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JP5599822B2 - アルブミンバインダーａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−を有するｆｇｆ２１誘導体及びそれらの使用 - Google Patents

アルブミンバインダーａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−を有するｆｇｆ２１誘導体及びそれらの使用 Download PDF

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Description

本発明は、線維芽細胞増殖因子21 (FGF21)、より特には、式A-B-C-D-E-のアルブミンバインダーが共有結合しているFGF21化合物の誘導体に関する。本発明は、また、特に、糖尿病、脂質異常症、肥満、循環器疾患、メタボリック・シンドローム、及び／または非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD)の治療のための、新規FGF21類似体、並びにこれらのFGF21誘導体及び類似体の製薬学的用途に関する。
本発明の誘導体は、例えば、より長期間、低血中グルコース濃度を維持することができ、FGF21のin vivoでの半減期を増加することができ、及び／またはFGF21のより低いクリアランスをもたらすなどによって、長引かせられる。本発明の誘導体は、好ましくは、さらに改良された酸化安定性を有する。
線維芽細胞増殖因子は、発達及び成体組織で発現しているポリペプチドである。それらは、例えば代謝調節及び細胞分化を含む複数の生理学的機構に関与する。全体のファミリーで20を超える繊維芽細胞増殖因子が存在する（FGFファミリー）。FGF19、FGF21及びFGF23を含むFGFファミリーの3つのメンバーは、代謝調節に関与する内分泌因子としてのサブファミリー機能を形成する。
線維芽細胞増殖因子21つまりFGF-21（本明細書において手短にFGF21）は、肝臓に優先的に発現し、ホルモン様代謝効果を与えることが示されている。
例えば、FGF21は、トランスジェニックマウスで過剰発現させると、食餌誘導性肥満からマウスを保護するために、マウス脂肪細胞でのグルコースの取込を活性化させ、糖尿病のげっ歯類に投与すると、血中グルコース及びトリグリセリド濃度を低下させることが示されている(Kharitonenkov et al., J. Clin. Invest. (2005), 115:1627-1635)。
血中グルコース及びトリグリセリドに対するFGF21による低下作用は糖尿病の猿においても示されている。FGF21は、また、糖尿病の猿において有意にLDLを減少させ、かつHDLを増加させることが可能である(Kharitonenkov et al., Endocrinology (2007), 148(2):774-81)。
食餌誘導性肥満マウス及びob/obマウスでは、FGF21は、さらに、主にはエネルギー消費の増加及び肥満の減少により、体重を低下させることが示された（Coskun et al., Endocrinology (2008), 149(12): 6018-6027)。
これらの結果に基づいて、FGF21は、糖尿病、脂質異常症、肥満、循環器疾患、及びメタボリック・シンドロームを治療する可能性を有する医薬品として示唆されてきた。メタボリック・シンドロームには、インスリン抵抗性、脂質異常症、内臓型肥満及び高血圧のような態様が含まれ、例えばGrundy et al., Circulation (2004), (109): 433-438におけるメタボリック・シンドロームの定義を参照されたい。
FGF21は、さらに、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD)を治療する可能性を有する医薬品として使用され得、上記に引用したCoskun et al. Endocrinology, 2008、及び印刷物に先立ち2008年10月7日に電子出版されたXu et al., Diabetes (2009）, 58(1):250-9を参照されたい。NAFLDは、印刷物に先立ち2008年12月12日に電子出版されたErickson, J. Lipid Res. (2008)によって規定されている。
Yieらは、レセプターの相互作用及び活性化におけるFGF21のN末及びC末の役割を研究した。FEBS Letters, 583 (2009), 19-24を参照されたい。
WO 2003/011213 A2は、FGF21前駆体アミノ酸配列に少なくとも95％の同一性を有するFGF21化合物の使用により、I型及びII型糖尿病または肥満の治療方法を開示する。
WO 2003/061712 A1は、改良された製薬学的特性、例えばA145E、を有するFGF21の突然変異タンパク質を開示する。
WO 2005/091944 A2は、FGF21, FGF21-K59C及びFGF21-K122Cのペグ化した誘導体を開示する。
WO 2005/113606 A2は、IgG4免疫グロブリンのFC部分またはヒト血清アルブミンを有する様々なFGF21融合タンパク質を開示する。
WO 2006/028595 A2は、さらに、酵母で発現すると、O-グリコシル化の能力が低下したFGF21の突然変異タンパク質、例えば、L118C-A134C-S167Aを開示する。
WO 2006/028714 A1は、酵母で発現すると、タンパク質分解に対して感受性が低下したFGF21のさらなる突然変異タンパク質、例えばL153Iを開示する。
WO 2006/065582 A2は、アミド分解が低下したFGF21の一層さらなる突然変異タンパク質、例えば、des-HPIP-L118C-A134C-N121Dを開示する。
WO 2006/078463 A2は、天然の成熟FGF21またはその特定の変異体の使用による循環器疾患の治療方法を開示する。
WO 2008/121563は、非天然のがコードされたアミノ酸並びにその誘導体を含むように改変されたFGF21ポリペプチドを開示する。
WO 2003/011213 A2 WO 2003/061712 A1 WO 2005/091944 A2 WO 2005/113606 A2 WO 2006/028595 A2 WO 2006/028714 A1 WO 2006/065582 A2 WO 2006/078463 A2 WO 2008/121563 US2001012628 A1 WO 2006/065582 WO 2006/050247 WO 2003/061712 WO 2005/091944 WO 2006/028595 WO 2006/028714 WO 2006/065582 WO 2008/121563 WO 2005/012347
Kharitonenkov et al., J. Clin. Invest. (2005), 115:1627-1635 Kharitonenkov et al., Endocrinology (2007), 148(2):774-81 Coskun et al., Endocrinology (2008), 149(12): 6018-6027 Grundy et al., Circulation (2004), (109): 433-438 Xu et al., Diabetes (2009, 58(1):250-9 Erickson, J. Lipid Res. (2008) FEBS Letters, 583 (2009), 19-24 Needleman, S. B. 及び Wunsch, C. D. (1970) J. MoI. Biol. 48, 443-453 Myers 及び W. Miller in Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17 W. R. Pearson 及び D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448 W. R. Pearson (1990) "Rapid 及び Sensitive Sequence Comparison with FASTP 及び FASTA," Methods in Enzymology 183:63-98 Nishimura et al. in Biochim. Biophys. Acta 1492(1):203-206 (2000) Protein Purification. Principles and Practice Series: Springer Advanced Texts in Chemistry Scopes, Robert K. 3rd ed., 1994 Patten, SMV et al., Journal of biological chemistry, 274, 10268-10276, 1999 FGF21 N- 及び C-termini play different roles in receptor interaction and activation, FEBS Letters 583 (2009) 19-24 Micanovic R. et al.: Different roles of N- and C- termini in the functional activity of FGF21. 1310689116140_0.'); 2009 May; 219(2):227-34
簡潔には、本発明は以下の請求項1において規定されるとおりである。
本発明は、FGF21化合物に共有結合したアルブミンバインダーを有するFGF21化合物の誘導体に関し、ここで、アルブミンバインダーは式 A-B-C-D-E-を有し、ここで、成分Aは脂肪酸またはその誘導体である。本発明は、また、特に、糖尿病、脂質異常症、肥満、循環器疾患、メタボリック・シンドローム、及び／または非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD)の治療のための、新規FGF21類似体、並びに医薬組成物中の本発明の誘導体及び類似体の使用に関する。
本発明の誘導体は、例えば、より長期間、低血中グルコース濃度を維持することができ、FGF21のin vivoでの半減期を増加することができ、及び／またはFGF21のより低いクリアランスをもたらすなどによって、長引かせられる。長引かせられるFGF21誘導体は、満足のいく生物学的活性を保持し、より少ない頻度で投与してもよい。誘導体は好ましくはさらに改良された酸化安定性を有する。
本発明は、式A-B-C-D-E-のアルブミンバインダーが共有結合しているFGF21化合物の誘導体に関し、ここでAは式I、IIまたはIIIの要素であり：
Figure 0005599822
ここで、nは8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18または19であり、*は-B-との結合点であり；
-B- は存在しないか、結合を表すか、あるいは-B1-, -B2-またはそれらの組み合わせから選択され、ここで-B1- は式 IV, V, VIまたはVIIの要素であり：
Figure 0005599822
ここで、*は-B2-または-C-との結合点であり、かつ#はA-または‐B2-との結合点であり;及び-B2-は式 IIX, IXまたはXXVIIIの要素あるいは式 IIX 及び/または式 IX 及び/または式 XXVIIIの最大4つの要素の組み合わせであり：
Figure 0005599822
ここで、bは0, 1または2であり、cは0, 1または2であり、ただしcが0であるときbは1または2であり、cが1または2であるときbは0であり、*は-C-, -B1-または別の-B2-との結合点であり、かつ#はA-, -B1-または別の-B2-との結合点であり；
Figure 0005599822
ここで、dは1または2であり、eは0, 1または2であり、*は-C-または-B1-との結合点であり、かつ#はA-または-B1-との結合点であり;または
#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式 XXVIII)
ここで、uは2, 3または4であり、*は-C-または-B1-との結合点であり、#はA-または-B1-との結合点であり;
-C-は存在しないか、結合を表すか、または式 XまたはXIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、pは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、qは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-D-、-E-またはFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-B-との結合点であり;または
Figure 0005599822
ここで、kは0, 1, 2, 3, 4, 5, 11または23であり、mは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-D-, -E-またはFGF21化合物との結合点であり;かつ#は-B-との結合点であり;
-D-は存在しないか、結合を表すか、あるいは式 XIIまたはXIIIの要素であり:
#-NH-(CH2)r-NH-CO-(CH2)s-* (式 XII)または
#-NH-(CH2)t-* (式 XIII)
ここで、rは2, 3, 4または5であり、sは1, 2, 3または4であり、tは1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-E-またはFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-C-との結合点であり;
-E-は存在しないか、結合を表すか、あるいは式 XXII, XXIII, XXIIIa, XXIV, XXIVa, XXV, XXVIまたはXXVIIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、*はFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-D-または-C-の結合点である;
あるいはそれらの医薬に許容できる塩である。
本発明は、また、(a) 独立して場合によりN末端 M (例えば、-1M)を有する、配列番号1と比較して以下の修飾: -1G, -1C,-1S, S6C, S6K, A26E, Q27E, Q28R, A31E, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, K122R, I152K, L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, 及び/またはS181K,Rの少なくとも1つ; 及び/または(b) 配列番号1と比較して、最大で25アミノ酸残基、好ましくは最大で20アミノ酸残基、より好ましくは最大で15アミノ酸残基、より一層好ましくは最大で10アミノ酸残基、もしくは非常に好ましくは最大で6アミノ酸残基のN末端伸長を含む新規FGF21に関し、ここで、少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、一層より好ましくは少なくとも80％、もしくは非常に好ましくは少なくとも90％のN末端の伸長アミノ酸残基がGまたはSである。配列番号1は181アミノ酸残基を有する成熟野生型ヒトFGF21ペプチドである。
最後に、本発明は、治療的に有効量の本発明の類似体または誘導体、及び医薬に許容できる塩を含む医薬組成物；並びに治療的に有効量の本発明の類似体、誘導体または組成物を患者に投与することを含む、糖尿病、脂質異常症、肥満、循環器疾患、メタボリック・シンドローム、及び／または非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD)を示す患者の治療方法に関する。
第一の態様において、本発明の誘導体は、FGF21化合物のチオール基、すなわちシステイン残基、に共有結合した式A-B-C-D-E-のアルブミンバインダーを有する。
第二の態様において、本発明の誘導体は、N末端アミノ基、及び／またはリジン残基のイプシロンアミノ基などの内部アミノ基であってよい、FGF21化合物のアミノ基に共有結合した式 A-B-C-のアルブミンバインダーを有する。
本発明の誘導体及び本発明の類似体は、例えば、グルコース低下作用、脂質異常症、肥満、循環器疾患、メタボリック・シンドローム、及び／または非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD)の改良に関連して、FGF21の生物学的効果に類似する生物学的効果を有する。
定義
本明細書に使用される用語「FGF21化合物」は天然のヒトFGF21及びその類似体を指す。
天然のヒトFGF21タンパク質の配列は、アクセッション番号Q9NSA1で、UNIPROTデータベースより入手可能である。209アミノ酸の前駆体タンパク質は、シグナルペプチド（アミノ酸1-28)及び成熟タンパク質（アミノ酸29-209)を含む。成熟タンパク質は本明細書において配列番号1（アミノ酸1-181)として、シグナルペプチドは配列番号2（アミノ酸1-28）として挙げられている。
本明細書において配列番号1の成熟タンパク質の位置146でLeuの代わりにProを有する天然ヒトFF21のアイソフォームまたは対立(allelic)型は、とりわけ、US2001012628 A1（該刊行されたUS出願書類中、配列番号2の残基番号174）より公知である。
本明細書において配列番号2の位置23でのLeuが欠失しているより短いシグナルペプチドを有する別のアイソフォームはWO 2003/011213から公知である（27アミノ酸残基のシグナルペプチドを有する国際公開刊行物の配列番号2を参照されたい）。
従って、天然ヒトFGF21の特定の例は、配列番号1、置換L146Pを有する配列番号1、並びに前記に参照した27または28アミノ酸シグナルペプチドが先行するこれらの配列のいずれかである。天然ヒトFGF21の好ましい例は、成熟部分、すなわち、配列番号1及びそのL146Pアイソフォームである。
FGF21との関係で本明細書において言及される用語「類似体」、すなわちFGF21類似体は、配列番号1由来の、特には、そのアミノ酸配列の改変による、天然のFGF21から推定され、もしくは由来し、または推定され得、もしくは由来し得る、ポリペプチドを指す。かかる改変、修正または変化には、1または複数のアミノ酸の置換、欠失及び／または付加が含まれてよい。例えば、アミノ酸は、アミノ酸配列のC末端で、N末端で、または内部で、付加され、及び／または、欠失されてよい。好ましくはアミノ酸はC末端及び／またはN末端で、より好ましくはN末端で付加され、及び／または、欠失される。C末端またはN末端で欠失したアミノ酸を有するアミノ酸配列も、また、当該技術分野において知られているように、切断配列として称されてもよい。同様に、配列中の内部で付加されたアミノ酸は挿入とも称されるであろう。用語「変異体」または「突然変異タンパク質」は、本明細書において、時々、用語「類似体」の代わりに使用される。
FGF21類似体の一例は、天然タンパク質(HPIP)の4つのN末アミノ酸残基が除去された、天然の成熟FGF21の切断型であり、それは、例えば、WO 2006/065582に開示される。この切断型は、野生型FGF21と同じ水準でマウス3T3-L1脂肪細胞におけるグルコースの取込を刺激すると云われている。このタンパク質は本明細書における配列番号1のアミノ酸5-181のアミノ酸配列を有する。
FGF21類似体のさらなる例は、N末端Met（「Met-FGF21」、つまりは配列番号1の-1M((マイナス1）M）の置換、とも示される）を有する配列番号1のポリペプチドである。FGF21化合物を大腸菌で発現させるとN末端Metが付加される。例えば、WO 2006/050247の表6を参照されたい。
FGF21類似体の他の例は、例えば、WO 2003/061712, WO 2005/091944, WO 2006/028595, WO 2006/028714, WO 2006/065582 及びWO 2008/121563（本明細書における背景技術の段落を参照のこと）に開示される修飾FGF21配列（しばしば突然変異タンパク質と称される）である。
FGF21類似体の一層さらなる例は、本明細書における実験パート並びに添付の特許請求の範囲に開示される。
FGF21の修飾の関係で本明細書で称されるものとしての用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」には、タンパク質の生合成において細胞により使用され、遺伝暗号として特定される20の標準αアミノ酸、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンが含まれる。該用語には、また、非標準的なアミノ酸、遺伝暗号によりコードもされるがタンパク質としては稀である、セレノシステイン及びピロリシンなどが含まれる。タンパク質において発見される他の非標準的なアミノ酸、例えばγ-カルボキシグルタミン酸やヒドロキシプロリンは、翻訳後修飾により形成され得る。遺伝暗号によりコードされない非標準的または非天然のアミノ酸のさらなる例は、オルニチン及びホスホセリンである。非標準的なアミノ酸の一層さらなる例は、化学合成により製造されるアミノ酸を含む合成アミノ酸、例えば、D−アラニン、D-グルタミン、D-ヒスチジン、及びD-ロイシン、Aib (α-アミノイソブチル酸), Abu (α-アミノ酪酸), Tle (tert-ブチルグリシン), β-アラニン, 3-アミノメチル安息香酸, アントラニル酸、des-アミノ-ヒスチジン(短縮でDesaminoHis、代替名称イミダゾプロピオン酸、短縮でImpr)などの遺伝暗号によってコードされるアミノ酸のD-異性体、β-アラニン, 2-アミノ-ヒスチジン, β-ヒドロキシ-ヒスチジン, ホモヒスチジン, Nα-アセチル-ヒスチジン, α-フルオロ-メチル-ヒスチジン, α-メチル-ヒスチジン, α,α-ジメチル-グルタミン酸, m-CF3-フェニルアラニン (短縮で m-CF3-Phe), α,β-ジアミノプロピオン酸 (短縮で Dap), 3-ピリジルアラニン, 2-ピリジルアラニンまたは4-ピリジルアラニン, (1-アミノシクロプロピル)カルボン酸, (1-アミノシクロブチル)カルボン酸, (1-アミノシクロペンチル)カルボン酸, (1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸, (1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸, 及び (1-アミノシクロオクチル)カルボン酸などのアミノ酸のβ類似体である。
本発明の目的のために、標準アミノ酸の2つの認められているコード（1文字及び3文字）が交換可能に使用され、また、時々、アミノ酸の名称が完全に書き出される。勿論、これらの用語は完全に同等であるとみなされる（例えば、S = Ser = セリン）。
本明細書で使用される用語「誘導体」は共有結合的に改変（修飾）されているFGF21化合物を差す。該用語は、それ自身限定的ではなく、むしろ記述的であり、構成FGF21ポリペプチド化合物それ自体に為される変化（「類似体」）と、誘導体化されることによる、FGF21化合物の側鎖に対する共有結合との間の区別を付けるためを意図しているからである。必要に応じて、この用語は、他の一般的な化学用語、例えば化合物で代用してよい。
用語「アルブミンバインダー」も、それ自体限定することを意図していない。繰り返しになるが、それはむしろ記述であり、FGF21化合物にA-B-C-D-E- の鎖を付着させる、すなわち、本発明の誘導体のために目的とする長引かされる効果を提供するかまたはそれに少なくとも貢献するヒト血清アルブミンに、生じた化合物（誘導体）が結合できる、という全般的な狙いまたは目的を反映しているからである。必要に応じて、この用語は、他の一般的な化学用語、例えば化合物で代用してもよい。
命名：
類似体及び誘導体は、問題になっている技術的事項の理解を容易にするのに最も適しているものとみなされるものであれば何であれ、ポリペプチド命名法、有機化学命名法、及び化学式、またはそれらの混ぜ合わせを交換可能に用いて、本明細書において命名される。例えば、実施例4の誘導体は、S-122-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-エチル)-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル] [Cys122]-Met-FGF21 ([Cys122] Met-FGF21が、位置122におけるCysのチオール基で、1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-エチル)-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イルにより修飾されることを意味する）と命名されてよい。しかし、この化合物は、また、以下の化合物：
Figure 0005599822
 でC122で誘導体化させた、K122C Met-FGF21としても定義されてよい。
変異体の命名（類似体の命名）
FGF21の変異体（または類似体）は、問題になっている技術的事項の理解を容易にするのに最も適しているものとみなされるものであれば何であれ、ポリペプチド命名法、有機化学命名法、化学式、アミノ酸置換、またはそれらの混ぜ合わせを交換可能に用いて、本明細書において命名される。
例えば、変異体における置換は「元のアミノ酸-位置-置換されたアミノ酸」として示されてよい。3文字または1文字のコードが使用されてよい。従って、表記「K122C」または「Lys122Cys」は、変異体とFGF121をさらに後述するようにアラインした（「アラインメント」）ときに、変異体が、FGF21（配列番号1）における位置122でのアミノ酸に対応する変異体のアミノ酸の位置において、リジンがシステインに置換されていることを含むことを意味している。
例えば複数の置換などの複数の修飾を、（コンマの後にスペースを伴う）複数のコンマによって分けてもよく、必要に応じて括弧で囲むことにより、それらが同じ変異体に属することを明確にする。実施例7において誘導体化される類似体は、例えば、「K56R, K59R, K69R, K122R Met-FGF21」または「(K56R, K59R, K69R, K122R) Met-FGF21」と示されてもよく、あるいは、それは、「K56R, K59R, K69R, 及び K122R 及びN末端Mを有する配列番号1」として称されてもよい。置換及び挿入が混ざった形態での複数の修飾を伴う変異体の命名に関して実施例2の化合物Yを参照されたい。
所望の位置での代替的な置換などの代替的な修飾は、例えば、位置181でのSerがLysまたはArgで置換されてもよいことを意味する、表示「S181K,R」におけるような、コンマによって分けられてもよい。
伸長は、繰り返しになるが、関連する技術的ポイントの理解を容易にするために、位置番号の付加（C末端における連続した正数及びN末端における負数）によって、または、より単純に、FGF21などの慣用名がしばしば用いられる、問題とする化合物への、正しい配列を使用しての、問題とする伸長アミノ酸を付加することによって、配列番号1を参照することにより記述されてよい。例として、化合物MGGGGG-FGF21は、配列番号1を参照することにより、位置-1でG、位置-2でG、位置-3でG、位置-4でG、位置-5でG、及び位置-6でMを有する、配列番号1 (FGF21)のポリペプチドを示す。同様に、化合物(q) MS-FGF21 (またはMet-Ser-FGF21)は、配列番号1を参照することにより、位置-1でS、及び位置-2でMを有する配列番号1（FGF21)のポリペプチドを示す。
変異体における挿入は、「挿入の前のアミノ酸位置番号-インデックス-挿入されたアミノ酸」として示されてよい。挿入の前のアミノ酸位置番号は、変異体及びFGF21がさらに以下に記載されるようにアラインされるとき（「アラインメント」）に生じる、ギャップのちょうど前のFGF21（配列番号1）のアミノ酸位置を差す。アミノ酸に関して、3文字または1文字のコードが使用されてよい。インデックスはアルファベット順に小文字であり、例えば、規定に従って、「a」は最初に挿入されたアミノ酸残基に関し、「b」は2番目に挿入されたアミノ酸残基に関する。従って、表示「V169aT」（または「Val169aThr」)または単純に「169aT」(または「169aThr」)は、すべて、変異体及びFGF21がさらに以下に記載されるようにアラインされるとき（「アラインメント」）に、変異体がFGF21（配列番号1）の位置169でバリンの後にトレオニンの挿入を含むことを意味する。
FGF化合物に追加のジスルフィド架橋が存在する場合には、例えば、位置118におけるCysと位置134におけるCysとの間のジスルフィド架橋が存在する場合、「L118C-A134C」のように、2つのCysが互いに近接してタイプされ、かつダッシュ(-)によって連結される。
本発明の目的のために、EMBOSSパッケージ(http://emboss.org)より得られるNeedleプログラムを用いて2つのアミノ酸配列のアラインメントを行ってもよい。好ましいバージョンは2.8.0である。Needleプログラムは、Needleman, S. B. 及び Wunsch, C. D. (1970) J. MoI. Biol. 48, 443-453に記述される全体的なアラインメントアルゴリズムを実施する。使用される代替行列(substitution matrxi)はBLOSUM62であり、ギャップオープンペナルティーが10であり、ギャップ伸長ペナルティーが0.5である。
本発明のFGF21類似体配列（「発明の配列」；例えば、K56R, K59R, 及び K69Rを有する配列番号1)と異なるアミノ酸配列（「外来配列」；例えば配列番号1のFGF21配列）との間の同一性の程度または割合は、どちらが最小にしても、「発明の配列」の長さまたは「外来配列」の長さによって除される、2つの配列のアラインメントにおける正確な一致の数として計算される。結果はパーセント同一性で表される。
正確な一致は、重複の同一位置において同一のアミノ酸残基を「発明の配列」と「外来配列」が有している場合に現れる（以下のアラインメントの例においてこれは「*」によって表される）。配列の長さは、配列におけるアミノ酸残基数である（例えば配列番号1の長さは181である）。
これは、前述のように「発明の配列」と「外来配列」のアラインメントの例である：
Figure 0005599822
従って、FGF21に対するこのFGF21類似体の同一性の割合は178/181x100% = 98.3%である。
代わりに、2つのアミノ酸配列間の同一性の程度が、Needleman-Wunschアラインメントであるプログラム「アライン」（すなわち、全体的なアラインメント）によって決定されてもよい。配列は、デフォルトのスコア化による行列(default scoringmatrix)BLOSUM50を用いるプログラムによりアラインされる。最初の残基のギャップに関するペナルティーは12であり、さらなる残基のギャップに関してペナルティーは2である。Needleman-Wunschアルゴリズムは、Needleman, S.B. 及び Wunsch, CD., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453に記載され、アライン用プログラムは、Myers 及び W. Miller in Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17による。「アライン」は、FASTAパッケージバージョンv20u6の一部である（W. R. Pearson 及び D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448 及びW. R. Pearson (1990) "Rapid 及び Sensitive Sequence Comparison with FASTP 及び FASTA," Methods in Enzymology 183:63-98)。
本発明のFGF21化合物の誘導体またはFGF21類似体を含む医薬組成物は、さらに、医薬に許容できる担体を含んでもよい。注射用に、担体は、必要に応じて、他の物質、例えば、生物学用生理食塩水などの生理食塩水が添加された、水であってよい。希釈剤及び適切な緩衝剤などの他の医薬に許容できる薬剤もまた使用してよい。必要に応じて、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、充填剤、増量剤、アジュバント、保存剤、抗酸化剤、着色剤、及び／または香味剤などの、追加の医薬に許容できる薬剤をも使用してよい。FGF21化合物の誘導体またはFGF21類似体は、精製されたポリペプチドもしくはその誘導体の形態で使用してもよく、または、当該技術分野で知られるように、適切な医薬に許容できる賦形剤を用いて製剤化してもよい。医薬組成物は、当該技術分野で知られる任意の態様で、例えば、注射で、例えば、静脈内で(i.v.)または皮下で(s.c.)で、投与されてよい。
FGF21化合物の誘導体またはFGF21類似体は、治療的または予防的有効量で医薬組成物中に含まれてよい。当該量は、問題とする適応症、治療を必要とする患者の状態、望ましい投与経路などの、治療または予防の目的等に依存する。熟練した医療従事者は、当該技術分野で日常的に行っているように、用量を調整し、これらの要因に依存して投与を修正しなければならないであろう。
特定の実施形態
以下は、本発明の誘導体の、特には本発明の第一の態様の誘導体の、特定の実施形態であり、ここで、式 A-B-C-D-E-のアルブミンバインダーはFGF21化合物のチオール基、すなわち、例えば、システイン残基に共有結合している：
一実施形態において、A-は式Iの要素である：
Figure 0005599822
ここで、nは14, 16または18である。
一実施形態において、-B-は-B1-、好ましくは式IVまたはVの要素を含む：
Figure 0005599822
一実施形態において、-B-は-B2-、好ましくは式IIXまたはIXの1または2つの要素を含む:
Figure 0005599822
ここで、より好ましくは、cは0であり、かつbは2であり（ガンマ-Glu)、あるいはcは0であり、かつbは1であり(ベータ-Asp)、あるいは、ここで、より好ましくは、dは1であり、かつeは2であり、またはdは2であり、かつeは1である。
一実施形態において、-B-は-B2-、好ましくは式 IIXの1または2つの要素を含む:
Figure 0005599822
ここで、より好ましくは、cは0であり、かつbは2であり(ガンマ-Glu)、あるいは、cは0であり、かつbは1である(ベータ-Asp)。
一実施形態において、-C-は式Xの要素である：
Figure 0005599822
ここで、好ましくはqは0, 1, 2, 3または4であり、より好ましくはqは1または2である。
一実施形態において、-C-は式 Xの要素である：
Figure 0005599822
ここで、好ましくはpは1または2であり、より好ましくはpは1であり、より一層好ましくはpは1であり、かつqは1または2であり、あるいは一層好ましくはpは1であり、かつqは2である。
一実施形態において、-C-は式 XIの要素である：
Figure 0005599822
ここで、好ましくはmは0, 1または2であり、より好ましくはmは1または2である。
一実施形態において、-C-は式 XIの要素である：
Figure 0005599822
ここで、好ましくはkは1, 2, 3, 4, 5または11であり、より好ましくはkは5である。
一実施形態において、-C-は式 XIの要素である：
Figure 0005599822
ここで、mは1であり、かつkは4, 5または11であり、好ましくはmは1であり、かつkは5である。
一実施形態において、-D-は、式 XIIの要素である:
#-NH-(CH2)r-NH-CO-(CH2)s-* (式 XII)
ここで、好ましくはrは2であり、及び/または、ここで、好ましくはsは1または2であり、非常に好ましくはrは2であり、かつsは2である。
一実施形態において、-D-は式 XIIIの要素である:
#-NH-(CH2)t-* (式 XIII)
ここで、好ましくはtは1, 2または3であり、より好ましくはtは2である。
一実施形態において、-D-は存在しない。
一実施形態において、-E-は式 XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVIまたはXXVIIの要素である:
Figure 0005599822
一実施形態において、-E-は式 XXII, XXIII, XXVまたはXXVIの要素である:
Figure 0005599822
一実施形態において、-E-は、活性化エステル、例えば、制限はされないが、N-ヒドロキシスクシンイミド(式 XIV)とのFGF21化合物の反応産物であるか、あるいは、式 XV, XVI, XVII, IIXX, IXX, XXまたはXIの反応要素である:
Figure 0005599822
ここで、#は-C-または-D-との結合点である。
一実施形態において、誘導体は、式 A-B-C-D-E-の1または2のアルブミンバインダーを有する。
一実施形態において、誘導体は、2つのアルブミンバインダーを有し、ここで、好ましくは、A-は式 I, IIまたはIIIの要素である：
Figure 0005599822
ここで、nは8, 9, 10, 11, 12または13である。
一実施形態において、誘導体は、2つのアルブミンバインダーを有し、ここで、好ましくは、A-は式 I, IIまたはIIIの要素である：
Figure 0005599822
ここで、nは10, 11, 12または13である。
一実施形態において、誘導体は、1つのアルブミンバインダーを有し、ここで、好ましくはA-は式 I, IIまたはIIIの要素である：
Figure 0005599822
ここで、nは10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17または18である。
一実施形態において、誘導体は、1つのアルブミンバインダーを有し、ここで、好ましくはA-は式 I, IIまたはIIIの要素である：
Figure 0005599822
ここで、nは14, 15, 16, 17または18である。
一実施形態において、A-B-C-D-E-は以下の式(1)-(12)から選択される:
Figure 0005599822
Figure 0005599822
または対応する誘導体のいずれかの医薬に許容できる塩。ところで、(2)及び(3)を含む誘導体は、式(1)を含む誘導体の分解により生成させてもよい。
一実施形態において、A-B-C-D-E-は以下の式(1)-(12)から選択される:
Figure 0005599822
Figure 0005599822
または対応する誘導体のいずれかの医薬に許容できる塩。ところで、(2)及び(3)を含む誘導体は、式(1)を含む誘導体の分解により生成させてもよい。
一実施形態において、アルブミンバインダーは、FGF21化合物の位置-1(例えば、類似体MetCys-FGF21における）、6, 71, 及び122から選択される1または複数の（例えば2つの）位置でシステイン残基に結合し、ここで、位置番号は配列番号1を参照することによる。
一実施形態において、本発明の化合物は、実施例4、5及び6の誘導体、好ましくは、以下：S-122-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-エチル)-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル] [Cys122]-Met-FGF21; S-71-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-エチル)-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル] [Cys71]Met-FGF21; 及びS-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [Cys71]Met-FGF21;またはこれらの化合物のいずれかの医薬に許容できる塩から選択される。
以下は、本発明の誘導体の、特には本発明の第二の態様の誘導体の、特定の実施形態であり、ここで、式 A-B-C-のアルブミンバインダーはFGF21化合物のアミノ基に共有結合している：
一実施形態において、A-は式 I, IIまたはIIIの要素であり：
Figure 0005599822
ここで、nは10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18または19であり、*は-B-との結合点であり;
-B-は-B1-, -B2-またはこれらの組み合わせであり、ここで、-B1-は式 IV, V, VIまたはVIIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、*は-B2-または-C-の結合点であり、かつ#はA-または-B2-の結合点であり;及び-B2-は式 IIX, IXまたはXXVIIの要素であるか、あるいは式 IIX 及び/または式 IX 及び/または XXVIIの最大で4つの要素の組み合わせであり：
Figure 0005599822
ここで、bは0, 1または2であり、かつcは0, 1または2であるが、ただし、cが0である時bは1または2であり、cが1または2である時bは0であり、*は-C-, -B1-または他の-B2-との結合点であり、かつ#はA-, -B1-または他の-B2-との結合点であり、あるいは
Figure 0005599822
ここで、dは1または2であり、eは0, 1または2であり、*は-C-または-B1-との結合点であり、かつ#はA-または-B1-との結合点であり;あるいは
#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式 XXVIII)
ここで、uは2, 3または4であり、*は-C-または-B1-との結合点であり、かつ#はA-または-B1-との結合点であり;及び
-C-は式 XまたはXIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、pは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、qは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*はFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-B-との結合点であり;または
Figure 0005599822
ここで、kは0, 1, 2, 3, 4, 5, 11または23であり、mは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*はFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-B-との結合点である;
あるいはこれらの医薬に許容できる塩である。
一実施形態において、A-は式 I, IIまたはIIIの要素であり：
Figure 0005599822
ここで、nは10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18または19であり、かつ*は-B-との結合点であり;
-B-は-B1-, -B2-またはこれらの組み合わせであり、ここで、-B1-は式 IV, V, VIまたはVIIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、*は-B2-または-C-との結合点であり、かつ#はA-または-B2-との結合点であり;及び、-B2-は式 IIXまたはIXの要素であるか、あるいは式 IIX 及び/または式 IXの最大で4つの要素の組み合わせであり:
Figure 0005599822
ここで、bは0, 1または2であり、cは0, 1または2であり、ただし、cが0である時bは1または2であり、及びcが1または2である時bは0であり、*は-C-, -B1-または他の-B2-との結合点であり、#はA-, -B1-または他の-B2-との結合点であり、あるいは
Figure 0005599822
ここで、dは1または2であり、eは0, 1または2であり、*は-C-または-B1-との結合点であり、かつ#はA-または-B1-との結合点であり;
-C-は式 XまたはXIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、pは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、qは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*はFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-B-との結合点であり;あるいは
Figure 0005599822
 ここで、kは0, 1, 2, 3, 4, 5, 11または23であり、mは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*はFGF21化合物との結合点であり;及び#は-B-との結合点であり;
あるいは、それらの医薬に許容できる塩である。
一実施形態において、A-は式 Iの要素である：
Figure 0005599822
ここで、nは好ましくは14, 16または18である。
一実施形態において、-B-は-B1-、好ましくは式 IVまたはVの要素を含む：
Figure 0005599822
一実施形態において、-B-は-B2-、好ましくは式 IIXの1又は2の要素を含む：
Figure 0005599822
ここで、より好ましくはcは0であり、かつbは2であり(ガンマ-Glu)、または、cは0であり、かつbは1である(ベータ-Asp)。
一実施形態において、-B-は-B2-、好ましくは式 IXの1または2の要素を含む:
Figure 0005599822
 ここで、より好ましくはdは1であり、かつeは2であり、または、dは2であり、かつeは1である。
一実施形態において、-B-は-B2-、好ましくは式 XXVIIIの1つまたは2つの要素を含む：
#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式 XXVIII)
ここで、より好ましくはuは3である。
一実施形態において、-C-は式 Xの要素である：
Figure 0005599822
ここで、好ましくはqは0, 1, 2, 3または4であり、より好ましくはqは1または2である。
一実施形態において、-C-は式 Xの要素である：
Figure 0005599822
ここで、好ましくはpは1または2であり、より好ましくはpは1である。
一実施形態において、-C-は式 Xの要素である：
Figure 0005599822
ここで、pは1であり、かつqは1または2であり、好ましくはpは1であり、かつqは2である。
一実施形態において、-C-は式 XIの要素である：
Figure 0005599822
ここで、好ましくはmは0, 1または2であり、より好ましくはmは1または2である。
一実施形態において、-C-は式 XIの要素である：
Figure 0005599822
ここで、好ましくはkは1, 2, 3, 4, 5または11であり、より好ましくはkは5であり、より一層好ましくはmは1であり、かつkは4, 5または11であり、あるいは、非常に好ましくはmは1であり、かつkは5である。
一実施形態において、本発明の化合物は、１つまたは2つの式 A-B-C-のアルブミンバインダーを有する誘導体である。
一実施形態において、本発明の化合物は、2つのアルブミンバインダーを有する誘導体であり、ここで、好ましくはA-は式 I, IIまたはIIIの要素である：
Figure 0005599822
ここで、nは8, 9,10, 11, 12または13である。
一実施形態において、本発明の化合物は、2つのアルブミンバインダーを有する誘導体であり、ここで、好ましくはA-は式 I, IIまたはIIIの要素である：
Figure 0005599822
ここで、nは10, 11, 12または13である。
一実施形態において、本発明の化合物は、1つのアルブミンバインダーを有する誘導体であり、ここで、好ましくはA-は式 I, IIまたはIIIの要素である：
Figure 0005599822
ここで、nは10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17または18である。
一実施形態において、本発明の化合物は、1つのアルブミンバインダーを有する誘導体であり、ここで、好ましくはA-は式 I, IIまたはIIIの要素である：
Figure 0005599822
ここで、nは14, 15, 16, 17または18である。
一実施形態において、本発明の化合物は誘導体であり、ここで、A-B-C-は以下の式(13)-(19)から選択される:
Figure 0005599822
Figure 0005599822
あるいは対応する誘導体のいずれか1つの医薬に許容できる塩。
一実施形態において、本発明の化合物は誘導体であり、ここで、A-B-C-は以下の式(13)-(15)から選択される：
Figure 0005599822
あるいは対応する誘導体のいずれか1つの医薬に許容できる塩。
一実施形態において、本発明の化合物は、アルブミンバインダーの結合が、好ましくはアミド結合の形成下で、N末端アミノ酸残基のアミノ基を介して生じる、化合物である。
一実施形態において、本発明の化合物は、アルブミンバインダーの結合が、好ましくはアミド結合の形成下で、リジン残基のイプシロンアミノ基を介して生じる、化合物である。
一実施形態において、本発明の化合物は、一方のアルブミンバインダーがN末端アミノ残基に結合し、他方が内部リジン残基に結合している、化合物である。
一実施形態において、本発明の化合物は、FGF21化合物の位置56, 59, 69, 122及び152から選択される1または複数（例えば2など）の位置で、アルブミンバインダーがリジン残基に結合しており、該位置番号は配列番号1を参照する、化合物である。
一実施形態において、本発明の化合物は、実施例7の化合物、好ましくは以下：N-アルファ1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタ-デカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] [Arg56, Arg59, Arg69, Arg122]-Met-FGF21；またはそれらの医薬に許容できる塩である。
以下は、構成FGF21化合物の構造により特徴付けされる、本発明の誘導体のさらなる特定の実施形態である：
好ましくは、FGF21化合物は、配列番号1に対して、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%, より好ましくは少なくとも90%, より一層好ましくは少なくとも95%の同一性を有する。
好ましくは、FGF21化合物は、配列番号1と比較して、最大で36のアミノ酸の変更（修飾）、好ましくは最大で30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11,10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2または1のアミノ酸の変更；より好ましくは最大で15, 14, 13, 12, 11または10のアミノ酸の修飾；より一層好ましくは最大で9, 8, 7, 6または5のアミノ酸の修飾；または非常に好ましくは最大で4, 3, 2または1のアミノ酸の修飾を有する。
好ましくは、FGF21化合物は、最大で25アミノ酸残基のN末端の伸長を有する。このような伸長は、負の残基番号、すなわち、配列番号1の残基番号-1から-25を用いて示されてよい。このN末端伸長は、本明細書に規定され請求されるように、FGF21化合物のN末端へのアルブミンバインダーの結合を促進することが予期されるリンカーである。このリンカーが使用される場合、誘導体は要素A-のみを含んでよく（もしくはのみからなってよく）、要素-B-, -C-, -D-及び-E-の全てが存在しなくてもよいことを意味している。しかしながら、好ましくは、要素-B-及び/または要素-C-はA-に加えて含まれ、より好ましくはTrxまたはInpの-B1-要素、または非常に好ましくは式 IIX, IXまたはXXVIIの-B2-要素、特にガンマ-Gluである。N末端伸長は、好ましくは、最大で20アミノ酸残基, より好ましくは最大で15アミノ酸残基, より一層好ましくは最大で10アミノ酸残基, または非常に好ましくは最大で6アミノ酸残基を有する。
N末端伸長アミノ酸残基の、好ましくは少なくとも50%, 好ましくは少なくとも60%, より好ましくは少なくとも70%, より一層好ましくは少なくとも80%, または非常に好ましくは少なくとも90%が、グリシンまたはセリンである。
一実施形態において、FGF21化合物は、配列番号1のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、FGF21化合物は、(a)配列番号1と比較して、少なくとも1つの以下の修飾：-1M, -1G, -1C, -1S, S6C, S6K, A26E, Q27E, Q28R, A31E, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, L118C, K122C, K122R, A134C, I152K, L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, 及び/またはS181K,R (好ましくは少なくとも1つの以下：-1M, -1G, -1C, -1S, S6C, S6K, A26E, Q27E, Q28R, A31E, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, L118C, K122C, K122R, A134C, I152K 及び/またはM168L)；及び/または、(b)配列番号1と比較して、最大で25アミノ酸残基, 好ましくは最大で20アミノ酸残基, より好ましくは最大で15アミノ酸残基, より一層好ましくは最大で10アミノ酸残基, または非常に好ましくは最大で6アミノ酸残基のN末端伸長であって、ここで、N末端伸長アミノ酸残基の、少なくとも50%, 好ましくは少なくとも60%, より好ましくは少なくとも70%, より一層好ましくは少なくとも80%, または非常に好ましくは少なくとも90%はGまたはSである、N末端伸長を含む。
一実施形態において、FGF21化合物は、(a)配列番号1と比較して、以下の修飾：(i) K122C, (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K), D102T, A26E, (Q28R, A31E), Q27E, M168L, (Y179F, A180E, S181R), (V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K), 及び/または(L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) (好ましくはK122C, (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K), D102T, A26E, (Q28R, A31E), Q27E, 及び/またはM168L), (ii) -1G, 及び(-1G, M168L),または(iii) S6C, (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R),及び(S6K, K56R, K59R, K69R, K122R)であって、ここで、(i)及び(iii)のFGF21化合物はさらに場合によりN末端Mを含んでよい、修飾； 及び/または(b)配列番号1と比較して、以下：(iv) MG-, MC-, MS-, MSGSGSGSGSG-, MGGGGG-, MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, MSGGGGG-, MSGSGGS-, MSGGSSG-, 及びMSGSGSG-から選択されるN末端伸長であって、ここで、(iv)のFGF21化合物それぞれにおけるN末端Mは場合により欠失していてもよい、N末端伸長を含む。
一実施形態において、FGF21化合物はY179F, A180E及びS181KもしくはS181R (i)を含み；好ましくは、それはさらにV169aT, P171L, S172E, Q173A及びG174V (ii)を含み；より好ましくは、それはさらにL166F, S167G及びM168L (iii)を含み；非常に好ましくはそれは(i), (ii)及び(iii)を含む。これらの実施形態(i)-(iii)のそれぞれは、場合によりN末端M(例えば-1M)を含む。
一実施形態において、FGF21化合物は、配列番号1と比較して、以下の置換：(a) K122C; (b) (K59R, K69R, K122R); (c) (K56R, K69R, K122R); (d) (K56R, K59R, K69R); (e) S71C; (f) S6C; (g) (K56R, K59R, K69R, K122R); (h) (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K); (i) (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R); (j) (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R);または(k) M168Lを含む。
一実施形態において、FGF21化合物は、FGF21 (配列番号1)と比較して、以下の修正：(i) N末端でのMet-Gly-, (ii) M168L, (iii) 実施形態(i)及び(ii), (iv) N末端でのMet-Cys-, (v) N末端でのGly-, (vi) 実施形態(v)及び(ii), (vii) N末端でのMet-Ser-, または(iix) N末端でのSer-を含み；好ましくは、FGF21化合物は、以下：(l) Met-Gly-FGF21, (m) Met-Gly-FGF21-M168L, (n) Met-Cys-FGF21, (o) Gly-FGF21-M168L, (p) Gly-FGF21, (q) Met-Ser-FGF21,または(r) Ser-FGF21から選択され；ここでFGF21は配列番号1のポリペプチドを差す。
一実施形態において、FGF21化合物は、配列番号1と比較して、以下のN末端伸長：(q) MS-FGF21, (s) MSGSGSGSGSG-, (t) MGGGGG-, (u) MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, (v) MSGGGGG-, (x) MSGSGGS-, (y) MSGGSSG-, 及び (z) MSGSGSG-; 並びにN末端Metを有さない、実施形態(q), (s), (t), (u), (v), (x), (y), 及び(z)のいずれか1つを含む。
一実施形態において、FGF21化合物は、配列番号1のポリペプチドの以下の変異体：(a) K122C, (e) S71C, (f) S6C, (n) Met-Cys-FGF21, N末端Metを有する化合物(a), (e)及び(f)のいずれか1つ, 並びにN末端Metを有さない化合物(n)から選択される。
一実施形態において、FGF21化合物は、配列番号1のポリペプチドの以下の変異体：(b) (K59R, K69R, K122R); (c) (K56R, K69R, K122R); (d) (K56R, K59R, K69R); (g) (K56R, K59R, K69R, K122R); (h) (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K); (i) (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R); (j) (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R); (k) (179F, 180E, 181R); (l) (169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K); 及び (m) (166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K); 並びにN末端Metを有する化合物(b), (c), (d), (g), (h), (i), (j), (k), (l)及び(m)のいずれか1つ（好ましくは(b)-(j) +/- N末端Met)から選択される。
一実施形態において、FGF21化合物は位置146でプロリンを有し、ここで位置番号は配列番号1を差し、それは、先行技術から公知の野生型対立FGF21である。
以下は、生物学的及び化学的特性によって特徴付けされる、本発明の誘導体のさらなる特定の実施形態である。
一実施形態において、本発明の誘導体は、好ましくは長引かされるものであり、参照としては本明細書に記載の実験セクションの実施例11である。
一実施形態において、本発明の誘導体は、マウスにおいて皮下注射で服用させたときに、少なくとも1.5時間, 好ましくは少なくとも2時間, より好ましくは少なくとも4時間, より一層好ましくは少なくとも5時間, または非常に好ましくは少なくとも6時間のT1/2を有する。
一実施形態において、誘導体は、マウスにおいて皮下注射で服用させたときに、少なくとも10時間, 好ましくは少なくとも15時間, より好ましくは少なくとも24時間, または非常に好ましくは少なくとも48時間のT1/2を有する。マウスは、db/dbマウスであり、レプチン受容体を欠失しているマウスが好ましい。
一実施形態において、誘導体の服用量は0.5 mg/kgである。にも関わらず、0.1から1.0 mg/kgの範囲にある服用量も使用されてもよい。
別の実施形態において、本発明の誘導体は、ミニブタにおいて静脈注射で服用させたときに、少なくとも15時間, 好ましくは少なくとも20時間, より好ましくは少なくとも30時間, より一層好ましくは少なくとも40時間, または非常に好ましくは少なくとも50時間のT1/2を有する。
本発明の誘導体は、ミニブタにおいて静脈注射で服用させたときに、少なくとも60時間, 好ましくは少なくとも70時間, より好ましくは少なくとも75時間ものT1/2を有するであろう。ミニブタは、好ましくは、正常な雄のグッティンゲンミニブタである。各処置群におけるブタの数は好ましくはn=3-4である。ブタは好ましくは12-15月齢、及びより好ましくは体重は約25kgである。ブタは、好ましくは0.1 mg/kg (約5 nmol/kg)の一回の静脈内投与で投薬される。
本発明の誘導体及び類似体並びに比較用のFGF21化合物の血漿濃度は、当該技術分野で公知の任意の適切な方法によって決定されてもよい。好ましいアッセイは、BioVendor (例えばBioVendor GmbH, Im Neuenheimer Feld 583, D-69120 Heidelberg, Germany)からカタログ番号RD191108200Rで入手可能な、Fibroblast Growth Factor-21 Human ELISAである。
誘導体は、好ましくは許容できる有効性を有し、参照としては本明細書に記載の実験セクションの実施例8である。
一実施形態において、有効性は、Met-FGF21の有効性の少なくとも1%, 好ましくは少なくとも5%, より好ましくは少なくとも10%, より一層好ましくは少なくとも20%, または非常に好ましくは少なくとも30%であり、ここで、有効性は、3T3-L1脂肪細胞におけるグルコース取込を測定することによって決定される。
一実施形態において、有効性は、Met-FGF21の有効性に対して、少なくとも40%, 好ましくは少なくとも50%, より好ましくは少なくとも60%, より一層好ましくは少なくとも70%である。
一実施形態において、有効性は、Met-FGF21の有効性に対して、少なくとも80%, 好ましくは少なくとも90%, より好ましくは少なくとも100%, より一層好ましくは少なくとも110%, または非常に好ましくは少なくとも120%であってさえよい。
これらの実験のそれぞれに関して、有効性は、3T3-L1脂肪細胞におけるグルコースの取込を測定することによって好ましくは決定される。
有効性は、Met-FGF21のEC50に対する誘導体のEC50として計算される。
3T3-L1脂肪細胞はマウス3T3-L1繊維芽細胞、好ましくはATCC CL-173由来である。
3T3-L1脂肪細胞におけるグルコース取込は、実施例8で概略が説明されるようにして測定されてよい。
本発明の誘導体は好ましくは許容可能な有効性及び伸長された半減期を有する。
一実施形態において、本発明の誘導体は、マウスにおいて皮下注射で服用された場合に、少なくとも1.5時間, 好ましくは少なくとも2時間, より好ましくは少なくとも4時間, より一層好ましくは少なくとも5時間, または非常に好ましくは少なくとも6時間のT1/2を有し、同時に、前述の実施形態のいずれか1つにおいて記載されるような有効性を有する。
一実施形態において、本発明の誘導体は、マウスにおいて皮下注射で服用された場合に、少なくとも10時間, 好ましくは少なくとも15時間, より好ましくは少なくとも24時間, または非常に好ましくは少なくとも48時間のT1/2を有し、同時に、前述の実施形態のいずれか1つにおいて記載されるような有効性を有する。
一実施形態において、本発明の誘導体は、ミニブタにおいて静脈注射で服用させたときに、少なくとも15時間, 好ましくは少なくとも20時間, より好ましくは少なくとも30時間, より一層好ましくは少なくとも40時間, または非常に好ましくは少なくとも50時間のT1/2を有し、同時に、前述の実施形態のいずれか1つにおいて記載されるような有効性を有する。
一実施形態において、誘導体は、ミニブタにおいて静脈注射で服用させたときに、少なくとも60時間, 好ましくは少なくとも70時間, より好ましくは少なくとも75時間のT1/2を有し、同時に、前述の実施形態のいずれか1つにおいて記載されるような有効性を有する。
誘導体は、db/dbマウスの血中グルコース濃度に対してin vivoで効果を有し、参照としては本明細書に記載の実験セクションの実施例11である。
誘導体は、ビヒクルコントロールに対して、db/dbマウスにおいて血中グルコースをin vivoで低下させることができる。
一実施形態において、血中グルコース値は、誘導体の最後の服薬が投与されて24時間後、好ましくは48時間後に低下する。
一実施形態において、血中グルコース値は、mMでの平均血中グルコース測定に基づいて、対応するビヒクルコントロールに対して、少なくとも10%, 好ましくは少なくとも15%, より好ましくは少なくとも20%, より一層好ましくは少なくとも25%, または非常に好ましくは少なくとも30%低下される。例として、表3のデータの参照により、0.22 mg/kgで投薬される、実施例4の誘導体は、最後の服薬から48時間後、17.1 mMの平均血中グルコース測定値を生じさせる。同じ時点で、ビヒクルは23.9 mMの平均血中グルコース測定値を生じさせる。従って、0.22 mg/kgで投薬される、実施例4の誘導体は、ビヒクルコントロールと比較して、100% - (100x17.1/23.9)% = 28%の血中グルコースの低下または減少を生じさせる。
一実施形態において、血中グルコース値は、少なくとも35%, 好ましくは少なくとも40%, より好ましくは少なくとも45%, または非常に好ましくは少なくとも50%低下する。実施例10の試験方法を参照せよ。
本発明の誘導体は、本明細書に記載の実施例9への参照によって、好ましくは酸化安定性である。
一実施形態において、本発明の誘導体はMet-FGF21よりも酸化に対してより安定である。これは、様々な温度での保存及び酸化に関する検査、または300 mMのH202の存在下で25°Cで1時間インキュベーションすることにより検査可能である。
用語「安定である」、すなわち安定性は、前述したように決定される、有効性を差す。
H202でインキュベーションした後、誘導体は、少なくとも15%, 好ましくは少なくとも20%, より好ましくは少なくとも30%, より一層好ましくは少なくとも40%, または非常に好ましくは少なくとも50%の有効性を有し、ここで、有効性は、同様に処理されるMet-FGF21、ただしH202処理はない、に対するものである。
以下は、第一に構造により、次に生物学的及び化学的特性により、そして最後に少数の追加の構造的な実施形態により規定される、本発明のFGF21類似体の特定の実施形態である。
ある実施形態は、(a)配列番号1と比較して、少なくとも1つの以下の修飾：-1G, -1C, -1S, S6C, S6K, A26E, Q27E, Q28R, A31E, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, K122R, I152K, L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, 及び/またはS181K, R (好ましくは-1G, -1C, -1S, S6C, S6K, A26E, Q27E, Q28R, A31E, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, K122R, I152K, 及び/またはM168L); 及び/または(b) 配列番号1と比較して、最大で25アミノ酸残基, 好ましくは最大で20アミノ酸残基, より好ましくは最大で15アミノ酸残基, より一層好ましくは最大で10アミノ酸残基, または非常に好ましくは最大で6アミノ酸残基のN末端伸長であって、少なくとも50%, 好ましくは少なくとも60%, より好ましくは少なくとも70%, より一層好ましくは少なくとも80%, または非常に好ましくは少なくとも90%の該N末端伸長アミノ酸残基はGまたはSである、N末端伸長を含むFGF21類似体である。
ある実施形態は、(a)配列番号1と比較して、以下の修飾：(i) (K122C), (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K), D102T, A26E, (Q28R, A31E), Q27E, M168L, (Y179F, A180E, S181R), (V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K),または(L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) (好ましくは(K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), 及び/または(K56R, K59R, K69R, K122R, I152K), D102T, A26E, (Q28R, A31E), Q27E, 及び/またはM168L), (ii) -1G, 及び (-1G, M168L),または(iii) S6C, (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R), 及び(S6K, K56R, K59R, K69R, K122R)であって、ここで、(i)及び(iii)のFGF21類似体はN末端Mをさらに場合により含む、修飾；及び/または(b)配列番号1と比較して、以下: (iv) MG-, MC-, MS-, MSGSGSGSGSG-, MGGGGG-, MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, MSGGGGG-, MSGSGGS-, MSGGSSG-, 及びMSGSGSG-から選択されるN末端伸長であって、ここで、(iv)のFGF21類似体のそれぞれにおけるN末端Mは場合により欠失していてよい、N末端伸長を含む、FGF21類似体である。
ある実施形態は、(a)配列番号1と比較して、以下の修飾：(i) (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K), D102T, A26E, (Q28R, A31E), Q27E, M168L, (Y179F, A180E, S181R), (V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K),または(L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) (好ましくは(K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), 及び/または(K56R, K59R, K69R, K122R, I152K), D102T, A26E, (Q28R, A31E), Q27E, 及び/またはM168L), (ii)-1G, 及び(-1G, M168L),または(iii) S6C, (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R), 及び (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R)であって、ここで、(i)及び(iii)のFGF21類似体はN末端Mをさらに場合により含む、修飾；及び/または(b)配列番号1と比較して、以下：(iv) MG-, MC-, MS-, MSGSGSGSGSG-, MGGGGG-, MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, MSGGGGG-, MSGSGGS-, MSGGSSG-, 及びMSGSGSG-から選択されるN末端伸長であって、ここで、(iv)のFGF21類似体のそれぞれにおけるN末端Mは場合により欠失してよい、N末端伸長を含む、FGF21類似体である。
ある実施形態は、配列番号1のポリペプチドと比較して、1または複数の以下の修飾： S6C, S6K, K56R, K59R, K69R, S71C, K122R, I152K, L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, 及び/またはS181K,R (好ましくはS6C, S6K, K56R, K59R, K69R, S71C, K122R, I152K, 及び/またはM168L)を含むFGF21類似体である。この実施形態は、番号順に、FGF21の成熟部分における新規の単一置換を含む。
ある実施形態は、配列番号1のポリペプチドと比較して、1または複数の以下の修飾： S6C, S71C, M168L, (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), (K56R, K69R, K122R), (K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K), 及び(K56R, K59R, K69R, K122R, L118C-A134C), (L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K), (V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K), 及び/または(Y179F, A180E, S181R); 好ましくは: S6C, S71C, M168L, (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), (K56R, K69R, K122R), (K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K), 及び/または(K56R, K59R, K69R, K122R, L118C-A134C)を含むFGF21類似体である。この実施形態は、FGF21の成熟部分における、構成する、単一及び複数の、または組み合わされた置換を有する、本発明の新規類似体を含む。単一の置換は最初に、次いで、最初の置換の後で、増加する数の置換の次に、組み合わされた置換が番号順で記載される。
ある実施形態は、Y179F, A180E 及びS181KもしくはS181R (i)を含み; 好ましくはV169aT, P171L, S172E, Q173A 及びG174V (ii)をさらに含み; より好ましくはL166F, S167G 及びM168L (iii)をさらに含み; 非常に好ましくは(i), (ii)及び(iii)を含むFGF21類似体である。
ある実施形態において、前述の実施形態のいずれかのFGF21類似体は、配列番号1の位置-1でMetをさらに含んでもよい。
ある実施形態は、以下：(l) Met-Gly-FGF21, (m) Met-Gly-FGF21-M168L, (n) Met-Cys-FGF21, (o) Gly-FGF21-M168L, (p) Gly-FGF21, (q) Met-Ser-FGF21,または(r) Ser-FGF21から選択されるFGF21類似体であり、ここでFGF21は配列番号1のポリペプチドを示す。
ある実施形態は、配列番号1と比較して、最大で25アミノ酸残基, 好ましくは最大で20アミノ酸残基, より好ましくは最大で15アミノ酸残基, より一層好ましくは最大で10アミノ酸残基, または非常に好ましくは最大で6アミノ酸残基のN末端伸長を有するFGF21類似体であり、ここで、少なくとも50%, 好ましくは少なくとも60%, より好ましくは少なくとも70%, より一層好ましくは少なくとも80%, または非常に好ましくは少なくとも90%のN末端伸長アミノ酸がグリシンまたはセリンである。
ある実施形態は、配列番号1と比較して、以下のN末端伸長：(q) MS-FGF21, (s) MSGSGSGSGSG-, (t) MGGGGG-, (u) MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, (v) MSGGGGG-, (x) MSGSGGS-, (y) MSGGSSG-, 及び(z) MSGSGSG-;並びにN末端Metを有さない実施形態(q), (s), (t), (u), (v), (x), (y), 及び(z)のいずれか1つを含むFGF21類似体である。
ある実施形態は、以下：(r) MSGSGSGSGSG-FGF21, (s) MGGGGG-FGF21, (t) MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-FGF21, (u) MSGGGGG-FGF21, (v) MSGSGGS-FGF21, (x) MSGGSSG-FGF21及び(y) MSGSGSG-FGF21、並びにN末端Metを有さない実施形態(r), (s), (t), (u), (v), (x)及び(y)のいずれか1つから選択されるFGF21類似体であって、ここでFGF21は配列番号1を差す。
ある実施形態は、位置146でP(プロリン）を有する前述の実施形態のいずれかのFGF21類似体であって、ここで該位置番号は配列番号1を参照する。
一実施形態において、FGF21類似体は、Met-FGF21の有効性に対して少なくとも1％の有効性を有し、ここで、有効性は3T3-L1脂肪細胞におけるグルコース取込を測定することによって測定される。
一実施形態において、FGF21類似体は、Met-FGF21の有効性に対して少なくとも5%, 好ましくは少なくとも10%, より好ましくは少なくとも20%, より一層好ましくは少なくとも30%, または非常に好ましくは少なくとも40%の有効性を有する。
一実施形態において、FGF21類似体は、Met-FGF21の有効性に対して少なくとも50%, 好ましくは少なくとも60%, より好ましくは少なくとも70%, より一層好ましくは少なくとも80%, または非常に好ましくは少なくとも90%の有効性を有する。
一実施形態において、FGF21類似体は、Met-FGF21の有効性に対して少なくとも100%, 好ましくは少なくとも120%, より好ましくは少なくとも140%, より一層好ましくは少なくとも160%, または非常に好ましくは少なくとも180%の有効性を有する。
一実施形態において、FGF21類似体は、Met-FGF21の有効性に対して少なくとも200%, 好ましくは少なくとも250%, より好ましくは少なくとも300%, より一層好ましくは少なくとも350%, または非常に好ましくは少なくとも400%の有効性を有する。
有効性は、FGF21誘導体に関して前述されたように決定される。
本発明のFGF21類似体は、ビヒクルコントロールと比較して、db/dbマウスにおける血中グルコースを低下可能である。
一実施形態において、mMでの平均血中グルコース測定値に基づいて、対応するビヒクルコントロールと比較して、血中グルコースは少なくとも1%, 好ましくは少なくとも2%, より好ましくは少なくとも3%, より一層好ましくは少なくとも4%, または非常に好ましくは少なくとも5%低下する。実施例10における試験方法を参照されたい。
用語「安定である」、つまり、安定性は、前述のように決定される有効性を差す。
一実施形態において、H202でのインキュベーション後の本発明の類似体の有効性は、少なくとも15%, 好ましくは少なくとも20%, より好ましくは少なくとも30%, より一層好ましくは少なくとも40%, または非常に好ましくは少なくとも50%であり、ここで、有効性は、同様に処理されるMet-FGF21、ただしH202処理はない、に対するものである。
これらの類似体は酸化安定性であることが好ましい。
一実施形態において、FGF21（配列番号1）と比較して、以下の修正：(i)N末端でMet-Gly-, (ii) M168L, (iii) 実施形態(i)かつ(ii), (iv)N末端でMet-Cys-, (v)N末端でGly-, (vi)実施形態(v)かつ(ii), (vii)N末端でMet-Ser- ,あるいは(iix)N末端でSer-を類似体は含んでおり； 好ましくはFGF21類似体は以下：(l) Met-Gly-FGF21, (m)Met-Gly-FGF21-M168L, (n)Met-Cys-FGF21, (o)Gly-FGF21-M168L, (p)Gly-FGF21, (q)Met-Ser-FGF21,または(r) Ser-FGF21から選択され、ここで、FGF21は必要に応じて位置146でP（プロリン）を有する配列番号1のポリペプチドを差す。
FGF21類似体を含むFGF21化合物、及びFGF21化合物の誘導体は、類似の化合物に関して記述されるように同様に製造可能である。より具体的には、以下の特定の実施例を参照する。
以下の実施例1及び2は、大腸菌におけるFGF21及びFGF21類似体のクローニング及び発現を記載する。代替的に、FGF21及び、N末端伸長を場合により有する、FGF21類似体は、下記のように酵母において発現可能である。
N末端アミノ酸伸長を有するFGF21は、出芽酵母で発現可能である。一実施形態において、これは、PMT2, PEP4及びYPS1が破壊されている株を作成することにある株の設計を必要とする。この株は、それぞれの遺伝子座で特定の組み込みを可能にする相同組み換えを利用する伝統的な技術を用いて設計可能である。N末端伸長を有するFGF21は、出芽酵母において維持可能である、出芽酵母発現ベクターにおいてコードされる。FGF21類似体を分泌経路に導くために、シグナルペプチドを含むプリプロ配列（例えば、MFアルファプリプロリーダー配列）が組み換え発現ベクター中に提供されてよい。この配列は、正しいリーディングフレームでFGF21類似体をコードするDNAに連結される。このシグナルペプチドは培地への分泌を確実にする。FGF21類似体配列に上流でかつ近接して、二ベースのアミノ酸配列が、培地への分泌の前にFGF21類似体からのプリプロ配列の開裂を確実にするために配置される。開裂はKEX2活性により引き起こされるであろう。FGF21類似体を培地から収集可能である。
FGF化合物の誘導体及びFGF21類似体は、必要があれば、例えばインスリンなどの他の医薬とともに製剤化されてよい。
以下の章におけるすべての実施形態、すなわち実施形態1から180は、可能な限度で、以下の請求1に従う。
さらなる特定の実施形態
1. 式A-B-C-D-E-のアルブミンバインダーが共有結合しているFGF21化合物の誘導体であって、ここで、
A-は式 I, IIまたはIIIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、nは10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18または19であり、*は-B-との結合点であり;
-B-は存在しないか、結合を表すか、あるいは-B1-, -B2-またはそれらの組み合わせから選択され、ここで、-B1- は式 IV, V, VIまたはVIIの要素であり：
Figure 0005599822
ここで、*は-B2-または-C-との結合点であり、かつ#はA-または‐B2-との結合点であり;及び-B2-は式 IIXまたはIXの要素、あるいは式 IIX 及び/または式 IXの最大4つの要素の組み合わせであり：
Figure 0005599822
ここで、bは0, 1または2であり、cは0, 1または2であり、ただしcが0であるときbは1または2であり、cが1または2であるときbは0であり、*は-C-, -B1-または別の-B2-との結合点であり、かつ#はA-, -B1-または別の-B2-との結合点であり；または
Figure 0005599822
ここで、dは1または2であり、eは0, 1または2であり、*は-C-または-B1-との結合点であり、かつ#はA-または-B1-との結合点であり;
-C-は存在しないか、結合を表すか、あるいは式 XまたはXIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、pは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、qは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-D-、-E-またはFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-B-との結合点であり;または
Figure 0005599822
ここで、kは0, 1, 2, 3, 4, 5, 11または23であり、mは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-D-, -E-またはFGF21化合物との結合点であり;かつ#は-B-との結合点であり;
-D-は存在しないか、結合を表すか、あるいは式 XIIまたはXIIIの要素であり:
#-NH-(CH2)r-NH-CO-(CH2)s-* (式 XII)または
#-NH-(CH2)t-* (式 XIII),
ここで、rは2, 3, 4または5であり、sは1, 2, 3または4であり、tは1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-E-またはFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-C-との結合点であり;
-E-は存在しないか、結合を表すか、あるいは式 XXII, XXIII, XXIIIa, XXIV, XXIVa, XXV, XXVIまたはXXVIIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、*はFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-D-または-C-の結合点である;
誘導体、あるいはそれらの医薬に許容できる塩。
2．式A-B-C-D-E-のアルブミンバインダーが共有結合しているFGF21化合物の誘導体であって、ここで、
A-は式 I, IIまたはIIIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、nは10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18または19であり、*は-B-との結合点であり;
-B-は存在しないか、結合を表すか、あるいは-B1-, -B2-またはこれらの組み合わせから選択され、ここで、-B1-は式 IV, V, VIまたはVIIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで*は-B2-または-C-との結合点であり、かつ#はA-または‐B2-との結合点であり;及び-B2-は式 IIXまたはIXの要素であり、あるいは式 IIX 及び/または式 IX 及び/または式 XXVIIの最大4つの要素の組み合わせであり：
Figure 0005599822
ここで、bは0, 1または2であり、cは0, 1または2であり、ただしcが0であるときbは1または2であり、cが1または2であるときbは0であり、*は-C-, -B1-または別の-B2-との結合点であり、かつ#はA-, -B1-または別の-B2-との結合点であり；または
Figure 0005599822
ここで、dは1または2であり、eは0, 1または2であり、*は-C-または-B1-との結合点であり、かつ#はA-または-B1-との結合点であり;または
#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式 XXVIII)
ここで、uは2, 3または4であり、*は-C-または-B1-との結合点であり、#はA-または-B1-との結合点であり;
-C-は存在しないか、結合を表すか、または式 XまたはXIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、pは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、qは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-D-、-E-またはFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-B-との結合点であり;または
Figure 0005599822
ここで、kは0, 1, 2, 3, 4, 5, 11または23であり、mは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-D-, -E-またはFGF21化合物との結合点であり;かつ#は-B-との結合点であり;
-D-は存在しないか、結合を表すか、あるいは式 XIIまたはXIIIの要素であり:
#-NH-(CH2)r-NH-CO-(CH2)s-* (式 XII)または
#-NH-(CH2)t-* (式 XIII),
ここで、rは2, 3, 4または5であり、sは1, 2, 3または4であり、tは1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-E-またはFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-C-との結合点であり;
-E-は存在しないか、結合を表すか、あるいは式 XXII, XXIII, XXIIIa, XXIV, XXIVa, XXV, XXVIまたはXXVIIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、*はFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-D-または-C-との結合点である;
誘導体、あるいはそれらの医薬に許容できる塩。
3. Aが式(III)の要素である場合に、-B-, -C-, -D- 及び -E-の少なくとも1つが存在し、及び／または結合を表さない、実施形態1または2の誘導体。
4. -B-及び-C-が存在し、かつ結合を表さない、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つの誘導体。
5. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる、式A-B-C-D-E-のアルブミンバインダーが共有結合しているFGF21化合物の誘導体であって、
A- は式 I, IIまたはIIIであり:
Figure 0005599822
ここで、nは10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18または19であり、*は-B-との結合点であり;
-B-は-B1-, -B2-またはそれらの組み合わせであり、ここで、-B1-は式 IV, V, VIまたはVIIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、*は-B2-または-C-との結合点であり、かつ#はA-または-B2-との結合点であり;及び-B2-は式 IIX, IXまたはXXVIIIの要素、あるいは式 IIX 及び/または式 IX 及び/または式 XXVIIIの最大4つの要素の組み合わせであり：
Figure 0005599822
ここで、bは0, 1または2であり、cは0, 1または2であり、ただしcが0であるときbは1または2であり、cが1または2であるときbは0であり、*は-C-, -B1-または別の-B2-との結合点であり、かつ#はA-, -B1-または別の-B2-との結合点であり；
Figure 0005599822
ここで、dは1または2であり、eは0, 1または2であり、*は-C-または-B1-との結合点であり、かつ#はA-または-B1-との結合点であり;または
#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式 XXVIII)
ここで、uは2, 3または4であり、*は-C-または-B1-との結合点であり、かつ#はA-または-B1-との結合点であり;
-C-は式 XまたはXIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、pは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、qは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-D-、-E-またはFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-B-との結合点であり;または
Figure 0005599822
ここで、kは0, 1, 2, 3, 4, 5, 11または23であり、mは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-D-, -E-またはFGF21化合物との結合点であり;かつ#は-B-との結合点であり;
-D-は場合により存在し、存在する場合には式 XIIまたはXIIIの要素であり:
#-NH-(CH2)r-NH-CO-(CH2)s-* (式 XII)または
#-NH-(CH2)t-* (式 XIII),
ここで、rは2, 3, 4または5であり、sは1, 2, 3または4であり、tは1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-E-またはFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-C-との結合点であり;
-E-は場合により存在し、存在する場合には結合、あるいは式 XXII, XXIII, XXIIIa, XXIV, XXIVa, XXV, XXVIまたはXXVIIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、*はFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-D-または-C-の結合点である;
誘導体、あるいはそれらの医薬に許容できる塩。
6. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる、式A-B-C-D-E-のアルブミンバインダーが共有結合しているFGF21化合物の誘導体であって、
A- は式 I, IIまたはIIIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、nは10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18または19であり、*は-B-との結合点であり;
-B-は-B1-, -B2-またはそれらの組み合わせであり、ここで、-B1-は式 IV, V, VIまたはVIIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、*は-B2-または-C-との結合点であり、かつ#はA-または-B2-との結合点であり;及び-B2-は式 IIXまたはIXの要素、あるいは式 IIX 及び/または式 IXの最大4つの要素の組み合わせであり：
Figure 0005599822
ここで、bは0, 1または2であり、cは0, 1または2であり、ただしcが0であるときbは1または2であり、cが1または2であるときbは0であり、*は-C-, -B1-または別の-B2-との結合点であり、かつ#はA-, -B1-または別の-B2-との結合点であり、または
Figure 0005599822
ここで、dは1または2であり、eは0, 1または2であり、*は-C-または-B1-との結合点であり、かつ#はA-または-B1-との結合点であり;
-C-は式 XまたはXIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、pは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、qは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-D-、-E-またはFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-B-との結合点であり;または
Figure 0005599822
ここで、kは0, 1, 2, 3, 4, 5, 11または23であり、mは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-D-, -E-またはFGF21化合物との結合点であり;かつ#は-B-との結合点であり;
-D-は場合により存在し、存在する場合には式 XIIまたはXIIIの要素であり:
#-NH-(CH2)r-NH-CO-(CH2)s-* (式 XII)または
#-NH-(CH2)t-* (式 XIII),
ここで、rは2, 3, 4または5であり、sは1, 2, 3または4であり、tは1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-E-またはFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-C-との結合点であり;
-E-は場合により存在し、存在する場合には結合、あるいは式 XXII, XXIII, XXIIIa, XXIV, XXIVa, XXV, XXVIまたはXXVIIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、*はFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-D-または-C-との結合点である;
誘導体、あるいはそれらの医薬に許容できる塩。
7. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる、FGF21化合物のチオール基に対して、式A-B-C-D-E-のアルブミンバインダーが共有結合しているFGF21化合物の誘導体であって、
A- は式 I, IIまたはIIIであり:
Figure 0005599822
ここで、nは10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18または19であり、*は-B-との結合点であり;
-B-は-B1-, -B2-またはそれらの組み合わせであり、ここで、-B1-は式 IV, V, VIまたはVIIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、*は-B2-または-C-との結合点であり、かつ#はA-または-B2-との結合点であり;及び-B2-は式 IIXまたはIXの要素、あるいは式 IIX 及び/または式 IXの最大4つの要素の組み合わせであり：
Figure 0005599822
 ここで、bは0, 1または2であり、cは0, 1または2であり、ただしcが0であるときbは1または2であり、cが1または2であるときbは0であり、*は-C-, -B1-または別の-B2-との結合点であり、かつ#はA-, -B1-または別の-B2-との結合点であり、または
Figure 0005599822
 ここで、dは1または2であり、eは0, 1または2であり、*は-C-または-B1-との結合点であり、かつ#はA-または-B1-との結合点であり;
-C-は式 XまたはXIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、pは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、qは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-D-、-E-またはFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-B-との結合点であり;または
Figure 0005599822
ここで、kは0, 1, 2, 3, 4, 5, 11または23であり、mは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-D-, -E-またはFGF21化合物との結合点であり;かつ#は-B-との結合点であり;
-D-は式 XIIまたはXIIIの要素であり:
#-NH-(CH2)r-NH-CO-(CH2)s-* (式 XII)または
#-NH-(CH2)t-* (式 XIII)
ここで、rは2, 3, 4または5であり、sは1, 2, 3または4であり、tは1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-E-またはFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-C-との結合点であり;
-E-は式 XXII, XXIII, XXIIIa, XXIV, XXIVa, XXV, XXVIまたはXXVIIの要素であり:
Figure 0005599822
 ここで、*はFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-D-または-C-の結合点である;
誘導体、あるいはそれらの医薬に許容できる塩。
8. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる、特に前の実施形態による、誘導体であって、
-E-は式 XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVIまたはXXVIIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、*はFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-D-または-C-の結合点である;
誘導体、あるいはそれらの医薬に許容できる塩。
9. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、A- は式 Iの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、nは本明細書で規定したとおりである、誘導体。
10. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、nは14, 16または18、好ましくは14または１６である、誘導体。
11. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、A- は式 Iの要素であり、好ましくはnが13である、誘導体。
12. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、-B-は-B1-、好ましくは式IVまたはV：
Figure 0005599822
の要素を含む、誘導体。
13. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、-B-は-B2-、好ましくは式IIX：
Figure 0005599822
の1つまたは2つの要素を含み、ここで、より好ましくはcが0であり、かつbが2であるか、またはcが0であり、かつbが1である、誘導体。
14. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、-B-は-B2-、より正確には式IX：
Figure 0005599822
の要素を含み、ここで、好ましくはdが1であり、かつeが2である、誘導体。
15. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで-B-が結合である、誘導体。
16. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、-C-が式X：
Figure 0005599822
の要素であり、ここで、好ましくはqは 0, 1, 2, 3または4であり、より好ましくはqは1または2であり、より一層好ましくはqは2である、誘導体。
17. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、-C-が式X：
Figure 0005599822
 の要素であり、ここで、好ましくはpは1または2であり、より好ましくはpは1である、誘導体。
18. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、pは1であり、かつqは1または2であり、好ましくはpは1であり、かつqは2である、誘導体。
19. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、-C-は式XI：
Figure 0005599822
の要素であり、ここで、好ましくは、mは0, 1または2であり、より好ましくはmは1または2である、誘導体。
20. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、-C-は式XI：
Figure 0005599822
の要素であり、ここで、好ましくは、kは1, 2, 3, 4, 5または11であり、より好ましくは、kは5である、誘導体。
21. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、mは1であり、かつkは4, 5または11であり、好ましくはmは1であり、かつkは5である、誘導体。
22. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、-D-は式XII：
#-NH-(CH2)r-NH-CO-(CH2)s-* (式 XII)
の要素であり、ここで、好ましくは、rは2であり、及び/または、好ましくは、sは1また2であり、非常に好ましくは、rは2であり、かつsは2である、誘導体。
23. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、-D-は式XIII：
#-NH-(CH2)t-* (式 XIII),
の要素であり、ここで、好ましくは、tは1, 2または3であり、より好ましくは、tは2である、誘導体。
24. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、-D-は存在していない、誘導体。
25. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、-E-は式 XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVIまたはXXVII:
Figure 0005599822
の要素である、誘導体。
26. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、-E-は式 XXII, XXIII, XXIIIa, XXVまたはXXVI:
Figure 0005599822
の要素である、誘導体。
27. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、Eは式XXIVの要素である、誘導体。
28. 式 A-B-C-D-E-の1つまたは2つのアルブミンバインダーを有する、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
29. 式 A-B-C-D-E-の1つのアルブミンバインダーを有する、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、A-は式 IまたはIIであり、
-B-は結合であるか、あるいは式 IIXまたはIXの要素であり、
-C-は式Xの要素であり、
-D-は式 XIIまたはXIIIの要素であり、かつ
-E-は式 XXIIまたはXXIVの要素であり、かつ
好ましくは、nは13, 14または16であり、bは2であり、dは1であり、eは2であり、pは1であり、qは2であり、rは2であり、sは2であり、かつtは2である、
誘導体。
30. 2つのアルブミンバインダーを有する、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
31. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、A-は式I, IIまたはIII:
Figure 0005599822
の要素であり、ここで、nは10, 11, 12または13である、誘導体。
32. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、A-は式I, IIまたはIII:
Figure 0005599822
の要素であり、ここで、nは8, 9, 10, 11, 12または13である、誘導体。
33. 1つのアルブミンバインダーを有する、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
34. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、A-は式I, IIまたはIII:
Figure 0005599822
の要素であり、ここで、nは14, 15, 16, 17, 18または19である、誘導体。
35. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、A-は式I, IIまたはIII:
Figure 0005599822
の要素であり、ここで、nは12, 13, 14, 15, 16, 17または18である、誘導体。
36. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる、式 A-B-C-D-E-のアルブミンバインダーが共有結合しているFGF21化合物の誘導体であって、
ここで、A-B-C-D-E-が以下の式(1)-(14)：
Figure 0005599822
Figure 0005599822
から選択される、誘導体；あるいは対応する誘導体のいずれか1つの医薬に許容できる塩。
37. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる、式 A-B-C-D-E-のアルブミンバインダーが共有結合しているFGF21化合物の誘導体であって、
ここで、A-B-C-D-E-が以下の式(1)-(12)：
Figure 0005599822
Figure 0005599822
から選択される、誘導体；あるいは対応する誘導体のいずれか1つの医薬に許容できる塩。
38. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、アルブミンバインダーの結合がシステイン残基のチオール基を介して生じる、誘導体。
39. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、アルブミンバインダーがFGF21化合物の位置-1、6、71及び122から選択される1または複数の位置でシステイン残基に結合し、ここで、位置番号は配列番号1を参照することによる、誘導体。
40. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる、実施例4、5及び6の誘導体、好ましくは、以下：
S-122-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-エチル)-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル] [Cys122]-Met-FGF21 (化合物F);
S-71-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-エチル)-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル] [Cys71]Met-FGF21 (化合物H); 及び
S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [Cys71]Met-FGF21 (化合物O)
から選択される化合物;あるいはこれらの化合物のいずれか1つの医薬に許容できる塩。
41. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる、FGF21化合物のアミノ基に共有結合している式A-B-C-のアルブミンバインダーを有するFGF21化合物の誘導体であって、
ここで、A-は式 I, IIまたはIII：
Figure 0005599822
の要素であり、ここでnは10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18または19であり、*は-B-との結合点であり;
-B-は-B1-, -B2-またはこれらの組み合わせであり、ここで、-B1-は式 IV, V, VIまたはVII:
Figure 0005599822
の要素であり、ここで、*は-B2-または-C-との結合点であり、かつ#はA-または-B2-との結合点であり;及び-B2-は式 IIXまたはIXの要素であるか、あるいは式 IIX 及び/または式 IXの最大で4つの要素の組み合わせであり：
Figure 0005599822
ここで、bは0, 1または2であり、かつcは0, 1または2であるが、ただし、cが0である時bは1または2であり、及びcが1または2である時bは0であり、*は-C-, -B1-または他の-B2-との結合点であり、かつ#はA-, -B1-または他の-B2-との結合点であり、あるいは
Figure 0005599822
ここで、dは1または2であり、eは0, 1または2であり、*は-C-または-B1-との結合点であり、かつ#はA-または-B1-との結合点であり;及び
-C-は式 XまたはXIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、pは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、qは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*はFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-B-との結合点であり;または
Figure 0005599822
ここで、kは0, 1, 2, 3, 4, 5, 11または23であり、mは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*はFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-B-との結合点である;
誘導体、あるいはその医薬に許容できる塩。
42. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる、FGF21化合物のアミノ基に共有結合している式A-B-C-のアルブミンバインダーを有するFGF21化合物の誘導体であって、
ここで、A-は式I, IIまたはIII:
Figure 0005599822
の要素であり、ここでnは10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18または19であり、*は-B-との結合点であり;
-B-は-B1-, -B2-またはこれらの組み合わせであり、ここで、-B1-は式 IV, V, VIまたはVII:
Figure 0005599822
の要素であり、ここで、*は-B2-または-C-との結合点であり、かつ#はA-または-B2-との結合点であり;及び-B2-は式 IIXまたは IXの要素であるか、あるいは式 IIX 及び/または式 IXの最大で4つの要素の組み合わせであり：
Figure 0005599822
ここで、bは0, 1または2であり、かつcは0, 1または2であるが、ただし、cが0である時bは1または2であり、及びcが1または2である時bは0であり、*は-C-, -B1-または他の-B2-との結合点であり、かつ#はA-, -B1-または他の-B2-との結合点であり、あるいは
Figure 0005599822
ここで、dは1または2であり、eは0, 1または2であり、*は-C-または-B1-との結合点であり、かつ#はA-または-B1-との結合点であり;または
#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式 XXVIII)
ここで、uは2, 3または4であり、*は-C-または-B1-との結合点であり、#はA-または-B1-との結合点であり;
-C-は式 XまたはXIの要素であり:
Figure 0005599822
ここで、pは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、qは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*はFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-B-との結合点であり;または
Figure 0005599822
ここで、kは0, 1, 2, 3, 4, 5, 11または23であり、mは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*はFGF21化合物との結合点であり;かつ#は-B-との結合点である;
誘導体、あるいはそれらの医薬に許容できる塩。
43. 好ましくは実施形態1-3及び29のいずれか1つによる、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、A-は式Iの要素：
Figure 0005599822
である誘導体。
44. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、nは14、16または18である、誘導体。
45. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、-B-は-B1-、好ましくは式IVまたはV：
Figure 0005599822
の要素を含む、誘導体。
46. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、-B-は-B2-、好ましくは式IIX：
Figure 0005599822
の1つまたは2つの要素を含み、ここで、より好ましくは、cは0でありbは2であるか、またはcは0でありbは1である、誘導体。
47. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、-B-は-B2-、好ましくは、式IX：
Figure 0005599822
の1つまたは2つの要素を含み、ここで、より好ましくはdは1でありeは2であるか、またはdは2でありeは1である、誘導体。
48. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、-B-は-B2-、好ましくは、式XXVIII：
#-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式 XXVIII)
の1つまたは2つの要素を含み、ここで、より好ましくは、uは3である、誘導体。
49. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、-C-は式X：
Figure 0005599822
の要素であり、ここで、好ましくは、qは0, 1, 2, 3または4であり、より好ましくは、qは1または2である、誘導体。
50. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、-C-は式X：
Figure 0005599822
の要素であり、ここで、好ましくは、pは1または2であり、より好ましくは、pは1である、誘導体。
51. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、pは1でありqは1または2であり、好ましくはpは1でありqは2である、誘導体。
52. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、-C-は式XI：
Figure 0005599822
の要素であり、ここで好ましくは、mは0, 1または2であり、より好ましくは、mは1または2である、誘導体。
53. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、-C-は式XI：
Figure 0005599822
の要素であり、好ましくは、kは1, 2, 3, 4, 5または11であり、より好ましくは、kは5である、誘導体。
54. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、mは1でありkは4, 5または11であり、 好ましくは、mは1でありkは5である、誘導体。
55. 式A-B-C-の1つまたは2つのアルブミンバインダーを有する、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
56. 2つのアルブミンバインダーを有する、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
57. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、A-は式I, IIまたはIII：
Figure 0005599822
 の要素であり、nは10, 11, 12または13である、誘導体。
58. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、A-は式I, IIまたはIII：
Figure 0005599822
 の要素であり、ここで、nは8, 9, 10, 11, 12または13である、誘導体。
59. 1つのアルブミンバインダーを有する、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
60. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、A-は式I, IIまたはIII：
Figure 0005599822
の要素であり、ここで、nは14, 15, 16, 17, 18または19である、誘導体。
61. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、
ここで、A-は式I, IIまたはIII：
Figure 0005599822
の要素であり、nは12, 13, 14, 15, 16, 17, 18または19である、誘導体。
62. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる、式A-B-C-のアルブミンバインダーが共有結合しているFGF21化合物の誘導体であって、ここで、A-B-C-は以下の式(13)-(19)：
Figure 0005599822
から選択される、誘導体；あるいは対応する誘導体のいずれかの医薬に許容できる塩。
63. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる、式A-B-C-のアルブミンバインダーが共有結合しているFGF21化合物の誘導体であって、
ここで、A-B-C-は以下の式(13)-(15)：
Figure 0005599822
から選択される、誘導体；あるいは対応する誘導体のいずれかの医薬に許容できる塩。
64. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、アルブミンバインダーの結合がN末端アミノ基のアミノ基を介して生じる、誘導体。
65. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、アルブミンバインダーの結合がリジン残基のイプシロンアミノ基を介して生じる、誘導体。
66. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、一方のアルブミンバインダーがN末端アミノ酸残基に結合し、他方が内部リジン残基に結合する、誘導体。
67. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、FGF21化合物の位置56, 59, 69, 122及び152から選択される1または複数の位置で、アルブミンバインダーがリジン残基に結合しており、該位置番号は配列番号1を参照する、誘導体。
68. 好ましくは実施例7、好ましくは以下：
N-アルファ1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタ-デカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] [Arg56, Arg59, Arg69, Arg122]-Met-FGF21 (化合物V)
である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体; またはその医薬に許容できる塩。
69. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、FGF21は、配列番号1に対して、少なくとも80％、好ましくは、少なくとも85%, より好ましくは少なくとも90%, より一層好ましくは少なくとも95%の同一性を有する、誘導体。
70. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、FGF21化合物は、配列番号1と比較して、最大で36のアミノ酸の修飾、好ましくは最大で30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11,10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2または1のアミノ酸の変更；あるいは最大で15, 14, 13, 12, 11または10のアミノ酸の修飾；より一層好ましくは最大で9, 8, 7, 6または5のアミノ酸の修飾；または非常に好ましくは最大で4, 3, 2または1のアミノ酸の修飾を有する、誘導体。
71. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、最大で25アミノ酸残基, 好ましくは最大で20アミノ酸残基, より好ましくは 最大で15アミノ酸残基, より一層好ましくは最大で10アミノ酸残基, または非常に好ましくは、最大で6アミノ酸残基のN末端伸張を有する、誘導体。
72. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、FGF21化合物は、少なくとも50%, 好ましくは少なくとも60%, より好ましくは少なくとも70%, より一層好ましくは少なくとも80%, または非常に好ましくは少なくとも90%のN末端伸張アミノ酸残基がグリシンまたはセリンである、誘導体。
73. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、FGF21化合物は配列番号1のアミノ酸配列を含む、誘導体。
74. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、FGF21化合物は、
(a)配列番号1と比較して、少なくとも1つの以下の修飾：-1M, -1G, -1C, -1S, S6C, S6K, A26E, Q27E, Q28R, A31E, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, L118C, K122C, K122R, A134C, I152K, L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, 及び/またはS181K,R (好ましくは少なくとも1つの以下：-1M, -1G, -1C, -1S, S6C, S6K, A26E, Q27E, Q28R, A31E, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, L118C, K122C, K122R, A134C, I152K 及び/またはM168L)；及び/または、
(b)配列番号1と比較して、最大で25アミノ酸残基, 好ましくは最大で20アミノ酸残基, より好ましくは最大で15アミノ酸残基, より一層好ましくは最大で10アミノ酸残基, または非常に好ましくは最大で6アミノ酸残基のN末端伸長であって、ここで、N末端伸長アミノ酸残基の、少なくとも50%, 好ましくは少なくとも60%, より好ましくは少なくとも70%, より一層好ましくは少なくとも80%, または非常に好ましくは少なくとも90%はGまたはSである、N末端伸張
を含む、誘導体。
75. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、FGF21化合物は、
(a)配列番号1と比較して、以下の修飾：
(i) K122C, (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K), D102T, A26E, (Q28R, A31E), Q27E, M168L, (Y179F, A180E, S181R), (V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K), 及び/または(L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) (好ましくはK122C, (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K), D102T, A26E, (Q28R, A31E), Q27E, 及び/またはM168L),
(ii) -1G, 及び(-1G, M168L),または
(iii) S6C, (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R),及び(S6K, K56R, K59R, K69R, K122R)
であって、ここで、(i)及び(iii)のFGF21化合物はさらに場合によりN末端Mを含んでよい、修飾；
及び/または
(b)配列番号1と比較して、以下：(iv) MG-, MC-, MS-, MSGSGSGSGSG-, MGGGGG-, MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, MSGGGGG-, MSGSGGS-, MSGGSSG-, 及びMSGSGSG-から選択されるN末端伸長であって、
ここで、(iv)のFGF21化合物それぞれにおけるN末端Mは場合により欠失していてもよい、N末端伸長
を含む、誘導体。
76. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、FGF21化合物は、配列番号1と比較して、以下の置換：(a) K122C; (b) (K59R, K69R, K122R); (c) (K56R, K69R, K122R); (d) (K56R, K59R, K69R); (e) S71C; (f) S6C; (g) (K56R, K59R, K69R, K122R); (h) (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K); (i) (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R); (j) (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R);または(k) M168Lを含む、誘導体。
77. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、FGF21化合物は、配列番号1と比較して、以下の修正：Y179F, A180E及びS181KまたはS181R(i); 好ましくは追加でV169aT, P171L, S172E, Q173A及びG174V (ii); より好ましくは追加でL166F, S167G及びM168L (iii); 非常に好ましくは (i), (ii)かつ(iii)を含み、ここで、各実施形態は独立に、そして場合により、N末端M（例えば-1M）を含む、誘導体。
78. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、FGF21化合物は、FGF21（配列番号1）と比較して、以下の修正：(i)N末端でMet-Gly-, (ii) M168L, (iii)実施形態(i)かつ(ii), (iv)N末端でMet-Cys-, (v)N末端でGly-, (vi)実施形態(v)かつ(ii), (vii) N末端でMet-Ser-,または(iix) N末端でSer-を含み; 好ましくは、FGF21化合物は、以下: (l) Met-Gly-FGF21, (m) Met-Gly-FGF21-M168L, (n) Met-Cys-FGF21, (o) Gly-FGF21-M168L, (p) Gly-FGF21, (q) Met-Ser-FGF21,または(r) Ser-FGF21から選択され;ここで、FGF21は配列番号1のポリペプチドを参照する、誘導体。
79. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、FGF21化合物は、配列番号1と比較して、以下のN末端伸張： (q) MS-FGF21, (s) MSGSGSGSGSG-, (t) MGGGGG-, (u) MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, (v) MSGGGGG-, (x) MSGSGGS-, (y) MSGGSSG- 及び(z) MSGSGSG-;並びにN末端Mを有さない実施形態(q), (s), (t), (u), (v), (x), (y)及び(z)のいずれか1つを含む、誘導体。
80. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、FGF21化合物は、配列番号1のポリペプチドの以下の変異体： (a) K122C, (e) S71C, (f) S6C, (n) Met-Cys-FGF21, N末端Metを有する化合物(a), (e)及び(f), 並びにN末端Metを有さない化合物(n)から選択される、誘導体。
81. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、FGF21化合物は、配列番号1のポリペプチドの以下の変異体：(b) (K59R, K69R, K122R); (c) (K56R, K69R, K122R); (d) (K56R, K59R, K69R); (g) (K56R, K59R, K69R, K122R); (h) (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K); (i) (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R); (j) (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R); (k) (179F, 180E, 181R); (l) (169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K); 及び (m) (166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K); 並びにN末端Metを有する化合物(b), (c), (d), (g), (h), (i)及び(j)のいずれか1つ（好ましくは(b)-(j) +/- N末端Met)から選択される、誘導体。
82. 位置146でプロリンを有し、位置番号は配列番号1を参照する、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
83. マウスにおいて皮下注射で服用させたときに、少なくとも1.5時間, 好ましくは少なくとも2時間, より好ましくは少なくとも4時間, より一層好ましくは少なくとも5時間, または非常に好ましくは少なくとも6時間のT1/2を有する、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
84. マウスにおいて皮下注射で服用させたときに、少なくとも10時間, 好ましくは少なくとも15時間, より好ましくは少なくとも24時間, または非常に好ましくは少なくとも48時間のT1/2を有する、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
85. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、(i)マウスはdb/dbマウス、好ましくはレプチン受容体を欠失しているマウスであり、及び／または誘導体の服用量は0.5mg/kgである、誘導体。
86. Met-FGF21の有効性に対して、少なくとも1%, 好ましくは少なくとも5%, より好ましくは少なくとも10%, より一層好ましくは少なくとも20%, または非常に好ましくは少なくとも30%の有効性を有し、ここで、有効性は、3T3-L1脂肪細胞におけるグルコース取込を測定することによって決定される、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体、または可能な限度で以下の実施形態のいずれかによるFGF類似体。
87. Met-FGF21の有効性に対して、少なくとも40%, 好ましくは少なくとも50%, より好ましくは少なくとも60%, より一層好ましくは少なくとも70%の有効性を有する、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体、または可能な限度で以下の実施形態のいずれかによるFGF類似体。
88. Met-FGF21の有効性に対して、少なくとも80%, 好ましくは少なくとも90%, より好ましくは少なくとも100%, より一層好ましくは少なくとも110%, または非常に好ましくは少なくとも120%の有効性を有する、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体、または可能な限度で以下の実施形態のいずれかによるFGF類似体。
89.有効性はMet-FGF21のEC50に対する誘導体のEC50として計算される、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体、または可能な限度で以下の実施形態のいずれかによるFGF類似体。
90.3T3-L1脂肪細胞はマウス3T3-L1繊維芽細胞、好ましくはATCC CL-173由来である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体、または可能な限度で以下の実施形態のいずれかによるFGF類似体。
91. 3T3-L1脂肪細胞におけるグルコース取込は、実施例8に概略が説明されるようにして測定される、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体、または可能な限度で以下の実施形態のいずれかによるFGF類似体。
92.有効性は実施形態64-69のいずれか1つに記述されるようにして決定される、Met-FGF21の有効性に対して少なくとも1%の有効性を有する、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体、または可能な限度で以下の実施形態のいずれかによるFGF類似体。
93. Met-FGF21に対する有効性は少なくとも1%, 好ましくは少なくとも5%, より好ましくは少なくとも10%, より一層好ましくは少なくとも20%, または非常に好ましくは少なくとも30%である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体、または可能な限度で以下の実施形態のいずれかによるFGF類似体。
94. Met-FGF21に対する有効性は少なくとも40%, 好ましくは少なくとも50%,より好ましくは少なくとも60%, または非常に好ましくは少なくとも70%である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体、または可能な限度で以下の実施形態のいずれかによるFGF類似体。
95. Met-FGF21に対する有効性は少なくとも80%, 好ましくは少なくとも90%, より好ましくは少なくとも100%, より一層好ましくは少なくとも110%, または非常に好ましくは少なくとも120%である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体、または可能な限度で以下の実施形態のいずれかによるFGF類似体。
96. ビヒクルコントロールに対して、db/dbマウスにおいてin vivoで血中グルコースを低下可能である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体、または可能な限度で以下の実施形態のいずれかによるFGF類似体。
97. 血中グルコースは、誘導体の最後の服薬が投与された24時間後、好ましくは48時間後に低下する、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
98. 血中グルコースは、mMでの平均血中グルコース測定に基づいて、対応するビヒクルコントロールに対して、少なくとも10%, 好ましくは少なくとも15%, より好ましくは少なくとも20%, より一層好ましくは少なくとも25%, または非常に好ましくは少なくとも30%低下する、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体、または可能な限度で以下の実施形態のいずれかによるFGF類似体。
99. 血中グルコースは、少なくとも35%, 好ましくは少なくとも40%, より好ましくは少なくとも45%, または非常に好ましくは少なくとも50%低下する、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体、または可能な限度で以下の実施形態のいずれかによるFGF類似体。
100. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ここで、(i)db/dbマウスは雄であり、9-11週齢であり、(ii)誘導体は、皮下注射で投与され、(iii)誘導体の服用量は0.2-1.0 mg/kg, 好ましくは0.2, 0.4, 0.6, 0.8または1.0 mg/kgの範囲にあり、(iv)誘導体はPBSに溶解しており、(v)誘導体は、毎日、好ましくは1日、2日かつ3日目に、1回投薬され、(vi)ビヒクルコントロールはPBSを用いて、好ましくは、250 ul/50 gマウスで処置され、及び/または(vii)血中グルコースはグルコースオキシダーゼ方法を用いて、好ましくは、Biosen 5040などのグルコースアナライザーを用いて測定される、誘導体。
101. 可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体であって、ビヒクルコントロールがMet-FGF21に置き換えられた、誘導体。
102. 300 mM H202の存在下で1時間25°Cでインキュベーションすることによる酸化の後に、Met-FGF21よりも安定である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体、または可能な限度で以下の実施形態のいずれかによるFGF類似体。
103. 安定性が、実施形態70-75のいずれか１つによって決定される有効性を参照する、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体、または可能な限度で以下の実施形態のいずれかによるFGF類似体。
104. H202でインキュベーション後に、少なくとも15%, 好ましくは少なくとも20%, より好ましくは少なくとも30%, より一層好ましくは少なくとも40%, または非常に好ましくは少なくとも50%の有効性を有し、有効性は、同様に処理されるMet-FGF21、ただしH202処理はない、に対するものである、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体、または可能な限度で以下の実施形態のいずれかによるFGF類似体。
105. (i)誘導体及びMet-FGF2がともにPBS、pH7.2に溶解しており、及び／または(ii)誘導体及びMet-FGF21の濃度が1mg/mlである、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
106. 実施例4-7及び12-55に記載の特定の誘導体のいずれか１つである、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
107. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチル-カルバモイル}-メチル) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181K] Ala-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
108. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタ-デカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチル-カルバモイル}-メチル) [28R, 56R, 59R, 69R, S71C, 102T, 121Q, 122R, 166F, 167G, 168L, 170T] Ala-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
109. N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] [Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T] Ala-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
110. N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] [K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des S181] Ala-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
111. N-アルファ-1-[4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)-ブチリル] [K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des S181] Ala-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
112. N-アルファ-1-[4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)-ブチリル] [Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T] Ala-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
113. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチル-カルバモイル}-メチル) (Q28R, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
114. N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル-アミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) Gly-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
115. N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル-アミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) Ala-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
116. N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) Ser-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
117. N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
118. N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Gly-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
119. N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
120. N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ser-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
121. N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
122. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチル-カルバモイル}-メチル) (S71C, 121Q, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ala-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
123. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチル-カルバモイル}-メチル) (S71C, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ala-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
124. N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ala-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
125. N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ala-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
126. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) (S71C, 121Q, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ser-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
127. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) (S71C, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ser-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
128. N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ser-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
129. N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ser-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
130. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) (S71C, 121Q, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
131. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) (S71C, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
132. N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
133. N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
134. FGF化合物が、実施例2 (好ましくは実施例2a-2af), 56 (好ましくは実施例56a-56as) 及び 57 (好ましくは実施例57a-57v)に記載の特定の類似体のいずれか1つであるFGF類似体である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
135. FGF化合物が本明細書に記載の実施例4-7 及び12-55のいずれか1つに存在するFGF化合物である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
136. FGF化合物が (Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
137. FGF化合物が (S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des S181) Ala-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
138. FGF化合物が (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des S181) Ala-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
139. FGF化合物が (Q28R, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21である、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
140. FGF21化合物が、以下の実施形態のいずれか1つに記載のFGF21類似体のいずれか1つである、可能な限度で先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体。
141. (a) 配列番号1と比較して、少なくとも1つの以下の修飾：-1G, -1C, -1S, S6C, S6K, A26E, Q27E, Q28R, A31E, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, K122R, I152K, L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, 及び/またはS181K, R (好ましくは-1G, -1C, -1S, S6C, S6K, A26E, Q27E, Q28R, A31E, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, K122R, I152K, 及び/またはM168L); 及び/または(b) 配列番号1と比較して、最大で25アミノ酸残基, 好ましくは最大で20アミノ酸残基, より好ましくは最大で15アミノ酸残基, より一層好ましくは最大で10アミノ酸残基, または非常に好ましくは最大で6アミノ酸残基のN末端伸長であって、少なくとも50%, 好ましくは少なくとも60%, より好ましくは少なくとも70%, より一層好ましくは少なくとも80%, または非常に好ましくは少なくとも90%のN末端伸長アミノ酸残基はGまたはSである、N末端伸長
を含む、FGF21類似体。
142. (a) 配列番号1と比較して、少なくとも1つの以下の修飾：-1G, -1C, -1S, -1A, S6C, S6K, Q27E, Q28R, A31E, K56R, K59R, K69R, S71C, D102E, N121Q, D102T, K122R, I152K, L166F, S167G, M168L, V169aT, G170T, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E 及び/またはS181K,R (好ましくは-1G, -1C, -1S, S6C, S6K, A26E, Q27E, Q28R, A31E, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, K122R, I152K 及び/またはM168L);及び/または
(b) 配列番号1と比較して、最大で25アミノ酸残基, 好ましくは最大で20アミノ酸残基, より好ましくは最大で15アミノ酸残基, より一層好ましくは最大で10アミノ酸残基, または非常に好ましくは最大で6アミノ酸残基のN末端伸長であって、少なくとも50%, 好ましくは少なくとも60%, より好ましくは少なくとも70%, より一層好ましくは少なくとも80%, または非常に好ましくは少なくとも90%のN末端伸長アミノ酸残基はGまたはSである、N末端伸長
を含む、FGF21類似体。
143. (a) 配列番号1と比較して、少なくとも1つの以下の修飾： -1A, -1C, -1S, -1G, S6K, S6C, Q15F, V16K, D24K, A26E, Q27E, Q28R, A31E, K56R, K59R, K69R, S71C, D102E, D102N, D102T, des121D, D121D, D121Q, K122R, P143V, A145E, 145aP, 145bM, L146V, L146E, 148aD, P149L, P149E, P150R, G151E, I152E, I152K, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, I154F, I154R, P155S, P155G, Q156H, Q156S, P157L, P158L, P158E, D159E, D159S, V160D, V160T, G161M, G161D, S162F, S163M, D164S, L166F, S167E, S167G, M168T, M168A, M168I, M168L, M168S, V169D, 169aT, G170T, G170S, P171M, P171L, S172D, S172E, Q173P, Q173A, G174F, G174A, G174V, R175G, S176L, P177V, S178T, Y179G, Y179F, A180E, S181K, S181R, 182G, 及び/または(b) 配列番号1と比較して、最大で25アミノ酸残基, 好ましくは最大で20アミノ酸残基, より好ましくは最大で15アミノ酸残基, より一層好ましくは最大で10アミノ酸残基, または非常に好ましくは最大で6アミノ酸残基のN末端伸長であって、ここで、少なくとも50%, 好ましくは少なくとも60%, より好ましくは少なくとも70%, より一層好ましくは少なくとも80%, または非常に好ましくは少なくとも90%のN末端伸長アミノ酸残基はGまたはSであるか、あるいは、少なくとも1つの以下の修飾：-15E, -14E, -13E, -12A, -10A, -11A, -11E, -10S, -9G, -8G, -8A, -7A, -6A, -6G, -5G, -4S, -3A, -3G, -2A, -2G, -2Sである、N末端伸長
を含む、FGF21類似体。
144. (a) 配列番号1と比較して、少なくとも1つの以下の修飾：-1A, -1C, -1S, -1G, S6K, S6C, Q15F, V16K, D24K, A26E, Q27E, Q28R, A31E, K56R, K59R, K69R, S71C, D102E, D102N, D102T, des121D, D121D, D121Q, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152K, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, I154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168A, M168I, M168L, M168S, 169aT, G170T, P171L, S172E, Q173A, G174F, G174V, Y179F, A180E, S181K, S181R, 182G, 及び/または(b) 配列番号1と比較して、最大で25アミノ酸残基, 好ましくは最大で20アミノ酸残基, より好ましくは最大で15アミノ酸残基, より一層好ましくは最大で10アミノ酸残基, または非常に好ましくは最大で6アミノ酸残基のN末端伸長であって、ここで、少なくとも50%, 好ましくは少なくとも60%, より好ましくは少なくとも70%, より一層好ましくは少なくとも80%, または非常に好ましくは少なくとも90%のN末端伸長アミノ酸残基はGまたはSであるか、あるいは、少なくとも1つの以下の修飾：-15E, -14E, -13E, -12A, -10A, -11A, -11E, -10S, -9G, -8G, -8A, -7A, -6A, -6G, -5G, -4S, -3A, -3G, -2A, -2G, -2Sである、N末端伸長
を含む、FGF21類似体。
145. (a) 配列番号1と比較して、少なくとも1つの以下の修飾：-1A, -1C, -1S, -1G, S6K, S6C, Q15F, V16K, D24K, A26E, Q27E, Q28R, A31E, K56R, K59R, K69R, S71C, D102E, D102N, D102T, des121D, D121D, D121Q, K122R, I152K, D159E, L166F, S167G, M168A, M168I, M168L, M168S, 169aT, G170T, P171L, S172E, Q173A, G174A, G174V, Y179F, A180E, S181K, S181R, 182G, 及び/または(b) 配列番号1と比較して、最大で25アミノ酸残基, 好ましくは最大で20アミノ酸残基, より好ましくは最大で15アミノ酸残基, より一層好ましくは最大で10アミノ酸残基, または非常に好ましくは最大で6アミノ酸残基のN末端伸長であって、ここで、少なくとも50%, 好ましくは少なくとも60%, より好ましくは少なくとも70%, より一層好ましくは少なくとも80%, または非常に好ましくは少なくとも90%のN末端伸長アミノ酸残基はGまたはSであるか、または、少なくとも1つの以下の修飾-15E, -14E, -13E, -12A, -10A, -11A, -11E, -10S, -9G, -8G, -8A, -7A, -6A, -6G, -5G, -4S, -3A, -3G, -2A, -2G, -2Sである、N末端伸長
を含む、FGF21類似体。
146. 最大で210アミノ酸残基、好ましくは最大で209アミノ酸残基、より好ましくは最大で206アミノ酸残基を含む、可能な限度で類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体。
147. N末端伸長が単一のアミノ酸である場合に該アミノ酸はMetとは異なる、可能な限度で類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体。
148. 可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体であって、
(a)配列番号1と比較して、以下の修飾：
(i) (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K), D102T, A26E, (Q28R, A31E), Q27E, M168L, (Y179F, A180E, S181R), (V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K), (L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) (好ましくは(K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K), D102T, A26E, (Q28R, A31E), Q27E,またはM168L),
(ii) -1G 及び (-1G, M168L),または
(iii) S6C, (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R) 及び (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R)
であって、ここで、(i)及び(iii)のFGF21類似体はさらに場合によりN末端Mを含んでよい、修飾、及び／または
(b)配列番号1と比較して、以下:(iv) MG-, MC-, MS-, MSGSGSGSGSG-, MGGGGG-, MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, MSGGGGG-, MSGSGGS-, MSGGSSG- 及び MSGSGSG-から選択されるN末端伸長であって、ここで、(iv)のFGF21類似体のそれぞれにおけるN末端Mは場合により欠失していてよいN末端伸長
を含む、FGF21類似体。
149. 可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体であって、
(a)配列番号1と比較して、以下の修飾： (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K), D102T, A26E, (Q28R, A31E), Q27E, M168L, (Y179F, A180E, S181R), (V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K),または(L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) (好ましくは(K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R),または(K56R, K59R, K69R, K122R, I152K), D102T, A26E, (Q28R, A31E), Q27E,またはM168L)であって、ここで、FGF21類似体はさらに場合によりN末端Mを含んでよい、修飾；及び／または、(b)配列番号1と比較して、以下：(iv) MG-, MC-, MS-, MSGSGSGSGSG-, MGGGGG-, MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, MSGGGGG-, MSGSGGS-, MSGGSSG- 及び MSGSGSG-から選択されるN末端伸長であって、ここで、(iv)のFGF21類似体のそれぞれにおけるN末端Mは場合により欠失していてよい、N末端伸長
を含む、FGF21類似体。
150. 可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体であって、(a)配列番号1と比較して、以下の修飾：-1G及び(-1G, M168L)；及び／または(b)配列番号1と比較して、以下：(iv) MG-, MC-, MS-, MSGSGSGSGSG-, MGGGGG-, MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, MSGGGGG-, MSGSGGS-, MSGGSSG- 及び MSGSGSG-から選択されるN末端伸長であって、ここで、(iv)のFGF21類似体のそれぞれにおけるN末端Mは場合により欠失していてよい、N末端伸長を含む、FGF21類似体。
151. 可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体であって、(a)配列番号1と比較して、以下の修飾: S6C, (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R) 及び (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R)であって、ここで、FGF21類似体はさらに場合によりN末端Mを含んでよい、修飾；及び/または(b)配列番号1と比較して、以下: (iv) MG-, MC-, MS-, MSGSGSGSGSG-, MGGGGG-, MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, MSGGGGG-, MSGSGGS-, MSGGSSG- 及び MSGSGSG-から選択されるN末端伸長であって、ここで、(iv)のFGF21類似体のそれぞれにおけるN末端Mは場合により欠失していてよい、N末端伸長を含む、FGF21類似体。
152. 可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体であって、配列番号1のポリペプチドと比較して、1つまたは複数の以下の修飾： S6C, S6K, K56R, K59R, K69R, S71C, K122R, I152K, L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E 及び/またはS181K,R (好ましくはS6C, S6K, K56R, K59R, K69R, S71C, K122R, I152K 及び/またはM168L)を含む、FGF21類似体。
153. 可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体であって、配列番号1のポリペプチドと比較して、1つまたは複数の以下の修飾： S6C, S71C, M168L, (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), (K56R, K69R, K122R), (K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K) 及び (K56R, K59R, K69R, K122R, L118C-A134C), (L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K), (V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) 及び/または(Y179F, A180E, S181R); 好ましくは(S6C, S71C, M168L, (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), (K56R, K69R, K122R), (K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K) 及び/または(K56R, K59R, K69R, K122R, L118C-A134C)を含む、FGF21類似体。
154. 可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体であって、Y179F, A180E 及び S181KもしくはS181R (i)を含み; 好ましくはさらにV169aT, P171L, S172E, Q173A 及び G174V (ii)を含み; より好ましくはさらにL166F, S167G 及び M168Lを含み(iii); 非常に好ましくは(i), (ii)かつ(iii)を含む、FGF21類似体。
155. 配列番号1の位置-1でMetをさらに含む、90aを含む実施形態89-90のいずれか1つに好ましくは従う、可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体。
156. 以下：(l) Met-Gly-FGF21, (m) Met-Gly-FGF21-M168L, (n) Met-Cys-FGF21, (o) Gly-FGF21-M168L, (p) Gly-FGF21, (q) Met-Ser-FGF21,または(r) Ser-FGF21の中から選択される、可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体であって、ここで、FGF21は配列番号1のポリペプチドを差す、FGF21類似体。
157. 配列番号1と比較して、最大で25アミノ酸残基, 好ましくは最大で20アミノ酸残基, より好ましくは最大で15アミノ酸残基, より一層好ましくは最大で10アミノ酸残基, または非常に好ましくは最大で6アミノ酸残基のN末端伸長であって、ここで、少なくとも50%, 好ましくは少なくとも60%, より好ましくは少なくとも70%, より一層好ましくは少なくとも80%, または非常に好ましくは少なくとも90%のN末端伸長アミノ酸残基がグリシンまたはセリンである、N末端伸長を有する、可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体。
158. 配列番号1と比較して、以下のN末端伸長：(q) MS-FGF21, (s) MSGSGSGSGSG-, (t) MGGGGG-, (u) MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, (v) MSGGGGG-, (x) MSGSGGS-, (y) MSGGSSG-, 及び (z) MSGSGSG-; 並びにN末端Metを有さない、実施形態(q), (s), (t), (u), (v), (x), (y), 及び(z)のいずれか1つを含む、好ましくは実施形態93の類似体である、可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体。
159. 以下：(r) MSGSGSGSGSG-FGF21, (s) MGGGGG-FGF21, (t) MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-FGF21, (u) MSGGGGG-FGF21, (v) MSGSGGS-FGF21, (x) MSGGSSG-FGF21 及び (y) MSGSGSG-FGF21, 並びに、N末端Metを有さない実施形態(r), (s), (t), (u), (v), (x) 及び (y)のいずれか1つの中から選択される、可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体であって、ここでFGF21は配列番号1を参照する、FGF21類似体。
160. 位置146でP(プロリン）を有し、位置番号は配列番号1を参照する、可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体。
161. Met-FGF21の有効性に対して、少なくとも1%, 好ましくは少なくとも5%, より好ましくは少なくとも10%, または非常に好ましくは少なくとも20%の有効性を有し、有効性は3T3-L1脂肪細胞におけるグルコース取込を測定することによって決定される、可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体。
162. Met-FGF21の有効性に対して、有効性は少なくとも30%, 好ましくは少なくとも40%, より好ましくは少なくとも50%, より一層好ましくは少なくとも60%, または非常に好ましくは少なくとも70%である、可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体。
163. 有効性は、(i)Met-FGF21の有効性に対して、少なくとも80%, 好ましくは少なくとも90%, より好ましくは少なくとも100%, より一層好ましくは少なくとも110%, または非常に好ましくは少なくとも120%であるか；(ii) Met-FGF21の有効性に対して、少なくとも100%, 好ましくは少なくとも120%, より好ましくは少なくとも140%, より一層好ましくは少なくとも160%, または非常に好ましくは少なくとも180%であるか;あるいは(iii)Met-FGF21の有効性に対して、少なくとも200%, 好ましくは少なくとも250%, より好ましくは少なくとも300%, より一層好ましくは少なくとも350%, または非常に好ましくは少なくとも400%である、可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体。
164. 実施形態70-75のいずれか1つに記載されるようにして有効性が決定される、可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体。
165. ビヒクルコントロールに対してdb/dbマウスにおいて血中グルコースを低下させることができる、可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体。
166. mMでの平均血中グルコース測定に基づいて、かつ対応するビヒクルコントロールに対して、血中グルコースは、少なくとも1%, 好ましくは少なくとも2%, より好ましくは少なくとも3%, より一層好ましくは少なくとも4%, または非常に好ましくは少なくとも5%低下される、可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体。
167. 可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体であって、(i)db/dbマウスは雄であり、9-11週齢であり、(ii)誘導体は、皮下注射で投与され、(iii)類似体の服用量は0.1-1.0 mg/kg, 好ましくは0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8または1.0 mg/kgの範囲にあり、(iv)類似体は、毎日、好ましくは1日、2日かつ3日目に1回投薬され、及び／または(v)血中グルコースはグルコースオキシダーゼ方法を用いて、好ましくは、Biosen 5040などのグルコースアナライザーを用いて測定される、FGF21類似体。
168. 300 mM H202の存在下で1時間25°Cでインキュベーションすることによる酸化の後に、Met-FGF21よりも安定である、可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体。
169. 安定性が、実施形態70-75のいずれか１つによって決定される有効性を参照する、可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体。
170. H202でインキュベーション後に、少なくとも15%, 好ましくは少なくとも20%, より好ましくは少なくとも30%, より一層好ましくは少なくとも40%, または非常に好ましくは少なくとも50%の有効性を有する、可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体であって、ここで、有効性は、同様に処理されるMet-FGF21、ただしH202処理はない、に対するものである、FGF21類似体。
171. FGF21 (配列番号1)と比較して、以下の修正：(i) N末端でのMet-Gly-, (ii) M168L, (iii) 実施形態(i)かつ(ii), (iv) N末端でのMet-Cys-, (v) N末端でのGly-, (vi) 実施形態(v)かつ(ii), (vii) N末端でのMet-Ser-, または(iix) N末端でのSer-を含み；好ましくは、FGF21類似体は、以下：(l) Met-Gly-FGF21, (m) Met-Gly-FGF21-M168L, (n) Met-Cys-FGF21, (o) Gly-FGF21-M168L, (p) Gly-FGF21, (q) Met-Ser-FGF21,または(r) Ser-FGF21から選択され；ここでFGF21は配列番号1のポリペプチドを差す、可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体。
172. 位置146でP(プロリン）を有し、位置番号は配列番号1を参照する、可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体。
173. 実施例2 (すなわち実施例2a-2af), 56 (すなわち実施例56a-56as) 及び 57に記載の特定の類似体のいずれか1つである、可能な限度でFGF21類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによるFGF21類似体。
174. 類似体についての前述の実施形態のいずれか1つの類似体または誘導体についての前述の実施形態のいずれか1つの誘導体、及び医薬に許容できる担体を含む組成物。
175. 医薬としての使用のための、好ましくは実施形態141-173のいずれか1つによる、可能な限度で類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによる類似体、好ましくは実施形態1-140のいずれか1つによる、可能な限度で誘導体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体、または実施形態174の組成物。
176. 糖尿病、脂質異常症、肥満、循環器疾患、メタボリック・シンドローム、及び／または非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD)の治療または予防における医薬としての使用のための、好ましくは実施形態141-173のいずれか1つによる、可能な限度で類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによる類似体、実施形態1-140のいずれか1つの誘導体、または実施形態174の組成物。
177. 糖尿病、脂質異常症、肥満、循環器疾患、メタボリック・シンドローム、及び／または非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD)の治療または予防における医薬の製造における使用のための、好ましくは実施形態141-173のいずれか1つによる、可能な限度で類似体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによる類似体、好ましくは実施形態1-140のいずれか1つによる、可能な限度で誘導体に関連する先行する実施形態のいずれか1つによる誘導体、または実施形態174の組成物。
178. 治療的に有効量の、実施形態141-173のいずれか1つの類似体、実施形態1-140のいずれか1つの誘導体、または実施形態174の医薬組成物を患者に投与することを含む、糖尿病、脂質異常症、肥満、循環器疾患、メタボリック・シンドローム、及び／または非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD)を示す患者の治療方法。
179. 治療的に有効量の、実施形態141-173のいずれか1つの類似体、実施形態1-140のいずれか1つの誘導体、または実施形態174の医薬組成物を患者に投与することを含む、集中治療を必要とする患者の治療方法。
180. 本明細書に記載の実施形態、特徴及び請求のいずれかの新規な組み合わせ。
様々な参考文献が本明細書において引用され、それらの開示はそっくりそのまま参照により援用される。
以下の実施例を、本発明を例示するために提供する。
略語
以下の略語がアルファベット順に以下に使用される： DCMはジクロロメタンであり、DICはジイソプロピルカルボジイミドであり、DIPEAはジイソプロピルエチルアミンであり、DPBSはDulbecco社のリン酸緩衝生理食塩水であり、DVBはジビニルベンゼンであり、EDACは(3-ジメチルアミノ-プロピル)エチルカルボジイミド塩酸塩であり、Fmocは9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルであり、HEPESは4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸であり、HOAtは1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾールであり, HOBtは1-ヒドロキシベンゾトリアゾールであり, HPβCDはヒドロキシプロピルβシクロデキストリンであり、HPLCは高速液体クロマトグラフィーであり、IBMXは3-イソブチル-1-メチルキサンチンであり、Inpはイソニペコチン酸であり、IPTGはイソプロピルβ-D-1-チオガラクト-ピラノシドであり、LCMSは液体クロマトグラフィー質量分析法（Liquid Chromatography Mass Spectroscopyであり、MALDI-TOF MSはMatrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectroscopy（マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法）であり、MeOHはメタノールであり、NanoES-MSはナノエレクトロスプレータンデム質量分析法であり、NMPは1-メチル-ピロリジン-2-オンであり、OEGは8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸であり、OtBuはtert.ブチルエステルであり、PBSはリン酸緩衝生理食塩水であり、RTは室温であり、TFAはトリフルオロ酢酸であり、THFはテトラヒドロフランであり、TIPSはトリイソプロピルシランであり、トリスはトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンまたは2-アミノ-2-ヒドロキシメチルプロパン-1,3-ジオールであり、Trxはトラネキサム酸であり、TSTUはO-(N-スックイミジル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩であり、及びUPLCはUltra Performance Liquid Chromatography（超高速液体クロマトグラフィー）である。
一般的方法
LCMS 方法1 (LCMS1)
Agilent Technologies LC/MSD TOF (G1969A)質量分析計を用いて、Agilent 1200シリーズHPLCシステムより溶離した後のサンプルの質量を同定した。タンパク質のスペクトルのデコンボリューションを、Agilent社製タンパク質コンフォメーションソフトウェアを用いて計算した。
溶離液：
A: 0.1% トリフルオロ酢酸入りの水
B: 0.1% トリフルオロ酢酸入りのアセトニトリル
カラム: Zorbax 5u, 300SB-C3, 4.8x50mm
勾配: 15分かけて25% - 95 %のアセトニトリル
LCMS 方法2 (LCMS2)
Perkin Elmer Sciex API 3000質量分析計を用いて、Perkin Elmerシリーズ200 HPLCシステムより溶離した後のサンプルの質量を同定した。
溶離液:
A: 0.05% トリフルオロ酢酸入りの水
B:0.05% トリフルオロ酢酸入りのアセトニトリル
カラム: Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5 μm
勾配: 1.5 ml/分で7.5分かけて5% - 90 %アセトニトリル
LCMS 方法3 (LCMS3)
Waters Micromass ZQ質量分析計を用いて、Waters Alliance HT HPLCシステムより溶離した後のサンプルの質量を同定した。
溶離液:
A: 0.1% トリフルオロ酢酸入りの水
B: 0.1% トリフルオロ酢酸入りのアセトニトリル
カラム: Phenomenex, Jupiter C4 50 X 4.60 mm id 5 μm
勾配: 1.0 ml/分で7.5分かけて10% - 90% B
実施例１: FGF21のクローニング及び発現
ヒトFGF21に関するDNA及びアミノ酸配列は、例えば、Nishimura et al. in Biochim. Biophys. Acta 1492(1):203-206 (2000)により開示されている。配列は、また、公的なデータベースより入手可能であり、それぞれ、アクセッション番号はEMBL:AB021975 及び UNIPROT:Q9NSA1である。
28アミノ酸のシグナルペプチドを有する天然ポリペプチドを分泌用に合成した：
Figure 0005599822
イタリック体で上記に示されるシグナルペプチドは、配列番号2として添付の配列表中に含まれる。残りの181アミノ酸からなる成熟FGF21ポリペプチドは配列番号1として配列表中に含まれる。
シグナルペプチドのない、しかしN末端にメチオニンが付加された成熟FGF21ポリペプチドを、大腸菌において内部タンパク質としてクローニングしかつ発現させた。より具体的には、3’末端にMetに関するATGコドン、並びに3’末端及び5’末端にそれぞれNde1及びBamH1制限酵素切断部位を含む550 bpのコード領域を、ファージT7プロモーターの制御下で、発現ベクターpET 11cのNde1-BamH1において挿入し、大腸菌B BL21 (DE3)を形質転換させた。細胞をOD450 0.5までLB培地、アンピシリン100 ug/mlで生育させ、37℃で4時間、0.3 mMのIPTGを用いて発現を誘導した。細胞の粗抽出物をFGF21発現の解析のために超音波処理により得た。
クマシー染色したSDS-PAGEは、可溶性の上清フラクションにおいて主に同定されたFGF21の発現がうまくいったこと、不溶性のペレット中にはほとんどなかったことを示した。発現したFGF21 (Met-FGF21)（化合物A)の計算MWは19.5 kDであるにも関わらず、25 kDのタンパク質としてゲル上でそれは移動したが、これは、タンパク質の移動を遅らせる、高含量のプロリンによるものと考えられる。
実施例２: FGF21類似体のクローニング及び発現
Met-FGF21の以下の12の類似体を当該技術分野において公知のように設計し、かつ実施例1または類似の方法を用いる出芽酵母において概論されるように大腸菌中に発現させた：
2a) K122C Met-FGF21 (化合物B),
2b) (K59R, K69R, K122R) Met-FGF21 (化合物C),
2c) (K56R, K69R, K122R) Met-FGF21 (化合物D),
2d) (K56R, K59R, K69R) Met-FGF21 (化合物G),
2e) S71C Met-FGF21 (化合物E),
2f) (K56R, K59R, K69R, K122R) Met-FGF21 (化合物S),
2g) (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K) Met-FGF21 (化合物R),
2h) D102T Met-FGF21 (化合物M),
2i) A26E Met-FGF21 (化合物N),
2j) (Q28R, A31E) Met-FGF21 (化合物P),
2k) Q27E Met-FGF21 (化合物Q) 及び
2l) M168L Met-FGF21 (化合物K)。
製造されたMet-FGF21の一層さらなる3つの類似体には以下：
2m) (179F, 180E, 181R) Met-FGF21 (化合物X),
2n) (169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) Met-FGF21 (化合物Y) 及び
2o) (166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) Met-FGF21 (化合物Z)
が含まれる。
FGF21の以下の2つの類似体もまた前述のように製造された：
2p) Gly-FGF21-M168L (化合物J) 及び
2q) Gly-FGF21 (化合物I)。
前述のように製造されたFGF21の一層さらなる14の類似体は以下の通りである：
2r) S6C-Met-FGF21,
2s) (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R)-Met-FGF21,
2t) (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R)-Met-FGF21,
2u) Met-Gly-FGF21,
2v) Met-Gly-FGF21-M168L,
2x) Met-Cys-FGF21,
2y) Met-Ser-FGF21,
2z) (r) MSGSGSGSGSG-FGF21,
2aa) (s) MGGGGG-FGF21,
2ab) (t) MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-FGF21,
2ac) (u) MSGGGGG-FGF21,
2ad) (v) MSGSGGS-FGF21,
2ae) (x) MSGGSSG-FGF21 及び
2af) (y) MSGSGSG-FGF21。
実施例３: FGF21及び類似体の精製
実施例1-2に記載されるようにして製造されたFGF21ポリペプチド及びその類似体を以下のように、または類似の技法を用いて、さらに精製した：
10 mMのリン酸カリウム緩衝液pH7.5中の大腸菌のスラリー(20% w/v)を超音波処理した（5分間、氷上で3秒のオン/オフの間隔）。ポリペプチドを遠心分離 (10,000 x g, 30分間)によってペレット化し、50 mM トリス pH 8.0において超音波処理により再度可溶化させ、残屑を遠心分離 (10,000 x g, 30分間)により除去した。生じた上清中のポリペプチドを、Protein Purification. Principles and Practice Series: Springer Advanced Texts in Chemistry Scopes, Robert K. 3rd ed., 1994に概論されるように、Q Sepharose Fast Flowレジン(GE Healthcare)を用いて、アニオン交換クロマトグラフィー(50 mM トリス pH 8.0, 50-250 mM NaCl)により精製した。いくつかの例では、50 mM トリス pH 8.0 及び 200 mM NaClを用いて操作するHiLoad 26/60 Superdex pg 75 カラム (GE Healthcare)を用いて、さらなる精製をサイズ排除クロマトグラフィーで行った。保存用に、ポリペプチドを50 mMの重炭酸アンモニウム pH7.9に移し、凍結乾燥させ、-80℃で保存した。
実施例４: Cysでアルブミンバインダーを有するFGF21化合物の誘導体化
マレイミドを含むアルブミンバインダーを以下に記載されるように合成してもよく、フリーのシステインを含むFGF21及びその類似体を以下にも記載されるように、かかるアルブミンバインダーを用いて誘導体化させてよい。
17-((S)-1-カルボキシ-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-プロピルカルバモイル)-ヘプタデカン酸の製造
工程 1: Fmoc-エチレンジアミン2-クロロトリチルレジン:
5.8 g (7.5 mmol) 2-塩化クロロトリチルレジン (100-200 メッシュ, 1% DVB, 1.3 mmol/gでロードされた)をDCM (80 mL)中で1時間膨張させ、次いで水分を抜いた(drained)。Fmoc-エチレンジアミン塩化水素をNMP (30 mL)及びDCM (30 mL)及びDIPEA (5 eq, 6.42 mL)に懸濁させた。この懸濁液をレジンに添加し3時間浸透した。レジンから水分を抜き、17:2:1の DCM:MeOH:DIPEA、DCM, NMP 及び DCM (3 x 80 mL)で洗浄した。乾燥機でKOH/NaOHを用いて乾燥させた。
工程 2: Fmoc-OEG-エチレンジアミン 2-クロロトリチルレジン:
3 mmolのFmoc-エチレンジアミン2-クロロトリチルレジンをCEM Libertyマイクロ波ペプチド合成機及びFmocベースのペプチド固相法を用いて修飾した。レジンをNMP (60 mL)中で膨張させ、水分を抜いた。
レジンを5%ピペリジン入りNMP (60 mL)を用いてFmoc脱保護し、30秒間加熱し、水分を抜き、NMP (60 mL)を用いて洗浄後、続いて、さらなる5％ピペリジン入りNMP (60 mL)で処置し、3分間70-75℃で加熱し、続いて、NMP (4 x 60 mL)を用いて洗浄した。0.3 MのFmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸溶液+ 0.3 M HOAt入りNMP (45 mL)をレジンに添加し、続いて、0.75 MのDIC溶液入りNMP (18 mL)を添加した。反応は10分間70-75℃まで加熱させ、続いて、NMP (4x60 mL)を用いて洗浄した。
工程 3: Fmoc-OEG-OEG-エチレンジアミン2-クロロトリチルレジン:
レジンを5%ピペリジン入りNMP (60 mL)を用いてFmoc脱保護し、30秒間加熱し、水分を抜き、NMP (60 mL)を用いて洗浄後、続いて、さらなる5％ピペリジン入りNMP (60 mL)で処置し、3分間70-75℃で加熱し、続いて、NMP (4 x 60 mL)を用いて洗浄した。0.3 MのFmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸溶液+ 0.3 M HOAt入りNMP (45 mL)をレジンに添加し、続いて、0.75 MのDIC溶液入りNMP (18 mL)を添加した。反応は10分間70-75℃まで加熱させ、続いて、NMP (4x60 mL)を用いて洗浄した。
工程 4: Fmoc-ガンマ-Glu-OEG-OEG-エチレンジアミン2-クロロトリチルレジン:
レジンを5%ピペリジン入りNMP (60 mL)を用いてFmoc脱保護し、30秒間加熱し、水分を抜き、NMP (60 mL)を用いて洗浄後、続いて、さらなる5％ピペリジン入りNMP (60 mL)で処置し、3分間70-75℃で加熱し、続いて、NMP (4 x 60 mL)を用いて洗浄した。0.3 MのFmoc-Glu-OtBu溶液+ 0.3 M HOAt入りNMP (45 mL)をレジンに添加し、続いて、0.75 MのDIC溶液入りNMP (18 mL)を添加した。反応は10分間70-75℃まで加熱させ、続いて、NMP (4x60 mL)を用いて洗浄した。
工程 5: C18-二酸-ガンマ-Glu-OEG-OEG-エチレンジアミン2-クロロトリチルレジン:
レジンを5%ピペリジン入りNMP (60 mL)を用いてFmoc脱保護し、30秒間加熱し、水分を抜き、NMP (60 mL)を用いて洗浄後、続いて、さらなる5％ピペリジン入りNMP (60 mL)で処置し、3分間70-75℃で加熱し、続いて、NMP (4 x 60 mL)を用いて洗浄した。0.3 Mのオクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル溶液+ 0.3 M HOAt入りNMP (45 mL)をレジンに添加し、続いて、0.75 MのDIC溶液入りNMP (18 mL)を添加した。反応は10分間70-75℃まで加熱させ、続いて、NMP (4x60 mL)を用いて洗浄した。
工程 6: 17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-アミノ-エチルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-1-カルボキシ-プロピルカルバモイル]-ヘプタデカン酸:
レジンをTFA/TIPS/水 95:2.5:2.5で1時間処理した。レジンをろ過し(filtered off)、ろ液を真空下で濃縮した。アセトニトリルを添加しサンプルを再濃縮した。粗生成物をHPLC (10-50% アセトニトリル, 0.1 % TFA, 60 ml/分, C18, 50mmx200mm, 15Å)により精製した。
LCMS2 m/z: 777 (M+1).
工程 7: 17-((S)-1-カルボキシ-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-プロピルカルバモイル)-ヘプタデカン酸:
N-マレオイル-ベータ-アラニン(0.65 mmol, 110 mg)をNMPに溶解した。EDAC (0.65 mmol, 125 mg) 及び HOBt (0.65 mmol, 88 mg)を添加し、混合物を室温で1時間攪拌した。17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-アミノ-エチルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-1-カルボキシ-プロピルカルバモイル]-ヘプタデカン酸(0.65 mmol, 504 mg)溶液入りNMP (5 ml)を添加し、混合物を室温で16時間攪拌した。粗生成物をHPLC(25-65% アセトニトリル, 0.1 % TFA, 60 mL/分, C18, 50mmx200mm, 15Å)で精製して、200mgの標記の化合物を得た。
LCMS2 m/z: 927.8 (M+1)
K122C Met-FGF21誘導体 S-122-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-エチル)-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル] [Cys122] Met-FGF21 (化合物F)の製造
実施例2及び3（K122C及びN末端Mを有する配列番号1）に記載されるように調製した、K122C Met-FGF21類似体における位置122でのCys残基を、上述のように調製した以下の試薬を用いてチオール基で修飾した：
Figure 0005599822
[Cys122]-Met-FGF21 (凍結乾燥させた)を20 mMのトリスバッファーpH 7.5に溶解し、PD-10 カラム(GE Healthcare 170851-01)を用いてバッファーを20 mMトリスバッファーに交換した。この溶液(4.1 mg/ml) 7 ml(1.48 μmol)に17-((S)-1-カルボキシ-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-プロピルカルバモイル)-ヘプタデカン酸入りアセトニトリル/トリスバッファー(1.3:1) (2.96 μmol)を含む1.5 mlの溶液を添加した。反応を可能にして1時間室温で反応させた。反応混合物を0.22 umのフィルターを介してろ過し、20 mM トリスバッファー pH 7.5を溶出させてサイズ排除クロマトグラフィー(GE Healthcare, Superdex 200, 26/60)、続いて、イオン交換クロマトグラフィー (Mono-Q 5/50, 0-0.5 M NaCl入り20 mM トリス, pH 7.5の勾配, 60カラムの容積に対して)を用いて精製した。LCMS 及び SDS-PAGEによる解析後、関連フラクションをプールし、50 mM NH4HCO3にバッファー交換し、凍結乾燥させた。
LCMS1: 理論的質量 = 20442.2, 発見された質量(found) 20442.3
実施例５: FGF21類似体の別のCys誘導体の製造
S71C Met-FGF21誘導体 S-71-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-エチル)-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル] [Cys71] Met-FGF21 (化合物H)の製造
19-((S)-1-カルボキシ-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-プロピルカルバモイル)-ノナデカン酸の製造
工程 1: 19-{(S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-[2-(2-{[2-(2-カルボキシメトキシ-エトキシ)-エチル-カルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}-ノナデカン酸 tert-ブチル エステル:
2-(19-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)ペンタン二酸 1-tert-ブチル エステル 5-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル) エステル(2.50 g) 及び [2-(2-{2-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-酢酸(1.47 g)の溶液入りエタノール(40 ml)にDIPEA(1.26 ml)を添加した。混合物を一晩室温で攪拌後、真空内で濃縮させた。0.1 N HCl水溶液(150 ml)及び酢酸エチル(200 ml)を残留物に添加した。層を分離し、水層を酢酸エチル(100 ml)で抽出した。組み合わせた有機層を水及びブラインを用いて洗浄し、乾燥させ（硫酸マグネシウム）、真空で濃縮させて、経時的に（on standing）結晶化する油を得た。
収率 96% (3.1 g). LCMS3: 理論的質量: 874.2. 発見された質量: 874.49
工程 2: 19-((S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシ-カルボニルメトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-プロピルカルバモイル)-ノナデカン酸 tert-ブチル エステル:
19-{(S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-[2-(2-{[2-(2-カルボキシメトキシ-エトキシ)-エチル-カルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}-ノナデカン酸 tert-ブチル エステル(3.1 g)の溶液入りアセトニトリル(50 ml)にTSTU (1.39 g) 及び DIPEA (0.91 ml)を添加した。混合物を一晩室温で攪拌後、真空内で濃縮させた。0.1 N HCl水溶液(100 ml)及び酢酸エチル(200 ml)を残留物に添加した。層を分離し、水層を酢酸エチル(50 ml)で抽出した。組み合わせた有機層を水及びブラインを用いて洗浄し、乾燥させ（硫酸マグネシウム）、真空で濃縮させて油を得た。収率 99% (3.4 g) LCMS3: 理論的質量: 971.2 発見された質量: 971.8
工程 3: 19-((S)-1-カルボキシ-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシカルボニルメトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-プロピルカルバモイル)-ノナデカン酸:
19-((S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシカルボニルメトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-プロピルカルバモイル)-ノナデカン酸 tert-ブチルエステル(3.4 g)をTFA (75 ml)中に45分間攪拌し、次いで真空内で濃縮させた。残留物をトルエンで3回濃縮させて固体を得た。残留物を2-プロパノール中で結晶化させ、ろ過して、白色の結晶化合物を得た。
収率 80% (2.4 g). LCMS3: 理論的質量: 859.03 発見された質量: 859.44
工程 4: 3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル:
マルイミドプロピオン酸(500 mg)を乾燥THF(15 ml)中に溶解させた。TSTU (790 mg)及びDIPEA (0.62 ml)を添加した。混合物を室温で一晩、窒素下で攪拌した。黄色の粘性の(thick)懸濁液を濃縮させた。残留物をDCM中に溶解させ、0.1 N HCl (2x) 及びブライン(1x)を用いて抽出した。有機層を乾燥させ(Na2SO4)、濃縮させて白色固体を得た。
LCMS3: 理論的質量: 266.21 発見された質量: 267.26 (M+1)
工程 5: 19-((S)-1-カルボキシ-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-プロピルカルバモイル)-ノナデカン酸:
N-ブトキシカルボニルエチレンジアミン(70 mg)の溶液入りアセトニトリル(4 ml)にDIPEA (0.07 ml)を添加し、かつ3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロピロール-1-イル)プロピオン酸2,5-ジオキソピロリジン-1-イル エステル(100 mg)を添加した。1時間攪拌後、混合物を真空内で濃縮した。残留物をDCM内に溶解し、5%クエン酸で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮した。この残留物にTFA (8 ml)を添加した。室温で1時間攪拌後、混合物を真空内で濃縮し、トルエンで2回共沈殿させた。この残留物をTHF (5 ml)中に溶解させた。19-((S)-1-カルボキシ-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシ-カルボニルメトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-プロピルカルバモイル)-ノナデカン酸(75 mg)及びDIPEA (0.09 ml)を添加した。混合物を室温で一晩攪拌した。Aバッファー: 0.1% TFA入りの水及びBバッファー:0.1% TFA入りのアセトニトリルを用いてHPLCにより精製した。45分かけて、勾配 10-80%B。流量: 20 ml/分, C18 カラム 30mmx250mm, 110Å. 収率 116 mg (34%)
LCMS3: 理論的質量: 955.17 発見された質量: 955.7
実施例2及び3に概論されるようにして製造されたS71C Met-FGF21類似体（S71C及びN末端Mを有する配列番号1）の位置71でのCys残基を上述のように製造した試薬を用いて位置71でチオール基で修飾した：
Figure 0005599822
NH4HCO3により凍結乾燥させた[Cys71] Met-FGF21 (1.68 mg, 85.9 nmol)をMiliQ水(1 ml)中に溶解させた。バッファーをPD10 カラム (GE healthcare 179851-01)で、0.02M トリス, pH 7.8に交換した。約3.5 mlの溶離液を回収した。この溶離液に、19-((S)-1-カルボキシ-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-プロピルカルバモイル)-ノナデカン酸 (0.86 umol)入り0.02M トリス, pH 7.8 /アセトニトリル1:1 (0.205 ml)を添加した。混合物を1時間室温で放置し、次いで5℃で一晩放置した。Aバッファー: 20 mM トリス, pH 7.8; Bバッファー: 20 mM トリス, 50 mM NaCl, pH 7.8を用いてmonoQ 5/50 GLカラムでアニオン交換により精製した。流量 0.5 ml及び20CVに対して勾配0-100%B。生成物を含む単離したフラクションをさらにBio Whittaker社製のDPBSバッファー中、HiLoad 26/60 superdex 200 prepグレードでサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。収量 0.466 g。
LCMS1: 理論的質量: 20511.3 発見された質量: 20511.3
実施例６: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
S71C Met-FGF21誘導体S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [Cys71] Met-FGF21 (化合物O)の製造
9-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ヨード-アセチルアミノ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}-ノナデカン酸の製造
工程 1: 19-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-アミノ-エチルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-1-tert-ブトキシカルボニル-プロピルカルバモイル]-ノナデカン酸 tert-ブチル エステル:
19-{(S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-[2-(2-{[2-(2-カルボキシメトキシ-エトキシ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}-ノナデカン酸tert-ブチルエステル(500 mg)の溶液入りアセトニトリル(15 ml)にTSTU (224 mg)及びDIPEA (0.13 ml)を添加した。室温で2時間攪拌後、この混合物をエチレンジアミン(0.50 ml)入りアセトニトリル(5 ml)の溶液中に注いだ。2時間攪拌後、混合物を真空内で濃縮した。残留物を1 N NaOH (100 ml) 及び酢酸エチル(400 ml)中で攪拌した。層を分離した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空内で濃縮させて、白色固体を得た。この固体をエタノール中で攪拌し、ついでろ過した。ろ液を濃縮してシロップを得た。収率 250 mg (48%)
LCMS3: 理論的質量: 916.26 発見された質量: 916.7
工程 2:. 19-{(S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ヨード-アセチルアミノ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}-ノナデカン酸 tert-ブチル エステル:
ヨード酢酸(60 mg)入りDCM (8 ml)の溶液に、TSTU (90 mg) 及びDIPEA(0.05 ml)を添加した。室温で60分間攪拌後、19-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-アミノ-エチルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-1-tert-ブトキシカルボニル-プロピルカルバモイル]-ノナデカン酸tert-ブチルエステル(0.25 g)入りDCM (8 ml)及びDIPEA(0.05 ml)の溶液を添加した。120分間攪拌後、混合物をDCM(100 ml)で希釈し、1 N HCl(50 ml)を添加した。層を分離した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、真空内で濃縮した。残留物をエタノールで共沈殿させて、固体の化合物を得た。収率 225 mg (76%)
LCMS3: 理論的質量: 1084.2 発見された質量: 1084.8
工程 3: 19-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ヨード-アセチルアミノ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}-ノナデカン酸:
19-{(S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ヨード-アセチルアミノ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}-ノナデカン酸tert-ブチルエステル(225 mg)をTFA (10 ml)で90分間処理した。混合物を真空内で沈殿させて、トルエンで2回共沈殿させた。残留物をAバッファー: 0.1% TFA入り水及びBバッファー: 0.1% TFA入りアセトニトリルを用いてHPLCで精製した。45分かけて勾配 10-80%B。流量: 20 ml/分, C18 カラム 30mmx250mm, 110Å 収率 45 mg (22%)
LCMS3: 理論的質量: 971.98 発見された質量: 972.6
実施例2及び3に概論されるようにして製造されたS71C Met-FGF21類似体（S71C及びN末端Mを有する配列番号1）の位置71でのCys残基を以下の試薬を用いてチオール基で修飾した：
Figure 0005599822
一般的手順A
NH4HCO3により凍結乾燥させた[Cys71] Met-FGF21 (7.53 mg, 385 nmol)を3x350 ul 0.02M トリス, pH 7.8に溶解させ、PD10カラムを介してバッファーを0.02M トリス, pH 7.8に交換した。約3.5 mlを回収した。上述のように製造された、19-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ヨード-アセチルアミノ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}-ノナデカン酸(1.5 mg)を0.02M トリス, pH 7.8 バッファー/アセトニトリル1:1 (0.75 ml)中に溶解させた。[Cys71] Met-FGF21の溶液にヨードアセトアミド溶液(0.561 ml, 3eq)を添加した。アセトニトリルの濃度は7％であった。混合物を室温で70時間放置した。混合物を4000gで10分間、Amicon Ultra-4遠心装置MWCO 10000にて限外ろ過した。約4 mlのAバッファーを用いた限外ろ過をさらに4回繰り返して、試薬を除去した。試料をAバッファー: 20 mM トリス, pH 7.8; Bバッファー: 20 mM トリス, 50 mM NaCl, pH 7.8を用いてmonoQ 5/50 GL カラムでアニオン交換により精製した。流量0.5 ml及び60CVに対して勾配0-100%B。生成物を含む単離したフラクションをプールし、Amicon Ultra-4遠心装置MWCO 10000で6000 rpmで2 x 10分間、限外ろ過により濃縮した。
50 mM NH4HCO3へのバッファー交換をPD10 (GE 179851-01)カラムを用いて行った。約4.0 mlの溶離液を回収した。これを、Millex GV滅菌0.22 umフィルターを介してろ過し、凍結乾燥させた。収量 2.18 mg。
LCMS1: 理論的質量: 20400.2 発見された質量: 20400.13
実施例７: N末端でアルブミンバインダーを有するFGF21化合物の誘導体化
(K56R, K59R, K69R, K122R) Met-FGF21誘導体 N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] [Arg56, Arg59, Arg69, Arg122] Met-FGF21 (化合物V)の製造
実施例2及び3に概論されるようにして製造された、K56R, K59R, K69R, K122R Met-FGF21類似体（K56R, K59R, K69R, 及び K122R及びN末端Mを有する配列番号1)におけるN末端Met残基を以下の試薬を用いてアルファアミノ基で修飾した：
Figure 0005599822
[Arg56, Arg59, Arg69, Arg122] Met-FGF21 (凍結乾燥された)をDPBSバッファーに溶解し、PD-10カラム(GE Healthcare170851-01)を用いてDPBSバッファーにバッファーを交換して、3.5 ml (4.3 mg/ml, 0.77 μmol)を得た。試料をDPBSバッファー(10.5 ml)を用いて希釈し、実施例4に概論されるようにして製造された、17-((S)-1-カルボキシ-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシ-カルボニルメトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-プロピルカルバモイル)-ヘプタ-デカン酸(6.2 μmol)入りアセトニトリル(7.5 ml)の溶液を添加した。室温で1時間後、混合物を0 °Cまで冷却し、冷した0.2 M NaOH (21 ml)を添加した。0℃で30分後、混合物を塩酸で中和した。混合物をAmicon Centriprep ultracel YM10遠心ろ過機(10000 MWCO)を用いて濃縮し、次いで5 ml 20 mM トリスバッファー, pH 7.5で希釈して、2回再濃縮させた（最終体積約5 ml)。溶液混合物を0.22 umフィルターを介してろ過し、イオン交換クロマトグラフィーにより精製して、実施例4に記載されるように凍結乾燥させた。
LCMS1: 理論的質量: 20368.1 発見された質量: 20367.2
実施例 8: 有効性アッセイ - 3T3-L1脂肪細胞におけるグルコース取込
本発明のFGF21化合物の生物学的活性または有効性を決定するために以下のアッセイを使用した。
マウス3T3-L1繊維芽細胞(例えば、カタログ番号CL-173でATCCより入手可能)を基礎培地（10%のウシ胎仔血清(FBS)及びペニシリン/ストレプトマイシン入りのDMEM (4500 mg/l グルコース）)で維持する。細胞はコンフルエンスに到達させずに、（視覚検査により）約60％のコンフルエンシーに到達する前に（新しいバイアルに移して）継代されるべきである。
グルコース取込アッセイのために、細胞を24ウェルプレートに80,000細胞／ウェル、または96ウェルプレートに20,000細胞／ウェルで播種し、それらがコンフルエンシーに到達した際に（高密度、分化した脂肪細胞が観察される）、培地を基礎培地から、トログリタゾン, IBMX, デキサメタゾン(例えばSigma社により市販) 及びヒトインスリン（例えばNovo Nordisk A/S社により市販)を含む基礎培地に変更する。
細胞を分化開始して7-14日後、好ましくは7-10日後に使用する。細胞を、基礎培地中のFGF21ポリペプチドまたは本発明の誘導体を用いて濃度を増大させて（0-300 nM)、20時間、刺激する。3H-デオキシグルコース（以下では：トレーサーという）の添加前に、細胞を温かい（約37℃）アッセイバッファー(1 mM MgCl2 及び2 mM CaCl2を有するPBS)、HEPES 及び 0.1 % ヒト血清アルブミン)で洗浄し、細胞をトレーサーで1時間インキュベーションする。このインキュベーションを氷冷のアッセイバッファーで2回洗浄することにより終了させる。細胞をTriton X-100で溶解し、溶解物を96ウェルプレートに移し、Microscint-40 (例えばPerkin Elmer社により市販)を添加し、トレーサーの量をTOP-カウンター(例えばPerkin Elmer 社のPackardトップカウンター)でカウントする。問題とするポリペプチドのEC50 を計算する。下記の表1に示す結果は、Met-FGF21のEC50 (有効性)に対する、本発明のFGF21化合物のEC50 (有効性)を示す。
Figure 0005599822
Figure 0005599822
本発明のFGF21化合物は、Met-FGF21の有効性と比較して満足でき、一部は非常に素晴らしい有効性を有することが表1の結果から明らかである。
実施例９: FGF21化合物の酸化安定性
複数の本発明のFGF21化合物の酸化安定性を過酸化水素を用いて促進実験(accelerated experiment)で決定した。
51 μM (1 mg/mL)の濃度で、PBS, pH 7.2に溶解される、問題となる化合物、例えばMet-FgF21を300 mM H202の存在下で25℃で1時間インキュベーションした。コントロール(非酸化Met-FGF21)を同様に処理したが、H202では処理しなかった。反応をPBSで平衡化したゲルろ過カラム(ZebaまたはSuperose 12)により脱塩することにより終了させた。
2つのMet残基（N末端Metを有する配列番号1である野生型Met-FGF21におけるN末端Met、以下では「Met1」という、及び配列番号1におけるMet168、以下では「Met168」）の酸化状態及び動態を、消化酵素トリプシン（例えば、Patten, SMV et al., Journal of biological chemistry, 274, 10268-10276, 1999を参照されたい）を酵素：基質（すなわち、トリプシン：FGF21）の比を1:100 (w/w)、37℃で2-18時間用いて、ペプチドマッピングにより決定した。生じた消化物を1% TFAを用いてクエンチングし、逆相UPLC (Waters)によりC18カラムでマッピングした。ペプチドの溶離液を214 nmでの吸光度でモニターした。ペプチドを回収し、スピードバキュームで乾燥させ、50 %アセトニトリル、0.1 %ギ酸で再構成させた。回収したペプチド、消化物及び無傷のタンパク質の質量分析をMALDI-TOF MS (Bruker Daltonics, autoflex II, ToF/ToF)及びNanoESスプレーキャピラリー（spray capillaries）を用いるNanoES-MS (Q-ToF Ultima, Waters)により実施した。
UPLCによる非酸化及び酸化Met-FGF21試料の解析を、300 mM H202 (1h, 25°C)で、消化物中のMet-S-酸化物（スルホキシド）へのMet1及びMet168残基の完全な酸化により実施した。回収したペプチドのMALDI解析によりMet1及びMet168に対する酸化部位を確認し、これには、ペプチドのMS/MSシーケンシングを用いて、ペプチド及びMet残基が酸化されてMet-S-酸化物となることが示されたことを含んだ。2つの残基の同様の酸化動態を、MALDI及びUPLC解析を用いて様々な過酸化水素濃度（0℃で30分間、25, 50, 100, 200及び 300 mM H202 でインキュベーションされる）の存在下で観察した。ペプチド1-18及びペプチド137-176に対してUPLCにより決定される半減期はそれぞれ、36.3及び40.3分であった。酸化生成物を、NanoES-MSを用いて無傷のタンパク質の直接解析によっても観察した。
実施例8の脂肪細胞アッセイにおいて、酸化Met-FGF21の活性は、非酸化Met-FGF21と比較して10％まで減少した。
同様の態様で、本発明の複数のFGF21化合物の酸化安定性を決定し、その結果を以下の表2に示す。酸化条件は、300 mM H202, 1h, 25°Cであった。
Figure 0005599822
実施例１０: FGF21化合物のin vivoテスト-薬力学
db/dbマウスはII型糖尿病に対するマウスモデルである。マウスはレプチン受容体を欠失し、高血糖症、インスリン抵抗性、過食症及び肥満により特徴付けされる。
雄db/dbマウス(9-11週齢)を用いて以下のFGF21化合物の血中グルコースに対する効果を測定した：(1)野生型FGF21 (N末端Metを有する配列番号1), (2)実施例4に（2つの服薬量で）記載されるように、Cys122でアルブミンバインダーを有する誘導体化されたN末端Metを有するFGF21のK122C類似体, 及び(3)実施例6に記載されうように、Cys71でアルブミンバインダーを有する誘導体化されたN末端Metを有するFGF21のS71類似体。類似体を実施例1-2に記載されるように大腸菌で発現させ、実施例3に記載されるように精製した。
化合物を（1日、2日及び3日で投薬して）1日1回PBS中0.2-1.0 mg/kgで、皮下注射で投与した。ビヒクル処理群（コントロール）を1日1回皮下注射でPBS, (250 ul/50g マウス）で処理した。血中グルコース濃度をグルコースアナライザー（Biosen 5040)を用いてグルコースオキシダーゼ法に基づき0, 1, 3, 4及び５日目に測定した。0日目で、血中グルコースを測定して、互いに有意に相違しない平均血中グルコースを有するそれぞれ8-10のマウスへ、異なる４つの群にマウスを割り振った。1日目で、血中グルコースを最初の投薬の2時間後に測定した。3日目で、3回目の投薬の2時間後に血中グルコースを測定した。4日目で、3回目の投薬の24時間後に血中グルコースを測定した。5日目に、最後（3回目）の投薬の48時間後に血液試料を採取して、血中グルコースを測定した。
結果を以下の表3に示し、ここで、血中グルコースはmM (平均± S.E.M (n=8または10))で示される。
Figure 0005599822
本発明のFGF21誘導体はin vivoで生物学的に活性である、すなわち、それらはビヒクルと比較して効果的に血中グルコースを低下させることを結果は示す。本発明の誘導体は、血中低下能力及び作用期間に関して、野生型FGF21よりも有効でさえあるようである。
実施例１１: FGF21化合物のin vivoテスト - 薬物動態
db/dbマウス
本発明のFGF21化合物（それぞれ、実施例4, 5及び6に記載されるように調製される、化合物F, H及びO)の薬物動態プロファイルを雄db/dbマウスで評価した。Met-FGF21 (化合物A)を3つの異なる投薬レベル、すなわち、0.125, 0.5及び1 mg/kgで皮下注射で、比較用に含めた。
本発明の化合物を1つの投薬レベル、すなわち、0.5 mg/kgで皮下注射（約24 nm/kg)で試験した。比較用化合物の血漿レベルを6時間追跡する一方で、本発明の化合物の血漿レベルを48時間追跡した。
血漿T1/2 は比較用化合物に関しては1.3-1.7時間であると測定され（試験化合物のように、0.5 mg/kgで投薬された場合、1.4時間）、化合物Fに関しては8.2時間、化合物Hに関しては15.9時間、そして化合物Oに関しては14.6時間であった。
ミニブタ
Met-FGF21（化合物A)及び本発明のFGF21化合物（実施例4に記載されるように製造される化合物F)の薬物動態プロファイルを、正常な雄のグッティンゲンミニブタ, n=3-4, (12-15月齢, 25 kg)で試験した。化合物Aの血漿濃度を1週間モニターした一方で、化合物Fの血漿濃度を2週間モニターした。両化合物を0.1 mg/kgの1回の静脈内投薬（約5 nmol/kg)として投薬した。
比較用化合物（化合物A)の平均半減期(T1/2)は標準偏差3.1時間を有する10.4時間であった一方で、本発明の化合物（化合物F)の平均T1/2は標準偏差17.1時間を有する91.9時間であった。
FGF21化合物の血漿レベルをFibroblast Growth Factor-21 Human ELISA (BioVendorより入手可能, カタログ番号RD191108200R)を用いて決定した。
これらの結果により本発明のFGF21誘導体の長引かせる効果が強く裏付けられた。
実施例１２: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
S71C Met-FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [Cys71] Met-FGF21 (化合物O)の製造
実施例2及び3に概論されるようにして調製されたS71C Met-FGF21類似体（S71C及びN末端Mを有する配列番号1）の位置71でのCys残基を、以下の試薬を用いてチオール基で修飾した：
Figure 0005599822
一般的手順B
NH4HCO3により凍結乾燥させた[Cys71] Met-FGF21 (21.8 mg, 1.1 umol)を20 mMトリス, 0.5 NaCl, pH 8.0 (4.36 ml)に溶解させた。前述のように調製した、19-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ヨード-アセチル-アミノ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}-ノナデカン酸(5.4 mg, 5eq)を、0.02M トリス, 0.5M NaCl pH 8.0 バッファー/アセトニトリル1:1 (1.09 ml)に溶解させ、[Cys71] Met-FGF21の溶液に添加した。2時間15分後、混合物をHiPrep 26/10入りAバッファー(1.5 CV)で脱塩した。プールしたフラクションをAバッファー: 20 mM トリス, pH 7.8; Bバッファー: 20 mM トリス, 50 mM NaCl, pH 7.8を用いてmonoQ 5/50 GLカラムでアニオン交換により精製した。流量0.5 ml及び60CVに対して0-100%Bの勾配。生成物を含む単離したフラクションをプールし、PD10 (GE 179851-01)カラムを用いてバッファーを50 mM NH4HCO3に交換した。溶離物を回収し、Millex GV滅菌0.22 umフィルターを介してろ過し、凍結乾燥させた。収量 6.7 mg.
LCMS1: 理論的質量: 20400.2 発見された質量: 20402.3
実施例１３: FGF21類似体の他のCys誘導体の製造
S71C Met-FGF21誘導体 S-71-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-エチル)-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル] [Cys71] Met-FGF21の製造
実施例2及び3に概論されるようにして調製される、S71C Met-FGF21類似体（S71C及びN末端Mを有する配列番号1）の位置71でのCys残基を上述のように製造した試薬を用いて位置71でチオール基で修飾した:
Figure 0005599822
サイズ排除精製せずに、実施例5の一般的手順Aを用いて化合物を製造した。
収量 2.88 mg.
LCMS1: 理論的質量: 20483.3. 発見された質量: 20483.
実施例１４: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
S71C Met-FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [Cys71] Met-FGF21の製造
17-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ヨード-アセチルアミノ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}-ヘプタデカン酸の製造
工程 1: 17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-アミノ-エチルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチル-カルバモイル)-1-カルボキシ-プロピルカルバモイル]-ヘプタデカン酸
エタノール(10 ml) 及びエチレンジアミン(1 ml)の溶液に17-((S)-1-カルボキシ-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシカルボニルメトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-プロピルカルバモイル)-ヘプタデカン酸(500 mg)を添加した。室温で一晩攪拌後、混合物を40℃で真空内で濃縮させた。残留物を分取HPLC（10-65% アセトニトリル, 0.1 % TFA, 20 ml/分, C18, 30mmx250mm, 110Å)により精製した。収率 332 mg (70%)
LCMS3: 理論的質量: 776.0. 発見された質量: 776.6 (M+1)
工程2: 17-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ヨード-アセチルアミノ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}-ヘプタデカン酸
ヨード酢酸(92 mg)入りアセトニトリル(1 ml)溶液にTSTU (142 mg) 及び DIPEA (0.085 ml)を添加した。室温で60分間攪拌後、17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-アミノ-エチルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-メトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-1-カルボキシ-プロピルカルバモイル]-ヘプタデカン酸(0.320 g)入り0.1M Na2CO3 (12 ml)の溶液を添加した。120分間攪拌後、混合物のpHを1N HClを用いて1に調整した。沈殿物をろ過し、水で洗浄して、真空内で乾燥させた。収率 350 mg (90%)
LCMS3: 理論的質量: 943.9 発見された質量: 944.6 (M+1)
実施例2及び3に概論されるようにして調製される、S71C Met-FGF21類似体（S71C及びN末端Mを有する配列番号1）の位置71でのCys残基を上述のように調製される試薬を用いて位置71でチオール基で修飾した：
Figure 0005599822
一般的手順B (NaCl)
サイズ排除精製せずにpH 7.5で、実施例12の一般的手順Bを用いて化合物を製造した。収率 15.9 mg (38%)
LCMS1: 理論的質量: 20372.19 発見された質量: 20372.34
実施例１５: FGF類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1G, 71C, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [71C, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Gly-FGF21の製造
実施例56に概論されるように調製される、(-1G, 71C, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K)FGF21類似体（配列番号1）の位置71でのCys残基を上述のように調製される試薬を用いて、位置71でチオール基で修飾した：
Figure 0005599822
一般的手順B (NaCl)
化合物を実施例12の一般的手順Bを用いて製造した。反応を1：1の20 mM トリス, 0.5 NaCl, pH 7.5及びDPBSバッファーの混合物で実施した。サイズ排除精製は行わなかった。収率 19.5 mg mg (58%)
LCMS1: 理論的質量: 20511 発見された質量: 20511
実施例16: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1G, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Gly-FGF21の製造
一般的手順C:
実施例56に概論されるように調製される、(-1G, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21類似体（配列番号1）の位置71でのCys残基を上述のように調製される試薬を用いて、位置71でチオール基で修飾した：
Figure 0005599822
(-1G, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21 (33.8 mg, 1.7 umol)入りDPBSバッファー (2.7 mg/ml)にトリス(3 mg)及び塩化ナトリウム(29 mg)を添加した。上述のように製造された、17-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ヨード-アセチルアミノ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-プロピル-カルバモイル}-ヘプタデカン酸(8 mg, 5eq)を0.02Mトリス, 0.5M NaCl pH 7.5 バッファー (0.2 ml)及びアセトニトリル(0.3 ml)に溶解させ、(-1G, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21の溶液に添加した。5時間後、Millex GV滅菌0.22 umフィルターを介して混合物をろ過し、Aバッファー(1.5CV)で2レーンのHiPrep 26/10で脱塩した。A-バッファー: 20 mM トリス, pH 7.5; B-バッファー: 20 mM トリス, 50 mM NaCl, pH 7.5を用いてSource 15Q 4,6/100 PE カラムでアニオン交換によりプールしたフラクションを交換した。流量 2.5 ml及び40CVに対して勾配5-40%B。生成物を含む単離したフラクションをプールし、HiPrep 26/10 カラムでバッファーをDPBSバッファーに交換した。溶離液をVivaspin 20遠心ろ過機(10000 MWCO)を用いて濃縮し、回収し、Millex GV滅菌0.22 umを介してろ過した。収率 10.9 mg (31%)
LCMS1: 理論的質量: 20525. 発見された質量: 20525
実施例17: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Ala-FGF21の製造
実施例56に概論されるように調製された(-1A, 71C,121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21類似体（配列番号1）の位置71でのCys残基を前述のように調製される試薬を用いて位置71でチオール基で修飾した：
Figure 0005599822
実施例16の一般的手順Cを用いて化合物を製造した。収率 11.4 mg (33%)
LCMS1: 理論的質量: 20539.4. 発見された質量: 20539.5
実施例18: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1S, 71C, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [71C, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Ser-FGF21 の製造
実施例56に記載されるようにして調製された、(-1S, 71C, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21類似体（配列番号1）の位置71でのCys残基を前述のように調製される試薬を用いて位置71でチオール基で修飾した：
Figure 0005599822
精製のために、MonoQ 5/50 Glカラムを用いて、実施例16の一般的手順Cを用いて化合物を製造した。収率 20.9 mg (58%)
LCMS1: 理論的質量: 20541, 発見された質量: 20541
実施例19: FGF21類似体のさらなるN末端誘導体の製造
(-5G, -4S, -3G, -2S, -1G, 56R, 59R. 69R, 102E, 121Q, 122R, 168L) FGF21誘導体 N-アルファ-3-[(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル)-カルボキシメチル-アミノ]-プロピオニル(-5G, -4S, -3G, -2S, -1G, 56R, 59R, 69R, 102E, 121Q, 122R, 168L) FGF21の製造
17-{カルボキシメチル-[2-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシカルボニル)-エチル]-カルバモイル}-ヘプタデカン酸の製造
WO 2005/012347に記載されるように調製される、17-{tert-ブトキシカルボニルメチル-[2-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシカルボニル)-エチル]-カルバモイル}-ヘプタデカン酸tert-ブチルエステル(240 mg)を95% TFAで1時間処理し、真空内で濃縮させた。残留物をアセトニトリルで共沈殿して、定量的収量で200 mgの白色固体を得た。
LCMS3: 理論的質量: 540.7, 発見された質量: 541.3 (M+1)
実施例56に概論されるように製造された、(-5G, -4S, -3G, -2S, -1G, 56R, 59R, 69R, 102E, 121Q, 122R, 168L) FGF21類似体（配列番号1）のN末端位置を前述のように調製した試薬を用いて修飾した:
Figure 0005599822
精製のために、MonoQ 5/50 Glカラムを用いて、実施例7の手順を用いて化合物を製造した。
LCMS3: 理論的質量: 20301.9, 発見された質量: 1451,2 (M+14).
以下の実施例における本発明のFGF21誘導体を同様に製造してよい：
実施例20: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1G, 71C, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [71C, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Gly-FGF21の製造
実施例21: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1G, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Gly-FGF21の製造
実施例22: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Ala-FGF21の製造
実施例23: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1S, 71C, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [71C, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Ser-FGF21の製造
実施例24: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1G, 71C, 102E, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [71C, 102E, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Gly-FGF21の製造
実施例25: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1G, 71C, 102E, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [71C, 102E, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Gly-FGF21の製造
実施例26: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1A, 71C, 102E, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [71C, 102E, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Ala-FGF21の製造
以下の例を調製した。
実施例27: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1A, 71C, 102E, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [71C, 102E, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Ala-FGF21の製造
実施例56に概論されるようにして製造された、(-1A, 71C, 102E, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K)FGF21類似体（配列番号1）の位置71でのCys残基を、上述のように製造した試薬を用いて位置71でチオール基で修飾した：
Figure 0005599822
精製のために、バッファーに5 %エタノールを添加した以外は、MonoQ 5/50 Glカラムを用いて、実施例16の一般的手順Cを用いて化合物を製造した。収率 18.2 mg (43%)
LCMS1: 理論的質量: 20553.39, 発見された質量: 20552.88
以下の実施例における本発明のFGF21誘導体を同様に調製してよい：
実施例28: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K, 182G) FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K, 182G] Gly-FGF21の製造
以下の例を製造した。
実施例29: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E) FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E] Ala-FGF21の製造
実施例56に概論されるようにして製造された、(-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E) FGF21類似体（配列番号1）における位置71でのCys残基を、上述のように製造した試薬を用いて位置71でチオール基で修飾した：
Figure 0005599822
精製のために、バッファーに5 %エタノールを添加した以外は、MonoQ 4,6/100 PEカラムを用いて、実施例16の一般的手順Cを用いて化合物を製造した。収率 19.8 mg (46%).
LCMS1: 理論的質量: 20498.40 発見された質量: 20498.07
実施例30: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181) FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181K] Ala-FGF21の製造
実施例56に概論されるようにして製造された、(-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181) FGF21類似体（配列番号1）の位置71でのCys残基を、上述のように製造された試薬を用いて位置71でチオール基で修飾した：
Figure 0005599822
精製のために、バッファーに5 %エタノールを添加した以外は、MonoQ 4,6/100 PEカラムを用いて、実施例16の一般的手順Cを用いて化合物を製造した。収率 11.3 mg (40%)
LCMS1: 理論的質量: 20411.32, 発見された質量: 20410.90
以下の実施例における本発明のFGF21誘導体を同様に製造してよい：
実施例31: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1A, 71C, 121Q, 143V, 145E, 146E, 148aD, 149L, 150R, 152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, 154F, 155S, 156S, 158L, 159E, 160T, 161D, 163M, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E) FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [71C, N121Q, 143V, 145E, 146E, 148aD, 149L, 150R, 152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, 154F, 155S, 156S, 158L, 159E, 160T, 161D, 163M, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E] Ala-FGF21の製造
実施例32： FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1A, 28R, 56R, 59R, 69R, S71C, 102T, 121Q, 122R, 166F, 167G, 168L, 170T) FGF21誘導体 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタ-デカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [28R, 56R, 59R, 69R, S71C, 102T, 121Q, 122R, 166F, 167G, 168L, 170T] Ala-FGF21の製造
実施例33: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1G, 71C, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-[(2-{3-[(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル)-カルボキシメチル-アミノ]-プロピオニルアミノ}-エチルカルバモイル)-メチル] [71C, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Gly-FGF21 の製造
17-(カルボキシメチル-{2-[2-(2-ヨード-アセチルアミノ)-エチルカルバモイル]-エチル}-カルバモイル)-ヘプタデカン酸の製造
工程 1: 17-{[2-(2-アミノ-エチルカルバモイル)-エチル]-カルボキシメチル-カルバモイル}-ヘプタデカン酸
エチレンジアミン(0.3 ml)入りTHF (4 ml)の溶液に、実施例19に記載されるように製造した、17-{カルボキシメチル-[2-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシカルボニル)-エチル]-カルバモイル}-ヘプタデカン酸(190 mg)の溶液を添加した。混合物を一晩室温で攪拌し、0.1 % TFA入り水及び0.1 % TFA入りアセトニトリルを溶離液として用いて、分取HPLCにより直接精製した。生成物を含むフラクションをプールし、凍結乾燥させた。収率 60 mg (35%)
LCMS3: 理論的質量: 485.67, 発見された質量: 486.38 (M+1)
工程 2: 17-(カルボキシメチル-{2-[2-(2-ヨード-アセチルアミノ)-エチルカルバモイル]-エチル}-カルバモイル)-ヘプタデカン酸
ヨードアセトアミド(35 mg)入りアセトニトリル(0.50 ml)の溶液にTSTU (56 mg) 及び DIPEA (0.032 ml)を添加した。混合物を1時間攪拌した後に、17-{[2-(2-アミノ-エチルカルバモイル)-エチル]-カルボキシメチル-カルバモイル}-ヘプタデカン酸(60 mg)入り0.1M Na2CO3 (5 ml)の溶液を添加した。混合物を2時間攪拌し、1N HCLを用いてpH 1まで酸性化させた。混合物を沈降させた。上清を移し、沈殿物を水で2回洗浄して、真空内で乾燥させた。収率 75 mg (93%)
LCMS3: 理論的質量: 653.60, 発見された質量: 654.27 (M+1)
実施例56に概論されるようにして製造された、(-1G, 71C, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K)FGF21類似体の位置71でのCys残基を、一般的手順A, BまたはCを用いて上述のように製造された試薬を用いて、位置71でチオール基で修飾してもよい。
Figure 0005599822
実施例34: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1G, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-[(2-{3-[(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル)-カルボキシメチル-アミノ]-プロピオニルアミノ}-エチルカルバモイル)-メチル] [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Gly-FGF21の製造
以下の例を製造した。
実施例35: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-[(2-{3-[(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル)-カルボキシメチル-アミノ]-プロピオニルアミノ}-エチルカルバモイル)-メチル] [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Ala-FGF21の製造
実施例56に概論されるようにして製造された、(-1A, 71C,121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K)FGF21類似体における位置71でのCys残基を、上述のように製造した試薬を用いて位置71でチオール基で修飾した：
Figure 0005599822
化合物を実施例16の手順を用いて製造した。収率 9.3 mg (33%)
LCMS1: 理論的質量: 20249.05 発見された質量: 20249.58
以下の実施例における本発明のFGF21誘導体を同様に製造してよい。
実施例36: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1S, 71C, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-[(2-{3-[(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル)-カルボキシメチル-アミノ]-プロピオニルアミノ}-エチルカルバモイル)-メチル] [71C, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Ser-FGF21の製造
実施例37: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1G, 71C, 102E, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-[(2-{3-[(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル)-カルボキシメチル-アミノ]-プロピオニルアミノ}-エチルカルバモイル)-メチル] [71C, 102E, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Gly-FGF21の製造
実施例38: N末端でアルブミンバインダーを有するFGF21化合物のさらなる誘導体化
(Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21誘導体 N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] [Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T] Ala-FGF21の製造
実施例56に概論されるようにして製造された、(Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21類似体（Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170Tを有する配列番号1)FGF21及びN末端Ala)のN末端Met残基を、実施例7に記載されるようにアルファアミノ基で修飾してよい。
実施例39: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1A, 71C, 102E, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-[(2-{3-[(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル)-カルボキシメチル-アミノ]-プロピオニルアミノ}-エチルカルバモイル)-メチル] [71C, 102E, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Ala-FGF21の製造
実施例40: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K) FGF21誘導体 S-71-[(2-{3-[(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル)-カルボキシメチル-アミノ]-プロピオニルアミノ}-エチルカルバモイル)-メチル] [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K] Ala-FGF21の製造
実施例41: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K, 182G-FGF21誘導体 S-71-[(2-{3-[(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル)-カルボキシメチル-アミノ]-プロピオニルアミノ}-エチルカルバモイル)-メチル] [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K, 182G] Ala-FGF21の製造
実施例42: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E) FGF21誘導体 S-71-[([(2-{3-[(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル)-カルボキシメチル-アミノ]-プロピオニルアミノ}-エチルカルバモイル)-メチル] [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E], Ala-FGF21の製造
実施例43: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181K) FGF21誘導体 S-71-[(2-{3-[(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル)-カルボキシメチル-アミノ]-プロピオニルアミノ}-エチルカルバモイル)-メチル] [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des 181K] Ala-FGF21の製造
実施例44: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1A, 71C, 121Q, 143V, 145E, 146E, 148aD, 149L, 150R, 152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, 154F, 155S, 156S, 158L, 159E, 160T, 161D, 163M, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E) FGF21誘導体 S-71-[(2-{3-[(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル)-カルボキシメチル-アミノ]-プロピオニルアミノ}-エチルカルバモイル)-メチル] [71C, 121Q, 143V, 145E, 146E, 148aD, 149L, 150R, 152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, 154F, 155S, 156S, 158L, 159E, 160T, 161D, 163M, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E] Ala-FGF21の製造
実施例45: FGF21類似体のさらなるCys誘導体の製造
(-1A, 28R, 56R, 59R, 69R, S71C, 102T, 121Q, 122R, 166F, 167G, 168L, 170T) FGF21誘導体 S-71-[(2-{3-[(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル)-カルボキシメチル-アミノ]-プロピオニルアミノ}-エチルカルバモイル)-メチル] [28R, 56R, 59R, 69R, S71C, 102T, 121Q, 122R, 166F, 167G, 168L, 170T] Ala-FGF21の製造
実施例46: N末端でアルブミンバインダーを有するFGF21化合物の誘導体化
(K56R, K59R, K69R, K122R) Gly-FGF21誘導体 N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] [K56R, K59R, K69R, K122R] Gly-FGF21の製造
FGF21誘導体を実施例7に記載されるのと同様の態様で製造かつ精製した。
LCMS1: 理論的質量: 20293.9 発見された質量: 20294.2
実施例47: N末端でアルブミンバインダーを有するFGF21化合物の誘導体化
(28R, K56R, 59R, 69R, 102T, 121Q, 122R, 168L, 179F, 180E, 181R) Gly-FGF21誘導体 N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタ-デカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] [28R, K56R, 59R, 69R, 102T, 121Q, 122R, 168L, 179F, 180E, 181R] Gly-FGF21の製造
FGF21誘導体を実施例7に記載されるのと同様の態様で製造かつ精製した。
LCMS1: 理論的質量: 20415.1 発見された質量: 20415.3
実施例48: N末端でアルブミンバインダーを有するFGF21化合物の誘導体化
(K56R, 59R, 69R, 122R, 168L) Gly-FGF21誘導体 N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] [K56R, 59R, 69R, 122R, 168] Gly-FGF21の製造
FGF21誘導体を実施例7に記載されるのと同様の態様で製造かつ精製した。
LCMS1: 理論的質量: 20275.9 発見された質量: 20276.1
実施例49: N末端でアルブミンバインダーを有するFGF21化合物の誘導体化
(K56R, 59R, 69R, 122R, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181R) Gly-FGF21誘導体 N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] [K56R, 59R, 69R, 122R, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181R] Gly-FGF21の製造
FGF21誘導体を実施例7に記載されるのと同様の態様で製造かつ精製した。
LCMS1: 理論的質量: 20535.2 発見された質量: 20535.6
実施例50: N末端でアルブミンバインダーを有するFGF21化合物の誘導体化
(K56R, 59R, 69R, 122R, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181R) Ser-FGF21誘導体 N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] [K56R, 59R, 69R, 122R, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181R] Gly-FGF21の製造
FGF21誘導体を実施例7に記載されるのと同様の態様で製造かつ精製した。
LCMS1: 理論的質量: 20565.2 発見された質量: 20565.5
実施例51: N末端でアルブミンバインダーを有するFGF21化合物の誘導体化
(-14E, -13E, -12A, -11E, -10A, -9G, -8G, -7A, -6G, -5G, -4S, -3G, -2G, -1S, K56R, 59R, 69R, 122R) FGF21誘導体 N-アルファ-1-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリル] [-14E, -13E, -12A, -11E, -10A, -9G, -8G, -7A, -6G, -5G, -4S, -3G, -2G,-1S, K56R, 59R, 69R, 122R] FGF21の製造
FGF21誘導体を実施例7に記載されるのと同様の態様で製造かつ精製した。
LCMS1: 理論的質量: 21063.6 発見された質量: 21063.8
実施例52: N末端でアルブミンバインダーを有するFGF21化合物の誘導体化
(-5G, -4S, -3G, -2S-, 1G, K56R, 59R, 69R, 102E, 121Q, 122R, 168L) FGF21誘導体 N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル-アミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] [-5G, -4S, -3G, -2S, -1G, K56R, 59R, 69R, 102E, 121Q, 122R, 168L] FGF21の製造
FGF21誘導体を実施例7に記載されるのと同様の態様で製造かつ精製した。
LCMS1: 理論的質量: 20592.2 発見された質量: 20592.9
実施例53: N末端でアルブミンバインダーを有するFGF21化合物の誘導体化
(K56R, K59R, K69R, K122R) Gly-FGF21誘導体 N-アルファ-1-(2-{2-[2-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-アセチル) [K56R, K59R, K69R, K122R] Gly-FGF21の製造
10 mg (511 nmol)の(K56R, K59R, K69R, K122R) Gly-FGF21入り1.72 ml バッファーを4 NAP-5-カラムを用いてバッファー交換してDPBSバッファーにした。タンパク質濃度を2.5mg/mlに決定した。この溶液に、400μlの20% HPβCD (ヒドロキシプロピルベータシクロデキストリン)及び400μlの10% N-アセチル-L-メチオニン, pH 7.5を添加した。この溶液に、8 eq (0,004086mmol)の{2-[2-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイル-アミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸の活性スクシンイミジルエステル入り200μl NMPを7°Cで添加した。スクシンイミジルエステルは炭酸 N,N-ジスクシンイミジル(CAS 74124-79-1)を用いて精製した。1:1で20分。90分後、4 mlの冷却した 0.2M NaOHを添加し、反応を30分間4℃で継続させた。次いで、4 mlの0.2M HClを添加し、pHを7.3に調整した。
反応混合物を、実施例4に記載されるように、0.22 umフィルターを介してろ過し、イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥させた。
LCMS1: 理論的質量: 20029.66 発見された質量: 20029.82.
実施例54: N末端でアルブミンバインダーを有するFGF21化合物の誘導体化
(K56R, K59R, K69R, K122R) Gly-FGF21誘導体 N-アルファ1-[4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)-ブチリル] [K56R, K59R, K69R, K122R] Gly-FGF21の製造
4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)-酪酸のスクシンイミジルエステルを、139 mgの4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)-酪酸及び115 mgのN-ヒドロキシスクシンイミドを1 ml DMF（数秒間熱湯で温められた）に溶解させることによって生成させた。145mgの(3-ジメチルアミノプロピル)エチルカルボジイミド塩酸塩を添加し、混合物を20分間室温で攪拌させた。3.5時間後、混合物を8 mlの水に注ぎ入れ、遠心分離機にかけた。上清を除去し、懸濁及び遠心分離を2回繰り返した。
溶離した後、10 mg (K56R, K59R, K69R, K122R)Gly-FGF21入り1.72ml DPBSを4 mlのDPBSにバッファー交換した。400 μlの10% N-アセチルメチオニン(約8に調整されたpH）及び400 μlの20% シクロデキストリンを添加した。330 μgの4-(16-(テトラゾ-5-イル)-ヘキサデカノイルスルファモイル)酪酸スクシンイミジルエステルの200μlの溶液入り1400 ul NMPを添加した。反応混合物を一晩7℃に置いた。4 mlの0.2 M NaOHを反応混合物に4℃で添加した。30分後、混合物を3.9 ml 0.2 M HClで中和した。
溶液混合物を、実施例4に記載されるように、0.22 umフィルターを介してろ過し、イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥させた。
LCMS1: 理論的質量: 20033.67 発見された質量: 20033.72.
実施例55: N末端でアルブミンバインダーを有するFGF21化合物の誘導体化
(-5G, -4S, -3G, -2S, -1G, K56R, 59R, 69R, 102E, 121Q, 122R, 168L) FGF21誘導体 N-アルファ-1-[4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)-ブチリル] [-5G, -4S, -3G, -2S, -1G, K56R, 59R, 69R, 102E, 121Q, 122R,168L] FGF21の製造
FGF21誘導体を実施例54に記載されるのと同様の態様で製造かつ精製した。
LCMS1: 理論的質量: 20331.94 発見された質量: 20332.39
実施例56: FGF21類似体のクローニング及び発現
以下の化合物を実施例2及び3に記載されるように製造かつ精製した：
56a) (K56R, K59R, K69R, K122R) Gly-FGF21;
56b) (K56R, K59R, K69R, K122R, M168L) Gly-FGF21;
56c) (Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, M168L, Y179F, A180E, S181R) Gly-FGF21;
56d) (K56R, K59R, K69R, D102E, N121Q, K122R, M168L) GSGSG-FGF21;
56e) (S71C, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) Gly-FGF21;
56f) (K56R, K59R, K69R, K122R, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181R) Ser-FGF21;
56g) (K56R, K59R, K69R, K122R, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181R) Gly-FGF21;
56h) (K56R, K59R, K69R, K122R) EEAEAGGAGGSGGS-FGF21;
56i) (S71C, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) Ser-FGF21;
56j) (S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) Gly-FGF21;
56k) (S71C, D102E, N121Q, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) Gly-FGF21;
56l) (S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) Ala-FGF21;
56m) (S71C, D102E, N121Q, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) Ala-FGF21;
56n) (Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21;
56o) (S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E) Ala-FGF21;
56p) (S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181G) Ala-FGF21;
56q) (S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des S181) Ala-FGF21;
56r) (D102N) Met-FGF21;
56s) (Q15F) Met-FGF21;
56t) (D24K) Met-FGF21;
56u (V16K) Met-FGF21;
56v) (S71C, M168I) Gly-FGF21;
56x) (S71C, M168L) Gly-FGF21;
56y) (K56R, K59R, K69R, K122R) FGF21;
56z) (N121Q) Met-FGF21;
56aa) (des N121) Met-FGF21;
56ab) (S71C) Gly-FGF21;
56ac) (P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) Met-FGF21;
56ad) (145aP, 145bM, L146V, P149E, G151E, I152D, A154R, P155G, Q156H, P157L, P158E, D159S, V160D, G161M, S162F, D164S, S167E, M168T, V169D, G170S, P171M, S172D, Q173P, G174F, R175G, S176L, P177V, S178T, Y179G, A180L, S181E, 182A, 183V, 184R, 185S, 186P, 187S, 188F, 189E, 190K) Met-FGF21;
56ae) (Q27E, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, Y179F, A180E, S181R) Gly-FGF21;
56af) (Q15F, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, Y179F, A180E, S181R) Gly-FGF21;
56ag) (S71C, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) Gly-FGF21;
56ah) (L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) Ser-FGF21;
56ai) (M168A) Met-FGF21;
56aj) (M168S) Met-FGF21;
56ak) (K56R, K59R, K69R, K122R, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181R) FGF21;
56al) (M168S) Ser-FGF21;
56am) (Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, D159E, M168L, G174A, Y179F) Gly-FGF21;
56an) (K56R, K59R, K69R, K122R) EESAASGAAAGSAAA-FGF21;
56ao) (Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Gly-FGF21;
56ap) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181R) FGF21;
56aq) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, desS181) FGF21;
56ar) (N121D) Met-FGF21; 及び
56as) (A26E, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, Y179F, A180E, S181R) Gly-FGF21.
実施例57: FGF21類似体のクローニング及び発現
以下のFGF21誘導体を実施例2及び3に記載されるのと同様に製造してもよい：
57a) (Q28R, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21;
57b) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) Gly-FGF21;
57c) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) Ala-FGF21;
57d) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) Ser-FGF21;
57e) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) FGF21;
57f) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Gly-FGF21;
57g) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21;
57h) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ser-FGF21;
57i) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) FGF21;
57j) P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ala-FGF21;
57k) (S71C, 121Q, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ala-FGF21;
57l) (S71C, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ala-FGF21;
57m) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ala-FGF21;
57n) (K56R, K59R, K69R, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ala-FGF21;
57o) (S71C, 121Q, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ser-FGF21;
57p) (S71C, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ser-FGF21;
57q) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ser-FGF21;
57r) (K56R, K59R, K69R, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ser-FGF21;
57s) (S71C, 121Q, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) FGF21;
57t) (S71C, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) FGF21;
57u) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) FGF21;
57v) (K56R, K59R, K69R, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) FGF21;
実施例58: HEK293/ベータ-クロトー Erk リン酸化アッセイ
Erkリン酸化アッセイを、ヒトベータ-クロトーで安定的に形質転換されたHEK293細胞において実施した。HEK293T/b-クロトー安定細胞を96ウェルプレート上に3000細胞/ウェルで播種した。2日後、新鮮な培地を添加し、2時間以上の後にFGF21タンパク質を添加した。プレートを12分間インキュベーションした。そして、製造業者の指示に従って、AlphaScreen SureFire Phospho-ERK1/2アッセイキット(Perkin Elmer, Waltham, MA)を用いて、全体的なERKリン酸化を評価し、AlphaScreen HTS Turboオプションとともに、EnVision Multilabel Microplate Reader Model 2103 (Perkin Elmer)をシグナル検出用に用いた。データは平均+/- S.E.M.として表される。EC50値を、GraphPad Prism バージョン5.02を用いて、4つのパラメーターのロジスティックな非線形の回帰分析により決定した。参考文献：Yie, J. et al.: FGF21 N- 及び C-termini play different roles in receptor interaction and activation, FEBS Letters 583 (2009) 19-24, 及び Micanovic R. et al.: Different roles of N- and C- termini in the functional activity of FGF21.
1310689116140_1.');
2009 May; 219(2):227-34。
Figure 0005599822
Figure 0005599822

Claims (8)

  1. 式 A-B-C-D-E-のアルブミンバインダーが、システイン残基のチオール基を介して、N末端アミノ酸残基のアミノ基を介して、または、リジン残基のイプシロンアミノ基を介して、共有結合しているFGF21化合物の誘導体であって、
    配列番号1に対して少なくとも80%の同一性を有し、
    ここで、A-は式IまたはII:
    Figure 0005599822
     の要素であり、nは8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18または19であり、*は-B-との結合点であり;
    -B-は-B2-であり、
    -B2-は式 IIX, IXまたはXXVIIIの要素であり：
    Figure 0005599822
     ここで、bは0, 1または2であり、cは0, 1または2であり、ただしcが0であるときbは1または2であり、cが1または2であるときbは0であり、*は-C-、-D-、-E-、またはFGF21化合物との結合点であり、かつ#はA-との結合点であり；または
    Figure 0005599822
     ここで、dは1または2であり、eは0, 1または2であり、*は-C-、-D-、-E-、またはFGF21化合物との結合点であり、かつ#はA-との結合点であり;または
    #-NH-SO2-(CH2)u-CO-* (式 XXVIII)
    ここで、uは2, 3または4であり、*は-C-、-D-、-E-、またはFGF21化合物との結合点であり、#はA-との結合点であり;
    -C-は存在しないか、結合を表すか、または式 XもしくはXIの要素であり:
    Figure 0005599822
     ここで、pは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、qは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-D-、-E-またはFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-B-との結合点であり;または
    Figure 0005599822
     ここで、kは0, 1, 2, 3, 4, 5, 11または23であり、mは0, 1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-D-, -E-またはFGF21化合物との結合点であり;かつ#は-B-との結合点であり;
    -D-は存在しないか、結合を表すか、または式 XIIもしくはXIIIの要素であり:
    #-NH-(CH2)r-NH-CO-(CH2)s-* (式 XII)または
    #-NH-(CH2)t-* (式 XIII)
    ここで、rは2, 3, 4または5であり、sは1, 2, 3または4であり、tは1, 2, 3, 4, 5または6であり、*は-E-またはFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-C-との結合点であり;
    -E-は存在しないか、結合を表すか、あるいは式 XXIIの要素であり:
    Figure 0005599822
     ここで、*はFGF21化合物との結合点であり、かつ#は-D-または-C-との結合点である
    誘導体、あるいはそれらの医薬的に許容できる塩。
  2. -B-及び-C-は存在し、かつ結合を表さない、請求項1に記載の誘導体。
  3. 式 A-B-C-D-E-のアルブミンバインダーが共有結合している、請求項1に記載のFGF21化合物の誘導体であって、ここで、A-B-C-D-E-は以下の式(1)-(14)：
    Figure 0005599822
    Figure 0005599822
    Figure 0005599822
     から選択される、誘導体；または対応する誘導体のいずれか1つの医薬に許容できる塩。
  4. S-122-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-エチル)-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル] [Cys122]-Met-FGF21 (化合物F); S-71-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-エチル)-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イル] [Cys71]Met-FGF21 (化合物H); S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) [Cys71]Met-FGF21 (化合物O); N-アルファ1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタ-デカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] [Arg56, Arg59, Arg69, Arg122]-Met-FGF21 (化合物V); S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチル-カルバモイル}-メチル) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181K] Ala-FGF21; S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタ-デカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチル-カルバモイル}-メチル) [28R, 56R, 59R, 69R, S71C, 102T, 121Q, 122R, 166F, 167G, 168L, 170T] Ala-FGF21; N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル-アミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] [Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T] Ala-FGF21; N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル-アミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] [K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des S181] Ala-FGF21; N-アルファ-1-[4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)-ブチリル] [K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des S181] Ala-FGF21; N-アルファ-1-[4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイル-スルファモイル)-ブチリル] [Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T] Ala-FGF21; S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタ-デカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチル-カルバモイル}-メチル) (Q28R, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21; N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル-アミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) Gly-FGF21; N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル-アミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) Ala-FGF21; N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル-アミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) Ser-FGF21; N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル-アミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) FGF21; N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリル-アミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル-アミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Gly-FGF21; N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル-アミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21; N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル-アミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ser-FGF21; N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル-アミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) FGF21; S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタ-デカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチル-カルバモイル}-メチル) (S71C, 121Q, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ala-FGF21; S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタ-デカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチル-カルバモイル}-メチル) (S71C, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ala-FGF21; N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル-アミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ala-FGF21; N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ala-FGF21; S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチル-カルバモイル}-メチル) (S71C, 121Q, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ser-FGF21; S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) (S71C, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ser-FGF21; N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S
    172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ser-FGF21; N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル-アミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) Ser-FGF21; S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタ-デカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチル-カルバモイル}-メチル) (S71C, 121Q, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) FGF21; S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイル-アミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エチルカルバモイル}-メチル) (S71C, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A
    154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) FGF21; N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) FGF21; 及び N-アルファ-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-アセチル] (K56R, K59R, K69R, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) FGF21から選択される誘導体のいずれか1つである請求項1から3のいずれか一項に記載の誘導体；あるいはこれらの化合物のいずれか1つの医薬的に許容できる塩。
  5. 式A-B-C-のアルブミンバインダーが共有結合している、請求項1に記載のFGF21化合物の誘導体であって、ここで、A-B-C-は以下の式(15)-(21)：
    Figure 0005599822
     から選択される、誘導体;または対応する誘導体の医薬的に許容できる塩。
  6. 請求項1から5のいずれか一項に記載の誘導体、及び医薬的に許容できる担体を含む、組成物。
  7. 医薬として使用するための、請求項6に記載の組成物。
  8. 糖尿病、脂質異常症、肥満、循環器疾患、メタボリック・シンドローム、及び／または非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD)の治療または予防における医薬として使用するための、請求項6に記載の組成物。
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