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JP5425400B2 - 産褥由来細胞を用いた脳卒中および他の急性神経変性障害の治療 - Google Patents

産褥由来細胞を用いた脳卒中および他の急性神経変性障害の治療 Download PDF

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Description

開示の内容
〔関連出願の相互参照〕
本明細書は、２００３年６月２７日に出願された米国仮出願第６０／４８３，２６４号の利益を請求する、２００４年６月２５日の出願された米国出願第１０／８７７，２６９号の一部継続出願であり、両出願の全開示内容は参照して本明細書に組み入れる。本明細書はまた、２００４年１２月２３日の出願された米国仮出願６０／６３８，９６６号の利益を請求するものであり、その全開示内も参照して本明細書に組み入れる。
〔発明の分野〕
本発明は、脳卒中患者の細胞に基づく治療、または再生治療の分野に関する。詳しくは、本発明は、脳卒中患者または他の形態の急性神経ストレスまたは損傷に苦しんでいる患者において神経組織を再生、修復、および改善し、挙動および神経機能を改善する能力を有する産褥組織（postpartum tissue）由来の細胞を、ならびにこのような個体において神経組織を再生、修復、および改善し、挙動および神経機能を改善するためにこのような産褥由来細胞を使用する方法を提供する。
〔発明の背景〕
本明細書には特許、公開出願、技術論文および学術論文を含む様々な刊行物が引用されている。引用されているこれらの各刊行物は参照してそのまま本明細書に組み入れる。
米国では、脳卒中は年間７００，０００人を襲っている。これらの脳卒中患者のうち４０％が死に至り、これは３分に１人に相当する。脳卒中関連の死亡のうち５０％は病院で起こっている。
最も多い２つの脳卒中が虚血性脳卒中と出血性脳卒中である。虚血性脳卒中では、脳への酸素の流れが欠如した結果、脳組織のアポトーシスと壊死が起こり、梗塞に至る。心血管虚血と同様に、脳虚血は血餅、血栓、塞栓、アテローム性動脈硬化巣による遮断、または他の脈管構造内閉塞など、様々な要因によって起こり得る。中でも高コレステロール血症、高血圧症、糖尿病および肥満は虚血性脳卒中のリスク因子として特定されている。虚血性脳卒中は世界での人の死の主因である。出血性脳卒中は全脳卒中の約１０〜２０％の間に相当し、典型的には脳の血管の破裂によって起こる。この破裂は脳内で出血をもたらし、貯まった血液が周囲の神経組織を損傷する場合がある。
原因にかかわらず、脳卒中発症の結果、特に閉塞または出血部位で神経細胞死が起こる。さらに、脈管構造における脳卒中発症に引き続いて起こる生化学反応は浮腫、出血合併（hemorrhagic transformation）を招き、さらに神経組織を損なう。脳卒中を原因とする神経損傷および神経細胞死は個体を身体的および精神的に衰弱させるおそれがある。とりわけ、脳卒中は情動制御、意識性、知覚、話す、聞く、見る、認知、運動および歩行に問題をきたすおそれがあり、麻痺を引き起こすこともある。
神経損傷および神経変性疾患は、成体においてはニューロンおよび神経系の他の細胞が増殖できないために、不可逆的なものであると長年考えられてきた。しかし、組織修復および再生を目的とした近年の幹細胞に基づく療法の登場により、いくつかの神経変性病態および他の神経疾患の有望な治療が提供される。幹細胞は、様々な成熟神経細胞系統を形成すべく自己再生および分化が可能である。このような細胞の移植は、標的組織を再構築し、それにより生理学的および解剖学的機能を回復させるための臨床手段として利用できる。幹細胞技術の適用は、組織工学、遺伝子療法送達、および細胞治療薬、すなわち、生物治療薬を生成する、または含む生細胞または細胞成分を外部から供給することによる、標的部位への生物治療薬の送達をはじめ、広範囲である（総説としては、Tresco, P. A.ら, (2000) Advanced Drug Delivery Reviews 42:2-37参照)。幹細胞の確認は、再生医療のための特定の細胞種の選択的再生を目的とした研究を促進した。
失われたニューロンを補うための細胞移植は、脳卒中から起こる神経損傷を治療する新たなアプローチである。幹細胞技術の治療的可能性を実現する１つの障害は、十分な数の幹細胞を得るのが難しいことであった。胚、または胎児組織は幹細胞の１つの供給源である。胚幹細胞および前駆細胞が、ヒトをはじめとするいくつかの哺乳類種から単離されており、このような細胞種のいくつかは自己再生および拡大培養可能であるとともに、全ての神経細胞系統へ分化可能であることが示されている(Svendsen, CV.ら(1997) Exp. Neurol. 148:135-146; Freed, C.R.ら(2001) New Engl J. Med. 344(10):-719; Burnstein, R.M.ら(2003) Int. J. Biochem. Cell Biol. 36:702-713; Zhang, S-C.ら(2001) Nat. Biotechnol. 19:1129-1133; Reubinoff, B.E.ら(2001) Nat. Biotechnol. 19:1134-1140; Bjorklund, L.M.ら(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(4):2344-2349)。しかし、胚または胎児の供給源からの幹細胞の誘導においては、多くの倫理的および道義的問題が持ち上がり、これらの問題は多分化能性(multipotent)または多能性(pluripotent)細胞の他の供給源を特定することにより避けるのが望ましい。
神経的潜在能力を有する幹細胞はまた、成体組織からも単離されている。神経幹細胞は発達中の脳や成体の神経系に存在する。これらの細胞は拡大培養可能であり、ニューロン、星状細胞および乏突起神経膠細胞へと分化可能である。しかしながら、成体神経幹細胞はまれにしかないばかりか、侵襲的手法によって得るしかなく、胚幹細胞よりも培養拡大力が限定されている場合がある。
他の成体組織からも、細胞に基づく神経療法に有用な前駆細胞を得ることができる。例えば、最近、骨髄および皮膚由来の成体幹細胞は拡大培養可能であり、かつ、数種の神経細胞系統を含む複数の系統を形成することが報告されている(Azizi, S.A.ら(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3908-3913; Li, Y.ら(2001) Neurosci. Lett. 315:67-70)。ヒト奇形腫およびヒト臍帯血（human ubilical cord ）単核細胞由来のニューロンなど、他の細胞種の線条体内グラフトおよび黒質内グラフトもパーキンソン病の動物モデルで試験されている(Baker, K.A.ら(2000) Exp. Neurol. 162:350-360; Ende, N. and R. Chen (2002) J Med. 33(1-4):173-180)。
臍帯および胎盤などの産褥組織は、幹細胞のもう１つの供給源として注目されている。例えば、胎盤の潅流または臍帯血もしくは組織からの採取により幹細胞を回収する方法が記載されている。これらの方法からの幹細胞の獲得の限定要因は、臍帯血の量または得られる細胞の量が不十分であること、ならびにこのような供給源から得られる細胞集団が不均一なこと、また特性決定ができないことであった。
よって、一連の神経細胞系統へと分化する能力を有する細胞を十分供給する別の供給源が依然として切望されている。さらに、脳卒中により引き起こされる神経的、神経学的および挙動障害を修復するための満足のいく方法も存在しない。脳卒中は運動系に影響を及ぼすことがあり、患者に片側不全麻痺または麻痺の徴候を与える。よって、一連の神経細胞系統へと分化する能力を有する細胞の、実質的に均一な集団で、信頼性があり、十分特性決定され、かつ豊富な供給は、神経修復、再生および改善するための様々な診断適用および治療適用、ならびに特に脳卒中患者における挙動および神経機能の改善のための適用に有利となる。
〔発明の概要〕
本発明の一態様は、急性神経変性症状を有する患者を治療する方法において、神経変性症状を治療するのに有効な量の産褥由来細胞を患者に投与することを含み、前記産褥由来細胞は実質的に血液を含まないヒト胎盤組織またはヒト臍帯組織に由来し、前記細胞は自己再生および拡大培養が可能であり、かつ、少なくとも神経表現型の細胞へと分化する能力を有し、前記細胞は増殖にＬ−バリンを必要とし、かつ、少なくとも約５％の酸素中で増殖可能であり、前記細胞は次の特徴：（ａ）培養において少なくとも約４０回の倍加能；（ｂ）コートまたは非コート組織培養容器における接着および拡大培養（該コート組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを含む）；（ｃ）組織因子、ビメンチン（vimentin）、およびα−平滑筋アクチンのうち少なくとも１つの産生；（ｄ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのうち少なくとも１つの産生；（ｅ）フローサイトメトリーにより検出されるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうち少なくとも１つの産生の欠如；（ｆ）繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、インターロイキン８；レチクロン(reticulon)１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫(melonoma)増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３；Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバー２；ウィルムス腫瘍１；アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２；レニン(renin)；酸化低密度リポタンパク質受容体１；ヒト(Homo sapiens)クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１；プロテインキナーゼＣζ；機能未知タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３；卵巣癌１においてダウンレギュレーション；およびクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３由来のヒト(Homo sapiens)遺伝子をコードする遺伝子の少なくとも１つが増大されている遺伝子発現；（ｇ）繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、低身長ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上部狭窄症、ウィリアムス−ビューレン症候群）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２）；間充織ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）；sine oculisホメオボックスホモログ１（ショウジョウバエ(Drosophila)）；クリスタリン(crystallin)αＢ；形態形成のdisheveled関連アクチベーター２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン(neuralin)１に類似；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；src homology three（ＳＨ３）およびシステイン豊富ドメイン；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；runt関連転写因子３；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；frizzledホモログ７（ショウジョウバエ(Drosophila)）；機能未知遺伝子ＢＣ００８９６７；ＶＩＩＩ型コラーゲンα１；テネイシンＣ(hexabrachion)；iroquoisホメオボックスタンパク質５；hephaestin；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ；ヒト(Homo sapiens)ｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム依存性チャネルサブファミリーＮメンバー４；インテグリンβ７；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；sine oculisホメオボックスホモログ２（ショウジョウバエ(Drosophila)）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；小胞関連膜タンパク質５(myobrevin)；ＥＧＦ含有fibulin様細胞外マトリックスタンパク質１；初期成長応答３；distal-lessホメオボックス５；機能未知タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ）；ビグリカン；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリンβ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（atrionatriureticペプチド受容体Ｃ）；機能未知タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）；ニューラリン(neuralin)１と類似；Ｂ細胞輸送遺伝子１；機能未知タンパク質ＦＬＪ２３１９１；およびＤＫＦＺｐ５８６Ｌ１５１をコードする遺伝子の少なくとも１つが低減されている遺伝子発現；（ｈ）ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＩＭＰ１のうち少なくとも１つの分泌；ならびに（ｉ）ＥＬＩＳＡにより検出されるＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、およびＶＥＧＦのうち少なくとも１つの分泌の欠如、のうち少なくとも１つをさらに含む。
一実施形態では、前記急性神経変性症状は虚血性脳卒中に起因し、別の実施形態では、前記急性神経変性症状は出血性脳卒中に起因する。
特定の実施形態では、前記細胞は、投与前にインビトロで神経系統細胞へと分化するように誘導される。他の実施形態では、前記細胞は、神経変性症状の治療を促進する遺伝子産物を産生するように遺伝的に操作される。
特定の実施形態では、前記細胞は、少なくとも１つの他細胞種とともに投与され、これらの多細胞種としては、星状細胞、乏突起神経膠細胞、ニューロン、神経前駆体、神経幹細胞、遺伝子操作細胞、または他の多分化能性または多能性幹細胞が挙げられる。この他の細胞種は、産褥由来細胞と同時、または前、または後に投与することができる。他の実施形態では、前記細胞は少なくとも１種類の他の薬剤とともに投与することができ、この他の薬剤は産褥由来細胞と同時、または前、または後に投与することができる。
一実施形態では、前記細胞は、患者の中枢神経系または末梢神経系の所定の部位に投与され、そこでこれらの細胞は、患者の神経系に対する栄養作用を含む１以上の作用を発揮し得る。
前記細胞は注射または注入によって投与することができ、あるいは移植可能なデバイス内に封入したり、細胞を含むマトリックスまたはスキャフォールドの移植により投与したりすることができる。
本発明の別の態様は、急性神経変性症状を有する患者を治療するための、製薬上許容される担体と前記産褥由来細胞を含む医薬組成物を特徴とする。特定の実施形態では、該組成物は、虚血性脳卒中または出血性脳卒中から起こる急性神経変性症状を治療するために使用される。
前記細胞は、組成物の処方前にインビトロで神経系統細胞へと分化するように誘導されることもできるし、あるいは神経変性症状の治療を促進する遺伝子産物を産生するように遺伝的に操作することもできる。
特定の実施形態では、該医薬組成物は少なくとも１種類の他の細胞種を含み、この他の細胞種は星状細胞、乏突起神経膠細胞、ニューロン、神経前駆体、神経幹細胞、遺伝子操作細胞、または他の多分化能性または多能性幹細胞であり得る。他の実施形態では、該医薬組成物は少なくとも１種類の他の薬剤を含む。
該医薬組成物は注射または注入による投与のために処方することもできるし、あるいは移植可能なデバイスに封入したり、マトリックスまたはスキャフォールド内に包含させたりすることができる。
本発明の別の態様は、神経変性症状を治療するのに有効な量の前記産褥由来細胞から製造された調製物を患者に投与するステップを含む、急性神経変性症状を有する患者を治療する方法を特徴とし、当該調製物は、産褥由来細胞の細胞溶解物、産褥由来細胞の細胞外マトリックス、または産褥由来細胞が増殖された細胞馴化培地を含む。
本発明のさらに別の態様は、製薬上許容される担体と、産褥由来細胞の細胞溶解物、産褥由来細胞の細胞外マトリックス、または産褥由来細胞が増殖された細胞馴化培地を含む前記調製物とを含む、急性神経変性症状を有する患者を治療するための医薬組成物を特徴とする。
本発明の別の態様は、治療上有効な量の細胞調製物を患者に投与するステップを含む、それを必要とする患者において脳卒中を治療する方法を特徴とし、当該細胞調製物は、前記のようにヒト胎盤組織またはヒト臍帯組織に由来する細胞を含む単離された産褥由来細胞を含む。一実施形態では、前記細胞は、患者に投与する前にインビトロで神経系統細胞へと分化するように誘導される。別の実施形態では、前記細胞は、脳卒中の治療を促進する遺伝子産物を産生するよう遺伝的に操作される。種々の実施形態では、前記細胞調製物は、星状細胞、乏突起神経膠細胞、ニューロン、神経前駆体、神経幹細胞または他の多分化能性または多能性幹細胞などの少なくとも１種類の他の細胞種をさらに含むか、または脳卒中の治療のための少なくとも１種類の他の薬剤をさらに含む。
一実施形態では、前記細胞調製物は未分画細胞溶解物を含み、別の実施形態では、前記細胞調製物は膜不含細胞溶解物を含む。他の実施形態では、前記細胞調製物は産褥由来細胞の細胞外マトリックス、または産褥由来細胞が増殖された細胞馴化培地を含む。前記細胞調製物は注射または注入による投与のために処方することもできるし、あるいは移植可能なデバイスに封入したり、マトリックスまたはスキャフォールドに包含させたりすることもできる。
本発明の他の特徴および利点は、以下の図面、詳細な説明および実施例を参照すれば理解される。
〔例示的実施形態の詳細な説明〕
定義
本明細書および特許請求の範囲では、本発明の方法およびその他の態様に関する様々な用語が使用されている。このような用語は特に断りのない限り、当技術分野での通常の意味を示すものとする。他の特に定義された用語は、ここに示される定義に即して解釈される。
「幹細胞」は、自己再生中の前駆細胞、非再生中の前駆細胞、および最終的な分化細胞を含む、単一細胞の自己再生能と後代細胞産生のための分化能の双方により定義される未分化細胞である。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）からの様々な細胞系統の機能的細胞へとインビトロで分化する能力、ならびに移植後に複数の胚葉の組織を生じる能力、および胚盤胞へ注射した後に、全てではなくても、実質的にほとんどの組織に寄与する能力を特徴とする。
幹細胞はそれらの発達能に従って、（１）「全能性」；（２）「多能性」；（３）「多分化能性（multipotent）」；（４）「貧能性(oligopotent)」；および（５）「分化単能性(unipotent)」として分類される。「全能性」細胞は全ての胚細胞種および胚体外細胞種を形成し得る。「多能性」細胞は全ての胚細胞種を形成し得る。「多分化能性」細胞は細胞系統のサブセットを形成し得るが、全て特定の組織、器官または生理系の範囲内である（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血液細胞限定貧能性前駆体、ならびに通常の血液成分である全ての細胞種および要素（例えば、血小板）を含む後代細胞を産生することができる）。「貧能性」の細胞は多分化能性幹細胞よりも限定された細胞系統のサブセットを生じ、「分化単能性」の細胞は単一の細胞系統（例えば、精子形成性幹細胞）を生じ得る。
幹細胞はまた、幹細胞が採取可能な供給源に基づいても分類される。「成体幹細胞」は一般に、複数の分化細胞種を含む組織に見られる多分化能性の未分化細胞である。成体幹細胞はそれ自体再生可能である。通常の環境下で、成体幹細胞はまた、その起源である組織およびおそらく他の組織種の特化した細胞種を得るために分化することができる。「胚幹細胞」は、胚盤胞段階の胚の内部細胞塊由来の多能性細胞である。「胎児」幹細胞は胎児組織または胎膜起源のものである。「産褥幹細胞」は、誕生後に利用可能な胚体外組織、すなわち、胎盤および臍帯に実質的に起源する多分化能性または多能性細胞である。これらの細胞は、速い増殖および多くの細胞系統へと分化する能力を含む多能性幹細胞の特徴を有することが分かっている。産褥幹細胞は血液由来（例えば、臍帯血から採取されるもの）または非血液由来（例えば、臍帯および胎盤の非血液組織から採取されるもの）であり得る。
「胚組織」は一般に、胚起源の組織として定義される （ヒトでは、受精から発達約６週までの期間をさす）。「胎児組織」は胎児起源の組織をさし、ヒトでは、発達約６週目から分娩までの期間をさす。「胚体外組織」は胚または胎児に関連しているが、胚または胎児起源ではない組織である。胚体外組織は、胚体外膜（絨毛膜、羊膜、卵黄嚢および尿膜）、臍帯および胎盤（それ自体は絨毛膜および母体の基底脱落膜から形成される）。
「分化」は、非特化（「決定済みでない」）または特化性の低い細胞が、例えば、神経細胞または筋肉細胞などの特化細胞の特徴を獲得するプロセスである。「分化」細胞は、その細胞系統内でより特化性の高い（「決定済みの」）立場をとった細胞である。「決定済み」とは、分化の過程に用いる場合、通常の環境下で特定の細胞種または細胞種サブセットに分化し続けるが、通常の環境下で異なる細胞種に分化することができないか、または分化性の低い細胞種には後戻りすることができないポイントまで分化経路が進行した細胞をさす。「脱分化」は、細胞が、その細胞系統内の特化性の低い（または決定済みでない）状態に後戻りするプロセスをさす。本明細書において、その細胞「系統」はその細胞の遺伝性、すなわち、どの細胞に由来し、どの細胞を生じるかを規定する。その細胞系統は、その細胞を発達および分化の遺伝スキーム内に置く。
広義において、「前駆細胞（progenitor cell）」は、それ自体よりも分化した後代を作り出す能力を有し、かつ、する前駆細胞のプールを満たす能力をなお保持する細胞である。この定義によれば幹細胞それ自体も、最終分化細胞へのより直接的な前駆体であるので、前駆細胞である。下記により詳細に記載するように、本発明の細胞に関しては、この「前駆細胞」のより広い定義が用いられる。狭義においては、前駆細胞は、多くの場合、分化経路の中間体である細胞として定義されており、すなわち、幹細胞から生じ、成熟細胞種または細胞種のサブセットの産生における中間体となる。この種の前駆細胞は一般に、自己再生不能である。よって、本明細書にこの種の細胞が言及される場合、「非再生前駆細胞」と呼ばれるか、または「中間的前駆細胞」もしくは「前駆体細胞（precursor cell）」と呼ばれる。
本発明の細胞は一般に、「産褥細胞」または「産褥由来細胞」（ＰＰＤＣ）と呼ばれる。本発明の細胞はまた、より詳しくは「臍由来細胞」（ＵＤＣ）または「胎盤由来細胞」（ＰＤＣ）と呼ばれる場合もある。さらに、これらの細胞は幹細胞または前駆細胞と記載される場合もあり、当該用語は広義において用いられる。「由来」とは、それらの細胞が生物源から採取され、インビトロで増殖、またはそうでなければ操作された（例えば、増殖培地で集団を拡大するまで、かつ／または細胞系統となるまで培養された）ことを示すのに用いる。インビトロにおける臍帯幹細胞に操作および本発明の臍由来細胞のユニークな特徴を以下に詳細に記載する。
培養細胞を表すために様々な用語が用いられる。「細胞培養物」とは一般に、生物体から採取され、制御された条件下で増殖（培養）された細胞をさす。「一次細胞培養」とは、最初の植え継ぎ前に、生物から直接採取された細胞、組織または器官の培養物である。細胞増殖および／または分裂を促進する条件下で増殖培地に置かれた場合に「拡大培養（expanded in culture）」され、大きな細胞集団が得られる。細胞を拡大培養した場合、細胞増殖速度は細胞数が倍加するのに必要な時間量により測定される場合がある。これは「倍加時間」と呼ばれる。
「細胞系統」は、一次細胞培養物の１回以上の植え継ぎ（subcultivations）により形成される細胞集団である。各回の植え継ぎは「継代培養」と呼ばれる。細胞が植え継がれる場合、その細胞は「継代培養」されたといわれる。特定の細胞集団または細胞系統は、継代培養された回数に関して示され、あるいは特徴付けられる場合がある。例えば、１０回継代培養された培養細胞集団はＰ１０培養物と呼ぶことができる。一次培養物、すなわち、組織から細胞を単離した後の初代培養物はＰ０と呼ばれる。１回目の植え継ぎの後、当該細胞は二次培養物（Ｐ１または１代目）で表される。２回目の植え継ぎの後、当該細胞は三次培養物（Ｐ２または２代目）などとなる。当業者ならば、継代培養期間中は何回も集団倍加し得るので、ある培養物の集団倍加回数は継代培養回数よりも大きい場合があることが分かるであろう。継代培養間の期間の細胞の増殖（すなわち、集団倍加回数）は、限定されるものではないが、播種密度、支持体、培地、増殖条件および継代培養間の時間を含む多くの因子によって異なる。
「細胞馴化培地」とは、その中で特定の細胞または細胞集団が培養された後、取り出された培地である。細胞をある培地中で培養した場合、当該細胞は他の細胞に栄養的支持体を提供することができる細胞因子を分泌する場合がある。このような栄養因子としては、限定されるものではないが、ホルモン、サイトカイン、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、タンパク質、小胞、抗体、および顆粒が挙げられる。これらの細胞因子を含む培地が細胞馴化培地である。
「増殖培地」とは一般に、ＰＰＤＣの培養に十分な培地をさす。特に、現在のところ本発明の細胞の培養に好ましい培地としては、ダルベッコの改変イーグル培地（ダルベッコの最少必須培地としても知られる）（ＤＭＥＭ）が挙げられる。特に好ましいのは、ＤＭＥＭ−低グルコースである（本明細書では、ＤＭＥＭ−ＬＧともいう）(Invitrogen, Carlsbad, CA)。このＤＭＥＭ−低グルコースには、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（例えば、定義済みウシ胎児血清，Hyclone, Logan UT）、抗生剤および抗真菌剤（好ましくは、５０〜１００単位／ｍＬペニシリン、５０〜１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および０〜０．２５μｇ／ｍＬアムホテリシンＢ；Invitrogen, Carlsbad, CA)、ならびに０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール(Sigma, St. Louis MO)を添加することが好ましい。
「標準増殖条件」とは、５％ＣＯ2を含む標準的な加湿雰囲気下、３７℃で細胞を培養することをさす。このような条件は培養に有用であるが、当該条件は、細胞を培養するために当技術分野で利用可能な選択肢を認識している当業者ならば変更することができる。
一般に、「栄養因子」は、細胞の生存、成長、増殖および／もしくは成熟を促進する、または細胞の活性増大を刺激する物質として定義される。
培養脊椎動物細胞に関して、「老化」（また、複製老化または細胞老化）とは、細胞培養の限定、すなわち、それらが集団倍加の現定数（ヘイフリック限界と呼ばれる場合もある）を超えては増殖できないことに関与する特性をさす。細胞老化は最初に繊維芽細胞様細胞を用いて記載されたが、培養系で首尾よく増殖可能なほとんどの正常ヒト細胞種は細胞老化を受ける。細胞種が異なればインビトロでの寿命も異なるが、最大寿命は典型的には集団倍加１００回より少ない（これは、全ての培養細胞が老化に至る、従って分裂できない培養物となる倍加回数である）。老化は生活期間には依存せず、むしろ培養が行われた細胞分裂、または集団倍加の回数を尺度とする。従って、必須増殖因子を取り除くことにより休止した細胞は、それらの増殖因子が再導入されれば成長および分裂を再開し、その後、継続的に増殖した等価の細胞と同じ回数倍加を行うことができる。同様に、細胞を様々な集団倍加回数後に液体窒素中で凍結させ、その後、解凍および培養すれば、それらの細胞は凍結させずに培養で維持した細胞と実質的に同じ回数倍加する。老化細胞は死細胞でも死に至りつつある細胞でもなく、プログラムされた細胞死（アポトーシス）に実際に耐性があり、３年といった長期間分裂しない状態で維持された。これらの細胞はまさに生きており、代謝活性があるが、分裂しない。分裂しない状態の老化細胞は生物剤、化学剤またはウイルス剤によっても逆転できるということはまだ見出されていない。
「神経変性症状（または障害）」とは、中枢神経系または末梢神経系の急性および慢性の症状、障害または疾病を包含する包括的な用語である。神経変性症状は加齢による場合もあり、あるいは、損傷または外傷による場合もあり、あるいは特定の疾病または障害に関連する場合もある。急性神経変性症状は、限定されるものではないが、例えば、脳卒中、局部的または散在的脳外傷、散在的脳損傷、脊髄損傷、または例えば、物理的または化学的火傷、深い裂傷または四肢切断による末梢神経外傷に起因する脳血管不全を含む、神経細胞の死滅または損傷に関連する症状が含まれる。急性神経変性疾患の例としては、脳虚血または脳梗塞（塞栓性閉塞および血栓性閉塞を含む）、急性虚血後の再潅流、周産期低酸素性虚血性損傷、心停止、ならびにいずれかのタイプ（硬膜外、硬膜下、くも膜下、および大脳内など)の頭蓋内出血、および頭蓋内および脊椎内損傷（挫傷、貫通、剪断、圧迫および裂傷など）、ならびにむち打ち症および揺さぶられっ子症候群(shaken infant syndrome)が挙げられる。慢性神経変性症状としては、限定されるものではないが、アルツハイマー病、ピック病、びまん性レビー小体病、進行性核上麻痺（スチール−リチャードソン症候群(Steel-Richardson Syndrome））、多系統変性（シャイ−ドレーガー症候群(Shy-Drager Syndrome）、神経変性関連の慢性癲癇症状；筋萎縮性側索硬化症、変性性運動失調（degenerative ataxias）、皮層基底変性、グアムのＡＬＳ−パーキンソン−痴呆合併症、亜急性硬化性汎脳炎、ハンチントン病、パーキンソン病、シヌクレイン病(synucleinopathy)（多系統萎縮を含む）、原発性進行性失語症、線条体黒質変性、マチャド−ヨセフ病(Machado-Joseph disease)／脊髄小脳失調症３型およびオリーブ橋小脳変性を含む運動神経性疾患、ジル・ド・ラ・トゥレット病(Gilles De La Tourette's disease)、延髄麻痺および偽延髄麻痺、脊髄および脊髄延髄筋萎縮（ケネディ病）(Kennedy's disease)、原発性側索硬化症、家族性痙性対麻痺、ウェルドニッヒ−ホフマン病(Werdnig-Hoffmann disease)、クーゲルベルグ−ヴェランダー病(Kugelberg-Welander disease)、テイ−サックス病(Tay-Sach's disease)、サンドホフ病(Sandhoff disease)、家族性痙性病、ウォルファルト−クーゲルベルク−ヴェランダー病(Wohlfart-Kugelberg-Welander disease)、痙攣性不全対麻痺、進行性多巣性白質脳症、家族性自律神経障害（ライリー−デイ症候群(Riley-Day syndrome））、およびプリオン病（限定されるものではないが、クロイツフェルト−ヤコブ病(Creutzfeldt-Jakob)を含む）、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカ−病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、クールー(Kuru)および致死性家族性不眠症）；多発性硬化症および遺伝病（白質萎縮症など）を含む脱髄性疾患が挙げられる。
「脳卒中」とは、脳の任意の部分への血流または酸素流が妨害、低下または停止することから起こる症状をさす。「虚血性脳卒中」とは、脈管構造の何らかの収縮または閉塞によって起こる、脳の任意の部分への血液供給が妨害、低下または停止することから起こる卒中をさす。脈管構造の閉塞は一時的な場合も恒久的な場合もある。「出血性脳卒中」とは、脳の脈管構造のいずれかに何らかの破裂が起こることにより起こる卒中をさす。脳卒中を含む、または脳卒中で見られるものなどの病因または徴候を含む急性神経変性疾患の例としては、上記に挙げられており、脳虚血または脳梗塞（塞栓性閉塞および血栓性閉塞を含む）、急性虚血後の再潅流、周産期低酸素性虚血性損傷、心停止、ならびにいずれかのタイプ（硬膜外、硬膜下、くも膜下および大脳内など)の頭蓋内出血、および頭蓋内および脊椎内損傷（挫傷、貫通、剪断、圧迫および裂傷など）、ならびにむち打ち症および揺さぶられっ子症候群が含まれる。
他の神経変性症状としては、ＣＮＳおよびＰＮＳに影響を及ぼす腫瘍および他の新生物性症状が挙げられる。この基礎にある疾病が増殖性のものである（神経変性性のものではなく）と考えられるが、周囲組織は損なわれているおそれがある。さらに、細胞治療は、アポトーシス分子または他の抗新生物性分子を、例えば、このような薬剤を産生する遺伝的に改変された細胞の送達によって、腫瘍部位に送達するために利用可能である。
他の神経変性症状としては、中でも、多巣性神経障害、感覚神経障害、運動神経障害、感覚−運動神経障害、感染関連神経障害、自律神経障害、感覚−自律神経障害、脱髄神経障害（限定されるものではないが、ギラン−バレー症候群(Guillain-Barre syndrome)および慢性炎症性脱髄性多発性神経障害を含む）、他の炎症性および免疫神経障害、薬剤性神経障害、薬理学的処置により誘発される神経障害、毒物性神経障害、外傷性神経障害（限定されるものではないが、圧迫、挫傷、裂傷および分断性神経障害を含む）、代謝性神経障害、内分泌および傍新生物性神経障害が挙げられる。
他の神経変性症状としては、基礎にある病因に関わらず、加齢性痴呆ならびにアルツハイマー病関連の痴呆、血管性痴呆、びまん性白質疾患（ビンスバンガー病(Binswanger's disease)）、内分泌または代謝起源の痴呆、頭部外傷およびびまん性脳損傷の痴呆、拳闘家痴呆および前頭葉痴呆をはじめとする、記憶喪失を伴う他の痴呆および症状が挙げられる。
「神経変性症状を治療する（または神経変性症状の治療）」とは、本明細書に記載されるような神経変性疾患の作用を緩和すること、あるいは、その神経変性疾患の進行を遅延させること、停止すること、または逆転させること、あるいは、その神経変性疾患の発症を遅延させること、または予防すること、をさす。
「有効量」とは、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、本明細書に記載の化合物、材料または組成物の濃度または量をさす。このような結果としては、限定されるものではないが、神経組織の再生、修復、または改善、および／または脳卒中患者における挙動および神経機能の改善が挙げられる。このような有効活性は、例えば、脳卒中患者に本発明の細胞および／または組成物を投与することにより達成され得る。インビボにおいて患者にＰＰＤＣを投与する場合、有効量は数百以下といった少量から数百万以上といった多量までの範囲であり得る。特定の実施形態では、有効量は１０3〜１０11細胞の範囲、より具体的には、少なくとも約１０4細胞であり得る。投与される細胞の数は、限定されるものではないが、当業者に知られている他の因子の中でも、治療部分の大きさまたは総体積／表面積、ならびに治療される領域の場所に対して投与部位の近接度を含む、治療される障害の詳細によって異なると考えられる。
「有効期間（または時間）」および「有効な条件」とは、薬剤または医薬組成物が意図する結果を達成するために必要な、または好ましい期間または他の制御可能な条件（例えば、インビトロ法については温度、湿度）をさす。
「患者」または「被験体」は本明細書では互換的に用いられ、医薬または治療組成物で、または本明細書に記載の方法に従って治療される動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトをさす。
「製薬上許容される担体（または媒体）」は「生体適合性担体または媒体」と互換的に使用することができ、治療的に投与される細胞および他の薬剤と適合するだけでなく、過度な毒性、刺激、アレルギー反応または他の合併症を生じることなく、適正な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに好適で、合理的な利益／リスク比で釣り合った、試薬、細胞、化合物、材料、組成物および／または投与形をさす。本明細書においてさらに詳しく記載されるように、本発明における使用に好適な製薬上許容される担体としては、液体、半固体（例えば、ゲル）および固体材料が含まれる（例えば、細胞スキャフォールドおよびマトリックス、チューブ、シート、ならびに当技術分野で公知であり、かつ、本明細書でさらに詳しく記載される他の材料）。これらの半固体および固体材料は体内で分解耐性を示す（非生分解性）ように設計することもできるし、あるいは体内で分解する（生分解性または生物浸食性）ように設計することもできる。生分解性材料は生体吸収性(bioresorbableまたはbioabsorbable)であってもよく、すなわち、生分解性材料は体液に溶解および吸収可能であるか（一例として、水溶性インプラントがある）、または他の材料への変換または天然経路による分解および排除により、分解され、最終的には体内から排除され得る。
本明細書では、細胞移植または組織移植に関する用語もいくつか使用されている。「自己移入（autologous transfer）」、「自己移植（autologous transplantation）」、および「自己移植片（autograft）」などは、移植ドナーが移植レシピエントでもある場合の移植をさす。「同種異系移入」、「同種異系移植」、および「同種異系移植片（allograft）」などは、移植ドナーが移植レシピエントと同種であるが、同じ個体ではない場合の移植をさす。ドナーの細胞がレシピエントと一致した組織適合性を有していた細胞移植を同系移入と呼ぶ場合がある。「異種移入」、「異種移植」および「異種移植片」などは、移植ドナーが移植レシピエントとは異なる種である場合の移植をさす。
説明：
多様な原因を持つ急性、慢性および進行性障害および疾患を包含する神経変性症状は、神経細胞の特定群または易損群の機能不全または損失を共通の特徴として有する。この共通性から、易損神経組織または損傷神経組織の修復および再生のための、類似の治療アプローチの開発が可能となり、その１つが細胞に基づく療法である。本明細書に記載のその様々な実施形態において、本発明は、産褥組織に由来する前駆細胞および細胞集団を利用する神経修復および再生のための方法および医薬組成物を特徴とする。本発明はいずれの神経変性症状にも適用可能であるが、脳卒中の治療に特に好適であると思われる。
上記で概略を示したように、本発明は、その一態様において、一般に、実質的に血液を含まないようにした胎盤組織または臍帯組織に由来する、単離された産褥由来細胞（ＰＰＤＣ）に向けられる。これらのＰＰＤＣは自己再生および拡大培養が可能であり、かつ、神経表現型の細胞へと分化する能力を有する。ある実施形態は、当該細胞を含む集団、当該細胞またはその成分もしくは産物を含む医薬組成物、および脳卒中患者を治療するために当該医薬組成物を使用する方法を特徴とする。これらの産褥由来細胞は、培養増殖特性、細胞表面マーカー、遺伝子発現、ある種の生化学的栄養因子を産生する能力、および免疫特性を特徴とする。
ＰＰＤＣの調製
本明細書に記載の方法によれば、哺乳類胎盤および臍帯は、満期妊娠または早産妊娠の終了時または終了後短時間のうちに、例えば、誕生後の娩出の後に回収する。産褥組織は、フラスコ、ビーカー、培養皿またはバッグなどの無菌容器にて、分娩室から研究室に移送することができる。この容器には、限定されるものではないが、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ダルベッコの最少必須培地としても知られる）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの塩溶液、またはウイスコンシン大学溶液またはペルフルオロ化学溶液などの、移植に用いる器官の輸送に用いる溶液をはじめとする、溶液または媒体を入れればよい。限定されるものではないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびナイスタチンなどの１種類以上の抗生剤および／または抗真菌剤を培地またはバッファーに添加してもよい。この産褥組織をヘパリン含有溶液などの抗凝固溶液ですすげばよい。この組織はＰＰＤＣの抽出まで約４〜１０℃で維持するのが好ましい。この組織はＰＰＤＣの抽出まで冷凍しないことがさらにより好ましい。
ＰＰＤＣの単離は好ましくは、無菌環境で行う。臍帯は、当技術分野で公知の手段により胎盤から分離することができる。あるいは、臍帯と胎盤を分離せずに用いる。ＰＰＤＣの単離前に産褥組織から血液および残渣を除去することが好ましい。例えば、産褥組織は、限定されるものではないが、リン酸緩衝生理食塩水などのバッファー溶液で洗浄してもよい。洗浄バッファーはまた、１種類以上の抗真菌剤および／または限定されるものではないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびナイスタチンなどの抗生剤を含んでもよい。
全胎盤またはその断片もしくは切片を含む産褥組織は、機械力（細断力または剪断力）によって解離させる。現在のところ好ましい実施形態では、この単離手順は酵素消化法も利用する。多くの酵素が、培養増殖を促進するため、複雑な組織マトリックスから個々の細胞を単離するのに有用であることが当技術分野で知られている。消化力の弱いもの（例えば、デオキシリボヌクレアーゼおよび天然プロテアーゼであるディスパーゼ）から消化力の強いもの（例えば、パパインおよびトリプシン）まで、このような酵素は市販されている。これと適合する酵素を非網羅的に挙げると、粘液溶解酵素活性、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、またはエラスターゼなど）、およびデオキシリボヌクレアーゼがある。現在のところ、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼおよび粘液溶解活性から選択される酵素活性が好ましい。例えば、コラゲナーゼは組織から様々な細胞を単離するのに有用であることが知られている。デオキシリボヌクレアーゼは一本鎖ＤＮＡを消化することができ、単離中の細胞の凝集を最小限とすることができる。好ましい方法は、例えば、コラゲナーゼとディスパーゼ、またはコラゲナーゼとディスパーゼとヒアルロニダーゼによる酵素処理を含み、このような方法が提供され、特定の好ましい実施形態では、コラゲナーゼと中性プロテアーゼであるディスパーゼの混合物が解離工程に使用される。ヒストリチクス菌(Clostridium histolyticum)由来の少なくとも１種のコラゲナーゼと、プロテアーゼ活性、ディスパーゼおよびサーモライシンのいずれかとの存在下での消化を用いる方法がより好ましい。コラゲナーゼ酵素活性とディスパーゼ酵素活性による消化を用いる方法がさらにより好ましい。また、コラゲナーゼ活性とディスパーゼ活性に加えてヒアルロニダーゼ活性による消化を含む方法も好ましい。当業者ならば、当技術分野において、様々な組織源から細胞を単離するための、このような多くの酵素処理が公知であることが分かるであろう。例えば、リベラーゼブレンドザイム(LIBERASE Blendzyme)(Roche)系の酵素の組合せが、本方法における使用に好適である。他の酵素源も公知であり、当業者ならば、このような酵素をそれらの天然源から直接採取することもできる。また、当業者ならば、新たな、または付加的な酵素もしくは酵素の組合せを、本発明の細胞を単離する上での有用性に関して評価する能力を備えている。好ましい酵素処理は０．５、１、１．５、または２時間またはそれを超える。他の好ましい実施形態において、解離工程の酵素処理中、３７℃で組織をインキュベートする。
本発明のいくつかの実施形態では、産褥組織は、例えば、胎盤の新生児相、新生児／母体相、および母胎相などの組織の様々な相を含む切片に分離する。その後、分離された切片を、本明細書に記載の方法に従い、機械的解離および／または酵素的解離により解離する。新生児系統または母体系統の細胞は、例えば、Ｙ染色体に関する核型分析またはin situハイブリダイゼーションによるなど、当技術分野で公知のいずれかの手段により同定することができる。
それからＰＰＤＣが増殖する単離細胞または産褥組織を用い、細胞培養物を誘導または播種することができる。単離細胞を、コートされていない、または細胞外マトリックス、またはラミニン、コラーゲン（天然、変性または架橋）、ゼラチン、フィブロネクチン、および他の細胞外マトリックスタンパク質などのリガンドでコートされた無菌組織培養容器に移す。ＰＰＤＣは、限定されるものではないが、ＤＭＥＭ（高グルコースまたは低グルコース）、改良ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ ２０１、イーグルの基本培地、ハムのＦ１０培地（Ｆ１０）、ハムのＦ−１２培地（Ｆ１２）、イスコーブの改変ダルベッコ培地、間葉幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ １６４０、およびＣＥＬＬ−ＧＲＯ−ＦＲＥＥなどの細胞の増殖を維持し得るいずれかの培養培地で培養する。この培養培地には、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）；ウマ血清（ＥＳ）；ヒト血清（ＨＳ）；β−メルカプトエタノール（ＢＭＥまたは２−ＭＥ）、好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）；１種類以上の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、白血球阻害因子（ＬＩＦ）およびエリスロポエチン；Ｌ−バリンを含むアミノ酸；および例えば、単独または組み合わせたペニシリンＧ、ストレプトマイシン硫酸塩、アムホテリシンＢ、ゲンタマイシンおよびナイスタチンなど、微生物汚染を抑制する１種類以上の抗生剤および／または抗真菌剤を含む、１種類以上の成分を添加してもよい。培養培地は以下の実施例で定義される増殖培地を含むのが好ましい。
これらの細胞を培養容器に、細胞増殖が可能な密度で播種する。好ましい実施形態では、これらの細胞を空気中ＣＯ2体積約０〜約５％で培養する。いくつかの好ましい実施形態では、細胞は、空気中約２〜約２５％のＯ2、好ましくは、空気中約５〜約２０％のＯ2下で培養する。細胞は好ましくは約２５〜約４０℃で培養し、より好ましくは３７℃で培養する。細胞は好ましくはインキュベーター内で培養する。培養容器中の培地は静置しても、例えばバイオリアクターを用いて振盪してもよい。ＰＰＤＣは好ましくは、低酸化ストレス下（例えば、グルタチオン、ビタミンＣ、カタラーゼ、ビタミンＥ、Ｎ−アセチルシステインの添加）で増殖される。本明細書において「低酸化ストレス」とは、培養細胞に対するフリーラジカル傷害が全くないか、または最小限である条件をさす。
最も適当な培養培地、培地調製および細胞培養技術の選択方法は当技術分野で周知であり、参照して本明細書に組み入れる、Doyleら(編), 1995, CELL & TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley & Sons, Chichester;およびHo and Wang (編), 1991, ANIMAL CELL BIOREACTORS, Butterworth-Heinemann, Bostonをはじめとする様々な出典に記載されている。
単離細胞または組織断片を十分な期間培養した後、産褥組織からの移動または細胞分裂、またはその双方の結果としてＰＰＤＣが増殖する。本発明のいくつかの実施形態では、ＰＰＤＣを継代培養、すなわち、細胞集団が有糸分裂により拡大培養できる、最初に使用されたものと同じまたは異なるタイプの新鮮培地を含有する個々の培養容器に取り出す。本発明の細胞は継代培養０代目〜老化までのいずれの時点で用いてもよい。これらの細胞は好ましくは、約３回〜約２５回の間継代培養され、より好ましくは、約４回〜約１２回継代培養され、好ましくは、１０回または１１回継代培養される。細胞のクローン集団が単離されたことを確認するために、クローニングおよび／またはサブクローニングを行うことができる。
本発明のいくつかの実施形態では、産褥組織に存在する種々の細胞種を部分集団に分画し、それからＰＰＤＣを単離することができる。これは、限定されるものではないが、産褥組織を解離してその成分を得るための酵素処理、その後のクローニングと、例えば、限定されるものではないが、形態学的マーカーおよび／または生化学マーカーに基づく選択；所望の細胞の選択的増殖（正の選択）、望ましくない細胞の選択的破壊（負の選択）；例えば、ダイズのアグルチニンによる、混合集団における示差的細胞凝集力に基づく分離；凍結−解凍法；混合集団における細胞の示差的接着性；濾過；通常の遠心分離およびゾーン遠心分離；遠心分離傾瀉（対流遠心分離）；単位重力分離；向流分布；電気泳動；および蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）をはじめとする、特定の細胞種の選択を含む、細胞分離の標準的技術を用いて達成することができる。クローン選択および細胞分離技術の総説としては、参照して本明細書に組み入れるFreshney, 1994, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, 3rd Ed., Wiley- Liss, Inc, New Yorkを参照。
培養培地は、必要に応じ、例えば、ピペットを用いてディッシュから培地を注意深く吸引し、新鮮培地を補充することにより変更される。インキュベーションは、ディッシュに十分な数または密度の細胞が蓄積するまで続ける。元の外植組織片は除去し、残りの細胞を標準的な技術を用いてトリプシン処理するか、またはセルスクレーパーもしくはキレート剤含有溶液などの細胞剥離の非酵素的手段を用いるか、または容易な解離を可能とするポリマーをコートした細胞培養皿を用いる。トリプシン処理後、細胞を回収し、新鮮培地へ移し、前記のようにインキュベートする。いくつかの実施形態では、培地は、浮遊細胞を除去するため、トリプシン処理から約２４時間後に少なくとも一度交換する。残った培養細胞をＰＰＤＣであると考えられる。
ＰＰＤＣは低温保存可能である。よって、以下にさらに詳しく記載される好ましい実施形態では、自己移入用のＰＰＤＣ（母または子のいずれか）は、子供の誕生後に適当な産褥組織から誘導することができ、その後、移植が必要になった場合に利用できるように低温保存することができる。
ＰＰＤＣの特徴
ＰＰＤＣは、例えば、増殖の特徴（例えば、集団倍加力、倍加時間、老化までの継代培養回数）、核型分析（例えば、正常な核型；母体系統または新生児系統）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）、免疫組織化学および／または免疫細胞化学（例えば、エピトープの検出のためのもの）、遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ；ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、および従来のＰＣＲ））、タンパク質アレイ、タンパク質分泌（例えば、血漿凝固アッセイまたはＰＤＣ細胞馴化培地の分析によるもの、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によるもの）、混合リンパ球反応（例えば、ＰＢＭＣの刺激の測定）、および／または当技術分野で公知の他の方法により特性決定することができる。
胎盤組織由来のＰＰＤＣの例は、the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)に寄託され、次のようにＡＴＣＣ受託番号が割り当てられている：（１）株名ＰＬＡ０７１００３（Ｐ８）は２００４年６月１５日に寄託され、受託番号ＰＴＡ−６０７４が割り当てられ；（２）株名ＰＬＡ０７１００３（Ｐ１１）は２００４年６月１５日に寄託され、受託番号ＰＴＡ−６０７５が割り当てられ；また（３）株名ＰＬＡ０７１００３（Ｐ１６）は２００４年６月１６日に寄託され、受託番号ＰＴＡ−６０７９が割り当てられている。臍組織由来のＰＰＤＣの例は２００４年６月１０日にthe American Type Culture Collectionに寄託され、次のようにＡＴＣＣ受託番号が割り当てられている：（１）株名ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ７）は受託番号ＰＴＡ−６０６７が割り当てられ；また（２）株名ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ１７）は受託番号ＰＴＡ−６０６８が割り当てられている。
種々の実施形態では、ＰＰＤＣは、次の増殖の特徴のうち１以上を有する：（１）培養増殖にＬ−バリンを必要とする；（２）約５％〜少なくとも約２０％の酸素を含有する雰囲気下で増殖することができる；（３）老化に達するまで少なくとも約４０回倍加する能力を有する；および（４）コートまたは非コート組織培養容器上で接着および拡大培養する（このコート組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチンまたはフィブロネクチンのコーティングを含む。
特定の実施形態では、ＰＰＤＣは正常な核型を有し、細胞の継代培養の際に維持される。核型分析は、胎盤由来の母体細胞から新生児細胞を同定および識別するのに特に有用である。核型分析法は当業者に利用可能であり、公知である。
他の実施形態では、ＰＰＤＣは、（１）組織因子、ビメンチン、およびα−平滑筋アクチンのうち少なくとも１つの産生；および（２）フローサイトメトリーにより検出されるＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ細胞表面マーカーのうち少なくとも１つの産生、を含む特定のタンパク質の産生によって同定することができる。他の実施形態では、ＰＰＤＣは、フローサイトメトリーにより検出されるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ細胞表面マーカーの少なくとも１つの産生の欠如により同定することができる。組織因子、ビメンチン、およびα−平滑筋アクチンのうち少なくとも２つを産生する細胞が特に好ましい。タンパク質組織因子、ビメンチン、およびα−平滑筋アクチンのうち３つ全てを産生する細胞がより好ましい。
他の実施形態では、ＰＰＤＣは、繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、インターロイキン８；レチクロン(reticulon)１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫(melonoma)増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３；Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバー２；ウィルムス腫瘍１；アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２；レニン；酸化低密度リポタンパク質受容体１；ヒト(Homo sapiens)クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１；プロテインキナーゼＣζ；機能未知タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３；卵巣癌１においてダウンレギュレーション；およびクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３由来のヒト(Homo sapiens)遺伝子のうち少なくとも１つをコードする遺伝子が増大されている遺伝子発現により同定することができる。
さらに他の実施形態では、ＰＰＤＣは、繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、低身長ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上部狭窄症、ウィリアムス−ビューレン症候群）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２）；間充織ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）；sine oculisホメオボックスホモログ１（ショウジョウバエ(Drosophila)）；クリスタリン(crystallin)αＢ；形態形成のdisheveled関連アクチベーター２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン(neuralin)１に類似；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；src homology three（ＳＨ３）およびシステイン豊富ドメイン；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；runt関連転写因子３；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；frizzledホモログ７（ショウジョウバエ(Drosophila)）；機能未知遺伝子ＢＣ００８９６７；ＶＩＩＩ型コラーゲンα１；テネイシンＣ(hexabrachion)；iroquoisホメオボックスタンパク質５；hephaestin；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ；ヒト(Homo sapiens)ｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム依存性チャネルサブファミリーＮメンバー４；インテグリンβ７；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；sine oculisホメオボックスホモログ２（ショウジョウバエ(Drosophila)）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；小胞関連膜タンパク質５(myobrevin)；ＥＧＦ含有fibulin様細胞外マトリックスタンパク質１；初期成長応答３；distal-lessホメオボックス５；機能未知タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ）；ビグリカン；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリンβ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（atrionatriureticペプチド受容体Ｃ）；機能未知タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）のうち少なくとも１つをコードする遺伝子が低減されている遺伝子発現により同定することができる。
他の実施形態では、ＰＰＤＣは、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１α、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＩＭＰ１のうち少なくとも１つの分泌により同定することができる。別の実施形態では、ＰＰＤＣは、ＥＬＩＳＡにより検出されるＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１β、Ｉ３０９、ＭＤＣ、およびＶＥＧＦのうち少なくとも１つの分泌の欠如により同定することができる。
好ましい実施形態では、該細胞は前記の増殖、タンパク質／表面マーカーの産生，遺伝子発現または物質分泌の特徴のうち２以上を含む。これらの特徴のうち３つ、４つ、または５つ、またはそれを超える特徴を含む細胞がより好ましい。これらの特徴のうち、６つ、７つまたは８つ、またはそれを超える特徴を含むＰＰＤＣがさらにより好ましい。現在のところ、前記特徴の全てを含む細胞がさらにより好ましい。
いくつかの態様において本発明のとともに使用するのに現在のところ好ましい細胞としては、前記の特徴を有する産褥細胞があり、より詳しくは、その細胞が正常な核型を有し、継代培養で正常な核型を維持する場合、さらに、その細胞がＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの各マーカーを発現する（これらの細胞は挙げられているマーカーに相当する、免疫学的に検出可能なタンパク質を産生する）場合がある。前記のものに加え、フローサイトメトリーにより検出されるマーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれに相当するタンパク質も産生しない細胞がさらにより好ましい。
種々の表現型をもたらす系統を分化する能力を有するある種の細胞は安定でないため、自発的に分化することができる。例えば神経系統を自発的に分化しない細胞が、現在のところ本発明とともに使用するのに好ましい。好ましい細胞は、増殖培地で増殖させた際に、それらの表面で産生されるマーカーに関して、また、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰを用いて測定される種々の遺伝子の発現パターンに関して実質的に安定である。これらの細胞は、例えば、継代培養中に何回も集団倍加しても、それらの表面マーカーの特徴を実質的に一定に保持している。
しかしながら、ＰＰＤＣの１つの特徴は、分化を誘導する細胞培養条件に置くことにより神経系表現型へと分化するように人為的に誘導することができるということである。これは、当技術分野で公知の１以上の方法によって行うことができる。例えば、本明細書で例示されているように、ＰＰＤＣは、ラミニンコートしたフラスコの、Ｂ２７（Ｂ２７サプリメント，Invitrogen）、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)（この組合せは本明細書では神経前駆体拡大(Neural Progenitor Expansion)（ＮＰＥ）培地と呼ぶ）中に置けばよい。ＮＰＥ培地にはｂＦＧＦおよび／またはＥＧＦをさらに添加してもよい。あるいは、ＰＰＤＣは、（１）ＰＰＤＣを神経前駆細胞、または星状細胞と共存培養することによるか、または（２）神経前駆細胞の細胞馴化培地中でＰＰＤＣを増殖させることにより、インビトロで分化誘導することもできる。
ＰＰＤＣの分化は、突起を延長して双極性細胞の形態により証明することができる。これらの誘導済みの細胞集団は、ネスチンの存在に関して陽性染色することができる。分化したＰＰＤＣはネスチン、ＴｕＪ１（βＩＩＩチューブリン）、ＧＦＡＰ、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＡＢＡ、Ｏ４および／またはＭＢＰの検出により評価することができる。いくつかの実施形態では、ＰＰＤＣは、ニューロスフェアの神経幹細胞形成に特徴的な三次元体を形成する能力を示した。
ＰＰＤＣ集団、改変、成分および産物
本発明の別の態様は、前記ＰＰＤＣの集団を特徴とする。いくつかの実施形態では、細胞集団は不均質である。本発明の不均質な細胞集団は、本発明の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のＰＰＤＣを含み得る。本発明の不均質な細胞集団は、幹細胞、または神経前駆細胞などの他の前駆細胞をさらに含み得るし、あるいは完全に分化した神経細胞もさらに含み得る。いくつかの実施形態では、この集団は実質的に均質であり、すなわち、実質的にＰＰＤＣのみ（好ましくは、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えるＰＰＤＣ）を含む。本発明の均質な細胞集団は臍由来細胞または胎盤由来細胞を含み得る。臍由来細胞の均質な集団は好ましくは母体系の細胞を含まない。胎盤由来細胞の均質な集団は、新生児系または母体系のものであり得る。細胞集団の均質性は、例えば、細胞選別（例えば、フローサイトメトリー）によるか、または公知の方法に従ったクローン拡大によるなど、当業者に公知のいずれかの方法により達成することができる。よって、好ましい均質ＰＰＤＣ集団は、産褥由来細胞のクローン細胞系統を含み得る。このような集団は、極めて望ましい機能性を有する細胞クローンが単離された場合に特に有用である。
また、１以上の因子の存在下で、または神経形成経路に沿って幹細胞分化を刺激する条件下でインキュベートされた細胞の集団も提供される。このような因子は当技術分野で公知であり、当業者ならば、分化に好適な条件の決定は慣例の実験を用いて行い得ることが分かるであろう。このような条件の至適化は、統計学的実験計画および分析によって行うことができ、例えば、応答表面の方法論によれば、例えば生体培養において複数の変数を同時に至適化することができる。現在のところ好ましい因子としては、限定されるものではないが、増殖因子または栄養因子などの因子、脱メチル化剤、神経系統細胞との共存培養または神経系統細胞の細胞馴化培地中での培養、ならびに神経形成経路または系統に沿って幹細胞分化を刺激するための当技術分野で公知の他の条件（例えば、Lang, KJDら, 2004, J. Neurosci. Res. 76:184-192; Johe, KKら, (1996) Genes Devel. 10:3129-3140; Gottleib, D., (2002) Ann. Rev. Neurosci. 25:381-407参照）が挙げられる。
ＰＰＤＣはまた、例えば、神経治療上有用な遺伝子産物を産生するように、または腫瘍治療用の抗新生物剤を産生するように遺伝的に改変することもできる。遺伝的改変は、限定されるものではないが、組み込み型ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクター；非組み込み型複製ベクター、例えば、パピローマウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、アデノウイルスベクター；または複製欠陥ウイルスベクターを含む様々なベクターのいずれかを用いて行うことができる。ＤＮＡを細胞へ導入する他の方法としては、リポソーム、エレクトロポレーション、パーティクルガン、または直接的ＤＮＡ注入の使用を含む。
細胞は好ましくは、中でもプロモーターまたはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位などの１以上の適当な発現制御エレメントおよび選択マーカーにより制御された、またはそれらのものと作動可能なように連結されたＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトされる。いずれのプロモーターを用いて、挿入された遺伝子の発現を駆動してもよい。例えば、ウイルスプロモーターとしては、限定されるものではないが、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０、パピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルスまたはエラスチン遺伝子プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子の発現を制御するのに用いる制御エレメントにより、インビボで必要な場合にのみ、その産物が合成されるように遺伝子発現の調節を可能とする。一時的発現が望ましい場合、非組み込み型および／または複製欠陥ベクターにおいて構成プロモーターを使用するのが好ましい。あるいは、誘導プロモーターを用いて、必要時に挿入遺伝子の発現を駆動することもできる。誘導プロモーターとしては、限定されるものではないが、メタロチオネインおよび熱ショックタンパク質関連のものが挙げられる。
外来ＤＮＡを導入した後、操作された細胞を富化培地で増殖させ、その後、選択培地に切り替えることができる。外来ＤＮＡにおける選択マーカーは選択耐性を付与し、細胞の、例えばプラスミド上、それらの染色体中に外来ＤＮＡを組み込まれ、細胞叢が形成するまで拡大培養し、これを次にクローン化し、増殖させて細胞系統とすることができる。この方法は、遺伝子産物を発現する細胞系統を操作するために有利に使用することができる。
本発明の細胞は、移植部位で炎症または拒絶反応を促進する因子の発現を「ノックアウト」または「ノックダウン」するように遺伝的に操作することができる。標的遺伝子発現レベルまたは標的遺伝子産物活性レベルを低下させる負の調節技術を以下に述べる。本明細書において「負の調節」とは、調節処理の不在下での標的遺伝子産物のレベルおよび／または活性に比べて、標的遺伝子産物のレベルおよび／または活性が低下していることをさす。ニューロンまたはグリア細胞に本来備わっている遺伝子発現は、例えば、相同組換え技術を用いて遺伝子を不活性化することによる発現阻害をはじめ、いくつかの技術を用いて低減またはノックアウトすることができる。典型的には、そのタンパク質の重要な領域をコードするエキソン（すなわち、その領域に対して５’側のエキソン）に、陽性選択マーカー、例えばｎｅｏを挿入し、標的遺伝子からの正常なｍＲＮＡの生成を妨げ、その結果、その遺伝子は不活性化させる。また、遺伝子は、遺伝子の一部欠失を作出することにより、または全遺伝子を欠失させることにより不活性化することもできる。ゲノム中距離が離れた、標的遺伝子に対して相同な２つの領域を有する構築物を用いることで、この２領域間の配列を欠失させることができる(Mombaertsら, 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88:3084-3087)。また、アンチセンス、ＤＮＡザイム、リボザイム、small interfering RNA（ｓｉＲＮＡ）および標的遺伝子の発現を阻害する他のこのような分子を使用して、標的遺伝子活性のレベルを低減させることもできる。例えば、主要組織適合性遺伝子複合体（ＨＬＡ）の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡ分子は、免疫応答に関して最も融通が利くことが示されている。さらに、標的遺伝子活性のレベルを低減する際に三重らせん分子を使用することもできる。これらの技術は、L.G. Davisら(編), 1994, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 2nd ed., Appleton & Lange, Norwalk, CNが詳細に記載している。
他の態様では、本発明は、ＰＰＤＣから調製された細胞誘導体および細胞溶解画分、ＰＰＤＣを含む不均質細胞集団または均質細胞集団、ならびに遺伝的に改変された、または神経形成経路に沿って分化するように刺激されたＰＰＤＣまたはその集団を提供する。細胞溶解物またはその画分などの細胞誘導体は多くの用途を持つ。例えば、ＰＰＤＣ溶解物溶解画分（すなわち、実質的に膜を含まない）をインビボで使用すると、拒絶反応、または他の有害な免疫応答を誘発する可能性が最も高い、かなりの量の細胞表面タンパク質を導入することなく、患者において同種異系的に使用される有益な細胞内環境が可能となる。細胞を溶解する方法は当技術分野で周知であり、機械的破砕、酵素的破砕、熱または化学的破砕、またはその組合せの種々の手段が挙げられる。このような細胞溶解物は、増殖培地において直接細胞から、従って、分泌された増殖因子などを含有した状態で調製することもできるし、あるいは例えばＰＢＳまたは他の溶液を含まない洗浄細胞から調製することもできる。洗浄細胞は、好ましい場合には、元の集団密度よりも高い濃度で再懸濁させてもよい。
一実施形態では、例えば、細胞を破砕した後に細胞画分の分離を行わずに、全細胞溶解物を調製する。もう１つの実施形態では、当技術分野で公知の常法、例えば、遠心分離、濾過または類似の方法により、細胞膜画分を可溶性の細胞画分から分離する。
産褥由来細胞集団から調製された細胞溶解物または細胞可溶性画分はそのまま使用してもよいし、例えば限外濾過もしくは凍結乾燥、または一様乾燥によりさらに濃縮してもよいし、部分精製してもよいし、当技術分野で公知の製薬上許容される担体または希釈剤と組み合わせてもよいし、あるいは例えば製薬上有用なタンパク質組成物などの生物製品のような他の化合物と組み合わせてもよい。細胞溶解物またはその画分はインビトロまたはインビボで、単独、または例えば自己のまたは同系の生細胞とともに使用することができる。これらの細胞溶解物は、インビボ導入する場合、治療部位に局所導入してもよいし、あるいは例えば、患者に必要な細胞増殖因子を提供するよう遠位に導入してもよい。
さらなる実施形態では、ＰＰＤＣは生体産物を高収量で生産するためにインビトロで培養することができる。例えば、目的の特定の生体産物（例えば、栄養因子）を本来産生するか、または生体産物を産生するように遺伝的に操作されたこのような細胞を、本明細書に記載の培養技術を用い、クローン拡大させることができる。あるいは、神経系統への分化を誘導する培地で細胞を拡大培養することもできる。いずれの場合でも、当該細胞によって産生され、培地中に分泌された生体産物は、標準的な分離技術、例えば、いくつか挙げれば、示差的タンパク質沈降法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動およびＨＰＬＣなどを用い、細胞馴化培地から容易に単離することができる。例えば、インビトロ三次元培養物を養うための流動法を利用するために「バイオリアクター」を使用することができる。基本的に、新鮮な培地が三次元培養物を通過する度に生体産物が培養物から洗い出され、流出物から前記のように単離することができる。
あるいは、目的の生体産物は細胞内に留まっている場合もあり、その場合は、その回収に前記のように細胞を溶解させることが必要となる。その後、生体産物を、前記に挙げた技術のいずれか１以上を用いて精製することができる。
他の実施形態では、本発明は、以下に記載するようなインビトロおよびインビボ使用のための、培養ＰＰＤＣ由来の細胞馴化培地を提供する。ＰＰＤＣ細胞馴化培地の使用により、ＰＰＤＣにより分泌された有益な栄養因子が、拒絶反応または他の有害な免疫応答を誘発し得る完全な細胞を導入することなく、患者において同種異系的に使用可能となる。細胞馴化培地は、培養培地で細胞を培養した後、培地から細胞を除去することにより調製される。
産褥由来細胞集団から調製された細胞馴化培地はそのまま使用してもよいし、例えば限外濾過もしくは凍結乾燥、または一様乾燥によりさらに濃縮してもよいし、部分精製してもよいし、当技術分野で公知の製薬上許容される担体または希釈剤と組み合わせてもよいし、あるいは例えば製薬上有用なタンパク質組成物などの生物製品のような他の化合物と組み合わせてもよい。細胞馴化培地はインビトロまたはインビボで、単独、または例えば自己のまたは同系の生細胞とともに使用することができる。細胞馴化培地は、インビボ導入する場合、治療部位に局所導入してもよいし、あるいは例えば、患者に必要な細胞増殖因子または栄養因子を提供するよう遠位に導入してもよい。
別の実施形態では、液体、固体または半固体支持体上でＰＰＤＣを培養することにより形成される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を作製し、回収し、組織修復または置換を必要とする被験体に生細胞を移植する代わりに利用する。ＰＰＤＣをインビトロにおいて、本明細書の他所で記載される三次元フレームワーク上、所望の量のＥＣＭがそのフレームワークに分泌されるような条件下で培養する。これは、新しい組織を取り出し、ＥＣＭをさらなる使用のために、例えば、注射用製剤として処理することを含む。これを達成するため、フレームワーク上の細胞を死滅させ、そのフレームワークから細胞残渣を取り出す。このプロセスはいくつかの異なる方法で行うことができる。例えば、生組織を、低温保存剤を用いずに液体窒素中で急速凍結させることもできるし、あるいは組織を無菌蒸留水中に浸漬し、細胞を浸透圧に応じてバーストさせることもできる。
細胞は一度死滅すると、細胞膜が破れ、細胞残渣は、ＥＤＴＡ、ＣＨＡＰＳまたは両性イオン性界面活性剤などの穏和な界面活性剤ですすいで処理することにより除去される。あるいは、組織を酵素消化し、かつ／または、細胞膜を分解し、細胞内容物の除去を可能とする試薬で抽出することができる。このような酵素の例としては、限定されるものではないが、ヒアルロニダーゼ、ディスパーゼ、プロテアーゼ、およびヌクレアーゼが挙げられる。界面活性剤の例としては、例えば、アルキルアリールポリエーテルアルコール（トリトン Ｘ−１００）、オクチルフェノキシポリエトキシ−エタノール(Rohm and Haas Philadelphia, PA)、ＢＲＩＪ−３５、ポリエトキシエタノールラウリルエーテル(Atlas Chemical Co., San Diego, CA)、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ ２０）、ポリエトキシエタノールソルビタンモノラウレート(Rohm and Haas)、ポリエチレンラウリルエーテル(Rohm and Haas)などの非イオン性界面活性剤；ならびに例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、硫酸化高級脂肪族アルコール、分枝鎖または非分枝鎖で７〜２２個の炭素原子を含有するスルホン化アルカンおよびスルホン化アルキルアレンなどのイオン性界面活性剤が挙げられる。
ＥＣＭの回収は、例えば、生分解性または非生分解性の三次元フレームワークで新たな組織が形成されたかどうかによって、様々な方法で行うことができる。例えば、フレームワークが非生分解性である場合、ＥＣＭは、このフレームワークに対して音波処理、高圧水ジェット、機械的掻き取り、または界面活性剤もしくは酵素による穏和な処理、または前記の任意の組合せを行うことによって取り出すことができる。
フレームワークが生分解性である場合、ＥＣＭは、例えば、フレームワークを溶液中で分解させるか、または溶解させることにより回収することができる。あるいは、生分解性フレームワークが、それ自体ＥＣＭとともに注射可能な材料からなっている場合、このフレームワークとＥＣＭは、その後の注射用にまとめて処理することができる。あるいは、ＥＣＭは、非生分解性フレームワークからＥＣＭを回収するための前記方法のいずれかにより生分解性フレームワークから取り出すことができる。全ての回収プロセスは、ＥＣＭが変性しないように設計するのが好ましい。非生分解性フレームワークはこれらの細胞とともに移植することができる。
回収された後、ＥＣＭはさらなる処理を施すことができる。例えば、音波処理によるなど当技術分野で周知の技術を用い、ＥＣＭをホモジナイズして微粒子とすることができ、従って外科用針を通り抜けることができる。このＥＣＭの成分は、所望によりγ線照射により架橋することができる。好ましくは、ＥＣＭを滅菌および架橋するためには、ＥＣＭを０．２５〜２メガラドの間で照射することができる。グルタルアルデヒドなどの有毒な薬剤を用いた化学架橋も可能であるが、一般に好ましくない。
ＥＣＭ中に存在する様々な種のコラーゲンなどのタンパク質の量および／または比率は、本発明の細胞によって産生されたＥＣＭと、１以上の他の細胞種のＥＣＭとを混合することにより調整することができる。また、タンパク質、増殖因子および／または薬剤などの生物学的に活性な物質をＥＣＭに配合することができる。生物学的に活性な物質の例としては、注射部位において神経の生存および保護を促進するＢＤＮＦが挙げられる。このような付加的薬剤は、本明細書の前記のいずれの実施形態においても、例えば、全細胞溶解物、可溶性細胞画分、またはさらなる精製成分およびＰＰＤＣにより産生された産物とともに使用可能である。
ＰＰＤＣ、ＰＰＤＣ誘導体成分または産物を含む医薬組成物
別の態様では、本発明は、脳卒中を治療するための種々の方法においてＰＰＤＣ、ＰＰＤＣ集団、ＰＰＤＣの成分および産物を用いる医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態は、生細胞（ＰＰＤＣ単独または他の細胞種と混合したもの）を含む医薬組成物を包含する。他の実施形態は、ＰＰＤＣ細胞成分（例えば、細胞溶解物、可溶性細胞画分、細胞馴化培地、ＥＣＭ、または前記のいずれかの成分）または産物（例えば、ＰＰＤＣにより本来産生される、または遺伝的改変から産生された栄養因子または他の生物因子、ＰＰＤＣ培養物由来の細胞馴化培地）を含む医薬組成物を包含する。いずれの場合でも、当該医薬組成物は、当技術分野で公知の抗炎症薬、抗アポトーシス薬、抗酸化薬、増殖因子、神経栄養因子、前脈管形成因子、または神経産生薬もしくは神経保護薬などの他の活性剤をさらに含んでもよい。
ＰＰＤＣ医薬組成物に添加可能な他の成分の例としては、限定されるものではないが、いくつか挙げると、（１）他の神経保護薬または神経受益薬；（２）当技術分野で公知の１以上のコラーゲン種、および／または増殖因子、血小板豊富血漿、および薬剤などの選択された細胞外マトリックス成分（あるいは、ＰＰＤＣは、増殖因子を発現および産生するよう遺伝的に操作することもできる）；（３）抗アポトーシス薬（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯミメチボディ(mimetibody）、トロンボポエチン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞増殖因子、カスパーゼ阻害剤）；（４）抗炎症化合物（例えば、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害剤、ペミロラスト(PEMIROLAST)、トラニラスト(TRANILAST)、レミケード(REMICADE)、シロリムス(SIROLIMUS)、および非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（テポキサリン(TEPOXALIN)、トルメチン(TOLMETIN)、およびスプロフェン(SUPROFEN)など）；（５）免疫抑制剤または免疫調節薬、例えば、カルシニュリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗増殖薬、コルチコステロイド、および種々の抗体；（６）抗酸化薬、例えば、プロブコール、ビタミンＣおよびＥ、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システインおよびＮ−アセチルシステイン；（６）局所麻酔薬；ならびに（７）神経栄養因子、例えば、ＧＤＦ５、ＢＭＰ−１４、ＣＤＭＰ−１、ＭＰ５２、ＢＭＰ７、ソニック・ヘッジホッグ(Sonic Hedgehog)（ＳＨＨ）、繊維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ８）、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、およびＣＮＴＦがある。
本発明の医薬組成物は、製薬上許容される担体または媒体とともに処方されたＰＰＤＣ、またはその成分もしくは産物を含む。好適な製薬上許容される担体としては、水、塩溶液（リンゲル液）、アルコール、オイル、ゼラチン、および炭水化物（ラクトース、アミロースまたはデンプンなど）、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンが挙げられる。このような調製物は滅菌することができ、所望により、滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、バッファー、および着色剤などの補助剤と混合することができる。本発明において用いるために好適な医薬担体は当技術分野で公知であり、例えば、Pharmaceutical Sciences (17th Ed., Mack Pub. Co., Easton, PA)、および国際公開第９６／０５３０９号に記載されている。
専らというわけではないが典型的には、ＰＰＤＣ成分または産物を含むが、生細胞を含まない医薬組成物は液体（または経口送達が適当である場合には固形錠剤、カプセル剤など）として処方される。これらは、限定されるものではないが、経口、鼻腔、眼内、および静脈内を含む非経口など、標的神経組織への薬剤および生体分子の送達を達成するための当技術分野で公知の許容されるいずれの経路の投与用にも処方することができる。特定の非経口投与経路としては、限定されるものではないが、筋肉内、皮下、腹腔内、大脳内、心室内、脳室内、くも膜下腔内、大槽内、硬膜外、動脈内、幹内(intrastemal)、滑膜内、関節内、脊髄内および／またはポンプ装置を伴う、もしくは伴わない頭蓋内もしくは脊椎内ニードルおよび／またはカテーテルを介した送達による脊髄周辺投与経路が挙げられる。
ＰＰＤＣ生細胞を含む医薬組成物は典型的には液体、半固体（例えば、ゲル）または固体（例えば、神経組織工学に適当なマトリックス、スキャフォールドなど）として処方される。液体組成物は、標的神経組織への生細胞の送達を達成するための当技術分野で公知の許容されるいずれの経路の投与用にも処方することができる。典型的には、これらには、限定されるものではないが、眼内、大脳内、心室内、脳室内、くも膜下腔内、大槽内、脊髄内および／またはポンプ装置を伴う、もしくは伴わない頭蓋内もしくは脊椎内ニードルおよび／またはカテーテルを介した送達による脊髄周辺投与経路を含む投与経路による、拡散様式での、または神経疾患または窮迫の部位へ標的化された、ＣＮＳまたはＰＮＳへの注射または注入が含まれる。注射または注入される場合、当該細胞は損傷部位へ移動することができる。
半固体または固体担体中に生細胞を含む医薬組成物は、典型的には、神経損傷または窮迫部位に外科的に移植するために処方される。液体組成物も外科的手法により投与することができると考えられる。特定の実施形態では、半固体または固体医薬組成物は、半透性ゲル、格子、細胞スキャフォールドなどを含むことができ、これらは非生分解性であっても生分解性であってもよい。例えば、特定の実施形態では、それらの周囲から外因性細胞を隔離することが望ましいか、または適当であり、さらに当該細胞に周囲の神経細胞に生体分子（例えば、神経栄養因子）を分泌および送達させることができる。これらの実施形態では、細胞は、宿主組織から移植細胞を物理的に分離する非分解性の選択的透過バリアにより取り囲まれた、生きたＰＰＤＣまたはＰＰＤＣを含む細胞集団を含む自己インプラントとして処方することができる。このようなインプラントは、これらが免疫細胞および高分子を、薬理学的に誘導される免疫抑制の不在下で移植細胞の死滅から守る能力を有することから、「免疫保護」と呼ぶことがある（このような装置および方法の総説としては、例えば、P.A. Trescoら, (2000) Adv. Drug Delivery Rev. 42:3-27参照）。
他の実施形態では、多様な分解性ゲルおよびネットワークを本発明の医薬組成物に用いる。例えば、徐放性処方物に特に好適な分解性材料としては、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどの生体適合性ポリマーが挙げられる。薬物送達ビヒクル中の分解性ポリマーの構造、選択および使用は、A. Dombら, 1992, Polymers for Advanced Technologies 3:279-292をはじめ、いくつかの刊行物に総説されている。
他の実施形態では、例えば、損傷もしくは断裂した脊髄または断裂した四肢の神経策などの大きな神経損傷部の修復のために、分解性、好ましくは、生体吸収性（bioresorbableまたはbioabsorbable）のスキャフォールドまたはマトリックス上または内に細胞を送達するのが望ましいか、または適当である。これらの典型的三次元生体材料はスキャフォールドに付着した、またはスキャフォールド内に分散した、またはスキャフォールドに捕捉された細胞外マトリックスに組み込まれた生細胞を含む。ひと度、身体の標的領域に移植されれば、これらのインプラントは宿主組織と一体となり、移植細胞がしだいに確立されてくる（例えば、Tresco, PAら(2000)前掲参照；また、Hutmacher, DW (2001) J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 12:107-174も参照）。
生体適合性マトリックスは、ホモポリマー、コポリマーおよびブロックポリマー、ならびにそれらの組合せを含む天然、修飾天然または合成生分解性ポリマーからなってよい。ポリマーは一般に、それが合成されたモノマーに基づいて呼称されることに注意されたい。
好適な生分解性ポリマーまたはポリマー種の例としては、フィブリン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、再構成基底膜マトリックス、デンプン、デキストラン、アルギン酸塩、ヒアルロン、キチン、キトサン、アガロース、多糖類、ヒアルロン酸、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリエチレングリコール、脱細胞化組織、自己集合ペプチド、ポリペプチド、グリコサミノグリカン、それらの誘導体および混合物が挙げられる。両グリコール酸および乳酸とも、中間体の環状ダイマーは重合前に調製および精製されるのが典型である。これらの中間体ダイマーはそれぞれグリコリドおよびラクチドと呼ばれる。他の有用な生分解性ポリマーまたはポリマー種としては、限定されるものではないが、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリオキサレート、ポリ（α−エステル）、ポリ無水物、ポリアセテート、ポリカプロラクトン、ポリ（オルトエステル）、ポリアミノ酸、ポリアミド、ならびにそれらの混合物およびコポリマーが挙げられる。さらなる有用な生分解性ポリマーとしては、限定されるものではないが、Ｌ−乳酸とＤ−乳酸のステレオポリマー、ビス（パラ−カルボキシフェノキシ）プロパン酸とセバシン酸のコポリマー、セバシン酸コポリマー、カプロラクトンのコポリマー、ポリ（乳酸）／ポリ（グリコール酸）／ポリエチレングリコールのコポリマー、ポリウレタンとポリ（乳酸）のコポリマー、ポリウレタンとポリ（乳酸）のコポリマー、α−アミノ酸のコポリマー、α−アミノ酸とカプロン酸のコポリマー、α−ベンジルグルタメートとポリエチレングリコールのコポリマー、コハク酸塩とポリ（グリコール）のコポリマー、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシ−アルカノエートおよびそれらの混合物が挙げられる。二元系および三元系も意図される。
一般に、マトリックスとして用いるのに好適な生分解性ポリマーは、意図される適用に好適な機械特性を有し、組織が内植して治癒するまで十分に完全な状態を保持し、炎症性応答または毒性応答を誘発せず、その目的を満たした後は体内で代謝され、形成される目的の最終産物へと容易に加工され、許容される保存寿命を示し、かつ、容易に滅菌されるように構成されるのが望ましい。
本発明の一態様では、マトリックスを形成するために用いる生体適合性ポリマーはヒドロゲルの形態である。一般に、ヒドロゲルは水において２０重量％を上回る吸収が可能であって、なお、明瞭な三次元構造を維持する架橋ポリマー材料である。この定義には、水性環境で膨潤する乾燥架橋ポリマーならびに水膨潤性材料が含まれる。親水性ポリマーの宿主は、そのポリマーが生物起源のものであれ、半合性品または完全合成品であれ、架橋されてヒドロゲルを形成することができる。このヒドロゲルは合成ポリマー材料から生成され得る。このような合成ポリマーは、ある範囲の特性および予測できるロット間の均一性が得られるように調整可能であり、一般に免疫原性の問題がない信頼性のある材料源となる。このようなマトリックスとしては、米国特許第５，６７０，４８３号および同第５，９５５，３４３号、米国特許出願第２００２／０１６０４７１号、ＰＣＴ出願第ＷＯ０２／０６２９６９号に記載されているものなど、自己集合ペプチドから形成されるヒドロゲルが挙げられる。
ヒドロゲルを薬剤送達適用に有用なものとする特性としては、平衡膨潤度、吸収動態、溶質透過性、およびそれらのインビボ性能が挙げられる。化合物に対する透過性は、一部には、膨潤度または水分含量および生分解速度によって異なる。ゲルの機械強度は膨潤度に正比例して低下するので、その混成系が機械強度を増強するようヒドロゲルを支持体に結合させることができるということもまた、十分本発明の意図の範囲内である。別の実施形態では、ヒドロゲルの有用な送達特性とともに支持体の機械強度が得られるよう、当該ヒドロゲルを多孔質支持体内に含浸させることができる。
本発明において使用可能なスキャフォールドまたはマトリックス（ひとまとめにして「フレームワーク」と呼ぶ場合がある）材料の限定されない例としては、不織マット、粒子系、多孔質発泡体、または自己集合ペプチドなどのヒドロゲルが挙げられる。不織マットは例えば、商標ＶＩＣＲＹＬ(Ethicon, Inc., Somerville, NJ)として販売されている、グリコール酸と乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の合成吸収性コポリマーからなる繊維を用いて形成してもよい。例えば、米国特許第６，３５５，６９９号に述べられているような凍結乾燥などの方法で形成されたポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーからなる発泡体も使用可能である。自己集合ペプチド（例えば、ＲＡＤ１６）などのヒドロゲルも使用可能である。in situ形成する分解性ネットワークも本発明における使用に好適である（例えば、Anseth, KSら(2002) J. Controlled Release 78:199-209; Wang, D.ら, (2003) Biomaterials 24:3969-3980；Heらの米国特許公報第２００２／００２２６７６号参照）。これらの材料は注射に好適な液体として処方し、その後、in situまたはインビボで分解性のヒドロゲルネットワークを形成するよう、様々な手段（例えば、温度、ｐＨ、露光の変化）によって誘導することができる。粒子系は、超臨界流体もしくはスピンディスク法、または当技術分野で公知の他の方法を用いて作製することができる。
別の実施形態では、このフレームワークはフェルトであり、このフェルトは生体吸収性材料、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくはブレンド、またはヒアルロン酸から製造されたマルチ糸から構成することができる。この糸はクランピング、カッティング、カーディングおよびニードリングからなる標準的なテキスタイル加工技術を用いてフェルトとする。別の実施形態では、細胞を混成構造であり得る発泡体スキャフォールド上に播種する。
前記実施形態の多くでは、フレームワークは、例えば、神経索修復用の分離した円柱を備えた脊髄の形状などの有用な形状に成型することができる(Friedman, JAら, (2002) Neurosurgery 51:742-751)。さらに、ＰＰＤＣは、プレフォーム型の非分解性外科用または移植用デバイス上で、例えば、繊維芽細胞含有ＧＤＣ血管内コイルを作製するのに使用されるものに対応する方法で培養することができる(Marx, WFら, (2001) Am. J. Neuroradiol 22:323-333)。
当該マトリックス、スキャフォールドまたはデバイスは細胞の接着を増強するために、細胞の接種前に処理することができる。例えば、接種前に、ナイロンマトリックスは０．１モル酢酸で処理し、ポリリジン、ＰＢＳおよび／またはコラーゲン中でインキュベートしてこのナイロンをコーティングすることができる。ポリスチレンも硫酸を用いて同様に処理することができる。また、フレームワークの外面は細胞の接着または増殖と組織の分化を向上させるため、フレームワークの血漿コーティングまたは１種類以上のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸）、細胞マトリックス、および／または限定されるものではないが、とりわけ、ゼラチン、アルギン酸塩、寒天、アガロース、および植物ゴムなどの他の材料の添加などにより改良することができる。
ＰＰＤＣ含有フレームワークは当技術分野で公知の方法に従って作製される。例えば、細胞を集密前または集密まで培養容器で自由に増殖させ、培養物から採取し、フレームワーク上に接種することができる。増殖因子は、所望により分化および組織形成を誘発するため、細胞の接種前、接種中または接種後に培養培地に添加することができる。あるいは、フレームワークそれ自体を、そのフレームワーク上での細胞の増殖が増強されるように、またはインプラントの拒絶反応のリスクが軽減されるように改良することもできる。従って、限定されるものではないが、抗炎症薬、免疫抑制薬または増殖因子を含む１種類以上の生物学的に活性な化合物を、局所放出用のフレームワークに添加してもよい。
ＰＰＤＣ、ＰＰＤＣ成分または産物を用いる方法
ＰＰＤＣ、ＰＰＤＣの一部、またはＰＰＤＣを含む細胞集団、またはＰＰＤＣの成分もしくはＰＰＤＣにより産生される産物は、神経細胞および組織の修復および再生を補助および促進するため、また、神経機能および挙動を改善するための様々な方法で使用することができる。このような利用にはインビトロ法、エキソビボ法およびインビボ法が包含される。
インビトロ法およびエキソビボ法（ex vivo method）：
一実施形態では、ＰＰＤＣは多様な化合物を医薬の有効性と細胞傷害性、増殖因子、調節因子などに関してスクリーニングするためインビトロで使用することができる。例えば、このようなスクリーニングは、脳卒中の治療に関し、ＰＰＤＣともに処方され、ＰＰＤＣと同時投与される候補化合物の有効性または毒性を評価するために、実質的に均質なＰＰＤＣ集団に対して行うことができる。あるいは、このようなスクリーニングは、新規な医薬候補の有効性を評価する目的で、神経細胞または神経前駆細胞へと分化するよう刺激されたＰＰＤＣに対して行ってもよい。この実施形態では、ＰＰＤＣをインビトロで維持し、供試化合物に曝す。細胞傷害性である可能性のある化合物の活性は、培養細胞を損傷または死滅させるその能力によって測定することができる。これは活性染色法により容易に評価することができる。増殖因子または調節因子の効果は、それらの因子に曝されていない細胞と比較して、培養細胞の数または強さを分析することにより評価することができる。これは、タイプ特異的細胞抗原を規定する抗体を用いる免疫組織化学法の使用を含む、標準的な細胞学的および／または組織学的技術を用いて達成することができる。
さらなる実施形態では、前記のように、ＰＰＤＣは、それらの細胞により本来産生される、または神経系統へと分化を誘導した際に細胞により産生される、または遺伝的改変によって細胞により産生される生体産物を産生させるためインビトロで培養することができる。例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１β、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、およびＩＬ−８は、増殖培地で増殖させた臍由来細胞から分泌されることが分かった。ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１α、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＡＲＣ、エオタキシン、およびＩＬ−８は、増殖培地で培養した胎盤由来ＰＰＤＣから分泌されることが分かった（実施例参照）。これらの栄養因子のうちＢＤＮＦおよびＩＬ−６などのいくつかは、神経再生に重要な役割を持っている。他の栄養因子も、神経修復および再生における使用に関してまだ検出または検討されていないので、ＰＰＤＣにより産生されるかもしれないし、培地に分泌されるかもしれない。
これに関して、本発明の別の実施形態は、神経系統への分化を刺激する条件下でインキュベートされた未分化ＰＰＤＣまたはＰＰＤＣのいずれかからの細胞馴化培地の産生のためのＰＰＤＣの使用を特徴とする。このような細胞馴化培地は、神経形成前駆細胞のインビトロもしくはエキソビボ培養における使用、またはインビボにおいて、ＰＰＤＣの均質集団、もしくは例えば、ＰＰＤＣと神経前駆体を含む不均質集団を含む移植細胞を支持することが意図される。
さらに別の実施形態は、様々な目的での、ＰＰＤＣ細胞溶解物、可溶性細胞画分もしくはその成分、またはＥＣＭもしくはその成分の使用を含む。前記のように、これらの成分のうちいくつかは医薬組成物において使用可能である。他の実施形態では、細胞溶解物またはＥＣＭは、外科術に用いる、または移植用の、またはエキソビボ目的の、物質またはデバイスをコーティング、またはそうでなければ処理して、このような処置の過程で接触する細胞または組織の治癒または生存を高める。
実施例１３および１５に示されるように、ＰＰＤＣは、成体神経前駆細胞との共存培養で増殖させた場合に、これらの細胞の生存、増殖および分化を補助する能力を示した。よって、別の実施形態では、ＰＰＤＣは、他の細胞、特に神経細胞および神経前駆体に栄養的支持体を提供するために、インビトロ共存培養で有利に使用される。共存培養では、ＰＰＤＣおよび所望の他の細胞が、この２種の細胞が接触される条件下で共存培養されるのが望ましい。これは、例えば、細胞を、不均質な細胞集団として培養培地中または好適な培養支持体上に播種することによって達成することができる。あるいは、ＰＰＤＣはまず集密まで増殖させ、その後、第２の所望の培養細胞種の支持体として働き得る。この実施形態では、細胞はさらに、例えば、膜または類似のデバイスによって物理的に分離することができ、これにより、共存培養後、他の細胞種が除去され、個別に使用することができる。神経細胞種の増殖および分化を促進するための、共存培養物におけるＰＰＤＣの使用は、研究およびと臨床／治療分野で適用を見出せる。例えば、ＰＰＤＣ共存培養は、基礎研究目的または薬剤スクリーニングアッセイで用いるため、培養神経細胞の拡大培養および分化を助長するために使用することができる。ＰＰＤＣ共存培養はまた、治療目的で後に投与するために、神経前駆体のエキソビボ拡大培養に使用することができる。例えば、神経前駆細胞は個体から採取し、ＰＰＤＣとの共存培養でエキソビボ拡大培養し、その後、その個体（自己移植）または別の個体（同系または同種異系移植）に戻すことができる。これらの実施形態では、エキソビボ拡大培養後、ＰＰＤＣと神経前駆体を含む混合細胞集団を、治療を必要とする患者に投与することができると考えられる。あるいは、自己移植が適当または望ましい場合では、これらの共存培養細胞集団を物理的に分離して培養すれば、患者に投与するための自己神経前駆体を取り出すことができる。
あるいは、神経前駆細胞または星状細胞は、脳卒中の場合と同様の経路を活性化するために虚血性傷害を受けさせることもできる。また、虚血条件でインキュベーションすることにより、細胞を予備馴化させてもよい。
インビボ法：
実施例１６〜１９に示されるように、ＰＰＤＣは体内に有効に移植されること、およびヒトにおける有効性の予測可能性に関して受け入れられている動物モデルにおいて喪失した神経機能を提供することが示されている。これらの結果は、脳卒中患者において神経組織を修復することにより脳卒中を治療するための細胞療法においてＰＰＤＣが用いられる場合、脳卒中患者において神経組織を再生することにより脳卒中を治療するための細胞療法においてＰＰＤＣが用いられる場合、脳卒中患者において神経機能または挙動を改善することにより脳卒中を治療するための細胞療法においてＰＰＤＣが用いられる場合の本発明の好ましい実施形態を裏付けるものである。一実施形態では、ＰＰＤＣは体内の標的神経部位に移植され、とりわけ、そこで当該ＰＰＤＣは１以上の神経表現型へ分化可能であるか、または当該ＰＰＤＣはその部位で神経前駆体および神経細胞の栄養的支持体となり得るか、または当該ＰＰＤＣはこれらの両方の様式で有益な効果を発揮し得る。
本発明の特定の実施形態はドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン、および脳のＤＡ豊富領域に影響を及ぼす他の状態、例えば、中大脳動脈（ＭＣＡ）およびその分枝に影響を及ぼす脳卒中の支持、再生または置換に向けられる。実施例１８に詳細に記載されるように、ＰＰＤＣは、中大脳動脈閉塞が一時的に誘発されたラットの治療において有効であることが示された。この細胞有効性研究では、機能回復をＰＢＳまたは間葉幹細胞のいずれかを受容した対照ラットと比較した挙動試験で統計学的に有意な改善が見られた。さらに、移植ＰＰＤＣは尾の静脈注射を介した全身投与から虚血傷害部位へ定着することができる。ＰＰＤＣは試験期間（２８日）の間ラットの脳で生存することが認められた。これには、虚血ラットの脳において、神経形成、脈管形成およびシナプス形成の増加、ならびに細胞アポトーシスおよび死滅の発生率の低さなど、神経栄養的利益の指標が伴っていた。このような利益は、ＰＰＤＣが宿主細胞の移動、増殖および神経形成を刺激した結果である可能性がある。著しくは、ヒトＰＰＤＣのラットへの移植は免疫抑制剤の使用を必要としなかった。
ＰＰＤＣは単独で投与してもよいし（例えば、実質的に均質な集団）、あるいは他の細胞との混合物として投与してもよい。前記のように、ＰＰＤＣはマトリックスもしくはスキャフォールドを用いて、または従来の製薬上許容される担体を用いて、医薬製剤として処方して投与することができる。このマトリックスまたはスキャフォールドは、材料の取り込みと交換を可能とするＧＭＰにより製造された封入系であり得る。ＰＰＤＣが他の細胞とともに投与される場合、他の細胞と同時または逐次に（他の細胞の前または後に）投与することができる。ＰＰＤＣとともに投与可能な細胞としては、限定されるものではないが、ニューロン、星状細胞、乏突起神経膠細胞、神経前駆細胞、神経幹細胞および／または他の多分化能性もしくは多能性幹細胞が挙げられる。種々のタイプの細胞を投与の直前または少し前にＰＰＤＣと混合することもできるし、あるいは投与前のある期間、共存培養することもできる。ＰＰＤＣは、生存の機会および／または有益な因子の産生を高めるため、投与前に短期間、低酸素状態とすることができる。ＰＰＤＣのカリウムチャネルは、１回から複数回の短時間の調節薬暴露によって調節可能である。
ＰＰＤＣは、他の神経受益薬もしくは生体分子、または当技術分野で公知の抗炎症薬、抗アポトーシス薬、抗酸化薬、増殖因子、神経栄養因子、神経再生薬もしくは神経保護薬などの他の活性薬剤とともに投与してもよい。ＰＰＤＣが他の薬剤とともに投与される場合、単一の医薬組成物として一緒に投与してもよいし、あるいは他の薬剤と別の医薬組成物として同時または逐次時に（他の薬剤の投与前または投与後に）投与してもよい。他の薬剤は、移植前から始まる、または回復経過中継続した治療計画の一部であってもよいし、あるいは当業者が適宜であると考える場合には、移植時点、さらには移植後に始まってもよい。
ＰＰＤＣとともに投与可能な他の成分の例としては、限定されるものではないが、いくつか挙げると、（１）他の神経保護薬または神経受益薬；（２）当技術分野で公知の１以上のコラーゲン種、および／または増殖因子、血小板豊富血漿、および薬剤などの選択された細胞外マトリックス成分（あるいは、ＰＰＤＣは、増殖因子を発現および産生するよう遺伝的に操作することもできる）；（３）抗アポトーシス薬（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯミメチボディ(mimetibody）、トロンボポエチン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞増殖因子、カスパーゼ阻害剤）；（４）抗炎症化合物（例えば、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１阻害剤、ペミロラスト(PEMIROLAST)、トラニラスト(TRANILAST)、レミケード(REMICADE)、シロリムス(SIROLIMUS)、および非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（テポキサリン(TEPOXALIN)、トルメチン(TOLMETIN)、およびスプロフェン(SUPROFEN)など）；（５）免疫抑制剤または免疫調節薬、例えば、カルシニュリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗増殖薬、コルチコステロイド、および種々の抗体；（６）抗酸化薬、例えば、プロブコール、ビタミンＣおよびＥ、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システインおよびＮ−アセチルシステイン；ならびに（６）局所麻酔薬がある。
一実施形態では、ＰＰＤＣは未分化細胞、すなわち、増殖培地で培養されたものとして投与される。あるいは、ＰＰＤＣは、培養系において所望の神経表現型、例えば、星状細胞、乏突起神経膠細胞またはニューロン、より具体的には、セロトニン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロンまたはグルタミン酸作動性ニューロンへの分化を刺激する条件に曝した後に投与してもよい（例えば、Isacson, O., (2003) The Lancet (Neurology) 2:417-424参照）。
本発明の細胞は外科的移植、注射、送達（例えば、カテーテルまたはシリンジによる）が可能であるか、そうでなければ、神経損傷または窮迫部位に直接的または間接的に投与可能である。本発明の細胞またはその組成物の投与経路としては、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、皮下、鼻腔内、大脳内、心室内、脳室内、くも膜下腔内、大槽内、脊髄内および／またはポンプ装置を伴う、もしくは伴わない頭蓋内もしくは脊椎内ニードルおよび／またはカテーテルを介した送達による脊髄周辺投与経路が挙げられる。
細胞が半固体または固体デバイスで投与される場合、体内の正確な場所への外科的移植が典型的に好ましい投与手段である。しかしながら、神経前駆細胞は、例えば、放射神経膠に従って、または化学シグナルに対する応答によって、神経系へ入る点から特定の場所へに大量の移動が可能であることが知られているので、液体または流体医薬組成物をＣＮＳまたはＰＮＳのより全般的な場所（例えば、広汎性の虚血性損傷の場合に予測されるような広汎な罹患領域）に投与することもできる。
産褥由来細胞または産褥由来細胞を含む組成物および／もしくはマトリックスは、マイクロカテーテル、カテーテル留置、シャント、カニューレまたはミニポンプを介してその部位へ送達することができる。これらの組成物および／またはマトリックスは、くも膜下腔内送達、または脳室内投与、または鼻腔内投与により黒質または線条体へ間接的に送達することもできる。ビヒクル賦形剤または担体は、患者への投与、特に、細胞分化が誘発される部位への局所投与に製薬上許容されることが知られているいずれのものであってもよい。例としては、液体培地、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、無菌生理食塩水、無菌リン酸緩衝生理食塩水、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚの培地（Ｌ１５，Invitrogen, Carlsbad, CA)、無菌水中のデキストロース、および他のいずれかの生理学上許容される液体が挙げられる。
損傷領域への送達方法は、例えば、F. Balis and D. Poplack (1989) Am. J. Pediatric. Hematol. Oncol. 11(1):74-86に教示されているものなどの既知の技術に従ってオマヤレザバーを用いたくも膜下腔内または脳室内送達である。損傷領域へのさらにより好ましい送達方法としては、マイクロカテーテルを介した直接的な実質組織注射によるものがある。
この神経幹細胞の移動能は悪性脳腫瘍の治療、すなわち、これらの移動性腫瘍の治療のための治療用遺伝子／遺伝子産物の送達を目的とした前駆細胞の使用に新しい道を拓いた。例えば、神経幹細胞は、成体齧歯類における頭蓋内神経膠腫へインビボ移植される場合、外来遺伝子の安定発現を継続しながら、それ自体腫瘍床に迅速かつ広範囲に分布し、拡大培養、進行中の腫瘍細胞の近位に移動する(Aboody, K.ら, (2000) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 97:12846-12851)。ＰＰＤＣはまた、この種の使用に好適であると予測される、すなわち、アポトーシス薬または他の抗新生物薬、例えばＩＬ−１２(Ehtesham, M.ら, (2002) Cancer Res. 62:5657-5663)または腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド(Ehtesham, M.ら, (2002) Cancer Res. 62:7170-7174)を産生するように遺伝的に改変されたＰＰＤＣは悪性腫瘍（例えば、膠芽腫）の一般部位に注射、またはそれ以外の方法で投与し、その後、ＰＰＤＣは治療薬の局所送達のために腫瘍細胞へ移動することができる。
他の実施形態は、製薬上許容される担体とＰＰＤＣ細胞成分（例えば、細胞溶解物またはその成分）または産物（例えば、ＰＰＤＣにより本来産生されるか、または遺伝的改変によって産生される栄養因子およびその他の生物因子、ＰＰＤＣ培養からの細胞馴化培地）、または増殖培地から精製されたＰＰＤＣ増殖培地または産物とを含む治療組成物を投与することにより脳卒中を治療する方法を包含する。また、これらの方法はさらに、当技術分野で公知の増殖因子、神経栄養因子または神経再生薬もしくは神経保護薬などの他の薬剤を投与することを含む。さらに、脳卒中の最初の発生から数時間〜数日後に１回または複数回投与することによって有効性を得ることができる。細胞も一定範囲の用量で投与することができる。
ＰＰＤＣまたは任意の他の治療薬もしくは本明細書に記載の組成物を投与するための投与形および投与計画は、個々の患者の状態、例えば、その脳卒中からの神経損傷の性質および程度、年齢、性別、体重および健康状態、ならびに医療従事者に知られている他の因子を考慮して、優良医療規範に従って開発される、従って、患者に投与される医薬組成物の有効量は当技術分野で公知のこれらの考慮により決定される。
ＰＰＤＣはまた、細胞の分化または生存を促進する電気刺激などの他の治療計画と並行して投与することもできる。
ＣＮＳは多少免疫特権組織であるので、ＰＰＤＣによる細胞療法を開始する前に患者を免疫抑制する必要がないか、または望まれない。さらに、実施例１１に示されるように、ＰＰＤＣは混合リンパ球反応において同種異系ＰＢＭＣを刺激しないことが示されている。よって、同種異系ＰＰＤＣの移植、または異種ＰＰＤＣの移植でさえも、場合によっては許容される。いくつかの実施形態では、ＰＰＤＣはそれ自体、免疫抑制効果を提供し、それにより、移植ＰＰＤＣの宿主拒絶反応を防ぐ。このような場合、細胞療法中の薬理学的な免疫抑制の必要はないと考えられる。
しかしながら、他の例では、細胞療法を開始する前に患者を薬理学的に免疫抑制するのが望ましい、または適当である場合がある。これは、全身または局所免疫抑制薬の使用により達成することもできるし、あるいは上記のように封入デバイスにて細胞を送達することにより、または細胞と患者の免疫プロフィールを調整適合させることにより達成することもできる。移植細胞に対する免疫応答を軽減または排除するためのこれら、および他の手段は当技術分野で公知である。別法として、ＰＰＤＣは前記のようにそれらの免疫原性を軽減するために遺伝的に改変することができる。
生きた患者における移植ＰＰＤＣの生存は、様々な走査技術、例えば、コンピューター体軸断層撮影法（ＣＡＴまたはＣＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）または陽電子放射型断層撮影（ＰＥＴ）スキャンの使用によって決定することができる。移植生存の決定は、また、神経組織を取り出し、それを視覚的または顕微鏡によって検査することにより死後に行うことができる。あるいは、細胞を神経細胞またはその産物、例えば、神経伝達物質に特異的な染色剤で処理することができる。移植細胞はまた、ローダミン標識またはフルオレセイン標識マイクロスフェア、ファーストブルー、鉄（ＩＩＩ）微粒子、ビスベンズアミドなどのトレーサー色素、またはβ−ガラクトシダーゼまたはβ−グルクロニダーゼなどの遺伝的に改変されたリポーター遺伝子産物の組み込み前までに同定することができる。
移植ＰＰＤＣの、被験体の神経組織への機能的組み込みは、損傷した、または罹患した神経機能の回復を調べることにより評価することができる。このような機能としては、神経生物学者および医師に周知の手順に従った、限定されるものではないが、運動、認知、感覚および内分泌機能を含む。
ＰＰＤＣ、ＰＰＤＣ成分または産物を含むキットおよびバンク
別の態様では、本発明は、神経の再生および修復のための様々な方法、ならびに前記のように神経機能または挙動を改善するための方法において、ＰＰＤＣ、ＰＰＤＣ集団、ＰＰＤＣの成分および産物を利用するキットを提供する。脳卒中の治療または他の計画治療に用いる場合、当該キットは、少なくともＰＰＤＣと製薬上許容される担体（液体、半固体または固体）を含む１以上の細胞集団を含み得る。当該キットはまた、所望により、例えば注射などの細胞を投与する手段を含み得る。当該キットはさらに細胞の使用説明書を含んでもよい。軍用など野戦病院向けに製造されるキットは、組織スキャフォールド、外科用縫合糸などを含む全処置用提供を含んでもよく、そこでは、細胞は急性傷害の修復と併用される。本明細書に記載のようなアッセイおよびインビトロ法向けのキットは、（１）ＰＰＤＣ、またはＰＰＤＣの成分もしくは産物、（２）インビトロ法を実施するための試薬、（３）必要であれば、他の細胞または細胞集団、および（４）インビトロ法を行うための説明書のうち１以上を含み得る。
さらにもう１つの態様では、本発明はまた、本発明の組織、細胞、細胞成分および細胞集団のバンキングを提供する。前記のように、これらの細胞は容易に低温保存または凍結乾燥される。よって、本発明は、バンク中の細胞を低温保存する方法を提供し、細胞が冷凍保存され、細胞の免疫学的、生化学的および遺伝学的特性に基づく細胞の完全な同定を伴う。これらの冷凍細胞を解凍し、手順の要件および患者の必要に応じて、拡大培養するか、または直接自己、同系、または同種異系療法に使用することができる。好ましくは、各低温保存サンプルに関する情報はコンピューター保存され、これは細胞または集団の特徴に基づいて形成される好適な一致を有する外科医、手順、および患者の要件に基づいて検索することができる。好ましくは、本発明の細胞を増殖させ、所望の細胞量まで拡大培養し、治療細胞組成物を単独または共存培養物として、マトリックスまたは支持体の存在下または不在下で調製される。いくつかの適用に関して新たに調製された細胞を使用することが好ましいが、それ以外の適用では低温保存され、細胞を冷凍し、コンピューターに情報を入力して、コンピューター入力とサンプルを関連づけることによってバンクを作製することができる。免疫学的目的のため、供給源またはドナーをこのような細胞のレシピエントを一致させる必要のない場合であっても、バンク系によれば、例えば、バンクの細胞の所望の生物学的または遺伝的特性と治療的必要を一致させることが容易となる。所望の特性とバンクのサンプルとが一致する場合、そのサンプルを回収し、治療用に調製される。本明細書に記載の細胞溶解物、ＥＣＭまたは細胞成分はまた、低温保存またはそれ以外の保存（例えば、凍結乾燥による）が可能であり、本発明に従ってバンク形成が可能である。
以下の実施例は本発明の実施形態のいくつかの態様をさらに詳細に説明する。これらの実施例は限定されるものではないが、本明細書に記載の本発明の態様をさらに説明するために提供される。
本明細書および実施例においては次の省略形が使用され得る：ＰＰＤＣ、産褥細胞；ＵＤＣ、臍由来細胞；ＰＤＣ、胎盤由来細胞；ＡＮＧ２（またはＡｎｇ２）、アンギオポエチン２；ＡＰＣ、抗原提示細胞；ＢＤＮＦ、脳由来神経栄養因子；ｂＦＧＦ、塩基性繊維芽細胞増殖因子；ｂｉｄ（ＢＩＤ）、「ｂｉｓ ｉｎ ｄｉｅ」（１日２回）；ＣＫ１８、サイトケラチン１８；ＣＮＳ、中枢神経系；ＣＸＣリガンド３、ケモカイン受容体リガンド３； ＤＭＥＭ、ダルベッコの最小必須培地；ＤＭＥＭ；：ｌｇ（またはＤＭＥＭ：Ｌｇ、ＤＭＥＭ：ＬＧ）、低グルコースを含むＤＭＥＭ；ＥＤＴＡ、エチレンジアミン四酢酸；ＥＧＦ（またはＥ）、上皮細胞増殖因子；ＦＡＣＳ、蛍光活性細胞選別；ＦＢＳ、ウシ胎児血清；ＦＧＦ（またはＦ）、繊維芽細胞増殖因子；ＧＣＰ−２、顆粒球走化性タンパク質−２；ＧＦＡＰ、膠原繊維酸性タンパク質；ＨＢ−ＥＧＦ、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子；ＨＣＡＥＣ、ヒト冠動脈内皮細胞；ＨＧＦ、肝細胞増殖因子；ｈＭＳＣ、ヒト間葉幹細胞；ＨＮＦ−１α、肝細胞特異的転写因子１α；ＨＵＶＥＣ、ヒト臍帯静脈内皮細胞；Ｉ３０９、ケモカインおよびＣＣＲ８受容体のリガンド；ＩＧＦ−Ｉ、インスリン様増殖因子１；ＩＬ−６、インターロイキン−６；ＩＬ−８、インターロイキン８；Ｋ１９、ケラチン１９；Ｋ８、ケラチン８；ＫＧＦ、ケラチノサイト増殖因子；ＬＩＦ、白血病阻害因子；ＭＢＰ、ミエリン塩基性タンパク質；ＭＣＰ−１、単球走化性タンパク質１；ＭＤＣ、マクロファージ由来ケモカイン；ＭＩＰ１α、マクロファージ炎症性タンパク質１α；ＭＩＰ１β、マクロファージ炎症性タンパク質１β；ＭＭＰ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）；ＭＳＣ、間葉幹細胞；ＮＨＤＦ、正常ヒト表皮繊維芽細胞；ＮＰＥ、神経前駆体拡大培養培地；Ｏ４、乏突起神経膠細胞または神経膠分化マーカーＯ４；ＰＢＭＣ、末梢血単核細胞；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；ＰＤＧＦｂｂ、血小板由来増殖因子；ＰＯ、「ｐｅｒ ｏｓ」（経口）；ＰＮＳ、末梢神経系；Ｒａｎｔｅｓ（またはＲＡＮＴＥＳ）、活性化時に調節される正常Ｔ細胞発現および分泌(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted)；ｒｈＧＤＦ−５、組換えヒト増殖および分化因子５；ＳＣ、皮下；ＳＤＦ−１α、間質由来因子１α；ＳＨＨ、ソニック・ヘッジホッグ(Sonic Hedgehog)；ＳＯＰ、標準的操作手順；ＴＡＲＣ、胸腺および活性化調節ケモカイン；ＴＣＰ、組織培養プラスチック；ＴＣＰＳ、組織培養ポリスチレン；ＴＧＦβ２、トランスフォーミング増殖因子β２；ＴＧＦβ−３、トランスフォーミング増殖因子β−３；ＴＩＭＰ１、マトリックスメタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤；ＴＰＯ、トロンボポエチン；ＴｕＪ１、βＩＩＩチューブリン；ＶＥＧＦ、血管内皮増殖因子；ｖＷＦ、すなわち(for)フォン・ウィルブランド因子；およびαＦＰ、α−フェトタンパク質。
以下の実施例および本明細書の他所で用いられるように、増殖培地は一般にＰＰＤＣの培養に十分な培地をさす。特に、本発明の細胞の培養に現在のところ好ましい培地は、ダルベッコの最少必須培地（本明細書ではＤＭＥＭとも省略される）を含む。ＤＭＥＭ−低グルコース（本明細書ではＤＭＥＭ−ＬＧとも）(Invitrogen, Carlsbad, CA)が特に好ましい。ＤＭＥＭ−低グルコースには好ましくは、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（例えば、定義済みウシ胎児血清、Hyclone, Logan UT）、抗生剤／抗真菌剤（（好ましくは、５０〜１００単位／ｍＬペニシリン、５０〜１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および０〜０．２５μｇ／ｍＬアムホテリシンＢ；Invitrogen, Carlsbad, CA））、および０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール(Sigma, St. Louis, MO)を添加する。以下の実施例で用いるように、増殖培地とは、１５％ウシ胎児血清および抗生剤／抗真菌剤（ペニシリン／ストレプトマイシンが含まれる場合、好ましくはそれぞれ５０Ｕ／ｍＬおよび５０μｇ／ｍＬであり；ペニシリン／ストレプトマイシン／アムホテリシンＢが用いられる場合、好ましくはそれぞれ１００Ｕ／ｍＬ、１００μｍｇ／ｍＬおよび０．２５μｇ／ｍＬである）を含むＤＭＥＭ−低グルコースをさす。場合によっては異なる増殖培地が用いられ、または異なるサプリメントが提供され、これらは通常、増殖培地に対するサプリメントとして本明細書に示されている。
また、以下の実施例に関して、また、本明細書の他所で用いられる、標準増殖条件とは、５％ＣＯ2を標準的雰囲気下、３７℃での細胞の培養をさす。前述の条件は培養に有用であるが、このような条件は、細胞培養のため当技術分野で利用可能な選択肢を認識する当業者により変更可能である。
実施例１
産褥組織からの誘導
本実施例では、胎盤および臍帯組織からの産褥由来細胞の調製を記載する。産褥臍帯および胎盤は、満期妊娠または早産妊娠のいずれかの出産時に得た。細胞を臍および胎盤組織の別の５ドナーから採取した。種々の細胞単離法を、１）幹細胞に共通の特徴である、表現型の異なる細胞へ分化する能力、または２）他の細胞および組織に有用な栄養因子を提供する能力、を有する細胞を得る能力に関して試験した。
方法および材料
臍帯細胞の単離。臍帯はNational Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA)から入手した。これらの組織を通常分娩から得られたものであった。細胞単離プロトコールを層流フード内で無菌的に行った。血液および残渣を除去するため、臍帯を、抗真菌剤および抗生剤（１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬアムホテリシンＢ）の存在下、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Invitrogen, Carlsbad, CA）で洗浄した。次に、これらの組織を、１５０ｃｍ2の組織培養プレート中、５０ｍＬの培地（ＤＭＥＭ−低グルコースまたはＤＭＥＭ−高グルコース；Invitrogen）の存在下で、組織が微細パルプ（fine pulp）状に細断されるまで機械的に解離させた。細断した組織を５０ｍＬのコニカルチューブ（１本当たり組織約５ｇ）を移した。次に、この組織を、それぞれ前記のような抗真菌剤および抗生剤を含有するＤＭＥＭ−低グルコース培地またはＤＭＥＭ高グルコース培地のいずれかの中で消化した。ある実験では、コラゲナーゼおよびディスパーゼの酵素混合物を用いた（ＤＭＥＭ−低グルコース培地中、「Ｃ：Ｄ；」コラゲナーゼ(Sigma, St. Louis, MO)５００単位／ｍＬ；およびディスパーゼ(Invitrogen)５０単位／ｍＬ）。また別の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼおよびヒアルロニダーゼ（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）の混合物を用いた（ＤＭＥＭ−低グルコース培地中、コラゲナーゼ５００単位／ｍＬ；ディスパーゼ５０単位／ｍＬ；およびヒアルロニダーゼ(Sigma)５単位／ｍＬ）。この組織と培地と消化酵素を含むコニカルチューブを、３７℃、オービタルシェーカー(Environ, Brooklyn, NY)にて２２５ｒｐｍで２時間インキュベートした。
消化後、組織を１５０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。ペレットを、２０ｍＬの増殖培地（ＤＭＥＭ：低グルコース(Invitrogen)、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；定義済みウシ血清；Ｌｏｔ＃ＡＮＤ１８４７５；Hyclone, Logan, UT）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール(Sigma)、１ｍＬ／１００ｍＬの、前記のような抗生剤／抗真菌剤に再懸濁させた。この細胞懸濁液を７０μｍナイロン細胞濾過器(BD Biosciences)で濾過した。増殖培地を含むさらに５ｍＬの洗液も濾過器に通した。次に、この細胞懸濁液を４０μｍナイロン細胞濾過器(BD Biosciences)に通し、続けてさらに５ｍＬの増殖培地ですすいだ。
濾液を増殖培地（総量５０ｍＬ）に再懸濁させ、１５０ｘｇで５分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞を５０ｍＬの新鮮増殖培地に再懸濁させた。この過程をさらに２回繰り返した。
最終の遠心分離上清を吸引した際、細胞ペレットを５ｍＬの新鮮増殖培地に再懸濁させた。トリパンプルー染色を用い、生細胞数を求めた。その後、標準条件下で細胞を培養した。
臍帯から単離した細胞を、ゼラチンコートＴ−７５ｃｍ2フラスコ(Corning Inc., Corning, NY)の、前記のような抗生剤／抗真菌剤を含む増殖培地中に５，０００細胞／ｃｍ2で播種した。２日後（実験によっては細胞を２〜４日間インキュベートした）、消耗培地をフラスコから吸引した。細胞をＰＢＳで３回洗浄して残渣と血液由来細胞を除去した。次に、細胞を増殖培地に再懸濁させ、密集するまで（０第目から約１０日間）増殖させ、継代培養１代目とした。その後の継代培養では（１代目から２代目など）、細胞は４〜５日で密集前（集密度７５〜８５％密集）に達する。これらのその後の継代培養では、細胞を５０００細胞／ｃｍ2で播種した。細胞は、５％二酸化炭素と大気酸素を含む加湿インキュベーター内、３７℃で増殖させた。
胎盤細胞の単離。胎盤組織はＮＤＲＩ(Philadelphia, PA)から得た。これらの組織は妊婦由来のものであり、通常の外科的分娩時に採取されたものであった。胎盤細胞も臍帯細胞の単離に関して記載したように単離した。
以下の実施例は、胎盤組織からの母体由来細胞および新生児由来細胞の別集団の単離に適用する。
細胞単離プロトコールは層流フード内で無菌的に行った。胎盤組織を、抗真菌剤および抗生剤（前記の通り）の存在下、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Invitrogen, Carlsbad, CA）で洗浄し、血液および残渣を除去した。次に、この胎盤組織を３片：上層（新生児側または新生児相）、中層（細胞分離帯の新生児および母体混合物）および下層（母体側または母体相）に切り分けた。
分離した切片を個々に、抗生剤／抗真菌剤を含むＰＢＳで数回洗浄し、さらに血液および残渣を除去した。次に、各切片を１５０ｃｍ2組織培養プレート中、５０ｍＬのＤＭＥＭ／低グルコースの存在下で機械的に解離させ、微細なパルプにした。このパルプを５０ｍＬのコニカルチューブに移した。各チューブには、約５ｇの組織を含んだ。この組織を、抗真菌剤および抗生剤（１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬアムホテリシンＢ）と消化酵素を含有するＤＭＥＭ−低グルコースまたはＤＭＥＭ−高グルコースのいずれかの中で消化した。いくつかの実験では、コラゲナーゼとディスパーゼ（「Ｃ：Ｄ」）の酵素混合物を用い、これはＤＭＥＭ−低グルコース培地中に５００単位／ｍＬのコラゲナーゼ(Sigma, St. Louis, MO)と５０単位／ｍＬのディスパーゼ(Invitrogen)を含んだ。他の実験では、コラゲナーゼとディスパーゼとヒアルロニダーゼ（Ｃ：Ｄ：Ｈ）の混合物を用いた（ＤＭＥＭ−低グルコース中、５００単位／ｍＬのコラゲナーゼ、５０単位／ｍＬのディスパーゼ、および５単位／ｍＬのヒアルロニダーゼ(Sigma)）。組織、培地、および消化酵素を含有するコニカルチューブを、３７℃、オービタルシェーカー(Environ, Brooklyn, NY)にて２２５ｒｐｍで２時間インキュベートした。
消化後、組織を１５０ｘｇで５分間遠心分離し、生じた上清を吸引除去した。このペレットを、ペニシリン／ストレプトマイシン／アムホテリシンＢを含む２０ｍＬの増殖培地に再懸濁させた。この細胞懸濁液を７０μｍのナイロン細胞濾過器(BD Biosciences)で濾過した後、さらに５ｍＬの増殖培地ですすいだ。全細胞懸濁液を４０μｍのナイロン細胞濾過器(BD Biosciences)に通した後、洗液として５ｍＬの増殖培地を加えた。
濾液を増殖培地（総量５０ｍＬ）に再懸濁させ、１５０ｘｇで５分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞ペレットを５０ｍＬの新鮮増殖培地に再懸濁させた。この過程をさらに２回繰り返した。最終の遠心分離の後、上清を吸引し、細胞ペレットを５ｍＬの新鮮増殖培地に再懸濁させた。細胞数は、トリパンプルー排除試験を用いて求めた。その後、細胞を標準条件で培養した。
リベラーゼ細胞単離。リベラーゼ(Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN)（２．５ｍｇ／ｍＬ，ブレンドザイム(Blendzyme)３；Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN)とヒアルロニダーゼ（５単位／ｍＬ，Sigma）を含むＤＭＥＭ−低グルコース培地中で臍組織から細胞を単離した。組織の消化および細胞の単離は、Ｃ：ＤまたはＣ：Ｄ：Ｈ酵素混合物の代わりにリベラーゼ／ヒアルロニダーゼ混合物を用い、上記で他のプロテアーゼ消化に関する記載と同様であった。リベラーゼで組織を消化すると、拡大培養が容易な産褥組織由来の細胞集団が単離された。
他の酵素の組合せを用いた細胞単離。種々の酵素の組合せを用い、臍帯から細胞を単離する手順を比較した。消化に関して比較した酵素には、ｉ）コラゲナーゼ；ｉｉ）ディスパーゼ；ｉｉｉ）ヒアルロニダーゼ；ｉｖ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ混合物（Ｃ；Ｄ）；ｖ）コラゲナーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｈ）；ｖｉ）ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｄ：Ｈ）；およびｖｉｉ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｄ：Ｈ）が含まれた。これらの種々の酵素消化条件を用いたところ、細胞単離の違いが見られた（表１−１）。
Figure 0005425400
臍帯中に残留する血液からの細胞の単離。種々のアプローチにより臍帯から細胞プールを単離するため、他の試みを行った。ある場合には、臍帯をスライスし、増殖培地で洗浄して血餅とゼラチン質を除去した。この血液とゼラチン質と増殖培地の混合物を回収し、１５０ｘｇで遠心分離した。このペレットを再懸濁させ、ゼラチンコートフラスコの増殖培地中に播種した。これらの実験から、拡大培養の容易な細胞集団が単離された。
臍帯血からの細胞の単離。ＮＤＲＩから入手した臍帯血サンプルからも細胞を単離した。ここで用いた単離プロトコールは、Ｈｏらによる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／２９９７１号（Ho, T. W.ら，国際公開第２００３０２５１４９ Ａ２号）のものであった。臍帯血（ＮＤＲＩ，Philadelphia PA）のサンプル（それぞれ５０ｍＬおよび１０．５ｍＬ）を溶解バッファー（濾過除菌１５５ｍＭ塩化アンモニウム、１０ｍＭ重炭酸カリウム、ｐＨ７．２に緩衝させた０．１ｍＭ ＥＤＴＡ（全成分ともSigma, St. Louis, MOから））と混合した。細胞を臍帯血：溶解バッファー１：２０の比率で溶解させた。得られた細胞懸濁液を５秒間ボルテックスにかけ、周囲温度で２分間インキュベートした。この溶解液を遠心分離した（２００ｘｇで１０分間）。細胞ペレットを、１０％ウシ胎児血清(Hyclone, Logan UT)、４ｍＭグルタミン(Mediatech Herndon, VA)、１００単位ペニシリン／１００ｍＬおよび１００μｇストレプトマイシン／１００ｍＬ(Gibco, Carlsbad, CA)を含有する完全最小必須培地(Gibco, Carlsbad CA)に再懸濁させた。再懸濁した細胞を遠心分離し（２００ｘｇで１０分間）、上清を吸引し、細胞ペレットを完全培地で洗浄した。細胞をＴ７５フラスコ(Corning, NY)、Ｔ７５ラミニンコートフラスコ、またはＴ１７５フィブロネクチンコートフラスコ（双方ともBecton Dickinson, Bedford, MA）のいずれかに直接播種した。
種々の酵素の組合せと増殖条件を用いた細胞の単離。細胞集団が種々の条件下で単離され、単離直後に種々の条件下で拡大培養されるかどうかを決定するため、前記の手順に従い、Ｃ：Ｄ：Ｈの酵素組合せを用い、０．００１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール(Sigma, St. Louis, MO)を含むまたは含まない増殖培地中で細胞を消化した。このようにして単離した胎盤由来細胞を様々な条件下で播種した。細胞は全てペニシリン／ストレプトマイシンの存在下で増殖させた（表１−２）。
Figure 0005425400
種々の酵素の組合せと増殖条件を用いた細胞の単離。全ての条件で、細胞は継代培養０〜１代目の間、よく接着および拡大培養された（表１−２）。条件５〜８および１３〜１６の細胞は、播種後４代目までよく増殖することが示され、この時点でそれらの細胞を低温保存し、バンクに入れた。
結果
種々の酵素の組合せを用いた細胞の単離。Ｃ：Ｄ：Ｈの組合せは、単離後に最良の細胞収量をもたらし、他の条件よりも培養でより多い世代拡大される細胞を生じた（表１）。コラゲナーゼまたはヒアルロニダーゼ単独を用いても拡大培養可能な細胞集団は得られなかった。この結果が供試したコラーゲンに特異的なものであるかどうかを決定する試みは行わなかった。
種々の酵素の組合せと増殖条件を用いた細胞の単離。酵素消化および増殖を試験した全ての条件下で、細胞は継代培養０〜１代目の間、よく接着および拡大培養された（表２）。実験条件５〜８および１３〜１６の細胞は播種後４代目までよく増殖し、この時点でそれらの細胞を低温保存した。さらなる検討のために全ての細胞をバンクに入れた。
臍帯の残留血液からの細胞の単離。有核細胞は接着し、急速に増殖した。これらの細胞をフローサイトメトリーで分析したところ、酵素消化により得られた細胞と同等であった。
臍帯血からの細胞の単離。これらの調製物は赤血球と血小板を含んだ。最初の３週間、接着および分裂する有核細胞は見られなかった。播種３週間後に培地を交換しても、接着および増殖が見られた細胞はなかった。
要約。酵素組合せコラゲナーゼ（マトリックスメタロプロテアーゼ）、ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）およびヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸を分解する粘液溶解酵素）を用い、臍帯および胎盤組織から効率的に細胞集団を誘導することができる。ブレンドザイムであるリベラーゼも使用可能である。具体的には、コラゲナーゼ（４Ｗｕｎｓｃｈ単位／ｇ）とサーモライシン（１７１４カゼイン単位／ｇ）であるブレンドザイム３も、細胞を単離するため、ヒアルロニダーゼとともに用いた。これらの細胞は、ゼラチンコートプラスチック上の増殖培地で培養したところ、多数回の継代培養で容易に拡大培養された。
また、臍帯の残留血液からも細胞が単離されたが、臍帯血ではなかった。この組織から洗い流した血餅中の、使用した条件下で接着および増殖する細胞の存在は、解剖過程で遊離した細胞によるものである可能性がある。
実施例２
産褥由来細胞の増殖の特徴
産褥由来細胞（ＰＰＤＣ）の細胞拡大培養能を、単離された幹細胞の他の集団と比較した。老化までの細胞拡大培養過程はヘイフリック限界(Hayflick L. 1974a, 1974b)と呼ばれる。産褥由来細胞は、十分な細胞数まで容易に拡大培養できることから、治療使用に極めて適している。
材料および方法
ゼラチンコーティングフラスコ。組織培養プラスチックフラスコは、２０分間室温でＴ７５フラスコ(Corning, Corning, NY)に２％（ｗ／ｖ）ブタゼラチン（タイプＢ：２２５ Ｂｌｏｏｍ；Sigma, St. Louis, MO）２０ｍＬを添加することによりコーティングした。ゼラチン溶液を除去した後、１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(Invitrogen, Carlsbad, CA)を加え、その後、吸引した。
ＰＰＤＣと他の細胞集団の拡大培養能の比較。増殖拡大能の比較のため、次の細胞集団を用いた；ｉ）間葉幹細胞（ＭＳＣ；Cambrex, Walkersville, MD）；ｉｉ）脂肪由来細胞（米国特許第６，５５５，３７４ Ｂ１号；米国特許出願第ＵＳ２００４００５８４１２号）；ｉｉｉ）正常皮膚繊維芽細胞（ｃｃ−２５０９ロット＃９Ｆ０８４４；Cambrex, Walkersville, MD）；ｉｖ）臍由来細胞；およびｖ）胎盤由来細胞。細胞をまず、ゼラチンコートＴ７５フラスコの、ペニシリン／ストレプトマイシン／アムホテリシンＢを含む増殖培地に５，０００細胞／ｃｍ2で播種した。次の継代培養では、細胞培養物を次のように処理した。トリプシン処理後、生細胞をトリパンプルー染色の後に計数した。細胞懸濁液（５０μＬ）をトリパンプルー（５０ｍＬ，Sigma, St. Louis MO）と合わせた。生細胞数は血球計を用いて評価した。
計数後、細胞を、ゼラチンコートＴ７５フラスコの２５ｍＬ新鮮増殖培地に５，０００細胞／ｃｍ2で播種した。３７℃の標準条件下で細胞を増殖させた。増殖培地は１週間に２回交換した。細胞が集密度約８５％に達した際に継代培養し、細胞が老化するまでこの過程を繰り返した。
各継代培養時に、細胞をトリプシン処理し、計数した。生細胞収量、集団倍加［ｌｎ（最終の細胞／最初の細胞）／ｌｎ２］および倍加時間（培養時間（時間）／集団倍加）を算出した。至適細胞拡大を決定するため、継代培養ごとの全細胞収量を、それまでの継代培養の全収量に各継代培養の拡大倍率を掛けることにより求めた（すなわち、拡大倍率＝最終の細胞／最初の細胞）。
低密度での細胞バンクの培養拡大能。継代培養１０代目の時点でバンクに入れた細胞の拡大能もまた、種々の条件セットを用いて試験した。正常皮膚繊維芽細胞（ｃｃ−２５０９ロット＃９Ｆ０８４４；Cambrex, Walkersville, MD）、臍由来細胞、および胎盤由来細胞を試験した。これらの細胞集団はそれまでの継代培養１０代目の時点でバンクに入れたものであり、５，０００細胞／ｃｍ2で培養され、その点まで各継代培養において密集するまで増殖させたものであった。解凍した後、継代培養１０代目の細胞集団に対する細胞密度の効果を調べた。細胞を標準条件下で解凍し、トリパンプルー染色を用いて計数した。次に、解凍した細胞を、前記のように抗生剤／抗真菌剤を含むＤＭＥＭ：低グルコース増殖培地に１０００細胞／ｃｍ2で播種した。細胞は３７℃、標準的大気条件下で増殖させた。増殖培地は１週間に２回交換し、細胞が集密度約８５％に達した際に継代培養した。その後、細胞を老化するまで、すなわち、それ以上拡大培養できなくなるまで継代培養した。各継代培養時に、細胞をトリプシン処理し、計数した。細胞収量、集団倍加［ｌｎ（最終の細胞／最初の細胞）／ｌｎ２］および倍加時間（培養時間（時間）／集団倍加）を算出した。継代培養ごとの全細胞収量を、それまでの継代培養の全収量に各継代培養の拡大倍率を掛けることにより求めた（すなわち、拡大倍率＝最終の細胞／最初の細胞）。
最初の細胞播種から低密度でのＰＰＤＣの拡大培養。新たに単離したＰＰＤＣの培養拡大能を低密度細胞播種条件下で試験した。ＰＰＤＤは本明細書に記載のように調製した。細胞を１０００細胞／ｃｍ2で播種し、老化するまで前記のように継代培養した。細胞は３７℃、標準的大気条件下で増殖させた。増殖培地は１週間に２回交換した。細胞は集密度約８５％に達した際に継代培養した。各継代培養に対し、細胞をトリプシン処理し、トリパンプルー染色により計数した。細胞収量、集団倍加［ｌｎ（最終の細胞／最初の細胞）／ｌｎ２］および倍加時間（培養時間（時間）／集団倍加）を各継代培養において算出した。継代培養ごとの全細胞収量を、それまでの継代培養の全収量に各継代培養の拡大倍率を掛けることにより求めた（すなわち、拡大倍率＝最終の細胞／最初の細胞）。細胞を、ゼラチンおよび非ゼラチンコートフラスコで増殖させた。
クローン新生児胎盤由来細胞の拡大培養。胎盤組織からの新生児細胞の集団を拡大培養するためにクローニングを用いた。胎盤から３種類の異なる細胞集団を単離した後（前記の通り）、これらの細胞集団を標準増殖条件下で拡大培養し、その後、核型分析を行い、単離された細胞集団の属性を明らかにした。これらの細胞は男児を分娩した母親から単離されたので、中期染色体進展を行うことで雌雄染色体間を識別するのが簡単であった。これらの実験により、胎児相細胞は新生児表現型(phenotpye)陽性の核型であり、中層細胞は新生児および母体双方の表現型に陽性の核型であり、母体相細胞は母体細胞陽性の核型であったことが示された。
低酸素培養条件における細胞の拡大培養。低酸素細胞培養条件はある特定の状況で細胞拡大を向上させ得ることが示されている（ＵＳ２００４０００５７０４）。ＰＰＤＣの細胞拡大が細胞培養条件を変更することによって向上するかどうかを調べるため、臍帯由来細胞の培養物を低酸素条件で増殖させた。細胞を、ゼラチンコートフラスコの増殖培地に５０００細胞／ｃｍ2で播種した。まず。細胞を標準的大気条件下で５代まで継代培養し、その時点で低酸素（５％Ｏ2）培養条件に移行した。
他の増殖条件。他のプロトコールでは、細胞を、非コート、コラーゲンコート、フィブロネクチンコート、ラミニンコートおよび細胞外マトリックスタンパク質コートを施したプレート上で拡大培養した。培養物はこれらの異なるマトリックス上で十分拡大培養することが示された。
結果
ＰＰＤＣと他の細胞および非幹細胞集団との培養拡大能の比較。臍帯由来細胞と胎盤由来細胞の双方を４０代以上拡大培養すると、６０日で細胞収量は＞１Ｅ１７細胞となった。これに対し、ＭＳＣおよび繊維芽細胞はそれぞれ＜２５日後および＜６０日後に老化した。脂肪由来細胞はほぼ６０日間拡大培養したが、全細胞収量は４．５Ｅ１２であった。従って、用いた実験条件下、５０００細胞／ｃｍ2で播種すると、産褥由来細胞は同じ条件下で増殖した他の細胞種よりもはるかに良好に拡大培養された（表２−１）。
Figure 0005425400
低密度での細胞バンクの培養拡大能。臍由来細胞、胎盤由来細胞および繊維芽細胞は１０代以上拡大培養され、６０日で細胞収量は＞１Ｅ１１細胞となった（表２−２）。これらの条件下で６０日後、繊維芽細胞は老化したが、臍由来細胞および胎盤由来細胞集団は、８０日後に老化し、それぞれ＞５０倍および＞４０倍の集団倍加となった。
Figure 0005425400
最初の細胞播種から低密度でのＰＰＤＣの増殖。ＰＰＤＣを、ゼラチンコートおよび非コートプレートまたはフラスコにて低密度（１，０００細胞／ｃｍ2）で拡大培養した。これらの条件下でこれらの細胞の培養拡大能は良好であった。細胞は対数増殖期には容易に拡大培養された。細胞拡大率は、胎盤由来細胞がゼラチンコートフラスコの増殖培地中、５０００細胞／ｃｍ2で播種された場合に見られたものと同等であった。非コートフラスコまたはゼラチンコートフラスコでの培養間の細胞拡大能に違いは見られなかった。しかしながら、細胞は、ゼラチンコートフラスコでは表現型としてはるかに小さく見え、非コートフラスコ非コートではもっと大きい細胞表現型が見られた。
クローン新生児胎盤由来細胞または母体胎盤由来細胞の拡大培養。クローン新生児細胞または母体細胞集団は、胎盤の、それぞれ新生児相または母体相から単離された胎盤由来細胞から拡大培養することができる。細胞を連続希釈した後、ゼラチンコートプレートの拡大培養用増殖培地に、９６ウェルゼラチンコートプレートの１ウェルにつき１細胞播種する。この最初のクローニングから、拡大性のクローンを同定し、トリプシン処理し、１２ウェルゼラチンコートプレートの増殖培地に再び播種した後、引き続き、Ｔ２５ゼラチンコートフラスコの増殖培地に５，０００細胞／ｃｍ2で継代培養する。クローン細胞集団が特定されたことを確認するためサブクローニングを行う。サブクローニング実験では、細胞をトリプシン処理し、０．５細胞／ウェルで再び播種する。増殖の良いサブクローンをゼラチンコートＴ２５フラスコにて５，０００細胞／ｃｍ2／フラスコで拡大培養する。細胞は５，０００細胞／ｃｍ2／Ｔ７５フラスコで拡大培養する。クローンの増殖の特徴をプロットすれば、細胞拡大を示すことができる。核型分析により、クローンが新生児のものか母体のものかを確認することができる。
低酸素培養条件での細胞の拡大培養。細胞は低酸素条件下でも十分拡大培養されたが、低酸素条件下での培養では、用いた条件下で、ＰＰＤＣの細胞拡大に対する有意な効果は見られなかった。
要約。単離された産褥由来細胞を標準的大気酸素下、ゼラチンコートまたは非コートフラスコの増殖培地中、約５０００細胞／ｃｍ2の密度で増殖させることを含む細胞拡大条件は、継代培養１１代目において多数の細胞を形成するに十分である。さらに、このデータは、より低い密度の培養条件（例えば、１０００細胞／ｃｍ2）を用いて容易に拡大培養可能であることを示唆する。低酸素条件での産褥由来細胞の拡大培養はまた細胞の拡大培養も促進するが、これらの増殖条件を用いた場合の細胞拡大能の増加向上はまだ認められたことがなかった。現在のところ、大きな細胞プールを形成するには標準的大気条件での産褥由来細胞の培養が好ましい。しかしながら、培養条件を変更すれば、産褥由来細胞の拡大も同様に変化し得る。この戦略を用い、これらの細胞集団の増殖能および分化能を向上させることができる。
用いた条件下で、ＭＳＣおよび脂肪由来細胞の培養拡大能には限界があるが、産褥由来細胞は、容易に拡大培養され多数の細胞が得られる。
実施例２の参照文献
Figure 0005425400
実施例３
胎盤由来細胞の増殖培地の評価
いくつかの細胞培養培地を胎盤由来細胞の増殖を補助する能力に関して評価した。通常（２０％）および低（５％）酸素における胎盤由来細胞の増殖を、ＭＴＳ比色定量アッセイを用い、３日後に評価した。
方法および材料
継代培養８代目（Ｐ８）の胎盤由来細胞を、９６ウェルプレートにて、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む増殖培地中、１×１０3細胞／ウェルで播種した。８時間後、下記のように培地を交換し、細胞を３７℃、５％ＣＯ2下で４８時間、通常酸素（大気）または低（５％ｖ／ｖ）酸素中でインキュベートした。ＭＴＳを培養培地(CELLTITER 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, WI)に３時間加え、４９０ｎｍで吸光度を測定した(Molecular Devices, Sunnyvale CA)。
Figure 0005425400
結果
ＭＴＳアッセイの標準曲線は、吸光度増加と細胞数増加の間に直線的な相関を確立した。得られた吸光度値を推定細胞数に変換し、最初の播種に対する変化率（％）を算出した。
血清の影響。通常の酸素条件において培地に血清を添加すると、吸光度、従って生細胞数に用量依存的な増加がもたらされた。完全ＭＳＣＧＭに血清を添加すると、吸光度に用量依存的な低下がもたらされた。血清を添加しない培地では、セルグロフリー(CELLGRO FREE)、ハムのＦ１０およびＤＭＥＭでしか明瞭に増殖しなかった。
酸素の影響。低酸素は増殖培地、ハムのＦ１０、およびＭＳＣＧＭの細胞増殖率を高めるものと思われた。最良の細胞増殖をもたらす培地を増殖の高いものから挙げると、増殖培地＞ＭＳＣＧＭ＞イスコブ(Iscove)＋１０％ＦＢＳ＝ＤＭＥＭ−Ｈ＋１０％ＦＢＳ＝ハムのＦ１２＋１０％ＦＢＳ＝ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳであった。
要約。胎盤由来細胞を通常酸素または低酸素において様々な培養培地で増殖可能である。胎盤由来細胞の短期増殖は、５％酸素または大気酸素中、０、２および１０％（ｖ／ｖ）血清を含む１２の基本培地で調べた。一般に、胎盤由来細胞は、タンパク質フリーでもあるハムのＦ１０およびセルグロフリーを除き、血清フリー条件では同様に増殖しなかった。これらの血清フリー培地における増殖は、１５％血清を含有する培地で見られた最大増殖の約２５〜３３％であった。
実施例４
Ｄ−バリンを含有する培地での産褥由来細胞の増殖
通常のＬ−バリンイソ型の代わりにＤ−バリンを含有する培地を用いると、培養繊維芽細胞様細胞の増殖を選択的に阻害できることが報告されている(Hongpaisan, 2000; Sordilloら, 1988)。産褥由来細胞がＤ−バリンを含有する培地で増殖可能かどうかはこれまでは知られていなかった。
方法および材料
胎盤由来細胞（Ｐ３）、繊維芽細胞（Ｐ９）および臍帯由来細胞（Ｐ５）をゼラチンコートＴ７５フラスコ(Corning, Corning, NY)に５×１０3細胞／ｃｍ2で播種した。２４時間後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(Gibco, Carlsbad, CA)で洗浄して残留する培地を除去した。この培地を改変増殖培地（Ｄ−バリン（特注品Gibco）、１５％（ｖ／ｖ）透析済みウシ胎児血清(Hyclone, Logan, UT)、０．００１％（ｖ／ｖ）βメルカプトエタノール(Sigma)、ペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco)を含むＤＭＥＭ）に交換した。
結果
このＤ−バリン含有培地に播種した胎盤由来細胞、臍帯由来細胞、および繊維芽細胞は、透析済み血清を含有する増殖培地に播種した細胞とは違い、増殖しなかった。繊維芽細胞は形態学的に変化し、サイズが大きくなり、形状も変化した。全ての細胞が死滅し、やがて４週間後、フラスコ表面から剥離した。これらの結果は、Ｄ−バリンを含有する培地が産褥由来細胞を選択的に増殖させるのに適さないことを示す。
実施例４の参照文献
Figure 0005425400
実施例５
胎盤由来細胞用の低温保存培地
胎盤由来細胞の低温保存用の低温保存培地を評価した。
方法および材料
ゼラチンコートＴ７５フラスコの増殖培地中で増殖させた胎盤由来細胞をＰＢＳで洗浄し、１ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ(Gibco)を用いてトリプシン処理した。トリプシン処理を、１０ｍＬの増殖培地を添加することで停止させた。これらの細胞を１５０ｘｇで遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを１ｍＬの増殖培地に再懸濁させた。細胞懸濁液のアリコート６０μＬを取り出し、６０μＬのトリパンプルー(Sigma)に加えた。血球計を用い、生細胞数を評価した。この細胞懸濁液を４等分したところ、各アリコートは８８×１０4細胞を含んだ。細胞懸濁液を遠心分離し、下記の各培地１ｍＬに再懸濁させ、クリオバイアル(Cryovial)(Nalgene)に移した。
１．）増殖培地＋１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ(Hybrimax, Sigma, St. Louis, MO)
２．）細胞凍結剤ｗ／ＤＭＳＯ、ｗ／メチルセルロース、血清フリー（Ｃ６２９５，Sigma, St. Louis, MO）
３．）細胞凍結剤血清フリー（Ｃ２６３９，Sigma, St. Louis, MO)
４．）細胞凍結剤ｗ／グリセロール（Ｃ６０３９，Sigma, St. Louis, MO）
「マイフロスティ(Mr Frosty)」冷凍容器を製造業者(Nalgene, Rochester, NY)の使用説明書に従って用い、−８０℃の冷凍庫で一晩、約−１℃／分で細胞を冷却した。細胞のバイアルを２日間液体窒素中に移した後、３７℃の水浴で急速解凍した。これらの細胞を１０ｍＬの増殖培地に加え、遠心分離した後、細胞数および生存率を評価した。ゼラチンコートフラスコに５，０００細胞／ｃｍ2で播種し、細胞が接着および増殖するかどうかを判定した。
結果
低温保存する細胞の最初の生存率をトリパンプルー染色により評価したところ１００％であった。低温保存する細胞の最初の生存率をトリパンプルー染色により評価したところ１００％であった。
細胞溶解により、Ｃ６２９５に対する生存率と比例する細胞数の減少が見られた。４種類全ての溶液で低温保存した生細胞は３日以内に接着し、分裂し、密集単層を形成した。評価した増殖率に区別可能な違いはなかった。
要約。細胞の低温保存は、細胞バンクまたは細胞産物の作製に利用可能な一手法である。４種類の低温保存混合物を、ヒト胎盤由来細胞を凍結傷害から保護する能力に関して比較した。胎盤由来細胞の低温保存に関して比較されたもののうち、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）および１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が好ましい培地である。
実施例６
産褥由来細胞の核型分析
細胞療法に用いる細胞系統は均質であり、夾雑細胞種を含まないことが好ましい。細胞療法に用いる細胞は、通常の染色体数（４６本）と構造を持っていなければならない。均質であり、かつ、非産褥組織起源の細胞を含まない胎盤および臍由来細胞系統を同定するため、細胞サンプルの核型分析を行った。
材料および方法
新生男児の産褥組織由来のＰＰＤＣを、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する増殖培地で培養した。新生児由来細胞と母体由来細胞（Ｘ，Ｘ）間の識別が可能となるよう新生男児（Ｘ，Ｙ）由来の産褥組織を選択した。細胞を、Ｔ２５フラスコ(Corning, Corning, NY)の増殖培地に５，０００細胞／ｃｍ2で播種し、集密度８０％まで拡大培養した。細胞を含むＴ２５フラスコは、頚の部分まで増殖培地で満たされていた。サンプルを臨床細胞遺伝学研究所に特別便で配送した（研究所間の推定輸送時間は１時間である）。染色体が最もよく見える分裂中期に細胞を分析した。計数した分裂中期の２０細胞のうち５細胞を正常な均質な核型数（２）であるかどうか分析した。細胞サンプルは、２つの核型が見られた場合に均質と特定した。２を超える核型が見られた場合を不均質と特定した。不均質な核型数（４）が見られた場合には、さらなる分裂中期細胞を計数し、分析した。
結果
染色体分析に送られた全ての細胞サンプルは、正常な様相を呈していると解釈された。１６の細胞系統のうち３系統は不均質な表現型（ＸＸとＸＹ）を示したが、このことは新生児起源と母体起源の双方に由来する細胞の存在を示す（表６−１）。組織胎盤−Ｎ由来の細胞を胎盤の新生児相から単離された。継代培養０代目において、この細胞系統は均質ＸＹを呈していた。しかしながら、継代培養９代目で、この細胞系統は不均質（ＸＸ／ＸＹ）となったが、これは前には検出されなかった母体起源の細胞が存在していたことを示す。
Figure 0005425400
要約。染色体分析により胎盤由来細胞および臍由来細胞を同定したところ、その核型は臨床細胞遺伝学研究所により解釈されたとろでは正常を呈していた。また、核型分析により、均質な核型により判定されるように、母体細胞由来のものを含まない細胞系統も確認された。
実施例７
フローサイトメトリーによるヒト産褥由来細胞表面マーカーの評価
フローサイトメトリーによる細胞表面タンパク質または「マーカー」の同定を用い、細胞系統の属性を決定することができる。複数のドナーからの、また、種々の処理および培養条件に曝された細胞における発現の一貫性を判定することができる。胎盤および臍から単離された産褥由来細胞（ＰＰＤＣ）系統が同定され（フローサイトメトリーによる）、これらの細胞系統の同定に関するプロフィールが得られた。
材料および方法
培地および培養容器。細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む増殖培地(Gibco Carlsbad, CA)で培養した。細胞を、血漿処理したＴ７５、Ｔ１５０、およびＴ２２５組織培養フラスコ(Corning, Corning, NY)で密集するまで培養した。これらのフラスコの増殖面は、２％（ｗ／ｖ）ゼラチン(Sigma, St. Louis, MO)とともに室温で２０分間インキュベートすることによりゼラチンコートした。
抗体染色およびフローサイトメトリー分析。フラスコ内の接着細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡで解離させた。細胞を採取し、遠心分離し、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳに１×１０7／ｍＬの細胞密度で再懸濁させた。製造業者の使用説明書に従い、目的の細胞表面マーカーに対する抗体（下記参照）を１００μＬの細胞懸濁液に加え、混合物を暗所で４℃にて３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して結合していない抗体を除去した。細胞を５００μＬのＰＢＳに再懸濁させ、フローサイトメトリーにより分析した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いて行った。
次の細胞表面マーカーに対する抗体を使用した。
Figure 0005425400
胎盤と臍の比較。継代培養８代目において、胎盤由来細胞を臍由来細胞と比較した。
継代培養間の比較。胎盤由来細胞と臍由来細胞を継代培養８代目、１５代目および２０代目において分析した。
ドナー間の比較。ドナー間の違いを比較するため、種々のドナーからの胎盤由来細胞を互いに比較し、また、種々のドナーからの臍由来細胞を互いに比較した。
表面コートの比較。ゼラチンコートフラスコで培養した胎盤由来細胞を、非コートフラスコで培養した胎盤由来細胞と比較した。ゼラチンコートフラスコで培養した臍由来細胞を、非コートフラスコで培養した臍由来細胞と比較した。
消化酵素の比較。細胞の単離および調製に用いた４つの処理を比較した。１）コラゲナーゼ；２）コラゲナーゼ／ディスパーゼ；３）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ；および４）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ／ディスパーゼ処置により胎盤から単離された細胞を比較した。
胎盤層の比較。胎盤組織の母体相由来の細胞を、胎盤組織の絨毛領域由来の細胞および胎盤の新生胎児相由来の細胞と比較した。
結果
胎盤と臍の比較。胎盤由来細胞および臍由来細胞をフローサイトメトリーにより分析したところ、ＩｇＧ対照に対する蛍光値の増大により示される、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−αおよびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの陽性発現が示された。これらの細胞は、ＩｇＧ対照に匹敵する蛍光値により示される、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの検出可能な発現に関して陰性であった。陽性曲線の蛍光値の変動を考慮した。陽性曲線の平均（すなわち、ＣＤ１３）および範囲（すなわち、ＣＤ９０）はいくらかの変動を示したが、これらの曲線は正常であるものと思われ、均質な集団であることが確認された。両曲線ともそれぞれＩｇＧ対照よりも高い値を示した。
継代培養間の比較−胎盤由来細胞。フローサイトメトリーにより、継代培養８代目、１５代目、および２０代目における胎盤由来細胞を分析したところ、ＩｇＧ対照に対する蛍光値の増大により示されるように、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−αおよびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに関して全て陽性であった。これらの細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現に関して陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有していた。
継代培養間の比較−臍由来細胞。フローサイトメトリーにより、継代培養８代目、１５代目、および２０代目における臍由来細胞を分析したところ、ＩｇＧ対照に対する蛍光の増大により示されるように、全てＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−αおよびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現した。これらの細胞は、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値により示されるように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱについては陰性であった。
ドナー間の比較−胎盤由来細胞。フローサイトメトリーにより分析された、個々のドナーから単離された胎盤由来細胞は各々、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−αおよびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現し、ＩｇＧ対照よりも蛍光値が増大していた。これらの細胞は、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値により示されるように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現については陰性であった。
ドナー間の比較−臍由来細胞。フローサイトメトリーにより分析された、個々のドナーから単離された臍由来細胞は各々、ＩｇＧ対照に対する蛍光値の増大に反映されるように、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−αおよびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの陽性発現を示した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現については陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有していた。
胎盤由来細胞に対するゼラチンによる表面コーティングの効果。ゼラチンコートまたは非コートフラスコのいずれかで拡大培養した胎盤由来細胞をフローサイトメトリーにより分析したところ、ＩｇＧ対照に対する蛍光値の増大に反映されるように、全てＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−αおよびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現した。これらの細胞は、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値により示されるように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現については陰性であった。
臍由来細胞に対するゼラチンによる表面コーティングの効果。ゼラチンおよび非コートフラスコで拡大培養した臍由来細胞をフローサイトメトリーにより分析したところ、全てＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−αおよびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの発現に関して陽性であり、ＩｇＧ対照よりも高い蛍光値を有していた。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現については陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有していた。
細胞表面マーカープロフィールに対する細胞の調製に用いる酵素消化法の効果。種々の消化酵素を用いて単離された胎盤由来細胞をフローサイトメトリーにより分析したところ、ＩｇＧ対照に対する蛍光の増大により示されるように、全てＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−αおよびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現した。これらの細胞は、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値により示されるように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現については陰性であった。
胎盤層の比較。胎盤の母体層、絨毛層、および新生児層からそれぞれ単離された細胞をフローサイトメトリーにより分析したところ、ＩｇＧ対照に対する蛍光の増大により示されるように、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−αおよびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの陽性発現を示した。これらの細胞は、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値により示されるように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現については陰性であった。
要約。フローサイトメトリーによる胎盤由来細胞および臍由来細胞の分析により、これらの細胞系統の属性が確認された。胎盤由来細胞および臍由来細胞はＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−αおよびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃについて陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱについては陰性である。この属性は、ドナー、継代培養、培養容器表面コーティング、消化酵素、および胎盤層を含む変数における変動間で一致していた。個々の蛍光値ヒストグラム曲線の平均および範囲にはある程度の変動が見られたが、全ての試験条件下で全ての陽性曲線が正常であり、発現した蛍光値はＩｇＧ対照よりも大きく、従って、これらの細胞はマーカーの陽性発現を有する均質な集団を含むことが確認された。
実施例８
産褥組織表現型の免疫組織化学的同定
ヒト産褥組織、すなわち、臍帯および胎盤内で見られる細胞の表現型を免疫組織化学により分析した。
材料および方法
組織の調製。ヒト臍帯および胎盤組織を採取し、４℃にて一晩、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドに浸漬固定した。免疫組織化学は、次のエピトープ：ビメンチン（１：５００；Sigma, St. Louis, MO）、デスミン(desmin）（１：１５０、ウサギで作製；Sigma；または１：３００、マウスで作製；Chemicon, Temecula, CA）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Sigma）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Sigma）、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Sigma）、およびＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；DAKOCytomation, Carpinteria, CA）に対する抗体を用いて行った。さらに、次のマーカーも試験した：抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００；Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１；１：１００；Santa Cruz Biotech）、および抗ヒトＮＯＧＯ−Ａ（１：１００；Santa Cruz Biotech）。固定標本をメスでトリミングし、エタノールを含むドライアイス浴上、ＯＣＴ包理化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ；Sakura, Torrance, CA）内に入れた。次に、凍結したブロックを標準的なクリオスタット (Leica Microsystems)を用いて切片とし（１０μｍ厚）、染色のためスライドグラスに置いた。
免疫組織化学。免疫組織化学は、従前の研究（例えば、Messinaら，(2003) Exper. Neurol. 184:816-829）と同様に行った。組織切片をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原に接近するため、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清(Chemicon, Temecula, CA)、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトン Ｘ−１００；Sigma）を含有するタンパク質遮断溶液に１時間曝した。目的のエピトープ（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１）が細胞表面に存在している場合には、エピトープの損失を避けるために、当該手順の全ての工程からトリトンを除いた。さらに、一次抗体がヤギに対して作製された場合には（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）、手順全体においてヤギ血清の代わりに３％（ｖ／ｖ）ロバ血清を用いた。遮断溶液に希釈した一次抗体を、次に、室温で４時間、これらの切片に適用した。一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０；Molecular Probes, Eugene, OR）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−アレキサ(Alexa)４８８（１：２５０；Molecular Probes）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Santa Cruz Biotech）とともにブロックを含む二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ(Molecular Probes)を１０分間適用し、細胞核を可視化した。
免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡(Olympus, Melville, NY)にて、適当な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化した。陽性染色は、対照染色を超える蛍光シグナルにより表された。代表的な画像を、デジタルカラービデオカメラとイメージプロ(ImagePro)ソフトウエア(Media Cybernetics, Carlsbad, CA)を用いて取り込んだ。三重染色サンプルについては、１回に放射フィルターを１つだけ用いて各画像を採取した。次に、アドビ・フォトショップ(Adobe Photoshop)ソフトウエア(Adobe, San Jose, CA)を用いて層状モンタージュを作製した。
結果
臍帯の特性決定。ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、およびＣＤ３４マーカーは臍帯内に見られた細胞のサブセットで発現された。特に、ｖＷＦおよびＣＤ３４の発現は臍帯内に含まれる血管に限定されていた。ＣＤ３４＋細胞は最内層（管腔側）に存在した。ビメンチンの発現は臍帯のマトリックスおよび血管の全域に見られた。ＳＭＡはマトリックスおよび動脈と静脈の外壁に限定されたが、血管それ自体には含まれていなかった。ＣＫ１８およびデスミンは血管内だけに見られ、デスミンは中層と外層に限定されていた。
胎盤の特性決定。ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、およびＣＤ３４は全て胎盤内に見られ、領域特異的であった。
ＧＲＯα、ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１、およびＮＯＧＯ−Ａの組織発現。これらのマーカーで臍帯または胎盤組織内に見られたものは無かった。
要約。ビメンチン、デスミン、α−平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、フォン・ウィルブランド因子、およびＣＤ３４はヒト臍帯および胎盤内の細胞で発現される。
実施例９
オリゴヌクレオチドアレイを用いた産褥組織由来細胞の分析
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰアレイを用い、臍由来細胞および胎盤由来細胞の遺伝子発現プロフィールを、繊維芽細胞、ヒト間葉幹細胞、およびヒト骨髄由来の別の細胞系統の場合と比較した。この分析により産褥由来細胞の特性決定ができ、これらの細胞に独特な分子マーカーが同定された。
材料および方法
細胞の単離および培養。ヒト臍帯および胎盤は、National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA)から、患者の同意を得て正常な満期分娩のものを入手した。これらの組織を受け取り、実施例１に記載のように細胞を単離した。細胞を、ゼラチンコート組織培養プラスチックフラスコの増殖培地（ＤＭＥＭ−ＬＧを使用）で培養した。これらの培養物を３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。
ヒト皮膚繊維芽細胞は、Cambrex Incorporated (Walkersville, MD;ロット番号９Ｆ０８４４）およびＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５０１（ＣＣＤ３９ＳＫ）から購入した。両系統を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清(Hyclone)およびペニシリン／ストレプトマイシン(Invitrogen)を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)で培養した。これらの細胞は、標準的な組織処理プラスチックで増殖させた。
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）は、Cambrex Incorporated (Walkersville, MD；ロット番号２Ｆ１６５５、２Ｆ１６５６および２Ｆ１６５７)から購入し、製造業者の使用説明書に従い、ＭＳＣＧＭ培地(Cambrex)で培養した。これらの細胞は３７℃、５％ＣＯ2下、標準的な組織培養プラスチックで増殖させた。
ヒト腸骨稜(iliac crest)骨髄は、患者の同意を得てＮＤＲＩから得た。骨髄はＨｏら（ＷＯ０３／０２５１４９）が概略を示した方法に従って処理した。骨髄を溶解バッファー（１５５ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ3、および０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）と、溶解バッファー２０部に対して骨髄１部の比率で混合した。この細胞懸濁液をボルテックスにかけ、周囲温度で２分間インキュベートし、５００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清および４ｍＭグルタミンを添加した最小必須培地−α(Invitrogen)に再懸濁させた。これらの細胞を再び遠心分離し、細胞ペレットを新鮮培地に再懸濁させた。生単核細胞を、トリパンブルー排除(Sigma, St. Louis, MO)を用いて計数した。これらの単核細胞を組織培養プラスチックフラスコに５×１０4細胞／ｃｍ2で播種した。これらの細胞を３７℃、標準的大気Ｏ2または５％Ｏ2のいずれかで５％ＣＯ2下、インキュベートした。細胞を、培地を交換せずに５日間培養した。培養５日後に培地と非接着細胞を除去した。接着細胞を培養維持した。
ｍＲＮＡの単離およびＧＥＮＥＣＨＩＰ分析。活発に増殖する細胞の培養物を、冷ＰＢＳにて細胞スクレーパーを用いてフラスコから取り出した。これらの細胞を３００ｘｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を新鮮なＰＢＳに再懸濁させ、再び遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットをすぐに凍結させ、−８０℃で保存した。細胞のｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡへと転写させ、次にこれをｃＲＮＡへと転写させ、ビオチン標識した。このビオチン標識ｃＲＮＡをＨＧ−Ｕ１３３Ａ ＧＥＮＥＣＨＩＰオリゴヌクレオチドアレイ(Affymetrix, Santa Clara CA)とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションおよびデータ収集は、製造業者の使用説明書に従って行った。分析は”Significance Analysis of Microarrays”（ＳＡＭ）バージョン１．２１コンピューターソフトウエア(Stanford University, Tusher, VGら, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:5116-5121)を用いて行った。
結果
１４の異なる細胞集団を分析した。これらの細胞を、継代培養情報、培養支持体、および培養培地とともに表９−１に挙げる。
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このデータを、これらの細胞で示差的に発現された２９０の遺伝子を分析する主成分分析により評価した。この分析によれば、集団間の類似性の相対的比較が可能となる。表９−２は、細胞対の比較に関して算出されたユークリッド距離を示す。これらのユークリッド距離は、細胞種間で示差的に発現された２９０の遺伝子に基づく細胞も比較を基にしたものであった。ユークリッド距離は、２９０の遺伝子の発現間の類似性と反比例する（すなわち、距離が長くなるほど、存在する類似性が小さくなる）。
【０２５４】
【表９−１】
表９−２：細胞対のユークリッド距離
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表９−３、９−４、および９−５は、胎盤由来細胞で増大された遺伝子発現（表９−３）、臍由来細胞で増大された遺伝子発現（表９−４）、および臍由来細胞および胎盤由来細胞で低下した遺伝子発現（表９−５）を示す。「プローブセットＩＤ」とされた列は、特定の受託番号（「ＮＣＢＩ受託番号」の列）のＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ）データベース内に見出すことができる配列を含む、命名された遺伝子（「遺伝子名」の列）とハイブリダイズする、チップ上の特定の部位に存在するいくつかのオリゴヌクレオチドプローブのセットに関する製造業者の識別コードをさす。
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表９−６、９−７、および９−８は、ヒト繊維芽細胞（表９−６）、ＩＣＢＭ細胞（表９−７）、およびＭＳＣ（表９−８）において増大されている遺伝子の発現を示す。
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要約。本検討は臍帯および胎盤に由来する産褥細胞の分子同定を得るために行った。この分析は３種類の異なる臍帯と３種類の異なる胎盤に由来する細胞を含んだ。この検討はまた、２種類の異なる皮膚繊維芽細胞系統と、３種類の間葉幹細胞系統と、３種類の腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞系統も含んだ。これらの細胞によって発現されたｍＲＮＡを、２２，０００遺伝子のプローブを含んだオリゴヌクレオチドアレイを用いて分析した。結果は、これら５つの異なる細胞種で２９０の遺伝子が示差的に発現されたことを示した。これらの遺伝子は、胎盤由来細胞で特異的に増大されている１０遺伝子と、臍帯由来細胞で特異的に増大されている７遺伝子を含む。５４遺伝子は、他の細胞種に比較して胎盤および臍帯で特異的に低い発現レベルを有することが分かった。選択された遺伝子の発現をＰＣＲで確認した（以下の実施例を参照）。これらの結果は、産褥由来細胞は、例えば、骨髄由来細胞および繊維芽細胞と比較して、明瞭な遺伝子発現プロフィールを有することを示す。
実施例１０
産褥由来細胞の細胞マーカー
前記の実施例では、ヒト胎盤およびヒト臍帯由来の細胞における類似性および相違を、他の供給源に由来する細胞と遺伝子発現プロフィールを比較することによって評価した（オリゴヌクレオチドアレイを使用）。６つの「シグネチャー」遺伝子：酸化ＬＤＬ受容体 １、インターロイキン−８、レニン、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３（ＣＸＣリガンド３）、および顆粒球走化性タンパク質２（ＧＣＰ−２）を同定した。これらの「シグネチャー」遺伝子は産褥由来細胞では比較的高レベルで発現した。
本実施例に記載される手順を行い、マイクロアレイデータを立証し、遺伝子とタンパク質発現の間の一致／不一致を見つけるとともに、胎盤由来細胞および臍由来細胞に独特な識別子の検出のための信頼できる一連のアッセイを確立した。
方法および材料
細胞。ゼラチンコートＴ７５フラスコにて、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む増殖培地で増殖させた胎盤由来細胞（３つの単離物、核型分析により同定したところ、主として新生児の単離物１つを含む）、臍由来細胞（４つの単離物）、および正常ヒト表皮繊維芽細胞（ＮＨＤＦ；新生児および成人）。間葉(Mesechymal幹細胞（ＭＳＣ）を間葉幹細胞 増殖培地ブリットキット（ＭＳＣＧＭ；Cambrex, Walkerville, MD)で増殖させた。
ＩＬ−８プロトコールでは、細胞を液体窒素から解凍し、ゼラチンコートフラスコに５，０００細胞／ｃｍ2でプレーティングし、４８時間、増殖培地で増殖させ、その後、さらに８時間、１０ｍＬの血清飢餓培地［ＤＭＥＭ−低グルコース(Gibco, Carlsbad, CA)、ペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco, Carlsbad, CA)および０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン(BSA; Sigma, St. Louis, MO)］で増殖させた。この処理の後、ＲＮＡを抽出し、上清を１５０ｘｇで５分間遠心分離して細胞残渣を除去した。その後、上清をＥＬＩＳＡ分析のため−８０℃で冷凍した。
ＥＬＩＳＡアッセイのための細胞培養。胎盤および臍由来の産褥細胞、ならびにヒト新生児包皮由来のヒト繊維芽細胞を、ゼラチンコートＴ７５フラスコの増殖培地で培養した。継代培養１１代目に液体窒素中で細胞を凍結させた。細胞を解凍し、１５ｍＬ容の遠沈管に移した。１５０ｘｇで５分間遠心分離した後、上清を廃棄した。細胞を４ｍＬの培養培地に再懸濁させ、計数した。細胞を、１５ｍＬの増殖培地が入った７５ｃｍ2フラスコ中、３７５，０００細胞／フラスコで２４時間増殖させた。この培地を血清飢餓培地に８時間交換した。インキュベーション終了時に血清飢餓培地を回収し、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離した（−２０℃で保存）。
各フラスコ内の細胞の数を評価するため、２ｍＬのチルプシン(tyrpsin)／ＥＤＴＡ(Gibco, Carlsbad, CA)を各フラスコに加えた。細胞をフラスコから解離させた後、トリプシン活性を８ｍＬの増殖培地で中和した。細胞を１５ｍＬの遠沈管に移し、１５０ｘｇで５分間、遠心分離した。上清を除去し、各管に１ｍＬの増殖培地を加えて細胞を再懸濁させた。細胞数は血球計を用いて評価した。
ＥＬＩＳＡアッセイ。細胞により血清飢餓培地中へ分泌されたＩＬ−８の量を、ＥＬＩＳＡアッセイ(R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いて分析した。アッセイは全て、製造業者が提供している使用説明書に従って行った。
全ＲＮＡの単離。密集状態の産褥由来細胞および繊維芽細胞から、またはＩＬ−８の発現に関しては前記のように処理した細胞から、ＲＮＡを抽出した。細胞を、β−メルカプトエタノール(Sigma, St. Louis, MO)を含む３５０μＬのバッファーＲＬＴを用い、製造業者の使用説明書に従って溶解した（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；Qiagen, Valencia, CA)。ＲＮＡを製造業者の使用説明書に従って抽出し（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；Qiagen, Valencia, CA）、ＤＮアーゼ処理（２．７Ｕ／サンプル）(Sigma St. Louis, MO)を施した。ＲＮＡを５０μＬのＤＥＰＣ処理水で溶出させ、−８０℃で保存した。
逆転写。また、ヒト胎盤および臍からもＲＮＡを抽出した。組織（３０ｍｇ）を、２−メルカプトエタノールを含むバッファーＲＬＴ ７００μＬに懸濁させた。サンプルを機械的にホモジナイズし、製造業者の使用説明書に従い、ＲＮＡ抽出を進めた。ＲＮＡを５０μＬのＤＥＰＣ処理水で抽出し、−８０℃で保存した。ＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬(Applied Biosystems, Foster City, CA)とともにランダムヘキサマーを用い、２５℃１０分間、３７℃６０分間、および９５℃１０分間で逆転写させた。サンプルを−２０℃で保存した。
ｃＤＮＡマイクロアレイにより産褥細胞において独特な調節を受けていることが確認された遺伝子（シグネチャー遺伝子−酸化ＬＤＬ受容体、インターロイキン−８、レンニン(rennin)およびレチクロン）を、リアルタイムＰＣＲおよび従来のＰＣＲを用いてさらに調べた。
リアルタイムＰＣＲ。Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）遺伝子発現産物を用いｃＤＮＡサンプルに対してＰＣＲを行った：酸化ＬＤＬ受容体（Ｈｓ００２３４０２８）；レンニン（Ｈｓ００１６６９１５）；レチクロン（Ｈｓ００３８２５１５）；ＣＸＣリガンド３（Ｈｓ００１７１０６１）；ＧＣＰ−２（Ｈｓ００６０５７４２）；ＩＬ−８（Ｈｓ００１７４１０３）；およびＧＡＰＤＨ(Applied Biosystems, Foster City, CA)を、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００ ＳＤＳソフトウエア(Applied Biosystems, Foster City, CA)とともに７０００配列検出系を用い、製造業者の使用説明書に従い(Applied Biosystems, Foster City, CA)、ｃＤＮＡおよびＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックスと混合した。温度サイクル条件は、まず、５０℃２分および９５℃１０分の後、９５℃１５秒および６０℃１分の４０サイクルとした。ＰＣＲデータは製造業者の使用説明書に従って分析した（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出系の場合は、Applied BiosystemsのUser Bulletin #2）。
従来のＰＣＲ。リアルタイムＰＣＲからの結果を確認するため、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００(Perkin Elmer Applied Biosystems, Boston, Massachusetts, USA)を用いて従来のＰＣＲを行った。ＰＣＲは、２μＬのｃＤＮＡ溶液、１×ＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄユニバーサルミックスＰＣＲ反応バッファー(Applied Biosystems, Foster City, CA)を用い、初期変性を９４℃５分間として行った。各プライマーセットに関して増幅を至適化した。ＩＬ−８、ＣＸＣリガンド３、およびレチクロンでは、９４℃１５秒、５５℃１５秒および７２℃３０秒の３０サイクル）；レンニンでは、９４℃１５秒、５３℃１５秒および７２℃３０秒の３８サイクル）；酸化ＬＤＬ受容体およびＧＡＰＤＨでは、９４℃１５秒、５５℃１５秒および７２℃３０秒の３３サイクル。増幅に用いたプライマーは表１に一覧化されている。最終的なＰＣＲ反応液のプライマー濃度は１μＭとした（ただし、ＧＡＰＤＨの場合は０．５μＭとした）。ＧＡＰＤＨプライマーでは、製造業者のＴａｑＭａｎプローブを最終的なＰＣＲ反応液に加えなかったこと以外はリアルタイムＰＣＲの場合と同様であった。サンプルを２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルに流し、臭化エチジウム(Sigma, St. Louis, MO)で染色した。６６７ユニバーサル・ツインパック・フィルム(VWR International, South Plainfield, NJ)を用い、焦点距離ポラロイドカメラ(VWR International, South Plainfield, NJ)で画像を取り込んだ。
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免疫蛍光。ＰＰＤＣを室温にて１０分間、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド(Sigma- Aldrich, St. Louis, MO)で固定した。継代培養０代目（Ｐ０）（単離後に直接）および継代培養１１代目（Ｐ１１）の臍および胎盤由来細胞（胎盤由来細胞単離物２つ、臍由来細胞単離物２つ）ならびに繊維芽細胞（Ｐ１１）を用いた。免疫組織化学は、次のエピトープ：ビメンチン（１：５００；Sigma, St. Louis, MO）、デスミン（１：１５０；Sigma；ウサギで作製；または１：３００；Chemicon, Temecula, CA；マウスで作製）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Sigma）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Sigma）、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Sigma）、およびＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；DAKOCytomation, Carpinteria, CA）に対する抗体を用いて行った。さらに、次のマーカーも１１代目の産褥細胞に対して試験した：抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００；Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１；１：１００；Santa Cruz Biotech）、および抗ヒトＮＯＧＡ−Ａ（１：１００；Santa Cruz Biotech）。
培養物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原に接近するため、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清(Chemicon, Temecula, CA)、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトン Ｘ−１００；Sigma, St. Louis, MO）を含有するタンパク質遮断溶液に３０分間曝した。目的のエピトープが細胞表面に存在している場合には（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１）、エピトープの損失を避けるために、当該手順の全ての工程からトリトン Ｘ−１００を除いた。さらに、一次抗体がヤギに対して作製された場合には（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）、手順全体においてヤギ血清の代わりに３％（ｖ／ｖ）ロバ血清を用いた。遮断溶液に希釈した一次抗体を、次に、室温で１時間、培養物に適用した。一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０；Molecular Probes, Eugene, OR）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−アレキサ(Alexa)４８８（１：２５０；Molecular Probes）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Santa Cruz Biotech）とともにブロックを含む二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。その後、培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ(Molecular Probes)を１０分間適用し、細胞核を可視化した。
免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡(Olympus, Melville, NY)にて、適当な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化した。全ての場合で陽性染色は、対照染色を超える蛍光シグナルを表し、その場合には、一次抗体溶液の適用を除き、前記で概略を示した全手順を続けた。代表的な画像を、デジタルカラービデオカメラとイメージプロ(ImagePro)ソフトウエア(Media Cybernetics, Carlsbad, CA)を用いて取り込んだ。三重染色サンプルについては、１回に放射フィルターを１つだけ用いて各画像を採取した。次に、アドビ・フォトショップ(Adobe Photoshop)ソフトウエア(Adobe, San Jose, CA)を用いて層状モンタージュを作製した。
ＦＡＣＳ分析のための細胞の調製。フラスコに接着している細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(Gibco, Carlsbad, CA)で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ(Gibco, Carlsbad, CA)で解離させた。細胞を採取し、遠心分離し、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳに、１×１０7／ｍＬの細胞濃度で再懸濁させた。１００μＬアリコートをコニカルチューブに分注した。細胞内抗原が染色された細胞をＰｅｒｍ／洗浄バッファー(BD Pharmingen, San Diego, CA)で透過性とした。製造業者の使用説明書に従い、アリコートに抗体を加え、これらの細胞を暗所にて４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して余分な抗体を除去した。二次抗体を必要とする細胞を１００μＬの３％ＦＢＳに再懸濁させた。二次抗体を製造業者の使用説明書に従って加え、細胞を暗所にて４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して余分な二次抗体を除去した。洗浄した細胞を０．５ｍＬ ＰＢＳに再懸濁させ、フローサイトメトリーにより分析した。次の抗体を使用した：酸化ＬＤＬ受容体 １（ｓｃ−５８１３；Santa Cruz, Biotech）、ＧＲＯａ（５５５０４２；BD Pharmingen, Bedford, MA）、マウスＩｇＧ１κ（Ｐ−４６８５およびＭ−５２８４；Sigma）、ロバ抗ヤギＩｇＧ（ｓｃ−３７４３；Santa Cruz, Biotech）。フローサイトメトリー分析はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ(Becton Dickinson San Jose, CA)を用いて行った。
結果
ヒト胎盤、成体および新生児繊維芽細胞および間葉幹細胞（ＭＳＣ）由来の細胞のｃＤＮＡ に対して行った、選択された「シグネチャー」遺伝子に関するリアルタイムＰＣＲの結果は、他の細胞に比べて胎盤由来細胞では、酸化ＬＤＬ受容体とレンニンの双方が高レベルで発現されたことを示す。リアルタイムＰＣＲから得られたデータをΔΔＣＴ法により分析し、対数スケールで表した。レチクロンおよび酸化ＬＤＬ受容体の発現レベルは、他の細胞よりも臍由来細胞で高かった。産褥由来細胞と対照の間では、ＣＸＣリガンド３およびＧＣＰ−２の発現レベルにおいて有意差は見られなかった。リアルタイムＰＣＲの結果を従来のＰＣＲにより確認した。さらに、ＰＣＲ産物の配列決定によってもこれらの知見が確認された。前記に挙げた従来のＰＣＲ ＣＸＣリガンド３プライマーを用いたところ、産褥由来細胞と対照の間では、ＣＸＣリガンド３に発現レベルに有意差は見られなかった。
産褥におけるサイトカインＩＬ−８の産生を、増殖培地で培養した産褥由来細胞と血清飢餓状態の産褥由来細胞の双方で評価した。リアルタイムＰＣＲの全データを従来のＰＣＲとＰＣＲ産物の配列決定で確認した。
血清フリー培地で増殖させた細胞の上清にＩＬ−８が存在しているかどうかを調べたところ、臍帯細胞由来の培地およびいくつかの胎盤細胞単離物で最高量が検出された（表１０−１）。ヒト皮膚繊維芽細胞由来の培地では、ＩＬ−８は検出されなかった。
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 胎盤由来細胞はまた、ＦＡＣＳ分析により、酸化ＬＤＬ受容体、ＧＣＰ−２およびＧＲＯαの産生についても調べた。細胞はＧＣＰ−２陽性と判定された。酸化ＬＤＬ受容体およびＧＲＯはこの方法では検出されなかった。
胎盤由来細胞はまた、免疫組織化学分析により、選択されたタンパク質の産生に関しても試験した。単離直後（継代培養０代目）、ヒト胎盤由来細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、６種類のタンパク質：フォン・ウィルブランド因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、α−平滑筋アクチン、およびビメンチンに対する抗体に曝した。細胞はα−平滑筋アクチンとビメンチンの双方に関して陽性染色された。このパターンは継代培養１１代目まで保持された。継代培養０代目の数細胞だけ（＜５％）がサイトケラチン１８に関して陽性染色された。
継代培養０代目のヒト臍帯由来の細胞を、免疫組織化学分析により、選択されたタンパク質の産生に関してプロービングした。単離直後（継代培養０代目）、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、６種類のタンパク質：フォン・ウィルブランド因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、α−平滑筋アクチン、およびビメンチンに対する抗体に曝した。臍由来細胞はα−平滑筋アクチンおよびビメンチン陽性であり、継代培養１１代目までこの染色パターンは一貫していた。
要約。マイクロアレイおよびＰＣＲ（リアルタイム型および従来型の双方）によって測定された遺伝子発現レベル間の一致が４つの遺伝子：酸化ＬＤＬ受容体１、レンニン、レチクロン、およびＩＬ−８で確立された。これらの遺伝子の発現はＰＰＤＣにおいてｍＲＮＡレベルでの示差的に調節され、ＩＬ−８はまたタンパク質レベルでも示差的に調節された。酸化ＬＤＬ受容体の存在は、胎盤由来細胞におけるＦＡＣＳ分析では、タンパク質レベルで検出されなかった。ＧＣＰ−２とＣＸＣリガンド３の示差的発現はｍＲＮＡレベルでは確認されなかったが、ＧＣＰ−２は、胎盤由来細胞においてＦＡＣＳ分析により、タンパク質レベルで検出された。この結果は、マイクロアレイ試験から最初に得られたデータには反映されていないが、これは方法論の感度の違いによるものである可能性がある。
単離直後（継代培養０代目）、ヒト胎盤由来細胞はα−平滑筋アクチンとビメンチンの双方に関して陽性染色された。このパターンは継代培養１１代目の細胞でも見られた。これらの結果は、ビメンチンおよびα−平滑筋アクチンの発現は、増殖培地中、これらの手順で用いる条件下で継代培養した場合、細胞に保持され得ることが示唆された。継代培養０代目のヒト臍帯由来細胞をα−平滑筋アクチンおよびビメンチンの発現に関してプロービングしたところ、双方とも陽性であった。この染色パターンは継代培養１１代目まで保持された。
実施例１１
産褥由来細胞のインビトロ免疫学的評価
産褥由来細胞（ＰＰＤＣ）を、存在すれば、これらの細胞がインビボ移植の際に誘発する免疫応答を推定する試みにおいてそれらの免疫学的特徴に関してインビトロで評価した。ＰＰＤＣを、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の存在に関してフローサイトメトリーにより評価した。これらのタンパク質は抗原提示細胞（ＡＰＣ）により発現され、ナイーブＣＤ４+Ｔ細胞の直接刺激に必要とされる(Abbas & Lichtman, CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY, 5th Ed. (2003) Saunders, Philadelphia, p. 171)。これらの細胞系統をまた、ＨＬＡ−Ｇ(Abbas & Lichtman, 2003,前掲）、ＣＤ１７８(Coumansら, (1999) Journal of Immunological Methods 224, 185-196)、およびＰＤ−Ｌ２(Abbas & Lichtman, 2003,前掲; Brownら (2003) The Journal of Immunology 170, 1257-1266)の発現に関してもフローサイトメトリーにより分析した。胎盤組織に残留する細胞によるこれらのタンパク質の発現は、子宮内の胎盤組織の免疫特権状態を媒介すると考えられる。胎盤由来細胞系統および臍由来細胞系統がインビボで免疫応答を誘発する程度を推定するため、これらの細胞系統を一元配置混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で検定した。
材料および方法
細胞培養。細胞を、２％ゼラチン(Sigma, St. Louis, MO)でコートされたＴ７５フラスコ(Corning, Corning, NY)中、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する増殖培地で、密集するまで培養した。
抗体染色 細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(Gibco, Carlsbad, CA)で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ(Gibco, Carlsbad, MO)で解離させた。細胞を採取し、遠心分離し、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳに、１×１０7／ｍＬの細胞密度で再懸濁させた。製造業者の使用説明書に従い、１００μＬの細胞懸濁液に抗体（表１１−１）を加え、暗所で４℃にて３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して結合していない抗体を除去した。細胞を５００μＬのＰＢＳに再懸濁させ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用い、フローサイトメトリーにより分析した。
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混合リンパ球反応。ＣＴＢＲ ＳＯＰ Ｎｏ．ＣＡＣ−０３１を用いた混合リンパ球反応を行うため、細胞系統Ａと表示される継代培養１０代目の臍由来細胞および細胞系統Ｂと表示される継代培養１１代目の胎盤由来細胞の低温保存バイアルをドライアイス上でＣＴＢＲ(Senneville, Quebec)に送った。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を複数の男性および女性ボランティアドナーから採取した。刺激側（ドナー）同種異系ＰＢＭＣ、自己ＰＢＭＣ、および産褥細胞系統をマイトマイシンＣで処理した。自己の、マイトマイシンＣ処理した刺激細胞を応答側（レシピエント）ＰＢＭＣに加え、４日間培養した。インキュベーション後、［3Ｈ］−チミジンを各サンプルに加え、１８時間培養した。これらの細胞を採取した後、放射標識されたＤＮＡを抽出し、シンチレーションカウンターを用い、［3Ｈ］−チミジンの取り込みを測定した。
同種異系ドナーに対する刺激指数（ＳＩＡＤ）は、受容側＋マイトマイシンＣで処理した同種異系ドナーの平均増殖を受容側の基本増殖で割って算出した。ＰＰＤＣの刺激指数は、受容側＋マイトマイシンＣで処理した産褥細胞系統の平均増殖を受容側の基本増殖で割って算出した。
結果
混合リンパ球反応−胎盤由来細胞。７人のヒトボランティア血液ドナーを、他の６人の血液ドナーとの混合リンパ球反応において旺盛な増殖反応を示す１人の同種異系ドナーを特定するためスクリーニングした。このドナーは同種異系陽性対照ドナーとして選択された。残りの６人の血液ドナーをレシピエントとして選択した。同種異系陽性対照ドナーおよび胎盤由来細胞系統をマイトマイシンＣで処理し、６人の個々の同種異系受容者との混合リンパ球反応において培養した。反応は、２枚の細胞培養プレートを用い、プレート１枚当たり３人の受容者として３反復で行った（表１１−２）。平均刺激指数は１．３（プレート２）〜３（プレート１）の範囲であり、同種異系ドナー陽性対照は４６．２５（プレート２）〜２７９（プレート１）の範囲であった（表１１−３）。
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混合リンパ球反応−臍由来細胞。６人のヒトボランティア血液ドナーを、他の５人の血液ドナーとの混合リンパ球反応において旺盛な増殖反応を示す１人の同種異系ドナーを特定するためスクリーニングした。このドナーは同種異系陽性対照ドナーとして選択された。残りの５人の血液ドナーをレシピエントとして選択した。同種異系陽性対照ドナーおよび胎盤細胞系統をマイトマイシンＣで処理し、５人の個々の同種異系受容者との混合リンパ球反応において培養した。反応は、２枚の細胞培養プレートを用い、プレート１枚当たり３人の受容者として３反復で行った（表１１−４）。平均刺激指数は６．５（プレート１）〜９（プレート２）の範囲であり、同種異系ドナー陽性対照は４２．７５（プレート１）〜７０（プレート２）の範囲であった（表１１−５）。
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抗原提示細胞マーカー−胎盤由来細胞。フローサイトメトリーにより分析された胎盤由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値により示されるように、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の陰性発現を示すが、このことは胎盤細胞系統がＣＤ４+Ｔ細胞を直接刺激するのに必要な細胞表面分子を欠いていることを示す。
免疫調節マーカー−胎盤由来細胞。フローサイトメトリーにより分析された胎盤由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照よりも高い蛍光値により示されるように、ＰＤ−Ｌ２の陽性発現を示し、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値により示されるように、ＣＤ１７８およびＨＬＡ−Ｇの陰性発現を示す。
抗原提示細胞マーカー−臍由来細胞。フローサイトメトリーにより分析された臍由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値により示されるように、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の陰性発現を示すが、このことは臍細胞系統がＣＤ４+Ｔ細胞を直接刺激するのに必要な細胞表面分子を欠いていることを示す。
免疫調節細胞マーカー−臍由来細胞。フローサイトメトリーにより分析された臍由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照よりも高い蛍光値により示されるように、ＰＤ−Ｌ２の陽性発現を示し、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値により示されるように、ＣＤ１７８およびＨＬＡ−Ｇの陰性発現を示す。
要約。胎盤由来細胞系統で行った混合リンパ球反応において、平均刺激指数は１．３〜３の範囲であり、同種異系陽性対照の平均刺激指数は４６．２５〜２７９の範囲であった。臍由来細胞系統で行った混合リンパ球反応では、平均刺激指数は６．５〜９の範囲であり、同種異系陽性対照の平均刺激指数は４２．７５〜７０の範囲であった。胎盤および臍由来細胞系統では、フローサイトメトリーにより測定されたように、刺激タンパク質ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の発現は陰性であった。胎盤および臍由来細胞系統では、フローサイトメトリーにより測定されたように、免疫調節タンパク質ＨＬＡ−ＧおよびＣＤ１７８の発現は陰性であり、ＰＤ−Ｌ２の発現は陽性であった。同種異系ドナーＰＢＭＣは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、ＣＤ８、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２を発現する抗原提示細胞を含み、それによりナイーブＣＤ４+Ｔ細胞の刺激が可能である。ナイーブＣＤ４+Ｔ細胞の直接刺激に必要な胎盤由来細胞および臍由来細胞上に抗原提示細胞表面分子が存在しないこと、および免疫調節タンパク質であるＰＤ−Ｌ２が存在することは、同種異系対照に比べて、ＭＬＲにおいてこれらの細胞により発揮される刺激指数が低いことを説明し得る。
実施例１２
産褥由来細胞による栄養因子の分泌
胎盤由来細胞および臍由来細胞からの選択された栄養因子の分泌を測定した。検出のために選択された因子としては、（１）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）(Rosenら(1997) Ciba Found. Symp. 212:215-26)、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）(Salcedoら(2000) Blood 96;34-40)、インターロイキン−８（ＩＬ−８）(Liら(2003) J. Immunol. 170:3369-76)、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）(Hughesら(2004) Ann. Thorac. Surg. 77:812-8)、マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＴＩＭＰ１）、アンギオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、間質由来因子１α（ＳＤＦ−１α）などの脈管形成活性を有することが知られているもの；（２）脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）(Chengら(2003) Dev. Biol. 258;319-33)、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、トランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦβ２）などの神経栄養／神経保護活性を有することが知られているもの；および（３）マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１ａ）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ１ｂ）、単球走化性因子−１（ＭＣＰ−１）、Ｒａｎｔｅｓ(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted)、Ｉ３０９、胸腺および活性化調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）、エオタキシン、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、ＩＬ−８）などのケモカイン活性を有することが知られているものが含まれた。
方法および材料
細胞培養。胎盤および臍由来のＰＰＤＣならびにヒト新生児包皮に由来するヒト繊維芽細胞を、ゼラチンコートＴ７５フラスコ中、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む増殖培地で培養した。細胞を継代培養１１代目に低温保存し、液体窒素中で保存した。細胞を解凍した後、それらの細胞に増殖培地を加えた後、１５ｍＬ容の遠沈管に移し、細胞を１５０ｘｇで５分間遠心分離した。上清を廃棄した。細胞ペレットを４ｍＬの増殖培地に再懸濁させ、細胞を計数した。細胞を、１５ｍＬの増殖培地を含有する７５ｃｍ2容のフラスコにつき３７５，０００細胞で播種し、２４時間培養した。この培地を血清フリー培地（ＤＭＥＭ−低グルコース(Gibco)、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン(Sigma)、ペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco)）と８時間交換した。インキュベーションの終了時に、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離することにより細胞馴化血清フリー培地を回収し、−２０℃で保存した。各フラスコ内の細胞数を評価するため、細胞をＰＢＳで洗浄し、２ｍＬトリプシン／ＥＤＴＡを用いて解離させた。トリプシン活性を、８ｍＬの増殖培地を加えることで阻害した。細胞を１５０ｘｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を１ｍＬの増殖培地に再懸濁させた。細胞数は血球計を用いて評価した。
ＥＬＩＳＡアッセイ。細胞を３７℃、５％二酸化炭素および大気酸素下で増殖させた。胎盤由来細胞（バッチ１０１５０３）もまた、５％酸素またはβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）中で増殖させた。各細胞サンプルにより産生されたＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１α、ＧＣＰ−２、ＩＬ−８およびＴＧＦ−β２の量をＥＬＩＳＡアッセイ(R&D Systems, Minneapolis, MN)により測定した。アッセイは全て、製造業者の使用説明書に従って行った。
ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ多重ＥＬＩＳＡアッセイ。ケモカイン（ＭＩＰ１ａ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ−１、Ｒａｎｔｅｓ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、エオタキシン、ＭＤＣ、ＩＬ８）、ＢＤＮＦ、および脈管形成因子（ＨＧＦ、ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ１、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＴＰＯ、ＨＢ−ＥＧＦを、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔプロテオームアレイ(Pierce Biotechnology Inc.)を用いて測定した。プロテオームアレイは、ウェル当たり２〜１６のタンパク質の定量測定のための多重サンドイッチＥＬＩＳＡである。これらのアレイは、９６ウェルプレートの各ウェルに、２×２、３×３、または４×４パターンの４〜１６の異なる捕捉抗体をスポットすることにより作製される。サンドイッチＥＬＩＳＡ法の後、プレートの各ウェル内の各スポットにおいて生成された化学発光シグナルを捕捉するため、プレート全体を画像化する。各スポットにおいて生成されたシグナルの量は、原標品またはサンプル中の標的タンパク質の量に比例する。
結果
ＥＬＩＳＡアッセイ。ＭＣＰ−１およびＩＬ−６は、胎盤由来細胞および臍由来細胞ならびに皮膚繊維芽細胞により分泌された（表１２−１）。ＳＤＦ−１αは、５％Ｏ2中で培養された胎盤由来細胞により、および繊維芽細胞により分泌された。ＧＣＰ−２およびＩＬ−８は、臍由来細胞により、およびＢＭＥまたは５％Ｏ2の存在下で培養された胎盤由来細胞により分泌された。また、ＧＣＰ−２は、ヒト繊維芽細胞により分泌された。ＴＧＦ−β２はＥＬＩＳＡアッセイでは検出できなかった。
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ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ多重ＥＬＩＳＡアッセイ。ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、およびＩＬ−８は、臍由来細胞から分泌された（表１２−２および１２−３）。ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ａ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＡＲＣ、エオタキシン、およびＩＬ−８は、胎盤由来細胞から分泌された（表１２−２および１２−３）。Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ、またはＰＤＧＦ−ｂｂは検出されなかった。
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要約。臍由来細胞および胎盤由来細胞は複数の栄養因子を分泌した。ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８など、これらの栄養因子のうちいくつかは、脈管形成に重要な役割を果たす。ＢＤＮＦおよびＩＬ−６などの他の栄養因子は神経再生に重要な役割を持つ。
実施例１３
産褥由来細胞の短期的神経分化
胎盤由来細胞および臍由来細胞（ひとまとめにして産褥由来細胞またはＰＰＤＣ）の、神経系統細胞へ分化する能力を調べた。
材料および方法
産褥細胞の単離および増殖。実施例１に記載のように、胎盤組織および臍帯組織からＰＰＤＣを単離し、拡大培養した。
改変ウッドバリー−ブラック(Woodbury-Black)プロトコール。（Ａ）このアッセイは、元は骨髄間質細胞の神経誘導能を試験するために実施されたアッセイから採用したものであった(Woodbury, D.ら(2000) J. Neurosci. Res. 61(4):364-370)。臍由来細胞（０２２８０３）Ｐ４および胎盤由来細胞（０４２２０３）Ｐ３を解凍し、密集前（７５％）に達するまで、増殖培地中、５，０００細胞／ｃｍ2で拡大培養した。次に、細胞をトリプシン処理し、Ｔｉｔｒｅｔｅｋ ＩＩスライドガラス(VWR International, Bristol, CT)のウェルあたり６，０００細胞として播種した。対照として、間葉幹細胞（Ｐ３；１Ｆ２１５５；Cambrex, Walkersville, MD）、骨芽細胞（Ｐ５；ＣＣ２５３８；Cambrex）、脂肪由来細胞（Ａｒｔｅｃｅｌ，ＵＳ６５５５３７４ Ｂ１）（Ｐ６；ドナー２）および新生児ヒト皮膚繊維芽細胞（Ｐ６；ＣＣ２５０９；Cambrex）も同じ条件下で播種した。
全ての細胞をまず、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Hyclone, Logan, UT）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；２０ｎｇ／ｍＬ；Peprotech, Rocky Hill, NJ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ；２０ｎｇ／ｍＬ；Peprotech）およびペニシリン／ストレプトマイシン(Invitrogen)を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)で４日間拡大培養した。４日後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Invitrogen）ですすぎ、その後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン中で２４時間培養した。２４時間後、細胞をＰＢＳですすいだ。次に、細胞を、２００ｍＭブチル化ヒドロキシアニソール、１０μＭ塩化カリウム、５ｍｇ／ｍＬインスリン、１０μＭフォルスコリン、４μＭバルプロ酸、および２μＭヒドロコルチゾン（化学薬品は全てSigma, St. Louis, MOから入手）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（血清フリー）からなる誘導培地中で１〜６時間培養した。その後、細胞を１００％氷冷メタノール中で固定し、免疫細胞化学法を行い（下記方法を参照）、ヒトネスチンタンパク質の発現を評価した。
（Ｂ）ＰＰＤＣ（臍（０２２８０３）Ｐ１１；胎盤（０４２２０３）Ｐ１１）および成体ヒト皮膚繊維芽細胞（１Ｆ１８５３，Ｐ１１）を解凍し、密集前（７５％）に達するまで、増殖培地中、５，０００細胞／ｃｍ2で拡大培養した。次に、細胞をトリプシン処理し、（Ａ）と同様の密度で、ただし、（１）２４ウェル組織培養処理プレート（ＴＣＰ，Ｆａｌｃｏｎブランド，VWR International）、（２）ＴＣＰウェル＋２％（ｗ／ｖ）ゼラチン（室温で１時間吸着）、または（３）ＴＣＰウェル＋２０μｇ／ｍＬの吸着マウスラミニン（３７℃で最低２時間吸着；Invitrogen）に播種した。
厳密に（Ａ）と同様に、細胞をまず培養拡大し、培地を前記の時間枠で切り替えた。前記のように１つの培養物セットを５日と６時間、この場合、室温で１０分間、氷冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド(Sigma)で固定した。第２の培養物セットでは、培地を除去し、Ｂ２７（Ｂ２７サプリメント；Invitrogen）、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン(Invitrogen)を含有する、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地(Invitrogen)からなる神経前駆体拡大培地（ＮＰＥ）に切り替えた。ＮＰＥ培地にさらにレチノイン酸（ＲＡ；１μＭ；Sigma）を添加した。４日後、この培地を除去し、培養物を室温にて１０分間氷冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド(Sigma)で固定し、ネスチン、ＧＦＡＰ、およびＴｕＪ１タンパク質の発現に関して染色した（表Ｎ１−１参照）。
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二段階分化プロトコール。ＰＰＤＣ（臍（０４２２０３）Ｐ１１、胎盤（０２２８０３） Ｐ１１）、成体ヒト皮膚繊維芽細胞（Ｐ１１；１Ｆ１８５３；Cambrex）を解凍し、密集前（７５％）に達するまで増殖培地中、５，０００細胞／ｃｍ2で拡大培養した。次に、細胞をトリプシン処理し、２，０００細胞／ｃｍ2で、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ；Peprotech, Rocky Hill, NJ）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ；Peprotech）を添加したＮＰＥ培地の存在下、ラミニン(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)でコートした２４ウェルプレートに播種した［全培地組成物はＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅとも呼ばれる］。同時に、海馬から単離された成体ラット神経前駆体（Ｐ４；（０６２６０３）を２４ウェルラミニンコートプレートのＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ培地に培養プレーティングした。全ての培養物をこのような条件下で６日間維持し（この間一度細胞に補給した）、さらに７日間表Ｎ１−２に挙げられている分化条件に培地を切り替えた。培養物を室温で１０分間氷冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド(Sigma)で固定し、ヒトまたはラットネスチン、ＧＦＡＰ、およびＴｕＪ１タンパク質の発現に関して染色した。
Figure 0005425400
複数の増殖因子プロトコール。臍由来細胞（Ｐ１１；（０４２２０３））を解凍し、密集前（７５％）に達するまで増殖培地中、５，０００細胞／ｃｍ2で拡大培養した。次に、細胞をトリプシン処理し、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋Ｅ（２０ｎｇ／ｍＬ）の存在下、２４ウェルラミニンコートプレート(BD Biosciences)に２，０００細胞／ｃｍ2で播種した。さらに、いくつかのウェルは、ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ＋２％ＦＢＳまたは１０％ＦＢＳを含んだ。予備分化の４日後、全ての培地を除去し、サンプルを、ソニック・ヘッジホッグ(Sonic Hedgehog)（ＳＨＨ；２００ｎｇ／ｍＬ；Sigma, St. Louis, MO）、ＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍＬ；Peprotech）、ＢＤＮＦ（４０ｎｇ／ｍＬ；Sigma）、ＧＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ；Sigma）、およびレチノイン酸（１μＭ；Sigma）を添加したＮＰＥ培地に切り替えた。培地交換から７日後、培養物を室温で１０分間、氷冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド(Sigma)で固定し、ヒトネスチン、ＧＦＡＰ、ＴｕＪ１，デスミン、およびα−平滑筋アクチンの発現に関して染色した。
神経前駆体共存培養プロトコール。成体ラット海馬前駆体（０６２６０３）を、ラミニンコート２４ウェルディッシュ(BD Biosciences)のＮＰＥ＋Ｆ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋Ｅ（２０ｎｇ／ｍＬ）中に、ニューロスフェアまたは単細胞（１０，０００細胞／ウェル）としてプレーティングした。
別に、臍由来細胞（０４２２０３）Ｐ１１および胎盤由来細胞（０２２８０３）Ｐ１１を解凍し、４８時間、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋Ｅ（２０ｎｇ／ｍＬ）中、５，０００細胞／ｃｍ2で拡大培養した。次に、細胞をトリプシン処理し、既存の神経前駆体培養物上に２，５００細胞／ウェルで播種した。この時、既存の培地を新鮮培地に交換した。４日後、培養物を室温で１０分間氷冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド(Sigma)で固定し、ＰＰＤＣを同定するため、ヒト核タンパク質（ｈＮｕｃ；Chemicon）に関して染色した（前記の表ＮＵ１−１）。
免疫細胞化学。免疫細胞化学法を、表ＮＵ１−１に挙げられた抗体を用いて行った。培養物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原に接近するため、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清(Chemicon, Temecula, CA)、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトン Ｘ−１００；Sigma）を含有するタンパク質遮断溶液に３０分間曝した。遮断溶液に希釈した一次抗体を、次に、室温で１時間、培養物に適用した。次に、一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０；Molecular Probes, Eugene, OR）、およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−アレキサ(Alexa)４８８（１：２５０；Molecular Probes）とともに遮断溶液を含む二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。その後、培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ(Molecular Probes)を１０分間適用し、細胞核を可視化した。
免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡(Olympus, Melville, NY)にて、適当な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化した。全ての場合で陽性染色は、対照染色を超える蛍光シグナルを表し、その場合には、一次抗体溶液の適用を除き、前記で概略を示した全手順を続けた。代表的な画像を、デジタルカラービデオカメラとイメージプロ(ImagePro)ソフトウエア(Media Cybernetics, Carlsbad, CA)を用いて取り込んだ。三重染色サンプルについては、１回に放射フィルターを１つだけ用いて各画像を採取した。次に、アドビ・フォトショップ(Adobe Photoshop)ソフトウエア(Adobe, San Jose, CA)を用いて層状モンタージュを作製した。
結果
ウッドバリー−ブラックプロトコール。（Ａ）この神経誘導組成物中でインキュベーションすると、全ての細胞種が双極性の形態と突起の延長を伴う細胞へ形質転換した。他のより大きな非双極性形態も見られた。さらに、これらの誘導細胞集団は、多分化能性神経幹細胞および前駆体細胞のマーカーであるネスチンに関して陽性染色された。
（Ｂ）組織培養プラスチック（ＴＣＰ）ディッシュ上で繰り返した場合、培養物表面に予めラミニンを吸着していなければ、ネスチンの発現は見られなかった。ネスチン発現細胞が次に成熟ニューロンの生成へ進むことができるかどうかをさらに評価するため、ＰＰＤＣおよび繊維芽細胞を、神経幹細胞および前駆細胞からこのような細胞への分化を誘導することが知られている培地組成であるＮＰＥ＋ＲＡ（１μＭ）に曝した（２、３、４）。細胞を、未熟および成熟ニューロンのマーカーであるＴｕＪ１、星状細胞のマーカーであるＧＦＡＰ、およびネスチンに関して染色した。ＴｕＪ１が検出された条件はなく、神経形態を有する細胞も見られなかったが、このことは、ニューロンは短期間には形成されなかったことを示唆する。さらに、免疫細胞化学により決定されたように、ネスチンおよびＧＦＡＰはもはやＰＰＤＣによっては発現されなかった。
二段階分化。臍および胎盤ＰＰＤＣ単離物（ならびにそれぞれ陰性対照細胞種および陽性対照細胞種としてのヒト繊維芽細胞および齧歯類神経前駆体）をラミニン（神経促進）コートディッシュにプレーティングし、神経前駆体からニューロンおよび星状細胞への分化を促進することが知られている１３の異なる増殖条件（および２つの対照条件）に曝した。さらに、ＰＰＤＣ分化に対するＧＤＦ５およびＢＭＰ７の影響を調べるために２つの条件を加えた。一般に、二段階分化アプローチが採られ、細胞をまず、６日間神経前駆体拡大培養条件に置いた後、７日間完全分化条件に置いた。形態学的には、臍由来細胞および胎盤由来細胞はいずれも、この手順の経過中、細胞形態に基本的な変化を示した。しかし、対照の神経前駆体プレーティング条件を除いては、神経細胞または星状細胞は見られなかった。ヒトネスチン、ＴｕＪ１、およびＧＦＡＰについて陰性の免疫細胞化学により形態学的所見が確認された。
複数の増殖因子。様々な神経分化剤に１週間曝した後、細胞を神経前駆体（ヒトネスチン）、ニューロン（ＴｕＪ１）、および星状細胞（ＧＦＡＰ）の指標となるマーカーに関して染色した。第一段階において非血清含有培地で増殖させた細胞は血清含有（２％または１０％）培地の細胞よりも種々の形態を持っていたが、このことは潜在的神経分化を示す。具体的には、臍由来細胞をＥＧＦおよびｂＦＧＦに曝し、その後、ＳＨＨ、ＦＧＦ８、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、およびレチノイン酸に曝すという二段階法の後、細胞は、培養星状細胞の形態と類似の突起の長期延長を示した。第一段階の分化に２％ＦＢＳまたは１０％ＦＢＳが含まれた場合、細胞数が増え、細胞形態は高密度対照培養と変わらなかった。ヒトネスチン、ＴｕＪ１、またはＧＦＡＰに関する免疫細胞化学分析により、潜在的神経分化の証拠は得られなかった。
神経前駆体とＰＰＤＣの共存培養。２日早く神経拡大培養条件（ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ）に播種したラット神経前駆体の培養物の上にＰＰＤＣをプレーティングした。プレーティングしたＰＰＤＣの視覚的検査は、これらの細胞が単一細胞としてプレーティングされたことを明らかにしたが、プレーティング４日後（全体で６日目）のヒト特異的な核染色（ｈＮｕｃ）により、それらはもつれ、神経前駆体との接触を避ける傾向があることが示された。さらに、ＰＰＤＣが接着すると、これらの細胞は拡がり、ラット起源のものであった分化ニューロンにより神経支配されることが明らかになったが、このことはＰＰＤＣが筋肉細胞に分化した可能性があることを示唆する。この所見は位相差顕微鏡下の形態に基づくものであった。別の所見として、典型的に大きな細胞体（神経前駆体よりも大きい）は、薄い突起が多方向に拡がっているという神経前駆体に似た形態を持っていた。ＨＮｕｃ染色（細胞核の半分に見られる）は、これらのヒト細胞がラット前駆体と融合し、それらの表現型をとる場合があることを示唆している。神経前駆体のみを含む対照ウェルは前駆体総数が少なく、臍または胎盤ＰＰＤＣを含むウェルを共存培養した場合よりも明らかに分化した細胞が見られたが、このことは、臍由来細胞および胎盤由来細胞の双方が、ケモカインおよびサイトカインの放出によるか、または接触により媒介される効果により、神経前駆体の分化および挙動に影響を及ぼしたことを示す。
要約。ＰＰＤＣが神経系統細胞へ分化する短期的能力を調べるため、複数のプロトコールを実施した。これらには、それぞれ多分化能性神経幹細胞および前駆体細胞、未熟および成熟ニューロン、ならびに星状細胞に関連するタンパク質ネスチン、ＴｕＪ１、およびＧＦＡＰに関する免疫細胞化学と組み合わせた、形態の位相差画像法を含んだ。これらの短期プロトコールのある場合に、神経分化が見られたことを示す証拠が認められた。
ＰＰＤＣと神経前駆体の共存培養においていくつかの顕著な所見が得られた。異種細胞種とともにヒトＰＰＤＣを用いるこのアプローチにより、これらの培養物中の各細胞の起源の絶対的決定が可能となる。第一に、これらの培養物において、細胞質が拡大し、細胞体から神経突起様の構造が伸びており、さらに細胞体の半分だけがｈＮｕｃタンパク質で染色されたいくつかの細胞を観察した。これらの細胞は、神経系統細胞へ分化したヒトＰＰＤＣであった可能性があるか、またはこれらの細胞は神経前駆体と融合したＰＰＤＣであった可能性もある。第二に、神経前駆体がＰＰＤＣに向かって神経突起を伸ばしているのが見られ、これらの神経前駆体がニューロンへ分化し、ＰＰＤＣを神経支配したことを示す。第三に、神経前駆体とＰＰＤＣの培養物はラット起源の細胞が多く、神経前駆体単独の対照培養物よりも分化が多量であるが、このことは、プレーティングされたＰＰＤＣが可溶性因子、および／または神経前駆体の生存、増殖および／または分化を刺激した接触依存性機構を提供したことをさらに示している。
実施例１３の参照文献
Figure 0005425400
実施例１４
産褥由来細胞の長期神経分化
臍由来細胞および胎盤由来細胞（ひとまとめにして産褥由来細胞またはＰＰＤＣ）が神経系統細胞へと長期的に分化を受ける能力を評価した。
材料および方法
ＰＰＤＣの単離および増殖。従前の実施例に記載のように、ＰＰＤＣを単離し、拡大培養した。
ＰＰＤＣ細胞の解凍およびプレーティング。従前に増殖培地で増殖させたＰＰＤＣの冷凍アリコート（臍（０２２８０３）Ｐ１１；（０４２２０３）Ｐ１１；（０７１００３）Ｐ１２；胎盤（１０１５０３）Ｐ７）を解凍し、ラミニン(BD, Franklin Lakes, NJ)コートしたＴ−７５フラスコにて、Ｂ２７（Ｂ２７サプリメント，Invitrogen）、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（１０ｍＬ）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)（これらの組合せを本明細書では神経前駆体拡大（ＮＰＥ）培地と呼ぶ）中、５，０００細胞／ｃｍ2でプレーティングした。ＮＰＥ培地にはさらにｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ，Peprotech, Rocky Hill, NJ）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ，Peprotech, Rocky Hill, NJ）を添加した（本明細書では、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦと表す）。
対照細胞のプレーティング。さらに、成体ヒト皮膚繊維芽細胞（Ｐ１１，Cambrex, Walkersville, MD）および間葉幹細胞（Ｐ５，Cambrex）を解凍し、ラミニンコートＴ−７５フラスコのＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ中に、同じ細胞播種密度でプレーティングした。さらなる対照として、繊維芽細胞、臍、および胎盤ＰＰＤＣを全ての培養物に対して特定の期間増殖培地で増殖させた。
細胞の拡大培養。全ての培養物からの培地を１週間に１回新鮮な培地に置き換え、細胞の拡大を観察した。一般に、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦでの増殖には限りがあるので、１か月に１回各培養を継代した。
免疫細胞化学。１か月後、全フラスコを室温で１０分間冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド(Sigma)で固定した。免疫細胞化学法は、ＴｕＪ１（βＩＩＩチューブリン；１：５００；Sigma, St. Louis, MO）およびＧＦＡＰ（膠原繊維酸性タンパク質；１：２０００；DakoCytomation, Carpinteria, CA）に対する抗体を用いて行った。要するに、培養物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原に接近するため、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清(Chemicon, Temecula, CA)、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトン Ｘ−１００；Sigma）を含有するタンパク質遮断溶液に３０分間曝した。遮断溶液に希釈した一次抗体を、次に、室温で１時間、培養物に適用した。次に、一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０；Molecular Probes, Eugene, OR）、およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−アレキサ(Alexa)４８８（１：２５０；Molecular Probes）とともにブロックを含む二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。その後、培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ(Molecular Probes)を１０分間適用し、細胞核を可視化した。
免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡(Olympus, Melville, NY)にて、適当な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化した。全ての場合で陽性染色は、対照染色を超える蛍光シグナルを表し、その場合には、一次抗体溶液の適用を除き、前記で概略を示した全手順を続けた。代表的な画像を、デジタルカラービデオカメラとイメージプロ(ImagePro)ソフトウエア(Media Cybernetics, Carlsbad, CA)を用いて取り込んだ。三重染色サンプルについては、１回に放射フィルターを１つだけ用いて各画像を採取した。次に、アドビ・フォトショップ(Adobe Photoshop)ソフトウエア(Adobe, San Jose, CA)を用いて層状モンタージュを作製した。
Figure 0005425400
結果
ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地はＰＰＤＣの増殖を遅くし、形態を変化させる。プレーティング直後、ＰＰＤＣの一部は、ラミニンコートした培養フラスコに接着した。これは凍結／解凍に関する細胞死のため、または新たな増殖条件のためであると考えられた。接着した細胞は増殖条件中に見られるものとは異なる形態をとっていた。
密集した際、培養を継代培養し、増殖を観察した。継代培養で生存した細胞の拡大は極めて小さかった。この時点で、臍由来細胞の培養物では、拡がった形態を持たず、色相の明るい特徴を有する非常に小さな細胞が見られ始めた。このようなフラスコの領域は経時的に増えた。これらの小細胞から、それらの長手方向に沿って結節状構造とともに出現した分岐突起は、従前に記載されている脳および脊髄由来のＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋神経前駆体およびＴｕＪ１＋成熟ニューロンと極めて類似した特徴を有する（１、２）。時間が経つにつれ、これらの細胞はさらにニューロンらしくなり、やはりクローンにおいてのみ見られた。
臍由来細胞のクローンは神経タンパク質を発現する。解凍／プレーティング後１か月で培養物を固定し、神経タンパク質ＴｕＪ１および星状細胞で見られる中間体微細繊維であるＧＦＡＰに関して染色した。増殖培地で増殖させた全ての対照培養物およびＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地で増殖させたヒト繊維芽細胞およびＭＳＣはＴｕＪ１−／ＧＦＡＰ−であることが分かったが、臍および胎盤ＰＰＤＣではＴｕＪ１が検出された。神経様形態を持つ細胞でも持たない細胞でも拡大が見られた。いずれの培養物でもＧＦＡＰの発現は見られなかった。神経様形態を持つＴｕＪ１を発現する細胞のパーセンテージは全集団の１％以下であった（供試した臍由来細胞単離物ｎ＝３）。神経様形態を持たないＴｕＪ１＋細胞のパーセンテージは、数値化していないが、胎盤由来細胞培養物よりも臍由来細胞培養物で高かった。これらの結果から、増殖培地において特定の年齢適合対照がＴｕＪ１を発現しなかったことが明らかである。
要約。臍由来細胞から分化ニューロン（ＴｕＪ１の発現および神経形態学に基づく）を形成する方法が開発された。ＴｕＪ１の発現はインビトロでは１か月より早い時点では調べなかったが、臍由来細胞の少なくとも小さな集団は、誤った分化により、またはＬ−グルタミン、塩基性ＦＧＦ、およびＥＧＦを添加した最小培地に１か月曝した後の長期誘導により、ニューロンを生じ得ることは明らかである。
実施例１４の参照文献
Figure 0005425400
実施例１５
神経前駆体支持体のＰＰＤＣ栄養因子
非接触依存性（栄養性）機構による成体神経幹細胞および前駆細胞の生存および分化に対する臍由来細胞および胎盤由来細胞（ひとまとめにして産褥由来細胞またはＰＰＤＣ）の影響を調べた。
材料および方法
成体神経幹細胞および前駆細胞の単離。Ｆｉｓｈｅｒ ３４４成体ラットをＣＯ2窒息とその後の頸脱臼により犠牲にした。骨鉗子を用いて全脳を無傷な状態で取り出し、脳の運動および体性感覚領域後方の冠状切開により海馬組織を摘出した(Paxinos, G. & Watson, C. 1997. THE RAT BRAIN IN STEREOTAXIC COORDINATES)。組織を、Ｂ２７（Ｂ２７サプリメント；Invitrogen）、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ；Invitrogen）、およびペニシリン／ストレプトマイシン(Invitrogen)を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地(Invitrogen, Carlsbad, CA) （これらの組合せを本明細書では神経前駆体拡大（ＮＰＥ）培地と呼ぶ）で洗浄した。ＮＰＥ培地にはさらにｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ，Peprotech, Rocky Hill, NJ)およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ，Peprotech, Rocky Hill, NJ)を添加し、これを本明細書ではＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦと呼ぶ。
洗浄後、覆われている髄膜を除去し、組織をメスで細断した。細断した組織を集め、トリプシン／ＥＤＴＡ(Invitrogen)を全量の７５％として添加した。ＤＮアーゼ（１００μＬ／全量８ｍＬ，Sigma, St. Louis, MO）も加えた。次に、この組織／培地を１８ゲージニードル、２０ゲージニードル、最後に２５ゲージニードルに各１回順次通した（ニードルは全てBecton Dickinson, Franklin Lakes, NJから）。この混合物を２５０ｇで３分間遠心分離した。上清を除去し、新鮮なＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦを加え、ペレットを再懸濁させた。得られた細胞懸濁液を４０μｍ細胞濾過器(Becton Dickinson)に通し、ラミニンコートＴ−７５フラスコ(Becton Dickinson)または低クラスター２４ウェルプレート(Becton Dickinson)に入れ、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地中で、概略を示した研究に十分な細胞数が得られるまで増殖させた。
ＰＰＤＣプレーティング。従前に増殖培地で増殖させた産褥由来細胞（臍（０２２８０３）Ｐ１２、（０４２１０３）Ｐ１２、（０７１００３）Ｐ１２；胎盤（０４２２０３）Ｐ１２）を５，０００細胞／トランスウェルインサート（２４ウェルプレートの大きさ）で入れ、インサート中の増殖培地にて、密集するまで１週間増殖させた。
成体神経前駆体のプレーティング。ニューロスフェアとして、または単細胞として増殖させた神経前駆体を、細胞接着を促進するために１日、ラミニンコート２４ウェルプレートのＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ中に、およそ密度２，０００細胞／ウェルで播種した。１日後、産褥細胞を含むトランスウェルインサートを次のスキームに従って加えた。
（１）トランスウェル（増殖培地２００μＬ中の臍由来細胞）＋神経前駆体（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ，１ｍＬ）
（２）トランスウェル（増殖培地２００μＬ中の胎盤由来細胞）＋神経前駆体（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ，１ｍＬ）
（３）トランスウェル（成体ヒト皮膚繊維芽細胞［増殖培地２００μＬ中の１Ｆ１８５３；Cambrex, Walkersville, MD］Ｐ１２）＋神経前駆体（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ，１ｍＬ）
（４）対照：神経前駆体単独（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ，１ｍＬ）
（５）対照：神経前駆体単独（ＮＰＥ単独，１ｍＬ）
免疫細胞化学。共存培養７日後、全ての条件を室温で１０分間、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド(Sigma)で固定した。免疫細胞化学法は、表１５−１に一覧化されているエピトープに対する抗体を用いて行った。要するに、培養物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原に接近するため、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清(Chemicon, Temecula, CA)、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトン Ｘ−１００；Sigma）を含有するタンパク質遮断溶液に３０分間曝した。遮断溶液に希釈した一次抗体を、次に、室温で１時間、培養物に適用した。次に、一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０；Molecular Probes, Eugene, OR）、およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−アレキサ(Alexa)４８８（１：２５０；Molecular Probes）とともに遮断溶液を含む二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。その後、培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ(Molecular Probes)を１０分間適用し、細胞核を可視化した。
免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡(Olympus, Melville, NY)にて、適当な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化した。全ての場合で陽性染色は、対照染色を超える蛍光シグナルを表し、その場合には、一次抗体溶液の適用を除き、前記で概略を示した全手順を続けた。代表的な画像を、デジタルカラービデオカメラとイメージプロ(ImagePro)ソフトウエア(Media Cybernetics, Carlsbad, CA)を用いて取り込んだ。三重染色サンプルについては、１回に放射フィルターを１つだけ用いて各画像を採取した。次に、アドビ・フォトショップ(Adobe Photoshop)ソフトウエア(Adobe, San Jose, CA)を用いて層状モンタージュを作製した。
Figure 0005425400
神経前駆体分化の定量分析。海馬神経前駆体分化の定量化を検討した。各条件につき最低１０００細胞を計数し、少ない場合には、その条件で見られた細胞の総数とした。所与の染色について陽性の細胞のパーセンテージを、陽性細胞数をＤＡＰＩ（核）染色により判定された細胞総数で割ることにより評価した。
質量分析および２Ｄゲル電気泳動。共存培養の結果としてユニークな分泌因子を同定するため、細胞馴化培地サンプルを採取した後、培養し、固定物を−８０℃で一晩凍結させた。次に、サンプルを限外濾過スピンデバイス（カットオフ分子量３０ｋＤ）に適用した。保持液を免疫アフィニティークロマトグラフィー（抗Ｈｕ−アルブミン；ＩｇＹ）に適用した（免疫アフィニティーはこれらのサンプルからアルブミンを除去しなかった）。濾液をＭＡＬＤＩで分析した。透過物をＣｉｂａｃｈｒｏｎ Ｂｌｕｅアフィニティークロマトグラフィーに適用した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび２Ｄゲル電気泳動により分析した。
結果
ＰＰＤＣ共存培養は成体神経前駆体分化を刺激する。臍由来細胞または胎盤由来細胞とともに培養した後、成体ラット海馬由来の共存培養神経前駆細胞は、中枢神経系の主要な３つの系統全てへ有意な分化を示した。この効果は共存培養５日後に明らかに見られ、多くの細胞が複雑な突起を作り出し、分裂中の前駆細胞の特徴である色相の明るさが失われていた。ｂＦＧＦおよびＥＧＦの不在下で単独で増殖した神経前駆体は健康さを欠き、生存も限られていた。
この手順が完了した後、培養物を未分化幹細胞および前駆細胞（ネスチン）、未熟および成熟ニューロン（ＴｕＪ１）、星状細胞（ＧＦＡＰ）、および成熟乏突起神経膠細胞（ＭＢＰ）の指標となるマーカーに関して染色した。３つ全ての系統への分化が確認されたが、対照条件は、大多数の細胞にネスチン陽性染色が保持されていたことを証拠として、有意な分化を呈していなかった。臍由来細胞および胎盤由来細胞の双方が細胞の分化を誘導したが、３つの全ての系統の分化程度は、臍由来細胞と共存培養した場合よりも胎盤由来細胞と共存培養した場合の方が低かった。
臍由来細胞と共存培養した後の、分化した神経前駆体のパーセンテージを定量化した（表１５−２）。臍由来細胞は成熟乏突起神経膠細胞（ＭＢＰ）の数を有意に増加させた（両対照条件の０％に対し、２４．０％）。さらに、共存培養は、培養ＧＦＡＰ＋星状細胞およびＴｕＪ１＋ニューロンの数を増加させた（それぞれ４７．２％および８．７％）。これらの結果はネスチン染色により確認されたが、このことは共存培養後に前駆体状態が失われたことを示す（対照条件４の７１．４％に対し、１３．４％）。
分化はまた成体ヒト繊維芽細胞によっても影響を受けるものと思われたが、このような細胞は成熟乏突起神経膠細胞の分化を促進することはできず、感知できる量のニューロンを生成することもできなかった。しかしながら、定量しなかったものの、繊維芽細胞は神経前駆体の生存を高めるものと思われた。
Figure 0005425400
ユニークな化合物の同定。臍由来および胎盤由来共存培養からの細胞馴化培地と、適当な対照（ＮＰＥ培地±１．７％血清、繊維芽細胞との共存培養からの培地）との違いを検討した。潜在的にユニークな化合物が同定され、個々の２Ｄゲルから切り出した。
要約。成体神経前駆細胞と臍または胎盤ＰＰＤＣとの共存培養は、これらの細胞の分化をもたらす。本実施例に示されている結果は、臍由来細胞と共存培養した後の成体神経前駆細胞の分化が特に顕著であることを示す。特に、成熟乏突起神経膠細胞の有意なパーセンテージのものが、臍由来細胞分化の共存培養において生じた。臍由来細胞と神経前駆体の間には接触が見られないという点で、この結果は臍由来細胞から放出された可溶性因子の働きであるものと思われる（栄養作用）。
他の所見もいくつか得られた。第一に、ＥＧＦおよびｂＦＧＦが除かれた対照条件では極めて少数の細胞しか存在しなかった。ほとんどの細胞が死滅し、平均してウェル当たりに約１００細胞以下しか存在しなかった。第二に、ＥＧＦおよびｂＦＧＦが培地に保持された対照条件では、これは通常、拡大培地であることから、ごく少数の分化しか見られないと予測される。約７０％の細胞がそれらの前駆体状態（ネスチン＋）を保持していることが観察され、約３０％がＧＦＡＰ＋（星状細胞の指標）であった。これは、この手順の過程で見られるこのような有意な拡大が前駆体どうしを接触させ、このような分化を誘導したことによるものである可能性がある(Song, H.ら2002. Nature 417:6884 39-44)。
実施例１６
産褥由来細胞の移植
産褥臍および胎盤由来の細胞は、再生治療に有用である。ＳＣＩＤマウスに生分解性材料とともに移植された産褥由来細胞（ＰＰＤＣ）によって産生された組織を評価した。評価した材料は、不織ビクリル(Vicryl non-woven)（ＶＮＷ）、３５／６５ ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体、およびＲＡＤ １６自己集合ペプチドヒドロゲルであった。
方法および材料
細胞培養。胎盤由来細胞および臍由来細胞をゼラチンコートフラスコの増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース(Gibco, Carlsbad CA)、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（カタログ番号ＳＨ３００７０．０３；Hyclone, Logan, UT）、０．００１％（ｖ／ｖ）βメルカプトエタノール(Sigma, St. Louis, MO)、ペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco)）中で増殖させた。
サンプルの調製。１×１０6個の生細胞を、直径５ｍｍ、厚さ２．２５ｍｍのＶＮＷスキャフォールド（６４．３３ｍｇ／ｃｃ；ロット番号３５４７−４７−１）または直径５ｍｍの３５／６５ ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体（ロット番号３４１５−５３）の１５μＬ増殖培地中に播種した。細胞を２時間接着させた後、スキャフォールドを覆うようにさらなる増殖培地を加えた。細胞をスキャフォールド上で一晩増殖させた。また、細胞を含まないスキャフォールドも培地中でインキュベートした。
ＲＡＤ１６自己集合ペプチド（３Ｄマトリックス，Cambridge, MA、生物遺伝資源提供同意下）を水中１％（ｗ／ｖ）の無菌溶液として得、これを使用直前にダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Gibco）中、１０％（ｗ／ｖ）スクロース(Sigma, St Louis, MO)、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ中の１×１０6細胞と１：１で混合した。ＲＡＤ１６ヒドロゲル中の細胞の終濃度は１×１０6細胞／１００μＬとした。
Figure 0005425400
動物の準備。動物福祉法の現行の要件に従って、動物を取扱いおよび維持した。前記公法の応諾は、動物福祉規則（９ＣＦＲ）を遵守し、動物実験に関する指針(The Care and Use of Laboratory Animals)第７版に公布された現行標準に従うことにより遂行した。
マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）／Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤ／雄(Harlan Sprague Dawley, Inc., Indianapolis, Indiana)５週齢。ＳＣＩＤマウスの取扱いは全てフード内で行った。マウスを個々に秤量し、６０ｍｇ／ｋｇ ＫＥＴＡＳＥＴ（塩酸ケタミン，Aveco Co., Inc., Fort Dodge, Iowa）および１０ｍｇ／ｋｇ ＲＯＭＰＵＮ（キシラジン，Mobay Corp., Shawnee, Kansas）と生理食塩水の混合物の腹腔内注射により麻酔した。麻酔誘導後、動物用電気バリカンを用い、背側頸部領域から背側腰仙領域まで動物の背全体の毛を刈った。次に、これらの領域を二酢酸クロルヘキシジンでこすり洗いし、アルコールですすぎ、乾燥させ、利用可能ヨウ素１％のヨードフォア水溶液を塗布した。麻酔期間中、組織の乾燥を防ぐため、眼には眼用軟膏を塗布した。
皮下移植技術。マウスの背で各約１．０ｃｍ長の４つの皮膚切開部を作った。２つの頭蓋部位を背側部の胸部領域の、触診した肩胛骨の下端より５ｍｍ尾側となるように横断し、一方は脊柱の左、もう一方は右になるように置いた。別の２つは、臀筋領域を、尾の仙腰レベルで、触診した腸骨稜より約５ｍｍ尾側となるように横断し、各々正中の各側にくるように置いた。実験計画に従い、インプラントをこれらの部位に無作為に置いた。皮膚を下層の結合組織から分離し、小さなポケットを作り、インプラントをその切開部の約１ｃｍ尾側に置いた（またはＲＡＤ１６の場合には注入した）。適当な供試材料を皮下空間に移植した。皮膚の切開部は金属クリップで閉じた。
動物の飼育。マウスは実験過程では個々に小型隔離ケージで、温度範囲６４°Ｆ〜７９°Ｆ、相対湿度３０％〜７０％で飼育し、約１２時間明期／１２時間暗期の周期で維持した。可能性を最大限とするため、温度および相対湿度は記載の範囲内に維持した。食餌はＩｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｐｉｃｏ Ｍｏｕｓｅ Ｃｈｏｗ ５０５８(Purina Co.)からなり、水は自由摂取とした。
マウスを示された期間に二酸化炭素吸入により安楽死させた。皮下移植部位を覆われている皮膚とともに切り取り、組織学のために凍結させた。
組織学。インプラントとともに切り取った皮膚を１０％中性緩衝ホルマリン(Richard-Allan Kalamazoo, MI)で固定した。サンプルを覆われている、または隣接する組織とともに中央で二分し、パラフィン処理を施し、情報を用いて切断面に包埋した。ミクロトームにより５μｍの組織切片を得、常法を用い、ヘマトキシリンおよびエオジン(Poly Scientific Bay Shore, NY)で染色した。
結果
３０日後、ＳＣＩＤマウスに皮下移植された発泡体（細胞を含まない）には最小の組織内植しか見られなかった。これに対し、臍帯由来細胞または胎盤由来細胞とともに移植された発泡体には著しい組織充填が見られた。ＶＮＷスキャフォールドでは、ある程度の組織の内植が見られた。臍由来細胞または胎盤由来細胞を播種した不織スキャフォールドは、高いマトリックス接着と成熟血管を示した。
要約。合成吸収性不織／発泡体ディスク（直径５．０ｍｍ×厚さ１．０ｍｍ）または自己集合ペプチドヒドロゲルにヒト臍または胎盤いずれかに由来する細胞を播種し、ＳＣＩＤマウスの背棘領域の両側に皮下移植した。これらの結果は、産褥由来細胞は生分解性スキャフォールドにおける質の良い組織形成を劇的に高め得ることを示した。
実施例１７
神経修復における産褥由来細胞の使用
網膜神経節細胞（ＲＧＣ）病巣は、成体哺乳類ＣＮＳにおける様々な修復戦略のモデルとして広く用いられている。成体齧歯類ＲＧＣ軸策の眼球後切片では、出芽不全が起こり(Zengら, 1995)、親細胞集団の死滅が進行する(Villegas-Perezら, 1993)ことが示されている。多くの研究が、軸策切断されたＲＧＣの生存およびそれらの軸策の再生に対する種々の外因性および内因性因子の刺激作用が証明している(YipおよびSo, 2000; Fischerら, 2001)。さらに、細胞移植を用いて、断裂した神経軸策の再生を促進することができることを実証した研究もある(Liら,"Transplanted Olfactory Ensheathing Cells Promote Regeneration Of Cut Adult at Optic Nerve Axons", J. of Neuro., 2003; 23(21): 7783-7788)。よって、これら、および他の研究は、脊髄、末梢神経、陰部神経、視神経に影響を及ぼす神経障害、または神経の損傷が起こり得る傷害による他の疾病／外傷の治療のために、細胞に基づく方法を使用することができることを実証した。
自己集合ペプチド（ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（商標），米国特許第５，６７０，４８３号、同第５，９５５，３４３号、ＵＳ／ＰＣＴ出願第ＵＳ２００２／０１６０４７１号、国際出願第０２／０６２９６９号）は、３Ｄで細胞を接着させるため、２Ｄコーティングにおいて細胞をプレーティングするためのスキャフォールドとして、または懸濁培養の微小担体として働くように開発されたものである。三次元細胞培養は、固有の再生性と細胞のシグナル伝達問題を伴う動物由来材料（マウス肉腫抽出物）か、または物理的ナノメータースケールおよび天然ＥＣＭの化学的特性に近づけることができないはるかに大きな合成スキャフォールドのいずれかを必要とした。ＲＡＤ１６（ＮＨ２−（ＲＡＤＡ）3−ＣＯＯＨ）およびＫＬＤ（ＮＨ２−（ＫＬＤＬ）3−ＣＯＯＨ）は、インビボ細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と同様のスケールでナノ繊維へと自己集合する小さな（ＲＡＤ１６は５ｎｍ）オリゴペプチド断片に合成される（3D Matrix, Inc Cambridge, MA）。自己集合は培養培地または生理環境中に見られる一価または二価陽イオンによって開始される。本実施例に記載のプロトコールでは、ＲＡＤ１６は眼の欠損部に産褥細胞の移植を行うための微小担体として使用した。本実施例では、産褥由来細胞ＰＰＤＣの移植が成体ラット視神経軸策再生モデルにおいて有効性をもたらし得ることが実証される。
方法および材料
細胞。ヒト成体ＰＰＤＣ（臍および胎盤）および繊維芽細胞（継代培養１０代目）を１継代の間拡大培養した。まず、全細胞を、ゼラチンコートＴ７５フラスコの、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬアムホテリシンＢ(Invitrogen, Carlsbad, CA)を含む増殖培地中に５，０００細胞／ｃｍ2で播種した。継代培養１１代目に細胞をトリプシン処理し、トリパンプルー染色を用いて生存率を決定した。要するに、５０μＬの細胞懸濁液を０．０４％ｗ／ｖのトリパンプルー(Sigma, St. Louis, MO)５０μＬと合わせ、血球計を用い、生細胞数を評価した。次に、細胞をサプリメントフリーのＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)で３回洗浄した。その後、細胞を、製造業者の奨励に従って緩衝させ、等張とした２５μＬのＲＡＤ−１６(3DM Inc., Cambridge, MA)中に２００，０００細胞の密度で懸濁させた。１００μＬのサプリメントフリーＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地をこの細胞／マトリックス懸濁液の上に加え、使用まで湿潤状態を維持させた。これらの細胞／マトリックス培養は、移植を行うまで、標準的大気条件下で維持した。移植の時点で余分な培地を除去した。
動物および外科術。Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｓメスラット（体重２２０〜２４０ｇ）を使用した。腹腔内トリブロモエタノール麻酔下（２０ｍｇ／体重１００ｇ）、視神経を露出させ、視神経鞘を視神経円板から約２ｍｍのところで眼内切開し、この神経鞘から神経を引き上げ、鋭利なハサミで完全に分断した(Liら, 2003)。分断が完全であることを、近位端と遠位端が完全に離れていることを目で確かめることにより確認した。対照は移植を行わない傷害ラットとした。移植ラットでは、ＲＡＤ−１６に播種した培養産褥細胞が、一対の微小鉗子を用い、近位端と遠位端の間に挿入された。ＲＡＤ−１６中、約７５，０００細胞がこの断裂視神経に移植された。一対の微小鉗子を用い、細胞／マトリックスを断裂部に塗布した。この断裂視神経鞘を１０／０ブラック単繊維ナイロン(Ethicon, Inc., Edinburgh, UK)で縫合した。よって、ギャップは、この神経の切断された近位端と遠位端を互いに近接して引っ張ることにより閉じた。
細胞注入を行った後、移植後１０日間、動物にデキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ）を注射した。試験期間、移植２日前から試験終了時まで、経口シクロスポリンＡ（２１０ｍｇ／Ｌ飲料水；この結果として血中濃度２５０〜３００μｇ／Ｌ）(Bedford Labs, Bedford, Ohio)で動物を維持した。食物および水は自由摂取とした。動物を移植後３０日または６０日に犠牲にした。
ＣＴＢ適用。動物を犠牲にする３日前に、麻酔下で、３０〜５０ｍｍチップを有するガラス製マイクロピペットをレンズ後方の強膜から接線に沿って挿入し、１％逆行トレーサー−コレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）水溶液(List Biologic, Campbell, CA)４〜５μＬアリコートを２回、硝子体に注射した。動物に固定液を潅流させ、同じ固定液で１時間、指針液を採取した。これらの視神経を一晩スクロース中に移した。２０μｍのクリオスタット切片を０．１モルグリシン中で３０分間インキュベートし、２．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）(Boeringer Mannheim, Mannheim, Germany)および０．５％トリトンＸ−１００(Sigma, St. Louis, MO)を含有するＰＢＳ溶液、その後、ＰＢＳ中２％正常ウサギ血清（ＮＲＳ）(Invitrogen, Carlsbad, CA)、２．５％ＢＳＡ、および２％トリトンＸ−１００(Sigma, St. Louis, MO)を含有するＰＢＳで１：４０００希釈したヤギ抗ＣＴＢ抗体(List Biologic, Campbell, CA)を含有する溶液で遮断し、ＰＢＳ中２％トリトン−Ｘ１００で１：２００希釈したビオチン化ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体(Vector Laboratories, Burlinghame, CA)中、室温で２時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ中、１：２００ストレプトアビジン−グリーン(Alexa Flour 438;Molecular Probes, Eugene, OR)中、室温で２時間染色を行った。次に、染色された切片をＰＢＳで洗浄し、共焦顕微鏡用にヨウ化プロピジウムで対比染色した。
組織学的調製物。要するに、ＣＴＢ注射から５日後に、ラットに４％パラホルムアルデヒドを潅流させた。ラットに４ｃｍ3のウレタンを与え、その後、ＰＢＳ（０．１モル）、次いで４％パラホルムアルデヒドを潅流させた。脊髄を切断し、頭部から骨を除去し、小丘を露出させた。次に、小丘を摘出し、４％パラホルムアルデヒド中に入れた。眼の外周を切り取り、できるだけ後ろへやるようにして眼を摘出した。眼の裏側にある視神経を切断しないように注意した。眼を摘出し、筋肉を切断して視神経を露出させ、次にこれを４％パラホルムアルデヒド中に入れた。
結果
傷害単独。視神経の眼球後(retrotubular)切片後１か月、網膜に付着した神経セグメントにおいて複数のＣＴＢ標識された軸策が確認された。切断部に最も近い２００μｍでは、軸策は、主軸と直角にいくつかの分枝を出しており、切断面は神経腫状の絡み合った状態で終わっているのが見られた。近位端と遠位端の間のこの切断部では、ギャップは、血管化した結合組織の２〜３ｍｍのセグメントにより段階的に架橋されているのが見られたが、この架橋領域への軸策の進展は見られなかった。よって、傷害だけを受けた動物では、遠位端に達するような軸策の成長は見られなかった。
ＲＡＤ−１６の移植。切断部にＲＡＤ−１６を移植した後、血管化した結合組織の目に見える内植が認められた。しかし、近位端と遠位端の間に内植が見られた軸策は無かった。これらの結果は、このような状況では、ＲＡＤ−１６単独の適用では、軸策の再生を誘導するに十分なものではなかったことを示す。
産褥由来細胞の移植。断裂視神経への産褥由来細胞の移植は、視神経の再成長を刺激した。繊維芽細胞が移植された条件でもある程度の再成長が見られたが、これは移植胎盤由来細胞で見られた再成長に比べると最小のものであった。視神経の再成長は胎盤由来細胞を移植した４／５の動物で、成体皮膚繊維芽細胞を移植した３／６の動物で、また、臍由来細胞を移植した１／４の動物で見られた。再成長が見られた場合、ＣＴＢ標識により、網膜神経節細胞軸策が確認され、これは移植領域へと浸透することが証明された。また、神経膠細胞の瘢痕化のレベルを決定するため、ＧＦＡＰ標識も行った。このＧＦＡＰ発現は近位端で増強され、いくらかの免疫染色が神経支配された移植片に見られた。
要約。これらの結果は、移植ヒト成体産褥由来細胞は切断された網膜神経節細胞軸策の再生を刺激し、導くことができる。
実施例１７の参照文献
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実施例１８
一過性中大脳動脈閉塞脳卒中に対するＰＰＤＣ処置の効果
産褥由来細胞を、２時間中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ）を受けたラットで評価した。機能回復に関する挙動試験を種々の時点で行い、ビヒクルおよび間葉幹細胞対照と比較した。改善ならびに組織および細胞レベルの評価を行うため、犠牲時に組織学的研究を行った。
材料および方法
細胞の調製および移植。産褥臍由来細胞およびヒト間葉幹細胞(Cambrex, PT2501)を自家培養した後、研究施設に送り、移植当日にそれらを解凍および処理した。細胞を３７℃の水浴で解凍し、１５ｍＬ試験管内の１０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞をＰＢＳに再懸濁させた。細胞は移植まで氷上で維持し、トリパンプルー染色により生存率を調べた。この研究では、細胞の生存率はＰＰＤＣでは平均８０％、ＭＳＣでは９２％であった。
虚血後１日目に、無作為に選択した動物に細胞移植を行った。動物をＮ２Ｏ：Ｏ２（２：１）中、３．５％のハロタンで麻酔し、フェースマスクにより０．５％ハロタンで維持した。各実験群に、２ｍＬＰＢＳ中に懸濁させた細胞、ＰＢＳ単独を尾の静脈注射を投与した（２７Ｇ１／２，B-D Precision Glide）。これら４群（Ｎ＝８／群）は、ＰＰＤＣ１×１０6個（Ｕ１）、ＰＰＤＣ３×１０6個（Ｕ３）、ＭＳＣ３×１０6個（ＭＳＣ）、およびＰＢＳビヒクル対照であった。免疫抑制剤は適用しなかった。
一過性中大脳動脈閉塞。管腔内血管閉塞(Chenら,1992)の改変法を用い、２か月〜３か月齢のウィスターラット（雄、２７０〜３００ｇ）に中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ）を誘発した。要するに、ラットをＮ２Ｏ：Ｏ２（２：１）中、３．５％のハロタンで麻酔し、フェースマスクにより０．５％ハロタンで維持した。右総頚動脈、外頚動脈および内頚動脈を露出した。動物の体重によって１８．５〜１９．５ｍｍまでの長さの３−０単繊維ナイロン糸（炎に近づけて加熱することで先端を丸くしたもの）を外頚動脈から内頚動脈の管腔内へ、ＭＣＡの起点を遮断するまで入れた。ＭＣＡｏから２時間後に、この糸をその先端が内頚動脈から抜けるまで引き抜くことにより再潅流を行った。
神経機能試験。ＭＣＡｏの前（基準）、ＭＣＡｏから１日後および１週間後に、試験群が盲検化された試験者が４種類の挙動試験を行った。
改変神経学的重篤度スコア(Modified neurological severity score) （ｍＮＳＳ）は、運動、感覚、平衡および反射試験の混成である(Chenら, 2001)。神経機能を０〜１８のスコア（正常スコア０；最大欠陥スコア１８）に等級付けし、特定の異常挙動の提示または試験反射の欠如に対して１点が与えられている。正常機能の障害が大きいほど、高いスコアとなる。
フットフォールト試験では、ラットの前肢の配置不全が試験された(Zhangら, 2002)。ラットを大きさの異なる、登っていく六角形のグリッドに置いた。このグリッドを渡るのに用いた段階の総数を数え、各前肢のフットフォールト総数を記録した。ＭＣＡｏを有する動物において、障害のある（対側性）肢は非障害性の肢よりもフォールトが多いということが十分確立されている。
接着剤除去パッチテストには、各前肢の遠位橈骨に対する両側性の触覚刺激と同じ大きさ（１１３．１ｍｍ2）の、裏に接着剤の付いたペーパードットの使用が必要である(Schallertら, 1997)。外科術前に３日間、ラットに接着剤を剥がす練習をさせた。ラットが１０秒以内に接着ドットを剥がすことができれば、それらのラットにＭＣＡｏを施した。ＭＣＡｏ後、両前肢から各刺激を取り除く時間を１日３回記録した。各回は少なくとも５分離した。
コーナー試験は感覚機能および運動機能を測定し、長期の感覚欠陥および運動欠陥に感受性が高い(Zhangら, 2002)。コーナーへの進入を促すよう接合部に小さな隙間を設け、３０°で取り付けた２つのボード（寸法３０×２０×１ｃｍ3）の間にラットを置いた。コーナーに深く進入すると両方の震毛がともに刺激されるようにコーナーに面してラットを置いた。ラットは後肢で立って前方および上方を向いた後、開口端に向き直る。健康で無傷なラットは右を向いたり左を向いたりするが、これに対し、ＭＣＡｏ傷害ラットは優先的に傷害のない側を向く。他の方向に対して、ある方向を向く回数を、各試験１０回から記録し、向きのパーセンテージをコーナー試験スコアとして用いた。
脳切片の調製。細胞集団を同定するため、ＭＣＡｏ後の連続１４日間、全てのラットに毎日、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ，５０ｍｇ／ｋｇ，Sigma, St, Louis MO）の腹腔内注射を施した。ラットの脳を、生理食塩水を用いた経心腔的潅流、その後の４％パラホルムアルデヒドでの潅流および浸漬により固定した。ラット脳マトリックス(Activational Systems Inc., Warren, MI)を用い、各前脳を各動物につき、前頂５．２ｍｍ〜前頂−８．８ｍｍの計７ブロックの、厚さ２ｍｍの冠状ブロックに切断した(PaxinosおよびWatson 1986 The rat brain in stereotaxic coordinated, 2nd Ed. Sydney; Orlando. Academic Press)。これらの組織をパラフィンに包埋し、６μｍ厚の連続スライドを作製した。
梗塞領域の測定。７ブロックからの各冠状パラフィンスライド（６μｍ厚）の１つをヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。Global Lab Image analysis system (Data Translation, Malboro, MA)を用い、７つの脳スライドを追跡した。反対側の半球領域から同側半球の無傷な領域を差し引いた間接的病変領域が算出された(Swansonら, 1990)。病変部の容積は、反対側の半球に対する病変部の容積パーセンテージとして表される。
免疫組織化学的評価。前頂−１〜１ｍｍの冠状座標に対応する病変部のセンターから標準的なパラフィンブロックを得た。光学・蛍光顕微鏡(Olympus, BH-2)により分析するため、このブロックから６μｍ厚の連続切片をとった。グラフトされたヒト細胞を同定するため、マウス抗ヒト核モノクローナル抗体（ｍＡｂ １２８１，Chemicon International, Inc）を１：３００のタイターで使用した。増殖細胞を識別するため、マウス抗体(Dako)を１：１００のタイターで適用した。ヒト核またはＢｒｄＵと細胞種特異的マーカー（ニューロンに対してはＮｅｕＮ、１：５００希釈；星状細胞に対しては膠原繊維酸性タンパク質ＧＦＡＰ、１：５０００希釈）との細胞内同時局在を可視化するため、二重染色を行った。さらに、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ，１：４００，Dako）およびシナプトフィシン（１：５００，Chemicon）に対する抗体を用いて、それぞれ血管およびシナプスを同定した。
アポトーシス細胞染色。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ｄＵＴＰ−ビオチンニックおよび標識（ＴＵＮＥＬ）法（in situアポトーシス検出キット，Chemicon）を用い、in situアポトーシス検出を評価した(Liら, 1998, Liら, 1995)。ＴＵＮＥＬ法は、ＴｄＴとＤＮＡの３’−ＯＨ末端との特異的結合およびポリデオキシヌクレオチドポリマー細胞の合成の確保に基づくものである。染色は製造業者のプロトコールに従って行った。
細胞の定量。ドナーヒト細胞およびアポトーシス細胞を定量するため、切片ごとに同側半球のアポトーシス細胞の数を計数した。血管およびシナプス密度の測定のため、ＭＣＩＤコンピューター画像解析システムにて対物４０倍を用い、虚血性周縁部からの８視野をデジタル処理した。各視野について、血管の数ならびに虚血性境界区域（ＩＢＺ）におけるシナプトフィシンの陽性領域を計数した。
結果
神経機能の転帰。脳卒中から１日後の全ての動物において重篤な挙動欠陥が明らかであった。ＭＣＡｏを施した全てのラットは、ＭＣＡｏ後２８日まで経時的に進行する挙動回復を示した（表１８−１）。全ての機能試験において、ＭＣＡｏ前の群間では、挙動試験における有意差は検出されなかった。ＭＣＡｏ後２８日では、ｍＮＳＳ損傷は軽度から中度へ進行し、ＰＢＳ対照に比べ、細胞処理群ではｍＮＳＳに統計学的に有意な改善が見られた（Ｕ１に対してはｐ＝０．０１、Ｕ３に対してはｐ＝０．１、およびＭＳＣに対してはｐ＝０．０２）。また、記録されたフットフォールトのパーセンテージも、細胞療法を受けたラットにおいては統計学的に有意なように減少した（Ｕ１に対してはｐ＝０．０２、Ｕ３に対してはｐ＝０．０６、およびＭＳＣに対してはｐ＝０．０１）。
接着剤除去およびコーナー試験では、有意差は見られなかった。全ての群で動物の体重は、ＭＣＡｏ直後に同様の低下傾向を示し、その後、最初の１週間は安定増加した。
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梗塞容積。表１８−２に示されるように、４群の全てで、反対側半球に対する病変部の容積パーセンテージに有意な差は検出されなかった。
Figure 0005425400
組織学。脳のドナー細胞。脳組織内で、ヒト細胞を、ヒト特異的抗体ｍＡｂ１２８１により同定された丸〜卵形の核により同定された。ドナー細胞は生存し、レシピエントラットの虚血性損傷脳全域に分布していた。脳切片の免疫組織化学的二重染色により、約１％のヒトｍＡｂ１２８１陽性細胞は、神経マーカーＮｅｕＮ、および星状細胞マーカーＧＦＡＰと反応性があることが明らかになった（表１８−２）。
虚血脳における神経形成。チミジン類似体であるＢｒｄＵはＳ期の細胞に組み込むことができ、脳室下領域（ＳＶＺ）のＢｒｄＵ−陽性細胞は、増殖を受ける前駆細胞であると考えられる。この研究では、高い用量で処置したラットは、同側半球におけるＳＶＺの増殖増加を示した。ＳＶＺにおける前駆細胞は増殖状態で留まり得るか、またはそれらは細胞周期を出て、機能的脳細胞へと分化することができる。神経前駆細胞の前記特性は損傷または疾病後の脳の自己修復に結びついていることから、ＢｒｄＵおよびＧＦＡＰまたはＮｅｕＮの二重染色を行い、約５％のＢｒｄＵ陽性細胞がＧＦＡＰまたはＮｅｕＮを発現したことが示された（表１８−２）。
脈管形成。虚血性境界区域（ＩＢＺ）における肥大した、壁の薄い血管の存在は、脈管形成の指標となる(Zhangら(2002) J. Cereb. Blood Metab. 22:379-92)。細胞処理は、ＰＢＳビヒクル対照に比べてＩＢＺでは、血管数が１７〜２５％だけ増加することが認められた（表１８−２）。
シナプス形成。前シナプス小胞タンパク質であるシナプトフィシンがシナプス形成の指標として用いられる(Ujikeら(2002) Ann. Ny Acad. Sci. 965:55-67)。この研究では、ＩＢＺにおけるシナプトフィシン発現の増加が細胞の処理とともに観察された（表１８−２）。
細胞アポトーシスおよび細胞死の軽減。ＴＵＮＥＬ染色は、典型的な暗褐色で、丸または卵形のアポトーシス小体を有するアポトーシス細胞が損傷組織全域に存在していたことを示したが、大多数のアポトーシスはＩＢＺまたはＳＶＺに存在した。同側半球のアポトーシス細胞の数は、Ｕ１細胞を受容したマウスでは５１％、Ｕ３およびＭＳＣ処理ラットでは３８％だけ低下した（ＰＢＳ対照に比べ、Ｕ１ではＰ＜０．０１、ＭＳＣおよびＵ３ではＰ＜０．０５）（表１８−２）。
要約。ＰＰＤＣは脳卒中の処置に有用であることが証明された。細胞療法は、より高い運動−感覚スコアにより証明される神経機能の改善をもたらした。ＭＣＡｏ後に尾の静脈へ投与されたＰＰＤＣは虚血性脳組織へ流入し、免疫抑制剤を伴わずに細胞注射した後、少なくとも２８日間生存した。これらの積極的な作用はＭＣＡｏ後２１日で統計的に有意となり、観察の最終日まで（外科術後２８日）持続した。ＰＰＤＣ細胞で処置したラットの同側半球では有意に多い微小血管が存在していた（対照動物に比べ、Ｐ＜０．０５）。ＰＰＤＣ処置はまた、ＭＣＡｏ後２８日において同側半球におけるアポトーシス細胞の数を有意に減少させた。
実施例１８の参照文献
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実施例１９
内皮細胞ネットワーク形成アッセイ
脈管形成、すなわち、新たな血管の形成は、新しい組織の増殖に必要である。脈管形成の誘導は、多くの病態において重要な治療目標である。本研究はインビトロアッセイにおいて産褥由来細胞の潜在的脈管形成活性の同定をねらいとした。本研究は基底膜抽出物であるＭＡＴＲＩＧＥＬ(BD Discovery Labware, Bedford, MA)でコートした培養プレートに内皮細胞を播種するという十分確立された方法に従った(NicosiaおよびOttinetti (1990) In Vitro Cell Dev. Biol. 26(2): 119-28)。ＭＡＴＲＩＧＥＬ(BD Discovery Labware, Bedford, MA)上の内皮細胞を脈管形成因子で処理すると、毛細管に類似するネットワークを形成するよう細胞が刺激される。このことは、血管形成の刺激剤および阻害剤を試験するためのインビトロアッセイで一般的である(Itoら(1996) Int. J. Cancer 67(1): 148-52)。本研究では、培養ウェルインサート上に播種された産褥由来細胞との共存培養系を用いた。これらの透過性インサートは、内皮細胞培養培地と産褥由来細胞培養培地の間の培地成分の受動的交換を可能とする。
方法および材料
細胞培養。
産褥組織由来細胞。ヒト臍帯および胎盤を受け取り、従前に記載したように細胞を単離した（実施例１）。細胞を、ゼラチンコート組織培養プラスチックフラスコの増殖培地（ダルベッコの改変必須培地（ＤＭＥＭ；Invitrogen, Carlsbad, CA）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清(Hyclone, Logan UT)、１００単位／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン(Invitrogen)、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール(Sigma, St. Louis, MO)）で培養した。培養物は３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。実験に用いた細胞は継代培養４代〜１２代の間のものであった。
活発に増殖している産褥細胞をトリプシン処理し、計数し、ＣＯＳＴＡＲ ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ ６．５ｍｍ径組織培養インサート(Corning, Corning, NY)上にインサート１つ当たり１５，０００細胞を播種した。標準増殖条件下、３７℃、増殖培地中のこのインサート上で、４８〜７２時間細胞を培養した。
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）。ｈＭＳＣはCambrex (Walkersville, MD)から購入し、ＭＳＣＧＭ(Cambrex)で培養した。培養物は標準増殖条件下でインキュベートした。
活発に増殖しているＭＳＣをトリプシン処理し、計数し、ＣＯＳＴＡＲ ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ ６．５ｍｍ径組織培養インサート(Corning, Corning, NY)上にインサート１つ当たり１５，０００細胞を播種した。標準増殖条件下、増殖培地中のこのインサート上で、４８〜７２時間細胞を培養した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）。ＨＵＶＥＣはCambrex (Walkersville, MD)から入手した。細胞を、ＥＢＭまたはＥＧＭ内皮細胞培地(Cambrex)のいずれかで個別の培養物として増殖させた。細胞を、標準増殖条件下、標準的な組織培養プラスチック上で増殖させた。アッセイに用いた細胞は継代培養４代〜１２代の間のものであった。
ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）。ＨＣＡＥＣはCambrex Incorporated (Walkersville, MD)から購入した。これらの細胞はまた、ＥＢＭまたはＥＧＭ培地処方物のいずれかで個別の培養物として維持した。細胞を、標準増殖条件下、標準的な組織培養プラスチック上で増殖させた。実験に用いた細胞は継代培養４代〜８代の間のものであった。
内皮細胞ネットワーク形成（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）アッセイ。培養プレートを、製造業者の使用説明書に従い、ＭＡＴＲＩＧＥＬ(BD Discovery Labware, Bedford, MA)でコートした。要するに、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）(BD Discovery Labware, Bedford, MA)を４℃で解凍し、約２５０μＬアリコートに分け、冷却した２４ウェル培養プレート(Corning)の各ウェルに一様に分注した。次に、このプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、材料を固化させた。活発に増殖している内皮細胞をトリプシン処理し、計数した。細胞を、遠心分離、再懸濁、および上清の吸引により、２％ＦＢＳを含む増殖培地で２回洗浄した。細胞をコート済みウェルに、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含む約０．５ｍＬの増殖培地中、ウェル当たり２０，０００細胞として播種した。次に、細胞を約３０分間インキュベートし、細胞を定着させた。
次に、内皮細胞応答の陽性対照とするため、反応内皮細胞培養物を１０ｎＭのヒトｂＦＧＦ(Peprotech, Rocky Hill, NJ)または１０ｎＭのヒトＶＥＧＦ(Peprotech, Rocky Hill, NJ)のいずれかで処理した。産褥由来細胞を播種したトランスウェルインサートを、インサートチャンバー内に、２％ＦＢＳを含む増殖培地とともに適当なウェルに添加した。培養物を３７℃、５％ＣＯ2下で約２４時間インキュベートした。このウェルプレートをインキュベーターから取り出し、内皮細胞培養物の画像をオリンパス倒立顕微鏡(Olympus, Melville, NY)を用いて採取した。
結果
胎盤由来細胞または臍帯由来細胞との共存培養系では、ＨＵＶＥＣは細胞ネットワークを形成する（データは示されていない）。ＨＵＶＥＣ細胞は、ｈＭＳＣおよび１０ｎＭ ｂＦＧＦとの共存培養実験では限られた細胞ネットワークしか形成しない（データは示されていない）。いずれの処理も伴わないＨＵＶＥＣ細胞は、極めてわずかなネットワークしか形成しないか、または全く形成しない（データは示されていない）。これらの結果は、産褥由来細胞が、ＨＵＶＥＣを刺激する脈管形成因子を放出することを示唆する。
胎盤由来細胞または臍帯由来細胞との共存培養系では、ＣＡＥＣは細胞ネットワークを形成する（データは示されていない）。
表１９−１は、増殖培地において産褥由来細胞により放出される既知の脈管形成因子のレベルを示す。産褥由来細胞は前記のようにインサート上に播種された。これらの細胞を３７℃、大気酸素下で４８時間、インサート上で培養し、その後、２％ＦＢＳ培地に切り替え、３７℃で２４時間戻した。培地を除去し、即、凍結させ、−８０℃で保存し、Ｓｅａｒｃｈｌｉｇｈｔ多重ＥＬＩＳＡアッセイ(Pierce Chemical Company, Rockford, IL)により分析した。示されている結果は、２回の測定の平均である。これらの結果は、産褥由来細胞が検出可能なレベルの血小板由来増殖因子−ｂｂ（ＰＤＧＦ−ｂｂ）またはヘパリン結合上皮細胞増殖因子（ＨＢＥＧＦ）を放出しないことを示している。これらの細胞は、測定可能な量の、メタリノプロテアーゼ−１(metallinoprotease-1)（ＴＩＭＰ−１）、アンギオポエチン２（ＡＮＧ２）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の組織阻害剤を放出しない。
Figure 0005425400
表１９−２は、産褥由来細胞により放出される既知の脈管形成因子のレベルを示す。産褥由来細胞は前記のようにインサート上に播種された。これらの細胞を、５％酸素下で４８時間、インサート上、増殖培地中で培養した後、２％ＦＢＳ培地に切り替え、５％酸素下で２４時間インキュベートした。培地を除去し、即、凍結させ、−８０℃で保存し、Ｓｅａｒｃｈｌｉｇｈｔ多重ＥＬＩＳＡアッセイ(Pierce Chemical Company, Rockford, IL)により分析した。示されている結果は、２回の測定の平均である。これらの結果は、産褥由来細胞が検出可能なレベルの血小板由来増殖因子−ｂｂ（ＰＤＧＦ−ｂｂ）またはヘパリン結合上皮細胞増殖因子（ＨＢＥＧＦ）を放出しないことを示している。これらの細胞は、測定可能な量の、メタリノプロテアーゼ−１(metallinoprotease-1)（ＴＩＭＰ−１）、アンギオポエチン２（ＡＮＧ２）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の組織阻害剤を放出しない。
Figure 0005425400
要約。本研究の結果は、産褥由来細胞は、インビトロＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）(BD Discovery Lab ware, Bedford, MA)アッセイにおいてネットワークを形成するよう、ヒト臍帯静脈内皮細胞および冠動脈内皮細胞の双方を刺激可能であることを示す。この効果はこのアッセイ系で既知の脈管形成因子で見られたものと同様である。これらの結果は、産褥由来細胞がインビボ脈管形成の刺激に有用であることを示唆する。
実施例２０
ＲａｖＢｉｏおよびＢＤ Ｐｏｗｅｒｂｌｏｔサイトカインアレイ
ＲａｙＢｉｏ（登録商標）ヒトサイトカイン抗体アレイＣシリーズ１０００を用い、産褥由来細胞および溶解物中の１２０のタンパク質の発現を分析した。この分析により、ＰＰＤＣが同定され、これらの細胞にとって重要な栄養因子の発現スペクトルが確認された。
材料および方法
細胞増殖および採取。臍由来細胞を、増殖培地を含むゼラチンコートフラスコにて５，０００細胞／ｃｍ2として播種し、３〜４日間拡大培養した（目標採取密度は２５，０００細胞／ｃｍ2）。細胞を、トリプシンを用いて採取し、集め、３００ｒｃｆで５分間遠心分離した。トリプシン／培地を吸引除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。
細胞の洗浄および分注。洗浄後、細胞をＰＢＳ中、１．０Ｅ＋０７細胞／ｍＬに再懸濁させ、１．５ｍＬの無菌のシリコーン処理した微小遠沈管に１ｍＬアリコートを分注した。細胞を３００ｒｃｆで５分間遠心分離し、ＰＢＳを吸引除去した。細胞を溶解してアレイ分析するか、または分析のため、溶解および凍結乾燥させた。
凍結乾燥サンプルの調製。３ロットの細胞（ＰＰＤＣロットＬ０４０４０５、Ｌ０５２５０５、Ｌ０５０５０５）を液体窒素（ＬＮ２）中に６０秒間浸漬することにより、最終的に凍結乾燥されるように調製した。次に、ＬＮ２から試験管を取り出し、すぐに３７℃の水浴に６０秒または解凍されるまで浸漬した（最大インキュベーション時間は３分）。このプロセスをさらに２回繰り返した。これらの凍結−解凍サンプルを４℃、１３，０００ｒｃｆで１０分間遠心分離し、氷上に置いた。各試験管から上清液を除去した。全タンパク質含量を決定するため、溶解液をＰＢＳで希釈し、この希釈液をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより分析した。
凍結乾燥のため、溶解液で標識した１．５ｍＬの無菌クリオバイアルを、オートクレーブにかけて冷却した熱転移ブロックに入れた。溶解液上清のアリコートを定義された全タンパク質濃度でクリオバイアルに入れた。熱ブロックの入った、蓋をしていないクリオバイアルを、オートクレーブにかけた新しいオートクレーブポーチに無菌的に入れた。このポーチを凍結乾燥機に入れた。
適用した溶解液を含む試験材料をＦＴＳ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｕｒａ−Ｓｔｏｐ ＭＰ Ｓｔｏｐｐｅｒｉｎｇ Ｔｒａｙ Ｄｒｙｅｒに入れ、次の勾配プログラムを用いて凍結乾燥した。全ての段階で勾配率は２．５℃／分および１００−ｍＴバキュームとした。
Figure 0005425400
細胞ペレットの調製。冷凍細胞ペレット（ＰＰＤＣロット０６３００４Ｂ、０２２８０３、０５０６０４Ｂ、０７２８０４、１２０３０４、０７１４０４Ｃ、０９０３０４）を、ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｈｃｌ、ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ）と、ＲａｙＢｉｏサイトカインアレイ１０００．１キット(Raybiotech Inc.Norcross, GA)中に提供されている細胞溶解バッファーの１：１混合物を用いて溶解した。完全な細胞溶解を達成するため、ガラスビーズ(Sigma, MO)を用いた。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット(Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, IL)を用いて測定した。
ＲａｙＢｉｏアレイ分析。アレイ１０００．１からなるＲａｙＢｉｏアレイＶＩおよびＶＩＩを、各サンプル由来の、同量のタンパク質を用いて一晩プロービングした。残りのプロトコールは製造業者の指示に従って行った。膜上のスポットを定性分析し、目的のタンパク質を同定した。サンプル間の量的比較については、これらのスポットは濃度測定とＥＬＩＳＡにより確認される発現の変化により分析することができる。
結果
全部で１０の異なるＰＰＤＣ集団を分析した。４８タンパク質を定性的に同定し、表２０−１に一覧化している。全てのサンプルで比較的高濃度で発現するタンパク質もあるが、ある特定のサンプルで発現したものものある。
Figure 0005425400
要約
ＲａｙＢｉｏアレイにより、遺伝子アレイおよび／またはＥＬＩＳＡ分析によって従前に同定されたタンパク質の発現が確認される。特定の疾病の治療に有益な種々の栄養因子が同定されている。例えば、ＰＰＤＣにおいてはＦＧＦ、ＴＧＦ−ｂ、およびＧＣＳＦが同定され、これらの増殖因子は、急性脳卒中および脳卒中の回復の動物モデルにおける改善とともにこれまでに同定されたものである。さらに、パーキンソン病に明らかに関連しているＢＤＮＦ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、およびＴＧＦ−ｂ１がＰＰＤＣにおいて同定された。示されているデータは全て定性的に評価し、目的のタンパク質の発現のレベルの定量分析は未決定である。
実施例２１
一過性中大脳動脈閉塞脳卒中における種々のＰＰＤＣ用量の効果
産褥細胞を、２時間中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ）を受けたラットにおいて種々の用量で評価した。種々の用量：０．３×１０6、１×１０6、３×１０6、および１０×１０6細胞／用量−ラットでのＰＰＣ処置を、６０日の試験でＰＢＳ対照および間葉幹細胞対照と比較した。
材料および方法
細胞調製物。産褥由来細胞およびヒト間葉幹細胞(Cambrex, PT2501)を自家培養した後、研究施設に送り、そこで移植当日にそれらを解凍および処理した。細胞を３７℃の水浴で解凍し、１５ｍＬ試験管内の１０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞をＰＢＳに再懸濁させた。細胞は移植まで氷上で維持し、トリパンプルー染色により生存率を調べた。細胞の生存率はＰＰＤＣおよびＭＳＣで平均８５％であった。
虚血後１日目に、無作為に選択した動物に細胞移植を行った。動物をＮ2Ｏ：Ｏ2（２：１）中、３．５％のハロタンで麻酔し、フェースマスクにより０．５％ハロタンで維持した。各実験群に、２ｍＬＰＢＳ中に懸濁させた細胞、ＰＢＳ単独を尾の静脈注射を投与した（２７Ｇ１／２，B-D Precision Glide）。これら６群（Ｎ＝８／群）は、ＰＰＣ０．３×１０6、１×１０6、３×１０6、および１０×１０6個、ＭＳＣ３×１０6個、およびＰＢＳビヒクル対照であった。免疫抑制剤は適用しなかった。
一過性中大脳動脈閉塞。管腔内血管閉塞の改変法を用い、ラットに中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ）を誘発した。要するに、ラットをＮ2Ｏ：Ｏ2（２：１）中、３．５％のハロタンで麻酔し、フェースマスクにより０．５％ハロタンで維持した。右総頚動脈、外頚動脈および内頚動脈を露出した。動物の体重によって１８．５〜１９．５ｍｍまでの長さの３−０単繊維ナイロン糸（炎に近づけて加熱することで先端を丸くしたもの）を外頚動脈から内頚動脈の管腔内へ、ＭＣＡの起点を遮断するまで入れた。ＭＣＡｏから２時間後に、この糸をその先端が内頚動脈から抜けるまで引き抜くことにより再潅流を行った。
神経機能試験。ＭＣＡｏの前（基準）、ＭＣＡｏから１日後、ならびに７、１４、２１、２８、３５、４２、５６および６０日目に、試験群が盲検化された試験者が４種類の挙動試験を行った。各試験の詳細は実施例１８に記載されている通りである。
結果
神経機能の転帰。脳卒中から１日後の全ての動物において重篤な挙動欠陥が明らかであった。ＭＣＡｏを施した全てのラットは、ＭＣＡｏ後６０日まで経時的に進行する挙動回復を示した。ＰＰＤＣ処置を受けた動物は、全ての試験で機能回復に向かう傾向が示された。全体として、試験期間中、細胞療法の有益な効果が持続され、高まった。
ｍＮＳＳ試験（図１）、フットフォールト試験（図２）、および接着剤除去試験（図３）では用量応答性が見られ、３×１０6または１０×１０6ＰＰＤＣのいずれかの用量がより早く、より大きな回復をもたらした。コーナー試験では（図４）、ＰＰＤＣ処置ラットは、ＰＢＳビヒクル対照よりも良好に推移したが、ＭＳＣ処置ラットはＰＢＳ対照よりも悪かった。
要約
ＰＰＤＣは、齧歯類ＭＣＡｏモデルにおいて脳卒中の治療に有効性を示した。同等の機能改善転帰を示した２つの最高ＰＰＤＣ用量まで、用量応答性が見られた。細胞処置動物は６０日間安定した改善を続けた。
実施例２１の参照文献
Figure 0005425400
本発明は、以上に記載および例示された実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲内で変更および改変が可能である。
〔実施の態様〕
本発明の実施態様は以下の通りである。
（１）急性神経変性症状を有する患者を治療する方法において、
神経変性症状を治療するのに有効な量の産褥由来細胞を患者に投与するステップ、
を含み、
前記産褥由来細胞は、実質的に血液を含まないヒト胎盤組織またはヒト臍帯組織に由来し、
前記細胞は、自己再生および拡大培養が可能であり、かつ、少なくとも神経表現型の細胞へと分化する能力を有し、
前記細胞は、増殖にＬ−バリンを必要とし、かつ、少なくとも約５％の酸素中で増殖可能であり、
前記細胞は、次の特徴：
（ａ）培養において少なくとも約４０回の倍加能；
（ｂ）コートまたは非コート組織培養容器における接着（attachment）および拡大培養（expansion）であって、前記コート組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを含む、接着および拡大培養；
（ｃ）組織因子、ビメンチン（vimentin）、およびα−平滑筋アクチンのうち少なくとも１つの産生；
（ｄ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのうち少なくとも１つの産生；
（ｅ）フローサイトメトリーにより検出されるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうち少なくとも１つの産生の欠如；
（ｆ）繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞であるヒト細胞（human cell）に比べ、インターロイキン８；レチクロン(reticulon)１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫(melonoma)増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３；Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバー２；ウィルムス腫瘍１；アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２；レニン(renin)；酸化低密度リポタンパク質受容体１；ヒト(Homo sapiens)クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１；プロテインキナーゼＣζ；機能未知タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３；卵巣癌１においてダウンレギュレーション；およびクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３由来のヒト(Homo sapiens)遺伝子、をコードする遺伝子の少なくとも１つが増大（increase）されている遺伝子発現；
（ｇ）繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、低身長ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上部狭窄症、ウィリアムス−ビューレン症候群）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２）；間充織ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）；sine oculisホメオボックスホモログ１（ショウジョウバエ(Drosophila)）；クリスタリン(crystallin)αＢ；形態形成のdisheveled関連アクチベーター２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン(neuralin)１に類似；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；src homology three（ＳＨ３）およびシステイン豊富ドメイン；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；runt関連転写因子３；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；frizzledホモログ７（ショウジョウバエ(Drosophila)）；機能未知遺伝子ＢＣ００８９６７；ＶＩＩＩ型コラーゲンα１；テネイシンＣ(hexabrachion)；iroquoisホメオボックスタンパク質５；hephaestin；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ；ヒト(Homo sapiens)ｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム依存性チャネルサブファミリーＮメンバー４；インテグリンβ７；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；sine oculisホメオボックスホモログ２（ショウジョウバエ(Drosophila)）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；小胞関連膜タンパク質５(myobrevin)；ＥＧＦ含有fibulin様細胞外マトリックスタンパク質１；初期成長応答３；distal-lessホメオボックス５；機能未知タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ）；ビグリカン；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリンβ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（atrionatriureticペプチド受容体Ｃ）；機能未知タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）；ニューラリン(neuralin)１と類似；Ｂ細胞輸送遺伝子１；機能未知タンパク質ＦＬＪ２３１９１；およびＤＫＦＺｐ５８６Ｌ１５１、をコードする遺伝子の少なくとも１つが低減されている遺伝子発現；
（ｈ）ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＩＭＰ１のうち少なくとも１つの分泌；ならびに、
（ｉ）ＥＬＩＳＡにより検出されるＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、およびＶＥＧＦのうち少なくとも１つの分泌の欠如、
のうち少なくとも１つの特徴を含む、方法。
（２）実施態様１に記載の方法において、
前記急性神経変性症状は、虚血性脳卒中に起因する、方法。
（３）実施態様１に記載の方法において、
前記急性神経変性症状は、出血性脳卒中に起因する、方法。
（４）実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、投与前にインビトロで神経系統細胞へと分化するように誘導される、方法。
（５）実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、前記神経変性症状の治療を促進する遺伝子産物を産生するように遺伝的に操作される、方法。
（６）実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、少なくとも１つの他細胞種とともに投与される、方法。
（７）実施態様６に記載の方法において、
前記他の細胞種は、星状細胞、乏突起神経膠細胞、ニューロン、神経前駆体、神経幹細胞、遺伝子操作細胞、または他の多分化能性(multipotent)もしくは多能性(pluripotent)幹細胞である、方法。
（８）実施態様６に記載の方法において、
前記少なくとも１つの他の細胞種は、前記産褥由来細胞と同時、または前、または後に投与される、方法。
（９）実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、少なくとも１種類の他の薬剤とともに投与される、方法。
（１０）実施態様９に記載の方法において、
前記少なくとも１種類の他の薬剤は、前記産褥由来細胞と同時、または前、または後に投与される、方法。
（１１）実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、患者の中枢神経系または末梢神経系の所定の部位に投与される、方法。
（１２）実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、注射または注入により投与される、方法。
（１３）実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、移植可能なデバイス内に封入されて投与される、方法。
（１４）実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、当該細胞を含むマトリックスまたはスキャフォールドの移植により投与される、方法。
（１５）実施態様１に記載の方法において、
前記細胞は、患者の神経系に対して栄養作用を示す、方法。
（１６）急性神経変性症状を有する患者を治療するための医薬組成物において、
製薬上許容される担体と、
前記神経変性症状を治療するのに有効な産褥由来細胞と、
を含み、
前記産褥由来細胞は、実質的に血液を含まないヒト胎盤組織またはヒト臍帯組織に由来し、
前記細胞は、自己再生、および培養増殖が可能であり、かつ、少なくとも神経表現型の細胞へと分化する能力を有し、
前記細胞は、増殖にＬ−バリンを必要とし、かつ、少なくとも約５％の酸素中で増殖可能であり、
前記細胞は、次の特徴：
（ａ）培養において少なくとも約４０回の倍加能；
（ｂ）コートまたは非コート組織培養容器における接着および拡大培養であって、前記該コート組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを含む、接着および拡大培養；
（ｃ）組織因子、ビメンチン（vimentin）、およびα−平滑筋アクチンのうち少なくとも１つの産生；
（ｄ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのうち少なくとも１つの産生；
（ｅ）フローサイトメトリーにより検出されるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうち少なくとも１つの産生の欠如；
（ｆ）繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、インターロイキン８；レチクロン(reticulon)１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫(melonoma)増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３；Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバー２；ウィルムス腫瘍１；アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２；レニン(renin)；酸化低密度リポタンパク質受容体１；ヒト(Homo sapiens)クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１；プロテインキナーゼＣζ；機能未知タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３；卵巣癌１においてダウンレギュレーション；およびクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３由来のヒト(Homo sapiens)遺伝子、をコードする遺伝子の少なくとも１つが増大されている遺伝子発現；
（ｇ）繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、低身長ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上部狭窄症、ウィリアムス−ビューレン症候群）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２）；間充織ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）；sine oculisホメオボックスホモログ１（ショウジョウバエ(Drosophila)）；クリスタリン(crystallin)αＢ；形態形成のdisheveled関連アクチベーター２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン(neuralin)１に類似；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；src homology three（ＳＨ３）およびシステイン豊富ドメイン；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；runt関連転写因子３；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；frizzledホモログ７（ショウジョウバエ(Drosophila)）；機能未知遺伝子ＢＣ００８９６７；ＶＩＩＩ型コラーゲンα１；テネイシンＣ(hexabrachion)；iroquoisホメオボックスタンパク質５；hephaestin；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ；ヒト(Homo sapiens)ｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム依存性チャネルサブファミリーＮメンバー４；インテグリンβ７；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；sine oculisホメオボックスホモログ２（ショウジョウバエ(Drosophila)）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；小胞関連膜タンパク質５(myobrevin)；ＥＧＦ含有fibulin様細胞外マトリックスタンパク質１；初期成長応答３；distal-lessホメオボックス５；機能未知タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ）；ビグリカン；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリンβ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（atrionatriureticペプチド受容体Ｃ）；機能未知タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）；ニューラリン(neuralin)１と類似；Ｂ細胞輸送遺伝子１；機能未知タンパク質ＦＬＪ２３１９１；およびＤＫＦＺｐ５８６Ｌ１５１をコードする遺伝子の少なくとも１つが低減されている遺伝子発現；
（ｈ）ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＩＭＰ１のうち少なくとも１つの分泌；ならびに、
（ｉ）ＥＬＩＳＡにより検出されるＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、およびＶＥＧＦのうち少なくとも１つの分泌の欠如、
のうち少なくとも１つの特徴をさらに含む、医薬組成物。
（１７）実施態様１６に記載の医薬組成物において、
前記急性神経変性症状は、虚血性脳卒中または出血性脳卒中に起因する、医薬組成物。
（１８）実施態様１６に記載の医薬組成物において、
前記細胞は、前記組成物の処方前にインビトロで神経系統細胞へと分化するように誘導される、医薬組成物。
（１９）実施態様１６に記載の医薬組成物において、
前記細胞は、前記神経変性症状の治療を促進する遺伝子産物を産生するように遺伝的に操作される、医薬組成物。
（２０）実施態様１６に記載の医薬組成物において、
少なくとも１つの他の細胞種、
を含む、医薬組成物。
（２１）実施態様１６に記載の医薬組成物において、
前記他の細胞種は、星状細胞、乏突起神経膠細胞、ニューロン、神経前駆体、神経幹細胞、遺伝子操作細胞、または他の多分化能性(multipotent)もしくは多能性(pluripotent)幹細胞である、医薬組成物。
（２２）実施態様１６に記載の医薬組成物において、
少なくとも１種類の他の薬剤、
を含む、医薬組成物。
（２３）実施態様１６に記載の医薬組成物において、
注射または注入による投与のために処方される、医薬組成物。
（２４）実施態様１６に記載の医薬組成物において、
前記細胞は、移植可能なデバイスに封入される、医薬組成物。
（２５）実施態様１６に記載の医薬組成物において、
前記細胞は、マトリックスまたはスキャフォールド（scaffold）内に含まれる、医薬組成物。
（２６）実施態様１６に記載の医薬組成物において、
前記細胞は、患者の神経系に対して栄養作用を示す、医薬組成物。
（２７）実施態様１６に記載の医薬組成物において、
前記神経変性症状は、脳卒中である、医薬組成物。
（２８）急性神経変性症状を有する患者を治療する方法において、
神経変性症状を治療するのに有効な量の、実施態様１に記載の産褥由来細胞から製造された調製物を患者に投与するステップ、
を含み、
前記調製物は、前記産褥由来細胞の細胞溶解物、前記産褥由来細胞の細胞外マトリックス、または前記産褥由来細胞が増殖された細胞馴化培地を含む、方法。
（２９）急性神経変性症状を有する患者を治療するための医薬組成物において、
製薬上許容される担体と、
実施態様１に記載の産褥由来細胞から得られる調製物と、
を含み、
前記調製物は、前記産褥由来細胞の細胞溶解物、前記産褥由来細胞の細胞外マトリックス、または前記産褥由来細胞が増殖された細胞馴化培地を含む、医薬組成物。
【０４６６】
（３０）治療を必要とする患者において脳卒中を治療する方法において、
治療上有効な量の細胞調製物を患者に投与するステップ、
を含み、
前記細胞調製物は、実質的に血液を含まないヒト胎盤組織またはヒト臍帯組織に由来する細胞を含む単離された産褥由来細胞を含み、
前記細胞は、自己再生および培養増殖が可能であり、かつ、神経表現型の細胞へと分化する能力を有し、
前記細胞は、増殖にＬ−バリンを必要とし、かつ、少なくとも約５％の酸素中で増殖可能であり、
前記細胞は、次の特徴：
（ａ）培養において少なくとも約４０回の倍加能；
（ｂ）コートまたは非コート組織培養容器における接着および拡大培養であって、前記コート組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを含む、接着および拡大培養；
（ｃ）組織因子、ビメンチン（vimentin）、およびα−平滑筋アクチンのうち少なくとも１つの産生；
（ｄ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのうち少なくとも１つの産生；
（ｅ）フローサイトメトリーにより検出されるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうち少なくとも１つの産生の欠如；
（ｆ）繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、インターロイキン８；レチクロン(reticulon)１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫(melonoma)増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３；Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバー２；ウィルムス腫瘍１；アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２；レニン(renin)；酸化低密度リポタンパク質受容体１；ヒト(Homo sapiens)クローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１；プロテインキナーゼＣζ；機能未知タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３；卵巣癌１においてダウンレギュレーション；およびクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３由来のヒト(Homo sapiens)遺伝子、をコードする遺伝子の少なくとも１つが増大されている遺伝子発現；
（ｇ）繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、低身長ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上部狭窄症、ウィリアムス−ビューレン症候群）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２）；間充織ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）；sine oculisホメオボックスホモログ１（ショウジョウバエ(Drosophila)）；クリスタリン(crystallin)αＢ；形態形成のdisheveled関連アクチベーター２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン(neuralin)１に類似；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；src homology three（ＳＨ３）およびシステイン豊富ドメイン；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；runt関連転写因子３；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；frizzledホモログ７（ショウジョウバエ(Drosophila)）；機能未知遺伝子ＢＣ００８９６７；ＶＩＩＩ型コラーゲンα１；テネイシンＣ(hexabrachion)；iroquoisホメオボックスタンパク質５；hephaestin；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ；ヒト(Homo sapiens)ｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム依存性チャネルサブファミリーＮメンバー４；インテグリンβ７；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；sine oculisホメオボックスホモログ２（ショウジョウバエ(Drosophila)）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；小胞関連膜タンパク質５(myobrevin)；ＥＧＦ含有fibulin様細胞外マトリックスタンパク質１；初期成長応答３；distal-lessホメオボックス５；機能未知タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ）；ビグリカン；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリンβ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（atrionatriureticペプチド受容体Ｃ）；機能未知タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）；ニューラリン(neuralin)１と類似；Ｂ細胞輸送遺伝子１；機能未知タンパク質ＦＬＪ２３１９１；およびＤＫＦＺｐ５８６Ｌ１５１をコードする遺伝子の少なくとも１つが低減されている遺伝子発現；
（ｈ）ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＩＭＰ１のうち少なくとも１つの分泌；ならびに、
（ｉ）ＥＬＩＳＡにより検出されるＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、およびＶＥＧＦのうち少なくとも１つの分泌の欠如、
のうち少なくとも１つの特徴をさらに含む、方法。
【予納台帳番号】 ３６４８９８
【納付金額】 ４６８００
（３１）実施態様３０に記載の方法において、
前記細胞は、患者に投与する前にインビトロで神経系統細胞へと分化するように誘導される、方法。
（３２）実施態様３０に記載の方法において、
前記細胞は、脳卒中の治療を促進する遺伝子産物を産生するよう遺伝的に操作される、方法。
（３３）実施態様３０に記載の方法において、
前記細胞調製物は、少なくとも１種類の他の細胞種をさらに含む、方法。
（３４）実施態様３３に記載の方法において、
前記他の細胞種は、星状細胞、乏突起神経膠細胞、ニューロン、神経前駆体、神経幹細胞、または他の多分化能性(multipotent)もしくは多能性(pluripotent)幹細胞である、方法。
（３５）実施態様３０に記載の方法において、
前記細胞調製物は、少なくとも１種類の他の薬剤をさらに含む、方法。
（３６）実施態様３０に記載の方法において、
前記細胞調製物は、未分画細胞溶解物を含む、方法。
（３７）実施態様３０に記載の方法において、
前記細胞調製物は、膜不含細胞溶解物（membrane-free cell lysate）を含む、方法。
（３８）実施態様３０に記載の方法において、
前記細胞調製物は、注射または注入による投与のために処方される、方法。
（３９）実施態様３０に記載の方法において、
前記細胞は、移植可能なデバイスに封入される、方法。
（４０）実施態様３０に記載の方法において、
前記細胞調製物は、マトリックスまたはスキャフォールド内に含まれる、方法。
（４１）実施態様３０に記載の方法において、
前記細胞調製物は、患者の神経系に対して栄養作用を示す、方法。
ラットにおける中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ）後のModified Neurological Severity Score (mNSS)試験の結果を示したグラフである（ＰＰＣ＝産褥由来細胞；ＭＳＣ＝間葉幹細胞）。 ラットにおける中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ）後のフットフォールト試験(Foot-Fault Test)の結果を示したグラフである（ＰＰＣ＝産褥由来細胞；ＭＳＣ＝間葉幹細胞）。 ラットにおける中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ）後の接着剤除去試験(Adhesive Removal Test)試験の結果を示したグラフである（ＰＰＣ＝産褥由来細胞；ＭＳＣ＝間葉幹細胞）。 ラットにおける中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ）後のコーナー試験(Corner Test)の結果を示したグラフである（ＰＰＣ＝産褥由来細胞；ＭＳＣ＝間葉幹細胞）。

Claims (19)

  1. 脳卒中を起こした患者の治療に使用するための、単離された臍帯組織由来の細胞の実質的に均一な集団を含む治療細胞組成物において、
    前記集団は、血液を含まない哺乳類の臍帯組織から単離されたもの、または、血液を含まない哺乳類の臍帯組織から単離された臍帯由来の細胞集団から拡大培養されたもの、であり、
    前記集団は、ＣＤ１１７、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれも発現せず、自己再生および拡大培養が可能である、
    組成物。
  2. 請求項１に記載の組成物において、前記細胞集団は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの一つまたはそれ以上を発現する、組成物。
  3. 請求項１または２に記載の組成物において、
    前記細胞集団は、繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞であるヒト細胞（human cell）に比べ、インターロイキン８；レチクロン(reticulon)１；およびケモカイン受容体（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３の発現が増大している、組成物。
  4. 脳卒中を起こした患者の治療に使用するための、単離された臍帯組織由来の細胞の実質的に均一な集団を含む治療細胞組成物において、
    前記集団は、血液を含まないヒト臍帯組織から単離されたものであり、自己再生および拡大培養が可能であり、他の表現型の細胞へと分化する能力を有し、少なくとも４０回の倍加が可能で、かつ、次の特徴：
    （ａ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれの発現；
    （ｂ）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの全ての発現の欠如、
    （ｃ）繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞であるヒト細胞（human cell）に比べ、インターロイキン８；レチクロン(reticulon)１；およびケモカイン受容体（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３の発現の増大（increase）、
    （ｄ）因子ＭＣＰ−１、ＭＣＰ１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＩＭＰ１のそれぞれの分泌；ならびに、
    （ｅ）因子ＳＤＦ−１α、ＴＧＦ−β2、ＡＮＧ2、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ1ａ及びＶＥＧＦの全ての分泌の欠如
    を含む、組成物。
  5. 請求項４に記載の組成物において、
    前記細胞集団は、血液を含まない臍帯組織の酵素消化によって得られ得る、組成物。
  6. 請求項１〜５のいずれか1項に記載の組成物において、
    前記脳卒中は、虚血性脳卒中である、組成物。
  7. 請求項１〜５のいずれか1項に記載の組成物において、
    前記脳卒中は、出血性脳卒中である、組成物。
  8. 請求項１〜５のいずれか1項に記載の組成物において、
    前記細胞集団は、インビトロで神経系統細胞へと分化するように誘導されたものである、組成物。
  9. 請求項１〜５のいずれか1項に記載の組成物において、
    前記細胞集団は、脳卒中の治療を促進する遺伝子産物を産生するように遺伝的に操作される、組成物。
  10. 請求項１〜５のいずれか1項に記載の組成物において、
    少なくとも１つの他の細胞種と組み合わされた、組成物。
  11. 請求項１０に記載の組成物において、
    前記他の細胞種は、星状細胞、乏突起神経膠細胞、ニューロン、神経前駆体、神経幹細胞、遺伝子操作細胞、または他の多分化能性もしくは多能性幹細胞である、組成物。
  12. 請求項１〜５または１０のいずれか1項に記載の組成物において、
    少なくとも１種類の他の薬剤と組み合わされた、組成物。
  13. 請求項１０または１２に記載の組成物において、
    前記少なくとも１つの他の細胞種および／または前記少なくとも１つの他の薬剤は、前記臍帯組織由来の細胞と同時のまたはその前のまたはその後の、投与のためのものである、組成物。
  14. 請求項１〜５のいずれか1項に記載の組成物において、
    前記組成物は、前記患者の中枢神経系または末梢神経系の所定の部位への投与に適している、組成物。
  15. 請求項１〜５のいずれか1項に記載の組成物において、
    前記組成物は、注射または注入による投与のために処方される、組成物。
  16. 請求項１〜５のいずれか1項に記載の組成物において、
    前記細胞集団は、移植可能なデバイス内に封入される、組成物。
  17. 請求項１〜５のいずれか1項に記載の組成物において、
    前記細胞集団は、マトリックスまたはスキャフォールド内に含まれる、組成物。
  18. 請求項１〜５のいずれか1項に記載の組成物において、
    前記細胞は、臍帯組織由来の細胞の、実質的に均一な集団である、組成物。
  19. 脳卒中を起こした患者の治療に使用するための医薬組成物において、
    製薬上許容される担体と、請求項１〜１１および１５〜１８のいずれか1項に記載の組成物と、を含む、医薬組成物。
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