JP5491067B2

JP5491067B2 - リポソーム、リポソームの製造方法、及び医薬組成物

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Publication number: JP5491067B2
Application number: JP2009113878A
Authority: JP
Inventors: 一雄丸山; 亮鈴木; 裕一郎平
Original assignee: NEPA GENE CO Ltd
Current assignee: NEPA GENE CO Ltd
Priority date: 2009-05-08
Filing date: 2009-05-08
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2029-05-08
Also published as: JP2010260828A

Description

本発明は、超音波加熱凝固治療及び病巣部造影に使用されるリポソーム、そのリポソームの製造方法、及びそのリポソームを含有する医薬組成物に関する。

超音波診断装置は、産婦人科、循環器科、泌尿器科等で使用されており、超音波イメージング剤として、マイクロバブルを投与した後に超音波照射により影像して診断する方法が開発されている（特許文献１〜５参照）。

しかしながら、従来のマイクロバブルは、アルブミンで形成された巨大粒子中に気体を含有させるものであることから、粒子径が２〜６μｍと大きく、深部組織への移行性は低かった。そのため、深部組織での造影能は不十分であるという問題点がある。

一方、加熱凝固療法は、癌治療等の分野にて近年脚光を浴びている治療法であり、ミリメートル単位の微小な領域に強力超音波を集め、瞬時に組織変性を来す温度に上昇させる治療法である（非特許文献１）。

特許文献６には、この加熱凝固療法に使用されるフッ化ガスが封入されているガス封入リポソームが記載されている。

特許文献６では、リポソームをバイアルに詰めて、ガス加圧条件下でバス型超音波洗浄機を用いて超音波照射を行い、リポソームにフッ化ガスを封入する。

このガス封入リポソームを被験者に投与後、病巣部位に低周波超音波を照射する。これにより、その病巣部位で内封されたガスの微少気泡によるキャビテーションが生じ、病巣部位が高温となり死滅する。

米国特許第４５７２２０５号米国特許第４７１８４３３号米国特許第４７７４９５８号米国特許第４８４４８５２号米国特許第４９５７６５６号特開２００５−１５４２８２号公報（第３頁、第５頁）

Ｐ．Ｐ．Ｌｅｌｅ著「Ultrasound; medical applications,biological effects and hazard potential」Plenum Press New York 1987年

しかし、上述のガス封入リポソームでは、リポソーム内部へのフッ化ガスの封入効率が不十分であり、またパーフルオロノルマルペンタンのような常温で液体のものは、リポソーム内部への封入が困難である問題点がある。

本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、病巣部位の造影能が高く、ガス乃至液滴が効率的に封入されており加熱凝固療法の治療効果が高いリポソームを効率的に製造するリポソームの製造方法を提供することにある。

本発明の第１の観点に係るリポソームの製造方法は、生体親和性且つ両親媒性のミセル外殻形成物質と、分散液と、パーフルオロ炭化水素ガスとを含有する混合物を超高圧乳化分散機にて乳化分散させて、前記パーフルオロ炭化水素ガスを内包する生体親和性のミセルであるパーフルオロ炭化水素ガス内包ミセルを形成するミセル化工程と、脂質の薄膜をナノフィルターの一方の面に貼り付け、分散液に分散させた前記パーフルオロ炭化水素ガス内包ミセルを前記脂質の薄膜及び前記ナノフィルターを通過させることで、前記脂質をリポソーム膜とするリポソームを形成するリポソーム形成工程と、を有することを特徴とする。

また、前記リポソームの外表面に、標的細胞、標的組織又は標的病巣に対するリガンドを結合させてリガンド修飾リポソームを得るリガンド結合工程を有することが好ましい。

また、前記リガンドは、トランスフェリン、葉酸、ヒアルロン酸、糖鎖、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のＦａｂ'フラグメント、又はペプチドであることが可能である。

また、前記リガンド修飾リポソームに薬物及び遺伝子の少なくとも何れか一つを封入する封入工程を有することが好ましい。

また、前記パーフルオロ炭化水素ガスは、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフロオロプロパン、及びパーフロオロブタンの少なくとも何れか一つを含有することが好ましい。

また、前記リポソーム形成工程は、前記脂質の薄膜及び前記ナノフィルターを通過することにより形成されたリポソームを、超高圧乳化分散機にて粒子径を減少させることが好ましい。

本発明に係るリポソームの製造方法は、本発明に係るリポソームを効率的に製造できる。

本実施形態に係るリポソームを説明する説明図である。ガラスフィルター−水和（Hydration）法に使用するガラスフィルター装置を説明する説明図である。パーフルオロ炭化水素内包ミセルの直径を示す図である。ガラスフィルター−水和（Hydration）法により形成したリポソームの直径を示す図である。ナノマイザーによりサイズダウンしたリポソームの直径を示す図である。本実施形態に係るリポソームの電子顕微鏡写真図であり、そのうち（ａ）はパーフルオロ炭化水素内包ミセルが内包されている状態を示すものであり、（ｂ）は近接している２個のリポソームを示すものである。本実施例に係るリポソームのマウス結腸癌Colon26細胞に対する結合性を示す図であり、そのうち（ａ）は実施例１のリポソームの結合性とBare-Liposomeの結合性とを比較するものであり、（ｂ）は実施例１のリポソームの結合性とBSA-Liposomeの結合性とを比較するものである。超音波照射によるパーフルオロ炭化水素内包ミセル内のパーフルオロノルマルペンタンのガス化を示す図であり、そのうち（ａ）は超音波照射前であり、（ｂ）は超音波照射後である。超音波照射による造影能を示す図であり、そのうち（ａ）は本実施例のリポソームの超音波照射前であり、（ｂ）は本実施例のリポソームの超音波照射後であり、（ｃ）はコントロールの超音波照射前であり、（ｄ）はコントロールの超音波照射後である。超音波照射による発生するキャビテーションによる発熱の測定結果を示す図である。本実施例のリポソームをファントムゲル中に含有させ、超音波照射することによる加熱凝固作用を示す図である。超音波照射による一重項酸素の生成を示す図である。担癌マウスに本実施例のリポソームを注入し、超音波照射した後の抗腫瘍効果を示す図である。超音波照射による加熱凝固治療の結果を示す図であり、そのうち（ａ）は本実施例のリポソームを担癌マウスに注入し超音波照射した直後の照射部位であり、（ｂ）はその担癌マウスから摘出した肝臓であり、（ｃ）超音波照射のみの担癌マウスの肝臓である。

以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明する。本実施形態に係るリポソーム９００は、図１に示すように、パーフルオロ炭化水素内包ミセル１００を内包する。リポソーム９００の脂質組成、帯電状態、密度、重量、粒子径等は、加熱凝固治療の対象となる病巣部の性質等に応じて適宜設計することができる。

パーフルオロ炭化水素内包ミセル１００の外殻１１０は、生体親和性且つ両親媒性のミセル外殻形成物質で形成される。生体親和性且つ両親媒性のミセル外殻形成物質は、特に限定されるものではないが、例えば、ブロックコポリマーや両親媒性のリン脂質等である。

ブロックコポリマーは、親水性セグメント（以下、Ｘセグメントとする。）及び疎水性セグメント（以下、Ｙセグメントとする。）からなる、ＸＹ型又はＸＹＸ型のブロックコポリマーである。

親水性セグメントは、特に限定されるものでないが、例えばポリエチレングリコール、ポリリン酸、ポリオキシエチレン、ポリサッカライド、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアミノ酸あるいはこれらの誘導体由来のセグメントである。好ましいものとしてはポリエチレングリコールである。

疎水性セグメントは、特に限定されるものではないが、例えばポリ乳酸、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタミン酸）、ポリアスパラギン酸エステル、ポリグルタミン酸エステル、またこれらの部分加水分解物、ポリリシン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリンゴ酸、ポリアルキレンオキシドあるいはこれらの誘導体由来のセグメントである。好ましいものとしてはポリ乳酸である。

親水性セグメントと疎水性セグメントは、ポリマーミセルを形成しうるものであれば、それぞれのセグメントの大きさに制限がないが、例えば親水性セグメントの繰り返し単位は１０〜５００、好ましくは１５〜１００にあり、他方、疎水性セグメントの繰り返し単位は５〜１００、好ましくは１０〜３０である。

パーフルオロ炭化水素内包ミセル１００の内部１２０には、パーフルオロ炭化水素が内封される。

パーフルオロ炭化水素は、特に限定されるものではないが、例えばパーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフロオロプロパン、パーフロオロイソブタン、パーフロオロノルマルブタン、パーフロオロイソペンタン、パーフロオロノルマルペンタン、パーフルオロイソヘキサン、パーフルオロノルマルヘキサン、パーフルオロイソヘプタン、パーフルオロノルマルヘプタン、パーフルオロイソオクタン、及びパーフルオロノルマルオクタンである。好ましいものはパーフルオロノルマルペンタン（ｂ．ｐ．２９℃）である。パーフルオロノルマルペンタンを使用した場合、常温では、パーフルオロ炭化水素内包ミセル１００の内部にパーフルオロノルマルペンタンの液滴を内包することになる。

パーフルオロ炭化水素内包ミセル１００の直径は、特に限定されるものではないが、例えば５０ｎｍ〜１００ｎｍである。本実施形態では７０ｎｍである。パーフルオロ炭化水素内包ミセル１００の直径は、例えば動的光散乱法により測定される。

リポソーム９００の膜２００は、脂質類を含有する膜構成成分からなる。脂質類は、例えばリン脂質、グリセロ糖脂質及びスフィンゴ糖脂質の他、これらの脂質に、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基又は第４級アンモニウム基が導入されたカチオン性脂質である。

リン脂質は、特に限定されるものではないが、例えば、ホスファチジルコリン（大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルエタノールアミン（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）等）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミノカルボニル−ポリ（エチレングリコール）−プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミノカルボニル−ポリ（エチレングリコール）−プロピオン酸（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、水素添加リン脂質等の天然又は合成のリン脂質等が挙げられる。

グリセロ糖脂質は、特に限定されるものではないが、例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等が挙げられる。

スフィンゴ糖脂質は、特に限定されるものではないが、例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等が挙げられる。

カチオン性脂質は、特に限定されるものではないが、例えば、上記リン脂質、グリセロ糖脂質又はスフィンゴ糖脂質に、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアンモニウム基、モノアシルオキシアルキル−ジアルキルアンモニウム基、ジアシルオキシアルキル−モノアルキルアンモニウム基等の第４級アンモニウム基が導入された脂質が挙げられる。また、ポリアルキレングリコール修飾脂質としては、上記リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質に、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が修飾した脂質、例えばジ−Ｃ_12-24アシル−グリセロール−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−ＰＥＧ等が挙げられる。

不活性な親水性ポリマーであるポリアルキレンオキシド鎖（ポリオキシアルキレン鎖）又はＰＥＧ鎖がリポソーム９００表面に修飾されることにより、細胞内皮系組織の貪食細胞から捕捉されにくくすることができる。これにより、リポソーム９００を目標とする病巣部位に適切に到達させることができる。ＰＥＧの使用量は、例えばリポソームを構成する脂質に対して０．１〜３０質量％とすることができる。

リポソーム９００の表面は、リガンド３００で誘導化されている。リガンドとは、細胞表面上に存在するレセプター又は表面抗原と結合することができる物質である。リガンド３００は、特に限定されるものではないが、例えば、トランスフェリン、葉酸、ヒアルロン酸、ガラクトース、マンノース等の糖鎖、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のＦａｂ'フラグメント、又はペプチドである。

リガンド３００は好ましくはトランスフェリンである。トランスフェリンは生体内に存在する鉄結合蛋白質であり、細胞表面上のトランスフェリンレセプターと結合して細胞内に取り込まれることにより、鉄を細胞に供給する役割を有する。トランスフェリンレセプターは、癌種を問わず正常組織に比べて発現量が高いため、薬剤をトランスフェリンと結合させることにより、トランスフェリンレセプターを介して薬剤の腫瘍細胞内への取り込みを促進することができる。

リポソーム９００の表面に修飾されるペプチドは、ドラッグデリバリー用機能性ペプチドである。ペプチドは、特に限定されるものではないが、例えば、ポリアルギニンペプチド等の細胞膜透過性ペプチド、ＧＡＬＡペプチド等のｐＨ応答性膜融合性ペプチド、トランスサイトーシス誘導性ペプチド等である。

リポソーム９００には、膜構成物質として必要に応じ他の物質を加えることもでき、例えば膜安定化剤としてシトステロール、コレステロール、ジヒドロコレステロール、コレステロールエステル、フィトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、コレスタノール、ラノステロール、１−Ｏ−ステロールグルコシド、１−Ｏ−ステロールマルトシド、及びこれらの混合物を含有させることができる。

リポソーム９００の重量は特に限定されるものでなく、リポソーム内部に塩化セシウム等の高密度な溶液を充填させることにより上昇させることができる。リポソーム９００の密度は、リポソーム内部にデキストラン・サルフェート等の多糖類を含有させることにより上昇させることができる。

リポソーム９００の直径は、深部組織への到達性及び安定性等を考慮して、適宜調整することができ、例えば１００〜２００ｎｍである。リポソーム９００の直径を係る範囲に設定することにより、深部組織へ到達させることが可能である。ここで、リポソーム９００の直径は動的光散乱法により測定される。

リポソーム９００の内部には薬物４００を内包させることができる。薬物４００は、長期間血中濃度が維持されることが望まれる薬物又は特定の疾患部位や細胞への標的指向性を意図した投与が必要な薬物等が好ましい。薬物４００は、特に限定されるものではないが、例えば抗癌剤、抗生物質、抗喘息薬、抗血栓剤、抗原虫薬、免疫賦活剤、ペプチド系薬物、抗ウイルス薬である。

癌組織は多様であり、例えば一箇所の癌組織のうち、その辺縁部は血管新生により血流豊富な領域であるのに対し、中心部では逆に血流が欠乏した状況となるものがある。血流は熱エネルギーを運び去るため、血流豊富な癌病変部では加熱凝固治療の効果が得られにくい場合がある。そこで、薬物４００を用いて音響化学治療を組み合わせることにより、血流豊富な癌病変部の治療効果を促進させることができる。新生血管が多く、血流豊富な癌病変部では、薬物４００が届きやすく、後述するキャビテーション生成が容易であるため、音響化学治療を組み合わせることが好適である。

抗癌剤は、特に限定されるものではないが、例えばドキソルビシン、シスプラチン、マイトマイシン、ブレオマイシン、５−フルオロウラシル、メソトレキサート、ナイトロジェンマスタード、ブスルファン、オギザリプラチン、タキソール、カンプトテシン等である。抗生物質は例えばスルファゼン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン等である。抗喘息薬は例えばテオフィリン等である。抗血栓剤は例えばヘパリン、低分子量ヘパリン、ウロキナーゼ、トロンボモジュリン、ストレプトキナーゼ等である。抗原虫薬は例えばアンチモン酸メグルミン等である。免疫賦活剤は例えばムラミルペプチド類等である。ペプチド系薬物は例えば、天然型又は遺伝子組み換え型のα、β、γ−インターフェロン、インターロイキン、スーパーオキシドデスムターゼ等である。その他にも、薬物４００として、例えばプロスタグランジン等の動脈硬化症治療薬、動脈閉塞症、バーチャ病に対するＮＦカッパーＢ、デコイ等が挙げられる。

また、リポソーム９００の内部には薬物４００のみならず遺伝子類を内包させることも可能である。遺伝子類は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、デコイ、治療用オリゴヌクレオチド等である。

次に、本実施形態に係る医薬組成物について説明する。本実施形態に係る医薬組成物は、リポソーム９００及び薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体は、例えば滅菌水、緩衝液、食塩水等である。医薬組成物は、更に、種々の塩類、糖類、蛋白質、澱粉、ゼラチン、植物油及びポリエチレングリコール等を含有することができる。本実施形態に係る医薬組成物は、例えばボーラス注射又は連続注入により非経口的に投与できる。投与量は、特に限定されるものではなく、投与経路、症状の重篤度、患者の年齢及び状態、副作用の程度等により適宜設定できる。

次に、本実施形態に係るリポソーム９００の製造方法について説明する。まず、生体親和性且つ両親媒性のミセル外殻形成物質と、分散液と、パーフルオロ炭化水素とを含有する混合物を超高圧乳化分散機にて乳化分散させて、パーフルオロ炭化水素内包ミセル１００を形成する（ミセル化工程）。

生体親和性且つ両親媒性のミセル外殻形成物質は、上述したように例えば、ブロックコポリマーや両親媒性のリン脂質等である。ブロックコポリマーは、親水性セグメント及び疎水性セグメントからなり、例えば、ポリエチレングリコール−ポリ乳酸ブロックポリマーである。パーフルオロ炭化水素は、上述したように、例えばパーフルオロノルマルペンタンである。分散液は、特に限定されるものではないが、例えば硫酸アンモニウムである。

超高圧乳化分散機は、例えば超高圧ホモジナイザーを用いて行うことができる。超高圧ホモジナイザーとしては、例えば吉田機械興業社のナノマイザー（Nano-Mizer system mark II（登録商標）ＮＭ２）を使用できる。

超高圧分散、乳化処理の圧力は、例えば圧力２０ＭＰａ〜５０ＭＰａ、好ましくは３０ＭＰａ〜４０ＭＰａである。超高圧分散・乳化処理を実施する際の温度は、特に限定されるものではないが、例えば４℃〜５０℃、好ましくは１０℃〜３０℃である。加圧処理時間は、特に限定されないが、例えば１〜３０分である。

次に、パーフルオロ炭化水素内包ミセル１００を内包するリポソームを形成する（リポソーム形成工程）。リポソームの形成は、図２に示すように、ガラスフィルター装置５００を使用するガラスフィルター−水和（Hydration）法にて行う。ガラスフィルター装置５００は、中央部にナノフィルター５３０を有する。ナノフィルター５３０は、複数の細孔５３１を有する（なお、図２では、図面の簡易化のため細孔５３１は一つしか記載していない。）。細孔５３１の直径は、特に限定されるものではなく、所望するリポソーム粒子径により調整され、例えば１００ｎｍ〜１６０μｍである。ナノフィルター５３０の上部には、脂質の薄膜５２０が載置されるか、又はナノフィルター５３０の上部に脂質の薄膜５２０がコーティングされる。脂質の薄膜５２０は、例えば、上述したリン脂質又は糖脂質等を有機溶媒に溶解させた後に、その有機溶媒を乾燥させて形成される。有機溶剤とリン脂質の混合比は、リン脂質が溶解される十分量であれば特に限定されるものではないが、例えば３〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度に調整される。ガラスフィルター装置５００の下端部には排出口５４０が設けられる。

ガラスフィルター−水和（Hydration）法にてリポソームを形成する際は、まず、ナノフィルター５３０の上部空間５１０に、１２０ｍＭ硫酸アンモニウム等の分散液に分散させたパーフルオロ炭化水素内包ミセル１００を導入させる。このときの導入速度は、流速が、０．０１〜０．６ｍ／秒、好ましくは０．０５〜０．３ｍ／秒、より好ましくは０．１〜０．２ｍ／秒である。これにより、パーフルオロ炭化水素内包ミセル１００が細孔５３１を通過する際には、水和（Hydration）によりパーフルオロ炭化水素内包ミセル１００が内包されているリポソームが形成される。ガラスフィルター−水和（Hydration）法によれば、リポソーム内に内包されているパーフルオロ炭化水素内包ミセル１００の封入効率は７５〜８５％である。

ガラスフィルター−水和（Hydration）法にて形成されるリポソームの直径が大きい場合は、その後、超高圧乳化分散機にて粒子径を減少させることができる。超高圧乳化分散機は、上述したように、例えば超高圧ホモジナイザーを用いて行うことができる。ガラスフィルター−水和（Hydration）法にて形成されるリポソームの直径が例えば４３０ｎｍ〜５８０ｎｍである場合は、その後超高圧ホモジナイザーを用いて粒子径を減少させることにより、リポソームの直径を例えば１００ｎｍ〜２７０ｎｍとすることができる。

次に、粒子径を減少させたリポソームについて、ゲル濾過、透析、限外濾過、遠心分離等の方法により精製を行う。

次に、リポソームの外表面にリガンドを結合させてリガンド修飾リポソームを得る（リガンド結合工程）。リガンドは、上述したように例えばトランスフェリンである。リガンドとしてトランスフェリンを用いる場合、トランスフェリンは精製された蛋白質として市販されている。リポソームの外表面にトランスフェリンを結合させるためには、ＰＥＧ等の親水性ポリマーのリン脂質誘導体にさらに官能基を導入しておくことが好ましい。例えば、リン脂質に、末端にカルボキシル基を導入したＰＥＧのリン脂質誘導体を添加してリポソームを形成させ、外表面にカルボキシル基を有するリポソームを得る。これに、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドを結合させる。又は、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミノカルボニル−ポリ（エチレングリコール）−プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）を利用する。次に、このリンカーを付加したリポソームをトランスフェリンと反応させることにより、外表面にトランスフェリンが結合したアポ型のトランスフェリン結合リポソームが得られる。これを、クエン酸鉄−クエン酸ナトリウムで処理して、ホロ型のトランスフェリン結合リポソームが得られる。

次に、外側表面にトランスフェリンが結合したリポソームの内部に、薬物を封入する（封入工程）。薬物は、上述したように例えばドキソルビシンである。薬物の封入方法は、薬物の封入効率及び保存安定性等の観点から、予めリポソームを生成させ、リポソームの内水相と外水相との間に生じるイオン勾配やｐＨ勾配を利用してリポソーム内に薬物を封入するリモートローディング（Remote loading）法を採用することができる。リモートローディング法を用いる場合は、リポソーム膜を構成するリン脂質の相転移点以上の加熱下にて、薬物を導入しようとするリポソームの懸濁液と、薬物溶液との混合液を、６０℃〜７０℃で２５〜３５分間加温する。

なお、薬物のみならず、リポソームの内部には遺伝子類を封入することも可能である。また、薬物又は遺伝子類の封入方法は、リモートローディング法に限定されず、リポソーム調製時に予め薬物を溶解させた水溶液を用いることによる方法、又はリポソーム調製後に、ｐＨ勾配法、浸透圧勾配法等を用いて封入する方法等を使用することができる。

以上の工程を経て、本実施形態に係るリポソーム９００が製造される。本実施形態に係るリポソームの製造方法によれば、ミセル内部にパーフルオロ炭化水素を内包させてパーフルオロ炭化水素内包ミセルを形成し、そのパーフルオロ炭化水素内包ミセルをリポソーム内部に封入するから、常温で気体のパーフルオロ炭化水素（例えばパーフルオロノルマルペンタン）であっても、リポソーム内部に的確に封入することができる。

次に、本実施形態に係るリポソーム９００の使用態様について説明する。リポソーム９００を非経口的に被験者に投与すると、リポソーム９００はリガンドの働きにより病巣部位に集まる。そして、病巣部位に超音波を照射して、病巣部位の微小な領域に超音波を集め、瞬時に組織変性を来す温度に上昇させる。超音波照射の条件は、特に限定されるものではないが、例えば、照射強度１Ｗ／ｃｍ^２〜３０００Ｗ／ｃｍ^２、周波数１ＭＨｚ〜１０ＭＨｚ、照射時間１０秒間〜２０秒間とすることができる。超音波照射により、リポソーム９００が割れ、パーフルオロ炭化水素内包ミセル１００内部のパーフルオロ炭化水素の気泡が生じる。このパーフルオロ炭化水素の気泡の直径は、例えば４０μｍ〜６０μｍである。このパーフルオロ炭化水素の気泡の発生により、病巣部位の造影が可能となり、従来はできなかった深層病巣部位の画像化も可能となる。また、このパーフルオロ炭化水素の気泡がキャビテーション現象を起こし、病巣部位の組織内温度が７０〜１００℃にまで上昇して加熱凝固療法が促進される。また、薬物４００が内部に封入されている場合は、音響化学治療を組み合わせることにより、血流豊富な癌病変部の治療効果を促進させることができる。

本実施形態に係るリポソーム９００を使用する加熱凝固療法を用いることにより、例えば前立腺肥大症や前立腺癌の治療を効果的に促進できる。前立腺は直腸壁に隣接しているので、収束超音波を発生させるアプリケータを直腸内腔に挿入し、直腸壁を隔てて隣接する前立腺に超音波を収束させて、前立腺内部を加熱凝固できる。他にも、例えば肝臓癌、腎臓癌等の加熱凝固療法にも効果的に使用できる。

（実施例１）
ポリエチレングリコール（数平均分子量７５０）−ポリ乳酸（数平均分子量１０００）ブロックポリマーを１．３ｍｇ／ｍｌと、１２０ｍＭ硫酸アンモニウムを５０ｍｌと、パーフルオロノルマルペンタンを２００μｌとを混合させ、その混合液をナノマイザー（吉田機械興業（株））にて超高圧分散して乳化処理をした。圧力は３５ＭＰａ、温度は２０℃、加圧処理時間は１０分であった。このようにして形成されたパーフルオロ炭化水素内包ミセルの直径は、図３に示すように６９．５±１６．９ｎｍであった。なお、パーフルオロ炭化水素内包ミセルの直径は大塚電子株式会社のゼータ電位・粒径測定システムを使用して測定した。

次に、図２に示すガラスフィルター装置５００を使用し、ナノフィルター５３０の上部に脂質の薄膜５２０を載置した。脂質の薄膜５２０は、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、コレステロール（ＣＨ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミノカルボニル−ポリ（エチレングリコール）−プロピオン酸（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミノカルボニル−ポリ（エチレングリコール）−プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）を混合させた混合物にクロロホルム１０ｍｌを添加し、完全に溶解するまで攪拌した後、クロロホルムを乾燥させて形成された。ナノフィルター５３０は、直径２９．５ｍｍ、厚さ４ｍｍの円盤状ガラスフィルターを１０枚重ねて形成された。細孔５３１の直径は１３０μｍであった。

そして、ナノフィルター５３０の上部空間５１０に、１２０ｍＭ硫酸アンモニウム等の分散液に分散させたパーフルオロ炭化水素内包ミセル１００を導入させた。導入速度は、流速が０．１ｍ／秒であった。排出口５４０から得られたリポソームにはパーフルオロ炭化水素内包ミセル１００が内包されており、パーフルオロ炭化水素内包ミセル１００の封入効率は約８０％であった。また、リポソームの直径は、図４に示すように、５５７．７±１２３．７ｎｍであった。リポソームの直径は大塚電子株式会社のゼータ電位・粒径測定システムを使用して測定した。

次に、得られたリポソームをナノマイザー（吉田機械興業（株））にてサイズダウンさせた。これにより直径は図５に示すように、１８１．８±８８．３ｎｍとなった。圧力は３０ＭＰａ、温度は２０℃、加圧処理時間は８分であった。そして、粒子径を減少させたリポソームについて遠心分離により精製を行った。サイズダウンさせたリポソームの直径は大塚電子株式会社のゼータ電位・粒径測定システムを使用して測定した。

次に、上述のサイズダウンさせたリポソームに、トランスフェリン（三菱化学メディエンス株式会社）を脂質重量の２０％を加え、室温で撹拌した。反応時間は３時間であった。これにより、リポソームの外表面にトランスフェリンが結合していた。

次に、上述したリポソームの懸濁液にドキソルビシン溶液を混合させ、６５℃で３０分間加温して、ドキソルビシンをリポソームの内部にリモートローディング（Remote loading）法により封入させた。このようにして、形成されたリポソームの電子顕微鏡写真を図６に示す。図６（ａ）に示すように、リポソーム内部にパーフルオロ炭化水素内包ミセルが内包されている。図６（ｂ）は近接している２個のリポソームを示すものである。

（実施例２）
マウス結腸癌Colon26細胞に対して、実施例１にて製造したリポソームの結合性と、トランスフェリンによる修飾がなされていないリポソーム（Bare-Liposome）の結合性とを比較した。Bare-Liposomeは、トランスフェリン修飾をしない以外は上述の実施例１と同様の製造方法にして製造した。蛍光標識は、ニトロベンゾキサゾールジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（NBD-PE）を使用した。この比較結果を図７（ａ）に示す。トランスフェリン修飾がなされているリポソームのマウス結腸癌Colon26細胞に対する結合性が確認された。

次に、マウス結腸癌Colon26細胞に対して、実施例１にて製造したリポソームの結合性と、表面にＢＳＡが吸着しているリポソーム（BSA-Liposome）の結合性とを比較した。BSA-Liposomeは、トランスフェリン修飾をせずにウシ血清アルブミンを吸着させる以外は上述の実施例１と同様の製造方法にして製造した。蛍光標識は、NBD-PEを使用した。この比較結果を図７（ｂ）に示す。トランスフェリン修飾がなされているリポソームのマウス結腸癌Colon26細胞に対する結合性の優位性が確認された。

（実施例３）
実施例１にて製造したリポソームに、照射強度１Ｗ／ｃｍ^２、周波数１ＭＨｚの超音波を１５秒間照射した。図８（ａ）は超音波照射の前を示す写真であり、図８（ｂ）は超音波照射の後を示す写真である。図８（ｂ）に示すように、超音波照射により、パーフルオロ炭化水素内包ミセルに内包されていたパーフルオロノルマルペンタンの気泡の発生が確認された。気泡の直径は５０μｍ前後であった。直径は、顕微鏡観察写真内で無作為に抽出した１５０個の気泡の直径の平均から計算した。

（実施例４）
次に、実施例１にて製造したリポソームについて、超音波診断装置による超音波造影を行った。図９（ａ）は、実施例１にて製造したリポソームの超音波照射の前を示す写真であり、図９（ｂ）は、実施例１にて製造したリポソームの超音波照射の後を示す写真であり、図９（ｃ）は、ＰＢＳコントロールの超音波照射の前を示す写真であり、図９（ｄ）は、ＰＢＳコントロールの超音波照射の後を示す写真である。超音波照射は、照射強度１Ｗ／ｃｍ^２、周波数１ＭＨｚの超音波を１５秒間行った。図９（ｂ）に示すように、実施例１にて製造したリポソームの超音波造影能が確認された。

（実施例５）
次に、実施例１で製造したリポソームに対して超音波照射を行い、発生するキャビテーションによる発熱を熱電対で測定した。超音波照射は、照射強度１０００Ｗ／ｃｍ^２、周波数３．３５ＭＨｚ、照射時間３０秒であった。実施例１のリポソームの発熱と、ＰＢＳの場合の発熱と、無処置の場合（超音波照射無し）の発熱とにおける測定結果を図１０に示す。本実施例のリポソームは無処置の場合と比較して、約２０℃程度の温度上昇が確認された。これにより、本実施例のリポソームは、腫瘍組織の加熱凝固治療に有益であることが示された。

次に、実施例１で製造したリポソームをファントムゲル中に含有させ、超音波照射することにより加熱凝固作用を確認した。超音波照射は、照射強度１９００Ｗ／ｃｍ^２、周波数３．３５ＭＨｚ、照射時間３０秒と、照射強度３０００Ｗ／ｃｍ^２、周波数３．３５ＭＨｚ、照射時間３０秒とで行った。ファントムゲルは、７．５重量％ポリアクリルアミドゲルと６．５重量％ウシ血清アルブミンとを混合させたものである。この加熱凝固作用の結果を図１１に示す。照射強度１９００Ｗ／ｃｍ^２及び照射強度３０００Ｗ／ｃｍ^２のいずれの場合も、キャビテーションによる発熱により加熱凝固作用が生じることが確認された。これにより、本実施例のリポソームは、腫瘍組織の加熱凝固治療に有益であることが示された。

（実施例６）
次に、実施例１で製造したリポソームに超音波照射し、ドキソルビシンによる一重項酸素の発生を通常の手法に従いルミノール反応にて確認した。一重項酸素は反応性に富み、強い酸化作用により腫瘍細胞に傷害を与える。また、生体内における一重項酸素の寿命は非常に短く、影響を及ぼす範囲はそれが生成した局所に限定されるので、腫瘍細胞のみに傷害を与え、それ以外の健康部位には傷害を与えない。超音波の照射条件は、照射強度１Ｗ／ｃｍ^２、周波数１ＭＨｚ、照射時間１５秒間であった。一重項酸素の生成結果を図１２に示す。コントロールはＰＢＳである。本実施例に係るリポソームは、ローズベンガルやメチレンブルー溶液と比較しても高い一重項酸素の生成が確認された。

（実施例７）
次に、実施例１で製造したリポソームを担癌マウスに投与し、超音波照射による抗腫瘍効果を調べた。担癌マウスは、健康な実験用マウスの後背部にColon26細胞を１×１０^６cells／１００μｌ注入して作成した。リポソームの投与は、Colon26細胞を実験用マウスに投与してから４日後に注入した。超音波の照射条件は、照射強度６００Ｗ／ｃｍ^２、周波数３．３５ＭＨｚ、照射時間１２０秒間であった。超音波照射後に、腫瘍径を計測した。一方で、超音波照射のみの場合と無処理の場合（リポソーム注入も、超音波照射もしていない場合）とについても、同様に作成した担癌マウスに同じ超音波条件で超音波照射して腫瘍径を計測した。この結果を図１３に示す。図１３に示すように、本実施例のリポソームを注入して超音波照射した場合は、腫瘍体積が著しく減少していることが判明した。

次に、実施例１で製造したリポソームを担癌マウスに投与し、超音波照射による抗腫瘍効果を写真にて調べた。超音波の照射条件は、照射強度４００Ｗ／ｃｍ^２、周波数３．３５ＭＨｚ、照射時間１２０秒間であった。この結果を図１４（ａ）及び（ｂ）に示す。図１４（ａ）は、超音波照射直後の照射部位の写真であり、図１４（ｂ）は、担癌マウスの摘出した肝臓の写真である。図１４（ａ）及び（ｂ）に示されるように、本実施例のリポソームを注入後、体外からのピンポイントの超音波照射により、照射部位の熱変性が確認された。これにより、本実施例のリポソームは、腫瘍組織の加熱凝固治療に有益であることが示された。一方、同様の担癌マウスに同じ超音波条件により超音波照射を行い、担癌マウスの肝臓を摘出して調べた。この結果を図１４（ｃ）に示す。超音波照射のみの場合は、本実施例の場合と比較して、加熱凝固治療の治療効果は不十分であった。

１００：パーフルオロ炭化水素内包ミセル
２００：膜
３００：リガンド
４００：薬物
５００：ガラスフィルター装置
５２０：薄膜
５３０：ナノフィルター
５４０：排出口
９００：リポソーム

Claims

生体親和性且つ両親媒性のミセル外殻形成物質と、分散液と、パーフルオロ炭化水素ガスとを含有する混合物を超高圧乳化分散機にて乳化分散させて、前記パーフルオロ炭化水素ガスを内包する生体親和性のミセルであるパーフルオロ炭化水素ガス内包ミセルを形成するミセル化工程と、脂質の薄膜をナノフィルターの一方の面に貼り付け、分散液に分散させた前記パーフルオロ炭化水素ガス内包ミセルを前記脂質の薄膜及び前記ナノフィルターを通過させることで、前記脂質をリポソーム膜とするリポソームを形成するリポソーム形成工程と、を有することを特徴とするリポソームの製造方法。
前記リポソームの外表面に、標的細胞、標的組織又は標的病巣に対するリガンドを結合させてリガンド修飾リポソームを得るリガンド結合工程を有することを特徴とする請求項１記載のリポソームの製造方法。
前記リガンドは、トランスフェリン、葉酸、ヒアルロン酸、糖鎖、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のＦａｂ'フラグメント、又はペプチドであることを特徴とする請求項２記載のリポソームの製造方法。
前記リガンド修飾リポソームに薬物及び遺伝子の少なくとも何れか一つを封入する封入工程を有することを特徴とする請求項２又は３記載のリポソームの製造方法。
前記パーフルオロ炭化水素ガスは、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフロオロプロパン、及びパーフロオロブタンの少なくとも何れか一つを含有することを特徴とする請求項１乃至４の何れか1項に記載のリポソームの製造方法。
前記リポソーム形成工程は、前記脂質の薄膜及び前記ナノフィルターを通過することにより形成されたリポソームを、超高圧乳化分散機にて粒子径を減少させることを特徴とする請求項１記載のリポソームの製造方法。