JP5381741B2 - 光学的測定装置及び光学的測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、微小粒子などの試料を識別する光学的測定装置及び光学的測定方法に関する。より詳しくは、特定波長の光が照射されたときに試料から発せられる蛍光や散乱光を検出し、その種類などを識別する技術に関する。

一般に、細胞、微生物及びリポソームなどの生体関連微小粒子を識別する場合は、フローサイトメトリー（フローサイトメーター）を用いた光学的測定方法が利用されている（例えば、非特許文献１参照。）。フローサイトメトリーは、流路内を１列になって通流する微小粒子に特定波長のレーザ光を照射し、各微小粒子から発せられた蛍光又は散乱光を検出することで、複数の微小粒子を１個ずつ識別する方法である。

具体的には、フローセル内において、測定対象の微小粒子を含むサンプル液と、その周囲を流れるシース（鞘）液とで層流を形成し、サンプル液中に含まれる複数の微小粒子を１列に並べる。その状態でフローセルにレーザ光を照射すると、微小粒子がレーザービームを横切るように１個ずつ通過する。このとき、レーザ光により励起されて各微小粒子から発せられた蛍光及び／又は散乱光を、ＰＤ（Photo diode；フォトダイオード）、ＣＣＤ（Charge Coupled Device；電荷結合素子）又はＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube；光電子増倍管）などの光検出器を用いて検出する。

そして、光検出器で検出した光を電気的信号に変換して数値化して統計解析を行い、微小粒子の大きさ及び構造、構成するタンパク質などの情報から微小粒子の種類を判定する。また、従来、蛍光や散乱光に代えて、非線形ラマン散乱光を検出することにより、細胞などの生体関連微小粒子の内部構造を分析するフローサイトメーターも提案されている（特許文献１参照）。

一方、前述したフローサイトメトリーにおいて、試料を定量的及び安定的に分析するためには、試料に照射される励起光の光量を常に一定にしておくことが望ましい。しかしながら、一般に、励起光のビームスポットは数十μｍと小さく、また、ビームスポット内でも、３次元方向（光軸深さ方向及び光軸と直交する方向）において、パワー密度にばらつきが生じてしまう。

このため、励起光のビームスポットの特定位置に、測定対象の試料を正確に投入する必要があり、従来、励起光の照射位置と試料の通流位置とを位置合わせする方法が提案されている（特許文献２〜４参照。）。例えば、特許文献２に記載のフローサイトメーターでは、先ず、テスト用サンプルを含むテストサンプル液を流し、散乱光又は蛍光の強度が最も高くなるように、サンプル液流の位置を調整した後、測定対象の試料を含むサンプル液を流して測定を行っている。

また、特許文献３に記載の流動粒子分析装置では、前方散乱光、側方散乱光又は後方散乱光から、光分割器を介して取りだした検出光（散乱光）を、４分割フォトダイオードやエリアＣＣＤなどによって検出している。そして、その検出位置から、励起光の中心とシースフローの中心との位置ずれを検出し、この位置ずれが所定の範囲内に入るように、フローセルの位置を調節している。

更に、特許文献４に記載の平板状フローセル測定装置では、先ず、試料が流れていない状態で、流路の幅方向に移動させながら励起光を照射して散乱光の測定を行い、流路側壁からの散乱光を測定することにより、流路の位置を求める。そして、その位置情報に基づいて、流路の中心に励起光のビームスポットがくるように、ステージを移動させて平板状フローセルの位置合わせをしている。

特開２００９−２５８０７１号公報 特開２００６−１７０６８７号公報 特開平９−１６６５４１号公報 特開２００４−６９６３４号公報

中内啓光監修，「細胞工学別冊 実験プロトコルシリーズ フローサイトメトリー自由自在」，第２版，株式会社秀潤社，２００６年８月３１日発行

しかしながら、前述した従来の技術には、以下に示す問題点がある。フローサイトメトリーのように光を利用した分析方法において、測定対象の試料を定量的かつ安定的に分析しようとすると、ビームスポット内であってもビーム強度が許容できる範囲は、数μｍと極めて小さくなる。このため、ビームスポットの特定位置に、測定対象の試料を正確に通流させる必要があるが、試料の通流位置を常に一定に保つことは難しい。

特に、マイクロ流路が形成された分析チップを使用して測定を行う場合は、流路の形状のばらつきや送液速度の変化によって、サンプル液の通流位置が変動しやすい。一方、分析チップの形状のばらつきをなくすには、製造時の加工精度を上げることが考えられるが、その場合、コストアップや歩留まりの低下が問題となる。

また、特許文献２に記載のフローサイトメーターのように、測定前に、テストサンプル液を流して位置合わせをする方法は、微小粒子から発散される散乱光の信号強度のみを検出する方法であり、必然的に散乱信号の最大値を示した位置が最適位置となる。従って、この方法では、調整用信号に極性は存在せず、アクチュエータを動かしながら最大値になっているかを判別する動作が必要となるため、瞬時に最適値に調整を行うことが困難であり、リアルタイムでサーボをかけることができないという問題点がある。

また、検出信号の散乱強度は測定対象物の粒子径に依存し、測定する微小粒子によって検出最大値が異なるため、特許文献２に記載の方法では、均一な大きさの粒子を調整に使用しないと、精度良く調整を行うことができない。更に、このような信号強度のみを検出する調整方法においては、３軸調整などの多軸調整では、各軸の移動に伴う信号強度変化が独立しておらず、複雑な調整シーケンスが必要となる。

一方、特許文献３に記載の装置のように、散乱光の検出位置に基づいてフローセルを位置決めする方法は、光軸に直交する方向については粒子検出位置を検知することができるが、光軸方向については検知することができないという問題点がある。即ち、この方法では、光軸と直交する方向にのみ極性をもった検出信号を得ることが可能であり、光軸方向では微小粒子から発散される散乱光の信号強度のみを検出しているため、調整用信号に極性は存在せず、アクチュエータを動かしながら、最大値になっているか否か判別する動作が必要となる。このため、瞬時に最適値に調整を行うことは困難であり、リアルタイムでサーボをかけることができない。

また、微小粒子から生じる散乱光は、非常に微弱であり、その信号は測定対象である粒子の大きさに依存する。このため、測定対象の粒子が小さくなるほど、十分な信号強度を得ることが困難になり、十分な検出精度を得るための何らかの対策が必要となる。そして、前述したように、検出信号の散乱強度は測定対象物の粒子径に依存し、測定する粒子により検出最大値が異なるため、この特許文献３に記載の方法においても、均一な大きさの粒子を調整用に使用しないと、精度よく調整を行うことができないという問題点がある。

また、特許文献４に記載の装置のように、流路側壁からの散乱光に基づいてフローセルの位置決めする方法は、流路の中心部を探し出すことは可能であるが、フローセルの状態やシース液及びサンプル液の流速変化などにより、測定対象の微小粒子が中心部を通過している保証はない。このため、高精度な分析を目的とした装置では、十分な精度を保証することが難しいという問題点がある。

そこで、本発明は、測定対象が微小粒子であっても良好な位置信号調整信号を得ることができ、測定対象の試料（微小粒子）の位置を精度良く検出し、試料から発せられる蛍光や散乱光などを効率よく測定ことが可能な光学的測定装置及び光学的測定方法を提供することを主目的とする。

本発明に係る光学的測定装置は、試料に光を照射する光照射部と、光が照射された試料から発せられた散乱光を検出する散乱光検出部とを有し、前記散乱光検出部は、少なくとも、試料から発せられた散乱光をＳ偏光成分とＰ偏光成分とに分光する偏光ビームスプリッターと、前記Ｐ偏光成分を受光して散乱光の強度を検出する第１検出器と、前記Ｓ偏光成分を受光してその受光位置の変化から試料位置を検出する第２検出器とを備えるものである。
本発明においては、散乱現象により生じたＳ偏光成分だけを取り出し、その変化から試料位置を検出しているため、試料が小さく、散乱光が微弱な場合でも、精度よくその位置を検出することが可能である。このように試料位置を高精度で検出できると、それに基づき試料位置を調整することができるため、試料から発せられる蛍光や散乱光などを効率よく測定することが可能となる。
この測定装置は、マイクロ流路を備えた分析チップを有していてもよく、その場合、光照射部はマイクロ流路内を通流する試料に光を照射する。
また、偏光ビームスプリッターと第２検出器との間に、シリンドリカルレンズを配設し、非点収差法により光軸方向における試料位置を検出することもできる。
更に、試料と偏光ビームスプリッターとの間に、試料に照射されずに透過した光を除去する遮光マスクを配置してもよい。
更にまた、光が照射された試料から発せられた蛍光を検出する蛍光検出部を設けることもでき、その場合、試料と蛍光検出部及び散乱光検出部との間に、蛍光と散乱光とを分離するミラーを配設することが望ましい。
更にまた、第２検出器での検出結果に基づいて試料位置を調整する試料位置調整部を設けてもよい。

本発明に係る光学的測定方法は、測定対象の試料に光を照射する工程と、前記試料から発せられた散乱光をＳ偏光成分とＰ偏光成分とに分光する工程と、Ｐ偏光成分を測定して散乱光の強度を検出する工程と、Ｓ偏光成分を測定して非点収差法により試料位置を検出する工程と、を有する。
本発明においては、試料での散乱により生じたＳ偏光成分を取り出し、非点収差法により試料位置を検出しているため、検出精度が高い。このため、検出結果に基づき、試料位置を調整することで、高感度での測定を安定して行うことができる。

本発明によれば、Ｐ偏光成分とＳ偏光成分とを分離し、Ｓ偏光成分の変化から試料位置を検出しているため、測定対象の試料の位置を精度良く検出することができると共に、微弱な散乱光を励起光及び迷光と分離することができるため、測定対象が微小な粒子であっても、良好な位置検出信号を得ることができるため、試料から発せられる蛍光や散乱光などを効率よく測定することが可能となる。

本発明の第１の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。 遮光マスク４１の構成を模式的に示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。 （ａ）はマイクロ流路２２におけるサンプル液の通流位置を示す図であり、（ｂ）はマイクロ流路２２内を通流する液の速度分布を示す図である。 本発明の第３の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。 （ａ）及び（ｂ）はシリンドリカルレンズ５０を用いた検出例を示す図である。

以下、本発明を実施するための形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本発明は、以下に示す各実施形態に限定されるものではない。また、説明は、以下の順序で行う。

１．第１の実施の形態
（散乱光から試料位置を検出する光学的測定装置の例）
２．第２の実施の形態
（マイクロ流路を備える分析チップを使用した装置の例）
３．第３の実施の形態
（シリンドリカルレンズを配設した装置の例）

＜１．第１の実施の形態＞
［光学的測定装置の全体構成］
図１は本発明の第１の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。図１に示すように、本実施形態の光学的測定装置１には、例えば測定用セル２０内の試料２に、励起光５を照射する光照射部３と、励起光５が照射された試料２から発せられた蛍光６及び散乱光７などを検出する検出部４が設けられている。

［試料２について］
本実施形態の光学的測定装置１により測定される試料２は、励起光５を照射することにより、蛍光６及び散乱光７を発するものであればよく、例えば、細胞やマイクロビーズ等の微小粒子、ウィルス、バクテリア、酵母などが挙げられる。また、試料２は、１又は複数の蛍光色素で修飾されていてもよい。

［光照射部３の構成］
光照射部３は、励起光５を発する光源３０と、この励起光５を試料２に向けて集光する対物レンズ３１などを備えている。ここで使用する光源３０は、測定内容などに応じて適宜選択することができるが、例えばレーザダイオード、ＳＨＧ(Second Harmonic Generation)レーザ、ガスレーザ及び高輝度ＬＥＤ（Light Emitting Diode:発光ダイオード）などを使用することができる。

更に、この試料２の手前に配置される対物レンズ３１は、開口数ＮＡが低いことが望ましい。これにより、測定対象である微小粒子に対して励起ビームスポットが小さくなりすぎるのを避け、かつ焦点深度を広く確保することが可能となるため、励起光の位置決めマージンを広くすることができる。

更にまた、光源３０と対物レンズ３１との間に、特定波長の光のみを透過し、それ以外の光は反射する特性をもつバンドパスフィルター（図示せず）を配設することもできる。これにより、不要な光成分を除去することができるため、特にＬＥＤや白色光源を励起光として用いる場合には有効な手段である。なお、光照射部３は、特定波長の光（励起光５）を、試料２に照射可能な構成であればよく、光源、レンズ及び光学フィルターなどの各種光学部品の種類及び配置は適宜選択可能であり、前述した構成に限定されるものではない。

［検出部４の構成］
検出部４には、少なくとも、試料２から発せられた蛍光６を検出する蛍光検出器（図示せず）、並びに試料２から発せられた散乱光７を検出する散乱光強度検出器４６及び試料位置検出器４９が設けられている。また、試料２と蛍光検出器との間には、試料２側から順に、試料２から発せられた蛍光６及び散乱光７を集光する対物レンズ４０、励起光５を除去する遮光マスク４１、蛍光６と散乱光７を分離するダイクロックミラー４２が設けられている。

一方、ダイクロックミラー４２と散乱光強度検出器４６との間には、ダイクロックミラー４２側から順に、偏光ビームスプリッター（Polarizing Beam Splitter：ＰＢＳ）４３、集光レンズ４４、ピンホール４５が配設されている。また、偏光ビームスプリッター４３と試料位置検出器４９との間には、偏光ビームスプリッター４３側から順に、集光レンズ４７及びピンホール４８が配設されている。

（対物レンズ４０）
検出器側の対物レンズ４０は、開口数ＮＡが高いことが望ましく、これにより、測定対象である微小粒子から生じる微弱な散乱光及び蛍光を高感度に計測することが可能となる。

（遮光マスク４１）
励起光５の照射により、試料２からは、励起光５と同波長の散乱光７と、励起光５とは波長が異なる蛍光６が発せられるが、検出部４側に入射する光には、試料２に照射されずに測定セル２０を透過した励起光５も含まれる。しかしながら、試料２から発せられる蛍光６及び散乱光７は、励起光５に比べて非常に微弱な光であり、検出部４側に入射した光から励起光５を分離する必要がある。そこで、本実施形態の光学的測定装置１においては、検出部４に入射した光から励起光５を除去するため、対物レンズ４０とダイクロックミラー４２との間に、遮光マスク４１を配設している。

図２は遮光マスク４１の構成を模式的に示す図である。図２に示すように、遮光マスク４１は、中心部分に遮光領域４１ａが設けられ、その周囲に透過領域４１ｂが設けられている。この遮光マスク４１では、開口数ＮＡが低い対物レンズ３１を介して検出部４に入射する励起光５は、中心部分に設けられた遮光領域４１ａで遮光されるようになっている。一方、試料２から広い角度で出射される蛍光６や散乱光７は、遮光マスク４１の透過領域４１ｂを通過し、各検出器に入射する。

ここで、遮光マスク４１の遮光領域４１ａは、より大きい方が励起光５の遮光性に優れるが、その場合、信号強度が小さい蛍光６及び散乱光７の感度が低下してしまうという問題がある。このため、蛍光６及び散乱光７を高感度で検出するためには、遮光マスク４１の遮光領域４１ａは、励起光のＮＡを遮光できる最低限の大きさであることが望ましい。

なお、遮光領域４１ａが励起光のＮＡを大幅に超えると、蛍光６及び散乱光７の検出感度が低下することがある。また、遮光領域４１ａが励起光のＮＡと同等又は励起光のＮＡ未満であると、透過領域４１ｂを通過する光にビーム強度が強い励起光が混入してしまい、蛍光及び励起光の測定に支障をきたすことがある。また、光学部品の内部反射などによる迷光（励起光５）の混入も、測定に支障をきたすので、迷光及び散乱光以外の励起光成分は除去することが望ましい。

（ダイクロックミラー４２）
ダイクロックミラー４２は、特定波長の光のみを反射し、それ以外の波長成分を透過するものであり、本実施形態の光学的測定装置１では、散乱光７（励起光５を含む）を反射し、蛍光６を透過するものを使用する。そして、このダイクロックミラー４２によって、蛍光６と散乱光７（遮光マスク４１で除去できなかった励起光５を含む）とが分離される。

（蛍光検出器）
蛍光検出器は、試料２から発せられる蛍光６を検出可能なものであればよく、特に限定されるものではないが、例えばＰＤ（Photo diode）、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）又はＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube）などを使用することができる。

（偏光ビームスプリッター４３）
偏光ビームスプリッター４３は、入射する非偏光を、振動方向が直交する２つの偏光に分離するものであり、本実施形態の光学的測定装置１では、散乱光７を、Ｓ偏光７ｓとＰ偏光７ｐとに分離する。具体的には、偏光ビームスプリッター４３により、入射した散乱光７のうちＰ偏光７ｐを透過し、Ｓ偏光７ｓを反射する。これにより、Ｐ偏光７ｐのみが散乱光強度検出器４６に入射し、Ｓ偏光７ｓのみが試料位置検出器４９に入射することとなる。

なお、本実施形態の光学的測定装置１で使用される偏光ビームスプリッター４３は、例えば励起光５と同じの波長の光を分光可能なものあればよく、これにより、分光による損失を抑制することができる。

（集光レンズ４４，４７）
集光レンズ４４，４７は、Ｐ偏光７ｐ及びＳ偏光７ｓを、それぞれ散乱光強度検出器４６及び試料位置検出器４９に向けて集光するものであり、例えば凸レンズ、フレネルレンズ、球面ミラーなどを使用することができる。

（ピンホール４５，４８）
ピンホール４５，４８は、それぞれ散乱光強度検出器４６及び試料位置検出器４９に入射するＰ偏光７ｐ又はＳ偏光７ｓから、外乱成分を除去するものであり、例えば遮光プレート、ホログラム、光ファイバーなどを使用することができる。

（散乱光強度検出器４６）
散乱光強度検出器４６は、試料２から発せられた前方散乱光の強度を検出するものであり、偏光ビームスプリッター４３により分光されたＰ偏光７ｐを検出可能なものであればよい。このように、前方散乱光（Ｐ偏光７ｐ）の強度を検出することにより、例えば試料２の大きさに関する情報を得ることができる。

（試料位置検出器４９）
散乱光位置検出器４９は、試料２から発せられた前方散乱光７の偏光角の変化を検出するものであり、例えば４分割フォトダイオードやＣＣＤなどを使用することができる。試料２において、励起光５に散乱現象が起きると、その前後、即ち、励起光５と散乱光７とで偏光角に変化が生じる。そして、本発明者は、この散乱現象による偏光角変化を利用することにより、遮光マスク４１で除去できなかった励起光５及び光学部品の内部反射などにより生じる迷光を、偏光ビームスプリッター４３を用いて、散乱光７と完全に分離し、散乱光の発光点位置、即ち、試料２の位置を高精度に検出可能となることを見出した。

例えば、光源３０から発せられる励起光５の偏光をＰ偏光のみとし、試料２において生じた散乱光７から偏光角が回転した成分（Ｓ偏光７ｓ）のみを分離して、散乱光強度検出器４９で検出することにより、測定セル２０内における試料２の位置を知ることができる。これにより、測定された試料２の位置に応じて、励起光５の焦点位置を高精度に調整することができるようになるため、高感度で安定した測定を実現することができる。

［光学的測定装置１の動作］
次に、本実施形態の光学的測定装置１の動作について説明する。本実施形態の光学的測定装置１を使用して試料２を光学的に測定する際は、先ず、光照射部３の光源３０から励起光５を出射し、測定用セル２０内の試料２に照射する。そして、試料２から発せられた蛍光６及び散乱光７を、検出部４の対物レンズ４０で捕捉する。

その際、検出部４には、蛍光６及び散乱光７と共に、試料２に照射されずに測定セル２０を透過した励起光５も入射するが、この励起光５は、対物レンズ４０を通過した後、遮光マスク４１によって大部分が除去される。その後、ダイクロックミラー４２により、蛍光６と散乱光７（遮光マスク４１で除去できなかった励起光５を含む）とが分離され、蛍光６については、蛍光検出器（図示せず）によって検出される。

一方、散乱光７は、偏光ビームスプリッター４３によって、Ｓ偏光７ｓとＰ偏光７ｐとに分光される。そして、Ｐ偏光７ｐは、従来同様、散乱光強度検出器４６によりその強度を測定し、例えば試料２の大きさに関する情報を得る。また、Ｓ偏光７ｓは、集光レンズ４７により散乱光位置検出器４９の検出部に結像させて、その位置（結像位置）から試料２の位置を検出し、その結果に応じて、測定用セル２０の位置や励起光５の焦点位置を調整する。

なお、本実施形態の光学的測定装置１では、別途、散乱光位置検出器４９での検出結果に基づいて、測定用セル２０の位置や励起光の焦点位置を調整する調整部（図示せず）を設け、これらの調整を自動で行うようにしてもよい。

このように、本実施形態の光学的測定装置１では、遮光マスク４１で除去しきれなかった励起光５を含む散乱光７から、散乱光７のみが偏光角変化を生じることを利用し、散乱光７の発光点、即ち試料２の位置情報のみを検出している。このため、測定用セル２０の位置や励起光５の焦点位置を、高精度で調整することができる。これにより、試料２を、定量的かつ安定的に分析することができる。また、光利用効率が最も高い位置で検出を行うことが可能となるため、従来に比べて、高感度かつ高精度で測定することができる。

なお、本実施形態の光学的測定装置１は、微小粒子や細胞などの分析装置に限らず、例えば、製造装置、検査装置及び医療用装置などとしても使用することができる。

＜２．第２の実施の形態＞
［光学的測定装置の全体構成］
図３は本発明の第２の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す斜視図である。なお、図３においては、前述した第１の実施形態の光学的測定装置の構成要素と同じものには、同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。図３に示すように、本実施形態の光学的測定装置１１は、マイクロ流路が形成された分析チップ２１を使用して測定を行うものであり、マイクロチップ型ＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorting）システムに使用される。

本実施形態の光学的測定装置１１は、分析チップ２１に設けられた流路を通流する試料２ａ，２ｂに励起光を照射する光照射部と、励起光５が照射された試料２ａ，２ｂから発せられた蛍光６及び散乱光７などを検出する検出部を備えている。この光学的測定装置１１における光照射部には、励起光５を発する光源３０と、励起光５を試料２に向けて集光する対物レンズ３１との間に、半導体レーザ３０のビーム形状を成形するコリメータレンズ３２が設けられている。

また、検出部には、試料２から発せられた蛍光６を検出するための蛍光検出器５０及び回折格子５１と、散乱光７を検出するための散乱光強度検出器４６及び試料位置検出器４９とが設けられている。そして、試料２から発せられた光は、ダイクロックミラー４２により蛍光６と散乱光７に分離され、蛍光６は回折格子５１で分光された後、蛍光検出器５０で検出されるようになっている。一方、散乱光７は、偏光ビームスプリッター４３によりＰ偏光７ｐとＳ偏光７ｓとに分光され、それぞれ散乱光強度検出器４６及び試料位置検出器４９で検出される構成となっている。

［分析チップ２１］
本実施形態の光学的測定装置１１で使用する分析チップ２１には、試料２ａ，２ｂを通流させるマイクロ流路２２が設けられている。このマイクロ流路２２は、試料２ａ，２ｂを含むサンプル液の周囲をシース液で囲んで層流を形成し、励起光５が照射される測定領域において、試料２ａ，２ｂが一列に並んで通流するような構成となっている。また、マイクロ流路２２には、測定領域よりも下流側に、採取対象の試料２ａが集められる回収液貯留部２３、又は採取対象外の試料２ｂが集められる排液貯留部２４に連通する複数の分岐流路が設けられている。

更に、分析チップ２１には、マイクロ流路２２の測定領域よりも下流側で、分岐流路の手前に、試料２ａ，２ｂを各分岐流路に流入させるための分取機構２５が設けられている。この分取機構２５の構成は特に限定するものではないが、例えば圧電素子や電磁バルブを使用したもの、アクチュエータなどの可動デバイスを使用したものなどが挙げられる。

図４（ａ）はマイクロ流路２２におけるサンプル液の通流位置を示す図であり、図４（ｂ）はマイクロ流路２２内を通流する液の速度分布を示す図である。なお、図４（ｂ）は図４（ａ）に示すＡ−Ａ線による断面図に相当する。図３に示す分析チップ２１のように、測定領域と分取領域（分取機構２５）とが離れた位置に設けられている場合、分取領域において試料２ａ，２ｂの位置を特定するためには、これらがマイクロ流路２２内を一定速度で通流していることが望ましい。

一方、図４（ｂ）に示すように、マイクロ流路２２内を通流する液は、ハーゲン・ポアズイユの原理により、壁面で遅く中心部で速い速度分布をもつ。そこで、本実施形態の光学的測定装置１１においては、図４（ｂ）に示すように、マイクロ流路２２内に所望の速度でシース液を流し、その中心部にのみサンプル液を流している。これにより、壁面からのダメージを受けずに、試料２ａ，２ｂを一定速度で通流させることができる。

ただし、サンプル液の通流速度を常に一定に保つことは困難であり、その変動により試料２ａ，２ｂの通流位置が変化することがある。このため、本実施形態の光学的測定装置１１では、散乱光の偏光角変化を利用して試料２ａ，２ｂの通流位置を検出し、その結果に基づいて分析チップ１の位置を調整する。

［光学的測定装置１１の動作］
次に、本実施形態の光学的測定装置１１により、分析チップ２１を使用して、複数の試料２ａ，２ｂを個別に測定し、分取する方法について説明する。本実施形態の光学的測定装置１１では、先ず、光照射部の光源３０から励起光５を出射し、分析チップ２１のマイクロ流路２２を通流する試料２ａ，２ｂに照射する。このとき、試料２ａ，２ｂは、マイクロ流路２２内を一列に並んで通流しているため、励起光５を個別に照射することができる。

各試料２ａ，２ｂから発せられた蛍光６及び散乱光７は、検出部の対物レンズ４０で捕捉された後、ダイクロックミラー４２によって蛍光６と散乱光７とに分離される。そして、蛍光６は、回折格子５１で分光された後、蛍光検出器５０で検出される。その結果、採取対象の試料２ａであると判定された場合には、蛍光スペクトル、試料２ａの大きさ及び通流速度などに基づいて最適なタイミングを算出され、分取機構２５に駆動信号が送信される。これにより、分取機構２５が動作し、試料２ａを回収液貯留部２３に流入させる。また、採取対象外の試料２ｂであると判定された場合は、分取機構２５は動作させずに、試料２ｂを排液貯留部２４に流入させる。

一方、散乱光７は、偏光ビームスプリッター４３によって、Ｓ偏光７ｓとＰ偏光７ｐとに分光される。そして、Ｐ偏光７ｐは、散乱光強度検出器４６によりその強度を測定し、例えば試料２ａ，２ｂの大きさに関する情報を得る。また、Ｓ偏光７ｓは、集光レンズ４７により散乱光位置検出器４９の検出部に結像させて、その位置（結像位置）から試料２の位置を検出し、その結果に応じて、分析チップ２１の位置や励起光５の焦点位置を調整する。

このように、本実施形態の光学的測定装置１１は、散乱光７の偏光角変化を検出しているため、試料２ａ，２ｂの通流位置を高精度で検出することができる。そして、その結果に基づいて、励起光５照射のための光学系及び蛍光６・散乱光７を検出するための光学系に対して、分析チップ２１の位置やサンプル液の通流位置を調整することにより、チップの形状精度に依存しない測定をすることができる。これにより、チップの製造コストを低減することもできる。

また、散乱光の偏光角変化の検出信号を基に、サンプル液の通流位置を安定させることにより、流速の変化に対応することが可能となるため、装置の分析速度範囲（流速指定範囲）を拡大することができる。更に、励起光５のパワー密度が最大となる位置又は検出用の対物レンズ４０の焦点位置に、サンプル液を通流させることにより、試料２ａ，２ｂから放出される光（蛍光６，散乱光７）の受光強度を最大にすることできるため、高感度での測定が可能となる。

なお、本実施形態の光学的測定装置１１における上記以外の構成、動作及び効果は、前述した第１の実施形態と同様である。

＜３．第３の実施の形態＞
［光学的測定装置の全体構成］
図５は本発明の第３の実施形態に係る光学的測定装置の構成を模式的に示す図である。なお、図５においては、前述した第１及び第２の実施形態の光学的測定装置の構成要素と同じものには、同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。図５に示すように、本実施形態の光学的測定装置１２は、散乱光の偏光角変化を検出するための光学系の集光レンズ４７とピンホール４８との間に、シリンドリカルレンズ５０が配置されている以外は、前述した第１の実施形態と同様である。

［シリンドリカルレンズ５０］
シリンドリカルレンズ５０は、Ｓ偏光７ｓの結像パターンに楕円の収差を発生させるものであり、例えば、長軸が散乱光位置検出器４９の対角線と平行になるように、４５°の角度で配置される。これにより、非点収差法を用いて、試料２の励起光５における光軸方向の位置を検出することが可能となる。ここで、シリンドリカルレンズ５０としては、例えば凸レンズ、フレネルレンズ、球面ミラーなどを使用することができる。

［光学的測定装置１２の動作］
次に、光学的測定装置１２の動作として、非点収差法を用いて試料２の位置を検出方法について説明する。図６（ａ）及び（ｂ）はシリンドリカルレンズ５０を用いた検出例を示す図である。例えば、図６（ａ）及び（ｂ）に示すように、試料位置検出器４９に４分割の検出器を使用し、分析チップ２１における試料２の通流方向をＡからＢ方向（紙面右方向）とした場合、それと直交する方向（紙面上下方向）をトラッキング方向とする。

これにより得られる楕円状の結像パターンは、試料２から発せられた散乱光７のＳ偏光７ｓを結像させた像であり、図５に示す検出側の対物レンズ４０の焦点位置から励起光５の光軸方向にずれた位置に試料２が存在する場合、このような楕円状となる。一方、対物レンズ４０の焦点位置に試料２が存在する場合は、真円状の像となる。

このような非点収差光学系を用いた検出方法を、試料２の発光点検出に用いることにより、光軸方向とそれと直交する方向の検出を、独立した現象として検出することが可能となる。これは、光学的に独立した現象を利用しているものであり、光軸検出には非点収差による結像パターン変化、及びこれと直交する方向には入射軸倒れによる結像パターンの移動を利用しているためである。これにより、３次元方向に独立して検出を行うことが可能となるため、高精度で簡便な位置制御方法を実現することができる。

この散乱光（Ｓ偏光７ｓ）の結像パターンは、通流方向（Ａ→Ｂ）に移動するが、それと直交する方向には変化しない。そこで、Ａ→Ｄの中間点を基準にすると、（Ａ＋Ｂ）−（Ｃ＋Ｄ）の演算を行うことにより、変位量ＴＥを、試料２の位置に対するエラー信号（Tracking Error）として検出することができる。一方、光軸方向の位置検出には非点収差法が適用できるが、測定対象である試料２が通流している場合は、前述した方法によりトラッキング制御を行い、変位量ＴＥが０で、かつ結像パターンが検出器４９の４分割の中心に位置した時の状態のみを用いて判断を行う必要がある。

また、光軸方向については、（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ）の演算を行うことにより、変位量ＦＥをエラー信号（Focus Error）として検出することができる。ただし、その際、検出器４９の分割中心に試料２の結像パターンが位置していることを判定するため、（Ａ＋Ｄ）−（Ｂ＋Ｃ）＝０となった間、又は和信号（ＳＵＭ＝Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）が最大となった時に検出する必要がある。なお、和信号が分割中心部で最大となるのは、図６（ａ）及び（ｂ）に示す励起光強度分布が、検出器４９の中心部に集中している場合とする。

なお、図６における励起光強度分布が示すように、励起ビームが偏平形状になっており、通流方向において散乱光及び蛍光信号が出力される範囲が小さい場合には、常に分割ディテクタの中心部のみでしか検知しないため、特定時間検出する必要はない。また、サーボ信号の演算方法は、リアルタイムでの演算を行ってもよいし、各チャンネルの値を積分した後（ＡＲＥＡ）、前述した除算を行うことも可能である。更に、各チャンネルの最大値（ＨＩＧＨＴ）を用いて演算を行うこともできる。

一方、本実施形態においては、マイクロ流路における通流方向がＡ→Ｂとなっており、試料２が検出ビームに対して流れ込んでくるため、分析チップ２１の通流方向の位置合わせを行う必要はない。しかしながら、試料２から生じる蛍光及び散乱光を効率よく検知するためには、検出側の対物レンズ４０と励起光５の光軸を一致させる必要がある。図６に示すような４分割の場合、（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ）の演算を用いることで、通流方向における励起光５の位置を最適な位置に調整することができる。

また、一般に、偏光ビームスプリッターは、その偏光分離特性として、僅かながらＰ偏光成分に漏れが生じる。遮光マスク４１を取り除いた場合、全ての励起光５が偏光ビームスプリッターに入射されることになるため、励起光５がＰ偏光のみで構成されていても、分割ディテクタ（試料位置検出器４９）により励起光５の位置検出を行うことが可能である。即ち、本実施形態の光学的測定装置１２は、遮光マスク４１を取り除くことで、励起光５の位置を検出することが可能である。そして、前述した方法と同様の方式を適用することにより、励起光５の集光位置（励起側対物レンズ３１の焦点）を、検出側の対物レンズの焦点位置と３次元的に一致させることもできる。

このように、本実施形態の光学的測定装置１２は、測定対象である試料２の位置及び励起光５の集光位置を３次元的に検出することが可能であり、その検出された信号により、試料２の通流位置（チップ位置）を光学系の焦点位置に高精度に調整することができる。これにより、高感度で安定した測定を実現できる。

また、本実施形態の光学的測定装置１２では、分割ディテクタと非点収差光学系により散乱光の検出を行っているため、極性をもったサーボ信号を取得することができる。これにより、リアルタタイムでサーボをかけることが可能となる。そして、粒子径や散乱光の信号強度によらず、散乱光の結像パターンによりサーボ信号の検出が可能であり、かつ極性判断を行うことが可能であるため、リアルタイムで位置調整を行うことができる。

なお、本実施形態の光学的測定装置１２における上記以外の構成、動作及び効果は、前述した第１及び第２の実施形態と同様である。

１、１１、１２ 光学的測定装置
２ 試料
２ａ 採取対象試料
２ｂ 採取対象外試料
３ 光照射部
４ 検出部
５ 励起光
６ 蛍光
７ 散乱光
７ｐ Ｐ偏光
７ｓ Ｓ偏光
２０ 測定用セル
２１ 分析チップ
２２ マイクロ流路
２３ 回収液貯留部
２４ 排液貯留部
２５ 分取機構
３０ 光源
３１、４０ 対物レンズ
３２ コリメータレンズ
４１ 遮光マスク
４２ ダイクロックミラー
４３ 偏光ビームスプリッター
４４、４７ 集光レンズ
４５、４８ ピンホール
４６、４９ 検出器
５０ シリンドリカルレンズ
５１ 蛍光検出器
５２ 回折格子

Claims (7)

1. 試料に光を照射する光照射部と、
   光が照射された試料から発せられた散乱光を検出する散乱光検出部と、を有し、
   前記散乱光検出部は、少なくとも、
   試料から発せられた散乱光をＳ偏光成分とＰ偏光成分とに分光する偏光ビームスプリッターと、
   前記Ｐ偏光成分を受光して散乱光の強度を検出する第１検出器と、
   前記Ｓ偏光成分を受光してその受光位置の変化から試料位置を検出する第２検出器と、
   を備える光学的測定装置。
2. マイクロ流路を備えた分析チップを有し、前記光照射部は前記マイクロ流路内を通流する試料に光を照射する請求項１に記載の光学的測定装置。
3. 偏光ビームスプリッターと第２検出器との間に、シリンドリカルレンズが配設されており、非点収差法により光軸方向における試料位置を検出する請求項１又は２に記載の光学的測定装置。
4. 試料と偏光ビームスプリッターとの間に、試料に照射されずに透過した光を除去する遮光マスクが配置されている請求項１乃至３のいずれか１項に記載の光学的測定装置。
5. 更に、光が照射された試料から発せられた蛍光を検出する蛍光検出部を有し、
   前記試料と蛍光検出部及び散乱光検出部との間には、蛍光と散乱光とを分離するミラーが配設されている請求項１乃至４のいずれか１項に記載の光学的測定装置。
6. 第２検出器での検出結果に基づいて試料位置を調整する試料位置調整部を有する請求項１乃至５のいずれか１項に記載の光学的測定装置。
7. 測定対象の試料に光を照射する工程と、
   前記試料から発せられた散乱光をＳ偏光成分とＰ偏光成分とに分光する工程と、
   Ｐ偏光成分を測定して散乱光の強度を検出する工程と、
   Ｓ偏光成分を測定して非点収差法により試料位置を求める工程と、
   を有する光学的測定方法。

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