JP5785941B2 - 抗ｖｅｇｆ抗体とその使用 - Google Patents

Description

１．関連出願のクロスリファレンス及び配列表
本願は３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき、２００９年６月１７日付けで出願された米国仮出願第６０／２１８，００５号の優先権を主張し、その開示内容全体を本願に組込む。

本願はＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で提出された配列表を含み、全体を本願に組込む。２０１０年６月１５日付けで作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはファイル名３８１４９３ＰＣ．ｔｘｔ、サイズ１４１，４８２バイトである。

２．発明の分野
本発明は抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体を含有する医薬組成物及び前記抗体の治療用途に関する。

３．背景
血管新生は腫瘍増殖、増殖網膜症、加齢黄斑変性、関節リウマチ（ＲＡ）及び乾癬を含む各種病態に関与しているため、魅力的な治療ターゲットであることが明らかになっている（Ｆｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０９３１−１０９３４）。特定の分子血管新生因子が最初に注目されたのは、移植した腫瘍により強い血管新生応答が誘導されることが認められたためであった。現在では、血管新生が大半の原発腫瘍の増殖とその後の転移に不可欠であることは周知である。最初の報告後、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、腫瘍壊死因子−α、アンギオゲニン、インターロイキン（ＩＬ）−８及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、別称ＶＥＧＦＡないし血管透過性因子（ＶＰＦ））を含む多数の分子が血管新生の正の調節に関連付けられている（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：６６９−６７６）。

ＶＥＧＦ蛋白質は正常な胚形成期の脈管形成（胚循環系の新規形成）と異常な血管新生（既存脈管構造からの血管の増殖）の両面に関与する重要なシグナル伝達蛋白質である（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３９−４４２；Ｄｖｏｒａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１０２９−１０３９）。ＶＥＧＦは固形腫瘍及び血液悪性疾患、眼内血管新生症候群、炎症及び脳浮腫、並びに女性生殖管疾患に関係がある（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：６６９−６７６）。ＶＥＧＦ ｍＲＮＡは肺、乳房、胃腸管、腎臓、膵臓及び卵巣の腫瘍を含む多数のヒト腫瘍で過剰発現される（Ｂｅｒｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：１５３−１５９）。房水及び硝子体液におけるＶＥＧＦの増加は各種網膜症に関連付けられている（Ａｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：１４８０−１４８７）。高齢者の失明の主因である加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は血管新生と血管漏出に起因する。ＡＭＤ患者では脈絡膜血管新生膜にＶＥＧＦの局在が認められている（Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔａｌｍｏ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３７：８５５−８６８）。

ＶＥＧＦ遺伝子ファミリーは原型メンバーであるＶＥＧＦＡに加え、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤ及び胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）を含む。ヒトＶＥＧＦＡ遺伝子は７個のイントロンにより分断された８個のエクソンとして構成される。ＶＥＧＦにはＶＥＧＦ_１２１、ＶＥＧＦ_１４５、ＶＥＧＦ_１６２、ＶＥＧＦ_１６５、ＶＥＧＦ_１６５ｂ、ＶＥＧＦ_１８３、ＶＥＧＦ_１８９及びＶＥＧＦ_２０６を含む少なくとも６種類の異なるアイソフォームが存在し、ここで下付き文字はシグナル開裂後に残存するアミノ酸数を表す。天然ＶＥＧＦは４５ｋＤａホモダイマーヘパリン結合糖蛋白質である（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：６６９−６７６）。ＶＥＧＦ（具体的にはＶＥＧＦＡ）は２種の近縁受容体チロシンキナーゼであるＶＥＧＦＲ−１（別称Ｆｌｔ−１）とＶＥＧＦＲ−２（別称Ｆｌｋ−１ないしキナーゼドメイン領域（ＫＤＲ）ないしＣＤ３０９）とに結合する。各受容体は７個の細胞外領域と１個の膜貫通領域をもつ。ＶＥＧＦはニューロピリンＮＲＰ１（別称血管内皮細胞増殖因子１６５受容体（ＶＥＧＦ１６５Ｒ）又はＣＤ３０４）及びＮＲＰ２（別称血管内皮細胞増殖因子１６５受容体２（ＶＥＧＦ１６５Ｒ２））とも結合する。

血管新生調節におけるその中心的な役割により、ＶＥＧＦは治療介入の魅力的なターゲットとなる。実際に、ＶＥＧＦ又はその受容体シグナル伝達系の阻害を目的とする各種治療ストラテジーが新生物疾患の治療用に目下開発中である。抗ＶＥＧＦ抗体であるベバシズマブはｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ又はＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）とも呼ばれ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより創製・販売されている組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である（Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９）。ベバシズマブを作製するために、マウス抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク及びＩｇＧ定常領域に移植した。次にＣＤＲ外の他の突然変異を分子に導入して結合を改善し、アミノ酸配列の〜９３％がヒトＩｇＧ_１に由来し、配列の〜７％がマウス抗体Ａ．４．６．１に由来する抗体を得た。ベバシズマブは分子量約１４９，０００ダルトンであり、グリコシル化されている。

ラニビズマブはベバシズマブに由来する親和性成熟Ｆａｂフラグメントである。ラニビズマブはＶＥＧＦに対する親和性が高く、寸法が小さいため、網膜に浸透し易く、従って、ＡＭＤに関連する眼内血管新生を治療し易い（Ｌｉｅｎ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ，Ｉｎ：Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ，２００８，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １８１，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ １３１−１５０）。ラニビズマブはＧｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発され、商品名Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）で販売されている。

Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）を含むレジメンで癌患者を治療すると、高血圧、尿蛋白、血栓イベント、出血及び心臓中毒を含む副作用を生じる可能性がある（Ｂｌｏｗｅｒｓ ＆ Ｈａｌｌ，２００９，Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｒｓ．１８（６）：３５１−６，３５８）。また、ヒト化抗体であるにも拘わらず、ベバシズマブはヒトに投与した場合に免疫応答を誘発する可能性がある。このような免疫応答の結果、免疫複合体により抗体又はフラグメントが循環から排出され、反復投与が治療に不適切になるため、患者への治療効果が弱まり、抗体の再投与が制限されかねない。

Ｆｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０９３１−１０９３４ Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：６６９−６７６ Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３９−４４２ Ｄｖｏｒａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１０２９−１０３９ Ｂｅｒｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：１５３−１５９ Ａｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：１４８０−１４８７ Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔａｌｍｏ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３７：８５５−８６８ Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９ Ｌｉｅｎ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ，Ｉｎ：Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ，２００８，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １８１，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ １３１−１５０ Ｂｌｏｗｅｒｓ ＆ Ｈａｌｌ，２００９，Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｒｓ．１８（６）：３５１−６，３５８

従って、例えばベバシズマブよりも親和性が高く、少ない用量で投与することができる変異体、又はベバシズマブに比較して免疫原性及び他の副作用の弱い変異体を作製することにより、これらの問題の１つ以上を解決する改良型抗ＶＥＧＦ抗体又はフラグメントを提供することが必要である。

セクション３又は本願の他のセクションで資料を引用又は記載する場合にはこのような資料が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものとして解釈すべきでない。

４．概要
本発明はベバシズマブ又はラニビズマブに比較して免疫原性を低下及び／又はＶＥＧＦに対する親和性を改善した抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブの変異体に関する。ベバシズマブは（アミノ末端からカルボキシ末端に向かって）本願でＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３と呼ぶ３個の重鎖ＣＤＲと、（アミノ末端からカルボキシ末端に向かって）本願でＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３と呼ぶ３個の軽鎖ＣＤＲをもつ。ベバシズマブＣＤＲの配列を図１Ａ及び１Ｂに示し、その番号付けを表１（重鎖ＣＤＲ）と表２（軽鎖ＣＤＲ）に示す。ベバシズマブの親和性成熟により近縁抗体であるラニビズマブを作製した。ラニビズマブはＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３及びＣＤＲ−Ｈ２配列がベバシズマブと同一であるが、そのＣＤＲ−Ｈ１及びＣＤＲ−Ｈ３配列はベバシズマブの配列と相違する。ラニビズマブの重鎖及び軽鎖配列を図１Ｃに示し、ＣＤＲを図１Ｄに示す。

本発明の抗体は一般にベバシズマブ及びラニビズマブに比較して少なくとも１個の重鎖ＣＤＲに少なくとも１カ所のアミノ酸置換をもつ。

所定態様において、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブ又はラニビズマブに比較してＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｓ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｑ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＹ５３Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｅ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｄ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｐ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９８Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｅ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｄ、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ、及びＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ５１Ａから選択される少なくとも１カ所の置換を含む。他の態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は表８及び９から選択される少なくとも１カ所の置換を含む。親和性を改善した変異体抗体に導入することができる他の突然変異としては、表６に記載するもの等の候補脱免疫化置換と、限定されないが、表１０及び１１に記載する突然変異等の抗体のＶＥＧＦ結合能を失わせない他の突然変異（例えば置換）、又は表１２−１〜１２−９及び１３に記載する突然変異等の公知突然変異が挙げられる。導入することができる更に他の突然変異としては、限定されないが、表１４〜１６に記載する突然変異が挙げられる。

特定実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は表７から選択される置換組合せ、及び場合により１種以上の他の突然変異（例えば表６に記載するもの等の候補脱免疫化置換と、限定されないが、表１０及び１１に記載する突然変異等の抗体のＶＥＧＦ結合能を失わせない他の突然変異（例えば置換）、又は表１２−１〜１２−９及び１３に記載する突然変異等の公知突然変異）を含む。本発明の抗ＶＥＧＦ抗体に導入することができる更に他の突然変異としては、限定されないが、表１４〜１６に記載する突然変異が挙げられる。

他の実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は以下のＣＤＲ置換：Ｋ６４Ｓ（ＣＤＲ−Ｈ２）、Ｋ６４Ｑ（ＣＤＲ−Ｈ２）、Ｙ５３ＦとＫ６４Ｑ（ＣＤＲ−Ｈ２）、Ｈ９７ＥとＹ９８Ｆ（ＣＤＲ−Ｈ３）、又はＴ５１Ａ（ＣＤＲ−Ｌ２）の１種以上を含む。抗ＶＥＧＦ抗体は更に、場合により表６、７、８、９、１０、１１、１２−１〜１２−９又は１３〜１６の１以上から選択される１種以上の他の突然変異又は突然変異の組合せを含むことができる。

他のＣＤＲ置換としては、Ｎ３１Ｆ（ＣＤＲ−Ｈ１）、Ｈ９７Ｅ（ＣＤＲ−Ｈ３）、Ｈ９７Ｄ（ＣＤＲ−Ｈ３）、Ｈ９７Ｐ（ＣＤＲ−Ｈ３）、Ｙ９９Ｅ（ＣＤＲ−Ｈ３）、Ｙ９９Ｄ（ＣＤＲ−Ｈ３）、Ｓ１００ａＧ（ＣＤＲ−Ｈ３）（但し、ＣＤＲ−Ｈ３における３位は場合によりチロシン以外のものである）、Ｔ２８Ｐ、Ｎ３１Ｆ、Ｎ３１Ｇ及びＮ３１Ｍ（ＣＤＲ−Ｈ１）、Ｈ９７Ａ、Ｈ９７Ｑ、Ｈ９７Ｓ、Ｈ９７Ｔ、Ｓ１００ａＤ、Ｓ１００ａＥ及びＳ１００Ａｖ（ＣＤＲ−Ｈ３）、Ｔ３０Ｗ、Ｔ３０Ｒ又はＴ３０Ｑ（ＣＤＲ−Ｈ１）、Ｙ５３Ｆ、Ｔ５８Ｆ、Ａ６１Ｇ、Ａ６１Ｋ、Ａ６１Ｒ、Ａ６１Ｈ、Ａ６１Ｙ、Ｋ６４Ｇ、Ｋ６４Ｅ、Ｒ６５Ｌ、Ｒ６５Ｔ、Ｒ６５Ａ、Ｒ６５Ｅ及びＲ６５Ｄ（ＣＤＲ−Ｈ２）、並びにＹ９８Ｆ及びＹ１００ｅＦ（ＣＤＲ−Ｈ３）が挙げられる。ＣＤＲは場合により表６、７、８、９、１０、１１、１２−１〜１２−９及び１３の１以上から選択される１種以上の他の突然変異又は突然変異の組合せを含む。

更に他の置換としては、（ａ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｄと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｄと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；（ｂ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｐと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｄと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；（ｃ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｐと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｅ；（ｄ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｅと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｅ；（ｅ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｄと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｅ；（ｆ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｅと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｄと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；（ｇ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｄと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；（ｈ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｐと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９９Ｄ；（ｉ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｄと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；（ｊ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧ；又は（ｋ）ＣＤＲ−Ｈ１におけるＮ３１Ｆと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｐと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＳ１００ａＧから選択される置換組合せを含む重鎖ＣＤＲ置換が挙げられる。場合により他の置換としては、表６、７、８、９、１０、１１、１２−１〜１２−９及び１３の１以上から選択される１種以上の他の突然変異又は突然変異の組合せが挙げられる。

更に他の重鎖置換としては、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＡ６１Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＡ６１Ｅ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＡ６１Ｄ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｌ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｇ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｑ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｔ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｋ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｒ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｅ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＤ６２Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｓ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｖ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｑ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｖ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｆ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｎ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｓ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｑ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｋ、ＣＤＲ−Ｈ２におけるＲ６５Ｉ、及びＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９８Ｈから選択される少なくとも１カ所の置換が挙げられる。場合により、表７、８、９、１０、１１、１２−１〜１２−９及び１３の１以上から選択される１種以上の他の突然変異又は突然変異の組合せも挙げられる。

所定態様において、本発明の抗体はベバシズマブ又はラニビズマブのＶＨ及びＶＬ配列に対して少なくとも８０％の配列一致度（所定実施形態では、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列一致度）をもつＶＨ及びＶＬ配列をもち、ベバシズマブ又はラニビズマブに比較して少なくとも１個のＣＤＲに少なくとも１カ所のアミノ酸置換を含む。他の態様において、本発明の抗体はベバシズマブ又はラニビズマブのＶＨ及びＶＬ配列に対して少なくとも８０％の配列一致度（所定実施形態では、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列一致度）をもつＶＨ及びＶＬ配列をもち、ベバシズマブ又はラニビズマブに比較して少なくとも１個のフレームワーク領域に少なくとも１カ所のアミノ酸置換を含む。特定実施形態において、ベバシズマブ又はラニビズマブのＶＨ及びＶＬ配列に対する重鎖及び軽鎖の配列一致度百分率は独立して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列一致度、又は少なくとも９９％の配列一致度から選択される。所定態様において、本発明の抗体はベバシズマブ又はラニビズマブのＶＨ及び／又はＶＬ配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列一致度をもつＶＨ及び／又はＶＬ配列をもつ。

所定態様において、本発明の抗体はベバシズマブ又はラニビズマブに比較してそのＣＤＲに１７カ所までのアミノ酸置換をもつ。１７カ所のアミノ酸置換をもち、その標的結合能を維持する変異体抗体がＢｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３：１６１０−１４により作製されている。

特定実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は独立して
−ベバシズマブ又はラニビズマブの対応するＣＤＲに比較して１カ所まで、２カ所まで、３カ所まで、４カ所まで、５カ所まで、６カ所まで、７カ所まで、８カ所まで、９カ所まで又は１０カ所までのＣＤＲ−Ｈ１置換；
−ベバシズマブ又はラニビズマブの対応するＣＤＲに比較して１カ所まで、２カ所まで、３カ所まで、４カ所まで、５カ所まで、６カ所まで、７カ所まで、８カ所まで、９カ所まで、１０カ所まで、１１カ所まで、１２カ所まで、１３カ所まで、１４カ所まで、１５カ所まで、１６カ所まで又は１７カ所までのＣＤＲ−Ｈ２置換；
−ベバシズマブ又はラニビズマブの対応するＣＤＲに比較して１カ所まで、２カ所まで、３カ所まで、４カ所まで、５カ所まで、６カ所まで、７カ所まで、８カ所まで、９カ所まで、１０カ所まで、１１カ所まで、１２カ所まで、１３カ所まで又は１４カ所までのＣＤＲ−Ｈ３置換；
−ベバシズマブ又はラニビズマブの対応するＣＤＲに比較して１カ所まで、２カ所まで、３カ所まで、４カ所まで、５カ所まで、６カ所まで、７カ所まで、８カ所まで、９カ所まで、１０カ所まで又は１１カ所までのＣＤＲ−Ｌ１置換；
−ベバシズマブ又はラニビズマブの対応するＣＤＲに比較して１カ所まで、２カ所まで、３カ所まで、４カ所まで、５カ所まで、６カ所まで又は７カ所までのＣＤＲ−Ｌ２置換；及び
−ベバシズマブ又はラニビズマブの対応するＣＤＲに比較して１カ所まで、２カ所まで、３カ所まで、４カ所まで、５カ所まで、６カ所まで、７カ所まで、８カ所まで又は９カ所までのＣＤＲ−Ｌ３置換
をもつ。

本発明は更に修飾抗ＶＥＧＦ抗体を含有する医薬組成物を提供する。所定態様において、医薬組成物はベバシズマブ又はラニビズマブに比較してＶＥＧＦに対する親和性が増加及び／又は免疫原性が低下している。

本発明は本発明の抗ＶＥＧＦ抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、前記核酸を含むベクターを提供する。更に、本発明は抗ＶＥＧＦ抗体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換された原核及び真核宿主細胞と、前記ヌクレオチド配列を発現するように遺伝子組換えされた真核（例えば哺乳動物）宿主細胞も提供する。宿主細胞を培養することにより抗ＶＥＧＦ抗体を作製する方法も提供する。

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は癌（例えば結腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌及び乳癌）、網膜疾患（例えば加齢黄斑変性（「ＡＭＤ」））及び免疫疾患（例えば関節リウマチ）の治療に有用である。

所定態様において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブ又はラニビズマブに比較して少ない用量、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％少ない用量で使用することができる。

当然のことながら、特許出願の通例通り、本願では内容からそうでないことが明白である場合を除き、単数形の不定冠詞と定冠詞は１以上という意味で使用する。更に、特許出願の通例通り、本願では「又は」なる用語は離接接続詞「又は」又は接続詞「及び」の意味で使用する。

本明細書で言及する全刊行物を本願に組込む。本明細書で文献、行為、材料、装置、論文等について記載している場合には常に本発明の背景を提示することのみを目的とする。これらの如何なる内容も従来技術の根拠になると認めるものではなく、あるいは本願の優先日以前に何処かに存在していた本発明に関連する分野における通常の一般知識であると認めるものでもない。

本発明の特徴と利点はその実施形態に関する以下の詳細な説明から更に理解されよう。

５．表及び図面の簡単な説明

表１はベバシズマブの重鎖ＣＤＲにおけるアミノ酸の番号付けを示す。ＣＤＲ１〜３を夫々配列番号３〜５として開示する。 表２はベバシズマブの軽鎖ＣＤＲにおけるアミノ酸の番号付けを示す。ＣＤＲ１〜３を夫々配列番号６〜８として開示する。 表３は免疫原性について試験したベバシズマブＶＬペプチドを示す。 表４は免疫原性について試験したベバシズマブＶＨペプチドを示す。 表５はベバシズマブにおいて同定されたＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープ領域を示す。ＣＤＲ領域を下線で示す。 表６はベバシズマブの免疫原性を低下させるためのＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３における候補突然変異を示す。表６におけるアミノ酸の番号付けはベバシズマブ重鎖におけるカバット番号付けに対応する。 表７は表面プラズモン共鳴法により分析したＫ_Ｄ改善をもたらすベバシズマブにおける重鎖ＣＤＲアミノ酸置換を示す。Δｋ_ｏｎはｋ_ｏｎの改善倍率（突然変異体／ＷＴ）を意味する。Δｋ_ｏｆｆはｋ_ｏｆｆの改善倍率（ＷＴ／突然変異体）を意味する。ΔＫ_Ｄは野生型に比較した突然変異体におけるＫ_Ｄの改善を意味する。表７におけるアミノ酸の番号付けはベバシズマブ重鎖におけるカバット番号付けに対応する。 表８はＶＥＧＦに対する親和性を増加させることが予備結合試験により判明したベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける突然変異を示す（データは示さず）。表８におけるアミノ酸の番号付けはベバシズマブ重鎖におけるカバット番号付けに対応する。 表９はＶＥＧＦに対する親和性を増加させることが予備試験により判明したベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける突然変異を示す（データは示さず）。表９におけるアミノ酸の番号付けはベバシズマブ重鎖におけるカバット番号付けに対応する。 表１０は結合に影響を与えずに本発明の抗体に導入することができるベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける突然変異を示す。表１０におけるアミノ酸の番号付けはベバシズマブ重鎖におけるカバット番号付けに対応する。 表１１は結合に影響を与えずに本発明の抗体に導入することができるベバシズマブ軽鎖ＣＤＲにおける突然変異を示す。表１１におけるアミノ酸の番号付けはベバシズマブ軽鎖におけるカバット番号付けに対応する。 表１２−１〜１２−９は本発明の抗体に導入することができるベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける公知突然変異を示す。表１２−１〜１２−９の各行は別個の公知変異体を示す。各変異体について、公知ＣＤＲ配列を網かけで示す。表１２−１〜１２−９に示す各変異体の配列番号を夫々表２０−１〜２０−９に示す。ＣＤＲ−Ｈ１の列にはＣＤＲ−Ｈ１の部分配列を示す。ＣＤＲ−Ｈ１の最後のアスパラギンは示さない。この部分配列は配列番号４１１に対応する。この部分配列についてＣＤＲ−Ｈ１における公知突然変異を示すが、当然のことながら、全長ＣＤＲについてもこれらの突然変異が存在する。 表１２−１〜１２−９は本発明の抗体に導入することができるベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける公知突然変異を示す。表１２−１〜１２−９の各行は別個の公知変異体を示す。各変異体について、公知ＣＤＲ配列を網かけで示す。表１２−１〜１２−９に示す各変異体の配列番号を夫々表２０−１〜２０−９に示す。ＣＤＲ−Ｈ１の列にはＣＤＲ−Ｈ１の部分配列を示す。ＣＤＲ−Ｈ１の最後のアスパラギンは示さない。この部分配列は配列番号４１１に対応する。この部分配列についてＣＤＲ−Ｈ１における公知突然変異を示すが、当然のことながら、全長ＣＤＲについてもこれらの突然変異が存在する。 表１２−１〜１２−９は本発明の抗体に導入することができるベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける公知突然変異を示す。表１２−１〜１２−９の各行は別個の公知変異体を示す。各変異体について、公知ＣＤＲ配列を網かけで示す。表１２−１〜１２−９に示す各変異体の配列番号を夫々表２０−１〜２０−９に示す。ＣＤＲ−Ｈ１の列にはＣＤＲ−Ｈ１の部分配列を示す。ＣＤＲ−Ｈ１の最後のアスパラギンは示さない。この部分配列は配列番号４１１に対応する。この部分配列についてＣＤＲ−Ｈ１における公知突然変異を示すが、当然のことながら、全長ＣＤＲについてもこれらの突然変異が存在する。 表１２−１〜１２−９は本発明の抗体に導入することができるベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける公知突然変異を示す。表１２−１〜１２−９の各行は別個の公知変異体を示す。各変異体について、公知ＣＤＲ配列を網かけで示す。表１２−１〜１２−９に示す各変異体の配列番号を夫々表２０−１〜２０−９に示す。ＣＤＲ−Ｈ１の列にはＣＤＲ−Ｈ１の部分配列を示す。ＣＤＲ−Ｈ１の最後のアスパラギンは示さない。この部分配列は配列番号４１１に対応する。この部分配列についてＣＤＲ−Ｈ１における公知突然変異を示すが、当然のことながら、全長ＣＤＲについてもこれらの突然変異が存在する。 表１２−１〜１２−９は本発明の抗体に導入することができるベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける公知突然変異を示す。表１２−１〜１２−９の各行は別個の公知変異体を示す。各変異体について、公知ＣＤＲ配列を網かけで示す。表１２−１〜１２−９に示す各変異体の配列番号を夫々表２０−１〜２０−９に示す。ＣＤＲ−Ｈ１の列にはＣＤＲ−Ｈ１の部分配列を示す。ＣＤＲ−Ｈ１の最後のアスパラギンは示さない。この部分配列は配列番号４１１に対応する。この部分配列についてＣＤＲ−Ｈ１における公知突然変異を示すが、当然のことながら、全長ＣＤＲについてもこれらの突然変異が存在する。 表１２−１〜１２−９は本発明の抗体に導入することができるベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける公知突然変異を示す。表１２−１〜１２−９の各行は別個の公知変異体を示す。各変異体について、公知ＣＤＲ配列を網かけで示す。表１２−１〜１２−９に示す各変異体の配列番号を夫々表２０−１〜２０−９に示す。ＣＤＲ−Ｈ１の列にはＣＤＲ−Ｈ１の部分配列を示す。ＣＤＲ−Ｈ１の最後のアスパラギンは示さない。この部分配列は配列番号４１１に対応する。この部分配列についてＣＤＲ−Ｈ１における公知突然変異を示すが、当然のことながら、全長ＣＤＲについてもこれらの突然変異が存在する。 表１２−１〜１２−９は本発明の抗体に導入することができるベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける公知突然変異を示す。表１２−１〜１２−９の各行は別個の公知変異体を示す。各変異体について、公知ＣＤＲ配列を網かけで示す。表１２−１〜１２−９に示す各変異体の配列番号を夫々表２０−１〜２０−９に示す。ＣＤＲ−Ｈ１の列にはＣＤＲ−Ｈ１の部分配列を示す。ＣＤＲ−Ｈ１の最後のアスパラギンは示さない。この部分配列は配列番号４１１に対応する。この部分配列についてＣＤＲ−Ｈ１における公知突然変異を示すが、当然のことながら、全長ＣＤＲについてもこれらの突然変異が存在する。 表１２−１〜１２−９は本発明の抗体に導入することができるベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける公知突然変異を示す。表１２−１〜１２−９の各行は別個の公知変異体を示す。各変異体について、公知ＣＤＲ配列を網かけで示す。表１２−１〜１２−９に示す各変異体の配列番号を夫々表２０−１〜２０−９に示す。ＣＤＲ−Ｈ１の列にはＣＤＲ−Ｈ１の部分配列を示す。ＣＤＲ−Ｈ１の最後のアスパラギンは示さない。この部分配列は配列番号４１１に対応する。この部分配列についてＣＤＲ−Ｈ１における公知突然変異を示すが、当然のことながら、全長ＣＤＲについてもこれらの突然変異が存在する。 表１２−１〜１２−９は本発明の抗体に導入することができるベバシズマブ重鎖ＣＤＲにおける公知突然変異を示す。表１２−１〜１２−９の各行は別個の公知変異体を示す。各変異体について、公知ＣＤＲ配列を網かけで示す。表１２−１〜１２−９に示す各変異体の配列番号を夫々表２０−１〜２０−９に示す。ＣＤＲ−Ｈ１の列にはＣＤＲ−Ｈ１の部分配列を示す。ＣＤＲ−Ｈ１の最後のアスパラギンは示さない。この部分配列は配列番号４１１に対応する。この部分配列についてＣＤＲ−Ｈ１における公知突然変異を示すが、当然のことながら、全長ＣＤＲについてもこれらの突然変異が存在する。 表１３は本発明の抗体に導入することができるベバシズマブ軽鎖ＣＤＲにおける公知突然変異を示す。表１３の各行は別個の公知変異体を示す。各変異体について、公知ＣＤＲ配列を網かけで示す。表１３に示す各変異体の配列番号を表２０−１０に示す。 表１４は免疫原性について試験したベバシズマブＣＤＲ２ ＶＨペプチドを示し、配列番号６２から不変の残基は空欄により示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイ結果も示す。 表１４は免疫原性について試験したベバシズマブＣＤＲ２ ＶＨペプチドを示し、配列番号６２から不変の残基は空欄により示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイ結果も示す。 表１５は免疫原性について試験したベバシズマブＣＤＲ３ ＶＨペプチドを示し、配列番号７４から不変の残基は空欄により示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイ結果も示す。 表１６は免疫原性について試験したベバシズマブＣＤＲ２ ＶＬペプチドを示し、配列番号２５から不変の残基は空欄により示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイ結果も示す。 表１７はベバシズマブにおける３個のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの選択されたエピトープ変異を示す。 表１８は単一可変領域突然変異体とその付随する平均蛍光強度（ＭＦＩ）スコアを示す。 表１９は組合せ可変領域突然変異体とその付随するＥＣ_５０を示す。 表２０−１〜２０−１０は夫々表１２−１〜１２−９及び表１３に一覧を示したベバシズマブ変異体のＣＤＲに対応する配列番号が分かっている場合にはその配列番号を示す。Ｎ／ＡはＣＤＲ配列が不明であることを示す。 表２０−１〜２０−１０は夫々表１２−１〜１２−９及び表１３に一覧を示したベバシズマブ変異体のＣＤＲに対応する配列番号が分かっている場合にはその配列番号を示す。Ｎ／ＡはＣＤＲ配列が不明であることを示す。 表２０−１〜２０−１０は夫々表１２−１〜１２−９及び表１３に一覧を示したベバシズマブ変異体のＣＤＲに対応する配列番号が分かっている場合にはその配列番号を示す。Ｎ／ＡはＣＤＲ配列が不明であることを示す。 表２０−１〜２０−１０は夫々表１２−１〜１２−９及び表１３に一覧を示したベバシズマブ変異体のＣＤＲに対応する配列番号が分かっている場合にはその配列番号を示す。Ｎ／ＡはＣＤＲ配列が不明であることを示す。 表２０−１〜２０−１０は夫々表１２−１〜１２−９及び表１３に一覧を示したベバシズマブ変異体のＣＤＲに対応する配列番号が分かっている場合にはその配列番号を示す。Ｎ／ＡはＣＤＲ配列が不明であることを示す。 表２０−１〜２０−１０は夫々表１２−１〜１２−９及び表１３に一覧を示したベバシズマブ変異体のＣＤＲに対応する配列番号が分かっている場合にはその配列番号を示す。Ｎ／ＡはＣＤＲ配列が不明であることを示す。 表２０−１〜２０−１０は夫々表１２−１〜１２−９及び表１３に一覧を示したベバシズマブ変異体のＣＤＲに対応する配列番号が分かっている場合にはその配列番号を示す。Ｎ／ＡはＣＤＲ配列が不明であることを示す。 表２０−１〜２０−１０は夫々表１２−１〜１２−９及び表１３に一覧を示したベバシズマブ変異体のＣＤＲに対応する配列番号が分かっている場合にはその配列番号を示す。Ｎ／ＡはＣＤＲ配列が不明であることを示す。 表２０−１〜２０−１０は夫々表１２−１〜１２−９及び表１３に一覧を示したベバシズマブ変異体のＣＤＲに対応する配列番号が分かっている場合にはその配列番号を示す。Ｎ／ＡはＣＤＲ配列が不明であることを示す。 表２０−１〜２０−１０は夫々表１２−１〜１２−９及び表１３に一覧を示したベバシズマブ変異体のＣＤＲに対応する配列番号が分かっている場合にはその配列番号を示す。Ｎ／ＡはＣＤＲ配列が不明であることを示す。 図１Ａは夫々ベバシズマブ重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列である配列番号１及び配列番号２を示し、ＣＤＲ領域を太字下線で示す。 図１ＢはベバシズマブのＣＤＲ配列と対応する配列番号を示す。 図１Ｃは夫々ラニビズマブ重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列である配列番号９及び配列番号１０を示し、ＣＤＲ領域を太字下線で示す。 図１ＤはラニビズマブのＣＤＲ配列と対応する配列番号を示す。 図２Ａ〜２ＢはベバシズマブＶＬペプチド応答を示す。図２Ａは刺激指数２．９５以上で各ＶＬペプチドに応答したドナーの百分率を示す。Ｎ＝ドナー９９人。図２Ｂはペプチド毎に全９９人のドナーの平均刺激指数±標準誤差を示す。 図３Ａ〜３ＢはベバシズマブＶＨペプチド応答を示す。図３Ａは刺激指数２．９５以上で各ＶＨペプチドに応答したドナーの百分率を示す。Ｎ＝ドナー９９人。図３Ｂはペプチド毎に全９９人のドナーの平均刺激指数±標準誤差を示す。 図４Ａ〜４Ｃは突然変異体ベバシズマブエピトープペプチドに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示す。未変異親エピトープ配列に対する平均応答を白記号で示す。大きい丸は表１７に示す選択変異を表す。図４ＡはＶＨ ＣＤＲ２ペプチドに対応する。 図４Ａ〜４Ｃは突然変異体ベバシズマブエピトープペプチドに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示す。未変異親エピトープ配列に対する平均応答を白記号で示す。大きい丸は表１７に示す選択変異を表す。図４ＢはＶＨ ＣＤＲ３ペプチドに対応する。 図４Ａ〜４Ｃは突然変異体ベバシズマブエピトープペプチドに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示す。未変異親エピトープ配列に対する平均応答を白記号で示す。大きい丸は表１７に示す選択変異を表す。図４ＣはＶＬ ＣＤＲ２ペプチドに対応する。

６．詳細な説明
６．１ 抗ＶＥＧＦ抗体
本発明は抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。特に指定しない限り、「抗体」（Ａｂ）なる用語は特定抗原と特異的に結合するか又は前記抗原に対して免疫反応性の免疫グロブリン分子を意味し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子組換え抗体及び他の改変型抗体を包含し、前記改変型抗体としては、限定されないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば二重特異性抗体、ダイアボディ、トライアボディ及びテトラボディ）及び抗体の抗原結合フラグメント（例えばＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ及びｓｃＦｖフラグメント）が挙げられる。更に、特に指定しない限り、「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）なる用語はインタクト分子に加え、蛋白質と特異的に結合することが可能な抗体フラグメント（例えばＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２フラグメント）も包含するものとする。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２フラグメントはインタクト抗体のＦｃフラグメントを含まず、動物の循環からより迅速に排出され、インタクト抗体よりも非特異的組織結合が少ないと思われる（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６）。

「ｓｃＦｖ」なる用語は従来の抗体の重鎖と軽鎖の可変領域を連結して１本鎖を形成した１本鎖Ｆｖ抗体を意味する。

「ＶＨ」とは抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を意味し、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はＦａｂの重鎖を含む。「ＶＬ」とは免疫グロブリン軽鎖の可変領域を意味し、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はＦａｂの軽鎖を含む。抗体（Ａｂ）と免疫グロブリン（Ｉｇ）は同一の構造特徴をもつ糖蛋白質である。抗体は特定標的に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体と標的特異性をもたない他の抗体様分子の両方を包含する。天然抗体及び免疫グロブリンは通常では、２本の同一の軽（Ｌ）鎖と２本の同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖蛋白質である。各重鎖はアミノ末端に可変領域（ＶＨ）をもち、それに続いて多数の定常領域が存在する。各軽鎖はアミノ末端に可変領域（ＶＬ）をもち、カルボキシ末端に定常領域をもつ。

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はヒトＶＥＧＦと結合し、細胞におけるＶＥＧＦ受容体活性を阻害する。

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は抗体ベバシズマブ（別称Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））及び／又はラニビズマブ（別称Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））の相補性決定領域（ＣＤＲ）と配列において近縁のＣＤＲを含む。

ＣＤＲは軽鎖及び重鎖可変領域の両者で超可変領域とも呼ばれる。可変領域のより高度に保存された部分をフレームワーク（ＦＲ）と言う。当分野で公知の通り、抗体の超可変領域を規定するアミノ酸位置／境界は状況と当分野で公知の各種定義により異なる場合がある。可変領域内の所定の位置は、ある基準群下では超可変領域の内側にあるとみなすことができるが、別の基準群下では超可変領域の外側にあるとみなすことができるので、ハイブリッド超可変位置とみなすことができる。これらの位置の１個以上が拡張超可変領域に存在する場合もある。本発明はこれらのハイブリッド超可変位置に変異を含む抗体を提供する。天然重鎖及び軽鎖の可変領域は各々主にβシート構造をとる４個のＦＲ領域を３個のＣＤＲでつなぎ、βシート構造をつなぎ、場合によってはその一部となるループを形成する。各鎖におけるＣＤＲはＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順でＦＲ領域により極近接してつなぎ合わされ、他の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の標的結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．１９８７参照））。特に指定しない限り、本願で使用する免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けはＫａｂａｔらの免疫グロブリンアミノ酸残基番号付けシステムに従う。

ベバシズマブの重鎖及び軽鎖可変領域の配列を夫々配列番号１及び配列番号２により示す。図１Ａにも重鎖及び軽鎖可変領域の配列を示す。ベバシズマブのＣＤＲの配列とその対応する配列番号を図１Ｂに示す。本発明の組成物と方法では配列番号１又は配列番号２をコードする任意ヌクレオチド配列を使用することができる。

ラニビズマブの重鎖及び軽鎖の配列を夫々配列番号９及び配列番号１０により示す。図１Ｃにも重鎖及び軽鎖の配列を示す。ラニビズマブのＣＤＲの配列とその対応する配列番号を図１Ｄに示す。本発明の組成物と方法では配列番号９又は配列番号１０をコードする任意ヌクレオチド配列を使用することができる。

本発明は更にベバシズマブ及びラニビズマブのＣＤＲ配列に近縁のＣＤＲ配列を含む抗ＶＥＧＦ抗体フラグメントも提供する。「抗体フラグメント」なる用語は全長抗体の一部を意味し、一般には標的結合領域ないし可変領域を意味する。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２及びＦｖフラグメントが挙げられる。「Ｆｖ」フラグメントは完全な標的認識結合部位を含む最小抗体フラグメントである。この領域は１個の重鎖可変領域と１個の軽鎖可変領域を非共有的に緊密に結合した二量体（ＶＨ−ＶＬ二量体）から構成される。この構成において各可変領域の３個のＣＤＲは相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に標的結合部位を規定する。多くの場合には、６個のＣＤＲが抗体に対する標的結合特異性を付与する。しかし、場合によっては、１個の可変領域（又は標的に特異的な３個のＣＤＲのみからなるＦｖの半分）でも標的を認識し、結合することができる。「１本鎖Ｆｖ」ないし「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは１本のポリペプチド鎖に抗体のＶＨ領域とＶＬ領域を含む。一般に、Ｆｖポリペプチドは更にｓｃＦｖが標的結合に望ましい構造を形成できるようにＶＨ領域とＶＬ領域の間にポリペプチドリンカーを含む。「単一ドメイン抗体」は標的に対して十分な親和性を示す単一のＶＨ又はＶＬドメインから構成される。１特定実施形態において、単一ドメイン抗体はラクダ抗体である（例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：２５−３８参照）。

Ｆａｂフラグメントは軽鎖の定常領域と重鎖の第１の定常領域（ＣＨ_１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは抗体ヒンジ領域に由来する１個以上のシステインを含む少数の残基が重鎖ＣＨ_１領域のカルボキシル末端に付加されている点がＦａｂフラグメントと相違する。Ｆ（ａｂ’）フラグメントはＦ（ａｂ’）_２ペプシン消化産物のヒンジシステインにおけるジスルフィド結合の開裂により生成される。抗体フラグメントのその他の化学的カップリングも当業者に公知である。

所定実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はモノクローナル抗体である。本願で使用する「モノクローナル抗体」なる用語はハイブリドーマ法により作製される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」なる用語は任意真核、原核又はファージクローンを含むシングルクローンに由来する抗体を意味し、抗体の作製方法を意味するものではない。本発明に関して有用なモノクローナル抗体はハイブリドーマ法、組換え法及びファージディスプレイ法、又はその組み合わせの使用を含む当分野で公知の多様な技術を使用して作製することができる。本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はキメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体を包含する。

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はキメラ抗体とすることができる。本願で使用する「キメラ」なる用語はラット又はマウス抗体等の非ヒト免疫グロブリンに由来する可変配列と、一般にはヒト免疫グロブリン鋳型から選択されるヒト免疫グロブリン定常領域をもつ抗体を意味する。キメラ抗体の作製方法は当分野で公知である。例えばその開示内容全体を本願に組込むＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（４７１９）：１２０２−７；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４−２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；４，８１６，５６７号；及び４，８１６３９７号参照。

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はヒト化抗体とすることができる。「ヒト化」型の非ヒト（例えばマウス）抗体は非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント（例えば抗体のＦｖ，Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）_２又は他の標的結合サブドメイン）である。一般に、ヒト化抗体はＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全部又は実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である少なくとも１個、一般には２個の可変領域の実質的に全部を含む。ヒト化抗体は更に免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、一般にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含むことができる。抗体ヒト化方法は当分野で公知である。例えばいずれもその開示内容全体を本願に組込むＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−７；Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号；５，５８５，０８９号；５，６９３，７６１号；５，６９３，７６２号；及び６，１８０，３７０号；ＥＰ２３９４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；ＥＰ５９２１０６；ＥＰ５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２８：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．７：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９６９−９７３；並びに米国特許第５，５６５，３３２号参照。

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はヒト抗体とすることができる。ヒト患者の治療処置には完全「ヒト」抗ＶＥＧＦ抗体が望ましいと思われる。本願で使用する「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列をもつ抗体と、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体又は１種以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、内在性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を包含する。ヒト抗体はヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用してファージディスプレイ法を含む当分野で公知の各種方法により作製することができる。各々その開示内容全体を本願に組込む米国特許第４，４４４，８８７号及び４，７１６，１１１号；並びにＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５；ＷＯ９８／５０４３３；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９８／１６６５４；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；及びＷＯ９１／１０７４１参照。機能的内在性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用してヒト抗体を作製することもできる。例えばその開示内容全体を本願に組込むＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号；５，６２５，１２６号；５，６３３，４２５号；５，５６９，８２５号；５，６６１，０１６号；５，５４５，８０６号；５，８１４，３１８号；５，８８５，７９３号；５，９１６，７７１号；及び５，９３９，５９８号参照。更に、Ｍｅｄａｒｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、Ａｓｔｅｌｌａｓ Ｐｈａｒｍａ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）及びＲｅｇｅｎｅｒｏｎ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）等の企業に委託し、上記と同様の技術を使用して選択抗原に対するヒト抗体を提供してもらうことができる。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は「誘導選択」と呼ばれる技術を使用して作製することができる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えばマウス抗体）を使用し、同一エピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３）。

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は霊長類化抗体とすることができる。「霊長類化抗体」なる用語はサル可変領域とヒト定常領域を含む抗体を意味する。霊長類化抗体の作製方法は当分野で公知である。例えばその開示内容全体を本願に組込む米国特許第５，６５８，５７０号；５，６８１，７２２号；及び５，６９３，７８０号参照。

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は二重特異性抗体とすることができる。二重特異性抗体は少なくとも２種類の異なる抗原に対して結合特異性をもつモノクローナル抗体であり、多くの場合にはヒト又はヒト化抗体である。本発明では、結合特異性の一方をＶＥＧＦに対する特異性とすることができ、他方を他の任意抗原、例えば細胞表面蛋白質、受容体、受容体サブユニット、組織特異抗原、ウイルス由来蛋白質、ウイルスにコードされるエンベロープ蛋白質、細菌由来蛋白質又は細菌表面蛋白質等に対する特異性とすることができる。１特定実施形態において、本発明の抗体はＶＥＧＦとＣＤ３の両方に対する結合特異性をもつ二重特異性抗体である。

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は誘導体化抗体を含む。例えば、限定されないが、誘導体化抗体は一般にグルコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知保護基／ブロッキング基による誘導体化、蛋白分解、細胞リガンド又は他の蛋白質との結合（抗体コンジュゲートについては、セクション６．６参照）等により修飾されている。限定されないが、特異的化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等の公知技術により多数の化学修飾の任意のものを実施することができる。更に、例えばａｍｂｒｘ技術を使用して１種以上の非天然アミノ酸を誘導体に導入することもできる（例えばＷｏｌｆｓｏｎ，２００６，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３（１０）：１０１１−２参照）。

本発明の更に別の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体又はそのフラグメントは対応する野生型配列に対して少なくとも１種の定常領域介在性生物学的エフェクター機能を変更するように配列を改変した抗体又は抗体フラグメントとすることができる。

例えば、所定実施形態では、非改変抗体に対して少なくとも１種の定常領域介在性生物学的エフェクター機能を低下させるように、例えばＦｃ受容体（ＦｃγＲ）との結合性を低下させるように、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を改変することができる。ＦｃγＲ相互作用に必要な特定領域で抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異させることによりＦｃγＲ結合性を低下させることができる（例えばＣａｎｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１；及びＬｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７−２６６２参照））。抗体のＦｃγＲ結合能を低下させると、オプソニン化、食作用及び抗原依存性細胞傷害作用（「ＡＤＣＣ」）等のＦｃγＲ相互作用に依存する他のエフェクター機能も低下させることができる。

他の実施形態では、非改変抗体に対して少なくとも１種の定常領域介在性生物学的エフェクター機能を獲得又は改善するように、例えばＦｃγＲ相互作用を強化するように、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を改変することができる（例えばＵＳ２００６／０１３４７０９参照）。例えば、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は対応する野生型定常領域よりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡと結合する定常領域をもつことができる。

従って、本発明の抗体はオプソニン化、食作用又はＡＤＣＣの亢進又は低下を生じるように生物学的活性を改変することができる。このような改変は当分野で公知である。例えば、ＡＤＣＣ活性を低下させる抗体の改変は米国特許第５，８３４，５９７号に記載されている。典型的なＡＤＣＣ低下変異体は米国特許第５，８３４，５９７号の図４に示される「突然変異体３」に対応し、残基２３６を欠失させ、残基２３４、２３５及び２３７（ＥＵ番号付けを使用）をアラニンで置換したものである。

所定実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はフコース濃度が低いか又はフコースを含まない。フコースを含まない抗体は特に抗体用量が低い場合にＡＤＣＣ活性の増加に相関されている。Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−７３参照。フコース不含抗体の作製方法としては、ラット骨髄腫ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）で増殖させる方法が挙げられる。ＹＢ２／０細胞はポリペプチドのフコシル化に必要な酵素であるα−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８ ｍＲＮＡの発現レベルが低い。

更に別の態様において、抗ＶＥＧＦ抗体又はそのフラグメントは例えば胎児性Ｆｃ受容体であるＦｃＲｎ相互作用に関与する特定領域で免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異させることによりＦｃＲｎに対するその結合親和性を増加又は低下させるように改変した抗体又は抗体フラグメントとすることができる。（例えばＷＯ２００５／１２３７８０参照）。特定実施形態では、重鎖定常領域のアミノ酸残基２５０、３１４及び４２８のうちの少なくとも１個を単独又は任意組み合わせ（例えば２５０位と４２８位、又は２５０位と３１４位、又は３１４位と４２８位、又は２５０位と３１４位と４２８位、特に２５０位と４２８位の組み合わせ）で置換するように、ＩｇＧクラスの抗ＶＥＧＦ抗体を突然変異させる。２５０位では、置換するアミノ酸残基はスレオニン以外の任意アミノ酸残基とすることができ、限定されないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン又はチロシンが挙げられる。３１４位では、置換するアミノ酸残基はロイシン以外の任意アミノ酸残基とすることができ、限定されないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンが挙げられる。４２８位では、置換するアミノ酸残基はメチオニン以外の任意アミノ酸残基とすることができ、限定されないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンが挙げられる。適切なアミノ酸置換の特定の組み合わせは米国特許第７，２１７，７９７号の表１に記載されており、同表の開示内容全体を本願に組込む。このような突然変異はＦｃＲｎに対する抗体の結合性を増加し、抗体を分解から保護し、その半減期を延長する。

更に他の態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は例えばＪｕｎｇ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０（９）：９５９−９６６；Ｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７（５）：４８１−９．Ｅｐｕｂ ２００４ Ａｕｇ １７；及びＵＳ ２００７／０２８０９３１に記載されているように、その超可変領域の１個以上に１個以上のアミノ酸が挿入されている。

各種実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体又はそのフラグメントは異種宿主における発現を増加するように改変された抗体又は抗体フラグメントとすることができる。所定実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体又はそのフラグメントは異種宿主細胞における発現及び／又は異種宿主細胞からの分泌を増加するように改変された抗体又は抗体フラグメントとすることができる。所定実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体又はそのフラグメントは大腸菌等の細菌における発現を増加するように改変されている。他の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体又はそのフラグメントは酵母における発現を増加するように改変されている（Ｋｉｅｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：５６５１−５６５６）。更に他の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体又はそのフラグメントは昆虫細胞における発現を増加するように改変されている。他の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体又はそのフラグメントはＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞における発現を増加するように改変されている。

所定実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体又はそのフラグメントは産生中の抗体の安定性を増加するように改変された抗体又は抗体フラグメントとすることができる。所定実施形態において、抗体又はそのフラグメントはアスパラギンやグルタミン等の非酵素脱アミド化し易い１種以上のアミノ酸を脱アミド化しにくいアミノ酸で置換するように改変することができる（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７７：１４３２−１４３９）。他の実施形態において、抗体又はそのフラグメントはメチオニン、システイン又はトリプトファン等の酸化し易い１種以上のアミノ酸を酸化しにくいアミノ酸で置換するように改変することができる。更に他の実施形態において、抗体又はそのフラグメントはアスパラギンやグルタミン酸等の環化し易い１種以上のアミノ酸を環化しにくいアミノ酸で置換するように改変することができる。

６．２ 核酸分子及び発現系
本発明は本発明の抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸分子及び宿主細胞を包含する。

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は宿主細胞で免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子を組換え発現させることにより作製することができる。抗体を組換え発現させるためには、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを組込んだ１個以上の組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、軽鎖及び重鎖を宿主細胞で発現させ、場合により宿主細胞を培養する培地に分泌させ、培地から抗体を回収することができる。抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を獲得し、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組込み、ベクターを宿主細胞に導入するためには、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９８９）及び米国特許第４，８１６，３９７号に記載されている方法等の標準組換えＤＮＡ法を使用する。

１実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は１個以上のＣＤＲにおける変異を除き、ベバシズマブ又はラニビズマブと同様である。別の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は１個以上のフレームワーク領域における変異を除き、ベバシズマブ又はラニビズマブと同様である。更に別の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は１個以上のＣＤＲと１個以上のフレームワーク領域における変異を除き、ベバシズマブ又はラニビズマブと同様である。このような抗体を本願では「ベバシズマブ近縁」又は「ラニビズマブ近縁」配列と総称し、単に本発明の抗ＶＥＧＦ抗体と言う場合もある。抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸を作製するためには、先ず軽鎖及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡフラグメントを得る。これらのＤＮＡは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して軽鎖及び重鎖可変領域配列をコードする生殖系列ＤＮＡ又はｃＤＮＡの増幅と改変により得ることができる。ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は当分野で公知である（例えば「ＶＢＡＳＥ」ヒト生殖系列配列データベース参照；更に各々その開示内容を特に本願に組込むＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２Ｔ：１１６−１９８；及びＣｏｘ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６も参照）。ベバシズマブ又はラニビズマブの重鎖又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡフラグメントを合成し、突然変異誘発用鋳型として使用し、常法の突然変異誘発技術を使用して本願に記載するような変異体を作製することもできるし、あるいは、前記変異体をコードするＤＮＡフラグメントを直接合成することもできる。

抗ＶＥＧＦ ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、例えば可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するように、これらのＤＮＡフラグメントを標準組換えＤＮＡ技術により更に操作することができる。これらの操作では、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡフラグメントを、抗体定常領域又はフレキシブルリンカー等の別の蛋白質をコードする別のＤＮＡフラグメントと機能的に連結する。この文脈で使用する「機能的に連結」なる用語は、２つのＤＮＡフラグメントによりコードされるアミノ酸配列がインフレームに維持されるように２つのＤＮＡフラグメントを結合することを意味する。

ＶＨをコードする単離されたＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ_１、ＣＨ_２、ＣＨ_３及び場合によりＣＨ_４）をコードする別のＤＮＡ分子と機能的に連結することにより、ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡを全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で公知であり（例えばＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２参照）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは標準ＰＣＲ増幅法により得ることができる。重鎖定常領域はＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域とすることができるが、所定実施形態ではＩｇＧ_１又はＩｇＧ_４定常領域である。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子では、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ_１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子と機能的に連結することができる。

ＶＬをコードする単離されたＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子と機能的に連結することにより、ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡを全長軽鎖遺伝子（及びＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で公知であり（例えばＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）参照）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは標準ＰＣＲ増幅法により得ることができる。軽鎖定常領域はκ又はλ定常領域とすることができるが、所定実施形態ではκ定常領域である。ｓｃＦｖ遺伝子を作製するためには、ＶＬ領域とＶＨ領域をフレキシブルリンカーでつないでＶＨ配列とＶＬ配列を連続する１本鎖蛋白質として発現させることができるように、ＶＨをコードするＤＮＡフラグメントとＶＬをコードするＤＮＡフラグメントを、フレキシブルリンカーをコードする別のフラグメント、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ_４−Ｓｅｒ）_３をコードする別のフラグメントと機能的に連結する（例えばＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４参照）。

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を発現させるためには、遺伝子を転写制御配列及び翻訳制御配列と機能的に連結するように、上記のように得られた部分的又は全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入する。この文脈で「機能的に連結」なる用語は、ベクター内の転写制御配列及び翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を制御するというその所期機能を発揮するように、抗体遺伝子をベクターにライゲーションすることを意味する。発現ベクターと発現制御配列は使用する発現宿主細胞と適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子と抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入することもできるが、より一般には、両方の遺伝子を同一の発現ベクターに挿入する。

標準方法（例えば抗体遺伝子フラグメントとベクター上の相補的制限部位のライゲーション、又は制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション）により抗体遺伝子を発現ベクターに挿入する。本発明の抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖又は重鎖配列を挿入する前に、発現ベクターに予め抗体定常領域配列を組込むことができる。例えば、抗ＶＥＧＦ ＶＨ及びＶＬ配列を全長抗体遺伝子に変換する１つのアプローチは、ＶＨセグメントをベクター内のＣＨセグメントと機能的に連結し、ＶＬセグメントをベクター内のＣＬセグメントと機能的に連結するように、夫々重鎖定常領域と軽鎖定常領域を予めコードする発現ベクターに挿入する方法である。上記の追加又は代用として、組換え発現ベクターは宿主細胞からの抗体鎖の分泌を助長するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドを抗体鎖遺伝子のアミノ末端とインフレームで連結するように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチドでも異種シグナルペプチド（即ち非免疫グロブリン蛋白質に由来するシグナルペプチド）でもよい。

抗体鎖遺伝子に加え、本発明の組換え発現ベクターは宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を含む。「調節配列」なる用語はプロモーター、エンハンサー及び抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を包含するものとする。このような調節配列は例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）に記載されている。当業者に自明の通り、調節配列の選択を含めて発現ベクターの設計は、形質転換させる宿主細胞の選択、所望される蛋白質発現レベル等の因子に依存し得る。哺乳動物宿主細胞発現に適切な調節配列としては、哺乳動物細胞における高レベルの蛋白質発現を誘導するウイルスエレメントが挙げられ、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーが挙げられる。ウイルス調節エレメントとその配列の詳細な説明については、例えばＳｔｉｎｓｋｉの米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらの米国特許第４，５１０，２４５号及びＳｃｈａｆｆｎｅｒらの米国特許第４，９６８，６１５号参照。

抗体鎖遺伝子と調節配列に加え、本発明の組換え発現ベクターには、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）や選択マーカー遺伝子等の他の配列を組込むことができる。選択マーカー遺伝子はベクターを導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えばいずれもＡｘｅｌらの米国特許第４，３９９，２１６号、４，６３４，６６５号及び５，１７９，０１７号参照）。例えば、一般に選択マーカー遺伝子はベクターを導入された宿主細胞にＧ４１８、ピューロマイシン、ブラスチシジン、ハイグロマイシン又はメトトレキサート等の薬剤に対する耐性を付与する。適切な選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ＤＨＦＲ⁻宿主細胞におけるメトトレキサート選択／増幅用）とｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。軽鎖と重鎖を発現させるために、重鎖と軽鎖をコードする発現ベクターを標準技術により宿主細胞にトランスフェクトする。「トランスフェクション」なる用語の各種語形は外来ＤＮＡを原核又は真核宿主細胞に導入するために一般に使用されている多様な技術（例えばエレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション等）を包含するものとする。

本発明の抗体は原核又は真核宿主細胞のどちらでも発現させることが可能である。所定実施形態では、正しく折り畳まれた免疫的に活性な抗体を最適に分泌させるために、真核細胞、例えば哺乳動物宿主細胞で抗体の発現を実施する。本発明の組換え抗体を発現させるための典型的な哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０に記載されているＤＨＦＲ⁻ＣＨＯ細胞と、例えばＫａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８２，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているようなＤＨＦＲ選択マーカーの併用を含む）、ＮＳ０ミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞２９３細胞及びＳＰ２／０細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合には、宿主細胞における抗体の発現又は宿主細胞を増殖させる培地への抗体の分泌を可能にするために十分な時間にわたって宿主細胞を培養することにより抗体を産生させる。標準蛋白質精製法を使用して培地から抗体を回収することができる。ＦａｂフラグメントやｓｃＦｖ分子等のインタクト抗体の部分を作製するために宿主細胞を使用することもできる。当然のことながら、上記手順の変形も本発明の範囲に含まれる。例えば、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖又は重鎖のいずれか（両方ではない）をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトすることが望ましい場合もある。

ＶＥＧＦとの結合に不要な軽鎖及び重鎖のいずれか又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去するために組換えＤＮＡ技術を使用してもよい。このような短縮型ＤＮＡ分子から発現される分子も本発明の抗体に含まれる。

更に、標準化学架橋法により本発明の抗体を第２の抗体と架橋させることにより、一方の重鎖と一方の軽鎖が本発明の抗体であり、他方の重鎖と軽鎖がＶＥＧＦ以外の抗原に特異的である２機能性抗体を作製することもできる。２価抗体をコードするように組換えた核酸を発現させることにより２機能性抗体を作製することもできる。

所定実施形態では、軽鎖及び／又は重鎖ＣＤＲにおけるアミノ酸残基を突然変異させることにより、二重特異性抗体、即ち同一結合部位を使用してＶＥＧＦと非近縁抗原とに結合する抗体を作製することができる。各種実施形態では、抗原結合部位の周辺のアミノ酸残基を突然変異させることにより、ＨＥＲ２とＶＥＧＦ等の２種類の抗原と結合する二重特異性抗体を作製することができる（Ｂｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３：１６１０−１６１４）。二重特異性抗体をコードするように組換えた核酸を発現させることにより２機能性抗体を作製することもできる。

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を組換え発現させるためには、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクターと、軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターの２個の本発明の発現ベクターを宿主細胞にコトランスフェクトすればよい。一般には、２個のベクターは各々別々の選択マーカーを含む。あるいは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードする１個のベクターを使用してもよい。

抗ＶＥＧＦ抗体の１以上の部分をコードする核酸を作製後、例えば異なるＣＤＲ配列をもつ抗体、Ｆｃ受容体に対する親和性の低い抗体、又は異なるサブクラスの抗体をコードする核酸を作製するように、コーディング配列に別の改変又は突然変異を導入することができる。

化学合成により（例えばＳｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２^ｎｄ ｅｄ．，１９８４ Ｔｈｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．に記載されている方法により）本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を作製することもできる。無細胞プラットフォームを使用して変異体抗体を作製することもできる（例えばＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉａ Ｎｏ．２（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）参照）。

組換え発現により本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を作製後、免疫グロブリン分子の精製方法として当分野で公知の任意方法、例えばクロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、特にプロテインＡ又はプロテインＧ選択後のＶＥＧＦに対する親和性及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心、溶解度差又は他の任意標準蛋白質精製法により精製することができる。更に、精製を助長することが本願に記載されているか又は他の資料から当分野で知られている異種ポリペプチド配列と本発明の抗ＶＥＧＦ抗体又はそのフラグメントを融合することもできる。

単離後、所望により、例えば高性能液体クロマトグラフィー（例えばＦｉｓｈｅｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｏｒｋ ａｎｄ Ｂｕｒｄｏｎ，ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８０）参照）又はＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）でゲル濾過クロマトグラフィーにより抗ＶＥＧＦ抗体を更に精製することができる。

６．３ 抗ＶＥＧＦ抗体の生物学的活性
所定実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はＶＥＧＦとの結合についてベバシズマブ又はラニビズマブと競合したり、ＶＥＧＦ活性を中和する等の所定の生物学的活性をもつ。

従って、所定実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はＶＥＧＦとの結合についてベバシズマブ又はラニビズマブと競合する。ＶＥＧＦとの結合について競合する能力は競合アッセイを使用して試験することができる。競合アッセイの１例では、（例えばＰＢＳ中１μｇ／ｍＬの濃度で４℃にて一晩）ＶＥＧＦ溶液とマイクロウェルプレートを接触させることにより、固体表面（例えばマイクロウェルプレート）にＶＥＧＦを付着させる。プレートを（例えばＰＢＳ中０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄し、（例えばＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬで）ブロックする。飽和未満の量のビオチン化ベバシズマブ（８０ｎｇ／ｍＬ）又は等量のビオチン化ラニビズマブと非標識ベバシズマブ（又は場合によりラニビズマブ）（「参照」抗体）又は競合する抗ＶＥＧＦ抗体（「試験」抗体）抗体の混合物をＥＬＩＳＡ緩衝液（例えばＰＢＳ中１％ ＢＳＡ及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で（例えば２．８μｇ／ｍＬ、８．３μｇ／ｍＬ又は２５μｇ／ｍＬの濃度に）系列希釈してウェルに加え、プレートを温和に振盪しながら１時間温置する。プレートを洗浄し、ＥＬＩＳＡ緩衝液で希釈した１μｇ／ｍＬ ＨＲＰ共役ストレプトアビジンを各ウェルに加え、プレートを１時間温置する。プレートを洗浄し、結合した抗体を基質（例えばＴＭＢ，Ｂｉｏｆｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ）の添加により検出した。停止用緩衝液（例えばＢｉｏ ＦＸ Ｓｔｏｐ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｂｉｏｆｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ）の添加により反応を終了し、マイクロプレートリーダー（例えばＶＥＲＳＡｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して６５０ｎｍで吸光度を測定する。この競合アッセイの変形を使用して本発明の抗ＶＥＧＦ抗体とベバシズマブ又はラニビズマブの競合を試験することもできる。例えば、所定態様では、抗ＶＥＧＦ抗体を参照抗体として使用し、ベバシズマブ又はラニビズマブを試験抗体として使用する。更に、可溶性ＶＥＧＦの代わりに、培養細胞（例えば哺乳動物細胞）の表面で発現される膜結合型ＶＥＧＦを使用することもできる。競合アッセイの他のフォーマットも当分野で公知であり、利用することができる。

各種実施形態では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を０．０８μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬの濃度又は上記数値のいずれかを両端とする範囲の濃度（例えば２μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの範囲の濃度）で使用する場合に、抗ＶＥＧＦ抗体は標識ベバシズマブ又はラニビズマブの結合を少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は上記数値のいずれかを両端とする範囲の百分率だけ低下させる（例えば本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は標識ベバシズマブ又はラニビズマブの結合を５０％〜７０％低下させる）。

他の実施形態では、ベバシズマブ又はラニビズマブを０．４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬの濃度又は上記数値のいずれかを両端とする範囲の濃度（例えば２μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの範囲の濃度）で使用する場合に、ベバシズマブ又はラニビズマブは本発明の標識抗ＶＥＧＦ抗体の結合を少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は上記数値のいずれかを両端とする範囲の百分率だけ低下させる（例えばベバシズマブ又はラニビズマブは本発明の標識抗ＶＥＧＦ抗体の結合を５０％〜７０％低下させる）。

他の態様において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は細胞増殖や細胞遊走等のインビトロアッセイの範囲でＶＥＧＦ活性を阻害（又は中和）する。例えば、１実施形態において、アッセイされるＶＥＧＦ活性は内皮細胞（「ＥＣ」）増殖の誘導である（例えば、Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：３２５５０−３２５５８のプロトコル参照）。別の実施形態において、アッセイされるＶＥＧＦ活性はＥＣ遊走の誘導である（例えばＬｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２：３２９−３３３に記載されているインビトロスクラッチアッセイプロトコル参照）。１特定実施形態では、ＶＥＧＦにより刺激される増殖及び細胞遊走と不死化ウシ網膜内皮細胞でＶＥＧＦ_１６５により誘導されるタイトジャンクション蛋白質の脱局在化を阻止する能力について抗ＶＥＧＦ抗体を試験する（Ｄｅｉｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ９２：８３９−８４３）。更に別の実施形態では、レポーターアッセイを使用してＶＥＧＦ活性の中和をアッセイする（例えばＹｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ２６（４）：４１７−２０及び米国特許第６，７８７，３２３号参照）。

ＶＥＧＦ中和アッセイの他のフォーマットも当分野で公知であり、利用することができる。

各種実施形態では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を２ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬの濃度、又は上記数値のいずれかを両端とする範囲の濃度（例えば１μｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬの範囲の濃度）で使用する場合に、抗ＶＥＧＦ抗体はＶＥＧＦを少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は上記数値のいずれかを両端とする範囲の百分率だけ中和する（例えば本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はＶＥＧＦ活性を５０％〜７０％中和する）。

所定実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はＶＥＧＦの中和に関してベバシズマブもしくはラニビズマブの少なくとも０．７倍有効、０．８倍有効、少なくとも０．９倍有効、少なくとも１倍有効、少なくとも１．１倍有効、少なくとも１．２５倍有効、少なくとも１．５倍有効、少なくとも２倍有効、少なくとも５倍有効、少なくとも１０倍有効、少なくとも２０倍有効、少なくとも５０倍有効、少なくとも１００倍有効、少なくとも２００倍有効、少なくとも５００倍有効、少なくとも１０００倍有効であり、又はＶＥＧＦの中和の中和に関してベバシズマブもしくはラニビズマブに比較して上記数値の任意組合せを両端とする範囲の効力をもつ（例えばＶＥＧＦの中和に関してベバシズマブもしくはラニビズマブの０．９倍〜５倍有効又はベバシズマブもしくはラニビズマブの２倍〜５０倍有効である）。

６．４ 抗ＶＥＧＦ抗体の反応速度特性
所定実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はＶＥＧＦに対する高い結合親和性をもつ。特定実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は特定の会合速度定数（ｋ_ｏｎないしｋ_ａ値）、解離速度定数（ｋ_ｏｆｆないしｋ_ｄ値）、親和性定数（Ｋ_Ａ値）、解離定数（Ｋ_Ｄ値）及び／又はＩＣ_５０値をもつ。各種実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体とＶＥＧＦ受容体の相互作用の結合定数は、例えばＫａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５：２２９−２４０に開示されている方法に従い、表面プラズモン共鳴法を使用して測定することができる。所定態様において、このような数値は下記実施形態から選択される。

１特定実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は少なくとも１０^４Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^４Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^８Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも５×１０^８Ｍ^−１ｓ^−１、少なくとも１０^９Ｍ^−１ｓ^−１のｋ_ｏｎ又は上記数値の任意組合せを両端とする任意範囲のｋ_ｏｎ（例えば５×１０^５〜５×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、又は１０^７〜１０^８Ｍ^−１ｓ^−１）でＶＥＧＦと結合する。

別の実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は１０^−３ｓ^−１以下、５×１０^−４ｓ^−１以下、１０^−４ｓ^−１以下、５×１０^−５ｓ^−１以下、１０^−５ｓ^−１以下、５×１０^−６ｓ^−１以下、１０^−６ｓ^−１以下、５×１０^−７ｓ^−１以下、１０^−７ｓ^−１以下、５×１０^−８ｓ^−１以下、１０^−８ｓ^−１以下のｋ_ｏｆｆ速度、又は上記数値の任意組合せを両端とする任意範囲のｋ_ｏｆｆ速度（例えば５×１０^−４〜１０^−６ｓ^−１、又は１０^−３〜５×１０^−５ｓ^−１）でＶＥＧＦと結合する。

別の実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は少なくとも少なくとも１０^８Ｍ^−１、少なくとも５×１０^９Ｍ^−１、少なくとも１０^１０Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１０Ｍ^−１、１０^１１Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１１Ｍ^−１、少なくとも１０^１２Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１２Ｍ^−１、少なくとも１０^１３Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１３Ｍ^−１、少なくとも１０^１４Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１４Ｍ^−１、少なくとも１０^１５Ｍ^−１のＫ_Ａ（ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆ）、又は上記数値の任意組合せを両端とする任意範囲のＫ_Ａ（例えば５×１０^９Ｍ^−１〜１０^１１Ｍ^−１、又は１０^１１Ｍ^−１〜５×１０^１４Ｍ^−１）でＶＥＧＦと結合する。

他の実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は１０^−８Ｍ以下、５×１０^−９Ｍ以下、１０^−９Ｍ以下、５×１０^−１０Ｍ以下、１０^−１０Ｍ以下、５×１０^−１１Ｍ以下、１０^−１１Ｍ以下、５×１０^−１２Ｍ以下、１０^−１２Ｍ以下、５×１０^−１３Ｍ以下、１０^−１３Ｍ以下、５×１０^−１４Ｍ以下、１０^−１４Ｍ以下、５×１０^−１５Ｍ以下、１０^−１５Ｍ以下のＫ_Ｄ（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）、又は上記数値の任意組合せを両端とする任意範囲のＫ_Ｄ（例えば５×１０^−９〜５×１０^−１２Ｍ、又は５×１０^−１１Ｍ〜５×１０^−１３Ｍ）でＶＥＧＦと結合する。

特定実施形態において、Ｋ_Ｄ（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）値は当分野で周知であるか又は本願に記載するアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、蛍光偏光アッセイ又は他の任意バイオセンサー（例えばＢＩＡｃｏｒｅ）により測定される。

所定実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はＶＥＧＦと結合し、５×１０^７ｎＭ未満、１０^７ｎＭ未満、５×１０^６ｎＭ未満、１０^６ｎＭ未満、５×１０^５ｎＭ未満、１０^５ｎＭ未満、５×１０^４ｎＭ未満、１０^４ｎＭ未満、５×１０^３ｎＭ未満、１０^３ｎＭ未満、５×１０^２ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、９０ｎＭ未満、８０ｎＭ未満、７０ｎＭ未満、６５ｎＭ未満、６０ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５×１０^−１ｎＭ未満、１０^−１ｎＭ未満、５×１０^−２ｎＭ未満、１０^−２ｎＭ未満、５×１０^−３ｎＭ未満、１０^−３ｎＭ未満、５×１０^−４ｎＭ未満もしくは１０^−４ｎＭ未満のＩＣ_５０値、又は上記数値の任意組合せを両端とする任意範囲のＩＣ_５０（例えば５×１０^７〜５０ｎＭ、又は１５ｎＭ〜５×１０^−３ｎＭ）でＶＥＧＦ受容体（Ｆｌｔ−１又はＦｌｋ−１）に対するＶＥＧＦの結合を阻害する。ＩＣ_５０は当分野で周知の方法又は本願に記載する方法（例えばＥＬＩＳＡ）に従って測定することができる。

他の実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はＶＥＧＦと結合し、バイオアッセイ（例えばＥＣ増殖又は遊走）において５×１０^７ｎＭ未満、１０^７ｎＭ未満、５×１０^６ｎＭ未満、１０^６ｎＭ未満、５×１０^５ｎＭ未満、１０^５ｎＭ未満、５×１０^４ｎＭ未満、１０^４ｎＭ未満、５×１０^３ｎＭ未満、１０^３ｎＭ未満、５×１０^２ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、９０ｎＭ未満、８０ｎＭ未満、７０ｎＭ未満、６５ｎＭ未満、６０ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５×１０^−１ｎＭ未満、１０^−１ｎＭ未満、５×１０^−２ｎＭ未満、１０^−２ｎＭ未満、５×１０^−３ｎＭ未満、１０^−３ｎＭ未満、５×１０^−４ｎＭ未満もしくは１０^−４ｎＭ未満のＩＣ_５０値、又は上記数値の任意組合せを両端とする任意範囲のＩＣ_５０（例えば５×１０^７〜５０ｎＭ、又は１５ｎＭ〜５×１０^−３ｎＭ）でＶＥＧＦ活性を中和する。抗ＶＥＧＦ抗体のＩＣ_５０を測定するために使用することができる典型的な中和アッセイを下記セクション６．３に記載する。

所定実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体はＶＥＧＦと結合し、ＶＥＧＦ中和アッセイにおいて約１ｐｍ〜約１μＭのＩＣ_５０値でＦｌｔ−１、Ｆｌｋ−１もしくは両者に対するＶＥＧＦの結合を阻害するか又はＶＥＧＦ活性を阻害する。特定実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体はＶＥＧＦと結合し、ＶＥＧＦ中和アッセイにおいて１０ｐＭ〜１００ｎＭ、１００ｐＭ〜１０ｎＭ、２００ｐＭ〜５ｎＭ、３００ｐＭ〜４ｎＭ、５００ｐＭ〜３ｎＭ、７５０ｐＭ〜２ｎＭ、１ｎＭ〜２０ｎＭ、５００ｐＭ〜４０ｎＭ、５０ｐＭ〜５０ｎＭ、２５０ｐＭ〜１００ｎＭ及び１００ｎＭ〜１μＭのＩＣ_５０値、又は上記数値の任意組合せを両端とする任意範囲のＩＣ_５０（例えば１０ｐＭ〜５０ｎＭ、又は７５０ｐＭ〜２ｎＭ）でＦｌｔ−１、Ｆｌｋ−１もしくは両者に対するＶＥＧＦの結合を阻害するか又はＶＥＧＦ活性を阻害する。

上記実施形態の所定態様において、ＩＣ_５０は０．００１μＭ、０．００５μＭ、０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、１０００μＭ又は上記数値の任意組合せを両端とする任意範囲（例えば０．０１〜５０μＭ、又は１０μＭ〜１００μＭ）の濃度のＶＥＧＦの存在下で測定される。

所定実施形態において、本発明の抗体の反応速度特性は同等アッセイにおいてベバシズマブ又はラニビズマブと比較して同等であるか、又は改善されている。例えば、所定実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの約０．５倍〜１０００倍の範囲のｋ_ｏｎ速度、例えばベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの０．５倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの０．７５倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの０．９倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの１倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの１．１倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの１．２倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの１．３倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの１．４倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの１．５倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの１．７５倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの２倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの２．２５倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの２．５倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの３倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの４倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの５倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの７．５倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの１０倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの１５倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの２０倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの５０倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの７５倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの１００倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの１５０倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの２００倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの２００倍のｋ_ｏｎ、あるいは上記数値の任意組合せを両端とする範囲のｋ_ｏｎ、例えばベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの２倍〜７５倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの５倍〜１００倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの０．５倍〜１０００倍のｋ_ｏｎ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｎの０．７５倍〜２００倍のｋ_ｏｎ等でＶＥＧＦと結合する。

所定実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの０．００１倍〜３倍の範囲のｋ_ｏｆｆ速度、例えばベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの０．００２倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの０．００５倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの０．００７５倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの０．０１倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの０．０２５倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの０．０５倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの０．０７５倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの０．１倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの０．２５倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの０．５倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの０．７５倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの０．９倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの１倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの１．１倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの１．２５倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの１．５倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの１．７５倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの４倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの３倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの２倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの３倍のｋ_ｏｆｆ、あるいは上記数値の任意組合せを両端とする範囲のｋ_ｏｆｆ、例えばベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの０．０１倍〜１．１倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの０．０５倍〜１．２５倍のｋ_ｏｆｆ、ベバシズマブ又はラニビズマブのｋ_ｏｆｆの０．１倍〜０．９倍のｋ_ｏｆｆ等でＶＥＧＦと結合する。

他の実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの０．２５倍〜１０００倍の範囲のＫ_Ａ（ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆ）、例えばベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの０．５倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの０．７５倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの１倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの２倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの４倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの１０倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの１５倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの２０倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの３０倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの４０倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの５０倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの１００倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの２５０倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの５００倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの７５０倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの１０００倍のＫ_Ａあるいは上記数値の任意組合せを両端とする範囲のＫ_Ａ、例えばベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの０．７５倍〜１０ ５倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの１倍〜１００倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの１０倍〜２０倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの４倍〜５０倍のＫ_Ａ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ａの２倍〜２０倍のＫ_Ａ、あるいは本願に開示するｋ_ｏｎ速度とｋ_ｏｆｆ速度から計算することができる任意数値又は範囲のＫ_ＡでＶＥＧＦと結合する。

他の実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄ（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）の０．００１倍〜１０倍の範囲のＫ_Ｄ、例えばベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの０．００１倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの０．００５倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの０．０１倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの０．０５倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの０．０７５倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの０．１倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの０．２倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの０．３倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの０．４倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの０．５倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの０．６倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの０．７倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの０．８倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの０．９倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの１倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの１．５倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの２倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの４倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの７．５倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの１０倍のＫ_Ｄあるいは上記数値の任意組合せを両端とする範囲のＫ_Ｄ、例えばベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの０．０１倍〜２倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの０．１倍〜１．５倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブのＫ_Ｄの０．７倍〜４倍のＫ_Ｄ、ベバシズマブ又はラニビズマブの０．２倍〜２倍のＫ_Ｄ、あるいは本願に開示するｋ_ｏｎ速度とｋ_ｏｆｆ速度から計算することができる任意数値又は範囲のＫ_ＤでＶＥＧＦと結合する。

所定実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はＶＥＧＦと結合し、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．００１倍〜１０倍の範囲のＩＣ_５０値、例えばベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．００１倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．００５倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．０１倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．０５倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．０７５倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．１倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．２倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．３倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．４倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．５倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．６倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．７倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．８倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．９倍のＩＣ_５０、Ｉベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の１倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の１．５倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の２倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の４倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の７．５倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の１０倍のＩＣ_５０、あるいは上記数値の任意組合せを両端とする範囲のＩＣ_５０、例えばベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．０１倍〜２倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．１倍〜１．５倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．７倍〜４倍のＩＣ_５０、ベバシズマブ又はラニビズマブのＩＣ_５０の０．２倍〜２倍のＩＣ_５０でＦｌｔ−１、Ｆｌｋ−１もしくは両者に対するＶＥＧＦの結合を阻害するか又はＶＥＧＦの活性を中和する。所定実施形態では、単一ＣＤＲ置換によりベバシズマブ又はラニビズマブに比較してＩＣ_５０の上記差を生じることができるが、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はこのような置換に加え、ベバシズマブ又はラニビズマブに比較して１６カ所までの他のＣＤＲ置換を含むことができる。

６．５ 抗ＶＥＧＦ抗体の免疫原性低下
所定態様において、本発明はベバシズマブ又はラニビズマブに比較して免疫原性の低下した抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。本発明はベバシズマブのＣＤＲに比較してそのＣＤＲ及び／又はフレームワーク領域に単一又は複数のアミノ酸置換をもち、少なくとも１カ所の置換がベバシズマブ又はラニビズマブに比較して抗体の免疫原性を低下させる抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。所定実施形態において、免疫原性低下は１個以上のＴ細胞エピトープを消失又は減少させる１カ所以上のアミノ酸置換に起因する。

所定態様において、免疫原性の低下した本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブ又はラニビズマブに比較して生物学的活性、例えばＶＥＧＦに対する親和性又はＶＥＧＦ活性の中和が同等であるか又は改善されている。このような特性は例えば上記セクション６．３に記載した方法により試験することができる。

所定実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体の免疫原性はベバシズマブ又はラニビズマブ抗体に比較して低下している。このような抗体は一般に配列番号２５、配列番号６２及び／又は配列番号７４に対応する領域に重鎖及び／又は軽鎖可変領域に対する変異配列をもつ。前記抗体は一般に配列番号２５、配列番号６２及び配列番号７４に対応する１、２又は全３種の配列に１、２又は３カ所のアミノ酸置換をもつが、本願では１、２又は全３領域における４カ所又は５カ所までの置換が想定される。

本願で使用する「免疫原性の低下」した変異体とは、配列番号２５、配列番号６２及び／又は配列番号７４に対応する領域に夫々配列番号２５、配列番号６２又は配列番号７４のペプチドに比較して低い増殖応答を末梢血単核細胞に誘発する変異配列をもつ抗ＶＥＧＦ抗体を意味する。増殖応答を評価するために使用することができる代表的な増殖アッセイについては下記セクション７に記載する。増殖応答の低下は応答率百分率、刺激指数又は両者により表すことができる。

他の実施形態では、配列番号２５、配列番号６２又は配列番号７４の配列をもつペプチドに比較して、変異配列は少なくとも２５％の応答率低下、少なくとも３０％の応答率低下、少なくとも３５％の応答率低下、少なくとも４０％の応答率低下、少なくとも４５％の応答率低下、少なくとも５０％の応答率低下、少なくとも６０％の応答率低下、少なくとも６５％の応答率低下、少なくとも７０％の応答率低下、少なくとも７５％の応答率低下、少なくとも８０％の応答率低下、少なくとも８５％の応答率低下、少なくとも９０％の応答率低下、少なくとも９５％の応答率低下、１００％の応答率低下、又は上記数値のいずれかを両端とする範囲の応答率低下、例えば２５％〜７５％の応答率低下、５０％〜９０％の応答率低下、６０％〜１００％の応答率低下、７０％〜９０％の応答率低下等をもたらす。

他の実施形態において、変異配列は夫々配列番号２５、配列番号６２又は配列番号７４のペプチドにより誘発される刺激指数に対して刺激指数を少なくとも５％低下、少なくとも１０％低下、少なくとも１５％低下、少なくとも２０％低下、少なくとも２５％低下、少なくとも３０％低下、少なくとも３５％低下又は少なくとも４０％低下させるか、あるいは配列番号２５、配列番号６２又は配列番号７４のペプチドに比較して上記数値のいずれかを両端とする範囲の刺激指数の低下、例えば５％〜２０％低下、１０％〜３０％低下、２５％〜３５％低下、３０％〜４０％低下等をもたらす。

ベバシズマブ又はラニビズマブに比較して免疫原性の低下した候補抗ＶＥＧＦ抗体の典型的実施形態は表６に示すＣＤＲ置換又は置換組合せの１種以上を含む。場合により、ベバシズマブ又はラニビズマブに比較して免疫原性の低下した抗ＶＥＧＦ抗体は単独又は組合せとしての表７〜１３のいずれかにおけるＣＤＲ突然変異等の１カ所以上の他の置換を含む。

ベバシズマブ又はラニビズマブに比較して免疫原性の低下した候補抗ＶＥＧＦ抗体の更に他の典型的実施形態は表１４〜１６に示すＣＤＲ置換又は置換組合せの１種以上を含む。ベバシズマブ又はラニビズマブに比較して免疫原性の低下した抗ＶＥＧＦ抗体の所定の好ましい実施形態を表１９に示す。

６．６ 抗体コンジュゲート
本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は例えばＶＥＧＦとの結合を妨げないように任意型の分子を抗体と共有結合することにより修飾された抗体コンジュゲートを含む。

所定態様では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体をエフェクター部分又はラベルと共役することができる。本願で使用する「エフェクター部分」なる用語は例えば抗腫瘍剤、薬剤、毒素、生体活性蛋白質（例えば酵素、他の抗体又は抗体フラグメント）、合成又は天然ポリマー、核酸（例えばＤＮＡ及びＲＮＡ）、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート金属、ナノ粒子及びレポーター基（例えば蛍光化合物又はＮＭＲもしくはＥＳＲ分光法により検出可能な化合物）を包含する。

１例では、所定の生体応答を改変するように、細胞傷害性物質、放射性核種又は薬剤部分等のエフェクター部分と抗ＶＥＧＦ抗体を共役することができる。エフェクター部分は蛋白質又はポリペプチドとすることができ、限定するものではないが、例えば毒素（例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素）、シグナル伝達分子（例えばα−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子又は組織プラスミノーゲンアクチベーター）、抗血栓剤もしくは抗血管新生剤（例えばアンギオスタチン又はエンドスタチン）又はサイトカインもしくは成長因子等の生体応答調節剤（例えばインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又は神経成長因子（ＮＧＦ））が挙げられる。

別の例において、エフェクター部分は細胞毒素又は細胞傷害性物質とすることができる。細胞毒素及び細胞傷害性物質の例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシンとそのアナログ又はホモログが挙げられる。

エフェクター部分としては、限定されないが、更に代謝拮抗剤（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロソスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ５並びにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）（シスプラチン））、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（旧名ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（旧名アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）、及び有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）も挙げられる。

他のエフェクター部分としては、限定されないが、^１１１Ｉｎ及び^９０Ｙ、Ｌｕ^１７７、ビスマス^２１３、カリホルニウム^２５２、イリジウム^１９２並びにタングステン^１８８／レニウム^１８８等の放射性核種と、限定されないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミン等の薬剤が挙げられる。

このようなエフェクター部分を抗体に共役するための技術は当分野で周知である（例えばＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｐｐ．６２３−５３（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７））；Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７−１２３参照）。

１例では、抗体のＮ末端又はＣ末端又は内部で抗ＶＥＧＦ抗体又はそのフラグメントを共有結合（例えばペプチド結合）により別の蛋白質（又はその部分；好ましくは前記蛋白質の少なくとも１０、２０又は５０アミノ酸部分）のアミノ酸配列と融合する。抗体又はそのフラグメントを抗体の定常領域のＮ末端で他の蛋白質と結合することができる。このような融合体を作製するためには、例えばＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載されているように、組換えＤＮＡ法を使用することができる。別の例において、エフェクター分子は半減期をインビボで延長することができ、及び／又は上皮バリアを通して抗体を免疫系に送達し易くすることができる。この種の適切なエフェクター分子の例としては、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合蛋白質又はＷＯ２００５／１１７９８４に記載されているもの等のアルブミン結合化合物が挙げられる。

所定態様では、抗ＶＥＧＦ抗体を小分子毒素と共役する。所定の典型的な実施形態では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体をドラスタチンないしドロスタチンペプチドアナログ又は誘導体（例えばアウリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号及び５，７８０，５８８号））と共役する。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤部分はそのＮ（アミノ）末端、Ｃ（カルボキシル）末端又は内部で抗体と結合することができる（ＷＯ０２／０８８１７２）。典型的なアウリスタチン実施形態としては、その開示内容全体を本願に組込む米国特許第７，４９８，２９８号（例えばリンカーと共役したＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ等のモノメチルバリン化合物を製造するリンカーと方法を開示している）に開示されているような、Ｎ末端に結合したモノメチルアウリスタチン薬剤部分ＤＥ及びＤＦが挙げられる。

他の典型的実施形態において、小分子毒素としては、限定されないが、カリケアマイシン、メイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコテセン及びＣＣ１０６５が挙げられる。本発明の１実施形態では、抗体を１個以上のメイタンシン分子（例えば抗体分子１個当たり約１から約１０個のメイタンシン分子）と共役する。メイタンシンを例えばＭａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換し、Ｍａｙ−ＳＨ３に還元して抗体と反応させる（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１）と、メイタンシノイド−抗体又はメイタンシノイド−Ｆｃ融合コンジュゲートを作製することができる。同様に使用することができるカリケアマイシンの構造アナログとしては、限定されないが、γ_１ ^１、γ_３ ^１、Ｎ−アセチル−γ_１ ^１、ＰＳＡＧ及びθ_１ ^１が挙げられる（Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：３３３６−３３４２；Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：２９２５−２９２８；米国特許第５，７１４，５８６号；米国特許第５，７１２，３７４号；米国特許第５，２６４，５８６号；米国特許第５，７７３，００１号）。

本発明の抗体を標的送達のためにリポソームと共役することもできる（例えばＰａｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：３９９−４３５；Ｍａｒｔｙ ＆ Ｓｃｈｗｅｎｄｅｎｅｒ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０９：３８９−４０１参照）。

１例では、本発明の抗体をポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分と結合することができる。１特定例では、抗体は抗体フラグメントであり、利用可能な任意アミノ酸側鎖又は抗体フラグメントに位置する末端アミノ酸官能基（例えば任意遊離アミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基）を介してＰＥＧ部分を結合することができる。このようなアミノ酸は抗体フラグメントに天然に存在するものでもよいし、組換えＤＮＡ法を使用してフラグメントに組込んでもよい。例えば、米国特許第５，２１９，９９６号参照。複数部位を使用して２個以上のＰＥＧ分子を結合してもよい。抗体フラグメントに位置する少なくとも１個のシステイン残基のチオール基を介してＰＥＧ部分を共有結合することができる。結合点としてチオール基を使用する場合には、適切に活性化したエフェクター部分（例えばマレイミドやシステイン誘導体等のチオール選択的誘導体）を使用することができる。

１特定例において、抗ＶＥＧＦ抗体コンジュゲートは例えばＥＰ０９４８５４４に開示の方法に従ってペグ化、即ちＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を共有結合した修飾Ｆａｂ’フラグメントである。Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ（ｅｄ．），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ，１９９７）；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（Ｍ．Ａｓｌａｍ ａｎｄ Ａ．Ｄｅｎｔ，ｅｄｓ．，Ｇｒｏｖｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８）；及びＣｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：５３１−５４５も参照。ＰＥＧはヒンジ領域のシステインに結合することができる。１例において、ＰＥＧ修飾Ｆａｂ’フラグメントは修飾ヒンジ領域の１個のチオール基にマレイミド基を共有結合している。リジン残基をマレイミド基に共有結合することができ、リジン残基上のアミン基の各々に分子量約２０，０００Ｄａのメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーを結合することができる。従って、Ｆａｂ’フラグメントに結合されるＰＥＧの総分子量は約４０，０００Ｄａとすることができる。

本願で「ラベル」なる用語を使用する場合には、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体と直接又は間接的に共役することができる検出可能な化合物又は組成物を意味する。ラベルはそれ自体検出可能（例えば放射性同位体ラベル又は蛍光ラベル）でもよいし、酵素ラベルの場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的改変を触媒することができる。有用な蛍光部分としては、限定されないが、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジエチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリスリン等が挙げられる。有用な酵素ラベルとしては、限定されないが、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等が挙げられる。

特に診断目的に有用な他の抗ＶＥＧＦ抗体コンジュゲートについては、下記セクション６．７に記載する。

６．７ 抗ＶＥＧＦ抗体の診断用途
例えばビオチン化、西洋ワサビペルオキシダーゼ又は他の任意の検出可能な部分（セクション６．６に記載したものを含む）により修飾された抗体を含めて本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は診断目的に有利に使用することができる。

特に、抗ＶＥＧＦ抗体は例えば、限定されないが、インビトロ及びインビボ両者の診断法を含めてＶＥＧＦを精製又は検出するために使用することができる。例えば、前記抗体は生体試料中のＶＥＧＦの濃度を定性的及び定量的に測定するためのイムノアッセイで利用される。例えばその開示内容全体を本願に組込むＨａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８）参照。

本発明は更に診断剤と共役した抗体又はそのフラグメントを包含する。例えば、特定細胞、組織もしくは血清における該当標的の発現を検出するため、又は例えば所定治療レジメンの効力を判定するための臨床試験手順の一部として免疫応答の発生もしくは進行をモニターするために、抗体を診断用に使用することができる。抗体を検出可能な物質と結合することにより検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、各種酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、各種ポジトロン断層法を使用するポジトロン放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は当分野で公知の技術を使用して抗体（又はそのフラグメント）に直接又は媒介物（例えば当分野で公知のリンカー）を介して間接的に結合又は共役することができる。酵素ラベルの例としては、ルシフェラーゼ（例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ））、アルカリホスファターゼ、β−カラクトシダーゼ、アセチルコリンステラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ等が挙げられる。適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリスリンが挙げられ、発光物質の１例としてはルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられ、適切な放射性物質の例としては、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ又は^９９Ｔｃが挙げられる。

本発明は、（場合により検出可能な部分と共役した）本発明の１種以上の抗ＶＥＧＦ抗体を使用して生体試料（個体の細胞、組織又は体液）を接触させる段階と、試料がＶＥＧＦ発現に陽性であるか否か、又は試料の発現が対照試料に比較して変化（例えば増減）しているか否かを検出する段階を含むＶＥＧＦの発現の検出方法を提供する。

本発明の方法を使用して診断することができる疾患としては、限定されないが、本願に記載する疾患が挙げられる。所定実施形態において、組織又は体液は末梢血、末梢血白血球、生検（例えば肺又は皮膚生検）、及び組織である。

６．８ 抗ＶＥＧＦ抗体を使用する治療方法
６．８．１ 臨床効果
本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は病的血管新生を特徴とする各種新生物又は非新生物病態を治療するために使用することができる。

本発明の抗体は癌と良性腫瘍を含めて血管新生が腫瘍増殖に重要な役割を果たす腫瘍の治療で有用である。本願で治療する癌の例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫及び白血病が挙げられる。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（胃腸癌を含む）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸・直腸癌、子宮体癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌及び各種頭頸部癌が挙げられ、更にＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞性白血病、慢性骨髄芽球性白血病及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）が挙げられ、更に母斑症に関連する異常血管増殖、浮腫（例えば脳腫瘍に関連するもの）及びメイグス症候群が挙げられる。より具体的には、本発明の抗体により治療可能な癌としては、乳癌、結腸・直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫及び多発性骨髄腫が挙げられる。所定実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はヒト患者における結腸・直腸癌を治療するために使用される。

本発明は腫瘍増殖を維持するための栄養を提供するために必要な腫瘍血管の発生の阻害を目的とする癌治療ストラテジーである抗血管新生治療を包含する。血管新生は原発腫瘍増殖と転移の両方に関与しているため、本発明により提供される抗血管新生治療は原発部位における新生物増殖を抑制すると共に、二次部位への腫瘍の転移を予防することが可能である。

本発明の抗体で治療可能な非新生物病態としては、網膜疾患（例えば加齢黄斑変性）と免疫及び炎症性疾患（例えば関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性及び他の増殖網膜症（未熟児網膜症を含む）、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性、甲状腺過形成（グレーブス病を含む）、角膜及び他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、腹水、心膜液貯留（例えば心膜炎に関連するもの）及び胸水貯留）が挙げられる。

従って、本発明は上記疾患のいずれかの治療を必要とする患者における前記疾患の治療方法であって、前記患者に本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を投与する段階を含む方法を提供する。場合により、例えば１日後、２日後、３日後、５日後、１週間後、２週間後、３週間後、１カ月後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、２カ月後又は３カ月後に前記投与を反復する。反復投与は同一用量でも異なる用量でもよい。１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回又はそれ以上投与を反復することができる。例えば、所定投与レジメンに従い、患者に長期間、例えば６カ月間、１年間又はそれ以上、抗ＶＥＧＦ治療を実施する。患者に投与する抗ＶＥＧＦ抗体の量は所定実施形態では治療有効量である。本願で使用する「治療有効」量のＶＥＧＦ抗体を単回又は治療レジメンの期間、例えば１週間、２週間、３週間、１カ月、３カ月、６カ月、１年間又はそれ以上にわたって投与することができる。代表的な治療レジメンについては、下記セクション６．１１に記載する。

本発明によると、疾患の治療は任意臨床ステージもしくは発現期にある任意形態の疾患をもつと既に診断されている患者の治療；疾患の症状もしくは徴候の発症もしくは進行もしくは増悪もしくは悪化の遅延；並びに／又は疾患の予防及び／もしくは重篤度軽減を包含する。

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を投与する「対象」又は「患者」は非霊長類（例えばウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等）又は霊長類（例えばサル又はヒト）等の哺乳動物が好ましい。所定実施形態において、対象又は患者はヒトである。所定態様において、ヒトは小児患者である。他の態様において、ヒトは成人患者である。

６．９ 医薬組成物及び投与経路
本発明は本発明の抗ＶＥＧＦ抗体及び、場合により下記セクション６．１０に記載する併用療法剤等の１種以上の他の治療剤を含有する組成物を提供する。前記組成物は通常では、一般に医薬的に許容可能な担体を含有する滅菌医薬組成物の一部として提供される。この組成物は（患者に投与する所望方法に応じて）任意の適切な形態とすることができる。

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、眼内、局所、髄腔内及び脳室内等の各種経路で患者に投与することができる。任意の所定場合に最適な投与経路は特定抗体、対象、疾患の種類と重篤度及び対象の健康状態により異なる。

網膜疾患以外の適応症の治療には、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体の有効用量は単回（例えばボーラス）投与、複数回投与又は連続投与により約０．１から約７５ｍｇ／ｋｇとすることができ、あるいは単回（例えばボーラス）投与、複数回投与又は連続投与により０．０１〜５０００μｇ／ｍＬの血清濃度に達するような量とすることができ、あるいは治療する病態、投与経路並びに対象の年齢、体重及び健康状態に応じて本願に記載する任意有効範囲又は数値とすることができる。所定実施形態において、例えば癌の治療には、各用量は体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇから約５０ｍｇ、例えば体重１ｋｇ当たり約３ｍｇから約２５ｍｇの範囲とすることができる。抗体を水溶液として製剤化し、皮下注射により投与することができる。

網膜疾患（例えば加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の治療には、注入後の眼球の抗ＶＥＧＦ抗体の房水濃度が１〜５０μｇ／ｍＬとなるような用量が適切である。ＡＭＤの治療には、各用量を０．１ｍｇ〜約１ｍｇ、例えば約０．２５から約０．５ｍｇとすることができる。抗体を水溶液として製剤化し、硝子体内注射により投与することができる。

医薬組成物は１用量当たり所定量の本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を含有する単位用量形態とすると好適である。このような単位は限定されないが、例えば０．１ｍｇから５ｇ、例えば１ｍｇから１ｇ又は１０から５０ｍｇを含有することができる。本発明で使用する医薬的に許容可能な担体は例えば治療する病態や投与経路に応じて多様な形態をとることができる。

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体の治療用製剤は所望純度の抗体を場合により当分野で一般に利用されている医薬的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤（本願では「担体」と総称する）、即ち緩衝剤、安定剤、防腐剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤及び他の各種添加剤と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液として保存できるように製造することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｏｓｏｌ，ｅｄ．１９８０）参照。このような添加剤は使用する用量及び濃度でレシピエントに非毒性でなければならない。

緩衝剤はｐＨを生理的条件に近い範囲に維持するのに役立つ。緩衝剤は約２ｍＭから約５０ｍＭの範囲の濃度で加えることができる。本発明で使用するのに適切な緩衝剤としては、クエン緩衝液（例えばクエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混液、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混液、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混液等）、コハク酸緩衝液（例えばコハク酸−コハク酸一ナトリウム混液、コハク酸−水酸化ナトリウム混液、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混液等）、酒石酸緩衝液（例えば酒石酸−酒石酸ナトリウム混液、酒石酸−酒石酸カリウム混液、酒石酸−水酸化ナトリウム混液等）、フマル酸緩衝液（例えばフマル酸−フマル酸一ナトリウム混液、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混液、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混液等）、グルコン酸緩衝液（例えばグルコン酸−グルコン酸ナトリウム混液、グルコン酸−水酸化ナトリウム混液、グルコン酸−グルコン酸カリウム混液等）、蓚酸緩衝液（例えば蓚酸−蓚酸ナトリウム混液、蓚酸−水酸化ナトリウム混液、蓚酸−蓚酸カリウム混液等）、乳酸緩衝液（例えば乳酸−乳酸ナトリウム混液、乳酸−水酸化ナトリウム混液、乳酸−乳酸カリウム混液等）及び酢酸緩衝液（例えば酢酸−酢酸ナトリウム混液、酢酸−水酸化ナトリウム混液等）等の有機及び無機酸とその塩が挙げられる。更に、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液及びトリメチルアミン塩（例えばＴｒｉｓ）も使用することができる。

微生物増殖を遅らせるために防腐剤を添加することができ、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加することができる。本発明で使用するのに適切な防腐剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば塩化ベンザルコニウム、臭化ベンザルコニウム及びヨウ化ベンザルコニウム）、塩化ヘキサメトニウム、アルキルパラベン（例えばメチルパラベン又はプロピルパラベン）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール及び３−ペンタノールが挙げられる。等張化剤は「安定剤」と言う場合もあり、本発明の液体組成物の等張性を確保するために添加することができ、多価糖アルコール類、例えば三価以上の糖アルコール類（例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトール）が挙げられる。安定剤とは増量剤から治療剤を可溶化する添加剤又は変性もしくは容器壁への付着を防止するのに役立つ添加剤に至るまでの機能に対応し得る広い分類の賦形剤を意味する。典型的な安定剤としては、多価糖アルコール類（上記のもの）、アミノ酸類（例えばアルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン等）、有機糖類又は糖アルコール類（例えばラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロール等が挙げられ、イノシトール等のシクリトール類も含む）、ポリエチレングリコール、アミノ酸ポリマー、硫黄含有還元剤（例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム）、低分子量ポリペプチド（例えば１０残基以下のペプチド）、蛋白質（例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）、親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）、単糖類（例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコース）、二糖類（例えばラクトース、マルトース、スクロース）及び三糖類（例えばラフィノース）、並びに多糖類（例えばデキストラン）が挙げられる。安定剤は活性蛋白質１重量部当たり０．１から１０，０００重量部の範囲で加えることができる。

治療剤を溶解し易くすると共に、治療用蛋白質を撹拌による凝集から保護し、更に蛋白質の変性を生じずに製剤を表面剪断応力に暴露できるようにするために、非イオン性界面活性剤ないしデタージェント（別称「湿潤剤」）を添加することができる。適切な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート類（２０，８０等）、ポロキサマー類（１８４，１８８等）、プルロニックポリオール類、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル類（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０，ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０等）が挙げられる。非イオン性界面活性剤は約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲、例えば約０．０７ｍｇ／ｍｌから約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で加えることができる。

その他の賦形剤としては、増量剤（例えば澱粉）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、及び補助溶媒が挙げられる。

本願の製剤は更に本発明の抗ＶＥＧＦ抗体以外に併用療法剤も含有することができる。適切な併用療法剤の例は下記セクション６．１０に挙げる。

皮下投与用の投与スケジュールは疾患の種類、疾患の重篤度及び抗ＶＥＧＦ抗体に対する患者の感受性を含む多数の臨床因子に応じて６カ月に１回から毎日までとすることができる。

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体の投与用量は特定抗体、疾患の種類（例えば癌、炎症性等）、対象、疾患の重篤度、対象の健康状態、治療レジメン（例えば併用療法剤の使用の有無）、及び選択する投与経路に従って異なり、適切な用量は当業者が容易に決定することができる。

当業者に自明の通り、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体の最適量と投与間隔は治療する病態の種類と程度、投与形態、投与経路、投与部位、及び治療する特定対象の年齢と健康状態により決定され、適切な使用量は最終的に医師が決定する。この投与を適切な回数反復することができる。副作用が生じる場合には、通常の臨床診療に従って投与量及び／又は頻度を変更又は低減することができる。

６．１０ 併用療法
以下、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を利用することができる併用法について記載する。併用法は少なくとも２種類の薬剤を患者に投与し、第１の薬剤を本発明の抗ＶＥＧＦ抗体とし、第２の薬剤を併用療法剤とする。抗ＶＥＧＦ抗体と併用療法剤は同時、順次又は別々に投与することができる。

本発明の併用療法は相加効果を上回る効果が得られ、治療有効量の抗ＶＥＧＦ抗体又は併用療法剤を単独で投与した場合には得られない治療効果が得られる。

本発明の方法では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体と併用療法剤を同時又は順次併用投与することができる。本願で使用する表現では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体と併用療法剤を同日、例えば１回の患者来院中に患者に投与する場合に順次投与すると言う。順次投与は１時間置き、２時間置き、３時間置き、４時間置き、５時間置き、６時間置き、７時間置き又は８時間置きに実施することができる。他方、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体と併用療法剤を別の日に患者に投与する場合に別々に投与すると言い、例えば、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体と併用療法剤を１日置き、２日置き、３日置き、１週間置き、２週間置き又は１カ月置きに投与することができる。本発明の方法では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を投与する前に併用療法剤を投与してもよいし、後に投与してもよい。

非限定的な１例として、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体と併用療法剤を一定期間併用投与した後に、第２の期間に本発明の抗ＶＥＧＦ抗体と併用療法剤を交互に投与することができる。

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体と併用療法剤を投与する潜在的相乗効果により、一方又は両方を単独で投与した場合には治療有効量とならない量でこれらの薬剤を投与することができる。

所定態様において、併用療法剤は抗血管新生剤、抗リウマチ薬、抗炎症剤、化学療法剤、放射線療法剤、免疫抑制剤又は細胞毒性薬である。

各種疾患を治療するために使用する場合には、同一又は同様の疾患に適した他の治療剤と本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を併用できると考えられる。癌を治療するために使用する場合には、外科処置、放射線療法、化学療法又はその組合せ等の従来の癌治療法と本発明の抗体を併用することができる。

所定の他の態様において、本発明の抗体との併用腫瘍治療に有用な他の治療剤としては、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（別称Ｈｅｒ２）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４又はＴＮＦ−α等の腫瘍増殖に関与する他の因子のアンタゴニスト（例えば抗体）が挙げられる。

場合により、癌及び乳癌の治療には、１種以上のサイトカインも患者に投与することが有益な場合がある。好ましい実施形態では、ＶＥＧＦ抗体を増殖抑制剤と併用投与する。

増殖抑制剤に適切な用量は現在使用されている用量であり、増殖抑制剤と抗ＶＥＧＦ抗体の併用作用（相乗効果）により用量を減らすことができる。

癌、免疫疾患及び網膜疾患の治療には、抗炎症剤を本発明の抗ＶＥＧＦ抗体と適切に併用することができる。抗炎症剤としては、限定されないが、アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン、メペリジン、デキサメタゾン、ペンタサ、メサラジン、アサコール、リン酸コデイン、ベノリラート、フェンブフェン、ナプロシン、ジクロフェナク、エトドラク及びインドメタシン、アスピリン及びイブプロフェンが挙げられる。

癌の治療には、化学療法剤を本発明の抗ＶＥＧＦ抗体と適切に併用することができる。化学療法剤としては、限定されないが、放射性分子、毒素（細胞毒素又は細胞傷害性物質とも言い、細胞の生存に有害な任意物質を含む）、及び化学療法用化合物を内包させたリポソーム又は他の小胞が挙げられる。適切な化学療法剤の例としては、限定されないが、１−デヒドロテストステロン、５−フルオロウラシルデカルバジン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アクチノマイシンＤ、アドリアマイシン、アルデスロイキン、抗α５β１インテグリン抗体、アルキル化剤、アロプリノールナトリウム、アルトレタミン、アミフォスチン、アナストロゾール、アントラマイシン（ＡＭＣ）、有糸分裂阻害剤、シス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）（シスプラチン）、ジアミノジクロロ白金、アントラサイクリン、抗生物質、代謝拮抗剤、アスパラギナーゼ、ＢＣＧ生菌（膀胱内）、リン酸ベタメタゾンナトリウム及び酢酸ベタメタゾン、ビカルタミド、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、ロイコボリンカルシウム、カリケアマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、コルヒチン、共役エストロゲン、シクロホスファミド、シクロソスファミド、シタラビン、シタラビン、サイトカラシンＢ、サイトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダクチノマイシン（旧名アクチノマイシン）、ダウノルビシンＨＣＬ、クエン酸ダウノルビシン、デニロイキンディフティトックス、デクスラゾキサン、ジブロモマンニトール、ジヒドロキシアントラシンジオン、ドセタキセル、メシル酸ドラセトロン、ドキソルビシンＨＣＬ、ドロナビノール、大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼ、ボロシキシマブ、エメチン、エポエチン−α、エルビニアＬ−アスパラギナーゼ、エステル化エストロゲン、エストラジオール、リン酸エストラムスチンナトリウム、臭化エチジウム、エチニルエストラジオール、エチドロネート、エトポシドシトロボラム因子、リン酸エトポシド、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルコナゾール、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、フォリン酸、ゲムシタビンＨＣＬ、グルココルチコイド、酢酸ゴセレリン、グラミシジンＤ、グラニセトロンＨＣＬ、ヒドロキシ尿素、イダルビシンＨＣＬ、イホスファミド、インターフェロンα−２ｂ、イリノテカンＨＣＬ、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、酢酸ロイプロリド、レバミソールＨＣＬ、リドカイン、ロムスチン、メイタンシノイド、メクロレタミンＨＣＬ、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファランＨＣＬ、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、メチルテストステロン、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、酢酸オクトレオチド、オンダンセトロンＨＣＬ、パクリタキセル、パミドロン酸二ナトリウム、ペントスタチン、ピロカルピンＨＣＬ、プリマイシン、ポリフェプロザン２０カルムスチンインプラント、ポルフィマーナトリウム、プロカイン、プロカルバジンＨＣＬ、プロプラノロール、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾトシン、タモキシフェン、タキソール、テニポシド、テノポシド、テストラクトン、テトラカイン、チオエパクロラムブシル、チオグアニン、チオテパ、トポテカンＨＣＬ、クエン酸トレミフェン、トラスツズマブ、トレチノイン、バルルビシン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン及び酒石酸ビノレルビンが挙げられる。

Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ ａｎｄ Ｊａｉｎ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ ４０７：２４９−２５７に挙げられているもの等の任意抗血管新生剤を本発明の抗ＶＥＧＦ抗体と併用することができる。所定実施形態において、抗血管新生剤は別のＶＥＧＦアンタゴニスト又はＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト（例えばＶＥＧＦ変異体、可溶性ＶＥＧＦ受容体フラグメント、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲを阻害することが可能なアプタマー、中和性抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの低分子量阻害剤及びその任意組合せ）である。上記の代用又は追加として、２種以上の抗ＶＥＧＦ抗体を患者に併用投与してもよい。

所定実施形態では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体とホルモン療法を併用することができる。所定実施形態において、ホルモン療法はエストロゲン及び／又はプロゲステロンが癌細胞増殖を促進するのを抑制する１種以上の薬剤を含み、例えば選択的エストロゲン受容体モジュレーター（例えばタモキシフェン）、アロマターゼ阻害剤（例えばアナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））又はレトロゾール（Ｆｅｍａｒａ））、アロマターゼ不活化剤（例えばエキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標）））又はエストロゲン産生抑制剤（例えばゴセレリン（Ｚｏｌａｄｅｘ））が挙げられる。他の実施形態において、ホルモン療法は卵巣からのホルモンの産生を抑制する１種以上の薬剤である。

所定態様では、小分子蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）阻害剤と抗ＶＥＧＦ抗体を併用することができる。所定実施形態において、ＰＴＫ阻害剤はＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼに対して特異的である。他の実施形態において、ＰＴＫ阻害剤はチロシンキナーゼのＶＥＧＦ受容体ファミリーの２種以上（例えばＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２）と結合する。他の実施形態において、本発明の組成物と方法で有用な蛋白質チロシンキナーゼ阻害剤としては、受容体チロシンキナーゼのＶＥＧＦファミリーと選択的に結合せず、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＤＧＦＲ及び／又はＲａｆ等の他の蛋白質ファミリーのチロシンキナーゼドメインとも結合するＰＴＫ阻害剤が挙げられる。

所定実施形態において、チロシンキナーゼは受容体チロシンキナーゼであり、即ち細胞外リガンド結合ドメインをもち、１種以上のリガンドの結合により活性化される大きい蛋白質の細胞内ドメインである。所定実施形態において、蛋白質チロシンキナーゼは非受容体チロシンキナーゼである。本発明の方法で使用されるＰＴＫ阻害剤としては、限定されないが、ゲフィニチブ（ＺＤ−１８３９，Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、エルロチニブ（ＯＳＩ−１７７４，Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ−１０３３）、バンデタニブ（ＺＤ６４７４，Ｚａｃｔｉｍａ（登録商標））、チルホスチンＡＧ−８２５（ＣＡＳ １４９０９２−５０−２）、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）、ＡＧ−４９４（ＣＡＳ １３３５５０−３５−３）、ＲＧ−１３０２２（ＣＡＳ １４９２８６−９０−８）、ＲＧ−１４６２０（ＣＡＳ １３６８３１−４９−７）、ＢＩＢＷ ２９９２（Ｔｏｖｏｋ）、チルホスチン９（ＣＡＳ １３６８３１−４９−７）、チルホスチン２３（ＣＡＳ １１８４０９−５７−７）、チルホスチン２５（ＣＡＳ １１８４０９−５８−８）、チルホスチン４６（ＣＡＳ １２２５２０−８５−８）、チルホスチン４７（ＣＡＳ １２２５２０−８６−９）、チルホスチン５３（ＣＡＳ １２２５２０−９０−５）、ブテイン（１−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２−プロペン−１−オン；２’，３，４，４’−テトラヒドロキシカルコン；ＣＡＳ ４８７−５２−５）、クルクミン（（Ｅ，Ｅ）−１，７−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１，６−ヘプタジエン−３，５−ジオン；ＣＡＳ ４５８−３７−７）、Ｎ４−（１−ベンジル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−Ｎ６，Ｎ６−ジメチルピリド−［３，４−ｄ］−ピリミジン−４，６−ジアミン（２０２２７２−６８−２）、ＡＧ−１４７８、ＡＧ−８７９、シクロプロパンカルボン酸−（３−（６−（３−トリフルオロメチルフェニルアミノ）ピリミジン−４−イルアミノ）フェニル）アミド（ＣＡＳ ８７９１２７−０７−８）、Ｎ８−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−Ｎ２−（１−メチルピペリジン−４−イル）ピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン−２，８−ジアミン、２ＨＣｌ（ＣＡＳ １９６６１２−９３−８）、４−（４−ベンジルオキシアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン（ＣＡＳ １７９２４８−６１−４）、Ｎ−（４−（（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル）２−ブチンアミド（ＣＡＳ ８８１００１−１９−０）、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２及びＨＫＩ−３５７が挙られる。

１特定実施形態では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を静脈内５−フルオロウラシル系化学療法と併用する。この併用は特に結腸又は直腸の転移性癌患者の第一又は第二選択治療に適している。

別の特定実施形態では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体をカルボプラチン及びパクリタキセルと併用する。この併用は特に切除不能な局所進行再発性又は転移性非扁平上皮型非小細胞肺癌患者の第一選択治療に適している。

更に別の特定実施形態では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体をパクリタキセルと併用する。この併用は特に転移性ＨＥＲ２陰性乳癌の化学療法を受けていない患者の治療に適している。

網膜疾患の治療には、抗血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ペグ化アプタマーであるＥ１００３０、補体カスケードのＣ５成分を標的とするペグ化アプタマーであるＡＲＣ１９０５、及びα５β１インテグリン膜貫通受容体を標的とするモノクローナル抗体であるボロシキシマブ、Ｖｉｓｕｄｙｎｅ（登録商標）による光線力学療法（ＰＤＴ）、又はアプタマー（ペガプタニブナトリウム）であるＭａｃｕｇｅｎ（登録商標）と本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を併用することができる。

６．１１ 治療レジメン
本発明は本発明の抗ＶＥＧＦ抗体の投与を含む治療レジメンを提供する。治療レジメンは患者の年齢、体重及び病態により異なる。治療レジメンは２週間から無期限まで継続することができる。特定実施形態において、治療レジメンは２週間〜６カ月間、３カ月間〜５年間、６カ月間〜１年間又は２年間、８カ月間〜１８カ月間等の期間継続する。治療レジメンは非可変用量レジメンでもよいし、複数可変用量レジメンでもよい。

下記典型的投与レジメンでは、抗ＶＥＧＦ抗体を皮下投与用滅菌防腐剤フリー溶液として投与することができる。

転移性結腸・直腸癌の治療には、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体をボーラス−ＩＦＬ（イリノテカン、５−フルオロウラシル及びロイコボリンレジメン）と併用して０．５〜１５ｍｇ／ｋｇの用量で２週間置きに静脈内投与する。特定実施形態において、用量はボーラス−ＩＦＬと併用して２週間置きに１〜４ｍｇ／ｋｇ、２〜６ｍｇ／ｋｇ、０．５〜３ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、３〜４．８ｍｇ／ｋｇ又は１〜４．５ｍｇ／ｋｇとする。

転移性結腸・直腸癌の治療の別の実施形態では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体をＦＯＬＦＯＸ４（オキサリプラチン、ロイコボリン及びフルオロウラシルレジメン）と併用して１〜３０ｍｇ／ｋｇの用量で２週間置きに静脈内投与する。特定実施形態において、用量はＦＯＬＦＯＸ４と併用して２週間置きに２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜１２ｍｇ／ｋｇ、１〜７．５ｍｇ／ｋｇ、２〜２０ｍｇ／ｋｇ、６〜９．７５ｍｇ／ｋｇ又は４〜９．５ｍｇ／ｋｇとする。

非扁平上皮型非小細胞肺癌の治療には、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体をカルボプラチン／パクリタキセルと併用して２〜４０ｍｇ／ｋｇの用量で３週間置きに静脈内投与する。特定実施形態において、用量はカルボプラチン／パクリタキセルと併用して３週間置きに５〜１４ｍｇ／ｋｇ、４〜２０ｍｇ／ｋｇ、１０〜１７．５ｍｇ／ｋｇ、７〜１４ｍｇ／ｋｇ、１０〜３０ｍｇ／ｋｇ又は３〜３０ｍｇ／ｋｇとする。

転移性乳癌の治療には、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体をパクリタキセルと併用して０．５〜２０ｍｇ／ｋｇの用量で２週間置きに静脈内投与する。特定実施形態において、用量はパクリタキセルと併用して２週間置きに１〜４ｍｇ／ｋｇ、２〜６ｍｇ／ｋｇ、０．５〜３ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、３〜４．８ｍｇ／ｋｇ又は１〜４．５ｍｇ／ｋｇとする。

転移性乳癌の治療には、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を単独療法として０．５〜２０ｍｇ／ｋｇの用量で２週間置きに静脈内投与する。特定実施形態において、用量は単独療法として２週間置きに１〜４ｍｇ／ｋｇ、２〜６ｍｇ／ｋｇ、０．５〜３ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、３〜４．８ｍｇ／ｋｇ又は１〜４．５ｍｇ／ｋｇとする。

加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の治療には、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を０．１〜１ｍｇの用量で１カ月（約２８日）に一度硝子体内注射により投与する。特定実施形態において、用量は１カ月（約２８日）に一度硝子体内注射により０．１〜０．４ｍｇ、０．２〜０．６ｍｇ、０．１〜０．２５ｍｇ、０．２５〜０．５ｍｇ、０．２５〜０．７５ｍｇ又は０．３〜０．４５ｍｇとする。１特定実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体で治療する患者はウェット型ＡＭＤ患者である。別の特定実施形態において、患者はドライ型ＡＭＤ患者である。

６．１２ 診断及び医薬キット
本発明は本発明の抗ＶＥＧＦ抗体（抗体コンジュゲートを含む）を含む医薬キットを包含する。医薬キットは、（例えば凍結乾燥形態又は水溶液としての）本発明の抗ＶＥＧＦ抗体と、
−例えば上記セクション６．１０に記載したような併用療法剤；
−抗ＶＥＧＦ抗体の投与装置、例えばペン、注射針及び／又はシリンジ；並びに
−抗体が凍結乾燥形態の場合には抗体を再懸濁するための医薬グレード水又は緩衝液
の１種以上を含むパッケージである。

所定態様では、抗ＶＥＧＦ抗体の各単位用量を別々に個装し、キットに１単位用量以上（例えば２単位用量、３単位用量、４単位用量、５単位用量、８単位用量、１０単位用量、又はそれ以上）を含むことができる。１特定実施形態では、１単位用量以上を各々シリンジ又はペンに収容する。

本発明は本発明の抗ＶＥＧＦ抗体（（抗体コンジュゲートを含む）を含む診断キットも包含する。診断キットは、（例えば凍結乾燥形態又は水溶液としての）本発明の抗ＶＥＧＦ抗体と、診断アッセイを実施するために有用な１種以上の試薬を含むパッケージである。抗ＶＥＧＦ抗体を酵素で標識する場合には、キットは酵素により必要とされる基質及び補因子（例えば検出可能な発色団又は蛍光団を提供する基質前駆体）を含むことができる。更に、安定剤、緩衝液（例えばブロック緩衝液又は溶解緩衝液）等の他の添加剤も加えることができる。所定実施形態では、診断キットに含まれる抗ＶＥＧＦ抗体を固相表面に固相化するか、又は抗体を固相化することが可能な固相表面（例えばスライド）をキットに含む。各種試薬の相対量はアッセイの感度を実質的に最適化するような溶液中の試薬の濃度が得られるように大幅に変動させることができる。１特定実施形態では、賦形剤を添加した通常は凍結乾燥状態の乾燥粉末として抗体と１種以上の試薬を（別梱又は同梱で）提供し、溶解後に適切な濃度の試薬溶液が得られるようにすることができる。

７．実施例１：ベバシズマブのＴ細胞エピトープの同定
７．１ 材料及び方法
７．１．１ ペプチド
ペプチドはＭｉｍｏｔｏｐｅｓ（Ａｄｅｌａｉｄｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によるマルチペンフォーマットを使用して合成した。１２個のアミノ酸がオーバーラップする１５量体ペプチドとしてベバシズマブ軽鎖及び重鎖Ｖ領域の配列（表３及び４）を合成し、合計６９種のペプチドを得た。ペプチドを凍結乾燥し、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で約１〜２ｍｇ／ｍＬに再懸濁した。ストックペプチドを−２０℃で凍結保存した。

７．１．２ ヒト末梢血単核細胞
院外ドナーバフィーコート製品をＳｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡから購入した。カルシウム又はマグネシウムを含有しないＤＰＢＳでバフィーコート材料を１：１ ｖ：ｖに希釈した。希釈したバフィーコート材料（２５〜３５ｍｌ）を５０ｍｌ円錐形遠心管（Ｓａｒｓｔｅｄ又はＣｏｓｔａｒ）に入れ、ＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ−ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１２．５ｍｌを重層した。試料を９００ｇで３０分間室温にて遠心した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を界面から採取した。ＤＰＢＳを加えて最終容量を５０ｍｌとし、細胞を３５０ｇで５分間遠心した。ペレット化した細胞をＤＰＢＳに再懸濁し、計数した。

７．１．３ 樹状細胞
樹状細胞を単離するために、新たに単離したＰＢＭＣ１０^８個を総容量３０ｍｌのＡＩＭ Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に加え、Ｔ７５培養フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ）に播種した。過剰のＰＢＭＣを９０％胎仔ウシ血清（ＦＣＳ），１０％ ＤＭＳＯ中、細胞５×１０^７個／ｍＬの密度で−８０℃に凍結した。Ｔ７５フラスコを３７℃で５％ ＣＯ_２下に２時間温置した。非接着細胞を除去し、接着性単層をＤＰＢＳで洗浄した。樹状細胞を単球から区別するために、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）８００単位／ｍＬとＩＬ−４（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）５００単位／ｍＬを含有するＡＩＭ Ｖ培地３０ｍｌを加えた。フラスコを５日間温置した。５日目にＩＬ−１α（Ｅｎｄｏｇｅｎ）とＴＮＦα（Ｅｎｄｏｇｅｎ）を５０ｐｇ／ｍＬ及び０．２ｎｇ／ｍＬまで加えた。フラスコを更に２日間温置した。７日目に、最終濃度１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び１６．５〜３３μｇ／ｍＬマイトマイシンＣとなるようにマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）０．５〜１．０ｍｇを含有する１００ｍＭ ＥＤＴＡ ３ｍｌを加えることにより樹状細胞を採取した。フラスコを更に１時間３７℃で５％ ＣＯ_２下に温置した。樹状細胞を採取し、ＡＩＭ Ｖ培地で２〜３回洗浄した。

７．１．４ 細胞培養
７日目に、予め凍結しておいた自家ＰＢＭＣを３７℃水浴で素早く解凍した。細胞をすぐにＤＰＢＳ又はＡＩＭ Ｖ培地で希釈し、３５０ｇで５分間遠心した。磁気ビーズ（Ｅａｓｙ−Ｓｅｐ ＣＤ４^＋ｋｉｔ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する陰性選択によりＣＤ４^＋細胞を増菌した。９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ ９０７７）でウェル当たり樹状細胞２×１０^４個に対してＣＤ４^＋Ｔ細胞２×１０^５個の割合で自家ＣＤ４^＋Ｔ細胞と樹状細胞を同時培養した。ペプチド約５μｇ／ｍＬを加えた。対照ウェルにはＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）ビヒクル単独を０．２５％ ｖ：ｖで加えた。陽性対照ウェルには０．２５％ ＤＭＳＯと１μｇ／ｍＬ破傷風トキソイド（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ又はＣａｌＢｉｏＣｈｅｍ）を加えた。培養液を５日間温置した。５日目にウェル当たり０．２５μＣｉのトリチウム化チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ又はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加えた。Ｐａｃｋａｒｄ Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ Ｃｅｌｌハーベスターを使用して培養液を６日目にフィルターマットに採取した。Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ １４５０シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用してシンチレーション計数を実施した。

７．１．５ データ解析
６〜１２回の反復試験からの個々の結果を平均することにより、平均バックグラウンドＣＰＭ値を計算した。４個の陽性対照ウェルのＣＰＭ値を平均した。ペプチド毎に２又は３個のウェルを平均した。平均実験ＣＰＭ値を平均対照値で割ることにより、陽性対照とペプチドウェルの刺激指数値を計算した。データセットに加えるためには、破傷風トキソイド陽性対照ウェルで３．０を上回る刺激指数が必要であった。刺激指数が２．９５以上となる全ペプチドについて応答を記録した。９９人のドナー群からの末梢血液試料を使用してペプチドを試験した。全ペプチドに対する応答を集計した。試験したペプチド毎に、２．９５以上の刺激指数で応答したドナー群の百分率を計算した。更に、全ドナーの平均刺激指数も計算した。

７．２ 結果
７．２．１
ベバシズマブＶＨ及びＶＬ領域におけるＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープの同定
９９人のドナー群内でペプチドに対する応答率百分率の解析によりＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープペプチドを同定した。ベバシズマブ重鎖及び軽鎖Ｖ領域に相当する全試験ペプチドについて平均応答百分率と標準偏差を計算した。平均バックグラウンド応答＋（３×標準偏差）以上の応答率を潜在的ＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープとみなした。ベバシズマブ軽鎖Ｖ領域について、３２種のペプチド（表３）を試験した結果、２．１±２．７％の平均バックグラウンド応答百分率が得られた。バックグラウンド＋（３×標準偏差）は１０．２％であることが分かった。１３番目の１種のペプチド（Ｑ４０−Ｔ５４）がベバシズマブ軽鎖ペプチドデータセットでこのレベルの応答を示し、応答率は１５．２％であった（図２Ａ）。ベバシズマブ重鎖Ｖ領域について、３７種のペプチドを試験した（表４）。平均バックグラウンド応答百分率は２．８±３．１％であった。バックグラウンド＋（３×標準偏差）は１２．１％であった。ベバシズマブ重鎖データセット内の１種のペプチド＃１８（Ｎ５２−Ｒ５６）が１６．２％の応答百分率に達した（図３Ａ）。第２のペプチドは重鎖データセットにおける３０番目のペプチドで９．１％の応答率に達し、刺激指数増加によるエピトープとみなした（下記参照）。

データセット内の全ペプチドについて平均刺激指数を計算した。軽鎖ペプチド１３は１．８２±０．２４ ｓ．ｅ．ｍ．という高い平均刺激指数値であった（図２Ｂ）。重鎖ペプチド＃１８は２．１６±０．３５ ｓ．ｅ．ｍ．の平均刺激指数であった（図３Ｂ）。３０番目のペプチドは平均刺激指数増加と平均を上回る応答率により、１．４５±０．１８ ｓ．ｅ．ｍ．の平均刺激指数となった（図３Ｂ）。この抗体Ｖ領域のＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープ含有量を測定する場合には３０番目のペプチドを使用した。これらの全刺激指数値は２個のデータセットにおける全ペプチドの平均刺激指数よりも有意に高かった（全６９種の重鎖及び軽鎖ペプチドで１．１４±０．０７）。

これらのデータによると、ベバシズマブＶ領域には３個のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ領域が存在する（表５）。ＶＬ領域では、フレームワーク２とＣＤＲ２に由来する２個のアミノ酸を含むエピトープが１３番目のペプチドで検出された。この配列はヒト化中に配列に挿入されたマウス復帰突然変異（Ｖ４６）を含む。表５では、ＣＤＲに由来するアミノ酸を下線で示す。重鎖では、２個のエピトープペプチド領域が同定された。１８番目の強いほうのエピトープは全ＣＤＲ２を含む。第２のエピトープペプチド領域はフレームワーク３及びＣＤＲ３アミノ酸の両方を含む。

７．２．２ ベバシズマブ変異体抗体の免疫原性低下変異体
ベバシズマブを突然変異解析した（下記実施例２参照）。突然変異解析と共に実施した抗原結合試験に基づき、ＶＥＧＦに対する抗体の親和性を有意に低下させないＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３領域内の１組の候補アミノ酸置換を同定した（表６）。これらのアミノ酸置換を単独及び組合せて試験し、野生型抗体に比較して免疫原性の低下したベバシズマブの変異体を同定した。

８．実施例２：ＶＥＧＦに対する親和性の増加したベバシズマブの変異体の同定
ベバシズマブ抗体を網羅的に突然変異解析し、ベバシズマブに比較してＶＥＧＦに対する親和性の増加した突然変異体を同定した。ベバシズマブに比較したＶＥＧＦに対する候補高親和性突然変異体の親和性増加をＢＩＡｃｏｒｅにより解析し、その結合特徴を確認した。

８．１ 材料及び方法
８．１．１ ＢＩＡｃｏｒｅ
ヒトＩｇＧ_１を含むプラスミドに１５種の変異体ベバシズマブＶＨ領域構築物を非改変ＶＬ領域と共にクローニングし、一過的トランスフェクションにより２９３Ｔ／１７細胞株で発現させ、抗体をプロテインＡ又はプロテインＧ親和性により精製した。ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００及び３０００表面プラズモン共鳴システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用することによりＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に対する抗体の親和性を測定した。先ず、標準ＢＩＡｃｏｒｅアミンカップリング試薬（Ｎ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド，ＥＤＣ；Ｎ−ヒドロキシスミシンイミド，ＮＨＳ；及びエタノールアミンＨＣｌ，ｐＨ８．５）を使用してポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）をバイオセンサー表面に固相化した後、抗ＶＥＧＦ抗体（ベバシズマブ及びベバシズマブ変異体）を５μＬ／ｍｉｎの低流速で平行表面に捕捉した。ＶＥＧＦの二量体性質によるアビディティを最小化するようにＲＬを低く維持した。参照表面では抗体の捕捉を実施せず、陰性対照とした。次に、ＶＥＧＦを全フローセルに流速５０μＬ／ｍｉｎで２分間注入して会合をモニターした後、ＨＢＳ−Ｐランニング緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，０．００５％ Ｐ−２０，ｐＨ ７．４）を２５分間流し、解離相をモニターした。各サイクルで０ｎＭから５１２ｎＭまで４倍刻みで増加した６種類の異なるＶＥＧＦ濃度のＶＥＧＦを表面に注入した。各サイクルの終わりに１．５％ Ｈ_３ＰＯ_４を流速１００μＬ／ｍｉｎで２回素早く吹き付けて表面を再生させた。結合データを１：１ラングミュアモデルにフィットさせ、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｅソフトウェアから結合定数を抽出した。各解析で二重参照を適用し、参照表面と緩衝液単独対照からのバックグラウンド応答を排除した。全結合反応速度データを少なくとも３回の別々の測定で解析した。

８．２ 結果
結果を絶対数と野生型に対する改善倍率として示す。一覧に加えたほぼ全変異体はベバシズマブ又は野生型と比較した場合に会合速度（ｋ_ｏｎ）と解離（ｋ_ｏｆｆ）速度が改善した（表７）。変異体の最終親和性値は０．１ｎＭ範囲内であり、配列番号８２に対応する変異体では０．０８ｎＭという低値に達した。これらの値はこれらの実験で測定した親和性が１．９ｎＭであったベバシズマブとは対照的である。

表８及び９は予備結合試験でＶＥＧＦに対する親和性がベバシズマブよりも高い他の重鎖変異体を示す（データは示さず）。表１０は予備試験でＶＥＧＦに対する親和性がベバシズマブと同等である重鎖変異体を示す（データは示さず）。表１１は予備試験でＶＥＧＦに対する親和性がベバシズマブと同等である軽鎖変異体を示す（データは示さず）。

９．実施例３：脱免疫化変異体ペプチドの選択
ベバシズマブの免疫原性領域に対応する変異体ペプチド（実施例１参照）を作製した（表１４〜１６）。実施例２に記載した網羅的突然変異解析に基づいて変異体ペプチドを選択し、ＶＥＧＦに対するベバシズマブの結合親和性を実質的に低下させないＣＤＲ変異を同定した。

合計７７種のペプチドを合成し、親１５量体ペプチドの各々の２回ずつの合成を含む抗原結合試験に基づいて試験した。セクション７．１に記載した方法を利用して親及び変異体ペプチドで合計９３人のドナーを試験し、結果を図４Ａ〜４Ｃに示す。特に、図４Ａ〜４Ｃは突然変異体ベバシズマブエピトープペプチドに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示す。未変異親エピトープ配列に対する平均応答を白記号で示す。大きい丸は表１７に示す選択変異を表す（下記参照）。図４ＡはＶＨ ＣＤＲ２ペプチドに対応し、図４ＢはＶＨ ＣＤＲ３ペプチドに対応し、図４ＣはＶＬ ＣＤＲ２ペプチドに対応する。選択したペプチドの免疫原性を表１７に示す。

重鎖可変領域ＣＤＲ２ペプチドでは、この試験で親ペプチドに対する平均応答百分率は５．３８％及び６．４５％であった。３種の突然変異体ペプチドが親ペプチドに比較して総応答率と平均刺激指数の低下を示した。

この試験で重鎖可変領域ＣＤＲ３エピトープペプチドの親ペプチド応答率は７．５３％及び６．４５％であった。親ペプチドに比較して総応答の低下を示す１種の突然変異体ペプチド配列が確認された。

最後に、この試験における軽鎖可変領域ＣＤＲ２ペプチド親応答率は２５．８％及び１５％であった。親ペプチドに比較して総免疫原性の低下を示す１種の突然変異体ペプチドが同定された。

脱免疫化突然変異がベバシズマブに比較してＶＥＧＦに対する親和性を維持したことを実証するために、フローサイトメトリーを使用し、（単独又は二重アミノ酸変異体及びベバシズマブとしての）改変エピトープペプチドに突然変異を導入する変異体抗体の結合特性を比較した。数種の脱免疫化突然変異はベバシズマブに比較してＶＥＧＦに対する親和性が同等以上であった。

１試験では、一過的にトランスフェクトした２９３ｃ１８細胞で表面結合型のベバシズマブ変異体を発現するものを３ｎＭのＡｌｅｘａ６４７共役ｒＨｕＶＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ ＃ＰＨＧ０１４３）と希釈倍率４００倍のヤギ抗ヒトκＲＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃａｔ＃２０６３−０９）で染色した。ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ ＣｙＡｎ ＡＤＰフローサイトメーターを使用してフローサイトメトリーによりデータを収集し、Ｔｒｅｅｓｔａｒ’ｓ ＦｌｏＪｏ解析プログラムを使用して解析した。この試験で測定した平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表１８に示す。

別の試験では、ＶＥＧＦと結合するベバシズマブと変異体抗体のＥＣ_５０を測定した。ＶＥＧＦを５μＭから０．０１μＭまで２倍系列希釈しながら上記のようにベバシズマブとその変異体をＡｌｅｘａｓ６４７共役ｒＨｕＶＥＧＦと共に使用して抗体力価検定プロットを作成した。ＥＣ_５０値を表１９に示す。

１０．特定実施形態、資料引用
本願に引用する全刊行物、特許、特許出願及び他の文献は個々の刊行物、特許、特許出願又は他の文献を全目的で本願に組込むと個々に記載すると同程度までその開示内容全体を全目的で本願に組込む。各種特定実施形態を例証及び記載したが、当然のことながら、発明の趣旨と範囲内で種々の変更を行うことができる。

Claims (33)

1. 抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメントであって、
   配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号４（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号５（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号７（ＣＤＲ−Ｌ２）、及び配列番号８（ＣＤＲ−Ｌ３）と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の置換又は置換の組合せを有する６個のＣＤＲを含み；
   該少なくとも１つのアミノ酸の置換又は置換の組合せが、
   ｉ）ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｓ；
   ｉｉ）ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｑ；
   ｉｉｉ）ＣＤＲ−Ｈ２におけるＹ５３Ｆ及びＫ６４Ｑ；
   ｉｖ）ＣＤＲ−Ｈ２におけるＹ５３Ｆ及びＫ６４Ｓ；
   ｖ）ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｅ；
   ｖｉ）ＣＤＲ−Ｈ３におけるＹ９８Ｆ；
   ｖｉｉ）ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｅ及びＹ９８Ｆ；
   ｖｉｉｉ）ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７Ｐ及びＹ９８Ｆ；
   ｉｘ）ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｓ及び、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ５１Ａ；
   ｘ）ＣＤＲ−Ｈ２におけるＫ６４Ｑ及び、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ５１Ａ；
   ｘｉ）ＣＤＲ−Ｈ２におけるＹ５３ＦとＫ６４Ｑ及び、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ５１Ａ；及び
   ｘｉｉ）ＣＤＲ−Ｈ３におけるＨ９７ＥとＹ９８Ｆ及び、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ５１Ａ；
   から選択され、全ての置換の番号付けは、カバット番号付けに対応するものである抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント。
2. ＣＤＲ−Ｈ２がＫ６４Ｓの置換を含む、請求項１に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント。
3. ＣＤＲ−Ｈ２がＫ６４Ｑの置換を含む、請求項１に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント。
4. ＣＤＲ−Ｈ２がＹ５３Ｆ及びＫ６４Ｑの置換を含む、請求項１に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント。
5. ＣＤＲ−Ｈ３がＨ９７Ｅの置換を含む、請求項１に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント。
6. ＣＤＲ−Ｈ３がＨ９７Ｐ及びＹ９８Ｆの置換を含む、請求項１に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント。
7. ＣＤＲ−Ｈ３がＨ９７Ｅ及びＹ９８Ｆの置換を含む、請求項１に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント。
8. ＣＤＲ−Ｈ３がＨ９７ＥおよびＹ９８Ｆの置換を含み、ＣＤＲ−Ｌ２がＴ５１Ａの置換を含む、請求項１に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント。
9. 下記の配列を含む請求項１に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント、
   ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列であるＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号３）；
   ＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列であるＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＳＲ（配列番号４１３）；
   ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列であるＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号５）；
   ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列であるＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号６）；
   ＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列であるＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号７）；及び
   ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列であるＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号８）。
10. 下記の配列を含む請求項１に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント、
    ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列であるＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号３）；
    ＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列であるＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＱＲ（配列番号４１４）；
    ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列であるＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号５）；
    ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列であるＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号６）；
    ＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列であるＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号７）；及び
    ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列であるＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号８）。
11. 下記の配列を含む請求項１に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント、
    ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列であるＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号３）；
    ＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列であるＷＩＮＴＦＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＱＲ（配列番号４１５）；
    ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列であるＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号５）；
    ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列であるＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号６）；
    ＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列であるＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号７）；及び
    ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列であるＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号８）。
12. 下記の配列を含む請求項１に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント、
    ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列であるＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号３）；
    ＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列であるＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号４）；
    ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列であるＹＰＥＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号４１６）；
    ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列であるＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号６）；
    ＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列であるＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号７）；及び
    ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列であるＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号８）。
13. 下記の配列を含む請求項１に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント、
    ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列であるＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号３）；
    ＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列であるＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号４）；
    ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列であるＹＰＰＦＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号４１７）；
    ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列であるＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号６）；
    ＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列であるＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号７）；及び
    ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列であるＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号８）。
14. 下記の配列を含む請求項１に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント、
    ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列であるＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号３）；
    ＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列であるＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号４）；
    ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列であるＹＰＥＦＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号４１８）；
    ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列であるＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号６）；
    ＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列であるＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号７）；及び
    ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列であるＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号８）。
15. 下記の配列を含む請求項１に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント、
    ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列であるＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号３）；
    ＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列であるＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＳＲ（配列番号４１３）；
    ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列であるＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号５）；
    ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列であるＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号６）；
    ＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列であるＦＡＳＳＬＨＳ（配列番号３８７）；及び
    ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列であるＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号８）。
16. 下記の配列を含む請求項１に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント、
    ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列であるＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号３）；
    ＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列であるＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＱＲ（配列番号４１４）；
    ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列であるＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号５）；
    ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列であるＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号６）；
    ＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列であるＦＡＳＳＬＨＳ（配列番号３８７）；及び
    ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列であるＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号８）。
17. 下記の配列を含む請求項１に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント、
    ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列であるＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号３）；
    ＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列であるＷＩＮＴＦＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＱＲ（配列番号４１５）；
    ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列であるＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号５）；
    ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列であるＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号６）；
    ＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列であるＦＡＳＳＬＨＳ（配列番号３８７）；及び
    ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列であるＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号８）。
18. 下記の配列を含む請求項１に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント、
    ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列であるＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号３）；
    ＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列であるＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号４）；
    ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列であるＹＰＥＦＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号４１８）；
    ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列であるＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号６）；
    ＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列であるＦＡＳＳＬＨＳ（配列番号３８７）；及び
    ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列であるＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号８）。
19. ヒト化抗体、又はヒト化抗体の抗ＶＥＧＦ結合フラグメントである、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント。
20. ＩｇＧである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント。
21. ＡＤＣＣ活性を増加する１種以上の突然変異をＦｃ領域に含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント。
22. フコシル化されていない請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント。
23. ＦｃγＲとの結合性を増加する１種以上の突然変異をＦｃ領域に含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント。
24. ＦｃＲｎとの結合性を増加する１種以上の突然変異をＦｃ領域に含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント。
25. 前記１種以上の突然変異以外に、配列番号１に対応するＶ _Ｈ 配列及び配列番号２に対応するＶ _Ｌ 配列を有する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント。
26. 請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体又はその抗ＶＥＧＦ結合フラグメントを含む、抗体−薬剤コンジュゲート。
27. 請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体若しくはその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント、又は請求項２６に記載の抗体−薬剤コンジュゲートと、医薬的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物。
28. 癌を治療するための医薬の製造における、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体若しくはその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント、請求項２６に記載の抗体−薬剤コンジュゲート又は請求項２７に記載の医薬組成物の使用。
29. 癌が転移性結腸癌、転移性直腸癌、非扁平上皮型非小細胞肺癌又は転移性ＨＥＲ２陰性乳癌である、請求項２８に記載の使用。
30. 癌が切除不能、局所進行、再発性又は転移性の非扁平上皮型非小細胞肺癌である請求項２８に記載の使用。
31. 加齢黄斑変性治療するための医薬の製造における、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体若しくはその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント、請求項２６に記載の抗体−薬剤コンジュゲート、又は請求項２７に記載の医薬組成物の使用。
32. 免疫疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体若しくはその抗ＶＥＧＦ結合フラグメント、請求項２６に記載の抗体−薬剤コンジュゲート、又は請求項２７に記載の医薬組成物の使用。
33. 免疫疾患が関節リウマチ又はグレーブス病である、請求項３２に記載の使用。

Images