JP5872684B2

JP5872684B2 - 免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチド

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Publication number: JP5872684B2
Application number: JP2014511897A
Authority: JP
Inventors: シユリール，カルラ・クリステイーナ; イルク，トーマス・シモン
Original assignee: インターベットインターナショナルベー．フェー．
Priority date: 2011-05-26
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2016-03-01
Anticipated expiration: 2032-05-25
Also published as: BR112013029968A2; RU2013156635A; ZA201308479B; WO2012160183A1; JP2014516533A; EP2714907A1; RU2587633C2; MX2013013800A; EP2714907B1; US20140199345A1; MX346596B; CA2834442A1; CN103547674A; US9359602B2

Description

本発明は、免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチド、このようなオリゴデオキシヌクレオチドを含むベクターおよびワクチン、薬剤としてのこれらの使用、感染症を防ぐまたは感染症と闘う際のこれらの使用、このようなオリゴデオキシヌクレオチドの検出方法、ならびにこの方法において用いられる細胞に関するものである。

過去２０年の間に、免疫系科学において、脊椎動物の免疫系は、病原体の独特な特性に対する受容体介在性認識を介して、微生物感染を検出し、かつ迅速な免疫活性化を誘発するメカニズムを有することが明らかとなってきており、これがいわゆる、同系（ｃｏｇｎａｔｅ）宿主病原体認識受容体（ＰＲＲ）と相互作用する病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）である（非特許文献１、非特許文献２）。

ある種の型の病原体デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が、これらＰＡＭＰの間で共通していることが現在明らかである。１９９５年に、細菌ＤＮＡ中の非メチル化ＣｐＧモチーフが、マウスのＢ細胞活性化を誘発することが報告された（非特許文献３）。この研究により初めて、細菌免疫刺激性非メチル化ＣｐＧ含有ＤＮＡの特異的認識と、哺乳類のＤＮＡにおける以前に認識されたＣｐＧの抑制および広範なＣｐＧメチル化との関連が生み出された。最も有効なＢ細胞刺激性非メチル化ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧＯＤＮ）は、配列要素ＧＡＣＧＴＴを有することが示された。

当該分野における次の先例となる論文は、大阪（日本）のアキラシズオ研究室によって発表された（非特許文献４）。遺伝子クローニングおよびマウスにおけるターゲット遺伝子ノックアウトアプローチによって、ＣｐＧ−ＯＤＮに対するマウスの細胞反応が、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）によって媒介されることが明白に示された。その後、ＣｐＧ−ＯＤＮは、主にＮＦカッパ−Ｂ経路を介したＴＬＲ９シグナリングのアゴニストであることが示された（非特許文献５）。その後１０年のうちに、基本的な研究トピックおよび一般的な潜在的免疫療法用途について非常に数多くの研究が発表された（例えば、非特許文献６から非特許文献８の総説；非特許文献９から非特許文献１５）。いくつかの総説記事が、ＣｐＧ−ＯＤＮの抗感染用途（非特許文献１６）、癌治療におけるＴＬＲ９アゴニストの利用（非特許文献１７、非特許文献１８）、喘息およびアレルギー治療のためのＴＬＲ９活性化（非特許文献１９から非特許文献２１）、ならびにワクチンアジュバント（非特許文献２２から非特許文献２７）に注目している。

ＣｐＧＯＤＮは、獣医学的用途、特にウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ニワトリおよび魚類における免疫刺激剤およびワクチンアジュバントとして記載および考察されている（非特許文献２８から非特許文献３３）。

ニワトリにおける獣医学的利用の分野では、ニワトリをニューカッスル病から保護するための例えばワクチンでのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの使用が記載されている（非特許文献３４）。最近、ニワトリにおいて、ＴＬＲ２１が、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの認識において、哺乳類のＴＬＲ９に対する機能的相同体としての機能を果たしていることが示された（非特許文献３５）。

ＩｗａｓａｋｉＡ，ＭｅｄｚｈｉｔｏｖＲ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｄａｐｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｔｙｂｙｔｈｅｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍ．２０１０．Ｓｃｉｅｎｃｅ３２７，２９１−２９５．ＭｅｄｚｈｉｔｏｖＲ．，Ａｐｐｒｏａｃｈｉｎｇｔｈｅａｓｙｍｐｔｏｔｅ：２０ｙｅａｒｓｌａｔｅｒ．２００９．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３０，７６６−７７５．ＫｒｉｅｇＡ．Ｍ．，ＹｉＡ，Ｋ．，ＭａｔｓｏｎＳ．，ＷａｌｄｓｃｈｍｉｄｔＴ，Ｊ．，ＢｉｓｈｏｐＧ．Ａ．，ＴｅａｓｄａｌｅＲ．，ＫｏｒｅｔｚｋｙＧ．Ａ．，ＫｌｉｎｍａｎＤ．Ｍ．，１９９５．ＣｐＧｍｏｔｉｆｓｉｎｂａｃｔｅｒｉａｌＤＮＡｔｒｉｇｇｅｒｄｉｒｅｃｔＢ−ｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ３７４，５４６−５４９．ＨｅｍｍｉＨ．，ＴａｋｅｕｃｈｉＯ．，ＫａｗａｉＴ．，ＫａｉｓｈｏＴ．，ＳａｔｏＳ．，ＳａｎｊｏＨ．，ＭａｔｓｕｍｏｔｏＭ．，ＨｏｓｈｉｎｏＫ．，ＷａｇｎｅｒＨ．，ＴａｋｅｄａＫ．，ＡｋｉｒａＳ．，２０００．ＡＴｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓｂａｃｔｅｒｉａｌＤＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ４０８，７４０−７４５．ＭｅｄｚｈｉｔｏｖＲ．，２００１．ＣｐＧＤＮＡ：ｓｅｃｕｒｉｔｙｃｏｄｅｆｏｒｈｏｓｔｄｅｆｅｎｓｅ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，１５−１６．ＫｒｉｅｇＡ．Ｍ．，２００２．ＣｐＧｍｏｔｉｆｓｉｎｂａｃｔｅｒｉａｌＤＮＡａｎｄｔｈｅｉｒｉｍｍｕｎｅｅｆｆｅｃｔｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０，７０９−７６０．ＫｒｉｅｇＡ．Ｍ．，２００３．ＣｐＧｍｏｔｉｆｓ：ｔｈｅａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｉｎｂａｃｔｅｒｉａｌｅｘｔｒａｃｔｓ？Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，８３１−８３５．ＫｒｉｅｇＡ．Ｍ．，２００６．ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＴｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ９ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ．５，４７１−４８４．ＫｌｉｎｍａｎＤ．Ｍ．，２００４．ＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｕｓｅｓｏｆＣｐＧｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，２４９−２５８．ＶｏｌｌｍｅｒＪ．，２００５．ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎｄｒｕｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙＣｐＧｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｌｉｇａｎｄｓｆｏｒＴＬＲ９．ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５，６７３−６８２．ＷｉｌｓｏｎＨ．Ｌ．，ＤａｒＡ．，ＮａｐｐｅｒＳ．Ｋ．，ＭａｒｉａｎｅｌａＬｏｐｅｚＡ．，ＢａｂｉｕｋＬ．Ａ．，ＭｕｔｗｉｒｉＧ．Ｋ．，２００６．ＩｍｍｕｎｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＣｐＧｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５，１８３−２１３．ＫｉｎｄｒａｃｈｕｋＪ．，ＰｏｔｔｅｒＪ．，ＷｉｌｓｏｎＨ．Ｌ．，ＧｒｉｅｂｅｌＰ．，ＢａｂｉｕｋＬ．Ａ．，ＮａｐｐｅｒＳ．，２００８．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ９：ＣｐＧｓａｎｄｂｅｙｏｎｄ．ＭｉｎｉＲｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，５９０−６００．ＤｏｒｎＡ．，ＫｉｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒＳ．，２００８．ＣｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｐＧ−，ｎｏｎ−ＣｐＧ−，ａｎｄａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｓｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１０，１０−２０．ＶｏｌｌｍｅｒＪ．，ＫｒｉｅｇＡ．Ｍ．，２００９．ＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＣｐＧｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＴＬＲ９ａｇｏｎｉｓｔｓ．Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６１，１９５−２０４．ＷｉｌｓｏｎＫ．Ｄ．，ｄｅＪｏｎｇＳ．Ｄ．，ＴａｍＹ．Ｋ．，２００９．Ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆＣｐＧｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｎｈａｎｃｅｓｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅｆｆｉｃａｃｙ．Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６１，２３３−２４２．ＫｒｉｅｇＡ．Ｍ．，２００７ａ．Ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｔｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ９ａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｏｃ．４，２８９−２９４．ＫｒｉｅｇＡ．Ｍ．，２００７ｂ．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＴＬＲ９ａｇｏｎｉｓｔｓｆｏｒｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７，１１８４−１１９４．ＷｅｉｎｅｒＧ．Ｊ．，２００９．ＣｐＧｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄｔｈｅｒａｐｙｏｆｌｙｍｐｈｏｉｄｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６１，２６３−２６７．ＫｌｉｎｅＪ．Ｎ．，２００７．ＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｏｆａｓｔｈｍａｕｓｉｎｇＣｐＧｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．３９，２７９−２８６．ＫｌｉｎｅＪ．Ｎ．，ＫｒｉｅｇＡ．Ｍ．，２００８．Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ９ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｗｉｔｈＣｐＧｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｆｏｒａｓｔｈｍａｔｈｅｒａｐｙ．ＤｒｕｇＮｅｗｓＰｅｒｓｐｅｃｔ．２１，４３４−４３９．ＦｏｎｓｅｃａＤ．Ｅ．，ＫｌｉｎｅＪ．Ｎ．，２００９．ＵｓｅｏｆＣｐＧｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆａｓｔｈｍａａｎｄａｌｌｅｒｇｉｃｄｉｓｅａｓｅ．Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６１，２５６−２６２．ＫｌｉｎｍａｎＤ．Ｍ，ＣｕｒｒｉｅＤ．，ＧｕｒｓｅｌＩ．，ＶｅｒｔｈｅｌｙｉＤ．，２００４．ＵｓｅｏｆＣｐＧｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｓｉｍｍｕｎｅａｄｊｕｖａｎｔｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１９９，２０１−２１６．ＫｌｉｎｍａｎＤ．Ｍ．，２００６．ＡｄｊｕｖａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣｐＧｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５，１３５−１５４．ＤａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒＣ．Ａ．，２００７．ＴＬＲ９ａｇｏｎｉｓｔｓａｓａｄｊｕｖａｎｔｓｆｏｒｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９，４５−５２．ＷａｇｎｅｒＨ．，２００９．ＴｈｅｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆＣｐＧ−ａｎｔｉｇｅｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６１，２４３−２４７．ＭｕｔｗｉｒｉＧ．，ｖａｎＤｒｕｎｅｎＬｉｔｔｅｌ−ｖａｎｄｅｎＨｕｒｋＳ．，ＢａｂｉｕｋＬ．Ａ．，２００９．ＡｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏｅｎｈａｎｃｉｎｇｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｂｙＣｐＧｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６１，２２６−２３２．ＫｌｉｎｍａｎＤ．Ｍ．，ＫｌａｓｃｈｉｋＳ．，ＳａｔｏＴ．，ＴｒｏｓｓＤ．，２００９．ＣｐＧｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｓａｄｊｕｖａｎｔｓｆｏｒｖａｃｃｉｎｅｓｔａｒｇｅｔｉｎｇｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６１，２４８−２５５．ＢａｂｉｕｋＬ．Ａ．，ＧｏｍｉｓＳ．，ＨｅｃｋｅｒＲ．，２００３．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏｄｉｓｅａｓｅｃｏｎｔｒｏｌ．Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ．８２，８７０−８７５．ＣａｒｒｉｎｇｔｏｎＡ．Ｃ．，ＳｅｃｏｍｂｅｓＣ．Ｊ．，２００６．ＡｒｅｖｉｅｗｏｆＣｐＧｓａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｌｅｖａｎｃｅｔｏａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ．Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１１２，８７−１０１．ＧｒｉｅｂｅｌＰ．Ｊ．，ＢｒｏｗｎｌｉｅＲ．，ＭａｎｕｊａＡ．，ＮｉｃｈａｎｉＡ．，ＭｏｏｋｈｅｒｊｅｅＮ．，ＰｏｐｏｗｙｃｈＹ．，ＭｕｔｗｉｒｉＧ．，ＨｅｃｋｅｒＲ．，ＢａｂｉｕｋＬ．Ａ．，２００５．Ｂｏｖｉｎｅｔｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ９：ａｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１０８，１１−１６．ＭｕｔｗｉｒｉＧ．，ＰｏｎｔａｒｏｌｌｏＲ．，ＢａｂｉｕｋＳ．，ＧｒｉｅｂｅｌＰ．，ｖａｎＤｒｕｎｅｎＬｉｔｔｅｌ−ｖａｎｄｅｎＨｕｒｋＳ．，ＭｅｎａＡ．，ＴｓａｎｇＣ．，ＡｌｃｏｎＶ．，ＮｉｃｈａｎｉＡ．，ＩｏａｎｎｏｕＸ．，ＧｏｍｉｓＳ．，ＴｏｗｎｓｅｎｄＨ．，ＨｅｃｋｅｒＲ．，ＰｏｔｔｅｒＡ．，ＢａｂｉｕｋＬ．Ａ．，２００３．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙＣｐＧＤＮＡｍｏｔｉｆｓｉｎｄｏｍｅｓｔｉｃａｎｉｍａｌｓ．Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．９１，８９−１０３．ＳｉｎｇｈＭ．，Ｏ’ＨａｇａｎＤ．Ｔ．，２００３．Ｒｅｃｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓｉｎｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｖａｃｃｉｎｅａｄｊｕｖａｎｔｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．３３，４６９−４７８．ＷｅｒｌｉｎｇＤ．，ＪｕｎｇｉＴ．Ｗ．，２００３．ＴＯＬＬ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓｌｉｎｋｉｎｇｉｎｎａｔｅａｎｄａｄａｐｔｉｖｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．９１，１−１２．ＬｉｎｇｈｕａＺｈａｎｇら，２００７．ＶａｃｃｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈＮｅｗｃａｔｌｅｄｉｓｅａｓｅｖａｃｃｉｎｅａｎｄＣｐＧｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｉｎｄｕｃｅｓｓｐｅｃｉｆｉｃｉｍｍｕｎｉｔｙａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔＮｅｗｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓｉｎＳＰＦｃｈｉｃｋｅｎ．Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎ．ＡｎｄＩｍｍｕｎｏｐａｔｈ．１１５，２１６−２２２．Ｂｒｏｗｎｌｉｅ，Ｒ．，ＺｈｕＪ．，ＡｌｌａｎＢ．，ＭｕｔｗｉｒｉＧ．Ｋ．，ＢａｂｉｕｋＬ．Ａ．，ＰｏｔｔｅｒＡ．，ＧｒｉｅｂｅｌＰ．，２００９．ＣｈｉｃｋｅｎＴＬＲ２１ａｃｔｓａｓａｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｈｏｍｏｌｏｇｕｅｔｏｍａｍｍａｌｉａｎＴＬＲ９ｉｎｔｈｅｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆＣｐＧｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６，３１６３−３１７０．

免疫調節剤としての特異的ＣｐＧＯＤＮの設計は、従来、完全にランダムなものであった。これは特に、非哺乳類ＣｐＧＯＤＮについて当てはまる。その理由は多くの要因からなり：先ず第１に、ヒトＴＬＲの免疫調節性ＣｐＧモチーフと非ヒトＴＬＲの免疫調節性ＣｐＧモチーフとの相関関係について知識がなく、非哺乳類種については放っておかれていること；第２に、非常に低い濃度のＣｐＧＯＤＮの影響を選択的に試験できるほどノイズレベルの十分に低いバックグラウンドで利用可能な細胞系がないこと；さらに、利用可能な高スループットのスクリーニング法がなく、たとえあったとしても、非哺乳類種の免疫調節剤として、ＣｐＧＯＤＮのインビボ有効性とインビトロ有効性との間に明白な相関関係がないこと、である。

従って、高い免疫調節効果を有することで、低ドーズでも効果のある新規なＣｐＧＯＤＮが明らかに必要とされている。そして、ＣｐＧ−活性のインビトロ活性とインビボ活性との相関関係を示すという獣医学的目的のために、選択的かつ感度の良いＣｐＧＯＤＮ選択系が必要とされている。

本発明の目的の１つは、このような新規のＣｐＧＯＤＮを提供することである。

この点で、本発明の一実施形態は、式^５’［Ｇ］_ｘ｛［Ｔ］_ｐＴＴＣＧＴＣ［Ｔ］_ｑ｝_ｎ［Ｇ］_ｚ ^３’を有し、式中、ｐ＝１から１５、ｑ＝１から１５、ｎ＝２から１００、ｘ＝３から１０、およびｚ＝０から１０である、免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド、またはその医薬的に許容可能な塩に関するものである。

ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｃｈｉＴＬＲ２１のプラスミドマップである。種々のｚｅｏ／Ｇ４１８二重耐性クローン細胞系のＳＥＡＰ活性の概要である。種々のｚｅｏ／Ｇ４１８二重耐性クローン細胞系のＳＥＡＰ活性の概要である。種々のｚｅｏ／Ｇ４１８二重耐性クローン細胞系のＳＥＡＰ活性の概要である。種々のｚｅｏ／Ｇ４１８二重耐性クローン細胞系のＳＥＡＰ活性の概要である。リポータ細胞（ＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆｔｙ２−ｃｈｉｃｋｅｎＴＬＲ２１）におけるリポータ酵素ＳＥＡＰの有色産物量（４０５ｎｍで吸光する）を誘導する際の、試験した種々の化合物での強度を示す図である。試験した種々の化合物のＥＣ_５０値（ピコモル）を示す図である。リポータ細胞（ＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆｔｙ２−ｃｈｉｃｋｅｎＴＬＲ２１）におけるリポータ酵素ＳＥＡＰの有色産物量（４０５ｎｍで吸光する）を誘導する際の、試験したさらなる修飾化合物での強度を示す図である。リポータ細胞（ＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆｔｙ２−ｃｈｉｃｋｅｎＴＬＲ２１）におけるリポータ酵素ＳＥＡＰの有色産物量（４０５ｎｍで吸光する）を誘導する際の、試験したさらなる修飾化合物での強度を示す図である。リポータ細胞（ＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆｔｙ２−ｃｈｉｃｋｅｎＴＬＲ２１）におけるリポータ酵素ＳＥＡＰの有色産物量（４０５ｎｍで吸光する）を誘導する際の、試験したさらなる修飾化合物での強度を示す図である。

「免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド」は、シグナル伝達カスケードの開始を刺激する非メチル化シチジン−リン酸−グアノシンジヌクレオチド配列を含むオリゴデオキシヌクレオチドを指し、これにより転写因子（ＮＦ−κＢまたはインターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）等）の活性化が導かれる。この活性化が今度は、炎症性サイトカインの発現および他細胞の活性化イベントをもたらす。ＮＦ−κＢ結合部位およびＮＦ−κＢによって影響される遺伝子発現は、とりわけＳｃｈｉｎｄｌｅｒおよびＢａｉｃｈｗａｌ（１９９４）によって説明されている。

用語オリゴデオキシヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドの短い核酸ポリマー（すなわち、リン酸基および交換可能な有機塩基と結合したデオキシリボースを多数含む分子）を意味する。このような有機塩基として、置換ピリミジンまたは置換プリンがある。例としてそれぞれ、シトシンおよびチミン、ならびにアデニンおよびグアニンがある。

本発明に係るオリゴヌクレオチドは、修飾を含んでよい。このような修飾の例として、例えば、ヌクレオシドの３’および／または５’末端に位置するリン酸ジエステルヌクレオシド間ブリッジにおける修飾がある。このような修飾はとりわけ、例えばホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートによるリン酸ジエステルの置換えに関連する。

他の修飾として例えば、デホスホブリッジによるホスホジエステルブリッジの置換えがある。デホスホブリッジの例として、メチルヒドロキシルアミン、ホルムアセタールおよびジメチレンスルホン基がある。

さらに他の修飾として、天然のヌクレオシド塩基の、非天然のヌクレオシド塩基（５−フルオロシトシン、７−デアザ−７−置換グアニン、７−デアザ−８−置換グアニン、２−チオウラシル、ジヒドロウラシル、５−ブロモ−シトシン、６−置換シトシン、Ｎ４−置換シトシン等）による置換えに関する修飾がある。

また、他の修飾として、糖単位（β−リボース糖またはβ−Ｄ−２’−リボース糖単位）の修飾糖単位（例えばＬ−２’−デオキシリボースまたは２’−Ｌ−アラビノース等）による置換えに関する修飾がある。

オリゴヌクレオチドのさらなる見識を与えるテキストとして、例えば「ＰＣＲＰｒｉｍｅｒ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」（第２版，２００３，ＣａｒｌＷ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ編，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ；ＧａｂｒｉｅｌａＳ．Ｄｒｅｋｓｌｅｒ，ＵｎｉｆｏｒｍｅｄＳｅｒｖｉｃｅｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｔｈｅＨｅａｌｔｈＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓＩＳＢＮ９７８−０８７９６９６５４−２）がある。

ＣｐＧモチーフを有する構造｛［Ｔ］_ｐＴＴＣＧＴＣ［Ｔ］_ｑ｝_ｎが、本発明に係るＯＤＮの活性のある免疫刺激部分を表す。従って、本発明は、このいわゆる「バックボーン」を含む免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドを提供する。

本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドのバックボーンは、構造｛［Ｔ］_ｐＴＴＣＧＴＣ［Ｔ］_ｑ｝_ｎが少なくとも２回、好ましくは３回存在しなければならないことがわかった。従って、ｎは少なくとも２であるべきである。また、ｎが増大すると、オリゴデオキシヌクレオチドの活性が増大することもわかった。この効果は、ｎが増大すると安定する。従って、基本的に、バックボーン構造の数ｎは少なくとも２であるべきである。好ましくは、ｎの範囲は３≦ｎ≦１００である。これは単に、合成配列がより長くなるほど製造がより困難になるという事実によるためである。実際には、好ましくはｎの範囲は２≦ｎ≦１８である。より好ましくは、ｎの範囲は３≦ｎ≦１８であり、さらにより好ましくは、ｎの範囲は４≦ｎ≦１８であり、なおさらにより好ましくは、ｎの範囲は５≦ｎ≦１８である。

本発明に係るＣｐＧＯＤＮの識別は、とりわけ、ＮＦ−κＢ活性化の検出に現在使用されている検出系よりも選択的な検出系を用いることによって、可能となった。Ｂｒｏｗｎｌｉｅら（２００９）は、ＮＦ−κＢルシフェラーゼベースのリポータ系を記載している。他の系は例えば、ＩＬ−８転写測定、サイトカイン分泌、またはＮＯ分泌の検出に基づくものである。

これに反し、本発明では、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）ベースの検出系を用いた。ＳＥＡＰは、哺乳類の系におけるリポータ酵素である（Ｙａｎｇら，１９９７）。この系は、驚くほど感度が良いことがわかっており、また、驚くべきことに、試験したＣｐＧＯＤＮのインビトロ活性とインビボ活性との間で密接な相関関係が与えられる。ＳＥＡＰ系は、基質としてパラ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）と共に用いられた。

既存の系に対する別の改善が、ＳＥＡＰ遺伝子を有するプラスミドの細胞内への導入および細胞内での安定した維持であった（これまで、全ての検出系が、リポータ遺伝子による細胞の一過性トランスフェクションを用いていた）。これは、リポータ遺伝子の、細胞内への導入および細胞内での安定した維持によって初めて、ドーズ／応答曲線が作成され得たことによるものである。このような曲線は、種々のＣｐＧＯＤＮ活性間で信頼できる比較がなされ得るとすれば、不可欠なものである。

従って、本発明の実施例部において詳細に記載される方法および細胞系は、種々のＣｐＧＯＤＮ間の信頼できる逐次比較を初めて可能にするものである。

用いられる系のさらなる詳細が、実施例部に与えられている。

本方法および本細胞系は、種々のＣｐＧＯＤＮ間のこのような信頼できる逐次比較を可能にするので、本発明に係るｐ＞１のオリゴデオキシヌクレオチドが、ｐ＝１の場合よりも高い活性レベルを有すると判定され得た。従って、本実施形態の好ましい形は、ｐ＞１である。ｐ値２、３、４、５または６がより好ましい（好ましい順である）。ｐ＞６の値がさらにより好ましいが、活性レベルの増大はなくなる。ｐ値が１５を超えると、合成はますます困難となるであろう。従って、好ましくは、ｐ値は１５を超えるべきでない。

また、本発明に係るｑ＞１のオリゴデオキシヌクレオチドが、ｑ＝１の場合よりも高い活性レベルを有すると判定され得た。従って、本実施形態の好ましい形は、ｑ＞１である。ｑ値２、３、４、５または６がより好ましい（好ましい順である）。ｑ＞６の値がさらにより好ましいが、活性レベルの増大はなくなる。

ｑ値が１５を超えると、合成はますます困難となるであろう。従って、好ましくは、ｑ値は１５を超えるべきでない。

構造^５’［Ｇ］_ｘ｛［Ｔ］_ｐＴＴＣＧＴＣ［Ｔ］_ｑ｝_ｎ［Ｇ］_ｚ ^３’の５’末端のＧの数が増大すると、ＣｐＧＯＤＮの活性が増大することがわかった。ｘ値は少なくとも３であるべきであり、Ｇの数が増大して最大２０Ｇになるまで、ＣｐＧＯＤＮの活性が向上する。従って、好ましくは、ｘは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である（進むにつれ好ましい順である）。

また、構造^５’［Ｇ］_ｘ｛［Ｔ］_ｐＴＴＣＧＴＣ［Ｔ］_ｑ｝_ｎ［Ｇ］_ｚ ^３’の３’末端のＧの数が増大すると、ＣｐＧＯＤＮの活性が（わずかに）減少することもわかった。ｚ値は１０以下であるべきであり、Ｇの数が減少して０Ｇになるまで、ＣｐＧＯＤＮの活性が向上する。従って、より好ましくは、ｚは９、８、７、６、５、４、３、２、１または０である（進むにつれ好ましい順である）。

前述のように、ヌクレオシドの３’および／または５’末端に位置するリン酸ジエステルヌクレオシド間ブリッジにおける数種類の修飾が可能である。しかし、基本的に、合成方法により、通常の一般的な２ヌクレオチド間の結合タイプは：リン酸ジエステル（ＰＤＥ）結合およびホスホロチオエート（ＰＴＯ）結合である。ＣｐＧＯＤＮの安定性および免疫刺激効果を向上させるために、合成オリゴデオキシヌクレオチドの構成ブロックにホスホロチオエートが与えられて、ＰＴＯ結合が形成される。

しかしながら、驚くべきことに、^５’［Ｇ］_ｘおよび^３’［Ｇ］_ｚヌクレオチドだけがＰＴＯ結合によって結合され、他のヌクレオチドがＰＤＥ結合によって結合されると、本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドの有効性がさらに増大することがわかった。（このような場合、^５’［Ｇ］_ｘと｛［Ｔ］_ｐＴＴＣＧＴＣ［Ｔ］_ｑ｝との結合はＰＴＯ結合であり、｛［Ｔ］_ｐＴＴＣＧＴＣ［Ｔ］_ｑ｝と［Ｇ］_ｚ ^３’との結合はＰＤＥ結合である。）
従って、本実施形態の別の好ましい形は、^５’［Ｇ］_ｘおよび^３’［Ｇ］_ｚヌクレオチドがホスホロチオエート結合を有し、他のヌクレオチドはリン酸ジエステル結合を有する本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドに関するものである。

本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドのバックボーンは、構造^５’｛［Ｔ］_ｐＴＴＣＧＴＣ［Ｔ］_ｑ｝_ｎ ^３’がｎ毎に同じである必要はない。これは、本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドバックボーンがとりわけ：｛ＴＴＴＣＧＴＣＴ｝｛ＴＴＴＣＧＴＣＴＴ｝｛ＴＴＴＴＣＧＴＣＴ｝のように見えてよいことを意味する。このような一連の３つの異なる連続的な様々なバックボーンは、ヘテロポリマーとして示されるものである。３つの同じコピーの一続きが、ホモポリマーと呼ばれるものである。

好ましくは、本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドは、^５’｛［Ｔ］_ｐＴＴＣＧＴＣ［Ｔ］_ｑ｝_ｎ ^３’ホモポリマーを含む。

本発明に係るＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、ピコモル（サブナノモル）の量で活性がある；このＥＣ_５０は１ｎＭ未満である。

オリゴデオキシヌクレオチドの最大半量濃度（ＥＣ_５０）とは、リポータ細胞（ＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆｔｙ２−ｃｈｉｃｋｅｎＴＬＲ２１またはＨＤ１１−ｐＮｉｆＴｙ２Ｈｙｇ）におけるリポータ酵素ＳＥＡＰ（の有色産物（４０５ｎｍで吸光する）を生産する）量を誘導するのに必要なオリゴデオキシヌクレオチドの、最大半量酵素反応速度をもたらす量である。オリゴデオキシヌクレオチドのＥＣ_５０がこれらの細胞において１ｎＭ未満であるならば、ピコモル（サブナノモル）の量で活性があると考えられる。

本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドを、反応性化学基を介して、担体またはハプテンに結合することは確実に可能である。このような結合により、組み合わせた分子の免疫刺激効果は増進する。

そのような成分の単なる例として、例えばジゴキシゲニン、アミノヘキシル、テキサスレッドおよびビオチンがある。好ましい担体またはハプテンは、３’−および５’−標識化テキサスレッドならびに５’−標識化ジゴキシゲニンである。オリゴデオキシヌクレオチドのハプテン／担体への結合は、当該技術において周知である。

本発明の別の実施形態は、本発明に係る免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドを含むベクターに関するものである。このようなベクターは、核酸分子（プラスミド、ウイルス、バクテリオファージまたは分子生物学で用いられる他の任意のベクター等）であってよい。単なる例として、免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドを含むベクターは例えば、細菌中で増やされ得るプラスミド等のＤＮＡ分子であってよい（本発明に係る免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドがクローン化されている）。このようなプラスミドは好ましくは活性な複製起源を有し、これにより大量のプラスミドが宿主内に存在することになる。このような細菌の大規模な増殖に続くプラスミドの単離が、本発明に係る免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドの合成生産の代替方法を提供する。

本発明の目的の１つは、感染症を防ぐまたは感染症と闘うためのワクチン中の良好な免疫刺激性成分として、抗原成分または抗原成分をコードする遺伝的情報と併せて用いられ得る新規のＣｐＧＯＤＮ、および医薬的に許容可能な担体を提供することである。

通常、用語抗原成分は、ヒトまたは動物に投与された場合に、免疫応答を誘導、刺激または増進することができる少なくとも１つのエピトープを含む物質の組成物を指す。

抗原成分は、任意の種類の抗原成分であってよいが、好ましくは、野生型の形態でヒトまたは動物に対する病原性を有する微生物またはウイルスに由来するものである。

抗原成分は、完全な病原体（好ましくは不活性化または弱毒化された形態である）、病原体の抽出物、または病原体の免疫原性タンパク質であってよい。

抗原成分が病原体の免疫原性タンパク質である場合、その免疫原性タンパク質は好ましくは、インビトロ培養細胞中で発現されて、インビトロ培養細胞から回収される。

従って、別の実施形態は、感染症を防ぐまたは感染症と闘うためのワクチンに関するものであり、前記ワクチンは、免疫刺激量の本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチド、および／または本発明に係るベクター、免疫原性量の抗原成分もしくは抗原成分をコードする遺伝的情報、ならびに医薬的に許容可能な担体を含むことを特徴とする。

当然、オリゴデオキシヌクレオチドの免疫刺激量と抗原成分の免疫原性量とは、相互に強く関連付けられる。本発明の利点の１つは、本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドの存在が、感染症を防ぐまたは感染症と闘うのに必要な抗原成分の量を少なくすることができることである。

感染症を防ぐ、または感染症と闘うのに必要な抗原成分の量は、抗原成分の免疫原性量と呼ばれる。

オリゴデオキシヌクレオチドの免疫刺激量は、抗原成分の免疫原性量（すなわち、感染症を防ぐまたは感染症と闘うのに必要な抗原成分の量）を減少させることができる量である。

そのため、基本的に、表現「オリゴデオキシヌクレオチドの免疫刺激量」および「免疫原性量」は、互いに関連させて見なければならない。

勿論、ワクチンが、抗原成分をコードする遺伝的情報を含む場合、この遺伝的情報によって発現される抗原成分の量は、感染症を防ぐまたは感染症と闘うに十分であるべきであり；それはすなわち、免疫原性量でなければならない。

本発明に係る非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドが免疫刺激性であるという事実は、これによりワクチン中の抗原成分の免疫学的有効性が増進されることを意味する。この理由で、本発明に係るワクチンは、多くの場合、本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドが存在しない場合よりも少ない抗原成分または抗原成分をコードする遺伝的情報を含むこととなる。従って、場合によっては、このような抗原成分は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを加えなければ、免疫原性特性が低いことがあるので、所望の免疫原性レベルに達しないにもかかわらず、結局のところ多量に与えられなければならない。そのような場合、抗原成分は、通常の高い濃度で投与されるが、しかしながらここで所望のレベルの免疫原性を得るために本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドと共に与えられる。

従って、本発明に係るオリゴヌクレオチドと共に投与される抗原成分または抗原成分をコードする遺伝的情報の量は、経験則として、オリゴヌクレオチドがない場合に与えられる量以下であろう。特異的ワクチンの製造に従事する当業者であれば、その特異的ワクチン量がわかるであろう。また、実施例は、例えば、（例えば３つの異なる不活化ウイルスワクチン（ニューカッスル病ウイルスワクチン、感染性気管支炎ウイルスワクチンおよびシチメンチョウ鼻気管炎ワクチン）において）用いられる抗原成分量についての十分なガイダンスを与えている。

抗原成分または抗原成分をコードする遺伝的情報と共に投与される必要がある本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドの量は、選択されるオリゴデオキシヌクレオチドおよび抗原成分の双方に依存する。

本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドの非常に適切な量は、通常１から１００ナノモルの間で変化するであろう。非常に良好なインビボ結果は例えば、３０のデオキシヌクレオチドの平均長さを有する、１から１０μｇの本発明のオリゴデオキシヌクレオチド（インビトロ試験においてナノモル範囲で活性があることが示された）で得られた。

オリゴデオキシヌクレオチドが、ピコモル範囲で活性があるオリゴデオキシヌクレオチドの群から選ばれる場合、当業者は、１ナノモルより下、１ナノモルをずっと下回る量（すなわち、ピコモル量）を、ナノモル量を試験する前に試験する価値があるかもしれないということに気付くであろう。

本発明に係るワクチンは、医薬的に許容可能な担体を含む。この担体の性質はとりわけ、投与経路に依存する。投与経路が経口経路または鼻腔内経路を介するものである場合、担体は、滅菌水、生理的塩類液またはバッファのような簡単なものであってよい。注射が好ましい経路である場合、担体は好ましくは等張性であるべきであり、かつ注射に適するようなｐＨ制限を有するべきである。しかしながら、このような担体は当該技術において広く知られている。

本発明に係るワクチンは、抗原成分または抗原成分をコードする遺伝的情報、および本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドに加えて、アジュバントを含んでよい。アジュバントは一般に、非特異的な方法で宿主の免疫応答を増大させる物質である。

多くのアジュバントが当該技術において適していることが知られており（フロイントの完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマーおよびポリアニオン、例えばデキストラン硫酸、ｃａｒｂｏｐｏｌおよびピラン、水酸化アラム（ａｌｕｍｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）等）。また、多用されるのは、リン酸アラム、サポニン、植物油（トコフェロール等）および鉱油である。非常に有効なアジュバントは、水中油エマルジョンおよび特に油中水エマルジョンであり、さらに水中油アジュバントおよび油中水アジュバントとも呼ばれる。このようなエマルジョンは当該技術において周知である。従って、好ましくは、ワクチンは油中水アジュバントを含む。

好ましくは、抗原成分は、野生型の形態で家禽類に対する病原性を有するウイルスまたは微生物であるか、このウイルスまたは微生物に由来する。

より好ましくは、前記ウイルスまたは微生物は、伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウスのう病（ガンボロ）、ニワトリ貧血エージェント、トリレオウイルス、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、ヘモフィルス・パラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（コリーザ）、ニワトリポックスウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、感染性咽頭気管炎ウイルス、シチメンチョウのヘルペスウイルス、アイメリア属種、オルニソバクテリウム・ライノトラキア（Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ）（トリ感染症病原菌）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、マイコプラズマ・シノビエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓｙｎｏｖｉａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属種および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）からなる群から選択される。

また、本発明の別の実施形態は、薬剤として使用するための本発明に係る免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドに関するものである。

また、本発明の別の実施形態は、家禽類において感染症を防ぐまたは感染症と闘う際に使用するための本発明に係る免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドに関するものである。

これまで、全ての検出系は、リポータ遺伝子による細胞の一過性トランスフェクションを用いていた。このような一過性の系では、ＣｐＧＯＤＮの有効性の信頼できる逐次比較が可能ではない。前述したように、既存の系に対する主要な改善は、リポータ遺伝子を有するプラスミドの、細胞内への導入および細胞内での安定した維持であった。安定とは、何回かの細胞分裂周期の後にプラスミドが細胞中に存在したままであることを意味するものである。

プラスミドの安定した維持が、１つまたは複数の選択剤（抵抗遺伝子がプラスミド上に存在することによる抗生物質等）の圧力下で細胞を増殖させることによって、頻繁に得られる。プラスミドを損失すると、プラスミドを失った細胞が死ぬこととなる。残りの生存細胞にはプラスミドがまだ存在することとなる。

安定維持の別の方法として、線状化プラスミドによるトランスフェクションがあろう。このようなプラスミドは通常、細胞のゲノム中に統合されるので、安定して維持される。従って、本発明のさらに別の実施形態は、ＴＬＲ２１−受容体と、ＮＦ−κＢリポータ遺伝子をコードするプラスミドとを含む細胞に関するものであり、プラスミドは細胞中に安定して維持される。このような細胞は、ＣｐＧ分子のスクリーニング、より具体的には本発明に係るＣｐＧ分子のスクリーニングにおいて使用するのに非常に適している。

実施例は、細胞中に安定して維持され得る、リポータ遺伝子をコードするプラスミドを含むこのような細胞を得る方法について、十分なガイダンスを与えている。

上でも言及したように、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）に基づく検出系が、使用される検出系に非常に適していることが示された。

従って、好ましくは、リポータ遺伝子は、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子である。

基本的に、ＴＬＲ２１を有し、かつこれを発現する任意の細胞または細胞系（上述したように、ＮＦ−κＢリポータ遺伝子、好ましくはＳＥＡＰ遺伝子を有するプラスミドの導入、および好ましくはその安定した維持を可能とする）が、ＴＬＲ２１特異的ＣｐＧＯＤＮを試験するのに適している。

ＴＬＲ２１特異的ＣｐＧＯＤＮを試験するのに適したそのような細胞系の好ましい例として、ニワトリ細胞系ＨＤ１１がある。

従って、好ましくは、検出系において使用するための細胞系は、リポータ遺伝子をコードする安定したプラスミドを含むＨＤ１１細胞系である。

ニワトリ細胞系（ＨＤ１１細胞系等）は、ニワトリＴＬＲの全パネルを示す。これにより、ある種の条件において、ある種のバックグラウンド活性が生じ得る。

従って、哺乳類細胞系のような非家禽類細胞系が、より好ましい細胞系である。このような哺乳類細胞系の例として、ＴＬＲ２１がクローン化されているＨＥＫ２９３細胞がある。このような細胞系は、ＴＬＲ２１活性化シグナルに対する選択性がより特異的である。

従って、より好ましくは、検出系において使用するための細胞系は、安定して維持されるリポータ遺伝子を含み、かつＴＬＲ２１がクローン化されている哺乳類細胞系ＨＥＫ２９３である。

本発明のさらに別の実施形態は、本発明に係る免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドの検出方法に関するものであり、当該方法は、ａ）本発明に係るオリゴデオキシヌクレオチドを細胞に接触させるステップと、ｂ）リポータ遺伝子の産物のレベルを検出するステップとを含む。

この方法の好ましい形において、リポータ遺伝子の産物はＳＥＡＰである。
本実施形態のより好ましい形は、本発明に係る免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドの検出方法に関するものであり、細胞は、ニワトリ細胞系ＨＤ１１、またはニワトリＴＬＲ２１がクローン化されているＨＥＫ２９３細胞系の細胞である。

実施例
実施例１
ニワトリＴＬＲ２１の遺伝子クローニングおよび非相同発現
ニワトリＴＬＲ研究における最近の進展により、ＴＬＲ２１が、鳥種において、哺乳類ＴＬＲ９の機能的相同体であることが示唆されている（Ｋｅｅｓｔｒａ２００８、Ｂｒｏｗｎｌｉｅら２００９）。

ＴＬＲ２１遺伝子クローニングの概略
Ｇｅｎｂａｎｋデータベース配列ＮＭ＿００１０３０５５８に基づいて、プライマーペアを、ニワトリＴＬＲ２１遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅用に合成した：
Ｇａ−ＴＬＲ２１−ｆｏｒ１
ＧＡＡＧＣＴＴ（ＡＣＣ）［ＡＴＧ］ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＣ
Ｇａ−ＴＬＲ２１−ｒｅｖ１
ＧＧＣＧＧＣＣＧ［ＣＴＡ］ＣＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧ
プライマーは、フランキング位置制限クローニング部位（下線）、ならびにコザック配列（丸括弧）、開始コドンおよび終止コドン（角括弧）を与えるように設計した。これらのプライマーおよびテンプレートとしてニワトリ脾臓総ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを実行した。予想されるサイズ（約３０００ｂｐ）のＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ内にクローン化し、５つの独立したプラスミドクローン（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ１２、Ｐ１３、Ｐ１４）を配列決定した。

用いたニワトリＴＬＲ２１のＤＮＡ配列。

ＡＡＧＣＴＴ（ＡＣＣ）［ＡＴＧ］ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＣＡＣＴＧＡＴＧＣＣＧＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＣＧＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＡＧＧＡＴＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＧＣＣＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＧＴＧＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＣＡＴＧＣＣＡＴＣＧＣＧＣＴＣＡＡＴＣＴＧＴＣＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＡＴＧＣＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＴＴＧＣＣＣＡＣＣＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＧＣＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＣＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＧＴＧＣＣＴＴＣＡＡＴＧＧＧＣＴＧＧＧＴＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＴＣＴＣＡＣＡＡＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＣＡＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＧＧＧＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＡＣＣＴＧＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＣＡＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＧＧＴＧＴＣＡＣＣＡＡＧＴＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＣＣＴＧＧＴＣＡＡＣＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＴＣＴＣＴＡＣＧＧＧＧＣＧＧＧＣＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＧＧＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＴＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＣＣＴＡＴＧＴＧＡＡＡＡＣＡＡＣＣＴＧＡＣＡＡＣＧＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＣＧＣＣＴＣＧＣＴＧＣＴＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＴＧＣＡＡＣＡＡＣＴＣＧＣＴＧＡＧＧＧＡＧＴＴＡＧＣＧＧＧＧＧＧＣＡＧＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＣＴＡＴＧＧＣＡＣＧＴＧＡＡＧＡＴＡＣＴＣＧＡＣＣＴＣＴＣＣＴＡＣＡＡＣＡＧＴＡＴＣＴＣＡＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＣＴＴＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣＴＧＡＴＣＧＧＣＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＣＣＴＧＴＴＧＧＡＣＡＴＣＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＣＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＴＡＡＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＣＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＴＴＧＴＡＡＴＧＣＡＣＴＧＣＡＧＴＴＧＴＧＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＧＡＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＣＧＴＧＧＧＣＴＧＴＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＡＣＡＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＴＧＣＣＴＧＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＣＴＣＧＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＣＧＣＴＴＴＡＡＣＣＧＣＡＴＣＣＴＧＡＣＴＧＴＴＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧＣＴＣＡＡＴＡＴＴＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＴＧＡＣＡＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＣＣＴＣＴＡＴＣＡＣＡＡＣＴＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＣＧＣＡＣＣＣＴＣＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＣＡＡＣＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＴＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＣＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＧＧＧＧＧＣＡＡＣＡＡＣＴＴＧＣＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＡＣＡＧＴＣＡＣＴＧＣＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＣＡＡＡＣＴＧＣＧＣＡＧＧＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＡＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＣＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＣＴＡＣＣＣＴＧＧＧＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＧＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＣＡＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＣＴＴＣＣＧＣＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＴＣＡＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＡＡＣＡＴＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＡＴＣＣＣＡＣＣＧＧＡＴＧＴＣＴＴＣＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＣＴＣＣＣＴＧＧＣＡＴＴＧＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＴＧＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＡＴＣＴＴＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＴＧＣＡＧＧＧＣＴＧＣＡＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＧＧＣＡＡＴＣＴＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴＧＧＣＣＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＣＡＧＣＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＴＴＧＣＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＴＧＴＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＴＧＡＣＡＡＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＧＣＡＧＧＴＴＧＴＣＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＴＣＡＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＴＡＴＣＴＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＡＣＴＧＣＡＣＣＧＧＣＡＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧＴＧＴＡＣＣＡＣＣＧＣＧＣＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＴＡＣＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＴＴＣＴＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＴＣＡＡＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＣＴＡＣＣＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣＴＡＣＡＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＴＴＧＧＧＴＧＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＧＴＧＣＣＴＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＣＴＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＣＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＣＧＧＧＣＣＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＴＧＡＣＡＡＣＡＴＴＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＡＣＧＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＣＧＣＡＧＣＧＡＧＴＧＧＴＧＣＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＡＧＣＴＡＣＣＧＧＣＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＡＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＡＣＣＡＣＣＧＣＡＴＧＣＧＧＣＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＣＧＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＧＣＴＧＧＣＣＴＣＴＴＧＡＣＣＣＣＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＣＧＣＴＣＴＴＴＴＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＴＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＣＧＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＡＡＣＡＧＡＴＧ［ＴＡＧ］ＣＧＧＣＣＧＣ

ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｏ−ｃｈｉＴＬＲ２１によるＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆＴｙ２−Ｚｅｏ（クローン細胞系）のトランスフェクション
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞２９３は、１９７０年代にウイルストランスフォーメーション（Ｇｒａｈａｍら，１９７７）によって生み出されたものであり、現在、細胞系リポジトリ（ＡＴＣＣ等）を経由して、研究コミュニティが利用できるものである。

ｐＮｉｆｔｙ２は、ＮＦκＢ転写因子活性化（多くの免疫刺激性作用（そのなかでも、Ｔｏｌｌ様受容体活性化）のホールマークである）の検出を可能にするプラスミドである。ＮＦκＢ活性化に関する転写／翻訳に依存的なｐＮｉｆＴｙ２中のリポータ遺伝子は、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である。詳細は、このプラスミドを販売している企業（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）のデータシートに記載されている。ｐＮｉｆｔｙ２によるトランスフォーメーション／トランスフェクションイベントを、細菌および哺乳類細胞の双方において、増殖培地へのゼオシンの添加により選択する。

ＨＥＫ２９３細胞を、標準的な方法（リポフェクション）によってｐＮｉｆＴｙ２によりトランスフェクトし、安定した細胞系を選択し、ＮＦ−κＢ／ＳＥＡＰ軸の機能性を、ヒト腫瘍壊死因子α（Ｓｉｇｍａ）による刺激によって確立した。刺激した細胞の培養上清中の分泌ＳＥＡＰを、発色基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ、５ｍＭ）（アルカリ性バッファ（５０ｍＭＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６、２ｍＭＭｇＣｌ２）中）を用いるマイクロタイタープレート比色アッセイによって判定した。発色（λ＝４０５ｎｍ）を、マイクロタイタープレートリーダによって監視した。また、この読取りを用いて、高いシグナル対ノイズ比のクローン系を（限界希釈法によって）選択した。これらの選択したクローンの１つ（ダブ（ｄｕｂｂｅｄ）クローン１１）を、ニワトリＴＬＲ２１を用いるさらなる研究に用いた。

ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｎｅｏは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した標準的な哺乳類発現ベクターである。このベクター内へのニワトリＴＬＲ２１遺伝子のサブクローニングを、ＰＣＲによって導入したフランキング位置ＨｉｎｄＩＩＩ（開始コドン）およびＮｏｔＩ（終止コドン）部位を介して行った（図１参照）。

続いて、このプラスミドをクローンＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆｔｙ２−ｚｅｏ系内にトランスフェクトし（リポフェクション）、組換え細胞を、ゼオシンおよびＧ４１８双方の増殖培地中への添加により選択した。生じたポリクローナル組換え細胞系の機能性を、ＯＤＮ−Ｘ４およびＯＤＮ−ＨＥＫ１−ＰＴＯによる培養物の刺激、ならびにＳＥＡＰの検出によって評価した。続いて、優れたクローン系を、限界希釈法とその後の刺激およびＳＥＡＰ検出とによって識別した。

ＳＥＡＰは、哺乳類系におけるリポータ酵素である（Ｙａｎｇら，１９９７）。ＳＥＡＰは、分泌型ヒト胚アルカリホスファターゼである。この主要な利点は、高い安定性および非常に高い特異的活性であり、これらにより検出の感度およびロバスト性が確実なものとなる。ＳＥＡＰ検出用のいくつかの基質が記載されているが、経済的かつロバストなｐＮＰＰを選択した（その反応産物ｐ−ニトロフェノラートが高い感度（ε４０５＝１８５００Ｍ−１ｃｍ−１）で検出されるからである）。発明者らの試験セットアップでは、カイネティックアッセイを実行する（より広い定量化ダイナミックレンジをもたらすからである）。

ＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆＴｙ２−Ｚｅｏ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｏ−ｃｈｉＴＬＲ２１（ＰｖｕＩで線状化した）によりトランスフェクトし、培地を３５０μｇ／ｍｌゼオシンおよび６００μｇ／ｍｌＧ４１８で補充することにより、ポリクローナル細胞系を選択した。ＯＤＮ−Ｘ４（ＰＤＥ）およびＯＤＮ−ＨＥＫ１（ＰＴＯ）により細胞を刺激することによって、機能性試験を実行した。分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）が、選択した細胞によって生産されたが、親ＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆＴｙ２−Ｚｅｏ細胞系によっては生産されなかった。単一細胞クローニングを実行し、個々のクローンを、ＯＤＮ−Ｘ４（ＰＤＥ）（ＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧＧＧ）およびＯＤＮ−ＨＥＫ１（ＰＴＯ）（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＧＴＣＧＴＴ）に対する反応性について分析した。

４６のｚｅｏ／Ｇ４１８二重耐性クローン細胞系のうち、わずか３つが明らかにＯＤＮ刺激に反応し、さらに３つから４つの細胞系がより弱いシグナルを示した。従って、選択したクローンの８５％が機能的でなかった。

さらなる全ての研究用に、クローン細胞系３８（ＯＤＮ−Ｘ４（ＰＤＥ）およびＯＤＮ−ＨＥＫ１（ＰＴＯ）刺激に対する反応に関して飛びぬけた最も高いＳＥＡＰ読取りシグナルを生じた）を用いた。

図２から図５は、種々のｚｅｏ／Ｇ４１８二重耐性クローン細胞系のＳＥＡＰ活性の概要を示す。

実施例２
Ｘ４３−バッチ４：ＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＧＴＣＴＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧから開始して、以下の修飾をし、試験した：
Ｘ４３−Ｉ−ＴＧＧＧＧＧＧＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＣＧＴＣＴＧＧＧＧＧ
Ｘ４３−Ｉ−ＣＧＧＧＧＧＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＧＴＣＣＧＧＧＧＧ
Ｘ４３−ＩＩ−ＴＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＧＧＧＧＧ
Ｘ４３−ＩＩ−ＣＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＣＧＴＣＣＣＴＴＴＴＣＧＴＣＣＣＴＴＴＴＣＧＴＣＣＣＧＧＧＧＧ
Ｘ２３−バッチ３ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧ
Ｘ２３−ＩＧＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＣＴＴＧＴＣＧＴＣＴＴＧＴＣＧＴＣＴＧＧＧＧＧ
図６からわかるように、オリゴヌクレオチドＸ４３−ＩＩＴは、試験した他のオリゴヌクレオチドと比較すると、最大反応に関して、リポータ細胞（ＨＥＫ２９３−ｐＮｉｆｔｙ２−ｃｈｉｃｋｅｎＴＬＲ２１）中のリポータ酵素ＳＥＡＰの有色産物（４０５ｎｍで吸光する）の極端な誘導量をもたらしている。

Ｘ４３−ＩＩ−Ｔは、式^５’［Ｇ］_ｘ｛［Ｔ］_ｐＴＴＣＧＴＣ［Ｔ］_ｑ｝_ｎ［Ｇ］_ｚ ^３’を表し、式中ｘ＝６、ｚ＝５、ｐ＝２、ｑ＝２およびｎ＝３である。

図６に基づいて、以下のＥＣ_５０を、種々の化合物について計算した：
ＥＣ_５０計算値：
Ｘ４３−バッチ４３．９１ｎＭ
Ｘ４３−Ｉ−Ｔ＞１２００ｎＭ
Ｘ４−Ｉ−Ｃ＞３００ｎＭ
Ｘ４３−ＩＩ−Ｔ０．５３ｎＭ
Ｘ４３−ＩＩ−Ｃ８．２８ｎＭ
Ｘ２３−バッチ３６．０８ｎＭ
Ｘ２３−Ｉ＞４００ｎＭ
結論：以下のように、ＯＤ４０５ｎｍ／分を表す図６、およびナノモルのＥＣ_５０を表す図７から、Ｘ４３（→Ｘ４３−ＩＩ−Ｔ）中の３’−フランキング位置に２つのチミジン、および５’−フランキング位置に２つのチミジンを追加すると、最大反応およびＥＣ_５０の双方に関して、効力が予想外に大きく増加する。化合物^５’［Ｇ］_６｛［Ｔ］_２ＴＴＣＧＴＣ［Ｔ］_２｝_３［Ｇ］_５ ^３’のＥＣ_５０は、ピコモルの範囲にあることが示された。

実施例３
本実施例において、ｎの数を、Ｘ４３−ＩＩ−ｔｒｉｐのｎ＝３から、ｎ＝４（Ｘ４３−ＩＩ−ｑｕａｄ）、およびｎ＝５（Ｘ４３−ＩＩ−ｐｅｎｔ）に変えた。

Ｘ４３−ｔｒｉｐ５’−ＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＧＴＣＴＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧ−３’（＝標準形１）
Ｘ４−ｐｅｎｔ５’−ＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧＧＧ−３’（＝標準形２）
Ｘ４３−ＩＩ−ｔｒｉｐ５’−ＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＧＧＧＧＧ−３’（ｎ＝３、［ｐおよびｑ］＝２）
Ｘ４３−ＩＩ−ｑｕａｄ５’−ＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＧＧＧＧＧ−３’（ｎ＝４、［ｐおよびｑ］＝２）
Ｘ４３−ＩＩ−ｐｅｎｔ５’−ＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＧＧＧＧＧ−３’（ｎ＝５、［ｐおよびｑ］＝２）
図８に、数ｎの増大効果を示す。以下の表において、ＥＣ_５０に及ぼすｎの増大効果を示す。ｎの増大によりＥＣ_５０が減少することから、より高い免疫刺激効果が導かれることが明らかである。

ＯＤＮＥＣ５０
Ｘ４３−ｔｒｉｐ３３８ｐＭ
Ｘ４３−ＩＩ−ｔｒｉｐ１５５ｐＭ
Ｘ４３−ＩＩ−ｑｕａｄ１３２ｐＭ
Ｘ４３−ＩＩ−ｐｅｎｔ５９ｐＭ
Ｘ４−ｐｅｎｔ３４０ｐＭ
実施例４
本実施例において、数ｐおよびｑを、２（Ｘ４３−ＩＩ−ｔｒｉｐ）から、３（Ｘ４３−ＩＩＩ−ｔｒｉｐ）、および４（Ｘ４３−ＩＶ−ｔｒｉｐ）にまで変えた。

Ｘ４３−Ｉ−ｔｒｉｐ５’−ＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＧＴＣＴＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧ−３’（＝標準形１）
（ｎ＝３、［ｐおよびｑ］＝０）
Ｘ４−ｐｅｎｔ５’−ＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧＧＧ−３’（＝標準形２）
Ｘ４３−ＩＩ−ｔｒｉｐ５’−ＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＧＧＧＧＧ−３’
（ｎ＝３、［ｐおよびｑ］＝２）
Ｘ４３−ＩＩＩ−ｔｒｉｐ５’−ＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＧＧＧＧＧ−３’
（ｎ＝３、［ｐおよびｑ］＝３）
Ｘ４３−ＩＶ−ｔｒｉｐ５’−ＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＧＧＧＧＧ−３’
（ｎ＝３、［ｐおよびｑ］＝４）
図９に、数ｐおよびｑの増大効果を示す。以下の表において、ＥＣ_５０に及ぼすｎの増大効果を示す。ｐおよびｑの増大によりＥＣ_５０が減少することから、より高い免疫刺激効果が導かれることが明らかである。

ＯＤＮＥＣ_５０
Ｘ４３−ｔｒｉｐ３３８ｐＭ
Ｘ４３−ＩＩ−ｔｒｉｐ１５５ｐＭ
Ｘ４３−ＩＩＩ−ｔｒｉｐ１４８ｐＭ
Ｘ２３−ＩＶ−ｔｒｉｐ１０４ｐＭ
Ｘ４−ｐｅｎｔ３４０ｐＭ

実施例５
本実施例において、数ｘを６から７に増大させ（Ｘ４３−ＩＩ−５７３５）、ｚを５から２に減少させた（Ｘ４３−ＩＩ−５７３２）。

Ｘ４３−ＩＩ５’−ＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＧＧＧＧＧ−３’
（＝標準形１、Ｘ４３−ＩＩ−ｔｒｉｐ）
Ｘ４−ｐｅｎｔ５’−ＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧＧＧ−３’
（＝標準形２）
Ｘ４３−ＩＩ−５７３５５’−ＧＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＧＧＧＧＧ−３’
（→ｘ＝７、ｚ＝５、ｐおよびｑの双方＝２、ならびにｎ＝３）
Ｘ４３−ＩＩ−５７３２５’−ＧＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＴＴＧＧ−３’
（→ｘ＝７、ｚ＝２、ｐおよびｑの双方＝２、ならびにｎ＝３）
図１０に、数ｘの増大効果および数ｚの減少効果を示す。以下の表において、ＥＣ_５０に及ぼすｎの増大効果を示す。ｘの増大およびｚの減少の双方によりＥＣ_５０が増大することから、より高い免疫刺激効果が導かれる。

ＯＤＮＥＣ_５０
Ｘ４３−ＩＩ−ｔｒｉｐ１５５ｐＭ
Ｘ４３−ＩＩ−５７３５１０５ｐＭ
Ｘ２３−ＩＩ−５７３２＜＜１００ｐＭ
Ｘ４−ｐｅｎｔ３４０ｐＭ

Claims

式
^５’［Ｇ］_ｘ｛［Ｔ］_ｐＴＴＣＧＴＣ［Ｔ］_ｑ｝_ｎ［Ｇ］_ｚ ^３’
を有し、
式中、ｐ＝１から１５、ｑ＝１から１５、ｎ＝２から１００、ｘ＝３から１０、およびｚ＝０から１０である、免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド、またはその医薬的に許容可能な塩。
ｐ＞１である、請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
ｐ＞２である、請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
ｑ＞１である、請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
ｑ＞２である、請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
ｎ＝３から１８である、請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
^５’［Ｇ］_ｘおよび^３’［Ｇ］_ｚヌクレオチドがホスホロチオエート結合を有し、他のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合を有することを特徴とする、請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
｛［Ｔ］_ｐＴＴＣＧＴＣ［Ｔ］_ｑ｝_ｎがホモポリマーである、請求項１から請求項７の何れかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
前記オリゴデオキシヌクレオチドは、担体またはハプテンに結合されている、請求項１から請求項８の何れかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
請求項１から請求項８の何れかに記載のオリゴデオキシヌクレオチドを含むベクター。
感染症を防ぐまたは感染症と闘うためのワクチンであって、
免疫刺激量の、請求項１から請求項９の何れかに記載のオリゴデオキシヌクレオチドおよび免疫学的量の抗原成分若しくは抗原成分をコードするポリヌクレオチド、および／または
請求項１０に記載のベクターおよび免疫学的量の抗原成分もしくは抗原成分をコードするポリヌクレオチド、ならびに
医薬的に許容可能な担体を含むことを特徴とする、ワクチン。
前記抗原成分が、野生型の形態で家禽類に対する病原性を有するウイルスまたは微生物であるか、このウイルスまたは微生物に由来することを特徴とする、請求項１１に記載のワクチン。
前記ウイルスまたは微生物が、伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウスのう病（ガンボロ）、ニワトリ貧血エージェント、トリレオウイルス、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、ヘモフィルス・パラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（コリーザ）、ニワトリポックスウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、感染性咽頭気管炎ウイルス、シチメンチョウのヘルペスウイルス、アイメリア属種、オルニソバクテリウム・ライノトラキア（Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、マイコプラズマ・シノビエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓｙｎｏｖｉａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属種および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載のワクチン。
薬剤として使用するための、請求項１から請求項９の何れかに記載の免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド、または請求項１０に記載のベクター。
家禽類において感染症の予防に使用するための、請求項１から請求項９の何れかに記載の免疫刺激性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド、または請求項１０に記載のベクター。