JP5750766B2 - 血管新生誘導活性及び抗菌活性を有するポリペプチドおよびそれを含有する創傷治療剤 - Google Patents
血管新生誘導活性及び抗菌活性を有するポリペプチドおよびそれを含有する創傷治療剤 Download PDFInfo
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Description
本発明は、血管新生誘導活性及び抗菌活性を有する新規ポリペプチドおよびそれを含有する血管新生誘導剤または創傷治療剤に関する。
熱傷、褥瘡、創傷、皮膚潰瘍、下肢潰瘍、糖尿病性潰瘍、閉塞性動脈疾患及び閉塞性動脈硬化症等の種々の疾患又は傷害の治療においては、血管新生が有効である。また、このような疾患においては、細菌感染が病態の重篤な増悪を誘発することから、抗菌活性及び血管新生誘導活性を併せ持つ血管新生誘導剤または創傷治療剤が求められている。
血管新生誘導活性及び抗菌活性を有するポリペプチドとしては、LL−37が知られている。（非特許文献１および２）。
また、中神らは、血管内皮増殖活性、ひいては血管新生誘導活性を有するポリペプチドを発明し、さらに該ペプチドがLL−37より高い血管新生誘導活性を有することを見出し、これを特許出願した（特許文献１）。
さらに中神らは、特許文献１に係るペプチドより高い血管新生誘導活性を有する30アミノ酸残基よりなるポリペプチドAG30-5Cを見出し、これを特許出願した（特許文献２）。
特許文献１および２には、該ポリペプチドが抗菌活性を有することも開示されている。
また他にも、低用量で血管新生誘導作用を示すペプチドとしてProadrenomedullin NH2-Terminal 20 peptide(PAMP)が知られている（非特許文献３）。
Koczulla R, von Degenfeld G, Kupatt C, Krotz F, Zahler S, GloeT, Issbrucker K, Unterberger P, Zaiou M, Lebherz C, Karl A, Raake P, Pfosser A, Boekstegers P, Welsch U, Hiemstra PS, Vogelmeier C, Gallo RL, Clauss M, Bals R., "An angiogenic role for the human peptide antibiotic LL-37/hCAP-18.", J Clin Invest. 2003 Jun;111(11):1665-72
Zanetti M., "Cathelicidins, multifunctional peptides of the innate immunity.," J Leukoc Biol. 2004 Jan;75(1):39-48. Epub 2003 Jul 22.
Martinez A, Zudaire E, Portal-Nunez S, Guedez L, Libutti SK, Stetler-Stevenson WG, Cuttitta F. "Proadrenomedullin NH2-terminal 20 peptide is a potent angiogenic factor, and its inhibition results in reduction of tumor growth." Cancer Res. 2004 Sep 15;64(18):6489-94.
本発明の目的は、さらに優れた血管新生誘導活性及び抗菌活性を有する新規なポリペプチド及びそれを有効成分として含む新規な血管新生誘導剤または創傷治療剤を提供することである。
本願発明者らは、先のポリペプチドより高い血管内皮増殖活性、ひいては血管新生誘導活性を有するポリペプチドを見出した。また、それらのポリペプチドは従来のポリペプチドより高い抗菌活性を有していた。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特許文献１および２に記載されたポリペプチドの類縁体を探索することにより、該ポリペプチドよりも高い血管新生誘導活性および抗菌活性を有するポリペプチドを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
(1) アミノ酸配列が配列番号８及び１０のいずれかで表されるポリペプチド。
(2) アミノ酸配列が配列番号８で表される(1)記載のポリペプチド。
(3) アミノ酸配列が配列番号１０で表される(1)記載のポリペプチド。
(4) カルボキシル末端がアミド化されている(1)〜(3)のいずれか１項に記載のポリペプチド。
(5) (1)〜(4)のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分として含有する血管新生誘導剤。
(6) (1)〜(4)のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分として含有する抗菌剤。
(7) (1)〜(4)のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分として含有する、熱傷、創傷、びらん、皮膚潰瘍および難治性創傷から成る群から選択される疾患または障害の予防、改善又は治療剤。
(8) 熱傷、創傷、びらん、皮膚潰瘍および難治性創傷から成る群から選択される疾患または障害が、細菌または真菌の感染を伴うことを特徴とする、(7)記載の予防、改善又は治療剤。
(9) 熱傷、創傷、びらん、皮膚潰瘍および難治性創傷から成る群から選択される疾患または障害の感染を予防することを特徴とする、(7)記載の予防、改善又は治療剤。
に関する。
(1) アミノ酸配列が配列番号８及び１０のいずれかで表されるポリペプチド。
(2) アミノ酸配列が配列番号８で表される(1)記載のポリペプチド。
(3) アミノ酸配列が配列番号１０で表される(1)記載のポリペプチド。
(4) カルボキシル末端がアミド化されている(1)〜(3)のいずれか１項に記載のポリペプチド。
(5) (1)〜(4)のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分として含有する血管新生誘導剤。
(6) (1)〜(4)のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分として含有する抗菌剤。
(7) (1)〜(4)のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分として含有する、熱傷、創傷、びらん、皮膚潰瘍および難治性創傷から成る群から選択される疾患または障害の予防、改善又は治療剤。
(8) 熱傷、創傷、びらん、皮膚潰瘍および難治性創傷から成る群から選択される疾患または障害が、細菌または真菌の感染を伴うことを特徴とする、(7)記載の予防、改善又は治療剤。
(9) 熱傷、創傷、びらん、皮膚潰瘍および難治性創傷から成る群から選択される疾患または障害の感染を予防することを特徴とする、(7)記載の予防、改善又は治療剤。
に関する。
本発明により、優れた血管新生誘導活性及び抗菌活性を有するポリペプチドが提供された。また、このポリペプチドを有効成分とする新規な血管新生誘導剤が提供された。
上記の通り、本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列が配列番号８及び１０のいずれかで表されるポリペプチドである。なお、本明細書において、「ポリペプチド」と「ペプチド」の語は同義に用いられる。
特許文献２に記載されているポリペプチドAG30-5Cのアミノ酸配列を配列番号７に示す。AG30-5Cは、特許文献２および下記実施例において具体的に記載されているように、抗菌活性及び血管新生誘導活性を有する。AG30-5Cの種々の類縁体を作製し、その血管新生誘導活性及び抗菌活性を調べた。その結果、本発明に係る上記ポリペプチドが、血管新生誘導活性及び抗菌活性を有することが明らかになった。下記実施例に具体的に記載したように、本発明の実施例になるポリペプチドは、AG30-5Cよりも高い血管新生誘導活性及び抗菌活性を有していた。
なお、本発明の血管新生誘導剤の有効成分であるポリペプチドは、いずれも新規物質である。
一般に、ポリペプチドから成る医薬において、生体内でのポリペプチドの安定性を高めるために、ポリペプチドに糖鎖やポリエチレングリコール(PEG)鎖を付加したり、ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部としてＤ体アミノ酸を用いたりする技術が広く知られており、用いられている。糖鎖やPEG鎖を付加したり、ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部としてＤ体アミノ酸を用いたりすることにより、生体内でのペプチダーゼによる分解を受けにくくなり、生体内におけるポリペプチドの半減期が長くなる。また、ペプチドのＮ末端のアセチル化および／またはＣ末端のアミド化によって、ペプチドの安定性が向上することもよく知られている。本発明のポリペプチドは、抗菌活性を有する限り、生体内安定化のためのこれらの公知の修飾を施したものであってもよく、本明細書及び特許請求の範囲における「ポリペプチド」という語は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、生体内安定化のための修飾を施したものも包含する意味で用いている。
ポリペプチドに対する糖鎖付加は周知であり、例えば、Sato M, Furuike T, Sadamoto R, Fujitani N, Nakahara T, Niikura K, Monde K, Kondo H, Nishimura S., "Glycoinsulins: dendritic sialyloligosaccharide-displaying insulins showing a prolonged blood-sugar-lowering activity.",J Am Chem Soc. 2004 Nov 3;126(43):14013-22やSato M, Sadamoto R, Niikura K, Monde K, Kondo H, Nishimura S,"Site-specific introduction of sialic acid into insulin.", Angew Chem Int Ed Engl. 2004 Mar 12;43(12):1516-20等に記載されている。糖鎖は、Ｎ末端、Ｃ末端又はそれらの間のアミノ酸に結合可能であるが、ポリペプチドの活性を阻害しないためにＮ末端又はＣ末端に結合することが好ましい。また、付加する糖鎖の個数は、１個又は２個が好ましく、１個がより好ましい。糖鎖は、単糖から４糖が好ましく、さらには２糖又は３糖が好ましい。糖鎖は、ポリペプチドの遊離のアミノ基又はカルボキシル基に直接又は例えば炭素数１〜１０程度のメチレン鎖等のスペーサー構造を介して結合することができる。
ポリペプチドに対するPEG鎖の付加も周知であり、例えば、Ulbricht K, Bucha E, Poschel KA, Stein G, Wolf G, Nowak G., "The use of PEG-Hirudin in chronic hemodialysis monitored by the Ecarin Clotting Time: influence on clotting of the extracorporeal system and hemostatic parameters.", Clin Nephrol. 2006 Mar;65(3):180-90.やDharap SS, Wang Y, Chandna P, Khandare JJ, Qiu B, Gunaseelan S, Sinko PJ, Stein S, Farmanfarmaian A, Minko T., "Tumor-specific targeting of an anticancer drug delivery system by LHRH peptide.", Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Sep 6;102(36):12962-7."等に記載されている。PEG鎖は、Ｎ末端、Ｃ末端又はそれらの間のアミノ酸に結合可能であり、通常、１個又は２個のPEG鎖が、ポリペプチド上の遊離のアミノ基やカルボキシル基に結合される。PEG鎖の分子量は、特に限定されないが、通常3000〜7000程度、好ましくは5000程度のものが用いられる。
ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部をＤ体とする方法も周知であり、例えば、Brenneman DE, Spong CY, Hauser JM, Abebe D, Pinhasov A, Golian T, Gozes I., "Protective peptides that are orally active and mechanistically nonchiral.", J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jun;309(3):1190-7やWilkemeyer MF, Chen SY, Menkari CE, Sulik KK, Charness ME., "Ethanol antagonist peptides: structural specificity without stereospecificity.", J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jun;309(3):1183-9.等に記載されている。ポリペプチドを構成するアミノ酸の一部をＤ体としてもよいが、ポリペプチドの活性をできるだけ阻害しないため、ポリペプチドを構成するアミノ酸の全てをＤ体アミノ酸とすることが好ましい。
ここで本発明に係る薬理学的に許容される塩として、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸との塩や、酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸等の有機酸との塩を挙げることができ、中でも塩酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩がより好ましい。
さらに、本発明のポリペプチドには、実質的に同じ効果を奏するものであれば前述のものに限定されず、例えば１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドも含まれる。
本発明の血管新生誘導剤の有効成分であるポリペプチドは、市販のペプチド合成機を用いた化学合成等の常法により容易に製造することができる。また、上記安定化修飾も、上記各文献に記載されているような周知の方法により容易に行なうことができる。
本発明のポリペプチドは、高い血管新生誘導活性を有するので、血管新生誘導剤として用いることができる。血管新生誘導剤としての使用方法は公知のポリペプチド系の血管新生誘導剤と同様であり、溶液剤、乳剤、懸濁剤、粉剤、散剤、顆粒剤、ゲル、軟膏、または経皮パッチとして、特に好ましくは溶液剤、粉剤、あるいは経皮パッチとして投与することができる。溶液剤として好ましくは緩衝液、特に好ましくは生理食塩緩衝液等の水系媒体に溶解した溶液を投与することができる。溶液中のポリペプチドの濃度は、特に限定されないが、通常、0.001mg /mL〜100mg/mL程度、好ましくは0.001mg /mL〜10mg/mL程度、0.1mg /mL〜5mg/mL程度、特に好ましくは1mg/mL〜10mg/mL程度である。投与経路は、通常、血管新生が必要な部位への塗布や注射等の局所投与である。投与量は、症状や患部の大きさ等に応じて適宜選択されるが、通常、ポリペプチド量として0.001mg〜100mg程度、好ましくは0.005mg〜50mg程度、特に好ましくは0.01mg〜10mg程度であるが、もちろん、これらの範囲に限定されるものではない。なお、本発明の血管新生誘導剤を製剤化する際に用いられる薬剤的に許容できる担体としては、上記した水系媒体の他にも、製剤分野で常用されている担体を用いることができ、例えば、軟膏のような外用剤の場合には、炭化水素類（親水ワセリン、白色ワセリン、精製ラノリン、流動パラフィン等）、酸化亜鉛、高級脂肪酸及びそのエステル（アジピン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、アジピン酸エステル、ミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステル、セバシン酸ジエチル、ラウリン酸ヘキシル、イソオクタン酸セチル等）、ロウ類（鯨ロウ、ミツロウ、セレシン等）、高級アルコール（セタノール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール等）などが挙げられる。溶液剤の場合には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等を挙げることができ、経口剤の場合には、乳糖、デンプン等を挙げることができる。その他、必要に応じ、乳化剤、界面活性剤、等張化剤、pH調整剤等の各種医薬添加剤を配合することもできる。なお、これらの薬剤的に許容できる担体及び医薬添加剤は、製剤分野において周知であり、広く用いられているものである。
本発明のポリペプチドおよびこれを有効成分として含有する予防、改善および治療剤を、生体に投与する場合の具体的な疾患及び障害の例として、熱傷、創傷（切創・手術創を含む。本明細書中、以下同様。）、びらん、皮膚潰瘍（褥瘡、熱傷潰瘍、外傷性潰瘍、下肢潰瘍（静脈瘤症候群を含む）、帯状疱疹後潰瘍、放射線潰瘍、薬物潰瘍、糖尿病性潰瘍、術後潰瘍を含む。本明細書中以下同様。）、感染を伴う熱傷、創傷および皮膚潰瘍、難治性創傷（潰瘍および/または感染を伴うものを含む）を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。皮膚潰瘍は、損傷（欠損又は壊死）が真皮にまで及んでいる状態を指す（臨床透析vol.24, No7. 2008, 819-921など参照のこと）。すなわち、表皮層を完全に欠損または壊死し、真皮層も完全または部分的に欠損または壊死した状態を指す（Eur. J. Dermat. Vol.10, No.3, 2000, 173-80など参照のこと）。一般に皮膚潰瘍を伴う創傷を難治性創傷、または難治性皮膚潰瘍とも称する。潰瘍を伴う創傷は重症度の高い創傷であり、本発明のポリペプチドは皮膚潰瘍にも治療効果を示すことからも、これらがより軽症な潰瘍に至らない程度の創傷（熱傷を含む）に対しても治療効果を呈することは当業者には理解できるであろう。
本明細書中、「治療」とは、上記の傷および潰瘍が完全に消失することのみならず、傷および潰瘍の面積が部分的に縮小することも含む。また、本明細書中、「治療」および「改善」とは、傷および潰瘍の面積の完全な消失および部分的な縮小を促進することも含む。
本発明のポリペプチドおよびこれを有効成分として含有する予防、改善および治療剤は、これらの疾患又は障害に対する予防、改善又は治療剤として用いることができる。なお、本発明のポリペプチドおよびこれを有効成分として含有する予防、改善および治療剤は、高い血管新生誘導活性を有する一方、抗菌活性も有しているので、抗菌活性を併有することが望まれる疾患又は障害の予防、改善又は治療剤として特に適しており、このような疾患又は障害として、上記の疾患又は障害のうち熱傷、褥瘡、創傷、皮膚潰瘍を挙げることができる。また、本発明のポリペプチドおよびこれを有効成分として含有する予防、改善および治療剤は、感染を伴う熱傷、創傷、びらん、皮膚潰瘍に対しても有効であるとともに、感染を伴わない上記疾患または障害に対する感染予防にも有効である。
本発明のポリペプチドは、細菌（好気性菌および嫌気性菌を含む）および真菌に対して抗菌作用を示し、広範な抗菌スペクトルを有する。したがって、の広範な菌に感染（二次感染を含む）した熱傷、創傷、びらん、皮膚潰瘍、感染を伴う熱傷、創傷および皮膚潰瘍、難治性創傷（潰瘍および/または感染を伴うものを含む）ならびにその他の外傷に対して有効であるとともに、これらの広範な菌に対する感染予防にも有効である。例えば、大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌、腸内細菌などの皮膚感染の治療・改善および感染予防に有効である。例えば、本発明のポリペプチドおよびこれを有効成分として含有する予防、改善および治療剤は、外科手術における縫合後の手術創の治癒促進（肉芽形成促進を含む）とともに、その感染（二次感染を含む）の予防のために、用いることができる。勿論、感染した手術創の感染および/または創そのものの治癒に対しても用いることが可能である。
また、本発明のポリペプチドは血管新生作用を有することから、閉塞性動脈疾患、閉塞性動脈硬化症の治療剤としても用いることができる。
本明細書中、「治療」とは、上記の傷および潰瘍が完全に消失することのみならず、傷および潰瘍の面積が部分的に縮小することも含む。また、本明細書中、「治療」および「改善」とは、傷および潰瘍の面積の完全な消失および部分的な縮小を促進することも含む。
本発明のポリペプチドおよびこれを有効成分として含有する予防、改善および治療剤は、これらの疾患又は障害に対する予防、改善又は治療剤として用いることができる。なお、本発明のポリペプチドおよびこれを有効成分として含有する予防、改善および治療剤は、高い血管新生誘導活性を有する一方、抗菌活性も有しているので、抗菌活性を併有することが望まれる疾患又は障害の予防、改善又は治療剤として特に適しており、このような疾患又は障害として、上記の疾患又は障害のうち熱傷、褥瘡、創傷、皮膚潰瘍を挙げることができる。また、本発明のポリペプチドおよびこれを有効成分として含有する予防、改善および治療剤は、感染を伴う熱傷、創傷、びらん、皮膚潰瘍に対しても有効であるとともに、感染を伴わない上記疾患または障害に対する感染予防にも有効である。
本発明のポリペプチドは、細菌（好気性菌および嫌気性菌を含む）および真菌に対して抗菌作用を示し、広範な抗菌スペクトルを有する。したがって、の広範な菌に感染（二次感染を含む）した熱傷、創傷、びらん、皮膚潰瘍、感染を伴う熱傷、創傷および皮膚潰瘍、難治性創傷（潰瘍および/または感染を伴うものを含む）ならびにその他の外傷に対して有効であるとともに、これらの広範な菌に対する感染予防にも有効である。例えば、大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌、腸内細菌などの皮膚感染の治療・改善および感染予防に有効である。例えば、本発明のポリペプチドおよびこれを有効成分として含有する予防、改善および治療剤は、外科手術における縫合後の手術創の治癒促進（肉芽形成促進を含む）とともに、その感染（二次感染を含む）の予防のために、用いることができる。勿論、感染した手術創の感染および/または創そのものの治癒に対しても用いることが可能である。
また、本発明のポリペプチドは血管新生作用を有することから、閉塞性動脈疾患、閉塞性動脈硬化症の治療剤としても用いることができる。
本発明のポリペプチドおよびこれを有効成分として含有する予防、改善および治療剤は、単独で使用することもできるし、さらなる抗菌性が望まれる場合には他の抗菌剤又は抗生物質と併用することもできる。これらの抗菌剤又は抗生物質の例として、セフェム系、カルバペネム系、アミノグリコシト系、ニューキノロン系、β−ラクタム系、ペニシリン系及びグリコペプチド系抗生物質等を挙げることができ、より具体的には、セフタジジム、メロペネム、トブラマイシン、シプロフロキサシン、メチシリン、アンピシリン及びバンコマイシン等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１
１． ポリペプチドの合成
文献Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce (1984)、Fmoc solid synthesis：a practical approach, Oxford University Press（2000）および第5版 実験化学講座16 有機化合物の合成IV等に記載の方法に従い、全自動固相合成機を用いて、保護ペプチド樹脂をFmoc法で合成した。得られた保護ペプチド樹脂にトリフルオロ酢酸（TFA）とスカベンジャー（チオアニオール、エタンジチオール、フェノール、トリイソプロピルシラン、水などの混合物）を加えて、樹脂から切り出すとともに脱保護して、粗ペプチドを得た。この粗ペプチドを、逆相HPLCカラム(ODS)を用いて、0.1%TFA-H2O/CH3CNの系でグラジエント溶出し、精製を行った。目的物を含む分画を集め凍結乾燥して、目的のペプチドを得た。合成したペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸シーケンサーG1000A（Hewlett Packard）、PPSQ-23A（島津製作所）又はProciscLC（ABI社）を用いて確認した。
ペプチドの配列を以下に示す。SR-２、SR-３、SR-４およびSR-６はＣ末端をアミド化したものを後述の実施例に用いた。なお、Ｃ末端をアミド化したものも配列表には、アミノ酸配列のみを示す。
１． ポリペプチドの合成
文献Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce (1984)、Fmoc solid synthesis：a practical approach, Oxford University Press（2000）および第5版 実験化学講座16 有機化合物の合成IV等に記載の方法に従い、全自動固相合成機を用いて、保護ペプチド樹脂をFmoc法で合成した。得られた保護ペプチド樹脂にトリフルオロ酢酸（TFA）とスカベンジャー（チオアニオール、エタンジチオール、フェノール、トリイソプロピルシラン、水などの混合物）を加えて、樹脂から切り出すとともに脱保護して、粗ペプチドを得た。この粗ペプチドを、逆相HPLCカラム(ODS)を用いて、0.1%TFA-H2O/CH3CNの系でグラジエント溶出し、精製を行った。目的物を含む分画を集め凍結乾燥して、目的のペプチドを得た。合成したペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸シーケンサーG1000A（Hewlett Packard）、PPSQ-23A（島津製作所）又はProciscLC（ABI社）を用いて確認した。
ペプチドの配列を以下に示す。SR-２、SR-３、SR-４およびSR-６はＣ末端をアミド化したものを後述の実施例に用いた。なお、Ｃ末端をアミド化したものも配列表には、アミノ酸配列のみを示す。
SR-１（配列番号１）
MLKLIFLHRLKRMRKRLKRK
SR-２（配列番号２）
ELRFLHRLKRRLRKRLKRKLR-amide
SR-３（配列番号３）
ELRFLHRLKRMRKRLKRKLR-amide
SR-４（配列番号４）
KLIFLHRLKRMRKRLKRKLR-amide
SR-５（配列番号５）
KRMRKRLKRKLRLWHRKRYK
SR-６（配列番号６）
MRKRLKRKLRLWHRKRYK-amide
AG30-5C（配列番号７）
MLKLIFLHRLKRMRKRLKRKLRFWHRKRYK
SR-０８（配列番号８）
LKLIFLHRLKRMRKRLK*RK-amide
（K*：LysのD体）
ＰＡＭＰ（配列番号９）
ARLDVASEFRKKWNKWALSR-amide
MLKLIFLHRLKRMRKRLKRK
SR-２（配列番号２）
ELRFLHRLKRRLRKRLKRKLR-amide
SR-３（配列番号３）
ELRFLHRLKRMRKRLKRKLR-amide
SR-４（配列番号４）
KLIFLHRLKRMRKRLKRKLR-amide
SR-５（配列番号５）
KRMRKRLKRKLRLWHRKRYK
SR-６（配列番号６）
MRKRLKRKLRLWHRKRYK-amide
AG30-5C（配列番号７）
MLKLIFLHRLKRMRKRLKRKLRFWHRKRYK
SR-０８（配列番号８）
LKLIFLHRLKRMRKRLK*RK-amide
（K*：LysのD体）
ＰＡＭＰ（配列番号９）
ARLDVASEFRKKWNKWALSR-amide
２．ポリペプチドのMALDI-TOF/MSを用いた分析
合成したポリペプチドの配列をMALDI-TOF/MSを用いた分析結果により確認した。最終濃度100μg/mLのポリペプチド0.1% TFA/50% アセトニトリル溶液 1μLにマトリクス溶液（α-Cyano 4-Hydroxy Cinnamic Acid） 1μLを加え、MALDI用測定試料とした。MALDI用測定試料（0.4μL）をMALDIターゲットプレートに塗布し、乾燥させた。MALDI-TOF/MSを用いて測定した。
合成したポリペプチドの配列をMALDI-TOF/MSを用いた分析結果により確認した。最終濃度100μg/mLのポリペプチド0.1% TFA/50% アセトニトリル溶液 1μLにマトリクス溶液（α-Cyano 4-Hydroxy Cinnamic Acid） 1μLを加え、MALDI用測定試料とした。MALDI用測定試料（0.4μL）をMALDIターゲットプレートに塗布し、乾燥させた。MALDI-TOF/MSを用いて測定した。
MALDI-TOF/MS条件：
Laser intensity： 2100
Number of shots： 1000
Laser intensity： 2100
Number of shots： 1000
結果
各ポリペプチドのMALDI-TOF/MSの理論値及び実測値を表1に示した。各ポリペプチドの検出されたm/zは、それぞれの理論値と一致し、合成したポリペプチドの配列を確認することができた。
各ポリペプチドのMALDI-TOF/MSの理論値及び実測値を表1に示した。各ポリペプチドの検出されたm/zは、それぞれの理論値と一致し、合成したポリペプチドの配列を確認することができた。
３． ポリペプチドの血管新生誘導活性
AG30-5Cを陽性対照として、SR-１およびSR-２の血管新生誘導活性を測定した。具体的には、血管新生キット(Angiogenesis Kit, KZ-1000, 倉敷紡績株式会社)を用いてポリペプチドの管腔形成能を評価した。陰性対照としてポリペプチドなしの群（コントロール）を用いた。
AG30-5Cを陽性対照として、SR-１およびSR-２の血管新生誘導活性を測定した。具体的には、血管新生キット(Angiogenesis Kit, KZ-1000, 倉敷紡績株式会社)を用いてポリペプチドの管腔形成能を評価した。陰性対照としてポリペプチドなしの群（コントロール）を用いた。
各ポリペプチドの濃度が10 μg/mLとなるように血管新生専用培地（倉敷紡績（株）KZ-1500）に添加した。ポリペプチドを添加した専用培地を用いて細胞を37℃、5% CO2条件下で24ウェルプレート内で培養した。培地は、培養4日目、7日目及び9日目に同じポリペプチドを含有するものと交換した。培養開始11日目に培地を除き、管腔染色キット（CD31抗体染色用）を用いて以下の手順に従い染色を行った。
一次抗体（マウス抗ヒトCD31抗体）をブロッキング液（1％BSAを含むダルベッコリン酸緩衝液（PBS（−）））で4000倍に希釈した。各ウェルにこの一次抗体溶液0.5 mLを添加し、60分間37℃でインキュベートした。インキュベート終了後、1 mLのブロッキング液で各ウェルを計3回洗浄した。
次いでブロッキング液で500倍希釈した二次抗体溶液（ヤギ抗マウスIgGアルカリホスファターゼ複合体）0.5 mLを各ウェルに添加し、60分間37℃でインキュベートした後、1 mLの蒸留水で3回洗浄した。その間に、BCIP/NBTの錠剤2錠を蒸留水に溶解し、ポアサイズ0.2 μmのフィルターで濾過して基質溶液を準備した。調製したBCIP/NBT基質溶液0.5 mLを各ウェルに添加し，管腔が深紫色になるまで（通常5-10分間）37℃でインキュベートした。インキュベート終了後、蒸留水1 mLで各ウェルを3回洗浄した。洗浄後、洗浄液を吸引除去し、自然乾燥するため静置した。乾燥後、顕微鏡下で各ウェルの写真を撮影した。
得られた各画像を、血管新生定量ソフトウェアを用い定量化した。様々な指標でコンピューター解析を行い、このスケールをもとに各視野中に形成された管腔の長さを測定し、コントロールに対するポリペプチド添加の効果を評価した。
結果を表３および4に示す。
表３に示されるように、本発明のポリペプチドSR-１およびSR-２は、いずれも血管新生誘導活性を有していた。その活性は、AG30-5Cよりも高かった。
また、表４に示されるように、本発明のポリペプチドSR-１８は、血管新生誘導活性を有していた。その活性は、AG30-5CおよびPAMPよりも高かった。
４．ポリペプチドの抗菌活性
ATPアッセイ法を用いてポリペプチドの抗菌活性を測定した。
ATPアッセイ法を用いてポリペプチドの抗菌活性を測定した。
PROMEGA社BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay kitを用いて、細菌の生存率からペプチドの抗菌活性を評価した。すなわち、マイクロタイタープレートあるいは試験管を用いて、ペプチド濃度10μg/mLにおける生菌中のATP量を測定した。
菌株には、グラム陽性菌として黄色ブドウ球菌ATCC29213 (S. aureus ATCC29213) あるいはグラム陰性菌として緑膿菌（P. aeruginosa ATCC27853）を用いた。細菌を培地で３〜４時間培養した後、A600における吸光度を測定した。McFarland #0.5にしたがって、ミューラー・ヒントン・ブロス（Mueller-Hinton broth：MHB）で菌液を希釈した。各菌株を大腸菌換算で0.5−1x105CFU/mL（最終濃度）程度になるように添加した。マイクロプレートあるいは試験管に各ペプチドを最終濃度10μg/mLになるよう調製、分注し、菌液を添加した。ペプチド無添加のものを陰性対照とし、トブラマイシン（TOB）を陽性対照とした。プレートを37℃で3時間培養し、培養液中のATP量を測定した。陰性対照と比較して相対値を求め、それを生存率とした。
結果を表５に示す。
表３に示されるように、本発明のポリペプチドSR-１、SR-２、SR-３、SR-４およびSR-６は、AG30-5Cより黄色ブドウ球菌に対して優れた抗菌活性を示した。さらに、SR-２およびSR−３は、AG30-5Cより緑膿菌に対して優れた抗菌活性を示した。
実施例２
１． ポリペプチドの合成
実施例１と同様にして、本発明のポリペプチドであるSR-07及び対照のポリペプチドであるAP00196を合成し、合成した各ポリペプチドのアミノ酸配列を、実施例１と同様にして確認した。これらのポリペプチドの配列は次の通りであった。
１． ポリペプチドの合成
実施例１と同様にして、本発明のポリペプチドであるSR-07及び対照のポリペプチドであるAP00196を合成し、合成した各ポリペプチドのアミノ酸配列を、実施例１と同様にして確認した。これらのポリペプチドの配列は次の通りであった。
SR-07（配列番号１０)
MLKLIFLHRLKRMRKRLK*RK
AP00196（対照）（配列番号１１）
KNLRRIIRKIIHIIKKYG
MLKLIFLHRLKRMRKRLK*RK
AP00196（対照）（配列番号１１）
KNLRRIIRKIIHIIKKYG
２． ポリペプチドの抗菌活性（ATPアッセイ）
ATPアッセイ法を用いてSR-08、SR-07各ポリペプチドの抗菌活性を測定した。すなわち、PROMEGA社BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay kitを用いて、細菌の生存率からペプチドの抗菌活性を評価した。すなわち、マイクロタイタープレートあるいは試験管を用いて、ペプチド濃度10μg/mLにおける生菌中のATP量を測定した。対照として、トブラマイシン（TOB）、オキサシリン（OX）およびメロペネム(MEPM)を下記表６のとおりの濃度でそれぞれ用いた。
ATPアッセイ法を用いてSR-08、SR-07各ポリペプチドの抗菌活性を測定した。すなわち、PROMEGA社BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay kitを用いて、細菌の生存率からペプチドの抗菌活性を評価した。すなわち、マイクロタイタープレートあるいは試験管を用いて、ペプチド濃度10μg/mLにおける生菌中のATP量を測定した。対照として、トブラマイシン（TOB）、オキサシリン（OX）およびメロペネム(MEPM)を下記表６のとおりの濃度でそれぞれ用いた。
菌株には、大腸菌：ATCC 25922（Escherichia coli ATCC 25922）、緑膿菌：ATCC 27853（Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853）、黄色ブドウ球菌：ATCC29213 (Staphylococcus aureus ATCC29213)、肺炎桿菌：JCM 1662（ Klebsiella pneumoniae JCM 1662）、腸内細菌(1)：JCM 1232（Enterobacter cloacae JCM 1232）、腸内細菌(2)：JCM 1235（Enterobacter aerogenes JCM 1235）を用いた。
細菌を培地で３〜４時間培養した後、A600における吸光度を測定した。McFarland #0.5にしたがって、ミューラー・ヒントン・ブロス（Mueller-Hinton broth：MHB）で菌液を希釈した。各菌株を大腸菌換算で0.5-1x105CFU/mL（最終濃度）程度になるように添加した。マイクロプレートあるいは試験管に各ペプチドを最終濃度10μg/mLになるよう調製、分注し、菌液を添加した。プレートを37℃で3時間培養し、培養液中のATP量を測定した。陰性対照と比較して相対値を求め、それを生存率とした。
結果（平均値）を下記表７に示す。
結果（平均値）を下記表７に示す。
表７に示されるように、本発明のポリペプチドは広い抗菌スペクトルを有していた。
３． ポリペプチドの抗菌活性（MIC測定）
さらに、上記菌株に加えて種々の他の菌株についても「最小発育阻止濃度（minimum inhibitory concentration：MIC）」を以下のとおり測定した。MICは菌の発育が阻止される最小の薬剤濃度であり、抗菌剤の効力、菌の感受性の強さなどの指標として用いられ、その濃度以下であれば、菌は生育(増殖)でき、濃度以上であれば生育できないという濃度である。この測定は、日本化学療法学会またはCLINICAL AND LABORATORY STANDARD INSTITUTE（CLSI）が標準法として定める方法に従って測定されるが、ここではＣＬＳＩが2007年1月発行した「Ｍ１００−Ｓ１７ /Ｍ７−Ａ７」（Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Seventeenth Informational Supplemen、Vol. 27 No.1）に準拠し、微量液体希釈法で測定した。すなわち、マイクロタイタープレートあるいは試験管を用いて、薬剤感受性試験を行った。
さらに、上記菌株に加えて種々の他の菌株についても「最小発育阻止濃度（minimum inhibitory concentration：MIC）」を以下のとおり測定した。MICは菌の発育が阻止される最小の薬剤濃度であり、抗菌剤の効力、菌の感受性の強さなどの指標として用いられ、その濃度以下であれば、菌は生育(増殖)でき、濃度以上であれば生育できないという濃度である。この測定は、日本化学療法学会またはCLINICAL AND LABORATORY STANDARD INSTITUTE（CLSI）が標準法として定める方法に従って測定されるが、ここではＣＬＳＩが2007年1月発行した「Ｍ１００−Ｓ１７ /Ｍ７−Ａ７」（Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Seventeenth Informational Supplemen、Vol. 27 No.1）に準拠し、微量液体希釈法で測定した。すなわち、マイクロタイタープレートあるいは試験管を用いて、薬剤感受性試験を行った。
細菌を液体培地で４〜６時間培養した後、A600における吸光度を測定した。McFarland #0.5にしたがって、ミューラー・ヒントン・ブロス（Mueller-Hinton broth：MHB）で希釈した。各菌株を105CFU/ml（最終濃度）程度になるように添加した。各ペプチドは任意の濃度に調製し、そこから段階希釈を行った。各濃度段階のポリペプチドを分注したマイクロプレートあるいは試験管に菌液を添加した。クロラムフェニコール、アンホテリシンB、シプロフロキサシン、メロペネム(MEPM)、シプロフロキサシン(CPFX)、トブラマイシン（TOB）、およびオキサシリン（OX）を陽性対照とした。プレートを37℃で20時間培養し、生育の阻止された最小の濃度を最小生育阻止濃度とした。
それぞれの菌についての結果(MIC)を下記表８−１ないし表８−３に示す。
単位：濃度（μg/mL）
※2回の試験でMICが一致したものは欄内の数字が1個、一致しなかったものは1回目/2回目それぞれの値を示した
※N.T.：試験せず
単位：濃度（μg/mL）
※2回の試験でMICが一致したものは欄内の数字が1個、一致しなかったものは1回目/2回目それぞれの値を示した
※N.T.：試験せず
この結果からも、SR-07およびSR-08のポリペプチドは、広い抗菌スペクトルを有していることがわかった。
４． 管腔形成試験
続いてこれらの血管新生活性を調べるために、倉敷紡績株式会社の血管新生キット（製品番号：KZ-1000）を用いてポリペプチドの管腔形成を評価した。陽性対照として血管内皮増殖因子（VEGF）、陰性対照としてポリペプチドなしの無刺激の群を用いた。
続いてこれらの血管新生活性を調べるために、倉敷紡績株式会社の血管新生キット（製品番号：KZ-1000）を用いてポリペプチドの管腔形成を評価した。陽性対照として血管内皮増殖因子（VEGF）、陰性対照としてポリペプチドなしの無刺激の群を用いた。
キットに添付の血管新生専用培地を用いて、各ポリペプチドの濃度が0.5、2.5、10 μg/mLとなるように調製した。キットに添付の細胞が播種された24ウェル（ヒト血管内皮細胞と線維芽細胞を最適濃度で共培養した細胞）にポリペプチドを含有する血管新生専用培地を添加し、37℃、5% CO2条件下で培養した。培養4日目、7日目及び9日目に同じ添加物を含有する培地と交換した。培養開始11日目に管腔染色キット（CD31抗体染色用）を用いて以下の手順に従い染色した。
培地を除き、ダルベッコリン酸緩衝液（PBS（−））洗浄後、氷冷した70%エタノールを添加し細胞を固定した。ブロッキング液（1％BSAを含むダルベッコリン酸緩衝液（PBS（−））で各ウェルを洗浄し、ブロッキング液で4000倍に希釈したCD31染色1次抗体（マウス抗ヒトCD31抗体）を各ウェルに0.5 mL添加後、60分間37℃でインキュベートした。インキュベート終了後、1mLのブロッキング液で各ウェルを計3回洗浄した。次いでブロッキング液で500倍希釈した2次抗体溶液（ヤギ抗マウスIgGアルカリホスファターゼ複合体）0.5 mLを各ウェルに添加し、60分間37℃でインキュベートした後、1mLの蒸留水で3回洗浄した。その間に、BCIP/NBTの錠剤2錠を蒸留水に溶解し、ポアサイズ0.2μmのフィルターで濾過して基質溶液を準備した。調製したBCIP/NBT基質溶液0.5mLを各ウェルに添加し，管腔が深紫色になるまで（通常5-10分間）37℃でインキュベートした。インキュベート終了後、蒸留水1 mLで各ウェルを3回洗浄した。洗浄後、洗浄液を吸引除去し、自然乾燥するため静置した。乾燥後、顕微鏡下で各ウェルの写真を撮影した。
得られた各画像を、血管新生定量ソフトウェアを用い定量化した。倉敷紡績株式会社の血管新生定量ソフトウェア（血管新生定量ソフトウェア Ver 1.0）のスケールをもとに各視野中に形成された管腔の面積を測定し、陰性対照に対するポリペプチド添加時の割合で評価した。
結果を図１に示す。表中、陰性対照を100とした相対値を示す。この結果から試験した濃度でSR-07 およびSR-08ともに管腔形成能を示すことがわかった。
５． コラーゲン産生試験
48ウェルプレートに正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）を播種した。培地は1% FBS含有Medium 106を用いた。約3時間、37℃、5% CO2インキュベーター内で培養後、培地で各濃度に希釈したペプチドまたはFGFb（陽性対照）を添加し、さらに培養した。3日目に同じ添加物を含有するものと交換し、さらに2日間培養した。
48ウェルプレートに正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）を播種した。培地は1% FBS含有Medium 106を用いた。約3時間、37℃、5% CO2インキュベーター内で培養後、培地で各濃度に希釈したペプチドまたはFGFb（陽性対照）を添加し、さらに培養した。3日目に同じ添加物を含有するものと交換し、さらに2日間培養した。
コラーゲン産生量の測定はSemi-Quantitative Collagen Assay Kitを用いて行った。
5日間培養後、培地を吸引除去し、冷PBS(-)で細胞を洗浄した。冷メタノール／エタノールを添加して10分間、室温で静置し細胞を固定した。冷PBS(-)で細胞を2回洗浄後、染色液（Dye Solution）を各ウェルに加えて室温、30分間静置した。染色液を除き、脱イオン水で4〜5回洗浄した。抽出液（Dye extraction solution）を各ウェルに加えて色素を抽出し、抽出液の540nmおよび605nmの吸光度を測定した。
5日間培養後、培地を吸引除去し、冷PBS(-)で細胞を洗浄した。冷メタノール／エタノールを添加して10分間、室温で静置し細胞を固定した。冷PBS(-)で細胞を2回洗浄後、染色液（Dye Solution）を各ウェルに加えて室温、30分間静置した。染色液を除き、脱イオン水で4〜5回洗浄した。抽出液（Dye extraction solution）を各ウェルに加えて色素を抽出し、抽出液の540nmおよび605nmの吸光度を測定した。
コラーゲン量および非コラーゲンタンパク量は以下の計算式により算出した。
コラーゲン(μg/well)＝[OD540 - (OD605 × 0.291) ] / 37.8 ×1000
非コラーゲンタンパク(μg/well) ＝ OD605 / 2.04 ×1000
コラーゲン(μg/well)＝[OD540 - (OD605 × 0.291) ] / 37.8 ×1000
非コラーゲンタンパク(μg/well) ＝ OD605 / 2.04 ×1000
結果を図２に示す。図２に示されるように、SR-07およびSR-08ともに線維芽細胞のコラーゲン産生を誘導する効果があることが明らかになった。
６． ヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖への影響
次に、これらポリペプチドのヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の増殖に対する影響を検討した。同仁化学のCell Counting Kit（WST-1）を用いてポリペプチドの細胞増殖活性を調べた。陰性対照（Control）として、ポリペプチドなしの群を用いた。細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞：HUVEC）を96ウェルプレートに播種した（0.5×104 cells/well/100 μL、血清1%）。細胞を播種してから約3時間後、ポリペプチド（1,3,10,30,または100μg/ml）、陽性対照としてFGF(100ng/ml)を100μL添加した。無刺激の群には培地のみを100 μL添加した。CO2インキュベータ内に約48時間静置した後、WST-1試薬を各ウェルに20μL添加し、CO2インキュベータ内で約 2時間静置した。Wallac 1420 ARVOsx（プログラム：WST-1）にて波長450 nm，620 nmの吸光度を測定した。各測定値のO.D.450 - O.D.620を求めた。測定ウェルのO.D.450 - O.D.620の値から細胞を含まない空ウェルのO.D.450 - O.D.620の平均値を引いたものをNet O.D.450 とした。細胞増殖活性は無刺激のNet O.D.450に対するポリペプチド添加時の割合で評価した。
次に、これらポリペプチドのヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の増殖に対する影響を検討した。同仁化学のCell Counting Kit（WST-1）を用いてポリペプチドの細胞増殖活性を調べた。陰性対照（Control）として、ポリペプチドなしの群を用いた。細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞：HUVEC）を96ウェルプレートに播種した（0.5×104 cells/well/100 μL、血清1%）。細胞を播種してから約3時間後、ポリペプチド（1,3,10,30,または100μg/ml）、陽性対照としてFGF(100ng/ml)を100μL添加した。無刺激の群には培地のみを100 μL添加した。CO2インキュベータ内に約48時間静置した後、WST-1試薬を各ウェルに20μL添加し、CO2インキュベータ内で約 2時間静置した。Wallac 1420 ARVOsx（プログラム：WST-1）にて波長450 nm，620 nmの吸光度を測定した。各測定値のO.D.450 - O.D.620を求めた。測定ウェルのO.D.450 - O.D.620の値から細胞を含まない空ウェルのO.D.450 - O.D.620の平均値を引いたものをNet O.D.450 とした。細胞増殖活性は無刺激のNet O.D.450に対するポリペプチド添加時の割合で評価した。
結果を図３に示す。図３に示されるように、SR-07は１〜10μg/mlで、SR-08 は１〜30μg/mlでHUVECに対し増殖能を有し、それを超える濃度では毒性を示す傾向があることが明らかになった。
７． 正常ヒト皮膚線維芽細胞の増殖への影響
続いて、上記と同様の方法で、正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）の増殖に対する影響も検討した。
続いて、上記と同様の方法で、正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）の増殖に対する影響も検討した。
結果を図４に示す。図４に示されるように、SR-07およびSR-08 は１〜30μg/mlでNHDFに対し増殖能を有し、それを超える濃度では毒性を示す傾向があることが明らかになった。
８． 血清中安定性の検討
ポリペプチドについて、血清中の安定性を評価した。ペプチドを最終濃度500μg/mLとなるように、ヒト血清（株式会社ケー・エー・シーより購入）またはラットより採血後室温放置後遠心分離により得られたラット血清に溶解させ、３７℃で静置した．3分または10分の静置後、HPLCクロマトグラム分析に供し分解物ピークを検出し、溶液中に残存するペプチド濃度の開始濃度に対する割合を算出した。また、各ペプチドの血清中の半減期を算出した。
ポリペプチドについて、血清中の安定性を評価した。ペプチドを最終濃度500μg/mLとなるように、ヒト血清（株式会社ケー・エー・シーより購入）またはラットより採血後室温放置後遠心分離により得られたラット血清に溶解させ、３７℃で静置した．3分または10分の静置後、HPLCクロマトグラム分析に供し分解物ピークを検出し、溶液中に残存するペプチド濃度の開始濃度に対する割合を算出した。また、各ペプチドの血清中の半減期を算出した。
ここで、HPLCクロマトグラム分析の条件は下記のとおりであった。
カラム：CAPCELL PAK C18 MGII （S-3μm，4.6×150PE，資生堂）
ガードカラム：GUARD CARTRIDGE CAPCELL C18 MG （S-3μm，4.0×10PE，資生堂）
カラム温度：50℃
移動相A：0.025% トリフルオロ酢酸溶液
移動相B：0.025% トリフルオロ酢酸 アセトニトリル
流量：1.0 mL/min
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：220 nm）
注入量：100 μL
グラジェント条件：
カラム：CAPCELL PAK C18 MGII （S-3μm，4.6×150PE，資生堂）
ガードカラム：GUARD CARTRIDGE CAPCELL C18 MG （S-3μm，4.0×10PE，資生堂）
カラム温度：50℃
移動相A：0.025% トリフルオロ酢酸溶液
移動相B：0.025% トリフルオロ酢酸 アセトニトリル
流量：1.0 mL/min
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：220 nm）
注入量：100 μL
グラジェント条件：
結果を表１０に示す。
表１０に示されるように、ラット血清中においては、SR-08の方が顕著に高い安定性を示したものの、ヒト血清中では両者の安定性はほとんど同等であった。
９． ペーパーディスクモデルによる肉芽組織形成能の比較
続いて、これらポリペプチドのin vivoにおける肉芽組織形成能について検討した。Crl:CD（SD）系ラット（雄、9週齢、日本チャールス・リバー株式会社より入手）に、25、250、2500μg/ｍLの濃度の被験物質である各ペプチド、2.5、25、250μg/ｍLの濃度のｂFGF製剤（陽性対照）または生食（陰性対照）を40μlずつディスク(disc)に添加し、最終的には、各ペプチドは1, 10及び100μg/discの用量とし、添加したペーパーディスク（FILTER PAPER φ8 mm , ADVANTEC）をラット背部皮下に埋め込んだ。8日後、ペーパーディスクを摘出し、ペーパーディスク周辺部の肉芽組織を採取し、その湿重量を測定した。
続いて、これらポリペプチドのin vivoにおける肉芽組織形成能について検討した。Crl:CD（SD）系ラット（雄、9週齢、日本チャールス・リバー株式会社より入手）に、25、250、2500μg/ｍLの濃度の被験物質である各ペプチド、2.5、25、250μg/ｍLの濃度のｂFGF製剤（陽性対照）または生食（陰性対照）を40μlずつディスク(disc)に添加し、最終的には、各ペプチドは1, 10及び100μg/discの用量とし、添加したペーパーディスク（FILTER PAPER φ8 mm , ADVANTEC）をラット背部皮下に埋め込んだ。8日後、ペーパーディスクを摘出し、ペーパーディスク周辺部の肉芽組織を採取し、その湿重量を測定した。
結果を図５（SR-07）および図６（SR-08）に示す。図５及び図６に示されるように、SR-07およびSR-08ともにin vivoにおいて肉芽組織形成を促進することがわかった。
１０． 切創治癒効果
次に、ラット切創モデルを用いて、SR-07およびSR-08のポリペプチドのin vivoにおける切創治癒効果を評価した。ラット切創モデルの作製および創耐張力の測定は、山浦哲明ら（応用薬理22，565〜579(1981)）に記載のとおり行った。
次に、ラット切創モデルを用いて、SR-07およびSR-08のポリペプチドのin vivoにおける切創治癒効果を評価した。ラット切創モデルの作製および創耐張力の測定は、山浦哲明ら（応用薬理22，565〜579(1981)）に記載のとおり行った。
すなわち、Crl:CD（SD）系ラット（雄、７週齢、日本チャールス・リバー株式会社より入手）の背部に安全剃刀で30〜36 mmの切創を作製し，等間隔に3ヵ所を縫合した。この外科処置を実施した日を1日目（day0）とした。縫合部位に，各濃度に調製した被験物質である各ペプチド（10, 100及び1000μg/mL）を50μL滴下（添加量として500 ng, 5及び50μg）した。50μLの生理食塩水を添加したものを陰性対照（Saline）とした。なお，各ペプチドは、創耐張力測定日まで1日1回滴下した。3日目（day 3）に抜糸し，6日目（day 6）に創耐張力を測定した。
結果を図７(SR-07)および図８（SR-08）に示す。図７及び図８に示されるように、創耐張力を増加させる傾向が見られ、線維芽細胞増殖およびコラーゲン産生による結合組織の再生を促し、切創治癒を促進しうることが示唆された。
１１． 感染創による治癒効果
上記で切創治癒促進効果が認められたが、さらに、黄色ブドウ球菌に感染した創傷に対する治癒効果を評価した。ラット感染創モデルは、Stenberg BD他（J Surg Res. 1991 Jan;50(1):47-50.）およびHayward P 他（Am J Surg. 1992 Mar;163(3):288-93.）を参考に下記のとおり作製した。HWY/slc系ヘアレスラット（雄、7週齢、日本エスエルシー株式会社より入手）を用いた。全層欠損作製前日に白血球数の測定及びサイクロフォスファマイド（100 mg/kg）の尾静脈内投与を行い、その翌日に白血球数をカウントし、白血球数5000以下の個体のみを使用した。ラットの背部に1.73 x 1.73 cm（約3cm2）の正方形の全層欠損を作製し、欠損部に黄色ブドウ球菌（約105CFU/25μL）及び被験物質としてペプチド SR-07またはSR-08 2 mg/mLを25μL滴下（投与量として50μg）した。なお、bFGF製剤（陽性対照）群は3μg/25μLを、陰性対照群は生理食塩水を25μL滴下した。被験物質投与後、創部を被覆剤（パーミロール, 日東メディカル）で被覆した（day 0）。その後、黄色ブドウ球菌及び被験物質を1日1回連続4日間（day 0, 1, 2, 3）滴下した。全層欠損作製日から10日目まで、まだ治癒していない創傷面積を測定し、創傷を与えた面積に対する割合を算出し、グラフに示した（図９(SR-07)および図１０(SR-08)）。
上記で切創治癒促進効果が認められたが、さらに、黄色ブドウ球菌に感染した創傷に対する治癒効果を評価した。ラット感染創モデルは、Stenberg BD他（J Surg Res. 1991 Jan;50(1):47-50.）およびHayward P 他（Am J Surg. 1992 Mar;163(3):288-93.）を参考に下記のとおり作製した。HWY/slc系ヘアレスラット（雄、7週齢、日本エスエルシー株式会社より入手）を用いた。全層欠損作製前日に白血球数の測定及びサイクロフォスファマイド（100 mg/kg）の尾静脈内投与を行い、その翌日に白血球数をカウントし、白血球数5000以下の個体のみを使用した。ラットの背部に1.73 x 1.73 cm（約3cm2）の正方形の全層欠損を作製し、欠損部に黄色ブドウ球菌（約105CFU/25μL）及び被験物質としてペプチド SR-07またはSR-08 2 mg/mLを25μL滴下（投与量として50μg）した。なお、bFGF製剤（陽性対照）群は3μg/25μLを、陰性対照群は生理食塩水を25μL滴下した。被験物質投与後、創部を被覆剤（パーミロール, 日東メディカル）で被覆した（day 0）。その後、黄色ブドウ球菌及び被験物質を1日1回連続4日間（day 0, 1, 2, 3）滴下した。全層欠損作製日から10日目まで、まだ治癒していない創傷面積を測定し、創傷を与えた面積に対する割合を算出し、グラフに示した（図９(SR-07)および図１０(SR-08)）。
図９及び図１０に示されるように、感染創傷に対しては、SR-07およびSR-08ともに、bFGF製剤（フィブラストスプレー）より高い治癒効果を示し、感染を伴わない創傷に対して生理食塩水を投与した群と同程度の早さで治癒することがわかった。
１１． 糖尿病皮弁モデルにおける糖尿病性皮膚潰瘍の治癒効果
糖尿病モデルを作製することを目的として，7週齢のオスのヘアレスラット（HWY/slc）を用いて、全層欠損皮弁作製前日に血糖値の確認及びストレプトゾトシン（65 mg/kg）の尾静脈内単回投与を行った．ストレプトゾトシン投与翌日に血糖値を測定し，血糖値が300 mg/dL以上の個体のみを糖尿病モデルと判定し全層欠損皮弁モデルを作製した．全層欠損皮弁は，まずラットの背部に2x2 cm（正方形）の尾側を基部とした有茎皮弁を作製し，作製した有茎皮弁の中央部に1.4x1.4 cm（正方形：約2 cm2）の全層（真皮層も含む）欠損部を作製した．その後，ただちに皮弁部を縫合処置することによって全層欠損皮弁モデルとした．該モデルは真皮層も欠損していることから、糖尿病性の難治性創傷または皮膚潰瘍のモデルである。作製した創部に目的の被験物質投与後，創部を被覆剤（パーミロール, 日東メディカル）で被覆した（day 0）．その後，測定日毎に1日1回の被験物質の投与を行い，創面積の変化をデジタルノギス及びデジタル画像からの実測値を算出し、まだ治癒していない創傷面積を測定し、創傷を与えた面積（Day 0）に対する割合を算出した結果を図１１に示す。
糖尿病モデルを作製することを目的として，7週齢のオスのヘアレスラット（HWY/slc）を用いて、全層欠損皮弁作製前日に血糖値の確認及びストレプトゾトシン（65 mg/kg）の尾静脈内単回投与を行った．ストレプトゾトシン投与翌日に血糖値を測定し，血糖値が300 mg/dL以上の個体のみを糖尿病モデルと判定し全層欠損皮弁モデルを作製した．全層欠損皮弁は，まずラットの背部に2x2 cm（正方形）の尾側を基部とした有茎皮弁を作製し，作製した有茎皮弁の中央部に1.4x1.4 cm（正方形：約2 cm2）の全層（真皮層も含む）欠損部を作製した．その後，ただちに皮弁部を縫合処置することによって全層欠損皮弁モデルとした．該モデルは真皮層も欠損していることから、糖尿病性の難治性創傷または皮膚潰瘍のモデルである。作製した創部に目的の被験物質投与後，創部を被覆剤（パーミロール, 日東メディカル）で被覆した（day 0）．その後，測定日毎に1日1回の被験物質の投与を行い，創面積の変化をデジタルノギス及びデジタル画像からの実測値を算出し、まだ治癒していない創傷面積を測定し、創傷を与えた面積（Day 0）に対する割合を算出した結果を図１１に示す。
図１１に示されるように、いずれのポリペプチドでも、創傷を与えた直後から対照である生理食塩水(Saline)投与群に比べて、残存する創傷面積は減少し、本発明のポリペプチドにより糖尿病をともなう難治性創傷の治癒が促進されることがわかった。
また、完全治癒までの日数をSR-07及びSR-08について図１２(SR-07)及び図１３(SR-08)にそれぞれ示した。完全治癒までの日数は、SR-07及びSR-08でいずれも0.2μg/μL群にて溶媒対照群と比較して有意に短かった。創傷治癒率の評価と同様に、完全治癒日数でも同様の傾向であった。この結果より、皮膚潰瘍、さらには糖尿病性皮膚潰瘍においても本発明のポリペプチドSR-07およびSR-08は治療効果を示すことがわかった。
１２． 熱傷潰瘍治癒効果
7週齢のオスのヘアレスラット（HWY/slc）を用いて、熱傷モデルを作成し、本発明のポリペプチドの治癒効果を調べた。エーテル麻酔下にてラット背部に灼熱ゴテ（100℃，φ12 mm）を5秒間接着させ熱傷を惹起させることにより、熱傷潰瘍モデルを作成した。該モデルは、真皮組織および筋肉組織にまで壊死に到る重篤な熱傷であり、熱傷性皮膚潰瘍を起こしていることが確認された。熱傷惹起翌日に，壊死した皮膚を外科的に除去して熱傷モデルとした．熱傷モデル作製後、創部に被験物質を投与し、その上から被覆剤を用いて被覆した（day 0）．対照は、被覆剤のみとした。その後，測定日毎に1日1回の被験物質の投与を行い，Day6およびDay8に創面積の変化をデジタルノギス及びデジタル画像からの実測値の算出によりまだ治癒していない熱傷面積を測定し、熱傷を与えた面積（Day 0）に対する割合を算出した。尚，被験物質の濃度は0.2μg/μL（20μg/創）とした。
7週齢のオスのヘアレスラット（HWY/slc）を用いて、熱傷モデルを作成し、本発明のポリペプチドの治癒効果を調べた。エーテル麻酔下にてラット背部に灼熱ゴテ（100℃，φ12 mm）を5秒間接着させ熱傷を惹起させることにより、熱傷潰瘍モデルを作成した。該モデルは、真皮組織および筋肉組織にまで壊死に到る重篤な熱傷であり、熱傷性皮膚潰瘍を起こしていることが確認された。熱傷惹起翌日に，壊死した皮膚を外科的に除去して熱傷モデルとした．熱傷モデル作製後、創部に被験物質を投与し、その上から被覆剤を用いて被覆した（day 0）．対照は、被覆剤のみとした。その後，測定日毎に1日1回の被験物質の投与を行い，Day6およびDay8に創面積の変化をデジタルノギス及びデジタル画像からの実測値の算出によりまだ治癒していない熱傷面積を測定し、熱傷を与えた面積（Day 0）に対する割合を算出した。尚，被験物質の濃度は0.2μg/μL（20μg/創）とした。
結果を図１４（SR-07）および図１５（SR-08）に示す。いずれのグラフにおいても、黒いバーは対照を、白いバーはペプチドを示す。図１４及び図１５に示されるように、熱傷潰瘍モデルにおいても本発明のポリペプチドSR-07およびSR-08は治療効果を示すことがわかった。
１３． 褥瘡に対する治癒効果
皮膚潰瘍の一つである褥瘡に対する治癒効果を確認するために、7週齢のオスのヘアレスラット（HWY/slc）を用いて、褥瘡モデルを作成し、本発明のポリペプチドの治癒効果を調べた。ラット背部に一対の磁石（φ10ｘ5mm 販売店：アズバイオ ケニス 希土類磁石 型：ＫＤ-2 Code ：3-118-119 磁束密度：350mT）にて皮膚を8時間接着させ褥瘡を惹起した。褥瘡惹起翌日に、壊死した皮膚を外科的に除去して褥瘡モデルとした。褥瘡モデル作製後、創部に被験物質を投与し、その上から被覆剤を用いて被覆した（day 0）。対照は、被覆剤のみとした。その後，測定日毎に1日1回の被験物質の投与を行い、創面積の変化をデジタルノギス及びデジタル画像からの実測値の算出によって測定した。尚、被験物質の濃度は0.2μg/uL（4μg/創）とした。まだ治癒していない熱傷面積を測定し、熱傷を与えた面積（Day 0）に対する割合を算出した。
皮膚潰瘍の一つである褥瘡に対する治癒効果を確認するために、7週齢のオスのヘアレスラット（HWY/slc）を用いて、褥瘡モデルを作成し、本発明のポリペプチドの治癒効果を調べた。ラット背部に一対の磁石（φ10ｘ5mm 販売店：アズバイオ ケニス 希土類磁石 型：ＫＤ-2 Code ：3-118-119 磁束密度：350mT）にて皮膚を8時間接着させ褥瘡を惹起した。褥瘡惹起翌日に、壊死した皮膚を外科的に除去して褥瘡モデルとした。褥瘡モデル作製後、創部に被験物質を投与し、その上から被覆剤を用いて被覆した（day 0）。対照は、被覆剤のみとした。その後，測定日毎に1日1回の被験物質の投与を行い、創面積の変化をデジタルノギス及びデジタル画像からの実測値の算出によって測定した。尚、被験物質の濃度は0.2μg/uL（4μg/創）とした。まだ治癒していない熱傷面積を測定し、熱傷を与えた面積（Day 0）に対する割合を算出した。
その結果を図１６（SR-07）および図１７（SR-08）に示す。いずれのグラフにおいても、黒いバーは対照を、白いバーはペプチドを示す。図１６及び図１７に示されるように、褥瘡においても本発明のポリペプチドSR-07およびSR-08は治療効果を示すことがわかった。
さらに、Day12における各ペプチドの残存創傷面積割合の測定結果を下記表１１及び表１２に示す。
表１１及び表１２に示されるように、本発明のポリペプチドSR-07およびSR-08投与群では、12日目においては有意に治癒が促進されていることがわかる。
１４． 切創治癒における皮膚組織評価
7週齢のオスのSDラット（Crl:CD）を用いて、切創モデルを作成し、本発明のポリペプチド投与による皮膚組織変化を評価した。ラットの背部に30〜36 mmの安全剃刀で切創を作製し，等間隔に3ヵ所を縫合した（day 0）．縫合部位に，各濃度に調整した被験物質（200 μg/mL）を50 μL滴下（添加量として10 μg）した．なお，被験物質は抜糸日まで1日1回滴下により投与した。縫合3日目に抜糸し，6日目に切創部位の皮膚組織を採取し、その皮膚をHE染色にて評価した。
7週齢のオスのSDラット（Crl:CD）を用いて、切創モデルを作成し、本発明のポリペプチド投与による皮膚組織変化を評価した。ラットの背部に30〜36 mmの安全剃刀で切創を作製し，等間隔に3ヵ所を縫合した（day 0）．縫合部位に，各濃度に調整した被験物質（200 μg/mL）を50 μL滴下（添加量として10 μg）した．なお，被験物質は抜糸日まで1日1回滴下により投与した。縫合3日目に抜糸し，6日目に切創部位の皮膚組織を採取し、その皮膚をHE染色にて評価した。
観察の結果、Saline群では表皮有棘層での肥厚（右上段図矢印部分）が認められた。また、切創部位近傍では好中球及び線維芽細胞が多数認められた。sailine群と比較しSR-07及びSR-08では、表皮有棘層での肥厚が少なく、また線維芽細胞がsailine群よりもはやくコラーゲンに置き換わる現象が観察された。SR-07,SR-08についてSalineと比較して肉芽形成及びコラーゲンの増加が認められるだけでなく、肥厚を抑制しながら創傷治癒を促進することが分かった。
Claims (9)
- アミノ酸配列が配列番号８及び１０のいずれかで表されるポリペプチド。
- アミノ酸配列が配列番号８で表される請求項１記載のポリペプチド。
- アミノ酸配列が配列番号１０で表される請求項１記載のポリペプチド。
- カルボキシル末端がアミド化されている請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する血管新生誘導剤。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する抗菌剤。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、熱傷、創傷、びらん、皮膚潰瘍および難治性創傷から成る群から選択される疾患または障害の予防、改善又は治療剤。
- 熱傷、創傷、びらん、皮膚潰瘍および難治性創傷から成る群から選択される疾患または障害が、細菌または真菌の感染を伴うことを特徴とする、請求項７記載の予防、改善又は治療剤。
- 熱傷、創傷、びらん、皮膚潰瘍および難治性創傷から成る群から選択される疾患または障害の感染を予防することを特徴とする、請求項７記載の予防、改善又は治療剤。
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