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JP5892939B2 - 細胞状態をモニタリングするための方法及び間葉系幹細胞を不死化するための方法 - Google Patents

細胞状態をモニタリングするための方法及び間葉系幹細胞を不死化するための方法 Download PDF

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Description

分野
本発明は、医学、細胞生物学、分子生物学及び遺伝学の分野に関する。本発明は、医学の分野に関する。
より詳細には、本発明は、細胞又は生物の生理学的状態又は病理学的状態をモニタリングする方法に関する。本発明はまた、癌のような疾患の診断及び処置にも関する。
米国特許出願第60/713,992号、米国特許出願第12/065,549号、米国特許出願第12/065,551号、米国特許出願第60/878,222号、米国特許出願第12/377,398号、米国特許出願第61/066,671号、米国特許出願第61/227,865号、及び米国特許出願第61/257,121号が参照される。また、国際出願番号第PCT/GB2005/003206号、国際出願番号第PCT/SG2006/000233号、国際出願番号第PCT/SG2006/000232号、国際出願番号第PCT/SG2007/000257号、及び国際出願番号第PCT/SG2009/000062号も参照される。
上記出願並びに本出願及び上記出願それぞれにおいて引用されたか又は参照された各文書は、上記出願それぞれの手続中に引用された文書（「出願及び文献に引用された文書」）、並びに上記の各出願、各文献及び任意の出願及び文献に引用された文書において引用されたか又は言及された任意の製品についての任意の製造業者の指示書又はカタログを含めて、本書により本書中で参照として組み込まれる。さらに、本文中で引用された全ての文書及び本文中で引用された文書における全ての引用された文書又は参照、並びに本文中又は本文中に組み込まれた任意の文書において引用されたか若しくは言及された任意の製品についての任意の製造業者の指示書又はカタログは、本書により本書中で参照として組み込まれる。本文中に参照として組み込まれた文書又は本文中の任意の教示は、本発明の実施において使用され得る。本文中に参照として組み込まれる文書は、先行技術であることを認められるものではない。
概要
本発明の第１の局面に従って、我々は、細胞の状態をモニタリングする方法であって、上記細胞によって分泌された選択されたmicroRNA（miRNA）種について、（a）上記miRNA種の前駆形態（pre-miRNA）対（b）上記miRNA種の成熟形態（成熟miRNA）の比を確立することを含み、ここで確立された上記pre-miRNA対成熟miRNA比は、上記細胞の状態の指標である、方法を提供する。
上記細胞は、細胞集団、組織、器官又は生物に含まれていてもよく、上記pre-miRNA対成熟miRNA比は、それぞれ上記細胞集団、組織、器官又は生物の状態の指標である。上記miRNA種は、上記細胞によって分泌されたエキソソームに含まれていてもよく、上記方法は、このようなエキソソームを得ること及び上記エキソソームから上記miRNA種の前駆形態及び成熟形態を得ることを含んでいてもよい。上記エキソソームは、生物のサンプルから得られてもよい。上記生物は、上記細胞を含んでもよい。上記サンプルは、血液サンプル、血清サンプル、唾液サンプル又は尿サンプルを含んでもよい。
上記pre-miRNA対成熟miRNA比は、上記miRNA種の前駆形態と成熟形態とに結合可能であり且つこれらを識別可能である核酸配列を含むアレイへのハイブリダイゼーションによって確立されてもよい。上記pre-miRNA対成熟miRNA比は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によって確立されてもよい。
上記方法は、複数の選択されたmiRNA種についての複数のpre-miRNA対成熟miRNA比を含むプロフィールを確立することを含んでもよく、上記複数のpre-miRNA対成熟miRNA比のそれぞれは、上記細胞の状態の指標である。上記プロフィールは、上記複数の選択されたmiRNA種の前駆形態と成熟形態とに結合可能であり且つこれらを識別可能である複数のプローブを含むアレイへのハイブリダイゼーションによって確立されてもよい。
上記細胞の状態は、細胞周期状態、分化状態、発生状態若しくは代謝状態のような生理学的状態、又は、疾患状態、ヒト疾患状態、糖尿病状態、免疫障害状態、神経変性障害状態、癌化状態、癌性状態若しくは腫瘍状態のような病理学的状態を含んでもよい。
本発明の第２の局面に従って、（a）細胞の状態における変化を検出するための方法であって、上記細胞のpre-miRNA対成熟miRNA比（又はこのような比を含むプロフィール）における変化を検出することを含み、ここで、このような変化は、上記細胞の状態における変化を指し示す方法が、提供される。我々は、特定の状態にある細胞を確立するための方法を提供し、この方法は、上記細胞のpre-miRNA対成熟miRNA比（又はこのような比を含むプロフィール）と特定の状態であることが分かっている細胞のpre-miRNA対成熟miRNA比（又はこのような比を含むプロフィール）とを比較することを含む。我々は、生物の状態をモニタリングする方法を提供し、この方法は、上記生物由来のサンプル又は上記生物のサンプルを得ること、上記サンプルに対し上記請求項のいずれか１項に記載の方法を実施すること、及び得られた上記pre-miRNA対成熟miRNA比から上記生物の状態を確立することを含む。我々は、生物の疾患を検出する方法を提供し、この方法は、上記生物由来のサンプル又は上記生物のサンプルを得ること、上記サンプルに対し上記請求項のいずれか１項に記載の方法を実施すること、及び得られた上記pre-miRNA対成熟miRNA比と疾患を有する生物のものであるか又は疾患を有する生物由来のものであることが分かっているサンプルのpre-miRNA対成熟miRNA比とを比較することを含む。我々は、生物における疾患の処置又は予防の方法を提供し、この方法は、上述のように生物における疾患を検出すること、及び上記生物に対し上記疾患のための処置を施すことを含む。
上記細胞は、間葉系幹細胞（MSC）を含んでいてもよい。上記細胞の状態は、非形質転換状態と形質転換状態とを含んでいてもよい。上記形質転換状態は、c-myc形質転換状態を含んでいてもよい。上記microRNAは、hsa-let-7b microRNA（miRBase登録番号MI0000063）を含んでいてもよい。上記比は、形質転換状態において正常状態と比較して2.8倍高くてもよい。これらの任意の組み合わせが可能である。
本発明の第３の局面に従って、我々は、複数のmiRNA種の前駆形態と成熟形態とに結合可能であり且つこれらを識別可能である複数の核酸配列を含むアレイを提供する。
本発明の第４の局面に従って、（a）間葉系幹細胞（MSC）を提供する工程；及び（b）上記間葉系幹細胞に癌遺伝子を導入して形質転換させる工程を含む方法が提供され、ここで、形質転換した上記間葉系幹細胞は、自身が増殖する培地中に上記癌遺伝子の遺伝子産物を分泌しない。
上記癌遺伝子は、c-mycを含んでもよい。上記間葉系幹細胞（MSC）は、huES9.E1のような樹立された細胞株を含んでもよい。上記間葉系幹細胞（MSC）は、臍帯に由来してもよい。
形質転換された間葉系幹細胞は、老化を回避可能であってもよい。形質転換された間葉系幹細胞は、形質転換されていない間葉系幹細胞と比較して、増大した増殖速度を有してもよい。形質転換された間葉系幹細胞は、形質転換されていない間葉系幹細胞と比較して、例えば２４時間のような縮小した集団倍加時間を有してもよい。形質転換された間葉系幹細胞は、形質転換されていない間葉系幹細胞と比較して、増大したテロメラーゼ活性を有してもよい。
本発明の第５の局面に従って、我々は、馴化培地を提供する方法を提供し、この方法は、上述の工程を含み、その後、上記形質転換された間葉系幹細胞又はその子孫細胞を、細胞培養培地中で培養して馴化させ、馴化させた培地を上記形質転換された間葉系幹細胞から分離することを含む。
本発明は、第６の局面において、エキソソームを提供する方法を提供し、この方法は、（a）間葉系幹細胞馴化培地（MSC-CM）を請求項１２に記載の方法によって得ること；（b）上記間葉系幹細胞馴化培地を、例えば、1000 kDaより粗い膜を通した限外濾過によって濃縮すること；（c）濃縮した上記間葉系幹細胞馴化培地を、例えばTSK GuardカラムSWXL, 6 x 40 mm又はTSK gel G4000 SWXL, 7.8 x 300 mmカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにかけること；及び（d）UV吸光度画分、例えば220 nmで、例えば擬弾性光散乱（QELS）によって検出される動的光散乱を示す画分を選択することを含み、上記工程（d）は、例えば、１１〜１３分間、例えば１２分間の保持時間で溶出する画分を回収することを含む。
本発明の第７の局面に従って、薬学的組成物を調製する方法が提供され、この方法は、上述の方法によって間葉系幹細胞馴化培地（MSC-CM）を得るか、又はエキソソームを得ること、及び、場合によっては、上記MSC-CM又は上記エキソソームを、薬学的に許容される担体又は希釈剤と混合することを含む。
形質転換された間葉系幹細胞、上記馴化培地、上記エキソソーム若しくは上記薬学的組成物は、間葉系幹細胞の少なくとも１つの生物学的特性を含んでもよい。上記生物学的特性は、心臓保護を含んでもよい。上記馴化培地、上記エキソソーム若しくは上記薬学的組成物は、例えば心筋虚血及び再灌流傷害のマウスモデル若しくはブタモデルにおいてアッセイされたように、梗塞サイズを縮小可能であってもよい。上記馴化培地、上記エキソソーム若しくは上記薬学的組成物は、例えば過酸化水素（H2O2）誘導性細胞死のインビトロアッセイにおいてアッセイされたような酸化ストレスを軽減可能であってもよい。
本発明の第８の局面に従って、我々は、上述の方法によって得られる不死化間葉系幹細胞、馴化培地、エキソソーム、又は薬学的組成物を提供する。
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の能力の範囲内の化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA及び免疫学の従来技術を採用する。このような技術は、文献において説明される。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel, F. M. et al. (1995及び定期的な補遺；Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)；B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons；J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice；Oxford University Press；M. J. Gait（編）, 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press；D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press；Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies: A Laboratory Manual by Ed Harlow（編）, David Lane（編）(1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855. Handbook of Drug Screening, Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandesにより編集(2001 , New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9);及びLab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3を参照されたい。これらの一般文書のそれぞれは、本書中で参照として組み込まれる。
図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ及び図１Ｆは、hESC-MSCの形質転換を示す図である。図１Ａ：mycを形質移入させたHuES9.E1 MSC（E1-myc 21.1）、GFPを形質移入させたHuES9.E1 MSC（E1-GFP）及び親MSCであるHuES9.E1（E1）由来の細胞性DNAのPCR解析。DNAは、それぞれエキソン２及びエキソン３に特異的なプライマーを用いて増幅させた。内因性myc遺伝子についての予測されるPCR断片サイズは1.7kbであり、形質移入したmyc cDNAについての予測されるPCR断片サイズは0.36kbであり、myc-レンチウイルス由来の増幅断片により示される。図１Ｂ：光学顕微鏡下で観察された形質移入されたMSCの細胞形態。図１Ｃ：E1-myc 21.1及びGFP-MSCの異なる継代に由来するRNAに対して、c-myc mRNAのレベルについての定量的RT-PCRを実施した。相対的myc-転写物レベルを、GFP-MSCにおいてのmyc-転写物レベルに対して規準化した。図１Ｄ：相対的テロメラーゼ活性。1μgの細胞溶解物タンパク質を、テロメラーゼ活性によってTSプライマーを伸長するために最初に使用し、次いで、テロメラーゼ産物を、リアルタイムPCRによって定量した。Ct値は、テロメラーゼ産物の量を表し、従って、溶解物中のテロメラーゼ活性に間接的に比例していた。図１Ｅ：G-bandingによるE1-myc 16.3の核型分析。図１Ｆ：細胞周期の速度。細胞を、CFDAでラベルし、その蛍光を、フローサイトメトリによって経時的にモニタリングした。材料及び方法において記載される通り、各時点における細胞蛍光の損失を使用し、細胞が行っている細胞分裂の数を計算した。 図２は、表面抗原プロファイリングを示す図である。HuES9.E1及びE1-myc 16.3 MSCを、蛍光色素と結合した特異的抗体によって染色し、FACSによって解析した。E1-myc 16.3の蛍光は、p16又はp6における細胞の平均細胞蛍光であった。非特異的蛍光を、アイソタイプを適合させたマウスモノクローナル抗体と共に細胞をインキュベートすることによって評価した。 図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃは、Hus9E1及びE1-myc 16.3 MSCの分化を示す図である。MSCを、骨形成（図３Ａ）を起こすように誘導し、次いでフォン・コッサ染色法によって染色した；MSCを、軟骨形成（図３Ｂ）を起こすように誘導し、次いでアルシアンブルーで染色した；MSCを、脂肪形成（図３Ｃ）を起こすように誘導し、ここで、E1-myc 16.3及びHus9E1 MSCを、脂肪形成誘導性培地に２日間曝露した。 図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃは、遺伝子発現分析を示す図である。Hus9E1及びE1-myc 16.3 MSC由来のRNAを、Sentrix HumanRef-8 Expression BeadChip Version 3にハイブリダイズさせ、そしてBeadstudio及びGenespring GX 10によって分析した。図４Ａ：Beadstudio解析を用いたHuES9.E1とE1-myc 16.3 MSCとの間の遺伝子発現の対比較。図４Ｂ及び図４Ｃ：PANTHER解析。E1-myc 16.3 MSCにおいて２倍より多く過剰発現させた161遺伝子及び２分の１未満に過少発現させた226過少発現遺伝子を、PANTHERアルゴリズムを用いて解析した。各遺伝子セットにおける生物学的プロセスについて観察した遺伝子の頻度を、参照頻度と比較した。この場合、参照頻度は、NCBIデータベースにおける生物学的プロセスについての遺伝子の頻度である。p < 0.05の参照頻度を超える頻度が観察されるこれらの生物学的プロセスは、有意であると見なされる。 図５Ａ、図５Ｂ及び図５Ｃは、分泌の解析を示す図である。図５Ａ：ウェスタンブロット解析。E1MSC又は E1myc-MSCの細胞溶解物、馴化培地（CM）及びHPLC精製したエキソソームに由来するタンパク質を、SDS-PAGE上で分離し、抗myc抗体、抗アクチン抗体及び抗CD9抗体でプローブした。図５Ｂ：E1myc-MSCからのCMのHPLC分画及び動的光散乱。CMを、BioSep S4000, 7.8 mm x 30 cmカラムを用いたHPLC上で分画した。CM中の構成成分を、150 mMのNaClを有するpH 7.2の20 mMリン酸緩衝液で溶出した。溶出様式は、均一溶媒であり、そして実行時間は、４０分間であった。溶出物を、220 nmにおけるUV吸光度についてモニタリングした。次いで、各溶出ピークを、光散乱によって解析した。最も早い溶出ピーク（矢印）を、虚血／再灌流傷害のマウスモデルにおいて試験するために回収した。図５Ｃ：0.3μgのHPLC精製したエキソソームを、急性の心筋／虚血再灌流傷害のマウスモデルに対し、再潅流の５分前に静脈内投与した。生理食塩水（n=10）、E1myc 21.1由来のエキソソーム（n=5）及びE1myc 16.3由来のエキソソーム（n=4）で処置した際の梗塞サイズ（IS）を、危険領域（AAR）の百分率として測定した。E1-myc 21.1エキソソーム又はE1-myc 16.3エキソソームによって処置されたマウスにおける相対的梗塞サイズ（IS/AAR）は、それぞれ23.4±8.2％及び22.6±4.5％であり、相対的梗塞サイズは、生理食塩水で処置されたマウスにおける38.5±5.6％の相対的梗塞サイズよりも有意に低かった（それぞれ、p<0.001及びp<0.002）。 図６は、hESC-MSCの形質転換を示す図である。図６は、mycによって形質移入されたMSC（myc-MSC）、GFPによって形質移入されたMSC（GFP-MSC）及び親MSC HuES9.E1（MSC）に由来する細胞性DNAのPCR解析を示す。DNAを、エキソン２及びエキソン３に特異的なプライマーをそれぞれ用いて増幅させた。内因性myc遺伝子についての予測PCR断片サイズは、1.7kbであり、そして形質移入されたmyc cDNAについての予測PCR断片サイズは、0.36kbであった。 図７は、myc-MSC又はGFP-MSC由来のRNAにおけるc-myc mRNAについての定量的RT-PCRを示す。 図８は、形質移入後のhESC-MSCの細胞形態を示す。２２代の継代におけるHuES9.E1 ESC-MSCを、c-myc又はGFPのいずれかを含むレンチウイルスベクターによって形質移入させた。c-myc又はGFPで形質移入された細胞の形態を、２２代の継代における形質移入の後、次いで１代後の２３代の継代の後に、光学顕微鏡下で観察した。 図９は、相対的テロメラーゼ活性を示す。最初に、1μgの細胞溶解物タンパク質を、テロメラーゼ活性によってTSプライマーを伸長させるために使用し、次いでテロメラーゼ産物を、リアルタイムPCRによって定量した。従って、テロメラーゼ産物の量を表すCt値は、溶解物中のテロメラーゼ活性に対し間接的に比例していた。 図１０は、細胞分泌物中の前駆体miRNA対成熟miRNAの比を示す図である。親MSC又はmyc-MSCのいずれかによって馴化された培養培地を回収し、RNAを抽出し、そして成熟miRNA及び前駆体miRNAについてアッセイした。このRNAについて、hsa-let-7b miRNA（miRBase登録番号MI0000063）及びhsa-let-7g miRNAの前駆形態及び成熟形態に特異的なプライマーを用いて定量的RT-PCRを実施し、そしてhsa-let-7b miRNA（miRBase登録番号MI0000063）及びhsa-let-7g miRNAの前駆形態対成熟形態の比を計算した。 図１１は、miRNAの一次形態を同定するプライマーの設計を示す図である。 図１２は、miRNAの前駆形態を同定するプライマーの設計を示す図である。 図１３は、miRNAの成熟形態を同定するプライマーの設計を示す図である。
詳細な説明
間葉系幹細胞（MSC）は、奇形腫形成の危険性がほぼ無い、間葉系細胞型、例えば脂肪細胞、軟骨細胞及び骨細胞に分化する、限定されてはいるが強力な能力を有する、多分化能幹細胞である。MSC移植は、筋骨格傷害を処置するため、心臓血管疾患において心機能を改善するため、及び移植片対宿主疾患の重篤さを緩和するために使用されている[1]。近年、MSC移植は、種々の疾患の処置における治療有効性を示しているが、その根底にあるメカニズムは、議論されている[2,3,4,5,6,7,8,9]。幾つかの報告は、MSCによって分泌される因子[10]は、動脈形成[11]、腸における幹細胞クリプト[12]、虚血性傷害[9,13,14,15,16,17,18]及び造血[19,20]において治療効果に関連していることを示唆している。このパラクライン仮説を支持して、多くの研究は、MSCが、主に心臓組織及び血管組織の成長及び再生を通して損傷した心臓組織を潜在的に修復し得るサイトカイン、ケモカイン及び増殖因子を分泌することを観察している[21,22]。このパラクライン仮説は、心臓血管疾患の処置においてMSCを使用する代わりに非細胞ベースの代替物を提供する可能性がある[23]。非細胞ベースの治療は、細胞ベースの治療に対し、一般に、製造がより容易であり、そして非生物であるのでより安全であり、そして免疫拒絶を誘発しない。
我々は、以前、ヒト胚性幹細胞又は胎仔組織に由来する間葉系幹細胞（MSC）によって馴化された培養培地[24,25,26]が、心筋虚血／再灌流傷害から心臓を保護し得、そして梗塞サイズを縮小し得ることを、MI/R障害のブタモデル及びマウスモデルの両方において実証した[25,26,27]。その後の研究は、この心臓保護が、約50〜100 nmの直径のエキソソーム又は微粒子によって媒介されたこと、及びこれらの微粒子は、タンパク質及びRNAの両方の荷を運搬することを実証した[24,25,26,27,28]。これらのエキソソームは、HPLCにおけるサイズ排除[25,26]によって均質な大きさの粒子の集団として精製され得、そしてMI/R障害のマウスモデルにおいて梗塞サイズを馴化培地の約１０分の１の用量で縮小した。
MSC分泌における治療剤としてのエキソソームの同定は、細胞ベースの治療法よりもむしろ生物学的治療法を提供する可能性がある。細胞と違い、エキソソームは、急性の免疫拒絶を誘発せず、そして非生物であり、より小さい。それらは、腫瘍又は塞栓の形成のような危険性がより少ない。生存を維持しなければならない細胞ベースの治療と違い、非生物であるエキソソームの製造及び保存は、より複雑でなく、従って費用が嵩まない。治療剤となるだけでなく、エキソソームは、「天然の」薬物送達ビヒクルとして提唱されている[29]。これらの脂質ビヒクルは、治療剤を担い、そしてこの治療剤を細胞型に特異的な様式で送達するために使用され得る。hESC-MSCは、エキソソームの効率的な産生のための理想的な細胞性供給源であり得る。我々は、これらの細胞が、エキソソームの産生及び回収の間、既知組成中で増殖し得、そしてこれらのエキソソームが、HPLCで精製されて均質なサイズの粒子集団を産生し得ることを実証した[25,26,27]。これらの細胞が、無限に増大可能な細胞供給源であるhESCに由来することは、別の利点である。
hESC-MSCもまた、培養物中で非常に増大し易いが、親hESCとは異なり、有限回数のみの細胞分裂を行うことだけができ、その後増殖を停止して老化する。従って、常に新しいバッチのMSCをhESCから誘導して、エキソソームの細胞供給源を補強する必要があり、誘導の度に誘導、試験及び評価の再発コストがかかる。再誘導の必要性を回避し、そして治療剤又は送達ビヒクルとしてのエキソソームの商業的に持続可能な産生のための同一のMSCの無限の供給を確保するために、我々は、老化を回避するための癌遺伝子形質転換の使用を開発する。癌遺伝子形質転換は、細胞生物学を改変し、エキソソームの産生又は特性に影響する可能性がある。v-myc遺伝子の胎仔MSCへの形質移入は、細胞を不死化するがこれらMSCの基本的特徴は改変しなかったことが以前に報告されている[30]。ここで、我々は、MYCタンパク質をコードするc-myc遺伝子を有するレンチウイルスベクターを上述のhuES9.E1 MSC[24]に２２代目及び１６代目の継代において形質移入させ、プールした細胞株及び３つの独立に派生したクローン細胞株をそれぞれ産生した。我々は、形質転換した細胞を、MSCについてのISCT最小定義基準[31]、すなわち、プラスチック接着性、CD29+、CD44+、CD49a+CD49e+、CD105+、CD166+、MHCI+、CD34-、CD45-及びHLA-DR-の表面抗原プロフィール並びに脂肪細胞、軟骨細胞及び骨細胞への分化能に従って試験した。これらの細胞の分泌を、エキソソームの存在について評価し、そしてこれらのエキソソームの治療有効性を、心筋虚血／再灌流傷害（MI/R）のマウスモデルにおいて以前に記載されたように試験した[27]。
形質転換された間葉系幹細胞
ヒトESC由来間葉系幹細胞（hESC-MSC）からのエキソソーム又は分泌された二層脂質小胞（bi-lipid vesicles）は、動物モデルにおいて心筋虚血／再灌流傷害を軽減することが示されている。しかし、hESC-MSCは無限に増大可能ではないので、これらのエキソソームの大規模産生は、hESCからの誘導を介したhESC-MSCの補強を必要とし、新しいバッチごとに試験及び評価の再発コストがかかるであろう。
ここで、我々は、hESC-MSCのc-myc不死化が、治療的に有効なエキソソームの産生を損なうことなくこの制約を回避できるかどうか調べる。mycによって形質転換されたMSCは、主として親hESC-MSCに似ているが、プラスチック接着性の低下、速い増殖、老化の欠損、myc発現の増大及びインビトロ脂肪形成能の欠損という主な相違点を有し、形質転換細胞を技術的に非MSCにしている。それにも関わらず、myc形質転換されたMSC由来のエキソソームは、心筋虚血／再灌流傷害のマウスモデルにおいて相対的梗塞サイズを縮小することができ、このことは、治療用エキソソームの産生能力は、保存されていることを示していた。
従って、我々は、まず、形質転換された間葉系幹細胞を提供する。形質転換された間葉系幹細胞は、例えば、適切な形質転換剤、例えば癌遺伝子による形質転換によって、間葉系幹細胞から得られ得るか又は誘導され得る。我々はさらに、このような形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又はいずれかを含む細胞株の子孫細胞を提供する。このような細胞は、本書中で、「形質転換された間葉系幹細胞」又は本書中に記載の方法によって得られる形質転換された間葉系幹細胞と呼ばれる場合がある。
我々は、従って、（a）間葉系幹細胞（MSC）を提供する工程；及び（b）上記間葉系幹細胞に癌遺伝子を導入して形質転換させる工程を含む方法であって、形質転換された上記間葉系幹細胞は、自身が増殖する培地中に上記癌遺伝子の遺伝子産物を分泌しない方法を記載する。
上記癌遺伝子は、c-mycを含んでもよい。
上記間葉系幹細胞（MSC）は、huES9.E1のような樹立された細胞株を含んでもよい。
上記間葉系幹細胞（MSC）は、臍帯に由来してもよい。
形質転換された間葉系幹細胞は、形質転換されていない間葉系幹細胞と比較して、老化を回避可能であってもよい。形質転換された間葉系幹細胞は、形質転換されていない間葉系幹細胞と比較して、増大した増殖速度を有してもよい。形質転換された間葉系幹細胞は、形質転換されていない間葉系幹細胞と比較して、例えば２４時間のような縮小した集団倍加時間を有してもよい。形質転換された間葉系幹細胞は、形質転換されていない間葉系幹細胞と比較して、増大したテロメラーゼ活性を有してもよい。
我々は、馴化培地を提供する方法を記載し、この方法は上述の工程を含み、その後、上記形質転換された間葉系幹細胞又はその子孫細胞を、細胞培養培地中で培養して馴化させ、馴化させた培地を上記形質転換された間葉系幹細胞から分離することを含む。
我々は更に、エキソソームを提供する方法を記載し、この方法は、（a）間葉系幹細胞馴化培地（MSC-CM）を上述の方法によって得ること；（b）上記間葉系幹細胞馴化培地を、例えば、1000 kDaより粗い膜を通した限外濾過によって濃縮すること；（c）濃縮した上記間葉系幹細胞馴化培地を、例えばTSK GuardカラムSWXL, 6 x 40 mm又はTSK gel G4000 SWXL, 7.8 x 300 mmカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにかけること；及び（d）UV吸光度画分、例えば220 nmで、例えば擬弾性光散乱（QELS）によって検出される動的光散乱を示す画分を選択することを含み、上記工程（d）は、例えば、１１〜１３分間、例えば１２分間の保持時間で溶出する画分を回収することを含む。
我々は更に、薬学的組成物を調製する方法を記載し、この方法は、上述の方法によって間葉系幹細胞馴化培地（MSC-CM）を得るか、又は上述の方法によってエキソソームを得ること、及び、場合によっては、上記MSC-CM又は上記エキソソームを、薬学的に許容される担体又は希釈剤と混合することを含む。
上記馴化培地、上記エキソソーム若しくは上記薬学的組成物は、間葉系幹細胞の少なくとも１つの生物学的特性、例えば間葉系幹細胞馴化培地（MSC-CM）の生物学的活性、例えば心臓保護を含んでもよい。
上記馴化培地、上記エキソソーム若しくは上記薬学的組成物は、例えば心筋虚血及び再灌流傷害のマウスモデル若しくはブタモデルにおいてアッセイされたように、梗塞サイズを縮小可能であってもよく、或いは、例えば過酸化水素（H2O2）誘導性細胞死のインビトロアッセイにおいてアッセイされたような酸化ストレスを軽減可能であってもよい。
上記馴化培地、上記エキソソーム若しくは上記薬学的組成物は、個体において、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷及び変性疾患、例えば糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、癌、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚科学的障害、皮膚科学的病変、皮膚炎、乾癬、コンジローマ、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚癌、アトピー性皮膚炎、ベーチェット病、慢性肉芽腫性疾患、皮膚T細胞リンパ種、潰瘍形成、初期損傷誘導性炎症及び免疫調節異常によって特徴づけられ且つ線維症及び機能欠損を含む慢性組織再構築をもたらす病理学的状態、腎虚血傷害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎並びに鼻炎からなる群より選択される疾患又は整形外科疾患を処置するために好適であってもよく、或いは、創傷治癒、瘢痕軽減、骨形成、骨移植又は骨髄移植を助けるために使用されてもよく、或いは、（i）Rho GTPaseによる細胞骨格調節、細胞周期、インテグリンシグナル伝達経路、ケモカイン及びサイトカインのシグナル伝達経路によって媒介される炎症、FGFシグナル伝達経路、EGF受容体シグナル伝達経路、血管形成、プラスミノーゲン活性カスケード、凝血、糖代謝、ユビキチンプロテアソーム経路、新規プリン生合成、TCA周期、フェニルアラニン生合成、ヘム生合成のうちのいずれか１つ以上より選択される経路の調節において使用されてもよく、（ii）細胞構造及び細胞運動性、細胞構造、細胞間情報伝達、細胞運動性、細胞接着、エンドサイトーシス、有糸分裂、エキソサイトーシス、細胞質分裂、細胞周期、免疫及び防御、サイトカイン／ケモカイン媒介性免疫、マクロファージ媒介性免疫、顆粒球媒介性免疫、リガンド媒介性シグナル伝達、サイトカイン及びケモカイン媒介性シグナル伝達経路、シグナルトランスダクション、細胞外マトリクスタンパク質媒介性シグナル伝達、増殖因子ホメオスタシス、受容体タンパク質チロシンキナーゼシグナル伝達経路、細胞接着媒介性シグナル伝達、細胞表面受容体媒介性シグナルトランスダクション、JAK-STATカスケード、酸化防止及びフリーラジカル除去、ホメオスタシス、ストレス応答、血液凝固、発生プロセス、中胚葉発生、骨格発生、血管形成、筋発生、筋収縮、タンパク質代謝及びタンパク質修飾、タンパク質分解、タンパク質折り畳み、タンパク質複合体アセンブリ、アミノ酸活性、細胞内タンパク質輸送、他のタンパク質標的化及び局在化、アミノ酸代謝、タンパク質生合成、タンパク質ジスルフィド−イソメラーゼ反応、炭水化物代謝、糖代謝、ペントース−リン酸短路、他の多糖類代謝、プリン代謝、リン酸代謝の調節、ビタミン代謝、アミノ酸生合成、pre-mRNAプロセシング、翻訳調節、mRNAスプライシングのうちのいずれか１つ以上を含むプロセスの調節において使用されてもよく、或いは（iii）シグナル伝達分子、ケモカイン、増殖因子、サイトカイン、インターロイキン、他のサイトカイン、細胞外マトリクス、細胞外マトリクス構造タンパク質、他の細胞外マトリクス、細胞外マトリクス糖タンパク質、プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、他のプロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、メタロプロテアーゼインヒビター、セリンプロテアーゼインヒビター、酸化還元酵素、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、シャペロン、シャペロニン、Hsp 70ファミリーシャペロン、他のシャペロン、シンセターゼ、シンターゼ及びシンセターゼ、選択されたカルシウム結合タンパク質、アミノアシル-tRNAシンセターゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、他のイソメラーゼ、ATPシンターゼ、ヒドラターゼ、トランスアミナーゼ、他のリアーゼ、他の酵素制御因子、選択された調節分子、アクチン結合細胞骨格タンパク質、細胞骨格タンパク質、非モーターアクチン結合タンパク質、アクチン及びアクチン関連タンパク質、アネクシン、チューブリン、細胞接着分子、アクチン結合モータータンパク質、中間フィラメント、リボ核タンパク質、リボソームタンパク質、翻訳因子、他のRNA結合タンパク質、ヒストン、カルモジュリン関連タンパク質、小胞コートタンパク質のうちのいずれか１つ以上を含む機能を補助するために使用されてもよい。
我々は、更に、上述の方法によって得られ得る不死化間葉系幹細胞を記載する。
我々は、更に、上述の方法によって得られ得る馴化培地を記載する。
我々は、更に、上述の方法によって得られ得るエキソソームを記載する。
我々は、更に、上述の方法によって得られ得る薬学的組成物を記載する。
我々は、更に、上述の馴化培地の供給源、上述のエキソソームの供給源又は上述の薬学的組成物の供給源を含む、馴化培地、エキソソーム又は薬学的組成物の送達のための送達システムと並んで、馴化培地、エキソソーム又は薬学的組成物を標的に送達するために操作可能なディスペンサーを記載する。
我々は、更に、馴化培地、エキソソーム又は薬学的組成物の標的への送達の方法における、上述の送達システムの使用を記載する。
上記の形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、心臓保護活性を含んでもよい。この心臓保護活性は、急性心筋梗塞（AMI）のマウスモデルにおいてアッセイされてもよい。
上記の形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、任意の手段で得た間葉系幹細胞を形質転換することによって得ることができる。形質転換された間葉系幹細胞が由来する間葉系幹細胞は、例えば、胚性幹細胞、死亡胎仔細胞のような胎仔細胞、又は任意の他の好適な組織供給源に由来する、任意の好適な間葉系幹細胞を含んでもよい。間葉系幹細胞は、胚性幹細胞株又は胎仔細胞株から得られてもよく、またこれらに由来してもよい。同様に、形質転換された間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞株から樹立されてもよい。
例えば、間葉系幹細胞は、例えば、WO2007/027157又はWO2007/027156に記載されるように、胚性幹細胞又は胚性幹細胞株から樹立されてもよい。
間葉系幹細胞はまた、出生前の細胞、例えば妊娠初期又は妊娠中期の胎仔細胞から樹立されてもよい。胎仔細胞は、任意の好適な齢、例えば、２週齢、４週齢、８週齢、１６週齢又は２４週齢までの細胞を含んでもよい。胎仔細胞は、任意の組織由来の細胞、例えば四肢の細胞、腎細胞又は肝細胞を含んでもよい。間葉系幹細胞が由来する出生前の細胞は、組織内に含まれていてもよい。この組織は、死亡胎仔に由来してもよい。間葉系幹細胞は、哺乳動物、霊長類又はヒトの間葉系幹細胞を含んでもよい。
この方法は、間葉系幹細胞を無血清培地中で培養することを更に含んでもよい。この無血清培地は、ノックアウトDMEM培地のような無血清培地を含んでもよい。これは、10％血清置換培地で補強されてもよい。これは、非必須アミノ酸で補強されてもよい。これは、10 ng/mlのFGF2で補強されてもよい。これは、10ng/mlの組換えヒトEGFで補強されてもよい。これは、55μMのβ−メルカプトエタノールで補強されてもよい。
形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、形質転換された間葉系幹細胞が以下の特徴の１つ以上を示すようなものであってもよい。形質転換された間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞の１つ以上の形態特徴を示してもよい。このような特徴は、コンフルーエントにおける指紋渦巻きを含んでもよい。これは、線維芽細胞の表現型を有する接着性の単層を形成することを含んでもよい。
形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、プラスチックに接着可能であってもよい。形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、72時間から96時間の間の平均集団倍加時間を示し得る。形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、CD29、CD44、CD49a、CD49e、CD105、CD166、MHC Iの１つ以上、例えば全ての発現を含む表面抗原プロフィールを示してもよい。これは、HLA-DR、CD34及びCD45の１つ以上の発現の低減又は欠失を示してもよい。形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、CD29+、CD44+、CD49a+CD49e+、CD105+、CD166+、MHC I+、CD34-及びCD45-であってもよい。
形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、HESX1、POUFL5、SOX-2、UTF-1及びZFP42の１つ以上、例えば全ての発現の低減を示してもよい。形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、OCT4、NANOG及びSOX2の１つ以上、例えば全ての発現の低減を示してもよい。形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、アルカリホスファターゼ活性が検出不能であることを示してもよい。
形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、10、20、30、40又はより多くの継代の細胞培養物において維持され得る。形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、少なくとも１０世代の継代で細胞培養物を維持した場合に実質的に安定な核型又は染色体数を有してもよい。形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、レシピエント動物に移植した場合の奇形腫の形成を実質的に誘導しないものであってもよい。レシピエント動物は、免疫無防備状態のレシピエント動物を含んでもよい。この期間は、３週間後であってもよく、例えば、２〜９ヶ月後であってもよい。形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、SCIDマウスに移植した際に催奇性でないものであってもよい。
形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、マウス特異的c-mos反復配列についてネガティブであり、そしてヒト特異的alu反復配列についてポジティブであるものであってもよい。形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、骨形成、脂肪形成又は軟骨形成を行うことができるもの、例えば、骨細胞、脂肪細胞又は軟骨細胞に分化できるものであってもよい。形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、世代から世代にわたって実質的に安定的な遺伝子発現パターンを有してもよい。
形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、上記方法によって得られ得る形質転換された間葉系幹細胞の任意の２種以上、例えば全てが、実質的に同一な遺伝子発現プロフィールを示すものであってもよい。これは、例えば、上記方法によって得られ得る形質転換された間葉系幹細胞の任意の２つ以上の単離物の間の遺伝子発現相関係数は、0.9より高いものであってもよい。これは、上記方法によって得られ得る形質転換された間葉系幹細胞の任意の２種以上、例えば全てが、互いに実質的に類似又は同一（例えば、同質）であることであってもよい。これは、上記方法によって得られ得る形質転換された間葉系幹細胞と親培養物の細胞との間の遺伝子発現相関係数が、0.8より高いものであってもよい。
形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、哺乳動物、例えばマウス又はヒトの、形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株を含んでもよい。
我々は、更に、上述されるように、形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株によって馴化された培地を含む馴化培地を提供する。上述の形質転換された間葉系幹細胞によって分泌された粒子もまた、提供され、この粒子は、形質転換された間葉系幹細胞馴化培地（MSC-CM）の生物学的活性、例えば心臓保護のような、形質転換された間葉系幹細胞の少なくとも１つの生物学的特性を含む。これらは、以下でより詳細に説明される。
我々はまた、疾患の処置の方法において使用される、上述の形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株、馴化培地又は粒子も、提供する。この疾患は、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷及び変性疾患、例えば糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、癌、タンパク質凝集塊の蓄積又は細胞内もしくは細胞外病変を伴う疾患；ハンチントン病及びアルコール性肝疾患からなる群より選択されてもよい。
この疾患は、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚科学的障害、皮膚科学的病変、皮膚炎、乾癬、コンジローマ、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚癌、アトピー性皮膚炎、ベーチェット病、慢性肉芽腫性疾患、皮膚T細胞リンパ種、潰瘍形成、初期損傷誘導性炎症及び免疫調節異常によって特徴づけられ且つ線維症及び機能欠損を含む慢性組織再構築をもたらす病理学的状態、腎虚血傷害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎並びに鼻炎からなる群より選択されてもよく、又は整形外科疾患であってもよい。
形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物、細胞株、馴化培地又は粒子は、創傷治癒、瘢痕軽減、骨形成、骨移植又は骨髄移植を補助するために使用されてもよい。
形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物、細胞株、馴化培地又は粒子は、Rho GTPaseによる細胞骨格調節、細胞周期、インテグリンシグナル伝達経路、ケモカイン及びサイトカインのシグナル伝達経路によって媒介される炎症、FGFシグナル伝達経路、EGF受容体シグナル伝達経路、血管形成、プラスミノーゲン活性カスケード、凝血、糖代謝、ユビキチンプロテアソーム経路、新規プリン生合成、TCA周期、フェニルアラニン生合成、ヘム生合成のうちのいずれか１つ以上より選択される経路の調節のため又は調節を補助するために使用されてもよい。
形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物、細胞株、馴化培地又は粒子は、細胞構造及び細胞運動性、細胞構造、細胞間情報伝達、細胞運動性、細胞接着、エンドサイトーシス、有糸分裂、エキソサイトーシス、細胞質分裂、細胞周期、免疫及び防御、サイトカイン／ケモカイン媒介性免疫、マクロファージ媒介性免疫、顆粒球媒介性免疫、リガンド媒介性シグナル伝達、サイトカイン及びケモカイン媒介性シグナル伝達経路、シグナルトランスダクション、細胞外マトリクスタンパク質媒介性シグナル伝達、増殖因子ホメオスタシス、受容体タンパク質チロシンキナーゼシグナル伝達経路、細胞接着媒介性シグナル伝達、細胞表面受容体媒介性シグナルトランスダクション、JAK-STATカスケード、酸化防止及びフリーラジカル除去、ホメオスタシス、ストレス応答、血液凝固、発生プロセス、中胚葉発生、骨格発生、血管形成、筋発生、筋収縮、タンパク質代謝及びタンパク質修飾、タンパク質分解、タンパク質折り畳み、タンパク質複合体アセンブリ、アミノ酸活性、細胞内タンパク質輸送、他のタンパク質標的化及び局在化、アミノ酸代謝、タンパク質生合成、タンパク質ジスルフィド−イソメラーゼ反応、炭水化物代謝、糖代謝、ペントース−リン酸短路、他の多糖類代謝、プリン代謝、リン酸代謝の調節、ビタミン代謝、アミノ酸生合成、pre-mRNAプロセシング、翻訳調節、mRNAスプライシングのうちのいずれか１つ以上を含むプロセスの調節において使用されてもよい。
形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物、細胞株、馴化培地又は粒子は、シグナル伝達分子、ケモカイン、増殖因子、サイトカイン、インターロイキン、他のサイトカイン、細胞外マトリクス、細胞外マトリクス構造タンパク質、他の細胞外マトリクス、細胞外マトリクス糖タンパク質、プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、他のプロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、メタロプロテアーゼインヒビター、セリンプロテアーゼインヒビター、酸化還元酵素、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、シャペロン、シャペロニン、Hsp 70ファミリーシャペロン、他のシャペロン、シンセターゼ、シンターゼ及びシンセターゼ、選択されたカルシウム結合タンパク質、アミノアシル-tRNAシンセターゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、他のイソメラーゼ、ATPシンターゼ、ヒドラターゼ、トランスアミナーゼ、他のリアーゼ、他の酵素調節因子、選択された調節分子、アクチン結合細胞骨格タンパク質、細胞骨格タンパク質、非モーターアクチン結合タンパク質、アクチン及びアクチン関連タンパク質、アネクシン、チューブリン、細胞接着分子、アクチン結合モータータンパク質、中間フィラメント、リボ核タンパク質、リボソームタンパク質、翻訳因子、他のRNA結合タンパク質、ヒストン、カルモジュリン関連タンパク質、小胞コートタンパク質のうちのいずれか１つ以上を含む機能を補強するために使用されてもよい。
また、上述の馴化培地又は粒子の供給源を含む、馴化培地又は粒子の送達のための、馴化培地又は粒子を標的に送達するために操作可能なディスペンサーを伴う送達システムが提供される。
我々は、更に、馴化培地又は粒子の標的への送達の方法における、このような送達システムの使用を提供する。
更に、分化した間葉系細胞を得る方法も、提供され、この方法は、上述の形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株を提供すること、そしてこの形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株を、骨細胞、脂肪細胞又は軟骨細胞に分化させることを含む。
我々は更に、このような方法によって得ることができる分化した間葉系細胞を提供する。
また、上で示された形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物、細胞株、馴化培地又は粒子或いは上述の馴化培地を、薬学的に許容される賦形剤又は担体と一緒に含む薬学的組成物も、提供される。
我々は、細胞培養培地を馴化する方法を提供し、この方法は、上述の形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物又は細胞株を、細胞培養培地中で培養すること、及び必要に応じてこの細胞培養培地を単離することを含む。
我々は更に、上で示された形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物、細胞株、馴化培地又は粒子を得ること、及びこの形質転換された間葉系幹細胞、細胞培養物、細胞株、馴化培地又は粒子を患者に投与することを含む、疾患を処置する方法を提供する。
この疾患は、上で示された疾患から選択されてもよい。
形質転換された間葉系幹細胞の取得
形質転換された間葉系幹細胞は、遺伝子操作などの本書中に記載される方法及び組成物を用いて間葉系幹細胞から得られ得るか又は誘導され得る。遺伝子操作は、癌遺伝子のような好適な形質転換剤による形質転換を含み得る。
従って、我々は、少なくとも１つの形質転換遺伝子を含むベクターで間葉系幹細胞を形質移入することによって、このような細胞株を不死化するか又は形質転換するための方法を記載する。
形質転換遺伝子の例には、以下が含まれる：（1）v-myc、N-myc、T抗原及びユーイング肉腫癌遺伝子のような核癌遺伝子（Fredericksen et al. (1988) Neuron 1 :439-448；Bartlett, P. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3255-3259、及びSnyder, E. Y. et al. (1992) Cell 68:33-51）、（2）bcr-abl及びニューロフィブロミンのような細胞質癌遺伝子（Solomon, E. et al. (1991) Science 254: 1 153-1160）、（3）neu及びretのような膜癌遺伝子（Aaronson, A. S. A. (1991) Science 254: 1 153-1 161）、（4）mutant p53及びmutant Rb（網膜芽細胞腫）のような腫瘍抑制遺伝子（Weinberg, R. A. (1991) Science 254: 1 138-1 146）、並びに（5）Notchドミナントネガティブのような他の形質転換遺伝子（Coffman, C. R. et al. (1993) Cell 23:659-671）。癌遺伝子の例は、v-myc及びSV40 T抗原を含む。
形質転換遺伝子は、テロメラーゼ遺伝子（Tert）と同様に、Akt、ras、EGF受容体などのような癌遺伝子を更に含んでもよい。
形質転換遺伝子をコードする核酸のような外来性の（異種の）核酸が、間葉系幹細胞内に導入され得るか、又は形質移入され得る。外来性DNAを保有する間葉系幹細胞は、遺伝子操作された細胞と呼ばれる。外来性DNAは、種々の技術を用いて導入され得る。１つの実施形態において、形質転換遺伝子をコードするDNAを含む外来性DNAは、レトロウイルス形質移入の技術を用いて間葉系幹細胞に導入される。目的の遺伝子を保有する組換えレトロウイルスは、E. coliβ−ガラクトシダーゼ（lacZ）又は癌遺伝子のようなマーカー遺伝子を導入するために使用される。組換えレトロウイルスは、パッケージング細胞株中に産生されて、高力価のウイルス粒子を有する（一般に、105〜106 pfu/ml）培養物上清を産生する。組換えウイルス粒子は、間葉系幹細胞の培養物に、細胞培養物をウイルス粒子と8μg/mlのポリブレンとを含む培地と共に３時間インキュベートすることによって感染させるために使用される。レトロウイルスの感染後、細胞は、リンスされて標準培地中で培養される。次いで、感染細胞は、外来性DNAの取り込み及び発現について分析される。細胞は、選択的マーカー遺伝子を取り込み且つ発現した細胞について選択する選択的条件に供されてもよい。
別の実施形態において、外来性DNAは、リン酸カルシウム媒介型形質移入の技術を用いて導入されてもよい。目的の遺伝子、例えば形質転換遺伝子をコードするDNAを含むリン酸カルシウム沈殿物は、Wigler et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1373-1376の技術を用いて調製される。間葉系幹細胞の培養物は、組織培養皿中に樹立される。細胞のプレート培養の２４時間後、約20 μg/mlの外来性DNAを含むリン酸カルシウム沈殿物が、添加される。細胞は、室温で20分間に亘ってインキュベートされる。30μMのクロロキンを含む組織培養培地が添加され、そして細胞は、３７℃で一晩インキュベートされる。形質移入後、細胞は、外来性DNAの取り込み及び発現について分析される。細胞は、選択的マーカー遺伝子を取り込み且つ発現した細胞について選択する選択的条件に供されてもよい。
本書中で使用される場合、用語「非形質転換細胞」は、形質転換された細胞内のウイルス遺伝子の発現ゆえに細胞に改変された増殖特性を付与する癌遺伝子を含むウイルス又はウイルスゲノムの一部の導入によって細胞を不死化させる必要なく、インビトロで増殖可能な細胞を意味する。これらのウイルス遺伝子は、代表的に、ウイルス感染によって又は単離されたウイルス遺伝子を含むDNAベクターによる形質移入によって、細胞内に導入されている。
本書中で使用される場合、用語「遺伝子操作された細胞」は、外来性の（すなわち、非天然由来の）核酸、例えばDNAが導入されている細胞をいう。外来性の核酸は、種々の技術によって導入され得、この種々の技術は、限定しないが、リン酸カルシウム媒介型形質移入、DEAE媒介型形質移入、マイクロインジェクション、レトロウイルス形質転換、原形質融合及びリポフェクションを含む。遺伝子操作された細胞は、一時的様式又は長期的様式のいずれかで外来性核酸を発現し得る。一般に、一時的発現は、外来性DNAが形質移入された細胞の染色体DNA内に安定的に組み込まれていない場合に起こる。対照的に、外来性DNAの長期的発現は、外来性DNAが形質移入された細胞の染色体DNA内に安定的に組み込まれている場合に起こる。
本書中で使用される場合、「不死化細胞」又は「形質転換された細胞」は、「不死化遺伝子」又は「形質転換遺伝子」の導入によって培養物中で無限に増殖可能な細胞を意味し、これらの遺伝子は、遺伝子操作された細胞内の不死化遺伝子又は形質転換遺伝子の発現により細胞に改変された増殖特性を付与する。不死化遺伝子及び形質転換遺伝子は、ウイルス感染によって又は単離された１つ以上の癌遺伝子をコードするウイルスの核酸を含むベクターの形質移入によって細胞内に導入され得る。ウイルス又はウイルス癌遺伝子は、不死化を可能にするが好ましくは細胞の形質転換を可能にしないものが選択される。不死化細胞は、培養物中で無限に増殖するが、動物内に導入された際に腫瘍を引き起こさないものであってもよい。
本書中で使用される場合、用語「形質転換された細胞」は、導入された形質転換遺伝子を有し、且つ培養物中で無限に増殖する能力を有する細胞をいう。「形質転換」は、形質転換された細胞の産生をいう。
形質転換された間葉系幹細胞培養物及び細胞株
本書中に記載の方法によって得られる形質転換された間葉系幹細胞は、細胞として維持されてもよく、又は細胞培養物若しくは細胞株へと発生してもよいことが明らかであろう。
従って、本書において、そして適切な場合、用語「形質転換された間葉系幹細胞」は、対応する細胞培養物、すなわち形質転換された間葉系幹細胞培養物又は対応する細胞株、すなわち形質転換された間葉系幹細胞株の言及をも含むと理解されるべきである。一般に、形質転換された幹細胞、細胞培養物又は細胞株は、由来について上述されたものと同じ又は類似の条件の培養物及び培養培地中で維持され得る。
形質転換された間葉系幹細胞馴化培地
我々は、形質転換された間葉系幹細胞の培養物によって馴化された培地を更に提供する。このような馴化培地は、本書において「形質転換された間葉系幹細胞馴化培地」と呼ばれ、以下で更に詳細に説明される。
このような馴化培地は、形質転換された間葉系幹細胞によって分泌されるか、排出されるか、放出されるか、または産生される分子を含み得る。馴化培地は、形質転換された間葉系幹細胞の１種以上の分子、例えば、ポリペプチド、核酸、炭水化物又は他の複合体若しくは単純な分子を含み得る。馴化培地はまた、形質転換された間葉系幹細胞の１種以上の活性も含み得る。馴化培地は、形質転換された間葉系幹細胞自体の代わりに、形質転換された間葉系幹細胞自体に加えて、又は形質転換された間葉系幹細胞自体を補強して、使用されてもよい。従って、形質転換された間葉系幹細胞が好適に使用される任意の目的において、馴化培地は同様に使用され得る。
このような馴化培地、及びそれに含まれる任意の分子（詳細にはタンパク質又はポリペプチド含む）は、形質転換された間葉系幹細胞の活性の補助として、又は形質転換された間葉系幹細胞の代わりに、例えば疾患を処置するか又は予防する目的のために使用されてもよい。従って、本書中に記載される方法で得られた形質転換された間葉系幹細胞が特定の目的で使用され得ることが言及されている場合、このような形質転換された間葉系幹細胞によって馴化された培地が、その目的のために同様に使用され得ることは明らかであろう。
馴化培地は、任意の好適な方法で製造され得る。例えば、形質転換された間葉系幹細胞を培地中、例えば細胞培養培地中で、所定の時間培養することによって製造され得る。下に記載される「馴化培地調製プロトコール」を含む馴化培地を調製する多くの方法が、採用され得る。
形質転換された間葉系幹細胞は、詳細には、本書中で記載される方法のいずれかによって製造される形質転換された間葉系幹細胞を含んでもよい。馴化培地は、実施例で記載されるように、形質転換された間葉系幹細胞によって分泌されるポリペプチドを含むであろう。
馴化培地を産生するプロトコールの特定の例は、これに限定するものではないが、以下の通りである。
馴化培地を形質転換された間葉系幹細胞から調製するためのプロトコールの例は、以下の通りの「馴化培地調製プロトコール」を含んでもよい。
形質転換された間葉系幹細胞馴化培地調製プロトコール
分泌物は、形質転換されたMSCを化学的に定義された無血清培養培地中で、上述、実施例及び参考文献２５の通りに３日間増殖させることによって調製され得る。80％コンフルーエントな培養物を、PBSで３回洗浄し、次いで、一晩、フェノールレッド非含有であり1×インスリン−トランスフェリン−セレンタンパク質、10ng/ml組換えヒトFGF2、10ng/ml組換えヒトEGF、1×グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン及び55μM β−メルカプトエタノールを補強したDMEM培地から成る化学的に定義された培地中で一晩培養してもよい。培養物は、次いで、PBSで３回洗浄され、次いで、新鮮な化学的に定義された培地が加えられてもよい。全ての培地成分は、Invitrogenから入手され得る。培養物は、この培地中で３日間維持され得る。この馴化培地（CM）は、次いで、回収され、遠心分離によって浄化され、100 kDaのMWカットオフのタンジェント流濾過（Satorius, Goettingen, Germany）を用いて50倍に濃縮されて、220 nmフィルターを通した濾過によって無菌化され得る。
馴化培地は、そのままで、又は１回以上の処理工程の後に、治療において使用され得る。例えば、馴化培地は、UV処理、フィルター無菌化などされ得る。１回以上の精製工程が、採用されてもよい。詳細には、馴化培地は、例えば、透析又は限外濾過によって濃縮されてもよい。例えば、この培地は、例えば3Kの公称分画分子量（NMWL）による膜限外濾過を用いて濃縮されてもよい。
本書中で記載される目的、例えば疾患の処置又は予防のために、体重100 kgあたり15〜750 mgのタンパク質を含む馴化培地の用量が、このような処置を必要とする患者に投与され得る。
形質転換された間葉系幹細胞粒子
我々は、形質転換された間葉系幹細胞（MSC）から誘導可能な粒子を記載する。このような粒子は、本書中で「形質転換された間葉系幹細胞粒子」という。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、形質転換されたMSCから、幾つかの手段のいずれか、例えば、形質転換されたMSCからの分泌、出芽又は分散によって誘導可能であり得る。例えば、形質転換された間葉系幹細胞粒子は、形質転換されたMSCから、産生され得るか、滲出され得るか、噴出され得るか又は零れ落ち得る。形質転換されたMSCが細胞培養物中にある場合、形質転換された間葉系幹細胞粒子は、細胞培養培地中に分泌され得る。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、詳細には、小胞を含み得る。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、エキソソームを含み得る。本書中で記載される形質転換された間葉系幹細胞粒子は、本書中で記載されるエキソソームの特性の任意の１つ以上を含み得る。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、小胞又は脂質二重層によって区切られた平坦な球を含み得る。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、40〜100 nmの直径を有し得る。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、エンドソーム膜の内側への出芽によって形成され得る。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、約1.13〜1.19 g/mlの密度を有し得、そしてショ糖勾配に浮かび得る。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、コレステロール及びスフィンゴミエリン、並びにGM1、GM3、フロチリン及びsrcタンパク質キナーゼLynのような脂質ラフトマーカーに富んでいてもよい。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、形質転換された間葉系幹細胞中又は形質転換された間葉系幹細胞馴化培地（形質転換されたMSC-CM）中に存在する１種以上のタンパク質、例えば形質転換されたMSC若しくは形質転換されたMSC-CMに特徴的又は特異的なタンパク質を含み得る。それらは、RNA、例えばmiRNAを含み得る。
我々は、形質転換されたMSC中又は形質転換されたMSCの培養によって馴化された培地中において見出される１種以上の遺伝子又は遺伝子産物を含む形質転換された間葉系幹細胞粒子を提供する。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、形質転換されたMSCによって分泌される分子を含み得る。このような形質転換された間葉系幹細胞粒子、その中に含まれる分子、詳細にはタンパク質又はポリペプチドを含む分子の任意の組み合わせは、形質転換されたMSC又は形質転換されたMSCによって馴化された培地の活性を補強するため或いは形質転換されたMSC又は形質転換されたMSCによって馴化された培地の代わりに、例えば疾患を処置するため又は予防するための目的で使用され得る。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、細胞骨格において見出される細胞質タンパク質、例えばチューブリン、アクチン及びアクチン結合タンパク質、細胞内膜融合及び輸送、例えばアネクシン及びrabタンパク質、シグナル伝達タンパク質、例えばタンパク質キナーゼ、14-3-3及びヘテロ三量体Gタンパク質、代謝酵素、例えばペルオキシダーゼ、ピルベート及び脂質キナーゼ、並びにエノラーゼ-1及びテトラスパニンのファミリー、例えばCD9、CD63、CD81及びCD82を含んでもよい。詳細には、形質転換された間葉系幹細胞粒子は、１種以上のテトラスパニンを含んでもよい。形質転換された間葉系幹細胞は、mRNA及び／又はmicroRNAを含んでもよい。
本書中で使用される用語「粒子」は、別個の存在を意味し得る。粒子は、形質転換された間葉系幹細胞（形質転換されたMSC）又は形質転換された間葉系幹細胞馴化培地（形質転換されたMSC-CM）から単離され得る物であってもよい。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、少なくとも形質転換されたMSC又は形質転換されたMSC-CMの活性に応答可能であり得る。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、形質転換されたMSC又は形質転換されたMSC-CMの機能の実質的に殆ど又は全てに応答可能であり且つこれらを実行し得る。例えば、形質転換された間葉系幹細胞粒子は、形質転換されたMSC又は形質転換されたMSC-CMの代替物（又は生物学的代替物）であってもよい。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、形質転換されたMSC又は形質転換されたMSC-CMが使用され得る治療目的のいずれかのために使用され得る。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、形質転換された間葉系幹細胞の少なくとも１つの特性を含み得る。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、生物学的特性、例えば生物学的活性を有し得る。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、形質転換されたMSCの任意の生物学的活性を有し得る。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、例えば、形質転換されたMSCの治療活性又は回復活性を有し得る。生物学的活性は、心臓保護を含み得る。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、梗塞サイズを縮小することができ得る。梗塞サイズの縮小は、心筋虚血及び再灌流傷害のマウスモデル又はブタモデルにおいてアッセイされ得る。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、酸化ストレスを軽減することができ得る。酸化ストレスの軽減は、過酸化水素（H2O2）誘導性細胞死のインビトロアッセイにおいてアッセイされ得る。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、小胞を含む。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、エキソソームを含み得る。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、間葉系幹細胞馴化培地（MSC-CM）中又は形質転換された間葉系幹細胞馴化培地（形質転換されたMSC-CM）中に少なくとも70％のタンパク質を含み得る。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、分子量100 kDaを超える複合体を含み得る。分子量100 kDaを超える複合体は、100 kDa未満のタンパク質を含み得る。粒子は、分子量300 kDaを超える複合体を含み得る。分子量100 kDaを超える複合体は、300 kDa未満のタンパク質を含み得る。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、分子量1000 kDaを超える複合体を含み得る。粒子は、2 nm〜200 nmのサイズを有し得る。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、50ηm〜150 nmのサイズを有し得る。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、50 nm〜100 nmのサイズを有し得る。
形質転換された間葉系幹細胞粒子のサイズは、0.2μMフィルターに対する濾過及び10 kDaの分子量カットオフを有する膜に対する濃縮によって決定されてもよい。形質転換された間葉系幹細胞粒子のサイズは、電子顕微鏡観察によって決定されてもよい。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、100 nm未満の流体力学半径を含んでいてもよい。これは、約30 nm〜約70 nmの流体力学半径を含んでもよい。これは、約40 nm〜約60 nm、例えば、約45 nm〜約55 nmの流体力学半径を含んでもよい。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、約50 nmの流体力学半径を含んでもよい。流体力学半径は、レーザー回折又は動的光分散によって決定され得る。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、リン脂質、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、シンゴミエリン（shingomyelin）、セラミド、糖脂質、セレブロシド、ステロイド、コレステロールからなる群より選択される脂質を含んでもよい。コレステロール対リン脂質の比は、0.3〜0.4（モル／モル）より大きくてもよい。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、脂質ラフトを含んでもよい。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、Triton-X100のような非イオン性界面活性剤中に不溶性であってもよい。形質転換された間葉系幹細胞粒子が非イオン性活性剤で処理された際に、この形質転換された間葉系幹細胞粒子は、特定の分子量の複合体において特定の分子量のタンパク質が実質的に保持されていてもよい。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、シクロデキストリン、例えば20 mMのシクロデキストリンに感受性であってもよい。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、シクロデキストリンで処理されると、特定の複合体の実質的な溶解を起こすものであってもよい。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、リボ核酸（RNA）を含んでもよい。この粒子は、1.9の吸光度比（260:280 nm）を有し得る。形質転換された間葉系幹細胞粒子は、CD9、CD109及びthy-1からなる群より選択される表面抗原を有し得る。
我々は、上述の形質転換された間葉系幹細胞粒子を産生する方法を更に記載し、この方法は、形質転換された間葉系幹細胞粒子を形質転換された間葉系幹細胞馴化培地（MSC-CM）から単離することを含む。
この方法は、分子量、サイズ、形状、組成又は生物学的活性に基づき、他の構成要素から形質転換された間葉系幹細胞粒子を分離することを含んでもよい。
重量は、上に記載された重量から選択されてもよい。サイズは、上に記載されたサイズから選択されてもよい。組成は、上に記載された組成から選択されてもよい。生物学的活性は、上に記載された生物学的活性から選択されてもよい。
我々は、上述の形質転換された間葉系幹細胞粒子を産生する方法を更に記載する。この方法は、形質転換された間葉系幹細胞馴化培地（MSC-CM）を得ることを含んでいてもよい。これは、形質転換された間葉系幹細胞馴化培地を濃縮することを含んでもよい。形質転換された間葉系幹細胞馴化培地は、1000 kDaよりも粗い膜を通した限外濾過によって濃縮されてもよい。この方法は、濃縮された形質転換された間葉系幹細胞馴化培地を、サイズ排除クロマトグラフィーにかけることを含んでもよい。TSK GuardカラムSWXL、6 x 40 mm又はTSKゲルG4000 SWXL、7.8 x 300 mmカラムが、採用され得る。この方法は、例えば、220 nmにおいて動的光散乱を示すUV吸光度画分を選択することを含んでもよい。動的光散乱は、擬弾性光散乱（QELS）検出器によって検出され得る。この方法は、１１〜１３分間、例えば１２分間の保持時間で溶出する画分を回収することを含んでもよい。
我々は、上述の形質転換された間葉系幹細胞粒子を薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と共に含む、薬学的組成物を更に提供する。
我々は、疾患を処置する方法における使用のための、このような形質転換された間葉系幹細胞粒子又はこのような薬学的組成物を更に提供する。
我々は、このような形質転換された間葉系幹細胞粒子の、疾患の処置のための薬学的組成物の調製のために使用を、更に提供する。
我々は、このような形質転換された間葉系幹細胞粒子の、個体における疾患の処置の方法における使用を、更に提供する。
この疾患は、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷並びに変性疾患、例えば糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病及び癌からなる群より選択されてもよい。
この疾患は、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚科学的障害、皮膚科学的病変、皮膚炎、乾癬、コンジローマ、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚癌、アトピー性皮膚炎、ベーチェット病、慢性肉芽腫性疾患、皮膚T細胞リンパ種、潰瘍形成、初期損傷誘導性炎症及び免疫調節異常によって特徴づけられ且つ線維症及び機能欠損を含む慢性組織再構築をもたらす病理学的状態、腎虚血傷害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎並びに鼻炎又は整形外科疾患からなる群より選択されてもよい。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、個体における創傷治癒、瘢痕軽減、骨形成、骨移植又は骨髄移植を補助するために使用されてもよい。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、（i）Rho GTPaseによる細胞骨格調節、細胞周期、インテグリンシグナル伝達経路、ケモカイン及びサイトカインのシグナル伝達経路によって媒介される炎症、FGFシグナル伝達経路、EGF受容体シグナル伝達経路、血管形成、プラスミノーゲン活性カスケード、凝血、糖代謝、ユビキチンプロテアソーム経路、新規プリン生合成、TCA周期、フェニルアラニン生合成、ヘム生合成のうちのいずれか１つ以上より選択される経路の調節において使用されてもよく；（ii）細胞構造及び細胞運動性、細胞構造、細胞間情報伝達、細胞運動性、細胞接着、エンドサイトーシス、有糸分裂、エキソサイトーシス、細胞質分裂、細胞周期、免疫及び防御、サイトカイン／ケモカイン媒介性免疫、マクロファージ媒介性免疫、顆粒球媒介性免疫、リガンド媒介性シグナル伝達、サイトカイン及びケモカイン媒介性シグナル伝達経路、シグナルトランスダクション、細胞外マトリクスタンパク質媒介性シグナル伝達、増殖因子ホメオスタシス、受容体タンパク質チロシンキナーゼシグナル伝達経路、細胞接着媒介性シグナル伝達、細胞表面受容体媒介性シグナルトランスダクション、JAK-STATカスケード、酸化防止及びフリーラジカル除去、ホメオスタシス、ストレス応答、血液凝固、発生プロセス、中胚葉発生、骨格発生、血管形成、筋発生、筋収縮、タンパク質代謝及びタンパク質修飾、タンパク質分解、タンパク質折り畳み、タンパク質複合体アセンブリ、アミノ酸活性、細胞内タンパク質輸送、他のタンパク質標的化及び局在化、アミノ酸代謝、タンパク質生合成、タンパク質ジスルフィド−イソメラーゼ反応、炭水化物代謝、糖代謝、ペントース−リン酸短路、他の多糖類代謝、プリン代謝、リン酸代謝の調節、ビタミン代謝、アミノ酸生合成、pre-mRNAプロセシング、翻訳調節、mRNAスプライシングのうちのいずれか１つ以上を含むプロセスの調節において使用されてもよく；或いは（iii）シグナル伝達分子、ケモカイン、増殖因子、サイトカイン、インターロイキン、他のサイトカイン、細胞外マトリクス、細胞外マトリクス構造タンパク質、他の細胞外マトリクス、細胞外マトリクス糖タンパク質、プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、他のプロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、メタロプロテアーゼインヒビター、セリンプロテアーゼインヒビター、酸化還元酵素、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、シャペロン、シャペロニン、Hsp 70ファミリーシャペロン、他のシャペロン、シンセターゼ、シンターゼ及びシンセターゼ、選択されたカルシウム結合タンパク質、アミノアシル-tRNAシンセターゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、他のイソメラーゼ、ATPシンターゼ、ヒドラターゼ、トランスアミナーゼ、他のリアーゼ、他の酵素調節因子、選択された調節分子、アクチン結合細胞骨格タンパク質、細胞骨格タンパク質、非モーターアクチン結合タンパク質、アクチン及びアクチン関連タンパク質、アネクシン、チューブリン、細胞接着分子、アクチン結合モータータンパク質、中間フィラメント、リボ核タンパク質、リボソームタンパク質、翻訳因子、他のRNA結合タンパク質、ヒストン、カルモジュリン関連タンパク質、小胞コートタンパク質のうちのいずれか１つ以上を含む機能を補強するために使用されてもよい。
我々は、形質転換された間葉系幹細胞粒子を送達するための送達システムを更に提供し、このシステムは、形質転換された間葉系幹細胞粒子の供給源を、粒子を標的に送達するために操作可能なディスペンサーと共に含む。
我々は、粒子の標的への送達の方法における、このような送達システムの使用を、更に提供する。
形質転換された間葉系幹細胞は、分泌された約50〜100 nm直径の大型複合体を介して心臓保護効果を媒介し得る。従って、このような複合体又は粒子は、細胞自体に代えて、心臓保護を含む、治療的手段に使用されてもよい。
形質転換された間葉系幹細胞粒子、複合体又はエキソソームは、種々の目的、例えば、虚血、心臓炎症若しくは心不全のような心臓病又は心疾患の処置又は予防の目的のために使用され得る。それらはまた、以下の潅流傷害を治すために使用され得る。
形質転換されたMSCによって馴化された培地（例えば、下で説明する形質転換された幹細胞馴化培地又は形質転換されたMSC-CM）は、形質転換されたMSCの生物学的活性を含んでもよく、そして形質転換されたMSC自体を代替し得る。形質転換されたMSCの生物学的特性又は生物学的活性は、従って、形質転換された間葉系幹細胞馴化培地の生物学的特性又は生物学的活性に対応し得る。従って、形質転換された間葉系幹細胞粒子は、形質転換された間葉系幹細胞馴化培地（形質転換されたMSC-CM）の１つ以上の生物学的特性又は生物学的活性を含み得る。
形質転換された間葉系幹細胞馴化培地（形質転換されたMSC-CM）のような馴化細胞培養培地は、形質転換された間葉系幹細胞（形質転換されたMSC）、その子孫細胞又はそれに由来する細胞株を、細胞培養培地中で培養し、そして細胞培養培地を単離することによって得られ得る。形質転換された間葉系幹細胞は、胚性幹（ES）細胞コロニーを分散することによって細胞を得ることを含むプロセスによって産生され得る。この細胞又はその子孫細胞は、FGF2含有無血清培地中で共培養物無しに増殖され得る。さらなる詳細が、本書中の他所で提供される。
形質転換された間葉系幹細胞粒子の単離
形質転換されたMSC粒子は、多くの方法において産生され得るか又は単離され得る。このような方法は、形質転換された間葉系幹細胞（形質転換されたMSC）からの粒子の単離を含んでもよい。このような方法は、形質転換されたMSC粒子を形質転換された間葉系幹細胞馴化培地（形質転換されたMSC-CM）から単離することを含んでもよい。
形質転換されたMSC粒子は、例えば、形質転換されたMSC粒子の任意の特性に基づいて無関連の構成成分から分離することによって、単離され得る。例えば、形質転換されたMSC粒子は、分子量、サイズ、形状、組成又は生物学的活性に基づいて単離され得る。
馴化培地は、分離の間、分離の前又は分離後に、濾過されても、濃縮されても、その両方をされてもよい。例えば、これは、膜、例えばサイズ又は分子量のカットオフを有する膜を通して、濾過され得る。これは、接線力濾過又は限外濾過に供されてもよい。
例えば、本書中他所における分子量についてのアッセイにおいて記載されるように、好適な分子量又はサイズのカットオフの膜による濾過が、使用され得る。
必要に応じて濾過されるか濃縮されるか又はその両方をされた馴化培地は、更なる分離手段、例えばカラムクロマトグラフィーに供されてもよい。例えば、種々のカラムを用いた高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）が、使用され得る。カラムは、サイズ排除カラム又は結合カラムであってもよい。
形質転換されたMSC粒子の１つ以上の特性又は生物学的活性は、形質転換された間葉系幹細胞馴化培地（形質転換されたMSC-CM）の分画の間、その活性を追跡するために使用され得る。例としては、光散乱、屈折率、動的光散乱又はUV可視化検出器が、形質転換されたMSC粒子を追跡するために使用され得る。例えば、心臓保護活性のような治療活性が、分画の間、活性を追跡するために使用され得る。
以下の章は、形質転換されたMSC間葉系幹細胞粒子、例えばエキソソームが、どのように得られ得るかの特定の例を提供する。
形質転換された間葉系幹細胞粒子は、形質転換された間葉系幹細胞を培地中で培養して馴化することによって、産生され得る。形質転換された間葉系幹細胞は、形質転換されたHuES9.E1細胞を含み得る。この培地は、DMEMを含み得る。DMEMは、フェノールレッドを含まないものであってもよい。この培地は、インスリン、トランスフェリン若しくはセレンタンパク質（ITS）、又はこれらの任意の組み合わせで補強されてもよい。これは、FGF2を含んでもよい。これは、PDGF ABを含んでもよい。FGF2の濃度は、約5 ng/ml FGF2であってもよい。PDGF ABの濃度は、約5 ng/mlであってもよい。この培地は、グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン若しくはβ−メルカプトエタノール、又はこれらの組み合わせを含んでもよい。
細胞は、約1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10日間又はそれ以上に亘って、例えば3日間に亘って、培養され得る。馴化培地は、細胞を培地から分離することによって得られ得る。馴化培地は、例えば、500 gで遠心分離されてもよい。これは、膜を通した濾過によって濃縮されてもよい。この膜は、1000 kDaより粗い膜を含み得る。馴化培地は、約50倍又はそれ以上濃縮されてもよい。
馴化培地は、液体クロマトグラフィー、例えばHPLCに供されてもよい。馴化培地は、サイズ排除によって分離され得る。任意のサイズ排除マトリクス、例えばセファロースが、使用され得る。例として、TSK GuardカラムSWXL, 6 x 40 mm又はTSK gel G4000 SWXL, 7.8 x 300 mmが、使用され得る。溶出緩衝液は、任意の生理学的培地、例えば生理食塩水を含み得る。これは、pH 7.2で150 mMのNaClを含む20 mMリン酸緩衝液を含み得る。クロマトグラフィーシステムは、0.5 ml/分の流速で平衡化され得る。溶出様式は、均一溶媒であってもよい。220 nmにおけるUV吸光度が、溶出の進行を追跡するために使用され得る。画分は、擬弾性光散乱（QELS）検出器を用いて光散乱（DLS）について試験され得る。
動的光散乱を示すことが見出された画分は、保持され得る。例えば、上述のような一般的方法によって産生され、そして11〜13分間、例えば12分間の保持時間で溶出した画分が、動的光散乱を示すことが見出される。このピークにおける粒子のrhは、約55〜65 nmである。このような画分は、形質転換されたMSC間葉系幹細胞粒子、例えばエキソソームを含む。
形質転換されたMSC粒子の送達
本書中で記載された形質転換されたMSC粒子は、ヒト又は動物の身体に、任意の好適な手段で送達され得る。
我々は、従って、本書中で記載されたように、形質転換されたMSC粒子を標的細胞、標的組織、標的器官、動物の身体又はヒトの身体に送達するための送達システム、及び形質転換されたMSC粒子を標的に送達するためにこの送達システムを使用するための方法を記載する。
この送達システムは、形質転換されたMSC粒子の供給源、例えば形質転換されたMSC粒子を含む容器を含み得る。この送達システムは、形質転換されたMSC粒子を標的に分配するためのディスペンサーを含み得る。
従って、我々は、形質転換されたMSC粒子を送達するための送達システムを提供し、このシステムは、本書中で記載されたように形質転換されたMSC粒子の供給源を、形質転換された粒子を標的に送達するために操作可能なディスペンサーを共に含む。
我々は、形質転換されたMSC粒子を標的に送達する方法におけるこのような送達システムの使用を、更に提供する。
流体を体内に送達するための送達システムは、当該分野で公知であり、注射、外科的点滴、カテーテル（潅流カテーテルを含む）、例えば米国特許第6,139,524号において記載されるもの、例えば、米国特許第7,122,019号に記載されるような薬物送達カテーテルを含む。
肺又は鼻腔への送達は、鼻腔内送達を含めて、例えば、当該分野で公知の鼻腔スプレー、パッファー、吸入器など（例えば、米国意匠登録第D544,957号において示されるもの）を使用して達成され得る。
腎臓への送達は、大動脈内腎送達カテーテル、例えば米国特許第7,241,273号に記載のものを用いて達成され得る。
特定の送達は、最適な処置を達成するため、所定量の形質転換されたMSC粒子を適切な間隔で送達するように設計可能なものであるべきであることは、明らかである。
形質転換されたMSC粒子は、例えば、アテローム硬化症を処置又は予防するために使用され得る。ここで、形質転換されたMSC粒子の潅流は、アテローム硬化症プラークを安定化させ得るか又はプラークにおける炎症を軽減するために、静脈内で行われてもよい。形質転換されたMSC粒子は、静脈内潅流によって敗血症性ショックを処置又は予防するために使用され得る。
形質転換されたMSC粒子は、心不全の処置又は予防のために使用され得る。これは、形質転換されたMSC粒子の長期的な冠内潅流又は心筋内潅流により、再形成を遅らせるか又は心不全を遅らせることによって達成され得る。形質転換されたMSC粒子は、鼻腔内送達による肺の炎症の処置又は予防のために使用され得る。
形質転換されたMSC粒子は、皮膚科学的状態、例えば乾癬の処置又は予防のために使用され得る。経皮微量注射針を用いた形質転換されたMSC粒子の長期的送達は、状態が改善するまで使用され得る。
送達方法は、形質転換されたMSC粒子が送達される特定の器官によること、及び当業者は、従って、使用する手段を決定することができることが、明らかである。
例として、心臓炎症において、形質転換されたMSC粒子は、例えば、心臓組織（すなわち、心筋、心膜又は心内膜）に、胸壁を通した直接の冠内注射によって、又は組織内、例えば心筋内への直接注入のための蛍光顕微鏡の案内の下での標準的な経皮カテーテルベースの方法の使用して、或いは体腔内に挿入されたステント若しくはカテーテルからのインヒビターの注入を用いて、送達され得る。
任意の種々の冠状動脈カテーテル又は潅流カテーテルが、形質転換されたMSC粒子を投与するために使用され得る。或いは、形質転換されたMSC粒子は、冠状動脈に配置されたステントを被膜していてもよく、又はこれにしみ込んでいてもよい。
間葉系幹細胞（MSC）の取得
本書中で記載される形質転換された間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞から単離され得るか、又は産生され得る。形質転換された間葉系幹細胞の産生における使用のために好適な間葉系幹細胞は、当該分野で公知の任意の方法によって製造され得る。
詳細には、MSCは、胚性幹（ES）細胞コロニー又はその子孫細胞を、共培養物非存在下でFGF2含有の無血清培地中にて分散することによって細胞を増殖させることによって得られ得る。更なる例として、間葉系幹細胞は、出生前の組織から誘導され得る。出生前の組織、例えば胎仔組織は、例えば、解剖、切り刻み又は洗浄、或いはこれらの任意の組み合わせによって処理され得る。
これらのそれぞれは、以下の節で更に詳細に記載される。
胚性幹細胞供給源からの間葉系幹細胞
hESCから間葉系幹細胞（MSC）又はMSC様細胞を得る先行技術方法は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）遺伝子の分化しているhESC内への形質移入（Xu et al., 2004）又はマウスOP9細胞株との共培養（Barberi et al., 2005）を含む。これらの誘導プロトコールにおける外因性遺伝物質及びマウス細胞の使用は、腫瘍化又は生物種の異なる感染因子の感染の受容し難い危険性を誘発する。
間葉系幹細胞は、分化したhESCからの類似の又は同一の（例えば、同質の）MSC集団の単離のための臨床的に関連し且つ再現可能なプロトコールの使用によって、誘導され得る。一般には、この方法は、胚性幹（ES）細胞コロニーを、細胞に分散することを含む。この細胞は、次いで、プレート培養されて増殖させられる。この細胞を、線維芽細胞増殖因子2（FGF2）を含有する無血清培地中で共培養無しで増殖させて、間葉系幹細胞（MSC）を得る。
従って、このプロトコールは、血清、マウス細胞の使用又は遺伝子操作を必要とせず、殆ど操作及び時間を必要とせず、従って、非常に大規模化し易い。このプロトコールは、２種の異なるhESC細胞株であるHuES9及びH-1、及びまた、第3の細胞株であるHes-3からのMSCの単離のために使用され得る。本書中で記載される方法及び組成物によって得られるヒトES細胞由来のMSC（hESC-MSC）は、骨髄由来のMSC（BM-MSCs）と非常に類似している。
胚性幹細胞培養物は、ヒト胚性幹細胞（hESC）培養物を含み得る。
１つの実施形態において、間葉系幹細胞（MSC）を産生する方法は、hESCをトリプシン処理しそしてFGF2で補強され且つフィーダーの支持の無い培地中に増殖させることを含み、この培地は、CD105+CD24-細胞選別の前に、必要に応じて、PDGF ABを含んでもよい。
この方法は、トリプシン処理したhESCからの、FGF2及び必要に応じてPDGF ABで補強された培地中での無フィーダー増殖の一週間後の、CD105+, CD24-細胞の選別を含み、少なくとも幾つか、例えば実質的に全ての、又は全ての細胞が、互いに類似であるか、又は同一である（例えば、同質である）hESC-MSC細胞培養物を産生するために産生される。
この方法によって産生されたMSCは、間葉系幹細胞馴化培地（MSC-CM）を産生するために使用され得、ここからsが単離され得る。
胚性幹細胞コロニーの脱凝集
間葉系幹細胞を産生する１つの方法は、胚性幹細胞コロニーを細胞に分散又は脱凝集することを含み得る。
胚性幹細胞コロニーは、huES9コロニー（Cowan CA, Klimanskaya I, McMahon J, Atienza J, Witmyer J, et al. (2004) Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med 350: 1353-1356）又はH1 ESCコロニー（Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, et al. (1998) Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science 282: 1145-1147）を含み得る。
コロニー中の細胞は、実質的な程度、すなわち、少なくとも凝集塊に脱凝集又は分散されていてもよい。コロニーは、コロニー中の全ての細胞が個々になる程度、すなわち、コロニーが完全に脱凝集されるまで、脱凝集又は分散されていてもよい。
脱凝集は、分散剤によって達成され得る。
分散剤は、コロニー中の胚性幹細胞の少なくとも幾つかを互いに分離できる任意の物であってもよい。分散剤は、コロニー中の細胞間又は細胞と基質との間、或いはその両方の接着を破壊する試薬を含み得る。分散剤はプロテアーゼを含んでもよい。
分散剤は、トリプシンを含み得る。トリプシンによる処理は、例えば、3分間に亘って、或いは、およそ３７℃で続けられ得る。次いで、細胞は、中性化され、遠心分離されて培地中に再懸濁されて、その後プレート培養される。
この方法は、ヒト胚性幹細胞のコンフルーエントなプレートのトリプシンによる分散及び細胞のプレート培養を含み得る。
脱凝集は、以下の一連の工程の少なくとも幾つかを含み得る：吸引、リンス、トリプシン処理、インキュベーション、移動、クエンチング、再播種及び分取。以下のプロトコールは、Hedrick Lab, UC San Diego（http://hedricklab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html）からの応用である。
吸引工程において、培地は、容器、例えばフラスコから、吸引されるか又はほぼ除去される。リンス工程において、細胞は、例えば5〜10 mlの量の緩衝化培地でリンスされ、この緩衝化培地は、Ca2+及びMg2+非含有であってもよい。例えば、細胞は、カルシウム及びマグネシウム比含有のPBSでリンスされてもよい。トリプシン処理工程において、緩衝液中のある量の分散剤が、容器に加えられ、そしてこの容器が回転されて、分散剤溶液で増殖表面を被膜する。例えば、ハンクス液（Hank's BSS）中の1 mlのトリプシンが、フラスコに加えられ得る。
インキュベーション工程において、細胞は、維持温度においてある時間置かれる。例えば、細胞は、37℃で数分間（例えば、2〜5分間）置かれ得る。移動工程に置いて、細胞は、機械的動作によって、例えば、掻き取り又は容器の側面を手で叩くことによって、移動され得る。細胞は、シート状で剥がれ、表面上に滑り落ちる。
クエンチング工程において、ある量の培地が、フラスコに加えられる。この培地は、分散剤の作用を止めるために、中性化剤を含んでいてもよい。例えば、分散剤がトリプシンのようなプロテアーゼであった場合、培地は、タンパク質、例えば血清タンパク質を含んでいてもよく、これは、プロテアーゼの活性を失活させる。特定の例において、3 mlの血清を含む細胞培養培地が、フラスコに加えられて、計4 mlにされる。細胞は、移動させるため又は細胞を分散させるために、ピペッティングされてもよい。
再播種工程において、細胞は、新鮮な培養容器に再播種され、そして新鮮な培地が加えられる。多くの再播種が、異なる分割比で行われ得る。例えば、細胞は、1/15希釈及び1/5希釈で再播種され得る。特定の例において、細胞は、25cm2のフラスコ内に1滴の細胞を加えることによって再播種され、そしてこの培養物を再播種するために別のフラスコに3滴を加え、次いで、7〜8 mlの培地がそれぞれに加えられて、例えば、75cm2のフラスコからの1/15希釈物及び1/5希釈物を提供してもよい。分取工程において、細胞は、新しい皿に分取されてもよく、又はどのような分割比が所望される場合でも、培地が加えられ得る。
特定の実施形態において、この方法は、以下の工程を含む：ヒトES細胞は、最初、非接着様式で懸濁状態にて増殖し、胚様体（EB）を形成する。次いで、5〜10日齢のEBを、トリプシン処理し、その後、接着性の細胞として、ゼラチンで被膜した組織培養プレート上にプレート培養する。
細胞培養物の維持
分解された細胞又は間葉系幹細胞などの細胞は、プレート培養され、細胞培養物として維持されてもよい。
細胞は、培養容器又はゼラチン処理したプレートのような基質上にプレート培養されてもよい。重要なことには、細胞は、共培養物の存在無しで、例えば、フィーダー細胞の非存在下で、増殖して増える。
細胞培養物中の細胞は、無血清培地中で増殖してもよい。この培地は、１種以上の増殖因子、例えば上皮増殖因子（EGF）、線維芽細胞増殖因子2（FGF2）及び必要に応じて血小板由来増殖因子AB（PDGF AB）によって、例えば5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml又は30ng/mlで補強されてもよい。細胞培養物中の細胞は、コンフルーエントの際には、分割又は継代培養されてもよい。これは、任意の好適な手段、例えばトリプシンによる処理、洗浄及び再プレート培養によって分割され得る。分割比は、例えば、1:4を含み得る。
間葉系幹細胞は、細胞株として維持されてもよい。
共培養物の非存在
幾つかの実施形態において、我々の方法は、共培養物の非存在下で細胞を培養することを含む。
用語「共培養物」は、共に増殖する２種以上の異なる種の細胞、例えば、間質性フィーダー細胞の混合物をいう。
従って、代表的なES細胞培養物において、培養皿の内側表面は、通常、分裂しないように処理されているマウス胚性皮膚細胞のフィーダー層によって被膜されている。このフィーダー層は、ES細胞が接着して増殖出来るようにする接着表面を提供する。更に、フィーダー細胞は、培養培地中に、ES細胞増殖に必要な栄養を放出する。本書中で記載される方法及び組成物において、ES細胞及びMSC細胞は、このような共培養物の非存在下で培養されてもよい。
細胞は、単層で、又はフィーダー細胞の非存在下で、培養され得る。胚性幹細胞は、フィーダー細胞の非存在下で培養されて、間葉系幹細胞（MSC）を樹立し得る。MSC自体は、フィーダー細胞の非存在下で培養され得る。
分離又は脱凝集された胚性幹細胞は、培養基質上に直接プレート培養されてもよい。間葉系幹細胞は、培養基質上で培養され得る。培養基質は、組織培養容器、例えばペトリ皿を含んでもよい。この容器は、事前処理されてもよい。細胞は、ゼラチン処理された組織培養プレート上にプレート培養されて増殖してもよい。
皿のゼラチン被膜のためのプロトコールの例は、以下である。0.1％のゼラチンを蒸留水中に含む溶液を作製し、そしてオートクレーブする。これは、室温で保存可能である。組織培養皿の底を、ゼラチン溶液で覆い、そして5〜15分間インキュベートする。ゼラチンを除去すると、プレートは使用可能である。低浸透圧による溶解を予防するために、細胞を加える前に培地を加えておくべきである。
無血清培地
分離又は脱凝集された胚性幹細胞は、無血清培地を含み得る培地中で培養されてもよい。間葉系幹細胞は、無血清培地を含み得る培地中で培養されてもよい。
用語「無血清培地」は、血清タンパク質、例えばウシ胎仔血清を非含有である細胞培養培地を含み得る。無血清培地は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第5,631,159号及び同第5,661,034号において記載される。無血清培地は、例えば、Gibco-BRL（Invitrogen）から市販されている。
無血清培地は、タンパク質非含有であってもよく、すなわち、タンパク質、加水分解物及び未知の組成物の構成要素を含有しないものであってもよい。無血清培地は、全ての構成要素が既知の化学構造を有する、化学的に定義された培地を含み得る。化学的に定義された無血清培地は、完全に定義されたシステムを提供するために有利であり、これにより、変動性をなくすことによって改善された再現性及びより一定した性能を可能にし、そして外来性の因子による夾雑物混入の可能性を低減する。
無血清培地は、ノックアウトDMEM培地（Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York）を含み得る。
無血清培地は、血清代替培地のような１種以上の構成要素で、5％、10％、15％などの濃度で補強されてもよい。無血清培地は、Invitrogen- Gibco（Grand Island, New York）からの10％の血清代替培地を含み得るか、又はこれで補強され得る。
増殖因子
分離又は分解された胚性幹細胞が中で培養される無血清培地は、１種以上の増殖因子を含み得る。間葉系幹細胞を含む無血清培地は、１種以上の増殖因子を含み得る。多くの増殖因子が当該分野で公知であり、PDGF、EGF、TGF-a、FGF、NGF、エリスロポエチン、TGF-b、IGF-I及びIGF-IIを含む。
増殖因子は、線維芽細胞増殖因子2（FGF2）を含み得る。この培地はまた、他の増殖因子、例えば血小板由来増殖因子AB（PDGF AB）も含み得る。これらの増殖因子の両方は、当該分野で公知である。この方法は、FGF2及びPDGF ABの両方を含む培地中で細胞を培養することを含み得る。
或いは、又は更に、この培地は、上皮増殖因子（EGF）を更に含み得る。EGFの使用は、MSCの増殖を増強し得る。EGFは、任意の好適な濃度、例えば5〜10 ng/ml EGFで使用され得る。EGFは、PDGFの代わりに使用されてもよい。EGFは、当該分野で周知のタンパク質であり、符号EGF、代替の符号URG、Entrez 1950、HUGO 3229、OMIM 131530、RefSeq NM#001963、UniProt P01133で表される。
従って、我々は、（i）FGF2、（ii）FGF2及びPDGF並びに（iii）FGF2、EGF及び他の組み合わせを含む培地の使用を開示する。
FGF2は、広範囲の分裂促進因子、血管形成因子及び神経栄養因子であり、多くの組織及び細胞型において低レベルで発現し、そして脳及び脳下垂体において高濃度に達する。FGF2は、生理学的及び病理学的な多くのプロセスに関係していて、これらのプロセスには、四肢の発生、血管形成、創傷治癒及び腫瘍増殖が含まれる。FGF2は、例えば、Invitrogen-Gibco（Grand Island, New York）から商業的に入手され得る。
血小板由来増殖因子（PDGF）は、線維芽細胞、平滑筋及び結合組織を含む広範な細胞型についての強力な分裂促進物質である。PDGFは、A鎖及びB鎖と呼ばれる２本の鎖のダイマーから成り、AA又はBBのホモダイマーとして、又はABヘテロダイマーとして存在し得る。ヒトPDGF-ABは、13.3 kDaのA鎖及び12.2 kDaのB鎖から成る25.5 kDaのホモダイマータンパク質である。PDGF ABは、例えば、Peprotech（Rocky Hill, New Jersey）から商業的に入手され得る。
上皮増殖因子すなわちEGFは、受容体EGFRに結合することによって細胞成長、増殖及び分化の調節において重要な役割を果たす増殖因子である。ヒトEGFは、53アミノ酸残基及び3つの分子内ジスルフィド結合を有する6045 Daのタンパク質である。EGFは、高親和性で細胞表面上の上皮増殖因子受容体（EGFR）に結合することによって作用し、そして受容体の内因性のタンパク質−チロシンキナーゼ活性を刺激する。このチロシンキナーゼ活性は、シグナルトランスダクションカスケードを開始し、細胞内で種々の生化学的変化−細胞内カルシウムレベルの上昇、糖代謝の増大及びタンパク質合成、並びにEGFRの遺伝子を含む特定の遺伝子の発現の増大−をもたらし、最終的に、DNA合成及び細胞増殖に導く。EGFは、多くの製造業者から商業的に入手され得る。
増殖因子、例えばFGF2及び必要に応じてPDGF ABが、約100 pg/ml、例えば約500 pg/ml、例えば約1 ng/ml、例えば約2 ng/ml、例えば約3 ng/ml、例えば約4 ng/ml、例えば約5 ng/mlの濃度で培地中に存在し得る。幾つかの実施形態において、この培地は、約5 ng/mlでFGF2を含む。培地はまた、例えば約5 ng/mlで、PDGF ABも含み得る。
細胞の分割
培養物中の細胞は、一般に、接触阻害が細胞の分裂及び増殖を停止するコンフルーエントまで増殖し続ける。このような細胞は、次いで、基質又はフラスコから分離されて、「分割」され、組織培養培地中に希釈され、再プレート培養されることによって、継代培養されるか又は植え継がれ得る。
本書中に記載される方法及び組成物は、従って、培養中の継代又は分割を含み得る。細胞培養物中の細胞は、1:2以上、例えば1:3、例えば1:4、1:5又はそれ以上の分割比で、分割され得る。用語「継代」は、細胞株のコンフルーエント培養物を分取すること、新鮮な培地に植え付けること、そしてコンフルーエント又は飽和が得られるまでこの系統を培養することであるプロセスをいう。
選択、スクリーニング又は選別工程
この方法は、間葉系幹細胞の更なる単離又は選択のための、選択又は選別工程を更に含む。
この選択又は選別工程は、間葉系幹細胞（MSC）を細胞培養物から１つ以上の表面抗原マーカーの手段によって選択することを含み得る。選択又は選別工程の使用は、MSCに対する特異性を選別しそして選択する厳密性を更に増強し、そして更にhESCのような胚性幹細胞及び開始物質からの他のhESC誘導体からの夾雑物混入の可能性を低減し得る。次いで、この方法は、奇形腫形成の危険性を更に低減し、そして我々が記載したプロトコールの臨床的妥当性を更に増大する。
抗原発現に基づく選択又は選別についての多くの方法が公知であり、そしてこれらのいずれかが、本書中で記載の選択又は選別工程において使用され得る。選択又は選別は、蛍光活性化細胞選別（FACS）の手段によって達成され得る。従って、当該分野で公知のように、FACSは、レポーター、例えば細胞によって発現される抗原に結合しそして標識する標識抗体に細胞を曝露することを含む。抗体を産生しそして標識し、レポーターを形成する方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、Harlow and Laneにおいて記載される。次いで、細胞は、FACS機を通され、FACS機は、標識に基づいて細胞を互いに選別する。或いは、又は更に、磁気細胞選別（MACS）が、細胞を選別するために使用され得る。
我々は、多くの候補表面抗原、例えば、CD105、CD73、ANPEP、ITGA4（CD49d）、PDGFRAがMACSを補助することが知られているが、幾つかのMSC関連表面抗原、例えばCD29及びCD49eはまた、hESCのようなES細胞において高度に発現されていて、その発現は、FACS分析によって確かめられることを認識している。MSCとの表面抗原の関連性は、hESCのようなES細胞からMSCを単離するための選択可能マーカーとしてこれらの抗原を認めるには、充分ではない可能性がある。従って、選択又は選別工程は、MSCとES細胞との間で異なって発現される抗原を使用し得る。
我々の方法の選択又は選別工程は、間葉系幹細胞について、抗原の発現に基づいて明確に選択し得る。このような抗原は、例えば、hESCとhESCMSCとの遺伝子発現プロフィールを比較することによって、同定され得る。詳細な実施形態において、選択又は選別は、下の表E1A及びE1Bにおいて示される抗原のいずれかの使用を特異的に行い得る。
我々の方法の選択又は選別工程は、間葉系幹細胞について、MSCにおいて発現するがhESCのようなES細胞において発現しないことが同定されている抗原の発現に基づいてポジティブに選択し得る。
CD73は、MSCにおいて高度に発現されるが、hESCにおいては高度に発現されない。CD73及びCD105の両方は、MSCにおいて高度に発現される表面抗原であり、hESCに関連してhESC-MSCにおいて高度に発現する表面抗原の上位20種の中にあり、推定MSCの選択可能マーカーとしてのCD73及びCD105のいずれか（又は両方）の使用は、hESCの分化によって産生された推定MSCについての選別に同じように有効である。
或いは、又は更に、選択又は選別工程は、hESCのような胚性幹細胞（ES細胞）上の表面抗原として高度に発現するが間葉系幹細胞、例えばhESC-MSCにおいて高度に発現しない表面抗原に基づいて、抗原に対してネガティブに選択し得る。選択又は選別は、公知の又は以前に同定されたhESC特異的表面抗原、例えばMIBP、ITGB1BP3及びPODXL、並びにCD24に基づき得る。
FACS分析は、CD24のhESC上の発現は確認するが、hESC-MSC上の発現は確認しない。従って、CD24は、それ自体で、又は分化したhESC培養物からの推定MSCを単離するためのポジティブ選択可能マーカーであるCD105と一緒のいずれかで、ネガティブ選択又は選別のマーカーとして使用され得る。
出生前供給源由来の間葉系幹細胞
形質転換された間葉系幹細胞が製造される間葉系幹細胞は、出生前組織に由来し得る。出生前組織、例えば胎仔組織は、例えば、解剖、切り刻み又は洗浄、或いはこれらの任意の組み合わせによって処理され得る。
間葉系幹細胞は、このような出生前組織から、任意の好適な特性、例えば優先的接着に基づいて誘導され得る。例えば、間葉系幹細胞は、その基質への接着能力に基づいて選択され得る。この基質は、例えば、プラスチックを含み得る。従って、間葉系幹細胞は、出生前組織塊における間葉系幹細胞をプラスチックに接着させることによって、出生前組織から誘導され得る。この目的のために、組織は、１つ以上のプラスチック表面を有する容器に置かれ得る。このような容器は、培養容器、例えば、組織培養プレートを含み得る。この容器は、ゼラチン処理され得る。間葉系幹細胞は、組織塊から脱出可能とされ得る。これらは、容器の表面に接着させられ得る。出生前組織の残りは、例えば洗い流されることによって取り除かれ得る。従って、組織片の大半は、このように洗い流されることが可能であり、均質な細胞培養物が残る。
組織は、任意の好適な培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地中で培養され得る。培地は、任意の好適な補足物、例えば血清代替培地、EGF、FGF2などによって補強され得る。血清代替培地は、存在する場合、任意の好適な濃度、例えば10％で含まれ得る。EGFは、存在する場合、任意の好適な濃度、例えば5、10、15又は20 ng/mlで含まれ得る。FGF2は、存在する場合、任意の好適な濃度、例えば5、10、15又は20 ng/mlで含まれ得る。
出生前間葉系幹細胞を誘導するために使用され得る特定のプロトコールは、以下を含み得る。培養物は、無血清培養培地中又は血清含有培養培地中で培養され得る。コンフルーエントである場合、培養物は、例えば、トリプシン処理によって継代されて、ゼラチン処理した組織培養プレート上で、例えば1:4に分割されてもよい。無血清培養培地は、10％の血清代替培地、非必須アミノ酸、10 ng/ml FGF2、10 ng/ml 組換えヒトEGF及び55μM β-メルカプトエタノールで補強されたノックアウトDMEM培地で製造され得る。血清含有培養培地は、ペニシリン−ストレプトマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸及び10%ウシ胎仔血清で補強されたグルタミン非含有DMEM-高グルコースで製造され得る。代わりに、又は更に、EGF、PDGFが使用され得る。
培養物は、共培養物を含むか、又は共培養物非存在下で、例えばフィーダー細胞非存在下で確立され得る。この目的のために、間葉系幹細胞は、フィーダー細胞層無しで培養され得る。これは、以下で更に詳細に記載される。
間葉系幹細胞は、以下で更に詳細に記載されるように、必要に応じて間葉系幹細胞を他の細胞から細胞表面マーカーの発現に基づいて選択されることによって誘導され得る。細胞は、従って、必要に応じて、例えば、CD105（登録番号NM#000118.1）又はCD73（登録番号NM#002526.1）又はその両方の発現の上昇を検出することによって選択され得る。細胞は、必要に応じて、CD24（登録番号NM 013230.1）の発現の低下を検出することによって更に選択され得る。従って、間葉系幹細胞は、CD105+ CD24-である細胞について選択することによって得られ得る。間葉系幹細胞は、細胞を適切な表面抗原に対する抗体で標識することによって選択され得、そして蛍光活性化細胞選別（FACS）又は磁気細胞選別（MACS）によって選択され得る。
形質転換された間葉系幹細胞の特徴
本書中に記載される方法及び組成物によって得られた形質転換された間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞の１つ以上の特性又は特徴を示し得る。
これらは、間葉系幹細胞を同定するために通常使用される当該分野で公知の形態学的基準、表現型基準及び機能的基準のうち任意の１つ以上を満たし得る9。特性又は特徴は、The International Society for Cellular Therapyによって定義される通りであってもよい。詳細には、これらは、Dominici et al (2006)に示される１つ以上の特徴を示し得る。
形態学
本書中に記載された方法及び組成物によって得られた形質転換された間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞の１つ以上の形態学的特徴を示し得る。
本書中に記載された方法及び組成物によって得られた形質転換された間葉系幹細胞は、コンフルーエントにおいて代表的な指紋渦巻きを示し得る。
得られた形質転換された間葉系幹細胞は、線維芽細胞表現型を有する接着性単層を形成し得る。形質転換された間葉系幹細胞は、プラスチックに接着可能であり得る。
これらは、72〜96時間の平均集団倍加時間を有し得る。最適な培養物は、25%〜85%のコンフルーエント又は1 cm2あたり15,000〜50,000細胞であり得る。
抗原プロフィール
更に、得られた形質転換された間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞と類似の又は同じ表面抗原プロフィールを示し得る。
本書中に記載された方法及び組成物によって得られた形質転換された間葉系幹細胞は、１種以上の多能性マーカー、例えばOct-4、SSEA-4及びTRa1-60の、例えばポリペプチドレベルにおける発現を欠くか、又は発現の低下を示し得る。これらは、OCT4及びSOX2のうちの１つ又は両方の転写発現を示すが、hES3ヒトESCのような胚性幹細胞と比較して減少したレベルを示す。この発現レベルは、胚性幹細胞と比較して、２分の１以下、５分の１以下、１０分の１以下又はそれより低い。
得られた形質転換された間葉系幹細胞は、「代表的な」MSC様表面抗原プロフィールを示し得る。これらは、例えば、間葉系幹細胞に関連する１つ以上のマーカーの発現を示し得る。これらは、以下の任意の１つ以上の発現を含み得る：CD29、CD44、CD49a、CD49e、CD105、CD166、MHC I。形質転換された間葉系幹細胞は、例えば、発現の非存在が間葉系幹細胞に関連する任意の１つ以上のマーカーの発現の低下又は非存在を示し得る。従って、形質転換された間葉系幹細胞は、HLA-DR、CD34及びCD45の任意の１つ以上の発現の低下又は欠失を示し得る。形質転換された間葉系幹細胞は、詳細には、CD29+、CD44+、CD49a+ CD49e+、CD105+、CD166+、MHC I+、CD34-及びCD45-細胞を含み得る。
形質転換された間葉系幹細胞は、マウス特異的c-mos反復配列についてネガティブであり、そしてヒト特異的alu反復配列についてポジティブであり得る。骨形成、脂肪形成又は軟骨形成の任意の１つ以上が起こり得、詳細には、骨細胞、脂肪細胞又は軟骨細胞の任意の１つ以上に分化することが可能である。
分化能
得られた形質転換された間葉系幹細胞は、当該分野で公知且つ下に記載される方法を用いて、任意の間葉系系統に分化し得る。従って、本書中に記載された方法及び組成物によって得られた形質転換された間葉系幹細胞は、脂肪形成、軟骨形成及び骨形成を含む分化能を示し得る9。
増殖能力
記載の通りに得られた形質転換された間葉系幹細胞は、インビトロで実質的な増殖能力を有し得る。幾つかの実施形態において、得られた形質転換された間葉系幹細胞は、正常な二倍体核型を維持しながら、少なくとも10回の集団倍加を行い得る。形質転換された間葉系幹細胞は、正常な二倍体核型を維持しながら、少なくとも20〜30回の集団倍加を行い得る。幾つかの実施形態において、形質転換された間葉系幹細胞は、その間に安定的な遺伝子発現プロフィール及び表面抗原プロフィールを示す。
得られた形質転換された間葉系幹細胞は、染色体異常及び／又は遺伝子発現の変更のようないかなる欠損を示さないものであり得る。幾つかの実施形態において、このような欠損は、10回の継代後、例えば13回の継代後、例えば15回の継代後までは、明確でない。
均質性
得られた形質転換された間葉系幹細胞は、高度な均一性を示し得る。言い換えると、異なる供給源から得られた形質転換された間葉系幹細胞は、１つ以上、例えば複数の、互いに共有する均一な又は別個の特徴を示し得る。
これらは、１つ以上の、例えば複数の、他の間葉系幹細胞、例えばヒト胚性幹細胞由来間葉系幹細胞（hESC-MSC）と共有する、例えばWO2007/027157又はWO2007/027156に記載されるような、均一な又は別個の特徴を示し得る。
本書中に記載された方法及び組成物によって産生された形質転換された間葉系幹細胞は、天然において類似であるか又は同一（例えば、同質）であり得る。すなわち、プロトコールによって単離された形質転換された間葉系幹細胞クローンは、表現型又は他において、互いに高度な類似性又は同一性を示し得る。
類似性又は同一性は、多くの方法によって計られることが可能であり、そして１つ以上の特徴によって測定され得る。例えば、クローンは、遺伝子発現において類似であるか又は同一であってもよい。例えば、形質転換された間葉系幹細胞は、この方法によって産生された間葉系幹細胞であって、実質的に類似又は同一の遺伝子発現プロフィール、すなわち、発現される遺伝子の同定とこれらが発現されるレベルの同定との組み合わせを示す任意の２種以上、例えば全てであってもよい。
この方法によって得られた形質転換された間葉系幹細胞の任意の２種以上の単離物の間の遺伝子発現相関係数は、0.8より高くても、例えば、0.85又は0.9より高くてもよい。この方法によって得られた形質転換された間葉系幹細胞の任意の２つ以上の異なる継代、例えば連続する継代の間の遺伝子発現相関係数は、0.8より高くても、例えば、0.85又は0.9より高くてもよい。この方法によって得られた形質転換された間葉系幹細胞とhESC-MSC、例えばWO2007/027157又はWO2007/027156に記載されるものとの間の遺伝子発現相関係数は、0.8より高くても、例えば、0.85又は0.9より高くてもよい。
遺伝子発現の同質性は、多くの方法によって測定され得る。ゲノムワイドな遺伝子プロファイリングは、例えば、実施例で記載のように抽出されたRNAのアレイハイブリダイゼーションを用いて行われ得る。総RNAが抽出されて、cDNAに変換され、これが、対応するゲノム由来の複数の遺伝子配列を含むアレイチップにハイブリダイズされる。アレイは、National Center for Biotechnology Information（NCBI）スタッフ及び協力者によって今も検証され、アノテーションされ、そしてキュレーションされている十分に特徴づけされたNCBI参照配列（RefSeq）遺伝子を含み得る。
次いで、サンプル間の遺伝子発現は、分析ソフトウェアを用いて比較され得る。１つの実施形態において、遺伝子発現の類似性又は同一性は、「相関係数」として表現され得る。このような尺度において、２つのサンプル間の高い相関係数は、２つのサンプルにおける遺伝子発現のパターンの間の高度な類似性を示す。反対に、２つのサンプル間の低い相関係数は、２つのサンプルにおける遺伝子発現のパターンの間の類似性が低いことを示す。標準化が行われ得、系統的な変動又は偏り（強度の偏り、空間的偏り、プレートの偏り及びバックグラウンドの偏りを含む）がデータ分析の前に排除され得る。
相関試験は、当該分野で公知であり、例えばHill, T. & Lewicki, P. (2006). Statistics: Methods and Applications. StatSoft, Tulsa, OK, ISBN: 1884233597（StatSoft, Inc. (2006). Electronic Statistics Textbook. Tulsa, OK: StatSoft. WEB: http://www.statsoft.com/textbook/stathome.html）に記載のT検定及びピアソン検定を含む。Khojasteh et al., 2005, A stepwise framework for the normalization of array CGH data, BMC Bioinformatics 2005, 6:274を参照されたい。クラス内相関係数（ICC）もまた、Khojasteh et al, 前出のように行われ得る。
例えば、ピアソン検定が行われて、ピアソン相関係数を算出し得る。1.0の相関係数は、同一の遺伝子発現パターンを示す。
このような目的で、cDNAは、Sentrix HumanRef-8 Expression BeadChipにハイブリダイズさせられて、Illumina BeadStation 500xを用いて走査され得る。データは、Illumina BeadStudio（Illumina, Inc, San Diego, CA, USA）を用いて抽出され、標準化され、そして分析され得る。しかし、遺伝子発現プロフィールの類似性をアッセイするために任意の好適なチップ及び走査ハードウェア及び（相関測定を出力する）ソフトウェアが使用され得ることは、読者にとって明らかである。
例えば上述の手段によって測定された場合、任意の２つの単離物の間の遺伝子発現相関係数は、0.65以上であり得る。遺伝子発現相関係数は、0.70以上、例えば0.80以上、例えば0.85以上、例えば0.90以上であり得る。この係数は、0.91以上、0.92以上、0.93以上、0.94以上、0.95以上、0.96以上、0.97以上、0.98以上、0.99以上、又は1.0であり得る。
幾つかの実施形態において、本書中に記載の方法は、このようにして得られた形質転換された間葉系幹細胞の任意の２つ以上の単離物の間の遺伝子発現相関係数が、同じRNAサンプル間の技術的複製物の間の一定時間、例えば１ヶ月間あけて実施された相関係数とおよそ同じであるか、又はこれより僅かに少ない、形質転換された間葉系幹細胞を産生する。例えば、形質転換された間葉系幹細胞の任意の２つ以上の単離物の間の遺伝子発現相関係数は、0.70以上、例えば0.80以上、例えば0.85以上、例えば0.90以上であってもよい。相関係数は、0.91以上、0.92以上、0.93以上、0.94以上、0.95以上、0.96以上、0.97以上、0.98以上、0.99以上又は1.0であってもよい。
遺伝子発現相関係数は、上述の誘導、選択又は選別手順を受けている細胞について、このような範囲であり得る。多くの単離物、例えば全ての単離物の間の遺伝子発現相関係数は、このような範囲であり得る。
従って、我々は、互いに実質的に類似するか又は同じ（例えば、同質）である、形質転換された間葉系幹細胞を産生する方法を提供する。単離物は、ほぼ同一な遺伝子発現プロフィールを示し得る。
上述の「内的」同質性（すなわち、本方法由来の形質転換された間葉系幹細胞の単離物間の同質性）と同じく、同質性は、このような単離物と他の細胞又は細胞型との間でも評価され得る。詳細には、比較は、他の方法によって誘導された間葉系幹細胞、例えばヒトESC-MSC培養物（例えば、WO2007/027157又はWO2007/027156に記載されるもの）と行われ得る。従って、幾つかの実施形態において、本書中に記載される方法及び組成物によって得られる形質転換された間葉系幹細胞は、例えばヒトESC-MSC培養物に類似の、同質の、又は同一の遺伝子発現プロフィールを示す。従って、得られた形質転換された間葉系幹細胞は、例えばヒトESC-MSC培養物（例えば、WO2007/027157又はWO2007/027156に記載されるもの）に対して、0.5より高い、例えば0.6より高い、例えば0.7より高い、例えば0.8より高い、例えば0.9より高い遺伝子発現の相関係数を示し得る。
テロメラーゼ活性
このように誘導された形質転換された間葉系幹細胞は、テロメラーゼ活性を含み得る。テロメラーゼ活性は、間葉系幹細胞ではない細胞のような対照細胞と比較して、上昇しているか、又は上方調節されていてもよい。例えば、対照細胞は、分化した細胞、例えば間葉系系統に分化した細胞、例えば骨細胞、脂肪細胞又は軟骨細胞を含み得る。
テロメラーゼ活性は、当該分野で公知の手段によって、例えば、TRAP活性アッセイ（Kim et al., Science 266:2011, 1997）を用いるか、市販のキット（TRAPeze.RTM. XK Telomerase Detection Kit, Cat. s7707; Intergen Co., Purchase N.Y.;又はTeloTAGGG.TM. Telomerase PCR ELISA plus, Cat. 2,013,89; Roche Diagnostics, Indianapolis）を用いるかによって、決定され得る。hTERT発現は、RT-PCRによるmRNAレベルにおいて評価し得る。LightCycler TeloTAGGG.TM. hTERT定量化キット（Cat. 3,012,344; Roche Diagnostics）は、研究目的のために市販されている。
例えば、相対的テロメラーゼ活性は、リアルタイム定量的テロメア反復増幅プロトコールによって測定され得る。このqPCRベースのアッセイは、サンプル中に存在するテロメラーゼ活性によって、インビトロで産生された産物を定量化する。テロメラーゼ産物の量と直接的に比例する相対的テロメラーゼ活性は、タンパク質細胞溶解物1μgあたりの閾値サイクル数（すなわちCt値）によって評価され得る。Hues9.E1は、以前に記載されたhESC-MSC系統をいい、HEKは、ヒト胚性腎細胞株である。各胎仔MSCについてのCt値は、多数の継代、例えば、2回、3回、4回などの継代についての平均値を取ってもよい。継代は、例えば、3回の継代、例えばP16、P18及びP20を含み得る。対照細胞、例えばHues9.E1について、平均値は、2回の継代、例えばP20及びP22についての平均値である。アッセイは、各継代について、多数回、例えば3回実施され得る。
テロメラーゼ検出方法の特定の例は、実施例において提供される。
本書中に記載の方法によって誘導される間葉系幹細胞は、このような方法によってアッセイされた25以上、例えば26以上又は27以上のCt値を有する。Ct値は、例えば、28以上、29以上、30以上、31以上又は32以上であってもよい。
自己再生の維持
形質転換された間葉系幹細胞は、自己再生を維持出来得る。
形質転換された間葉系幹細胞及び細胞株（又はこれらに由来する分化細胞）は、胚性幹細胞の１つ以上の特徴を示さないものであってもよい。このような特徴は、OCT4遺伝子、SSEA-4遺伝子、Tra1-60遺伝子の発現及びアルカリホスファターゼ活性を含み得る。間葉系幹細胞は、多能性の１種以上の特徴マーカーの発現の低下を示し得る。このような多能性マーカーは、Nanog、BMP4、FGF5、Oct4、Sox-2及びUtf1などを含み得る。
本書中で記載された方法によって製造された形質転換された間葉系幹細胞は、非腫瘍原生であっても、非催奇性であっても、又はその両方であってもよい。
従って、形質転換された間葉系幹細胞は、レシピエント動物に移植した場合に、奇形腫の形成を実質的に誘導しないものであり得る。形質転換された間葉系幹細胞は、免疫無防備状態又は免疫不全の宿主動物に移植した場合に、腫瘍を生じないものであり得る。
レシピエント動物は、免疫無防備状態レシピエント動物を含み得る。免疫無防備状態又は免疫不全の宿主動物は、SCIDマウス又はRag1 -/-マウスを含み得る。細胞は、形質転換された間葉系幹細胞が移植されるレシピエント動物が、好適な期間、例えば移植後3週間、又は2〜9ヶ月に亘って、奇形腫形成を示さないものであってもよい。形質転換された間葉系幹細胞は、移植後長期間、例えば2週間より長く、例えば2ヶ月より長く、例えば9ヶ月より長く、腫瘍を形成しないものであってもよい。
催腫瘍性試験のための詳細なプロトコールは、以下である。
1 x 106個の胚性幹細胞が、SCIDマウスに皮下移植される。胚性幹細胞由来腫瘍が約1 cm径となる3週間目に、Qtracker（登録商標）Cell Labeling Kit（Quantum Dot Corp, Hay ward, CA）を用いてQdot（登録商標）ナノ結晶（655 nm発光）で標識された形質転換された間葉系幹細胞が、胚性幹細胞由来奇形腫内に注射される。
３日後、マウスを、過剰量の麻酔で安楽死させて、腫瘍を除去する。腫瘍は、4%のパラホルムアルデヒドで固定し、そして20μm厚で凍結切片にする。切片を、ラット抗pecam1（Pharmingen, San Diego, California）を用い、その後FITC結合体化ウサギ抗ラット抗体（Chemicon, Temecula, California）を用い、DAPIで対比染色して、pecam-1免疫応答性についてアッセイする。切片は、共焦点顕微鏡によって分析する。
本書中に記載される方法によって作られた形質転換された間葉系幹細胞はまた、以下の特徴の１つ以上を示す。形質転換された間葉系幹細胞は、長期間、例えば40世代よりも長くに亘って細胞培養物中で維持可能であり得る。これらは、染色体数によって評価した場合に実質的に安定的な核型を有し得、例えば、細胞培養中で少なくとも10世代に亘って維持される。これらはまた、実質的に安定的な遺伝子発現パターンを、何世代にも亘って示し得る。これにより、我々は、選択された遺伝子のセットの１つ以上、例えば実質的に全ての発現レベルは、1世代における形質転換された間葉系幹細胞と次世代の形質転換された間葉系幹細胞との間で有意に変動しないことを意味する。
遺伝子のセットは、以下の１つ以上、サブセット、又は全てを含み得る：ケルベロス(GenBank登録番号：NM#009887、AF031896、AF035579)、FABP（GenBank登録番号：NM#007980、M65034、AY523818、AY523819）、Foxa2（GenBank登録番号：NM#010446、X74937、L10409）、Gata-1（GenBank登録番号：NM#008089、X15763、BC052653）、Gata-4（GenBank登録番号：NM#008092、AF179424、U85046、M98339、AB075549）、Hesx1（GenBank登録番号：NM#010420、X80040、U40720、AK082831）、HNF4a（GenBank登録番号：NM#008261、D29015、BC039220）、c-kit（GenBank登録番号：NM#021099、Y00864、AY536430、BC075716、AK047010、BC026713、BC052457、AK046795）、PDGFRa（NM#011058、M57683、M84607、BC053036）、Oct4（GenBank登録番号：NM#013633、X52437、M34381、BC068268）、Runx1（GenBank登録番号：NM#009821、D26532、BC069929、AK051758）、Sox17（GenBank登録番号：NM#011441、D49474、L29085、AK004781）、Sox2（GenBank登録番号：NM#011443、U31967、AB108673）、Brachyury（NM#009309、X51683）、TDGF1（GenBank登録番号：NM#011562、M87321）及びTie-2（GenBank登録番号：NM#013690、X67553、X71426、D13738、BC050824）。
本書中で記載される方法は、形質転換された間葉系幹細胞及び分化した細胞の産生を、形質転換された間葉系幹細胞のクローン子孫細胞を含めて、可能にする。用語、細胞の「クローン子孫」細胞は、実質的に何ら形質転換処理又は遺伝子改変を受けていない細胞の子孫をいう。実質的な遺伝子変化を受けていないこのようなクローン子孫細胞は、親細胞又は先祖細胞、例えば形質転換された間葉系幹細胞と実質的に遺伝的に同一である。用語「形質転換された間葉系幹細胞」は、形質転換された間葉系幹細胞に由来する細胞株、すなわち形質転換された間葉系幹細胞株を含むと理解されるべきであり、逆もまた然りである。
培養物中での長期的維持
形質転換された間葉系幹細胞又はその子孫細胞は、1世代より多く培養され得る。
例えば、細胞は、5世代より多く、10世代より多く、15世代より多く、20世代より多く、25世代より多く、50世代より多く、40世代より多く、45世代より多く、50世代より多く、100世代より多く、200世代より多く、500世代より多く、又は800世代より多く培養され得る。詳細には、細胞株は、1世代、2世代、3世代、4世代、5世代、6世代、7世代、8世代、9世代、10世代、11世代、12世代、13世代、14世代、15世代、20世代、25世代、30世代、35世代、40世代、45世代、50世代、75世代、100世代、200世代、500世代又はより多くの世代に亘って維持され得る。
培養物中の細胞は、一般に、接触阻害が細胞分裂及び増殖を停止させるコンフルーエントまで増殖する。次いで、このような細胞は、基質又はフラスコから分離され、そして、組織培養培地中への希釈によって再プレート培養され、「分割」されるか又は継代され得る。培養された細胞は、従って、培養の間に継代され得るか、又は分割され得る。これらは、1:2以上、例えば、1:3、1:4、1:5以上で分割され得る。用語「継代」は、細胞株のコンフルーエント培養物を分取すること、新鮮な培地に植え付けること、そしてコンフルーエント又は飽和が得られるまでこの系統を培養することであるプロセスをいう。
本書中に記載される方法によって誘導された形質転換された間葉系幹細胞は、しかし、何代もの世代に亘って維持され得る。他方で、生物から直接誘導される「通常の」細胞（すなわち、非形質転換体細胞）は、不死ではないことが確立されている。言い換えると、このような体細胞は、培養物中において限られた寿命を有する（致死性である）。これらは、無限に増殖し続けず、一定の数の世代後、最終的に、増殖する能力又は分裂する能力を失う。このような細胞は、約50世代後に、「危機段階」に達して死ぬ。従って、このような体細胞は、限定された回数だけ継代し得る。
本書中に記載される方法に従って、形質転換された間葉系幹細胞は、50世代を超えて増殖し得る。幾つかの実施形態において、形質転換された間葉系幹細胞は、形質転換された間葉系幹細胞株のように、無限に増殖し得る。形質転換された間葉系幹細胞及び形質転換された間葉系幹細胞株は、制限された系統であり得る。詳細には、これらは、三胚葉全てになる能力はない。幾つかの実施形態において、形質転換された間葉系幹細胞株は、非多能性であってもよい。
我々は、複数の細胞を含む組成物を更に提供し、ここで、この細胞の大部分は、間葉系幹細胞である。例えば、少なくとも細胞の60%が間葉系幹細胞を含み得る。更に、我々は、単離された間葉系幹細胞を提供する。細胞株の用語は、培養物中で維持され得そして増殖され得て、且つ不死又は無限の寿命を示し得る細胞をいうと理解され得る。
心臓保護能力
このように誘導された形質転換された間葉系幹細胞又はこのような細胞によって馴化された培地は、実施例に記載されるように、心臓保護活性を含み得る。心臓保護は、虚血及び／又は再潅流の間の心臓機能の回復及び維持を含み得る。
心臓保護は、任意の好適なモデル系、例えば急性心筋梗塞（AMI）のマウスモデルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイにおいて、AMIは、Salto-Tellez M, Yung Lim S, El-Oakley RM, Tang TP, ZA AL, et al. (2004)、Myocardial infarction in the C57BL/6J mouse: a quantifiable and highly reproducible experimental model. Cardiovasc Pathol 13: 91- 97において記載される通り、マウスにおいて、左冠状動脈前下行枝の持続的な結紮によって誘導される。
100μlの10×濃縮馴化培地又は非馴化培地（対照）を、上述のように作り、次いで、頸静脈に配置された浸透圧ポンプを介して、次の72時間に亘ってマウスに投与される。これらのマウスの心臓機能は、3週間後にMRIによって評価される。
心臓保護はまた、心筋虚血／再潅流（MI/R）障害のブタ／マウスモデルを評価することによってもアッセイされ得る（Timmers L, Lim S-K, Arslan F, et al. Reduction of myocardial infarct size by human mesenchymal stem cell conditioned medium. Stem Cell Research. 2008;1 : 129-137）。このアッセイにおいて、障害は、ブタにおける一時的な左回旋枝の閉塞又はマウスにおけるLADの閉塞によって誘発され、その後、閉塞を除去して、再潅流を開始させる。
上述の心臓保護アッセイはまた、特に慢性虚血における心臓保護について試験するためにも使用され得る。これ及び他のMI/R障害モデルは、異なる臨床的指標において心臓保護を評価する必要がある。
このように誘導された形質転換された間葉系幹細胞若しくはこのような細胞によって馴化された培地又はそこから単離された粒子は、再灌流傷害を緩和出来得る。これは、WO2008/020815に記載のように、虚血−再潅流のブタモデルを用いてアッセイされ得る。
間葉系幹細胞（形質転換された間葉系幹細胞を含む）馴化培地の心臓保護能力をアッセイするための簡潔なプロトコールは、以下である。MIは、縫合で動脈を結紮することによる左冠状動脈（LCA）の30分間の閉塞によって誘導され得る。その後の再潅流は、縫合を解くことによって開始され得る。再潅流の5分前に、マウスは、Hues9.E1（hESC-MSC）CMの3μgのタンパク質又は胎仔MSC CMの150μgタンパク質を含む200μlの生理食塩水希釈馴化培地を、尾静脈から静脈内注入されてもよい。対照動物は、200μlの生理食塩水を注入され得る。再潅流の24時間後、危険領域（AAR）の百分率としての梗塞サイズ（IS）を、上記した参考文献26のようにエバンスブルー色素注射及びTTC染色を用いて評価し得る。
簡潔には、分析のための心臓の切除の直前に、LCAは、虚血の誘発においてと同じく再結紮され得、エバンスブルー色素は、動脈内に注入され得、そしてAARは、エバンスブルー色素で染色されなかった動脈によって定義され得る。次いで、心臓は、切除され、そして心臓の断面は、TTCで染色され得る。生存可能な心筋は、TTCによって赤く染色され、生存不能な心筋は染まらない。相対梗塞サイズは、TTCによって染まらない生存不能な心筋の領域として、エバンスブルー色素によって染色されない領域によって定義されるAAR危険領域に関連して測定され得る。
梗塞サイズ
このようにして誘導された形質転換された間葉系幹細胞又はこのような細胞によって馴化された培地は、梗塞サイズを縮小する能力を有し得る。梗塞サイズは、非馴化培地又は生理食塩水で処理された動物と比較して、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上又は70%以上縮小し得る。
梗塞サイズについてのアッセイ
梗塞サイズは、例えば、以下の方法を用いてアッセイされ得る。
心臓の切除直前に、LCxCA（ブタ）又はLCA（マウス）は、MIの誘発と正確に同じ場所で結紮される。エバンスブルー色素は、冠状系を介して注入されて、危険領域（AAR）を描き出す。
次いで、心臓は、切除され、LVは、単離されて、頂部から基部まで5枚の切片に切断される。切片は、1%の塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC、Sigma-Aldrich Chemicals, Zwijndrecht, the Netherlands）中、37℃のゼーレンセン緩衝液（13.6 g/L KH2P04 + 17.8 g/L Na2HPO4・2H2O, pH 7.4）において15分間インキュベートされる、生存可能な心筋から梗塞組織を識別する。
全ての切片は、両側から走査され、それぞれのスライドについて、梗塞領域は、digital planimetry software（Image J）を用いて、危険領域及び総領域と比較される。切片の重量についての校正の後、梗塞サイズは、AAR及びLVの百分率として計算される。
酸化ストレス
本書中で記載される方法によって産生される形質転換された間葉系幹細胞は、酸化ストレスを軽減出来得る。
酸化ストレスは、非馴化培地又は生理食塩水で処理された動物と比較して、10%以上、20%以上、25%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上又は70%以上軽減され得る。
酸化ストレスの軽減は、過酸化水素（H2O2）誘導性細胞死のインビトロアッセイにおいてアッセイされ得る。
酸化ストレスについてのアッセイ
酸化ストレスの軽減は、例えば、過酸化水素（H2O2）誘導性細胞死のインビトロアッセイを用いてアッセイされ得る。まとめると、過酸化水素（H2O2）誘導性細胞死は、ヒト白血病CEM細胞において誘導され、そして細胞生存率は、トリパンブルー色素排除によってモニタリングされる。ヒト白血病CEM細胞は、馴化培地又は形質転換された幹細胞と共に（対照として生理食塩水と共に）インキュベートされ、そして50μM H2O2で処理されて、酸化ストレスを誘発する。細胞生存率は、トリパンブルー色素排除を用いて、H2O2処理の12時間、24時間、36時間及び48時間後に評価される。
酸化ストレスの軽減は、DNA酸化のインビボアッセイを用いてさらにアッセイされ得る。インビボ酸化ストレスはまた、以下のようにもアッセイされ得る。ブタは、粒子、馴化培地又は形質転換された間葉系幹細胞で（対照として生理食塩水で）処理される。ブタ心臓の組織切片を、得る。処理したブタ及び処理しないブタの組織切片中の核酸化ストレスは、酸化DNAについての8-OHdG免疫染色によって定量化される。組織切片は、DNA酸化及び酸化ストレスの指標である強い核染色についてアッセイされる。
用途
本書中に記載の方法に従って作られた形質転換された間葉系幹細胞及び分化した細胞は、種々の商業的に重要な研究、診断及び治療目的で使用され得る。これらの用途は、一般に、当該分野で周知であるが、個々で簡潔に記載する。
間葉系幹細胞及び分化した細胞集団は、再生医療のために使用され得る。間葉系幹細胞、例えば形質転換された間葉系幹細胞及びそこから作られた分化した細胞は、エキソビボ拡大によって作られ得るか、又は患者に直接投与され得る。これらはまた、外傷後の損傷組織の再増殖のためにも使用され得る。
従って、脂肪細胞又はそれ由来であり得る脂肪組織は、再建又は形成手術の間、腔又は凹みを埋めるために使用され得る。軟骨細胞は、軟骨修復のために使用され得、骨細胞は、骨修復のために使用され得る。本書中に記載される方法及び組成物によって作られた形質転換された間葉系幹細胞は、任意のこれらの細胞型に分化され得、記載の目的のために使用され得る。
本書中に記載される方法及び組成物は、以下のいずれか１つの処置のための分化した細胞の製造のために使用され得るか、又はその処置のための薬学的組成物の調製のために使用され得る：再生医療によって処置可能な疾患、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病及び癌のような変性疾患。
本書中で記載される方法及び組成物によって産生される形質転換された間葉系幹細胞及び分化した細胞は、疾患の処置のために使用され得るか、又は疾患の処置のための薬学的組成物の調製のために使用され得る。このような疾患は、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病などのような変性疾患及び癌を含む再生医療によって処置可能な疾患を含み得る。
幹細胞は、例えば、間葉系幹細胞の供給源として使用され得るか或いは癌のための免疫治療のためのNK細胞又は樹状細胞に分化した細胞の供給源として使用され得、間葉系幹細胞及び分化した細胞は、本書中に記載される方法及び組成物によって作られる。
本書中に記載される方法及び組成物は、形質転換された間葉系幹細胞の産生を可能にし、この形質転換された間葉系幹細胞は、無論、当該分野で公知の方法を用いて分化され得ることは、明らかである。従って、分化した細胞の任意の用途は、供給源とする形質転換された間葉系幹細胞に同様に付属している。
分化した細胞
分化した細胞、例えば、最終分化した細胞は、記載された方法に従って作られた形質転換された間葉系幹細胞又は細胞株に由来し得る。我々は、従って、分化した細胞を産生するための方法を記載し、この方法は、記載の通りの形質転換された間葉系幹細胞又は細胞株を産生すること、及びこれらから分化した細胞を誘導することを含む。本書中で記載される方法及び組成物によって作られる形質転換された間葉系幹細胞は、これらの細胞型のいずれかに分化し得、記載の目的のために使用され得る。
本書中で記載される方法に従って作られ得る分化した細胞は、以下のいずれか又は全てを含み得る。
i）脂肪細胞：脂肪又は脂肪組織の機能的細胞型であり、身体中、特に皮膚の下で見出される。脂肪細胞は、エネルギー、熱調節及び機械的衝撃に対する緩衝作用のために、脂肪を蓄え、そして合成する。
ii）心筋細胞：心臓の機能的筋細胞型であり、継続的に且つ律動的に拍動させる。
iii）軟骨細胞：関節の軟骨、外耳道、気管、口頭蓋、咽頭、椎間板及び肋骨の先端を作る機能的細胞型
iv）線維芽細胞：身体の殆どの組織で見出される結合細胞又は支持細胞。線維芽細胞は、特定の器官の機能的細胞型が正確に働くのを助ける指導的な支持足場を提供する。
v）肝細胞：肝臓の機能的細胞型であり、代謝廃棄物の解毒、赤血球の破壊及びその構成物の回収、並びに血漿のためのタンパク質の合成のための酵素を製造する。
vi）造血細胞：血液を作る機能的細胞型。造血細胞は、成体の骨髄内に見出される。胎仔においては、造血細胞は、肝臓、脾臓、骨髄及び子宮内の胎仔を囲む支持組織において見出される。
vii）筋細胞：筋肉の機能的細胞型。
viii）神経細胞：脳の機能的細胞型であり、活動電位を導くことに特化している。
ix）骨細胞：骨を作ることを担う機能的細胞型。
x）膵島細胞：膵臓の機能的細胞であり、インスリン、グルカゴン、ガストリン及びソマトスタチンの分泌を担う。また、これらの分子は、炭水化物及び脂肪の代謝、血糖値及び胃内での酸分泌を含む多くのプロセスを調節する。
形質転換された間葉系幹細胞及び分化した細胞の用途
本書中に記載の方法及び組成物に従って作られた形質転換された間葉系幹細胞及び分化した細胞は、種々の商業的に重要な研究、診断及び治療目的で使用され得る。
例えば、分化した細胞の集団が、分化した表現型に特異的な抗体及びcDNAライブラリーを調製するために使用され得る。抗体を惹起し、精製しそして修飾することにおいての一般的な技術並びにイムノアッセイ及び免疫隔離方法におけるその用途は、Handbook of Experimental Immunology（Weir & Blackwell, eds.）；Current Protocols in Immunology（Coligan et al., eds.）；及びMethods of Immunological Analysis（Masseyeff et al., eds., Weinheim: VCH Verlags GmbH）に記載されている。mRNA及びcDNAライブラリーの調製に関わる一般的技術は、RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization（R. E. Farrell, Academic Press, 1998）；cDNA Library Protocols（Cowell & Austin, eds., Humana Press）；及びFunctional Genomics（Hunt & Livesey, eds., 2000）に記載されている。比較的同質な細胞集団が、薬物スクリーニング及び治療適用における使用のために、特に適している。
形質転換された間葉系幹細胞及び分化した細胞のこれら及び他の用途は、下及び本書中の他所に更に詳細に記載される。形質転換された間葉系幹細胞及び分化した細胞は、詳細には、疾患の処置のための薬学的組成物の調製のために使用され得る。このような疾患は、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病などの変性疾患、及び癌を含む、再生医療によって処置可能な疾患を含み得る。
本書中に記載される方法及び組成物によって作られる形質転換された間葉系幹細胞は、ヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞（hESC-MSC）の特性、例えばWO2007/027157又はWO2007/027156に記載されるものと類似であるか又は同一の特性を有する。従って、形質転換された間葉系幹細胞及びこれらから作られる任意の分化した細胞は、hESC-間葉系幹細胞などの間葉系幹細胞が使用されることが公知であるか、使用される可能性がある任意の用途において使用され得る。
薬物スクリーニング
本書中に記載される方法及び組成物に従って作られた形質転換された間葉系幹細胞及び分化した細胞はまた、形質転換された間葉系幹細胞又は分化した細胞の特徴に影響する因子（例えば、溶媒、低分子薬物、ペプチド、ポリヌクレオチドなど）及び環境条件（例えば、培養条件又は操作）についてスクリーニングするために使用され得る。
幾つかの適用において、形質転換された間葉系幹細胞及び分化した細胞は、成熟を促進する因子又はこのような細胞の長期培養物における増殖及び維持を促進する因子をスクリーニングするために使用される。例えば、候補成熟因子又は増殖因子は、これらを、別々のウェル内の形質転換された間葉系幹細胞又は分化した細胞に加え、次いで、更なる培養及び細胞の使用のための所望される基準に従って、もたらされた何らかの表現型の変化を決定することによって試験される。
更に、形質転換された間葉系幹細胞及び分化した細胞の遺伝子発現プロフィールは、これらの細胞において特有であるか高度に発現される受容体、転写因子及びシグナル伝達分子を同定するために使用され得る。受容体、転写因子及びシグナル伝達分子についての特定のリガンド、低分子インヒビター又はアクチベーターは、形質転換された間葉系幹細胞及び分化した細胞の分化及び特性を調節するために使用され得る。
特定のスクリーニング適用は、薬物研究における薬学的化合物の試験に関連する。読者は、一般に、標準的教本 'In vitro Methods in Pharmaceutical Research', Academic Press, 1997及び米国特許第5,030,015号）並びに本書中の他所のおける薬物スクリーニングの一般的記載を参照されたい。候補薬学的化合物の活性の評価は、一般に、分化した細胞と候補化合物とを合わせ、化合物に起因し得る細胞の形態学、マーカー表現型又は代謝活性における（無処理の細胞又は不活性化合物で処理された細胞と比較した）何らかの変化を決定すること、次いで、変化が観察された化合物の効果を相関させることを含む。
スクリーニングは、例えば、この化合物が特定の細胞型に対する薬理学的効果を有するように設計されているか、又はどこかに効果を有するように設計されている化合物が意図しない副作用を有するかのいずれかであるために、行われ得る。２種以上の薬物が、考えられる薬物−薬物相互作用効果を検出するために、（細胞と同時に又は順に合わせることによって）組み合わせて試験され得る。幾つかの適用において、化合物は、最初に、毒性の可能性についてスクリーニングされる（Castell et al., pp. 375-410 in 'In vitro Methods in Pharmaceutical Research,' Academic Press, 1997）。細胞毒性は、最初の例において決定され得、細胞生存能力、生存、形態学並びに特定のマーカー、受容体又は酵素の発現及び放出における影響によって決定され得る。染色体DNAにおける薬物の効果は、DNA合成又は修復を測定することによって決定され得る。特に細胞周期における不定期な時期において、又は細胞複製に必要なレベルを超える[3H]チミジン又はBrdUの組み込みは、薬物効果と矛盾しない。望まない効果はまた、姉妹染色分体交換の普通でない速度を含み得、中期延展体によって決定される。読者は、更なる詳細については、A. Vickers（PP 375-410 in 'In vitro Methods in Pharmaceutical Research,' Academic Press, 1997）を参照されたい。
組織再生
本書中に記載される方法及び組成物に従って作られた形質転換された間葉系幹細胞及び分化した細胞は、それを必要とするヒト患者における組織再構築又は組織再生のために使用され得る。細胞は、意図される組織部位に移植されて機能欠損領域を再構築又は再生するために移植される様式で適用される。
例えば、本書中に記載される方法及び組成物は、幹細胞の分化を調節するために使用され得る。形質転換された間葉系幹細胞及び分化した細胞は、皮膚移植片の増殖のような組織操作のために使用され得る。幹細胞分化の調節は、人工器官又は組織の生体工学、又はステントのような補綴に使用され得る。
癌
本書中に記載される方法及び組成物によって作られる形質転換された間葉系幹細胞及び分化した細胞は、癌の処置のために使用され得る。
用語「癌」及び「癌性」は、代表的には、無制御の細胞増殖によって特徴づけられる哺乳動物における生理学的状態をいうか又は記載する。癌の例は、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫及び白血病を含むが、これに限定されない。
このような癌のより詳細な例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、例えば神経膠芽腫及び神経線維腫症のようなグリア細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝細胞癌及び種々の型の頭部及び頸部癌を含む。更なる例は、結腸癌、乳癌、肺癌及び前立腺癌、白血病及びリンパ腫を含む造血器腫瘍、ホジキン病、再生不良性貧血、皮膚癌及び家族性腺腫性ポリポージスを含む固形腫瘍癌である。更なる例は、脳新生物、結腸直腸新生物、胸部新生物、子宮頸部新生物、眼新生物、肝臓新生物、肺新生物、膵臓新生物、卵巣新生物、前立腺新生物、皮膚新生物、精巣新生物、新生物、骨新生物、絨毛性新生物、卵管新生物、直腸新生物、結腸新生物、腎臓新生物、胃新生物及び副甲状腺新生物を含む。乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、悪性黒色腫、白血病、リンパ腫、卵巣癌、子宮頸癌及び胆道癌腫もまた、含まれる。
本書中に記載される方法及び組成物に従って作られる形質転換された間葉系幹細胞及び分化した細胞はまた、エンドスタチン及びアンギオスタチン又は細胞毒性物質或いは化学治療剤のような抗癌剤と組み合わせて使用されてもよい。例えば、アドリアマイシン、ダウノマイシン、シスプラチン、エトポシド、タキソール、タキソテール及びビンクリスチンのようなアルカロイド、並びにメトトレキサートのような抗代謝剤などの薬物。本書中で使用される場合、用語「細胞毒性物質」は、細胞の機能を阻害するか若しくは予防する、及び／又は細胞の破壊を生じる物質をいう。この用語は、放射性同位体（例えば、I、Y、Pr）、化学治療剤及び細菌起源、真菌起源、植物起源又は動物起源の酵素学的に活性な毒素又はそれらの断片のような毒素を含むことが意図される。
また、この用語は、癌遺伝子産物／チロシンキナーゼインヒビター、例えばWO 94/22867に開示される二環式アンサマイシン、EP 600832に開示される1,2-ビス（アリールアミノ）安息香酸誘導体、EP 600831に開示される6,7-ジアミノ-フタラジン-1-オン誘導体、EP 516598に開示される4,5-ビス（アリールアミノ）-フタルイミド誘導体、又はSH2含有基質タンパク質へのチロシンキナーゼの結合を阻害するペプチド（例えば、WO 94/07913を参照されたい）を含む。「化学治療剤」は、癌の処置において有用な化学化合物である。化学治療剤の例は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル（5-FU）、シトシンアラビノシド（Ara-C）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、シトキサン（Cytoxin）、タキソール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ビンクリスチン、VP-16、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、ニコチンアミド、エスペラマイシン（米国特許第4,675,187号を参照されたい）、メルファラン及び他の関連のナイトロジェンマスタード及び内分泌療法（例えば、ジエチルスチベストロール（DES）、タモキシフェン、LHRH拮抗薬物、プロゲスチン、抗プロゲスチンなど）を含む。
処置可能な疾患
本書中に記載される方法によって得られた形質転換された間葉系幹細胞のプロテオームは、分析され得る。
このように得られた形質転換された間葉系幹細胞は、WO2007/027157又はWO2007/027156に記載されるhESC-MSCのような間葉系幹細胞の発現プロフィールと類似する発現プロフィールを有し得る。従って、我々の方法によって誘導された形質転換された間葉系幹細胞は、例えばパラ分泌因子を分泌する能力において、対応するものに対して有意な生物学的類似性を有し得る。
従って、本書中に記載される形質転換された間葉系幹細胞は、WO2007/027157又はWO2007/027156に記載されるようなhESC-MSCが好適である任意の目的のために、使用され得る。
形質転換された間葉系幹細胞は、代謝の疾患、防御応答の疾患、並びに血管新生、造血及び骨格発生を含む組織分化、又はこれらの生物学的プロセスの任意の１つ以上が関わる修復若しくは処置の疾患を処置するために使用され得る。同様に、形質転換された間葉系幹細胞によって発現される、例えば分泌されるタンパク質は、それのみで、又は組み合わせて、例えば馴化培地の形態で、形質転換された間葉系幹細胞の活性を補強するために、又は形質転換された間葉系幹細胞の代わりに、例えばこのような疾患を処置するか又は予防する目的で、使用され得る。
形質転換された間葉系幹細胞は、心臓血管生物学、骨発生及び造血のシグナル伝達経路、例えばJak-STAT経路、MAPK経路、Toll様受容体経路、TGF-βシグナル伝達経路及びmTORシグナル伝達経路を活性化するために使用され得る。従って、形質転換された間葉系幹細胞、これらによって発現されるタンパク質などが、任意のシグナル伝達経路が関わる疾患、又はその原因がこれらのシグナル伝達経路の任意の１つ以上における１つ以上の欠損に関わる疾患を予防又は処置するために使用され得る。
従って、形質転換された間葉系幹細胞は、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷並びに糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病及び癌のような変性疾患を処置するために使用され得る。
形質転換された間葉系幹細胞はまた、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚科学的障害、皮膚科学的病変、皮膚炎、乾癬、コンジローマ、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚癌、アトピー性皮膚炎、ベーチェット病、慢性肉芽腫性疾患、皮膚T細胞リンパ種、潰瘍形成、初期損傷誘導性炎症及び免疫調節異常によって特徴づけられ且つ線維症及び機能欠損を含む慢性組織再構築をもたらす病理学的状態、腎虚血傷害、嚢胞性繊維症、副鼻腔炎並びに鼻炎、又は整形外科疾患を処置するためにも使用され得る。
これらは、個体において創傷治癒、瘢痕軽減、骨形成、骨移植又は骨髄移植を補助するために使用されてもよい。
我々は、本書中で得られた形質転換された間葉系幹細胞又はこのような形質転換された間葉系幹細胞によって馴化される培地の、以下のうちのいずれか１つ以上より選択される経路の調節における使用を更に提供する：Rho GTPaseによる細胞骨格調節、細胞周期、インテグリンシグナル伝達経路、ケモカイン及びサイトカインのシグナル伝達経路によって媒介される炎症、FGFシグナル伝達経路、EGF受容体シグナル伝達経路、血管形成、プラスミノーゲン活性カスケード、凝血、糖代謝、ユビキチンプロテアソーム経路、新規プリン生合成、TCA周期、フェニルアラニン生合成、ヘム生合成。
我々はまた、本書中で得られた形質転換された間葉系幹細胞又はこのような形質転換された間葉系幹細胞によって馴化される培地の、以下のうちのいずれか１つ以上より選択されるプロセスの調節における使用を更に提供する：細胞構造及び細胞運動性、細胞構造、細胞間情報伝達、細胞運動性、細胞接着、エンドサイトーシス、有糸分裂、エキソサイトーシス、細胞質分裂、細胞周期、免疫及び防御、サイトカイン／ケモカイン媒介性免疫、マクロファージ媒介性免疫、顆粒球媒介性免疫、リガンド媒介性シグナル伝達、サイトカイン及びケモカイン媒介性シグナル伝達経路、シグナルトランスダクション、細胞外マトリクスタンパク質媒介性シグナル伝達、増殖因子ホメオスタシス、受容体タンパク質チロシンキナーゼシグナル伝達経路、細胞接着媒介性シグナル伝達、細胞表面受容体媒介性シグナルトランスダクション、JAK-STATカスケード、酸化防止及びフリーラジカル除去、ホメオスタシス、ストレス応答、血液凝固、発生プロセス、中胚葉発生、骨格発生、血管形成、筋発生、筋収縮、タンパク質代謝及びタンパク質修飾、タンパク質分解、タンパク質折り畳み、タンパク質複合体アセンブリ、アミノ酸活性、細胞内タンパク質輸送、他のタンパク質標的化及び局在化、アミノ酸代謝、タンパク質生合成、タンパク質ジスルフィド−イソメラーゼ反応、炭水化物代謝、糖代謝、ペントース−リン酸短路、他の多糖類代謝、プリン代謝、リン酸代謝の調節、ビタミン代謝、アミノ酸生合成、pre-mRNAプロセシング、翻訳調節、mRNAスプライシング。
我々は更に、本書中で得られた形質転換された間葉系幹細胞又はこのような形質転換された間葉系幹細胞によって馴化される培地の、以下のうちのいずれか１つ以上より選択される機能を含む機能の補助における使用を提供する：シグナル伝達分子、ケモカイン、増殖因子、サイトカイン、インターロイキン、他のサイトカイン、細胞外マトリクス、細胞外マトリクス構造タンパク質、他の細胞外マトリクス、細胞外マトリクス糖タンパク質、プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、他のプロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、メタロプロテアーゼインヒビター、セリンプロテアーゼインヒビター、酸化還元酵素、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、シャペロン、シャペロニン、Hsp 70ファミリーシャペロン、他のシャペロン、シンセターゼ、シンターゼ及びシンセターゼ、選択されたカルシウム結合タンパク質、アミノアシル-tRNAシンセターゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、他のイソメラーゼ、ATPシンターゼ、ヒドラターゼ、トランスアミナーゼ、他のリアーゼ、他の酵素調節因子、選択された調節分子、アクチン結合細胞骨格タンパク質、細胞骨格タンパク質、非モーターアクチン結合タンパク質、アクチン及びアクチン関連タンパク質、アネクシン、チューブリン、細胞接着分子、アクチン結合モータータンパク質、中間フィラメント、リボ核タンパク質、リボソームタンパク質、翻訳因子、他のRNA結合タンパク質、ヒストン、カルモジュリン関連タンパク質、小胞コートタンパク質。
更に、本書中で得られた形質転換された間葉系幹細胞又はこのような形質転換された間葉系幹細胞によって馴化される培地は、これらの機能が役割を有し得るか又は修復又は処置が任意の１つ以上のこれらの生物学的プロセスに関わる疾患を処置するために使用され得る。同様に、形質転換された間葉系幹細胞によって発現されるタンパク質は、それのみで又は組み合わせて、例えば馴化培地の形態で、形質転換された間葉系幹細胞の活性を補強するために、又は形質転換された間葉系幹細胞の代わりに、例えばこのような疾患を処置又は予防する目的で使用され得る。
本書中で得られた形質転換された間葉系幹細胞による遺伝子産物は、心臓血管生物学、骨発生及び造血における重要なシグナル伝達経路、例えばJak-STAT経路、MAPK経路、Toll様受容体経路、TGF-βシグナル伝達経路及びmTORシグナル伝達経路を活性化するために使用され得る。従って、hESC-MSC、これらによって発現されるタンパク質などが、これらのシグナル伝達経路のいずれかが関わる疾患、又はその原因がこれらのシグナル伝達経路の任意の１つ以上における１つ以上の欠損に関わる疾患を予防又は処置するために使用され得る。
従って、このような馴化培地は、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷並びに糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病及び癌のような変性疾患を処置するために使用され得る。
このような馴化培地はまた、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚科学的障害、皮膚科学的病変、皮膚炎、乾癬、コンジローマ、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚癌、アトピー性皮膚炎、ベーチェット病、慢性肉芽腫性疾患、皮膚T細胞リンパ種、潰瘍形成、初期損傷誘導性炎症及び免疫調節異常によって特徴づけられ且つ線維症及び機能欠損を含む慢性組織再構築をもたらす病理学的状態、腎虚血傷害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎並びに鼻炎、又は整形外科疾患を処置するためにも使用され得る。
馴化培地は、個体において創傷治癒、瘢痕軽減、骨形成、骨移植又は骨髄移植を補助するために使用されてもよい。
詳細には、馴化培地は、血管化、血液病学（特に免疫プロセス）又は筋骨格発生などに関わるプロセスを調節するために使用され得る。
このような組成物は、馴化培地が使用され得る任意の目的のために使用され得る。文脈がそれ以外を述べていない限り、用語「馴化培地」は、MSCに曝露された細胞培養培地のみでなく、馴化培地中に存在するポリペプチドの１種以上、例えば実質的に全てを含む組成物を含むと理解されるべきである。
更に、本書中で得られた形質転換された間葉系幹細胞から分泌される任意の１種以上のタンパク質は、馴化培地の形態を含めて、WO2007/027157又はWO2007/027156において記載されるようなhESC-MSCの目的と同じ目的で使用され得る。
形質転換された間葉系幹細胞はまた、これらによって分泌されるか又は発現されるタンパク質のいずれかの供給源としても使用され得る。我々は、従って、ポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、記載の形質転換された間葉系幹細胞を得ること、形質転換された間葉系幹細胞を培養すること、及び形質転換された間葉系幹細胞から、例えば形質転換された間葉系幹細胞が増殖している培地から、ポリペプチドを単離することを含む。
皮膚科学的障害
本書中に記載される方法によって得られる形質転換された間葉系幹細胞によって馴化される培地は、皮膚科学的障害を処置するために使用され得る。
従って、このような馴化培地の皮膚創傷又は皮膚科学的病変又は障害、例えば皮膚炎又は乾癬への局所塗布は、治癒を改善し、そして瘢痕を軽減する。また、これは、ホメオスタシスも維持する。馴化培地は、リポソームベースのエマルジョン、ゲル又はクリーム処方物において、及び部分的に標準的創傷包帯において送達され得る。馴化培地はまた、皮膚修復及び治癒を促進するための化粧用スキンケア製品の補足物として使用され得る。
このような馴化培地の皮膚障害における効力を試験するために好適な動物モデルは、皮膚炎のマウスモデルである。マウスの皮膚上への感作は、以前に記載されている[A72, A73]ように実施される。簡潔には、100μlのPBS中の50μgのBlo t 5又はPBSのみが、1cm2のガーゼに適用され、そして透明テープ（Smith Nephew）で皮膚にパッチされる。この手順は、50日間に亘って2回繰り返される。次いで、CM及びNCMが、1cm2のガーゼに適用されて、種々の期間で上述のように皮膚にパッチされる。
皮膚炎症の組織学的試験のために、パッチされた皮膚からの標本が得られ、そして10%緩衝化中性ホルマリンで直ちに固定される。
喘息及びアレルギー
本書中に記載される方法によって得られる形質転換された間葉系幹細胞によって馴化された培地は、喘息及びアレルギーの処置のために使用され得る。
喘息は、あまり明らかにされていない遺伝的因子及び環境的因子のセットによって起こる等しく複雑な原因による複雑な疾患である。生じる病理は、気道の慢性炎症並びに平滑筋量の増加及び細胞外マトリクスタンパク質の堆積の増加によって特徴づけられる上皮下の線維症をもたらし、結果として肺機能の低下をもたらす、免疫調節不全である。
現在の治療法は、幾つかの因子又はシグナル伝達経路、例えばECM、インテグリン及び間葉系細胞機能[A74]、toll様受容体[A75]、TGF-β及びEGF[A76, A77]のような増殖因子、及びIL6経路の調節を含む。hESC-MSCによるCMは、これらの標的領域における生物学的効果を予測されていて、我々は、CMは、喘息の肺における免疫調節の回復を助け、そして組織修復を促進し、肺組織の瘢痕化を最小化することを予測する。
このような馴化培地（CM）及び非馴化培地（NCM）の慢性気道炎症及び気道における効果を調べるため、マウスの皮膚上への感作が、上述のように実施される[A72, A73]。50日後、パッチされたマウスを麻酔し、そして50μgのBlo t 5を鼻腔内誘発を連続して3日間行う。最終投与の24時間後、気道の応答性亢進（AHR）を、侵襲性BUXCO [A79]を用いて測定する。マウスを麻酔し、そして馴化培地又は非馴化培地を連続して3日間鼻腔内で与える。最終投与の24時間後、気道の応答性亢進（AHR）を、測定する。更に24時間後、BAL液を回収する。気管支肺胞洗浄回収の後、肺を10%の中性化ホルマリンで固定する。
CM及びNCMの急性気道炎症及び気道における効果を調査する。
高レベルのIL-4、IL-5、IL-13及び検出不能レベルのIFN-γを分泌するBlot t 5特異的Th2細胞株が、マウスアレルギーモデルを確立するために使用される。簡潔には、無処理のマウスの感作を、2.5 x 106のBlot t 5特異的Th2細胞を、各マウスに静脈内で養子移入することにより行う。これらのマウスを、麻酔し、そして50μgのBlot t 5で3日間連続で鼻腔内（IN）誘発する。最後のIN誘発の24時間後、気道の応答性亢進（AHR）を、侵襲性BUXCO [A79]を用いて測定する。マウスを麻酔し、そしてCM又はNCMを連続して3日間鼻腔内で与える。最後のBlot t 5誘発の48時間後、BAL液を回収する。気管支肺胞洗浄回収の後、組織学的分析のために、肺を10%の中性化ホルマリンで固定する。
臨床実施において、肺疾患を処置するためのCMの使用は、標準的エアロゾル治療を効果的に用いて投与され得る[A80〜86]。
他の疾患
本書中に記載される方法によって得られる形質転換された間葉系幹細胞によって馴化された培地は、他の疾患を処置するために使用され得る。
一般的に、我々は、このような馴化培地は、ホメオスタシスを回復しそして初期損傷誘導性炎症及び免疫調節異常によって特徴づけられ且つ線維症及び機能欠損を含む慢性組織再構築をもたらす病理学的状態において組織修復を促進する際に有用であることを予測する。他の疾患は、腎虚血傷害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎及び鼻炎を含む。
整形外科
本書中に記載される方法によって得られる形質転換された間葉系幹細胞によって馴化された培地は、整形外科的障害を処置するために使用され得る。
筋骨格組織の修復のための現在の治療戦略は、多くの場合、機械的支持を提供するだけでなく、血管形成及び最終的には新しい骨の形成を開始するための細胞移動、細胞接着、増殖及び分化を促進する足場を提供するための、生体材料（セラミックス又はポリマー）の使用を含む[A87〜90]。このような馴化培地のコンピューター分析に基づき、足場設計へのCMの組み込みは、足場の細胞移動、増殖、接着、骨格分化及び血管形成を増強し得る。
骨再生がなければ萎縮性偽関節をもたらす欠損における骨再生へのCMの効果を試験するために、ニュージーランド白ウサギに、CM又はNCMのいずれかで被膜されたコラーゲンスポンジ又はヒドロゲルのような好適なマトリクスで満たした15 mmの臨界サイズの欠損を[A91]、橈骨の１つに入れる。3週間毎に、レントゲン写真を撮る。6又は12週間後、動物を殺傷する。新しい骨を、マイクロCT走査によって測定し、そして移植片における内皮細胞の抗CD31染色を用いて血管分布を測定する。少なくとも最初に血管分布の増大が見られ、また、新しい骨の形成も見られる筈である。
軟骨修復におけるCMの効果を試験するために、骨軟骨傷害のウサギモデル[A92]を使用する。CMは、コラーゲン又はヒドロゲルのような好適な足場を被膜し、3 mmの骨軟骨膝欠損内に移植される[A93]。臨床適用において、CMは、現存する足場又は骨移植片へのCMの組み込みによって使用されてもよい[A94]。
骨髄移植
MSCは、骨髄移植[A95]を増強すること、及び移植片対宿主疾患を緩和することが示されている。MSCの移植は、造血移植[A96]及びGVHDの限定[A97, A98]を促進することによって、同種間移植の結果を改善することが示されている。MSCは、恐らくは可溶性の因子の分泌を介して[A100]、造血幹細胞ニッチの増大[A99]、寛容の誘導、同種組織移植片の拒絶であるGVHDの軽減及び炎症の調節[A98]を通して、これらの効果を媒介することが仮定される。
このような馴化培地のMSCによる潜在的な臨床適用：インビトロにてCMで培養培地を補強することによる造血幹細胞集団の拡大又はインビボにて移植の間にCMを造血幹細胞と共に注入すること、CMの静脈内注入によるGVHDの改善、又は移植前若しくは移植後の治療の一部としてのCMの静脈内注入による移植された細胞又は組織に対する免疫寛容の誘導。
心臓疾患
本書中に記載される形質転換された間葉系幹細胞は、心臓疾患の処置又は予防のために使用され得る。
心臓疾患は、心臓に影響する種々の疾患についての広い意味を含む用語である。2007年には、米国、イングランド、カナダ及びウェールズにおいての死の主因であり、米国のみにおいて34秒間に１人がなくなっている。心臓疾患は、以下のいずれかを含む。
冠動脈心疾患
冠動脈疾患は、心筋に供給している動脈の壁の内側におけるアテローム班の蓄積によって起こる動脈の疾患である。狭心症（胸痛）及び心筋梗塞（心臓発作）は、冠動脈心疾患の症候であり、これによって起こる状態である。毎年459,000を超える米国人が、冠動脈心疾患で亡くなっている。英国においては、年間101,000の死が、冠動脈心疾患に起因する。
心筋症
心筋症は、任意の理由による心筋（すなわち、実際の心臓の筋肉）の機能の低下である。心筋症を有する人々は、多くの場合、不整脈及び／又は突然の心臓死の危険にある。一次的な病理が心筋自体以外である外因性の心筋症が、心筋症の大部分を占める。心筋症の飛び抜けて多い一般的な原因は、虚血である。
世界保健機構は、特定の心筋症として以下を含める：アルコール性心筋症、冠動脈疾患、先天性心疾患、心臓に影響する栄養病、虚血性（すなわち虚血下）心筋症、高血圧性心筋症、弁膜心筋症、炎症性心筋症。
更に、以下が含まれる：
全身性代謝疾患に次ぐ心筋症
内因性心筋症（確認出来る外因に起因しない心臓の筋肉の衰弱）
拡張型心筋症（DCM、最も一般的な形態であり、心臓移植の主要な指標の１つである。DCMにおいて、心臓（特に左心室）が肥大し、そしてポンプ機能が低下する）
肥大型心筋症（HCM又はHOCM、サルコメアタンパク質の遺伝子の種々の変異によって起こる遺伝性障害。HCMにおいて、心筋は厚くなり、血液の流れを遮り、心臓が正常に機能することを妨害し得る。）
不整脈原性右室心筋症（ARVC、心臓の電気的妨害から生じ、ここで、心筋は、線維性瘢痕組織に置き換えられている。右心室は、一般に最も影響を受ける）
拘束性心筋症（RCM、最も稀な心筋症である。心室の壁が硬化するが、厚くはならず、心臓を血液で正常に満たすことに抵抗性である）
緻密化心筋症。左心室の壁が誕生から正常に成長することに失敗し、心エコー図の間に見た場合スポンジ様の外観を有する。
心臓血管障害
心臓血管障害は、心臓自体及び／又は血管系、特に心臓に繋がる又は心臓からの静脈及び動脈に影響する多くの特定の疾患のいずれかである。疾患の二形性における研究は、心臓血管疾患に罹患する女性は、通常、血管に影響する形態に罹患していて、男性は、通常、心筋自体に影響する形態に罹患していることを示唆している。心臓血管疾患の公知の又は関連する原因は、真性糖尿病、高血圧、高ホモシステイン血症及び高コレステロール血症を含む。
心臓血管疾患の種類は、アテローム硬化症を含む。
虚血性心疾患
虚血性心疾患は、心臓自体の疾患であり、器官への血液供給の低下によって特徴づけられる。これは、酸素及び栄養を供給する動脈が停止し、そして心臓が酸素及び栄養を充分に受け取れず、最終的に拍動を止めてしまった際に起こる。
心不全
心不全は、うっ血性心不全（又はCHF）及びうっ血心不全（CCF）とも呼ばれ、心臓が体内を通して十分な量の血液を満たすか又は流す能力を損なう任意の構造的又は機能的心臓障害から生じ得る状態である。肺性心は、心臓の右側の不全である。
高血圧性心疾患
高血圧性心疾患は、高血圧、特に限局性の高血圧によって生じる心疾患である。高血圧性心疾患によって起こり得る状態は、以下を含む：左心室肥大、冠動脈心疾患、（うっ血性）心不全、高血圧性心筋症、心律動異常、炎症性心疾患など。
炎症性心疾患は、心筋及び／又は心筋の周りの組織の炎症を含む。心内膜炎は、心臓の内層である心内膜の炎症を含む。関連する最も多い構造は、心臓弁である。炎症性心肥大。心筋炎は、心臓の筋肉部分である心筋の炎症を含む。
心臓弁膜症
心臓弁膜症は、１つ以上の心臓の弁に影響する疾患プロセスである。心臓の右側における弁は、三尖弁及び肺動脈弁である。心臓の左側における弁は、僧帽弁及び大動脈弁である。大動脈弁狭窄症、僧帽弁逸脱、及び弁膜心筋症が含まれる。
[上記文書は、2009年2月20日 06:33に改訂された無料の百科事典であるWikipedia（http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Heart#disease&oldid=268290924）における、Heart disease（2009年2月3日）から適用される。]
pre-miRNA対成熟miRNA比
我々はまた、実施例において、前駆体miRNA対成熟miRNAの比が、細胞の状態によって変化することを実証する。従って、我々が「pre-miRNA対成熟miRNA比」と呼ぶこのような比は、細胞の状態をモニタリングするためのマーカーとして使用され得る。
実施例は、定量的RT-PCR（qRT-PCR）分析を用いて、ヒト胚性幹細胞（hESC）に由来する間葉系幹細胞（MSC）から分泌されるエキソソームは、miRNAを含むことを示す。このようなmiRNAは、主に前駆体（pre）miRNA形態であり、検出可能なレベルのprimary（pri）miRNAは存在しない。従って、例えば、エキソソーム中のhsa-let-7b（miRBase登録番号MI0000063）及びhsa-let-7g（miRBase登録番号MI0000433）についてのpre-miRNA対成熟miRNA比は、細胞中のpre-miRNA対成熟miRNA比に対して、それぞれ169倍及び1078倍高かった。
我々は、実施例において、c-myc遺伝子で形質転換されたMSCは、老化せずに増殖し続けて、高レベルのテロメラーゼ活性を維持することを示す。我々は、リアルタイムRT-PCR分析を用いて、mycで形質転換されたMSCのhsa-let-7b miRNA（miRBase登録番号MI0000063）分泌のpre-miRNA対成熟miRNA比は、親MSCによる分泌に対して、2.8倍に増大することを示す。他方、hsa-let-7gのpre-miRNA対成熟miRNA比は、形質転換の結果によって変わらなかった。
hsa-let-7bは、本書中他所にて詳細に記載される。
従って、癌遺伝子によるMSCの形質転換は、細胞に癌化状態を示させる。このような癌化状態において、hsa-let-7b miRNA（miRBase登録番号MI0000063）の前駆体miRNA対成熟miRNAの比が、非形質転換細胞におけるhsa-let-7b miRNAの前駆体miRNA対成熟miRNAの比に対して増大する。従って、hsa-let-7b miRNAの前駆体miRNA対成熟miRNAの比は、細胞の癌化状態をモニタリングするために使用され得る。
他のmiRNA種についての前駆体miRNA対成熟miRNAの比もまた変化することが、形質転換の結果として観察される。従って、これらの他のmiRNA種のpre-miRNA対成熟miRNA比が、hsa-let-7bのpre-miRNA対成熟miRNA比の代わりに、或いはこれに加えて、癌化形質転換のマーカーとして使用され得る。
我々は、特定のmiRNA種についての前駆体miRNA対成熟miRNAの比が、細胞状態の変化、例えば、生理学的状態の変化又は病理学的状態の変化、或いは生理学的状態から病理学的状態への間の変遷の結果として変化することを見出す。
従って、これらのmiRNAのpre-miRNA対成熟miRNA比をモニタリングすることによって、細胞状態の変化がモニタリングされ得る。
我々は、細胞の状態をモニタリングする方法を記載し、この方法は、細胞によって分泌された選択されたmicroRNA（miRNA）種について、（a）このmiRNA種の前駆形態（pre-miRNA）対（b）このmiRNA種の成熟形態（成熟miRNA）の比を確立することを含み、ここで、確立されたpre-miRNA対成熟miRNA比は、細胞の状態の指標である。
この細胞は、細胞塊、組織、器官又は生物の中に含まれていてもよい。このpre-miRNA対成熟miRNA比は、細胞塊、組織、器官又は生物のそれぞれの状態の指標であってもよい。
このmiRNA種は、細胞によって分泌されたエキソソームに含まれていてもよい。この方法は、このようなエキソソームを得ること、及びそれからmiRNA種の前駆形態及び成熟形態を得ることを含み得る。
pre-miRNA対成熟miRNA比は、miRNA種の前駆形態と成熟形態とに結合可能であり且つこれらを識別可能である核酸配列を含むアレイへのハイブリダイゼーションによって確立されてもよい。
pre-miRNA対成熟miRNA比は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によって確立されてもよい。
この方法は、それぞれ細胞の状態の指標である複数の選択されたmiRNA種についての複数のpre-miRNA対成熟miRNA比を含む、プロフィールを確立することを含んでもよい。
この方法は、複数の選択されたmiRNA種についての複数のpre-miRNA対成熟miRNA比を含むプロフィールをを確立することを含んでいてもよく、コノプロフィールは、複数の選択されたmiRNA種の前駆形態と成熟形態とに結合可能であり且つこれらを識別可能である複数のプローブを含むアレイへのハイブリダイゼーションによって確立されることを含んでもよい。
エキソソームは、細胞を含む生物のサンプルから得られてもよく、このサンプルは、例えば、血液サンプル、血清サンプル、唾液サンプル又は尿サンプルを含んでもよい。
細胞の状態は、生理学的状態、例えば細胞周期状態、分化状態、発生状態又は代謝状態を含んでもよい。
細胞の状態は、病理学的状態、例えば疾患状態、ヒト疾患状態、糖尿病状態、免疫障害状態、神経変性障害状態、癌化状態、癌性状態又は腫瘍状態を含んでもよい。
我々は、細胞の状態における変化を検出するための上記の方法を更に記載し、この方法は、細胞のpre-miRNA対成熟miRNA比（又はこのような比を含むプロフィール）における変化を検出することを含、このような変化は細胞の状態を示す。
我々は、特定の状態にある細胞を確立するための上記の方法を更に記載し、この方法は、細胞のpre-miRNA対成熟miRNA比（又はこのような比を含むプロフィール）と特定の状態であることが分かっている細胞のpre-miRNA対成熟miRNA比（又はこのような比を含むプロフィール）とを比較することを含む。
我々は、生物の状態をモニタリングする方法を更に記載し、この方法は、この生物由来の又はこの生物のサンプルを得ること、このサンプルに対し上記の方法を実施すること、及びこのようにして得られたpre-miRNA対成熟miRNA比からこの生物の状態を確立することを含む。
我々は、生物における疾患を検出する方法を更に記載し、この方法は、この生物由来の又はこの生物のサンプルを得ること、このサンプルに対し上記の方法を実施すること、及びこのようにして得られたpre-miRNA対成熟miRNA比と疾患を有する生物のものであるか又は疾患を有する生物由来のものであることが分かっているサンプルのpre-miRNA対成熟miRNA比と比較することを含む。
我々は、生物における疾患の処置又は予防の方法を更に記載し、この方法は、生物における疾患を請求項１４に従って検出すること、及びこの生物に対しこの疾患のための処置を施すことを含む。
細胞は、間葉系幹細胞（MSC）を含んでもよい。細胞の状態は、非形質転換状態と形質転換状態、例えばc-myc形質転換状態とを含んでもよい。microRNAは、hsa-let-7b microRNAを含んでもよい。この比は、形質転換状態において正常状態と比較して2.8倍高くてもよい。上記の任意の組み合わせが、可能であり得る。
我々は、複数のmiRNA種の前駆形態と成熟形態とに結合可能であり且つこれらを識別可能である複数の核酸配列を含むアレイを、更に記載する。
HSA-LET-7B
hsa-let-7bは、miRBASE登録番号MI0000063を有する。pre-hsa-let-7bは、以下の配列を有する：
pre- hsa-let-7bは、以下の構造を有する：
成熟hsa-let-7bは、miRBase登録番号MIMAT0000063を有し、以下の配列を有する：
hsa-let-7bは、以下の文献において詳細に記載される："Identification of novel genes coding for small expressed RNAs" Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, Tuschl T. Science. 294:853-858（2001）；"Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia" Michael MZ, O' Connor SM, van Hoist Pellekaan NG, Young GP, James RJ. Mol Cancer Res. 1 :882-891（2003）；"Altered expression profiles of microRNAs during TPA- induced differentiation of HL-60 cells" asashima K, Nakamura Y, Kozu T. Biochem Biophys Res Commun. 322:403-410（2004）；"A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing" Landgraf P, Rusu M, Sheridan R, Sewer A, Iovino N, Aravin A, Pfeffer S, Rice A, Kamphorst AO, Landthaler M, Lin C, Socci ND, Hermida L, Fulci V, Chiaretti S, Foa R, Schliwka J, Fuchs U, Novosel A, Muller RU, Schermer B, Bissels U, Inman J, Phan Q, Chien M. Cell. 129: 1401-1414（2007）及び"Patterns of known and novel small RNAs in human cervical cancer" Lui WO, Pourmand N, Patterson BK, Fire A. Cancer Res. 67:6031-6043（2007）。
細胞状態の変化
本書中上述の方法及び組成物に従って、pre-miRNA対成熟miRNA比は、種々の細胞状態の変化をモニタリングするために使用され得る。
このような細胞状態の変化は、細胞周期状態のような生理学的状態の変化を含み得る。従って、miRNA種のpre-miRNA対成熟miRNA比は、細胞のG1状態、M状態、G2状態又はS状態をモニタリングするために使用され得る。
生理学的状態は、分化状態を含んでもよい。言い換えれば、miRNA種のpre-miRNA対成熟miRNA比は、細胞が分化しているか又は未分化であるかを決定するために使用され得る。これは、例えば、細胞の多能性を検出するために使用され得る。これは、細胞が幹細胞であるか否か、又は例えば細胞が分化中の細胞であるか否か、或いは最終分化しているか否かを検出するために使用され得る。
生理学的状態は、発生状態又は発生段階を含んでもよい。従って、miRNA種のpre-miRNA対成熟miRNA比は、胚性状態若しくは段階、胎仔状態若しくは段階、新生仔状態若しくは段階、乳仔状態若しくは段階、若年状態若しくは段階、幼若状態若しくは段階、青年状態若しくは段階、成体状態若しくは段階などの細胞又はこれに由来する細胞であるかを決定するために使用され得る。
病理学的状態のモニタリング
細胞状態は、疾患状態のような病理学的状態を含んでもよい。従って、miRNA種のpre-miRNA対成熟miRNA比は、細胞の病理学的状態、又は正常な状態から病理学的な状態への変化をモニタリングするために使用されてもよい。
pre-miRNA対成熟miRNA比は、細胞が正常（非疾患）状態であるか又は疾患状態であるかを検出するために使用され得る。これは、細胞の正常、非疾患状態から疾患状態への進行をモニタリングするために使用され得る。これは、細胞の疾患の状態をモニタリングするために使用され得る。疾患は、生物が罹患しているか罹患し得る任意の種々の疾患を含み得る。
一般に、疾患状態は、肥大型心筋症、細菌性心内膜炎、無脳回、筋萎縮性側索硬化症、目眩、ファロー四徴症、心筋炎、アルコール中毒症、貧血症、腕神経叢、神経症、痔、先天性心疾患、円形脱毛症、鎌形赤血球貧血、僧帽弁逸脱、自律神経系疾患、異常、アルツハイマー病、狭心症、直腸疾患又は催不整脈性右のいずれか１つ以上を含んでもよい。
疾患状態は、心室異形成、酒土性座瘡、弱視、硬直性脊椎炎、心房細動、心臓タンポナーデ、後天性免疫不全症候群、アミロイド症、食欲不振、不安症、自閉症、脳新生物、中枢神経系疾患、色覚異常、動脈硬化症、背部痛、乳房疾患、中枢神経系感染症、直腸結腸新生物、関節炎、ベーチェット症候群、乳房新生物、脳性小児まひ、一般的な風邪、喘息、双極性障害、火傷又は子宮頸部新生物のいずれか１つ以上を含んでもよい。
疾患状態は、コミュニケーション障害、アテローム硬化症、盲目、カンジダ症、シャルコー・マリー病、クローン病、注意欠陥障害、脳損傷、白内障、潰瘍性大腸炎、累積外傷性障害、嚢胞性線維症、発達障害、摂食障害、丹毒、線維筋痛症、褥創、糖尿病、肺気腫、escherichia coli感染、毛包炎、嚥下障害、糖尿病性足病変又は脳炎のいずれか１つ以上を含んでもよい。
疾患状態は、食道疾患、食物過敏症、痴呆、ダウン症候群、日本脳炎、目新生物、食中毒、デング熱、失読症、子宮内膜症、ファブリー病、胃腸炎、鬱病、失調症、てんかん、慢性疲労症候群、胃食道逆流、ゴーシェ病、血液疾患、ヒルシュスプルング病、水頭症、甲状腺機能亢進症、歯肉炎、血友病、組織球増加、多汗症、低血糖症、緑内障、肝炎及びhiv感染のいずれか１つ以上を含んでもよい。
疾患状態は、高シュウ酸尿、甲状腺機能低下症、糖原病、肝レンズ核変性症、ホジキン病、過敏症、免疫不全症候群、頭痛、ヘルニア、ホルト・オーラム症候群、高血圧症、不能症、鬱血性心不全、陰部ヘルペス、ハンチントン病、肺高血圧症、失禁、不妊症、白血病、全身性エリテマトーデス、マズラ菌症、精神遅滞、炎症、肝新生物、ライム病、マラリア又は先天性代謝異常のいずれか１つ以上を含んでもよい。
疾患状態は、炎症性腸疾患、長qt間隔症候群、リンパ管筋腫症、麻疹、片頭痛、インフルエンザ、腰痛、リンパ浮腫、黒色腫、口腔異常、ラテックス・アレルギー、閉塞性肺疾患、リンパ腫、脳膜炎、ムコ多糖症又はハンセン病のいずれか１つ以上を含んでもよい。
疾患状態は、肺新生物、黄斑変性、更年期、多発性硬化症、筋ジストロフィー症、筋膜疼痛症候群、骨関節炎、膵臓新生物、消化性潰瘍、重症筋無力症、悪心、骨粗鬆症、パニック障害、ペルシャ湾症候群、骨髄腫、聴神経腫、中耳炎、対麻痺、フェニルケトン尿症、骨髄増殖性障害、眼振、卵巣新生物あるいはパーキンソン病のいずれか１つ以上を含んでもよい。
疾患状態は、クロム親和性細胞腫、心筋疾患、日和見感染、疼痛、扁平部炎、恐怖性障害、心筋梗塞、遺伝性視神経萎縮、膵臓病、シラミ寄生症、疫病、ツタウルシ皮膚炎、プリオン病、反射性交感神経性ジストロフィー、統合失調症、内気、小児麻痺、前立腺疾患、気道疾患、硬皮症、シェーグレン症候群又はリウマチ性多発性筋痛のいずれか１つ以上を含んでもよい。
疾患状態は、前立腺腫瘍、下肢静止不能、脊柱側弯症、皮膚疾患、ポスト小児麻痺症候群、乾癬、網膜疾患、壊血病、皮膚新生物、前癌症状、狂犬病、網膜芽細胞腫、性別障害、睡眠障害、妊娠、奇病、サルコイドーシス、性感染症、痙性斜頸又は脊髄損傷のいずれか１つ以上を含んでもよい。
疾患状態は、吃音、精巣新生物、抜毛癖、尿路感染病、脊椎癒合不全、化学物質関連障害、サラセミア、三叉神経痛、泌尿生殖器の疾病、脊髄小脳変性症、乳幼児突然死、血栓症、結核、血管疾患、斜視、自殺、耳鳴り、結節硬化、ウイルス性疾患、外傷後ストレス障害、脊髄空洞症、トゥレット症候群、ターナー症候群又は視覚障害のいずれか１つ以上を含んでもよい。
疾患状態は、精神的ストレス、顎関節機能不全症候群、トラホーム、尿失禁、嘔吐、フォン・ヴィレブランド病、腎性骨ジストロフィー、細菌感染、消化器系新生物、骨新生物、外陰部疾患、子宮外妊娠、ダニ媒介疾患、マルファン症候群、老化、ウィリアムズ症候群、血管新生因子、じんましん、敗血症、吸収不良症候群又は損傷及び傷害のいずれか１つ以上を含んでもよい。
疾患状態は、脳血管発作、多種化学物質過敏症、目眩、水腎症、黄熱病、神経原性関節障害、肝細胞癌、多形腺腫、ファーター膨大部、メッケル憩室、円錐角膜皮膚、疣、シックビル症候群、泌尿器疾患、虚血性視神経症、総胆管結石、耳鼻咽喉疾患、上大静脈症候群、副鼻腔炎、橈骨骨折、変形性骨炎、絨毛性新生物、軟骨肉腫又は読書（reading）及び頸動脈狭窄症のいずれか１つ以上を含んでもよい。
疾患状態は、拡張蛇行静脈、クロイツフェルト・ヤコブ症候群、胆嚢疾患、関節置換術、白斑、鼻疾患、環境病、巨大結腸、肺炎、前庭疾病、クリプトコッカス症、帯状疱疹、ファロピーオ管新生物、感染、不整脈、耐糖能異常、神経内分泌腫瘍、疥癬のいずれか１つ以上を含んでもよい。
疾患状態は、アルコール性肝炎、寄生虫疾患、耳管炎、クリプトコックス髄膜炎、頭蓋内動脈瘤、悲嘆、結石、色素性母斑、直腸新生物、真菌症、血管腫、結腸の新生物、ビタミンA過剰症、腎石灰症、腎臓新生物、ビタミン、カルチノイド腫瘍、セリアック病、下垂体疾患、脳死、胆道疾病又は前立腺炎のいずれか１つ以上を含んでもよい。
疾患状態は、医原病、消化管出血、腺癌、中毒性巨大結腸、四肢切断患者、脂漏性角化症、骨髄炎、バレット食道、出血、胃新生物、水痘、胆嚢炎又は軟骨腫のいずれか１つ以上を含んでもよい。
疾患状態は、細菌感染及び真菌症、上皮小体新生物、精索捻転症、腺腫、扁平苔癬、肛門腺新生物、脂肪腫、足白癬、アルコール性肝臓疾患、神経性線維症、リンパ系疾患、高齢者虐待、湿疹、憩室炎、癌腫、膵臓炎、アメーバ症、妊娠合併症、腎盂腎炎、感染性単核症又は動脈瘤のいずれか１つ以上を含んでもよい。
詳細には、疾患状態は、糖尿病、免疫障害、神経変性障害又は癌若しくは腫瘍のような疾患を含んでもよい。従って、pre-miRNA対成熟miRNA比は、上に挙げた疾患のいずれかを罹患しているか又はこれらに罹患し易い生物の細胞の細胞状態をモニタリングするために使用されてもよい。
細胞は、組織、組織塊、器官又は生物に含まれていてもよい。この場合、前駆体miRNA対成熟miRNA比は、細胞状態に加えて、細胞が含まれている組織の状態、組織塊、器官又は生物を決定するために使用され得る。
エキソソーム
エキソソームは、直径30〜100 nmの分泌された微粒子であって、網状赤血球によって放出されたものが最初に発見された（1A）。これらは、本質的には、タンパク質とRNAとの両方を含むリン脂質小胞である。
現在、エキソソームは、血液由来のもの（B細胞、樹状細胞、肥満細胞、T細胞及び血小板）及び非血液由来のもの（腸上皮細胞、シュワン細胞、神経細胞、腫瘍細胞、腫瘍細胞株（マウス小グリア細胞、中皮腫細胞、黒色腫細胞、卵巣癌腫細胞を含む）、及び精子（（2A）にて論評されている））を含む多くの細胞型によって分泌されていることが知られている。しかし、これらの機能は、あまり理解されていないままである。近年の研究は、これらは、健康及び腫瘍転移のような疾患において、抗原提示の際及び感染因子を媒介する際に役割を果たし得る（3A, 4A）。
エキソソームの生合成は、積荷のよく性質決定されたESCRT（輸送に必要なエンドソーム選択複合体）媒介型側面分離及びエンドソーム膜の内方出芽を通してエンドソーム多胞体（MVB）における腔内小胞の形成を含む、多くの高度に調節された細胞プロセスを介して進行する（5A）。
このように高度に調節された細胞プロセスは、一般に、細胞の生理学的状態又は病理学的状態の変化に感受性であり、エキソソームの生合成はまた、縦列に作用し、これらの作用は、エキソソームの量又は組成において顕在化することが考えられる。
我々の体内の細胞によって分泌されるエキソソームの少なくとも１つの画分は、循環中に放出されることであると一般に推測される。実際、容易に入手可能な体液、例えば血液及び尿中のエキソソームは、多くの細胞型を起源とすることが見出されており（2A）、腫瘍患者における循環するエキソソームと腫瘍由来のmicroRNAプロフィールは、類似していることが示された（6A）。合わせて、これらの特徴は、循環するエキソソームを、生体マーカーを同定するために理想的な標的にする（7A）。
エキソソームは、タンパク質及びRNAの積荷を両方運ぶので、体液中、例えば尿中及び血液中のエキソソームタンパク質及びRNAは、どちらも、疾患の生体マーカーとして評価される（7A）。尿エキソソームのプロテオミクスは、潜在的な生体マーカーについてプロファイルされている（8A〜11A）。エキソソームフェチュインAは、急性腎傷害を検出するための新規な尿生体マーカーとして同定されている（12A）。
生物学的サンプル
本書にて記載された方法及び組成物は、細胞の状態をモニタリングするために、その細胞によって分泌された前駆体miRNA対成熟miRNAの比を含む。好都合には、この比は、細胞の分泌物を含む生物学的サンプルを取ることによって決定され得る。
細胞が生物内に含まれる場合、このサンプルは、限定されないが、殆ど全ての生物の体液（限定されないが、血液、鼻咽頭分泌物、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門分泌液及び膣分泌液、汗及び精液を含む）を含む任意の数のものを含み得る。
エキソソームの調製
エキソソームは、当業者に公知の多くの方法を用いて調製され得る。一般には、細胞分泌液を含む培地が、遠心分離機にて1000 rpmで遠心分離され得る。次いで、上清を、1000 kDa分子量カットオフの限外濾過膜にて濃縮する。
或いは、又はこれに加えて、米国特許第6,899,863号は、カラムクロマトグラフィーを用いてエキソソームのような膜小胞を調製する方法を記載する。
エキソソームもまた、Sze et al（17A）において記載される技術を用いて調製され得る。
このプロトコールは、以下のように簡潔にまとめることができる。MSC分泌物を回収するために、コンフルーエントの80%のHuES9.E1培養物を、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄し、化学的に定義された無血清培養培地に移動させて一晩インキュベートし、PBSで洗浄し、そして新鮮な化学的に定義された無血清培養培地中で3日間培養する。
MSC分泌物を含む馴化培地を回収し、遠心分離によって浄化し、100 kDa MWカットオフ限外濾過膜（Satorius）を用いて50回遠心分離し、そして220 nmフィルターを通した濾過によって無菌化する。
エキソソームを単離し、そして調製するための方法の更に詳細な記載は、本書中他所に示されている。
miRNAの調製
miRNAは、例えば、当業者に公知の多くの手段のいずれかによって細胞分泌物から回収されたエキソソームから調製され得る。miRNAを調製するためのプロトコールの例は、以下である。
RNAは、１容量の馴化培地に３容量のTrizol LS（Invitrogen）を加え、製造業者のプロトコールに従って抽出を完了することによって、馴化培地から単離される。
総RNA及び小型RNAを、Trizol（Invitrogen）及びmirVana miRNA Isolation Kit（AppliedBiosystems）をそれぞれ用いて精製する。
RNAは、Quant-iTTM RiboGreen RNA Assay Kit（Invitrogen）を用いて定量化され、そして8%のグリオキサール又は15%のNovex Tris-ホウ酸塩-EDTA (TBE)-尿素ゲル（Invitrogen）を含む1.5%のアガロースゲル上で解析される。
ゲル上で分離されたRNAは、エチジウムブロミド（EB）染色によって可視化される。
或いは、又はこれに加えて、馴化培地を、等容量のPBS、細胞溶解緩衝液（Biovision）、40 mMシクロデキストリン（Sigma-Aldrich）又は4000 U/mlホスホリパーゼ A2（Sigma-Aldrich）と共に37℃で30分間インキュベートし、その後、10分の1容量の1 mg/ml RNase A（Roche）を加える。これらの混合物を、次いで、更に37℃で5分間インキュベートする。RNAを、Trizol LSで抽出し、TBE-尿素ゲルで分離した後にEBで染色する。
前駆体miRNA及び成熟miRNAの定量化
実施例は、miRNAを調製しそして単離するためのプロトコールを詳細に記載し、このプロトコールは、本書中で記載される方法及び組成物と共に用いられ得る。本書中で記載される方法及び組成物において使用されるmicroRNAは、当業者に公知の多くの方法を用いて調製され得る。
例えば、microRNAは、配列決定、ノーザンハイブリダイゼーション、改変Invader（登録商標）アッセイ、リアルタイムPCR、ループプライマーRT-PCR及びアレイハイブリダイゼーションなどを用いて検出されて定量化され得る。これらの技術は、以下でより詳細に記載される。
サンプル中のmicroRNAの配列決定は、サンプル中のmicroRNAの全集団を同定しそして定量的に解読するために行われてもよい。このようなサービスは、例えば、LC Sciences（www.lcsciences.com）によって提供される。
ノーザンハイブリダイゼーションは、miRNAを検出しそして定量化するために使用されていて、Lim, L. et al. 2003. Genes & Development 17:991-1008に記載されている。或いは、RNAse保護は、この目的のために使用され得る。RNase保護及びノーザンハイブリダイゼーションのためのプローブは、当業者に公知の従来的手段を通して作られ得る。mirVana（商標）miRNA Probe Construction KitAM1550（カタログ番号AM1550, Ambion, Applied Biosystems, Austin, Texas, USA）のようなキットが、この目的のために使用され得る。
Allawi, H. T. et al. 2004. RNA 10: 1153-1161によって記載される改変Invader（登録商標）アッセイは、miRNAを検出しそして定量化するためにもまた、使用され得る。改変Invaderアッセイは、定量的であり、感度が高く、そして迅速なmiRNAアッセイであり、細胞性の総RNAのほんの50〜100 ng又はほんの1,000個の溶解された細胞を用いて、miRNAの分析において成功裏に使用され得る。このアッセイは、前駆体miRNAと成熟miRNAとの間で1つのヌクレオチドによって異なるmiRNAの間を識別可能である。未画分の界面活性剤溶解物において実施され得るInvader miRNAアッセイは、マイクロタイタープレート中の蛍光検出を実施可能であって、且つ2〜3時間のインキュベーション時間を必要とするのみであり、ハイスループットスクリーニング分析において多数のサンプルの平行な分析を可能にする。
前駆体miRNA及び成熟miRNAの検出及び定量化はまた、当該分野で公知の種々の方法、例えば、米国特許第7,601,495号（Chen）に記載の方法を介して達成され得る。さらに、実施例は、成熟miRNA及び前駆体miRNAの検出及び定量ののためのプロトコールを詳細に記載していて、このプロトコールは、本書中で記載の方法及び組成物と共に使用され得る。米国特許第7,601,495号（Chen）に記載の方法は、成熟miRNAに好適である。
多くのキットもまた、前駆体miRNA及び成熟miRNAを検出及び定量化するために市販されていて、使用され得る。このようなキットの一例は、mirPremier（商標）microRNA Isolation Kit（カタログ番号SNC10及びSNC50, Sigma- Aldrich, St. Louis, Missouri, USA）である。miRNAの単離及び調製のために使用され得る別のキットは、RNAqueous（登録商標）-Micro Kit（カタログ番号AM 1931, Ambion, Applied Biosystems, Austin, Texas, USA）である。
例えば、miRNA検出及び定量化は、miRCURY LNA（商標）Universal RT microRNA PCR（Exiqon）を用いて実施され得る。これは、384ウェルPCRプレート中に事前に分取されたmicroRNA PCRプライマーセットを含む即時使用可能なパネルを含む。このウェルにcDNAが加えられてPCRマスター混合物が加えられ、730個までのmicroRNAのリアルタイム PCRプロファイリングが達成され得る。検出装置に応じて、microRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I+II, VI .M（カタログ番号203601, Exiqon A/S, Vedbaek, Denmark）又はmicroRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I+II, V 1.R（カタログ番号203602, Exiqon A/S, Vedbaek, Denmark）のいずれかが、使用され得る。
代替として、mirVana（商標）qRT-PCR miRNA Detection Kit（カタログ番号AM1558, Ambion, Applied Biosystems, Austin, Texas, USA）が、miRNAを検出しそして定量化するために使用され得る。
ループプライマーRT-PCR
例として、ループプライマーRT-PCRと呼ばれるリアルタイム定量化法が、成熟miRNAの正確且つ感度の高い検出のために使用され得る。このアッセイは、たった1ヌクレオチド異なる２種のmiRNAの間及び成熟miRNAとその前駆体との間の識別が可能である。
簡潔には、miRNAは、mirVana miRNA Isolation Kit（カタログ番号AM1560又はAM1561, Ambion, Applied Biosystems, Austin, Texas, USA）を用いて培養細胞から精製される。
次いで、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応が、実施される。このアッセイは、逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応の2工程を含む。逆転写工程は、ステムループ逆転写を含み、ここで、ステムループRTプライマーが、miRNA標的にアニーリングし、そして逆転写酵素の存在下で伸長する。RNAサンプル、ループプライマー、1X緩衝液、逆転写酵素及びRNaseインヒビターを含むRT反応物を、16℃及び42℃にてそれぞれ30分間インキュベートする。
ポリメラーゼ連鎖反応工程において、リアルタイムPCRが、実施される。microRNA特異的順プライマー、TaqMan（登録商標）プローブ及び逆プライマーが、PCR反応のために使用される。リアルタイムPCRは、Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR Systemにおいて実施される。データ分析のために、細胞あたりのコピー数を、合成lin-4 miRNAの標準曲線に基づいて概算する。miRNAの定量化は、測定されたCT値に基づいて概算される。
ノーザン分析もまた、実施され得る。溶液ハイブリダイゼーションに基づくノーザン分析が、mirVana（商標）miRNA Detection Kit（カタログ番号AM1552, Ambion, Applied Biosystems, Austin, Texas, USA）を用いて実施され得る。
この方法を回折する図は、図１３に示される。
マイクロアレイ分析
miRNA検出及び定量化はまた、マイクロアレイハイブリダイゼーションによって実施され得る。使用され得るプロトコールの一例は、以下である。
RNAは、Cy5又はCy3で標識され、そして事前に載せられたプローブとハイブリダイズする。
各実験におけるデータは、検出可能シグナルの検出、シグナル強度の計算及び示差比の計算を含む標準的データ分析を用いて分析される。第１に、バックグラウンドが減算される。バックグラウンドは、回帰ベースのバックグラウンドマッピング法を用いて決定される。回帰は、ブランク点を除く最低強度データ点5〜25%において実施される。
次いで、生データ行列からバックグラウンド行列を減算する。
バックグラウンド減算と共に、バックグラウンドを減算したデータにおいて、Cy3/Cy5チャネル標準化を、LOWESS（局在重量回帰）法を用いて実施する。
標準化は、サンプル量の変動、異なる標識色素及びスキャナーのシグナル取得の相違のような、システム関連の変動を除去し、これによって、生物学的変動が、はっきりと明らかにされ得る。
検出可能である転写物は、シグナル強度が、3（バックグラウンドSD）よりも強い場合、及び点CVが0.5未満である場合という少なくとも2つの条件に適合した場合、列挙される。CVは、（SD）／（シグナル強度）によって計算される。
繰り返しプローブが、アレイ上に見出される場合、繰り返しプローブのシグナルの少なくとも50%を超える検出レベルである場合にのみ、転写物が検出可能であるとして挙げられる。
マイクロアレイハイブリダイゼーションサービスは、市販の供給業者、例えばLC Sciences（www.lcsciences.com）によって実施され得る。このサービスは、μParaflo（登録商標）技術及び専売のプローブ設計を用いたゲノム全域に亘るmicroRNA（miRNA）発現プロファイリングサービスであり、miRNAの非常に感度の高い特異的直接検出を可能にする。Sanger miRBaseデータベースの最新バージョン（Release 14.0）において利用可能である全ての種の成熟miRNAについての標準的アレイが、使用される。
microRNA
microRNA（miRNA）は、以下からなる群より選択され得る：hsa-miR-424（miRBase登録番号MI0001446）、hsa-miR-424*（miRBase登録番号MI0001446）、hsa-miR-425（miRBase登録番号MI0001448）、hsa-miR-425*（miRBase登録番号MI0001448）、hsa-miR-454（miRBase登録番号MI0003820）、hsa-miR-455-3p（miRBase登録番号MI0003513）、hsa-miR-483-5p（miRBase登録番号MI0002467）、hsa-miR-484（miRBase登録番号MI0002468）、hsa-miR-491-5p（miRBase登録番号MI0003126）、hsa-miR-503（miRBase登録番号MI0003188）、hsa-miR-505*（miRBase登録番号MI0003190）、hsa-miR-532-5p（miRBase登録番号MI0003205）、hsa-miR-574-15-3p（miRBase登録番号MI0003581）、hsa-miR-584（miRBase登録番号MI0003591）、hsa-miR-612（miRBase登録番号MI0003625）、hsa-miR-625（miRBase登録番号MI0003639）、hsa-miR-629（miRBase登録番号MI0003643）、hsa-miR-708（miRBase登録番号MI0005543）、hsa-miR-744（miRBase登録番号MI0005559）、hsa-mir-766（miRBase登録番号MI0003836）、hsa-miR-768-3p（miRBase登録番号MI0005117）、hsa-miR-768-5p（miRBase登録番号MI0005117）、hsa-miR-769-5p（miRBase登録番号MI0003834）、hsa-miR-877（miRBase登録番号MI0005561）、hsa-miR-92、hsa-mir-92a-1（miRBase登録番号MI0000093）、hsa-mir-92a-2（miRBase登録番号MI0000094）、hsa-miR-92b（miRBase登録番号MI0003560）、hsa-miR-93（miRBase登録番号MI0000095）、hsa-miR-98（miRBase登録番号MI0000100）、hsa-miR-99a（miRBase登録番号MI0000101）、hsa-miR-99b（miRBase登録番号MI0000746）、hsa-let-7a、hsa-let-7a-l（miRBase登録番号MI0000060）、hsa-let-7a-2（miRBase登録番号MI0000061）、hsa-let-7a-3（miRBase登録番号MI0000062）、hsa-miR-151-3p（miRBase登録番号MI0000809）、hsa-miR-23a（miRBase登録番号MI0000079）、hsa-let-7b（miRBase登録番号MI0000063）、hsa-miR-151-5p（miRBase登録番号MI0000809）、hsa-miR-23a*（miRBase登録番号MI0000079）、hsa-let-7b*（miRBase登録番号MI0000063）、hsa-miR-152（miRBase登録番号MI0000462）、hsa-mir-23b（miRBase登録番号MI0000439）、hsa-let-7c（miRBase登録番号MI0000064）、hsa-miR-155（miRBase登録番号MI0000681）、hsa-miR-24、hsa-mir-24-1（miRBase登録番号MI0000080）、hsa-let-7d（miRBase登録番号MI0000065）、hsa-miR-15a（miRBase登録番号MI0000069）、hsa-miR-24-2*（miRBase登録番号MI0000081）、hsa-20、let-7d*、hsa-let-7d（miRBase登録番号MI0000065）、hsa-miR-15b（miRBase登録番号MI0000438）、hsa-miR-25（miRBase登録番号MI0000082）、hsa-let-7e（miRBase登録番号MI0000066）、hsa-miR-16、hsa-mir-16-1（miRBase登録番号MI0000070）、hsa-mir-16-2（miRBase登録番号MI0000115）、hsa-miR-26a、hsa-mir-26a-l（miRBase登録番号MI0000083）、hsa-mir-26a-2（miRBase登録番号MI0000750）、hsa-let-7f、hsa-let-7f-1（miRBase登録番号MI0000067）、hsa-let-7f-2（miRBase登録番号MI0000068）、hsa-miR-17（miRBase登録番号MI0000071）、hsa-miR-26b（miRBase登録番号MI0000084）、hsa-let-7g（miRBase登録番号MI0000433）、hsa-miR-181a、hsa-mir-181a-2（miRBase登録番号MI0000269）、hsa-miR-27a（miRBase登録番号MI0000085）、hsa-let-7i（miRBase登録番号MI0000434）、hsa-miR-181a*、hsa-mir-181a-1（miRBase登録番号MI0000289）、has-miR-27b（miRBase登録番号MI0000440）、hsa-miR-100（miRBase登録番号MI0000102）、hsa-miR-181a-2*（miRBase登録番号MI0000269）、hsa-miR-27b*（miRBase登録番号MI0000440）、hsa-miR-103、hsa-mir-103-2（miRBase登録番号MI0000108）、hsa-mir-103-1（miRBase登録番号MI0000109）、hsa-mir-103-1-as3（miRBase登録番号:MI0007261）、hsa-mir-103-2-as（miRBase登録番号MI0007261）、hsa-miR-181b、hsa-mir-181b-l（miRBase登録番号MI0000270）、hsa-mir-181b-2（miRBase登録番号MI0000683）、hsa-miR-28-3p（miRBase登録番号MI0000086）、hsa-miR-106a（miRBase登録番号MI0000113）、hsa-miR-181c（miRBase登録番号MI0000271）、hsa-miR-28-5p（miRBase登録番号MI0000086）、hsa-miR-572（miRBase登録番号MI0003579）、hsa-miR-106b（miRBase登録番号MI0000734）、hsa-miR-181d（miRBase登録番号MI0003139）、hsa-miR-296-5p（miRBase登録番号MI0000747）、hsa-miR-107（miRBase登録番号MI0000114）、hsa-miR-185（miRBase登録番号MI0000482）、hsa-miR-29a（miRBase登録番号MI0000087）、hsa-miR-574-5p（miRBase登録番号MI0003581）、hsa-25miR-10a、hsa-miR-186（miRBase登録番号:MI0000483）、hsa-miR-29c（miRBase登録番号MI0000735）、hsa-miR-575（miRBase登録番号MI0003582）、hsa-miR-122（miRBase登録番号MI0000442）、hsa-miR-187*（miRBase登録番号MI0000274）、hsa-miR-30a（miRBase登録番号MI0000088）、hsa-miR-1224-5p（miRBase登録番号MI0003764）、hsa-miR-18a（miRBase登録番号MI0000072）、hsa-miR-30a*（miRBase登録番号MI0000088）、hsa-miR-1228（miRBase登録番号MI0006318）、hsa-miR-18b（miRBase登録番号MI0001518）、hsa-miR-30b（miRBase登録番号MI0000441）、hsa-miR-1234（miRBase登録番号MI0006324）、hsa-miR-191（miRBase登録番号MI0000465）、hsa-miR-30c、hsa-mir-30c-2（miRBase登録番号MI0000254）、hsa-mir-30c-l（miRBase登録番号MI0000736）、hsa-miR-1237（miRBase登録番号MI0006327）、hsa-miR-191*（miRBase登録番号MI0000465）、hsa-miR-30d（miRBase登録番号MI0000255）、hsa-miR-638（miRBase登録番号MI0003653）、hsa-miR-1238（miRBase登録番号MI0006328）、hsa-miR-192（miRBase登録番号MI0000234）、hsa-miR-30e（miRBase登録番号MI0000749）、hsa-miR-663（miRBase登録番号MI0003672）、hsa-miR-124、hsa-mir-124-1（miRBase登録番号:MI0000443）、hsa-mir-124-2（miRBase登録番号MI0000444）、hsa-mir-124-3（miRBase登録番号MI0000445）、hsa-mir-124b（miRBase登録番号:MI0000260）、hsa-miR-193a-5p（miRBase登録番号MI0000487）、hsa-miR-30e*（miRBase登録番号MI0000749）、hsa-miR-671-5p（miRBase登録番号MI0003760）、hsa-miR-125a-3p（miRBase登録番号MI0000469）、hsa-miR-195（miRBase登録番号MI0000489）、hsa-miR-31（miRBase登録番号MI0000089）、hsa-miR-30、hsa-mir-30c-2（miRBase登録番号MI0000254）、hsa-mir-30c-1（miRBase登録番号MI0000736）、hsa-miR-125a-5p（miRBase登録番号MI0000469）、hsa-miR-197（miRBase登録番号MI0000239）、hsa-miR-31*（miRBase登録番号MI0000089）、hsa-miR-125b、hsa-mir-125b-1（miRBase登録番号MI0000446）、hsa-mir-125b-2（miRBase登録番号MI0000470）、hsa-miR-198（miRBase登録番号MI0000240）、hsa-miR-320、hsa-mir-320a（miRBase登録番号MI0000542）、hsa-mir-320b-1（miRBase登録番号MI0003776）、hsa-mir-320c-1（miRBase登録番号MI0003778）、hsa-mir-320b-2（miRBase登録番号MI0003839）、hsa-mir-320d-1（miRBase登録番号MI0008190）、hsa-mir-320c-2（miRBase登録番号MI0008191）、hsa-mir-320d-2（miRBase登録番号MI0008192）、hsa-mir-320e（miRBase登録番号MI0014234）、hsa-miR-765（miRBase登録番号MI0005116）、hsa-miR-126（miRBase登録番号MI0000471）、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-199a-3p（miRBase登録番号MI0000242）、hsa-mir-199a-2（miRBase登録番号MI0000281）、hsa-miR-324-5p（miRBase登録番号MI0000813）、hsa-miR-128、hsa-mir-128-1（miRBase登録番号MI0000447）、hsa-mir-128-2（miRBase登録番号MI0000727）、hsa-miR-199a875p、hsa-miR-328（miRBase登録番号MI0000804）、hsa-miR-130a（miRBase登録番号MI0000448）、hsa-miR-199b-5p（miRBase登録番号MI0000282）、hsa-miR-330-3p（miRBase登録番号MI0000803）、hsa-miR-130b（miRBase登録番号MI0000748）、hsa-miR-19b、hsa-mir-19b-1（miRBase登録番号MI0000074）、hsa-mir-19b-2（miRBase登録番号MI0000075）、hsa-miR-33l-3p（miRBase登録番号MI0000812）、hsa-miR-132（miRBase登録番号MI0000449）、hsa-miR-20a（miRBase登録番号MI0000076）、hsa-miR-335（miRBase登録番号MI0000816）、hsa-miR-137（miRBase登録番号MI0000454）、hsa-miR-20b（miRBase登録番号MI0001519）、hsa-miR-342-3p（miRBase登録番号MI0000805）、hsa-miR-923（miRBase登録番号MI0005715）、hsa-miR-140-3p（miRBase登録番号MI0000456）、hsa-miR-21（miRBase登録番号MI0000077）、hsa-miR-345（miRBase登録番号MI0000825）、hsa-miR-143（miRBase登録番号MI0000459）、hsa-miR-210（miRBase登録番号MI0000286）、hsa-miR-34a（miRBase登録番号MI0000268）、hsa-miR-145（miRBase登録番号MI0000461）、hsa-miR-212（miRBase登録番号MI0000288）、hsa-miR-34a*（miRBase登録番号MI0000268）、hsa-miR-145*（miRBase登録番号MI0000461）、hsa-miR-214（miRBase登録番号MI0000290）、hsa-miR-361-5p（miRBase登録番号MI0000760）、hsa-miR-933（miRBase登録番号MI0005755）、hsa-miR-146a（miRBase登録番号MI0000477）、hsa-miR-22（miRBase登録番号MI0000078）、hsa-miR-362-3p、5、hsa-miR-940（miRBase登録番号MI0005762）、hsa-miR-146b-5p（miRBase登録番号MI0003129）、hsa-miR-22*（miRBase登録番号MI0000078）、hsa-miR-362-5p（miRBase登録番号MI0000762）、hsa-miR-148b（miRBase登録番号MI0000811）、hsa-miR-221（miRBase登録番号MI0000298）、hsa-miR-365、hsa-mir-365-1（miRBase登録番号MI0000767）、hsa-mir-365-2（miRBase登録番号MI0000769）、hsa-miR-149（miRBase登録番号MI0000478）、hsa-miR-221*（miRBase登録番号MI0000298）、hsa-miR-374b（miRBase登録番号MI0005566）、hsa-miR-149*（miRBase登録番号MI0000478）、hsa-miR-222（miRBase登録番号MI0000299）、hsa-miR-421（miRBase登録番号MI0003685）、hsa-miR-150*（miRBase登録番号MI0000479）、hsa-miR-222*及びhsa-miR-423-5p（miRBase登録番号MI0001445）。
miRBaseデータベースは、公開されたmiRNA配列及び注釈の検索可能なデータベースであり、http://www.mirbase.orgでアクセスし得る。miRBaseは、以下の記事において記載される。miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Griffiths- Jones S, Grocock RJ, van Dongen S, Bateman A, Enright AJ. NAR, 2006, 34, Database Issue, D140-D144；The microRNA Registry. Griffiths-Jones S. NAR, 2004, 32, Database Issue, D109-D111。以下の出版物は、miRNA注釈におけるガイドラインを提供する。A uniform system for microRNA annotation. Ambros V, Bartel B, Bartel DP, Burge CB, Carrington JC, Chen X, Dreyfuss G, Eddy SR, Griffiths-Jones S, Marshall M, Matzke M, Ruvkun G, Tuschl T. RNA, 2003, 9(3), 277-279。
マイクロアレイ
我々は、上に列挙したmiRNAのそれぞれの前駆形態と成熟形態とに特異的に結合可能であり、そしてこれらを識別可能である核酸配列を含むセットを記載する。
核酸配列のセットは、規則正しい様式で好都合に並べられ得る。これらは、基板に付着されてもよい。例えば、このような核酸のセットを含むマイクロアレイが、提供され得る。
マイクロアレイは、microRNAの前駆形態にハイブリダイズしそして検出することが可能なプライマーのセット又はプローブ、並びにmicroRNAの成熟形態にハイブリダイズしそして検出することが可能なプライマーのセット又はプローブを含み得る。
このようなマイクロアレイの構築は、Sanger miRBase Release 10.1に列挙されたmiRNA転写物のリストを利用し得る。
pre-miRNA対成熟miRNA比
pre-miRNA対成熟miRNA比は、miRNA種の前駆形態対miRNA種の成熟形態の量の比として単純に計算され得る。
或いは、又はこれに加えて、細胞状態における変化の結果として変化しないことが知られているmiRNA種の前駆形態対成熟形態の比は、内部対照として使用され得る。
従って、miRNA種のpre-miRNA対成熟miRNA比における変化をモニタリングすることの代わりに、又はこれに加えて、第１の比対第２の比が、モニタリング目的のために使用され得る。ここで、第１の比は、細胞状態における変化の結果として変化することが知られているmiRNA種の前駆形態対成熟形態の比であり、そして第２の比は、細胞状態における変化の結果として変化しないことが知られているmiRNA種の前駆形態対成熟形態の比である。
pre-miRNA対成熟miRNA比プロフィール
1つのmiRNA種の前駆体miRNA対成熟miRNAの比を決定する代わりに、又はこれに加えて、それぞれが細胞の状態の指標である、複数の選択されたmiRNA種についての複数のpre-miRNA対成熟miRNA比を含むプロフィールもまた、確立され得る。このようなプロフィールの変化は、細胞の状態をモニタリングするための手段として、モニタリングされ得る。このプロフィールは、当該分野で公知の任意の手段、例えば、複数の選択されたmiRNA種の前駆形態と成熟形態とに結合可能であり且つこれらを識別可能である複数のプローブを含むアレイへのハイブリダイゼーションによって確立され得る。
他の用途
我々は、細胞の状態における変化を検出するための方法を記載する。この方法は、細胞のpre-miRNA対成熟miRNA比（又はこのような比を含むプロフィール）における変化を検出することを含み、ここで、このような変化は、細胞の状態における変化の指標である。
我々は、細胞が特定の状態にあることを確立する方法を記載する。この方法は、細胞のpre-miRNA対成熟miRNA比（又はこのような比を含むプロフィール）と特定の状態にあることが分かっている細胞のpre-miRNA対成熟miRNA比（又はこのような比を含むプロフィール）とを比較することを含む。
我々は、生物の状態をモニタリングする方法を記載する。この方法は、この生物のサンプル又はこの生物由来のサンプルを得ること、サンプル中のmiRNA種のpre-miRNA対成熟miRNA比を確立すること、及び得られたpre-miRNA対成熟miRNA比からこの生物の状態を確立することを含む。
我々は、生物における疾患を検出する方法を記載する。この方法は、この生物からサンプルを得ること、サンプル中のmiRNA種のpre-miRNA対成熟miRNA比を確立すること、及び得られたpre-miRNA対成熟miRNA比と疾患に罹患している生物のサンプル又はそのような生物に由来するサンプルのpre-miRNA対成熟miRNA比とを比較することを含む。
我々は、生物における疾患の処置又は予防の方法を記載する。この方法は、上述のように生物における疾患を検出すること、及びこの生物に対しこの疾患に対する処置を施すことを含む。
実施例1〜15は、間葉系幹細胞の癌遺伝子による形質転換を記載する。実施例16〜25は、細胞の状態をモニタリングするためのマーカーとしてのpre-miRNA対成熟miRNA比の使用を記載する。
実施例１．材料及び方法−huES9.E1 MSC癌遺伝子による形質転換
以前に記載されたヒトESC由来huES9.E1 MSCを、21代目又は16代目の継代にてc-myc遺伝子又はGFP遺伝子のいずれかを担うレンチウイルスで感染させて、それぞれcmyc-MSC及びGFP-MSCという2種の形質転換細胞を産生した。c-myc cDNAを、pMXs-hc-MYC [32]から、PTDmyc（5' GAA TTC GAA TGC CCC TCA ACG TTA GC 3'）プライマー及びPTDmyca（5' CTC GAG CGC ACA AGA GTT CCG TAG C 3'）プライマーを用いて増幅させた。増幅した断片を、pDriveベクター内に組み込み、そして配列決定を行った。c-myc断片を消化し、そしてXhol（充填）／EcoRl断片としてSmal／EcoRlで消化したpLVX-puroベクター内に、適合する末端でクローニングした（Clontech, www.clontech.com）。レンチウイルス粒子を、Lenti-X HT Packaging System（Clontech, www.clontech.com）を用いて、製造業者のプロトコールにしたがって産生した。ウイルス力価を、Lenti-X（商標）qRT-PCR titration kit（Clontech, www.clontech.com）を用いて決定した。21代目の継代で感染させたHuES9.E1 hESC-MSCs [24]を、10 cm皿あたり106個の細胞でプレート培養し、そして4μg/mlのポリブレンの存在下でMOI=5にて一晩ウイルスで感染させた。翌日、培養培地を、新鮮な培地に置換した。感染の48時間後に、培養培地をピューロマイシン（2μg/ml）含有の培養培地と置き換えることにより、選択を開始した。選択の3日後、細胞を、ヒトESC由来huES9.E1 MSCと同じく増殖させ、そしてこれらの細胞をプールして、E1-myc 21.1系統として産生した。16代目の継代で感染させたHuES9.E1 hESC-MSCs [24]については、細胞を、6ウェルプレートの3つのウェル上にプレート培養した。各ウェルについてのウイルス感染及びその後の薬剤選択を、上述の通りに実施した。3種の独立に感染した細胞培養物のそれぞれに由来するクローン系統を、限界希釈によって得た。クローニングした細胞を107個の細胞になるまで（又は15 cm培養皿にコンフルーエントになるまで）増殖させ、この細胞を、p1と名付けた。3種のクローン系統を産生し、それぞれ、E1-myc 16.1系統、E1-myc 16.2系統及びE1-myc 16.3系統と名付けた。c-myc又はGFP導入遺伝子の組み込みを、c-mycのエキソン2及びエキソン3についての特異的プライマー、それぞれ：5'-GCCCCTGGTGCTCCATGAGGAGACACC'-3'及び5'-ACATTCTCCTCGGTGTCCGAGG-3、を用い、以下のPCR条件：94、2分間1サイクル；94℃15秒間、60℃30秒間、72℃90秒間32サイクル、及び72℃5分間1サイクルを用いてゲノムDNAを増幅させることにより、確認した。PCR産物を、1%アガロースゲル上で解析した。
myc-MSCの脂肪細胞、軟骨細胞及び骨細胞への分化を、脂肪生成、軟骨生成、及び骨生成のhMSC Differentiation BulletKit（Lonza, Walkersville, MD）を、製造業者の指示通りにそれぞれ用いて行った。G-bandingによる核型分析を、Cytogenetics Laboratory, KKHによって実施した。
実施例２．材料及び方法−テロメラーゼ活性
相対的テロメラーゼ活性を、Wege H. et al [33]に記載された方法の変法を用いてSYBR（登録商標）Greenリアルタイム定量化テロメア反復配列増幅プロトコールアッセイによって測定した。簡潔にいうと、300万個の細胞を回収し、そして細胞溶解物を、市販の哺乳動物細胞抽出キット（Cat K269-500-1, BioVision, www.biovision.com）を用いて調製した。PCR増幅のための試薬の組成は、総容量25μl中、1μgのタンパク質細胞溶解物、0.1μgのTSプライマー（5'-AATCCGTCGAGCAGACTT-3'）、0.1μgのACXプライマー（5'-GCGCGG[CTTACC]3CTAACC-3'）を有する、10μlの2× SYBR Green Super Mix（Cat 170-8880, BioRad, Singapore）及び10mMのEGTAであった。反応液を、最初に25℃で20分間インキュベートして、細胞溶解物中のテロメラーゼによりTSプライマーを伸長させ、その後95℃で2分間インキュベートしてテロメラーゼ活性を不活化してプライマーを変性させた。テロメラーゼ産物を、95℃30秒間、60℃90秒間の40サイクルのPCRによって増幅させた。相対的テロメラーゼ活性を、1μgタンパク質細胞溶解物についての閾値サイクル数（又はCt値）を用いて、HEK293細胞に対して評価した。
実施例３．材料及び方法−細胞周期の速度
細胞周期速度を評価するために、2×107個の細胞を、PBS中2mlの10μM CFDA（Molecular Probe, Eugene, Or）で37℃にて15分間前標識し、24時間培養し、次いで、ゼラチンで被膜した6ウェルにおいて１ウェルあたり5×104個の細胞で再プレート培養した。0時間目、24時間目、48時間目及び72時間目に、二連のウェルからの細胞を回収し、2%のパラホルムアルデヒド中で固定し、FACSplus（Becton Dickinson; San Jose, CA）で分析した。24時間あたりの細胞周期の数を計算し、1回の細胞分裂を表す細胞蛍光の各半量を推定した。従って、24時間あたりの細胞周期の数（n）を、n=lg(F-Fn)/lg2とし、ここで、Fは、初期の平均細胞蛍光であり、Fnは、24時間後の平均細胞蛍光であるとして計算した。次いで、細胞周期の数を、時間に対してプロットし、細胞周期あたりの平均時間を導いた。
実施例４．材料及び方法−表面抗原分析
Hus9E1 MSC及びE1myc MSC上の細胞表面抗原の発現を、フローサイトメトリを用いて分析した。細胞を、5分間トリプシン処理し、遠心分離し、培養培地中に再懸濁し、そして細菌培養皿中で1時間37℃、5% CO2インキュベーター内でインキュベートした。次いで、細胞を回収し、遠心分離し、2% FBSで洗浄した。次いで、2.5×105個の細胞を、以下の複合モノクローナル抗体のそれぞれと共に氷上で60分間インキュベートした：CD29-PE、CD44-FITC、CD49a-PE、CD49e-PE、CD105-FITC、CD166-PE、CD73-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC、HLADR-PE、及びMHC1-PE（PharMingen、San Diego、CA）。インキュベーション後、細胞を洗浄し、そして2% FBS中に再懸濁した。同様の細胞アリコートを、アイソタイプが適合したマウスモノクローナル抗体（PharMingen、San Diego、CA）と共にインキュベーションすることにより、非特異的蛍光を決定した。データを、CELLQuestソフトウェアを用い、BD FACSCalibur（商標）Flow Cytometer（BD Biosciences, San Jose, CA）機器において20,000事象を回収することによって分析した。
実施例５．材料及び方法−qRT-PCRによるRNAの分析
細胞における相対的myc転写物レベルを、qRT-PCRを用いて決定した。GFP-MSC（p17）及びE1myc-MSC（p24、p27、p29）からの20ngのRNAを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（ABI, USA）を用いてcDNAに変換した。次いで、cDNAを、StepOnePlus Real-Time PCR system（Applied Biosystems, www.appliedbiosystems.com.sg）にて、myc転写物又はアクチン転写物のいずれかに特異的なプライマーセットで、94℃10分間1サイクル、94℃15秒間、60℃60秒間40サイクル及び95℃15秒間、60℃60秒間、95℃15秒間1サイクルによって増幅した。myc特異的プライマーセットは、5'-CCCGCCCCTGTCCCCTAGCCG-3'及び5'- AGAAGGGTGTGACCGCAACGTAG3'である。
実施例６．材料及び方法−Illumina遺伝子チップ分析
総RNAを、myc-MSCの異なる継代から技術的な三組（technical triplicates）を調製した。RNAを、Illumina（登録商標）TotalPrep RNA Amplification Kitを用いて、p4、p7及びp8のE1-myc 16.3細胞及びp15及びp16の親HuES9- E1 MSCから調製した。500ngのRNAを、Illumina RNA Amplification Kit（Ambion, Inc., Austin, TX）を製造業者の指示に従って用いて、ビオチン化cRNAに変換した。750ngのビオチン化cRNAを、Sentrix HumanRef-8 Expression BeadChip Version 3（Illumina, Inc., San Diego, CA）に対してハイブリダイズし、洗浄及びスキャンを、Illumina BeadStation 500xマニュアルに従って実施した。データを、Genespring GX 10を用いて分析した。変位値標準化を、75パーセンタイルにシフトすることによって実施し、そして標準化データを、全てのサンプルの中央値に対しベースライン変換した。
実施例７．材料及び方法−ウェスタンブロットハイブリダイゼーション
タンパク質を、4〜12%のSDS-ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜上に電気ブロットし、ブロックし、ヒトCD9、ACTIN（Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）及びMYC（Abcam, Cambridge, MA）に対する一次抗体と共にインキュベートした。次いで、このブロットを、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）と共にインキュベートし、その後、HRP増大化学発光基質（Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA）と共にインキュベートし、そしてX線フィルムに曝露した。
実施例８．材料及び方法−微粒子のHPLC精製
機器セットアップは、二つのポンプ、自動インジェクター、恒温カラムオーブン及びUV可視検出器を有する液体クロマトグラフィーシステムから成り、Shimadzu Corporation（Kyoto, Japan）からのClass VPソフトウェアによって操作された。使用されたクロマトグラフィーカラムは、Tosoh Corporation（Tokyo, Japan）からのTSK Guard column SWXL, 6 x 40 mm及びTSK gel G4000 SWXL, 7.8 x 300 mmであった。以下の、Dawn 8（光散乱）、Optilab（屈折率）及びQELS（動的光散乱）の検出器を、一連でUV可視検出器の後に繋げた。最後の3つの検出器は、Wyatt Technology Corporation（California, USA）からのものであり、ASTRAソフトウェアによって操作された。サンプルの成分を、サイズ排除によって、すなわち、高分子が低分子の前に溶出することにより、分離した。使用した溶出緩衝液は、150 mMのNaClを含む20 mMリン酸緩衝液、pH 7.2であった。この緩衝液を、0.1μmの孔サイズを通して濾過し、そして使用前に15分間脱気した。クロマトグラフィーシステムを、Dawn 8におけるシグナルが約0.3検出器電圧単位にて安定化するまで流速0.5 ml/分で平衡化した。UV可視検出器を、220nmに設定し、そしてカラムを25℃にてオーブン平衡化した。溶出様式は、均一溶媒であり、そして実行時間は、40分間であった。注入されたサンプルの容量は、50〜100μlの範囲であった。流体力学半径Rhを、QELS及びDawn 8検出器によってコンピューター処理した。ピーク頂点における最高計数率（Hz）を、Rhとして取得した。220nmにて可視化した分離した成分のピークを、更なる特徴付け研究のための画分として回収した。
実施例９．材料及び方法−心臓保護に関する分泌物の試験
分泌物を、以前に記載された[34]ように、化学的に定義された無血清培養培地中で3日間形質転換したMSCを増殖させることによって調製した。簡潔にいうと、まずp12の細胞を、上述のように、血清含有培養培地中で増殖させた。p15において、80%コンフルーエントの細胞培養物を、PBSで3回洗浄し、次いでフェノールレッド非含有且つインスリン、トランスフェリン及びセレンタンパク質（ITS）（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）、5ng/ml FGF2（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）、5ng/ml PDGF AB（Peprotech, Rocky Hill, NJ）、グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン、及びβ−メルカプトエタノールで補強されたDMEM（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）から成る化学的に定義された培地中で一晩インキュベートした。次いで、細胞培養物をPBSで洗浄し、そして新鮮な化学的に定義された培地で更に3日間置き換えて、馴化培地を産生した。このCMを回収し、そして500 x gで遠心分離することによって浄化した。浄化されたCMを、100 kDaのMWカットオフ膜（Satorius, Goettingen, Germany）によるタンジェント流濾過システムを用いて容量を50分の1に減らすことによって、50倍に濃縮した。100 kDaのMWカットオフ膜の使用は、100 kDa未満のMWを有する分子にフィルターを通させ、100 kDa未満の分子の優先的な欠失を生じる。次いで、濃縮されたCMを、220nmのフィルターを通した濾過によって滅菌した。
このCMを、虚血及び再灌流傷害のマウスモデルにて試験した。MIを、30分間の左冠状動脈（LCA）の結紮、及びその後の再潅流によって誘導した。再潅流の5分前に、マウスに、myc-MSCによって馴化された培養培地から精製した0.3μgのエキソソームタンパク質の生理食塩水溶液200μlを静脈内注入した。対照動物に、200μlの生理食塩水を注入した。再潅流の24時間後に、以前に記載された[27]エバンスブルー色素注入及びTTC染色を用いて危険領域（AAR）の百分率として梗塞サイズ（IS）を評価した。
実施例１０．材料及び方法−統計分析
Post hoc Dunnettを伴うtwo-way ANOVAを、群間の梗塞サイズにおける相違を試験するために使用した。アレイの各対の相関係数を、ピアソン相関試験を用いて評価した。
実施例１１．結果−huES9.E1 MSC培養物の形質転換
21代目の継代におけるHuES9.E1 MSCを、GFP含有レンチウイルス又はmyc含有レンチウイルスのいずれかによって感染させた。感染した培養物を、ピューロマイシン選択の下で3日間静置した。生存している細胞を、プールした。ゲノムDNAのPCR増幅は、myc導入遺伝子がゲノム内に成功裏に組み込まれたことを実証した（図１A）。プールされてE1-myc 21.1系統を形成したmyc形質転換された細胞とは異なり、GFP形質転換された細胞は、増殖の速度の低下及びより平坦な、拡散する形態を獲得する老化に進行し（図１B）、そしてp26を超えて増殖できなかった。myc形質転換細胞は、GFP形質転換細胞（GFP-MSC）と比較して、c-myc転写物レベルにおいて100倍高く発現しており（図１C）、より高いテロメラーゼ活性を発現していた（図１D）。独立してクローニングされる系統を産生するために、p16における3つのHuES9.E1 MSC培養物を、独立して感染させ、そしてピューロマイシン薬剤選択下にて静置した。生存している細胞培養物を、限界希釈によってクローニングし、3つの系統、E1-myc 16.1系統、E1-myc 16.2系統及びE1-myc 16.3系統をそれぞれ産生した。この系統を、G-bandingによって核型分析した。3つ全ての細胞株の細胞形態は、E1-myc 21.1系統の細胞形態と類似していた。E1-myc 16.3系統のみが、20/20中期におけるp11〜q13の間に9番染色体の挾動原体逆位を持つ46XXの親の核型を有するので[24]、全てのその後の実験において使用した（図１E）。その親細胞とは対照的に、myc形質転換された細胞は、非形質転換MSCの集団倍加時間19時間に対し、集団倍加時間13時間でより速く増殖した。平均細胞周期時間は、以前に記載された通り[35]、CFDA細胞標識を用いて、19時間から11時間に短縮された（図１F）。形質転換された細胞は、効率的に老化を回避し、そしてその増殖速度を少なくとも更に20代の継代について維持し続けた。形質転換された細胞は、顕著な核を有し、より小さくより丸かった。これらの細胞はまた、細胞塊の形成を生じる接触阻害もまた欠失していた（図１C）。増殖の増大と一致して、細胞は、GFP形質転換細胞又は非形質転換細胞よりも高いレベルのテロメラーゼ活性を有した（図１E）。
実施例１２．結果−myc-MSCの評価
myc-MSC培養物を、ヒトMSCの定義についてのISCT最小基準[31]に従って評価した。以前に観察されたように（図１C）、培養物は、プラスチック培養皿に接着せず、その非形質転換MSCは、特にコンフルーエントにおいて、細胞は、プラスチック皿に単層として接着する代わりに塊を形成し始めた。myc形質転換細胞の表面抗原プロフィールは、MHC Iのネガティブ発現を除き、その親細胞のプロフィールと非常に類似していた。細胞は、CD29+、CD44+、CD49a+CD49e+、CD73+CD105+、CD166+、MHCI-、HLA-DR-、CD34-及びCD45-であった（図２）。ポリクローナルE1-myc 21.1細胞株及びモノクローナルE1-myc 16.3細胞株の両方のインビトロ分化能を、次に試験した（図３）。両細胞株は、軟骨細胞及び骨細胞に容易に分化した（図３A、図３B）が、脂肪細胞には分化しなかった。MSCにおける脂肪形成の誘導は、3日間の誘導培地への曝露及び3日間の維持培地への曝露からなる6日間の処理プロトコール4サイクルを必要とした。我々は、誘導培地への曝露は、myc形質転換細胞において死を誘導したが、非形質転換親細胞の死は誘導しなかったことを観察した（図３C）。これらの観察は、myc形質転換細胞は、脂肪形成分化を受けられないことを示唆した。同時に、これらの観察は、myc形質転換はMSCの基本的な特徴を変更しないことが観察された以前の報告[29]とは異なり、我々がここで、c-myc形質転換は、MSCの定義された特性、すなわち、脂肪形成を受ける能力に影響を与えることを観察したことを実証した。
実施例１３．結果−遺伝子発現プロフィール
myc形質転換MSC及びそれらの親MSCの、マイクロアレイハイブリダイゼーションによる全ゲノムに亘る遺伝子発現プロファイリングを実施し、細胞型間の関係性を評価した。マイクロアレイハイブリダイゼーションを、Sentrix Human Ref-8 Expression BeadChip version 3（Illumina, Inc., San Diego, CA）上で、p4、p7及びp8におけるE1-myc 16.3 MSC由来のRNA並びにp15及びp16の親HuES9-E1 MSC由来のRNAを用いて、二連で実施した。E1-myc 16.3 MSCの異なる継代間又は親HuES9-E1 MSCの異なる継代間の遺伝子発現プロフィールは、0.98を超える相関値を有し、非常に類似していた。E1-myc 16.1 MSCと親HuES9-E1 MSCとの間の相関係数r2はまた、比較的高く、0.92であった（図４A）。E1-myc 16.1 MSCにおける少なくとも2倍、総計161個の遺伝子の発現量が増加されていて、そして226個の遺伝子の発現量が減少されており、このことは、myc形質転換後の遺伝子発現における変化が存在することを示唆していた。これらの異なって発現される遺伝子は、PANTHER（Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships）によって、機能的にクラスター形成されており[36, 37]、ここで、各遺伝子セットにおけるそれぞれの生物学的プロセスについて観察された遺伝子の頻度を、この場合NCBIデータベースにおける生物学的プロセスについての遺伝子の頻度である参照頻度と比較した。161の発現量が増加された遺伝子について、11の過剰提示された生物学的プロセスがあり、すなわち、代謝プロセス、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド及び核酸代謝プロセス、一次代謝プロセス、アミノ酸輸送、硫黄代謝プロセス、オルガネラ形成、ミトコンドリア形成、ペルオキシソーム輸送、細胞性アミノ酸及び誘導体代謝プロセス、ポリリン酸異化プロセス及びタンパク質代謝プロセスであった。4の過少提示されたプロセスがあり、すなわち、小胞媒介型輸送、エキソサイトーシス、細胞表面受容体結合型シグナル伝達及び免疫系プロセスであった（図４B）。226の発現量が減少された遺伝子において、37の過剰提示された生物学的プロセス及び1つの過少提示された生物学的プロセスがあった（図４C）。
発現量が増加された遺伝子について、関連の過剰提示されたプロセスの多くは、一般に、細胞集団の増加又は細胞分裂のためのタンパク質同化活性のために重要であり、観察された細胞増殖活性の増大と一致していた。過少提示されたプロセス、すなわち小胞媒介型輸送、エキソサイトーシスは、エキソソーム産生が影響しない可能性を示唆した。発現量が減少された遺伝子について、37の過剰提示されたプロセスは、接着、分化、情報伝達、免疫応答、細胞死及び代謝に関連するプロセスに広範に分類され得た。これらのプロセスもまた、myc形質導入MSCの我々の観察の幾つか、すなわちプラスチックへの接着の低減、脂肪形成分化能の欠失及びMHC I発現の欠失と一致した。
実施例１４．結果−分泌物の心臓保護活性
myc形質転換MSCにおける脂肪形成能の欠失は、ESC由来MSCの特徴の他の局面、例えば治療用エキソソームの産生もまた、形質転換によって損なわれ得ることを示した。我々は、ESC由来MSCによって分泌されたエキソソームが心筋虚血及び再灌流傷害のマウスモデルにおいて保護的であったことを以前に実証した[27]。この局面が損なわれたか否かを試験するため、形質転換された細胞を、化学的に定義された培地中で増殖させ、馴化培養培地（CM）を回収し、そしてエキソソームを以前に記載されたように[34, 38]精製した。形質転換体におけるc-myc転写物及びタンパク質レベルの増大にも関わらず、c-mycタンパク質は、CM中及び精製されたエキソソーム中において検出不能であった（図５A）。CMのHPLCタンパク質プロフィールは、非形質転換MSC由来のCMのHPLCタンパク質プロフィール[38]に類似していて（図５B）、最も速い溶出画分は、約12分間の保持時間を有した。このピークの動的光散乱分析は、50〜65 nmの範囲の流体力学半径以内の粒子の存在を明らかにした。代表的な実行において、我々は、通常、馴化培地1リットルあたり約1.5mgのエキソソームを精製した。E1-myc 21.1又はE1-myc 16.3のいずれかに由来するHPLC精製されたエキソソームを、心筋虚血−再灌流傷害のマウスモデルに、マウス1匹あたりそれぞれ0.3又は0.4μgの用量で投与した（図５C）。E1-myc 21.1エキソソーム処理された群、E1-myc 16.3エキソソーム処理された群又は生理食塩水処理された対照群における左心室（LV）領域の百分率としての危険領域（AAR）は、それぞれ39.1±3.4％、41.7±4.7％及び40.8±11.8％であって、類似していた。E1-myc 21.1エキソソーム又はE1-myc 16.3エキソソームで処理されたマウスにおける相対的梗塞サイズ（IS/AAR）は、それぞれ23.4±8.2％及び22.6±4.5％であり、その相対的梗塞サイズは、生理食塩水処理されたマウスにおける相対的梗塞サイズである38.5±5.6％よりも有意に低かった（それぞれp<0.001及びp<0.002）。
実施例１５．考察
この報告は、c-myc遺伝子の過剰発現によるヒトESC由来MSCの形質転換を記載する。この形質転換は、細胞が老化を回避すること、テロメラーゼ活性を増大すること、及び増殖を増強することを可能にした。一般に、形質転換細胞対その親細胞の間の全ゲノムに亘る遺伝子発現は、0.92の相関係数で保存された。形質転換細胞はまた、以下の表面抗原プロフィールの特徴を有する：CD29+、CD44+、CD49a+CD49e+、CD105+、CD166+、MHCI-、HLA-DR-、CD34-及びCD45-。形質転換細胞は、ヒトMSCの定義についてISCT最小基準における基本的要求の大部分を満たす[31]が、これらは、それにも関わらず、改変MSC表現型を有する。それらは、プラスチックに対する接着性の低下及び脂肪形成を受けないことを示し、これは、皮肉にも、ヒトESC由来MSCにおける3つの基本的MSC分化能の中でも最も強力であると報告されていた[24]。従って、myc形質転換後にMSC特性における基本的な変化はないことが観察されたという以前の報告[29]とは対照的に、我々は、myc形質転換細胞における幾つかの基本的な変化、例えば、細胞がもはやヒトMSCの定義についてのISCT最小基準[31]を満たさないこと、及び技術的にMSCではないことを観察した。定義のMSC特性の欠失にも関わらず、myc形質転換細胞は、虚血／再灌流傷害のマウスモデルにおいて梗塞サイズを縮小し得るエキソソームを分泌し続けた。しかし、我々は、各細胞によって分泌されるエキソソームの量が形質転換後に減少したが、これは、高い増殖速度によって又はエキソソームの回収のための細胞の高い細胞密度でのプレート培養によって、適切に補強され得ることに留意した。従って、c-myc形質転換は、治療剤又は送達ビヒクルのいずれかとしてのエキソソームの産生のための細胞の無限の供給源を確実にする実践的戦略を表す。更に、増殖速度の増大は、細胞産生のための時間を縮小し、それによって産生費用を低下させる。
実施例１６．材料及び方法：c-mycレンチウイルスベクター及びGFPレンチウイルスベクターの構築及び産生
c-myc cDNA配列を、XhoI又はEcoRIの制限部位のいずれかを含むプライマーを用いてpMXs-hc-MYC（15A）から増幅させた。
次いで、増幅させた断片を、XhoI又はEcoRIで切断し、そしてXhoI-EcoRI制限消化したレンチウイルスベクターpLVX-puro（Clontech, www.clontech.com）内にクローニングした。
次いで、組換えベクターを配列決定し、組換えmyc配列を確認した。レンチウイルス粒子を、Lenti-X HT Packaging System（Clontech, www.clontech.com）を製造業者のプロトコールを用いて産生した。
ウイルス力価を、Lenti-X（商標）qRT-PCR titration kit（Clontech, www.clontech.com）を用いて決定した。
実施例１７．材料及び方法：MSCの形質転換
22代目の継代におけるHuES9.E1 hESC-MSCs（14A）を、c-myc導入遺伝子又はGFP導入遺伝子のいずれかを含むレンチウイルスで感染させた。
細胞を、10 cm皿あたり106個の細胞でプレート培養した。翌日、細胞に、4μg/mlポリブレン存在下、MOI=5でウイルスを一晩感染させた。
翌日に培養培地を交換し、そして感染の48時間後に、ピューロマイシン（2μg/ml）での選択を開始した。
c-myc導入遺伝子又はGFP導入遺伝子の挿入を、エキソン2及びエキソン3に特異的なプライマー、それぞれ：5'- GCCCCTGGTGCTCCATGAGGAGACACC-3'及び5'-ACATTCTCCTCGGTGTCCGAGG-3'を用い、94℃、2分間1サイクル；94℃、15秒間；60℃、30秒間；72℃、90秒間32サイクル及び72℃、5分間1サイクルのPCR条件下で、ゲノムDNAを増幅することによって確認した。
PCR産物を、1％アガロースゲル上で解析した。
実施例１８．材料及び方法：テロメラーゼ活性
相対的テロメラーゼ活性を、Wege H. et al（16A）によって記載された方法の変法を用いたSYBR（登録商標）Greenリアルタイム定量的テロメア反復増幅プロトコールアッセイによって測定した。
簡潔にいうと、300万個の細胞を回収し、そして細胞溶解物を、市販の哺乳動物細胞抽出キット（Cat K269-500-1, BioVision, www.biovision.com）を用いて調製した。
PCR増幅のための試薬の組成は、総容量25μl中、1μgのタンパク質細胞溶解物、0.1μgのTSプライマー（5'-AATCCGTCGAGCAGACTT-3'）、0.1μgのACXプライマー（5'- GCGCGG[CTTACC]3CTAACC-3'）を含む、10μlの2×SYBR Green Super Mix（Cat 170-8880, BioRad, Singapore）及び10mM EDTAであった。
反応液を、まず、25℃で20分間インキュベートして、細胞溶解物中のテロメラーゼにTSプライマーを伸長させ、その後、95℃で2分間インキュベートして、テロメラーゼ活性を不活化し、プライマーを変性させた。
テロメラーゼ産物を、95℃、30秒間；60℃、90秒間40サイクルのPCRによって増幅させた。相対的テロメラーゼ活性を、1μgのタンパク質細胞溶解物に対して閾値サイクル数（又はCt値）を用いてHEK細胞に対して評価した。
実施例１９．材料及び方法：エキソソームを含有する馴化培地の調製
馴化培地（CM）を、以前に記載されたように（17A）、HuES9.E1 MSC、（c-myc）MSC及び（GFP）MSCから調製した。
簡潔にいうと、80％コンフルーエントなHuES9.E1培養物を、PBSで洗浄し、化学的に定義された無血清培養培地に移して一晩インキュベートし、PBSで洗浄して新鮮な化学的に定義された無血清培養培地中で3日間培養した。
MSC分泌を含むCMを回収し、遠心分離によって浄化し、100 kDaのMWカットオフ限外濾過膜（Sartorius, www.sartorius.com）を用いて50倍に濃縮し、そして0.2μmフィルターを通して滅菌した。
実施例２０．材料及び方法：RNAの単離
RNAを、3倍量のTrizol LS（Invitrogen, www.invitrogen.com）をCMに加え、そして製造業者のプロトコールに従って抽出を完了することによってCMから単離した。
MSCからの総RNA及び小型RNAを、Trizol（Invitrogen, www.invitrogen.com）及びmirVana（商標）miRNA Isolation Kit（Applied Biosystems, www.appliedbiosystems.com.sg）をそれぞれ用いて精製した。
RNAを、Quant-iTTM RiboGreen（登録商標）RNA Assay Kit（Invitrogen, www.invitrogen.com）を用いて定量化し、そして8％のグリオキサール又は15％のNovex（登録商標）TBE尿素ゲル（Invitrogen, www.invitrbgen.com）を含む1.5％アガロースゲル上で解析した。
ゲル中の分離されたRNAを、エチジウムブロミド（EB）染色によって可視化した。幾つかの実験のために、CMを、等量のPBS、細胞溶解緩衝液（BioVision, www.biovision.com）、40 mMシクロデキストリン（Sigma-Aldrich）又は4,000U/mlのホスホリパーゼA2（Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com）と共に37℃で30分間事前インキュベートし、その後、10分の1容量の1mg/mlのRNase A（Roche Applied Science, www.roche- applied-science.com）を加えた。
次いで、これらの混合物を、更に5分間37℃でインキュベートした。RNAを、Trizol LSで抽出し、そしてTBE-尿素ゲル上で分離して、EB染色にかけた。
実施例２１．材料及び方法：qRT-PCRによるRNAの分析
細胞における相対的myc転写物レベルを、qRT-PCRを用いて決定した。GFP-MSC（p17）及びcmyc-MSC（p24、p27、p29）からの20 ngのRNAを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（ABI, USA）を用いてcDNAに変換した。
次いで、cDNAを、94℃、10分間1サイクル；94℃、15秒間；60℃、60秒間40サイクル及び95℃、15秒間、60℃ 60秒間、95℃、15秒間1サイクルによって、myc転写物又はアクチン転写物に特異的なプライマーセットを用いてStepOnePlus Real-Time PCR system（Applied Biosystems, www.appliedbiosystems.com.sg）上で増幅した。
myc特異的プライマーセットは、5'-CCCGCCCCTGTCCCCTAGCCG-3'及び5'- AGAAGGGTGTGACCGCAACGTAG3'である。
MSC又はCMにおける成熟miRNAを検出するため、10 ngの小型RNAを、cDNAに変換し、そしてTaqMan microRNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems, www.appliedbiosystems.com.sg）を用いて、製造業者のプロトコールに従って15μl中に再懸濁した。
各RNAサンプルについてのPCR反応を、20μlの反応容量中1μl cDNA及び10μlのTaqMan 2×Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems, www.appliedbiosystems.com.sg）により、StepOne Plus Realtime PCR system（Applied Biosystems, www.appliedbiosystems.com.sg）において三連で実施した。
熱サイクルパラメーターは、95℃、10分間1サイクルの後、95℃、15秒間の40サイクル、次いで60℃、60秒間1サイクルであった。
使用したプライマーは、TaqManプライマーであった：hsa-let-7b（Cat AB Assay ID 000378, AppliedBiosystems）及びhsa-let-7g（Applied Biosystems, www.appliedbiosystems.com.sg）。
pre-miRNAのqRT-PCR検出のために、以前に記載されているように（18A）、プライマーを、Primer Express（登録商標） Software Version 3.0（AppliedBiosystems）を用いて設計した。
cDNAへの変換のために、10 ng のRNAサンプルを、12μlの反応容量中10 pmolの下流プライマーと共に80℃で5分間変性した。
次いで、RNA及び下流プライマーを、60℃、5分間でアニーリングさせ、次いで室温まで冷ました。
5×反応緩衝液、dNTPs、DTT、RNaseインヒビター及びThermoscript逆転写酵素（Invitrogen, www.invitrogen.com）を、製造業者の勧め通りに加えた。反応混合物を、45分間60℃にてインキュベートし、その後、5分間85℃にてインキュベートした。
次いで、20μlの反応容量中にcDNA及びSYBR green PCR Master. Mix（AppliedBiosystems）を含む、10分の1の反応混合物を用いてPCRを実施した。
PCRパラメーターは、95℃、15秒間1サイクル及び60℃1分間40サイクルであった。PCR反応を、三連で実施した。
hsa-let-7b pre-miRNA（登録番号 MI0000063, http://microrna.sanger.ac.uk）についてのプライマー配列は、5'TGAGGTAGTAGGTTGTGTGGT3'及び5'GGAAGGCAGTAGGTTGTATAG3'であった。
hsa-let-7g pre-miRNA（登録番号 MI0000137, http://microrna.sanger.ac.uk）について、プライマー配列は、5'GTAGTAGTTTGTACAGTTTGAGGGT3'及び5'GGCAGTGGCCTGTACAGT3'であった。
実施例２２．材料及び方法：統計的分析
統計的有意性を、スチューデントt検定を用いて分析した。
実施例２３．結果：c-myc導入遺伝子によるMSCの形質転換
hESC-MSCは、老化が始まる前に、継代25代目まで、1:4の分割で広範囲に培養で増殖し得た。
HuES9.E1 hESC-MSCs p22を、c-myc遺伝子又はGFP遺伝子のいずれかによって、レンチウイルスベクターを介して形質移入した（図６）。予測通り、c-myc形質転換MSC（myc-MSC）は、GFP形質転換MSC（GFP-MSC）よりもc-myc mRNAを高レベルで発現した（図７）。
p23又は形質移入の1代後に、GFP-MSC培養物は、以下の老化特徴を示した：僅かにしか増殖又は細胞分裂しない、より大きくより平坦な細胞。対照的に、myc-MSC培養物は、以下の癌化特徴を示した：接触阻害の欠失及び多くの小さな増殖する細胞。
接着性の単層としての増殖の代わりに、myc-MSCは、多細胞層の塊を形成した（図８）。
GFP-MSC又は親MSCとは異なり、myc-MSCにおけるテロメラーゼ活性は、有意に高かった（図９）。
実施例２４．結果：pre-miRNA対成熟miRNA比は形質転換によって変化される
我々は、以前に、細胞性miRNA集団に関して、分泌されたmiRNA集団は、少なくとも2種のmiRNA、hsa-let-7b miRNA及びhsa-let-7g miRNAについての高いpre-miRNA対成熟miRNA比を有することを報告した。
hsa-let-7b miRNA及びhsa-let-7g miRNAについてのこの比に形質転換が影響しているか否かを決定するために、分泌されたRNAを、myc-MSCによって馴化された培養培地及びmyc-MSCからそれぞれ調製した。
定量的RT-PCRを実施した。
c-myc形質転換は、hsa-let-7b miRNAについてのpre-miRNA対成熟miRNA比を増大したが、hsa-let-7g miRNAについては増大しなかった（図１０）。
hsa-let-7bのpre-miRNA対成熟miRNA比は、2.5から7.1に増大し、2.8倍の増大を示した。
比におけるこの変化が、分泌物中又は細胞中のpre-miRNAレベルにおける変化であるのか、成熟miRNAレベルにおける変化であるのか、又は両方かを決定するために、これらのレベルを、qRT-PCRによって決定した。
実施例２５．考察
我々は、hESC-MSCがRNA含有エキソソームを分泌することを以前に実証した（Chen et al., 印刷中）。
これらの細胞によって馴化された培養培地を用い、我々は、このCMは、コレステロールリッチなリン脂質小胞内に包まれたRNAを含み、主に小型RNAを含んで500 ntより大きなRNAを検出不能であることを観察した。
エキソソームの小型RNAは、miRNA、幾つかのリボゾームRNA分解中間体及び最も多くは、他の小型非コードRNAを含むが、細胞中の無傷のmRNA又はリボゾームRNAはあまり含まない。
MSCエキソソームmiRNAは、成熟形態の代わりに主に前駆形態であり、例えば、hsa-let-7b miRNA及びhsa-let-7g miRNAのようなエキソソームRNAの幾つかについてのpre-miRNA対成熟miRNA比は、細胞性RNAにおいてのそれよりも有意に高かった。
ここで、我々は、pre-miRNA対成熟miRNA比は、細胞の生理学的状態又は病理学的状態によって変化する可能性が高いと仮定した。
ここで、我々は、分泌されたhsa-let-7b miRNAについてのpre-miRNA対成熟miRNA比は、c-myc癌遺伝子による形質転換の際に増大したが、hsa-let-7g miRNAについての比は増大しなかったことを実証した。
分泌されたmiRNA中のpre-miRNA対成熟miRNA比におけるこの選択的変化は、独自の循環するmicroRNA（miRNA）プロフィールを同定する現在の実践を、癌についての予測及び予後のマーカーとして拡大するように適応し得る（13A）（6A）。
分泌されたか又は循環するmiRNAを評価するためのpre-miRNA対成熟miRNA比の使用は、定量的成分を循環するmiRNAの現在の定性的プロファイリングに導入し、生物学的サンプル及びサンプル調製に固有の変動を最小化し、そしてpre-miRNA対成熟miRNA比に基づく生体マーカーの強度を一般に増大する。
参考文献
本書中で言及された出願及び特許のそれぞれ、及び上記出願及び特許のそれぞれにおいて出願及び特許のそれぞれの手続の間を含めて引用されたか又は参照された各文書（「出願引用文献」）並びに出願、特許及び任意の出願引用文書のそれぞれにおいて引用されたか又は言及された任意の製品の任意の製造業者の指示書又はカタログは、本書により本書中で参照として組み込まれる。更に、本書中に引用された全ての文書及び本書中で引用された文書において引用されたか又は参照された全ての文書、及び本書中で引用されたか又は言及された任意の製品についての任意の製造業者の指示書又はカタログは、本書により、本書中で参照として組み込まれる。
本発明の記載された方法及びシステムの種々の変更及び改変は、本発明の範囲及び精神を逸脱しないことは、当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求される本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際に、分子生物学及び関連の分野における当業者に明らかな本発明を実施するために記載された様式の種々の変更が、本特許請求の範囲内に企図されている。

Claims (16)

  1. 間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の形質転換状態をモニタリングする方法であって、前記方法は、前記間葉系幹細胞によって分泌されたｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ ｍｉＲＮＡ（ＣＧＧＧＧＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＧＵＧＧＵＵＵＣＡＧＧＧＣＡＧＵＧＡＵＧＵＵＧＣＣＣＣＵＣＧＧＡＡＧＡＵＡＡＣＵＡＵＡＣＡＡＣＣＵＡＣＵＧＣＣＵＵＣＣＣＵＧ）について、（ａ）ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ ｍｉｃｒｏＲＮＡの前駆形態（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）対（ｂ）ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ ｍｉｃｒｏＲＮＡの成熟形態（成熟ｍｉＲＮＡ）の比を確立することを包含し、ここで確立された前記ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ対成熟ｍｉＲＮＡ比は、前記間葉系幹細胞の形質転換状態の指標である方法。
  2. 前記ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ ｍｉｃｒｏＲＮＡが、前記間葉系幹細胞によって分泌されたエキソソーム中に含まれる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記方法がこのようなエキソソームを得ること、及びそこから前記ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ ｍｉｃｒｏＲＮＡの前駆形態及び成熟形態を得ることを含む、請求項２に記載の方法。
  4. それぞれが細胞の状態の指標である、複数の選択されたｍｉＲＮＡ種に関する複数のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ対成熟ｍｉＲＮＡ比を含むプロフィールを確立することを含む、請求項１、２又は３に記載の方法。
  5. 前記ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ対成熟ｍｉＲＮＡ比が、前記ｍｉＲＮＡ種の前駆形態と成熟形態とに結合し、且つこれらを識別可能である核酸配列を含むアレイへのハイブリダイゼーションによって確立される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ対成熟ｍｉＲＮＡ比が、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって確立される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 形質転換状態における前記ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ対成熟ｍｉＲＮＡ比が、正常状態と比較して２．８倍高い、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記間葉系幹細胞が非形質転換状態であるか、又はｃ−ｍｙｃ形質転換状態である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 複数の選択されたｍｉＲＮＡ種の前駆体形態及び成熟形態と結合可能であり、且つ識別可能である複数のプローブを含むアレイであって、前記複数の選択されたｍｉＲＮＡ種がｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂｍｉｃｒｏ ＲＮＡ（ＣＧＧＧＧＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＧＵＧＧＵＵＵＣＡＧＧＧＣＡＧＵＧＡＵＧＵＵＧＣＣＣＣＵＣＧＧＡＡＧＡＵＡＡＣＵＡＵＡＣＡＡＣＣＵＡＣＵＧＣＣＵＵＣＣＣＵＧ）を含む、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の形質転換状態をモニタリングするための、アレイ。
  10. 以下の工程を含む方法：
    （ａ）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を提供する工程；
    （ｂ）前記間葉系幹細胞に癌遺伝子を導入してそれを形質転換する工程；及び
    （ｃ）請求項１〜８のいずれかに記載の方法によって前記間葉系幹細胞によって分泌されたｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ ｍｉｃｒｏＲＮＡのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ対成熟ｍｉＲＮＡ比を確立して、このような形質転換を検出する工程；
    ここで、前記形質転換された間葉系幹細胞は自身が増殖する培地中に前記癌遺伝子の遺伝子産物を分泌しない方法。
  11. （ａ）前記癌遺伝子がｃ−ｍｙｃを含むか；（ｂ）前記間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が樹立された細胞株を含むか；又は（ｃ）前記間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が臍帯に由来する、請求項１０に記載の方法。
  12. 形質転換された間葉系幹細胞が、形質転換されていない間葉系幹細胞と比較して、（ａ）老化を回避可能であるか；（ｂ）増大した増殖速度を有するか；（ｃ）縮小した集団倍加時間を有するか；又は（ｄ）増大したテロメラーゼ活性を有する、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 馴化培地を提供する方法であって、請求項１０、１１又は１２に記載の工程を包含し、その後、前記形質転換された間葉系幹細胞又はその子孫細胞を、細胞培養培地中で培養して馴化し、馴化された培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）を前記形質転換された間葉系幹細胞から分離することを包含する方法。
  14. エキソソームを提供する方法であって、（ａ）間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）を請求項１３に記載の方法によって得ること；（ｂ）前記間葉系幹細胞馴化培地を、濃縮すること；（ｃ）濃縮した前記間葉系幹細胞馴化培地を、サイズ排除クロマトグラフィーにかけること；及び（ｄ）ＵＶ吸光度画分を選択することを包含する方法。
  15. 薬学的組成物を調製する方法であって、請求項１３に記載の方法によって間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）を得るか、又は請求項１４に記載の方法によってエキソソームを得ること、及び、前記ＭＳＣ−ＣＭ又は前記エキソソームを、薬学的に許容される担体又は希釈剤と混合することを包含する方法。
  16. 形質転換された間葉系幹細胞、前記馴化培地、前記エキソソーム若しくは前記薬学的組成物が、間葉系幹細胞の少なくとも１つの生物学的特性を含むか、又は前記馴化培地、前記エキソソーム若しくは前記薬学的組成物が、心筋虚血及び再灌流傷害のマウスモデル若しくはブタモデルにおいてアッセイされる梗塞サイズを縮小可能であるか、又は過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）誘導性細胞死のインビトロアッセイにおいてアッセイされる酸化ストレスを軽減可能である、請求項１〜８、１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
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