JP5739487B2 - 薬理学的硝子体融解 - Google Patents
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Description
「処置」は、任意の内科的疾患の任意の程度への軽減または改善を意味し、障害の完全な治癒が含まれるが、その必要はない。
以下に列挙したマイクロプラスミンの変異型は、アミノ酸1〜791からなるヒトプラスミノゲンのアミノ酸配列および番号に対応する(図1、配列番号10を参照のこと)。
(a)pPICZαAベクター
InvitorogenCorporation(Carlsbad,California)から購入したpPICZαA分泌ベクターを使用して、ピキア・パストリス中での組換えヒトマイクロプラスミノゲンおよびミニプラスミノゲンの発現および分泌を行った。このベクターの顕著な特徴には、(i)ピキア属において組換えタンパク質のメタノール誘導性高レベル発現が可能なアルコールオキシダーゼ1(AOX1)プロモーターを含む942bpフラグメントおよびAOX1染色体遺伝子座へのプラスミド組み込みのターゲティング;(ii)天然の転写終結およびAOX1遺伝子由来のポリアデニル化シグナル;(iii)大腸菌(Escherichia.coli)およびピキア・パストリスにゼオシン耐性を付与する発現カセット、(iv)大腸菌中でのプラスミドの増殖および維持のためのColE1複製起点、(v)タンパク質の検出および精製に使用することができるc−mycエピトープおよびポリヒスチジン(6×His)タグ、および(vi)ピキアゲノムへの有効な組み込みのためにAOX1遺伝子座でベクターを線状化可能な固有の制限部位(例えば、SacI、PmeI、BstXI)が含まれる。
Clontech(Palo Alto,California)から市販されているAdvantage cDNAポリメラーゼミックスを使用して、ヒトマイクロプラスミノゲンタンパク質(アミノ酸543〜791(配列番号4))をコードする核酸配列を、ベクターFmyc−pPliから増幅した(PCRレスキュー)(Lasters et al.in Eur.J.Biochem.244:946,1997)。94℃で3分間のDNAテンプレートの分解後、30ラウンドの熱サイクリングを行い(94℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で30秒間)、その後72℃で2分間の最終伸長を行った。以下のオリゴヌクレオチドプライマーLY−MPLG1(センス)およびLY−MPLG2(アンチセンス)を本反応で使用した:
LY−MPLG1:5’GGGGTATCT CTC GAG AAA AGA GCC CCT TCA TTT GAT TG(配列番号1)
LY−MPLG2:5’GTTTTTGT TCT AGA TTA ATT ATT TCT CAT CAC TCC CTC(配列番号2)。
上記pPICZα−MPLG1ベクターを使用して、ミニプラスミノゲンの発現のためのpPICZα由来の分泌ベクターを以下のように構築した。
LY−MINPLG1:5’GGGGTATCT CTC GAG AAA AGA GCA CCT CCG CCT GTT GTC CTG CTT CC(配列番号5)
LY−MINPLG2:5’GCA GTG GGC TGC AGT CAA CAC CCA CTC(配列番号6)。
(a)pPICZα−MPLG1でのピキア属の形質転換。10μgのベクターpPICZα−MPLG1を、5’AOX1領域中でベクターを線状化するPmeIで消化した。DNAを沈殿させ、滅菌蒸留水中に0.33μg/μlに濃縮し、5μlを使用してEasySelectPichia発現キットに含まれるマニュアルにしたがって調製したコンピテントピキア・パストリスX33細胞を形質転換した。
高発現株の選択を以下のように行った。ゼオシン耐性形質転換体を、YPDSZプレート(1%酵母抽出物、2%ペプトン、2%グルコース、1Mソルビトール、2%寒天、100μg/mlゼオシン)上で選択した。34個の単一コロニーを、10ml BMYZ−グリセロール培地(1%酵母抽出物、2%ペプトン、1%グリセロール、100mMリン酸カリウム(pH6.0)、1.34%酵母窒素塩基、4×10−5%ビオチン、100μg/mlゼオシン)を含む50ml Falconチューブ中でインキュベートし、30℃で16時間培養した。細胞をペレット化し、AOX1プロモーター由来の発現を誘導するために、2mlのBMYZ─メタノール培地(BMYZ−グリセロールと同一であるが、グリセロールの代わりに0.5%メタノールを含む)中に再懸濁し、40時間培養した。この期間中(6、22、26、および30時間後)に培養物に4パルスの0.5%メタノールを供給した。インキュベーション培養後、培養上清中のマイクロプラスミノゲンの存在を、Lijnen et al.in Eur.J.Brochent.120:149,1981に記載のように評価した。簡単に述べれば、無希釈または10倍希釈の上清中のマイクロプラスミノゲンを、ウロキナーゼと30分間インキュベートして、マイクロプラスミノゲンをマイクロプラスミンに活性化した。異なる時間の呈色基質S2403(Chromogenix,Antwerp,Belgium)によって決定されたそのアミド分解活性によって決定された、得られたマイクロプラスミン活性を、既知量の精製プラスミンまたはマイクロプラスミン調製物の活性と比較した。その後の大量産生のために、ウロキナーゼ活性化後に高マイクロプラスミン活性を示すクローンX33−MPLG1番号5を選択した。2001年12月12日にブダペスト条約の条項にしたがってこのクローンをBelgian Coordinated Collections of Microorganisms(BCCM−MUCL−COLLECTION)に寄託し、アクセッション番号MUCL43676で受託された。
以下の4つの工程で50リットル規模のX33−MPLG1番号5の発酵を行った。0.7mlの接種物(細胞バンクウイルス番号グリセロールOOC17)を使用して、400mlYSG+(6g/lの酵母抽出物、5g/lのダイズペプトン、20g/lのグリセロール)中にて、270rpmで震盪しながら2リットルフラスコでの細胞培養を30℃で23時間行い、OD600 15を得た(予備培養工程後)。次いで、600mlの接種物を使用して、大気圧で50l/分通気し、溶存酸素(DO)が20%超であり、200〜500rpmで震盪し、12.5%アンモニアでpH5.8に維持した30l基本培地(26.7ml/lの85%H3PO4、1.05g/1 CaSO4・2H2O、18.2g/l K2SO4、、14.9g/l MgSO4・7H2O、4.13g/l KOH、40g/l100%グリセロールならびに4.76ml/l PTM1塩溶液(6g/l CuSO4・5H2O、0.08g/l NaI、3.36g/l MnSO4・H2O、0.2g/l NaMoO4・2H2O、0.02g/lホウ酸、0.82g/l CoCl2・6H2O、20g/l ZnC12、65g/l FeSO4・7H2O、0.2g/l d−ビオチン、および5ml/l HSSO4を含む))を含むMRP80発酵デバイス中にて30℃で発酵させた。24時間後且つ50のOD600後(バッチ工程後)、溶存酸素の急速な増加によってグリセロールの枯渇が証明された。グリセロール供給(632g/lの100%グリセロールおよび12ml/PTM1)により、24時間でOD600が258まで増加した。次いで、6時間以内に250ml/時間まで流速を増加させてメタノールを供給し、988ml/lメタノールおよび12ml/l PTM1を使用して66時間維持し、培養終了時にOD600が325に達した。350リットル規模のX33−MPLG1番号5の発酵により、比例的に類似の結果が得られた。
次いで、回収物を、陽イオン交換流動層クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、およびアフィニティクロマトグラフィを含む3工程プロセスで精製する。
i)定量的活性化。0.5%のスタフィロキナーゼ変異型SY162を含む0.5MNaCl、25mMリン酸一水素二ナトリウム(Na2HPO4・12H2O)緩衝液(pH7.0)のモル比で23℃で30分間マイクロプラスミノゲンのマイクロプラスミンへの活性化を行った。WO99/40198に記載のように、SY162は、野生型と比較して、12アミノ酸置換(K35A、E65Q、K74R、E80A、D82A、T90A、E99D、T101S、E108A、K109A、K130T、およびK135R)を含む免疫原性が減少したスタフィロキナーゼ変異型である。最終濃度1M(132g/l)までマイクロプラスミンに固体硫酸アンモニウムを添加し、混合物を4〜8℃で15分間撹拌した。
20μlの反応物中の約15μgのベクターpPICZα−MPLG1を、5’AOX1領域中でベクターを線状化するPmeIで消化する。線状DNA(3μg)を使用して、EasySelectPichia発現キットに含まれるマニュアルにしたがって調製したコンピテントピキア・パストリスX33細胞を形質転換した。
正常なブタ眼における後部硝子体剥離(PVD)に対する培地および異なる薬剤の効果を調査するための信頼のおける固定技術を確立するために、本実験を行った。
網膜表面の内境界膜から後部硝子体皮質を解離するマイクロプラスミンの能力を決定するために、本実験を行った。
マイクロプラスミンがヒト眼の硝子体網膜分離を有効に誘導することができるかどうかを決定するために本実験を行った。
(a)ヒト死後の眼の投与および処置
眼の疾患が認められていない26個のヒトの眼球を、Munichアイバンクから得た。これらの眼球を、死後19時間以内に34〜69歳の範囲の13人のドナーから取り出した。直径14mmのトレフィンを使用した角膜の回収後、26個の眼球を37℃の湿室で15分間インキュベートした。次いで、0.2mlのマイクロプラスミンを、13個の眼の硝子体腔に注射した。詳細には、1.25mgのマイクロプラスミンを、それぞれ4ml、2ml、または1.5mlの眼内灌流溶液BBSPLUS(登録商標)にて0.3125mg/ml、0.625mg/ml、および0.9375mg/mlの濃度に希釈した。総体積が0.2mlのこれらの溶液を硝子体腔に注射し、眼内の最終マイクロプラスミン用量をそれぞれ62.5μg、125μg、および188μgとした。コントロールとして使用した13個の他方の眼に、0.2mlの平衡塩類溶液(BSSPLUS(登録商標))を注射した。
次いで、眼球を、扁平部に沿って二等分し、前部を破棄した。直径12.5mmの角膜トレフィンを硝子体を通過してゆっくり移動させ、後極を打ち抜いた。次いで、走査型および透過型電子顕微鏡法のための網膜試料を、直径4mmの角膜トレフィンを使用して後極から得た。
(a)走査型電子顕微鏡
62.5μgのマイクロプラスミンを注射した死後ヒトの眼の走査型電子顕微鏡法(SEM)により、ILMに覆われた不連続なコラーゲン原線維網が遊離した後部硝子体剥離が明らかとなった(図6、パネルA)。125μg(図6、パネルB)および188μg(図6、パネルC)のマイクロプラスミンをそれぞれ注射した眼のSEMにより、完全な硝子体網膜分離と一致する露呈したILMが明らかとなった。これらの両方のより高い用量により、硝子体網膜境界の類似の超微細構造が得られた。
全てのマイクロプラスミン処置眼の網膜内の形態学的性質は、コントロール眼と比較して変化しなかった。ILMの超微細構造は、コントロール眼(図7、パネルB)と比較してマイクロプラスミン処置眼(図7、パネルA)で十分に保存された。
これらのデータは、マイクロプラスミンの硝子体内注射によって、硝子体切除または任意の他の手術介入を行うことなくヒトの眼の硝子体皮質と内境界膜との間の切断を誘導することができることを示す。125μgのマイクロプラスミンにより、30分以内にヒト硝子体網膜接合部(junction)が切断される。酵素作用に関して、125μgのマイクロプラスミンは、2Uのプラスミン(Sigma−Aldrich,Munich,ドイツ)と同用量であり、ブタ死体眼およびヒトドナー眼において完全な硝子体網膜分離を引き起こす。これらのデータはまた、マイクロプラスミン処置眼の硝子体への気泡の適用は硝子体網膜接合部の切断に必要な用量に影響を与えなかったことを示す。
これらの実験の目的は、in vivoでのPVDに対するマクロプラスミンの有用性を決定することであった。
(a)ネコモデル
解剖学者および生理学者によってネコ網膜は広く研究されており、薬理学的誘導PVDの安全性の評価に有用なモデルとなる。ヒト網膜と同様に、ネコ網膜は桿体細胞に支配されており、眼窩外側の網膜内循環を有する。これは、網膜内血管を有さないウサギと対照的である。ウサギ内部網膜は硝子体表面上に存在する脈管構造によって灌流しており、これはウサギの硝子体網膜境界に主に注目する実証研究の価値を制限する。何年もの間、ネコモデルから網膜の剥離に対する細胞応答に関する高品質のデータが得られている。したがって、本発明者らは、in vivoでのPVDの実施におけるマイクロプラスミンの有用性の研究にネコモデルを使用した。
実施例6のヒト死後眼について記載のように、屠殺したネコから眼球を取出し、固定し、電子顕微鏡法のために処理した。2人の観察者が個別に電子顕微鏡写真を評価した。各観察者は、ILMに覆われたコラーゲン原線維網が連続または不連続のいずれであるか、コラーゲン原線維がILMに単独または疎らに存在するかどうか、またはILMがいかなるコラーゲン原線維を欠くかどうかの決定によって硝子体網膜分離の程度を評価した。
眼の試料を、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)でリンスし、PBS中で調製した5%アガロース(Sigma,St Louis MO,アメリカ)で泳動した。厚さ100μmの切片を、ビブラトーム(Technical Products International,Polysciences,Warrington,PA,アメリカ)を使用して切断し、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA;Fisher Scientific,Pittsburgh,PA,アメリカ)、0.1%Triton X−100(Roche Boehringer,Mannheim,ドイツ)、および0.1%アジ化ナトリウム(Sigma−Aldrich,Munich,ドイツ)を含む正常なロバ血清(20倍;Dianova,Hamburg,ドイツ)を含むPBS(BSA、Triton、およびアジドを含むこのPBS溶液を、PBTAという)中で回転させながら4℃で一晩インキュベートした。ブロッキング血清の除去後、以下の6セットの対に一次抗体を添加した:抗グリア線維性酸性タンパク質(GFAP;500倍;DAKO,Hamburg,ドイツ)と抗IV型コラーゲン(50倍;DAKO)との対;抗ビメンチン(50倍;DAKO)と抗フィブロネクチン(400倍;DAKO)との対;抗シナプトフィジン(50倍;DAKO)と抗神経フィラメント(25倍;DAKO)との対;抗ラミニン(25倍;DAKO)と抗CD68(50倍;DAKO)との対;抗赤色/緑色オプシン(100倍;Santa Cruz Biotechnology,アメリカ)と抗ロドプシン(200倍;Santa Cruz Biotech)との対;抗青色オプシン(100倍;Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,CA,アメリカ)と抗ロドプシン(200倍;Santa Cruz Biotech)との対。この実験で使用した抗体の特異性を表5に列挙する。
(a)走査型電子顕微鏡法
25μgマイクロプラスミンの硝子体内注射の1日後、疎らなコラーゲン原線維がILMを覆った(図8、パネルA)。治療3日後、25μgマイクロプラスミンにより完全な硝子体網膜分離が認められた(図8、パネルB);硝子体網膜境界上に残存するコラーゲン原線維の断片は存在しなかった。14.5μgのマイクロプラスミンを投与した眼は、注射3日後にILMを覆う疎らなコラーゲン原線維が明らかであった(図8、パネルC)。処置21日後、14.5μg(図8、パネルD)および25μgのマイクロプラスミン(図8、パネルE)では、露呈したILMが認められた。全ての他方のコントロール眼は、網膜を覆った密集したコラーゲン原線維網が認められた(図8、パネルF)。これらのデータを、表6にまとめる。
網膜の細胞構築に関して、マイクロプラスミン処置眼(図9、パネルA)とコントロール眼(図9、パネルB)との間に相違は認められなかった。マイクロプラスミン処置眼の内部網膜およびILMの超微細構造(図9、パネルCおよびE)は、コントロール眼の内部網膜およびILM(図9、パネルDおよびF)と比較して十分に保存されていた。
マイクロプラスミン処置眼およびコントロール眼では、ミューラー細胞の末端部分は、抗GFAP(図10、パネルAおよびB)および抗ビメンチン(図10、パネルCおよびD)で明白に標識された。内顆粒層上のミューラー細胞プロセスの広範な染色は存在しなかった。抗IV型コラーゲンおよび抗フィブロネクチンを使用して有意な染色は認められなかった(データ示さず)。これは、これらの抗体の種特異性に関し得る。ILMは、抗ラミニンによって染色された。処置眼およびコントロール眼の両方でマクロファージはほとんど存在しなかった。神経節細胞の軸索および樹状突起、水平細胞、ならびに内網状層および外網状層は、抗神経フィラメントおよび抗シナプトフィジンによって明白に標識された(図10、パネルEおよびF)。光受容細胞層は、抗神経フィラメントによって標識された。任意の使用抗体に関して、いかなる研究の測定点においてもマイクロプラスミン処置眼(パネルA、C、E)とコントロール眼(図10、パネルB、D、およびF)との間に相違は存在しなかった。
in vivoでの硝子体網膜境界におけるマイクロプラスミンの除去効果を評価するために、2つの異なる用量を5頭の成体ネコの硝子体腔に投与した。第1の使用用量は、ヒト死後眼における完全なPVDの誘導に十分であることが見出された用量の1/5である25μgのマイクロプラスミンであった。明らかに、25μgのマイクロプラスミンは0.4Uのプラスミン(Sigma)に等価であり、臨床的に0.4Uの自己プラスミンを黄斑円孔および糖尿病網膜症を罹患したヒトの眼の硝子体腔に適用した。ネコの眼のより小さな硝子体体積のために調整する場合(ヒト眼の硝子体体積の約60%)、第2の用量である14.5μgのマイクロプラスミンは、ヒト眼において25μgのマイクロプラスミンの用量に等価である。
非浸襲性動的光散乱(DLS)技術を使用したin vivoおよびin situでの新鮮な死後ブタ網膜に対するμPiの生物物理学的効果を特徴づけるためのマイクロプラスミン(μPi)の効果を評価するために、本研究を行った。DLSにより、散乱光の強度における時間関数測定によって溶液および懸濁液中の粒子および高分子の力学に関する情報が得られる。
(a)硝子体研究のためのDLS装置の組み立て
本明細書中に記載の硝子体研究のために新規の小型DLS光ファイバープローブ(米国特許第5,973,779号)を組み立てた。これは、1対の0.25ピッチのSelfocGRINレンズから構成され、侵入度が〜16mmであり、散乱角が160°である。2つの単一モードの光ファイバーおよび2つのGRINレンズを含む光ファイバープローブにより、眼における高分子の力学的特徴の研究のための小型のリモコン手段が得られる。それぞれステンレススチール性フェルールに格納された2つの単一モードの光ファイバーを個別のステンレススチールハウジングにマウントする。散乱体積中の強く集中した点を得るためにファイバーハウジングとレンズハウジングとの間に意図的に空気ガスを残す。そのハウジング中の2つの光ファイバーを整列させ、マイクロレンズと軸外の位置に固定する。2つのハウジングを、ステンレススチール製の第3の(外側の)ハウジングの内側に入れ、ハウジングの後部を熱収縮チューブで覆う。レーザーおよび光検出器モジュールとの容易な合わせのために、光ファイバーの2つの自由端をEC/PC型オス・コネクタで終端処理を行った。
DLSは、溶液(この場合、硝子体)中に懸濁する粒子の平均直径を非侵襲性で客観的に定量することができる。粒子サイズを正確に計算するために、溶媒の粘度を知るか推測することが必要である。前に記載のように、現在非ニュートン流体の粘度を正確に測定することができないので、仮定しなければならない。硝子体が約99%の水を含む場合、硝子体の粘度を水の粘度とすることが妥当である。この仮定の妥当性を試験するために、全硝子体ゲル、濾過器を通過しない硝子体の亜分画(ゲル)、濾過器を通過する硝子体の亜画分(非ゲル)、および0.22μm Milliporeフィルターを通過した硝子体の亜画分(液体硝子体)についてDLSを測定した。光学キュベット中でこれらの研究を行い、極めて均一な既知の直径の拡散20nmポリスチレンナノスフェアをトレーサーとして添加した。全硝子体および全ての異なる亜画分におけるDLS測定により、硝子体の微小粘度(microviscosity)が実際に純粋のそれに非常に近いことを示す類似の結果が得られた。硝子体の微小粘度は、ヒアルロナン(HA)分子およびコラーゲン線維束が懸濁した捕捉された水の粘度をいう。HA分子のブラウン運動は、HA分子と比較してわずかにサイズが大きいコラーゲン線維束よりもはるかに速い。DLSスペクトルでは、HA分子情報をより速い(短い)遅延時間で組み込み、コラーゲンはより遅い(長い)遅延時間で組み込む。得られた情報を、粒子サイズ分布に示す。
BSSPLUS(登録商標)(ALCON Labs,Ft.Worth,TX)を使用して全ての溶液を調製した。マイクロプラスミンを、4mg/mlストック溶液の濃度で使用した。直径20nmであり且つ二重蒸留脱イオン水に懸濁したポリスチレンナノスフェア(Bangs Laboratories,Fishers,IN)を、全サンプル中のナノスフェア数が確実に一定になる固定比で全サンプル中に添加した。
新鮮な非固定ブタ眼(n=11)を、扁平面切開を介して後部セグメントを切開し、前部硝子体から離れてレンズ/虹彩絞りを鋭く切開した。この組織を切開することなくできるだけ水晶体後面の近くに切片を運んだ。眼を、以下の後部セグメントと共にホルダーに維持した。
インタクトなブタ眼(n=39)の扁平部での穿刺切開を介して30Gニードルを使用して、ポリスチレンナノスフェアおよび0.0125、0.0025、0.05、0.125、0.25、0.5、0.6、および0.8mgのμPiを含む300μLの実験溶液およびコントロール溶液を注射した。眼を、角膜を上にし且つ後部を下にして(仰臥位の模倣)保持したホルダー中にて37℃で30分間または120分間インキュベートした。眼を温度制御水浴中に入れる前(常に試料と水との間のいかなる接触も回避する)およびその後15分毎に、眼をほぼ光軸に対して10〜15秒間回転させた。インキュベーション後、扁平部切開を介して眼の前部を切開した。硝子体/空気境界の後ろの深さ4mmの光軸(平均=18.6、s.d.=11.8)および水平軸(平均=30.8ポイント、d.d.=18.0)に沿ったいくつかのポイントでDLSを行った。
(a)ブタ硝子体の分子形態学
アイカップ(eye cup)(前部を切開して除去したもの)の光軸に沿った複数のポイントから得た全(インタクトな)硝子体のDLS測定により、空気−硝子体境界の1.25mm〜4.75mm下の全てのポイントで非常に類似した所見が証明された。これらの所見はまた、キュベットに入れた切開した全硝子体、濾過後に保持された残存硝子体、および濾過器を通過した硝子体の亜画分で得られた所見と類似している。全てほぼ同一の粒子サイズ分布を示した。より大きな粒子サイズの群(右側)の平均サイズは約1000nmであり、主にコラーゲンを示す。より小さな粒子サイズ分布(左側)は主にヒアルロナン(HA)を示す。この粒子サイズ分布パターンは、ポリスチレンナノスフェア注射を受けた眼で同一であった。
図12は、比較のために、5つの異なるブタ眼中の空気/硝子体境界から4mm下のポイントおよび20nmポリスチレンナノスフェア溶液から得たTCFを示す。μPi用量が増加するにつれて遅い成分(より大きな分子種)の消滅と共にTCFの勾配が減少し、最終的に20nmナノスフェアのみ(すなわち、全てがより小さいサイズの分子種)のTCFに近づくことが認められる。
0.0125〜0.8mgの用量範囲のμPiとの37℃で30分間のインキュベーション後、光軸および水平軸の両方に沿って有意な変化は存在しなかった。光軸では、最も高用量の0.8mgで正規化平均粒子サイズは1/7に減少した。0.125mgの用量では、30分後に正規化平均粒子サイズは約1/3に減少した。最も低用量の0.0125mgではいかなる有意な効果も認められないようであった。全範囲の用量と通して、粒子サイズの減少はμPiの用量に反比例した(相関係数=0.93)。データを、線形(直線)フィッティングルーチンに適合させた。正規化全強度および多分散性プロットにより、このデータの信頼性がされに支持される。粒子サイズ分散は、漸増用量のμPiを使用して、粒子サイズ分布の左側への有意なシフトを証明する。これにより、μPiは、種々の化学結合の有意な脆弱化および破壊ならびに硝子体高分子構造の溶解に有効であることが示唆される。
この実験では、DLSを使用して、粒子サイズ、散乱強度、および多分散性の測定によって硝子体の分子構造を非浸襲的に評価した。結果は、全硝子体内の硝子体の位置において類似のDLSプロフィールが認められることを示した。マイクロプラスミンの最も顕著な効果は、特により高い用量で37℃で30分間インキュベートした全硝子体に対する効果であった。正規化平均粒子サイズが実質的に減少し、統計的に有意な用量−応答関係が確立された。これにより、現在の手術実施を妨害しない薬物効果に30分の時間枠が妥当であるので、μPiが硝子体−網膜手術のためのアジュバントとして有用であることが示唆される。μPiが硝子体−網膜境界の裂開を誘導することが示唆される前の実施例のデータと組み合わせて、この薬物は、以下の2つの薬理学的硝子体融解の所望の成分が達成されるようである:後部硝子体剥離および硝子体高分子の破壊、ならびにその後の硝子体の拡散係数の増加および最終的な液化。
外科的硝子体切除を必要とする硝子体網膜疾患を示す患者を、外科的硝子体切除手順の前にマイクロプラスミン注射で処置する。患者は、眼の健康のベースラインを確立するために全眼科試験を受けるべきである。眼科試験には、間接的検眼鏡検査、スリットランプ生体顕微鏡法、網膜周辺部試験、眼圧測定、視力(裸眼視力および矯正視力)、徴候学、眼底撮影法、フルオレセイン血管造影法、網膜電図写真、およびAスキャン測定が含まれる。
本実施例では、糖尿病性網膜症を発症した糖尿病患者を、マイクロプラスミンの硝子体内注射によって処置する。
マイクロプラスミンは、全長プラスミンの分子量の約1/3である。そのより小さなサイズにより、マイクロプラスミンは、プラスミンよりも硝子体内でより迅速に拡散すると予想される(Xu,J.et al.,前出)。より迅速な拡散により、より迅速な薬理学的効果が誘導されると予想される。マイクロプラスミンがプラスミンより迅速に拡散することおよびマイクロプラスミンが硝子体ゲルを変化させることができることの両方を確認するために本研究を行った。
食肉処理場から得た新たに単離したブタ眼を使用した。第1の実験では、一方の眼にマイクロプラスミン(0.125mg)を注射し、他方の眼に賦形剤コントロール(BSS−PLUS(登録商標))を注射した。室温で2時間両眼の維持後、両眼にフルオレセインを注射し、さらに30分間インキュベートした。0、10、20、および30分後に写真撮影を行った。
第1の実験では、コントロール眼は事実上硝子体内フルオレセイン拡散は認められなかった(データ示さず)。しかし、マイクロプラスミン処置眼では、明らかなフルオレセイン拡散が認められた(データ示さず)。
マイクロプラスミンは、賦形剤コントロールと比較してフルオレセイン分散の明らかな促進を証明した。さらに、マイクロプラスミンの分子量の分子量に基づいて予想したところ、このフルオレセイン拡散は、全長プラスミン投与で認められた拡散よりも範囲が広い。この所見は、マイクロプラスミンはプラスミンよりも迅速に拡散するという予測を支持する。これらの所見は、より迅速に薬理学的効果が得られる臨床的利点を有し得る。
Claims (17)
- マイクロプラスミンを含み、患者の眼における硝子体の粘度の減少、硝子体の液化、後部硝子体剥離の誘導、硝子体及び/若しくは房水由来の出血の除去若しくは減少、硝子体及び/若しくは由来の眼球内異物の除去若しくは減少、硝子体液及び/若しくは房水に投与した薬剤若しくは組成物の拡散の増加、又は網膜外新血管形成の減少に用いるための組成物。
- 前記マイクロプラスミンは、安定化マイクロプラスミン、組換えマイクロプラスミン、安定化組換えマイクロプラスミン、およびセリンプロテアーゼ触媒活性を有するマイクロプラスミンの変異型から選択される、請求項1記載の組成物。
- 前記眼は、網膜剥離、網膜裂傷、硝子体出血、糖尿病性硝子体出血、増殖性糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引、黄斑皺襞形成症、黄斑滲出、嚢胞様黄斑浮腫、フィブリン沈着、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜下出血、眼内炎、未熟児網膜症、網膜色素変性症、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される疾患を有する、請求項1又は2記載の組成物。
- 前記治療又は予防は、硝子体切除を用いずに行われ、又は硝子体切除の補助として行われる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記マイクロプラスミンの有効量が0.005mg〜0.2mg/眼の範囲である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 更に第2の薬剤を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第2の薬剤が、眼の障害又は眼の障害の合併症の治療又は予防に有用なTPCD以外のタンパク質、化学物質、又は他の物質である、請求項6記載の組成物。
- 前記第2の薬剤が、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼAC、コンドロイチナーゼB、コンドロイチン4−スルファターゼ、コンドロイチン6−スルファターゼ、B−グルクロニダーゼ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、RGD含有ペプチド、エキスタチン、ファルボリジン、抗インテグリン抗体、P2Y受容体アゴニスト、尿素、ヒドロキシ尿素、チオ尿素、血管形成インヒビター、VEGFインヒビター、及びPlGFインヒビター、並びにその任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項6又は7記載の組成物。
- 前記VEGFインヒビターが、抗VEGF抗体、VEGFアプタマー、又は可溶性VEGF受容体である、請求項8記載の組成物。
- 前記PlGFインヒビターが、抗PlGF抗体、PlGFアプタマー、又は可溶性VEGF受容体である、請求項8記載の組成物。
- 前記組成物が溶液である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物がヒト用である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記マイクロプラスミンがヒトマイクロプラスミンである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記マイクロプラスミンは、SEQ ID NO.10の543〜791アミノ酸の二本鎖ポリペプチドからなり、且つArg561とVal562との間のペプチド結合がプラスミノーゲン活性化因子により開裂している、請求項1〜13のいずれかに記載の組成物。
- 前記マイクロプラスミンは、活性化マイクロプラスミノーゲンであり、該マイクロプラスミノーゲンは、SEQ ID NO.3によりコードされる、請求項1〜14のいずれかに記載の組成物。
- 前記マイクロプラスミンは、メチロトローフ酵母における組み換え体の発現によって産生される、請求項1〜15のいずれかに記載の組成物。
- 前記メチロトローフ酵母はピキア・パストリス(Pichia Pastoris)である、請求項16記載の組成物。
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