JP5328190B2

JP5328190B2 - Ｔｒｐａ１の活性化物質の評価方法

Info

Publication number: JP5328190B2
Application number: JP2008076109A
Authority: JP
Inventors: 郁尚藤田; 秀作山; 文裕岡田; 義雄辻野; 真琴富永
Original assignee: Mandom Corp; Inter University Research Institute Corp National Institute of Natural Sciences
Current assignee: Mandom Corp; Inter University Research Institute Corp National Institute of Natural Sciences
Priority date: 2008-03-24
Filing date: 2008-03-24
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2028-03-24
Also published as: JP2009225733A

Description

本発明は、ＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、化粧品などの外用剤の開発、生化学などの分野における基礎研究などに好適である、ＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法に関する。

肌荒れなどの皮膚トラブルは、年々増加する傾向にある。例えば、アトピー性皮膚炎に罹患している患者や敏感肌を有する人の場合、皮膚におけるバリアー能が低下しているため、刺激性物質などが皮膚から侵入しやすくなっている。そのため、アトピー性皮膚炎に罹患している患者の皮膚や敏感肌を有する人の皮膚は、前記皮膚トラブルが生じやすくなっている。したがって、日常的に皮膚に使用される化粧品は、無刺激又は低刺激の品質を有することが望ましい。

皮膚に対する物質の刺激性などの評価は、例えば、ヒトパッチ試験、ドレイズ皮膚一次刺激試験、眼粘膜刺激性試験、蛋白変性試験、溶血変性試験、細胞増殖阻害試験、分化阻害試験、透過性試験などにより行なわれている（例えば、非特許文献１を参照）。しかしながら、これらの試験は、皮膚における感覚刺激を定量的に測定することができないため、皮膚に対する物質の刺激性を、十分な感度で評価することが困難であるという欠点がある。皮膚における感覚刺激を定量的に測定する方法としては、ヒトによるスティンギングテスト法が知られている（例えば、非特許文献２を参照）。しかしながら、ヒトによるスティンギングテスト法は、被験者によるバラつき、季節の違いなどによって実験結果の誤差が大きいため、皮膚における感覚刺激を、十分な精度及び感度で評価することが困難であるという欠点がある。
フラグランス・ジャーナル(Fragrance Journal)、１９９４年、第２２巻、第８号、ｐ．６７−７３フロッシュピー．ジェイ．（Frosch, P. J.）及びキングマンエー．エム．（Kingman, A. M.）、ジャーナル・オブ・ソサエティ・コスメティック・ケミスツ・ジャパン（Journal of Society Cosmetic Chemists Japan）、１９７７年、第２８巻、ｐ．１９７−２０９

本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を活性化する物質を高い感度で評価することができるＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法を提供することを目的とする。また、本発明は、感覚刺激を引き起こす物質を高い精度で、かつ高い感度で評価することができる感覚刺激を引き起こす物質の評価方法を提供することを目的とする。

すなわち、本発明の要旨は、
（１）被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを含む混合物のｐＨが８〜１０となるように調整して接触させ、該被験物質により、ＴＲＰＡ１の生理学的機能が活性化されるか否かを調べることを特徴とするＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法、
（２）前記ＴＲＰＡ１の生理学的機能の活性化を、細胞内カルシウムイオン濃度を指標として測定する前記（１）に記載の評価方法、
（３）前記ＴＲＰＡ１発現細胞が、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を発現可能に宿主細胞に導入することにより得られる細胞である前記（１）又は（２）に記載の評価方法、
（４）前記宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞又はＮＩＨ３Ｔ３細胞である前記（３）に記載の評価方法、並びに
（５）被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを含む混合物のｐＨが８〜１０となるように調整して接触させ、該被験物質により、ＴＲＰＡ１の生理学的機能が活性化されるか否かを調べることを特徴とする感覚刺激を引き起こす物質の評価方法
に関する。

本発明のＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法は、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を活性化する物質を高い感度で評価することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の感覚刺激を引き起こす物質の評価方法は、感覚刺激を引き起こす物質を高い精度で、かつ高い感度で評価することができるという優れた効果を奏する。

本発明のＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法は、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、該被験物質により、ＴＲＰＡ１の生理学的機能が活性化されるか否かを調べることを特徴とする。

本発明のＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法は、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させているため、被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞との接触に際してアルカリ性溶液を用いない場合に比べて、被験物質によるＴＲＰＡ１の生理学的機能の活性化をより高い感度で評価することができるという優れた効果を奏する。このように、本発明のＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法は、高い感度でＴＲＰＡ１の活性化物質を評価することができるため、被験物質が少量であっても、この被検物質がＴＲＰＡ１の活性化物質であるか否かを評価することができる。また、本発明のＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法では、被験物質の評価にＴＲＰＡ１発現細胞が用いられているため、ヒトや実験動物を用いなくても、ＴＲＰＡ１を介して皮膚などに感覚刺激を引き起こす物質を評価することができる。

本明細書において、アルカリ性溶液とは、例えば、アルカリ性物質、アルカリ性緩衝液などを含み、アルカリ性である溶液をいう。

アルカリ性溶液のｐＨは、ＴＲＰＡ１の生理学的機能に対する被験物質の作用の発現を増強させるｐＨで、かつＴＲＰＡ１発現細胞が生育できるｐＨである。アルカリ性溶液のｐＨは、ＴＲＰＡ１発現細胞の種類によって、生育できるｐＨの範囲が異なるため、一概に決定することができない。通常、アルカリ性溶液のｐＨは、ｐＨ８〜１４である。

アルカリ性物質としては、特に限定されないが、例えば、アンモニア、モノエタノールアミン、トリエタノールアミン、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが挙げられる。アルカリ性物質を溶解させる溶媒としては、特に限定されないが、エタノール、生理的食塩水、水などが挙げられる。

また、アルカリ性緩衝液としては、アルカリ性のトリス塩酸緩衝液、ヘペス緩衝液などが挙げられる。

被験物質としては、特に限定されないが、例えば、無機化合物、有機化合物、植物抽出物、微生物培養物、微生物抽出物などが挙げられる。被験物質は、必要に応じて、溶媒に溶解させてもよい。かかる溶媒は、ＴＲＰＡ１発現細胞の生育、ＴＲＰＡ１の生理学的機能の発現に影響を与えない溶媒であるのが望ましい。被験物質を溶解させる溶媒としては、例えば、エタノール、生理的食塩水、水などが挙げられる。

ＴＲＰＡ１発現細胞は、一過性受容体電位チャネル（ＴＲＰチャネル）の１つであるＴＲＰＡ１の生理学的機能を発現する細胞である。

ＴＲＰＡ１の生理学的機能としては、例えば、痛み刺激、温度刺激、機械刺激、化学刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられる。

ＴＲＰＡ１発現細胞は、内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞であってもよく、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞であってもよい。

ＴＲＰＡ１発現細胞のなかでは、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を簡便な操作で、かつ高い感度で測定することができる観点から、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞（以下、「外因性ＴＲＰＡ１発現細胞」ともいう）が好ましい。

内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経細胞などが挙げられる。

外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、宿主細胞に導入された前記核酸が、染色体外要素として存在している細胞であってもよく、宿主細胞に導入された前記核酸が組み込みにより染色体に組み込まれている細胞であってもよい。

外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、慣用の形質転換方法によって、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を保持する組換えベクターなどにより宿主細胞を形質転換することにより得られる。

ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよい。ヒトにおけるＴＲＰＡ１活性化物質を的確に評価する観点から、ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、好ましくはヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸である。ＴＲＰＡ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：１に示される塩基配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００７３３２としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸の塩基配列である。なお、ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが陽イオンを透過させる生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＡ１の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１又は数個のヌクレオチド残基の置換、欠失又は挿入を有する変異型核酸であってもよい。

変異型核酸としては、例えば、（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔｔｏｏｐｅｎｇａｐ１１、Ｃｏｓｔｔｏｅｘｔｅｎｄｇａｐ１、ｅｘｐｅｃｔｖａｌｕｅ１０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ１１の条件（デフォルト値）下、評価対象の配列をアライメントして算出される配列相同性の値が、ＴＲＰＡ１が有する生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を少なくとも発現するポリペプチドである核酸、
（Ｂ）配列番号：２において、１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を少なくとも発現するポリペプチドである核酸、
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。

なお、本明細書において、「ストリンジェントな条件」は、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸によりコードされるポリペプチドの生理学的機能と同等又はそれ以上の生理学的機能を有するポリペプチドをコードする核酸を得る観点から、好ましくは配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸と、配列番号：１に対する配列相同性が少なくとも６０％である塩基配列からなる核酸とが特異的にハイブリダイゼーションする条件である。前記ストリンジェントな条件としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸とハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５重量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中、室温、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度条件で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度条件下での洗浄を行なう条件などが挙げられる。

ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、例えば、配列番号：１に示される塩基配列に基づき作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：１に示される塩基配列に基づき設計され、合成された２種のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などにより得られる。

形質転換方法は、用いられる宿主細胞の種類に応じた方法であればよい。形質転換方法としては、例えば、モレキュラークローニング：アラボラトリーマニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールドスプリングハーバープレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕などに記載されたエレクトロポレーション法、リポフェクション法、トランスフェクション法、パーティクルガン法などが挙げられる。

組換えベクターは、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を、慣用のベクターと連結させることにより得られるベクターである。ベクターは、調製が容易であり、効率よく宿主細胞に導入することができ、かつ宿主細胞内でＴＲＰＡ１を効率よく発現させることができるベクターであればよい。ベクターは、形質転換後の細胞のなかから外因性ＴＲＰＡ１発現細胞を選択する観点から、好ましくは選択マーカー遺伝子を有するベクターである。また、ベクターは、必要により、ＴＲＰＡ１を連結させるための部位の上流に、発現プロモーターを有していてもよい。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。

プラスミドベクターとしては、特に限定されないが、例えば、大腸菌のプラスミドベクター、酵母のプラスミドベクターなどが挙げられる。また、ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。

発現プロモーターは、宿主細胞内でＴＲＰＡ１を発現させるに適したプロモーターであればよい。発現プロモーターは、用いられる宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。

前記宿主細胞としては、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、特に限定されないが、例えば、動物細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。これらのなかでは、ヒトにおけるＴＲＰＡ１の生理学的機能を十分に再現する観点から、好ましくは動物細胞である。動物細胞としては、例えば、ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞などが挙げられる。サル細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＯＳ−７細胞などが挙げられる。マウス細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられる。ヒト細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。前記宿主細胞のなかでは、ヒトの組織において、ＴＲＰＡ１を活性化する物質を評価する観点及びヒトにおける感覚刺激をもたらす被験物質を評価する観点から、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞が好ましい。これらのなかでは、温度感受性ＴＲＰチャネルがほとんど発現していない観点から、ＨＥＫ２９３細胞がより好ましい。

形質転換後の細胞からの外因性ＴＲＰＡ１発現細胞の選択は、例えば、用いられた組換えベクターが選択マーカー遺伝子を有する場合、選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養することなどにより行なうことができる。また、得られた細胞が外因性ＴＲＰＡ１発現細胞であることの確認は、例えば、細胞を、１〜１０ｍＭパラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することにより行なうことができる。細胞が外因性ＴＲＰＡ１発現細胞である場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、パラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも大きくなる。

被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞との接触は、例えば、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを、ＴＲＰＡ１発現細胞の培養に適した培地に添加し、得られた混合物をインキュベーションすること、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを混合し、得られた混合物をインキュベーションすることなどにより行なわれる。

ＴＲＰＡ１発現細胞の培養に用いられる培地としては、当該ＴＲＰＡ１発現細胞が生育するのに適した成分、例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質など）、血清（例えば、ウシ胎仔血清など）、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどを成分とする培地であればよい。前記培地は、慣用の基本培地に、前記成分を補った培地であってもよく、市販されている培地であってもよい。基本培地としては、特に限定されないが、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地などが挙げられる。ＴＲＰＡ１発現細胞の培養に用いられる培地は、ＴＲＰＡ１発現細胞の種類により培養条件が異なるため、一概に決定することができない。例えば、用いられるＴＲＰＡ１発現細胞が、ＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞である場合、ＴＲＰＡ１発現細胞の培養に用いられる培地として、１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地などが用いられる。

被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞との接触に際して、被験物質の量は、被験物質の種類に応じて適宜設定することができる。

また、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞との接触に際して、ＴＲＰＡ１発現細胞の数は、試験データの信頼性の観点から、１視野（データ解析範囲）あたり、好ましくは１×１０¹細胞以上、より好ましくは１×１０²細胞以上であり、細胞の間隔を確保し、細胞が密になりすぎない観点から、好ましくは３×１０^２細胞以下、より好ましくは２×１０^２細胞以下となるようにすることができる。

さらに、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞との接触に際して、アルカリ性溶液の量は、用いられるアルカリ性溶液の種類により異なるので、一概に決定することができない。通常、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞との混合物中におけるアルカリ性溶液の濃度は、有効な緩衝効果を発揮する観点から、好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上であり、浸透圧に影響させない観点から、好ましくは５０ｍＭ以下、より好ましくは３０ｍＭ以下である。

被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを含む混合物のｐＨは、ＴＲＰＡ１の生理学的機能に対する被験物質の作用の発現が増強されるｐＨで、かつＴＲＰＡ１発現細胞が生育できるｐＨであればよい。通常、前記混合物のｐＨは、８〜１０である。

なお、ＴＲＰＡ１発現細胞とアルカリ性溶液と被験物質とを接触させるに先立って、生理学的機能を発現させるに適した状態にＴＲＰＡ１発現細胞を維持するために、必要に応じて、ＴＲＰＡ１発現細胞を、任意の時間培養してもよい。

ＴＲＰＡ１発現細胞の培養方法は、用いられる細胞の種類に応じた方法であればよく、例えば、単層静置培養法、浮遊培養法、回転培養法、三次元担体培養法などの方法が挙げられる。また、培養温度、培養時間、培養液のｐＨ、二酸化炭素濃度などの培養条件は、用いられる宿主細胞に応じて適宜設定される。ＴＲＰＡ１発現細胞に用いられる宿主細胞がＨＥＫ２９３細胞である場合、ＴＲＰＡ１発現細胞は、細胞を良好に生育させる観点から、通常、５体積％二酸化炭素中、３６℃〜３８℃、好ましくは３６．５℃〜３７．５℃で培養される。

被験物質によるＴＲＰＡ１の生理学的機能の活性化は、例えば、細胞内カルシウムイオン濃度、ＴＲＰＡ１を介する電位、これらの組み合わせなどを指標として測定される。

被験物質によるＴＲＰＡ１の生理学的機能の活性化は、例えば、アルカリ性溶液と接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度と、被験物質とアルカリ性溶液と接触させたＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度との差、アルカリ性溶液に接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１を介する電位と、被験物質とアルカリ性溶液とに接触させたＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１を介する電位の差、これらの組み合わせなどを調べることにより測定される。

アルカリ性溶液に接触させたＴＲＰＡ１発現細胞内では、アルカリ性溶液に接触させていないＴＲＰＡ１発現細胞に比べて、ＴＲＰＡ１を介するＴＲＰＡ１発現細胞外からＴＲＰＡ１発現細胞内へのカルシウムイオンの流入量が増大する。したがって、被験物質とアルカリ性溶液とに接触させたＴＲＰＡ１発現細胞では、被験物質に接触させたＴＲＰＡ１発現細胞に比べて、被験物質によるＴＲＰＡ１を介するＴＲＰＡ１発現細胞外からＴＲＰＡ１発現細胞内へのカルシウムイオンの流入量が相対的に増大し、細胞内カルシウムイオン濃度の増加の幅が大きくなる。よって、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞との接触により、細胞内カルシウムイオン濃度をより高感度で測定することができるため、前記ＴＲＰＡ１の生理学的機能の活性化は、細胞内カルシウムイオン濃度を指標として測定することが好ましい。

細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法としては、例えば、カルシウムキレート化剤に基づく蛍光試薬（以下、「蛍光カルシウム指示薬」ともいう）をＴＲＰＡ１発現細胞に導入し、細胞内のカルシウムイオンに前記蛍光カルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンに結合した蛍光カルシウム指示薬の蛍光強度を介して、間接的に調べる方法などが挙げられる。前記蛍光カルシウム指示薬としては、例えば、カルシウムイオンに対する結合量によってその蛍光特性が変化する試薬であればよく、特に限定されないが、例えば、ＦＵＲＡ２、ＦＵＲＡ２−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３などが挙げられる。

この場合、被験物質がＴＲＰＡ１活性化物質であることの判断基準としては、例えば、〔Ｉ〕アルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞に比べて、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度が、増加していること、〔ＩＩ〕被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度と、被験物質と中性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度との差が、ＴＲＰＡ１の既知のアゴニストとアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度と、ＴＲＰＡ１の既知のアゴニストと中性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させたときのＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度との差と同じであるかそれよりも大きいことなどが挙げられる。

なお、蛍光カルシウム指示薬が２種類の励起波長を有する場合、より精度を高める観点から、各励起波長における蛍光強度から蛍光強度比を算出するのが望ましい。具体的には、例えば、蛍光カルシウム指示薬であるＦＵＲＡ２−ＡＭの励起波長は、３４０ｎｍ及び３８０ｎｍである。この場合、細胞内カルシウムイオン濃度は、励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度と励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度との蛍光強度比（励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度）により調べることができる。

ＴＲＰＡ１を介する電位の測定方法としては、例えば、パッチクランプ法などが挙げられる。

この場合、被験物質がＴＲＰＡ１活性化物質であることの判断基準としては、例えば、アルカリ性溶液に接触させたＴＲＰＡ１発現細胞における一定の電位下での電流に比べて、被験物質とアルカリ性溶液とに接触させたＴＲＰＡ１発現細胞における前記電位と同じ電位下での電流が、大きいことなどが挙げられる。

本発明のＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法に供することによって、ＴＲＰＡ１の活性化物質であることが判明した被験物質は、ＴＲＰＡ１を介して皮膚などに感覚刺激を引き起こす。本発明のＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法によれば、例えば、化粧品、皮膚外用剤などの成分として用いる化合物などを被験物質として用いることにより、前記化合物などが感覚刺激を引き起こさないかどうかを調べることができる。これにより、感覚刺激を引き起こす物質を予め除外することも可能となるため、本発明のＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法によれば、皮膚トラブルを生じやすい人に適した化粧品、皮膚外用剤などの製造が可能になる。また、本発明のＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法により、感覚刺激を引き起こす物質のスクリーニング、薬理学的評価などを行なうことができる。

本発明の感覚刺激を引き起こす物質の評価方法は、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、該被験物質により、ＴＲＰＡ１の生理学的機能が活性化されるか否かを調べることを特徴とする。

本発明の感覚刺激を引き起こす物質の評価方法は、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させているため、被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞との接触に際してアルカリ性溶液を用いない場合に比べて、被験物質によるＴＲＰＡ１を介する感覚刺激をより高い感度で評価することができるという優れた効果を奏する。このように、本発明の感覚刺激を引き起こす物質の評価方法は、高い感度で感覚刺激を引き起こす物質を評価することができるため、被験物質が少量であっても、この被検物質が感覚刺激を引き起こす物質であるか否かを評価することができる。また、本発明の感覚刺激を引き起こす物質の評価方法は、感覚刺激を引き起こす物質を評価するに際して、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１の生理学的機能が活性化されるか否かを調べているため、感覚刺激を引き起こす物質を高い精度で評価することができるという優れた効果を奏する。

被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞との接触は、前記ＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法における操作と同様の操作を行なうことにより実施することができる。

ＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１の生理学的機能の活性化は、前記ＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法と同様の指標により測定することができる。

被験物質がＴＲＰＡ１活性化物質であることの判断基準は、前記ＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法における被験物質がＴＲＰＡ１活性化物質であることの判断基準と同様である。

本発明の感覚刺激を引き起こす物質の評価方法によれば、例えば、種々の化合物などのなかから、感覚刺激を引き起こす物質をスクリーニングすることができる。また、本発明の感覚刺激を引き起こす物質の評価方法によれば、化粧品、皮膚外用剤などに含まれる成分の薬理学的評価を行なうことができる。

以下に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。

（製造例１）
ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２）に示される塩基配列の６３位〜３８８８位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、である商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＡ１発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔インビトロジェン社製、商品名：ＰＬＵＳＲｅａｇｅｎｔ（プラスリージェント）、カタログ番号：１１５１４−０１５〕６μｌとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミン（登録商標）、カタログ番号：１８３２４−０１２〕４μｌと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）ＩＲｅｄｕｃｅｄ−ＳｅｒｕｍＭｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１）２００μｌとを混合し、混合物ＩＩを得た。

また、５×１０^５細胞のＨＥＫ２９３細胞を、直径３５ｍｍのシャーレ上、１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中、５体積％二酸化炭素、３７℃で、７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。

得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを導入し、ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。

（実験例１）
溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製した。得られた溶媒Ａを実験例１の試験液とした。

（実験例２）
溶媒Ｂ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）〕を調製した。得られた溶媒Ｂを実験例２の試験液とした。

（実験例３）
被験物質として、ＴＲＰＡ１の既知のアゴニストであるイシリン〔和光純薬工業（株）製、カタログ番号：４２０−０３７−Ｍ００１〕を、最終濃度が１０μＭとなるように、溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕に添加し、実験例３の試験液を調製した。

（実験例４）
実験例３における溶媒Ａに代えて、アルカリ性溶液である溶媒Ｂ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）〕を用いたことを除き、実験例１と同様の操作を行なうことにより、実験例４の試験液を調製した。

（実験例５）
被験物質として、ＴＲＰＡ１の既知のアゴニストであるシンナムアルデヒド〔和光純薬工業（株）製、カタログ番号：０３１−０３４５３〕を、最終濃度が１００μＭとなるように、前記溶媒Ａに添加し、実験例５の試験液を調製した。

（実験例６）
実験例５における溶媒Ａに代えて、アルカリ性溶液である溶媒Ｂを用いたことを除き、実験例５と同様の操作を行なうことにより、実験例６の試験液を調製した。

（実験例７）
被験物質として、ＴＲＰＡ１の既知のアゴニストであるイソチオシアン酸アリル〔和光純薬工業（株）製、カタログ番号：０１６−０１４６３〕を、最終濃度が５μＭとなるように、前記溶媒Ａに添加し、実験例７の試験液を調製した。

（実験例８）
実験例７における溶媒Ａに代えて、アルカリ性溶液である溶媒Ｂを用いたことを除き、実験例７と同様の操作を行なうことにより、実験例８の試験液を調製した。

（実施例１）
前記製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地中、室温で６０分間インキュベーションして、前記ＴＲＰＡ１発現細胞にＦＵＲＡ２−ＡＭを導入した。

得られたＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を、循環定温チャンバー付蛍光測定装置（浜松ホトニクス株式会社製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０）の各チャンバーに入れた。その後、チャンバー中のＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を、被験対象となる試験液の溶媒と同じ溶媒で洗浄した。

つぎに、洗浄後のＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、試験液を入れ、洗浄後のＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞と試験液とを混合した。チャンバー中の混合物のｐＨは、ＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞と試験液との混合直後において、チャンバーに入れた試験液が、実験例１、３、５及び７それぞれの試験液である場合、ｐＨ７．４であり、チャンバーに入れた試験液が、実験例２、４、６及び８それぞれの試験液である場合、ｐＨ９．０であった。

その後、チャンバーにおいて、試験液を循環させながら、励起波長３４０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入され、細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度_340nm」という）及び励起波長３８０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入されたＦＵＲＡ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度_380nm」という）を測定した。測定された蛍光強度_340nm及び蛍光強度_380nmから、蛍光強度比（蛍光強度_340nm／蛍光強度_380nm）を算出した。

実験例１〜８で得られた試験液に接触させたＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ２−ＡＭに基づく蛍光強度比を図１に示す。図１中、バー１は、実験例１の試験液を用いた場合の蛍光強度比、バー２は、実験例２の試験液を用いた場合の蛍光強度比、バー３は、実験例３の試験液を用いた場合の蛍光強度比、バー４は、実験例４の試験液を用いた場合の蛍光強度比、バー５は、実験例５の試験液を用いた場合の蛍光強度比、バー６は、実験例６の試験液を用いた場合の蛍光強度比、バー７は、実験例７の試験液を用いた場合の蛍光強度比、バー８は、実験例８の試験液を用いた場合の蛍光強度比を示す。

図１に示される結果から、バー１、３、５及び７の蛍光強度比に比べて、バー２、４、６及び８の蛍光強度比が大きいため、被験物質と中性の溶液とに接触させたＴＲＰＡ１発現細胞を用いる場合に比べて、被験物質とアルカリ性溶液とに接触させたＴＲＰＡ１発現細胞を用いることによって、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を、より高感度で測定することができることがわかる。したがって、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、被験物質によりＴＲＰＡ１の生理学的機能が活性化されるか否かを調べることにより、高感度でＴＲＰＡ１の活性化物質を評価することができることが示唆される。

また、バー２の蛍光強度比に比べて、バー４、６及び８それぞれの蛍光強度比が大きいため、イシリン、シンナムアルデヒド及びイソチオシアン酸アリルは、いずれも、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を活性化させることが知られているパラオキシ安息香酸メチルエステルのように、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を活性化させることが示唆される。なお、パラオキシ安息香酸メチルエステルは、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を活性化させることにより、細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの流入量を増加させ、感覚刺激を引き起こすことが知られている。したがって、かかる結果から、イシリン、シンナムアルデヒド及びイソチオシアン酸アリルは、いずれも、パラオキシ安息香酸メチルエステルに比べて、より強い感覚刺激を引き起こす物質であることが示唆される。

実験例１〜８で得られた試験液に接触させたＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ２−ＡＭに基づく蛍光強度比を示すグラフである。

Claims

被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを含む混合物のｐＨが８〜１０となるように調整して接触させ、該被験物質により、ＴＲＰＡ１の生理学的機能が活性化されるか否かを調べることを特徴とするＴＲＰＡ１の活性化物質の評価方法。
前記ＴＲＰＡ１の生理学的機能の活性化を、細胞内カルシウムイオン濃度を指標として測定する請求項１に記載の評価方法。
前記ＴＲＰＡ１発現細胞が、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を発現可能に宿主細胞に導入することにより得られる細胞である請求項１又は請求項２に記載の評価方法。
前記宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞又はＮＩＨ３Ｔ３細胞である請求項３に記載の評価方法。
被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを、被験物質とアルカリ性溶液とＴＲＰＡ１発現細胞とを含む混合物のｐＨが８〜１０となるように調整して接触させ、該被験物質により、ＴＲＰＡ１の生理学的機能が活性化されるか否かを調べることを特徴とする感覚刺激を引き起こす物質の評価方法。