Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

JP5739487B2 - 薬理学的硝子体融解 - Google Patents

薬理学的硝子体融解 Download PDF

Info

Publication number
JP5739487B2
JP5739487B2 JP2013160571A JP2013160571A JP5739487B2 JP 5739487 B2 JP5739487 B2 JP 5739487B2 JP 2013160571 A JP2013160571 A JP 2013160571A JP 2013160571 A JP2013160571 A JP 2013160571A JP 5739487 B2 JP5739487 B2 JP 5739487B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
vitreous
microplasmin
eye
composition
tpcd
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2013160571A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2013241448A (ja
Inventor
パコラ,スティーブ
スメット,マーク デ
スメット,マーク デ
Original Assignee
スロムボジェニクス エヌ.ブイ.
スロムボジェニクス エヌ.ブイ.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by スロムボジェニクス エヌ.ブイ., スロムボジェニクス エヌ.ブイ. filed Critical スロムボジェニクス エヌ.ブイ.
Publication of JP2013241448A publication Critical patent/JP2013241448A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5739487B2 publication Critical patent/JP5739487B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46Hydrolases (3)
    • A61K38/48Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/484Plasmin (3.4.21.7)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00Drugs for disorders of the senses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02Ophthalmic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02Ophthalmic agents
    • A61P27/06Antiglaucoma agents or miotics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02Ophthalmic agents
    • A61P27/10Ophthalmic agents for accommodation disorders, e.g. myopia
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y302/00Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y302/00Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01035Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y304/00Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21007Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y304/00Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24007Interstitial collagenase (3.4.24.7), i.e. matrix metalloprotease 1 or MMP1
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y402/00Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/02Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C12Y402/02004Chondroitin ABC lyase (4.2.2.4), i.e. chondroitinase
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y402/00Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/02Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C12Y402/02005Chondroitin AC lyase (4.2.2.5)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y402/00Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/02Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C12Y402/02019Chondroitin B lyase (4.2.2.19)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Inorganic Insulating Materials (AREA)

Description

本発明は、一般に、哺乳動物の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法に関する。より詳細には、本発明は、哺乳動物の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法における、触媒ドメインを含む短縮プラスミンタンパク質の使用に関する。
成体ヒトの眼は、およそ矢状径が24〜25mm、横径24mm、および体積約6.5ccのわずかに非対称の球体である。ヒトの眼を、3つの異なる層(すなわち、外層、中間層、および内層)に分類することができる。眼の外層は、しばしば「白眼」と呼ばれる強膜および眼の前面を覆う角膜からなる。中間層は、前部および後部に分類され、前部は円形の色素含有虹彩、水晶体、および毛様体からなり、後部は脈絡膜からなる。内層は、眼の感覚部分である網膜からなる。網膜は、本質的に、脈絡膜の裏側に沿って走る神経組織層であり、視覚性部分および非視覚性部分に分類することができる。視覚機構に関与する視覚性部分は、有効な視覚器である桿体細胞および錐体細胞を含む。
ヒトの眼を、3つの房に分類することもできる。角膜と虹彩との間の前房および虹彩と水晶体との間の後房は房水で満たされている。対照的に、水晶体と網膜との間の硝子体腔は、硝子体(硝子体または硝子体液としても公知)と呼ばれるより粘度の高い液体で満たされている。正常な眼中の硝子体液は、眼球体積の約80%を占める透明なゲルである。角膜、瞳孔、およびレンズと通して眼に入る光を、硝子体を介して網膜に伝達する。
正常なヒトの眼の硝子体液は、約99%の水および1%の高分子であるゲルである。これらの高分子には、膠原線維網、ヒアルロン酸、可溶性糖タンパク質、糖、および他の低分子量の代謝産物が含まれる。II型コラーゲンは、硝子体の主な線維性コラーゲンであるが、硝子体はV型、IX型、およびXI型コラーゲンも含む。硝子体の前部(硝子体の後面(後部硝子体皮質としても公知))は、最も著しくは硝子体基部および視神経円板で網膜内面に直接接触しており、且つ主な網膜血管に沿っている。網膜への硝子体の正常な接着は、後部硝子体皮質と網膜の内境界膜(ILM)との間の細胞および分子の相互作用によって媒介される。ILMは、本質的に、網膜ミューラー細胞の基底膜である。ILMは、I型およびIV型コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンなどの糖タンパク質、ならびに他の複合糖質を含む。これらの成分は、硝子体とILMとの間のコラーゲン線維の空間を埋めて結合する。
加齢に伴って、硝子体液はゲルから液体に変化し、それに伴って段階的に萎縮して網膜のILMから離れる。このプロセスは、「後部硝子体剥離」(PVD)として公知であり、通常は40歳以降に発症する。しかし、硝子体の変性変化は、糖尿病、イールズ病、およびブドウ膜炎などの病理学的状態によっても誘導され得る。また、PVDは、健常者よりも近視の人および白内障手術を受けた人で早期に発症し得る。通常、硝子体は網膜から完全に分離する。しかし、時折、硝子体は一定の場所で網膜と強固に接着する。硝子体の抵抗性ある異常に強固な接着によるこれら小規模病巣は、接着部位で硝子体から網膜に強い牽引力を伝達し得る。硝子体によるこの持続的な牽引力により、しばしば網膜が蹄鉄型に裂ける。網膜裂傷が修復されない限り、この裂傷を介して硝子体液が網膜内または網膜下部に漏れだし、網膜剥離、つまり非常に重症な視力を脅かす病態を起こし得る。さらに、硝子体とILMとの間の持続的接着により、血管の破裂部から出血し、硝子体が濁り、混濁し得る。
不完全なPVDの発生は、硝子体黄斑牽引症候群、硝子体出血、黄斑円孔、黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病黄斑症、および網膜剥離を含む、多数の硝子体網膜疾患に影響を与える。したがって、硝子体手術の重要な目的は、硝子体牽引を防止する様式で硝子体を網膜から分離することである。
眼から硝子体を除去するために、通常は硝子体切除と呼ばれる超微細手術手順を行う。この手順では、小型手持ち式切断デバイスを使用して眼から硝子体を除去すると同時に眼の破壊を防止するために除去した硝子体を生理食塩水に置換する。この方法を使用した硝子体の外科的除去は高度な技術に依存し、硝子体皮質の完全な除去は困難な業務である。さらに、機械的硝子体切除には、瘢痕化、裂傷、および網膜の他の損傷などの合併症のリスクがある。明らかに、術後の患者の視力に悪影響を与え得るので、このような損傷は非常に望ましくない。
したがって、網膜から硝子体を除去するための別の方法は最近の研究の中心課題である。このような方法は、硝子体の液化および/または硝子体網膜境界の分離(PVD)の誘導/促進に使用することができる酵素および化学物質の使用が模索されている。「薬理学的硝子体切除」と呼ばれるこれらのアプローチは、PVDを誘導するために実験および/または臨床試験で硝子体内注射されるα−キモトリプシン、ヒアルロニダーゼ、細菌コラゲナーゼ、コンドロイチナーゼ、およびディスパーゼなどのいくつかのタンパク質分解酵素を含んでいた。しかし、これらの技術のほとんどは、ILMから後部硝子体を完全にまたは合併症を伴うことなく遊離しない。さらに、これらの場合のいくつかでは、副作用のリスクが高い。例えば、哺乳動物系における細菌プロテアーゼの使用により免疫応答が起こり、増殖性硝子体網膜症を発症し、その結果複雑な網膜再剥離が起こる。コラゲナーゼは硝子体を液化することが報告されているが、網膜の外層を破壊することも示されている。α−キモトリプシンは、注射した眼において傍乳頭網膜出血および硝子体出血を起こすことが報告されている。最後に、ディスパーゼは、注射15分後に網膜の内層に有毒であることが報告されている。ディスパーゼの使用濃度に依存して、注射した眼において増殖性網膜症または黄斑前膜(epiretinal cellular membrane)を発症し得る。
免疫原性および細菌プロテアーゼの他の副作用を考慮すると、内因性ヒト由来プロテアーゼを使用した薬理学的硝子体融解が望ましい。プラスミンは、プラスミノゲン由来のセリンプロテアーゼである。プラスミノゲンは、哺乳動物血液の重要な成分である。ヒトプラスミノゲンは、791アミノ酸からなる分子量が約92,000ダルトンの一本鎖糖タンパク質である(非特許文献1を参照のこと)。アミノ末端にグルタミン酸を有する天然のプラスミノゲン(「Glu−プラスミノゲン」)は、プラスミンによるArg68−Met69、Lys77−Lys78、またはLys78−Val79ペプチド結合の限定分解限定的消化によって一般に「Lys−プラスミノゲン」と呼ばれるタンパク質に変換される。ウロキナーゼまたはストレプトキナーゼなどのプラスミノゲンアクチベーターによるプラスミノゲンの活性化により、Arg561とVal562との間のペプチド結合が切断されてプラスミノゲン分子がプラスミンと呼ばれる二本鎖の酵素活性形態に変換される。プラスミンは、2つのポリペプチド、2つのジスルフィド結合によって軽B鎖に結合した重A鎖を含み、B鎖はセリンプロテアーゼ触媒ドメインを含む。プラスミンのセリンプロテアーゼ触媒活性は、in vivoでのその血餅溶解能力に関与する。
最近、プラスミンは、硝子体切除の補助物質としても示唆されている。さらに、自己プラスミン酵素(APE)は、薬理学的硝子体切除の薬剤として示唆されている。しかし、プラスミン使用に関連する欠点がいくつか存在する。第1に、今までのところプラスミンを使用した全ての臨床介入はAPEの使用に依存しており、その単離は、患者からの採血、プラスミノゲンの単離、単離プラスミノゲンのプラスミンへの活性化、ならびにプラスミン酵素の精製および安定性試験を含む骨の折れる時間のかかるプロセスを必要とする。さらに、この手順はコストがかかり、且つ血液感染病原体の存在がこの手順をさらに複雑にし得る。また、プラスミンは非常に分解しやすいので、使用前に長期間保存することができない。さらなる欠点は、65,000ダルトンと83,000ダルトンとの間の範囲であるプラスミンの分子量の大きさである。従って、より小さな分子と比較して硝子体中の注射位置から硝子体網膜境界へのプラスミンのような高分子の拡散が妨げられる。
Forsgren M.et al.,FEBS Lett.213(2):254−60,1987
したがって、薬理学的硝子体融解のためのプラスミンの欠点を克服した被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法が当該分野で必要である。詳細には、プラスミンよりも硝子体から硝子体網膜境界に速く拡散することができ、遅延や個々の患者における自己プラスミノゲン酵素の単離に関する他の付随する問題もなく容易且つ大量に得ることができる、プラスミンよりも小さな分子を使用した眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法が必要である。
本発明は、プラスミンの触媒ドメインを含む短縮プラスミンタンパク質(TPCD)を含む組成物を使用した被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。1つの実施形態では、TPCDは、ミニプラスミン、組換えミニプラスミン、安定化ミニプラスミン、安定化組換えミニプラスミン、ミニプラスミンの変異型、マイクロプラスミン、組換えマイクロプラスミン、安定化マイクロプラスミン、安定化組換えマイクロプラスミン、マイクロプラスミンの変異型、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される。
本発明はまた、修飾TPCDを含む組成物を使用した被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。修飾TPCDは、プラスミンの修飾触媒ドメインを含むTPCDである。
本発明は、被験体の硝子体液および/または房水のTPCDを含む組成物との接触による被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。本発明は、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出(macular exudate)、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血、弱視、眼内炎、未熟児網膜症、緑内障、網膜色素変性症、およびその任意の組み合わせなどであるが、これらに限定されない眼の障害を治療または防止する方法を提供する。本発明の方法を、硝子体切除とは独立して、または硝子体切除の補助として実施することができる。
本発明はまた、少なくとも2つのTPCDを含む組成物を被験体に投与する工程を含む、被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。本発明のこの態様の1つの実施形態では、硝子体液および/または房水と少なくとも2つのTPCDを含む組成物との接触によって組成物を投与する。
本発明は、さらに、少なくとも1つのTPCDを含む第1の組成物および少なくとも1つのTPCDを含む第2の組成物を被験体に投与する工程を含む、眼の障害または眼の障害の合併症を治療または予防する方法を含む。本発明のこの態様の1つの実施形態では、硝子体液および/または房水との接触によって少なくとも1つのTPCDを含む第1の組成物および少なくとも1つのTPCDを含む第2の組成物を被験体に投与する。本発明のこの態様の別の実施形態では、少なくとも1つのTPCDを含む第1の組成物および少なくとも1つのTPCDを含む第2の組成物のTPCDは同一のTPCDである。本発明のこの態様のさらに別の実施形態では、少なくとも1つのTPCDを含む第1の組成物および少なくとも1つのTPCDを含む第2の組成物のTPCDは異なるTPCDである。本発明のこの態様のさらなる実施形態では、少なくとも1つのTPCDを含む第1の組成物および少なくとも1つのTPCDを含む第2の組成物のTPCDを、実質的に同時に被験体に投与する。さらに別の実施形態では、少なくとも1つのTPCDを含む第1の組成物および少なくとも1つのTPCDを含む第2の組成物のTPCDを、異なる時間で被験体に投与する。
本発明は、さらに、少なくとも1つのTPCDおよび少なくとも1つの第2の薬剤を含む組成物の投与による被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。第2の薬剤には、単独またはTPCDとの組み合わせによって眼の障害または障害の合併症の治療または予防に有用な任意の物質が含まれる。第2の薬剤には、ヒアルロニダーゼ、ディスパーゼ、コンドロイチナーゼ、コラゲナーゼ、RGD含有ペプチド、抗インテグリン抗体、尿素、ヒドロキシ尿素、チオ尿素、P2Y受容体アゴニスト、および任意の血管形成インヒビター(VEGFインヒビターおよびPIGFインヒビターが含まれるが、これらに限定されない)が含まれるが、これらに限定されない。
本発明はまた、第2の薬剤を含む組成物の投与前または投与後の少なくとも1つのTPCDを含む組成物の被験体への投与による被験体の眼の障害または眼の障害の合併症を治療または予防する方法を含む。
本発明の方法を使用して、硝子体の粘度の減少、硝子体の液化、後部硝子体剥離の誘導、硝子体液および/または房水由来の出血の除去または減少、硝子体液および/または房水由来の眼球内異物の除去または減少、網膜に有毒な物質の除去または減少、硝子体液および/または房水に投与した薬剤または組成物の拡散の増加、網膜外新血管形成の減少、ならびにその任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない1つまたは複数の転帰による、被験体の眼の障害または眼の障害の合併症を治療または予防することができる。
本発明はまた、被験体の硝子体をTPCDを含む組成物と接触させる工程を含む硝子体切除方法を提供する。硝子体切除の前もしくは同時または硝子体切除から独立して接触工程を行うことができる。
本発明はまた、少なくとも2つのTPCDを含む組成物を提供する。
本発明は、さらに、少なくとも1つのTPCDおよび少なくとも1つの第2の薬剤を含む組成物を提供する。
ヒトプラスミノゲンのDNA配列(配列番号9)およびアミノ酸配列(配列番号10)を示す図である。 ヒトマイクロプラスミノゲンのDNA配列(配列番号3)およびアミノ酸配列(配列番号4)を示す図である。 ヒトミニプラスミノゲンのDNA配列(配列番号7)およびアミノ酸配列(配列番号8)を示す図である。 マイクロプラスミンでのブタの眼の治療効果を示す図である。パネルAは、0.125mgのマイクロプラスミンを含む0.1mlのBSS PLUS(登録商標)で120分間処置したブタの眼の緩慢な脱水後の網膜の中心周辺(mid−periphereal)の低倍率の画像(11倍)である。この画像の中央は、硝子体ストランドである。この硝子体ストランドは、網膜表面で崩壊している硝子体である可能性が高い。残りのパネルに示されるように、ほとんどの網膜表面は硝子体が存在しない。パネルBは、血管に隣接する露出網膜を示す(倍率800倍)。網膜表面上に細胞はほとんど認められない。不規則な表面は、血管自体の表面である。パネルCおよびDは、それぞれ多くの硝子体または細胞物質を欠くなめらかな網膜表面を示す1200倍および3600倍のBの網膜領域の拡大図である。3600倍では、線維性のストランドがいくつか認められる。パネルEは、本質的にパネルCと同一の所見であるがより中央の網膜位置を示す1500倍の画像であり、パネルFは、その線維性構造を喪失した硝子体の粗い粒子構造を示す。マイクロプラスミン処理眼中の硝子体構造は、コントロール眼中の硝子体と比較して外観が非常に異なる(データ示さず)。 ブタの眼の毛様体突起は、マイクロプラスミンでの120分間の処置後にインタクトであることを示す図である(パネルAおよびB)。 ヒトの死後の眼における硝子体網膜境界の走査型電子顕微鏡写真(倍率3600倍)を示す図である。62.5μgのマイクロプラスミンの硝子体内注射により、ILMを覆うコラーゲン原線維の断片が不連続に遊離する後部硝子体剥離(PVD)が起こる(パネルA)。125μg(パネルB)および188μg(パネルC)のマイクロプラスミンにより完全なPVDが起こり、ILMが露呈する。パネルDは、62.5μgのマイクロプラスミンおよびガスで処置した眼におけるILMに対するコラーゲン原線維の圧縮を示す。パネルEは、125μgのマイクロプラスミンおよびガスでの処置後の完全なPVDを示す。マイクロプラスミン処置眼で認められたPVDと異なり、コントロール眼ではコラーゲン原線維の密集した網状構造が存在する(パネルF)。 ヒト死後の眼におけるILMの透過型電子顕微鏡写真を示す図である。マイクロプラスミン処置眼においてILM状にコラーゲン原線維が存在しないことに留意のこと(矢印)(パネルA、倍率13,600倍)。対照的に、コントロール眼においてはILM上にコラーゲン原線維が依然として存在する(矢印)(パネルB;倍率6800倍)。 ネコの眼における硝子体網膜境界の走査型電子顕微鏡写真(倍率3600倍)を示す図である。25μgのマイクロプラスミンの硝子体内注射により、処置1日後にILM上にコラーゲン原線維の断片が遊離した(パネルA)。処置から3日後、25μgのマイクロプラスミンにより、完全なPVDが起こった(パネルB)。14.5μgのマイクロプラスミンでの処置から3日後にコラーゲン原線維の断片が認められた(パネルC)。14.5μgのマイクロプラスミン注射(パネルD)および25μgのマイクロプラスミン注射(パネルE)から3週間後に、露呈したILMが認められた。著しく対照的に、コントロール眼は密集して結合した硝子体皮質を示した(パネルF)。 ネコの眼のやや薄い切片の光学顕微鏡研究の結果を示す図である。これらの研究は、コントロール眼で認められた正常な網膜の細胞構築(パネルB)がマイクロプラスミン処置眼(パネルA)でも認められることを示した。透過型電子顕微鏡法により、コントロール眼(パネルDおよびF)で認められるようなマイクロプラスミン処置眼(パネルCおよびE)において十分に保存された内部網膜およびILMが明らかとなった。パネルAおよびBで使用した倍率は250倍であり、パネルCおよびDの倍率は6000倍であり、パネルEおよびFの倍率は30,000倍であった。 グリア線維酸性タンパク質(パネルAおよびB、緑)およびビメンチン(パネルCおよびD、赤)に対するプローブを使用した共焦点レーザー走査顕微鏡の結果を示す図である。マイクロプラスミン処置眼(パネルAおよびC)とコントロール眼(パネルBおよびD)との間のGFAPおよびビメンチンの染色における相違は存在しない。シナプトフィジン(緑)および神経フィラメント(赤)に対するプローブを使用した二重標識免疫組織化学は、マイクロプラスミン処置眼(パネルE)とコントロール眼(パネルF)との間に相違は認められない。パネルA、B、およびCの倍率は400倍であり、パネルDの倍率は250倍であり、パネルEおよびFの倍率は160倍であった。 20nmポリスチレンナノスフェア溶液と比較した全ブタ硝子体の時間相関関数(TCF)を示す図である。硝子体では、曲線に対して2つの成分が存在する。初期(速い)成分は、自由に拡散し、相当な分子運動(ブラウン運動)を示すヒアルロナン(HA)の存在に起因する。後期(遅い)成分は、より大きいので拡散の自由度が低く(より不自然)、ブラウン運動がより遅いコラーゲンに起因する。対照的に、ポリスチレンナノスフェア溶液は、溶液中で非常に速く運動するナノスフェアのサイズの小ささおよびその完全な球形構造に起因する非常に速いたった1つの成分(単分散)を有する。 異なる用量のマイクロプラスミン(μPli)薬理学的硝子体融解および20nmポリスチレンナノスフェアを受けた5つのブタの眼についての正規化時間相関関数を示す図である。空気/硝子体境界から4mm下の光軸でDLS測定を行った。非処置(賦形剤)硝子体では、曲線に対して2つの成分が存在する。初期(速い)成分は、自由に拡散し、相当な分子運動(ブラウン運動)を示すヒアルロナン(HA)の存在に起因する。後期(遅い)成分は、より大きいので拡散の自由度が低く(より不自然)、ブラウン運動がより遅いコラーゲンに起因する。他の極端な場合に、ポリスチレンナノスフェア溶液は、溶液中で非常に速く運動するナノスフェアのサイズの小ささおよびその完全な球形構造に起因する非常に速いたった1つの成分(単分散)を有する。漸増用量のμPliでは、低速成分(より大きな分子種)の消滅によりTCFの勾配が減少し、最終的には20nmナノスフェアのみ(全てがより小さなサイズの分子種)のTCFに近づく。 マイクロプラスミンおよびフルオレセインの注射後のブタの眼の代表的な写真を示す図である。両画像は同一の眼であり、右の画像は左の画像の20分後に撮影し、硝子体中のフルオレセイン分散を示す。 プラスミンおよびフルオレセインの注射後のブタの眼の代表的な写真を示す図である。両画像は同一の眼であり、下の画像は上の画像の20分後に撮影し、硝子体中のフルオレセイン分散がマイクロプラスミン処置眼よりも低い程度であることを示す(図13)。
本明細書中に引用された特許出願、特許、および引用文献は、この分野の当業者の知識を示し、その全体が本明細書中で参考として援用される。本明細書中で引用した任意の引用文献と本開示の特定の教示との間に矛盾が生じた場合、本開示を優先する。
以下の詳細な説明およびそれに伴う実施例を、本発明の一定の好ましい実施形態を記載および説明することのみを目的として提供し、決して本発明の範囲を制限することを意図しない。他で定義しない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者によって一般に理解されている意味を有する。
本発明を詳細に説明する前に、以下で使用する一定の用語の定義を記載することはその理解の一助となろう。
定義
「処置」は、任意の内科的疾患の任意の程度への軽減または改善を意味し、障害の完全な治癒が含まれるが、その必要はない。
「防止」は、障害の発症を防御または保護すること、すなわち、予防薬として機能することを意味する。
「障害」は、任意の疾患、機能障害、症候群、病態、痛み、またはその任意の組み合わせを意味する。障害には、任意の障害、機能障害、症候群、病態、痛み、またはその任意の組み合わせ由来の任意の合併症も含まれる。
「被験体」は、任意の哺乳動物、特にヒトを意味する。
「接触」は、組成物と接触対象(例えば、硝子体、房水など)との間で相互作用する任意の投与様式を意味する。組成物の接触対象との相互作用は、実質的に組成物の投与と同時、組成物のおよそ投与時から始まって長期間、または組成物の投与時から遅れて起こり得る。
「組成物」は、1つまたは複数の物質の組み合わせまたは混合物を意味する。
「物質」は、質量を有し、且つ空間を占めるものを意味する。
「異物」は、医師、臨床医学者、獣医師、または研究者によって被験体の眼に有害または有毒と決定される任意の物質および/または健常な哺乳動物の眼に通常見出されない物質を意味する。
「眼科的に許容可能なキャリア」は、(医師、臨床医学者、獣医師、または研究者が決定したところ)被験体の眼におけるその意図する使用に第2の物質が不適切とならないように第2の物質(例えば、TPCD)を組み合わせることができる物質である。眼科的に許容可能なキャリアの非限定的な例には、平衡塩類溶液(BSS)およびBSS−PLUS(登録商標)が含まれる。
「薬学的に許容可能なキャリア」には、水、緩衝化食塩水、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール)、またはその適切な混合物が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容可能なキャリアならびにこのようなキャリアおよびその処方物の作製方法の他の例は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences(20th Edition,A.Gennaro(ed.),Lippincott,Williams & Wilkins,2000)に見出される。
「有効量」は、研究者、獣医、医師、または他の臨床医学者によって模索されたヒトまたは他の哺乳動物の眼の応答を誘発する物質または組成物の量を意味する。
「誘導する」は、所望の結果をもたらすか刺激することを意味する。
「軽減する」は、任意の範囲に減少することを意味する。
「眼に対する毒作用」は、研究者、獣医、医師、または他の臨床医学者によって被験体に有害と決定された被験体の眼の任意の副作用を意味する。
「硝子体(vitreous)」は、眼の水晶体と網膜との間の房を占める硝子体(vitreous body)とも呼ばれる硝子体液を意味する。
「TPCD」は、「プラスミンの触媒ドメインを含む短縮プラスミンタンパク質」の頭文字である。「短縮プラスミンタンパク質」は、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、Val79−プラスミン(すなわち、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸79〜791)の1つまたは複数のアミノ酸の欠失によって得られる任意のプラスミンタンパク質を意味する。このようなアミノ酸の欠失は、N末端(例えば、配列番号10のアミノ酸444〜791、543〜791、または562〜791からなるTPCDが得られる)および/またはC末端および/または配列番号10のアミノ酸79〜791の任意の内部の一部または位置に存在し得る。配列番号10由来の短縮タンパク質が酵素的に不活性な形態として作製された場合、プラスミノゲンアクチベーターを使用して短縮タンパク質の対応する活性形態に活性化しなければならないと理解すべきである。例えば、配列番号10のアミノ酸543〜791からなるタンパク質を組換えによって作製する場合、タンパク質はその酵素活性形態ではない可能性が非常に高い。したがって、Arg561とVal562との間のペプチド結合を切断してタンパク質を活性化するために、タンパク質をプラスミノゲンアクチベーターで処理すべきである。TPCDの非限定的な例には、ミニプラスミン、組換えミニプラスミン、安定化ミニプラスミン、安定化組換えミニプラスミン、ミニプラスミンの変異型、マイクロプラスミン、組換えマイクロプラスミン、安定化マイクロプラスミン、安定化組換えマイクロプラスミン、およびマイクロプラスミンの変異型(マイクロプラスミンおよびミニプラスミンの変異型はプラスミンの触媒ドメインを含む)が含まれる。
「プラスミンタンパク質」は、ヒトプラスミノゲンのArg561とVal562との間のペプチド結合が切断されたヒトプラスミノゲンのアミノ酸配列(配列番号10)から作製されたかこれに由来する任意のタンパク質を意味する。プラスミノゲンアクチベーターを使用してArg561とVal562との間のペプチド結合を切断することができる。プラスミノゲンタンパク質の非限定的な例には、Lys−プラスミン、ミニプラスミン、およびマイクロプラスミンが含まれる。
「プラスミンの触媒ドメイン」は、プラスミンの触媒三つ組み(すなわち、His603、Asp646、およびSer741)を含み、且つアミノ酸配列がセリンプロテアーゼ活性を有する、配列番号10(ヒトプラスミノゲン)のアミノ酸543〜791に由来する約130〜240アミノ酸のアミノ酸配列を意味する。
「プラスミンの修飾触媒ドメイン」は、1つまたは複数のアミノ酸の付加および/または欠失および/または置換による触媒ドメインのアミノ酸配列の変化によって変化したプラスミンの触媒ドメインを意味する。勿論、プラスミンの触媒三つ組み(すなわち、His603、Asp646、およびSer741)に対応するアミノ酸を変化させないと理解すべきである。修飾により、タンパク質のプラスミン様触媒活性を増加、減少、または変化しないままにできる。例えば、マイクロプラスミンおよびミニプラスミンの修飾触媒ドメインは、これらのタンパク質の触媒活性を増加、減少、または変化しないままにできる。
「修飾TPCD」は、TPCDがプラスミン様セリンプロテアーゼ触媒活性を有する、プラスミンの修飾触媒ドメインを含むTPCDである。
「第2の薬剤」は、被験体の眼の障害または眼の障害の合併症の治療または防止における単独またはTPCDと組み合わせて使用することができる任意の物質を意味する。好ましくは、第2の薬剤は、TPCDの触媒活性を妨げない。
「タンパク質の安定化」は、1つまたは複数の安定剤の使用によるタンパク質の分解および/または不活化からの保護を意味する。
本明細書中に記載のものに類似または等価な任意の方法および物質を本発明の実務または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。
薬理学的硝子体融解は、被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防するための1つまたは複数のタンパク質薬および/または化学薬品および/または核酸薬の使用方法である。本発明は、少なくとも1つの触媒ドメインを含む短縮プラスミンタンパク質(TPCD)を使用した薬理学的硝子体融解方法を提供する。詳細には、本発明は、硝子体液および/または房水と有効量のTPCDを含む組成物との接触による眼の障害または眼の障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。これらの方法により、硝子体の液化、後部硝子体剥離、硝子体液および/または房水由来の出血の除去または減少、硝子体液および/または房水由来の眼球内異物の除去または減少、硝子体液および/または房水に投与した薬剤または組成物の拡散の増加、網膜外新血管形成の減少、ならびにその任意の組み合わせであるが、これらに限定されない転帰となる。硝子体切除の補助として、または硝子体切除を用いずに、これらの方法を使用することができる。
したがって、本発明は、第1の態様として、硝子体液および/または房水を有効量のTPCDを含む組成物と接触させる工程を含む、被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。1つの実施形態では、TPCDの分子量は、約40,000ダルトン未満である。別の実施形態では、TPCDの分子量は、還元形態で約26,500ダルトンであるか非還元形態で29,000ダルトンである。さらに別の実施形態では、TPCDの分子量は、約20,000ダルトンと30,000ダルトンとの間である。さらなる実施形態では、TPCDの分子量は、約20,000ダルトン未満である。
第2の態様では、本発明は、硝子体液および/または房水を有効量の少なくとも2つのTPCDを含む組成物と接触させる工程を含む、被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。
第3の態様では、本発明は、硝子体液および/または房水を有効量の少なくとも1つのTPCDを含む第1の組成物および有効量の少なくとも1つのTPCDを含む第2の組成物と接触させる工程を含む、被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。本発明のこの態様の1つの実施形態では、少なくとも1つのTPCDを含む第1の組成物および少なくとも1つのTPCDを含む第2の組成物は、同一のTPCDを含み得る。本発明のこの態様の別の実施形態では、少なくとも1つのTPCDを含む第1の組成物および少なくとも1つのTPCDを含む第2の組成物は、異なるTPCDを含み得る。本発明のこの態様のさらなる実施形態では、第1および第2の組成物を、実質的に同時または異なる時間で被験体に投与することができる。
第4の態様では、本発明は、硝子体液および/または房水を有効量の少なくとも1つのTPCDおよび少なくとも1つの第2の薬剤を含む組成物と接触させる工程を含む、被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。本発明のこの態様では、第2の薬剤は、TPCDであることを意図しない。
第5の態様では、本発明は、硝子体液および/または房水を有効量の少なくとも1つの第2の薬剤を含む組成物と接触させる前、同時、または後に硝子体液および/または房水を有効量の少なくとも1つのTPCDを含む組成物と接触させる工程を含む、被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法を提供する。
第6の態様では、本発明は、硝子体液および/または房水を有効量の少なくとも1つのTPCDを含む組成物と接触させる工程を含む、硝子体を液化する方法を提供する。本発明のこの態様の1つの実施形態では、硝子体の液化により、硝子体液の粘度が減少する。本発明の他の実施形態では、硝子体の液化により、硝子体腔および/または房水からの血液、沈殿物、異物、および/または眼、特に網膜に有毒な物質のクリアランス速度が増加する。本発明のこの態様の別の実施形態では、硝子体の液化により、網膜外新血管形成が減少する。本発明のこの態様のさらに別の実施形態では、硝子体の液化により、硝子体液および/または房水に投与した薬剤または組成物の拡散が増加する。本発明のこの態様のさらなる実施形態では、硝子体の液化は、標準的な硝子体切除または25ゲージ(またはより小さな)硝子体切除中の硝子体の除去の一助となる。
第7の態様では、本発明は、硝子体液および/または房水を有効量の少なくとも1つのTPCDを含む組成物と接触させる工程を含む、後部硝子体剥離を誘導する方法を提供する。
上記の本発明の任意の第1から第7の態様では、硝子体切除の補助としてまたは硝子体切除を用いずに硝子体液および/または房水をTPCDを含む組成物と接触させる工程を行うことができる。
第8の態様では、本発明は、硝子体液および/または房水を少なくとも1つのTPCDを含む組成物と接触させる工程を含む、硝子体切除方法を提供する。硝子体切除と同時またはその前に接触工程を行うことができる。
第9の態様では、本発明は、少なくとも2つのTPCDを含む組成物を提供する。
第10の態様では、本発明は、少なくとも1つのTPCDおよび少なくとも1つの第2の薬剤を含む組成物を提供する。
本発明の全ての態様の1つの実施形態では、TPCDは、ミニプラスミン、組換えミニプラスミン、安定化ミニプラスミン、安定化組換えミニプラスミン、ミニプラスミンの変異型、マイクロプラスミン、組換えマイクロプラスミン、安定化マイクロプラスミン、安定化組換えマイクロプラスミン、マイクロプラスミンの変異型、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される。本発明の全ての態様の別の実施形態では、眼の障害または障害の合併症を治療または予防する方法および硝子体切除方法により、1つまたは複数の以下の結果によって眼の障害が改善される:硝子体の粘度の減少、硝子体の液化、後部硝子体剥離の誘導、硝子体、硝子体腔、および/または房水由来の出血の除去または減少、硝子体、硝子体腔、および/または房水由来の眼球内異物の除去または減少、硝子体、硝子体腔、および/または房水由来の網膜に有毒な物質の除去または減少、硝子体液および/または房水に投与した薬剤または組成物の拡散の増加、または網膜外新血管形成の減少。本発明の全ての態様のさらに別の実施形態では、治療または防止が模索される眼の障害または眼の障害の合併症は、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血、弱視、眼内炎、未熟児網膜症、緑内障、網膜色素変性症、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される。
TPCDには、プラスミンの触媒ドメインを含む任意の短縮プラスミンタンパク質が含まれる。短縮プラスミンタンパク質は、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、Val79−プラスミン(すなわち、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸79〜791)の1つまたは複数のアミノ酸の欠失によって得られる任意のプラスミンタンパク質を含む。したがって、全てのTPCDは、プラスミンセリンプロテアーゼドメインの触媒三つ組み、すなわち、His603、Asp646、およびSer741を含まなければならない。配列番号10(ヒトプラスミノゲン)のアミノ酸79〜791中の1つまたは複数のアミノ酸の欠失によって、Val79−プラスミンを短縮することができる。このような欠失は、N末端、C末端、または配列番号10のアミノ酸79〜791の内部の位置に存在し得る。配列番号10(ヒトプラスミノゲン)のアミノ酸79〜791の短縮に起因するタンパク質が酵素的に不活性な形態で作製された場合、プラスミノゲンアクチベーターを使用してタンパク質をTPCDと見なされる活性形態に変換しなければならないと理解すべきである。プラスミノゲンアクチベーターは、Arg561とVal562との間のペプチド結合を切断して、タンパク質を活性化する。1つの実施形態では、TPCDには、本質的に配列番号10のアミノ酸444〜791からなるタンパク質が含まれる。別の実施形態では、TPCDには、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸444〜791中の1つまたは複数のアミノ酸が欠失したタンパク質が含まれる。別の実施形態では、TPCDには、本質的に配列番号10のアミノ酸543〜791からなるタンパク質が含まれる。さらに別の実施形態では、TPCDには、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸543〜791中の1つまたは複数のアミノ酸が欠失したタンパク質が含まれる。別の実施形態では、TPCDには、本質的に配列番号10のアミノ酸562〜791からなるタンパク質が含まれる。別の実施形態では、TPCDには、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸562〜791中の1つまたは複数のアミノ酸が欠失したタンパク質が含まれる。欠失は、N末端、C末端、または配列番号10(ヒトプラスミノゲン)のアミノ酸444〜791、543〜791、および562〜791の内部の位置に存在し得る。タンパク質中のアミノ酸の欠失方法は当業者に周知である(例えば、Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al.(eds.),John Wiley & Sons,2001;およびMolecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,Sambrook and Russell,2000)。呈色基質S2403(Chromogenix,Antwerp,Belgium)(実施例2を参照のこと)または任意の他の呈色基質を使用したTPCDのアミド分解活性の測定または当該分野で公知の任意の他の方法によってTPCDの触媒活性を決定することができる。
本発明はまた、修飾TPCDの使用を想定する。修飾TPCDは、修飾TPCDがプラスミン様セリンプロテアーゼ触媒活性を有する、プラスミンの触媒ドメインの修飾形態を有するTPCDである。触媒ドメインの修飾には、プラスミンの触媒ドメインにおけるアミノ酸の挿入および/または欠失および/または置換が含まれる。しかし、プラスミンセリンプロテアーゼドメインの触媒三つ組み、すなわち、ヒスチジン603、アスパラギン酸646、およびセリン741、に対応するアミノ酸は変化しない。好ましくは、触媒ドメインの修飾は、触媒三つ組みの一部ではないアミノ酸の1つまたは複数の保存的置換を含む。保存的アミノ酸置換およびこのような保存的アミノ酸置換の作製方法は、当業者に周知である(例えば、Current Protocols in Molecular Biology,supra;およびMolecular Cloning:A Laboratory Manual,supraを参照のこと)。これらの修飾により、元のドメインの触媒活性を増加、減少、または変化しないままにできる。呈色基質S2403(Chromogenix,Antwerp,Belgium)(実施例2を参照のこと)または当該分野で公知の任意の他の方法を使用したTPCDのアミド分解活性の測定によって、修飾TPCDの触媒活性を決定することができる。
TPCDには、ミニプラスミン、組換えミニプラスミン、安定化ミニプラスミン、安定化組換えミニプラスミン、ミニプラスミンの変異型、マイクロプラスミン、組換えマイクロプラスミン、安定化マイクロプラスミン、安定化組換えマイクロプラスミン、およびマイクロプラスミンの変異型が含まれるが、これらに限定されない。マイクロプラスミンおよびミニプラスミンの変異型には、これらのタンパク質のアミノ酸欠失によって産生することができるマイクロプラスミンおよびミニプラスミンのより短い形態が含まれる。マイクロプラスミンおよびミニプラスミンの全ての変異型は、これらがそれぞれマイクロプラスミンおよびミニプラスミンと同一の触媒活性レベルを有さない場合でさえセリンプロテアーゼ触媒活性を有すると予想される。したがって、マイクロプラスミンおよびミニプラスミンの全変異型は、ヒトプラスミノゲンのプラスミンセリンプロテアーゼドメインの触媒三つ組み、すなわち、His603、Asp646、およびSer741を含む配列番号10のアミノ酸603〜741を含むことが必要である。1つの実施形態では、ミニプラスミンの変異型には、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸444〜791中の1つまたは複数のアミノ酸が欠失したタンパク質が含まれる。別の実施形態では、マイクロプラスミンの変異型には、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸543〜791中の1つまたは複数のアミノ酸が欠失したタンパク質が含まれる。さらに別の実施形態では、マイクロプラスミンの変異型には、得られたタンパク質がセリンプロテアーゼ触媒活性を有する、ヒトプラスミノゲンのアミノ酸562〜791中の1つまたは複数のアミノ酸が欠失したタンパク質が含まれる。欠失は、N末端、C末端、または配列番号10のアミノ酸444〜791、543〜791、および562〜791の内部の位置に存在し得るが、マイクロプラスミンおよびミニプラスミンの全変異型は、配列番号10のアミノ酸603〜741を含む必要がある。マイクロプラスミンおよびミニプラスミンの変異型には、これらのタンパク質のアミノ酸の挿入および/または置換が含まれるが、これらに限定されない。マイクロプラスミンまたはミニプラスミンのアミノ酸置換は好ましくは保存的置換であると想定される。マイクロプラスミンおよびミニプラスミンまたは任意の他のTPCDの変異型を、組換え法によって調製し、プラスミノゲンアクチベーターを使用して活性プラスミン形態に活性化することができる。あるいは、マイクロプラスミンおよびミニプラスミンまたは任意の他のTPCDの変異型を、当該分野で周知の任意の他の手段(ヒトプラスミノゲンのエラスターゼでの消化またはプラスミン、マイクロプラスミン、もしくはミニプラスミンの部分的還元およびアルキル化などであるが、これらに限定されない)によって調製することができる。マイクロプラスミン、ミニプラスミン、またはさらに言えば任意のTPCDのこれらの変異型を、呈色基質S2403または任意の他の呈色基質を使用してセリンプロテアーゼ触媒活性についてアッセイすることができる。さらに、マイクロプラスミン、ミニプラスミン、または任意の他のTPCDの変異型を、ブタ、ネコ、または死後ヒトの眼への異なる用量の変異型を含む任意の平衡塩類溶液の注射によってPVDを誘導する能力および/または硝子体液化能力について試験することができる。TPCDにより任意のこれらの眼のPVD誘導および/または硝子体液化が可能である場合、このTPCDを哺乳動物の眼の障害の治療に有用であると見なす。好ましくは、TPCDは、注射した眼に有毒ではない。マイクロプラスミン変異型の非限定的な例を、表1に示す。
表1:マイクロプラスミン変異型の非限定的な例
以下に列挙したマイクロプラスミンの変異型は、アミノ酸1〜791からなるヒトプラスミノゲンのアミノ酸配列および番号に対応する(図1、配列番号10を参照のこと)。
Figure 0005739487
Figure 0005739487
Figure 0005739487
Figure 0005739487
Figure 0005739487
Figure 0005739487
Figure 0005739487
Figure 0005739487
Figure 0005739487
ミニプラスミンおよびマイクロプラスミンは、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、組織型プラスミノゲンアクチベーター、またはウロキナーゼなどであるが、これらに限定されないプラスミノゲンアクチベーターによるミニプラスミノゲンおよびマイクロプラスミノゲンの活性化によって産生される。ミニプラスミノゲンおよびマイクロプラスミノゲンは、哺乳動物の重要な血液成分である一本鎖糖タンパク質であるプラスミノゲンに由来する。ヒトプラスミノゲンは、N末端前活性化ドメイン、それぞれ約80アミノ酸の5つの相同クリングルドメイン、セリンプロテアーゼ触媒ドメイン、およびドメイン間連結配列から構成される791残基(配列番号10)の多ドメインタンパク質である。プラスミンまたはプラスミノゲンアクチベーターは、ヒトプラスミノゲンのN末端のArg68−Met69間、Lys77−Lys78間、またはLys78−Val79間のペプチド結合を切断して、Lys−プラスミノゲン(例えば、アミノ酸69〜791または78〜791または79〜791からなるタンパク質)と呼ばれるより短いプロ酵素が得られる。酵素エラスターゼによるさらなる切断により、最初の4つのクリングルドメインが除去されてプロ酵素であるミニプラスミノゲン(典型的には、アミノ酸442〜791)が産生される。第5のクリングルのさらなる切断により、プロ酵素マイクロプラスミノゲン(典型的には、アミノ酸543〜791)が得られる。プラスミノゲンのクリングルは、プラスミノゲンのフィブリンなどの基質への特異的結合を媒介するリジン結合部位を含む。プラスミノゲンのプロ酵素形態は、Arg561とVal562との間のペプチド結合の切断によってその酵素活性形態に活性化されて対応するタンパク質のジスルフィド結合二本鎖形態が得られる。プラスミノゲンタンパク質の活性化産物は、プラスミンと呼ばれる。したがって、Lys−プラスミノゲンの活性化産物はLys−プラスミンと呼ばれ、ミニプラスミノゲンおよびマイクロプラスミノゲンの活性化産物はそれぞれミニプラスミンおよびマイクロプラスミンと呼ばれる。Lys−プラスミンのその非グリコシル化形態の分子量は65,000であり、その完全にグリコシル化された形態の分子量は約83,000ダルトンであり、ミニプラスミンの分子量は約38,000であり、マイクロプラスミンの分子量は、還元形態で約26,500ダルトンであり、非還元形態で約29,000ダルトンである。プラスミンと同様に、ミニプラスミンおよびマイクロプラスミンは触媒活性を有する。プラスミンを超えるミニプラスミンおよびマイクロプラスミンの利点は、プラスミンと比較してそのサイズが小さいことである。したがって、マイクロプラスミンおよびミニプラスミンは共にプラスミンよりも硝子体中での拡散速度が速いと予想される(Xu,J.et al.,Pharmaceutical Research 17:664−669,2000)。
1つの実施形態では、TPCDの分子量は、約40,000ダルトン未満である。別の実施形態では、TPCDの分子量は、約20,000ダルトンと約30,000ダルトンとの間である。さらに別の実施形態では、TPCDの分子量は、還元形態で26,500および非還元形態で約29,000である。さらなる実施形態では、TPCDの分子量は、約20,000未満である。
米国特許第4,774,087号に記載のように、マイクロプラスミンを、pHが約9.5〜11.5の範囲の高アルカリ溶液中でのプラスミンおよびプラスミノゲンの自己分解によって調製することができる。あるいは、PCT出願WO02/50290号に記載のように、マイクロプラスミンおよびミニプラスミンを、組換え法によって調製することができる。簡単に述べれば、ミニプラスミノゲンおよびマイクロプラスミノゲンをコードするDNAを、メチロトローフ酵母(例えば、ハンセヌラ属、ピキア属、カンジダ属、およびトルロプシス属)中でのこれらのタンパク質の発現に使用することができる酵母発現ベクター(例えば、Invitrogen CorporationのpPICZαA分泌ベクター)に単独でクローン化する。最も高いミニプラスミン活性およびマイクロプラスミン活性を有するタンパク質を産生する酵母クローンを、大量産生のために選択する。これらのクローンを、任意の規模で成長させることができるが、典型的には約20リットル〜約500リットルの規模で行う。分泌されたミニプラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲンを、陽イオン交換流動層クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、およびアフィニティクロマトグラフィを含む3工程プロセスで精製する。このプロセスによって得られた精製マイクロプラスミノゲンおよびミニプラスミノゲンを、1モル比のプラスミノゲンアクチベーター(例えば、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、SY162スタフィロキナーゼ変異型など)を使用してその活性形態に活性化する。ミニプラスミンおよびマイクロプラスミンの組換え産生プロセスを拡大して任意のTPCDを産生することができることに留意すべきである。自己プラスミン酵素と比較した組換えTPCD使用の利点は、巨大産生バッチから組換えタンパク質を調製して活性が均一な酵素を得ることができることである。これらの酵素は均一な活性を有するので、標準化したプロトコールを実施することができる。さらなる利点は、遅延や各患者におけるプラスミンの単離および精製に関する他の付随する問題もなくこれらのタンパク質を容易に利用することができることである。
上記プロセスによって得られたTPCDを、濃縮、安定化、および/または凍結乾燥することができる。タンパク質の濃縮方法は、当業者に周知である(例えば、Protein Purification Methods:A Practical Approach,Harris,E.L.V and Angal,S.(eds.),IRL Press,1989;A Guide to Protein Isolation(Second Edition),Clive Dennison,Kluwer Academic Publications,2003;and Protein Methods(Second Edition),Daniel M.Bollag,Michael D.Rozycki,Stuart J.Edelstein(eds.),Wiley,1996を参照のこと)。
安定化は、(例えば、TPCDの安定剤との接触または安定剤の存在下でのTPCDの精製による)1つまたは複数の安定剤の使用による分解および/または不活化からのタンパク質の保護方法である。安定剤には、トラネキサム酸、ヘキサン酸、リジン、セリン、トレオニン、メチオニン、グルタミン、アラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、多価アルコール、薬学的に許容可能な炭水化物、グルコサミン、チアミン、ナイアシンアミド、任意の酸性緩衝液(クエン酸、酢酸、塩酸、炭酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、または安息香酸を含む)、および塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどの塩、ならびにその任意の誘導体または組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。自己プラスミン酵素と比較した安定化組換え産生TPCD使用の1つの利点は、これらのタンパク質が患者毎の採血、精製、プラスミン酵素の調製および保存によって得られた自己プラスミン酵素よりも安定なことである。その調製直後に使用する必要がある自己プラスミン酵素と異なり、安定化組換えTPCDは、精製から相当な時間を経た後でさえも使用することができる。
精製タンパク質の濃縮直後または安定化直後に本発明のTPCDを凍結乾燥することができる。タンパク質の凍結乾燥方法は、当業者に周知である。凍結乾燥TPCDを、任意の量、好ましくは使用時に容易に再構成することができる量をバイアル(例えば、ガラス)に保存することができる。
凍結乾燥したマイクロプラスミン、ミニプラスミン、または任意の他のTPCDを、眼科的に許容可能なキャリア中に再構成し、その後硝子体液および/または房水への接触に使用することができる。1つの実施形態では、眼科的に許容可能なキャリアは、被験体の硝子体に適合するpHおよび浸透圧を有する滅菌溶媒である。眼科的に許容可能なキャリアの非限定的な例は、等張生理食塩水、平衡塩類溶液(BSS)、およびBSSPLUS(登録商標)である。平衡塩類溶液は、典型的には、0.64%塩化ナトリウム、0.075%塩化カリウム、0.048%脱水塩化カルシウム、0.03%塩化マグネシウム六水和物、0.39%酢酸ナトリウム三水和物、0.17%クエン酸ナトリウム二水和物、pH調整のための水素化ナトリウム/塩酸、および水を含む。
TPCDを含む組成物を使用した硝子体液および/または房水の接触方法は、特定の被験体、治療される病態の重症度、および有効な治療に必要な投薬量に依存し、患者ごとに医師が決定することができる。有効量のTPCDが得られる硝子体液および/または房水の硝子体液および/または房水への任意の接触方法を使用することができる。硝子体液および/または房水とのこのような接触は、TPCDを含む組成物の投与と同時に行ってはならないと理解すべきである。接触を遅らせるか、投与時から長期間にわたって接触させることができる。硝子体液および/または房水の1つの接触方法は、硝子体液および/または房水への1回または複数回の各眼内注射による。結膜下注射、筋肉内注射、または静脈内注射によって、硝子体液および/または房水に接触させることもできる。当該分野で周知の手順にしたがって、TPCDを含む溶液を使用して、これらの任意の注射を行うことができる。しかし、あるいは、被験体の眼の障害または障害の合併症を治療または防止するために硝子体液および/または房水にTPCDを十分に拡散させる任意の他の適切な方法によって、硝子体液および/または房水をTPCDと接触させることができる。硝子体内移植可能デバイス(OCUSERT(登録商標)(Alza Corp.,Palo Alto,Calif.)およびVITRASERT(登録商標)(Bausch and Lamb,Inc.,Rochester,N.Y.)が含まれるが、これらに限定されない)の移植によって、TPCDを含む組成物を投与することもできる。本発明は、TPCDが継続的に供給されるように、持続性製剤、徐放性処方物、または任意の移植可能なデバイスを使用して、硝子体液および/または房水をTPCDに接触させることができることも想定する。
当業者は、TPCDの投与計画を容易に決定することができ、これは患者および模索される効果に依存して変化する。眼(詳細には、網膜)または関連する解剖学的構造に有意な毒性を生じることなく所望の治療効果(硝子体の液化、後部硝子体剥離、および/または硝子体腔からの血液、有毒物質、または異物の除去が含まれるが、これらに限定されない)が得られる任意の用量でTPCDを使用することができる。さらに、単回用量または複数回用量としてTPCDを投与することができる。典型的なTPCD投薬量は、約0.005mg/眼〜約0.2mg/眼の範囲である。注射する場合、TPCDを、約0.05ml〜約0.3mlの滅菌溶液(例えば、滅菌BSSまたはBSS PLUS(登録商標))/眼の送達体積で投与することができる。硝子体切除が行われる場合、硝子体が除去される前の約15分間と120分間との間硝子体液および/または房水中にTPCDが残存する。本発明の1つの実施形態では、眼あたり0.125mgのTPCDを含む0.1mlの滅菌BSSまたはBSSPLUS(登録商標)を送達させる。別の実施形態では、眼あたり0.125mgのTPCDを含む0.1mlの滅菌BSSまたはBSSPLUS(登録商標)を硝子体切除前に約15〜120分間送達させる。
本発明はまた、1つを超えるTPCDを含む組成物の使用を意図する。したがって、本発明の1つの態様では、硝子体液および/または房水を第1のTPCDおよび第2のTPCDを含む組成物と接触させる。本発明のこの態様の1つの特定の実施形態では、第1および第2のTPCDは、ミニプラスミン、組換えミニプラスミン、安定化ミニプラスミン、安定化組換えミニプラスミン、ミニプラスミンの変異型、マイクロプラスミン、組換えマイクロプラスミン、安定化マイクロプラスミン、安定化組換えマイクロプラスミン、マイクロプラスミンの変異型、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される。本発明の別の態様では、硝子体液および/または房水を少なくとも1つのTPCDを含む第1の組成物および少なくとも1つのTPCDを含む第2の組成物と接触させる。TPCDは、同一または異なるタンパク質であってよく、実質的に同時または異なる時間で投与することができる。さらに、TPCDを、少なくとも1つの第2の薬剤をさらに含む組成物として投与することもできる。さらに、硝子体液および/または房水を少なくとも1つのTPCDを含む組成物と接触させ、その後少なくとも1つの第2の薬剤を含む組成物と接触させるかその逆を行うことができる。これらの各組成物に必要な時間が異なる場合(すなわち、一方の組成物が他方と比較して作用するのにより多くの時間を必要とする場合)、これが必要であり得る。第2の薬剤は、眼の障害または眼の障害の合併症の治療または予防に有用な任意のタンパク質(しかしTPCDではない)、化学物質、または他の物質である。このような第2の薬剤は、米国特許第4,820,516号;同第5,292,509号;同第5,866,120号;同第6,051,698号;同第6,462,071号;同第6,596,725号;および同第6,610,292号に記載されている。本発明で有用な第2の薬剤の非限定的な例には、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼAC、コンドロイチナーゼB、コンドロイチン4−スルファターゼ、コンドロイチン6−スルファターゼ、およびB−グルクロニダーゼなどのグリコサミノグリカナーゼ酵素;コラゲナーゼ酵素;ディスパーゼ;RGD、GRGDS、GRGDTP、エキスタチン、およびファルボリジンなどのRGD含有ペプチド;抗インテグリン抗体;P2Y受容体アンタゴニスト;尿素、ヒドロキシ尿素、チオ尿素、および抗血管形成薬(血管内皮成長因子(VEGF)インヒビター(例えば、抗VEGF抗体、VEGFアプタマー、可溶性VEGF受容体など)および胎盤成長因子(PlGF)インヒビター(例えば、抗PlGF抗体、PlGFアプタマー、可溶性VEGF受容体など)が含まれるが、これらに限定されない)が含まれる。これらのほとんどの第2の薬剤自体が、硝子体液化の促進および/または後部硝子体剥離の誘導が可能である。第2の抗血管形成薬は、眼の新血管形成の防止に有用であり得る。低酸素性網膜からのVEGFおよび/またはPIGFの発現により、網膜外新血管形成が起こり得る。したがって、VEGFおよび/またはPIGFの阻害は、新血管形成の防止に有効な方法である。
TPCDを含む組成物は、硝子体の液化および/または網膜および他の組織(例えば、網膜上皮、黄斑)からの硝子体の解離(disinsertion)または剥離に有用である。この硝子体液化および/または硝子体剥離の結果として、網膜および他の組織に対する硝子体の牽引力が最小になり、硝子体内の流動物の天然の代謝回転速度が加速される。したがって、TPCDを含む組成物は、眼の多数の障害の治療または予防に特に適切であり、硝子体液化、後部硝子体剥離、網膜外新血管形成の減少、および/または眼の後眼房および/または後眼房の隣接組織(例えば、網膜または黄斑)由来の毒素もしくは他の有害物質(例えば、血管新生因子、浮腫液、出血など)のクリアランスの加速に有利である。このような眼の障害の例には、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血、弱視、眼内炎、未熟児網膜症、緑内障、網膜色素変性症、およびこれらの障害の臨床症状TPCD投与に応答する他の障害が含まれるが、これらに限定されない。本発明は、硝子体とTPCDを含む組成物との接触を含む眼の障害の治療を意図する。このような接触により、硝子体が液化し、そして/または後部硝子体剥離が誘導され、そして/または硝子体腔からの血液または他の有毒物質が除去され、そして/または網膜外新血管形成が減少し、それにより障害が治療または防止されると予想される。
本発明はまた、網膜への硝子体の接着および硝子体萎縮の結果またはであるかこれによって悪化する眼の種々の障害発症を防止または阻害する方法に関する。1つの実施形態では、本発明の方法により、眼から硝子体を除去することなく被験体の眼の障害または障害の由来の合併症を防止または阻害することができる。特に、本発明は、硝子体萎縮または硝子体への新血管形成に関連する障害の発症の防止または遅延の予防工程としての後部硝子体剥離の誘導による増殖性障害患者(糖尿病患者などであるが、これらに限定されない)または増殖性障害の発症リスクのある患者の治療プロセスに関する。本発明の1つの実施形態では、糖尿病性網膜症の進行を阻害するために糖尿病患者の眼に組成物を導入する。好ましくは、増殖性障害が発症する前に組成物を眼に導入する。1つの実施形態では、増殖性障害の発症前に組成物を眼の硝子体に導入し、眼から硝子体を除去することなく組織を無期限に眼にとどめることが可能である。さらなる実施形態では、本発明は、治療を必要とする患者の後部硝子体剥離の誘導による網膜新血管形成および黄斑浮腫などの網膜中心静脈閉塞症および網膜静脈分枝閉塞症の合併症を防止するためのプロセスに関する。本発明は、後部硝子体剥離の誘導による切迫黄斑円孔または全層性黄斑円孔(特発性または外傷性)の治療プロセスを提供する。硝子体萎縮に起因する網膜剥離、網膜裂傷、および網膜出血の発症を、このような障害が起こる前に眼から硝子体を除去することなく後部網膜剥離の誘導によって防止または軽減することができる。
多数の眼科障害の原因は、血液網膜膜の不安定化である。この不安定化により、脈絡毛細管の種々の成分(例えば、血清成分、脂質、タンパク質)が硝子体腔に侵入して網膜表面に損傷を与える。この不安定化はまた、新血管形成として公知の硝子体腔の血管浸潤の前兆である。硝子体の新血管形成は、硝子体の基質に依存する。したがって、重合硝子体形態の基質を除去する硝子体の液化により新血管形成が遮断される。1つの実施形態では、本発明は、硝子体をTPCDを含む組成物と接触する工程を含む、網膜新血管形成の発症の防止または減少による眼の障害を治療または防止する方法を提供する。
糖尿病性網膜症および外傷を含むいくつかの眼科障害により、網膜血管が破裂または漏出して硝子体に出血する(すなわち、硝子体出血)。硝子体出血は、典型的には、硝子体の濁りまたは混濁として現れ、いつもではないが時折網膜の裂傷または剥離を伴う。網膜の裂傷または剥離が硝子体の出血を伴う場合、このような網膜の裂傷または剥離を迅速に診断し、手術によって修復することが重要である。網膜の裂傷または剥離を迅速に診断および修復できない場合、裂傷または剥離領域中の網膜の光受容細胞は壊死し得る。網膜の光受容体細胞の壊死により失明し得る。さらに、網膜剥離が長期間未修復のままであるとさらに硝子体が出血し、そして/または出血部位に線維組織が形成され得る。線維組織により、硝子体と網膜との間に望ましくない不変の線維の接着物が形成され得る。いかなる治療も行わない場合、出血性の硝子体混濁において網膜が硝子体を通して十分に視覚可能になるまで透明になるのに6〜12ヶ月またはそれ以上かかり得る。このような場合、医師が任意の網膜表面部分を修復する必要がある場合または医師が混濁または濁った硝子体によって妨げられた患者の網膜表面を見えるようにする必要がある場合、硝子体切除として公知の超微細手術手順を実施する必要があり得る。この手順は、超微細手術カッターを使用した硝子体の全部または一部の除去および眼窩の形状を維持する透明な液体または他の物質への硝子体の置換を含む。標準的な硝子体切除手術手段は当業者に周知である。1つの実施形態では、本発明は、硝子体切除の補助としての硝子体と少なくとも1つのTPCDを含む組成物との接触を意図する。他の実施形態では、硝子体切除を行わずに硝子体を少なくとも1つのTPCDを含む組成物と接触させる。
本発明を以下の実施例によってさらに例示するが、本明細書中に記載の特定の手順に対する範囲または精神において本発明を制限すると解釈されない。対照的に、本明細書中の説明の解釈後、手段には種々の他の実施形態、修正形態、および等価物が含まれ、これら自体が本発明の精神および/または添付の特許請求の範囲の範囲を逸脱することなく当業者に示唆されることが示唆され得ることが明らかに理解される。
ピキア・パストリス(Pichia.pastoris)中でのヒトマイクロプラスミノゲンおよびヒトミニプラスミノゲンの発現のためのベクター構築
(a)pPICZαAベクター
InvitorogenCorporation(Carlsbad,California)から購入したpPICZαA分泌ベクターを使用して、ピキア・パストリス中での組換えヒトマイクロプラスミノゲンおよびミニプラスミノゲンの発現および分泌を行った。このベクターの顕著な特徴には、(i)ピキア属において組換えタンパク質のメタノール誘導性高レベル発現が可能なアルコールオキシダーゼ1(AOX1)プロモーターを含む942bpフラグメントおよびAOX1染色体遺伝子座へのプラスミド組み込みのターゲティング;(ii)天然の転写終結およびAOX1遺伝子由来のポリアデニル化シグナル;(iii)大腸菌(Escherichia.coli)およびピキア・パストリスにゼオシン耐性を付与する発現カセット、(iv)大腸菌中でのプラスミドの増殖および維持のためのColE1複製起点、(v)タンパク質の検出および精製に使用することができるc−mycエピトープおよびポリヒスチジン(6×His)タグ、および(vi)ピキアゲノムへの有効な組み込みのためにAOX1遺伝子座でベクターを線状化可能な固有の制限部位(例えば、SacI、PmeI、BstXI)が含まれる。
上記特徴に加えて、本ベクターは、培地に分泌タンパク質として異種タンパク質を発現するサッカロミセス・セレビシエα因子プレプロペプチドの分泌シグナルを含む。pPICZ中でのα因子接合シグナル配列のプロセシングは以下の2工程で起こる。
1.配列Glu−Lys−Arg* Glu−Ala−Glu−Ala(*は切断部位である)中のアルギニンとグルタミンとの間に起こるKEX2遺伝子産物によるシグナル配列の予備切断。しかし、Glu−Ala反復は、Kex2による切断に常に必要ではない。
2.Glu−Ala反復は、STE13遺伝子産物によってさらに切断される。いくつかの場合、Stel3切断は効率的ではなく、Glu−Ala反復は、目的の発現タンパク質のNH末端上に残存する。
pPICZαAベクター中のα因子シグナル配列の操作されたすぐ下流に、外来遺伝子のクローニングを容易にするための酵素EcoRI、SfiI、KpnI、XhoI、SacII、およびXbaIの認識配列を有する多クローニング部位が存在する。他クローニング部位中のXhoI部位に加えて、Lys−Arg Kex2切断部位のすぐ上流にα因子分泌シグナルのカルボキシル末端にXhoI認識配列が存在する。このXhoI制限部位を使用して、PCRクローニングアプローチおよびXhoI部位からアルギニンコドンへの配列の再構築のための適切な正方向プライマーの使用によって、Kex2切断部位と同一面の目的の遺伝子をクローン化することができる。次いで、天然のNH末端を含む目的の組換えタンパク質を発現する。
(b)マイクロプラスミノゲンのための発現ベクターの構築
Clontech(Palo Alto,California)から市販されているAdvantage cDNAポリメラーゼミックスを使用して、ヒトマイクロプラスミノゲンタンパク質(アミノ酸543〜791(配列番号4))をコードする核酸配列を、ベクターFmyc−pPliから増幅した(PCRレスキュー)(Lasters et al.in Eur.J.Biochem.244:946,1997)。94℃で3分間のDNAテンプレートの分解後、30ラウンドの熱サイクリングを行い(94℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で30秒間)、その後72℃で2分間の最終伸長を行った。以下のオリゴヌクレオチドプライマーLY−MPLG1(センス)およびLY−MPLG2(アンチセンス)を本反応で使用した:
LY−MPLG1:5’GGGGTATCT CTC GAG AAA AGA GCC CCT TCA TTT GAT TG(配列番号1)
LY−MPLG2:5’GTTTTTGT TCT AGA TTA ATT ATT TCT CAT CAC TCC CTC(配列番号2)。
LY−MPLG1プライマーは、α因子接合シグナル(Leu−Glu−Lys Arg)の最後の4つの残基を含む非アニーリング伸長が先行したヒトプラスミノゲンの残基543〜548(Ala−Pro−Ser−Phe−Asp−Cys)に対応するアニーリング領域を有していた。この伸長では、Leu−GluコドンによりXhoI制限部位(下線)が決定され、Kex2切断部位と同一面の目的の遺伝子をクローニング可能である。LY−MPLG2プライマーは、プラスミノゲンの最後の7残基に対応するアニーリング領域、その後にTAA終止コドンおよびXbaI認識配列(下線)を含む非アニーリング領域を有していた。
予想サイズ(〜780bp)を有する増幅フラグメントを、XhoIおよびXbaIで消化し、ベクターpPICZαAに方向性にクローン化した。XhoIおよびXbaI制限によってレシピエントベクター−フラグメントを調製し、Qiaquickゲル抽出キット(Qiagen GmbH,ドイツ)を使用してアガロースゲルから精製した。E.コリTG1株(DSMZコレクション番号1208,ドイツ)を、ライゲーション混合物で形質転換し、ゼオソン耐性クローンを選択した。制限分析に基づいて、予想サイズのインサートを含むプラスミドクローンをさらなる特徴付けのために保持した。Invitrogen Corporation(Carlsbad,California)のEasySelectピキア発現キットに含まれるプライマー5’AOXおよび3’AOXを使用したベクターpPICZα−MPLG1(クローン番号5)の配列決定により、α因子接合シグナルに融合したマイクロプラスミノゲンコード領域の正確な挿入およびコード領域中の望ましくない変異の不在を確認した。
使用したヒトマイクロプラスミノゲンの決定したヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を、それぞれ配列番号3および配列番号4に示す。Forsgren et al.in FEBS Lett.213:254,1987によって以前に決定された配列と比較して、10の位置でヌクレオチド配列が異なる。しかし、アミノ酸配列は同一であった。
(c)ミニプラスミノゲンのための発現ベクター構築
上記pPICZα−MPLG1ベクターを使用して、ミニプラスミノゲンの発現のためのpPICZα由来の分泌ベクターを以下のように構築した。
ミニプラスミノゲンタンパク質(配列番号10のアミノ酸444〜604)のクリングル5および触媒ドメイン一部をコードする500bpDNAフラグメントを、ベクターFdTet−SN−miniPlg(Lasters et al.、前出)から増幅させた「PCRレスキュー」)。94℃で3分間のDNAテンプレート変性工程後、30サイクルの熱サイクリング(94℃で10秒間、50℃で10秒間、72℃で1秒間)、その後72℃で2分間の最終伸長工程を行った。以下のオリゴヌクレオチドプライマーLY−MINPLG1(センス)およびLY−MINPLG2(アンチセンス)を本反応で使用した:
LY−MINPLG1:5’GGGGTATCT CTC GAG AAA AGA GCA CCT CCG CCT GTT GTC CTG CTT CC(配列番号5)
LY−MINPLG2:5’GCA GTG GGC TGC AGT CAA CAC CCA CTC(配列番号6)。
LY−MINPLG1プライマーは、因子接合シグナルの最後の4つの残基(Leu−Glu−Lys−Arg)を含む非アニーリング伸長が先行したプラスミノゲンの残基444〜452(Ala−Pro−Pro−Pro−Val−Val−Leu−Leu−Pro)に対応するアニーリング領域を有していた。この伸長では、Leu−GluコドンによりXhoI制限部位(下線)が決定され、Kex2切断部位と同一面の目的の遺伝子をクローニング可能である。
LY−MINPLG2プライマーは、ヒトプラスミノゲンの残基596〜604(Glu−Trp−Val−Leu−Thr−Ala−Ala−His−Cys)に対応するアニーリング領域を有する。触媒ドメインのこのアニーリング領域はまた、マイクロプラスミノゲン発現ベクター中に存在し、固有のPstI認識配列(下線)を含む。
予想されるサイズを有する増幅フラグメントを、XhoIおよびPstIで消化し、ベクターpPICZα−MPLG1由来のレシピエントベクターフラグメントに方向性にクローン化した。XhoIおよびPstI制限によってレシピエントベクター−フラグメントを調製し、Qiaquickゲル抽出キット(Qiagen GmbH,ドイツ)を使用してアガロースゲルから精製した。E.コリTG1株(DSMZコレクション番号1208,ドイツ)を、ライゲーション混合物で形質転換し、ゼオソン耐性クローンを選択した。制限分析に基づいて、予想サイズのインサートを含むプラスミドクローンをさらなる特徴付けのために保持した。プライマー5’AOXおよび3’AOXを使用したベクターpPICZα−KMPLG1(クローン番号3)の配列決定により、α因子接合シグナルに融合した増幅フラグメントの正確な挿入およびコード領域中にいかなる変異も存在しないことを確認した。
組換え安定化マイクロプラスミンの調製方法
(a)pPICZα−MPLG1でのピキア属の形質転換。10μgのベクターpPICZα−MPLG1を、5’AOX1領域中でベクターを線状化するPmeIで消化した。DNAを沈殿させ、滅菌蒸留水中に0.33μg/μlに濃縮し、5μlを使用してEasySelectPichia発現キットに含まれるマニュアルにしたがって調製したコンピテントピキア・パストリスX33細胞を形質転換した。
(b)高発現株の選択
高発現株の選択を以下のように行った。ゼオシン耐性形質転換体を、YPDSZプレート(1%酵母抽出物、2%ペプトン、2%グルコース、1Mソルビトール、2%寒天、100μg/mlゼオシン)上で選択した。34個の単一コロニーを、10ml BMYZ−グリセロール培地(1%酵母抽出物、2%ペプトン、1%グリセロール、100mMリン酸カリウム(pH6.0)、1.34%酵母窒素塩基、4×10−5%ビオチン、100μg/mlゼオシン)を含む50ml Falconチューブ中でインキュベートし、30℃で16時間培養した。細胞をペレット化し、AOX1プロモーター由来の発現を誘導するために、2mlのBMYZ─メタノール培地(BMYZ−グリセロールと同一であるが、グリセロールの代わりに0.5%メタノールを含む)中に再懸濁し、40時間培養した。この期間中(6、22、26、および30時間後)に培養物に4パルスの0.5%メタノールを供給した。インキュベーション培養後、培養上清中のマイクロプラスミノゲンの存在を、Lijnen et al.in Eur.J.Brochent.120:149,1981に記載のように評価した。簡単に述べれば、無希釈または10倍希釈の上清中のマイクロプラスミノゲンを、ウロキナーゼと30分間インキュベートして、マイクロプラスミノゲンをマイクロプラスミンに活性化した。異なる時間の呈色基質S2403(Chromogenix,Antwerp,Belgium)によって決定されたそのアミド分解活性によって決定された、得られたマイクロプラスミン活性を、既知量の精製プラスミンまたはマイクロプラスミン調製物の活性と比較した。その後の大量産生のために、ウロキナーゼ活性化後に高マイクロプラスミン活性を示すクローンX33−MPLG1番号5を選択した。2001年12月12日にブダペスト条約の条項にしたがってこのクローンをBelgian Coordinated Collections of Microorganisms(BCCM−MUCL−COLLECTION)に寄託し、アクセッション番号MUCL43676で受託された。
(c)発酵
以下の4つの工程で50リットル規模のX33−MPLG1番号5の発酵を行った。0.7mlの接種物(細胞バンクウイルス番号グリセロールOOC17)を使用して、400mlYSG+(6g/lの酵母抽出物、5g/lのダイズペプトン、20g/lのグリセロール)中にて、270rpmで震盪しながら2リットルフラスコでの細胞培養を30℃で23時間行い、OD600 15を得た(予備培養工程後)。次いで、600mlの接種物を使用して、大気圧で50l/分通気し、溶存酸素(DO)が20%超であり、200〜500rpmで震盪し、12.5%アンモニアでpH5.8に維持した30l基本培地(26.7ml/lの85%HPO、1.05g/1 CaSO・2HO、18.2g/l KSO、、14.9g/l MgSO・7HO、4.13g/l KOH、40g/l100%グリセロールならびに4.76ml/l PTM1塩溶液(6g/l CuSO・5HO、0.08g/l NaI、3.36g/l MnSO・HO、0.2g/l NaMoO・2HO、0.02g/lホウ酸、0.82g/l CoCl・6HO、20g/l ZnC1、65g/l FeSO・7HO、0.2g/l d−ビオチン、および5ml/l HSSOを含む))を含むMRP80発酵デバイス中にて30℃で発酵させた。24時間後且つ50のOD600後(バッチ工程後)、溶存酸素の急速な増加によってグリセロールの枯渇が証明された。グリセロール供給(632g/lの100%グリセロールおよび12ml/PTM1)により、24時間でOD600が258まで増加した。次いで、6時間以内に250ml/時間まで流速を増加させてメタノールを供給し、988ml/lメタノールおよび12ml/l PTM1を使用して66時間維持し、培養終了時にOD600が325に達した。350リットル規模のX33−MPLG1番号5の発酵により、比例的に類似の結果が得られた。
(d)精製
次いで、回収物を、陽イオン交換流動層クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、およびアフィニティクロマトグラフィを含む3工程プロセスで精製する。
i)陽イオン交換流動層クロマトグラフィ。ベッド体積が5,120cmであり、2カラム体積の1M NaCl、25mM酢酸ナトリウム(CHCOONa・3HO)緩衝液(pH6.0)およびその後の1カラム体積の25mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)の上昇流によって層流を起こさせて平衡化したStreamline 200カラム(Pharmacia Biotechnology Cat No.18−1100−22)中にパッケージングされたStreamlineSP(Pharmacia Biotechnology,Cat.No.17−0993−01/02にて利用可能)を使用して陽イオン交換流動層吸着クロマトグラフィを行った。発酵ブロスを水でオンライン式にて希釈し(7倍)、流速1000ml/分で層流ベッドを上方へ通過させた。弱く結合した物質を、25mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)の上昇流で洗浄した。次いで、カラムアダプターを高さ16.3cmの沈殿ベッド表面まで低下させた。逆流させ、捕捉タンパク質を2カラム体積の0.5M NaCl、25mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で溶離した。固体硫酸アンモニウムを、30%飽和に達するまで溶離Stremline画分に添加し(溶離Streamline画分1リットルあたり164gの硫酸アンモニウム)、混合物を4〜8℃で1時間ゆっくりと撹拌した。
ii)疎水性クロマトグラフィ。4〜8℃でパッケージング体積2,700cmのVantage 180/500カラム(Millipore,Cat.No.87018001から利用可能)にパッケージングされたHexyl TSK 650C(Toso−Haas Cat.No.19027から利用可能)を使用して、疎水性クロマトグラフィを行った。溶離streamline画分を、38l/時間の流速でカラムにロードした。次いで、カラムを、164g/l硫酸アンモニウムを含む1.5倍体積の25mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で洗浄し、7カラム体積の25mM酢酸ナトリウム(pH6.0)を使用してカラムから溶離した。
iii)アフィニティクロマトグラフィ。パッケージング体積3,186cmのVantage 130/500カラム(Millipore,Cat.No.87013001から利用可能)にパッケージングされたBlue Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia Biotechnology,Cat.No.17−0948−02/03から利用可能)を使用して、4〜8℃でアフィニティクロマトグラフィを行った。溶離画分を、流速20l/時間でカラムにロードし、1カラム体積の25mMリン酸一水素二ナトリウム(NaHPO・12HO)緩衝液(pH7.0)で洗浄した。マイクロプラスミノゲンタンパク質画分を、5カラム体積の0.5M NaCl、25mMリン酸一水素二ナトリウム緩衝液(pH7.0)でカラムから溶離し、−20℃で凍結保存した。SDSゲル電気泳動によって証明したところ、物質の純度は98%超であった。
(e)マイクロプラスミンの定量的活性化および安定化。
i)定量的活性化。0.5%のスタフィロキナーゼ変異型SY162を含む0.5MNaCl、25mMリン酸一水素二ナトリウム(NaHPO・12HO)緩衝液(pH7.0)のモル比で23℃で30分間マイクロプラスミノゲンのマイクロプラスミンへの活性化を行った。WO99/40198に記載のように、SY162は、野生型と比較して、12アミノ酸置換(K35A、E65Q、K74R、E80A、D82A、T90A、E99D、T101S、E108A、K109A、K130T、およびK135R)を含む免疫原性が減少したスタフィロキナーゼ変異型である。最終濃度1M(132g/l)までマイクロプラスミンに固体硫酸アンモニウムを添加し、混合物を4〜8℃で15分間撹拌した。
ii)疎水性クロマトグラフィ。パッケージング体積が1,738cmであり、4カラム体積の0.1Mの安定剤、トラネキサム酸(Bournonville Pharma,Braine−L’Alleud,Belgiumから利用可能)、および1M(NHSO(pH7.0)を含む25mM NaHPO・12HO緩衝液(pH7.0)で平衡化したBPG 100/500カラム(Pharmacia Biotechnology,Cat.No.18−1103−01から利用可能)中にパッケージングしたPhenyl Sepharose 6 Fast Flow(Pharmacia Biotechnology,Cat.No.17−0965−03/05から利用可能)を使用して4〜8℃で疎水性クロマトグラフィを行った。活性化産物を、18l/時間の線形流速でカラムにロードし、0.1Mトラネキサム酸および1M(NHSOを含む4.5カラム体積の25mM NaHPO・12HO緩衝液(pH7.0)で洗浄した。線形流速6l/時間の0.1Mトラネキサム酸および0.7M(NH4)2SO4を含む5カラム体積の25mM NaHPO・12HO緩衝液(pH7.0)でマイクロプラスミンをカラムから溶離し、0.1Mトラネキサム酸を含むリン酸緩衝化生理食塩水で平衡化した。0.1Mトラネキサム酸を含む25mM NaHPO・12HO緩衝液(pH7.0)でカラムからスタフィロキナーゼ変異型SY162を溶離した。特異的ELISAアッセイで証明されるように、この手順により、マイクロプラスミンピークから99%超のスタフィロキナーゼを除去した。
iii)接線限外濾過(tangential ultrafiltration)による濃縮およびダイアフィルトレーション。この工程では、工程(ii)からの溶離物を濃縮し、緩衝液を低pHクエン酸緩衝液と交換した。工程(ii)のトラネキサム酸をこの工程で除去し、低pHクエン酸緩衝液によってマイクロプラスミンを安定化した。
2つのPellicon 2 Biomaxメンブレン(5kDa、2.5μm、Millipore,Bedford,Massachusetts,Cat.No.P2B005A25から利用可能)を使用して、2〜8℃で限外濾過を行った。メンブレンを、Microgon Pump Cart System(Microgon,Laguna Hills,Californiaから利用可能)に接続したPellicon 2 Process Holderにマウントした。メンブレンを精製水で洗浄し、操作前にメンブレンの完全性を試験した。0.5M NaOHで60分間および0.1M NaOHで60分間の連続的再循環によって浄化した。浄化工程によってメンブレンが深部まで浄化されて、サンプルの適用前にメンブレン上に残存するいかなる潜在的な微量タンパク質も除去する。次いで、通過物のpHが3.1に達するまで、メンブレンを5mMのクエン酸(pH3.1)でリンスした。Phenyl Sepharose溶離物のpHを、3.1に調整し、限外濾過によってタンパク質を4mg/mlに濃縮した。5倍体積の5mMクエン酸(pH3.1)に対して60〜90分間ダイアフィルトレーションを行った。50リットルの発酵装置で実施した3つの運転の収量(gで示す)を、表2にまとめる。
Figure 0005739487
iv)濾過滅菌(0.2μm)。微生物汚染がないことを確認するために、この工程を行った。
2〜8℃でマンニトールを濃度1.5g/gのタンパク質に添加し、23℃でMillipak100フィルター(サイズ500cm)(Millipore,Cat.No.MPGL10CA3から利用可能)にて滅菌濾過を行い、ペリスタリックポンプにて500ml/分の流速で約500mlの5mMクエン酸(pH3.1)を用いてリンスした。濾過物を滅菌無発熱物質バッグに回収し、−20℃で保存した。
組換え安定化ミニプラスミンの調製方法
20μlの反応物中の約15μgのベクターpPICZα−MPLG1を、5’AOX1領域中でベクターを線状化するPmeIで消化する。線状DNA(3μg)を使用して、EasySelectPichia発現キットに含まれるマニュアルにしたがって調製したコンピテントピキア・パストリスX33細胞を形質転換した。
高発現株の選択を本質的に以下のように行った。ゼオシン耐性形質転換体を、YPDSZプレート(実施例2に定義)上で選択した。50個の単離コロニーを、15ml BMYZ−グリセロール培地(実施例2に定義)を含む50mlFalconチューブ中でインキュベートし、30℃で16時間培養した。細胞をペレット化し、AOX1プロモーター由来の発現を誘導するために、1.5mlのBMYZ─メタノール培地(実施例2に定義)中に再懸濁し、40時間培養した。この期間中に培養物に3または4パルスの0.5%メタノールを定期的に供給した。インキュベーション培養後、培養上清中のミニプラスミノゲンの存在を、Lijnen et al.(前記)に記載のように評価した。簡単に述べれば、10倍希釈の上清中のミニプラスミノゲンを、ストレプトキナーゼと10分間インキュベートして、活性複合体を形成させた。異なる時間の呈色基質S2403(実施例2に定義)を使用して決定した得られたミニプラスミン活性を、既知量の精製プラスミノゲン調製物の活性と比較した。これらの条件下では、全ての試験クローンは、3mg/lと15mg/lとの間で変化する収量のミニプラスミノゲンを産生した。その後の大量産生のために、最も高いミニプラスミン活性を示す2つのクローンX33−KMPLG1番号6およびX33−KMPLG1番号25を選択した。2003年12月4日にブダペスト条約の条項にしたがってこれら2つのクローンをBelgian Coordinated Collections of Microorganisms(BCCM−MUCL−COLLECTION)に寄託し、アクセッション番号MUCL45309(クローンX33−KMPLG1番号6)およびアクセッション番号MUCL45308(クローンX33−KMPLG1番号25)で受託された。
新規の固定方法
正常なブタ眼における後部硝子体剥離(PVD)に対する培地および異なる薬剤の効果を調査するための信頼のおける固定技術を確立するために、本実験を行った。
食肉処理場から得た新たに単離したブタの眼を、直後に処理するか、室温で6時間まで放置した。固定を容易にするために角膜を除去した。酵素反応を停止させるために、眼を0℃のPeter液(1.25%グルタルアルデヒド/1%パラホルムアルデヒドを含む0.08M炭酸緩衝液(pH7.4))中で24〜36時間固定した。次いで、眼を、0.1Mカコジル酸緩衝液(pH7.4)で洗浄し、100%までの漸増濃度のエタノール中で段階的に脱水した。
新たに処理した眼および6時間放置した眼は、共に網膜の超微細構造は有意に変化せず、硝子体は網膜表面に接着したままであった。したがって、この方法は、眼組織のための非外傷性固定手順を提供し、網膜表面から硝子体が分離する可能性を最小にする。さらに、この手順により、視神経から網膜周辺部までの全網膜表面を研究可能である。
死後のブタの眼における硝子体網膜境界に対するマイクロプラスミンの効果
網膜表面の内境界膜から後部硝子体皮質を解離するマイクロプラスミンの能力を決定するために、本実験を行った。
体積0.1mlの眼内灌流液BSSPLUS(登録商標)中、以下の用量でマイクロプラスミンを使用した:0.0625、0.125、0.156、0.25、および0.390mg。これらのマイクロプラスミン溶液のpHは、0.0625mgの用量のための7.92〜0.390mgの用量のための6.52の範囲であった。
上記開示のマイクロプラスミン溶液を、室温(24℃)で新たに屠殺したブタから得た眼の硝子体液に個別に注射した。実施例4に記載のように、マイクロプラスミン注射から15分後、30分後、60分後、または120分後に眼を固定した。0.0625mgのマイクロプラスミン注射処置から1時間後に後部硝子体剥離(PVD)が認められたのに対して、0.125mgのマイクロプラスミンを含むか超える全ての用量での注射から約30分でPVDが認められた。この剥離は、硝子体基部付近(硝子体への接着が強固な網膜周辺部から鋸状縁までにわたる領域)以外の全ての網膜表面切片で注射から約120分後に最も明らかであった(図4、パネルA)。後部硝子体剥離に加えて(図4、パネルB〜E)、電子顕微鏡法により、硝子体の構造が線維性の低い構造に変化することが示された。線維性構造は、硝子体液の液化を示すより不定形且つ一様にすりガラス状に改変された(図4、パネルF)。
肉眼的試験または組織病理学(電子顕微鏡法が含まれる)によって決定したところ、0.25mg未満の用量ではいかなる眼または網膜に対しても有毒ではなかった。特に、自己消化の徴候は認められなかった。自己消化の初期徴候として細胞の空砲形成がしばしば認められ、0.390mg未満の用量では空砲形成は認められなかった。電子顕微鏡法によって、他の眼組織も試験した(図5、パネルAおよびB)。0.39mg未満の用量では、網膜の構造変化は認められなかった。しかし、0.25mgのマイクロプラスミンで処置したいくつかの眼では、網膜の隆起および少数の炎症細胞が網膜表面上に疎らに分布していた。最も高い用量のマイクロプラスミン(0.390mg)で処置した眼の肉眼的組織学は、網膜境界が白っぽい外観を有することを示した。この眼の電子顕微鏡法により、局在化網膜剥離が示唆される網膜表面の複数の小さな隆起が存在することが明らかとなった。
これらの実験は、0.06〜0.2mgの投薬量で使用したマイクロプラスミンによりいかなる網膜の超微細構造の変化を誘導することなく後部硝子体を一貫して分離することを示す。後部硝子体分離は、視神経だけでなく硝子体基部までずっと存在する。後部硝子体分離によって透明でなめらかな網膜表面が遊離し、高分解能走査電子顕微鏡(倍率12,000倍)(非検出線維の可能性の排除に十分な倍率)を使用してコラーゲン線維を認識することができなかった。
ヒト死後の眼における後部硝子体剥離
マイクロプラスミンがヒト眼の硝子体網膜分離を有効に誘導することができるかどうかを決定するために本実験を行った。
(方法)
(a)ヒト死後の眼の投与および処置
眼の疾患が認められていない26個のヒトの眼球を、Munichアイバンクから得た。これらの眼球を、死後19時間以内に34〜69歳の範囲の13人のドナーから取り出した。直径14mmのトレフィンを使用した角膜の回収後、26個の眼球を37℃の湿室で15分間インキュベートした。次いで、0.2mlのマイクロプラスミンを、13個の眼の硝子体腔に注射した。詳細には、1.25mgのマイクロプラスミンを、それぞれ4ml、2ml、または1.5mlの眼内灌流溶液BBSPLUS(登録商標)にて0.3125mg/ml、0.625mg/ml、および0.9375mg/mlの濃度に希釈した。総体積が0.2mlのこれらの溶液を硝子体腔に注射し、眼内の最終マイクロプラスミン用量をそれぞれ62.5μg、125μg、および188μgとした。コントロールとして使用した13個の他方の眼に、0.2mlの平衡塩類溶液(BSSPLUS(登録商標))を注射した。
マイクロプラスミンで処置した13個の眼のうち、9個の眼を、マイクロプラスミンのみの硝子体内注射によって処置した。62.5μgのマイクロプラスミン(pH7.4)を、2つの眼の硝子体腔に注射し、125μgのマイクロプラスミン(pH7.2)を、5つの眼の硝子体腔に注射し、188μgのマイクロプラスミン(pH7.2)を、2つの眼に投与した。残りの4個の眼のうち、2個の眼を62.5μgのマイクロプラスミンおよび0.6mlのスルフヘキサフルオリド(SF)で処置し、2個を125μgのマイクロプラスミンおよび0.6mlのスルフヘキサフルオリド(SF)で処置した。硝子体切除またはガス注射と組み合わせたプラスミンのみによるPVDの誘導が以前に報告されているので、SFでさらに処置した。上記で考察した投与および処置を、表3にまとめる。
Figure 0005739487
処置後、全ての眼を37℃で30分間インキュベートした。その後、眼球を4%パラホルムアルデヒド中に入れ、眼内の酵素作用を停止させるために、0.1mlの固定剤(パラホルムアルデヒド)を硝子体腔にも注射した。マイクロプラスミンおよびSFで処置した眼球を、立位で後極を固定した。
(b)走査型および透過型電子顕微鏡法
次いで、眼球を、扁平部に沿って二等分し、前部を破棄した。直径12.5mmの角膜トレフィンを硝子体を通過してゆっくり移動させ、後極を打ち抜いた。次いで、走査型および透過型電子顕微鏡法のための網膜試料を、直径4mmの角膜トレフィンを使用して後極から得た。
走査型電子顕微鏡法用の網膜ディスクを、2%四酸化オスミウム(Dalton固定剤)で前固定し、エタノール中で脱水し、臨界点乾燥を行い、金でスパッタコーティングし、ISM−35CF電子顕微鏡(JEOL(登録商標),東京,日本)を使用して撮影した。
透過型電子顕微鏡法用の試料を、Dalton固定剤で後固定し、脱水し、EPON(商標)に包埋した。半薄切片を、2%トルイジンブルーで染色した。超薄切片を、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛を使用して対比させ、Zeiss EM9電子顕微鏡(Zeiss,Jena,ドイツ)を使用して分析した。
2人の観察者が個別に電子顕微鏡写真を評価した。各観察者は、内境界膜(ILM)に覆われたコラーゲン原線維網が連続または不連続のいずれであるか、コラーゲン原線維がILMに単独または疎らに存在するかどうか、またはILMがいかなるコラーゲン原線維を欠く(露呈したILM)かどうかの決定によって硝子体網膜分離の程度を評価した。
(結果)
(a)走査型電子顕微鏡
62.5μgのマイクロプラスミンを注射した死後ヒトの眼の走査型電子顕微鏡法(SEM)により、ILMに覆われた不連続なコラーゲン原線維網が遊離した後部硝子体剥離が明らかとなった(図6、パネルA)。125μg(図6、パネルB)および188μg(図6、パネルC)のマイクロプラスミンをそれぞれ注射した眼のSEMにより、完全な硝子体網膜分離と一致する露呈したILMが明らかとなった。これらの両方のより高い用量により、硝子体網膜境界の類似の超微細構造が得られた。
62.5μgのマイクロプラスミンおよびSFを注射した眼では、ILMを覆う硝子体皮質の断片が認められた(図6、パネルD)。しかし、125μgのマイクロプラスミン注射およびその後のガスタンポン挿入(gas tamponade)を行った眼では、露呈したILMと一致する完全な硝子体網膜分離が認められた(図6、パネルE)。
上記で考察したマイクロプラスミン処置眼と対照的に、SEMで決定したところ、コントロール眼では後部硝子体剥離は認められなかった(図6、パネルF)。これらの結果を、表4にまとめる。
Figure 0005739487
(b)透過型電子顕微鏡法
全てのマイクロプラスミン処置眼の網膜内の形態学的性質は、コントロール眼と比較して変化しなかった。ILMの超微細構造は、コントロール眼(図7、パネルB)と比較してマイクロプラスミン処置眼(図7、パネルA)で十分に保存された。
(結論)
これらのデータは、マイクロプラスミンの硝子体内注射によって、硝子体切除または任意の他の手術介入を行うことなくヒトの眼の硝子体皮質と内境界膜との間の切断を誘導することができることを示す。125μgのマイクロプラスミンにより、30分以内にヒト硝子体網膜接合部(junction)が切断される。酵素作用に関して、125μgのマイクロプラスミンは、2Uのプラスミン(Sigma−Aldrich,Munich,ドイツ)と同用量であり、ブタ死体眼およびヒトドナー眼において完全な硝子体網膜分離を引き起こす。これらのデータはまた、マイクロプラスミン処置眼の硝子体への気泡の適用は硝子体網膜接合部の切断に必要な用量に影響を与えなかったことを示す。
マイクロプラスミン誘導後部硝子体剥離のinvivo分析
これらの実験の目的は、in vivoでのPVDに対するマクロプラスミンの有用性を決定することであった。
(方法)
(a)ネコモデル
解剖学者および生理学者によってネコ網膜は広く研究されており、薬理学的誘導PVDの安全性の評価に有用なモデルとなる。ヒト網膜と同様に、ネコ網膜は桿体細胞に支配されており、眼窩外側の網膜内循環を有する。これは、網膜内血管を有さないウサギと対照的である。ウサギ内部網膜は硝子体表面上に存在する脈管構造によって灌流しており、これはウサギの硝子体網膜境界に主に注目する実証研究の価値を制限する。何年もの間、ネコモデルから網膜の剥離に対する細胞応答に関する高品質のデータが得られている。したがって、本発明者らは、in vivoでのPVDの実施におけるマイクロプラスミンの有用性の研究にネコモデルを使用した。
5頭の12月齢と23月齢の間の成体飼いネコを0.5mlのケタミン(Ketaset,Park−Davis,Eastleigh,イギリス)および0.3mlのメデトミド(Dormitor,Pfizer,イギリス)の筋肉内注射を用いて麻酔した。麻酔したネコに、14.5μgまたは25μgのマイクロプラスミンを硝子体内注射し、これらのネコの他方の眼に平衡塩類溶液(BSS−PLUS(登録商標))を注射し、コントロールとして使用した。本研究で使用した5頭のネコのうち、3頭のネコに25μgのマイクロプラスミンを硝子体内注射した。これらのネコのうちの1頭を、注射から1日後に屠殺し、第2のネコを3日後に屠殺し、第3のネコを3週間後に屠殺した。2頭の残りのネコに14.5μgのマイクロプラスミンを注射した。これらのうち、一方を3日後に屠殺し、他方を3週間後に屠殺した。
(b)走査型および透過型電子顕微鏡
実施例6のヒト死後眼について記載のように、屠殺したネコから眼球を取出し、固定し、電子顕微鏡法のために処理した。2人の観察者が個別に電子顕微鏡写真を評価した。各観察者は、ILMに覆われたコラーゲン原線維網が連続または不連続のいずれであるか、コラーゲン原線維がILMに単独または疎らに存在するかどうか、またはILMがいかなるコラーゲン原線維を欠くかどうかの決定によって硝子体網膜分離の程度を評価した。
(c)共焦点顕微鏡法
眼の試料を、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)でリンスし、PBS中で調製した5%アガロース(Sigma,St Louis MO,アメリカ)で泳動した。厚さ100μmの切片を、ビブラトーム(Technical Products International,Polysciences,Warrington,PA,アメリカ)を使用して切断し、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA;Fisher Scientific,Pittsburgh,PA,アメリカ)、0.1%Triton X−100(Roche Boehringer,Mannheim,ドイツ)、および0.1%アジ化ナトリウム(Sigma−Aldrich,Munich,ドイツ)を含む正常なロバ血清(20倍;Dianova,Hamburg,ドイツ)を含むPBS(BSA、Triton、およびアジドを含むこのPBS溶液を、PBTAという)中で回転させながら4℃で一晩インキュベートした。ブロッキング血清の除去後、以下の6セットの対に一次抗体を添加した:抗グリア線維性酸性タンパク質(GFAP;500倍;DAKO,Hamburg,ドイツ)と抗IV型コラーゲン(50倍;DAKO)との対;抗ビメンチン(50倍;DAKO)と抗フィブロネクチン(400倍;DAKO)との対;抗シナプトフィジン(50倍;DAKO)と抗神経フィラメント(25倍;DAKO)との対;抗ラミニン(25倍;DAKO)と抗CD68(50倍;DAKO)との対;抗赤色/緑色オプシン(100倍;Santa Cruz Biotechnology,アメリカ)と抗ロドプシン(200倍;Santa Cruz Biotech)との対;抗青色オプシン(100倍;Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,CA,アメリカ)と抗ロドプシン(200倍;Santa Cruz Biotech)との対。この実験で使用した抗体の特異性を表5に列挙する。
Figure 0005739487
回転しながら4℃で一晩のインキュベーション後、切片をPBTAでリンスし、二次抗体と共に4℃で一晩再度インキュベートした。Cy2またはCy3(Dianova,.Hamburg,ドイツ)と抱合した一次抗体の各組み合わせのためにロバ抗マウス二次抗体およびロバ抗ウサギ二次抗体を使用した。全ての二次抗体を100倍希釈で使用し、全ての抗体をPBTAで希釈した。次いで、切片をリンスし、N−没食子酸プロピルを含むグリセロール中にマウントし、レーザー走査型共焦点顕微鏡(LSM510,Zeiss,ドイツ)で観察した。
(結果)
(a)走査型電子顕微鏡法
25μgマイクロプラスミンの硝子体内注射の1日後、疎らなコラーゲン原線維がILMを覆った(図8、パネルA)。治療3日後、25μgマイクロプラスミンにより完全な硝子体網膜分離が認められた(図8、パネルB);硝子体網膜境界上に残存するコラーゲン原線維の断片は存在しなかった。14.5μgのマイクロプラスミンを投与した眼は、注射3日後にILMを覆う疎らなコラーゲン原線維が明らかであった(図8、パネルC)。処置21日後、14.5μg(図8、パネルD)および25μgのマイクロプラスミン(図8、パネルE)では、露呈したILMが認められた。全ての他方のコントロール眼は、網膜を覆った密集したコラーゲン原線維網が認められた(図8、パネルF)。これらのデータを、表6にまとめる。
Figure 0005739487
(b)光学顕微鏡法および透過型電子顕微鏡法
網膜の細胞構築に関して、マイクロプラスミン処置眼(図9、パネルA)とコントロール眼(図9、パネルB)との間に相違は認められなかった。マイクロプラスミン処置眼の内部網膜およびILMの超微細構造(図9、パネルCおよびE)は、コントロール眼の内部網膜およびILM(図9、パネルDおよびF)と比較して十分に保存されていた。
(c)レーザー共焦点顕微鏡法
マイクロプラスミン処置眼およびコントロール眼では、ミューラー細胞の末端部分は、抗GFAP(図10、パネルAおよびB)および抗ビメンチン(図10、パネルCおよびD)で明白に標識された。内顆粒層上のミューラー細胞プロセスの広範な染色は存在しなかった。抗IV型コラーゲンおよび抗フィブロネクチンを使用して有意な染色は認められなかった(データ示さず)。これは、これらの抗体の種特異性に関し得る。ILMは、抗ラミニンによって染色された。処置眼およびコントロール眼の両方でマクロファージはほとんど存在しなかった。神経節細胞の軸索および樹状突起、水平細胞、ならびに内網状層および外網状層は、抗神経フィラメントおよび抗シナプトフィジンによって明白に標識された(図10、パネルEおよびF)。光受容細胞層は、抗神経フィラメントによって標識された。任意の使用抗体に関して、いかなる研究の測定点においてもマイクロプラスミン処置眼(パネルA、C、E)とコントロール眼(図10、パネルB、D、およびF)との間に相違は存在しなかった。
(考察)
in vivoでの硝子体網膜境界におけるマイクロプラスミンの除去効果を評価するために、2つの異なる用量を5頭の成体ネコの硝子体腔に投与した。第1の使用用量は、ヒト死後眼における完全なPVDの誘導に十分であることが見出された用量の1/5である25μgのマイクロプラスミンであった。明らかに、25μgのマイクロプラスミンは0.4Uのプラスミン(Sigma)に等価であり、臨床的に0.4Uの自己プラスミンを黄斑円孔および糖尿病網膜症を罹患したヒトの眼の硝子体腔に適用した。ネコの眼のより小さな硝子体体積のために調整する場合(ヒト眼の硝子体体積の約60%)、第2の用量である14.5μgのマイクロプラスミンは、ヒト眼において25μgのマイクロプラスミンの用量に等価である。
ネコ眼における25μgマイクロプラスミンの硝子体内投与から3日後に、完全な硝子体網膜分離が存在するのに対して、処置から1日後では硝子体網膜境界に幾らかのコラーゲン原線維が依然として存在していた。これは、マイクロプラスミンの効果が24時間を超えて継続し、その天然のアゴニストであるα−2−抗プラスミンによる血中プラスミノゲンの急速な不活化と非常に対照的であることを示す。マイクロプラスミン活性の寿命についての1つの理由は、α−2−抗プラスミンが別の基質によって飽和するかマイクロプラスミンがプラスミンと比較して抗プラスミンアンタゴニストに対する親和性が異なることであり得る。別の可能性のある理由は、α−2−抗プラスミンによってマイクロプラスミンが不活化された後にマイクロプラスミンの経路の下流(例えば、コラゲナーゼまたは基質金属プロテイナーゼの活性化)が活性なままであることであり得る。
マイクロプラスミン処置眼の網膜の細胞構築はコントロールと比較して変化しなかった。超微細構造に関して、マイクロプラスミン処置眼とコントロール眼との間に網膜の解剖学的性質の相違は存在しなかった。ILMおよび網膜は、全ての試料で十分に保存された。さらに、マイクロプラスミン注射後にいかなる炎症反応の徴候も認められなかった。詳細には、電子顕微鏡法およびレーザー供焦点顕微鏡法では、網膜の炎症性細胞浸潤のいかなる証拠も認められなかった。
ネコモデルでは、網膜剥離により、ミューラー細胞が有意に増殖し、その細胞質中の中間フィラメントタンパク質(グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)およびビメンチンなど)が大量に上方制御される。このミューラー細胞応答は、グリオーシスとして広く公知であり、網膜の剥離に対する複雑な細胞応答で重要な役割を果たすと考えられる。正常な網膜では、ミューラー細胞は休止しており、非常に少量のGFAPおよびビメンチンを発現する。しかし、網膜剥離を誘導しない硝子体切除でさえもGFAPの上方制御を生じると示された。本発明者らのグループによる最近の研究は、ネコ眼におけるILMの意図する剥離後の中間フィラメントタンパク質の顕著な上方制御を証明した(未公開データ)。これらのデータは、外科手術による外傷の任意の形態に対するミューラー細胞の高い反応性を示す。
本研究では、マイクロプラスミンによるPVD誘導後にミューラー細胞反応性のいかなる変化も認められなかった。さらに、いかなる適用抗体に関しても処理眼とコントロール眼との間に相違は存在しなかった。網膜の変化しない超微細構造および免疫反応性に関連する研究の任意の測定点のミューラー細胞の休止状態により、PVD誘導におけるマイクロプラスミンの安全性を示す実験的証拠が得られる。
要するに、これらの研究は、マイクロプラスミンはin vivoでのPVDの誘導に有効であることを示す。さらに、これらの研究は、超微細構造レベルで網膜の変化が認められないという点でマイクロプラスミンは安全なようであることを示す。
動的光散乱の使用によるブタ硝子体に対するマイクロプラスミンの効果の評価
非浸襲性動的光散乱(DLS)技術を使用したin vivoおよびin situでの新鮮な死後ブタ網膜に対するμPiの生物物理学的効果を特徴づけるためのマイクロプラスミン(μPi)の効果を評価するために、本研究を行った。DLSにより、散乱光の強度における時間関数測定によって溶液および懸濁液中の粒子および高分子の力学に関する情報が得られる。
DLS実験では、流動物中に懸濁した小粒子集団を光が通過する場合、非常に離れた場所に絶えず変動する斑点パターンが認められる(Chu B.,Laser light scattering:Basic prinicples and practice,Academic Press,New York,1991を参照のこと)。この斑点パターンは、光路中の干渉の結果であり、これは、散乱媒質中の粒子が、粒子自体と流動物の分子との間の衝突に起因する1μ秒以上のタイムスケールで無作為に運動する(ブラウン運動)につれて変動する。粒子−粒子相互作用の非存在下で(希釈懸濁液)、小粒子から散乱した光が急速に変動し、大粒子から散乱した光はより遅く変動する。
本研究のために構築したDLS装置により、拡散係数、サイズ、散乱強度、および多分散性(不均一性の測定)などの力学情報が得られる。一般に、粒子サイズの増加(nmから数ミクロンまで)およびこれらの粒子の数または密度の増加により、散乱光強度が増加する。多分散性は、異なるサイズの種の異なる群の数の測定である。DLS測定では、異なるタイムスケールで分散するので(小粒子はより早く、より大きなものはより遅く移動する)、サイズの異なる3群までを同定することができる。したがって、散乱光の強度および多分散性の変化は、粒子サイズデータを補足することができる。薬理学的介入後に硝子体粒子サイズが減少して散乱光強度が増加する場合、より大きな分子種の破壊および/またはこれらの実験の場合の固有の硝子体構造によってあらかじめ排除された20nmポリスチレンナノスフェアの流入のいずれかに起因する溶液中のより小さなサイズの分子種数がおそらく増加する。多分散性が増加する場合、サンプル中の分子種集団中の均一性が増加すると説明される可能性が最も高く、あらかじめ排除した20nmポリスチレンナノスフェア流入をさらに示す。DLSの最も魅力的な特徴は、非浸潤性且つ定量的であり、数nmから数μmまで範囲のサイズで有効に作用し、小サンプル体積のみを必要とし、多分散系または複数のサイズ(2〜3成分まで)の分散液のために妥当に十分に作用することである。本明細書中に示すデータを、Brookhaven Instruments,NYから入手した累積サイズおよび指数サイズ拡散ルーチンを使用して分析した。これらのスキームは、Stock R.S.and Ray W.H.,J.Polym.Sci.23:1393,1985に概説されている。例として、図11は、全ブタ硝子体(多分散系)および直径20nmのポリスチレンナノスフェア溶液(単分散系)についての時間自己相関関数またはTCFに関する典型的なDLS測定を示す。
(方法と材料)
(a)硝子体研究のためのDLS装置の組み立て
本明細書中に記載の硝子体研究のために新規の小型DLS光ファイバープローブ(米国特許第5,973,779号)を組み立てた。これは、1対の0.25ピッチのSelfocGRINレンズから構成され、侵入度が〜16mmであり、散乱角が160°である。2つの単一モードの光ファイバーおよび2つのGRINレンズを含む光ファイバープローブにより、眼における高分子の力学的特徴の研究のための小型のリモコン手段が得られる。それぞれステンレススチール性フェルールに格納された2つの単一モードの光ファイバーを個別のステンレススチールハウジングにマウントする。散乱体積中の強く集中した点を得るためにファイバーハウジングとレンズハウジングとの間に意図的に空気ガスを残す。そのハウジング中の2つの光ファイバーを整列させ、マイクロレンズと軸外の位置に固定する。2つのハウジングを、ステンレススチール製の第3の(外側の)ハウジングの内側に入れ、ハウジングの後部を熱収縮チューブで覆う。レーザーおよび光検出器モジュールとの容易な合わせのために、光ファイバーの2つの自由端をEC/PC型オス・コネクタで終端処理を行った。
実験装置の主な構成要素は、DLS小型光ファイバープローブ(上記)、デジタル相関カード(BI−9000 Brookhaven Instruments NY)を含むコンピュータ(Gateway PC500S)、波長635nmの1mW固体レーザ(OZ Optics,Canada)、およびアバランシェフォトダイオード検出器(Perkin Elmer,Canada)からなる。プローブを、プローブにアクセスして眼内の所望の位置に向かうように手作業で制御した翻訳ステージを介して接続した光学アセンブリ上にマウントする。
各一過性自己相関関数(TCF)は、回収に20秒かかる(1分間を要するフィルタリングキュベット研究を除く)。全測定のために5μ秒の遅延時間を一定に保持した。硝子体研究の開始前に、ポリスチレン標準(直径20nmのラテックスナノスフェア)の水性分散物の使用によって、装置を、その安定性、信頼性、および再現性について十分に試験した。
(b)硝子体の動的光散乱および粘度の問題
DLSは、溶液(この場合、硝子体)中に懸濁する粒子の平均直径を非侵襲性で客観的に定量することができる。粒子サイズを正確に計算するために、溶媒の粘度を知るか推測することが必要である。前に記載のように、現在非ニュートン流体の粘度を正確に測定することができないので、仮定しなければならない。硝子体が約99%の水を含む場合、硝子体の粘度を水の粘度とすることが妥当である。この仮定の妥当性を試験するために、全硝子体ゲル、濾過器を通過しない硝子体の亜分画(ゲル)、濾過器を通過する硝子体の亜画分(非ゲル)、および0.22μm Milliporeフィルターを通過した硝子体の亜画分(液体硝子体)についてDLSを測定した。光学キュベット中でこれらの研究を行い、極めて均一な既知の直径の拡散20nmポリスチレンナノスフェアをトレーサーとして添加した。全硝子体および全ての異なる亜画分におけるDLS測定により、硝子体の微小粘度(microviscosity)が実際に純粋のそれに非常に近いことを示す類似の結果が得られた。硝子体の微小粘度は、ヒアルロナン(HA)分子およびコラーゲン線維束が懸濁した捕捉された水の粘度をいう。HA分子のブラウン運動は、HA分子と比較してわずかにサイズが大きいコラーゲン線維束よりもはるかに速い。DLSスペクトルでは、HA分子情報をより速い(短い)遅延時間で組み込み、コラーゲンはより遅い(長い)遅延時間で組み込む。得られた情報を、粒子サイズ分布に示す。
(c)試薬
BSSPLUS(登録商標)(ALCON Labs,Ft.Worth,TX)を使用して全ての溶液を調製した。マイクロプラスミンを、4mg/mlストック溶液の濃度で使用した。直径20nmであり且つ二重蒸留脱イオン水に懸濁したポリスチレンナノスフェア(Bangs Laboratories,Fishers,IN)を、全サンプル中のナノスフェア数が確実に一定になる固定比で全サンプル中に添加した。
(d)オープンスカイモデル(Open Sky Model)
新鮮な非固定ブタ眼(n=11)を、扁平面切開を介して後部セグメントを切開し、前部硝子体から離れてレンズ/虹彩絞りを鋭く切開した。この組織を切開することなくできるだけ水晶体後面の近くに切片を運んだ。眼を、以下の後部セグメントと共にホルダーに維持した。
試料を、60μLの20nmポリスチレンナノスフェア溶液を含む溶液(300μl)を露呈した硝子体の前面に注ぐことによって、コントロールおよび0.08、0.125、0.4、0.6、および0.8mgの用量のμPiを用いて室温で処置した。硝子体/空気境界より1、2、および4mm下に存在する中心光軸に沿った単一のポイントでDLSを行った。15分毎に90〜360分間DLSを読み取った。
(e)眼閉鎖モデル(Closed Eye Model)
インタクトなブタ眼(n=39)の扁平部での穿刺切開を介して30Gニードルを使用して、ポリスチレンナノスフェアおよび0.0125、0.0025、0.05、0.125、0.25、0.5、0.6、および0.8mgのμPiを含む300μLの実験溶液およびコントロール溶液を注射した。眼を、角膜を上にし且つ後部を下にして(仰臥位の模倣)保持したホルダー中にて37℃で30分間または120分間インキュベートした。眼を温度制御水浴中に入れる前(常に試料と水との間のいかなる接触も回避する)およびその後15分毎に、眼をほぼ光軸に対して10〜15秒間回転させた。インキュベーション後、扁平部切開を介して眼の前部を切開した。硝子体/空気境界の後ろの深さ4mmの光軸(平均=18.6、s.d.=11.8)および水平軸(平均=30.8ポイント、d.d.=18.0)に沿ったいくつかのポイントでDLSを行った。
(結果)
(a)ブタ硝子体の分子形態学
アイカップ(eye cup)(前部を切開して除去したもの)の光軸に沿った複数のポイントから得た全(インタクトな)硝子体のDLS測定により、空気−硝子体境界の1.25mm〜4.75mm下の全てのポイントで非常に類似した所見が証明された。これらの所見はまた、キュベットに入れた切開した全硝子体、濾過後に保持された残存硝子体、および濾過器を通過した硝子体の亜画分で得られた所見と類似している。全てほぼ同一の粒子サイズ分布を示した。より大きな粒子サイズの群(右側)の平均サイズは約1000nmであり、主にコラーゲンを示す。より小さな粒子サイズ分布(左側)は主にヒアルロナン(HA)を示す。この粒子サイズ分布パターンは、ポリスチレンナノスフェア注射を受けた眼で同一であった。
(b)オープンスカイモデル
図12は、比較のために、5つの異なるブタ眼中の空気/硝子体境界から4mm下のポイントおよび20nmポリスチレンナノスフェア溶液から得たTCFを示す。μPi用量が増加するにつれて遅い成分(より大きな分子種)の消滅と共にTCFの勾配が減少し、最終的に20nmナノスフェアのみ(すなわち、全てがより小さいサイズの分子種)のTCFに近づくことが認められる。
室温で種々の溶液での処置後の深さ1mmでのDLS測定(n=5)の結果:偽薬および0.08mgは全体として本質的に同一であった。0.125mgの用量を使用して、210分後の全平均粒子サイズは約1/3に減少した。60分後に平均粒子サイズは約80%減少し、0.6mgでの平均粒子サイズはほぼ完全に減少した(20nmポリスチレンナノスフェアのみが検出された)。
空気/硝子体境界から2mm下の測定では(n=3)、180分後に全平均粒子サイズは約1/3に減少した(データ示さず)。37℃での試料のインキュベーションおよびDL5測定時のその温度の維持により、2つの異なる時間での2つの異なる眼において0.5mgμPiで60分間での処置後の全平均粒子サイズは40%減少した。これら全ての試料についての全強度の測定および多分散性の測定により、粒子サイズ決定が支持および裏付けられた。
(c)眼閉鎖モデル
0.0125〜0.8mgの用量範囲のμPiとの37℃で30分間のインキュベーション後、光軸および水平軸の両方に沿って有意な変化は存在しなかった。光軸では、最も高用量の0.8mgで正規化平均粒子サイズは1/7に減少した。0.125mgの用量では、30分後に正規化平均粒子サイズは約1/3に減少した。最も低用量の0.0125mgではいかなる有意な効果も認められないようであった。全範囲の用量と通して、粒子サイズの減少はμPiの用量に反比例した(相関係数=0.93)。データを、線形(直線)フィッティングルーチンに適合させた。正規化全強度および多分散性プロットにより、このデータの信頼性がされに支持される。粒子サイズ分散は、漸増用量のμPiを使用して、粒子サイズ分布の左側への有意なシフトを証明する。これにより、μPiは、種々の化学結合の有意な脆弱化および破壊ならびに硝子体高分子構造の溶解に有効であることが示唆される。
0.0125〜0.6mgの用量範囲のμPiとの37℃で2時間のインキュベーション後にも有意な変化が存在した。最も高い用量では、光軸に沿って測定した正規化平均粒子サイズが87.5%減少した。正規化散乱強度および正規化多分散性プロットによりこのデータが裏付けされる。粒子サイズ分布は、用量の漸増に伴う左へのシフトを示し、より高い用量で有意な比率が達成された。4mm下の水平軸に沿ったDLS測定によって、正規化平均粒子サイズが約85%減少し、正規化散乱強度および多分散プロットにおける支持される所見が得られる類似の結果が示された。
30分後および2時間後の結果の比較により、インキュベーションが長くなるにつれて粒子サイズの破壊度がより高いことが証明された。0.6mgの用量で正規化平均粒子直径は30分間のインキュベーションで約20%であり、2時間のインキュベーションで約10%と見なされた。したがって、インキュベーションが長くなるにつれて粒子サイズが約1/2未満に減少した。
DLS測定由来の主なパラメーターは、拡散係数である。拡散係数の変化は、μPiに応答した硝子体の高分子構造の変化を示す。μPi用量の増加により、硝子体の拡散係数が増加する。μPiの用量範囲にわたり、拡散係数はμPi用量に正比例する。したがって、μPiの増加によって拡散係数が増加し、粒子サイズ決定と同様に、この相関は統計的に有意であった(r=0.93)。
(考察)
この実験では、DLSを使用して、粒子サイズ、散乱強度、および多分散性の測定によって硝子体の分子構造を非浸襲的に評価した。結果は、全硝子体内の硝子体の位置において類似のDLSプロフィールが認められることを示した。マイクロプラスミンの最も顕著な効果は、特により高い用量で37℃で30分間インキュベートした全硝子体に対する効果であった。正規化平均粒子サイズが実質的に減少し、統計的に有意な用量−応答関係が確立された。これにより、現在の手術実施を妨害しない薬物効果に30分の時間枠が妥当であるので、μPiが硝子体−網膜手術のためのアジュバントとして有用であることが示唆される。μPiが硝子体−網膜境界の裂開を誘導することが示唆される前の実施例のデータと組み合わせて、この薬物は、以下の2つの薬理学的硝子体融解の所望の成分が達成されるようである:後部硝子体剥離および硝子体高分子の破壊、ならびにその後の硝子体の拡散係数の増加および最終的な液化。
外科的硝子体切除のアジュバントとしてのマイクロプラスミン
外科的硝子体切除を必要とする硝子体網膜疾患を示す患者を、外科的硝子体切除手順の前にマイクロプラスミン注射で処置する。患者は、眼の健康のベースラインを確立するために全眼科試験を受けるべきである。眼科試験には、間接的検眼鏡検査、スリットランプ生体顕微鏡法、網膜周辺部試験、眼圧測定、視力(裸眼視力および矯正視力)、徴候学、眼底撮影法、フルオレセイン血管造影法、網膜電図写真、およびAスキャン測定が含まれる。
硝子体切除の30分前までまたは1日前までに、処置すべき眼に0.025〜0.125mgのマイクロプラスミンを含む0.2mlの眼内灌流溶液または硝子体液化の促進および/または後部硝子体剥離の誘導のためのBSSPLUS(登録商標)または他の灌流溶液を注射する。
硝子体液化および/または後部硝子体剥離の促進により、医原性網膜外傷および外科合併症のリスクを抑えて外科的硝子体切除をより迅速且つ容易に実施することができる。より完全な硝子体の除去により、増殖性硝子体網膜症などの術後合併症のリスクを減少させることもできる。
マイクロプラズマを使用した糖尿病性網膜症の治療
本実施例では、糖尿病性網膜症を発症した糖尿病患者を、マイクロプラスミンの硝子体内注射によって処置する。
糖尿病患者は、眼の健康のベースラインを確立するために全眼科試験を受けるべきである。眼科試験には、間接的検眼鏡検査、スリットランプ生体顕微鏡法、網膜周辺部試験、眼圧測定、視力(裸眼視力および矯正視力)、徴候学、眼底撮影法、フルオレセイン血管造影法、網膜電図写真、およびAスキャン測定が含まれる。
予備試験後、患者の罹患した眼にマイクロプラスミンの硝子体内注射を行う。両眼が作用した場合、個別に処置することができる。処置すべき眼に0.005〜0.125mgのマイクロプラスミンを含む0.05〜0.2mlの硝子体液化の促進および/または後部硝子体剥離の硝子体内誘導のためのBSSPLUS(登録商標)または他の灌流溶液を注射する。
処置後、患者の眼を定期的に試験すべきである。患者によって示される糖尿病性網膜症の範囲を、静脈出血、IRMA、網膜虚血、牽引性網膜剥離、硝子体出血、硝子体切除の必要性、または糖尿病性網膜症の他の合併症の範囲をモニタリングするための定期的網膜試験およびフルオレセイン血管造影図によって継続的にモニタリングする。
死後ブタ眼におけるフルオレセイン拡散速度に対するプラスミンと比較したマイクロプラスミンの効果
マイクロプラスミンは、全長プラスミンの分子量の約1/3である。そのより小さなサイズにより、マイクロプラスミンは、プラスミンよりも硝子体内でより迅速に拡散すると予想される(Xu,J.et al.,前出)。より迅速な拡散により、より迅速な薬理学的効果が誘導されると予想される。マイクロプラスミンがプラスミンより迅速に拡散することおよびマイクロプラスミンが硝子体ゲルを変化させることができることの両方を確認するために本研究を行った。
(方法)
食肉処理場から得た新たに単離したブタ眼を使用した。第1の実験では、一方の眼にマイクロプラスミン(0.125mg)を注射し、他方の眼に賦形剤コントロール(BSS−PLUS(登録商標))を注射した。室温で2時間両眼の維持後、両眼にフルオレセインを注射し、さらに30分間インキュベートした。0、10、20、および30分後に写真撮影を行った。
第2の実験では、眼にマイクロプラスミン0.125mg(N=2)またはプラスミン1U(Sigmaから販売、N=2)を注射し、37℃で2時間インキュベートした。対で、4つ全ての眼にフルオレセインを注射し、さらに30分間インキュベートし、0、10、20、および30分後に写真撮影を行った。
(結果)
第1の実験では、コントロール眼は事実上硝子体内フルオレセイン拡散は認められなかった(データ示さず)。しかし、マイクロプラスミン処置眼では、明らかなフルオレセイン拡散が認められた(データ示さず)。
第2の実験では、マイクロプラスミン処置眼は、20分にわたりフルオレセイン拡散が14%および16%であり(図13)、プラスミン処置眼の蛍光拡散は10%減少した(図14)。
(考察)
マイクロプラスミンは、賦形剤コントロールと比較してフルオレセイン分散の明らかな促進を証明した。さらに、マイクロプラスミンの分子量の分子量に基づいて予想したところ、このフルオレセイン拡散は、全長プラスミン投与で認められた拡散よりも範囲が広い。この所見は、マイクロプラスミンはプラスミンよりも迅速に拡散するという予測を支持する。これらの所見は、より迅速に薬理学的効果が得られる臨床的利点を有し得る。

Claims (17)

  1. マイクロプラスミンを含み、患者の眼における硝子体の粘度の減少、硝子体の液化、後部硝子体剥離の誘導、硝子体及び/若しくは房水由来の出血の除去若しくは減少、硝子体及び/若しくは由来の眼球内異物の除去若しくは減少、硝子体液及び/若しくは房水に投与した薬剤若しくは組成物の拡散の増加、又は網膜外新血管形成の減少に用いるための組成物。
  2. 前記マイクロプラスミンは、安定化マイクロプラスミン、組換えマイクロプラスミン安定化組換えマイクロプラスミン、およびセリンプロテアーゼ触媒活性を有するマイクロプラスミンの変異型から選択される、請求項1記載の組成物。
  3. 前記眼は、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血眼内炎、未熟児網膜症網膜色素変性症、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される疾患を有する、請求項1又は2記載の組成物。
  4. 前記治療又は予防は、硝子体切除を用いずに行われ、又は硝子体切除の補助として行われる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
  5. 前記マイクロプラスミンの有効量が0.005mg〜0.2mg/眼の範囲である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
  6. 更に第2の薬剤を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
  7. 前記第2の薬剤が、眼の障害又は眼の障害の合併症の治療又は予防に有用なTPCD以外のタンパク質、化学物質、又は他の物質である、請求項6記載の組成物。
  8. 前記第2の薬剤が、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼAC、コンドロイチナーゼB、コンドロイチン4−スルファターゼ、コンドロイチン6−スルファターゼ、B−グルクロニダーゼ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、RGD含有ペプチド、エキスタチン、ファルボリジン、抗インテグリン抗体、P2Y受容体アゴニスト、尿素、ヒドロキシ尿素、チオ尿素、血管形成インヒビター、VEGFインヒビター、及びPlGFインヒビター、並びにその任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項6又は7記載の組成物。
  9. 前記VEGFインヒビターが、抗VEGF抗体、VEGFアプタマー、又は可溶性VEGF受容体である、請求項8記載の組成物。
  10. 前記PlGFインヒビターが、抗PlGF抗体、PlGFアプタマー、又は可溶性VEGF受容体である、請求項8記載の組成物。
  11. 前記組成物が溶液である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物。
  12. 前記組成物がヒト用である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物。
  13. 前記マイクロプラスミンがヒトマイクロプラスミンである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の組成物。
  14. 前記マイクロプラスミンは、SEQ ID NO.10の543〜791アミノ酸の二本鎖ポリペプチドからなり、且つArg561とVal562との間のペプチド結合がプラスミノーゲン活性化因子により開裂している、請求項1〜13のいずれかに記載の組成物。
  15. 前記マイクロプラスミンは、活性化マイクロプラスミノーゲンであり、該マイクロプラスミノーゲンは、SEQ ID NO.3によりコードされる、請求項1〜14のいずれかに記載の組成物。
  16. 前記マイクロプラスミンは、メチロトローフ酵母における組み換え体の発現によって産生される、請求項1〜15のいずれかに記載の組成物。
  17. 前記メチロトローフ酵母はピキア・パストリス(Pichia Pastoris)である、請求項16記載の組成物。
JP2013160571A 2002-12-06 2013-08-01 薬理学的硝子体融解 Expired - Fee Related JP5739487B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0228409.9 2002-12-06
GBGB0228409.9A GB0228409D0 (en) 2002-12-06 2002-12-06 Pharmacological vitreolysis

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2004559328A Division JP5426063B2 (ja) 2002-12-06 2003-12-05 薬理学的硝子体融解

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015060570A Division JP5996026B2 (ja) 2002-12-06 2015-03-24 薬理学的硝子体融解

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2013241448A JP2013241448A (ja) 2013-12-05
JP5739487B2 true JP5739487B2 (ja) 2015-06-24

Family

ID=9949140

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2004559328A Expired - Fee Related JP5426063B2 (ja) 2002-12-06 2003-12-05 薬理学的硝子体融解
JP2010128670A Expired - Fee Related JP5451533B2 (ja) 2002-12-06 2010-06-04 薬理学的硝子体融解
JP2013160571A Expired - Fee Related JP5739487B2 (ja) 2002-12-06 2013-08-01 薬理学的硝子体融解
JP2015060570A Expired - Fee Related JP5996026B2 (ja) 2002-12-06 2015-03-24 薬理学的硝子体融解

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2004559328A Expired - Fee Related JP5426063B2 (ja) 2002-12-06 2003-12-05 薬理学的硝子体融解
JP2010128670A Expired - Fee Related JP5451533B2 (ja) 2002-12-06 2010-06-04 薬理学的硝子体融解

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015060570A Expired - Fee Related JP5996026B2 (ja) 2002-12-06 2015-03-24 薬理学的硝子体融解

Country Status (25)

Country Link
US (11) US7547435B2 (ja)
EP (3) EP2327416B1 (ja)
JP (4) JP5426063B2 (ja)
CN (1) CN100577202C (ja)
AT (1) ATE534400T1 (ja)
AU (1) AU2003300821C1 (ja)
BE (1) BE2013C055I2 (ja)
BR (2) BRPI0310144A8 (ja)
CA (1) CA2508606C (ja)
CY (2) CY1112561T1 (ja)
DK (1) DK1581254T3 (ja)
ES (2) ES2377965T3 (ja)
FR (1) FR13C0052I2 (ja)
GB (1) GB0228409D0 (ja)
HK (1) HK1082419A1 (ja)
HU (1) HUS1300040I1 (ja)
IL (3) IL169008A (ja)
LU (1) LU92273I2 (ja)
MX (1) MXPA05006038A (ja)
NO (4) NO333837B1 (ja)
NZ (1) NZ541075A (ja)
PT (2) PT1581254E (ja)
SI (1) SI1581254T1 (ja)
WO (1) WO2004052228A2 (ja)
ZA (1) ZA200505193B (ja)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7152975B2 (en) * 2000-11-10 2006-12-26 Cooper Vision, Inc. Junctionless ophthalmic lenses and methods for making same
GB0228409D0 (en) 2002-12-06 2003-01-08 Thromb X Nv Pharmacological vitreolysis
PT1740698E (pt) 2004-04-22 2010-11-02 Talecris Biotherapeutics Inc Plasmina modificada por recombinação
JP4796787B2 (ja) * 2005-04-28 2011-10-19 富士フイルム株式会社 ラビリンチュラ類への遺伝子導入法
US20060257391A1 (en) * 2005-05-11 2006-11-16 Bausch & Lomb Incorporated Non-surgical method for preventing or reducing the rate of the progression of non-proliferative diabetic retinopathy and the treatment of other ocular conditions
WO2007005856A1 (en) * 2005-06-30 2007-01-11 Ista Pharmaceuticals, Inc. Use of hyaluronidase in combination with plasmin for the induction of posterior vitreous detachment
WO2007047874A2 (en) * 2005-10-20 2007-04-26 Talecris Biotherapeutics, Inc. Recombinantly modified plasmin
US20070134231A1 (en) * 2005-12-13 2007-06-14 Jani Dharmendra M Method for prolonging activity of autodegradable enzymes and compositions thereof
US20070134230A1 (en) * 2005-12-13 2007-06-14 Jani Dharmendra M Method for prolonging activity of autodegradable enzymes
US20070196350A1 (en) * 2006-02-22 2007-08-23 Bartels Stephen P Compositions and Methods for Effecting Controlled Posterior Vitreous Detachment
US20070212358A1 (en) * 2006-03-10 2007-09-13 Bartels Stephen P Compositions and Methods for Effecting Controlled Posterior Vitreous Detachment
US20090285826A1 (en) * 2006-05-04 2009-11-19 Fovea Pharmaceuticals Sa Combination drugs comprising vegf inhibitor and serine proteases/thrombolytic compounds for treating neovascular disorders
US8101394B2 (en) 2007-11-29 2012-01-24 Grifols Therapeutics Inc. Recombinantly modified plasmin
WO2009093970A1 (en) * 2008-01-22 2009-07-30 Omnio Healer Ab Method of improving wound healing
ES2441966T3 (es) * 2008-03-31 2014-02-07 Scarcell Therapeutics Procedimiento para el tratamiento cosmético del fotoenvejecimiento de la piel
UA103771C2 (ru) 2008-06-04 2013-11-25 Грифолз Терапьютикс Инк. Стрептокиназа, активирующая плазмин, способ и набор для получения плазмина
JP5789521B2 (ja) 2009-03-03 2015-10-07 グリフオルス・セラピユーテイクス・インコーポレーテツドGrifols Therapeutics,Inc. プラスミノーゲンを製造するための組成物、方法およびキット;ならびにそれから製造されるプラスミン
US8858924B2 (en) * 2009-03-26 2014-10-14 Warsaw Orthopedic, Inc. Compositions and methods for treatment of hemorrhage
CN102482338B (zh) 2009-07-10 2016-09-28 斯路姆基因公司 纤溶酶原和纤溶酶的变体
US20120189609A1 (en) 2009-08-28 2012-07-26 Thrombogenics Nv Improvement to trabeculectomy
US20110135626A1 (en) * 2009-12-08 2011-06-09 Alcon Research, Ltd. Localized Chemical Lysis of Ocular Tissue
MX337248B (es) 2011-01-05 2016-02-19 Thrombogenics Nv Variantes de plasminogeno y plasmina.
CA2839735A1 (en) * 2011-06-17 2012-12-20 Yong-xin LI D-serine for the treatment of visual system disorders
US9644196B2 (en) 2011-08-12 2017-05-09 Thrombogenics Nv Plasminogen and plasmin variants
RU2484795C2 (ru) * 2011-08-18 2013-06-20 Федеральное государственное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" Способ индукции задней отслойки стекловидного тела с помощью миниплазмина
ES2628321T3 (es) 2011-12-01 2017-08-02 Thrombogenics N.V. Mejora del resultado de una trabeculectomía
CN103205410B (zh) * 2012-01-13 2018-03-06 蔺莹莹 重组微纤维蛋白溶酶及其制备方法和应用
CA2871528A1 (en) 2012-04-24 2013-10-31 Thrombogenics N.V. Anti-pdgf-c antibodies
WO2014160281A2 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 Wayne State University Method of enhancing delivery of therapeutic compounds to the eye
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
US9459201B2 (en) 2014-09-29 2016-10-04 Zyomed Corp. Systems and methods for noninvasive blood glucose and other analyte detection and measurement using collision computing
FR3034992A1 (fr) 2015-04-15 2016-10-21 Arcadophta Milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et procede d'obtention
TWI653981B (zh) 2015-12-18 2019-03-21 深圳瑞健生命科學硏究院有限公司 Use of plasminogen for the preparation of a medicament for preventing or treating a condition associated with diabetic nerve injury
JP6682008B2 (ja) 2015-12-18 2020-04-15 タレンゲン インターナショナル リミテッドTalengen International Limited 糖尿病性腎症を予防及び治療するための方法
CN108463240A (zh) * 2015-12-18 2018-08-28 泰伦基国际有限公司 一种预防或治疗糖尿病性视网膜病变的方法
WO2017117464A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Kodiak Sciences Inc. Antibodies and conjugates thereof
RU2619991C1 (ru) * 2016-02-18 2017-05-22 Павел Владимирович Лыскин Способ лечения витреомакулярного тракционного синдрома
CA3013808A1 (en) 2016-03-10 2017-09-14 Thrombogenics Nv Posterior ocular fibrosis inhibition by antagonizing placental growth factor
US9554738B1 (en) 2016-03-30 2017-01-31 Zyomed Corp. Spectroscopic tomography systems and methods for noninvasive detection and measurement of analytes using collision computing
TWI642442B (zh) 2016-12-15 2018-12-01 深圳瑞健生命科學硏究院有限公司 纖溶酶原在製備降低胰高血糖素分泌的藥物上的用途
JP6766253B2 (ja) 2017-03-28 2020-10-07 森永乳業株式会社 新規ビフィドバクテリウム属細菌
RU2674926C1 (ru) * 2018-02-01 2018-12-13 Федеральное государственное автономное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАУ "НМИЦ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Способ оценки эффективности витреолизиса помутнений стекловидного тела
AU2019227997A1 (en) 2018-03-02 2020-09-24 Kodiak Sciences Inc. IL-6 antibodies and fusion constructs and conjugates thereof
CN110361242B (zh) * 2019-08-14 2022-01-18 武汉赛维尔生物科技有限公司 一种用于眼球组织的固定液以及眼球组织制片的预处理方法
AU2020364071A1 (en) 2019-10-10 2022-05-26 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US658972A (en) * 1900-04-09 1900-10-02 Interchangeable Brake Beam Company Brake-beam.
US2624691A (en) 1946-04-22 1953-01-06 Parke Davis & Co Fibrinolysin derived from blood and methods of obtaining the same
DK98833C (da) 1961-04-25 1964-05-25 Novo Terapeutisk Labor As Fremgangsmåde til stabilisering af terapeutisk anvendelige plasminopløsninger.
US3234106A (en) 1962-12-03 1966-02-08 Cutter Lab Soluble, purified profibrinolysin and fibrinolysin and method of producing same
US3950513A (en) 1965-12-03 1976-04-13 Novo Terapeutisk Laboratorium A/S Process of stabilizing therapeutically useful plasmin solutions
IT1194135B (it) 1981-01-05 1988-09-14 Novo Industri As Composizioni di plasmina stabilizzata e metodo per la loro preparazione
GB8504025D0 (en) 1985-02-16 1985-03-20 Biopharm Ltd Hyaluronidase
US4774087A (en) 1987-08-14 1988-09-27 Northwestern University Micro-size fibrinolytic plasmin
US5288485A (en) 1989-08-31 1994-02-22 Kao Corporation Vasodilating agent
ZA912770B (en) 1990-04-16 1992-01-29 Bethesda Eye Inst Enzymatic disinsertion of vitreous body
US5288489A (en) * 1991-08-28 1994-02-22 Orion Therapeutic Systems, Inc. Fibrinolysis and fibrinogenolysis treatment
AU4661493A (en) 1992-07-01 1994-01-31 Beth Israel Hospital Boston Enhancement of thrombolytic therapy with deglycosylated plasminogen
US5304118A (en) * 1992-12-16 1994-04-19 Trese Michael T Method for performing a vitrectomy on an eye
US5866120A (en) 1995-11-22 1999-02-02 Advanced Corneal Systems, Inc. Method for accelerating clearance of hemorrhagic blood from the vitreous humor with hyaluronidase
US6610292B2 (en) 1995-11-22 2003-08-26 Ista Pharmaceuticals, Inc. Use of hyaluronidase in the manufacture of an ophthalmic preparation for liquefying vitreous humor in the treatment of eye disorders
US5973779A (en) 1996-03-29 1999-10-26 Ansari; Rafat R. Fiber-optic imaging probe
US6207066B1 (en) 1996-07-23 2001-03-27 Nuvue Technologies, L.L.C. Method for purification of a blood component
US6051698A (en) 1997-06-06 2000-04-18 Janjic; Nebojsa Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes
US5722428A (en) 1996-10-29 1998-03-03 Washington University Method for producing a posterior vitreous detachment
US6596725B2 (en) 1997-02-10 2003-07-22 Inspire Pharmaceuticals, Inc. Use of certain dinucleotides to stimulate removal of fluid in retinal detachment and retinal edema
CA2288622A1 (en) 1997-05-22 1998-11-26 Advanced Corneal Systems, Inc. Use of hyaluronidase in the manufacture of an ophthalmic preparation for liquefying vitreous humor in the treatment of eye disorders
JP2002505082A (ja) 1998-02-04 2002-02-19 トロンブ−イックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 減少した免疫原性および/または減少したクリアランスを有するスタフィロキナーゼ誘導体の同定、製造および使用方法
US6378526B1 (en) 1998-08-03 2002-04-30 Insite Vision, Incorporated Methods of ophthalmic administration
US6462071B1 (en) 2000-03-02 2002-10-08 Vitreo-Retinal Technologies, Inc. Agents for intravitreal administration to treat or prevent disorders of the eye
US6733750B1 (en) 1999-03-09 2004-05-11 Minu, L.L.C. Process and composition for inducing posterior vitreous detachment
US6899877B2 (en) 1999-03-09 2005-05-31 Minu, L.L.C. Process for generating plasmin in the vitreous of the eye and inducing separation of the posterior hyaloid from the retina
US20040081643A1 (en) 1999-03-09 2004-04-29 Peyman Gholam A. Process for inhibiting vascular proliferation in the eye
US6585972B2 (en) 1999-03-09 2003-07-01 Gholam A. Peyman Process for crosslinking of collagen in the vitreous of the eye and inducing separation of the posterior hyaloid from the retina
WO2001034797A1 (fr) 1999-11-10 2001-05-17 Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd. Procede de preparation de fractions cellulaires contenant des hemangioblastes
US6355243B1 (en) 1999-11-13 2002-03-12 Bayer Corporation Method of thrombolysis by local delivery of active plasmin
US6964764B2 (en) 1999-11-13 2005-11-15 Talecris Biotherapeutics, Inc. Method of thrombolysis by local delivery of reversibly inactivated acidified plasmin
AU2001265953B2 (en) * 2000-05-12 2005-09-29 D. Collen Research Foundation Vzw Use of inhibitors of placental growth factor for the treatment of pathological angiogenesis, pathological arteriogenesis, inflammation, tumour formation and/or vascular leakage
US7122181B2 (en) 2000-12-19 2006-10-17 Research Development Foundation Lentiviral vector-mediated gene transfer and uses thereof
JP4047170B2 (ja) 2000-12-21 2008-02-13 トロム−イクス・ナムローゼ・フエンノートシャップ 酵母発現ベクターおよび酵母細胞における発現による組換えタンパク質の製造方法
US20020139378A1 (en) 2001-03-28 2002-10-03 Trese Michael T. Method for creating a separation of posterior cortical vitreous from the retina of the eye
FI20011132A0 (fi) 2001-05-30 2001-05-30 Innovationsagentur Markkeri hematopoieettisten kantasolujen tunnistamiseen
US7776026B2 (en) 2002-02-06 2010-08-17 Nuvue Technologies, Inc. Method for vitreous liquefaction
US6787135B2 (en) 2002-03-13 2004-09-07 William Beaumont Hospital Modification of vitreal matrix metalloproteinase activity
WO2004045558A2 (en) * 2002-11-18 2004-06-03 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for treating thrombotic disorders
GB0228409D0 (en) 2002-12-06 2003-01-08 Thromb X Nv Pharmacological vitreolysis
US20060257391A1 (en) 2005-05-11 2006-11-16 Bausch & Lomb Incorporated Non-surgical method for preventing or reducing the rate of the progression of non-proliferative diabetic retinopathy and the treatment of other ocular conditions
US20070212358A1 (en) * 2006-03-10 2007-09-13 Bartels Stephen P Compositions and Methods for Effecting Controlled Posterior Vitreous Detachment

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003300821C1 (en) 2012-03-22
FR13C0052I2 (fr) 2014-11-21
US20090081187A1 (en) 2009-03-26
US8747842B2 (en) 2014-06-10
EP2327415A1 (en) 2011-06-01
EP2327416B1 (en) 2019-05-01
CA2508606C (en) 2015-07-28
HK1082419A1 (en) 2006-06-09
SI1581254T1 (sl) 2012-05-31
US20080095753A1 (en) 2008-04-24
GB0228409D0 (en) 2003-01-08
US20110171190A1 (en) 2011-07-14
NO2013016I2 (no) 2017-06-28
PT1581254E (pt) 2012-02-06
US20090074739A1 (en) 2009-03-19
AU2003300821B2 (en) 2009-07-09
US8460655B2 (en) 2013-06-11
US7914783B2 (en) 2011-03-29
US8383105B2 (en) 2013-02-26
DK1581254T3 (da) 2012-02-27
NO333837B1 (no) 2013-09-30
US20050118158A1 (en) 2005-06-02
US20110300123A1 (en) 2011-12-08
CY2013033I2 (el) 2015-11-04
US7867489B2 (en) 2011-01-11
AU2003300821A1 (en) 2004-06-30
NO20052988L (no) 2005-09-05
CN100577202C (zh) 2010-01-06
JP5451533B2 (ja) 2014-03-26
JP5996026B2 (ja) 2016-09-21
HUS1300040I1 (hu) 2013-08-15
NO343759B1 (no) 2019-06-03
US20130302304A1 (en) 2013-11-14
CY1112561T1 (el) 2015-11-04
ATE534400T1 (de) 2011-12-15
ZA200505193B (en) 2007-08-29
NO20121170A1 (no) 2012-10-12
JP2006518708A (ja) 2006-08-17
EP2327416A1 (en) 2011-06-01
NO2013016I1 (no) 2013-11-19
LU92273I2 (fr) 2013-10-29
BR0317033A (pt) 2005-10-25
CA2508606A1 (en) 2004-06-24
PT2327416T (pt) 2019-07-04
US9770494B2 (en) 2017-09-26
CY2013033I1 (el) 2015-11-04
NO20052988D0 (no) 2005-06-17
US7547435B2 (en) 2009-06-16
MXPA05006038A (es) 2006-03-08
FR13C0052I1 (ja) 2013-04-10
JP2013241448A (ja) 2013-12-05
US7803368B2 (en) 2010-09-28
US8834869B2 (en) 2014-09-16
ES2377965T3 (es) 2012-04-03
US20080050356A1 (en) 2008-02-28
EP1581254B1 (en) 2011-11-23
US20150064161A1 (en) 2015-03-05
US9186394B2 (en) 2015-11-17
NZ541075A (en) 2008-02-29
IL213838A0 (en) 2011-07-31
JP2015131842A (ja) 2015-07-23
WO2004052228A2 (en) 2004-06-24
LU92273I9 (ja) 2019-01-15
BRPI0310144A8 (pt) 2018-04-24
US20130202613A1 (en) 2013-08-08
NO20121169A1 (no) 2012-10-12
ES2731625T3 (es) 2019-11-18
US20130195887A1 (en) 2013-08-01
EP1581254A2 (en) 2005-10-05
CN1738641A (zh) 2006-02-22
WO2004052228A3 (en) 2004-10-07
IL169008A (en) 2011-08-31
BE2013C055I2 (ja) 2023-03-07
EP2327415B1 (en) 2017-10-18
JP2010222369A (ja) 2010-10-07
IL202851A (en) 2015-04-30
JP5426063B2 (ja) 2014-02-26
EP1581254A4 (en) 2007-03-28
IL202851A0 (en) 2011-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5996026B2 (ja) 薬理学的硝子体融解

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20140924

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20141224

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20150121

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20150216

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150324

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20150414

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20150423

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5739487

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees