JP5745720B2 - イムノバインダーの溶解性の最適化 - Google Patents

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（関連出願）
この出願は、２００８年６月２５日に出願されたＵＳ６１／０７５，６９２、名称「Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｅｒｓ」の優先権を主張する。

（発明の背景）
抗体は、がん、自己免疫疾患およびその他の障害の処置において非常に有効かつ良好な治療剤であることが証明されている。典型的には完全長の抗体が臨床的に使用されているが、抗体断片の使用によってもたらすことができる多数の利点があり、それらは、組織浸透の増加、Ｆｃエフェクター機能を欠くためその他のエフェクター機能を付加することが可能であること、および全身性のより短いインビボ半減期の結果として全身性副作用が低減する可能性などである。抗体断片の薬物動態特性から、それらが局所治療的アプローチに特によく適している場合があることが示されている。さらに、抗体断片は、特定の発現系においては完全長の抗体よりも容易に産生することができる。

１つの型の抗体断片が、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり、これは、リンカー配列を介して軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に結合体化させられた重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）から構成される。したがって、ｓｃＦｖは、抗体の定常領域ドメインすべてを欠き、元々の可変ドメイン／定常ドメインの界面のアミノ酸残基（界面残基）が溶媒に対して露出された状態となる。ｓｃＦｖを、完全長の抗体（例えば、ＩｇＧ分子）から、確立された組換え工学の技法によって調製することができる。しかし、完全長の抗体の、ｓｃＦｖへの変換によって、しばしば、このタンパク質の安定性および溶解性が損なわれ、産生収率が低下し、凝集の傾向が高まる。凝集によって、免疫原性のリスクが生じる。

したがって、ｓｃＦｖの溶解性等の特性を改善するための試みがなされている。例えば、Ｎｉｅｂａ， Ｌら（非特許文献１）は、界面残基であることが公知である３つのアミノ酸残基を選択し、それらを変異させた。彼らは、変異ｓｃＦｖの細菌ペリプラズムにおける発現が増加し、熱誘導性凝集の割合が減少することを観察したが、熱力学的安定性および溶解性は顕著には変化しなかった。さらに、彼らの文献中では、ＰＥＧ沈殿法により決定した場合、遺伝子工学的に操作したｓｃＦｖの未変性タンパク質状態の溶解性の改善を何ら観察しなかったことが明示的に記載されている。また、部位特異的変異誘発を、ｓｃＦｖ内部の特定のアミノ酸残基に対して実施したその他の研究も報告されている（例えば、非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４を参照されたい）。これらの種々の研究においては、変異誘発のために選択されるアミノ酸残基は、（例えば、分子モデリング研究からの）ｓｃＦｖ構造内部のそれらの公知の位置に基づいて選ばれた。

別のアプローチにおいては、非常に不十分にしか発現しないｓｃＦｖ由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、有利な特性を有することが実証されているｓｃＦｖのフレームワーク領域内に融合させられた（非特許文献５）。得られたｓｃＦｖは、可溶性発現および熱力学的安定性の改善を示した。

Ｎｉｅｂａ， Ｌら、Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ．（１９９７年）１０巻：４３５〜４４４頁 Ｔａｎ， Ｐ．Ｈ．ら、Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ．（１９８８年）７５巻：１４７３〜１４８２頁 Ｗｏｒｎ， Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８年）３７巻：１３１２０〜１３１２７頁 Ｗｏｒｎ， Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９年）３８巻：８７３９〜８７５０頁 Ｊｕｎｇ， Ｓ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ．、Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ．（１９９７年）１０巻：９５９〜９６６頁

溶解性およびその他の機能特性を改善するための、ｓｃＦｖの遺伝子工学的操作における進展が、例えば、Ｗｏｒｎ， Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ．（２００１年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．３０５巻：９８９〜１０１０頁に総説されている。しかし、イムノバインダー（ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｅｒ）、特に、優れた溶解性を示すｓｃＦｖの合理的な設計を可能にする新しいアプローチが依然として求められている。さらに、ｓｃＦｖおよびその他の型の抗体を遺伝子工学的に操作し、それによって、溶解性、特に、未変性タンパク質の溶解性の改善をもたらす方法が依然として求められている。

（発明の概要）
本発明は、可変重鎖領域ＶＨ中に溶解性増強モチーフを含むイムノバインダー、およびｓｃＦｖ抗体等のイムノバインダーを遺伝子工学的に操作して、溶解性の改善をもたらす方法を提供する。特定の実施形態では、本発明の方法は、イムノバインダーの可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域の配列内部の、溶解性について潜在的に問題のあるアミノ酸を、溶解性の改善をもたらす好ましいアミノ酸残基で置換することを含む。例えば、特定の好ましい実施形態では、疎水性残基を、親水性残基で置換する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
重鎖アミノ酸位置１２、１０３および１４４（ＡＨｏナンバリング）において以下の溶解性増強モチーフ：
（ａ）重鎖アミノ酸位置１２におけるセリン（Ｓ）；
（ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３におけるセリン（Ｓ）；および
（ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４におけるスレオニン（Ｔ）；または
（ａ１）重鎖アミノ酸位置１２におけるセリン（Ｓ）；
（ｂ１）重鎖アミノ酸位置１０３におけるスレオニン（Ｔ）；および
（ｃ１）重鎖アミノ酸位置１４４におけるセリン（Ｓ）；または
（ａ２）重鎖アミノ酸位置１２におけるセリン（Ｓ）；
（ｂ２）重鎖アミノ酸位置１０３におけるスレオニン（Ｔ）；および
（ｃ２）重鎖アミノ酸位置１４４におけるスレオニン（Ｔ）；または
（ａ３）重鎖アミノ酸位置１２におけるセリン（Ｓ）；
（ｂ３）重鎖アミノ酸位置１０３におけるセリン（Ｓ）；および
（ｃ３）重鎖アミノ酸位置１４４におけるセリン（Ｓ）
のうちの１つを含む、イムノバインダー。
（項目２）
（ａ）軽鎖アミノ酸位置３１におけるアスパラギン酸（Ｄ）；
（ｂ）軽鎖アミノ酸位置８３におけるグルタミン酸（Ｅ）；
（ｃ）重鎖アミノ酸位置４３におけるアルギニン（Ｒ）；
（ｄ）重鎖アミノ酸位置６７におけるロイシン（Ｌ）；および／または
（ｅ）重鎖アミノ酸位置７８におけるアラニン（Ａ）
をさらに含む、項目１に記載のイムノバインダー。
（項目３）
イムノバインダーの溶解性を増強する方法であって、前記イムノバインダーが、重鎖可変（Ｖ _Ｈ ）領域またはその断片を含み、前記方法が、
Ａ）変異のために、前記Ｖ _Ｈ 領域内部の少なくとも２つのアミノ酸位置を選択する工程と、
Ｂ）変異のために選択された前記少なくとも２つのアミノ酸位置を変異させる工程と
を含み、前記少なくとも２つのアミノ酸位置が、１２、１０３および１４４（ＡＨｏナンバリング法による）からなる重鎖アミノ酸位置の群より選択され、前記変異工程が前記選択されたアミノ酸位置におけるアミノ酸の、親水性アミノ酸による置換を含む、方法。
（項目４）
前記親水性アミノ酸が、
（ａ）重鎖アミノ酸位置１２におけるセリン（Ｓ）；
（ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３におけるセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）；および／または
（ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４におけるセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）
である、項目３に記載の方法。
（項目５）
変異のために選択された前記アミノ酸位置におけるアミノ酸が、疎水性アミノ酸である、項目３または４に記載の方法。
（項目６）
前記疎水性アミノ酸が、ロイシン（Ｌ）またはバリン（Ｖ）である、項目５に記載の方法。
（項目７）
（ａ）重鎖アミノ酸位置１２におけるアミノ酸の変異のために選択されたアミノ酸がバリン（Ｖ）であり、
（ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３におけるアミノ酸の変異のために選択されたアミノ酸がバリン（Ｖ）であり、
（ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４におけるアミノ酸の変異のために選択されたアミノ酸がロイシン（Ｌ）である、
項目３から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記イムノバインダーの熱安定性、リフォールディング、発現収率、凝集および／または結合活性が、前記変異工程によって不利な影響を受けない、項目３から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記変異工程の結果、溶解性が少なくとも２倍増加する、項目３から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記変異工程が、
（ａ）軽鎖アミノ酸位置３１におけるアスパラギン酸（Ｄ）；
（ｂ）軽鎖アミノ酸位置８３におけるグルタミン酸（Ｅ）；
（ｃ）重鎖アミノ酸位置４３におけるアルギニン（Ｒ）；
（ｄ）重鎖アミノ酸位置６７におけるロイシン（Ｌ）；および
（ｅ）重鎖アミノ酸位置７８におけるアラニン（Ａ）
からなる群より選択されるアミノ酸位置（ＡＨｏナンバリング法）に１つまたは複数の変異を導入する工程をさらに含む、項目３から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
項目３から１０のいずれか一項に記載の方法によって調製されたイムノバインダー。
（項目１２）
ｓｃＦｖ抗体、完全長の免疫グロブリン、Ｆａｂ断片、Ｄａｂまたはナノボディである、項目１、２または１１のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目１３）
ヒトＴＮＦαまたはヒトＶＥＧＦに特異的に結合する、項目１、２、１１または１２のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
（項目１４）
項目１、２、１１、１２または１４のいずれか一項に記載のイムノバインダーおよび薬学的に許容できる担体を含む組成物。

好ましくは、提供するイムノバインダー、すなわち、本発明において使用するイムノバインダーまたは本発明の遺伝子工学的に操作する方法によって産生するイムノバインダーは、ｓｃＦｖであるが、その他のイムノバインダー、例として、完全長の免疫グロブリン、Ｆａｂ断片、単一ドメイン抗体（例えば、Ｄａｂ）およびナノボディも、この方法に従って遺伝子工学的に操作することができる。また、本発明は、この遺伝子工学的に操作する方法に従って調製したイムノバインダー、ならびにこれらのイムノバインダーおよび薬学的に許容できる担体を含む組成物も包含する。

１つの態様では、本発明は、重鎖アミノ酸位置１２、１０３および１４４（ＡＨｏナンバリング）における以下の溶解性増強モチーフのうちの１つを含むイムノバインダーを提供する：
（ａ）重鎖アミノ酸位置１２におけるセリン（Ｓ）；
（ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３におけるセリン（Ｓ）；および
（ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４におけるスレオニン（Ｔ）；または
（ａ１）重鎖アミノ酸位置１２におけるセリン（Ｓ）；
（ｂ１）重鎖アミノ酸位置１０３におけるスレオニン（Ｔ）；および
（ｃ１）重鎖アミノ酸位置１４４におけるセリン（Ｓ）；または
（ａ２）重鎖アミノ酸位置１２におけるセリン（Ｓ）；
（ｂ２）重鎖アミノ酸位置１０３におけるスレオニン（Ｔ）；および
（ｃ２）重鎖アミノ酸位置１４４におけるスレオニン（Ｔ）；または
（ａ３）重鎖アミノ酸位置１２におけるセリン（Ｓ）；
（ｂ３）重鎖アミノ酸位置１０３におけるセリン（Ｓ）；および
（ｃ３）重鎖アミノ酸位置１４４におけるセリン（Ｓ）。

別の態様では、本発明は、イムノバインダーを遺伝子工学的に操作する方法を提供し、このイムノバインダーは、（ｉ）Ｖ_Ｈフレームワーク残基を含む重鎖可変領域、もしくはその断片、および／または（ｉｉ）Ｖ_Ｌフレームワーク残基を含む軽鎖可変領域、もしくはその断片を含み、この方法は、
Ａ）変異のために、Ｖ_Ｈフレームワーク残基、Ｖ_Ｌフレームワーク残基、またはＶ_ＨおよびＶ_Ｌのフレームワーク残基の内部の少なくとも２つのアミノ酸位置を選択する工程と、
Ｂ）変異のために選択された少なくとも２つのアミノ酸位置を変異させる工程と
を含み、
変異のために選択された少なくとも２つのアミノ酸位置が、Ｖ_Ｈフレームワーク残基の内部にある場合には、置換は、１２、１０３および１４４（ＡＨｏナンバリング法による）からなる群より選択される１つまたは複数の重鎖アミノ酸位置においてであり、および／または、
変異のために選択された１つまたは複数のアミノ酸位置が、Ｖ_Ｌフレームワーク残基の内部にある場合には、置換は、１５、５２および１４７（ＡＨｏナンバリング法による；Ｋａｂａｔナンバリングを使用すると、アミノ酸位置１５、４４および１０６）からなる群より選択される軽鎖アミノ酸位置においてである。

変異のために選択された少なくとも２つのアミノ酸位置、および（１つまたは複数の）選択された場所において挿入された（１つまたは複数の）アミノ酸残基については、以下にさらに詳細に記載する。以下に記載するアミノ酸位置のナンバリングは、ＡＨｏナンバリングシステムを使用し、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用する場合の対応する位置を本明細書においてさらに記載し、ＡＨｏナンバリングシステムおよびＫａｂａｔナンバリングシステムについての変換表を、以下の詳細な説明において記載する。アミノ酸残基は、標準的な一文字略語コードを使用して記載する。

驚くべきことに、表示する位置における、表示する変異の存在によって、イムノバインダーの全般的な溶解性は増加するが、このタンパク質のその他の機能特性に対する負の影響はないことを見出すに至った。例えば、ｓｃＦｖのＶＨにおいて、３つの溶解性増強変異Ｖ１２Ｓ、Ｌ１４４ＳおよびＶ１０３Ｔを組み合わせた場合には、前記置換がｓｃＦｖの溶解性全体の約６０％に関与することを見出した。このことは、イムノバインダーの発現収率を増加させるための先行技術に記載されている試みとは異なる。例えば、ＵＳ６，８１５，５４０は、イムノバインダーの、鎖内ドメイン間の界面領域における疎水性を減少させることによる改変を記載している。前記目的では、１０個のアミノ酸の群から選択された１つまたは複数のアミノ酸で個々に置換され得る、可変重鎖フレームワーク中の１６個の位置が同定された。生じた変異体の発現収率が増加することが見出された。さらに、同じ研究グループによって、１９９９年、すなわち、言及した米国特許の優先日の３年後には、疎水性の表面残基を、より親水性の残基で置き換えることが、産生収率を改善するためのいくつかの研究において報告されていることを記載する論文（Ｊｕｎｇ， Ｓ．、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ， Ａ． およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ．（１９９７年）Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ．１０巻：９５９〜９６６頁を参照されたい）が公開された。これらの著者によれば、産生収率の増加は、正確なフォールディングとミスフォールディングされた物質の凝集との間の動態学的な配分の改善に起因し、一方、未変性タンパク質の溶解性は全く影響を受けず、その熱力学的安定性は顕著な様式では影響を受けない。したがって、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎらが言及する溶解性パラメータは、可溶性発現のみに関係し、未変性タンパク質の全般的な溶解性には関係しないことが当業者には明らかである。

以下の詳細な説明を考慮することによって、本発明がより良好に理解され、上記以外の対象が明らかになる。そのような説明に際しては、付属の図面を参照する。

図１は、野生型ＥＳＢＡ１０５（Ｅ１０５）およびその溶解性改変体についての、ＰＥＧ沈殿法による溶解度曲線を示すグラフである。 図２は、広い範囲の温度（２５〜９６℃）の熱チャレンジ（ｔｈｅｒｍｏｃｈａｌｌｅｎｇｅ）後に測定した野生型ＥＳＢＡ１０５（Ｅ１０５）およびその溶解性改変体の熱変性プロファイルを示すグラフである。 図３は、熱ストレス条件下における２週間のインキュベーション後の種々のＥＳＢＡ１０５溶解性変異体の分解挙動を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。 図４は、ＦＴＩＲ分析によって決定したＥＰ４３ｍａｘおよびその最適化改変体の熱変性曲線を示すグラフである。 図５は、ＦＴ−ＩＲによって測定した５７８ｍｉｎ−ｍａｘおよび５７８ｍｉｎ−ｍａｘ＿ＤＨＰの熱安定性を示すグラフである。 図６ａおよび６ｂは、硫酸アンモニウム沈殿法により決定した５７８ｍｉｎ−ｍａｘおよび５７８ｍｉｎ−ｍａｘ＿ＤＨＰの溶解性を示すグラフである。 図６ａおよび６ｂは、硫酸アンモニウム沈殿法により決定した５７８ｍｉｎ−ｍａｘおよび５７８ｍｉｎ−ｍａｘ＿ＤＨＰの溶解性を示すグラフである。

（発明の詳細な記述）
本発明は、イムノバインダーの溶解性を増強するための方法に関する。より具体的には、本発明は、イムノバインダーの溶解性を改善するアミノ酸の置換をイムノバインダー内部に導入することによって、イムノバインダーを最適化するための方法を開示する。また、本発明は、本発明の方法に従って遺伝子工学的に操作したイムノバインダー、例えば、ｓｃＦｖにも関する。

本発明をより容易に理解することができるように、特定の用語を最初に定義する。別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての科学技術用語は、本発明が属する分野の一般的な業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載するものに類似のまたはそれらと同等な方法および材料を、本発明を実施または試験する際に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書において言及する刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献はすべて、それらの全体が参照により援用される。対立が生じた場合には、定義を含めた、本明細書が優先する。さらに、材料、方法および実施例は、例証のために限られ、本発明を限定するものではない。

本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」の同義語である。本発明による抗体は、免疫グロブリン全体であってもよく、または免疫グロブリンの少なくとも１つの可変ドメインを含むそれらの断片、例として、単一の可変ドメイン、Ｆｖ（Ｓｋｅｒｒａ Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ．（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０巻：１０３８〜４１頁）、ｓｃＦｖ（Ｂｉｒｄ， Ｒ．Ｅ． ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２巻：４２３〜２６頁；Ｈｕｓｔｏｎ， Ｊ．Ｓ．ら（１９８８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５巻：５８７９〜８３頁）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、もしくは当業者に周知のその他の断片であってもよい。

本明細書で使用する場合、「抗体のフレームワーク」または「フレームワーク」という用語は、可変ドメインＶＬまたはＶＨのいずれかの一部を指し、これは、この可変ドメインの抗原結合ループのための骨格として働く（Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１〜３２４２頁）。

本明細書で使用する場合、「抗体のＣＤＲ」または「ＣＤＲ」という用語は、Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１〜３２４２頁によって定義される抗原結合ループからなる抗体の相補性決定領域を指す。抗体のＦｖ断片の２つの可変ドメインのそれぞれが、例えば、３つのＣＤＲを含有する。

「単鎖抗体」または「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーによって接続されている抗体の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）および抗体の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む分子を指す。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般的な構造：ＮＨ_２−Ｖ_Ｌ−リンカー−Ｖ_Ｈ−ＣＯＯＨまたはＮＨ_２−Ｖ_Ｈ−リンカー−Ｖ_Ｌ−ＣＯＯＨを有し得る。

本明細書で使用する場合、「同一性」は、２つのポリペプチドもしくは２つの分子の間、または２つの核酸間の配列の一致を指す。これら２つの比較される配列の両方のある位置が、同じ塩基またはアミノ酸の単量体サブユニットで占められている場合（例えば、これら２つのＤＮＡ分子のそれぞれのある位置がアデニンで占められている場合、または２つのポリペプチドのそれぞれのある位置がリジンで占められている場合）には、それぞれの分子は、その位置において同一である。２つの配列間の「パーセント同一性」は、これら２つの配列が共有する一致位置（ｍａｔｃｈｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）の数を、比較した位置の数で割り、１００を乗じた関数である。例えば、２つの配列の位置１０個のうち６つが一致する場合には、これら２つの配列は、６０％の同一性を有する。例として、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴとは、５０％の同一性を共有する（６つの全位置のうち３つが一致する）。一般に、最大の同一性が得られるように２つの配列を整列させて比較を行う。例えば、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）等のコンピュータプログラムによって好都合に実行される、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３〜４５３頁の方法を使用して、そのような整列を得ることができる。

「類似」配列は、整列させた場合、同一および類似のアミノ酸残基を共有する配列であり、類似の残基は、整列させた参照配列中の対応するアミノ酸残基についての保存的置換である。この点に関して、参照配列中の残基の「保存的置換」は、対応する参照残基に物理的または機能的に類似する残基、例えば、サイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合を形成する能力を含めた化学特性等が類似する残基による置換である。したがって、「保存的置換により改変された」配列は、参照配列または野生型配列と、１つまたは複数の保存的置換が存在する点で異なる配列である。２つの配列間の「パーセント類似性」は、これら２つの配列が共有する一致残基または保存的置換を含有する位置の数を、比較した位置の数で割り、因数１００を乗じた関数である。例えば、２つの配列の位置１０個のうち６つが一致し、１０個の位置のうち２つが保存的置換を含有する場合には、これら２つの配列は、８０％の類似性を示す。

本明細書で使用する場合、「アミノ酸のコンセンサス配列」は、少なくとも２つ、好ましくは３つ以上の整列させたアミノ酸配列のマトリックスを使用し、各位置において最も頻出するアミノ酸残基を決定することができるようにこのアラインメントにおけるギャップを可能にして、生成することができるアミノ酸配列を指す。このコンセンサス配列は、各位置において最も頻繁に表れるアミノ酸を含む配列である。単一の位置において、２つ以上のアミノ酸が等しく表れる場合には、このコンセンサス配列は、それらのアミノ酸の両方またはすべてを含む。

タンパク質のアミノ酸配列を、種々のレベルで分析することができる。例えば、保存または変動を、単一残基のレベル、複数残基のレベル、ギャップを有する複数残基のレベル等で示すことができる。残基は、同一の残基の保存を示す場合もあり、またはクラスレベルで保存されている場合もある。アミノ酸のクラスの例として、極性無電荷の側鎖またはＲ群を有するアミノ酸のクラス（セリン、スレオニン、アスパラギンおよびグルタミン）；正電荷Ｒ群を有するアミノ酸のクラス（リジン、アルギニンおよびヒスチジン）；負電荷Ｒ群を有するアミノ酸のクラス（グルタミン酸およびアスパラギン酸）；疎水性Ｒ群を有するアミノ酸のクラス（アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンおよびチロシン）；ならびに特殊なアミノ酸のクラス（システイン、グリシンおよびプロリン）が挙げられる。その他のクラスが当業者には公知であり、それらは、構造決定、または置換可能性を評価するためのその他のデータを使用して定義することができる。その意味では、置換可能なアミノ酸は、その位置において置換し、機能の保存を維持することができる任意のアミノ酸を指すことができる。

しかし、同じクラスのアミノ酸が、それらの生物物理学的特性によってある程度異なる場合があることが認識される。例えば、特定の疎水性Ｒ群（例えば、アラニン、セリンまたはスレオニン）は、その他の疎水性Ｒ群（例えば、バリンまたはロイシン）よりも親水性である（すなわち、親水性が高いかまたは疎水性が低い）であることが認識される。相対的な親水性または疎水性は、当該分野で認識されている方法を使用して決定することができる（例えば、Ｒｏｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９巻：８３４〜８３８頁（１９８５年）、およびＣｏｒｎｅｔｔｅら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１９５巻：６５９〜６８５頁（１９８７年）を参照されたい）。

本明細書で使用する場合、１つのアミノ酸配列（例えば、第１のＶ_Ｈ配列またはＶ_Ｌ配列）を、１つまたは複数の追加のアミノ酸配列（例えば、データベース中の１つまたは複数のＶＨ配列またはＶＬ配列）と整列させた場合、１つの配列（例えば、第１のＶ_Ｈ配列またはＶ_Ｌ配列）中のあるアミノ酸位置を、１つまたは複数の追加のアミノ酸配列中の「対応する位置」と比較することができる。本明細書で使用する場合、この「対応する位置」は、配列を最適に整列させた場合、すなわち、配列を、最も高いパーセント同一性またはパーセント類似性を達成するように整列させた場合に、（１つまたは複数の）比較される配列中の同等な位置を示す。

本明細書で使用する場合、「抗体データベース」という用語は、２つ以上の抗体のアミノ酸配列（「複数の」配列）のコレクションを指し、典型的には、数十、数百または数千個もの抗体のアミノ酸配列のコレクションを指す。抗体のデータベースは、例えば、抗体のＶ_Ｈ領域、抗体のＶ_Ｌ領域もしくは両方のコレクションのアミノ酸配列を保存してもよく、またはＶ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域から構成されるｓｃＦｖ配列のコレクションを保存してもよい。好ましくは、このデータベースは、検索可能な固定媒体、例として、コンピュータ上で、検索可能なコンピュータプログラム内に保存する。１つの実施形態では、この抗体データベースは、生殖系列の抗体の配列を含むかまたはそれらからなるデータベースである。別の実施形態では、この抗体データベースは、成熟した（すなわち、発現した）抗体の配列（例えば、成熟した抗体の配列のＫａｂａｔのデータベース、例えば、ＫＢＤデータベース）を含むかまたはそれらからなるデータベースである。さらに別の実施形態では、この抗体データベースは、機能により選択された配列（例えば、ＱＣアッセイから選択された配列）を含むかまたはそれらからなる。

「イムノバインダー」という用語は、抗体の抗原結合部位の全部または一部、例えば、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインの全部または一部を含有する分子を指し、したがって、イムノバインダーは、標的抗原を特異的に認識する。イムノバインダーの非限定的な例として、完全長の免疫グロブリン分子およびｓｃＦｖ、さらに、これらに限定されないが、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、Ｖ_Ｌドメイン、Ｖ_Ｈドメイン、Ｃ_ＬドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２断片、すなわち、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）本質的には、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂであるＦａｂ’断片（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３年）を参照されたい）；（ｉｖ）Ｖ_ＨドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｖ）抗体の単腕（ｓｉｎｇｌｅ ａｒｍ）のＶ_ＬドメインおよびＶ_Ｈドメインを含むＦｖ断片；（ｖｉ）Ｖ_ＨドメインまたはＶ_ＬドメインからなるＤａｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４１巻：５４４〜５４６頁）、ラクダ抗体（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３６３巻：４４６〜４４８頁（１９９３年）、およびＤｕｍｏｕｌｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１巻：５００〜５１５頁（２００２年）を参照されたい）、またはサメ抗体（例えば、サメＩｇ−ＮＡＲ Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標））等の単一ドメイン抗体；ならびに（ｖｉｉ）単一の可変ドメインを含有する重鎖可変領域および２つの定常ドメインであるナノボディを含めた、抗体断片が挙げられる。

本明細書で使用する場合、「機能特性」という用語は、例えば、ポリペプチドの製造上の特性または治療有効性を改善するために、当業者にとって、（例えば、従来のポリペプチドと比べた）改善が望ましくかつ／または好都合であるポリペプチド（例えば、イムノバインダー）の特性である。１つの実施形態では、この機能特性は、安定性（例えば、熱安定性）である。別の実施形態では、この機能特性は、（例えば、細胞性条件下における）溶解性である。さらに別の実施形態では、この機能特性は、凝集挙動である。さらに別の実施形態では、この機能特性は、（例えば、原核生物細胞中における）タンパク質発現である。さらに別の実施形態では、この機能特性は、対応する精製プロセスにおける封入体の可溶化後のリフォールディングの効率である。特定の実施形態では、抗原結合親和性は、改善が望まれる機能特性ではない。さらに別の実施形態では、機能特性の改善には、抗原結合親和性の実質的な変化は関与しない。

本明細書で使用する場合、「溶解性」という用語は、未変性タンパク質、すなわち、単量体であり、非凝集状態かつ機能性であるイムノバインダーの溶解性を指す。「溶解性の増強」は、この未変性タンパク質の溶解性の改善を意味し、これは、好ましくは、以下の方法のうちの少なくとも１つによって決定する：ＰＥＧ沈殿法、硫酸アンモニウム沈殿法、リフォールディングの収率、または当業者に公知である溶解性を決定するための任意のその他の方法。ＰＥＧ沈殿による方法は、Ａｔｈａら、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌｓ」、ＪＢＣ、２５６巻：１２１０８〜１２１１７頁（１９８１年）の記載に倣う方法である。硫酸アンモニウム沈殿法は、例えば、以下に従って実施することができる：１０μｌのアリコートの２０ｍｇ／ｍｌタンパク質溶液を調製し、それらのそれぞれに、異なる飽和度（例えば、３５％、３３％、３１％、２９％、２５％、２０％および１５％）の（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４溶液１０μｌを添加し、それに続いて、５秒間ボルテックスし、室温で、３０分間インキュベーションする。６０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した後、上清中のタンパク質濃度を決定する。この方法では、異なるタンパク質の比較対象は、Ｖ５０値であり、これは、５０％パーセントのタンパク質が沈殿する（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４の飽和パーセントである。Ｖ５０は、適用した（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４飽和パーセントに対する、決定した上清中の可溶性タンパク質のプロットから決定する。リフォールディングの収率は、対応する製造／精製の過程において可溶化した封入体から得た正しく折り畳まれたタンパク質のパーセントに対応する。本明細書で使用する場合、溶解性という用語は、可溶性発現は指さない。

（溶解性の改善を示すイムノバインダー）
第１の態様では、重鎖アミノ酸位置１２、１０３および１４４（ＡＨｏナンバリング）において以下の溶解性増強モチーフのうちの１つを含むイムノバインダーを提供する：
（ａ）重鎖アミノ酸位置１２におけるセリン（Ｓ）；
（ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３におけるセリン（Ｓ）；および
（ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４におけるスレオニン（Ｔ）；または
（ａ１）重鎖アミノ酸位置１２におけるセリン（Ｓ）；
（ｂ１）重鎖アミノ酸位置１０３におけるスレオニン（Ｔ）；および
（ｃ１）重鎖アミノ酸位置１４４におけるセリン（Ｓ）；または
（ａ２）重鎖アミノ酸位置１２におけるセリン（Ｓ）；
（ｂ２）重鎖アミノ酸位置１０３におけるスレオニン（Ｔ）；および
（ｃ２）重鎖アミノ酸位置１４４におけるスレオニン（Ｔ）；または
（ａ３）重鎖アミノ酸位置１２におけるセリン（Ｓ）；
（ｂ３）重鎖アミノ酸位置１０３におけるセリン（Ｓ）；および
（ｃ３）重鎖アミノ酸位置１４４におけるセリン（Ｓ）。

驚くべきことに、表示する位置における表示するアミノ酸の存在によって、イムノバインダー全体の全般的な溶解性が増加することを見出すに至った。例えば、ｓｃＦｖのＶＨにおいて、３つの溶解性増強変異Ｖ１２Ｓ、Ｌ１４４ＳおよびＶ１０３Ｔを組み合わせた場合には、前記置換がｓｃＦｖの溶解性全体の約６０％に関与することを見出した。疎水性パッチが、すべてのイムノバインダーの可変ドメイン中で保存されているので、表示する位置における１つまたは複数の置換を使用して、任意のイムノバインダーの溶解性を改善することができる。

このイムノバインダーは、好ましくは、ｓｃＦｖ抗体、完全長の免疫グロブリン、Ｆａｂ断片、Ｄａｂまたはナノボディである。

好ましい実施形態では、このイムノバインダーは、（ａ）軽鎖アミノ酸位置３１におけるアスパラギン酸（Ｄ）、（ｂ）軽鎖アミノ酸位置８３におけるグルタミン酸（Ｅ）、（ｃ）重鎖アミノ酸位置４３におけるアルギニン（Ｒ）、（ｄ）重鎖アミノ酸位置６７におけるロイシン（Ｌ）、および（ｅ）重鎖アミノ酸位置７８におけるアラニン（Ａ）からなる群のうちの１つまたは複数のアミノ酸をさらに含む。対応する位置における表示するアミノ酸のうちの１つまたは複数の存在によって、イムノバインダーの安定性の増強がもたらされる。

本明細書に表示するアミノ酸は、天然に存在するイムノバインダーもしくはその誘導体中に存在してもよく、またはイムノバインダーを、遺伝子工学的に操作して、上記のアミノ酸のうちの１つまたは複数を組み込んでもよい。

好ましい実施形態では、本明細書に開示するイムノバインダーは、ヒトＴＮＦαまたはヒトＶＥＧＦに特異的に結合する。

（溶解性の改善を示すイムノバインダーの遺伝子工学的操作）
実施例において詳細に記載するように、本明細書に記載する配列に基づくアプローチを使用して、溶解性の改善をもたらす特定のアミノ酸残基の置換を首尾よく同定するに至った。これらの実施例は、イムノバインダー（例えば、ｓｃＦｖ）のＶＨ領域内部および場合によりＶＬ領域中の定義したアミノ酸位置における例示的かつ好ましいアミノ酸の置換を列挙する。例示的な置換（より親水性であり、データベース（例えば、成熟した抗体（ＫＤＢ）のデータベース）において高い頻度で現れる置換）は、アミノ酸位置における問題のあるアミノ酸残基（例えば、溶媒に露出した疎水性残基）の置換を含む。特に好ましい置換は、問題のある残基よりも親水性であって、最も頻繁に存在する残基である。その他の実施形態では、より親水性のアミノ酸を、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）からなる群より選択する。

したがって、本発明は、１つまたは複数の特定したアミノ酸の置換を、ｓｃＦｖ抗体等のイムノバインダー内に導入する遺伝子工学的操作方法を提供する。そのような置換は、標準的な分子生物学的方法、例として、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ媒介型変異誘発等を使用して実施することができる。

実施例に記載するように、以下のアミノ酸位置を、表示するＶ_Ｈ配列またはＶ_Ｌ配列において、改変するための問題があるアミノ酸（すなわち、いわゆる「疎水性パッチ」）として同定するに至った：
Ｖ_Ｈ：アミノ酸位置２、４、５、１２、１０３および１４４；ならびに
Ｖ_Ｌ：アミノ酸位置、１５、５２および１４７。

使用したナンバリングは、ＡＨｏナンバリングシステムであり、ＡＨｏナンバリングをＫａｂａｔシステムのナンバリングに変換するための変換表を、表１および２に記載する。

驚くべきことに、ＶＨの位置１２、１０３、１４４（ＡＨｏナンバリングシステムによる）のうちの２つ以上における置換によって、イムノバインダー全体の全般的な溶解性が影響を受けることを見出すに至った。疎水性パッチは、すべてのイムノバインダーの可変ドメイン中で保存されているので、表示する位置における少なくとも２つの置換を使用して、任意のイムノバインダーの溶解性を改善することができる。

１つの実施形態では、本発明は、ｓｃＦｖ抗体等のイムノバインダーを遺伝子工学的に操作する方法を提供し、ここでは、少なくとも２つのアミノ酸の置換を、上記で同定した１つまたは複数のアミノ酸位置において行い、それによって、イムノバインダーの改変（すなわち、変異）形態を産生する。

したがって、別の態様では、本発明は、イムノバインダーを遺伝子工学的に操作する方法を提供し、この方法は、
Ａ）変異のために、Ｖ_Ｈ領域、Ｖ_Ｌ領域、またはＶ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域の内部の少なくとも２つのアミノ酸位置を選択する工程と、
Ｂ）変異のために選択された少なくとも２つのアミノ酸位置を変異させる工程と
を含み、変異のために選択された少なくとも２つのアミノ酸位置が、Ｖ_Ｈ領域の内部にある場合には、置換は、１２、１０３および１４４（ＡＨｏナンバリング法による；Ｋａｂａｔナンバリングを使用すると、アミノ酸位置１１、８９および１０８）からなる群より選択される少なくとも２つの重鎖アミノ酸位置においてであり、および／または
変異のために選択された１つまたは複数のアミノ酸位置が、Ｖ_Ｌ領域の内部にある場合には、置換は、１５、５２および１４７（ＡＨｏナンバリング法による；Ｋａｂａｔナンバリングを使用すると、アミノ酸位置１５、４４および１０６）からなる群より選択される軽鎖アミノ酸位置においてである。

特定の実施形態では、このアミノ酸位置は、疎水性アミノ酸（例えば、ロイシン（Ｌ）またはバリン（Ｖ））で占められている。１つの実施形態では、重鎖アミノ酸位置１２におけるアミノ酸は、バリン（Ｖ）である。別の実施形態では、重鎖アミノ酸位置１０３におけるアミノ酸は、バリン（Ｖ）である。別の実施形態では、重鎖アミノ酸位置１４４におけるアミノ酸は、ロイシン（Ｌ）である。別の実施形態では、軽鎖アミノ酸位置１５におけるアミノ酸は、バリン（Ｖ）である。別の実施形態では、軽鎖アミノ酸位置５２におけるアミノ酸は、フェニルアラニン（Ｆ）である。別の実施形態では、軽鎖アミノ酸位置１４７におけるアミノ酸は、バリン（Ｖ）である。

好ましくは、この変異工程は、選択されたアミノ酸位置におけるアミノ酸の、より親水性のアミノ酸による置換である。その他の実施形態では、より親水性のアミノ酸を、セリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）から選択する。

特定の実施形態では、この方法は、ａ）変異のために、イムノバインダーの内部の少なくとも２つのアミノ酸位置を選択する工程と、ｂ）変異のために選択された少なくとも２つのアミノ酸位置を変異させる工程とを含み、変異が、
（ｉ）重鎖アミノ酸のＡＨｏナンバリングの使用による位置１２（Ｋａｂａｔナンバリングの使用による位置１１）におけるセリン（Ｓ）；
（ｉｉ）重鎖アミノ酸のＡＨｏナンバリングの使用による位置１０３（Ｋａｂａｔナンバリングの使用による位置８９）におけるセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）；および
（ｉｉｉ）重鎖アミノ酸のＡＨｏナンバリングの使用による位置１４４（Ｋａｂａｔナンバリングの使用による位置１０８）におけるセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）
からなる群より選択される少なくとも２つの置換を含む。

非常に好ましい実施形態では、重鎖アミノ酸位置１２、１０３および１４４のうちの少なくとも１つは、スレオニン（Ｔ）である。

さらなるその他の実施形態では、この変異工程は、軽鎖アミノ酸のＡＨｏナンバリングもしくはＫａｂａｔナンバリングの使用による位置１５におけるスレオニン（Ｔ）による置換、および／または軽鎖アミノ酸のＡＨｏナンバリングの使用による位置１４７（Ｋａｂａｔナンバリング法の使用による位置１０６）におけるアラニン（Ａ）による置換を含む。

その他の実施形態では、この変異工程の結果、溶解性が、少なくとも２倍増加する（例えば、溶解性が２倍、２．５倍、３倍、３．５倍または４倍以上増加する）。

別の実施形態では、このイムノバインダーの熱安定性、リフォールディング、発現収率、凝集および／または結合活性は、この変異工程によって不利な影響を受けない。

特定の実施形態では、この変異工程は、（ａ）軽鎖アミノ酸位置３１におけるアスパラギン酸（Ｄ）；（ｂ）軽鎖アミノ酸位置８３におけるグルタミン酸（Ｅ）；（ｃ）重鎖アミノ酸位置４３におけるアルギニン（Ｒ）；（ｄ）重鎖アミノ酸位置６７におけるロイシン（Ｌ）；および（ｅ）重鎖アミノ酸位置７８におけるアラニン（Ａ）からなる群より選択されるアミノ酸位置（ＡＨｏナンバリング法）において、１つまたは複数の安定化変異をさらに含む。これらの変異は、イムノバインダーの安定性に対する効果があることが証明されている。

別の態様では、本発明は、本発明の方法に従って調製したイムノバインダーを提供する。

特定の例示的な実施形態では、本発明の方法に従って遺伝子工学的に操作したイムノバインダーは、治療上重要な標的抗原に結合する当該分野で認識されているイムノバインダー、あるいは治療上重要なイムノバインダーに由来する可変領域（ＶＬ領域および／もしくはＶＨ領域）または１つもしくは複数のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２および／もしくはＣＤＲＨ３）を含むイムノバインダーである。例えば、ＦＤＡまたはその他の規制当局によって現在承認されているイムノバインダーを、本発明の方法に従って遺伝子工学的に操作することができる。より具体的には、それらの例示的なイムノバインダーとして、これらに限定されないが、抗ＣＤ３抗体、例として、ムロモナブ（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ（登録商標）ＯＫＴ３；Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ；Ａｒａｋａｗａら Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９９６年）１２０巻：６５７〜６６２頁；ＫｕｎｇおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７９年）、２０６巻：３４７〜３４９頁を参照されたい）、抗ＣＤ１１抗体、例として、エファリズマブ（Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、抗ＣＤ２０抗体、例として、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）／Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｌｏｎｄｏｎ）またはイブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）（米国特許第５，７３６，１３７号；同第６，４５５，０４３号；および同第６，６８２，７３４号を参照されたい）、抗ＣＤ２５（ＩＬ２Ｒα）抗体、例として、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）またはバシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、抗ＣＤ３３抗体、例として、ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＮＪ、米国特許第５，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号を参照されたい）、抗ＣＤ５２抗体、例として、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、抗ＧｐＩＩｂ／ｇＩＩａ抗体、例として、アブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ）、抗ＴＮＦα抗体、例として、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ）またはアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ、米国特許第６，２５８，５６２号を参照されたい）、抗ＩｇＥ抗体、例として、オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、抗ＲＳＶ抗体、例として、パリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、米国特許第５，８２４，３０７号を参照されたい）、抗ＥｐＣＡＭ抗体、例として、エドレコロマブ（Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、抗ＥＧＦＲ抗体、例として、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）またはパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋ、ＣＡ）、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体、例として、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、抗α４インテグリン抗体、例として、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）、ＢｉｏｇｅｎＩｄｅｃ）、抗Ｃ５抗体、例として、エクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）、Ａｌｅｘｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃｈｅｓｉｒｅ、ＣＴ）、および抗ＶＥＧＦ抗体、例として、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、米国特許第６，８８４，８７９号を参照されたい）またはラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられる。

特定の例示的な実施形態では、本発明の方法に従って遺伝子工学的に操作したイムノバインダーは、当該分野で認識されている上記のイムノバインダーである。好ましい実施形態では、このイムノバインダーは、ｓｃＦｖ抗体である。その他の実施形態では、このイムノバインダーは、例えば、完全長の免疫グロブリン、Ｄａｂ、ナノボディまたはＦａｂ断片である。

前述の記載にもかかわらず、種々の実施形態では、特定のイムノバインダーを、本発明の遺伝子工学的操作方法における使用から除外し、かつ／またはこれらの遺伝子工学的操作方法により生成するイムノバインダーの組成物をなすことから除外する。例えば、種々の実施形態では、このイムノバインダーは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／１３１０１３号および第ＷＯ２００８／００６２３５号に開示されているｓｃＦｖ抗体またはそれらの改変体、例として、それぞれの内容が参照により本明細書に明示的に援用されるＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／１３１０１３号および第ＷＯ２００８／００６２３５号に開示されているＥＳＢＡ１０５またはその改変体のうちのいずれでもないという条件がある。

好ましくは、本明細書に開示するイムノバインダー、本明細書に開示する方法のために使用するイムノバインダーまたは本明細書に開示する方法によって生成したイムノバインダーはそれぞれ、ｓｃＦｖ抗体であるが、その他のイムノバインダー、例として、完全長の免疫グロブリン、Ｆａｂ断片、または本明細書に記載する任意のその他の型のイムノバインダー（例えば、Ｄａｂもしくはナノボディ）も包含する。

好ましい実施形態では、本明細書に開示するイムノバインダー、本明細書に開示する方法のために使用するイムノバインダーまたは本明細書に開示する方法によって生成したイムノバインダーはそれぞれ、ヒトＴＮＦαまたはヒトＶＥＧＦに特異的に結合する。

本発明は、本明細書に開示するイムノバインダーおよび薬学的に許容できる担体を含む組成物をさらに包含する。

（ＳｃＦｖの組成物および処方物）
本発明の別の態様は、本発明の方法に従って調製したｓｃＦｖ組成物に関する。したがって、本発明は、元々の目的のｓｃＦｖと比較して１つまたは複数の溶解性増強変異がそのアミノ酸配列中に導入されている遺伝子工学的に操作したｓｃＦｖの組成物を提供し、これら（１つまたは複数の）変異は、疎水性アミノ酸残基の位置に導入されている。１つの実施形態では、このｓｃＦｖは、１つの変異したアミノ酸位置（例えば、１つのフレームワークの位置）を含有するように遺伝子工学的に操作されている。その他の実施形態では、このｓｃＦｖは、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以上の変異したアミノ酸位置（例えば、フレームワークの位置）を含有するように遺伝子工学的に操作されている。

特定の実施形態では、この変異工程は、２００８年６月２５日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＨ２００８／０００２８５号、名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｎｔｉｂｏｉｅｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、または２００８年３月１２日出願の米国仮特許出願第６１／０６９，０５６号、名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｎｔｉｂｏｉｅｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」に記載されている１つまたは複数の安定化変異をさらに含む。これらの出願の両方が、参照により本明細書に援用される。例えば、このイムノバインダーは、（ａ）軽鎖アミノ酸位置３１におけるアスパラギン酸（Ｄ）；（ｂ）軽鎖アミノ酸位置８３におけるグルタミン酸（Ｅ）；（ｃ）重鎖アミノ酸位置４３におけるアルギニン（Ｒ）；（ｄ）重鎖アミノ酸位置６７におけるロイシン（Ｌ）；および（ｅ）重鎖アミノ酸位置７８におけるアラニン（Ａ）からなる群より選択されるアミノ酸位置（ＡＨｏナンバリング法）において、置換をさらに含むことができる。表示する位置における１つまたは複数の変異は、イムノバインダー全体の全般的な安定性に対する効果がある。その他の実施形態では、この変異工程は、以下の安定化変異（ＡＨｏナンバリング法）をさらに含む：（ａ）軽鎖アミノ酸位置３１におけるアスパラギン酸（Ｄ）；（ｂ）軽鎖アミノ酸位置８３におけるグルタミン酸（Ｅ）；（ｃ）重鎖アミノ酸位置４３におけるアルギニン（Ｒ）；（ｄ）重鎖アミノ酸位置６７におけるロイシン（Ｌ）；および（ｅ）重鎖アミノ酸位置７８におけるアラニン（Ａ）。

本発明の別の態様は、本発明のｓｃＦｖ組成物の薬学的処方物に関する。そのような処方物は典型的には、このｓｃＦｖ組成物および薬学的に許容できる担体を含む。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる担体」は、生理学的に適合性である、任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、例えば、（例えば、注射または注入による）静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、上皮投与、または（例えば、眼もしくは皮膚に対する）局所投与に適している。投与経路に応じて、ｓｃＦｖを、材料中でコーティングして、化合物を不活性化する恐れがある酸の作用およびその他の天然の条件から、化合物を保護することができる。

本発明の薬学的化合物は、１つまたは複数の薬学的に許容できる塩を含むことができる。「薬学的に許容できる塩」は、親化合物の所望の生物学的な活性を保持し、任意の望ましくない毒物学的作用をもたらさない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ， Ｓ． Ｍ．ら（１９７７年）Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ６６巻：１〜１９頁を参照されたい）。そのような塩の例として、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩には、無毒性の無機酸、例として、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等、ならびに無毒性の有機酸、例として、脂肪族のモノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族のスルホン酸等に由来する塩が挙げられる。塩基付加塩には、アルカリ土類金属、例として、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等、および無毒性の有機アミン、例として、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等に由来する塩が挙げられる。

また、本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容できる抗酸化剤も含むことができる。薬学的に許容できる抗酸化剤の例として、（１）水溶性抗酸化剤、例として、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（２）油溶性抗酸化剤、例として、アスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガレート、アルファ−トコフェロール等；および（３）金属キレート剤、例として、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等が挙げられる。

本発明の薬学的組成物中で利用することができる適切な水性および非水性の担体の例として、水、エタノール、ポリオール（例として、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）およびそれらの適切な混合物、オリーブ油等の植物油、ならびにオレイン酸エチル等の注射可能有機エステルが挙げられる。例えば、レシチン等のコーティング材料を使用することによって、分散物の場合には必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。

また、これらの組成物は、保存剤、加湿薬、乳化剤および分散化剤等のアジュバントも含有することができる。微生物の存在の阻止を、上記の滅菌手順、ならびに種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等を含めることの両方によって確実にすることができる。また、等張化剤、例として、糖、塩化ナトリウム等を、この組成物中に含めることも望ましい場合がある。さらに、注射可能薬学的形態の長期的吸収を、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の吸収を遅延させる薬剤を含めることによってもたらすこともできる。

薬学的に許容できる担体は、無菌の水溶液または分散物、および無菌の注射可能の溶液または分散物を用時調製するための無菌の粉末を含む。薬学的に活性な物質のための、そのような媒体および薬剤の使用は、当該分野では公知である。この活性化合物に適合する限り、任意の従来の媒体または薬剤の、本発明の薬学的組成物における使用を企図する。また、追加の活性化合物を、この組成物中に組み込むこともできる。

治療用組成物は典型的には、製造および保管の条件下で無菌かつ安定でなければならない。この組成物を、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適したその他の秩序構造として処方することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）ならびにそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい。例えば、レシチン等のコーティング材料を使用することによって、分散物の場合には必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、この組成物中に、等張化剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能組成物の長期的吸収を、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。

適切な溶媒中に、必要量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙した成分のうちの１つまたはそれらの組み合わせと共に組み込み、続いて、精密ろ過により滅菌することによって、無菌の注射可能溶液を調製することができる。一般に、この活性化合物を、基礎分散媒および上記に列挙したものからの必要なその他の成分を含有する無菌のビヒクル中に組み込むことによって、分散物を調製する。無菌の注射可能溶液を調製するための無菌の粉末の場合、調製の好ましい方法は、この活性成分に任意の追加の所望の成分を加えた溶液を先に無菌ろ過し、それから粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））である。

単回投薬形態を生成するための、担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される被験体および特定の投与様式に応じて変化させる。単回投薬形態を生成するための、担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は一般に、治療効果をもたらす組成物の量である。一般に、１００パーセント中、この量は、約０．０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは、約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは、約１パーセント〜約３０パーセントの、薬学的に許容できる担体と組み合わせた活性成分の範囲である。

投薬レジメンを調節して、最適な所望の応答（例えば、治療に対する応答）をもたらす。例えば、単回のボーラスを投与してもよく、用量をいくつかに分けて長時間にわたり投与してもよく、または治療状況の緊急性の指標に従って、用量を比例的に低下もしくは増加させてもよい。投与を容易にし、投与量を一様にするために、非経口用組成物を投薬単位形態として処方することは特に好都合である。本明細書で使用する場合、投薬単位形態とは、処置される被験体のための統一された投与量として適している物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体を伴って所望の治療効果をもたらすように計算された、所定の分量の活性化合物を含有する。本発明の投薬単位形態についての仕様は、（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体において感受性を処置するためのそのような活性化合物を作り上げる技術に内在する制限によって定まり、それらに直接依存する。

（抗体の位置のナンバリングシステム）
抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域におけるアミノ酸残基の位置を同定するために使用した２つの異なるナンバリングシステムについての変換表を提供する。

Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ．ら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１−３２４２）にさらに記載されている。ＡＨｏナンバリングシステムは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ， Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ．（２００１年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．３０９巻：６５７〜６７０頁にさらに記載されている。

（その他の実施形態）
また、米国仮特許出願第６０／９０５，３６５号（ＷＯ０８／１１０３４８の出願に優先権を与える）の付属文書（Ａ〜Ｃ）、および米国仮特許出願第６０／９３７，１１２号（ＷＯ０９／００００９８の出願に優先権を与える）の付属文書（Ａ〜Ｉ）に記載する、これらに制限されないが、同定したデータベース、バイオインフォマティクス、インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）においてデータを操作および解釈する方法、機能アッセイ、好ましい配列、好ましい（１つまたは複数の）残基の位置／変化、フレームワークの同定および選択、フレームワークの変化、ＣＤＲのアラインメントおよび組込み、ならびに好ましい変化／変異を含めた、方法論、参考文献および／または組成物はいずれも、本発明に含まれることを理解すべきである。

これらの方法論および組成物に関する追加の情報を、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第６０／８１９，３７８号；および同第６０／８９９，９０７号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／００６２３５号、名称「ｓｃＦｖ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｗｈｉｃｈ Ｐａｓｓ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ａｎｄ／Ｏｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｌａｙｅｒｓ」、それぞれ、２００６年７月および２００７年２月６日に出願；ＷＯ０６１３１０１３Ａ２、名称「Ｓｔａｂｌｅ Ａｎｄ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＴＮＦα」、２００６年６月６日出願；ＥＰ１５０６２３６Ａ２、名称「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ Ｗｈｉｃｈ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｏｆ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｓａｍｅ」、２００３年５月２１日出願；ＥＰ１４７９６９４Ａ２、名称「Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ ＳｃＦｖ ｗｉｔｈ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｔｈａｔ ｉｓ ｓｔａｂｌｅ ｉｎ ａ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ」、２０００年１２月１８日出願；ＥＰ１２４２４５７Ｂ１、名称「Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ Ｗｉｔｈ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｔｈａｔ Ｉｓ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｎ Ａ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」、２０００年１２月１８日出願；ＷＯ０３０９７６９７Ａ２、名称「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ Ｗｈｉｃｈ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｏｆ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｓａｍｅ」、２００３年５月２１日出願；およびＷＯ０１４８０１７Ａ１、名称「Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ Ｗｉｔｈ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｔｈａｔ Ｉｓ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｎ Ａ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」、２０００年１２月１８日出願；ならびにＨｏｎｅｇｇｅｒら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．３０９巻：６５７〜６７０頁（２００１年）に見出すことができる。

さらにまた、本発明は、その他の抗体のフォーマット、例えば、完全長の抗体、またはそれらの断片、例えば、Ｆａｂ、Ｄａｂ等を発見および／または改善するのに適した方法論および組成物も含むことを理解すべきである。したがって、本明細書において、所望の生物物理学的妥当性および／または治療における妥当性を達成するために選択するかまたは変化させるのに適切であるとして同定した原理および残基は、広い範囲のイムノバインダーに適用することができる。１つの実施形態では、臨床上意味のある抗体、例えば、ＦＤＡにより承認されている抗体が、本明細書に開示する１つまたは複数の残基の位置を改変することによって改善される。

しかし、本発明はイムノバインダーの遺伝子工学的操作に限定されない。例えば、これらに限定されないが、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（ＷＯ０１／６４９４２、ならびに米国特許第６，６７３，９０１号、同第６，７０３，１９９号、同第７，０７８，４９０号および同第７，１１９，１７１号を参照されたい）等のフィブロネクチン結合性分子、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（例えば、米国特許第６，７４０，７３４号および同第６，６０２，９７７号、ならびにＷＯ００／６３２４３を参照されたい）、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（リポカリンとしても公知である）（ＷＯ９９／１６８７３およびＷＯ０５／０１９２５４を参照されたい）、Ａドメインタンパク質（Ａ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＷＯ０２／０８８１７１およびＷＯ０４／０４４０１１を参照されたい）、さらに、Ｄａｒｐｉｎまたはロイシン反復タンパク質等のアンキリン反復タンパク質（ＷＯ０２／２０５６５およびＷＯ０６／０８３２７５を参照されたい）を含めた、その他の非免疫グロブリン型の結合性分子の遺伝子工学的操作に、本発明の方法を適用することができることを当業者は認識する。

本開示を、以下の実施例によってさらに例証するが、これらの実施例によって、本発明がさらに限定されると解釈してはならない。この出願全体を通して引用するすべての図ならびにすべての参考文献、特許、公開および未公開の特許出願の内容は、それらの全体が参照により本明細書に明示的に援用される。

（実施例１：溶解性の改善を示すｓｃＦｖの生成）
この実施例では、構造モデリングおよび配列分析に基づいたアプローチを使用して、溶解性の改善をもたらす、ｓｃＦｖフレームワーク領域における変異を同定した。

ａ）構造分析
ＥＳＢＡ１０５のｓｃＦｖの３Ｄ構造を、ＥｘＰＡＳｙウェブサーバを介してアクセスできる自動化タンパク質構造相同性モデリングのサーバを使用してモデル化した。この構造を、溶媒に対する相対的表面到達性（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｏｌｖｅｎｔ（ｒＳＡＳ））により分析し、残基を以下に従って分類した：（１）ｒＳＡＳ≧５０％を示す露出残基；および（２）５０％≦ｒＳＡＳ≧２５％を有する部分的露出残基。ｒＳＡＳ≧２５％を有する疎水性残基を、疎水性パッチとみなした。見出された各疎水性パッチの溶媒に到達可能な領域を確認するために、２７個のＰＤＢファイルから、ＥＳＢＡ１０５に対する高い相同性および２．７Å超の分解能を用いて計算を行った。平均ｒＳＡＳおよび標準偏差を、これらの疎水性パッチについて計算し、それらのそれぞれについて詳細に調べた（表３

を参照されたい）。

ＥＳＢＡ１０５中で同定された疎水性パッチの大部分が、可変ドメイン−定常ドメイン（ＶＨ／ＣＨ）の界面に相当する。このことは、ｓｃＦｖフォーマットにおける溶媒露出疎水性残基の以前の知見と相関した（Ｎｉｅｂａら、１９９７年）。また、疎水性パッチのうちの２つ（ＶＨ２およびＶＨ５）は、ＶＬ−ＶＨの相互作用にも寄与しており、したがって、それらを、それに続く分析から除外した。

ｂ）溶解性変異の設計
総数１２２個のＶＬ配列および１３７個のＶＨ配列を、Ａｎｎｅｍａｒｉｅ Ｈｏｎｅｇｇｅｒの抗体のウェブページ（ｗｗｗ．ｂｉｏｃ．ｕｚｈ．ｃｈ／ａｎｔｉｂｏｄｙ）から得た。これらの配列は本来、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）から抽出したＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットにおける３９３個の抗体構造に対応する。天然の残基よりも高い親水性を示す代替のアミノ酸を見出す確率を増加させるために、配列を使用して、種またはサブグループにかかわらず分析した。バイアスを低下させるために、データベース内の任意のその他の配列に対して９５％超の同一性を示す配列を除外した。これらの配列を整列させ、残基の頻度について分析した。配列分析のツールおよびアルゴリズムを適用して、ＥＳＢＡ１０５中の疎水性パッチを破壊するための親水性の変異を同定および選択した。これらの配列を、免疫グロブリン可変ドメインについてＡＨｏのナンバリングシステムに従って整列させた（Ｈｏｎｅｇｇｅｒおよび Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ２００１年）。この分析は、フレームワーク領域に限定した。

カスタマイズしたデータベースにおいて、各位置ｉについての残基の頻度ｆ（ｒ）を、その特定の残基がデータセット内で観察される回数を配列の総数で割ることよって計算した。第１の工程では、異なるアミノ酸の出現頻度を、各疎水性パッチについて計算した。ＥＳＢＡ１０５中で同定された各疎水性パッチについての残基の頻度を、上記のカスタマイズしたデータベースから分析した。表４

に、このデータベース中に存在する残基の総数で割った、疎水性パッチにおける残基の頻度を報告する。

第２の工程では、この疎水性パッチにおける親水性残基の頻度を使用して、各疎水性パッチにおいて最も多い親水性残基を選択することによって溶解性変異を設計した。表５

に、このアプローチを使用して同定した溶解性変異体を報告する。親および変異体の残基の疎水性を、いくつかの論文に公開されている値の平均疎水性として計算し、側鎖の溶媒に対する露出レベルの関数として表した。

ｃ）溶解性ＥＳＢＡ１０５改変体の試験
溶解性変異を、単独でかまたは複数の組合せとして導入し、リフォールディングの収率、発現、活性および安定性、ならびに凝集パターンについて試験した。表６

に、溶解性に対する潜在的な寄与、および変異が抗原結合を変化させるリスクレベルに基づいて最適化したＥＳＢＡ１０５改変体それぞれの中に導入した溶解性変異の種々の組合せを示す。

ｄ）溶解性の測定
ＥＳＢＡ１０５および改変体の最大溶解性を、Ａｔｈａら（ＪＢＣ、２５６巻：１２１０８〜１２１１７頁（１９８１年））によって最初に記載されたＰＥＧ沈殿の方法によって決定した。この方法では、遠心分離したＰＥＧ−タンパク質の混合物の上清中のタンパク質濃度を測定し、ＰＥＧ濃度に対して対数プロットする。２０ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液を、３０〜５０％の範囲における飽和ＰＥＧ溶液と１：１で混合した。これらの条件は、Ｌｏｇ Ｓ対Ｐｅｇ濃度（％ｗ／ｖ）の線形の依存性を実験的に決定した後に、野生型ＥＳＢＡ１０５について観察した溶解性プロファイルに基づいて選ばれた。改変体ＥＳＢＡ１０５のうち、優れた溶解性を示したいくつかの例の溶解度曲線を、図１に示す。また、溶解度の値の完全なリストも、表７

に提供する。

ｅ）熱安定性の測定
親のＥＳＢＡ１０５および溶解性追加物（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｆｏｌｌｏｗ ｕｐ）に対する熱安定性の測定を、ＦＴ−ＩＲ ＡＴＲ分光法を使用して実施した。これらの分子を、広い範囲の温度（２５〜９５℃）で熱チャレンジした。インターフェログラムのシグナルに対してフーリエ変換を適用することによって、変性プロファイルを得た（図２を参照されたい）。これらの変性プロファイルを使用して、ボルツマンシグモイドモデルに適用する、それぞれのＥＳＢＡ１０５改変体についての熱によるアンフォールディング転移の中間点（ＴＭ）を近似した

（表８）。

（ｉｉｉ．凝集の測定）
また、ＥＳＢＡ１０５およびその溶解性改変体を、分解および凝集の挙動を評価するために、時間依存試験において分析した。このために、可溶性タンパク質（２０ｍｇ／ｍｌ）を、ｐＨ６．５のリン酸緩衝液中、高い温度（４０℃）でインキュベートした。対照試料は、−８０℃に保った。これらの試料を、２週間のインキュベーション期間後に、分解（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および凝集（ＳＥＣ）について分析した。これによって、分解を起こしやすい改変体（図３を参照されたい）、または可溶性もしくは不溶性の凝集物を形成する傾向を示す改変体（表９を参照されたい）

を廃棄することが可能となった。

（ｉｖ．溶解性改変体の発現およびリフォールディング）
また、溶解性変異体を、親のＥＳＢＡ１０５分子と比べた発現およびリフォールディングの収率についても試験した。これらの研究の結果を、表１０

に示す。

すべての親水性溶解性変異体が、親のＥＳＢＡ１０５分子と比較して溶解性の改善を示したが、これらの分子の一部のみが、適切なその他の生物物理学的特性を示したに過ぎない。例えば、多くの改変体は、親のＥＳＢＡ１０５分子と比べて熱安定性および／またはリフォールディングの収率の低下を示した。特に、位置ＶＬ１４７における親水性の置換によって、安定性が極度に減少した。したがって、熱安定性に顕著な影響を及ぼさなかった溶解性変異を組み合わせて、さらなる熱ストレスを与え、それらの特性を確認した。

４つの異なる溶解性変異の組合せを含有する３つの変異体（Ｏｐｔ１．０、Ｏｐｔ０．２およびＶＨ：Ｖ１０３Ｔ）は、再現性、活性および熱安定性に影響を及ぼすことなく、ＥＳＢＡ１０５の溶解性を顕著に改善した。しかし、ＥＳＢＡ１０５中にＯｐｔ１．０とＯｐｔ０．２との変異の組合せを有する変異体（Ｏｐｔ１＿２）は、４０℃における２週間のインキュベーション後に不溶性の凝集物の量の増加を示した（表９を参照されたい）。このことは、ベータシートターン中の位置ＶＬ１５におけるＶａｌの役割によって説明することができるであろう。これは、Ｖａｌが、すべてのアミノ酸のうち、最も高いベータシートの傾向を示すからである。この結果は、位置ＶＬ１５における単一の溶解性変異は許容されるが、その他の疎水性パッチを破壊する溶解性変異体との組合せは許容されないことを実証した。したがって、Ｏｐｔ０＿２およびＶＨ：Ｖ１０３Ｔ中に含有される変異を、ｓｃＦｖ分子の溶解性特性を改善するための最良の変異（ｂｅｓｔ ｐｅｒｆｏｒｍｅｒ）として選択した。

（実施例２：溶解性および安定性の増強を示すｓｃＦｖの生成）
溶解性の設計によって同定したＥＳＢＡ１０５改変体を、品質管理（ＱＣ）アッセイにより同定した安定化変異で置換することによってさらに最適化した。上記の実施例１で同定した１〜３つの溶解性変異と、ＱＣ７．１および１５．２において見出されたすべての安定化変異（すなわち、ＶＬドメイン中のＤ３１ＮおよびＶ８３Ｅ、ならびにＶＨドメイン中のＶ７８Ａ、Ｋ４３およびＦ６７Ｌ）とを組み合わせて含有する総数４つの構築物を創出した。すべての最適化構築物が、野生型ｓｃＦｖよりも可溶性に優れたタンパク質をもたらした（表１１を参照されたい）。

最良の構築物は一貫して、野生型と比べて２倍超の溶解性の増加を示した。ｓｃＦｖ分子は、活性についても、安定性についても、安定化変異と溶解性増強変異との組合せによって顕著な影響は受けなかった。

すべての４つの改変体の溶解度の値を使用して、ｓｃＦｖの溶解性に対する各変異の寄与を解析した。これらの残基のうちのいくつかは、一次配列中および３Ｄ構造内部の両方において相互に比較的接近していたにもかかわらず、すべての変異が、ｓｃＦｖの溶解性に相加的に寄与するようであった。この分析によって、ＶＨドメイン中の３つの溶解性増強変異（Ｖ１２Ｓ、Ｌ１４４Ｓ、Ｖ１０３Ｔ（またはＶ１０３Ｓ））の組合せが、ｓｃＦｖの溶解性の約６０％に関与することを示した。疎水性パッチは、すべてのイムノバインダーの可変ドメイン中で保存されているので、この最適な変異の組合せを使用して、事実上任意のｓｃＦｖまたはその他のイムノバインダー分子の溶解性を改善することができる。

（実施例３：強力なＴＮＦαバインダーであるＥｐｉ４３ｍａｘの溶解性最適化改変体）
表１２は、強力なＴＮＦバインダーであるＥｐｉ４３ｍａｘの３つの最適化改変体についての特徴付けのデータを示す。

ＥＰ４３＿ｍａｘＤＨＰは、ＥＰ４３ｍａｘの溶解性増強改変体であり、上記の溶解性増強変異３つを含む（ＡＨｏ位置１２におけるＶ→Ｓ、ＡＨｏ位置１０３におけるＶ→Ｔ、およびＡＨｏ位置１４４におけるＬ→Ｔ）。ＥＰ４３＿ｍａｘｍｉｎ改変体およびＥＰ４３＿ｍｉｎｍａｘ改変体を、「ｍｉｎ」融合片と「ｍａｘ」融合片との間におけるドメインシャッフリングによって生成した。具体的には、「ｍｉｎｍａｘ」改変体は、軽鎖の最小融合片（ＣＤＲ融合のみ）バージョンと、重鎖の最大融合片バージョン（すなわち、ラビットＣＤＲと抗原結合に関与するラビットフレームワーク残基とが融合されている）とを含む。逆に、「ｍａｘｍｉｎ」改変体は、軽鎖の最大融合片バージョンと重鎖の最小融合片バージョンとを含む。ＥＰ４３ｍａｘおよびその最適化改変体の熱変性曲線を、ＦＴＩＲ分析により比較した（図４を参照されたい）。Ｅｐｉ４３ｍｉｎｍａｘは、Ｅｐｉ４３ｍａｘよりもより低いアンフォールディングの中間点を示すことを見出した。さらに、ｍｉｍａｘ改変体は、一段階のアンフォールディング転移を示し、このことは、両方のドメインが、非常に類似する温度においてアンフォールディングすることを示した。

（実施例４：ＶＥＧＦイムノバインダーの溶解性増強誘導体）
上記のＴＮＦイムノバインダー（ＥＳＢＡ１０５およびＥｐｉ４３ｍａｘ）に加えて、ＶＥＧＦイムノバインダーのいくつかの溶解性誘導体を、本発明の方法に従って遺伝子工学的に操作した。特に、これらのＶＥＧＦイムノバインダー改変体を、以下の残基について選択することによって、破壊された疎水性パッチ（「ＤＨＰ」）を有するように遺伝子工学的に操作した：（ａ）重鎖アミノ酸位置１２におけるセリン（Ｓ）；（ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３におけるセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）；および（ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４におけるセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）。これらのＤＨＰ改変体の生物物理学的な特徴を、それらの野生型対応物と比較した。これらの特徴は、（Ｂｉｏ−ＡＴＲにより決定した）融解温度またはＴ_ｍ、（ＡｑｕａＳｐｅｃにより決定した）６０℃におけるβ−シート喪失パーセント、６０℃における沈殿後のタンパク質喪失パーセント、硫酸アンモニウム沈殿法による溶解性、産物中のリフォールディングの収率、およびＥ．ｃｏｌｉ中における発現レベルを含んだ。

以下の表１４に示すように、ＶＥＧＦイムノバインダーのうちの１つ（ＥＳＢＡ５７８ｍｉｎｍａｘ ＦＷ １．４ ＤＨＰ）の溶解性が、このＤＨＰモチーフの導入によって顕著に増強した。さらに、その他の生物物理学的特性（例えば、熱安定性）は、このモチーフの導入によって、不利な影響を受けることも、改善されることもなかった。

５７８ｍｉｎ−ｍａｘおよびその溶解性最適化改変体（５７８ｍｉｎ−ｍａｘ＿ＤＨＰ）についての融解温度を決定するために使用した熱安定性曲線を、図５および表１３に示し、溶解度の値を決定するために使用した硫酸アンモニウム沈殿法の曲線を図６に示す。

（等価物）
当業者であれば、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し、または日常的な実験のみを使用して、それらを究明することも可能である。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。

Claims (14)

1. 重鎖アミノ酸位置１２、１０３および１４４（ＡＨｏナンバリング）において以下の溶解性増強モチーフ：
   （ａ）重鎖アミノ酸位置１２におけるセリン（Ｓ）；
   （ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３におけるセリン（Ｓ）；および
   （ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４におけるスレオニン（Ｔ）；または
   （ａ１）重鎖アミノ酸位置１２におけるセリン（Ｓ）；
   （ｂ１）重鎖アミノ酸位置１０３におけるスレオニン（Ｔ）；および
   （ｃ１）重鎖アミノ酸位置１４４におけるセリン（Ｓ）；または
   （ａ２）重鎖アミノ酸位置１２におけるセリン（Ｓ）；
   （ｂ２）重鎖アミノ酸位置１０３におけるスレオニン（Ｔ）；および
   （ｃ２）重鎖アミノ酸位置１４４におけるスレオニン（Ｔ）
   のうちの１つを含む、イムノバインダーであって、
   該イムノバインダーが重鎖可変領域またはその断片を含む、イムノバインダー。
2. （ａ）軽鎖アミノ酸位置３１におけるアスパラギン酸（Ｄ）；
   （ｂ）軽鎖アミノ酸位置８３におけるグルタミン酸（Ｅ）；
   （ｃ）重鎖アミノ酸位置４３におけるアルギニン（Ｒ）；
   （ｄ）重鎖アミノ酸位置６７におけるロイシン（Ｌ）；および／または
   （ｅ）重鎖アミノ酸位置７８におけるアラニン（Ａ）
   をさらに含む、請求項１に記載のイムノバインダー。
3. 未変性状態のイムノバインダーの溶解性を増強する方法であって、前記イムノバインダーが、重鎖可変（Ｖ_Ｈ）領域またはその断片を含み、前記方法が、
   Ａ）変異のために、前記Ｖ_Ｈ領域内部の少なくとも２つのアミノ酸位置を選択する工程と、
   Ｂ）変異のために選択された前記少なくとも２つのアミノ酸位置を変異させる工程と
   を含み、前記少なくとも２つのアミノ酸位置が、１２、１０３および１４４（ＡＨｏナンバリング法による）からなる重鎖アミノ酸位置の群より選択され、前記変異工程が前記選択されたアミノ酸位置におけるアミノ酸の、セリンまたはスレオニンによる置換を含む、方法。
4. 前記親水性アミノ酸が、
   （ａ）重鎖アミノ酸位置１２におけるセリン（Ｓ）；
   （ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３におけるセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）；および／または
   （ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４におけるセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）
   である、請求項３に記載の方法。
5. 変異のために選択された前記アミノ酸位置におけるアミノ酸が、疎水性アミノ酸である、請求項３または４に記載の方法。
6. 前記疎水性アミノ酸が、ロイシン（Ｌ）またはバリン（Ｖ）である、請求項５に記載の方法。
7. （ａ）重鎖アミノ酸位置１２におけるアミノ酸の変異のために選択されたアミノ酸がバリン（Ｖ）であり、
   （ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３におけるアミノ酸の変異のために選択されたアミノ酸がバリン（Ｖ）であり、
   （ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４におけるアミノ酸の変異のために選択されたアミノ酸がロイシン（Ｌ）である、
   請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記イムノバインダーの熱安定性、リフォールディング、発現収率、凝集および／または結合活性が、前記変異工程によって不利な影響を受けない、請求項３から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記変異工程の結果、溶解性が少なくとも２倍増加する、請求項３から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記変異工程が、
    （ａ）軽鎖アミノ酸位置３１におけるアスパラギン酸（Ｄ）；
    （ｂ）軽鎖アミノ酸位置８３におけるグルタミン酸（Ｅ）；
    （ｃ）重鎖アミノ酸位置４３におけるアルギニン（Ｒ）；
    （ｄ）重鎖アミノ酸位置６７におけるロイシン（Ｌ）；および
    （ｅ）重鎖アミノ酸位置７８におけるアラニン（Ａ）
    からなる群より選択されるアミノ酸位置（ＡＨｏナンバリング法）に１つまたは複数の変異を導入する工程をさらに含む、請求項３から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 請求項３から１０のいずれか一項に記載の方法によって調製されたイムノバインダー。
12. ｓｃＦｖ抗体、完全長の免疫グロブリン、Ｆａｂ断片、ＶＨドメインからなるＤａｂ断片または単一の可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含有する重鎖可変領域である、請求項１、２または１１のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
13. ヒトＴＮＦαまたはヒトＶＥＧＦに特異的に結合する、請求項１、２、１１または１２のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
14. 請求項１、２、１１、１２または１３のいずれか一項に記載のイムノバインダーおよび薬学的に許容できる担体を含む組成物。
    
    

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