JP5605658B2 - Proteolytic induction method in mammalian cells - Google Patents
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Description
本発明は哺乳類細胞において目的タンパク質の分解を効率良く誘導する方法に関する。 The present invention relates to a method for efficiently inducing degradation of a target protein in mammalian cells.
細胞内で特定のタンパク質の発現量をコントロールすることは、細胞内におけるそのタンパク質の機能及びそのタンパク質が関与する生命現象を解析する上において非常に有用である。この目的のために、これまで別個の原理に基づく複数の方法が開発されている。 Controlling the expression level of a specific protein in the cell is very useful in analyzing the function of the protein in the cell and the life phenomenon in which the protein is involved. To this end, several methods have been developed so far based on separate principles.
例えば、大腸菌のテトラサイクリン結合性転写抑制因子を利用して、培養細胞内に導入した遺伝子の転写発現をテトラサイクリン依存的に行う方法が知られている（非特許文献１、２）。この原理に基づく転写抑制システムは市販されており、多くの研究者が実際に利用してこれまで成果を上げてきた。しかしながら、この方法は目的遺伝子の転写制御を行う方法であるため、発現抑制を行っても実際のタンパク質が細胞内から除去されるまでに時間がかかる場合が多く、場合によっては、目的タンパク質の部分的発現量低下が二次的な細胞内応答反応を活性化してしまう場合もある。
同様に培養細胞内で発現抑制を行う方法としてｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡを細胞内に導入し、細胞内のＲＮＡ干渉反応を利用して対象遺伝子産物のｍＲＮＡを分解する方法が知られている。実際にこの方法に基づく製品も多くの会社から発売されている。しかし、この方法もｍＲＮＡレベルでの発現抑制を行うものであるため、発現抑制まで一般に２４〜４８時間もの時間を必要とする。また発現抑制の度合いも、対象とする因子やターゲットＲＮＡ配列に依存しており、９０％以上の発現抑制を達成できる可能性はそれほど高くない。For example, a method of performing transcriptional expression of a gene introduced into cultured cells in a tetracycline-dependent manner using a tetracycline-binding transcription repressing factor of Escherichia coli is known (Non-patent Documents 1 and 2). Transcription suppression systems based on this principle are commercially available, and many researchers have actually used them and have achieved results so far. However, since this method is a method of controlling transcription of the target gene, it often takes time for the actual protein to be removed from the cell even if expression is suppressed. In some cases, a decrease in the expression level may activate a secondary intracellular response.
Similarly, as a method for suppressing expression in a cultured cell, a method is known in which siRNA and shRNA are introduced into the cell and the mRNA of the target gene product is degraded using the intracellular RNA interference reaction. In fact, many companies have released products based on this method. However, since this method also suppresses expression at the mRNA level, it generally requires 24 to 48 hours to suppress expression. In addition, the degree of expression suppression depends on the target factor and target RNA sequence, and it is not very likely that expression suppression of 90% or more can be achieved.
最近になり、標的タンパク質に分解誘導タグを導入し、そのタグの分解制御を行うことによりタンパク質の発現を制御する方法が実用化され始めてきた。ラパマイシン結合タンパク質ＦＫＢＰ１２を改変したタンパク質は、ラパマイシン類似化合物であるＳｈｉｅｌｄ１に結合すると安定化され、結合しないと不安定化し細胞内で分解される。この性質を利用して、目的タンパク質にこのＦＫＢＰ１２由来タンパク質を融合して、Ｓｈｉｅｌｄ１依存的に発現制御を行う方法が発表された（非特許文献３）。この方法は一般にＳｈｉｅｌｄ１除去により標的タンパク質を４時間程度で分解するとされており、必要なプラスミドセット等が発売されている。この方法ではタンパク質を安定発現させるためにはＳｈｉｅｌｄ１を常に培地に添加する必要があるが、Ｓｈｉｅｌｄ１がラパマイシン類似化合物であるためにその細胞毒性に疑問がある。また、発現抑制に必要な分解時間も４時間程度という点から、細胞周期などの研究にはより素早い分解除去が可能なシステムが望まれてきた。 Recently, a method for controlling protein expression by introducing a degradation-inducing tag into a target protein and controlling the degradation of the tag has been put into practical use. A protein obtained by modifying the rapamycin-binding protein FKBP12 is stabilized when bound to Shield1, which is a rapamycin-like compound, and is destabilized and degraded in the cell if not bound. Utilizing this property, a method for fusing this FKBP12-derived protein to a target protein and controlling expression in a Shield1-dependent manner was disclosed (Non-patent Document 3). In this method, it is generally said that target protein is degraded in about 4 hours by Shield1 removal, and necessary plasmid sets and the like are on the market. In this method, it is necessary to always add Shield1 to the medium in order to stably express the protein. However, since Shield1 is a rapamycin-like compound, its cytotoxicity is questionable. In addition, since the degradation time required for expression suppression is about 4 hours, a system capable of faster degradation and removal has been desired for research on the cell cycle and the like.
かかる実情から本発明者は、植物ホルモンオーキシンによって誘導される植物特異的なタンパク質分解に着目し、この分解経路を出芽酵母に導入することで、オーキシンを培地に添加することで１５〜３０分というごく短時間で目的タンパク質を分解することにより発現抑制する方法を開発した（特許文献１）。 From this situation, the present inventors paid attention to plant-specific proteolysis induced by the plant hormone auxin, and by introducing this degradation pathway into budding yeast, the auxin is added to the medium to be 15 to 30 minutes. A method for suppressing expression by degrading the target protein in a very short time was developed (Patent Document 1).
しかしながら、上記特許文献１に記載したシロイヌナズナ由来のＴＩＲ１遺伝子と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡ遺伝子を用いた発現ベクターは、出芽酵母ではタンパク質の分解を誘導できるが、哺乳類細胞の培養系ではタンパク質の分解を誘導できないことが判明した。哺乳類細胞系で使用できなければ、ヒトを含む哺乳類のタンパク質の発現制御の研究には適用できない。
従って、本発明の課題は、哺乳類細胞系において、短時間で確実に安定して目的タンパク質の分解を誘導できるシステムを提供することにある。However, the expression vector using the TIR1 gene derived from Arabidopsis thaliana and the plant-derived Aux / IAA gene described in Patent Document 1 can induce protein degradation in Saccharomyces cerevisiae, but protein degradation in mammalian cell culture systems. It turned out that it could not be guided. If it cannot be used in mammalian cell systems, it cannot be applied to the study of the expression control of mammalian proteins including humans.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a system capable of inducing degradation of a target protein reliably and stably in a short time in a mammalian cell system.
そこで本発明者は、前記特許文献１記載の系が哺乳類細胞の培養系でタンパク質の分解を誘導できない原因について検討したところ、この発現ベクターは２４℃程度の温度条件では機能するが、哺乳類細胞の培養系である３７℃近辺では機能しないことが判明した。そこで、さらにＴＩＲ１遺伝子に着目して検討したところ、高温条件でも生育可能な植物であるワタ由来のＴＩＲ１遺伝子を用いた場合には、シロイヌナズナ由来のＴＩＲ１と同様に３７℃で機能できないのに対し、意外にもイネ由来のＴＩＲ１遺伝子を採用した場合には３７℃でも効率良く機能し、哺乳類細胞培養系で目的タンパク質の分解を速やかに誘導できることを見出した。
また、ウイルス由来のプロモーターとＩＲＥＳとの間にイネ由来のＴＩＲ１ファミリー遺伝子を連結し、その下流に植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子を連結してなる発現ベクターを導入すれば、全く意外にも効率良く、かつ迅速に目的タンパク質の分解が誘導できることも見出した。Therefore, the present inventor examined the reason why the system described in Patent Document 1 cannot induce protein degradation in a mammalian cell culture system. This expression vector functions under a temperature condition of about 24 ° C. It was found that it does not function in the vicinity of 37 ° C., which is a culture system. Therefore, when the TIR1 gene was further examined, the TIR1 gene derived from cotton, which is a plant that can grow even under high temperature conditions, cannot function at 37 ° C. like TIR1 derived from Arabidopsis thaliana. Surprisingly, it has been found that when the TIR1 gene derived from rice is employed, it functions efficiently even at 37 ° C., and the degradation of the target protein can be rapidly induced in a mammalian cell culture system.
An expression vector comprising a rice-derived TIR1 family gene linked between a virus-derived promoter and an IRES, and a chimeric gene expressing a target protein labeled with a plant-derived Aux / IAA family protein downstream thereof. It has also been found that the introduction of can induce degradation of the target protein unexpectedly efficiently and rapidly.
すなわち、本発明は、イネ由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子とを有することを特徴とする、オーキシン類により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性哺乳類細胞を提供するものである。
また、本発明は、ウイルス由来のプロモーターとＩＲＥＳとの間にイネ由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子を連結し、その下流に前記キメラ遺伝子を連結してなる発現ベクターを導入したものである上記のタンパク質分解誘導性哺乳類細胞を提供するものである。That is, the present invention comprises a rice-derived TIR1 family protein gene and a chimeric gene that expresses a target protein labeled with a plant-derived Aux / IAA family protein. Provided is a proteolytic-inducible mammalian cell that is induced.
The present invention also relates to the above-mentioned proteolysis in which an expression vector obtained by linking a rice-derived TIR1 family protein gene between a virus-derived promoter and IRES and linking the chimeric gene downstream thereof is introduced. Inducible mammalian cells are provided.
また、本発明は、宿主哺乳類細胞に、イネ由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子を導入することを特徴とする、オーキシン類により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性哺乳類細胞の製造法を提供するものである。
また、本発明は、前記遺伝子の導入が、ウイルス由来のプロモーターとＩＲＥＳとの間にイネ由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子を連結し、その下流に前記キメラ遺伝子を連結してなる発現ベクターを導入するものである上記のタンパク質分解誘導性哺乳類細胞の製造法を提供するものである。In addition, the present invention provides an auxin, wherein a chimeric gene expressing a target protein labeled with a plant-derived Aux / IAA family protein and a TIR1 family protein gene derived from rice is introduced into a host mammalian cell. The present invention provides a method for producing a proteolytic-inducible mammalian cell in which the target protein is induced to degrade.
Further, the present invention introduces an expression vector in which the gene is introduced by linking a rice-derived TIR1 family protein gene between a virus-derived promoter and an IRES and linking the chimeric gene downstream thereof. A method for producing the above-described proteolytic-inducible mammalian cell is provided.
また本発明は、イネ由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子とを有することを特徴とする、オーキシン類により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性哺乳類細胞用の遺伝子導入用ベクターを提供するものである。
また、本発明は、ウイルス由来のプロモーターとＩＲＥＳとの間にイネ由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子を連結し、その下流に前記キメラ遺伝子を連結してなる発現ベクターである上記の遺伝子導入用ベクターを提供するものである。The present invention also includes degradation of the target protein by auxins characterized by having a TIR1 family protein gene derived from rice and a chimeric gene expressing the target protein labeled with a plant-derived Aux / IAA family protein The present invention provides a vector for gene transfer for a proteolytic-inducible mammalian cell.
The present invention also provides the gene introduction vector, which is an expression vector obtained by linking a rice-derived TIR1 family protein gene between a virus-derived promoter and an IRES, and linking the chimeric gene downstream thereof. To do.
さらに本発明は、上記のタンパク質分解誘導性哺乳類細胞にオーキシン類を添加することを特徴とする目的タンパク質の分解誘導方法を提供するものである。 Furthermore, the present invention provides a method for inducing degradation of a target protein, which comprises adding auxins to the above-described proteolysis-inducing mammalian cells.
本発明の哺乳類細胞を用いれば、オーキシン類の添加により１５〜３０分で確実に目的タンパク質の分解が特異的に誘導できることから、所定のタンパク質の機能解析、所定のタンパク質の機能をターゲットにした医薬開発等の分野におけるツールとして有用である。 If the mammalian cell of the present invention is used, degradation of the target protein can be induced specifically in 15 to 30 minutes by adding auxins, so that the function analysis of the predetermined protein, the drug targeting the function of the predetermined protein Useful as a tool in development and other fields.
本発明のタンパク質分解誘導性哺乳類細胞は、（１）イネ由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子と、（２）植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子とを有する。このＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子と、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子との組み合せは、哺乳類細胞内で植物のユビキチン化酵素複合体に基づく分解経路を形成させたものである。すなわち、動物、植物、菌類等の種々の真核生物において、ユビキチン／プロテアソーム系のタンパク質分解が知られている。この分解システムは、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）−ユビキチン結合酵素（Ｅ２）−ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）という３つの酵素によって、ターゲットタンパク質にユビキチンが結合され、ポリユビキチン化されたターゲットタンパク質がプロテアソームによって特異的に認識され、分解されるシステムである。このユビキチンリガーゼとして、Ｅ３ユビキチン化酵素複合体（ＳＣＦ複合体）が報告されている。このＳＣＦ複合体は、Ｆ−ｂｏｘタンパク質、Ｓｋｐ１タンパク質、Ｃｕｌｌｉｎ−１タンパク質及びＲｂｘ１タンパク質という４つのサブユニットから構成されている。植物のＳＣＦ複合体について、Ｆ−ｂｏｘタンパク質としてＴＩＲ１ファミリータンパク質を有し、これが成長ホルモンであるオーキシンの受容体となっており、オーキシンを受容することによって、オーキシン情報伝達系の抑制因子Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識して、前記タンパク質を分解することが、近年解明された。そこで、本発明者は、オーキシンを誘導物質として、イネ由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質により、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識させ、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化した目的タンパク質を分解する系を、植物以外の哺乳類細胞において機能させることに成功したのである。 The proteolytic inducible mammalian cell of the present invention has (1) a rice-derived TIR1 family protein gene and (2) a chimeric gene that expresses a target protein labeled with a plant-derived Aux / IAA family protein. This combination of the TIR1 family protein gene and the chimeric gene expressing the target protein labeled with the Aux / IAA family protein forms a degradation pathway based on a plant ubiquitinase complex in mammalian cells. . That is, ubiquitin / proteasome proteolysis is known in various eukaryotes such as animals, plants, and fungi. In this degradation system, ubiquitin is bound to a target protein by three enzymes, ubiquitin activating enzyme (E1) -ubiquitin-conjugating enzyme (E2) -ubiquitin ligase (E3), and the polyubiquitinated target protein is specific by the proteasome. Is a system that is recognized and disassembled. As this ubiquitin ligase, an E3 ubiquitinase complex (SCF complex) has been reported. This SCF complex is composed of four subunits: F-box protein, Skp1 protein, Cullin-1 protein, and Rbx1 protein. The plant SCF complex has a TIR1 family protein as an F-box protein, which is a receptor for the growth hormone auxin, and by receiving auxin, an inhibitor of the auxin signal transduction system Aux / IAA It has recently been elucidated to recognize family proteins and degrade them. Accordingly, the present inventor has developed a system for recognizing an Aux / IAA family protein by a rice-derived TIR1 family protein using auxin as an inducer and degrading a target protein labeled with the Aux / IAA family protein. It was successful in functioning in cells.
本発明のタンパク質分解誘導性哺乳類細胞であれば、オーキシン類の添加によって、任意の時期に、発現した目的タンパク質を分解できる。つまり、本発明のタンパク質分解誘導性哺乳類細胞によれば、例えば、イネ由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質を含むＳＣＦ複合体及びＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質が発現する。このため、オーキシン類の共存下であれば、前記ＳＣＦ複合体のイネ由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質がオーキシン類を受容し、これによってＴＩＲ１ファミリータンパク質によるＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の認識、ならびに、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質へのポリユビキチン化が生じる。そして、プロテアソームによって、ポリユビキチン化Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質が分解される。このため、例えば、オーキシン類の添加、無添加によって、発現した目的タンパク質の分解を制御することが可能である。 With the proteolytic-inducible mammalian cell of the present invention, the target protein expressed can be degraded at any time by adding auxins. That is, according to the proteolysis-inducing mammalian cell of the present invention, for example, an SCF complex containing a rice-derived TIR1 family protein and a target protein labeled with an Aux / IAA family protein are expressed. Therefore, under the coexistence of auxins, the rice-derived TIR1 family protein of the SCF complex accepts auxins, thereby recognizing the Aux / IAA family protein by the TIR1 family protein, and the Aux / IAA family Polyubiquitination into proteins occurs. The target protein labeled with the polyubiquitinated Aux / IAA family protein is degraded by the proteasome. For this reason, for example, it is possible to control the degradation of the expressed target protein by adding or not adding auxins.
本発明に用いられるＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子は、イネ由来のものである。前記のように、特許文献１で用いられるシロイヌナズナ由来のものや、ワタ由来のものでは、哺乳類細胞の生育温度である３７℃近辺で機能しない。当該イネ由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子としては、ＴＩＲ１遺伝子、ＡＦＢ１遺伝子、ＡＦＢ２遺伝子、ＡＦＢ３遺伝子、ＦＢＸ１４遺伝子、ＡＦＢ５遺伝子が挙げられるが、ＴＩＲ１遺伝子が特に好ましい。より具体的には、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に登録されているアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００１０５９１９４（ＧｅｎｅＩＤ：４３３５６９６）、Ｏｓ０４ｇ０３９５６００もしくは同データベース登録の、アクセッションＮｏ．ＥＡＹ９３９３３、ＯｓＩ＿１５７０７の遺伝子が好ましい。 The TIR1 family protein gene used in the present invention is derived from rice. As described above, those derived from Arabidopsis thaliana and those derived from cotton used in Patent Document 1 do not function near 37 ° C., which is the growth temperature of mammalian cells. Examples of the rice-derived TIR1 family protein genes include TIR1 gene, AFB1 gene, AFB2 gene, AFB3 gene, FBX14 gene, and AFB5 gene, and TIR1 gene is particularly preferable. More specifically, accession numbers registered in NCBI (National Center for Biotechnology Information) are registered. NM_001059194 (GeneID: 4335696), Os04g0395600 or the accession No. registered in the same database. The genes EAY93933 and OsI — 15707 are preferred.
前記イネ由来ＴＩＲ１ファミリー遺伝子は、例えば、イネから抽出した天然のＤＮＡでもよいし、遺伝子工学によって合成したＤＮＡであってもよい。また、前記ＴＩＲ１ファミリー遺伝子は、例えば、エキソンとイントロンを含むＤＮＡでもよいし、エキソンからなるｃＤＮＡであってもよい。前記ＴＩＲ１ファミリー遺伝子は、例えば、ゲノムＤＮＡにおける全長配列又はｃＤＮＡにおける全長配列であってもよい。また、前記ＴＩＲ１ファミリー遺伝子は、発現したタンパク質が、ＴＩＲ１ファミリータンパク質として機能する範囲において、ゲノムＤＮＡにおける部分配列又はｃＤＮＡにおける部分配列であってもよい。本発明において、「ＴＩＲ１ファミリータンパク質として機能する」とは、例えば、オーキシン類の存在下で、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識することを意味する。イネ由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質がＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識できれば、前述のようにＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を分解できるからである。この際、本発明のタンパク質分解誘導性哺乳類細胞においては、イネ由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質が、他のサブユニット（Ｓｋｐ１タンパク質、Ｃｕｌｌｉｎタンパク質及びＲｂｘ１タンパク質）とともに、ＳＣＦ複合体（Ｅ３ユビキチン化酵素複合体）を形成していると推測される。 The rice-derived TIR1 family gene may be, for example, natural DNA extracted from rice or DNA synthesized by genetic engineering. The TIR1 family gene may be, for example, DNA containing exons and introns, or may be cDNA consisting of exons. The TIR1 family gene may be, for example, a full-length sequence in genomic DNA or a full-length sequence in cDNA. The TIR1 family gene may be a partial sequence in genomic DNA or a partial sequence in cDNA as long as the expressed protein functions as a TIR1 family protein. In the present invention, “functions as a TIR1 family protein” means, for example, recognition of an Aux / IAA family protein in the presence of auxins. This is because if the rice-derived TIR1 family protein can recognize the Aux / IAA family protein, the target protein labeled with the Aux / IAA family protein can be degraded as described above. At this time, in the proteolytic-inducible mammalian cell of the present invention, the rice-derived TIR1 family protein contains an SCF complex (E3 ubiquitinase complex) together with other subunits (Skp1 protein, Cullin protein and Rbx1 protein). Presumed to have formed.
本発明のタンパク質分解誘導性哺乳類細胞は、前記イネ由来ＴＩＲ１ファミリー遺伝子の転写を制御するプロモーター配列をさらに有することが好ましい。これによって、より確実にイネ由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質を発現できる。前記プロモーターは、制限されず、例えば、細胞の種類等に応じて適宜決定できる。 The proteolytic-inducible mammalian cell of the present invention preferably further has a promoter sequence that controls transcription of the rice-derived TIR1 family gene. Thereby, rice-derived TIR1 family proteins can be expressed more reliably. The promoter is not limited and can be appropriately determined according to, for example, the type of cell.
本発明において、前記キメラ遺伝子は、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子である。発現した目的タンパク質は、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化されていればよく、その形態は制限されないが、例えば、目的タンパク質とＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質とを含む融合タンパク質であることが好ましい。Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質は、例えば、目的タンパク質のＮ末側及びＣ末側のいずれに付加されてもよい。 In the present invention, the chimeric gene is a chimeric gene that expresses a target protein labeled with an Aux / IAA family protein. The expressed target protein may be labeled with the Aux / IAA family protein, and the form thereof is not limited. For example, it is preferably a fusion protein containing the target protein and the Aux / IAA family protein. The Aux / IAA family protein may be added to either the N-terminal side or the C-terminal side of the target protein, for example.
また、目的遺伝子とＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の位置関係は、制限されず、発現した目的タンパク質が、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化されるように、両遺伝子が機能的に配置されていればよい。具体例として、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子は、前記目的遺伝子の上流（５’側）又は下流（３’側）に隣接して配置されていることが好ましい。目的タンパク質が発現され、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化される限りにおいて、例えば、目的遺伝子の内部に、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子が介在してもよい。 In addition, the positional relationship between the target gene and the Aux / IAA family gene is not limited, as long as both genes are functionally arranged so that the expressed target protein is labeled with the Aux / IAA family protein. Good. As a specific example, the Aux / IAA family gene is preferably arranged adjacent to the upstream (5 'side) or downstream (3' side) of the target gene. As long as the target protein is expressed and labeled with the Aux / IAA family protein, for example, the Aux / IAA family gene may intervene inside the target gene.
前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子は、植物由来のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子であれば、その種類は制限されない。前記植物の種類は、制限されないがシロイヌナズナＩＡＡ１７遺伝子が好ましい。Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の具体例としては、例えば、ＩＡＡ１遺伝子、ＩＡＡ２遺伝子、ＩＡＡ３遺伝子、ＩＡＡ４遺伝子、ＩＡＡ５遺伝子、ＩＡＡ６遺伝子、ＩＡＡ７遺伝子、ＩＡＡ８遺伝子、ＩＡＡ９遺伝子、ＩＡＡ１０遺伝子、ＩＡＡ１１遺伝子、ＩＡＡ１２遺伝子、ＩＡＡ１３遺伝子、ＩＡＡ１４遺伝子、ＩＡＡ１５遺伝子、ＩＡＡ１６遺伝子、ＩＡＡ１７遺伝子、ＩＡＡ１８遺伝子、ＩＡＡ１９遺伝子、ＩＡＡ２０遺伝子、ＩＡＡ２６遺伝子、ＩＡＡ２７遺伝子、ＩＡＡ２８遺伝子、ＩＡＡ２９遺伝子、ＩＡＡ３０遺伝子、ＩＡＡ３１遺伝子、ＩＡＡ３２遺伝子、ＩＡＡ３３遺伝子及びＩＡＡ３４遺伝子等が挙げられる。前記タンパク質分解誘導性哺乳類細胞は、いずれか一種の前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子を有していてもよいし、二種類以上を有していてもよい。例えば、シロイヌナズナ由来のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の配列は、ＴＡＩＲ（ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）に登録されており、各遺伝子のアクセッションナンバーは、次のとおりである。ＩＡＡ１遺伝子（ＡＴ４Ｇ１４５６０）、ＩＡＡ２遺伝子（ＡＴ３Ｇ２３０３０）、ＩＡＡ３遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４２４０）、ＩＡＡ４遺伝子（ＡＴ５Ｇ４３７００）、ＩＡＡ５遺伝子（ＡＴ１Ｇ１５５８０）、ＩＡＡ６遺伝子（ＡＴ１Ｇ５２８３０）、ＩＡＡ７遺伝子（ＡＴ３Ｇ２３０５０）、ＩＡＡ８遺伝子（ＡＴ２Ｇ２２６７０）、ＩＡＡ９遺伝子（ＡＴ５Ｇ６５６７０）、ＩＡＡ１０遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４１００）、ＩＡＡ１１遺伝子（ＡＴ４Ｇ２８６４０）、ＩＡＡ１２遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４５５０）、ＩＡＡ１３遺伝子（ＡＴ２Ｇ３３３１０）、ＩＡＡ１４遺伝子（ＡＴ４Ｇ１４５５０）、ＩＡＡ１５遺伝子（ＡＴ１Ｇ８０３９０）、ＩＡＡ１６遺伝子（ＡＴ３Ｇ０４７３０）、ＩＡＡ１７遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４２５０）、ＩＡＡ１８遺伝子（ＡＴ１Ｇ５１９５０）、ＩＡＡ１９遺伝子（ＡＴ３Ｇ１５５４０）、ＩＡＡ２０遺伝子（ＡＴ２Ｇ４６９９０）、ＩＡＡ２６遺伝子（ＡＴ３Ｇ１６５００）、ＩＡＡ２７遺伝子（ＡＴ４Ｇ２９０８０）、ＩＡＡ２８遺伝子（ＡＴ５Ｇ２５８９０）、ＩＡＡ２９遺伝子（ＡＴ４Ｇ３２２８０）、ＩＡＡ３０遺伝子（ＡＴ３Ｇ６２１００）、ＩＡＡ３１遺伝子（ＡＴ３Ｇ１７６００）、ＩＡＡ３２遺伝子（ＡＴ２Ｇ０１２００）、ＩＡＡ３３遺伝子（ＡＴ５Ｇ５７４２０）及びＩＡＡ３４遺伝子（ＡＴ１Ｇ１５０５０）。 The type of the Aux / IAA family gene is not limited as long as it is a plant-derived Aux / IAA family gene. Although the kind of the plant is not limited, the Arabidopsis thaliana IAA17 gene is preferable. Specific examples of Aux / IAA family genes include, for example, IAA1 gene, IAA2 gene, IAA3 gene, IAA4 gene, IAA5 gene, IAA6 gene, IAA7 gene, IAA8 gene, IAA9 gene, IAA10 gene, IAA11 gene, IAA12 gene, IAA13 Gene, IAA14 gene, IAA15 gene, IAA16 gene, IAA17 gene, IAA18 gene, IAA19 gene, IAA20 gene, IAA26 gene, IAA27 gene, IAA28 gene, IAA29 gene, IAA30 gene, IAA31 gene, IAA32 gene, IAA33 gene and IAA34 gene Is mentioned. The proteolytic inducible mammalian cell may have any one type of the Aux / IAA family gene, or may have two or more types. For example, the sequence of an Aux / IAA family gene derived from Arabidopsis thaliana is registered in TAIR (the Arabidopsis Information Resource), and the accession numbers of the respective genes are as follows. IAA1 gene (AT4G14560), IAA2 gene (AT3G23030), IAA3 gene (AT1G04240), IAA4 gene (AT5G43700), IAA5 gene (AT1G15580), IAA6 gene (AT1G52830), IAA7 gene (AT3G23050), A2G23050, A2G23050, A2G23050 (AT5G65670), IAA10 gene (AT1G04100), IAA11 gene (AT4G28640), IAA12 gene (AT1G04550), IAA13 gene (AT2G33310), IAA14 gene (AT4G14550), IAA15 gene (AT1G80390), IAA0G17AT ), IA 18 genes (AT1G51950), IAA19 gene (AT3G15540), IAA20 gene (AT2G46990), IAA26 gene (AT3G16500), IAA27 gene (AT4G29890), IAA28 gene (AT5G25890), IAA29 gene (AT4G32280), AA31A31A31A31A31) (AT3G17600), IAA32 gene (AT2G01200), IAA33 gene (AT5G57420) and IAA34 gene (AT1G15050).
前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子は、例えば、天然のＤＮＡでもよいし、遺伝子工学によって合成したＤＮＡであってもよい。また、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子は、例えば、エキソンとイントロンを含むＤＮＡでもよいし、エキソンからなるｃＤＮＡであってもよい。前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子は、例えば、ゲノムＤＮＡにおける全長配列又はｃＤＮＡにおける全長配列のいずれでもよい。また、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子は、発現したタンパク質が、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質として機能する範囲において、ゲノムＤＮＡにおける部分配列又はｃＤＮＡにおける部分配列であってもよい。 The Aux / IAA family gene may be, for example, natural DNA or DNA synthesized by genetic engineering. The Aux / IAA family gene may be, for example, DNA containing exons and introns, or may be cDNA consisting of exons. The Aux / IAA family gene may be, for example, either a full-length sequence in genomic DNA or a full-length sequence in cDNA. The Aux / IAA family gene may be a partial sequence in genomic DNA or a partial sequence in cDNA as long as the expressed protein functions as an Aux / IAA family protein.
前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子が前記部分配列の場合、例えば、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインＩＩのＤＮＡ配列が挙げられる。前記ドメインＩＩのアミノ酸配列の具体例は、特開２００８−１８７９５８に記載されている。 When the Aux / IAA family gene is the partial sequence, for example, the DNA sequence of domain II of the Aux / IAA family protein can be mentioned. Specific examples of the amino acid sequence of the domain II are described in JP2008-187958.
本発明のタンパク質分解誘導性哺乳類細胞は、さらに、前記キメラ遺伝子の転写を制御するプロモーター配列を有することが好ましい。これによって、より確実に、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現できる。前記プロモーターは、制限されず、例えば、細胞の種類等に応じて適宜決定できる。 The proteolytic-inducible mammalian cell of the present invention preferably further has a promoter sequence that controls transcription of the chimeric gene. Thereby, the target protein labeled with the Aux / IAA family protein can be expressed more reliably. The promoter is not limited and can be appropriately determined according to, for example, the type of cell.
本発明において、前記目的タンパク質の遺伝子は、哺乳類細胞のゲノムに存在する内在の遺伝子でもよいし、哺乳類細胞に導入された外来の遺伝子であってもよい。また、前記外来遺伝子は、例えば、ゲノムＤＮＡに組み込まれてもよいし、組み込まれていなくてもよい。前者の場合、例えば、外来遺伝子を連結した遺伝子導入ベクター等によって、ゲノムＤＮＡ中に組み込まれた状態である。また、後者の場合、例えば、前記遺伝子導入用ベクター等が、プラスミドとして存在している状態であり、前記遺伝子導入用ベクターにおいて、前記目的遺伝子は、複製起点に機能的に連結されていることが好ましい。 In the present invention, the gene of the target protein may be an endogenous gene present in the genome of a mammalian cell or a foreign gene introduced into the mammalian cell. Moreover, the said foreign gene may be integrated in genomic DNA, for example, and does not need to be integrated. In the former case, for example, it is in a state of being incorporated into genomic DNA by a gene transfer vector or the like in which a foreign gene is linked. In the latter case, for example, the gene introduction vector is present as a plasmid, and in the gene introduction vector, the target gene is functionally linked to the origin of replication. preferable.
本発明において、哺乳類細胞は、Ｓｋｐ１遺伝子、Ｃｕｌｌｉｎ遺伝子、及び、Ｒｂｘ１遺伝子を有することが好ましい。これらの各遺伝子は、哺乳類細胞の内在遺伝子であることが好ましい。本発明のタンパク質分解誘導性哺乳類細胞では、これらの遺伝子から発現したタンパク質（すなわち、Ｓｋｐ１タンパク質、Ｃｕｌｌｉｎタンパク質及びＲｂｘ１タンパク質）と、イネ由来ＴＩＲ１ファミリー遺伝子から発現したＴＩＲ１ファミリータンパク質とから、ＳＣＦ複合体が構成されると推測される。 In the present invention, the mammalian cell preferably has a Skp1 gene, a Cullin gene, and an Rbx1 gene. Each of these genes is preferably an endogenous gene of a mammalian cell. In the proteolytic inducible mammalian cell of the present invention, an SCF complex is produced from proteins expressed from these genes (ie, Skp1 protein, Cullin protein and Rbx1 protein) and TIR1 family proteins expressed from rice-derived TIR1 family genes. Presumed to be composed.
本発明において、哺乳類細胞としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等の細胞等が挙げられる。細胞としては、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＣＦ、ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ細胞、ＤＴ４０等の培養細胞；初代培養細胞；造血幹細胞；Ｂ細胞、Ｔ細胞、白血球、単球・マクロファ−ジ、赤血球、血小板等の血球系細胞、血液細胞；受精卵母細胞；ＥＳ細胞等が挙げられる。また、その他の各種組織細胞等でもよい。 In the present invention, examples of mammalian cells include cells of humans, mice, rats, rabbits, and the like. Examples of the cells include HeLa cells, CHO cells, MCF, HEK293, HepG2, NIH3T3, COS cells, DT40 and the like; primary cultured cells; hematopoietic stem cells; B cells, T cells, leukocytes, monocytes / macrophage Blood cells such as erythrocytes and platelets, blood cells; fertilized oocytes; ES cells and the like. Further, other various tissue cells may be used.
本発明のタンパク質分解誘導性哺乳類細胞の製造方法は、例えば（１）宿主である哺乳類細胞に、イネ由来ＴＩＲ１ファミリー遺伝子を導入する工程、（２）宿主である哺乳類細胞に、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子を導入し、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子を形成する工程によって行うことができる。 The method for producing a proteolytic-inducible mammalian cell of the present invention includes, for example, (1) a step of introducing a rice-derived TIR1 family gene into a mammalian cell as a host, and (2) a plant-derived Aux / IAA into the mammalian cell as a host. This can be carried out by introducing a family gene and forming a chimeric gene that expresses the target protein labeled with the Aux / IAA family protein.
本発明において、前記工程（１）及び工程（２）の順序は制限されず、同時に行ってもよい。前記工程（１）におけるイネ由来ファミリー遺伝子の導入と、前記工程（２）におけるＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の導入とは、例えば、それぞれ別個のベクターを用いて行ってもよいが、前記イネ由来ファミリー遺伝子及び前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子とが挿入された一つのベクターを用いて行うのが好ましい。 In the present invention, the order of the step (1) and the step (2) is not limited and may be performed simultaneously. The introduction of the rice-derived family gene in the step (1) and the introduction of the Aux / IAA family gene in the step (2) may be performed using, for example, separate vectors. And a single vector into which the Aux / IAA family gene is inserted.
本発明において、目的遺伝子は、前述のように、哺乳類細胞のゲノムＤＮＡに存在する内在遺伝子でもよいし、外来遺伝子であってもよい。前記内在遺伝子の場合、前記工程（２）において、例えば、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子を哺乳類細胞に導入し、内在の目的遺伝子に機能的に連結させることによってキメラ遺伝子を形成できる。また、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子と目的遺伝子とを連結させたキメラ遺伝子を形成し、これを哺乳類細胞に導入し、ゲノムとの組換えによりキメラ遺伝子をゲノムに挿入してもよい。 In the present invention, the target gene may be an endogenous gene present in the genomic DNA of a mammalian cell or a foreign gene as described above. In the case of the endogenous gene, in the step (2), for example, an Aux / IAA family gene can be introduced into a mammalian cell and functionally linked to the endogenous target gene to form a chimeric gene. Alternatively, a chimeric gene in which an Aux / IAA family gene and a target gene are linked may be formed, introduced into a mammalian cell, and inserted into the genome by recombination with the genome.
目的遺伝子が外来遺伝子の場合、例えば、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の導入に先立って、外来遺伝子を前記哺乳類細胞に導入してもよい。また、目的遺伝子が外来遺伝子の場合、例えば、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子とともに、哺乳類細胞に導入してもよい。具体的には、予め、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子と目的タンパク質の遺伝子とが機能的に連結したキメラ遺伝子を作製し、これを哺乳類細胞に導入することもできる。 When the target gene is a foreign gene, for example, the foreign gene may be introduced into the mammalian cell prior to the introduction of the Aux / IAA family gene. In addition, when the target gene is a foreign gene, for example, it may be introduced into a mammalian cell together with the Aux / IAA family gene. Specifically, a chimeric gene in which an Aux / IAA family gene and a target protein gene are functionally linked in advance can be prepared and introduced into mammalian cells.
目的遺伝子が外来遺伝子であり、ベクターを用いた組換えによって、ＴＩＲ１ファミリー遺伝子とキメラ遺伝子とを導入する例について説明する。 An example in which the target gene is a foreign gene and a TIR1 family gene and a chimeric gene are introduced by recombination using a vector will be described.
まず、イネ由来ＴＩＲ１遺伝子をベクターに組み込み、ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターを作製する。ベクターの種類は、制限されず、例えば、哺乳類細胞の種類等に応じて適宜決定できる。具体例として、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。前記プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ、ｐＡＣＴ等が挙げられ、前記ウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス発現系等が挙げられる。 First, a rice-derived TIR1 gene is incorporated into a vector to prepare a TIR1 gene introduction vector. The type of vector is not limited, and can be appropriately determined according to, for example, the type of mammalian cell. Specific examples include plasmid vectors and virus vectors. Examples of the plasmid vector include pCMV, pcDNA, and pACT. Examples of the viral vector include an adenovirus expression system.
ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターは、前記ＴＩＲ１ファミリー遺伝子の転写を制御するプロモーター配列を有することが好ましい。前記プロモーターとしては、制限されず、例えば、哺乳類細胞の種類等に応じて適宜決定できる。具体例としては、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＧＡＬ４結合配列等が挙げられる。前記プロモーターは、通常、ＴＩＲ１ファミリー遺伝子の上流（５’側）に機能的に連結することが好ましい。さらに、細胞種特異的、器官特異的プロモーターでもよい。また、プロモーター配列をもたないＴＩＲ１ファミリー遺伝子を、例えば、宿主細胞や宿主動物個体における内在プロモーターの下流に組み込んでも良い。この場合、ＴＩＲ１ファミリー遺伝子を、例えば、特定遺伝子にターゲッティングしてもよいし、ランダムに組み込んでもよい。 The TIR1 gene introduction vector preferably has a promoter sequence that controls transcription of the TIR1 family gene. The promoter is not limited and can be appropriately determined according to, for example, the type of mammalian cell. Specific examples include CMV promoter, SV40 promoter, GAL4 binding sequence and the like. In general, the promoter is preferably operably linked upstream (5 ′ side) of the TIR1 family gene. Further, it may be a cell type-specific or organ-specific promoter. Further, a TIR1 family gene having no promoter sequence may be incorporated downstream of an endogenous promoter in a host cell or host animal individual, for example. In this case, the TIR1 family gene may be targeted to a specific gene, for example, or may be randomly incorporated.
また、哺乳類細胞への導入の有無を確認できることから、ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターは、さらに、選択マーカーコード配列を有してもよい。前記選択マーカーコード配列としては、制限されず、公知の薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、細胞表面レセプターマーカー等のマーカーをコードする配列が挙げられる。前記薬剤耐性マーカーとしては、制限されず、例えば、ネオマイシン耐性マーカー、ピューロマイシン耐性マーカー、ハイグロマイシン耐性マーカー等が挙げられる。前記蛍光タンパク質マーカーとしては、例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＧＦＰ（変異型ＧＦＰ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＧＦＰ）等が挙げられる。また、酵素マーカーとしては、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。これらの選択マーカーコード配列は、その配列にしたがってＰＣＲ等により合成してもよいし、前記選択マーカーコード配列を有する市販のベクターから調製することもできる。なお、ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターと後述するキメラ遺伝子導入用ベクターとを併用する場合、前記ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターにおける選択マーカーと、キメラ遺伝子導入用ベクターにおける選択マーカーは、異なるマーカーであることが好ましい。さらに、ＴＩＲ１ファミリー遺伝子は、例えば、他のタンパク質遺伝子又はタグ配列と機能的に連結させ、前記タンパク質とＴＩＲ１タンパク質とを含むタンパク質（例えば、融合タンパク質）として、また、タグで標識化されたＴＩＲ１タンパク質として、発現させてもよい。 Moreover, since the presence or absence of introduction into mammalian cells can be confirmed, the TIR1 gene introduction vector may further have a selection marker coding sequence. The selection marker coding sequence is not limited, and includes a sequence encoding a marker such as a known drug resistance marker, fluorescent protein marker, cell surface receptor marker and the like. The drug resistance marker is not limited, and examples thereof include a neomycin resistance marker, a puromycin resistance marker, and a hygromycin resistance marker. Examples of the fluorescent protein marker include GFP (Green Fluorescent Protein) and EGFP (mutant GFP). Examples of enzyme markers include luciferase and β-galactosidase. These selectable marker coding sequences may be synthesized by PCR or the like according to the sequence, or prepared from a commercially available vector having the selectable marker coding sequence. When a TIR1 gene introduction vector and a later-described chimeric gene introduction vector are used in combination, the selection marker in the TIR1 gene introduction vector and the selection marker in the chimeric gene introduction vector are preferably different markers. Furthermore, the TIR1 family gene is functionally linked to, for example, another protein gene or a tag sequence, and is a TIR1 protein labeled with a tag as a protein (for example, a fusion protein) containing the protein and the TIR1 protein. As such, it may be expressed.
他方、目的遺伝子及び植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子をベクターに連結して、キメラ遺伝子の導入用ベクターを作製する。キメラ遺伝子とは、前述のように、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現する遺伝子である。前記ベクターにおいて、前記目的遺伝子とＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子との位置は、制限されず、前述のように、標識化タンパク質を発現できる関係であればよい。具体例として、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子は、前記目的遺伝子の上流（５’側）又は下流（３’側）に隣接して配置されてもよく、目的遺伝子の内部に、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子が介在してもよい。 On the other hand, the target gene and the plant-derived Aux / IAA family gene are linked to a vector to prepare a vector for introducing a chimeric gene. As described above, the chimeric gene is a gene that expresses a target protein labeled with an Aux / IAA family protein. In the vector, the position of the target gene and the Aux / IAA family gene is not limited as long as the labeled protein can be expressed as described above. As a specific example, the Aux / IAA family gene may be arranged adjacent to the upstream (5 ′ side) or downstream (3 ′ side) of the target gene, and within the target gene, the Aux / IAA family gene May be interposed.
前記ベクターとしては、制限されず、前述と同様のものが挙げられる。また、キメラ遺伝子導入用ベクターは、前記キメラ遺伝子の転写を制御するプロモーター配列を有することが好ましい。前記プロモーターとしては、前述のようなものが挙げられる。また、真核細胞への導入の有無を確認できることから、キメラ遺伝子導入用ベクターは、さらに、前述のような選択マーカーコード配列を有してもよい。 The vector is not limited and includes the same ones as described above. Moreover, the chimeric gene introduction vector preferably has a promoter sequence that controls transcription of the chimeric gene. Examples of the promoter include those described above. In addition, since the presence or absence of introduction into a eukaryotic cell can be confirmed, the vector for introducing a chimeric gene may further have a selection marker coding sequence as described above.
そして、宿主細胞である哺乳類細胞に、前述のＴＩＲ１遺伝子導入用ベクター、ならびに、キメラ遺伝子導入用ベクターを導入する（工程（１）及び工程（２））。前記両ベクターの導入順序は、制限されない。 Then, the aforementioned TIR1 gene introduction vector and chimeric gene introduction vector are introduced into mammalian cells as host cells (step (1) and step (2)). The order of introducing both vectors is not limited.
ベクターの導入方法は、特に制限されず、例えば、使用するベクターの種類や宿主細胞の種類等に応じて、適宜決定できる。導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクョン法、エレクトロポレーション法が挙げられ、この他にも、レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター等を用いた方法が挙げられる。 The method for introducing the vector is not particularly limited, and can be appropriately determined depending on, for example, the type of vector to be used and the type of host cell. Examples of the introduction method include a calcium phosphate precipitation method, a DEAE dextran transfection method, and an electroporation method. In addition, methods using a retrovirus vector, an adenovirus vector, and the like can be given.
本発明においては、ＴＩＲ１遺伝子とキメラ遺伝子とが挿入された発現ベクターを用いるのが、効率的である。具体的には、ウイルス由来のプロモーターとＩＲＥＳ（ｍＲＮＡ内部のリボソーム結合サイト）を有するベクターに、これらの遺伝子を挿入して使用するのが好ましい。通常このようなｐＩＲＥＳベクターは、ウイルス由来のプロモーターとＩＲＥＳの間に発現させようとする目的遺伝子を挿入して使用するように設計されている。しかし、本発明者は、ウイルス由来のプロモーターとＩＲＥＳとの間にイネ由来のＴＩＲ１ファミリー遺伝子を連結し、その下流に前記キメラ遺伝子を連結してなる発現ベクターを作製することにより、効率良く、かつ迅速に目的タンパク質の分解が誘導されることを見出した（後記実施例２参照）。この発現ベクターのプロモーターとしてはＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等が挙げられるが、ＣＭＶプロモーターが好ましい。 In the present invention, it is efficient to use an expression vector into which a TIR1 gene and a chimeric gene are inserted. Specifically, it is preferable to use these genes inserted into a vector having a virus-derived promoter and IRES (ribosome binding site inside mRNA). Usually, such a pIRES vector is designed to be used by inserting a target gene to be expressed between a virus-derived promoter and the IRES. However, the present inventor efficiently produced an expression vector by linking a rice-derived TIR1 family gene between a virus-derived promoter and IRES, and linking the chimeric gene downstream thereof, and It was found that degradation of the target protein was rapidly induced (see Example 2 below). Examples of the promoter of this expression vector include CMV promoter, SV40 promoter and the like, and CMV promoter is preferable.
また、目的遺伝子がゲノムＤＮＡ内に存在する場合、例えば、目的遺伝子が哺乳類細胞の内在遺伝子である場合や、目的遺伝子が外来遺伝子であるが、すでに哺乳類細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれている場合は、次のようにして製造できる。この場合、キメラ遺伝子導入用ベクターに代えて、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子を挿入したＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子導入用ベクターを使用する。この遺伝子導入用ベクターは、例えば、哺乳類細胞のゲノムＤＮＡに対して、タンパク質発現の際、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で目的タンパク質を標識化できる部位に、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子が組み込まれる構造であることが好ましい。つまり、前記遺伝子導入用ベクターの構造は、ゲノムＤＮＡとの組換えによって、ゲノムＤＮＡ内の目的遺伝子とＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子とが機能的連結して、キメラ遺伝子を形成するものであればよい。このようにＡｕｘ／ＩＡＡファミリーが組み込まれることによって、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリーで標識化された目的タンパク質を発現できる。なお、キメラ遺伝子導入用ベクターは、例えば、ゲノムＤＮＡにおける目的遺伝子の遺伝子座やその配列等から、当業者であれば構築可能である。 In addition, when the target gene is present in the genomic DNA, for example, when the target gene is an endogenous gene of a mammalian cell, or when the target gene is a foreign gene but has already been incorporated into the genomic DNA of a mammalian cell It can be manufactured as follows. In this case, an Aux / IAA family gene introduction vector into which an Aux / IAA family gene is inserted is used instead of the chimeric gene introduction vector. This vector for gene transfer, for example, has a structure in which the Aux / IAA family gene is incorporated at a site where the target protein can be labeled with the Aux / IAA family protein during protein expression of the genomic DNA of mammalian cells. Is preferred. That is, the gene introduction vector may have any structure as long as the target gene in the genomic DNA and the Aux / IAA family gene are functionally linked to form a chimeric gene by recombination with the genomic DNA. By incorporating the Aux / IAA family in this way, a target protein labeled with the Aux / IAA family can be expressed. A chimera gene introduction vector can be constructed by a person skilled in the art from, for example, the locus of a target gene in genomic DNA, its sequence, and the like.
本発明のタンパク質分解誘導性哺乳類細胞にオーキシン類を作用させれば、目的タンパク質の分解が誘導される。その目的タンパク質の分解は、確実でありかつ極めて速やかである。例えば、１５〜３０分でほぼ完全に分解される。 When auxins are allowed to act on the proteolytic-inducible mammalian cells of the present invention, degradation of the target protein is induced. Degradation of the target protein is reliable and extremely rapid. For example, it is almost completely decomposed in 15 to 30 minutes.
目的タンパク質の分解誘導において、オーキシン類の添加量は、制限されず、例えば、オーキシン類の種類に応じて適宜決定できる。具体例としては、１μＭ〜１ｍＭであり、好ましくは２０μＭ〜５００μＭ培地に添加する。 In the induction of target protein degradation, the amount of auxin added is not limited, and can be appropriately determined according to, for example, the type of auxin. Specific examples include 1 μM to 1 mM, preferably 20 μM to 500 μM.
オーキシンとしては、例えば、１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール−３−酢酸等が挙げられる。また、この他にも、前記ＮＡＡ等と同様の生理活性を有する化合物群が挙げられ、例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、４−クロロフェノキシ酢酸、（２，４，５−トリクロロフェノキシ）酢酸、１−ナフタレンアセトアミド、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、４−パラクロロ酢酸等がある。例えば、代謝によってオーキシンの生理活性を有することとなる前躯体も使用できる。例えば、宿主細胞におけるエステラーゼやβ−酸化酵素によりオーキシン活性を有する物質に変換される物質が好ましい。具体例としては、例えば、インドール−３−酢酸メチルエステルやインドール−３−酪酸等が挙げられる。 Examples of auxin include 1-naphthalene acetic acid (NAA) and indole-3-acetic acid. In addition to this, there are compounds having the same physiological activity as NAA and the like, for example, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 4-chlorophenoxyacetic acid, (2,4,5-trichlorophenoxy) acetic acid. 1-naphthaleneacetamide, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 4-parachloroacetic acid and the like. For example, a precursor that has physiological activity of auxin by metabolism can also be used. For example, a substance that is converted into a substance having auxin activity by esterase or β-oxidase in the host cell is preferable. Specific examples include indole-3-acetic acid methyl ester and indole-3-butyric acid.
オーキシン類の添加は、前記細胞を含有する培地に対して行えばよい。 The auxins may be added to the medium containing the cells.
このように、オーキシン類の添加により目的タンパク質の分解が速やかに誘導できるので、オーキシン類を添加しない場合と対比することにより、目的タンパク質の影響を検討することができる。より具体的には、前記細胞にオーキシン類を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、前記オーキシン類を除去して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する方法；前記細胞にオーキシン類を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、オーキシン阻害物質を添加して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する方法等によって検討することができる。 Thus, since the degradation of the target protein can be induced promptly by the addition of auxins, the influence of the target protein can be examined by comparing with the case where auxins are not added. More specifically, a method for suppressing degradation of a newly expressed target protein by adding auxins to the cell to induce degradation of the expressed target protein and then removing the auxin; After the auxins are added to induce the degradation of the expressed target protein, an auxin inhibitor can be added to check the degradation of the newly expressed target protein.
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。 Next, examples of the present invention will be described. However, the present invention is not limited by the following examples.
参考例１
１．出芽酵母株の作製
分解目的のタンパク質をＥＧＦＰとし、ＮＡＡ添加によってＥＧＦＰを分解する出芽酵母株を作製した。なお、使用した出芽酵母のプロモーター配列や遺伝子配列は、ＳＧＤウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／に登録されている。Reference example 1
1. Production of Saccharomyces cerevisiae strain The budding yeast strain | stump | stock which decomposes | disassembles EGFP by adding NAA was made into protein for the objective decomposition | disassembly. The promoter sequence and gene sequence of the budding yeast used can be found on the SGD website http: // www. yeastgenome. org /.
（１）シロイヌナズナＴＩＲ１発現酵母株（ＹＮＫ２）
ｐＲＳ３０６−ＧＡＬプラスミドベクターをＳａｌ１及びＸｈｏ１で切断し、セルフライゲーションさせた。ｐＲＳ３０６−ＧＡＬプラスミドベクターは、文献（Ｌ．Ｄｒｕｒｙ，Ｇ．Ｐｅｒｋｉｎｓ ａｎｄ Ｊ．Ｄｉｆｆｌｅｙ“Ｔｈｅ Ｃｄｃ４／３４／５３ ｐａｔｈｗａｙ ｔａｒｇｅｔｓ Ｃｄｃ６ｐ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｂｕｄｄｉｎｇ ｙｅａｓｔ”ＥＭＢＯ Ｊ １６，５９６６−５９７６，１９９７）に開示されている。これにより、前記プラスミドベクターのマルチクローニングサイトにあるＳａｌＩサイトを除去した。シロイヌナズナのＴＩＲ１遺伝子（ＴＡＩＲ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＴ１Ｇ０４２５０．１）を、下記プライマーセット１を用いたＰＣＲで増幅し（１７８５ｂｐ）、この増幅物を、前記プラスミドベクターのＳｐｅ１−Ｎｏｔ１サイトにクローニングした。得られたベクターを、ｐＭＫ２６という。
＜プライマーセット１＞
Ｆプライマー７（配列番号１）
５’−ＡＧＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＣＡＧＡＡＧＣＧＡＡＴＡＧＣＣＴＴ−３’
Ｒプライマー８（配列番号２）
５’−ＡＴＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＡＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＣＣＧＴＴＡＧＴＡＧＴＡＡＴＧＡ−３’(1) Arabidopsis TIR1-expressing yeast strain (YNK2)
The pRS306-GAL plasmid vector was cut with Sal1 and Xho1 and self-ligated. The pRS306-GAL plasmid vector is described in the literature (L. Dury, G. Perkins and J. Diffley “The Cdc4 / 34/53 pathway targets Cdc6p for proteases in binding yeast”, 1997, 59-59. Yes. Thereby, the SalI site in the multicloning site of the plasmid vector was removed. The TIR1 gene (TAIR accession No. AT1G04250.1) of Arabidopsis thaliana was amplified by PCR using the following primer set 1 (1785 bp), and this amplified product was cloned into the Spe1-Not1 site of the plasmid vector. The obtained vector is called pMK26.
<Primer set 1>
F primer 7 (SEQ ID NO: 1)
5′-AGCTAGACTAGTATGCAGAAGCGAATACCCTT-3 ′
R primer 8 (SEQ ID NO: 2)
5′-ATCGATGCCGCCCGCAGATCTGCTAGTCGAACTAATCCGTTAGTAGTAATGA-3 ′
ｐＹＭ１８プラスミドベクターからＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩ断片を切断して、９Ｍｙｃタグ部分（４３５ｂｐ）を切り出し、これを、前記ベクターｐＭＫ２６のＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩサイトにクローニングした。ｐＹＭ１８プラスミドベクターは、文献（Ｃ．Ｊａｎｋｅ，Ｍ．Ｍａｇｉｅｒａ，Ｎ．Ｒａｔｈｆｅｌｄｅｒ，Ｃ．Ｔａｘｉｓ，Ｓ．Ｒｅｂｅｒ，Ｈ．Ｍａｅｋａｗａ，Ａ．Ｍｏｒｅｎｏ−Ｂｏｒｃｈａｒｔ，Ｇ．Ｄｏｅｎｇｅｓ，Ｅ．Ｓｃｈｗｏｂ，Ｅ．Ｓｃｈｉｅｂｅｌ，ａｎｄＭ．Ｋｎｏｐ．“Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｔａｇｇｉｎｇ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｓ：ｎｅｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｍｏｒｅ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ．”Ｙｅａｓｔ ２１，９７４−９６２，２００４）に開示されている。得られたベクターをｐＭＫ２７という。このベクターｐＭＫ２７を、ＵＲＡ３マーカー内部にあるＳｔｕ１で切断して、出芽酵母野生株Ｗ３０３−１ａにトランスフォーメーションし、相同組換えによって、前記プラスミドベクターを出芽酵母ゲノム上のＵＲＡ３部位に挿入した。得られた組換え体を、シロイヌナズナＴＩＲ１発現株「ＹＮＫ２」とした。なお、ＹＮＫ２において、ＴＩＲ１遺伝子の上流には、ベクター由来のＧＡＬ１−１０プロモーターが配置されている。 The SalI-BglII fragment was cleaved from the pYM18 plasmid vector to excise the 9Myc tag portion (435 bp) and cloned into the SalI-BglII site of the vector pMK26. The pYM18 plasmid vector is described in the literature (C. Janke, M. Magiera, N. Rathfelder, C. Taxis, S. Reber, H. Maekawa, A. Moreno-Borchart, G. Doenges, E. Schwobel, E. Schiebel, E. Schiebel. Knop. "A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: new fluorescens proteins, more marqueers and promoter subtests4. The obtained vector is called pMK27. This vector pMK27 was cleaved with Stu1 inside the URA3 marker, transformed into the budding yeast wild strain W303-1a, and the plasmid vector was inserted into the URA3 site on the budding yeast genome by homologous recombination. The obtained recombinant was designated as an Arabidopsis TIR1 expression strain “YNK2”. In YNK2, a vector-derived GAL1-10 promoter is arranged upstream of the TIR1 gene.
野生株Ｗ３０３−１ａ及びＹＮＫ２の遺伝型を以下に示す。
Ｗ３０３−１ａ
ＭＡＴａ ａｄｅ２−１ ｕｒａ３−１ ｈｉｓ３−１１，１５ ｔｒｐ１−１ ｌｅｕ２−３，１１２ ｃａｎ１−１００
ＹＮＫ２
ＭＡＴａ ａｄｅ２−１ ｈｉｓ３−１１，１５ ｔｒｐ１−１ ｌｅｕ２−３，１１２ ｃａｎ１−１００
ｕｒａ３−１：ＵＲＡ３−ＧＡＬ１−１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−シロイヌナズナＴＩＲ１（ｐＭＫ２７ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）The genotypes of wild strains W303-1a and YNK2 are shown below.
W303-1a
MATa ade2-1 ura3-1 his3-11, 15 trp1-1 leu2-3, 112 can1-100
YNK2
MATa ade2-1 his3-11, 15 trp1-1 leu2-3, 112 can1-100
ura3-1: URA3-GAL1-10 promoter-Arabidopsis TIR1 (pMK27 integrated)
ワタＴＩＲ１発現酵母株作製法
ワタＴＩＲ１遺伝子（ＮＣＢＩ、アクセッションＮｏ．ＤＱ６５９６２１）は下記のプライマーセットでワタｃＤＮＡライブラリーよりＰＣＲ増幅した。増幅した産物はｐＭＫ２６をＳｐｅＩとＳａｌＩで処理してシロイヌナズナＴＩＲ１遺伝子を取り除いた部分にクローニングした。
Ｆプライマー
５’−ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＣＡＴＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＣＧＴＴＴＴＣＧ−３（配列番号３）
Ｒプライマー
５’−ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴＧＡＡＡＧＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＡＡＴＣＴＴＣ−３’
（配列番号４）
シロイヌナズナＴＩＲ１を導入した際と同様の手法で出芽酵母にワタＴＩＲ１を導入した。Cotton TIR1-expressing yeast strain preparation Cotton TIR1 gene (NCBI, Accession No. DQ659621) was PCR amplified from a cotton cDNA library with the following primer set. The amplified product was cloned into a portion where pMK26 was treated with SpeI and SalI to remove the Arabidopsis TIR1 gene.
F primer 5'-GGGATAGTAGTATGCATAAGAAAATGGCGTTTTCG-3 (SEQ ID NO: 3)
R primer 5'-CCCGTCGAACTGAAAGCCCTCAATCCGAAATCTTC-3 '
(SEQ ID NO: 4)
Cotton TIR1 was introduced into budding yeast in the same manner as when Arabidopsis TIR1 was introduced.
＜ワタＴＩＲ１発現酵母株の遺伝型＞
ＭＡＴａ ａｄｅ２−１ ｈｉｓ３−１１，１５ ｔｒｐ１−１ ｌｅｕ２−３，１１２ ｃａｎ１−１００ ｕｒａ３−１：ＵＲＡ３−ＧＡＬ１−１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ワタＴＩＲ１<Genotype of cotton TIR1-expressing yeast strain>
MATa ade2-1 his3-11, 15 trp1-1 leu2-3, 112 can1-100 ura3-1: URA3-GAL1-10 promoter-cotta TIR1
イネＴＩＲ１発現酵母株作製法
イネＴＩＲ１遺伝子（ＮＣＢＩ、アクセッションＮｏ．ＮＭ＿００１０５９１９４）は下記のプライマーセットでイネｃＤＮＡライブラリーよりＰＣＲ増幅した。増幅した産物はｐＭＫ２６をＳｐｅＩとＳａｌＩで処理してシロイヌナズナＴＩＲ１遺伝子を取り除いた部分にクローニングした。
Ｆプライマー
５’−ＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＡＣＴＴＣＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＴ−３（配列番号５）
Ｒプライマー
５’−ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＧＡＴＴＴＴＡＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＧＴＧ−３’（配列番号６）
シロイヌナズナＴＩＲ１を導入した際と同様の手法で出芽酵母にイネＴＩＲ１を導入した。Rice TIR1-expressing yeast strain preparation The rice TIR1 gene (NCBI, Accession No. NM_001059194) was PCR amplified from a rice cDNA library with the following primer set. The amplified product was cloned into a portion where pMK26 was treated with SpeI and SalI to remove the Arabidopsis TIR1 gene.
F primer 5'-GGGGATCCCATGACGTACTCTCCCGGAGGAGGGT-3 (SEQ ID NO: 5)
R primer 5′-CCCGTCGACTAGGGATTTAACAAAAATTTGGGTG-3 ′ (SEQ ID NO: 6)
Rice TIR1 was introduced into Saccharomyces cerevisiae in the same manner as when Arabidopsis TIR1 was introduced.
＜イネＴＩＲ１発現酵母株の遺伝型＞
ＭＡＴａ ａｄｅ２−１ ｈｉｓ３−１１，１５ ｔｒｐ１−１ ｌｅｕ２−３，１１２ ｃａｎ１−１００ ｕｒａ３−１：ＵＲＡ３−ＧＡＬ１−１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−イネＴＩＲ１<Genetic type of rice TIR1-expressing yeast strain>
MATa ade2-1 his3-11, 15 trp1-1 leu2-3, 112 can1-100 ura3-1: URA3-GAL1-10 promoter-rice TIR1
参考例２
１．出芽酵母株の作製
（１）内在性蛋白質Ｍｃｍ４のＡｕｘｉｎ ｄｅｇｒｏｎ（ｍｃｍ４−ａｄ）株
内在性タンパク質Ｍｃｍ４を分解目的タンパク質とし、ＮＡＡ添加によりこれを分解する株を作製した。内在性タンパク質Ｍｃｍ４は、ＤＮＡ複製に関与するタンパク質である。Reference example 2
1. Production of Saccharomyces cerevisiae strain (1) Auxin degron (mcm4-ad) strain of endogenous protein Mcm4 A strain was prepared by using endogenous protein Mcm4 as a target protein for degradation and adding NAA. The endogenous protein Mcm4 is a protein involved in DNA replication.
まず、ＩＡＡ１７のコード領域に５ｘＧＡリンカー（５ｘＧｌｙ−Ａｌａ）を付加するために、下記プライマーセット７を用いて、ＩＡＡ１７を鋳型としたＰＣＲによって、ＩＡＡ１７のコード領域の増幅を行った（７４６ｂｐ）。下記プライマーセット７のＲプライマーは、５ｘＧＡリンカーを有しているため、得られた増幅物のＣ’末端側には、５ｘＧＡリンカーが付加している。なお、下記配列番号８において、下線部がリンカーである。
＜プライマーセット６＞
Ｆプライマー１４２（配列番号７）
５’−ＡＣＧＴＡＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＧＣ−３’
Ｒプライマー１７２（配列番号８）
５’−ＡＴＡＣＧＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＣＡＡＧＴＣＣＴＴＡＧＡＴＴＣＡＡＴＴＴＧＡＡＧＴＴＣＴＴＣＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＣＴＣ−３’First, in order to add a 5 × GA linker (5 × Gly-Ala) to the coding region of IAA17, the coding region of IAA17 was amplified by PCR using IAA17 as a template using the following primer set 7 (746 bp). Since the R primer of the following primer set 7 has a 5 × GA linker, a 5 × GA linker is added to the C ′ terminal side of the obtained amplification product. In the following SEQ ID NO: 8, the underlined portion is a linker.
<Primer set 6>
F primer 142 (SEQ ID NO: 7)
5'-ACGTATGAATTCTGTATATGAGATATAGTTGATTGTATGC-3 '
R primer 172 (SEQ ID NO: 8)
5'-ATACGTGTACCCGAGCTCCT GGCACCCGCTCCAGCGCCTGCACCAGCTC CCAAGTCCTTAGATTCAATTTTGAAGTTCTTCCTCGAGAGCTCTGCTCTTGCACTTCTC-3 '
このリンカーが付加された断片を、ｐＫＬ１８７プラスミドベクター（Ａ．Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｄｉａｚ，Ｍ．Ｋａｎｅｍａｋｉ，Ｖ．Ｍａｒｃｈｅｓｉ ａｎｄ Ｋ．Ｌａｂｉｂ“Ｒａｐｉｄ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｂｕｄｄｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｆｕｓｉｏｎ ｔｏ ａ ｈｅａｔ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｅｇｒｏｎ．”Ｓｃｉ ＳＴＫＥ ２２３，ＰＬ８，２００４）のＥｃｏＲ１−Ｋｐｎ１に挿入することにより、１ステップＰＣＲでＩＡＡ１７のコード配列を導入するプラスミドベクターを作製した。このベクターをｐＭＫ３８という。このベクターｐＭＫ３８を、下記プライマーセット８を用いてＰＣＲにより増幅した。そして、得られた増幅物を用いて、直接、前記（１）で得られたＴＩＲ１発現株ＹＮＫ２にトランスフォーメーションし、相同組換えによって、出芽酵母ゲノム上のＭＣＭ４ ５’部分に、ＣＵＰ１プロモーター−ＩＡＡ１７を導入した。この組換え体を、「ＹＮＫ４」という。なお、ゲノムへの挿入はＰＣＲにより確認した。 The fragment to which this linker was added was designated as a pKL187 plasmid vector (A. Sanchez-Diaz, M. Kanemaki, V. Marchesi and K. Labib “Rapid depletion of budging yeast 2 b) , PL8, 2004) was inserted into EcoR1-Kpn1 to prepare a plasmid vector into which the coding sequence of IAA17 was introduced by one-step PCR. This vector is called pMK38. This vector pMK38 was amplified by PCR using the following primer set 8. Then, using the obtained amplification product, the TIR1 expression strain YNK2 obtained in (1) above was directly transformed, and by homologous recombination, the MCM4 5 ′ portion on the budding yeast genome was transferred to the CUP1 promoter-IAA17. Was introduced. This recombinant is referred to as “YNK4”. The insertion into the genome was confirmed by PCR.
＜プライマーセット７＞
Ｆプライマー１８０（配列番号９）
５’−ＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＴＡＣＴＡＡＡＴＡＡＧＡＣＡＡＣＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧＴＴＡＴＡＴＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧ−３’
Ｒプライマー１８１（配列番号１０）
５’−ＧＡＧＣＴＧＧＡＧＴＴＡＴＴＡＴＣＣＴＣＴＴＴＴＧＴＴＧＧＡＧＡＧＣＴＡＧＡＣＴＧＴＴＧＡＧＡＣＡＴＧＧＣＡＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＴＧ−３’<Primer set 7>
F primer 180 (SEQ ID NO: 9)
5'-TTCTTTAAGAACACATCTTCAATACTAATAAGACAACCCATCTTCAGTTATATATAGGCGCGCCAGATCTG-3 '
R primer 181 (SEQ ID NO: 10)
5'-GAGCTGGAGGTTATTATCCCTCTTTTGTTGGAGAGCTAGACTGTTTGAGACATGGCACCCGCTCCAGCGCCTG-3 '
ＹＮＫ４の遺伝型を以下に示す。
ＹＮＫ４
ＭＡＴａ ａｄｅ２−１ ｈｉｓ３−１１，１５ ｔｒｐ１−１ ｌｅｕ２−３，１１２ ｃａｎ１−１００
ｕｒａ３−１：ＵＲＡ３−ＧＡＬ１−１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−シロイヌナズナＴＩＲ１（ｐＭＫ２７ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）
ｍｃｍ４：ＣＵＰ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｍｃｍ４−ａｄ（ｋａｎＭＸ）The genotype of YNK4 is shown below.
YNK4
MATa ade2-1 his3-11, 15 trp1-1 leu2-3, 112 can1-100
ura3-1: URA3-GAL1-10 promoter-Arabidopsis TIR1 (pMK27 integrated)
mcm4: CUP1 promoter-mcm4-ad (kanMX)
前記シロイヌナズナ由来のＴＩＲ１遺伝子に代えて、ワタＴＩＲ１遺伝子又はイネＴＩＲ１遺伝子を導入した出芽酵母株を作製した。 A budding yeast strain into which a cotton TIR1 gene or a rice TIR1 gene was introduced instead of the TIR1 gene derived from Arabidopsis thaliana was prepared.
２．出芽酵母株の生育実験
ＹＮＫ４株を、ＮＡＡ未添加のＹＰＤＣｕ寒天培地（２％ペプトン、１％酵母粉末、２％グルコース、０．１ｍＭ ＣｕＳＯ４、２％寒天）及び、ＮＡＡ添加のＹＰＧＮＡＡ寒天培地（２％ペプトン、１％酵母粉末、２％ガラクトース、０．１ｍＭ ＮＡＡ、２％寒天）に、プレート１枚あたりの細胞数が所定の数（５×１０５、５×１０４、５×１０３、５×１０２、５×１０個）となるようにスポットし、２４℃で２日間培養した。そして、細胞の成育を観察した。コントロールとして、出芽酵母野生株Ｗ３０３−１ａ及び参考例１で作製したＹＮＫ２株についても同様に生育を観察した。 2. Growth Experiment of Saccharomyces cerevisiae strain YNK4 strain was added to YPDCu agar medium (2% peptone, 1% yeast powder, 2% glucose, 0.1 mM CuSO 4 , 2% agar) without NAA and YPGNAA agar medium with NAA ( 2% peptone, 1% yeast powder, 2% galactose, 0.1 mM NAA, 2% agar) with a predetermined number of cells per plate (5 × 10 5 , 5 × 10 4 , 5 × 10 3 5 × 10 2 , 5 × 10), and cultured at 24 ° C. for 2 days. Then, cell growth was observed. As controls, growth was also observed for the budding yeast wild strain W303-1a and the YNK2 strain prepared in Reference Example 1.
これらの結果を図１に示す。同図において、２４℃、３０℃及び３７℃における培養結果であり、各株について、左から、スポットした細胞数が５×１０５、５×１０４、５×１０３、５×１０２、５×１０個である。
これらの結果から、シロイヌナズナＴＩＲ１遺伝子を用いた場合は、２４℃では目的タンパク質の分解を誘導するが、３０℃以上では良好な誘導はできないことがわかった。一方、ワタもイネも比較的高温下で生育が可能であることから、耐熱性に優れることが考えられるが、ワタＴＩＲ１遺伝子を用いた場合は３０℃以上で良好な目的タンパク質の分解を誘導できないことがわかった。
これに対し、イネＴＩＲ１遺伝子を用いた場合には、３０℃及び３７℃で良好な目的タンパク質分解誘導が得られることが判明した。These results are shown in FIG. In the same figure, it is a culture result in 24 degreeC, 30 degreeC, and 37 degreeC, and the cell number spotted from the left about each strain | stump | stock is 5x105, 5x104, 5x103, 5x102, 5x10 piece It is.
From these results, it was found that when the Arabidopsis thaliana TIR1 gene was used, degradation of the target protein was induced at 24 ° C., but good induction was not possible at 30 ° C. or higher. On the other hand, since both cotton and rice can grow at relatively high temperatures, it is considered to be excellent in heat resistance. However, when the cotton TIR1 gene is used, it is not possible to induce satisfactory degradation of the target protein at 30 ° C. or higher. I understood it.
On the other hand, when the rice TIR1 gene was used, it was found that good induction of proteolysis was obtained at 30 ° C. and 37 ° C.
実施例１
哺乳類細胞株の作製
（１）発現ベクターの作製及び形質転換
ｐＩＲＥＳ２−ＡｃＧＦＰ１（クローンテック社）のＥＧＦＰ部分を制限酵素ＢｓｔＸＩとＮｏｔＩで処理することで取り除き、この部分に下記プライマーセットを用いて、ｐＭＫ４２（ＥＧＦＰ−ＩＡＡ１７を含む自作のプラスミド）を鋳型として増幅したＥＧＦＰ−ＩＡＡ１７を挿入した（増幅された配列は配列番号１３に示す）。これにより、ＩＲＥＳの下流にＥＧＦＰ−ＩＡＡ１７がクローニングされたことになる。このプラスミドを制限酵素ＸｈｏＩとＳｍａＩで処理してここにＣ末端に９Ｍｙｃタグを付加したイネＴＩＲ１を挿入した。この処理により、イネＴＩＲ１はＣＭＶプロモーターとＩＲＥＳの間に挿入されたことになり、このプラスミドをｐＮＨＫ６０とした。ｐＮＨＫ６０は増殖中のＣＯＳ１、ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いて一過性発現導入した。図４に示したＨＥＫ２９３細胞は、ｐＮＨＫ６０を上記の条件で導入後、培地にＧ４１８を添加して安定発現株を樹立したものである。Example 1
Preparation of mammalian cell line (1) Preparation and transformation of expression vector The EGFP part of pIRES2-AcGFP1 (Clontech) was removed by treatment with restriction enzymes BstXI and NotI, and pMK42 was used for this part using the following primer set. EGFP-IAA17 amplified using (a self-made plasmid containing EGFP-IAA17) as a template was inserted (the amplified sequence is shown in SEQ ID NO: 13). Thereby, EGFP-IAA17 was cloned downstream of IRES. This plasmid was treated with restriction enzymes XhoI and SmaI, and rice TIR1 with a 9Myc tag added to the C-terminus was inserted into this plasmid. By this treatment, rice TIR1 was inserted between the CMV promoter and IRES, and this plasmid was designated as pNHK60. pNHK60 was transiently introduced into proliferating COS1, CHO, NIH3T3 cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). HEK293 cells shown in FIG. 4 are obtained by establishing a stable expression strain by introducing pNHK60 under the above conditions and then adding G418 to the medium.
＜プライマーセット８＞
Ｆ−プライマー
５’−ＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＣＡＣＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡ−３’（配列番号１１）
Ｒ−プライマー
５’−ＧＧＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧ−３’（配列番号１２）<Primer set 8>
F-primer 5′-CAGTGAATTCCCACAACCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ′ (SEQ ID NO: 11)
R-primer 5′-GGTCATGCGGCCCGCTGGGGTACCTTAAACCTTACG-3 ′ (SEQ ID NO: 12)
（２）哺乳類細胞株による目的タンパク質の分解誘導
一過性発現の実験においては、培地に５００μＭのＩＡＡもしくはＮＡＡを添加し、五時間後細胞を回収して抽出液調整をおこなった。図４に示した安定発現株を用いた実験では５００μＭのＩＡＡを添加後、図に示した時間に細胞を回収して抽出液調製をおこなった。因子の検出はウエスタンブロット法によりおこなった。(2) Degradation induction of target protein by mammalian cell line In the transient expression experiment, 500 μM IAA or NAA was added to the medium, and after 5 hours, the cells were collected and the extract was adjusted. In the experiment using the stable expression strain shown in FIG. 4, after adding 500 μM IAA, the cells were collected at the time shown in the figure to prepare the extract. Factors were detected by Western blotting.
（３）ウェスタンブロット
抽出したタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ニトロセルロースメンブレンに転写した。抗Ｍｙｃ抗体（マウスモノクローナル９Ｅ１０）、抗ＧＦＰ抗体（マウスモノクローナル ９Ｅ１）を用いて、ウェスタンブロッティングにより、各種タンパク質の検出を行った。なお、二次抗体として、ＨＲＰ標識されたＩｇＧ抗体を使用した。泳動コントロールとして、ポンソー染色により、全抽出タンパク質を検出した。シロイヌナズナＴＩＲ１遺伝子には９Ｍｙｃタグを付加していることから、前記Ｍｙｃ抗体とのウェスタンブロッティングにより、ＴＩＲ１タンパク質を検出できる。また、複合タンパク質における分解対象タンパク質ＥＧＦＰは、ＧＦＰ抗体とのウェスタンブロッティングにより検出できる。(3) Western blot The extracted protein was separated by SDS-PAGE and then transferred to a nitrocellulose membrane. Various proteins were detected by Western blotting using an anti-Myc antibody (mouse monoclonal 9E10) and an anti-GFP antibody (mouse monoclonal 9E1). As a secondary antibody, an HRP-labeled IgG antibody was used. As an electrophoresis control, the total extracted protein was detected by Ponceau staining. Since a 9 Myc tag is added to the Arabidopsis thaliana TIR1 gene, TIR1 protein can be detected by Western blotting with the Myc antibody. The protein EGFP to be decomposed in the complex protein can be detected by Western blotting with a GFP antibody.
実施例２
実施例１と同様にして、ウイルス由来のプロモーターとＩＲＥＳとの間にイネ由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子を連結し、その下流に標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子を連結してなる発現ベクターを導入した場合（図５中のＡ）と、ウイルス由来のプロモーターとＩＲＥＳとの間に標識された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子を連結し、その下流にイネ由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質遺伝子を連結した場合（図５中のＢ）との、標識目的タンパク質の分解誘導を比較した。すなわち、図５のＡもしくはＢのＤＮＡコンストラクトを含むプラスミドを、サル由来ＣＯＳ１細胞に一過性トランスフェクションし、一日後オーキシン（５００μＭ ＮＡＡもしくはＩＡＡ）を含む培地で５時間培養した。タンパク質サンプルを抽出した後、ＧＦＰ抗体を用いて、ウェスタンブロット法により発現しているＧＦＰ−ａｉｄ−ＮＬＳマーカータンパク質の検出を行った。その結果、Ａのコンストラクトでは、効率よいマーカータンパク質除去が行われているが、Ｂのコンストラクトでは目立った除去は確認されなかった（図５）。
通常ｐＩＲＥＳベクターは、ウイルス由来のプロモーターとＩＲＥＳとの間に発現させようとする目的遺伝子を挿入して使用するように没汁されている。上記の結果は、ｐＩＲＥＳベクターの常識を全く覆すものである。Example 2
In the same manner as in Example 1, an expression vector comprising a rice-derived TIR1 family protein gene linked between a virus-derived promoter and an IRES, and a chimeric gene expressing a target protein labeled downstream thereof is linked. When introduced (A in FIG. 5) and when a chimeric gene expressing a target protein labeled is linked between a virus-derived promoter and IRES, and a rice-derived TIR1 family protein gene is linked downstream thereof The degradation induction of the labeled target protein was compared with (B in FIG. 5). That is, the plasmid containing the DNA construct of A or B in FIG. 5 was transiently transfected into monkey-derived COS1 cells, and one day later, the cells were cultured in a medium containing auxin (500 μM NAA or IAA) for 5 hours. After extracting the protein sample, GFP-aid-NLS marker protein expressed by Western blotting was detected using GFP antibody. As a result, the marker protein was efficiently removed in the A construct, but no conspicuous removal was confirmed in the B construct (FIG. 5).
Usually, the pIRES vector is submerged so that the target gene to be expressed is inserted between the virus-derived promoter and the IRES. The above results completely overturn the common sense of pIRES vectors.
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