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JP5372380B2 - 結合化合物、免疫原性化合物およびペプチド模倣体 - Google Patents

結合化合物、免疫原性化合物およびペプチド模倣体 Download PDF

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Description

発明の詳細な説明
本発明は生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は結合分子の検出、同定および／または生成に関する。
一般に生体分子である結合分子と、それらの対応するリガンドとの間の相互作用は、生命の中核である。細胞はしばしば、たとえばホルモン、ペプチド、薬物、抗原、エフェクタ分子などの別の分子と、または別の受容体分子と特異的に相互作用または結合することができる受容体分子を有しているか、または含んでおり、たとえば、酵素はその基質と結合し、抗体分子および／またはＴ細胞は抗原と結合し、核酸はたんぱくと結合する。「相互作用または結合」とは、分子力の範囲内で結合分子およびリガンドが互いに接近し、互いの特性に影響を及ぼし得ることを意味する。この接近は、親密性および相互作用の程度を増大させることを含む分子認識の種々のステージに結合分子およびそのリガンドを導き、これらは、常に不可逆的であるわけではないが、結合する。
結合分子は、問題となっているリガンドの認識を可能とする明確な結合部位を含むが故に、結合能力を有する。リガンドもまた、対応する結合部位を有し、２つの結合部位が本質的に空間的な相補性によって相互作用し得るときにのみ、２分子は結合することができる。言うまでもなく、分子は三次元を有し、結合部位は三次元の性質であって、しばしば１つの結合部位の１つ以上の表面突出部または突起部分が他方の１つ以上のポケットまたはくぼみに対応して、ときには誘導適合変化をともない、三次元の鍵と鍵穴配置を形成する。ときには、このような突起部分は、問題となっている分子の単ループを含み、結合部位を本質的に形成するのはこの突起部分のみである。その場合、当業者はしばしばこれらの結合部位が直線状結合部位または連続結合部位を含むと称し、問題となっている分子の直線部分のみが本質的に結合反応の原因である。この専門用語は、たとえば、抗原がたんぱく配列の一部つまり直鎖ペプチドを含んでいる抗体−抗原反応を記載するのに広く使用されている。当業者はしばしば、直線状エピトープつまり連続エピトープについて述べることがあり、連続エピトープでは抗原分子の結合部位（エピトープ）は連続して結合したアミノ酸のループによって形成される。しかし、類似した連続結合部位（ここではエピトープおよび結合部位は同じ意味で使われる）は、（Ｔ細胞受容体などの）受容体−抗原相互作用、ホルモン受容体およびそのアゴニストまたはアンタゴニストなどの受容体−リガンド相互作用、受容体−サイトカイン相互作用、またはたとえば酵素−基質相互作用もしくは受容体−薬物相互作用に見られ、これらの相互作用では分子の直線部分が結合部位として認識される。
しかし、しばしば、そのような突起部分およびくぼみは、問題となっている分子の種々の異なる部分を含み、結合部位を本質的に形成するのは組合わされた部分である。一般に、当業者は問題となっている分子の異なる部分を含むそのような結合部位を、不連続もしくは立体配座結合部位またはエピトープと称する。たとえば、一次構造（たんぱく分子のアミノ酸配列）だけでなく二次および三次構造（分子のアルファらせんまたはベータシートへの折り畳みおよびその全体形）を、ならびにときおり四次構造（他のたんぱく分子との相互作用）さえもを有するたんぱく上にある結合部位は、一次構造内では離れており、ともに折り畳まれて結合部位内で近接するアミノ酸または短ペプチド配列を、必須の突起部分またはくぼみに含んでいる。直線状（連続）結合部位において、抗体との接触を仲介する重要なアミノ酸は、一般に、通常１５アミノ酸長以下の一次構造の一部内に位置する。これらの配列全体を含むペプチドは、インタクトなたんぱくのリガンドによって示される範囲内におおよそ位置する標的たんぱくに親和性を有する。しかし、立体配座（不連続）結合部位においては、一般に重要な残基は一次構造内でしばしば離間している２つ以上の結合領域にわたって分布している。折り畳まれると、これらの結合領域は、たんぱく表面で集められて複合の結合部位を形成し得る。たとえ完全な結合部位が高い親和性の相互作用を仲介しても、重複ペプチドの直線スキャンにおいて合成されるような１つの結合領域のみを覆うペプチドは一般に、たとえば標準のＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅ実験において、しばしば測定され得ない非常に低い親和性を有する。
生命において結合分子とそのリガンドとが演じる中心的役割によって、結合分子の検出、同定および／または生成への関心がますます拡大しつつある。たとえば結合部位の性質への洞察は、結合分子とそのリガンドとの結合を妨げることのできる化合物を設計できる可能性を提供する。さらに、（複合）分子の結合部位を模倣する結合分子の生成が、広範な種々の応用のために所望されている。たとえば、たんぱく性分子の結合部位を模倣するペプチドは、診断的、治療的および／または予防的利用に適している。このようなペプチドは、たとえばリガンド−受容体対に対するアゴニストまたはアンタゴニストとしての使用に適している。
さらに、免疫原性化合物の検出、同定および／または生成における関心がますます拡大しつつある。免疫原性化合物は、注目する抗体および／またはＴ細胞を得るのに特に適している。さらに、このような免疫原性化合物は宿主内の免疫応答を喚起するのに適しており、この免疫応答が、好ましくは、免疫原性化合物および／または免疫原性化合物が由来する免疫原によるその後の課題に対して、部分的なまたは完全な保護をもたらす。好ましくは、注目のたんぱく性分子によるその後の課題に対して、宿主内の部分的なまたは完全な保護的免疫応答をもたらすことのできる免疫原性化合物が生成される。通常、このような免疫原性化合物は、注目のたんぱく性分子に完全にまたは部分的に由来するペプチド配列を含む。
一般に、注目する結合化合物および／または免疫原性化合物のスクリーニング方法は、注目の分子を特異的に結合することができる化合物を検出するために、複数の想定される結合部位および／または免疫原性化合物の生産、ならびに、それに続く（たとえばリガンド、抗体および／またはＴ細胞などの）注目の分子とのインキュベーションを含む。ペプチド分野の初期研究は、たんぱくの活性アミノ酸配列またはペプチドを抗原的に検出または決定する方法に関する、国際公開第８４０３５６４号パンフレットである。いわゆるペプスキャン技術をもたらすこの研究は、複数の異なるペプチドの生産を含み、その後、合成されたペプチドがそれぞれ、問題となっている結合分子で試験される。この方法は、たんぱくまたはペプチド配列における連続結合部位および／または連続エピトープの検出を可能とする。広義にとらえたペプスキャン技術は、種々の性質の結合部位、免疫原性部位またはリガンドに本質的に相同であるか、類似しているか、模倣している（直線状ではあるが）ペプチドの試験または同定を提供する（mimotopes、Geyssenら、Mol. Immunol.、第２３巻、７０９−７１５頁、１９８６年）。ペプスキャン技術は、迅速で容易な方法で、受容体分子、酵素、抗体などと相互作用する直線状ペプチド配列の同定を可能とし、比較的容易に、問題となっている結合分子との反応性について非常に多くのペプチドの試験を可能とする。
しかし、ペプスキャン技術は非連続結合部位つまり立体配座結合部位の試験には適していない。さらに、ペプスキャン技術は、与えられたたんぱく性分子の一次アミノ酸配列に直接由来しないアミノ酸配列を有するペプチドであって、所望の特性を備えるものを得るには適していない。
国際公開第０２３１５１０号パンフレットにおいて、不連続結合部位のスクリーニング方法が開示されている。分子ライブラリが生成され、試験物質を形成するために、第１セグメントが第２セグメントのごく近傍にて発見される。その後、異なるセグメントを含む種々の試験物質が、所望の結合部位の存在についてスクリーニングされる。この方法は、注目する化合物内に存在する種々の結合部位の存在についてスクリーニングするのに適している。互いにごく近傍に発見されるセグメントはランダムに合成されるか、たんぱく性分子の公知のアミノ酸配列に由来する。しかし、セグメントがランダムに合成される場合、膨大な量の試験物質を合成する必要があり、困難で時間がかかる。他方、セグメントが注目するたんぱく性分子の一次配列に直接由来する場合は、たんぱく性分子の一次アミノ酸配列に直接由来しないアミノ酸配列を有するペプチドが生産されないので、かなり限られたコレクションが得られる。
本発明は、注目する結合部位および／または免疫原性部位の存在についてスクリーニングするのに適している化合物の生産方法を提供する。本発明の方法は、一方で、与えられたたんぱく性分子に少なくとも部分的に基づき、他方で、そのたんぱく性分子の一次配列（の一部）に正確に類似する配列を必ずしも含まない化合物を提供する。本発明は、結合化合物および／または免疫原性化合物を体系的に生成して、スクリーニングするために、注目するたんぱく性分子の一次配列に由来する少なくとも１つの配列が使用される方法を提供する。本発明は、注目する元々のたんぱく性分子の結合部位および／または免疫原性部位に匹敵するか、むしろ優れた特性の免疫原性化合物および／または結合化合物を生成、選択および／または同定する効果的な方法を提供する。本発明の方法の好ましい実施形態は、本実施形態が足場に結合されるペプチドを提供するので、所望の結合特性および／または免疫原性についてスクリーニングするのに特に適している。足場の使用は、遊離した直鎖ペプチドと比較して、生物学的に関連する二次構造を有するペプチドをしばしばもたらす。さらに、本発明の好ましい足場が使用されると、ペプチドと足場との第１結合の形成がペプチドと足場との第２結合の形成を加速するという事実によって、生産されたペプチドはそれらが足場に付着される前に保護される必要がない。このような好ましい足場は選択的に官能化される必要はない。ゆえに、好ましい実施形態においては、選択されたアミノ酸配列が、煩わしい保護および脱保護手順の必要なく、足場にカップリングされるペプチドに組込まれる効果的な方法が提供される。これらのペプチドは、溶液中で、より好ましくは水溶液中で足場にカップリングされるのが好ましい。水溶液の使用は種々の利点をもたらす。たとえば、水は（たとえばＤＭＦおよびＤＭＳＯと比較して）安価で、無毒で、凍結乾燥によって除去するのが容易である。さらに、（バッファ）塩は水に非常によく溶解し、水はまた（非常に疎水性のものを除いて）ほとんどのペプチドについて良好な溶解特性を有している。
所望の結合特性および／または免疫原性を備える化合物が本発明に従う方法で選択されると、その化合物は、たとえば、免疫原性組成物の調製のための、および／または（たとえば二次、三次および／または四次構造などの）注目のたんぱく性分子の特性へのより深い洞察を得るための、ペプチド模倣体、アゴニスト、アンタゴニストとしての使用に適している。注目するたんぱく性分子内の（不連続）結合部位および／またはエピトープを同定することができるが、与えられたたんぱく性分子と比較して、少なくとも１つの改良特性、好ましくは少なくとも１つの改良免疫原性および／または結合特性を備える化合物を提供するのが好ましい。
１つの側面において、本発明は、免疫原性化合物および／または結合化合物の存在および／または同定に関する試験に適した化合物の生産方法であって、
少なくとも１つのたんぱく性分子の一次配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を選択する工程であって、選択されるアミノ酸残基が、他の選択されたアミノ酸残基があれば、そのアミノ酸残基から好ましくは少なくとも２アミノ酸残基離れて位置するように、少なくとも１つのアミノ酸残基を選択する工程と、
少なくとも１つの選択されたアミノ酸残基の少なくとも１つのフランキング配列であって、少なくとも１つのたんぱく性分子のＮ-末端および／またはＣ-末端の方向に位置し、２〜４８アミノ酸残基の長さを有するフランキング配列を選択する工程と、
フランキング配列の少なくとも１つを含むペプチドであって、最小で４アミノ酸残基、最大で５０アミノ酸残基の長さを有するペプチドを生産する工程とを含む方法を提供する。
１つの実施形態において、フランキング配列は選択されたアミノ酸残基を含む。しかしながらこれは必須ではない。
本発明に従う方法は、注目するたんぱく性分子に少なくとも部分的に由来する配列を含む、少なくとも１つのペプチド、好ましくは複数のペプチドの生産を含んでいる。好ましい実施形態は、（注目するたんぱく性分子に由来する）フランキング配列の系統的な「シャッフリング」を含み、注目の結合化合物および／または免疫原性化合物の存在に関してスクリーニングされるのが好ましい複数のペプチドをもたらす。フランキング配列の長さ、種類および／または量を変化させることによって、複数のペプチドが生産される。ペプチドの量およびペプチド間の差異の程度は、特定の用途に依存して任意に選ばれる。
本発明に従う方法は、複数の化合物を生産し、少なくとも１つの所望の特性を備える化合物の存在に関して複数の化合物をスクリーニングするのに特に適している。複数の化合物は、所望の特性を備える化合物が生成され選択される機会を増進するために、少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１００、最も好ましくは少なくとも１０００の化合物を含むことが好ましい。好ましい実施形態において、複数の化合物は所望の免疫原性を備える化合物の存在に関してスクリーニングされる。これは、たとえば本発明の複数の化合物を抗体および／またはＴ細胞などの結合分子とともにインキュベートし、少なくとも１つの化合物が結合分子を特異的に結合させることができるかを決定することによってなされる。
好ましい実施形態において、宿主において免疫応答を誘導することができる化合物が選択される。この実施形態においては、本発明の少なくとも１つの化合物がヒトではない動物に投与され、免疫応答が誘導されるかが決定される。注目するたんぱく性分子に対して向けられる免疫応答を宿主内にて誘導することができる化合物が選択されるのが最も好ましい。ゆえに、体液性および／または細胞性応答などの免疫応答を宿主内にて誘導することができる化合物が選択されるのが好ましく、免疫応答中に、化合物を特異的に結合させることができるだけでなく、注目のたんぱく性分子をも特異的に結合させることができる抗体および／またはＴ細胞が生産される。本発明の方法が、このような結合化合物および／または免疫原性化合物を生成し検出するのに、特に効果的であることがわかった。好ましい実施形態において、化合物は、ヒトではない動物に投与される前に、抗体および／またはＴ細胞などの結合分子を用いる第１スクリーニング手順中に最初に選択される。ゆえに、この実施形態に従えば、本発明に従うペプチドが最初に生体外でスクリーニングされ、その後有望な候補ペプチドの免疫原性が続いて生体内で調査される２段階手順が好ましい。
本発明の方法は、一次配列が少なくとも部分的に知られている、注目するあらゆるたんぱく性分子に応用可能である。本発明の方法が免疫原性化合物および／または結合化合物を生産するために実行される場合、たんぱく性分子の表面露出領域から少なくとも１つのアミノ酸残基を選択することが好ましい。もちろんこれは、たんぱく性分子の（二次、三次および／または四次）構造が少なくとも部分的に知られている場合にのみ可能である。しかし、本発明の方法は、少なくとも部分的に知られている構造を有するたんぱく性分子に制限されない。未知の（二次、三次および／または四次）構造のたんぱく性分子で本発明の方法を実行することも可能である。その場合、もちろん、たんぱく性分子のアミノ酸残基はランダムに選択される。ここで、アミノ酸残基を選択するとは、アミノ酸残基を考慮するという意味である。物理的に単離し、または合成する必要はない。
アミノ酸残基が選択されると、続いて、アミノ酸残基の少なくとも１つのフランキング配列が選択される。フランキング配列は、注目するたんぱく性分子の一次配列において、選択されたアミノ酸残基から５つ、好ましくは３つのアミノ酸残基内に位置するいくつかの連続アミノ酸残基として定義される。フランキング配列は、選択されたアミノ酸残基に直接隣接して位置するのが好ましい。ゆえに、位置ｎのアミノ酸残基が選択されると、Ｎ-末端方向に位置するフランキング配列はアミノ酸位置ｎ−１にて終了するのが好ましく、Ｃ-末端方向に位置するフランキング配列はアミノ酸位置ｎ＋１にて開始するのが好ましい。１つの実施形態においては、フランキング配列は選択されたアミノ酸残基を含む。この実施形態に従えば、Ｎ-末端方向に位置するフランキング配列はアミノ酸位置ｎにて終了し、および／またはＣ-末端の方向に位置するフランキング配列はアミノ酸位置ｎにて開始する。ここで使用されるように、フランキング配列はその最もＮ-末端のアミノ酸残基にて「開始する」とよばれ、フランキング配列はその最もＣ-末端のアミノ酸残基にて「終了する」とよばれる。フランキング配列の長さは、２〜４８アミノ酸残基であるのが好ましい。好ましくは、その長さは４〜３０アミノ酸残基、より好ましくは４〜２１アミノ酸残基である。Ｎ-末端方向に位置する選択されたアミノ酸残基のフランキング配列の長さは、Ｃ-末端の方向に位置する選択されたアミノ酸残基のフランキング配列の長さと同じである必要はないが、これはもちろん可能である。さらに、選択されたアミノ酸残基の異なるフランキング配列を選択することが可能であり、それらのフランキング配列はＮ-末端および／またはＣ-末端の方向にあり、異なる長さである。ゆえに、本発明の方法はまた、選択されたアミノ酸残基の少なくとも２つのフランキング配列の選択を含み、それら少なくとも２つのフランキング配列は（Ｎ-末端またはＣ-末端の）同じ方向にある。
少なくとも１つのフランキング配列が選択されると、フランキング配列の少なくとも１つを含むペプチドが生産される。ここで、ペプチドは、ペプチド結合を介して互いに結合した少なくとも２つの連続アミノ酸残基を含む化合物として定義される。天然のアミノ酸残基の他に、本発明のペプチドは、たとえばＤ-アミノ酸残基などの、非天然アミノ酸残基を含むことが可能である。フランキング配列の少なくとも１つを含む本発明のペプチドは、たとえば固相合成などの当該技術において公知のあらゆる方法を用いて生産される。ペプチドの長さは４〜５０アミノ酸残基である。しかし、ペプチドは６〜２５アミノ酸残基の長さを有するのが好ましい。なぜなら、この長さのペプチドが最適な試験結果をもたらすことが示されたからである。したがって、ペプチドが最大２５アミノ酸残基の長さを有する本発明に従う方法が提供される。所望の結合化合物および／または免疫原性化合物を効率的にスクリーニングするために、異なるフランキング配列を有する複数のペプチドが合成されるのが好ましい。
本発明のペプチドは、生物学的に関連する二次構造を有する化合物を得るために、足場にカップリングされるのが好ましい。さらに、足場-結合ペプチドは、溶液中で遊離するペプチドと比較して、一般により安定である。したがって、１つの実施形態は、ペプチドと足場との少なくとも１つの結合を形成するために、生産されたペプチドを足場に接触させることを含む本発明に従う方法を提供する。束縛された、生物学的に関連する構造を得るために、ペプチドと足場との間に少なくとも２つの結合が形成されるのが好ましい。特に好ましい実施形態において、本発明に従うペプチドは足場にカップリングされ、その際ペプチドと足場との間の第１結合の形成が連続結合の形成を促進する。これは、ペプチドの反応性側鎖が、ペプチドと足場との間のカップリング反応中に、保護基によって保護される必要がないという利点をもたらす。第１結合が一旦形成されると、第２結合は過多の好ましくない副産物の形成が避けられるほど充分に速く形成される。
したがって、１つの側面における本発明は、免疫原性化合物および／または結合化合物の存在および／または同定に関する試験に適した化合物の生産方法であって、
少なくとも１つのたんぱく性分子の一次配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を選択する工程であって、選択されたアミノ酸残基が、他の選択されたアミノ酸残基があれば、そのアミノ酸残基から好ましくは少なくとも２つのアミノ酸残基離れて位置するように、少なくとも１つのアミノ酸残基を選択する工程と、
少なくとも１つの選択されたアミノ酸残基の少なくとも１つのフランキング配列であって、少なくとも１つのたんぱく性分子のＮ-末端および／またはＣ-末端の方向に位置し、２〜４８アミノ酸残基の長さを有するフランキング配列を選択する工程と、
フランキング配列の少なくとも１つおよび足場と反応することができる少なくとも２つの基を含むペプチドであって、最小で４アミノ酸残基、最大で５０アミノ酸残基の長さを有するペプチドを生産する工程と、
結合の形成が連続結合の形成を促進する、少なくとも２つの結合をペプチドと足場との間に形成するために、ペプチドを足場に接触させる工程とを含む方法を提供する。
生産されたペプチドは、ペプチドと足場との間に少なくとも２つの結合を形成するために、足場と接触させるのが好ましく、その際ペプチドと足場との間の結合の形成が、ペプチドと足場との間の連続結合の形成を促進する。ここで、足場は、本発明のペプチドを結合することができるあらゆる固体支持体として定義される。ペプチドが足場に結合された後は、その構造は、溶液中で遊離しているときのペプチドの構造と少なくとも部分的に異なることが好ましい。足場の使用は、生物学的に関連する二次構造を有する本発明のペプチドをもたらす。さらに、結果として生じるペプチド-足場化合物は、通常、遊離ペプチドと比較してより安定している。足場に結合されたペプチドの固定構造は、足場-結合ペプチドがリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストなどの免疫原性化合物および／または結合化合物として使用されるときに、特に適していることが実証された。本発明の任意の複数のペプチドの各ペプチドは、本質的に同じ種類の足場にカップリングされ、それら複数のペプチドの個々のペプチド間での直接の比較を可能とするのが好ましい。同じ種類の足場が使用される場合、その足場およびペプチドを含む種々の化合物間の差異は、ペプチド間の差異に起因しやすい。好ましい実施形態において、本発明の複数のペプチドを含むアレイが生産され、足場に結合された各ペプチドが、多くの試験化合物の中から有望な化合物を迅速に選択することを可能とする。
１つの実施形態において、足場と反応することができる少なくとも２つの基が同一である本発明の方法が提供される。これは、ペプチドと足場との間の少なくとも２つの結合が、同じ反応条件下で形成されるという利点をもたらす。結合を容易にするために、本発明のペプチドは少なくとも１つのＳＨ-官能基を含むことが好ましい。より好ましい実施形態において、足場と反応することができる少なくとも２つの基は２つのＳＨ-官能基である。ここで、ＳＨ-官能基は、スルフヒドリル基つまりチオール基（ＳＨ基）を含むペプチドの一部分（好ましくはアミノ酸残基）として定義される。しかし、他の基も可能である。さらに好ましい実施形態において、少なくとも１つのＳＨ-官能基はシステイン残基である。最も好ましい実施形態においては、足場と反応することができる少なくとも２つの基がシステイン残基である本発明の方法が提供される。１つの実施形態において、足場と反応することができる基はペプチドの第１のアミノ酸位置およびペプチドの最後のアミノ酸位置に位置する。さらなる実施形態において、足場と反応することができ、ペプチドの第１アミノ酸位置および最後のアミノ酸位置に位置する基は、システイン残基である。したがって、１つの実施形態は、ペプチドの第１および最後のアミノ酸残基がシステインである本発明に従うペプチド製造方法を提供する。他の実施形態においては、足場と反応することができる基の少なくとも１つは、本明細書の至るところに詳細に記載されるように、ペプチド配列内に位置する。
少なくとも１つのフランキング配列を含む本発明のペプチドは、所望の生物活性を有する安定化合物を得るために、足場にカップリングされる。原則として、あらゆる足場が適している。しかし、好ましくは、本発明のペプチドと足場との間の第１結合の形成が第２結合の形成を促進するような足場が使用される。１つの好ましい実施形態において、本発明のペプチドと足場との間の少なくとも１つの結合はチオエーテル結合を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のペプチドは（ヘテロ）芳香族化合物であって、好ましくは少なくとも２つのベンジル位ハロゲン置換基を含む（ヘテロ）芳香族化合物、好ましくはハロメチルアレーンにカップリングされる。好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、ビス(ブロモメチル)ベンゼン、トリス(ブロモメチル)ベンゼン、テトラ(ブロモメチル)ベンゼンまたはそれらの誘導体にカップリングされる。本発明に従うペプチドは、メタ-１,３-ビス(ブロモメチル)ベンゼン（ｍ-Ｔ２）、オルト-１,２-ビス(ブロモメチル)ベンゼン（ｏ-Ｔ２）、パラ-１,４-ビス(ブロモメチル)ベンゼン（ｐ-Ｔ２）、メタ-１,３-ビス(ブロモメチル)ピリジン（ｍ-Ｐ２）、２,４,６-トリス(ブロモメチル)メシチレン（Ｔ３）またはメタ-１,３-ビス(ブロモメチル)-５-アジドベンゼン（ｍ-Ｔ３-Ｎ３）にカップリングされるのが最も好ましい。
特に好ましい実施形態において、本発明に従うペプチドを足場にカップリングさせるために、国際公開第２００４０７７０６２号パンフレットに従う求核置換反応が実行される。このようなカップリング反応は求核置換反応を含み、遊離型の求核官能基を有する分子が足場と反応する。好ましい実施形態において、求核官能基はチオール基つまりスルフヒドリル基を含む。チオールは飽和炭素原子上での置換に効果的な求核剤である。一般に、分子に求核官能基を備えるのは困難ではない。たとえば、ペプチドまたはペプチド模倣体は、ペプチドアミノ酸配列中にシステイン残基を組み込むことによって、容易にチオール部分を有するように官能化される。
もちろん、種々の他の求核官能基を、アルコール（-ＯＨ）またはアミン（-ＮＨ）部分を有するアミノ酸のように、同様に本発明のペプチドに組込むことが可能である。しかし、一般にアルコールまたはアミンのカップリング反応に必要とされる化学反応は、ＳＨ-官能化ペプチドを使用する提供された方法とは対照的に、非保護ペプチドを使用することを許容しないということは強調されるべきである。したがって、本発明のペプチドは、少なくとも２つのＳＨ-官能基、好ましくは少なくとも２つの遊離型のシステイン スルフヒドリル基を含むのが好ましい。本発明に従う方法は非保護ペプチドの使用を許容しており、アミノ酸側鎖には、カップリング反応への不所望の関与を防止ための保護または処理が別になされない。ゆえに、本発明に従う方法は、本発明の本質的には非保護のペプチドを足場に接触させる工程を含むのが好ましい。重要なことには、ここに提供される非保護ペプチドを使用する方法は、無用な時間、努力および資金を省く。なぜなら、多段階の保護／脱保護工程を必要としないからである。
好ましい実施形態において、本発明に従うペプチドは、少なくとも２つの求核置換反応によって足場にカップリングされ、ペプチドは足場分子との２つの結合を形成する少なくとも２つの遊離型求核官能基を有する。たとえば、ペプチドは、反応基の一部である、足場の２つ以上の飽和炭素原子と反応する。求核置換はまた、求核剤および脱離基が単一の分子または分子状物質の一部であるとき、分子間過程であり得る。本発明の好ましい実施形態において、足場には、少なくとも１つの分子内求核置換反応を介して、少なくとも１つの分子が提供される。分子内過程は、類似の分子間反応よりもかなり有利なエントロピーを有する。なぜなら、２つの別々の分子が一体となる必要がないからである。
飽和炭素上で生じる求核反応の共通した特性は、その炭素原子が、炭素または水素以外の原子であるヘテロ原子にほぼ常に結合することである。さらに、そのヘテロ原子は通常炭素よりも電気陰性度が大きく、置換反応におけるいわゆる脱離基（Ｌ）でもある。脱離基は、元々その脱離基を炭素原子に結合させていた電子対とともに外れる。好ましい実施形態において、少なくとも１つのペプチドとの少なくとも２つの結合の形成を促進するために、少なくとも２つの脱離基を含む足場が使用される。脱離基が外れる容易さは基の塩基性に関連し得る。弱い塩基は、効果的に電子対を収容することができるので、通常良好な脱離基である。反応基の反応性は、脱離基の外れる傾向によって大きく左右される。反応基の反応性に幾分関係がある別の要因は、脱離基と炭素原子との間の結合強度である。なぜなら、置換が起こるためにはこの結合は破れなければならないからである。ゆえに、好ましい実施形態では、少なくとも２つの良好な脱離基を含む足場が本発明に従う方法において使用される。通常、良好な脱離基は強酸の共役塩基である。最も重要な脱離基は、ｐＫａ値が５未満の酸の共役塩基である。特に興味深い脱離基には、Ｉ−、Ｂｒ−およびＣｌ−などのハロゲン化物イオンが含まれる。ハロゲン化アルキルにおける炭素-ハロゲン（Ｃ-Ｘ）結合は、分極しており、炭素に部分的な正電荷が、ハロゲンに部分的な負電荷が存在する。ゆえに、炭素原子は求核剤（電子の対をもたらす試薬）による攻撃に敏感で、ハロゲンはＣ-Ｘ結合から２つの電子を獲得して、ハロゲン化物イオン（Ｘ−）として脱離する。１つの実施形態において、反応基は求核剤による攻撃に敏感な炭素原子を含み、反応基は炭素-ハロゲン結合を含む。好ましい実施形態において、反応基の少なくとも２つを含む足場が、求核剤としてのジ-ＳＨ官能化ペプチドと反応するために使用される。本発明のペプチドがハロゲン化アルカンを含む足場にカップリングされる、本発明に従う方法が提供される。ハロゲン化アルカン（ハロアルカンまたはハロゲン化アルキルとしても知られる）は、鎖の１つ以上の炭素原子に結合したハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素）を含む化合物である。ここで提供されるのは、２つのハロゲン原子を含むジハロ足場（dihaloscaffolds）、ならびに、１つ以上のループしたペプチドセグメントから成る、配座的に束縛されたペプチド構造の合成用のトリ-およびテトラハロ足場である。通常、良好な置換基は、電気陰性であって炭素原子に極性を与え、一度離れてしまうと余剰の電子対で安定し、分極可能であって遷移状態を安定化させる。ヨウ素を除いて、すべてのハロゲンは炭素よりも電気陰性である。塩素および臭素はかなり類似した電気陰性度を有し、かなり同等に炭素との結合に極性を与える。イオン化すると、双方は非常に弱い塩基であり、２つのうちＢｒ−はより弱い。臭化イオンはまた、そのより大きなサイズによって、より分極可能である。したがって、提供される方法は、有利には少なくとも２つのＣｌ原子を含む足場を用いて、より好ましくは少なくとも１つのＣｌ原子および少なくとも１つのＢｒ原子を含む足場を用いて、さらに好ましくは少なくともＢｒ原子を含む足場を用いて実行される。
好ましい実施形態において、足場はアリル系を含む。アリル系においては、３つの炭素原子があり、そのうち２つは炭素-炭素二重結合を介して結合される。好ましい実施形態において、本発明に従う足場とペプチドとの結合の形成は、アリル置換反応を介して生じる。アリル置換反応とは、アリル系の位置１にて生じる置換反応をいい、二重結合は位置２と位置３との間にある。入ってくる基は脱離基と同じく原子１に付着するか、２／３から１／２への二重結合の移動を伴って、入ってくる基は相対位置３に付着する。アリル置換の反応速度は非常に速い。なぜなら、アリルカチオン反応中間体、つまり二重結合した炭素に付いた正電荷を有する炭素原子は、通常安定であるからである。これは、アリル位カチオンが２つの正確に等価な構造の共鳴混成であることによる。寄与構造のいずれかにおいて、π電子雲とともに電子欠損炭素の空のｐ軌道がある。この空のｐ軌道と二重結合のπ電子雲との重なりはπ電子の非局在化をもたらし、これによって電子欠損炭素に電子を提供して、カチオンを安定化させる。少なくとも２つのアリル型ハロゲン原子を含む足場が、さらに好ましい。電子の非局在化によって、アリルハロゲン化物は、非常に容易にイオン化してカルボカチオンおよびハロゲン化物イオンを生成する傾向があり、そのため炭素ハロゲン化物結合の開列は迅速である。
本発明のさらなる実施形態において、炭素-酸素二重結合（つまりカルボニル基）が足場に存在する。アリル系と同様、カルボカチオンの安定化に寄与する共鳴構造を形成することができる。たとえば、足場は、Ｃ(Ｏ)-ＣＨ２-ハロゲンの構造を有する２つ以上の反応基を含む。
さらに、求核置換反応において、基質の構造は脱離基の性質と全く同様に重要な役割を果たす。たとえば、求核剤が炭素の背面を攻撃する場合、反応は脱離基がメチル基に結合されていれば妨害なく進み、水素は炭素を攻撃するのに充分な表面を残す。その炭素がより多く置換されていくと、より大きい基は、求核剤が脱離基を置換するために通らなければならない経路を妨害する。これらの理由のため、足場が少なくとも２つのハロメチル基を含むことも有利である。
１つの実施形態において、足場は芳香族化合物またはアレーンとしても知られる共役ポリエンを含み、この共役ポリエンに少なくとも２つの反応基が備えられている。芳香族化合物は平坦で、分子平面の上および下に非局在化した環状のπ電子雲を有する。本発明に従う分子の足場は、たとえばハロメチル基のような、少なくとも２つのベンジルハロゲン置換基を含むのが好ましい。適当な例は、これに限定されないが、ジ(ハロメチル)ベンゼン、トリ(ハロメチル)ベンゼンまたはテトラ(ハロメチル)ベンゼン、およびそれらの誘導体を含む。ベンジルハロゲン置換基の利点は、芳香族化合物として知られる共役ポリエンの共鳴に関連する特別な安定性において主に追求することが可能なことである。ベンジルハロゲン原子は、求核置換反応が生じる炭素を脱離するさらに強い傾向を有する。
ＳＨ-ＳＨペプチドなどの適したペプチドの、ハロメチルベンゼン誘導体との反応を含む実施形態は、非常に広い範囲のものである。反応は、少なくとも２つのハロメチル基を有する種々の芳香族化合物で、首尾よく進行する。これらの基はオルト、メタまたはパラ位のいずれかに位置することができる。前述の分子内触媒効果は、各カップリング様式に関して異なる。なぜなら、通常、パラおよびメタ-シクロファンはオルト-シクロファンよりも歪んでいるからである。少なくとも１つのループしたペプチド構造を有する足場の合成のために、オルト-、メタ-またはパラ-位に少なくとも２つのハロメチル基を有する他のすべての(ヘテロ)芳香族化合物も提供される。
本発明に従う方法における使用に適した分子足場はまた、より小さい、またはより大きい環構造の多環芳香族化合物を含む。しかし、本発明に従う方法における使用のための足場は、炭化水素に限定されない。反対に、提供される方法はまた、ヘテロ環芳香族足場−環構造中の炭素以外に少なくとも１つの原子、通常窒素、酸素または硫黄、を有する環状分子−を使用しても、適切に実行される。例には、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、３-ピロリン、ピリジン、ピリミジン、およびそれらの誘導体が含まれる。ヘテロ環芳香族足場は少なくとも２つのハロメチル基を含むものが好ましいが、これに限定されない。好ましい足場はメタ-ジブロモ-ピリジンである。
別の実施形態において、提供される方法は、縮合環芳香族化合物などの多環芳香族構造に基づく、または、多環芳香族構造から成る足場の使用を含む。炭素-炭素結合を共有する２つの芳香族環は、縮合しているといわれる。適当な縮合環芳香族足場は、それらが少なくとも２つの反応基を含むという条件で、たとえばナフタレン、アントラセンまたはフェナントレン、およびそれらの誘導体を含む。好ましい実施形態において、縮合環芳香族足場は少なくとも２つの反応基を含み、各基は、たとえばハロメチル基といった極めて反応性に富むベンジルハロゲン原子を含む。
系が炭素原子の対を共有しない、様々な芳香族系または共役系を含む分子もまた、足場分子として有用である。たとえば、足場は多環または縮合環構造を含み、たとえばベンゼンといった芳香環が炭素-炭素結合を介して直接結合した足場が試験され得る。代わりに、環は少なくとも１つの原子を含むリンカーを介して結合される。本発明の方法において適した足場の例は、図４，５および６に与えられている。当業者は、これらの分子のどのバージョンを使用するか選択することができるだろう。商業上の点からみて、本発明に従う足場は、比較的低価格にて市販され、大量に入手することができるのが好ましい。たとえば、ジブロモ足場の１,３-ビス(ブロモメチル)ベンゼンは現在、グラムあたり僅か約５ユーロで販売されている。
ゆえに、国際公開第２００４０７７０６２号パンフレットに従う方法は、第１および第２の反応基を使用して、本発明に従うペプチドの、足場との簡素で容易なカップリングを可能にする。第１結合の形成は連続的結合の形成を促進する。ゆえに、第１結合の形成は反応の連鎖をもたらし、第１結合の形成は（化学的）結合ともいわれ、第１反応基を介して、第２反応基の反応を増大させるなどする。この化学反応は官能基における変化を含むが、足場の分子骨格は本質的に変化しないままである。国際公開第２００４０７７０６２号パンフレットに従う方法の利点は、本質的に非保護のペプチドを足場にカップリングすることができ、足場を選択的に官能化する必要がないことである。さらに、国際公開第２００４０７７０６２号パンフレットに従う方法は、本発明に従うペプチドの水溶液中でのカップリングを可能にするが、他の公知のカップリング手順は、複数の保護-脱保護サイクルを介して有機溶媒中でしばしば実行される。したがって、好ましい実施形態は、ペプチドが足場にカップリングされ、ペプチドと足場との第１結合の形成が、ペプチドと足場との第２結合の形成を促進する本発明に従う方法を提供する。さらに好ましい実施形態は、ペプチドが溶液中で足場にカップリングされる本発明に従う方法を提供する。水溶液が使用されるのが最も好ましい。
本発明に従う１つの実施形態の非限定的な図解例を、以下に説明する。この例においては、注目するたんぱく性分子の２つのアミノ酸残基が選択される。これらのアミノ酸残基は双方とも、たんぱく性分子の表面露出領域から選択されるのが好ましい。選択されるアミノ酸残基は、第２に選択されるアミノ酸残基を含まない、第１に選択されるアミノ酸残基のフランキング配列を選択することが可能なように、互いから離れて位置する少なくとも２つのアミノ酸残基であるのが好ましい。この図解例において、たんぱく性分子の（一部の）一次配列は、配列Ｘ１〜Ｘ２４（Ｘはあらゆるアミノ酸残基を表わす）によって表わされる。
一次配列
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４
続いて、たとえばアミノ酸残基Ｘ１０およびＸ１５を選択する。その後、たとえば以下のフランキング配列を選ぶ。
Ｘ１０のフランキング配列：Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９およびＸ１１Ｘ１２
Ｘ１５のフランキング配列：Ｘ１３Ｘ１４およびＸ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０
続いて、これらのフランキング配列の少なくとも１つ、および足場と反応することができる少なくとも２つの基を含むペプチドを生産する。この例において、足場と反応することができる２つの基は、ペプチドの第１および最後のアミノ酸残基である２つのシステイン残基である。もちろん、多くの別の基を使用することが可能であり、それらの基のペプチド内での位置は変更することができる。この例においては、たとえば以下のペプチドを生成する。
１つのフランキング配列を含むペプチド：
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｃ
ＣＸ１１Ｘ１２Ｃ
ＣＸ１３Ｘ１４Ｃ
ＣＸ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｃ
２つのフランキング配列を含むペプチド：
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｃ
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１１Ｘ１２Ｃ
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１３Ｘ１４Ｃ
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｃ
ＣＸ１１Ｘ１２Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｃ
ＣＸ１１Ｘ１２Ｘ１１Ｘ１２Ｃ
ＣＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｃ
ＣＸ１１Ｘ１２Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｃ
ＣＸ１３Ｘ１４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｃ
ＣＸ１３Ｘ１４Ｘ１１Ｘ１２Ｃ
ＣＸ１３Ｘ１４Ｘ１３Ｘ１４Ｃ
ＣＸ１３Ｘ１４Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｃ
ＣＸ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｃ
ＣＸ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ１１Ｘ１２Ｃ
ＣＸ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ１３Ｘ１４Ｃ
ＣＸ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｃ
３つのフランキング配列を含むいくつかの可能なペプチド：
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｃ
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１１Ｘ１２Ｃ
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１３Ｘ１４Ｃ
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｃ
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１１Ｘ１２Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｃ
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１１Ｘ１２Ｃ
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｃ
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｃ
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１３Ｘ１４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｃ
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１１Ｘ１２Ｃ
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１３Ｘ１４Ｃ
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｃ
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｃ
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ１１Ｘ１２Ｃ
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ１３Ｘ１４Ｃ
ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｃ
ＣＸ１１Ｘ１２Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｃ
ＣＸ１１Ｘ１２Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１１Ｘ１２Ｃ
ＣＸ１１Ｘ１２Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１３Ｘ１４Ｃ
ＣＸ１１Ｘ１２Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｃ
ＣＸ１１Ｘ１２Ｘ１１Ｘ１２Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｃ
ＣＸ１１Ｘ１２Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１１Ｘ１２Ｃ
ＣＸ１１Ｘ１２Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｃ
ＣＸ１１Ｘ１２Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｃ
など
その後、生産されたペプチドは、本発明に従う（試験）化合物を生成するために、足場にカップリングされるのが好ましい。複数の試験化合物を生産するために、複数の異なるペプチドが、足場にカップリングされるのが好ましい。
さらに、前述の図解例において、３つのフランキング配列の組合せが可能であることが明らかだろう。さらに、４以上のフランキング配列を含む他のペプチドを設計することが可能である。しかし、ペプチドの全長は５０アミノ酸残基を超えないのが好ましい。
さらに、本発明の種々の実施形態は種々の異なる長さのフランキング配列の選択を含む。たとえば、前述の図解例において、たとえばＸ１０の以下のフランキング配列が選択される：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９および／または
Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９および／または
Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９および／または
Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９および／または
Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９および／または
Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９および／または
Ｘ７Ｘ８Ｘ９および／または
Ｘ８Ｘ９および／または
Ｘ９および／または
Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３および／または
Ｘ１１Ｘ１２および／または
Ｘ１１
フランキング配列の種類、長さおよび量を変更することによって、異なる種類および／または長さのペプチドが生産される。４〜２５アミノ酸残基のペプチドが生成されるのが好ましい。
与えられたたんぱく性分子の選択されるアミノ酸残基の数は変更することが可能であり、特定の用途に依存する。１つの好ましい実施形態において、少なくとも２つのアミノ酸残基が選択される。ゆえに、少なくとも１つのたんぱく性分子の一次配列内の、少なくとも２つのアミノ酸残基が選択される本発明に従う方法が提供される。効果の観点から、好ましくは、多くても５つのアミノ酸残基が選択される。３または４のアミノ酸残基が選択されるのが好ましい。特に好ましい実施形態においては、２つのアミノ酸残基が選択される。
もちろん、たんぱく性分子の１つの選択されたアミノ酸残基によって、本発明に従う方法を実行することも可能である。その場合、本発明のペプチドは、その１つの選択されたアミノ酸残基の、たんぱく性分子のＮ-末端方向に位置する少なくとも１つのフランキング配列、および／または、その１つの選択されたアミノ酸残基の、たんぱく性分子のＣ-末端方向に位置する少なくとも１つのフランキング配列を含む。もちろん、前述のように、異なる長さの種々のフランキング配列を使用することができる。
選択されるフランキング配列の数および長さは、特定の用途に依存する。１つの好ましい実施形態において、少なくとも２つのフランキング配列を含むペプチドが生産される。これらのフランキング配列は、互いに異なるか、同じであってもよい。１つの実施形態においては、選択された同じアミノ酸残基の少なくとも２つのフランキング配列が、ペプチドに組込まれる。しかし、別の実施形態においては、第１の選択されたアミノ酸残基のフランキング配列、および第２の選択されたアミノ酸残基のフランキング配列を含むペプチドが生産される。
本発明に従う方法では、足場と反応することができる少なくとも２つの基を含むペプチドが生産される。好ましい実施形態においては、それらの基は、少なくとも１つのＳＨ-基、好ましくは少なくとも１つのシステイン残基を含む。なぜなら、ＳＨ-基は(ヘテロ)芳香族分子を含む足場にペプチドをカップリングさせるのに特に適しているからである。既に述べたように、(ヘテロ)芳香族分子を含む（好ましくは少なくとも１つのベンジルハロゲン置換基を含む）足場の使用が好ましい。少なくとも１つのＳＨ-基（たとえばシステイン残基）を含む基が、ペプチドの足場とのカップリング反応において使用される場合、そのペプチドは、他の利用可能なシステイン残基の少なくとも一部を欠いているのが好ましい。利用可能なシステイン（残基）は、ＳＨ-基が別の基と反応することができるシステインとして定義される。ゆえに、たとえば保護基が設けられていることによって、ＳＨ-基が別の基と反応することができないシステイン残基は、「利用可能なシステイン」という用語の対象に含まれない。本発明のペプチドが他の利用可能なシステインを含む場合、足場と反応することを意図した少なくとも１つの基の代わりに、他の利用可能なシステインが足場と反応することができる。このように、ペプチドと足場との非意図的な結合が形成される可能性がある。さらに、他の利用可能なシステインは、足場と反応することを意図したＳＨ-基を含む基と、ジスルフィド結合を形成することができる。その場合もまた、ペプチドと足場とのカップリング反応が歪められる可能性がある。これらの問題は、フランキング領域に存在する少なくとも１つのシステイン残基が、他のスルフヒドリル基含有部分と結合を形成することができない基によって置換されると、少なくとも部分的に避けられる。１つの実施形態において、これは保護基または模倣基によって実行される。たとえば、除去可能な保護基によって保護されたシステイン、たとえばＣｙｓ(ＳｔＢｕ)、または、最も好ましくはシステイン-(アセトアミドメチル)基（Ｃｙｓ(Ａｃｍ)）などが使用される。本発明の化合物を生成するための、本発明のペプチドの足場への付着に続いて、保護基は、たとえば還元処理によって、容易に除去される。たとえば、１,４-ＤＤＴまたはエタンジチオールが使用される。フランキング配列のシステイン残基をバイオイソステリックユニット（bioisosteric unit）によって置換することも可能である。バイオイソステリックユニットは類似した大きさおよび物理化学的特性を有する機能団として定義される。
フランキング配列の少なくとも１つにおける少なくとも１つのシステインが、たとえばアラニン残基といった、足場と非反応性である別のアミノ酸残基によって置換されるのが最も好ましい。ゆえに、フランキング配列の少なくとも１つにおける少なくとも１つのシステインが、別のアミノ酸残基によって置換される本発明に従う方法が提供される。ペプチドに組み込まれるすべてのフランキング配列におけるすべてのシステインは、足場に結合することを意図したＳＨ基を有する２つの基以外の基を介してペプチドが足場に付着するのを防止するために、使用される足場と非反応性である他のアミノ酸残基によって、置換されるのが最も好ましい。
１つの好ましい実施形態において、種々の異なる長さのペプチドが、潜在的な結合化合物および／または免疫原性化合物のより多様なコレクションを提供するために合成される。結合分子間の相互作用および免疫原性相互作用は、しばしば非常に特異的である。ゆえに、本発明のペプチドの配列だけでなくその長さもまた、特異的相互作用に関するスクリーニングが実行される場合、しばしば関連性がある。したがって、少なくとも２つの異なる長さのペプチドを生産する工程を含む本発明に従う方法が提供される。６〜２５アミノ酸残基の長さの複数のペプチドが生成されるのが最も好ましい。注目するたんぱく性分子の二次、三次および／または四次構造が知られている場合、たんぱく性分子の表面露出領域から少なくとも１つのアミノ酸残基を選択することがさらに好ましい。
しかし、注目するたんぱく性分子の二次、三次および／または四次構造が知られていないか、部分的にしか知られていない場合には、予備スクリーニングを実行することが好ましい。その場合、本質的に同じ長さを有する複数の重複ペプチドが合成されるのが好ましい。２，３または４セットのペプチドが合成され、ペプチドの１セットはほぼ同じ長さのペプチドを含むのが好ましい。たとえば、２セットのペプチドが生産され、１セットは約８アミノ酸残基の長さのペプチドを含み、他のセットは約１５アミノ酸残基の長さのペプチドを含む。この実施形態によれば、（好ましくは足場にカップリングされた）複数の重複ペプチドが、所望の官能性（たとえば抗体、Ｔ細胞、リガンドまたは受容体などの注目する結合化合物に結合する能力）に関して試験される。１つ以上のペプチドが有望な候補であるとわかった場合、たんぱく性分子のどの領域からその有望な候補が由来しているように思われるのかを、決定するのが好ましい。たんぱく性分子のその領域が同定された後、第２の手順が続くのが好ましい。第２の手順においては、本発明の方法が再び実行される。今回は、第１の手順にて同定された前述の領域の少なくとも１つに存在する、少なくとも１つのアミノ酸残基が選択される。
１つの実施形態において、有望な候補であると思われるペプチドは、第２のペプチド（化学式(Ｘ)ｙ）と組合わされる。第２のペプチドは、同じたんぱく性分子から少なくとも部分的に由来するのが好ましい。たとえば、２つのシステイン残基が足場と反応することができる基として使用される場合、およびスクリーニング中に見つかった有望なペプチドが(Ｘ)ｘで表わされる場合、化学式Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙおよび／または(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣのペプチドが合成されるのが好ましい。この化学式において、Ｃはシステイン残基であり、(Ｘ)ｘは少なくとも１つのフランキング配列を表し、(Ｘ)ｙはその少なくとも１つのたんぱく性分子に由来するあらゆる配列を表す。 (Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｙはそれぞれ少なくとも１つのフランキング配列を表すのが好ましい。
結果として生じるペプチドは、本発明に従う安定した試験化合物を生産するために、もう一度足場にカップリングされるのが好ましい。試験化合物は、ここでも所望の官能性（たとえば抗体、Ｔ細胞、リガンドまたは受容体などの注目する結合化合物に結合する能力）に関してスクリーニングされるのが好ましい。試験化合物は、有望なペプチド(Ｘ)ｘが選択された第１のスクリーニングと比較して同じ官能性に関して試験されるのが好ましい。本発明のこの実施形態は、二次、三次および／または四次構造が知られていないか、部分的にしか知られていないたんぱく性分子に、少なくとも部分的に由来する免疫原性化合物および／または結合化合物を生産および／または同定するのに特に適している。１つの実施形態によれば、２，３または４セットのペプチドが合成され、ペプチドの１セットはほぼ同じ長さのペプチドを含み、結果として生じるペプチドは注目する結合分子を使用する第１のスクリーニング検定にかけられる。その後、有望な候補であると思われるペプチドは、化学式Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙおよび／または(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣの化合物を生成するために、二次、三次および／または四次構造が知られていないか、部分的にしか知られていないそのたんぱく性分子に由来する第２のペプチドにカップリングされる。その後、結果として生じるペプチドは、再び注目する結合分子を使用する第２のスクリーニング検定によってスクリーニングされる。
ゆえに、１つの実施形態は、式Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙまたはＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｘを含むペプチドが生産される本発明に従う方法を提供し、ここで、Ｃはシステイン残基であり、(Ｘ)ｘはフランキング配列の少なくとも１つを表し、(Ｘ)ｙは少なくとも１つのたんぱく性分子に由来するあらゆる配列を表す。 (Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｙはそれぞれフランキング配列の少なくとも１つを表すのが好ましい。
ここで、重複ペプチドは、たんぱく性分子の一次配列に由来し、各ペプチドがその一次配列の少なくとも１つのアミノ酸残基を、別のペプチドと共通して有するペプチドとして定義される。たとえば、長さｎの複数のペプチドが生産され、第１のペプチドは、たんぱく性分子の一次配列の、位置１にて開始し、位置ｎにて終了する。第２のペプチドは、たんぱく性分子の一次配列の、位置２にて開始し、位置ｎ＋１にて終了する。第３のペプチドは、たんぱく性分子の一次配列の、位置３にて開始し、位置ｎ＋２にて終了する、などである。ここでは、本質的に同じ長さを有するペプチドは、アミノ酸残基の量が互いに最大で５アミノ酸残基異なるペプチドとして定義される。これらのペプチドは、正確に同じ量のアミノ酸残基を有するのが好ましい。
本発明に従うペプチドは、足場と反応することができる少なくとも２つの基を含むのが好ましい。本発明のペプチドが足場と反応することができる２つの基を有する場合、結合に適した２つの部位を有する足場が使用されるのが好ましい。ここで、「結合に適した部位」および「結合部位」という語句は同じ意味で使用され、足場と反応することができる基を結合することができる部位として定義され、その基は本発明に従うペプチド上に存在する。その基はＳＨ官能基であるのが好ましく、求核置換反応に使用されるのが好ましい。したがって、足場の適した結合部位の例は、炭素よりも電気陰性度が大きいヘテロ原子に結合した飽和炭素である。
２つの結合部位を含む足場の例は、２つのハロゲン置換基を含む芳香族分子である。好ましくは、ビス(ブロモメチル)ベンゼン、(ブロモメチル)(クロロメチル)ベンゼンまたはビス(クロロメチル)ベンゼンが使用される。メタ-ジブロモキシレン（ｍ-Ｔ２）が使用されるのが最も好ましい。
１つの実施形態においては、足場と反応することができる少なくとも３つの基を含む、本発明に従うペプチドが生産される。この実施形態は、３つの部位にて足場に結合する本発明のペプチドによって、少なくとも２つのループが形成されるという利点をもたらす。少なくとも２つのループの各々は、連続結合部位および／または免疫原性部位の存在を試験するのに適している。しかし、不連続結合部位および／または免疫原性部位の存在を調査するために、少なくとも２つのループが一緒に試験されるのが好ましい。好ましい実施形態において、各ループはフランキング配列の少なくとも一部を含むので、種々のフランキング配列（の一部）の特性が同時に試験される。ゆえに、本発明のペプチドは、少なくとも２つのフランキング配列、および足場と反応することができる少なくとも３つの基を含むのが好ましい。足場と反応することができる少なくとも３つの基は、システイン残基であるのが好ましい。したがって、ペプチドが少なくとも３つのシステイン残基および少なくとも２つのフランキング配列を含む、本発明に従う方法が提供される。
もちろん、本発明のペプチドが足場と反応することができる３つの基を含む場合、結合に適した（少なくとも）３つの部位を有する足場が使用されるのが好ましい。たとえば、３つのハロゲン置換基を含む芳香族分子が使用される。この芳香族分子には、好ましくは、トリス(ブロモメチル)ベンゼン、ビス(ブロモメチル)(クロロメチル)ベンゼン、(ブロモメチル)ビス(クロロメチル)ベンゼンまたはトリス(クロロメチル)ベンゼンが含まれる。２,４,６-トリス(ブロモメチル)メシチレン（Ｔ３）が使用されるのが最も好ましい。
同様に、本発明のペプチドが足場と反応することができる４つの基を含む場合、結合に適した４つの部位を有する足場が使用されるのが好ましい。４つのハロゲン置換基を含む芳香族分子が使用されるのが好ましい。この芳香族分子には、好ましくは、テトラ(ブロモメチル)ベンゼン、トリス(ブロモメチル)(クロロメチル)ベンゼン、ビス(ブロモメチル)ビス(クロロメチル)ベンゼン、(ブロモメチル)トリス(クロロメチル)ベンゼンまたはテトラ(クロロメチル)ベンゼンが含まれる。１,２,４,５-テトラブロモジュレン（Ｔ４）が使用されるのが最も好ましい。
１つの好ましい実施形態において、化学式Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣまたはＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｘＣのペプチドが生産される。この化学式において、Ｃは足場と反応することができる基であり、システイン残基であるのが好ましく、(Ｘ)ｘは少なくとも１つのフランキング配列を表し、(Ｘ)ｙは注目するたんぱく性分子に由来するあらゆる配列を表す。(Ｘ)ｙは(Ｘ)ｘと同じたんぱく性分子に由来するのが好ましい。(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｙはそれぞれ、少なくとも１つのフランキング配列を表すのが好ましい。１つの実施形態において、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｙの長さはほぼ同じであり、(Ｘ)ｘのアミノ酸残基量と(Ｘ)ｙのアミノ酸残基量との差異は５以下であることを意味する。このようなペプチドが足場と結合する場合、本質的に同じ長さの２つのループが形成される。しかし、これは必須ではない。別の実施形態において、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｙの長さは互いにかなり異なり、(Ｘ)ｘのアミノ酸残基量と(Ｘ)ｙのアミノ酸残基量とは互いに６アミノ酸残基以上異なることを意味する。このようなペプチドが足場とカップリングされる場合、かなり異なる長さの２つのループが得られる。
足場と反応することができる３つの基を含む前述の化学式のペプチドは、３つの結合部位を有する足場にカップリングされるのが好ましい。このペプチドは、好ましくは３つのハロゲン置換基を含む芳香族分子に、より好ましくはトリス(ブロモメチル)ベンゼンに、最も好ましくは２,４,６-トリス(ブロモメチル)メシチレン（Ｔ３）にカップリングされる。これはたとえば図７に表わされる構造をもたらし、１つの足場上の２つのペプチドループを試験するのに特に適している。
化学式Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣまたはＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｘＣのペプチドが、種々の実施形態において生産される。１つの実施形態において、注目するたんぱく性分子の種々のフランキング配列が選択され、これらのフランキング配列は、化学式Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣまたはＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｘＣのペプチドを生成するために、ランダムに組合わされる。ここで、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｙは双方とも、少なくとも１つのフランキング配列を含む。そのフランキング配列は、注目するたんぱく性分子の少なくとも１つの表面露出領域から選択されるのが好ましい。別の実施形態において、本発明の方法が、複数のペプチドを生産するために初めに実行される。それら複数のペプチドは、所望の免疫原性および／または結合特性を有する化学式(Ｘ)ｘの少なくとも１つの有望な候補のペプチドを同定するために、たとえば抗体および／またはＴ細胞などの注目する結合分子でスクリーニングされる。その後、有望な候補のペプチドは、化学式Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣまたはＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｘＣのペプチドを得るために、化学式(Ｘ)ｙの別のペプチドと組合わされる。化学式(Ｘ)ｙのペプチドは、化学式(Ｘ)ｘの有望な候補のペプチドと同じたんぱく性分子に由来するのが好ましい。１つの好ましい実施形態において、化学式(Ｘ)ｘの有望な候補のペプチドと同じたんぱく性分子に少なくとも部分的に由来する重複ペプチドを含む化学式(Ｘ)ｙの複数のペプチドが生産される。その後、重複ペプチドを含む各ペプチド(Ｘ)ｙは、化学式(Ｘ)ｘの有望な候補のペプチドにカップリングされる。結果として生じるペプチドＣ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣまたはＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｘＣは、その後、好ましくは化学式(Ｘ)ｘの有望な候補のペプチドが選択された同じ種類のスクリーニング検定において、再びスクリーニングされる。少なくとも１つのペプチドＣ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣまたはＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｘＣが所望の免疫原性および／または結合特性を有すると思われる場合、そのペプチドが選択される。
化学式Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣまたはＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｘＣのペプチドが膜貫通たんぱくに少なくとも部分的に由来する場合、ペプチド(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｙはともに、その膜貫通たんぱくの細胞外ループドメインおよび／または遊離Ｎ-末端の双方に由来するのが好ましい。ここで、膜貫通たんぱくの遊離Ｎ-末端は、アミノ酸１で開始し、第１の膜貫通ドメイン（ほとんど膜貫通らせん）の第１アミノ酸残基にて終了する、たんぱくの直鎖Ｎ-末端部分として定義される。１つの実施形態において、本発明の方法が初めに実行され、膜貫通たんぱくの細胞外ループドメインおよび／または遊離Ｎ-末端に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基が選択される。本実施形態によれば、細胞外ループドメインおよび／または遊離Ｎ-末端に存在する少なくとも１つのフランキング配列を含む生産されたペプチドは、所望の免疫原性および／または結合特性を有する化学式(Ｘ)ｘの少なくとも１つの有望な候補のペプチドを同定するために、たとえば抗体および／またはＴ細胞などの注目する結合分子でスクリーニングされる。有望な候補のペプチドは、その後、化学式Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣまたはＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｘＣのペプチドを得るために、その膜貫通たんぱくの細胞外ループドメインおよび／または遊離Ｎ-末端由来の少なくとも１つのフランキング配列を含む化学式(Ｘ)ｙの別のペプチドと組合わされる。１つの実施形態において、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｙは、同じ細胞外ループドメインおよび／または遊離Ｎ-末端に由来する少なくとも１つのフランキング配列を含む。代わりに、またはさらに、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｙは、同じ膜貫通たんぱくの異なるドメインに由来する少なくとも１つのフランキング配列を含む。
化学式Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣまたはＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｘＣのペプチドが、ｃｙｓ-ノットスーパーファミリの一員などの、システイン残基間の少なくとも２つの内部シスチン結合を含むたんぱく性分子に少なくとも部分的に由来する場合、ペプチド(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｙは双方が、そのたんぱく性分子の１つ以上のシステイン残基の少なくとも１つのフランキング配列を含むのが好ましい。たんぱく性分子のシステイン残基のみが選択される本発明の方法が、実行されるのが好ましい。結果として、少なくとも１つのシステイン残基のフランキング配列（の組合せ）のみを含むペプチドが生産される。
注目するたんぱく性分子の（二次、三次および／または四次）構造が知られていなければ、重複ペプチドのセットが生成されるのが好ましい。１つの実施形態において、足場と反応することができる３つの基は、それぞれの重複ペプチド内の３つの部位に配置される。結果として生じるペプチドは、その後、本発明に従う試験化合物を提供するために、（少なくとも）３つの結合部位を含む足場にカップリングされるのが好ましい。好ましい実施形態において、足場と反応することができる１つの基は、重複ペプチドの第１のアミノ酸残基に配置され、足場と反応することができる１つの基は、重複ペプチドの最後のアミノ酸残基に配置され、足場と反応することができる１つの基は、足場と反応することができる第１の基と最後の基との間に配置される。足場と反応することができる基はシステイン残基であるのが好ましいため、化学式Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣのペプチドが生産されるのが好ましい。ここで、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｙは同じ重複ペプチドの一部であるのが好ましい。このペプチドＣ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣは、重複ペプチドの配列の第１のアミノ酸残基と、その重複ペプチドの配列の最後のアミノ酸残基と、第１のアミノ酸残基と最後のアミノ酸残基との間に位置する１つのアミノ酸残基とを、システインで置換することによって生産されるのが好ましい。代わりに、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｙは重複ペプチドをそれぞれ含む。１つの実施形態において、(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｙはほぼ同じ量のアミノ酸残基を含む。その場合、ｎ個のアミノ酸残基から成る重複ペプチドのセットが生産されるのが好ましく、ｎは奇数である。その後、アミノ酸残基１、（ｎ＋ｌ）／２およびｎがシステインによって置換される。他の利用可能なシステイン残基は、別のアミノ酸残基によって置換されるか、（たとえば保護基によって）不活性にされるのが好ましく、それによって他の利用可能なシステイン残基はペプチドと足場とのカップリング反応を妨げなくなる。結果として生じるペプチドＣ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣは、その後、（少なくとも）３つの結合部位を含む足場とカップリングされるのが好ましく、続いて所望の特性に関して試験される。
さらなる実施形態において、化学式Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｇ)ｎＣ(Ｘ)ｙＣまたはＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｇ)ｎＣ(Ｘ)ｘＣのペプチドが生産される。この化学式において、Ｃは足場と反応することができる基であり、好ましくはシステイン残基であり、(Ｇ)ｎはスペーサを表し、(Ｘ)ｘは少なくとも１つのフランキング配列を表し、(Ｘ)ｙは少なくとも１つのたんぱく性分子に由来するあらゆる配列を表す。(Ｘ)ｘおよび(Ｘ)ｙはそれぞれ、注目する同じたんぱく性分子の少なくとも１つのフランキング配列を表すのが好ましい。
もちろん、スペーサを別のフランキング配列(Ｘ)ｚによって置換することも可能である。その場合、化学式Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｚＣ(Ｘ)ｙＣ、Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｚＣ、Ｃ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｚＣ(Ｘ)ｘＣ、Ｃ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｚＣ、Ｃ(Ｘ)ｚＣ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣおよび／またはＣ(Ｘ)ｚＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｘＣのペプチドが生産される。
前述の化学式のペプチドは、（少なくとも）４つの結合部位を含む足場と、または、それぞれの足場が（少なくとも）２つの結合位置を含む２つの足場と、カップリングするのに特に適している。結果として生じる化合物の限定しない図解例が、図７および８に表わされている。
たとえば２つの別々のｍ-Ｐ２分子など、少なくとも２つの結合部位を有する２つの足場が使用される場合、どのシステイン残基が第１の足場にカップリングされ、どのシステイン残基が第２の足場にカップリングされるのかを、調整することがときおり所望される。たとえば、化学式Ｃ１(Ｘ)ｘＣ２(Ｇ)ｎＣ３(Ｘ)ｙＣ４のペプチドが使用される場合、Ｃ１およびＣ２はしばしば第１の足場と結合することが意図され、Ｃ３およびＣ４は第２の足場と結合することが意図される。これは、たとえば、第２の足場（たとえばＣ３およびＣ４）に結合させようとする２つのシステイン残基に、たとえばメトキシトリチル（Ｍｍｔ）またはトリチル（Ｔｒｔ）などの保護基を備えることによって、実行される。第１のカップリング反応において、保護されたＣ３およびＣ４を含むペプチドは第１の足場とインキュベートされる。その際、Ｃ１およびＣ２のみが足場と結合することができる。その後、Ｃ３およびＣ４が脱保護される。結果として生じる複合体が、今度は、第１の足場と同じ種類の足場であってもよい第２の足場とインキュベートされる（これは必須ではなく、第２の足場と第１の足場とは互いに異なってもよい）。今回は、Ｃ３およびＣ４は第２の足場と結合することができる。このようにして、Ｃ１およびＣ２は第１の足場と結合し、Ｃ３およびＣ４は第２の足場と結合する。もちろん、他の組合せが可能である。
化学式Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｇ)ｎＣ(Ｘ)ｙＣ、Ｃ(Ｘ)ｙＣ(Ｇ)ｎＣ(Ｘ)ｘＣ、Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｚＣ(Ｘ)ｙＣ、Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｚＣ、Ｃ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｚＣ(Ｘ)ｘＣ、Ｃ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｚＣ、Ｃ(Ｘ)ｚＣ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣまたはＣ(Ｘ)ｚＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｘＣのペプチドが膜貫通たんぱくに少なくとも部分的に由来する場合、ペプチド(Ｘ)ｘ、(Ｘ)ｙおよび任意で(Ｘ)ｚは、その膜貫通たんぱくの細胞外ループドメインおよび／または遊離Ｎ-末端に由来するのが好ましい。１つの実施形態において、化学式(Ｘ)ｘの少なくとも１つの有望なペプチドが、前述のように、第１のスクリーニング方法の間に選択され、この化学式(Ｘ)ｘのペプチドは、膜貫通たんぱくの細胞外ループドメインおよび／または遊離Ｎ-末端に由来する少なくとも１つのフランキング配列を含む、本発明の方法が実行される。この化学式(Ｘ)ｘの有望なペプチドは、その後、Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｇ)ｎＣ(Ｘ)ｙＣ、Ｃ(Ｘ)ｙＣ(Ｇ)ｎＣ(Ｘ)ｘＣ、Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｚＣ(Ｘ)ｙＣ、Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｚＣ、Ｃ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｚＣ(Ｘ)ｘＣ、Ｃ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｚＣ、Ｃ(Ｘ)ｚＣ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣおよびＣ(Ｘ)ｚＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｘＣから成る群から選択される化学式のペプチドを得るために、化学式(Ｘ)ｙの別のペプチドおよび／または化学式(Ｘ)ｚの別のペプチドと組合わされる。１つの実施形態において、(Ｘ)ｘ、(Ｘ)ｙおよび任意で(Ｘ)ｚは、同じ細胞外ループドメインおよび／または遊離Ｎ-末端に由来する少なくとも１つのフランキング配列を含む。代わりに、またはさらに、(Ｘ)ｘ、(Ｘ)ｙおよび任意で(Ｘ)ｚは膜貫通たんぱくの異なるドメインに由来する少なくとも１つのフランキング配列を含む。
Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｇ)ｎＣ(Ｘ)ｙＣ、Ｃ(Ｘ)ｙＣ(Ｇ)ｎＣ(Ｘ)ｘＣ、Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｚＣ(Ｘ)ｙＣ、Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｚＣ、Ｃ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｚＣ(Ｘ)ｘＣ、Ｃ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｚＣ、Ｃ(Ｘ)ｚＣ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｙＣおよびＣ(Ｘ)ｚＣ(Ｘ)ｙＣ(Ｘ)ｘＣから成る群から選択される化学式のペプチドが、たとえばｃｙｓ-ノットスーパーファミリの一員などの、システイン残基間の少なくとも２つの内部シスチン結合を含むたんぱく性分子に少なくとも部分的に由来する場合、ペプチド(Ｘ)ｘ、(Ｘ)ｙおよび任意で(Ｘ)ｚは、そのたんぱく性分子の１つ以上のシステイン残基の少なくとも１つのフランキング配列を含むのが好ましい。たんぱく性分子のシステイン残基のみが選択される、本発明の方法が実行されるのが好ましい。結果として、少なくとも１つのシステイン残基のフランキング配列（の組合せ）のみを含むペプチドが生産される。１つの好ましい実施形態においては、たんぱく性分子の少なくとも２つのシステイン残基の、少なくとも１つのフランキング配列を含むペプチドが生成される。たんぱく性分子の少なくとも２つのシステイン残基の、少なくとも２つのフランキング配列を含むペプチドが生成されるのが最も好ましい。
１つの好ましい実施形態において、本発明に従う方法は以下のように実行される。たんぱく性分子のＳＳ-架橋の第１のシステインＣｙｓ-１、Ｃｙｓ-１のフランキング配列(Ｘ)ｘであって、Ｃ-末端の方向に位置し、ｘアミノ酸残基の長さを有するフランキング配列(Ｘ)ｘを含み、第２のシステインＣが続き、ｎ個のグリシン残基(Ｇ)ｎが続き、第３のシステインＣが続き、そのＳＳ-架橋の第２のシステイン残基Ｃｙｓ-２のフランキング配列(Ｘ)ｙであって、Ｎ-末端の方向に位置し、ｙアミノ酸残基の長さを有するフランキング配列(Ｘ)ｙが続き、そのＳＳ-架橋の第２のシステインＣｙｓ-２が続く、複数のペプチドが生産される。結果として生じるペプチドは、化学式Ｃｙｓ-１(Ｘ)ｘＣ(Ｇ)ｎＣ(Ｘ)ｙＣｙｓ-２を含む。複数の異なるペプチドが合成されるのが好ましく、０はｘ、ｎおよびｙよりも小さいかそれらに等しく、ｘ、ｎおよびｙは６よりも小さいかそれに等しい。さらに、ｘ＋ｎ＋ｙは２１よりも小さいかそれに等しいのが好ましく、結果として生じるペプチドは２５アミノ酸残基よりも小さいかそれに等しい。生産されたペプチドが、その後、所望の免疫原性および／または結合特性に関してスクリーニングされるのが好ましい。これは、（少なくとも）４つの結合部位を含む足場との、またはそれぞれが（少なくとも）２つの結合部位を含む２つの足場との、そのペプチドのカップリング後に実行されるのが好ましい。そのペプチドがＴ４足場、または２つのＴ２足場とカップリングされるのが最も好ましい。それぞれの足場が（少なくとも）２つの結合部位を含む２つの足場が使用される場合、２つのシステイン残基Ｃｙｓ-１およびＣｙｓ-２は、ループを形成するために同じ足場とカップリングされるのが好ましい。他の２つのシステイン残基は、ループを形成するために別の足場とカップリングされるのが好ましい。既に説明したように、これは、たとえば、Ｃｙｓ-１およびＣｙｓ-２に保護基を備え、他の２つのシステイン残基を保護されていないままにすることによって、達成される。その場合、非保護システインが、ループを形成するために足場にカップリングされる。その後、Ｃｙｓ-１およびＣｙｓ-２が脱保護され、別の足場にカップリングされる。
Ｃｙｓ-１およびＣｙｓ-２にたとえばＴｒｔなどの第１の種類の保護基を備え、他の２つのシステイン残基にたとえばＭｍｔなどの第２の種類の保護基を備えることも可能である。両種類の保護基は異なる試薬を用いて除去される。このように、どのシステイン残基が足場に結合することができるかを決定することが可能である。
さらなる実施形態において、化学式Ｃ(Ｘ)ｘＣ(Ｘ)ｍ(Ｇ)ｎ(Ｘ)ｐＣ(Ｘ)ｙＣのペプチドが生産される。この化学式において、Ｃは足場と反応することができる基であり、好ましくはシステイン残基であり、(Ｇ)ｎはスペーサを表し、(Ｘ)ｘ、(Ｘ)ｍ、(Ｘ)ｐおよび(Ｘ)ｙはそれぞれ注目するたんぱく性分子の少なくとも１つのフランキング配列を表す。このペプチドは２つの足場にカップリングするのに特に適しており、各足場は（少なくとも）２つの結合部位を含む。
好ましい実施形態において、この化学式のペプチドは、（少なくとも）２つのＳＳ-架橋を含む注目するたんぱく性分子のフランキング配列を用いて合成され、そのたんぱく性分子の一次配列において、第２のＳＳ-架橋の第１のシステインは第１のＳＳ-架橋の第２のシステインからＮ-末端方向に位置し、第２のＳＳ-架橋の第１のシステインおよび第１のＳＳ-架橋の第２のシステインは互いから６アミノ酸残基内に位置するのが好ましく、たんぱく性分子の一次配列内のＳＳ-架橋の各システインの位置は知られている。ゆえに、第２のＳＳ-架橋の第１のシステインが位置ｎに位置する場合、第１のＳＳ-架橋の第２のシステインは、位置ｎ＋１、ｎ＋２、ｎ＋３、ｎ＋４、ｎ＋５またはｎ＋６に位置するのが好ましい。この実施形態によれば、第１のＳＳ-架橋の第１のシステインＣｙｓ-１．１、このＣｙｓ-１．１のフランキング配列(Ｘ)ｘであって、Ｃ-末端の方向に位置し、ｘアミノ酸残基の長さを有するフランキング配列(Ｘ)ｘを含み、第２のＳＳ-架橋の第１のシステインＣｙｓ-１．２が続き、このＣｙｓ-１．２のフランキング配列(Ｘ)ｍであって、Ｃ-末端の方向に位置し、ｍアミノ酸残基の長さを有するフランキング配列(Ｘ)ｍが続き、ｎ個のグリシン残基(Ｇ)ｎが続き、一次配列に存在する（第１のＳＳ-架橋の第２のシステイン（Ｃｙｓ-２．１）または第２のＳＳ-架橋の第２のシステイン（Ｃｙｓ-２．２）のいずれかであり得る）第３のシステイン残基のフランキング配列であって、Ｎ-末端の方向に位置し、ｐアミノ酸残基の長さを有するフランキング配列が続き、その第３のシステイン残基が続き、一次配列に存在する第４のシステイン残基のフランキング配列であって、Ｃ-末端の方向に位置し、ｙアミノ酸残基の長さを有するフランキング配列が続き、一次配列に存在する第４のシステイン残基であって、第１のＳＳ-架橋の第２のシステイン（Ｃｙｓ-２．１）または第２のＳＳ-架橋の第２のシステイン（Ｃｙｓ-２．２）のいずれかであり得る第４のシステイン残基が続く、複数のペプチドが生産される。
結果として生じるペプチドは、化学式
Ｃｙｓ-１．１(Ｘ)ｘＣｙｓ-１．２(Ｘ)ｍ(Ｇ)ｎ(Ｘ)ｐＣｙｓ-２．１(Ｘ)ｙＣｙｓ-２．２
または
Ｃｙｓ-１．１(Ｘ)ｘＣｙｓ-１．２(Ｘ)ｍ(Ｇ)ｎ(Ｘ)ｐＣｙｓ-２．２(Ｘ)ｙＣｙｓ-２．１
を含む。
複数の異なるペプチドが合成されるのが好ましく、０はｘ、ｍ、ｎ、ｐおよびｙよりも小さいかそれらに等しく、ｘ、ｍ、ｎ、ｐおよびｙは６よりも小さいかそれに等しい。さらに、ｘ＋ｍ＋ｎ＋ｐ＋ｙは２１よりも小さいかそれに等しいのが好ましく、結果として生じるペプチドは２５アミノ酸残基よりも小さいかそれに等しい。生産されたペプチドは、その後、所望の免疫原性および／または結合特性に関してスクリーニングされるのが好ましい。これは、（少なくとも）４つの結合部位を含む足場との、またはそれぞれが（少なくとも）２つの結合部位を含む２つの足場との、ペプチドのカップリング後に実行されるのが好ましい。ペプチドがＴ４足場または２つのＴ２足場とカップリングされるのが最も好ましい。それぞれの足場が（少なくとも）２つの結合部位を含む２つの足場が使用される場合、第１のＳＳ-架橋の２つのシステイン残基は、ループを形成するために、同じ足場とカップリングされるのが好ましい。第２のＳＳ-架橋の２つのシステイン残基は、ループを形成するために、別の足場とカップリングされるのが好ましい。これは、既に説明したように実行されるのが好ましい。たとえば、第１のＳＳ-架橋の２つのシステイン残基には保護基が備えられるが、他の２つのシステイン残基は非保護のままである。その場合、非保護システインが、ループを形成するために、足場とカップリングされる。その後、第１のＳＳ-架橋の２つのシステイン残基が脱保護され、別の足場にカップリングされる。
第１のＳＳ-架橋の２つのシステイン残基に、たとえばＴｒｔなどの、第１の種類の保護基を備え、他の２つのシステイン残基に、たとえばＭｍｔなどの、第２の種類の保護基を備えることも可能である。両種類の保護基は異なる試薬を用いて除去される。このように、どのシステイン残基が足場に結合することができるかを決定することが可能である。
さらなる実施形態において、化学式Ｃ(Ｘ)ｍ(Ｇ)ｎ(Ｘ)ｐＣ(Ｘ)ｑ(Ｇ)ｒ(Ｘ)ｓＣ(Ｘ)ｔ(Ｇ)ｕ(Ｘ)ｖＣのペプチドが生産される。この化学式において、Ｃは足場と反応することができる基であり、好ましくはシステイン残基であり、(Ｇ)ｎ、(Ｇ)ｒおよび(Ｇ)ｑはスペーサを表し、(Ｘ)ｍ、(Ｘ)ｐ、(Ｘ)ｑ、(Ｘ)ｓ、(Ｘ)ｔおよび(Ｘ)ｖはそれぞれ少なくとも１つのフランキング配列を表す。このペプチドには３つのスペーサが備えられており、そのペプチド内での柔軟なループを許容する。この化学式に従うペプチドはまた、２つの足場とカップリングするのに特に適しており、各足場は（少なくとも）２つの結合部位を含む。
好ましい実施形態において、この化学式に従うペプチドは、（少なくとも）２つのＳＳ-架橋を含む注目するたんぱく性分子のフランキング配列を用いて合成され、そのたんぱく性分子の一次配列内のＳＳ-架橋の各システイン位置は正確に知られておらず、そのたんぱく性分子の一次配列において、２つのシステイン残基は互いから６アミノ酸残基内に位置する。この場合、当業者は予め、第２のＳＳ-架橋の第１のシステインが、第１のＳＳ-架橋の第２のシステインからＮ-末端方向に位置するか、またはＣ-末端方向に位置するかを知らない。したがって、前述の化学式の複数の分子を合成するのが好ましく、複数のペプチドは、所望の結合特性および／または免疫原性を有するペプチドをスクリーニングするために、システインおよびフランキング配列の異なる組合せを含む。本発明に従う方法は、ＳＳ-架橋のシステイン残基およびそのフランキング配列を選択する工程を含むのが好ましい。なぜなら、たんぱく性分子のシステイン間のＳＳ-架橋はしばしば内部ループをもたらすからである。このようなループは通常、たんぱく性分子と別の化合物との相互作用に関わることがわかっている。ゆえに、ＳＳ-架橋のシステイン残基のフランキング配列は、注目するたんぱく性分子内の他の配列と比較して、結合事象および／または免疫力に関連する機会が増大する。
１つの好ましい実施形態において、一次配列にみられる第１のシステイン（Ｃ１）、このＣ１のフランキング配列(Ｘ)ｍであって、Ｃ-末端の方向に位置し、ｍアミノ酸残基の長さを有するフランキング配列(Ｘ)ｍを含み、ｎ個のグリシン残基(Ｇ)ｎが続き、一次配列にみられる第３のシステイン（Ｃ３）のフランキング配列(Ｘ)ｐであって、Ｎ-末端の方向に位置し、ｐアミノ酸残基の長さを有するフランキング配列(Ｘ)ｐが続き、Ｃ３が続き、Ｃ３のフランキング配列(Ｘ)ｑであって、Ｃ-末端の方向に位置し、ｑアミノ酸残基の長さを有するフランキング配列(Ｘ)ｑが続き、ｒ個のグリシン残基(Ｇ)ｒが続き、一次配列に存在する第２のシステイン残基（Ｃ２）のフランキング配列であって、Ｎ-末端の方向に位置し、ｓアミノ酸残基の長さを有するフランキング配列が続き、Ｃ２（たとえば第１のＳＳ-架橋の第２のシステインまたは第２のＳＳ-架橋の第１のシステインであり得る）が続き、一次配列に存在するＣ２のフランキング配列であって、Ｃ-末端の方向に位置し、ｔアミノ酸残基の長さを有するフランキング配列が続き、ｕ個のグリシン残基(Ｇ)ｕが続き、一次配列に存在する第４のシステイン残基（Ｃ４）のフランキング配列であって、Ｎ-末端の方向に位置し、ｖアミノ酸残基の長さを有するフランキング配列が続き、第４のシステイン残基（Ｃ４）が続く、複数のペプチドが生産される。結果として生じるペプチドは、化学式
Ｃ１(Ｘ)ｍ(Ｇ)ｎ(Ｘ)ｐＣ３(Ｘ)ｑ(Ｇ)ｒ(Ｘ)ｓＣ２(Ｘ)ｔ(Ｇ)ｕ(Ｘ)ｖＣ４
のものである。
複数の異なるペプチドが合成されるのが好ましく、０はｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、ｕおよびｖよりも小さいかそれらに等しく、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、ｕおよびｖは６よりも小さいかそれに等しい。さらに、ｍ＋ｎ＋ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ＋ｔ＋ｕ＋ｖは２１よりも小さいかそれに等しいのが好ましく、結果として生じるペプチドは２５アミノ酸残基よりも小さいかそれに等しい。生産されたペプチドは、その後、所望の免疫原性および／または結合特性に関してスクリーニングされるのが好ましい。これは、（少なくとも）４つの結合部位を含む足場との、またはそれぞれが（少なくとも）２つの結合部位を含む２つの足場との、ペプチドのカップリング後に実行されるのが好ましい。ペプチドがＴ４足場または２つのＴ２足場とカップリングされるのが最も好ましい。それぞれの足場が（少なくとも）２つの結合部位を含む２つの足場が使用される場合、Ｃ１およびＣ３は、ループを形成するために、同じ足場とカップリングされるのが好ましい。Ｃ２およびＣ４は、ループを形成するために、別の足場とカップリングされるのが好ましい。これは、既に説明したように実行されるのが好ましい。たとえば、Ｃ１およびＣ３には保護基が備えられるが、他の２つのシステイン残基は非保護のままである。その場合、非保護のＣ２およびＣ４が、ループを形成するために、足場とカップリングされる。その後、Ｃ１およびＣ３が脱保護され、別の足場にカップリングされる。
Ｃ１およびＣ３に、たとえばＴｒｔなどの、第１の種類の保護基を備え、Ｃ２およびＣ４に、たとえばＭｍｔなどの、第２の種類の保護基を備えることも可能である。両種類の保護基は異なる試薬を用いて除去される。このように、どのシステイン残基が足場に結合することができるかを決定することが可能である。
もちろん、他の組合せを生成することも可能である。前述の実施形態は、たとえば、ペプチド内でＣ３、Ｃ４およびそれらのフランキング配列の位置が交換されて、たとえば化学式
Ｃ１(Ｘ)ｍ(Ｇ)ｎ(Ｘ)ｐＣ４(Ｘ)ｑ(Ｇ)ｒ(Ｘ)ｓＣ２(Ｘ)ｔ(Ｇ)ｕ(Ｘ)ｖＣ３
のペプチドをもたらすように、修正される。
原則として、本発明に従う方法は、一次配列が知られているあらゆるたんぱく性分子に応用できる。しかし、好ましい実施形態においては、たんぱく性分子が、シスチン-ノットファミリ、膜貫通たんぱく、ＴＮＦ-アルファ、ＨＧＦ-ＳＦ、ＦＧＦ-ベータ、インターロイキン、ＩＬ-５、ケモカイン、Ｇたんぱく結合受容体、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＩＧＦ、ＬＭＦ、エンドセリン-１、ＶＩＰ、ＣＧＲＰ、ＰＩＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ-アルファ、ＥＧＦＲファミリ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ｐ５３、コルチコトロピン ＲＦ、ＡＣＴＨ、副甲状腺ホルモン、ＣＣＫ、サブスタンスＰ、ＮＰＹ、ＧＲＰ、ニューロトロフィン、アンジオテンシン-２、アンギオジェニン、アンジオポイエチン、ニューロテンシン、ＳＬＣＬＣ、ＳＡＲＳ-由来たんぱく、ＨＩＶ-由来たんぱく、パピローマウイルス-由来たんぱくおよびＦＭＤＶから成る群から選択される、本発明に従う方法が提供される。本発明の方法は、その群の一員から少なくとも部分的に由来する免疫原性化合物および／または結合化合物を生成するのに、特に適していることがわかった。
本発明に従う方法が膜貫通たんぱくの一次配列から少なくとも１つのアミノ酸残基を選択する工程を含む場合、細胞外ドメインから少なくとも１つのアミノ酸残基を選択するのが好ましい。しかし、本発明によれば、細胞外ドメインならびにそのような細胞外ドメインのＮ-末端方向に位置する３つのアミノ酸残基およびＣ-末端方向に位置する３つのアミノ酸残基から成る膜貫通たんぱくの配列を考慮したときに、最適な試験結果が得られる。したがって、少なくとも１つのアミノ酸残基が、少なくとも１つの膜貫通たんぱくの配列であって、細胞外ドメイン、その少なくとも１つの膜貫通たんぱくのＮ-末端の方向に位置する３つのフランキングアミノ酸残基、および、その少なくとも１つの膜貫通たんぱくのＣ-末端の方向に位置する３つのフランキングアミノ酸残基を含む配列から選択される、本発明に従う方法が提供される。
１つの特に好ましい実施形態において、本発明の方法は、シスチン-ノットスーパーファミリの一員から、好ましくはシスチン-ノット成長因子スーパーファミリの一員から少なくとも部分的に由来する、免疫原性化合物および／または結合化合物の、存在および／または同定に関する試験に適した化合物を生産するために実行される。
成長因子は、生体内および生体外の双方で細胞増殖を誘導する特性を共有するポリペプチドの、比較的大きな群を代表している。成長因子間の配列類似レベルは高くないが、成長因子は、それらの構造的および機能的類似性に基づいて、スーパーファミリに分類することができる。
４つの成長因子である、４つの別々のスーパーファミリ由来の神経成長因子（ＮＧＦ）、形質転換成長因子-ベータ（ＴＧＦ-ベータ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の結晶構造は、これらのたんぱくが構造的に関連し、共通した総合的なトポロジを共有することを明らかにした。これらのたんぱくは配列相同性をほとんど示さないが、これらはすべて、「シスチン-ノット」配座を形成するように結合した６つのシステインの異常配置を有する。これらたんぱくの活性型はダイマーであり、ホモダイマーまたはヘテロダイマーのいずれかである。それらの形状のため、シスチン-ノット成長因子がダイマーを形成するための固有の要件があると思われる。この組織化の追加のレベルは、この単純な構造モチーフ周辺で構築される構造の多様性を増大させる。
形質転換成長因子-ベータ２（ＴＧＦ-ベータ２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の結晶構造において、６つの保存されたシステイン残基（配列順にＣｙｓＩ〜ＣｙｓVI）は、ノット様トポロジに配置された３つのジスルフィド結合を形成する。ＣｙｓIIとＣｙｓＶとの間（[ＣｙｓII〜Ｖ]）およびＣｙｓIIIとＣｙｓVIとの間（[ＣｙｓIII〜VI]）の２つのジスルフィド結合は、８つのアミノ酸の環状構造を形成し、この環状構造を、残りの（ＣｙｓＩとＣｙｓIVとの間の）ジスルフィド結合が貫通する（図１Ａ参照）。保存されたシステインＩ〜VIのジスルフィド結合に含まれる硫黄（Ｓ）原子は、通常Ｓ１〜Ｓ６と呼ばれる。７以上のシステイン残基を有するシスチンノットドメインを見出すことができる。「追加の」システイン残基は通常、二量化中に、シスチンノットドメイン内または鎖間ジスルフィド結合内に、さらにジスルフィド結合を創出するのに使用される。しかし、相同性およびトポロジに基づいて、どのシステインが６つの保存された残基ＣｙｓＩ〜ＣｙｓVIを表すのかを示すことは常に可能である（さらに以下を参照）。
ジスルフィド結合の類似したノット配置が、いくつかの酵素阻害剤および電位依存性のＣａ２＋チャンネルに結合する神経毒の構造において述べられている（McDonaldら、１９９３年、Cell、第７３巻、４２１−４２４頁）。しかし、それらの配列においては、シスチントポロジが異なっている。Ｃｙｓ[III〜VI]は、Ｃｙｓ[Ｉ〜IV]およびＣｙｓ[II〜Ｖ]によって形成される大環状環を貫通する。ゆえに、シスチン-ノットたんぱくは、２つの構造的分類、つまり、成長因子型および阻害剤様シスチンノット、に分類される。
シスチン-ノット成長因子スーパーファミリは、糖たんぱくホルモン（たとえば卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ））、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ-ベータ）たんぱく（たとえば骨形成たんぱく４）、血小板由来成長因子様（ＰＤＧＦ様）たんぱく（たとえば血小板由来成長因子Ａ）、神経成長因子（ＮＧＦ）（たとえば脳由来神経栄養因子）を含むサブファミリに分けられる（表１２も参照）。
すべての成長因子シスチンノットの構造は、ノットの「上に」２つの歪んだベータ-ヘアピン（ベータ-１およびベータ-３）ループおよびノットの「下に」１つの（ベータ-２）ループを備える、類似したトポロジを有する。ベータ-１ループは、ＣｙｓＩとＣｙｓIIとの間の一連のアミノ酸によって形成される。ベータ-２ループは、ＣｙｓIIIとＣｙｓIVとの間のアミノ酸によって形成され、ベータ-３ループは、ＣｙｓIVとＣｙｓＶとの間のアミノ酸によって形成される（図１Ａ参照）。ヘアピンループの大きさ（つまり、示されるシステイン間のアミノ酸の数）は、ファミリの構成員間でかなり変動することができる。
Ｃｙｓ-ノットたんぱくファミリには、３つの異なる「フィンガープリント」、つまり、（１）ＧＦＣＹＳＫＮＯＴ、（２）ＧＬＹＣＯＨＯＲＭＯＮＥ、および（３）ＮＧＦがある。これらのフィンガープリントは、主に、Ｃｙｓ-ノット周囲のアミノ酸の（１）数および（２）性質において、互いに異なる。フィンガープリントは特定のたんぱく（サブ）ファミリの特徴を含むので、あるたんぱくが、あるたんぱく（サブ）ファミリに属するかを決定するのに使用することができる。
たとえば、「ＮＧＦ」は、神経成長因子にサインを付与する４-要素フィンガープリントである。このフィンガープリントは、５つの配列の初めのアラインメントに由来している。モチーフはそのアラインメントのＣ-末端部分の保存領域から得られ、それぞれの領域が、ジスルフィド結合形成に含まれる６つのＣｙｓ-残基の少なくとも１つを含んでいた。モチーフ２および３は、ＰＲＯＳＩＴＥパターンのＮＧＦによってコードされる領域にわたっている（ＰＳ００２４８；[ＧＳＲ]-ＣｙｓII-[ＫＲＬ]-Ｇ-[ＬＩＶ]-[ＤＥ]-ｘ(３)-[ＹＷ]-ｘ-Ｓ-ｘ-ＣｙｓIII）。角括弧内のアミノ酸は、その位置でのあり得るアミノ酸を示す。たとえば、ＣｙｓIIに対するＮ-末端残基は、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＡｒｇのいずれかであり得る。ｘはあらゆるアミノ酸を示す。ＯＷＬ２２．１アルゴリズムを使用する２回の反復が収束に達することが求められて、その点にて２８の配列を含む真のセットが同定された。ＳＴＰＲ３７_９ｆのアップデート版は、３３の配列の真のセットを同定した。
「ＧＬＹＨＯＲＭＯＮＥ」は、糖たんぱくホルモンにサインを付与する４-要素フィンガープリントである。このフィンガープリントは、８つの配列の最初のアラインメントに由来している。モチーフは実質的に全アラインメント長に及ぶ保存領域から得られ、モチーフ２および４は、ＰＲＯＳＩＴＥパターンのＧＬＹ_ＨＯＲＭＯＮＥ_ＡＬＰＨＡ_１（ＰＳ００７７９：ＣｙｓII-ｘ-Ｇ-Ｃ-ＣｙｓIII-[ＦＷ]-Ｓ-[ＥＱＳ]-Ａ-[ＦＹ]-Ｐ-Ｔ-Ｐ）、およびＧＬＹ_ＨＯＲＭＯＮＥ_ＡＬＰＨＡ_２（ＰＳ００７８０：Ｎ-Ｈ-Ｔ-ｘ-ＣｙｓＶ-ｘ-ＣｙｓVI-ｘ-Ｔ-Ｃｙｓ-ｘ(２)-Ｈ-Ｋ）によってコードされる領域を含んでいた。ＯＷＬ２２．１の２回の反復が収束に達することが求められて、その点にて２３の配列を含む真のセットが同定された。ＳＴＰＲ３７_９ｆのアップデート版は、３４の配列の真のセットを同定した。
「ＧＦＣＹＳＫＮＯＴ」は、成長因子シスチンノットファミリにサインを付与する２-要素フィンガープリントである。このフィンガープリントは、２５の配列の最初のアラインメントに由来している。モチーフ１は、ＣｙｓII-ｘ-Ｇ-ｘ-ＣｙｓIIIコンセンサスにわたり（ＰＲＯＳＩＴＥパターンのＰＤＧＦ（ＰＳ００２４９：Ｐ-[ＰＳＲ]-Ｃｙｓ-Ｖ-ｘ(３)-Ｒ-ＣｙｓII-[ＧＳＴＡ]-Ｇ-Ｃｙｓ-ＣｙｓIII）、ＴＧＦ_ＢＥＴＡ（ＰＳ００２５０：[ＬＩＶＭ]-ｘ(２)-Ｐ-ｘ(２)-[ＦＹ]-ｘ(４)-ＣｙｓII-ｘ-Ｇ-ｘ-ＣｙｓIII）、ＧＬＹ_ＨＯＲＭＯＮＥ_ＢＥＴＡ_１（ＰＳ００２６１：ＣｙｓII-[ＳＴＡＧＭ]-Ｇ-[ＨＦＹＬ]-ＣｙｓIII-ｘ-[ＳＴ]）、およびＮＧＦ（ＰＳ００２４８；[ＧＳＲ]-ＣｙｓII-[ＫＲＬ]-Ｇ-[ＬＩＶ]-[ＤＥ]-ｘ(３)-[ＹＷ]-ｘ-Ｓ-ｘ-ＣｙｓIII）参照）、モチーフ２はＣｙｓＶ-ｘ-ＣｙｓVIパターンにわたる。ＯＷＬ２６．０の４回の反復が収束に達することが求められて、その点にて１９２の配列を含む真のセットが同定された。いくつかの偽陽性も同定され、それらのほとんどが非常に偏った（システイン-リッチ）配列である（たとえば、メタロチオネインおよびケラチン）。ＳＴＰＲ３７_９ｆのアップデート版は、１９８の配列の真のセットを同定した。
本発明は、これらの１つ１つの模倣体、および発見されるこれらのファミリの構成員の１つ１つの模倣体を、設計し生産する方法を提供する。
現在、たとえばＴＮＦ-アルファ、ＣＤ（分化抗原のクラスタ）-ファミリ、サイトカイン、抗体または細胞表面受容体といった複合たんぱくの結合部位を、合成ペプチドを用いて模倣することが、たんぱく科学および薬剤開発において最も活発な領域の１つである。多くのたんぱくは、露出した表面の比較的小さい領域を含んだ相互作用を介して、生物活性を発現する。したがって、これらの表面エピトープを模倣する分子は非常に興味深い。なぜなら、それらは、たとえば、たんぱくおよびＤＮＡなどの、ある生理学的分子を認識するたんぱくの能力といった完全たんぱくの生物活性を、比較的小さな合成分子において模倣する手段を提供するからである。短い直鎖ペプチドは、固有の可撓性およびたんぱく分解に対する脆弱性のために、この目的には理想的ではない。代わりに、環化反応によって直鎖ペプチドの鎖を、生物学的に関連のある二次構造を有するループしたペプチド化合物に、束縛するのが好ましい。
本発明は、シスチン-ノット成長因子ファミリ構成員のペプチド模倣体として適しているループしたペプチド構造の設計のための、合理化された戦略を提供する。ここで使用される「ペプチド模倣体」という用語とは、ある生理学的分子を認識するＣｙｓ-ノットファミリ構成員の能力を模倣する（合成）ペプチド化合物をいう。さらに、本発明は、少なくとも１つのジスルフィド結合を含むたんぱく性分子（たとえばシスチン-ノットファミリの一員）に少なくとも部分的に由来する化合物であって、免疫原性化合物および／または結合化合物の存在および／または同定に関する試験に適した化合物の、生産方法を提供する。
本発明の１つの実施形態において、注目するたんぱく性分子は、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合を含み、ここで、２つのシステイン残基は一次配列において、互いから最小で３アミノ酸残基、最大で２１アミノ酸残基離れて位置する（第１のシステインの位置をｘ、第２のシステインの位置をｘ＋ｎとするとき、３＝＜ｎ＝＜２１であることを意味する）。この実施形態において、(Ｘ)ｍＣｘ(Ｘ)ｎ−１Ｃｘ＋ｎ(Ｘ)ｐの化学式の少なくとも１つのペプチドが合成されるのが好ましい。ここで、ＣｘおよびＣｘ＋ｎはそれぞれ位置ｘおよび位置ｘ＋ｎのシステイン残基を表し、(Ｘ)ｍは、ｍ個のアミノ酸残基から成りＮ-末端の方向に位置するＣｘのフランキング配列を表し、(Ｘ)ｐは、ｐ個のアミノ酸残基から成りＣ-末端の方向に位置するＣｘ＋ｎのフランキング配列を表し、(Ｘ)ｎ−１は、たんぱく性分子の一次配列内の第１システイン残基と第２システイン残基との間に位置するｎ−１個のアミノ酸残基を表す。１つの実施形態において、第１のシステイン残基と第２のシステイン残基との間に位置するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されるが、これは必須ではない。
既に説明したように、ＣｘおよびＣｘ＋ｎ以外に、そのペプチド内には他のシステイン残基が存在しないのが好ましい。(Ｘ)ｍ、(Ｘ)ｎ−１および／または(Ｘ)ｐの一部である、たんぱく性分子の一次配列における他のシステイン残基は、そのような「付加的」システイン残基とＣｘおよび／またはＣｘ＋ｎとの相互作用を避けるために、たとえばアラニンなどの別のアミノ酸残基に変更されるか、あるいは、たとえば保護基を用いて不活性にされるのが好ましい。好ましい実施形態において、化学式(Ｘ)ｍＣｘ(Ｘ)ｎ−１Ｃｘ＋ｎ(Ｘ)ｐのペプチドのセットが生産され、フランキング配列(Ｘ)ｍおよび(Ｘ)ｐは少なくとも部分的に異なる長さのものであり、ｍおよびｐは式０＝＜ｍ、ｐ＝＜１８を満たすのが好ましい。さらに、ｍ＋ｎ＋ｐは、２５アミノ酸残基以下の長さのペプチドを生産するために、２３よりも小さいかそれに等しいのが好ましい。少なくとも１つのペプチドは、その後、足場にカップリングされる。
本発明のさらなる実施形態において、注目するたんぱく性分子は、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合を含み、ここで、２つのシステイン残基は一次配列において、互いから２２アミノ酸残基以上離れて位置している（第１のシステインの位置をｘ、第２のシステインの位置をｘ＋ｎとするとき、ｎ＞２１であることを意味する）。この実施形態において、たんぱく性分子の一次配列内の位置ｘ＋[(ｎ−２０)／２]のアミノ酸残基にて開始し、位置ｘ＋[(ｎ＋２０)／２]のアミノ酸残基にて終了する、たんぱく性分子の一次配列の一部が考慮されるのが好ましい。ゆえに、本発明の方法は、その部分を用いて実行されるのが好ましく、これは、その部分の少なくとも１つのアミノ酸が選択されたり、そのアミノ酸の少なくとも１つのフランキング配列が選択されたりなどすることを意味する。したがって、１つの実施形態は、少なくとも１つのアミノ酸残基が少なくとも１つのたんぱく性分子のＳＳ-架橋配列から選択される、本発明に従う方法を提供する。ＳＳ-架橋の２つのシステインは、位置ｘおよび（ｘ＋ｎ）に位置するのが好ましく、ｎ＞２１であり、アミノ酸残基は、アミノ酸位置ｘ＋[(ｎ−２０)／２]にて開始し、アミノ酸位置ｘ＋[(ｎ＋２０)／２]にて終了するＳＳ-架橋配列の領域から選択されるのが好ましい。
以下の非限定的な例が、この実施形態を明確にする。２つのシステイン残基が、たんぱく性分子の一次配列の位置１および３１に位置する場合、以下の値が使用される：ｘ＝１、ｘ＋ｎ＝３１およびｎ＝３０。その後、アミノ酸位置１＋[(３０−２０)／２]＝６にて開始し、アミノ酸位置１＋[(３０＋２０)／２]＝２６にて終了する、２つのシステイン残基間の配列が考慮される。ゆえに、たんぱく性分子の一次配列内の位置６〜２６の配列が考慮される。位置６〜２６の配列から少なくとも１つのアミノ酸残基が選択されたり、少なくとも１つのその選択されたアミノ酸残基の、少なくとも１つのフランキング配列が選択されたりなどする。ここでも、好ましくは異なる長さであり、および／または、好ましくは異なるフランキング配列を含む、複数のペプチドが生成されるのが好ましい。
ｎが奇数である場合、値[(ｎ−２０)／２]および[(ｎ＋２０)／２]は整数ではない。その場合、結果として生じる値は丸められる。その値よりも小さいか大きい初めの整数値がとられる。たとえば、ｎ＝３５の場合、[(ｎ−２０)／２]の値は７．５である。その場合、値７または８のどちらかが選択される。
注目するたんぱく性分子が２つ以上の内部ジスルフィド結合を含み、各ジスルフィド結合が２つのシステイン残基間にある場合、少なくとも１つのシステイン残基が選択される本発明の方法が提供されるのが好ましい。したがって、本発明は、少なくとも１つのたんぱく性分子の一次配列内の選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つが、システイン残基である本発明に従う方法を提供する。選択されるアミノ酸残基は、それぞれそのたんぱく性分子のシステイン残基であるのがより好ましい。結果として、このより好ましい実施形態においては、選択されるフランキング配列はそれぞれシステイン残基のフランキング配列である。少なくとも１つのシステイン残基の少なくとも１つのフランキング配列を含むペプチドが生産される。異なるフランキング配列が、１つのペプチド内で組み合わされるのが好ましい。さらに好ましい実施形態において、異なる長さのフランキング配列を含む複数のペプチドが生産される。この実施形態は、結合化合物および／または免疫原性化合物をスクリーニングするのに特に有用である。なぜなら、通常、ジスルフィド結合を介して互いに結合するシステイン残基のフランキング配列は、しばしば相互作用事象と関連があるからである。
シスチンノットファミリの一員は、２つ以上のジスルフィド結合を含む。少なくとも３つのジスルフィド結合が、システイン残基の３対間に存在する。ゆえに、シスチンノットスーパーファミリの一員は、少なくとも６つのシステイン残基を含む（配列順にＣｙｓＩ〜ＣｙｓVI）。シスチンノットファミリの一員が注目するたんぱく性分子として考慮される場合、システイン残基の少なくとも２つは本発明に従う方法において選択されるのが好ましい。ＣｙｓIVおよびＣｙｓＶが選択されるのが最も好ましい。なぜなら、それらの間のシステイン残基およびアミノ酸残基が、必然的にたんぱく性分子内にベータ-３ヘアピン（Ｂ３）ループを形成するからである。このループを模倣するペプチドは、システイン-ノットファミリの一員のペプチド模倣体として、特に適していることが分かった。
本発明に従う方法で設計され合成される化合物は、注目する免疫原性化合物および／または結合化合物をスクリーニングするのに特に適している。１つの実施形態において、本発明に従う複数のペプチドが合成され、たとえば抗体かその機能部分、誘導体および／もしくは類似体、ならびに／または、Ｔ細胞かその機能部分、誘導体および／もしくは類似体などの、注目する結合化合物とインキュベートされる。結合したペプチドは選択され、および／または同定される。したがって、１つの実施形態は、注目する免疫原性化合物および／または結合化合物の存在および／または同定に関するスクリーニング方法であって、
本発明に従う方法によって異なるペプチドを含む複数の化合物を生産する工程と、
それらの化合物の少なくとも１つが、少なくとも１つのたんぱく性分子に特異的な抗体かその機能部分、誘導体もしくは類似体、または、少なくとも１つのたんぱく性分子に特異的なＴ細胞かその機能部分、誘導体もしくは類似体、に特異的に結合することができるかを試験する工程とを、含む方法を提供する。複数の化合物は、所望の特性を備える化合物が存在する機会を増大させるために、少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１００、最も好ましくは少なくとも１０００の化合物を含むのが好ましい。
抗体またはＴ細胞の機能部分は、種類において同じ免疫原性を有する一部として定義され、量において同じ免疫原性を有することは必須ではない。免疫原性とは、抗原を特異的に結合する能力を意味する。抗体またはＴ細胞の誘導体は、結果として生じる誘導体の免疫原性が、種類において本質的に同じであるように変更された抗体またはＴ細胞として定義され、量において本質的に同じ免疫原性を有することは必須ではない。誘導体は、たとえば保存的なアミノ酸置換といった、多くの方法で提供することができる。当業者は、抗体またはＴ細胞の類似化合物を充分に生成することができる。これは、たとえば、ペプチドライブラリのスクリーニングを介してなされる。そのような類似物は、種類において本質的に同じ抗体またはＴ細胞の免疫原性を有し、量において本質的に同じ特性を有することは必須ではない。
１つの実施形態において、本発明のペプチドの免疫原性は、ヒトでない動物に化合物を投与して、免疫応答が誘導されるかを決定することによって試験される。したがって、免疫原性化合物の存在および／または同定に関するスクリーニング方法であって、
本発明に従う方法によって異なるペプチドを含む複数の化合物を生産する工程と、
化合物の少なくとも１つが免疫応答を誘導することができるかどうかを試験する工程とを含む方法が提供される。
本発明のペプチドが注目するたんぱく性分子に対して免疫応答を誘導することができるかを試験するのが好ましい。これは、たとえば、ヒトでない動物に本発明のペプチドを与え、ヒトでないその動物から抗体および／またはＴ細胞を得て、注目するたんぱく性分子（のエピトープ）とその抗体および／またはＴ細胞をインキュベートし、その抗体および／またはＴ細胞が注目するたんぱく性分子（のエピトープ）と特異的に結合することができる抗体および／またはＴ細胞を含むかどうかを決定することによって、実行される。
本発明の化合物が注目する免疫原性化合物および／または結合化合物であると思われる場合、その化合物が選択されるのが好ましい。したがって、注目の免疫原性部位または結合部位を含む化合物を選択する工程をさらに含む、本発明に従う方法も、またここで提供される。選択された化合物は同定されるのが好ましい。
１つの実施形態においては、選択された化合物は免疫原性化合物および／または結合化合物として直接使用される。別の実施形態においては、選択された化合物は有望な候補化合物として扱われる。これは、さらなる調査が実行されることを意味する。１つの実施形態において、この候補化合物は、スクリーニングの第１ラウンドの後、さらに試験される。たとえば、有望な候補化合物が生体外スクリーニング方法中に選択された場合、たとえばヒトでない動物の生体内にてさらに試験される。１つの実施形態において、この有望な候補化合物は修飾されて、少なくとも１つの改良された特性の存在に関して再び試験される。これは、たとえば置換ネットマッピング（replacement net mapping）で実行され、置換ネットマッピングにおいては複数のペプチドが合成される。各ペプチドにおいて、元々の有望なペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基によって置換される。結果として生じるペプチドは、修飾されたペプチドの少なくとも１つが少なくとも１つの改良された特性を含むかどうかを決定するために、再び試験される。
１つの実施形態において、第１のスクリーニングにおいて同定された有望な候補ペプチドは、改良された免疫原性および／または結合特性を有する化合物を検索するために、別のペプチド配列と組合わされる。
本発明の方法は、注目する免疫原性および／または結合特性を有する本発明に従う化合物の、生産および／または同定に適している。したがって、本発明に従う方法によって取得可能な、所望の免疫原性および／または結合特性を有する単離、合成または組換え化合物もまた、ここで提供される。その化合物は、足場とカップリングされた、本発明に従うペプチドを含むのが好ましい。この足場は、（ヘテロ）芳香族分子、より好ましくはハロメチルアレーン ビス(ブロモメチル)ベンゼン、トリス(ブロモメチル)ベンゼンまたはテトラ(ブロモメチル)ベンゼンを含むのが好ましい。この足場は、少なくとも１つのメタ-ジブロモキシレン（ｍ-Ｔ２）足場、少なくとも１つの２,４,６-トリス(ブロモメチル)メシチレン（Ｔ３）足場、および／または少なくとも１つの１,２,４,５-テトラブロモジュレン（Ｔ４）足場を含むのが最も好ましい。本発明に従う化合物は、広範な種々の用途に適している。たとえば、本発明に従う化合物は治療の用途に用いられる。本発明に従う化合物は、たとえば、受容体-リガンド結合対に対するアゴニストまたはアンタゴニストとしての使用に適している。１つの実施形態において、所望の免疫原性を有する化合物が合成され選択される。したがって、本発明は、本発明に従う方法によって取得可能な免疫原性化合物を提供する。この免疫原性化合物は、たとえば、本発明の方法によって取得可能な免疫原性ペプチドから成る。しかし、本発明に従う免疫原性化合物は、免疫原性ペプチドの安定性および生物活性を改良するために、足場に結合された免疫原性ペプチドを含むのが好ましい。１つの実施形態において、本発明に従う免疫原性ペプチドは、少なくとも２つのＳＨ-官能基を介して（ヘテロ）芳香族分子、好ましくはハロメチルアレーンに結合される。なぜなら、このようなカップリング反応は、（あらゆる付加的システイン残基を除いて）その免疫原性ペプチドのアミノ酸残基を保護する必要なく、水溶液内でさえ、容易にかつ迅速に実行されるからである。さらに、結果として生じる免疫原性化合物は安定しており、ペプチドは生物学的に重要な構造を含む。特に好ましい実施形態において、本発明に従う免疫原性ペプチドは、ビス(ブロモメチル)ベンゼン、トリス(ブロモメチル)ベンゼンまたはテトラ(ブロモメチル)ベンゼンにカップリングされる。少なくとも１つのメタ-１,３-ビス(ブロモメチル)ベンゼン（ｍ-Ｔ２）、オルト-１,２-ビス(ブロモメチル)ベンゼン（ｏ-Ｔ２）、パラ-１,４-ビス(ブロモメチル)ベンゼン（ｐ-Ｔ２）、メタ-１,３-ビス(ブロモメチル)ピリジン（ｍ-Ｐ２）、２,４,６-トリス(ブロモメチル)メシチレン（Ｔ３）、メタ-１,３-ビス(ブロモメチル)-５-アジドベンゼン（ｍ-Ｔ３-Ｎ３）および／または１,２,４,５-テトラブロモジュレン（Ｔ４）足場にカップリングされる免疫原性ペプチドを含む、免疫原性化合物が提供されるのが最も好ましい。
さらに、本発明は、本発明に従う方法によって取得可能な免疫原性化合物を含む免疫原性組成物を提供する。１つの実施形態において、この免疫原性化合物は、たとえば食塩溶液といった適した担体、および／もしくはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン（たとえばＢＳＡまたはＲＳＡ）、オボアルブミン、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ウイルス様粒子などのたんぱく担体、または当該技術でよく知られているあらゆる他の適した担体に結合される。しかし、足場にカップリングされた本発明に従う免疫原性化合物の使用は、しばしば担体を使用する必要性を除去する。これは、そのような付加的担体に対して特異的に向けられる免疫応答が避けられるという利点を提供する。したがって、１つの実施形態は、足場に結合された免疫原性ペプチドを含む免疫原性化合物を含む免疫原性組成物を提供し、この免疫原性組成物は（本質的に）付加的担体を欠いている。１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、たとえば完全フロインドアジュバント（ＦＣＡ）、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）、水中油滴（Ｏ／Ｗ型）エマルジョンもしくは二重水中油滴（Ｏ／Ｗ／Ｏ型）エマルジョン、アルミニウム塩アジュバント、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ、ＭＦ５９、水酸化アルミニウム、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、ＲＩＢＩ、サポニン、および／またはＣｏＶａｃｃｉｎｅなどの適したアジュバントを含む。本発明に従う免疫原性組成物は、経口で、もしくはエアロゾルによって投与されるのが好ましく、または、筋肉内に、皮下に、もしくは高圧無針経皮的注射を介して、注射されるのが好ましい。治療的および／または予防的用途において使用される、本発明に従う（免疫原性）ペプチドおよび／または（免疫原性）化合物の投与量範囲は、厳密なプロトコール要件が存在し、ここでさらなる説明を必要としない、臨床試験における病院での上昇投与量試験に基づいて設計される。通常、体重１キログラムあたり１μｇ〜１ｍｇの投与量が使用される。
好ましい実施形態は、本発明に従う少なくとも２つの異なる免疫原性ペプチドを含む、本発明に従う免疫原性組成物を提供する。これらの少なくとも２つの異なる免疫原性ペプチドは、注目するたんぱく性分子に対して特異的に向けられる免疫応答を誘導することができるのが好ましい。これらの少なくとも２つの異なる免疫原性ペプチドは、宿主の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９５％において、注目するたんぱく性分子に対して特異的に向けられる防御免疫応答を誘導することができるのが最も好ましい。ここで、たんぱく性分子に対する防御免疫応答は、そのたんぱく性分子の少なくとも１つの特性を弱めることが可能な免疫応答として定義される。
１つの実施形態において、本発明のこれらの異なるペプチドはそれぞれ、宿主の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９５％において、たんぱく性分子に対する防御免疫応答を誘導することができる。しかし、１つの実施形態において、本発明の単一のペプチドはそれぞれ、単独では注目するたんぱく性分子に対して防御免疫応答を本質的に誘導することができないが、本発明に従う少なくとも２つのペプチドの組合せは、宿主の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９５％において、たんぱく性分子に対する防御免疫応答を誘導することができる。この場合、本発明に従う少なくとも２つの免疫原性ペプチドを含む免疫原性組成物が特に好ましい。１つの実施形態において、本発明に従う免疫原性組成物は、本発明に従う少なくとも３つの免疫原性ペプチドを含む。
本発明に従う少なくとも２つの免疫原性化合物を含む本発明の免疫原性組成物は、自己抗原に対する免疫付与に特に適している。自己抗原に対する免疫応答が所望される場合、免疫応答を誘導することができるのに充分なほど修飾された自己抗原でありながら、同時に、誘導された免疫応答が自己抗原を認識することができるように、元々の自己抗原に充分に類似する自己抗原が使用されるのが好ましい。このような修飾された自己抗原での免疫付与は通常、修飾自己抗原の非修飾自己抗原との類似性の観点から、効果的な免疫応答をもたらさない。しかし、本発明に従う少なくとも２つの免疫原性ペプチドの組合せは、この問題を少なくとも部分的に解決する。なぜなら、このような組合せは、よりよく防御免疫応答を誘導することができるからである。
１つの実施形態において、本発明に従う少なくとも２つの異なる免疫原性ペプチドが同じ足場に結合される。たとえば、ペプチドが別の立体配座に固定されるため、異なる三次元定位が得られるため、および／または、多価数の結果として、免疫付与は増大される。
本発明に従う方法によって取得可能な免疫原性ペプチドおよび／または免疫原性化合物は、たとえばヒトでない動物において免疫応答を誘導するのに適している。その後、免疫原性ペプチドおよび／または免疫原性化合物を特異的に結合することができる抗体および／またはＴ細胞を単離することが可能である。代わりに、またはさらに、本発明の免疫原性ペプチドおよび／または免疫原性化合物を特異的に結合することができる、抗体、Ｔ細胞、またはその機能部分、誘導体および／もしくは類似体が、たとえば未感作Ｔ細胞を、本発明に従う免疫原性ペプチドによって刺激された抗原提示細胞とインキュベートすることによって、生体外で生成される。したがって、１つの実施形態は、注目する免疫原性化合物および／または結合化合物を選択する工程と、免疫原性化合物を特異的に結合することができる抗体、Ｔ細胞、またはその機能部分、誘導体および／もしくは類似体を生産する工程とをさらに含む、本発明に従う方法を提供する。したがって、本発明に従う方法によって取得可能な免疫原性ペプチドおよび／または免疫原性化合物を特異的に結合することができる、単離された、または合成された抗体、Ｔ細胞、またはその機能部分、誘導体および／もしくは類似体も、ここで提供される。
本発明は、さらに、本発明に従う結合化合物を含むアレイを提供する。このようなアレイは、リガンドまたは受容体などの特定の分子の存在に関して、サンプルをスクリーニングするのに特に適している。
本発明は、さらに、本発明に従う方法によって取得可能な免疫原性ペプチドおよび／または免疫原性化合物を含むアレイを提供する。このようなアレイは、本発明に従う免疫原性ペプチドおよび／または免疫原性化合物を特異的に結合することができる抗体および／またはＴ細胞の存在に関して、サンプルをスクリーニングするのに特に適している。たとえば、個体から得られるサンプルは、その個体が注目するたんぱく性分子を特異的に結合することができる抗体および／またはＴ細胞を含むかどうかを決定するために、本発明に従うアレイでスクリーニングされる。このような抗体および／またはＴ細胞がサンプルに存在すると思われる場合、その個体は注目するたんぱく性分子の存在を含む病気を患っているか、患う危険があるということが示唆される。その病気（の危険）は、たとえば病原体の感染、悪性細胞の存在、自己免疫疾患などによって引き起こされる。
さらなる実施形態は、本発明に従う、抗体、Ｔ細胞、またはその機能部分、誘導体および／もしくは類似体を含むアレイを提供する。本発明のこのような抗体、Ｔ細胞、機能部分、誘導体および／または類似体は、本発明の免疫原性化合物を特異的に結合することができ、たとえば、そのアレイはサンプル中の免疫原性化合物の存在を決定するのに適している。さらに、その免疫原性化合物が注目する免疫原性たんぱく性分子のペプチド模倣体である場合、本発明の抗体、Ｔ細胞、機能部分、誘導体および／または類似体はまた、その注目するたんぱく性分子を特異的に結合することができる。その場合、そのアレイは、注目するたんぱく性分子のサンプル中における存在を決定するのにも適している。
発明の詳細な説明
シスチン-ノット成長因子ファミリの種々の構成員の調査は、シスチン-ノット成長ファミリ構成員のベータ-３ヘアピン（Ｂ３）ループのアミノ酸配列に由来し、独特な特徴を有するペプチドが、ペプチド模倣体としての使用に特に適していることを明らかにした。したがって、シスチン-ノット成長因子ファミリの一員のペプチド模倣体が提供され、そのペプチド模倣体は、シスチン-ノット成長因子ファミリ構成員のベータ-３ヘアピン（Ｂ３）ループのアミノ酸配列に由来するポリペプチドを含む。このポリペプチドにおいては、２つのアミノ酸残基が、足場を介して互いに共有結合された第１および第２システイン残基によって置換され、ａ）第１足場付着システイン残基は、野生型Ｂ３-ループにおけるアミノ酸ＣｙｓIVに対応する位置からｐ残基Ｃ-末端方向に位置して、位置ＣｙｓIV＋ｐとして示され、ここで５≦ｐ≦１２である。ｂ）第２足場付着システイン残基は、野生型Ｂ３-ループにおけるアミノ酸ＣｙｓＶに対応する位置からｑ残基Ｎ-末端方向に位置して、位置ＣｙｓＶ−ｑとして示され、ここで４≦ｑ≦１２であり、（ｐ−ｑ）は−３，−２，−１，０，１，２または３である。また、ｃ）ポリペプチドの長さは位置ＣｙｓIV＋ｘのアミノ酸から位置ＣｙｓＶ＋ｙのアミノ酸までであり、ｘ＋ｙ＝−１，０，１または２の条件下で、−５ｘ１および１ｙ６である。これらの基準を満たすループしたペプチド構造は、動物において特異的な抗体応答を誘導する能力によってとりわけ明らかなように、Ｃｙｓ-ノットファミリ構成員の模倣体として好適に使用されることがわかった。
ゆえに、Ｂ３-ループの天然の立体配座に充分に類似するループしたペプチド構造を達成するために、ポリペプチドの長さ、および、ポリペプチドを足場に付着（環化）されるポリペプチド内のシステイン残基の位置に関して、満たされるべきいくつかの一般的基準がある。ペプチド長は足場の性質にも依存するだろう。これらの一般的基準は、Ｃｙｓ-ノット成長因子ファミリ構成員のすべての構成員においてＢ３ループの「底」に位置する保存残基ＣｙｓIVおよびＣｙｓＶに関する（図１Ｂ参照）。天然のたんぱくにおいて、Ｂ３-ループは複雑なノット-構造の結果として形成され、ＣｙｓIVとＣｙｓＶとの間のジスルフィド結合によって形成されるのではないことに注目すべきである。本発明のペプチド模倣体においては、足場分子がポリペプチドを束縛して、Ｂ３-ループを模倣する二次構造を誘導する。足場は、ポリペプチドの末端よりもむしろ、ポリペプチド内のシステインに付着され、ペプチド模倣体はＡ-形分子として図式的にみなすことができる（図１Ｃ参照）。本発明のペプチド模倣体はまた、化学的に結合したペプチド足場（chemically linked peptide scaffold）とも呼ばれ、ＣＬＩＰＳとして短縮表記される。
任意のＣｙｓ-ノットたんぱくファミリ構成員のＢ３-ループならびに残基ＣｙｓIVおよびＣｙｓＶの同定を、一次アミノ酸配列の配列アラインメントに基づいてすることができる。表１３は、異なる哺乳類のＣｙｓ-ノット成長因子ファミリの種々の構成員の、そのようなアラインメントを示したものである。Ｂ３ループは、保存残基ＣｙｓIVにて開始し、残基ＣｙｓＶに対するＮ-末端側の残基にて終了する。この残基を残基ＣｙｓＶ-１ともいう。一度保存ＣｙｓIVおよびＣｙｓＶ残基が同定されれば、ポリペプチドの適した長さおよびポリペプチドの足場への付着のためのシステインの位置は、容易に決定することができる。
表１４Ａ〜１４Ｅは、Ｃｙｓ-ノット成長因子ファミリの５つの異なるサブファミリに関して、６つの保存Ｃｙｓ残基（ＣｙｓＩ〜ＣｙｓVI）の位置を記載している。たとえば、ｈＣＧ-アルファは、位置７，１２，２８，３１，３２，５９，６０，８２，８４および８７にそれぞれ位置する、１０のシステイン残基（Ｃ-１〜Ｃ-１０）を含む。この配列アラインメントに基づくと、ｈＣＧのＣ-２はＣｙｓＩに、Ｃ-３はＣｙｓIIに対応し、Ｃ-４は「追加の」システインであり、Ｃ-５はＣｙｓIIIに対応する。ゆえに、ｈＣＧの場合、残基Ｃｙｓ６０がＣｙｓIVに、残基Ｃｙｓ８２がＣｙｓＶに対応する。別の例として、ＧＬＨＢサブファミリ構成員ＦＳＨ-ベータにおいては、Ｃｙｓ５１がＣｙｓIVに、Ｃｙｓ８２がＣｙｓＶに対応する。同様の様式で、他のＣｙｓ-ノットファミリ構成員についても、ＣｙｓIVおよびＣｙｓＶ残基は容易に同定することができる。
満たされるべき第１および第２の基準は、システインが導入され、そのシステインを介してポリペプチドが足場に付着される位置を定義する。第１（つまり、Ｂ３-ループの配列に基づくＮ-末端システイン）および第２（つまりＣ-末端）システインの位置は、天然のたんぱくに最適に類似する二次構造を誘導する足場の能力に関連すると考えられる。そのポリペプチド内の第１システイン残基は、野生型たんぱくのＢ３-ループにおけるアミノ酸ＣｙｓIVに対応するアミノ酸位置から、Ｃ-末端方向（つまり「下流」）に位置する。この位置は位置ＣｙｓIV＋ｐとして示すことができる。位置ＣｙｓIVへの距離は、少なくとも５残基、最高で１２残基でなければならない。言い換えれば、第１の足場付着システインの位置は位置ＣｙｓIV＋ｐに対応し、５≦ｐ≦１２である。第２の足場付着システイン残基は、野生型たんぱくのＢ３-ループにおけるアミノ酸ＣｙｓＶに対応するアミノ酸位置から、Ｎ-末端方向（つまり「上流」）に位置する。この位置は位置ＣｙｓＶ−ｑとして示すことができる。位置ＣｙｓＶへの距離は、少なくとも４残基、最高で１２残基でなければならない。言い換えれば、第２の足場付着システインの位置は位置ＣｙｓＶ−ｑに対応し、４≦ｑ≦１２である。さらに、ヘアピン形成を乱すことなく両システインを１つの足場に結合させることができるように、両システインはおおよそ互いに反対に位置するのが重要である。その理由のため、（ｐ−ｑ）は−３，−２，−１，０，１，２または３であることが必要である。たとえば、ポリペプチドが足場に付着されるシステインの位置は、アミノ酸位置ＣｙｓIV＋１２およびＣｙｓＶ−１０、ＣｙｓIV＋１１およびＣｙｓＶ−１０、ＣｙｓIV＋１０およびＣｙｓＶ−８、ＣｙｓIV＋９およびＣｙｓＶ−８、ＣｙｓIV＋８およびＣｙｓＶ−６、ＣｙｓIV＋７およびＣｙｓＶ−５、ＣｙｓIV＋７およびＣｙｓＶ−６、ＣｙｓIV＋７およびＣｙｓＶ−４、ＣｙｓIV＋５およびＣｙｓＶ−４、またはＣｙｓIV＋６およびＣｙｓＶ−４に対応する。システインに関して好ましい位置は、ＣｙｓIV＋１０およびＣｙｓＶ−８、ＣｙｓIV＋７およびＣｙｓＶ−６、またはＣｙｓIV＋８およびＣｙｓＶ−６である。第１および第２のシステインの位置が位置ＣｙｓIV＋１０およびＣｙｓＶ−８に対応する、本発明に従うペプチド模倣体が提供されるのが最も好ましい。
第１および第２のシステインは、結晶構造において、互いに６Åまでの距離内であり、側鎖が同方向を向くアミノ酸の位置に導入されるのが好ましい。側鎖は、表面に露出せず、それでも、Ｂ１-およびＢ３-ループをともに維持する、いわゆる疎水性コアに加わるのが好ましい。
満たされるべき第３の基準は、ペプチド長に対する制限を提示する。この基準によれば、ポリペプチドの長さは、位置ＣｙｓIV＋ｘのアミノ酸から位置ＣｙｓＶ＋ｙのアミノ酸である。ここで、ｘ＋ｙ＝−１，０，１または２の条件下で−５ｘ１、１ｙ６である。言い換えれば、ポリペプチドの第１の残基は残基ＣｙｓIV＋ｘに、最後の残基はＣｙｓＶ＋ｙに対応する。ｘ＋ｙ＝−１，０，１または２であるという条件は、ポリペプチドの足場への付着後に、Ａ-形分子の「足」（図１Ｃ参照）が、ポリペプチドの第１および最後の残基がヘアピン構造において「隣接」する残基となることを、確実にするための長さにおおよそ匹敵することを確実にする。たとえば、ペプチドの長さは、ＣｙｓIV＋１からＣｙｓＶ＋１まで、ＣｙｓIV−５からＣｙｓＶ＋６まで、ＣｙｓIV−３からＣｙｓＶ＋４まで、ＣｙｓIV−５からＣｙｓＶ＋４まで、またはＣｙｓIV−２からＣｙｓＶ＋４までである。ポリペプチドの長さは、ＣｙｓIV＋１からＣｙｓＶ＋１まで、ＣｙｓIV−２からＣｙｓＶ＋４まで、またはＣｙｓIV−５からＣｙｓＶ＋４までであるのが好ましい。ＦＳＨベータの場合、これは、ポリペプチドが、たとえば、アミノ酸５２（Ｃｙｓ５１＋１）からアミノ酸８３（Ｃｙｓ８２＋１）、またはアミノ酸４６（Ｃｙｓ５１−５）からアミノ酸８６（Ｃｙｓ８２＋４）までの一連のアミノ酸残基に対応することを意味する。
用語「に由来する」は、ポリペプチド配列が、天然のＣｙｓ-ノットたんぱくのＢ３-ループに見られるアミノ酸配列と、同一でなくてもよいことを示すのに使用される。むしろ、ほとんどの場合、ポリペプチドは、導入された２つのシステイン残基に加えて、Ｃｙｓ-ノットファミリの野生型たんぱくにおけるＢ３-ループの配列とは、少なくとも１つのアミノ酸が異なる。以下に記載するように、前述の２つの位置の２つのシステイン以外の天然の配列におけるあらゆるシステイン残基は、第１および第２のシステイン以外の残基を介したポリペプチドの足場への付着を防止するために、足場と反応しない残基に変更されるのが好ましい。
以上の基準に基づいて、本発明は、Ｃｙｓ-ノット成長因子ファミリのあらゆる公知の、または今後同定される構成員であって、たとえば糖たんぱくホルモン-ベータ（ＧＬＨＢ）ファミリ、血小板由来増殖成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリ、形質転換成長因子（ＴＧＦ）ファミリ、神経成長因子（ＮＧＦ）ファミリまたは糖たんぱくホルモン-アルファ（ＧＬＨＡ）ファミリの一員である構成員の、ペプチド模倣体を提供する。
前述のように、ここで提供されるペプチド模倣体において、足場分子は、ポリペプチドを物理的に束縛して、Ｂ３-ループを模倣する二次構造を誘導する。以下の実施例は、ここで提供されるようなペプチド模倣体における足場の存在の妥当性を実証する。第１および第２のシステインが適した足場を介して結合されると、結果として生じるペプチドは非常に効果的な免疫原になると思われる。反対に、１つのペプチド分子内の第１および第２のシステインが互いに反応してジスルフィド架橋を形成すると、結果として生じるループしたペプチド構造は、試験動物において特有の免疫応答を誘導するのに使用することができない。足場によって付与される物理的束縛は、天然のＣｙｓ-ノットファミリ構成員のＢ３-ループの二次構造を模倣するヘアピン構造の形成に重要であると考えられる。
種々のタイプの足場を、本発明に従うループしたペプチド構造において使用することができる。適した足場は、ループしたペプチド構造を形成するために、ポリペプチド内の第１および第２のシステインと反応することができるものである。特に興味深い足場分子は（ヘテロ）芳香族化合物であり、特に、ハロメチルアレーンなどの少なくとも２つのベンジルハロゲン置換基を有するものである。これらの化合物はチオール基に対する反応性が非常に高く、システイン残基を含むペプチドと共有結合を迅速に形成する。１つの実施形態において、足場はビス(ハロメチル)ベンゼンもしくはテトラ(ハロメチル)ベンゼン、またはそれらの誘導体である。好ましい実施形態において、足場はオルト-、メタ-およびパラ-ジハロメチルベンゼン（ジハロキシレンとしても知られる）ならびに１,２,４,５-テトラハロメチルベンゼン（１,２,４,５-テトラハロジュレンとしても知られる）から成る群から選択される。足場は、メタ-ジブロモキシレン（ｍ-Ｔ２）または１,２,４,５-テトラブロモジュレン（Ｔ４）であるのがより好ましい。ここで使用される用語「足場」は、本発明のペプチド模倣体を作製するために使用することができる未反応分子（たとえばメタ-ジブロモベンゼン）を、および、システインと既に反応して、ジブロモベンゼンの場合、もはやハロゲン原子を含まない、結果として生じるペプチド模倣体内の足場部分を、指すことに注意すべきである。これらの足場でペプチド模倣体を構成する方法は、国際公開第２００４０７７０６２号パンフレットで説明されている。
非常に有用なペプチド模倣体を生成した足場およびペプチドの組合せが、いくつか観察された。１つの実施形態において、ループしたペプチド構造は、メタ-ジハロキシレン足場、好ましくはメタ-ジブロモキシレンに付着される、ＣｙｓIV＋１からＣｙｓＶ＋１までの長さを有するポリペプチドを含む。たとえば１,２,４,５-テトラブロモジュレンといったテトラハロジュレン足場への付着のための好ましいペプチド長は、ＣｙｓIV−２からＣｙｓＶ＋４までである。
ループしたペプチド構造が足場上に形成されるシステインの位置に関して、特に有用な位置が、成長因子のＣｙｓ-ノットスーパーファミリの異なるサブファミリについて、同定された。
ＧＬＢＨ、ＰＤＧＦまたはＴＧＦサブファミリの一員の模倣体を得るためのシステインの好ましい位置は、ＣｙｓIV＋１０とＣｙｓＶ−８との組合せである。ＦＳＨの場合、これは残基６１および７４に、ＶＥＧＦの場合、残基７８および９４に、ＧＤＮＦの場合、残基１１２および１２４に対応する。しかし、ＧＬＢＨファミリ構成員に関しては、位置ＣｙｓIV＋１２およびＣｙｓＶ−１０、ＣｙｓIV＋８およびＣｙｓＶ−６、またはＣｙｓIV＋７およびＣｙｓＶ−５もまた、良好な結果をもたらす。同様に、ＰＤＧＦ-ファミリ構成員については、位置ＣｙｓIV＋８およびＣｙｓＶ−６またはＣｙｓIV＋１２およびＣｙｓＶ−１０が、ＴＧＦファミリ構成員については、位置ＣｙｓIV＋１０およびＣｙｓＶ−１０またはＣｙｓIV＋７およびＣｙｓＶ−４が、適切に使用される。
１つの好ましい実施形態は、本発明に従うＶＥＧＦペプチド模倣体を提供する。この模倣体においては、第１のシステインの位置はアミノ酸位置ＣｙｓIV＋８に対応し、第２のシステインの位置は位置ＣｙｓＶ−６に対応する。また、ポリペプチドはＶＥＧＦたんぱくのＢ３-ループに由来する。
ＮＧＦ-ファミリに属する構成員の模倣体を得るためのシステインの好ましい位置は、ＣｙｓIV＋７およびＣｙｓＶ−６である（ＮＧＦの場合、残基８７および１０２）。ＮＧＦファミリ構成員のためのシステイン位置の他の有用な組合せは、ＣｙｓIV＋５およびＣｙｓＶ−４、ＣｙｓIV＋９およびＣｙｓＶ−８、ならびにＣｙｓIV＋１１およびＣｙｓＶ−１０を含む。
ＧＬＨＡ-ファミリに属する構成員の模倣体を得るためのシステインの好ましい位置は、ＣｙｓIV＋８およびＣｙｓＶ−６である（ＣＧの場合、残基６８および７６）。ＧＬＨＡ-ファミリ構成員のためのシステイン位置の他の有用な組合せは、ＣｙｓIV＋６およびＣｙｓＶ−４を含む。
１つの実施形態において、本発明はＧＬＢＨ-、ＰＤＧＦ-またはＴＧＦ-ファミリの一員の模倣体を提供する。ここで、模倣体は、２つのシステインを介して足場に付着されたループしたペプチド構造であって、構成員のベータ３-ヘアピンループのアミノ酸配列に由来するポリペプチドから成り、ポリペプチドの長さはアミノ酸位置ＣｙｓIV−５からＣｙｓＶ＋４までであり、ポリペプチドは位置ＣｙｓIV＋１０の第１のシステインおよび位置ＣｙｓＶ−８の第２のシステインを介して、テトラハロメチルベンゼン足場、好ましくはテトラブロモジュレンに付着される。別の実施形態において、ポリペプチドはシステインを介して、たとえばジブロモベンゼンといった二官能化された足場に付着され、ペプチドの長さは、たとえばアミノ酸ＣｙｓIV＋１からＣｙｓＶ＋１までと、幾分短い。
別の実施形態において、本発明はＧＬＢＨ-、ＰＤＧＦ- またはＴＧＦ-ファミリの一員の模倣体を提供する。ここで、模倣体は２つのシステインを介して足場に付着されたループしたペプチド構造であって、構成員のベータ３-ヘアピンループのアミノ酸配列に由来するポリペプチドから成り、ポリペプチドの長さはアミノ酸位置ＣｙｓIV−５からＣｙｓＶ＋４までであり、ポリペプチドは位置ＣｙｓIV＋１０の第１のシステインおよび位置ＣｙｓＶ−８の第２のシステインを介して、テトラハロメチルベンゼン足場、好ましくはテトラブロモジュレンに付着される。別の実施形態において、このポリペプチドはシステインを介して、たとえばジブロモベンゼンといった二官能化された足場に付着され、ペプチドの長さは、たとえばアミノ酸ＣｙｓIV＋１からＣｙｓＶ＋１までと、幾分短い。
さらに別の実施形態において、本発明はＧＬＢＨ-、ＰＤＧＦ- またはＴＧＦ-ファミリの一員の模倣体を提供する。ここで、模倣体は２つのシステインを介して足場に付着されたループしたペプチド構造であって、構成員のベータ３-ヘアピンループのアミノ酸配列に由来するポリペプチドから成り、ポリペプチドの長さはアミノ酸位置ＣｙｓIV−５からＣｙｓＶ＋４までであり、ポリペプチドは位置ＣｙｓIV＋１０の第１のシステインおよび位置ＣｙｓＶ−８の第２のシステインを介して、テトラハロメチルベンゼン足場、好ましくはテトラブロモジュレンに付着される。別の実施形態において、このポリペプチドはシステインを介して、たとえばジブロモベンゼンといった二官能化された足場に付着され、ペプチドの長さは、たとえばアミノ酸ＣｙｓIV＋１からＣｙｓＶ＋１までと、幾分短い。
さらなる側面において、本発明はＮＧＦ-ファミリの一員の模倣体を提供する。ここで、模倣体は２つのシステインを介して足場に付着されたループしたペプチド構造であって、構成員のベータ３-ヘアピンループのアミノ酸配列に由来するポリペプチドから成り、ポリペプチドの長さはアミノ酸位置ＣｙｓIV−５からＣｙｓＶ＋４までであり、ポリペプチドは位置ＣｙｓIV＋１０の第１のシステインおよび位置ＣｙｓＶ−８の第２のシステインを介して、テトラハロメチルベンゼン足場、好ましくはテトラブロモジュレンに付着される。別の実施形態において、このポリペプチドはシステインを介して、たとえばジブロモベンゼンといった二官能化された足場に付着され、ペプチドの長さは、たとえばアミノ酸ＣｙｓIV＋１からＣｙｓＶ＋１までと、幾分短い。
ポリペプチド長がＣｙｓIVおよび／またはＣｙｓＶ残基を含む場合、これは、少なくともこ（れら）のシステインは、足場との化学反応を避けるためにポリペプチド中に存在すべきではないことを意味する。たとえば、これらのシステインは、上述の２つのシステイン以外のシステインを介して足場にポリペプチドが付着するのを避けるために、たとえばアラニン残基といった足場と反応しない残基に変更することが可能である。同様に、天然の配列におけるあらゆる他のシステイン残基は、非システイン残基に変更されるべきである。たとえば、本発明は特定の側面において、メタ-ジブロモベンゼンに付着される配列ＴＦＫＥＬＶＹＥＴＣＲＶＰＧＡＡＨＨＡＤＳＬＣＴＹＰＶＡＴＱＡＨを有するＦＳＨのＢ３-ループに由来するポリペプチドから成る、ＦＳＨのペプチド模倣体を提供する（実施例３も参照）。ポリペプチド長はＣｙｓIV＋１（Ｔｈｒ５２）からＣｙｓＶ＋１（Ｈｉｓ５２）までの一連のアミノ酸残基に対応する。下線で示される第１のＣは位置ＣｙｓIV＋１０（ＦＳＨにおけるＶａｌ６１）に、第２のＣは位置ＣｙｓＶ−８（ＦＳＨにおけるＴｙｒ７４）に対応する。ＦＳＨにおける残基Ｃｙｓ６６は、足場との不所望の相互作用を妨げるために、このポリペプチド中には存在しない。ＦＳＨに由来するこのポリペプチド中において、それは（３つのアラニン残基の第１の）アラニンである。天然のＦＳＨの配列に関して、同様のアミノ酸変更を、足場１,２,４,５-テトラブロモジュレンに付着されるポリペプチドＫＩＱＫＴＡＴＦＫＥＬＶＹＥＴＣＲＶＰＧＡＡＨＨＡＤＳＬＣＴＹＰＶＡＴＱＡＨＡＧＫ（ＣｙｓIV−５からＣｙｓＶ＋４に対応）から成る本発明の別のＦＳＨペプチド模倣体において、見出すことができる。しかし、この場合、ＦＳＨにおけるＣｙｓ８４（ＣｙｓVIに対応）もまた、ＦＳＨにおいてみられるように、アラニンに変更されて、最後の５つの残基がＣＨＣＧＫの代わりにＡＨＡＧＫとなっている。
保護されたアミノ酸を含むポリペプチドを使用して、そのアミノ酸の不所望の反応性を避けることも可能である。１つの実施形態において、ポリペプチドは、足場への付着が意図される２つのシステインに加えて、除去可能な保護基Ｃｙｓ(ＳｔＢｕ)で保護されたシステイン残基（たとえばＣｙｓIVに対応する残基）を含む。本発明のペプチド模倣体を生成するための足場への付着に続いて、この保護基は、たとえば１,４-ＤＤＴまたはエタンジチオールを用いた還元的処理によって容易に除去することが可能である。
さらなる側面において、ペプチド模倣体が、ポリペプチドを２つのシステインを介して足場に付着させることによって生成される。ここで、ポリペプチドはＢ３-ループに由来するが、１つ以上のアミノ酸残基がバイオイソステリックユニットによって置換される。バイオイソステリック置換は、生物活性分子における官能基の、類似の大きさおよび物理化学的特性を有する別の官能基による置換として定義することができる。バイオイソステリック置換は、薬剤候補の特性（活性、選択性、輸送）を最適化するのために、不所望の副作用を除去するために、または、より合成しやすい分子を設計するために、医薬品産業において使用されている。バイオイソステリック置換は物理化学的または位相的な根拠による。
さらなる側面において、本発明はｈＣＧのペプチド模倣体を提供する。この模倣体は、ｈＣＧのＢ３-ループに類似するループした構造を形成するために、足場としての１,２,４,５-テトラブロモジュレンに付着されるポリペプチドＶＶＡＮＹＥＤＶＫＦＥＳＣＲＬＰＧＡＰＲＧＶＮＰＶＣＳＹＡＶＡＬＳＡＱＡＡＬから成るペプチド模倣体を提供する。位置６１（ＣｙｓIV＋１０）および７４（ＣｙｓＶ−８）の２つのシステイン（下線で示す）が、配列に組み込まれた。野生型たんぱくにおける位置５１（ＣｙｓIV）、６６、８２（ＣｙｓＶ）および８４（ＣｙｓVI）のシステイン（表１３参照）は、アラニン残基に変更された。ポリペプチドの長さはｈＣＧにおけるＣｙｓIV−２（Ｖａｌ４９）からＣｙｓＶ＋４（Ｌｅｕ８６）までの一連のアミノ酸残基に対応する。配列ＮＹＲＤＶＲＦＥＳＣＲＬＰＧＡＰＲＧＶＮＰＶＣＳＹＡＶＡＬＳＡＱのポリペプチドを含むペプチド模倣体もまた提供され、このペプチドは下線で示されるシステインを介して足場ｍ-Ｔ２に付着される。
足場ｍ-Ｔ２に付着される配列ＴＦＫＣＬＶＹＥＴＶＲＶＰＧＡＡＨＨＡＤＳＬＹＴＹＰＶＡＣＱＡＨのポリペプチドを含むＦＳＨペプチド模倣体、足場ｍ-Ｔ２に付着される配列ＴＦＫＥＬＶＹＥＴＣＲＶＰＧＤＡＨＨＡＤＳＬＣＴＹＰＶＡＴＱＡＨのポリペプチドを含むＦＳＨペプチド模倣体、足場Ｔ３に付着される配列ＴＦＫＥＬＶＹＥＴＣＲＶＰＧＡＡＨＨＡＤＳＬＣＴＹＰＶＡＴＱＡＨのポリペプチドを含むＦＳＨペプチド模倣体、足場ｍ-Ｔ２に付着される配列ＴＦＫＥＬＶＹＥＴＣＲＶＰＧＤＡＨＨＡＤＫＬＣＴＹＰＶＡＴＱＡＨのポリペプチドを含むＦＳＨペプチド模倣体、足場ｍ-Ｔ２に付着される配列ＴＦＫＥＬＶＹＥＴＣＲＶＰＧＤＡＨＫＡＤＳＬＣＴＹＰＶＡＴＱＡＨのポリペプチドを含むＦＳＨペプチド模倣体、足場ｍ-Ｔ２に付着される配列ＥＳＮＣＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭＳＣＬＱＨのポリペプチドを含むＶＥＧＦペプチド模倣体、足場ｍ-Ｔ２に付着される配列ＥＥＳＮＣＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭＳＣＬＱＨＮのポリペプチドを含むＶＥＧＦペプチド模倣体、および２つの足場ｍ-Ｔ２に付着される配列
ＮＹＥＤＶＫＦＥＳＣＲＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＣＳＹＡＶＡＬＳＡＱ
Ｓ
Ｓ
ＮＹＲＤＶＲＦＥＳＣＲＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＣＳＹＡＶＡＬＳＡＱ
のポリペプチドを含むｈＣＧペプチド模倣体もまた提供される。例において示されるように、これらのペプチド模倣体はＦＳＨ、ｈＣＧおよびＶＥＧＦ-特異的血清を誘導するのに特に適している。
さらに、本発明は、本発明のペプチド模倣体の調製方法に関する。本発明に従うループしたペプチド化合物を作製する方法であって、修飾されたポリペプチドおよび足場を用意する工程と、ポリペプチドの足場への共有結合を許容する条件下でポリペプチドと足場とを接触させる工程とを含む方法が提供される。接触は溶液中、より好ましくは水溶液中で実行されるのが好ましい。修飾ポリペプチドは注目するたんぱくのＢ３-ループに由来する配列を有し、ポリペプチドの長さは前述の基準を満たし、ポリペプチドは先に詳細に記載した位置に第１および第２のシステイン残基を含む。ポリペプチドは合成ペプチドであり得る。合成は、標準の固相ペプチド合成またはポリペプチドを生産する他のあらゆる方法を用いて実行することができる。足場は、ポリペプチドの第１および第２システインと共有結合を形成することができる２つの反応基を含むことが好ましく、これによってループしたペプチド構造の形成を誘導する。カップリング反応は、非保護アミノ酸側鎖を有するポリペプチドを用いて実行されるのが好ましい。カップリング反応は溶液中、より好ましくは水溶液中で実行されるのが好ましい。ハロゲン-官能化足場を用いる、ループしたペプチド構造の合成に関する詳細な情報は、国際公開第２００４０７７０６２号パンフレットにおいて見出すことができる。
別の実施形態において、本発明に従うペプチド模倣体を含むワクチン組成物が提供される。動物試験は、ここで開示される基準を満足するペプチド模倣体を含む組成物が、特異的免疫応答の形成を誘導することができることを明らかにした。実施例３は、ｍ-Ｔ２足場に環化されたＦＳＨ（残基５２〜８３）由来のＴＦＫＥＬＶＹＥＴＣＲＶＰＧＡＡＨＨＡＤＳＬＣＴＹＰＶＡＴＱＡＨポリペプチドのラットへの注射が、天然のＦＳＨに反応する抗体の生産をもたらすことを示している。良好な結果は、Ｔ４足場に環化されたＦＳＨ-由来ペプチドＫＩＱＫＴＡＴＦＫＥＬＶＹＥＴＣＲＶＰＧＡＡＨＨＡＤＳＬＣＴＹＰＶＡＴＱＡＨＡＧＫ（残基４９〜８６）によっても得られた。ここで記載されるポリペプチド長の妥当性は、第１システイン（位置ＣｙｓIV＋１０）から第２システイン（位置ＣｙｓＶ−８）までの配列を有するペプチドが使用されたときの、抗体誘導の大幅な減少によって実証される。足場に付着されると、このペプチドはループした構造を有するが、本発明の特徴的なＡ-形ペプチド模倣体の「足」を表す遊離端を欠く。
足場ｍ-Ｔ２に環化されたＦＳＨ-由来ペプチドＴＦＫＥＬＶＹＥＴＣＲＶＰＧＡＡＨＨＡＤＳＬＣＴＹＰＶＡＴＱＡＨが非常に高い抗体力価をもたらす一方で、直鎖ペプチドまたは２つのシステイン間のジスルフィド架橋を介して環化されているペプチドのみを受けたラットの血清が、ＦＳＨの顕著な認識を示さなかったことを実証している実施例３および図２から、適当な足場へのペプチドの環化の重要性は明らかである。さらに、この特定のペプチドに関して、メタ-Ｔ２足場はオルト-またはパラ-Ｔ２足場よりも好ましい。
実施例６は、ペプチド系ワクチンとして種々のペプチド組成物を用いて、ラットで実行されたワクチン接種実験の結果を記載している。ペプチド投与の６週後、ラットの血清がｈＣＧ認識能力に関して試験された。比較のために、２つの市販のｈＣＧに対する抗体が含まれた。本発明に従うペプチド模倣体を注射されたラットは、良好なｈＣＧ-特異的免疫応答を示したが、同じポリペプチドの直鎖型またはＳＳ-環化型を注射されたラットは、顕著な応答を示さなかった（図３）。
ゆえに、本発明はまた、本発明に従うループしたペプチド化合物を含むワクチンを提供する。免疫原性ペプチド化合物は、細胞性免疫を誘導するために単独で使用することができる。それらはまた、抗体生産または体液性応答を誘導するために、たとえば、他の分子と併せて、ワクチン組成物において使用することもできる。ペプチド模倣体は、たとえばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン（たとえばＢＳＡまたはＲＳＡ）、オボアルブミンなどのたんぱく担体といった担体に、カップリングすることが可能である。さらに、本発明に従うループしたペプチド化合物と特異的に反応する抗体が提供される。
本発明のＣｙｓ-ノットペプチド模倣体を含むワクチンの使用もまた提供される。
１つの実施形態において、ここで提供されるワクチンは哺乳類、好ましくはヒトにおける避妊ワクチンとして使用される。現在、ホルモン的男性避妊には、２つの主要なアプローチがある。１つは、単独の、またはゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）（類似体または免疫付与）と組合せたテストステロン（類似体）に、もう１つは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）に対する免疫付与に、頼っている。理論的には、後者の方法は精子形成を抑制するが、性欲を妨げないだろう。好ましい実施形態において、本発明は男性の避妊における使用のための抗-ＦＳＨワクチンを提供する。この抗-ＦＳＨワクチンは抗-黄体形成ホルモン（ＬＨ）抗体を含まないのが好ましい（ＬＨは性欲を維持するのに必須であるテストステロンの誘導に関与する）。
別の実施形態において、本発明は、抗癌治療における治療用ペプチドとしてのループしたペプチド化合物の使用を提供する。たとえば、能動免疫療法において使用することができるワクチンが提供される。たとえば、そのワクチンはｈＣＧを模倣するループしたペプチド化合物を含む。ｈＣＧホルモンは妊娠中自然に生産され、成長を促進し、発生中の胚を免疫攻撃（つまり拒否反応）から保護すると考えられている。ｈＣＧは、癌の主要な型すべてと関連する悪性腫瘍の生化学的マーカである。ｈＣＧの発現は腫瘍の攻撃性に相関することが示されており、つまり、ｈＣＧの発現が多くなるほど、腫瘍がより攻撃的になる。双方の場合において、ｈＣＧは成長因子として働き、迅速な細胞分裂を促進する。ｈＣＧは転移および組織浸潤を促進し、血管新生、つまり血管の形成を助長し、免疫抑制を促進して、胎児または腫瘍が拒絶反応を避けるのを可能とする。したがって、ｈＣＧに対して向けられる免疫応答は、腫瘍に対する免疫攻撃を促進し、ｈＣＧによって付与されるホルモンの利点を中和させる。結果として、抗-ｈＣＧワクチンは受胎能力を阻害するのに効果的で、従って癌を治療するのにも効果的である。確かに、癌においてｈＣＧワクチンを使用する臨床研究は、ｈＣＧへの免疫応答が患者の生存に重要な役割を果たすことを示している。
好ましい実施形態において、腫瘍形成生物におけるプロ-血管新生因子に対する様々な宿主免疫応答（体液性、細胞性）を誘導することができる、本発明のペプチド模倣体を含むワクチンが提供される。ＶＥＧＦ-Ａ／ＶＥＧＦＲ-２システムのペプチド模倣体が特に興味深い。なぜなら、腫瘍血管新生（腫瘍への新しい血管の形成）におけるこのシステムの役割が重大だからである。
本発明は以下の実施例によって例示される。実施例は決して本発明の範囲を限定しない。
実施例
実施例１：ＣＣＲ５に基づく免疫原性化合物の設計および調製
材料および方法
マイクロアレイ上でのペプチドの合成およびｍ-Ｐ２またはＴ３-足場との反応
ポリプロピレン支持体のポリアクリル酸とのグラフト化を、１２ｋＧｙ線量のガンマ放射線を用いて、ＣｕＳＯ４を含む６％ アクリル酸溶液中で支持体を照射することによって実行した。その後、カルボン酸基を含むグラフト化された固体支持体を、Ｎ-ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）とともにジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いて、ｔ-ブチルオキシカルボニル-ヘキサメチレンジアミン（Ｂｏｃ-ＨＭＤＡ）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いてＢｏｃ基を開裂させた。標準Ｆｍｏｃ試薬を用いてペプチドを合成し、アシル化後、室温にて２〜４時間、１３．３重量％ フェノール、５体積％ チオアニソール、２．５体積％ １,２-エタンジチオールおよび５体積％ ミリＱ水を含むＴＦＡ（１５ｍｌ／ｇ 樹脂）と反応させて脱保護した。Ｈ２Ｏによる３回の洗浄後、ペプチドマイクロアレイを、２０ｍＭ 重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．８）／アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）中のｍＰ２またはＴ３の１．０ｍＭ 過剰溶液で３０〜６０分間室温にて処理し、その後５０％ ＡＣＮ／Ｈ２Ｏで３回洗浄した。その後、マイクロアレイを過剰ミリポアＨ２Ｏで洗浄し、ディスラプト（disrupt）バッファ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、１％ ＳＤＳ／０．１％ β-メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ｐＨ７．２）中で７０℃３０分間超音波分解し、その後、さらに４５分間ミリポアＨ２Ｏ中で超音波分解した。
足場の合成
足場はAldrich社によって市販されている。
抗体によるマイクロアレイのスクリーニング
マイクロアレイをＰＢＳで３０分間前処理し、その後インキュベーションバッファ（５％ オボアルブミン、５％ ウマ血清および１％ Tween-８０を含むＰＢＳ）で１時間プレコートした。その後、マイクロアレイをｍＡｂ（通常、インキュベーションバッファに１／１０００希釈）で一夜、４℃にてインキュベートした。ＰＢＳ／Tween-８０（０．０５％）で洗浄（３×１０分）後、ペプチドをペルオキシダーゼ標識ウサギ抗-マウス抗体と１時間２５℃にてインキュベートし（rampo、１／１０００；Dako社、Glostrup、デンマーク）、その後、ＰＢＳ／Tween-８０（０．０５％）で再度洗浄（３×１０分）後、ペルオキシダーゼ基質２,２’-アジノ-ジ-３-エチルベンゾチアゾリンスルホン酸塩（ＡＢＴＳ；３０％ Ｈ２Ｏ２を２０μｌ含む１００ｍｌの０．１Ｍ クエン酸-リン酸ナトリウム（Mcllvaine）バッファ（ｐＨ４．０）中の５０ｍｇ）とインキュベートした。１時間後、（４５０ｎｍの）吸光度を、ＣＣＤカメラ（ＸＣ-７７ＲＲ、Sony社、日本）を使用して測定した。結合したｍＡｂを、前述のように、ディスラプト-バッファ中で超音波分解によって除去した。マイクロアレイをおよそ１０〜１５回、スクリーニングのために再使用した。
ＣＣＲ５
ＣＣＲ５は、細胞侵入のためにＨＩＶによって使用されるサイトカイン共受容体である。したがって、ＣＣＲ５に対して特異的に向けられた抗体は、ＨＩＶによる細胞侵入を妨げるのに適しているだろう。しかし、完全なＣＣＲ５による免疫付与は、ＣＣＲ５が膜貫通たんぱくであることから問題がある。したがって、ＣＣＲ５-特異的抗体を誘導することができるように、ＣＣＲ５に基づく免疫原性化合物が所望される。
適した試験化合物を設計するために、４つのＣＣＲ５配列を検討した。１つはＮ-末端ドメイン（Ｎｔ）で、３つは（Ｎ-末端方向およびＣ-末端方向に）膜貫通ドメインの約１〜６の隣接アミノ酸残基で拡張される細胞外ループドメインである。これらの細胞外ループドメインをｅ１、ｅ２およびｅ３と称する。考慮したドメインの一次配列は以下のとおりである（Ｎ-末端から開始）。
Ｎｔ：ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫＱＩＡ
ｅ１：ＰＦＷＡＨＹＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭＣＱＬＬＴＧＬ
ｅ２：ＩＦＴＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴＣＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱ
ｅ３：ＮＴＦＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮＲＬＤＱＡＭ
システイン残基は天然のＣＣＲ５において天然のＣ-架橋を形成する。
ｅ２におけるＣｙｓ残基のＮ-末端側の細胞外ドメインをＥＣＬ２Ａと称し、ｅ２におけるＣｙｓ残基のＣ-末端側の細胞外ドメインをＥＣＬ２Ｂと称する。同様に、ｅ３におけるＣｙｓ残基のＮ-末端側の細胞外ドメインをＥＣＬ３Ａと称し、ｅ３におけるＣｙｓ残基のＣ-末端側の細胞外ドメインをＥＣＬ３Ｂと称する。
ＥＣＬ２Ａ：ＴＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴ
ＥＣＬ２Ｂ：ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫ
ＥＣＬ３Ａ：ＱＥＦＦＧＬＮＮ
ＥＣＬ３Ｂ：ＳＳＳＮＲＬＤＱ
その後、種々のアミノ酸残基をＮｔ、ｅ１、ｅ２およびｅ３の一次配列内で選択する。これら選択したアミノ酸のフランキング配列を選択し、これらフランキング配列を含むペプチドを生産する。システイン残基を、足場と反応することができる基として使用する。
以下のペプチドを合成した。
合成およびスクリーニングされたペプチド
１ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫＱＩＡを覆う直鎖２１-マーに重なる全１８
２ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆う直鎖１８-マーに重なる全９
３ Ｎｔ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆う直鎖１９-マーに重なる全８
４ Ｎｔ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆う直鎖２０-マーに重なる全７
５ Ｎｔ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆う直鎖２１-マーに重なる全６
６ ｅ１ ＰＦＷＡＨＹＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭＣＱＬＬＴＧＬを覆う直鎖１８-マーに重なる全７
７ ｅ１ ＰＦＷＡＨＹＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭＣＱＬＬＴＧＬを覆う直鎖１ ９-マーに重なる全６
８ ｅ１ ＰＦＷＡＨＹＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭＣＱＬＬＴＧＬを覆う直鎖２０-マーに重なる全５
９ ｅ１ ＰＦＷＡＨＹＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭＣＱＬＬＴＧＬを覆う直鎖２１-マーに重なる全４
１０ ｅ２ ＩＦＴＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴＣＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱを覆う直鎖１８-マーに重なる全１３
１１ ｅ２ ＩＦＴＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴＣＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱを覆う直鎖１９-マーに重なる全１２
１２ ｅ２ ＩＦＴＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴＣＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱを覆う直鎖２０-マーに重なる全１１
１３ ｅ２ ＩＦＴＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴＣＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱを覆う直鎖２１-マーに重なる全１０
１４ ｅ３ ＮＴＦＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮＲＬＤＱＡＭを覆う直鎖１８-マーに重なる全５
１５ ｅ３ ＮＴＦＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮＲＬＤＱＡＭを覆う直鎖１９-マーに重なる全４
１６ ｅ３ ＮＴＦＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮＲＬＤＱＡＭを覆う直鎖２０-マーに重なる全３
１７ ｅ３ ＮＴＦＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮＲＬＤＱＡＭを覆う直鎖２１-マーに重なる全２
１８ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ６-マーに重なる全２３
１９ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ７-マーに重なる全２３
２０ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ８-マーに重なる全２１
２１ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ９-マーに重なる全２０
２２ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ１０-マーに重なる全１９
２３ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ１１-マーに重なる全１８
２４ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ１２-マーに重なる全１７
２５ ＭＤＹＱＶＳ ＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ１３-マーに重なる全１６
２６ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ１４-マーに重なる全１５
２７ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ１５-マーに重なる全１４
２８ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ１６-マーに重なる全１３
２９ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ１７-マーに重なる全１２
３０ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ１８-マーに重なる全１１
３１ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ１９-マーに重なる全１０
３２ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ２０-マーに重なる全９
３３ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＴＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ２１-マーに重なる全８
３４ ｅ１ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭを覆うＴ２ループ６-マーに重なる全８
３５ ｅ１ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭを覆うＴ２ループ７-マーに重なる全７
３６ ｅ１ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭを覆うＴ２ループ８-マーに重なる全６
３７ ｅ１ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭを覆うＴ２ループ９-マーに重なる全５
３８ ｅ１ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭを覆うＴ２ループ１０-マーに重なる全４
３９ ｅ１ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭを覆うＴ２ループ１１-マーに重なる全３
４０ ｅ１ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭを覆うＴ２ループ１２-マーに重なる全２
４１ ｅ１ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭを覆うＴ２ループ１３-マーに重なる全１
４２ ｅ２ａ ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴを覆うＴ２ループ６-マーに重なる全７
４３ ｅ２ａ ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴを覆うＴ２ループ７-マーに重なる全６
４４ ｅ２ａ ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴを覆うＴ２ループ８-マーに重なる全５
４５ ｅ２ａ ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴを覆うＴ２ループ９-マーに重なる全４
４６ ｅ２ａ ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴを覆うＴ２ループ１０-マーに重なる全３
４７ ｅ２ａ ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴを覆うＴ２ループ１１-マーに重なる全２
４８ ｅ２ａ ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴを覆うＴ２ループ１２-マーに重なる全１
４９ ｅ２ｂ ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫを覆うＴ２ループ６-マーに重なる全１０
５０ ｅ２ｂ ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫを覆うＴ２ループ７-マーに重なる全９
５１ ｅ２ｂ ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫを覆うＴ２ループ８-マーに重なる全８
５２ ｅ２ｂ ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫを覆うＴ２ループ９-マーに重なる全７
５３ ｅ２ｂ ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫを覆うＴ２ループ１０-マーに重なる全６
５４ ｅ２ｂ ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫを覆うＴ２ループ１１-マーに重なる全５
５５ ｅ２ｂ ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫを覆うＴ２ループ１２-マーに重なる全４
５６ ｅ２ｂ ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫを覆うＴ２ループ１３-マーに重なる全３
５７ ｅ２ｂ ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫを覆うＴ２ループ１４-マーに重なる全２
５８ ｅ２ｂ ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫを覆うＴ２ループ１５-マーに重なる全１
５９ ｅ３ ＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ６-マーに重なる全１３
６０ ｅ３ ＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ７-マーに重なる全１２
６１ ｅ３ ＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ８-マーに重なる全１１
６２ ｅ３ ＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ９-マーに重なる全１０
６３ ｅ３ ＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ１０-マーに重なる全９
６４ ｅ３ ＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ１１-マーに重なる全８
６５ ｅ３ ＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ１２-マーに重なる全７
６６ ｅ３ ＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ１３-マーに重なる全６
６７ ｅ３ ＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ１４-マーに重なる全５
６８ ｅ３ ＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ１５-マーに重なる全４
６９ ｅ３ ＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ１６-マーに重なる全３
７０ ｅ３ ＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ１７-マーに重なる全２
７１ ｅ３ ＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ１８-マーに重なる全１
７２ Ｎｔ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＡＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ１８-マーに重なる全１１
７３ Ｎｔ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＡＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ１９-マーに重なる全１０
７４ Ｎｔ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＡＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ２０-マーに重なる全９
７５ Ｎｔ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＡＱＫＩＮＶＫを覆うＴ２ループ２１-マーに重なる全８
７６ Ｎｔ＋ｅ３ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＡ-Ｇ-ＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ１８-マーに重なる全１３
７７ Ｎｔ＋ｅ３ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＡ-Ｇ-ＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ１９-マーに重なる全１２
７８ Ｎｔ＋ｅ３ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＡ-Ｇ-ＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ２０-マーに重なる全１１
７９ Ｎｔ＋ｅ３ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＡ-Ｇ-ＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ２１-マーに重なる全１０
８０ Ｎｔ＋ｅ１ ＱＫＩＮＶＫ-ＧＧ-ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭを覆うＴ２ループ１８-マーに重なる全４
８１ Ｎｔ＋ｅ１ ＱＫＩＮＶＫ-ＧＧ-ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭを覆うＴ２ループ１９-マーに重なる全３
８２ Ｎｔ＋ｅ１ ＱＫＩＮＶＫ-ＧＧ-ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭを覆うＴ２ループ２０-マーに重なる全２
８３ Ｎｔ＋ｅ１ ＱＫＩＮＶＫ-ＧＧ-ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭを覆うＴ２ループ２１-マーに重なる全１
８４ Ｎｔ＋ＥＣＬ３Ａ ＱＫＩＮＶＫ-ＧＧ-ＱＥＦＦＧＬＮＮＣを覆うＴ２ループ１８-マーに重なる全２
８５ Ｎｔ＋ＥＣＬ３Ａ ＱＫＩＮＶＫ-ＧＧ-ＱＥＦＦＧＬＮＮＣを覆うＴ２ループ１９-マーに重なる全１
８６ ｅ１＋ｅ２ａ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭ-ＧＧＧ-ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴＣを覆うＴ２ループ１８-マーに重なる全１０
８７ ｅ１＋ｅ２ａ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭ-ＧＧＧ-ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴＣを覆うＴ２ループ１９-マーに重なる全９
８８ ｅ１＋ｅ２ａ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭ-ＧＧＧ-ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴＣを覆うＴ２ループ２０-マーに重なる全８
８９ ｅ１＋ｅ２ａ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭ-ＧＧＧ-ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴＣを覆うＴ２ループ２１-マーに重なる全７
９０ ｅ１＋ｅ２ｂ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭ-ＧＧＧ-ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫを覆うＴ２ループ１８-マーに重なる全１２
９１ ｅ１＋ｅ２ｂ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭ-ＧＧＧ-ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫを覆うＴ２ループ１９-マーに重なる全１１
９２ ｅ１＋ｅ２ｂ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭ-ＧＧＧ-ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫを覆うＴ２ループ２０-マーに重なる全１０
９３ ｅ１＋ｅ２ｂ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭ-ＧＧＧ-ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫを覆うＴ２ループ２１-マーに重なる全９
９４ ｅ１＋ｅ３ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭ-ＧＧＧＧ-ＱＥＦＦＧＬＮＮＣを覆うＴ２ループ１８-マーに重なる全９
９５ ｅ１＋ｅ３ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭ-ＧＧＧＧ-ＱＥＦＦＧＬＮＮＣを覆うＴ２ループ１９-マーに重なる全８
９６ ｅ１＋ｅ３ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭ-ＧＧＧＧ-ＱＥＦＦＧＬＮＮＣを覆うＴ２ループ２０-マーに重なる全７
９７ ｅ１＋ｅ３ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭ-ＧＧＧＧ-ＱＥＦＦＧＬＮＮＣを覆うＴ２ループ２１-マーに重なる全６
９８ ｅ２ａ＋ｅ２ｂ ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴ-Ａ-ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫを覆うＴ２ループ１８-マーに重なる全９
９９ ｅ２ａ＋ｅ２ｂ ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴ-Ａ-ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫを覆うＴ２ループ１９-マーに重なる全８
１００ ｅ２ａ＋ｅ２ｂ ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴ-Ａ-ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫを覆うＴ２ループ２０-マーに重なる全７
１０１ ｅ２ａ＋ｅ２ｂ ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴ-Ａ-ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫを覆うＴ２ループ２１-マーに重なる全６
１０２ ｅ２ｂ＋ｅ１ ＣＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫ-ＧＧＧ-ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭＣを覆うＴ２ループ１８-マーに重なる全１４
１０３ ｅ２ｂ＋ｅ１ ＣＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫ-ＧＧＧ-ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭＣを覆うＴ２ループ１９-マーに重なる全１３
１０４ ｅ２ｂ＋ｅ１ ＣＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫ-ＧＧＧ-ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭＣを覆うＴ２ループ２０-マーに重なる全１２
１０５ ｅ２ｂ＋ｅ１ ＣＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫ-ＧＧＧ-ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭＣを覆うＴ２ループ２１-マーに重なる全１１
１０６ ｅ２ｂ＋ｅ３ ＣＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫ-ＧＧ-ＱＥＦＦＧＬＮＮＡＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ１８-マーに重なる全１７
１０７ ｅ２ｂ＋ｅ３ ＣＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫ-ＧＧ-ＱＥＦＦＧＬＮＮＡＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ１９-マーに重なる全１６
１０８ ｅ２ｂ＋ｅ３ ＣＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫ-ＧＧ-ＱＥＦＦＧＬＮＮＡＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ２０-マーに重なる全１５
１０９ ｅ２ｂ＋ｅ３ ＣＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫ-ＧＧ-ＱＥＦＦＧＬＮＮＡＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ２１-マーに重なる全１４
１１０ ｅ３＋ｅ１ ＱＥＦＦＧＬＮＮＡＳＳＳＮＲＬＤ-ＧＧＧ-ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭを覆うＴ２ループ１８-マーに重なる全１５
１１１ ｅ３＋ｅ１ ＱＥＦＦＧＬＮＮＡＳＳＳＮＲＬＤ-ＧＧＧ-ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭを覆うＴ２ループ１９-マーに重なる全１４
１１２ ｅ３＋ｅ１ ＱＥＦＦＧＬＮＮＡＳＳＳＮＲＬＤ-ＧＧＧ-ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭを覆うＴ２ループ２０-マーに重なる全１３
１１３ ｅ３＋ｅ１ ＱＥＦＦＧＬＮＮＡＳＳＳＮＲＬＤ-ＧＧＧ-ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭを覆うＴ２ループ２１-マーに重なる全１２
１１４ Ｎｔ＋ｅ３ｂ ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＣ-Ｇ-ＣＳＳＳＮＲＬＤを覆うＴ２ループ２１-マーに重なる全９
１１５ Ｎｔ＋ｅ３ｂ ＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣ-Ｇ-ＣＳＳＳＮＲＬＤＱＡＭＱを覆うＴ２ループ２１-マーに重なる全３６
１１６ Ｎｔ＋ｅ１ ＱＫＩＮＶＫ-ＧＧ-ＣＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭＣを覆うＴ２ループ１９〜２１-マー
１１７ ｅ１ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭ（左）およびｅ２ａ ＳＱＫＥＧＬＨＹＴ（右）Ｃ------１-Ｇ-１------Ｃを覆うＰ２Ｐ２ループ１８〜２１-マー
１１８ ｅ１ ＡＱＷＤＦＧＮ（左）およびｅ２ａ ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮ（右）Ｃ------１-Ｇ-１------Ｃを覆うＰ２Ｐ２ループ２１-マー
１１９ ｅ１ ＨＹＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭ（左）およびｅ２ａ ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮ（右）Ｃ------１-Ｇ-１------Ｃを覆うＰ２Ｐ２ループ２１-マー
１２０ Ｎｔ ＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫ（左）およびｅ３ ＱＥＦＦＧＬＮＮＣＳＳＳＮ（右）Ｃ------１-Ｇ-１------Ｃを覆うＰ２Ｐ２ループ２１-マー
１２１ ｅ１ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭ（左）およびｅ２ａ ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴ（右）を覆うＴ３ループ１６〜２０-マーペプチド
１２２ ｅ１ ＡＱＷＤＦＧＮＴＭ（左）およびｅ２ｂ ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦ（右）を覆うＴ３ループ２０-マーペプチド
１２３ ｅ２ｂ ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦ（左）およびｅ１ ＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭ（右）を覆うＴ３ループ２０-マーペプチド
１２４ ｅ２ｂ ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦ（左）およびｅ３ ＱＥＦＦＧＬＮＮＡＳＳＳＮＲＬＤＱ（右）を覆うＴ３ループ２０-マーペプチド
１２５ ｅ１ ＹＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭ（左）およびｅ３ ＱＥＦＦＧＬＮＮＡＳＳＳＮＲＬＤＱ（右）、ＧＣＧ（真中）を覆うＴ３ループ２０-マーペプチド
１２６ ｅ３ ＱＥＦＦＧＬＮＮＡＳＳＳＮＲＬＤＱ（左）およびｅ１ ＹＡＡＡＱＷＤＦＧＮＴＭ（右）、ＧＣＧ（真中）を覆うＴ３ループ２０-マーペプチド
１２７ ｅ２ ＳＬＰＧＩＩＦＴＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴＣＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱＴＬを覆うＴ３ループ２１-マーペプチド
１２８ Ｎｔ ＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫＱＩＡＡＲＬＬＰＰＬＹＳを覆うＴ３ループ２１-マーペプチド
ペプチドの第１シリーズ（前述の表の第１行）において、Ｎｔ配列のＣ-末端アミノ酸Ｋ、Ｉ、Ｎ、Ｖ、Ｋ、Ｑ、Ｉ、およびＡを選択した。次に、２１アミノ酸残基の長さを有するＮ-末端フランキング配列を選択した。ゆえに、ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱがＫのフランキング配列であったり、ＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫがＩのフランキング配列であったり、ＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩがＮのフランキング配列であったりする。その後、これらフランキング配列の１つを含むペプチドを生産した。
同様に、ペプチドの第２シリーズ（前述の表の第２行）において、Ｎｔ配列のＣ-末端アミノ酸Ｐ、Ｃ、Ｑ、Ｋ、Ｉ、Ｎ、ＶおよびＫを選択した。次に、１８アミノ酸残基の長さを有するＮ-末端フランキング配列を選択した。ゆえに、ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥがＰのフランキング配列であったり、ＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰがＣのフランキング配列であったり、ＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣがＱのフランキング配列であったりする。その後、これらフランキング配列の１つを含むペプチドを生産した。
第１〜１７シリーズ（前述の表の第１〜１７行）のペプチドは足場に結合せず、足場-結合ペプチドと比較してあまり適していないように思われた。
ペプチドの第１８シリーズにおいて、最初から６番目までのＮ-末端アミノ酸を除く全アミノ酸を選択し、６アミノ酸長を有するＮ-末端フランキング配列を選択した。その後、これらフランキング配列の１つおよび２つのシステイン残基を含むペプチドを生産した。ペプチドを、２つのシステイン残基を介してＰ２足場にカップリングさせた。注目すべきは、フランキング配列が、カップリングを意図されないシステイン残基を含む場合、そのシステインをアラニンで置換したことである。シリーズ１９〜７５のペプチドを同様に生産した。
シリーズ７６〜１１６において、ＣＣＲ５の２つの異なるドメインに由来するフランキング配列を組合せた。たとえば、シリーズ７６〜７９において、Ｎｔに由来するフランキング配列を、ｅ３に由来するフランキング配列に組合せた。同様に、シリーズ８０〜８３において、Ｎｔに由来するフランキング配列を、ｅ１に由来するフランキング配列に組合せたりなどした。結果として生じるペプチドは、２つのシステイン残基を介してＰ２にカップリングされた。
シリーズ１１７〜１２０において、２つのＰ２足場を使用した。２つのフランキング配列を含むペプチドを生産し、ｅ１に由来するフランキング配列をＥ２Ａに由来するフランキング配列に組合せ（前述の表の第１１７〜１１９行）、Ｎｔに由来するフランキング配列をｅ３に由来するフランキング配列に組合せた（前述の表の第１２０行）。システイン残基が各フランキング配列の最初と最後とに存在した（ゆえに、総計で４つのシステインが存在した）。フランキング配列がカップリングを意図されないシステイン残基を含む場合、そのシステインをアラニンで置換した。その後、前述の４つのシステイン残基を用いて、ペプチドを２つのＰ２足場にカップリングさせた（システイン残基をＣおよび１として表に表す）。Ｃとして表した２つのシステインを双方とも１つのＴ２足場にカップリングさせ、１として表した２つのシステイン残基を双方とも別の足場にカップリングさせた。
シリーズ１２１〜１２８において、Ｔ３足場を使用した。異なるＣＣＲ５ドメインに由来する２つのフランキング配列を含むペプチドを生産した。Ｔ３足場にカップリングさせるために３つのシステイン残基をペプチドに組み込んだ。
スクリーニング検定
生産したペプチドを市販の抗-ＣＣＲ５抗体２Ｄ７とともにインキュベートした。
結果
高い親和性で抗体２Ｄ７を結合させることのできる有望な化合物を以下に表わす。
Figure 0005372380
上記表の化合物は、すべてＰ２またはＴ３に結合するペプチドを含む。すべての化合物は抗体２Ｄ７を結合させることができる。
結論：この例によって、本発明者らは、直鎖ペプチドが２Ｄ７を結合させることができない一方で、本発明に従う方法は、２Ｄ７を結合させることができるＣＣＲ５の模倣体を同定するのに適していることを示している。このようなペプチドは、さらに、ＨＩＶ感染を無力化することができるＣＣＲ５-特異的抗体を誘導するために、免疫付与実験において使用される。
実施例２：インターロイキン５に基づく免疫原性化合物の設計および調製
適当な試験化合物を設計するために、５シリーズの化合物を生成した。その後、化合物を、ＩＬ５を特異的に結合させることのできる市販の抗体（抗体３９Ｄ１０）とともにインキュベートした。
シリーズ１
全ＩＬ５配列の重複１８-マー配列を生成した。これらのペプチドは足場にカップリングしなかった。これらのペプチドは、容認可能な親和性で、３９Ｄ１０を結合させることができなかった。
シリーズ２
全ＩＬ５配列の重複１３-マー配列を生成した。１つの１３-マー配列ならびにＮ-末端およびＣ-末端システイン残基を含むペプチドを生産した。１３-マー配列がカップリングを意図されないシステイン残基を含む場合、そのシステインをアラニンで置換した。その後、Ｎ-末端およびＣ-末端システイン残基を介して、ペプチドをＰ２足場にカップリングさせた。その後、結果として生じる化合物を、抗体３９Ｄ１０とともにインキュベートした。いくつかの化合物は結合することができたが、見込みのある化合物は見出されなかった。
シリーズ３〜５において、以下の２つのインターロイキン５配列を考慮した。
パート１、ＫＫＫＳＧＥＥＲＲＲＶＮＱＦＬＤＹ
パート２、ＬＩＡＮＥＴＬＲＩＰＶＰＶＨＫＮＨ
注目すべきは、パート１の４番目のアミノ酸残基であるセリンは、天然のヒトＩＬ５においてはシステイン残基であることである。足場がこのシステインとカップリングするのを避けるために、このシステインをセリンで置換した。
シリーズ３
このシリーズにおいて、パート１およびパート２の初めの３つのアミノ酸配列および最後の３つのアミノ酸残基を選択した。その後、１４〜１６アミノ酸残基の長さを有するＣ-末端およびＮ-末端フランキング配列を選択した。１つのフランキング配列ならびにＮ-末端およびＣ-末端システイン残基を含むペプチドを生産した。その後、Ｎ-末端およびＣ-末端システイン残基を介して、ペプチドをＰ２足場にカップリングさせた。結果として生じる化合物を，その後、抗体３９Ｄ１０とともにインキュベートした。パート１のフランキング配列を含むいくつかの化合物は、抗体３９Ｄ１０を結合することができた。
シリーズ４
このシリーズにおいて、パート１に由来するフランキング配列をパート２に由来するフランキング配列と組合せた。以下の概略配列に従って２１-マーを生産した。
ＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣ
ＣＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ
ＣＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ
ＣＸＸＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ
ＣＸＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ
ＣＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ
ＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＣ
ＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＣ
ＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＸＸＣ
ＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＸＣ
ＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＣ
ここで、Ｘ残基の第１の配列はパート１に由来するフランキング配列を表し、Ｘ残基の第２の配列はパート２に由来するフランキング配列を表す。ゆえに、フランキング配列長は異なるが、結果として生じるペプチドの全長は同じである（２１アミノ酸残基）。ペプチドをＴ３足場にカップリングさせた。結果として生じる化合物を、その後、抗体３９Ｄ１０とともにインキュベートした。抗体３９Ｄ１０に対して高い結合親和性を有する種々の化合物が見出された。これら化合物を以下に詳細に述べる。
シリーズ５
このシリーズにおいても、パート１に由来するフランキング配列をパート２に由来するフランキング配列と組合せた。このシリーズにおいて、結果として生じるペプチドは異なる長さである（パート１に由来するフランキング配列およびパート２に由来するフランキング配列を含む）。ペプチドを３つのシステイン残基を介してＴ３にカップリングさせ、その後、抗体３９Ｄ１０とともにインキュベートした。結果を以下に詳細に述べる。
結果
Ｔ３にカップリングさせた以下の４つのペプチドは、抗体３９Ｄ１０に対して高い親和性を有すると思われる。
１. Ａｃ-ＣＥＥＲＲＲＶＣＡＮＥＴＬＲＩＰＶＰＣＧＳＣ （Ｔ３） １：１５００
２. Ａｃ-ＣＳＧＥＥＲＲＲＶＣＡＮＥＴＬＲＩＰＣＧＳＣ （Ｔ３） １：１５００
３. Ａｃ-ＣＥＥＲＲＲＶＮＱＣＡＮＥＴＬＲＩＰＣＧＳＣ （Ｔ３） １：２０００
４. Ａｃ-ＣＧＥＥＲＲＲＣＩＡＮＥＴＬＲＩＰＣＧＳＣ （Ｔ３） １：４０００
４つのペプチドすべてが、パート１の部分配列およびパート２の部分配列を含む。
これら４つのペプチドを、全ヒトＩＬ５に対する抗体を誘導することができるかを試験するために、免疫付与実験に使用した。すべてヒトＩＬ５に由来するこれらのペプチドは、（ＯＤ最大値の５０％であるＯＤ値に従って計算した）抗体力価が１：１５００、１：２０００および１：４０００である全ヒトＩＬ５と、強い交差反応を示す抗体を誘導することができるように思われた。
結論
異なる領域由来のフランキング配列の組合せを含むペプチドは、天然ＩＬ５エピトープに最もよく類似するように思われる。これらペプチドは、本発明に従うスクリーニング方法によって見出された。
実施例３：ＦＳＨのペプチド模倣体の設計および調製、ならびにペプチドワクチンとしての使用
この実験において、ＦＳＨのＢ３-ループに対応するポリペプチドを設計し、２つのアミノ酸残基を、足場を介して互いに付着するポリペプチド中の第１および第２のシステイン残基で置換した。第１の足場付着システイン残基を、野生型Ｂ３-ループ内のアミノ酸ＣｙｓIVに対応する位置からｐ残基Ｃ-末端方向に位置する位置ＣｙｓIV＋ｐに導入した。ｐは５ｐ１２である。第２の足場付着システイン残基を、野生型Ｂ３-ループ内のアミノ酸ＣｙｓＶに対応する位置からｑ残基Ｎ-末端方向に位置する位置ＣｙｓＶ−ｑに導入した。ｑは４≦ｑ≦１２であって、（ｐ−ｑ）は−３，−２，−１，０，１，２または３である。ポリペプチド長はＣｙｓIV＋ｘの位置のアミノ酸からＣｙｓＶ＋ｙの位置のアミノ酸までである。ｘは−５≦ｘ≦１、ｙは１≦ｙ≦６であって、ｘ＋ｙ＝−１，０，１または２の条件である。
ペプチドを、Syro-シンセサイザ（MultiSynTech社、ドイツ）上で、４-(２’４’-ジメトキシフェニル- Ｆｍｏｃ-アミノメチル)-フェノキシ(リンクアミド（RinkAmide）)樹脂（BACHEM社、ドイツ）を使用して、固相ペプチド合成によって合成した。全アミノ酸を、側鎖官能基がＮ-ｔ-Ｂｏｃ（ＫＷ）、О-ｔ-Ｂｕ（ＤＥＳＴＹ）、Ｎ-Ｔｒｔ（ＨＮＱ）、Ｓ-Ｔｒｔ（Ｃ）、またはＮ-Ｐｂｆ（Ｒ）基のように保護され、Ｎ-アルファ-（Ｆｍｏｃ）のように保護された形態で購入し、使用した。ＮＭＰ中の６．５倍過剰のＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／アミノ酸／ＤＩＰＥＡ（１：１：１：２）を使用し、二重カップリングを使用する３０分の活性化時間のカップリングプロトコールを用いた。アセチル化ペプチドを、１３．３重量％ フェノール、５体積％ チオアニソール、２．５体積％ １,２-エタンジオール、および５体積％ ミリＱ-Ｈ２Ｏを含むＴＦＡ（１５ｍｌ／ｇ樹脂）で、２〜４時間室温にて反応させることで樹脂から開裂させ、その後（少なくともＴＦＡ体積の３倍の）ジエチルエーテルで沈殿させた。粗ペプチドを、「DeltaPack」（２５または４０×１００ｍｍの内径、１５マイクロメートルの粒径、１００Ａの細孔径；Waters社、米国）または「XTERRA」（５０×４．６ｍｍの内径、２．５マイクロメートルの粒径；Waters社、米国）ＲＰ-１８分取Ｃ１８カラムで、毎分１〜２％ Ｂの直線的ＡＢ-勾配で、逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰＣ）によって精製した。溶媒Ａは水中の０．０５％ ＴＦＡであり、溶媒Ｂは０．０５％ ＡＣＮであった。ペプチドの正確な一次イオン分子量を、Micromass ZQ （Micromass社、オランダ）またはVG Quattro II（VG Organic社、英国）の質量分析計で、エレクトロンスプレイイオン化質量分析によって確認した。ポリペプチドを、Ｔ２（２０％ アセトニトリル（ＡＣＮ）／８０％ 重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ）、ｐＨ７．８中、室温での、ペプチドと１．０５等量のＴ２との１時間の反応）またはＴ４足場（６０％ ＡＣＮ／４０％ 重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ）、ｐＨ７．８中、室温での、ペプチドと０．５等量のＴ４との１時間の反応）上に環化するか、システインのＳＳ-酸化を介して直接環化した。足場はSigma- Aldrich社から得た。さらに、システインを欠いている直鎖バージョンのポリペプチドを調製した（表４参照）。その後、メスのウィスター系ラットに、０日目に、ＰＢＳ／ＣＦＡ １：１（ｖ／ｖ）（ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水、ＣＦＡ＝完全フロイントアジュバント）中の約２．５ｍｇ／ｍｌのペプチドまたはペプチド-Ｔ-構成４００μｌで免疫性を与え、４週後に追加免疫（等量および等濃度）を行った。その後、免疫応答を確認するために抗-ペプチド力価を６週後に測定し、最終的にラットを８週後に出血させて抗血清を収集した。二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ-抗-ラット血清と組合せて、２,２’-アジン-ジ(エチルベンゾチアゾリンスルホン酸塩)（ＡＢＴＳ）を使用する、ＦＳＨ-結合ＥＬＩＳＡ（Greiner社、パレスチナ；１μｇ／ｍｌ ＦＳＨ（Biotrend社）によるＧＤＡ-コーティング）にて、抗血清を分析した。抗体ｐＡｂ ５２１５（Biogenesis社）およびｍＡｂ ６６０２（Medix Biochemicals社）を、ポジティブコントロールとして分析に含めた。
Figure 0005372380
図２に示す結果は、Ｂ３-由来ポリペプチドを足場に付着させることの妥当性を実証している。ＳＳ-酸化を介して環化された対応するペプチドおよび直鎖ポリペプチドは、それらだけでは免疫原性がないからである。
以下、表４Ｂおよび４Ｃに同じ結果を詳細に表す。ＣＬＩＰＳ位置ｐおよびｑなどの種々の値を示す。
Figure 0005372380
Figure 0005372380
この結果は、ＦＳＨのベータ３ループに由来する免疫原性化合物を生成できることを、明らかに実証している（表４Ｂの化合物４および９ならびに表４Ｃの化合物１を参照）。免疫原性化合物はＦＳＨ-特異的抗体の生産を引き起こす。
実施例４：ＦＳＨのペプチド模倣体の設計および調製、ならびにペプチドワクチンとしての使用
この実験において、長さおよびＣＬＩＰＳ-付着に関するシステイン残基のキラル配置の点で異なる、ＦＳＨのβ３-ループに対応するポリペプチドのセットを前述のように設計し、合成した。ポリペプチドをｍ-Ｔ２上に環化した（２０％ アセトニトリル／８０％ 重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ）、ｐＨ７．８中、室温でのペプチドと１．０５等量のｍ-Ｔ２との１時間の反応）。その後、メスのウィスター系ラットに、０日目に、ＰＢＳ／ＣＦＡ １：１（ｖ／ｖ）（ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水、ＣＦＡ＝完全フロイントアジュバント）中の約２．５ｍｇ／ｍｌのペプチドまたはペプチド-Ｔ-構成４００μｌで免疫性を与え、４週後に追加免疫（等量および等濃度）を行った。その後、免疫応答を確認するために抗-ペプチド力価を６週後に測定し、最終的にラットを１０週後に出血させて抗血清を収集した。二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ-抗-ラット血清と組合せて、２,２’-アジン-ジ(エチルベンゾチアゾリンスルホン酸塩)（ＡＢＴＳ）を使用する、ＦＳＨ-結合ＥＬＩＳＡ（Greiner社、パレスチナ；１μｇ／ｍｌ ＦＳＨ（Biotrend社）によるＧＤＡ-コーティング）にて、抗血清を分析した。抗体ｐＡｂ ５２１５（Biogenesis社）およびｍＡｂ ６６０２（Medix Biochemicals社）を、ポジティブコントロールとして分析に含めた。
Figure 0005372380
表７から、足場Ｔ２に結合するペプチドＴＦＫＥＬＶＹＥＴＣＲＶＰＧＤＡＨＨＡＤＳＬＣＴＹＰＶＡＴＱＡＨを含む化合物が好ましいと結論される。さらに、足場Ｔ３に結合するペプチドＴＦＫＥＬＶＹＥＴＣＲＶＰＧＡＡＨＨＡＤＳＬＣＴＹＰＶＡＴＱＡＨを含む化合物が好ましい。
実施例５：構造的に最適化されたＦＳＨのペプチド模倣体の設計および調製、ならびにペプチドワクチンとしての使用
本実験において、ＦＳＨのβ３-ループに対応するポリペプチドのセットを、ｍ抗体５８２８および６６０２でスクリーニングされた置換分析研究由来の抗体結合データを用いて、構造的に最適化した。ポリペプチドをｍ-Ｔ２上に環化した（２０％ アセトニトリル／８０％ 重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ）、ｐＨ７．８中、室温での、ペプチドと１．０５等量のｍ-Ｔ２との１時間の反応）。その後、メスのウィスター系ラットに、０日目に、ＰＢＳ／ＣＦＡ １：１（ｖ／ｖ）（ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水、ＣＦＡ＝完全フロイントアジュバント）中の約２．５ｍｇ／ｍｌのＣＬＩＰＳ-ペプチド構成４００μｌで免疫性を与え、４週後に追加免疫（等量および等濃度）を行った。その後、免疫応答を確認するために抗-ペプチド力価を６週後に測定し、最終的にラットを１０週後に出血させて抗血清を収集した。二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ-抗-ラット血清と組合せて、２,２’-アジン-ジ(エチルベンゾチアゾリンスルホン酸塩)（ＡＢＴＳ）を使用する、ＦＳＨ-結合ＥＬＩＳＡ（Greiner社、パレスチナ；１μｇ／ｍｌ ＦＳＨ（Biotrend社）によるＧＤＡ-コーティング）にて、抗血清を分析した。抗体ｐＡｂ ５２１５（Biogenesis社）およびｍＡｂ ６６０２（Medix Biochemicals社）を、ポジティブコントロールとして分析に含めた。
Figure 0005372380
表８から、足場Ｔ２に結合するペプチドＴＦＫＥＬＶＹＥＴＣＲＶＰＧＤＡＨＨＡＤＫＬＣＴＹＰＶＡＴＱＡＨを含む化合物が好ましいと結論される。さらに、足場Ｔ２に結合するペプチドＴＦＫＥＬＶＹＥＴＣＲＶＰＧＤＡＨＫＡＤＳＬＣＴＹＰＶＡＴＱＡＨを含む化合物が好ましい。
実施例６：ｈ-ＣＧのペプチド模倣体の設計および調製、ならびにペプチドワクチンとしての使用
本実験においては、ｈＣＧのβ３-ループに対応するポリペプチドを前述のように設計し、合成した。ポリペプチドをＴ２上（２０％ ＡＣＮ／８０％ 重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ）、ｐＨ７．８中、室温での、ペプチドと１．０５等量のＴ２との１時間の反応）、またはＴ４足場上（６０％ ＡＣＮ／４０％ 重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ）、ｐＨ７．８中、室温での、ペプチドと０．５等量のＴ４との１時間の反応）に環化するか、システインのＳＳ-酸化を介して直接環化した。さらに、システインを欠いている直鎖バージョンのポリペプチドを調製した（表５参照）。ラットに、実施例１においてＦＳＨ-ペプチドの模倣体に関して述べた種々のペプチドまたはペプチド構成で、免疫性を与えた。ＥＬＩＳＡ表面上のｈＣＧ（Biotrend社から購入）のコーティングを確認するために、ｈＣＧに対する市販の抗体ＣＧ-Ｂ２（Imgen社から購入）を、ポジティブコントロールとして分析に含めた。
Figure 0005372380
図３に示す結果は、Ｂ３-由来ポリペプチドを足場に付着させることの妥当性を実証している。ＳＳ-酸化を介して環化された対応するペプチドおよび直鎖ポリペプチドは、それらだけでは免疫原性がないからである。
以下、表９Ｂに同じ結果を詳細に表す。ＣＬＩＰＳ位置ｐおよびｑなどの種々の値を示す。
Figure 0005372380
実施例７：ｈＣＧのペプチド模倣体の設計および調製、ならびにペプチドワクチンとしての使用
この実験においては、長さおよびＣＬＩＰＳ-付着に関するシステイン残基の位置の点で異なるｈＣＧのβ３-ループに対応するポリペプチドのセットを、前述のように設計し、合成した。ポリペプチドをｍ-Ｔ２上に環化した（２０％ アセトニトリル／８０％ 重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ）、ｐＨ７．８中、室温での、ペプチドと１．０５等量のＴ２との１時間の反応）。その後、メスのウィスター系ラットに、０日目に、ＰＢＳ／ＣＦＡ １：１（ｖ／ｖ）（ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水、ＣＦＡ＝完全フロイントアジュバント）中の約２．５ｍｇ／ｍｌのペプチドまたはペプチド-Ｔ-構成４００μｌで免疫性を与え、４週後に追加免疫（等量および等濃度）を行った。その後、免疫応答を確認するために、抗-ペプチド力価を６週後に測定し、最終的にラットを１０週後に出血させて抗血清を収集した。二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ-抗-ラット血清と組合せて、２,２’-アジン-ジ(エチルベンゾチアゾリンスルホン酸塩)（ＡＢＴＳ）を使用する、ＦＳＨ-結合ＥＬＩＳＡ（Greiner社、パレスチナ；１μｇ／ｍｌ ｈＣＧ（Biotrend社）によるＧＤＡ-コーティング）にて、抗血清を分析した。抗体Ｂ２をポジティブコントロールとして、分析に含めた。
Figure 0005372380
表１０から、足場Ｔ２に結合するペプチド
＊ＮＹＥＤＶＲＦＥＳＣＲＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＣＳＹＡＶＡＬＳＡＱ＃＋ｍ-Ｔ２
Ｓ
Ｓ
＊ＮＹＲＤＶＲＦＥＳＣＲＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＣＳＹＡＶＡＬＳＡＱ＃＋ｍ-Ｔ２
を含む化合物が好ましいと結論される。
実施例８：ＶＥＧＦ-Ａのペプチド模倣体の設計および調製、ならびにペプチドワクチンとしての使用
この実験においては、長さおよびＣＬＩＰＳ-付着に関するシステイン残基の位置の点で異なる（ＦＳＨおよびｈＣＧのＢ３-ループに対応する）ＶＥＧＦ-Ａのβ５ターン-β６-ループに対応するポリペプチドのセットを、前述のように設計し、合成した。ポリペプチドをｍ-Ｔ２上に環化した（２０％ アセトニトリル／８０％ 重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ）、ｐＨ７．８中、室温での、ペプチドと１．０５等量のＴ２との１時間の反応）。その後、メスのウィスター系ラットに、０日目に、ＰＢＳ／ＣＦＡ １：１（ｖ／ｖ）（ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水、ＣＦＡ＝完全フロイントアジュバント）中の約２．５ｍｇ／ｍｌのペプチドまたはＣＬＩＰＳ-ペプチド-構成の４００μｌで免疫性を与え、４週後に追加免疫（等量および等濃度）を行った。その後、免疫応答を確認するために、抗-ペプチド力価を６週後に測定し、最終的にラットを９週後に出血させて抗血清を収集した。二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ-抗-ラット血清と組合せて、２,２’-アジン-ジ(エチルベンゾチアゾリンスルホン酸塩)（ＡＢＴＳ）を使用する、ＶＥＧＦ-結合ＥＬＩＳＡ（Greiner社、パレスチナ；０．１μｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ-ＡによるＧＤＡ-コーティング）にて、抗血清を分析した。ｍＡｂ ２９３をポジティブコントロールとして分析に含めた。
Figure 0005372380
結論：ＣＬＩＰＳ位置８，６（ｐ＝８およびｑ＝６）および１０，８（ｐ＝１０およびｑ＝８）が好ましい。
（表１２）
：Ｃｙｓ-ノットたんぱくサブファミリの要約
糖たんぱくホルモン-αファミリ
糖たんぱくホルモン(またはゴナドトロピン)-α１,２（ＧＬＨＡ-１,２）
糖たんぱくホルモン-βファミリ
胎盤性性腺刺激ホルモン-β（β-ＣＧ）
ゴナドトロピン-β１,２（ＧＴＨ-Ｉ,II）
卵胞刺激ホルモン(またはフォロトロピン（follotropin）)-β（ＦＳＨ-β）
黄体形成ホルモン-β(またはルトロピン)-β（β-ＬＨ）
甲状腺刺激ホルモン(またはチロトロピン)-β（ＴＳＨ）
コンタクチン関連たんぱく様２前駆体（ＣＴＡ-２）
糖たんぱくホルモンベータ-５前駆体（ＧＰＢ-５）

神経成長因子ファミリ
神経成長因子（ＮＧＦ）
神経栄養因子-３,４,５,７（ＮＴ-３,４,５,７；ＨＤＮＦ）
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）

ＰＤＧＦ-ファミリ
血小板由来増殖成長因子Ａ,Ｂ-１,２（ＰＤＧＦ-Ａ,Ｂ-１,２）
ＰＤＧＦ関連形質転換たんぱくシス（sis）（ＴＳＩＳ、＿ＳＭＳＡＶ、Ｐ２８ＳＩＳ）
胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）
血管内皮増殖因子Ａ,Ｂ,Ｃ,Ｄ,Ｈ（ＶＧＥＦ-Ａ,Ｂ,Ｃ,Ｄ,Ｈ）
血管内皮増殖因子毒素（ＴＸＶＥ、ＳＷＥＧＦ、ＩＣＰＰ）

形質転換成長因子スーパーファミリ
形質転換成長因子-ベータ１〜５（ＴＧＦβ１〜５）
アクチビン-β（インヒビン-β）
ＡＴＰ-依存性ＣＬＰ-たんぱく分解酵素ＡＴＰ-結合サブユニットＣＬＰＸ（ＣＬＰＸ）
骨形成たんぱく２〜８,１０,１５（ＢＭＰ２〜８,１０,１５）
６０Ａたんぱく前駆体（グラス ボトム ボート（Glass Bottom Boat）たんぱく、６０Ａ）
ＣＥＴ-１シノラブディス エレガンス（Caenorphabditis Elegans）
デカペンタプレジックたんぱく前駆体（ＤＥＣＡ）
ＤＶＲ１-たんぱく前駆体（ベジタル ヘミスフィア（Vegital Hemisphere）ＶＧ１たんぱく）
ドルサリン-１前駆体（ＤＳＬ１）
ＸＮＲ-１,２,４（アフリカツメガエル）
ＺＮＲ-１ゼブラダニオ（ゼブラフィッシュ）
ＶＧ１-セキショクヤケイ（ニワトリ）
胎盤骨形成たんぱく
節前駆体（ＮＯＤＡ）
ノリー病たんぱく（ＮＤＰ）
前立腺分化因子（ＰＤＦ）
（胚）成長分化因子１〜９（ＧＤＦ-１〜９）
グリア細胞系由来神経栄養因子前駆体（ＧＤＮＦ）
左右決定因子-ｂ前駆体（レフティ-ｂたんぱく、ＬＦＴＢ）
巨核球促進因子（ＭＳＦ）
ムチン-２前駆体（腸ムチン-２）
ミュラー管抑制因子（ＭＩＳ）
ニュールツリン前駆体（ＮＲＴＮ）
ペルセフィン（Persephin）前駆体（ＰＳＰＮ）
スクレロスティン（Sclerostin）（ＳＯＳＴ）
スクリュー（Screw）たんぱく前駆体（ＳＣＷ）
ユニビン（Univin）前駆体（ＵＮＩＶ）
Figure 0005372380
表１４は、Ｃｙｓ-ノットたんぱくファミリの種々の構成員における保存システインの位置を示し、角括弧内の数字は、たんぱくドメインまたは保存たんぱく領域の多重アラインメントの、Ｐｆａｍデータベースを示している。第１欄は、たんぱく内部で見つかったシステイン残基すべてを記載している。第２欄は、６つの保存システイン残基（ＣｙｓＩ〜ＣｙｓVI）の称号を表している。他の欄は、個々のサブファミリ構成員に対応するアミノ酸位置（Ｎ-末端から開始）を示している。
Figure 0005372380
Figure 0005372380
Figure 0005372380
Figure 0005372380
Figure 0005372380
Ｃｙｓ-ノット成長因子ファミリ構成員のＢ３-ループおよびそのペプチド模倣体の略図であり、Ｃｙｓ-ノットたんぱくファミリの種々の構成員の一般的なループ-構造を示している。 Ｃｙｓ-ノット成長因子ファミリ構成員のＢ３-ループおよびそのペプチド模倣体の略図であり、残基ＣｙｓIVおよびＣｙｓＶを含むＢ３-ループを示している。 Ｃｙｓ-ノット成長因子ファミリ構成員のＢ３-ループおよびそのペプチド模倣体の略図であり、本発明のペプチド模倣体の構造設計を示している。２つのシステインが、これらのシステインを介したポリペプチドの足場（Ｔとして示す）への共有結合が、天然たんぱくのＢ３-ループの二次構造に類似する立体配座をとるようにペプチドを誘導するために、ポリペプチド内に導入される。 ＦＳＨのペプチド模倣体を使用するワクチン接種実験の結果を示す図である。Ｘ-軸に示されるペプチド化合物で免疫付与されたラットの血清が、それらのペプチドが天然ＦＳＨに対する免疫応答を誘導することができるかを決定するために、ＥＬＩＳＡを使用して分析された。血清の４段階の希釈が試験された（１／１０，１／３０，１／１００および１／３００）。ＦＳＨに対するポリクローナル抗体５２１５（ｎｏ．１５）およびモノクローナル抗体６６０２（ｎｏ．１６）が、ポジティブコントロールとして使用された。詳細は実施例３に記載されている。 ｈＣＧのペプチド模倣体を使用するワクチン接種実験の結果を示す図である。Ｘ-軸に示されるペプチド化合物で免疫付与されたラットの血清が（使用された異なるペプチドおよび足場については、表５参照）、それらのペプチドが天然ｈＣＧに対する免疫応答を誘導することができるかを決定するために、ＥＬＩＳＡを使用して分析された。血清の種々の段階の希釈が試験された。抗体ｈＣＧ-Ｂ２（ｎｏ．７）が、ポジティブコントロールとして使用された。詳細は実施例６に記載されている。 オルト-、メタ-またはパラ-位の２つハロメチル基を有する芳香族足場を示す図である。Ｈａｌは塩素、臭素またはヨウ素原子を示す。
１,２-ビス(ハロメチル)ベンゼンおよび他の位置異性体
３,４-ビス(ハロメチル)ピリジン（Ｘ＝Ｎ）および他の位置異性体
３,４-ビス(ハロメチル)ピリダジン（Ｘ＝Ｎ）および他の位置異性体
４,５-ビス(ハロメチル)ピリミジン（Ｘ＝Ｎ）および他の位置異性体
４,５-ビス(ハロメチル)ピラジン（Ｘ＝Ｎ）および他の位置異性体
４,５-ビス(ハロメチル)-１,２,３-トリアジン（Ｘ＝Ｎ）および他の位置異性体
５,６-ビス(ハロメチル)-１,２,４-トリアジン（Ｘ＝Ｎ）および他の位置異性体
３,４-ビス(ハロメチル)ピロール（Ｘ＝Ｎ）、-フラン（Ｘ＝Ｏ）、-チオフェン（Ｘ＝Ｓ）および他の位置異性体
４,５-ビス(ハロメチル)イミダゾール（Ｘ＝Ｎ,Ｎ）、-オキサゾール（Ｘ＝Ｎ,Ｏ）、-チアゾール（Ｘ＝Ｓ）および他の位置異性体
４,５-ビス(ハロメチル)-３Ｈ-ピラゾール（Ｘ＝Ｎ,Ｎ）、-イソオキサゾール（Ｘ＝Ｎ,Ｏ）、-イソチアゾール（Ｘ＝Ｓ）および他の位置異性体
１,２-ビス(-ブロモメチルカルボニルアミノ)ベンゼン（Ｘ１＝ＮＨ、Ｘ２＝Ｏ）
２,２'-ビス(ハロメチル)ビフェニレン
２,２"-ビス(ハロメチル)テルフェニレン
１,８-ビス(ハロメチル)ナフタレン
１,１０-ビス(ハロメチル)アントラセン
ビス(２-ハロメチルフェニル)メタン
オルト-、メタ-またはパラ-位の３つのハロメチル基を有する芳香族足場を示す図である。 １,２,３-トリス(ハロメチル)ベンゼンおよび他の位置異性体 ２,３,４-トリス(ハロメチル)ピリジン（Ｘ＝Ｎ）および他の位置異性体 ２,３,４-トリス(ハロメチル)ピリダジン（Ｘ＝Ｎ）および他の位置異性体 ３,４,５-トリス(ハロメチル)ピリミジン（Ｘ＝Ｎ）および他の位置異性体 ４,５,６-トリス(ハロメチル)-l,２,３-トリアジン（Ｘ＝Ｎ）および他の位置異性体 ２,３,４-トリス(ハロメチル)ピロール（Ｘ＝Ｎ）、-フラン（Ｘ＝Ｏ）、-チオフェン（Ｘ＝Ｓ）および他の位置異性体 ２,４,５-ビス(ハロメチル)イミダゾール（Ｘ＝Ｎ,Ｎ）、-オキサゾール（Ｘ＝Ｎ,Ｏ）、-チアゾール（Ｘ＝Ｓ）および他の位置異性体 ３,４,５-ビス(ハロメチル)-１Ｈ-ピラゾール（Ｘ＝Ｎ,Ｎ）、-イソオキサゾール（Ｘ＝Ｎ,Ｏ）、-イソチアゾール（Ｘ＝Ｓ）および他の位置異性体 ２,４,２'-トリス(ハロメチル)ビフェニレン ２,３',２"-トリス(ハロメチル)テルフェニレン １,３,８-トリス(ハロメチル)ナフタレン １,３,１０-トリス(ハロメチル)アントラセン ビス(２-ハロメチルフェニル)メタン オルト-、メタ-またはパラ-位の４つのブロモメチル基を有する芳香族足場を示す図である。 １,２,４,５-テトラ(ハロメチル)ベンゼンおよび他の位置異性体 １,２,４,５-テトラ(ハロメチル)ピリジン（Ｘ＝Ｎ）および他の位置異性体 ２,４,５,６-テトラ(ハロメチル)ピリミジン（Ｘ１＝Ｘ２＝Ｎ）および他の位置異性体 ２,３,４,５-テトラ(ハロメチル)ピロール（Ｘ＝ＮＨ）、-フラン（Ｘ＝Ｏ）、-チオフェン（Ｘ＝Ｓ）および他の位置異性体 ２,２',６,６'-テトラ(ハロメチル)ビフェニレン ２,２",６,６"-テトラ(ハロメチル)テルフェニレン ２,３,５,６-テトラ(ハロメチル)ナフタレン ２,３,７,８-テトラ(ハロメチル)アントラセン ビス(２,４-ビス(ハロメチル)フェニル)メタン（Ｘ＝ＣＨ２） 単-、二重-および三重-ループペプチド構造の一段階合成の略図である。 二重-ループペプチドの段階的合成の略図である。部分的Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)-保護ペプチドのｍＰ２との最初の反応に、残存するＴｒｔ-保護基の除去、およびｍＰ２の第２の当量との反応が続く。

Claims (7)

  1. システインを介して足場ｍ-Ｔ２に付着されるポリペプチドＴＦＫＥＬＶＹＥＴＣＲＶＰＧＡＡＨＨＡＤＳＬＣＴＹＰＶＡＴＱＡＨ、
    システインを介して足場ｍ-Ｔ４に付着されるポリペプチドＫＩＱＫＴＡＴＦＫＥＬＶＹＥＴＣＲＶＰＧＡＡＨＨＡＤＳＬＣＴＹＰＶＡＴＱＡＨＡＧＫ、
    システインを介して足場ｍ-Ｔ２に付着されるポリペプチドＴＦＫＥＬＶＹＥＴＣＲＶＰＧＤＡＨＨＡＤＳＬＣＴＹＰＶＡＴＱＡＨ、
    システインを介して足場ｍ-Ｔ２に付着されるポリペプチドＴＦＫＥＬＶＹＥＴＣＲＶＰＧＤＡＨＨＡＤＫＬＣＴＹＰＶＡＴＱＡＨ、
    システインを介して足場ｍ-Ｔ２に付着されるポリペプチドＴＦＫＥＬＶＹＥＴＣＲＶＰＧＤＡＨＫＡＤＳＬＣＴＹＰＶＡＴＱＡＨ、
    システインを介して足場ｍ-Ｔ２に付着されるポリペプチドＮＹＲＤＶＲＦＥＳＣＲＬＰＧＡＰＲＧＶＮＰＶＣＳＹＡＶＡＬＳＡＱ、
    システインを介して足場ｍ-Ｔ２に付着されるポリペプチドＶＶＡＮＹＲＤＶＲＦＥＳＣＲＬＰＧＡＰＲＧＶＮＰＶＣＳＹＡＶＡＬＳＡＱＡＡＬ、および
    システインを介して２つの足場ｍ-Ｔ２に付着されるポリペプチド
    ＮＹＲＤＶＲＦＥＳＣＲＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＣＳＹＡＶＡＬＳＡＱ
    Ｓ
    Ｓ
    ＮＹＲＤＶＲＦＥＳＣＲＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＣＳＹＡＶＡＬＳＡＱ
    から成るペプチド模倣体の群から選択されるペプチド模倣体。
  2. ポリペプチドおよび足場を用意する工程と、前記ポリペプチドの前記足場への共有結合を許容する条件下で前記ポリペプチドと前記足場とを接触させる工程とを含むことを特徴とする、請求項１に記載のペプチド模倣体の作製方法。
  3. 前記接触させる工程が、溶液中で実行されることを特徴とする請求項２に記載のペプチド模倣体の作製方法。
  4. 前記接触させる工程が、水溶液中で実行されることを特徴とする請求項２に記載のペプチド模倣体の作製方法。
  5. 請求項１に記載のペプチド模倣体を含むワクチン組成物。
  6. 前記ペプチド模倣体が、担体にカップリングされることを特徴とする請求項５記載のワクチン組成物。
  7. 前記担体が、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）であることを特徴とする請求項６記載のワクチン組成物。
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