JP5856956B2

JP5856956B2 - 血液検査方法

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Publication number: JP5856956B2
Application number: JP2012522624A
Authority: JP
Inventors: 吉康狩野; 卓味大村; 紀光荒井; 順西村; 宮崎　修; 修宮崎
Original assignee: Sekisui Medical Co Ltd; Eidia Co Ltd
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd; Eidia Co Ltd
Priority date: 2010-06-29
Filing date: 2011-06-28
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2031-06-28
Also published as: JPWO2012002345A1; WO2012002345A1

Description

本発明は、ＰＩＶＫＡ−IIの測定方法、ＰＩＶＫＡ−IIの測定試薬及び抗体に関し、特に、検体中のビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIを測定することによる肝がんにおける肝障害度の判定及び特異性を上げることが可能なＰＩＶＫＡ−IIの測定方法、ＰＩＶＫＡ−IIの測定試薬及びモノクローナル抗体に関する。

ＰＩＶＫＡ−II（Protein Induced by Vitamin K Absence or Antagonist-II）は、ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）と並んで肝がんを診断するマーカーとして広く臨床検査室で測定されている。
ＰＩＶＫＡ−IIはビタミンＫ依存性血漿タンパク質の一つであるプロトロンビンの前駆物質である。プロトロンビン（血液凝固第II因子）は、分子量71,600のタンパクで、フラグメント1、2及びトロンビンの3領域から構成されており、アミノ酸配列も明らかにされている（非特許文献１）。フラグメント1は、Ｎ末端から41個のアミノ酸によって構成されるGlaドメインを含む156個のアミノ酸からなる。このGlaドメイン中の10個のγ−カルボキシグルタミン酸（Gla）残基が正常に合成されたものが正常プロトロンビン、正常に合成されず、その全てあるいは一部がグルタミン酸（Glu）残基のままのものがＰＩＶＫＡ−IIである。従って、ＰＩＶＫＡ−IIとは正常プロトロンビンのγ−カルボキシグルタミン酸残基についての脱カルボキシル化体であるということもでき、異常プロトロンビンと呼ばれることもある。１０個のグルタミン酸残基中いくつがγ−カルボキシル化を受けるかにより数種類のＰＩＶＫＡ−IIが混在した状態で存在している（非特許文献２）。

肝がん細胞が産出するＰＩＶＫＡ−IIは、ほとんどがGlu残基のままであり、セルラインＭＵ−３より得たモノクローナル抗体（特許文献１）を使用した従来のＰＩＶＫＡ−II測定試薬は、正常プロトロンビンの10個のGla残基のうち、10〜9個がGlu残基であるＰＩＶＫＡ−IIと強い反応性を示すことが知られている（非特許文献２）。

一般的には、ＰＩＶＫＡ−IIは次のようにして測定されている。まず、ＰＩＶＫＡ−IIに特異的なモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を吸着させた磁気ビーズやガラスビーズ、プラスチックプレート、ラテックス等を血清や血漿と第一反応させたのち、ＢＦ洗浄を行い、続いて酵素、蛍光物質、放射性同位元素やＲｕ錯体等で標識した、ヒトプロトロンビンに特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を加えて第二反応をさせてＢＦ洗浄した後、抗原抗体反応によって形成された免疫複合体に結合している酵素、蛍光物質、放射性同位元素、Ｒｕ錯体の吸光度又は発光量を測定する（特許文献２）。
また、プロトロンビンとは反応せず且つＰＩＶＫＡ−IIとのみ反応するモノクローナル抗体と、プロトロンビンと反応し且つＰＩＶＫＡ−IIとも反応するモノクローナル抗体を組み合わせた測定方法も知られている（特許文献３）。
また、Gla残基はカルシウム結合能を持っているため、カルシウム存在下で立体構造が変化することがわかっており、カルシウム存在下でのみＰＩＶＫＡ−IIに特異的に結合する抗体を用いた測定方法も知られている（非特許文献３）。

肝がんは他臓器の悪性腫瘍と異なり、もともと慢性肝炎や肝硬変であったところに肝がんが合併するため、肝がん症例の治療にあたっては腫瘍側因子だけではなく、肝障害度を考量した上で治療方針を決定する必要がある。腫瘍マーカー検査としては、ＰＩＶＫＡ−IIやＡＦＰが用いられているが、治療方針の決定に必要となる肝障害度や予後を必ずしも反映していない。こうした中、肝障害度や予後予測を反映する血液検査が望まれていた。
肝障害度とは、「原発性肝癌取扱い規約」に記載されている肝予備能を評価する指標である。腹水、血清ビリルビン値、血清アルブミン値、ＩＣＧＲ_１５、プロトロンビン活性値を３度に分類し、各項目別重症度を求め、２項目以上が該当した肝障害度を取る。またはＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類を用いて評価することもできる。Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類は、脳症、腹水、血清ビリルビン値、血清アルブミン値、プロトロンビン活性値について、１〜３点のポイントを付け、その合計点の低い方からＡ〜Ｃまで分類する肝障害度を示す指標である。

またＰＩＶＫＡ−IIは、肝がんでない場合でも、ビタミンＫ不足、ビタミンＫ拮抗剤投与症例においても上昇することがわかっている。試薬の高感度化に伴いアルコール性肝炎等における偽陽性が散見され、さらにＰＩＶＫＡ−IIが陽性にもかかわらず画像診断では肝がんが見つからない症例も報告されている。こうした中、より肝がんに特異性の高い測定方法の開発が望まれていた。

特公平５−４３３５７特開平５−２４９１０８特開平９−４３２３７

Biochemistry. 1987 Sep 22;26(19):6165-77 Biochem Biophys Acta. 2002 Apr 24；1586(3)：287-98 2002 J Immunoassay. 1995 May;16(2):213-29.

前述のごとくＰＩＶＫＡ−IIには、肝臓において肝がん細胞が産出するＰＩＶＫＡ−IIと、ビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−II（以下、肝がん細胞が産出するＰＩＶＫＡ−II以外のＰＩＶＫＡ−IIを「ビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−II」とする。）があるが、従来の測定試薬ではそれらの区別が難しく、偽陽性が散見されるため、より偽陽性の少ない測定方法の開発が望まれていた。
本発明は、肝がんにおける肝障害度の判定及び予後予測を可能とし、肝がんを感度良く検出することができるＰＩＶＫＡ−IIの測定方法、ＰＩＶＫＡ−IIの測定試薬、肝障害度の判定方法及び肝がんの判定方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意検討を行い、ビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIと反応する２種の抗体を用いた二抗体サンドイッチ法によりＰＩＶＫＡ−IIを測定することで、肝がんにおける肝障害度の判定及び予後予測が可能となることを見出した。また、この抗体を用いて得られる測定値と従来の方法で行ったＰＩＶＫＡ−II測定値を比較することにより、アルコール性肝炎や肝硬変と肝がんを区別することが可能であり、肝がんの予後予測と、特異性の高い肝がんの検出が可能となることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明のＰＩＶＫＡ−IIの測定方法は、（ａ）二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によってビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIを測定し、測定値Ａを得る工程、を含むＰＩＶＫＡ−IIの測定方法であって、前記（ａ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体として、ビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIに特異的な抗体を使用することを特徴とする。

本発明のＰＩＶＫＡ−IIの測定方法は、（ｂ）二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によってＰＩＶＫＡ−IIを測定し、測定値Ｂを得る工程、及び（ｃ）前記測定値Ａ及び前記測定値Ｂを比較する工程、をさらに含み、前記（ｂ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる一方の抗体として人肝がん細胞培養細胞株より精製したＰＩＶＫＡ−IIと反応する抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクローナル抗体を使用し、前記（ｂ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる他方の抗体としてヒトトロンビンと反応する抗体を含まない抗ヒトプロトロンビン抗体を使用することが好適である。

前記（ａ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体が、人肝がん細胞培養細胞株より精製したＰＩＶＫＡ−IIと反応しないことが好ましい。

前記（ａ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体が、ヒトトロンビンと反応しないことが好適である。

前記（ａ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体がモノクローナル抗体であることが好適である。

前記（ａ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体がいずれも、Ｃａ²⁺イオンの共存下における抗原固相ELISAにおいて、ｉ）プロトロンビンとは反応せず、且つｉｉ）プロトロンビンの脱炭酸処理を６時間したものに比べ、脱炭酸処理を３０分したものに対する反応性が高い、ものの組み合わせであることが好適である。

本発明のＰＩＶＫＡ−IIの測定試薬は、二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によってビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIを測定するに当り、抗体として、ビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIに特異的な抗体を使用することを特徴とする。

本発明のビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIの測定試薬において、前記二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体がいずれも、Ｃａ²⁺イオンの共存下における抗原固相ELISAにおいて、ｉ）プロトロンビンとは反応せず、且つｉｉ）プロトロンビンの脱炭酸処理を６時間したものに比べ、脱炭酸処理を３０分したものに対する反応性が高い、ものの組み合わせであることが好適である。

本発明のモノクローナル抗体の第一の態様は、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１２５８で特定されるハイブリドーマにより産生されることを特徴とする。

本発明のモノクローナル抗体の第二の態様は、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１２５９で特定されるハイブリドーマにより産生されることを特徴とする。

本発明のハイブリドーマの第一の態様は、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１２５８で特定されることを特徴とする。

本発明のハイブリドーマの第二の態様は、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１２５９で特定されることを特徴とする。

本発明のＰＩＶＫＡ−IIの測定方法及び測定試薬において、前記ビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIに特異的な抗体が、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１２５８で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体及び受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１２５９で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることが好適である。

本発明の肝障害度の判定方法は、本発明のＰＩＶＫＡ−IIの測定方法によって得られた値により、肝障害度を判定することを特徴とする。

本発明の肝がんの判定方法は、本発明のＰＩＶＫＡ−IIの測定方法によって得られた値により、肝がんを判定することを特徴とする。

本発明により、血液検査では従来は困難であった、肝がんにおける肝障害度の判定及び予後予測を的確に判定することができ、肝がんを感度良く検出することができる。さらに、本発明により、肝がんを発症していないアルコール性肝炎や肝硬変と肝がんを区別することが可能であり、肝がんの予後予測と、特異性の高い肝がんの検出が可能である。

抗体の反応性とプロトロンビンの脱炭酸処理時間の関係を示したグラフである。実施例２及び比較例１〜３の測定値のＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類別平均値を示したグラフであり、（ａ）は実施例２の結果、（ｂ）は比較例１の結果、（ｃ）は比較例２の結果、及び（ｄ）は比較例３の結果をそれぞれ示す。実施例２及び比較例１〜３のＲＯＣ分析の結果を示したグラフである。実施例３のＰＩＶＫＡ−IIの測定結果を示すグラフである。実施例３のレシオ値を示したグラフである。実施例４（１）のGla残基含有ペプチドに対する抗体の反応性を示すグラフである。実施例４（１）のペプチドの共通部位を示した図である。実施例４（２）の変性プロトロンビン及び変性ＰＩＶＫＡ−IIに対する反応性を示す図である。実施例４（３）のフラグメント１及びフラグメント２に対する反応性を示す図である。

以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。

本発明のＰＩＶＫＡ−IIの測定方法は、（ａ）二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によってビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIを測定し、測定値Ａを得る工程、を含むＰＩＶＫＡ−IIの測定方法であって、前記（ａ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体として、ビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIに特異的な抗体を使用するものである。本願明細書において、前記（ａ）工程で測定されたビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIをＮＸ−ＰＶＫＡと称することがある。

前記（ａ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体は、それぞれ、ビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIを抗原として作製されるビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIと反応する抗体であり、例えば、下記方法により製造される。

非肝がん症例のクマジン血漿（ビタミンＫ拮抗物質投与患者の血漿）より精製したＰＩＶＫＡ−II、すなわち、ビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIを免疫原にして、公知の方法によりハイブリドーマを作製し、ビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIと反応するハイブリドーマ株を選択する。該ハイブリドーマ株選択時に、人肝がん細胞培養細胞株より精製したＰＩＶＫＡ−IIやヒトトロンビンと反応しないハイブリドーマ株を選択することが好ましい。特に、プロトロンビンの１０個のグルタミン酸残基についてのγ−カルボキシル化の割合が高いＰＩＶＫＡ−IIに反応性が高いハイブリドーマを選択することが好適であり、具体的には、正常プロトロンビンの脱炭酸処理時間が短いＰＩＶＫＡ−IIに対して高い反応性を示すハイブリドーマを選択することが好適である。例えば、プロトロンビンより脱炭酸処理時間３０分及び６時間で調製したＰＩＶＫＡ−IIに対する反応性を比較する場合、３０分で調製したＰＩＶＫＡ−IIに対する反応性を６時間で調製したＰＩＶＫＡ−IIに対する反応性で割った場合に１より大きくなるハイブリドーマを選択することが好ましい。前記ハイブリドーマとしては、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１２５８で特定されるハイブリドーマ及び受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１２５９で特定されるハイブリドーマが好ましい。

前記選択したハイブリドーマを用いてモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製し、該モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを用いて公知の方法によりビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIと反応するモノクローナル抗体を得ることが好ましい。

前記（ａ）工程における二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法は、例えば、下記方法により実施される。
前記方法により、ビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIを抗原として２種のモノクローナル抗体を調製し、一方を固相化して用い、他方を標識して用いる。該２種の抗体は、互いに交差反応しない抗体である。
抗体を固相化する方法は特に制限はないが、例えば、磁気ビーズやマイクロプレート等の固相に固相化することが好適である。
抗体を標識する方法は特に制限はないが、Ｒｕ等の標識物質により標識することが好ましい。

前記固相化抗体及び標識抗体を用いて、検体中のビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIを測定する。測定は、二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法における通常の手順に従って行えばよい。なお、後述する実施例では、電気化学発光免疫測定法を用いた例を示したが、本発明はこれに限定されるものではなく、例えば、化学発光法や放射性同位元素法等の公知の測定法を広く使用可能である。

本発明において、前記（ａ）工程で測定されたＮＸ−ＰＶＫＡの測定値Ａを得ることにより、肝がんにおける肝障害度を判定することができる。また、測定値Ａを、従来の方法により測定されるＰＩＶＫＡ−IIの測定値と比較することにより、肝がんを発症していないアルコール性肝炎や肝硬変と肝がんを区別することができる。
従来の肝がんで上昇するＰＩＶＫＡ−IIの測定方法としては特に制限はないが、例えば、（ｂ）二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によってＰＩＶＫＡ−IIを測定し、測定値Ｂを得る工程を含み、前記（ｂ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる一方の抗体として人肝がん細胞培養細胞株より精製したＰＩＶＫＡ−IIと反応する抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクローナル抗体を使用し、前記（ｂ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる他方の抗体としてヒトトロンビンと反応する抗体を含まない抗ヒトプロトロンビン抗体を使用する方法が挙げられる。

前記測定値Ａと前記測定値Ｂを比較する手段は特に制限はなく、例えば、比や差を算出する方法が挙げられるが、測定値Ｂを測定値Ａで除算してレシオ値を求めることが好適である。

以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

（実施例１）モノクローナル抗体の調製
（１）ハイブリドーマの調製
クマジン血漿（UNIGLOBE RESEARCH CORPORATION社製）より精製したＰＩＶＫＡ−II（１ｍｇ／ｍＬ）とフロイドの完全アジュバント（GIBCO社製）とを１対１で混和乳化し、５０μｇ／１００μｍＬ（エマルジョン）で８週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス（日本チャールズリバー（株）製）の皮下に２週間間隔で４回投与後、最終免疫の３日後に脾臓を摘出した。摘出した脾臓から得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４とを１０対１の割合で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５４０（和光純薬工業（株）製）存在下にて細胞融合させた。融合細胞は脾臓細胞として２．５ｘ１０^６／ｍＬになるようにＨＡＴ培地に懸濁し、９６穴培養プレート（CORNING社製）に０．２ｍＬずつ分注した。これを５％ＣＯ_２インキュベーター中で３７℃にて培養し、おおよそ２週間後に、ハイブリドーマの生育してきたウェルの培養上清を、次に示すＥＬＩＳＡ法にしたがって評価し、ＰＩＶＫＡ−IIに反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択した。

具体的には、まず、マイクロプレート（NUNC社製）に前記のＰＩＶＫＡ−IIを０．１μｇ／ｍＬ固相化した。これに、各培養上清を反応させた後、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧヤギ抗体を反応させ、次いでオルトフェニレンジアミン（東京化成工業（株）製）を含むペルオキシダーゼ基質溶液を加え発色させ、１．５Ｎ硫酸を加えて発色を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ａｂｓ．４９２ｎｍ）で測定し、ＰＩＶＫＡ−IIと反応するハイブリドーマ株を選択した。このハイブリドーマを限界希釈法によりクローン化を行った後、その培養上清から、プロテインＡカラム（ファルマシア）を用いＩｇＧを精製した。

獲得したモノクローナル抗体の特異性を調べるため、プロトロンビン（Enzyme Research Laboratories社）からBajahらの方法（S. Paul Bajah, Paul A. Price, and William A. Russell, Decarboxylation of γ-Carboxyglutamic Acid Residues in Human Prothrombin, Journal of Biological Chemistry 257(7):3726,1982に記載の方法）に従い、脱炭酸時間の異なる各種ＰＩＶＫＡ−IIを調製した。具体的には、４．６ｍｇ／ｍＬのプロトロンビン溶液０．２２ｍＬに０．７８ｍＬの重炭酸アンモニウム溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８．０）を添加し、これを更に重炭酸アンモニウム溶液で４℃において一夜透析した。透析後の溶液に終濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌになるように０．１ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ・2Ｎａを添加し、室温で３０分間静置した。この溶液を再び重炭酸アンモニウム溶液で４℃において２時間透析した。透析後の溶液をスクリューキャップ付きの耐熱性バイアル6本に等量ずつ分注し、凍結乾燥した。次にバイアル内を窒素ガスで充満させ、１１０℃で各時間（0分、３０分、１時間、２時間、６時間、２３時間）加熱した。各バイアルに１ｍＬの生理食塩水を加え、内容物を溶解させ、使用するまで−８０℃で凍結保存した。

前記の各種ＰＩＶＫＡ−IIのうち、脱炭酸処理時間３０分及び６時間のＰＩＶＫＡ−II、及びプロトロンビンを０．１μｇ／ｍＬ固相化したマイクロプレートを用いて、塩化カルシウムを４ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で共存させた条件で、選択したハイブリドーマの精製ＩｇＧの反応性を測定した。この条件でプロトロンビンに反応せず、且つ脱炭酸処理時間６時間のＰＩＶＫＡ‐IIに比べて脱炭酸処理時間３０分のＰＩＶＫＡ‐IIに対して高い反応性を示すハイブリドーマを選択し、２種類のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ２４２１１と２４２１６（以下、それぞれ「ハイブリドーマ１１」及び「ハイブリドーマ１６」と表記することがある）を獲得した。前記得られたハイブリドーマ１１及び１６は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託され（受領日：2010年5月28日）、ハイブリドーマ１１の受託番号はＦＥＲＭＢＰ−１１２５８であり、ハイブリドーマ１６の受託番号はＦＥＲＭＢＰ−１１２５９である。

脱炭酸処理時間を表１及び図１に示した如く変更した以外は上記と同様の方法でプロトロンビンの脱炭酸処理を行い、５種類のＰＩＶＫＡ−IIを調製した。ハイブリドーマ１１から調製したＰ−１１モノクローナル抗体、ハイブリドーマ１６から調製したＰ−１６モノクローナル抗体、及び従来試薬（ピコルミＰＩＶＫＡ−II（エーディア（株）製））の抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクローナル抗体の前記５種類のＰＩＶＫＡ−II及びプロトロンビン（脱炭酸処理時間０分）に対する反応性を上記と同様の方法で測定した。結果を表１及び図１に示す。表１及び図１において、（１）はＰ−１１モノクローナル抗体、（２）はＰ−１６モノクローナル抗体、（３）は従来試薬の抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクローナル抗体（ＭＵ−３）である。なお、Ｐ−１１モノクローナル抗体及びＰ−１６モノクローナル抗体の調製は後述する方法により行った。

（２）モノクローナル抗体の調製
ハイブリドーマ１１及びハイブリドーマ１６からそれぞれ下記方法によりＰ−１１モノクローナル抗体及びＰ−１６モノクローナル抗体を調製した。
あらかじめ２週間前にプリスタン０．５ｍＬを腹腔内に注射しておいた１２週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、ハイブリドーマを細胞数０．５ｘ１０^６個の量で腹腔内に投与した。約１４日後に腹水を採取し、遠心処理して上清を得た。上清を等量の吸着用緩衝液（３ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ−１．５ｍｏｌ／ＬＧｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ，ｐＨ８．５）と混和後、濾過した。このろ液を吸着用緩衝液で平衡化したプロテインＡカラム（ファルマシア社製）に通して抗体をカラムに吸着させた後、０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させてモノクローナル抗体を精製した。

（実施例２）
実施例１で得たＰ−１６モノクローナル抗体及びＰ−１１モノクローナル抗体を用い、下記方法により、ビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIの測定を行った。
（１）Ｐ−１６モノクローナル抗体固相磁気ビーズの調製
磁気ビーズ（４．５ミクロン）３０ｍｇ／ｍＬの１ｍＬを試験管にとり、磁石でトラップし、上清液を捨てたあと、磁気ビーズにＰ−１６モノクローナル抗体０．５ｍｇ／ｍＬ（１５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．８）を１ｍＬ加え、室温で一昼夜撹拌しながら反応させた。磁気ビーズを洗浄したあと、１％ＢＳＡ・リン酸緩衝液を２ｍＬ加え、室温で１昼夜撹拌しながらブロッキングし、Ｐ−１６モノクローナル抗体固相磁気ビーズを調製した。使用時、ビーズ希釈液で磁気ビーズ量１ｍｇ／ｍＬに希釈して用いた。ビーズ希釈液の組成を下記に示す。
ビーズ希釈液の組成：０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１５０ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＮａＮ_３、１０％ウサギ血清（加熱）、０．１％マウス血清（清澄化）

（２）Ｒｕ標識Ｐ−１１モノクローナル抗体の調製
Ｐ−１１モノクローナル抗体１ｍｇ／ｍＬに調製した１ｍＬに、サクシニミド基修飾ルテニウム・トリ・ジピリジルのＲｕ錯体化合物を６８μＬ加え、室温で３０分撹拌しながら反応させたのち、２ｍｏｌ／Ｌグリシンを５０μＬ加え、反応を停止し、さらに室温で１０分間撹拌しながら反応させた。最後に試料をセファデックスＧ−２５（１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液で平衡化）に流し、Ｒｕ結合の蛋白分画を集め、Ｒｕ標識Ｐ−１１モノクローナル抗体を調製した。得られたＲｕ標識Ｐ−１１モノクローナル抗体は、使用時、Ｒｕ希釈溶液で１μｇ／ｍＬに希釈して用いた。Ｒｕ希釈液の組成を下記に示す。
Ｒｕ希釈液の組成：０．０１５ｍｏｌ／Ｌヘペス緩衝液（ｐＨ７．８）、０．１５０ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、０．０１３ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ_２、０．１％界面活性剤，０．１％ＮａＮ_３、０．１％ベンザミジン、１μｇ／ｍＬ、５％ウサギ血清（加熱）、０．０１％マウスＩｇＧ

（３）ビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIの測定
前記調製したＰ−１６モノクローナル抗体固相磁気ビーズ及びＲｕ標識Ｐ−１１モノクローナル抗体を用い、電気化学発光免疫測定法により検体中のビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−II（ＮＸ−ＰＶＫＡ）の測定値Ａを求めた。
検体として、手術を行っておらず、５年後の予後が判明している肝細胞癌患者６３名の血清試料を用い、下記方法に従いＮＸ−ＰＶＫＡ量を測定した。

各検体５０μＬにＰ−１６モノクローナル抗体固相磁気ビーズを２５μＬと１μｇ／ｍＬのＲｕ標識Ｐ−１１モノクローナル抗体を含むＲｕ標識抗体液１５０μＬを加え、３０℃で９分間反応させた。反応後、磁気ビーズを磁石でトラップしながらピコルミＢＦ洗浄液（エーディア（株）製）で３回洗浄した。０．１ｍｏｌ／Ｌトリプロピルアミンを含むピコルミ発光電解液（エーディア（株）製）を３００μＬ加えて、電極表面に送り、磁気ビーズに結合したＲｕの発光量を自動分析装置ピコルミIII（エーディア（株）製）で測定し、検体中のＮＸ−ＰＶＫＡ量を求めた。

実施例２の測定値をＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類別に平均値を算出した結果を表２及び図２（ａ）に示した。測定値について判別群を死亡例、対照群を生存例としてＲＯＣ分析を行った。得られたＲＯＣ曲線を図３に示す。ＲＯＣ分析における曲線下面積は、０．７１０であった。

（比較例１）
ピコルミＰＩＶＫＡ−II測定キット（エーディア（株）製）を用いて、ＰＩＶＫＡ−IIの測定を行った。結果を表２、図２（ｂ）及び図３に示した。ＲＯＣ分析における曲線下面積は、０．６５３であった。

（比較例２）
レーザー誘起蛍光検出法（ＬＡＢ法）による、ミュータスワコーＡＦＰ−Ｌ３測定キット（和光純薬工業（株）製）を用いて，ＡＦＰの測定を行った。結果を表２、図２（ｃ）及び図３に示した。ＲＯＣ分析における曲線下面積は、０．６５１であった。

（比較例３）
比較例２と同様の方法により、ＡＦＰ−Ｌ３（ＡＦＰのレクチン反応性による分画比）の測定を行った。結果を表２、図２（ｄ）及び図３に示した。ＲＯＣ分析における曲線下面積は、０．６６５であった。

表２及び図２に示した結果から明らかなように、実施例２のＮＸ−ＰＶＫＡのみがＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ分類（肝機能を評価するための分類）を反映していた。また、図３の結果から明らかなように、実施例２のＮＸ−ＰＶＫＡが最も予後予測を反映していた。

（実施例３）
検体として肝細胞癌患者２８人、肝硬変患者２０人、慢性肝炎患者９人の血清試料を用い、ＰＩＶＫＡ−IIとＮＸ−ＰＶＫＡ量を測定した。ＰＩＶＫＡ−II測定値をＮＸ−ＰＶＫＡ測定値で割ったレシオ値（ＮＸ−ＰＶＫＡ−Ｒ）を算出した。ＮＸ−ＰＶＫＡ量の測定は実施例２と同様の方法で行った。ＰＩＶＫＡ−IIの測定は、ピコルミＰＩＶＫＡ−II測定キット（エーディア（株）製）を用いて行った。測定値を表３に示す。

ＰＩＶＫＡ−II測定値をグラフにしたものを図４に示した。ＰＩＶＫＡ−II測定値をＮＸ−ＰＶＫＡ測定値で割ったレシオ値の結果をグラフにしたものを図５に示した。表３、図４及び図５において、ＨＣＣは肝細胞癌、ＣＨは慢性肝炎、ＬＣは肝硬変、ＢはＢ型肝炎、ＣはＣ型肝炎、ＮＢＮＣは非Ｂ型非Ｃ型肝炎、ＮＡＳＨは非アルコール性肝障害、ＡＩＨは自己免疫性肝炎、ＡＬＤはアルコール性肝障害である。
表３、図４、図５に示した結果から明らかなように、従来の測定方法で得たＰＩＶＫＡ−II測定値をＮＸ−ＰＶＫＡ測定値で割ったレシオ値（図５のＮＸ−ＰＶＫＡ−Ｒ）により、従来の測定方法では偽陽性となっていた検体を区別することができ、肝がんに高い特異性を示した。

（実施例４）
実施例１で得たＰ−１６モノクローナル抗体及びＰ−１１モノクローナル抗体のエピトープを下記方法により調べた。

（１）Ｇｌａ残基含有ペプチドに対する反応性
ＰＩＶＫＡ−IIのＮ末端１６残基に存在すると考えられるＧｌａ残基（γと表示）を含む下記配列番号１〜３で表わす３種のペプチド（ＰＶ００２、ＰＶ００３、ＰＶ００（４）を合成した。
ＰＶ００２：ＡＮＴＦＬＥγＶＲＫＧＮＬγＲγ
ＰＶ００３：ＡＮＴＦＬＥＥＶＲＫＧＮＬγＲγ
ＰＶ００４：ＡＮＴＦＬＥＥＶＲＫＧＮＬＥＲγ
ＰＶ００２のアミノ酸配列
Ala Asn Thr Phe Leu Glu Gla Val Arg Lys Gly Asn Leu Gla Arg Gla（配列番号１）
ＰＶ００３のアミノ酸配列
Ala Asn Thr Phe Leu Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Gla Arg Gla（配列番号２）
ＰＶ００４のアミノ酸配列
Ala Asn Thr Phe Leu Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg Gla（配列番号３）

この３種のペプチドに対する反応性を調べるため次の方法で競合ＥＬＩＳＡを行った。
脱炭酸処理時間1時間のＰＩＶＫＡ−IIをＰＢＳで０．１μｇ／ｍLの濃度に希釈した後、ＥＬＩＳＡ用96穴プレートに５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、４℃で一夜静置した。各ｗｅｌｌを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下、「ＰＢＳＴ」という）で3回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴ（以下、「ＢＳＡ−ＰＢＳＴ」という）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で1時間静置してブロッキングを行った。ＰＢＳＴで３回洗浄後、各ｗｅｌｌにＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈した各濃度（２０、４、０．８、０．１６、０．０３２μｍｏｌ／Ｌ）のペプチド溶液を２５μL／ｗｅｌｌずつ分注し、続いてＢＳＡ−ＰＢＳＴで２００ｎｇ／ｍLの濃度に希釈した各モノクローナル抗体（Ｐ−１６、Ｐ−１１）溶液を２５μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で1時間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで３０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ社製）溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で1時間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄後、オルトフェニレンジアミン（東京化成工業社製）を含む基質溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１０分間静置した。これに１．５Ｎ硫酸を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注して反応を停止後、マイクロプレートリーダー４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図６に示す。

まず、Ｐ−１６モノクローナル抗体は3種のペプチド全てに同等の反応性を示した。このことから、Ｐ−１６モノクローナル抗体のエピトープは3種のペプチドの共通部位であるＰＩＶＫＡ−IIのＮ末端の１〜６残基（図７に示すａａ１−６）、又はＰＩＶＫＡ−IIのアミノ酸配列のＮ末端から８〜１３残基（図７に示すａａ８−１３）であることが示唆された。一方、Ｐ−１１モノクローナル抗体は何れのペプチドとも反応しないことが判明した。本願明細書において、ＰＩＶＫＡ−IIのＮ末端からＸ〜Ｙ残基のものをａａＸ−Ｙと称する。

（２）変性ＰＩＶＫＡ−II、変性プロトロンビン、及び変性トロンビンに対する反応性
変性状態のＰＩＶＫＡ−II、プロトロンビン、及びトロンビンに対する各モノクローナル抗体の反応性をウエスタンブロット法により調べた。具体的には、脱炭酸処理時間2時間のＰＩＶＫＡ−II、0分のプロトロンビン、及び市販精製トロンビン（ベネシス社製）に対する反応性を次の方法で調べた。０．１ｍｇ／ｍLＰＩＶＫＡ−II、０．１ｍｇ／ｍLプロトロンビン、及び１０Ｕ／ｍLトロンビンを、それぞれメルカプトエタノール含有のＳＤＳ処理液（コスモバイオ社製）と１対１で混和後、１０分間煮沸処理した。各サンプルをコスモバイオ社製のポリアクリルアミドゲル（マルチゲルIIミニ４／２０）に５μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、３０ｍＡで１時間電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。泳動後のゲルをセミドライブロッタ−（コスモバイオ社製）を用いＰＶＤＦ膜に転写を行った（１００ｍＡ、４５分間）。該ＰＶＤＦ膜をレーン毎に切り分けた後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴに浸し、４℃で一夜ブロッキングを行った。ＰＢＳＴで１回洗浄後、５μｇ／ｍLの濃度の各モノクローナル抗体液をＰＶＤＦ膜と接触させ、室温で1時間静置した。ＰＢＳＴで3回洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで２０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ社製）溶液入りの容器に移し、室温で1時間緩やかに振とうさせた。各PVDF膜をＰＢＳＴで3回、更にＰＢＳで1回洗浄後、ジアミノベンチジン（同仁化学研究所社製）を含む基質溶液に浸して３分間反応させた後、精製水に移し反応を停止した。得られた染色像の結果を図８に示す。

まず、従来試薬の抗体はＰＩＶＫＡ−IIのみに反応しプロトロンビンには反応しなかったのに対し、Ｐ−１１及びＰ−１６モノクローナル抗体は何れもＰＩＶＫＡ−IIとプロトロンビンに対し同等に反応した。一方、トロンビンに対しては、何れの抗体も反応しなかった。このことから、Ｐ−１１及びＰ−１６モノクローナル抗体はＰＩＶＫＡ−IIとプロトロンビンの一次アミノ酸配列の共通部位即ちＧｌａ残基を含まない部位を認識していることが示唆された。

（３）フラグメント１及びフラグメント２に対する反応性
プロトロンビンのフラグメント１及び２に対する各モノクローナル抗体の反応性をウエスタンブロット法により調べた。フラグメント１及び２（Enzyme Research Laboratories社製）をＰＢＳでそれぞれ０．０５ｍｇ／ｍLの濃度に調製し、メルカプトエタノール含有のＳＤＳ処理液（コスモバイオ社製）とそれぞれ１対１で混和後、１０分間煮沸処理した。
調製したフラグメント１及び２を用い、上記（２）のウエスタンブロット法と同様の方法で各モノクローナル抗体のフラグメント１及び２に対する反応性を調べた。得られた染色像の結果を図９に示す。

従来試薬の抗体（ＭＵ−３）はプロトロンビン由来のフラグメント１及び２のどちらにも反応しなかった。フラグメント１に対し、Ｐ−１６モノクローナル抗体は強い反応性が、Ｐ−１１モノクローナル抗体は弱いながらも反応性が認められた。一方、フラグメント２に対しては、Ｐ−１１及びＰ−１６モノクローナル抗体のどちらも反応性が認められなかった。このことから、Ｐ−１１及びＰ−１６モノクローナル抗体のエピトープは、フラグメント１即ちプロトロンビンのＮ末端から１５６残基（ａａ１−１５６）の中に存在することが示唆された。

（４）Ｇｌａ残基非含有ペプチドに対する反応性
プロトロンビンのＮ末端から７０番目まででＧｌａ残基を含まない（１０個のGla残基全てがGul残基のままのＰＩＶＫＡ−II）配列番号４〜１３で表わされる部分ペプチド１０本を合成した。
ａａ１−１６のアミノ酸配列
Ala Asn Thr Phe Leu Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg Glu （配列番号４）
ａａ７−２２のアミノ酸配列
Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu Glu Thr Cys （配列番号５）
ａａ１３−２８のアミノ酸配列
Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe （配列番号６）
ａａ１９−３４のアミノ酸配列
Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe Glu Ala Leu Glu Ser Ser （配列番号７）
ａａ２５−４０のアミノ酸配列
Glu Glu Ala Phe Glu Ala Leu Glu Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe （配列番号８）
ａａ３１−４６のアミノ酸配列
Leu Glu Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr Ala （配列番号９）
ａａ３７−５２のアミノ酸配列
Thr Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr Ala Cys Glu Thr Ala Arg Thr （配列番号１０）
ａａ４３−５８のアミノ酸配列
Lys Tyr Thr Ala Cys Glu Thr Ala Arg Thr Pro Arg Asp Lys Leu Ala （配列番号１１）
ａａ４９−６４のアミノ酸配列
Thr Ala Arg Thr Pro Arg Asp Lys Leu Ala Ala Cys Leu Glu Gly Asn （配列番号１２）
ａａ５５−７０のアミノ酸配列
Asp Lys Leu Ala Ala Cys Leu Glu Gly Asn Cys Ala Glu Gly Leu Gly （配列番号１３）

上記（１）と同様の競合ＥＬＩＳＡで各モノクローナル抗体と各ペプチドの反応性を調べた。その結果を表４に示す。まず、Ｐ−１６モノクローナル抗体はａａ１−１６のペプチドに反応性を示し、ａａ７−２２及び他のペプチドに対しては反応性を示さなかった。一方、Ｐ−１１モノクローナル抗体は何れのペプチドとも反応しないことが判明した。

以上の結果をまとめると、次の通りである。
Ｐ−１６モノクローナル抗体のエピトープは、該抗体の上記（１）と（４）に記載のペプチドに対する反応性、及び上記（２）に記載したＰＩＶＫＡ−IIとプロトロンビンに対する反応性から、プロトロンビンフラグメント１のＮ末端から５残基（配列番号１４で表わすａａ１−５）の範囲であることが判明した。
ａａ１−５のアミノ酸配列
Ala Asn Thr Phe Leu （配列番号１４）

また、Ｐ−１１モノクローナル抗体のエピトープは、上記（３）でフラグメント１（ａａ１−１５６）に反応すること、及び上記（４）でａａ１−７０に含まれる各ペプチドに反応しないことから、プロトロンビンフラグメント１のａａ６０−１５６の範囲に存在することが考えられた。

本発明のＰＩＶＫＡ−II測定方法及び測定試薬は、肝障害度の判定及び予後予測、肝がんの予後予測と、特異性の高い肝がんの検出に利用できる。

Claims

（ａ）二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によってビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−ＩＩを測定し、測定値Ａを得る工程、
（ｂ）二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によってＰＩＶＫＡ−ＩＩを測定し、測定値Ｂを得る工程、及び
（ｃ）前記測定値Ａ及び前記測定値Ｂを比較する工程、
を含むＰＩＶＫＡ−ＩＩの測定方法によって得られた値により、肝がんにおける肝障害度を判定するための血液検査方法であって、
前記（ａ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体として、人肝がん細胞培養細胞株より精製したＰＩＶＫＡ−IIと反応せず、ビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−ＩＩに特異的な抗体を使用し、
前記（ｂ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる一方の抗体として人肝がん細胞培養細胞株より精製したＰＩＶＫＡ−ＩＩと反応する抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩモノクローナル抗体を使用し、
前記（ｂ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる他方の抗体としてヒトトロンビンと反応する抗体を含まない抗ヒトプロトロンビン抗体を使用することを特徴とする、方法。
前記（ａ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
前記（ａ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体のエピトープが、プロトロンビンのＮ末端から１５６残基の中に存在することを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
前記ビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−IIに特異的な抗体が、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１２５８で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体及び受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１２５９で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
（ａ）二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によってビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−ＩＩを測定し、測定値Ａを得る工程、
（ｂ）二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によってＰＩＶＫＡ−ＩＩを測定し、測定値Ｂを得る工程、及び
（ｃ）前記測定値Ａ及び前記測定値Ｂを比較する工程、
を含むＰＩＶＫＡ−ＩＩの測定方法によって得られた値により、肝がんを判定するための血液検査方法であって、
前記（ａ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる抗体として、人肝がん細胞培養細胞株より精製したＰＩＶＫＡ−IIと反応せず、ビタミンＫ欠乏に起因するＰＩＶＫＡ−ＩＩに特異的な抗体を使用し、
前記（ｂ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる一方の抗体として人肝がん細胞培養細胞株より精製したＰＩＶＫＡ−ＩＩと反応する抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩモノクローナル抗体を使用し、
前記（ｂ）工程の二抗体サンドイッチ法で用いられる他方の抗体としてヒトトロンビンと反応する抗体を含まない抗ヒトプロトロンビン抗体を使用することを特徴とする、方法。