしくは乾癬に関係のあるＴＮＦα、喘息に関係のあるアデノシンＡＩ受容体、卵巣癌等に関係のあるｃ−ｒａｆ ｋｉｎａｓｅ、膵臓癌等に関係のあるＨ−ｒａｓ、冠動脈疾患に関係のあるｃ−ｍｙｃ、大腸癌に関係のあるＰＫＡ Ｒｉａ、エイズに関係のあるＨＩＶ、固形癌に関係のあるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、癌に関係のあるＶＥＧＦ受容体、腎臓癌に関係のあるリボヌクレオチド還元酵素、ＣＭＶ性網膜炎に関係のあるＣＭＶ ＩＥ２、前立腺癌に関係のあるＭＭＰ−９、悪性グリオーマに関係のあるＴＧＦβ２、多発性硬化症に関係のあるＣＤ４９ｄ、糖尿病に関係のあるＰＴＰ−１Ｂ、癌に関係のあるｃ−ｍｙｂ、乳癌等に関係のあるＥＧＦＲ、癌に関係のあるｍｄｒ１、ａｕｔｏｔａｘｉｎ及びＧＬＵＴ−１の遺伝子を挙げることができる。アンチセンス核酸も当該術分野で公知ものまたはそれらと同様の機能または作用を有するすべてのものを本発明に従いＰＩＣを形成する対象とすることができる。

式（１）で表されるポリ（アミノ酸）は、例えば、それ自体公知のアスパラギン酸エステルまたはグルタミン酸エステル由来のＮ−カルボン酸無水物の重合により製造したポリアミノ酸エステルを、Ｒ^４ａおよびＲ^４ｂの基のポリアミン残基に対応するポリアミンを用いてアミノリシスを行うことによりポリ（アミノ酸）の側鎖にポリアミン残基を導入することにより、製造することができる（例えば、Ｋ．Ｍｉｙａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１６２８７−１６２９４、ＷＯ ２００６／０８５６６４ Ａ（特許文献３）、ＷＯ ２００７／０９９６６０ Ａ、参照）。式（２）のブロックコポリマーは、上記のように製造したポリ（アミノ酸）と、それ自体公知のポリエチレンセグメントの連結方法に従い製造できる（例えば、上記特許文献３参照）。

本発明の微粒子は、上記の好ましいカチオン性ポリアミノ酸をはじめとするいずれかのカチオン性ポリマーと結晶性ポリオールの共存する水性溶液を凍結乾燥することにより、効率よく調製できる。このような共存する水性溶液は、カチオン性ポリマーと結晶性ポリオールの水性溶液を個別に調製したものを併せるか、単一の水性媒体にカチオン性ポリマーと結晶性ポリオールを相前後して、または同時に加えて調製してもよい。

凍結乾燥は、凍結状態のままで減圧して試料から水や昇華性のものを除き、乾燥する手段であり、それ自体公知の凍結乾燥操作またはその改良した操作によって実施することができる。したがって、上記のカチオン性ポリマーと結晶性ポリオールの共存する水性溶液を適当な凍結器で凍結し、減圧器を備えた脱気装置で凍結状態のままで減圧乾燥すればよ
い。凍結速度及び／または水性溶液中の溶質濃度の変化により、生成する微粒子の平均粒径をある程度調節できるが、微細な微粒子を形成するには、きわめて低い温度、例えば、液体窒素温度下で急速凍結するのがよい。凍結乾燥操作は、水性媒体を吸引除去するのに適する減圧下で実施する。限定されるものでないが、このような操作は、凍結乾燥装置（ＤＲＣ−１０００・ＦＤＵ１１００（棚型）もしくはＦＤＵ−２１００（枝型）；それぞれ、ＥＹＥＬＡ製）を使用して実施するのが便利である。

結晶性ポリオールとカチオン性ポリマーの共存する水性溶液は、濃度、一般に、０．１〜１０ｗ／ｖ％、好ましくは０．２５〜５ｗ／ｖ％の結晶性ポリオール水性溶液と濃度、一般に、１〜１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜５００μｇ／ｍＬのカチオン性ポリマーの水性溶液となるように調製すればよい。こうして調製した水性溶液を上記凍結乾燥操作に供した後、再水和させることにより本発明の従う微粒子を含有する水性分散溶液が得られる。

このような水性分散溶液にそのまま、適当であるときは、フィルターや沈殿処理等を介して精製した後、アニオン荷電性化合物または薬剤を当該水溶液に加え温和な撹拌を行った後、インキュベート（または静置）すると、微粒子表面に該アニオン荷電性化合物を担持または吸着させることができる。このような担持または吸着が生じたことは、例えば、降述する実施例に示すごとく微粒子の表面電位を測定して確認することができる。通常、最終的な該微粒子の表面電位がプラスの状態に維持される状態にあるときは、得られる微粒子の水性溶液中での良好な分散状態が維持できる。

別法として、アニオン荷電性化合物が表面に担持または吸着した微粒子は、カチオン性ポリマーと結晶性ポリオールに加え、アニオン荷電性化合物の共存する水性溶液を調製した後、上記凍結乾燥操作に供して調製することもできる。

＜発明の具体的な態様＞
本発明を説明するのに煩雑になることを避けるために、以下では、特定の結晶性ポリオール、カチオン性ポリマー及び核酸分子を使用し、そして特定の操作を実施した例を挙げて本発明を説明するが、本発明がこれらに限定されることを意図するものでない。

＜製造例１＞
ポリ（Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノエチルアスパルタミド）の製造
ｎ−ブチルアミンを開始剤として、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）とジクロロメタンの混合溶媒に溶解し、開裂重合することによって、ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ＰＢＬＡ）（重合度約１００）を合成した。次に、ＰＢＬＡ（５１３ｍｇ）をベンゼン凍結乾燥後、２５ｍＬのＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）に溶解し、ベンジルエステルに対して５０倍当量のジエチレントリアミン（ＤＥＴ）を同量のＮＭＰと混合した後、０℃、アルゴン下で、ＰＢＬＡ溶液をＤＥＴ溶液に加え、１時間反応させた。その後、冷却した５Ｎ ＨＣｌ水溶液に加え、４℃で０．０１Ｎ ＨＣｌ、純水の順に透析精製を行い、凍結乾燥によって回収した。こうして、標題のポリ（Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノエチルアスパルタミド）〔以下、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）と略記する〕白色粉末を得た。

＜製造例２＞
ポリエチレングリコール−ｂｌｏｃｋ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）コポリマーの製造
片末端がメトキシで、もう一方の末端がアミノプロピルであり、平均分子量が１２，０００のポリエチレングリコールをジクロロメタンに溶解し、ＢＬＡ−ＮＣＡをＤＭＦとジクロロメタンの混合溶媒に溶解して加え、４０℃で２日間反応させ、ポリエチレングリコ
ール−ｂｌｏｃｋ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）コポリマー（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を得た。ＮＭＲによる解析からＰＢＬＡ部分の重合度は約６８であった。こうして得られたＰＥＧ−ＰＢＬＡをベンゼンに溶解させ、凍結乾燥を行った後、アルゴン雰囲気下でＮＭＰに溶解させ、ベンジルエステルに対して５０倍当量のジエチレントリアミン（ＤＥＴ）を同量のＮＭＰと混合した後、１０℃、アルゴン下で、ＰＥＧ−ＰＢＬＡ溶液をＤＥＴ溶液に加え、１時間反応させた。その後、冷却した５Ｎ ＨＣｌ水溶液に加え、４℃で０．０１Ｎ ＨＣｌ、純水の順に透析精製を行い、凍結乾燥によって回収することにより標題のブロックコポリマー（以下、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）と略記する）を得た。

カチオン性ポリマーで被覆されたマンニトールナノ粒子の調製とアニオン荷電性物質のナノ粒子表面への担持
この実施例では、マンニトールとカチオン性ポリマーＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の混合溶液に対して凍結乾燥処理を施すことにより表面がＰＡｓｐ（ＤＥＴ）で被覆されたナノ粒子が調製されることと、そのカチオン性ナノ粒子はアニオン性薬剤ｓｉＲＮＡを表面に担持できることを確認する。

＜材料及び方法＞
（１）２０ｗ／ｖ％のマンニトールストック溶液と５ｍｇ／ｍＬのＰＡｓｐ（ＤＥＴ）（重合度約１００）ストック溶液をそれぞれ１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．３）中で調製した。それらの溶液を種々の濃度で混合することにより、マンニトール／ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）混合溶液を得た。具体的には、マンニトール濃度を５ｗ／ｖ％とし、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）濃度を０、４０、８０μｇ／ｍＬの３種類の混合溶液を調製した。それらの溶液をサンプル管に入れ、液体窒素に浸漬させて急速凍結処理を施した。さらにそれらを凍結乾燥装置（ＤＲＣ−１０００・ＦＤＵ１１００（棚型）もしくはＦＤＵ−２１００（枝型）、ＥＹＥＬＡ製）にセットし、２〜３日間の乾燥処理を行った。乾燥物に対して純水を添加し、再水和処理を施した後、ＺｅｔａＳｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ製）にて粒子径と表面電位の測定を行った。結果を図１に示す。図１（ａ）に示されるように、凍結乾燥処理を施したマンニトールは、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の有無に関わらず約１２０ｎｍ前後の粒子径を有することが確認された。一方、図１（ｂ）に示されるように粒子の表面電位は、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）添加なしのとき負の値（約−３０ｍＶ）であったのに対し、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の添加により正の値（約＋３５ｍＶ）となることが確認された。これより、マンニトールコアをＰＡｓｐ（ＤＥＴ）が覆うカチオン性ナノ粒子が調製されたと考えられる。
（２）次に、得られたカチオン性ナノ粒子がアニオン性薬剤ｓｉＲＮＡを担持できるかどうかを確認するために、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）濃度４０μｇ／ｍＬで調製したナノ粒子に対して種々の濃度（０、１０、２０、３０、３５、４０μｇ／ｍＬ）のｓｉＲＮＡ溶液を添加した。そしてそれらの混合溶液に対して再び粒子径と表面電位の測定を行った。結果を図２に示す。図２−ａに粒子径、図２−ｂに表面電位の結果を示す。図２（ａ）に見られるように、ｓｉＲＮＡ濃度の増加とともに粒子径はわずかに増加していき、３５μｇ／ｍＬ以上では大きな粒子の存在が確認された。一方、図２（ｂ）の表面電位については、ｓｉＲＮＡ濃度の増加とともに値が徐々に減少していることから、カチオン性ナノ粒子表面へのｓｉＲＮＡの吸着が生じたものと考えられる。また粒子径が大幅に増加したｓｉＲＮＡ濃度（３５、４０μｇ／ｍＬ）ではナノ粒子の表面電位が中性に近いことから、分散安定性が低下しているものと考えられる。

マンニトール、カチオン性ポリマーＰＡｓｐ（ＤＥＴ）、アニオン性薬剤ｓｉＲＮＡのワンステップナノ粒子調製と培養細胞へのｓｉＲＮＡ導入
この実施例では、マンニトール、カチオン性ポリマーＰＡｓｐ（ＤＥＴ）とｓｉＲＮＡ
の混合溶液に対して凍結乾燥処理を施すことにより、マンニトールをコアとし、表面がＰＡｓｐ（ＤＥＴ）とｓｉＲＮＡで被覆されたナノ粒子が調製されることを確認し、さらに培養細胞へのｓｉＲＮＡ導入を評価した。

＜材料及び方法＞
（１）２０ｗ／ｖ％のマンニトールストック溶液、５ｍｇ／ｍＬのＰＡｓｐ（ＤＥＴ）（重合度約１００）ストック溶液、１５μＭのｓｉＲＮＡストック溶液をそれぞれ１０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．３）中で調製した。それらの溶液を種々の濃度で混合することにより、マンニトール／ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）／ｓｉＲＮＡ混合溶液を得た。具体的には、マンニトール濃度を５ｗ／ｖ％、ｓｉＲＮＡ濃度を０．７５μＭとし、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）濃度を８０、２４０、３２０μｇ／ｍＬの３種類の混合溶液を調製した。それらの溶液をサンプル管に入れ、液体窒素に浸漬させて急速凍結処理を施した。さらにそれらを凍結乾燥装置（ＤＲＣ−１０００・ＦＤＵ１１００（棚型）もしくはＦＤＵ−２１００（枝型）、ＥＹＥＬＡ製）にセットし、２〜３日間の乾燥処理を行った。乾燥物に対して純水を添加し、再水和処理を施した後、ＺｅｔａＳｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ製）にて粒子径と表面電位の測定を行った。結果を図３に示す。図３（ａ）に示されるように、凍結乾燥処理を施したサンプルは、約１１０ｎｍ前後の粒子径を有することが確認された。一方、図３（ｂ）に示されるように粒子の表面電位は、約４０ｍＶとなることが確認された。（２）次に、培養細胞（ＧＬ３−ルシフェラーゼ発現マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０）に対し、１００ｎＭ ｓｉＲＮＡとなる濃度で得られたナノ粒子を播いた。この際、ｓｉＲＮＡの配列として、ＧＬ３−ルシフェラーゼ遺伝子に対応する配列と対応しない配列（ＥＧＦＰ配列）の２種類を使用した。４８時間後、ＧＬ３−ルシフェラーゼたんぱく質の発現量をルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ製）により定量した。結果を図４に示す。図４に示されるように、ＧＬ３−ｓｉＲＮＡを用いた場合、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）量依存的にＧＬ３−ルシフェラーゼ量が減少することが確認された。一方、ＥＧＦＰ−ｓｉＲＮＡを用いた場合、ＧＬ３−ルシフェラーゼの減少が見られなかったことから、ｓｉＲＮＡ配列依存的な遺伝子抑制効果と同時にマンニトール／ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）／ｓｉＲＮＡナノ粒子自体の毒性は非常に低いことが確認された。

実施例２におけるマンニトールに代え、トレハロースを０、０．２５、０．５、１、２．５、５、１０ｗ／ｖ％で、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を８０μｇ／ｍＬで用いたこと以外、実施例２（１）と同様な操作を繰り返して微粒子を得、散乱光強度（ａ）と粒子径（ｂ）を測定した結果を図５に、それぞれマンニトールを用いた場合の結果とともに示す。

図５（ａ）の結果より、トレハロースを用いた場合であっても、１ｗ／ｖ％以上では有意な散乱光強度が得られており、ナノ粒子が調製されることが確認された。一方、ナノ粒子の粒子径については、図５（ｂ）より１２０〜１８０ｎｍであることが確認された。マンニトールを使用した場合と比べると、ナノ粒子調製に必要とされる濃度が高く、またナノ粒子の会合数が低かった（ナノ粒子の会合数（分子量）は、散乱光強度の２乗根に比例する）。

実施例２におけるマンニトールに代え、ポリエチレングリコール（分子量６０００）を用い、またＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を６０、８０μｇ／ｍＬで用いたこと以外、実施例２（１）と同様な操作を繰り返して微粒子を得、粒子径（ａ）および表面電位（ｂ）を測定した結果を図６に、それぞれマンニトールを用いた場合の結果とともに示す。

図６（ａ）より、ポリエチレングリコールを用いた場合、３００ｎｍのナノ粒子が調製されることが確認された。一方、調製されたナノ粒子のζ電位は、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）な
しでは約−５ｍＶとわずかに負に帯電していたが、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の添加により約＋２０ｍＶへと増加したことから、ナノ粒子表面へのＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の担持が確認された。マンニトールを用いた場合と比べると、粒子径が大きく、ζ電位は低いことが分かった。

実施例２におけるＰＡｓｐ（ＤＥＴ）に代え、ポリエチレンイミン（分子量：５０００、ＰＥＩ）を５０μｇ／ｍＬで、またはポリリシン（分子量：１８０００、ＰＬｙｓ）を１３０μｇ／ｍＬで用いたこと以外、実施例２と同様な操作を繰り返して微粒子を得、散乱光強度（ａ）および粒子径（ｂ）を測定した結果を図７に、それぞれＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を８０μｇ／ｍＬで用いた場合の結果とともに示す。

図７（ａ）より、マンニトール濃度０．５ｗ／ｖ％以上で有意な散乱光強度が得られたことより、ＰＥＩまたはＰＬｙｓを用いた場合であっても、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）と同様にナノ粒子が調製されることが確認された。一方、図７（ｂ）より、調製されたナノ粒子の粒子径は、１２０〜２３０ｎｍであることも確認された。

実施例２におけるＰＡｓｐ（ＤＥＴ）に代え、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いたこと以外、実施例２と同様な操作を繰り返して微粒子を得、粒子径（ａ）および表面電位（ｂ）を測定した結果を図８に、それぞれＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いた場合の結果とともに示す。

図８（ａ）から、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いた場合であっても、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）と同様に、粒子径８０〜１３０ｎｍのナノ粒子が調製されることが確認された。また、ζ電位についても同様に、＋３０〜４０ｍＶであった。

Claims (12)

1. 結晶性ポリオールとカチオン性ポリマーの共存する水性溶液を凍結乾燥する工程を含んでなる表面にカチオン性ポリマーの固定された結晶性ポリオール微粒子の調製方法であって、
   結晶性ポリオールがマンニトール、トレハロース、キシリトール、ソルビトール、イノシトール、グルコース、ガラクトース、スクロース、マンノース、フルクトース、リボース、キシロース、デキストリン及びオキシエチレン単位が１０〜２５００のポリエチレングリコールからなる群より選ばれ、そして
   カチオン性ポリマーがポリリシン、ポリアルギニン、スペルミン、スペルミジン、キトサン、ポリエチレンイミン、ポリ（ポリアミン修飾アスパルタイド）及びポリ（ポリアミン修飾グルタメート）、並びにこれらに由来するポリマー鎖のブロックとポリエチレングリコールに由来するポリマー鎖のブロックを含む共重合体からなる群より選ばれ、
   結晶性ポリオールとカチオン性ポリマーの共存する水性溶液が、濃度０．１〜１０ｗ／ｖ％の結晶性ポリオール水性溶液と濃度１〜１０００μｇ／ｍＬのカチオン性ポリマーの水性溶液の混合液であり、かつ、
   得られる微粒子を純水中で測定すると微粒子の表面のζ電位がプラスである、
   ことを特徴する、方法。
2. 結晶性ポリオール微粒子中の結晶性ポリオールが結晶状態にある請求項１に記載の調製方法。
3. 得られる微粒子を純水中で測定すると微粒子の平均粒子径が１０〜１０００ｎｍである、請求項１に記載の調製方法。
4. 表面のζ電位が＋５〜＋１００ｍＶである、請求項１に記載の調製方法。
5. カチオン性ポリマーと結晶性ポリオールからなり、かつ、表面にカチオン性ポリマーが固定化された結晶性ポリオールの微粒子であって、
   結晶性ポリオールがマンニトール、トレハロース、キシリトール、ソルビトール、イノシトール、グルコース、ガラクトース、スクロース、マンノース、フルクトース、リポース、キシロース、デキストリン及びオキシエチレン単位が１０〜２５００のポリエチレングリコールからなる群より選ばれ、そして
   カチオン性ポリマーがポリリシン、ポリアルギニン、スペルミン、スペルミジン、キトサン、ポリエチレンイミン、ポリ（ポリアミン修飾アスパルタイド）及びポリ（ポリアミン修飾グルタメート）、並びにこれらに由来するポリマー鎖のブロックとポリエチレングリコールに由来するポリマー鎖のブロックを含むブロックコポリマーからなる群より選ばれ、
   結晶性ポリオールが結晶状態にあり、該結晶状態にある結晶を純水中で測定した場合の平均粒子径が１０〜１０００ｎｍであり、
   かつ
   該微粒子を純水中で測定すると微粒子の表面のζ電位がプラスである
   ことを特徴とする、微粒子。
6. カチオン性ポリマーが、下記式（１）で表される請求項５に記載の微粒子：
   式中、
   Ｒ¹は、ヒドロキシル基、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキルオキシ基、炭素数２〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルケニルオキシ基、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキニルオキシ基または炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキル置換イミノ基を表し、
   Ｒ²は、水素原子、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキル基または炭素数１〜２４の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキルカルボニル基を表し、
   Ｒ^3a及びＲ^3bは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基を表し、
   Ｒ^4a及びＲ^4bは、相互に独立して、下記の基：
   −ＮＨ−（ＣＨ₂）_p1−〔ＮＨ−（ＣＨ₂）_q1−〕_r1ＮＨ₂ （ｉ）；
   −ＮＨ−（ＣＨ₂）_p2−Ｎ〔−（ＣＨ₂）_q2−ＮＨ₂〕₂ （ｉｉ）；
   −ＮＨ−（ＣＨ₂）_p3−Ｎ｛〔−（ＣＨ₂）_q3−ＮＨ₂〕〔−（ＣＨ₂）_q4−ＮＨ〕_r2Ｈ｝ （ｉｉｉ）；及び
   −ＮＨ−（ＣＨ₂）_p4−Ｎ｛〔−（ＣＨ₂）_q5−Ｎ〔−（ＣＨ₂）_q6−ＮＨ₂〕₂｝ （ｉｖ）
   よりなる群の同一もしくは異なる基から選ばれ、
   ここで、ｐ１〜ｐ４、ｑ１〜６、およびｒ１〜２は、それぞれ相互に独立して、１〜５の整数であり、
   ｎは、０〜５、０００の整数であり、
   ｙは、０〜５，０００の整数であり、
   但し、Ｒ^3a及びＲ^3bがメチレン基の場合には、ｎは５以上であり、ｙはｎより小さい整数である。
7. カチオン性ポリマーが、下記式（２）で表されるブロックコポリマーである、請求項５に記載の微粒子：
   式中、Ｒ²、Ｒ^3a、Ｒ^3b、Ｒ^4a、Ｒ^4b、ｎ及びｙは、請求項８の式（１）について定義したのと同義であり、
   Ｌ¹は−Ｓ−Ｓ−または原子価結合であり、
   Ｌ²は−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ₂）_p1−ＮＨ−、または−Ｌ^2a−（ＣＨ₂）_q1−Ｌ^2b−であり、ここで、ｐ１およびｑ１は、相互に独立して、１〜５の整数であり、Ｌ^2aはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、Ｌ^2bはＮＨまたはＯであり、
   Ｒ⁵は、水素原子、または未置換もしくは置換された炭素数１〜１２の直鎖もしくは分枝状のアルキル基であり、そして
   ｍは、３０〜２０，０００の整数を表す。
8. 純水中で測定した場合に微粒子の平均粒子径が１０〜１０００ｎｍである、請求項５〜７のいずれかに記載の微粒子。
9. 表面のζ電位が＋５〜＋１００ｍＶである、請求項５〜８のいずれかに記載の微粒子。
10. 結晶性ポリオールがマンニトールである、請求項５〜９のいずれかに記載の微粒子。
11. 請求項５〜１０のいずれかに記載の微粒子の表面にさらに核酸分子が結合している微粒子。
12. 核酸分子がｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｍＲＮＡ、プラスミドＤＮＡである、請求項１１に記載の微粒子。