JP5367490B2 - イムノクロマト法用テストストリップ - Google Patents
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Description
本発明は、イムノクロマト法用テストストリップに関する。さらに、本発明は、前記イムノクロマト法用テストストリップを用いた、検出対象物の検出方法又は定量方法に関する。
イムノクロマト法とは、検出対象物が毛細管現象により多孔質支持体内を移動し、標識粒子に捕捉され、更に多孔質支持体に局所的（例えば、ライン状）に固定化された捕捉物質と効率的に接触することによって前記検出対象物が濃縮され、捕捉物質が固定化されたラインが発色することによって検出対象物の有無を判定する免疫測定法をいう。
イムノクロマト法の特徴として下記の３点が挙げられる。
（１）判定までに要する時間が２０分以下であり迅速な検査が可能である。
（２）検体を滴下するだけで測定でき、操作が簡便であるため、複数の検体処理が可能である。
（３）特別な検出装置を必要とせず、判定が容易なため一般消費者が自身で検査できる。
これらの特徴を利用して、イムノクロマト法は妊娠検査薬やインフルエンザ検査薬に用いられており、新たなＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ Ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ）の手法として注目を集めている（例えば、特許文献１参照）。
ここで、ＰＯＣＴとは、患者にできる限り近い場所での診断のための検査をいう。従来は採取した血液、尿、患部組織などの検体は、病院の中央検査室や専門の検査センターに送られデータを出すので、診断の確定までに時間がかかっていた（例えば、１日以上）。ＰＯＣＴによれば、瞬時に提供される検査情報をもとに迅速かつ的確な治療が可能となることから、病院での緊急検査や手術中の検査が可能になるので、最近、医療現場でニーズが高い。
イムノクロマト法の特徴として下記の３点が挙げられる。
（１）判定までに要する時間が２０分以下であり迅速な検査が可能である。
（２）検体を滴下するだけで測定でき、操作が簡便であるため、複数の検体処理が可能である。
（３）特別な検出装置を必要とせず、判定が容易なため一般消費者が自身で検査できる。
これらの特徴を利用して、イムノクロマト法は妊娠検査薬やインフルエンザ検査薬に用いられており、新たなＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ Ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ）の手法として注目を集めている（例えば、特許文献１参照）。
ここで、ＰＯＣＴとは、患者にできる限り近い場所での診断のための検査をいう。従来は採取した血液、尿、患部組織などの検体は、病院の中央検査室や専門の検査センターに送られデータを出すので、診断の確定までに時間がかかっていた（例えば、１日以上）。ＰＯＣＴによれば、瞬時に提供される検査情報をもとに迅速かつ的確な治療が可能となることから、病院での緊急検査や手術中の検査が可能になるので、最近、医療現場でニーズが高い。
イムノクロマト法において、一度の測定で複数の検出対象物の検出が可能であれば、検体の使用の効率化が図れ、さらに一検査項目あたりのイムノクロマト法用テストストリップの部材コストを減らすことができ、有用である。
複数の検出対象物を検出するイムノクロマト法用テストストリップとしては、例えば２種類の検出対象物であれば、２本のテストストリップを使用する方法が知られている。しかし、この方法では２倍量の検体が必要となり、少量の検体しか用いることが出来ないときには使用出来ない。
複数の検出対象物を検出する第２のイムノクロマト法用テストストリップとしては、１本のテストストリップに２本のテストラインを保持させ、１本のテストストリップで２種類の検出対象物を検出する方法が知られている。しかし、この方法では、使用する検体量は少なくて済むものの、同じメンブレン上に２種類のラインが塗布されているため、両方の検出対象物についてメンブレンの処理方法あるいはメンブレンの種類を変えることができず、検出感度を向上させるための条件最適化が困難であることが課題であった。さらに、２種類の標識粒子が２種類のラインを毛細管現象で通過することとなり、標識粒子とライン状に固定化された抗体の間で非特異的吸着が生じ、擬陽性の原因となる場合がある。
複数の検出対象物を検出する第３のイムノクロマト法用テストストリップとしては、１本のテストストリップを用い、１本のテストラインに２種類の抗体を固定化し、２種類の異なる色調の標識試薬を用いることで、同一ライン上で２種類の検出対象物を検出する方法が知られている（例えば、特許文献２、特許文献３参照）。しかし、この方法では、使用する検体量は少なくて済むものの、同じメンブレン上に２種類の検出用抗体が塗布されているため、両方の検出対象物についてメンブレンの処理方法あるいはメンブレンの種類を変えることができず、検出感度を向上させるための条件最適化が困難である。さらに２種類の標識粒子が同一ライン上で抗原抗体意反応をする際に、本来ならば特異的には結合しない標識粒子とライン状に固定化された抗体の間で非特異的吸着が生じ、正しい判定ができない場合がある。
複数の検出対象物を検出する第２のイムノクロマト法用テストストリップとしては、１本のテストストリップに２本のテストラインを保持させ、１本のテストストリップで２種類の検出対象物を検出する方法が知られている。しかし、この方法では、使用する検体量は少なくて済むものの、同じメンブレン上に２種類のラインが塗布されているため、両方の検出対象物についてメンブレンの処理方法あるいはメンブレンの種類を変えることができず、検出感度を向上させるための条件最適化が困難であることが課題であった。さらに、２種類の標識粒子が２種類のラインを毛細管現象で通過することとなり、標識粒子とライン状に固定化された抗体の間で非特異的吸着が生じ、擬陽性の原因となる場合がある。
複数の検出対象物を検出する第３のイムノクロマト法用テストストリップとしては、１本のテストストリップを用い、１本のテストラインに２種類の抗体を固定化し、２種類の異なる色調の標識試薬を用いることで、同一ライン上で２種類の検出対象物を検出する方法が知られている（例えば、特許文献２、特許文献３参照）。しかし、この方法では、使用する検体量は少なくて済むものの、同じメンブレン上に２種類の検出用抗体が塗布されているため、両方の検出対象物についてメンブレンの処理方法あるいはメンブレンの種類を変えることができず、検出感度を向上させるための条件最適化が困難である。さらに２種類の標識粒子が同一ライン上で抗原抗体意反応をする際に、本来ならば特異的には結合しない標識粒子とライン状に固定化された抗体の間で非特異的吸着が生じ、正しい判定ができない場合がある。
イムノクロマト法では標識粒子として金ナノ粒子や着色ラテックス粒子が最もよく使用されている（例えば、特許文献４参照）。金ナノ粒子や着色ラテックス粒子を用いたイムノクロマト法用テストストリップの幅は、ラインの判定を精度よく行うために、通常５ｍｍ程度必要である。ストリップの幅を狭くしても精度よく判定が可能であれば、使用する検体の量が少なくて済むため、微量の検体しか使用できない場合にも使用が可能であり、さらに１ストリップあたりの作製コストを下げることが可能となる。しかし、金ナノ粒子や着色ラテックス粒子を用いたイムノクロマト法用テストストリップでは、ストリップの幅が５ｍｍ以下になると、ラインの有無をはっきり目視で判別することができなくなり、判定の精度が低下してしまう場合がある。
本発明の課題は、上記の問題点に鑑みて、検体に含まれる２種以上の検出対象物を一度で高精度の検出又は定量が可能な、ラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップ、検出対象物の検出方法又は定量方法、及びイムノクロマト法用検出システムを提供することにある。
本発明者等は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、検出対象物ごとにコンジュゲートパッドとメンブレンを分けてラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを作製することで、複数の検出対象物を検出することが可能であることを見い出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。
本発明の課題は下記の手段により達成された。
（１）検体に含まれる少なくとも２種の検出対象物を一度で検出又は定量するラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップであって、
試料添加用部材、
第１の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッド、
前記第１の検出対象物に対する標識粒子が流れる方向に対して、第１の検出対象物を検出するための抗体固定化部及び第１の検出対象物に対する標識粒子を捕捉するための抗体固定化部を順次設けた、第１のメンブレン、
第２の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッド、
第２の検出対象物を検出するための抗体固定化部を有する第２のメンブレン、及び
吸収パッド
をこの順に直列連結して有し、
第１の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドと、第２の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドとを分離し、第１の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドの下流側且つ第２の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドの上流側で、第２の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドの直前に第１の検出対象物に対する標識粒子を捕捉する抗体固定化部を設けた、ラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップ。
（２）前記第１の検出対象物に対する標識粒子及び前記第２の検出対象物に対する標識粒子がそれぞれ平均粒径２０〜６００ｎｍのシリカナノ粒子であり、前記第１の検出対象物を検出するための抗体固定化部及び第１の検出対象物に対する標識粒子を捕捉するための抗体固定化部を設けた第１のメンブレンに対する、前記第１の検出対象物に対する標識粒子の透過率が３％以下であることを特徴とする、前記（１）項に記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップ。
（３）前記第１の検出対象物に対する標識粒子及び前記第２の検出対象物に対する標識粒子がそれぞれ蛍光シリカナノ粒子であることを特徴とする、前記（１）又は（２）項に記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップ。
（４）前記テストストリップの幅が０．５ｍｍ〜２ｍｍであり、前記試料添加用部材に添加する検出対象物を含む試料の体積が５〜４０μＬであることを特徴とする、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップ。
（５）前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップの試料添加用部材に検体を添加し、前記検体に含まれる２種の検出対象物を一回の検査で検出又は定量することを特徴とする、ラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを用いた検出対象物の検出方法又は定量方法。
（６）前記検出対象物がＡ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスであることを特徴とする、前記（５）項記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを用いた検出対象物の検出方法又は定量方法。
（７）前記ラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップにおける第１の検出対象物に対する標識粒子及び第２の検出対象物に対する標識粒子がそれぞれ蛍光物質を含有する平均粒径２０〜６００ｎｍのシリカナノ粒子であり、第１の検出対象物を検出するための抗体固定化部及び第２の検出対象物を検出するための抗体固定化部に集積される前記シリカナノ粒子に励起光源を照射し、前記シリカナノ粒子が発する蛍光を電荷結合素子もしくは光電子増倍管で受光または目視で蛍光を確認することで、検体に含まれる検出対象物を検出または定量することを特徴とする、前記（５）又は（６）項記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを用いた検出対象物の検出方法又は定量方法。
（８）前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを用いたイムノクロマト法用テストストリップの試料添加用部材に検体を添加し、前記検体に含まれる２種の検出対象物を一回の検査で検出又は定量するラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを用いた検出対象物の検出方法又は定量方法であって、前記第１の検出対象物に対する標識粒子及び前記第２の検出対象物に対する標識粒子がそれぞれ蛍光シリカナノ粒子であり、さらに第１の検出対象物及び第２の検出対象物を検出するための抗体固定化部における蛍光測定の際の蛍光バックグランド強度を低下させる、ラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを用いた検出対象物の検出方法又は定量方法。
（１）検体に含まれる少なくとも２種の検出対象物を一度で検出又は定量するラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップであって、
試料添加用部材、
第１の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッド、
前記第１の検出対象物に対する標識粒子が流れる方向に対して、第１の検出対象物を検出するための抗体固定化部及び第１の検出対象物に対する標識粒子を捕捉するための抗体固定化部を順次設けた、第１のメンブレン、
第２の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッド、
第２の検出対象物を検出するための抗体固定化部を有する第２のメンブレン、及び
吸収パッド
をこの順に直列連結して有し、
第１の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドと、第２の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドとを分離し、第１の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドの下流側且つ第２の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドの上流側で、第２の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドの直前に第１の検出対象物に対する標識粒子を捕捉する抗体固定化部を設けた、ラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップ。
（２）前記第１の検出対象物に対する標識粒子及び前記第２の検出対象物に対する標識粒子がそれぞれ平均粒径２０〜６００ｎｍのシリカナノ粒子であり、前記第１の検出対象物を検出するための抗体固定化部及び第１の検出対象物に対する標識粒子を捕捉するための抗体固定化部を設けた第１のメンブレンに対する、前記第１の検出対象物に対する標識粒子の透過率が３％以下であることを特徴とする、前記（１）項に記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップ。
（３）前記第１の検出対象物に対する標識粒子及び前記第２の検出対象物に対する標識粒子がそれぞれ蛍光シリカナノ粒子であることを特徴とする、前記（１）又は（２）項に記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップ。
（４）前記テストストリップの幅が０．５ｍｍ〜２ｍｍであり、前記試料添加用部材に添加する検出対象物を含む試料の体積が５〜４０μＬであることを特徴とする、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップ。
（５）前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップの試料添加用部材に検体を添加し、前記検体に含まれる２種の検出対象物を一回の検査で検出又は定量することを特徴とする、ラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを用いた検出対象物の検出方法又は定量方法。
（６）前記検出対象物がＡ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスであることを特徴とする、前記（５）項記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを用いた検出対象物の検出方法又は定量方法。
（７）前記ラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップにおける第１の検出対象物に対する標識粒子及び第２の検出対象物に対する標識粒子がそれぞれ蛍光物質を含有する平均粒径２０〜６００ｎｍのシリカナノ粒子であり、第１の検出対象物を検出するための抗体固定化部及び第２の検出対象物を検出するための抗体固定化部に集積される前記シリカナノ粒子に励起光源を照射し、前記シリカナノ粒子が発する蛍光を電荷結合素子もしくは光電子増倍管で受光または目視で蛍光を確認することで、検体に含まれる検出対象物を検出または定量することを特徴とする、前記（５）又は（６）項記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを用いた検出対象物の検出方法又は定量方法。
（８）前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを用いたイムノクロマト法用テストストリップの試料添加用部材に検体を添加し、前記検体に含まれる２種の検出対象物を一回の検査で検出又は定量するラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを用いた検出対象物の検出方法又は定量方法であって、前記第１の検出対象物に対する標識粒子及び前記第２の検出対象物に対する標識粒子がそれぞれ蛍光シリカナノ粒子であり、さらに第１の検出対象物及び第２の検出対象物を検出するための抗体固定化部における蛍光測定の際の蛍光バックグランド強度を低下させる、ラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを用いた検出対象物の検出方法又は定量方法。
本発明のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップ、検出対象物の検出方法又は定量方法及びイムノクロマト法用検出システムによれば、複数の検出対象物を一度で高精度に検出することができる。
まず、本発明のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップの好ましい一実施形態を説明する。
本発明のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップの一実施態様としては、
（１）試料添加用部材（本明細書において、「サンプルパッド」ともいう）と、第１の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッド（本明細書において、「第１のコンジュゲートパッド」ともいう）とが、
（２）前記第１のコンジュゲートパッドと、前記第１の検出対象物に対する標識粒子が流れる方向に対して第１の検出対象物を検出するための抗体固定化部及び第１の検出対象物に対する標識粒子を捕捉するための抗体固定化部を順次設けたメンブレン（本明細書において、「第１のメンブレン」ともいう）とが、
（３）前記第１のメンブレンと、第２の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッド（本明細書において、「第２のコンジュゲートパッド」ともいう）とが、及び
（４）前記第２のコンジュゲートパッドと、第２の検出対象物を検出するための抗体固定化部を有するメンブレン（本明細書において、「第２のメンブレン」ともいう）と吸収パッドとが、
それぞれ相互に毛細管現象が生じるように直列連結してなる。
本発明のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップの一実施態様としては、
（１）試料添加用部材（本明細書において、「サンプルパッド」ともいう）と、第１の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッド（本明細書において、「第１のコンジュゲートパッド」ともいう）とが、
（２）前記第１のコンジュゲートパッドと、前記第１の検出対象物に対する標識粒子が流れる方向に対して第１の検出対象物を検出するための抗体固定化部及び第１の検出対象物に対する標識粒子を捕捉するための抗体固定化部を順次設けたメンブレン（本明細書において、「第１のメンブレン」ともいう）とが、
（３）前記第１のメンブレンと、第２の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッド（本明細書において、「第２のコンジュゲートパッド」ともいう）とが、及び
（４）前記第２のコンジュゲートパッドと、第２の検出対象物を検出するための抗体固定化部を有するメンブレン（本明細書において、「第２のメンブレン」ともいう）と吸収パッドとが、
それぞれ相互に毛細管現象が生じるように直列連結してなる。
ラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップの形状は、添加する検体がテストストリップ中を毛細管現象により移動することができる限り、特に制限はない。例えば、ラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップの形状としては、サンプルパッド、第１のコンジュゲートパッド、第１のメンブレン、第２のコンジュゲートパッド、第２のメンブレンをこの順で一方向に連結した形状、第１のコンジュゲートパッドと第１のメンブレン中を検体が移動する向きと第２のコンジュゲートパッドと第２の抗体固定化メンブレン中を検体が移動する向きが逆になった形状等が挙げられる。第１のコンジュゲートパッドと第１のメンブレン中を検体が移動する向きと第２のコンジュゲートパッドと第２の抗体固定化メンブレン中を検体が移動する向きが逆になった構造の場合、第１のメンブレンの抗体固定化部と第２のメンブレンのコントロールラインが隣接し、かつ第１のメンブレンの抗体固定化部と第２のメンブレンの抗体固定化部が隣接していると、蛍光検出の際、読み取りが効率的にできる。ここで、「コントロールライン」とは、標識粒子により標識された検出対象物を検出することはできないが、テストラインと結合しなかった標識粒子を検出するためのメンブレンの一部分をいう。
ラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップは、検出又は定量する検出対象物（標的物質ともいう）の種類に応じて、コンジュゲートパット及びメンブレンを直列連結して作成することができる。例えば、検出対象物が２種類である場合、サンプルパッド、第１のコンジュゲートパッド、第１のメンブレン、第２のコンジュゲートパッド、第２のメンブレンをこの順で直列連結することでテストストリップを作成することができる。検出対象物が３種類である場合、上記のテストストリップの構成部材に加えて、第３のコンジュゲートパッド及び第３のメンブレンをさらに連結することでテストストリップを作成することができる。すなわち、検出対象物の種類に応じて、適宜本発明のテストストリップを作成することができる。このように、検出対象物が３種類以上ある場合は、それぞれの検出対象物に対するメンブレン及びコンジュゲートパッドのセットを設けることにより、３種類目以上の検出対象物を、検出対象物ごとに検出することができる。
本発明のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップにおいて、第１の検出対象物を検出するための抗体固定化部を有する第１のメンブレンに、第１の検出対象物に対する標識粒子を捕捉するための抗体固定化部（本明細書において、「標識粒子捕捉部」ともいう）を第１の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドの下流側且つ第２の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドの上流側で、第２の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドの直前に設ける。このように標識粒子を捕捉するための抗体固定化部を第１のメンブレンに設けることで、第１の検出対象物に対する標識粒子が下流側の第２のメンブレンに移動することを防ぎ、擬陽性が生じることを防ぐことができる。第１のメンブレンにおける標識粒子捕捉部の位置は、第１の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドの下流側且つ第２の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドの上流側で、第２の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドの直前に、かつ標識粒子が流れる方向に対して、検出対象物を検出するための抗体固定化部より下流に設ける。
本発明の標識粒子を捕捉するための抗体固定化部は、標識粒子のみを結合する抗体が固定化されてなる。例えば、標識粒子の表面にマウスＩｇＧが結合している場合は、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体が固定化した抗体固定化部を用いることができる。本発明に用いることができる抗体としては、マウスＩｇＧ、ヤギＩｇＧの他、ウサギＩｇＧ、ニワトリＩｇＹ、マウスＩｇＥ、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＥが挙げられる。前記抗体固定化部（標識粒子捕捉部）の形状としては局所的に捕捉用抗体が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円形状、帯状等が挙げられるが、帯状であることが好ましく、幅１．０〜３．０ｍｍの帯状であることがより好ましい。また、標識粒子を十分捕捉するために前記抗体固定化部の抗体の固定量は、１〜１００μｇ／ｃｍ２であることが好ましく、１０〜１００μｇ／ｃｍ２であることがより好ましい。
抗体の固定化方法としては、抗体溶液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。
抗体の固定化方法としては、抗体溶液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。
次に、本発明のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップの各部材について図１（ａ）及び（ｂ）を参考に説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
１）試料添加用部材（サンプルパッド）２
サンプルパッド２は検出対象物を含むサンプルを滴下する構成部材である。
サンプルパッド２は検出対象物を含むサンプルを滴下する構成部材である。
２）標識粒子含浸部材（コンジュゲートパッド）３及び５
コンジュゲートパッド３及び５は、それぞれ第１の検出対象物に対する標識粒子及び第２の検出対象物に対する標識粒子が含浸された構成部材であり、サンプルパッド２から毛細管現象により移動してきた試料に含まれる検出対象物が抗原抗体反応等の分子認識反応で、前記標識粒子によって捕捉され、標識される部分である。
コンジュゲートパッドにおける単位面積（ｃｍ２）当たりの前記標識粒子の含有量は特に制限はないが５０μｇ〜２ｍｇが好ましい。含浸方法としては、前記標識粒子の分散液を塗布、滴下又は噴霧後、乾燥する方法等が挙げられる。
コンジュゲートパッド３及び５は、それぞれ第１の検出対象物に対する標識粒子及び第２の検出対象物に対する標識粒子が含浸された構成部材であり、サンプルパッド２から毛細管現象により移動してきた試料に含まれる検出対象物が抗原抗体反応等の分子認識反応で、前記標識粒子によって捕捉され、標識される部分である。
コンジュゲートパッドにおける単位面積（ｃｍ２）当たりの前記標識粒子の含有量は特に制限はないが５０μｇ〜２ｍｇが好ましい。含浸方法としては、前記標識粒子の分散液を塗布、滴下又は噴霧後、乾燥する方法等が挙げられる。
３）抗体固定化メンブレン（第１のメンブレン４及び第２のメンブレン６）
第１のメンブレン４及び第２のメンブレン６は、前記標識粒子により標識された検出対象物が毛細管現象によって移動する構成部材であり、固定化抗体−検体−標識粒子からなるサンドイッチ型免疫複合体形成反応が行われる、第１の検出対象物に対する抗体固定化部（第１の検出対象物の判定部）（４１）及び第２の検出対象物に対する抗体固定化部（第２の検出対象物の判定部）（６１）をそれぞれ有する。
前記メンブレンにおける前記抗体固定化部（判定部）の形状としては局所的に捕捉用抗体が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられるが、できるだけ細いライン状であることが好ましく、幅０．５〜２．０ｍｍのライン状とすることができる。
第１のメンブレン４及び第２のメンブレン６は、前記標識粒子により標識された検出対象物が毛細管現象によって移動する構成部材であり、固定化抗体−検体−標識粒子からなるサンドイッチ型免疫複合体形成反応が行われる、第１の検出対象物に対する抗体固定化部（第１の検出対象物の判定部）（４１）及び第２の検出対象物に対する抗体固定化部（第２の検出対象物の判定部）（６１）をそれぞれ有する。
前記メンブレンにおける前記抗体固定化部（判定部）の形状としては局所的に捕捉用抗体が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられるが、できるだけ細いライン状であることが好ましく、幅０．５〜２．０ｍｍのライン状とすることができる。
固定化抗体−検出対象物−標識粒子からなるサンドイッチ型免疫複合体形成反応により、抗体固定化部（判定部）（４１及び６１）に前記標識粒子により標識された検出対象物が捕捉され、形成された前記複合体中の前記標識粒子に由来する発色又は蛍光等の標識の程度により検出対象物の有無を判定、すなわち陽性・陰性を判定することができる。すなわち、前記抗体固定化部（判定部）（４１及び６１）に標識粒子が濃縮され、着色シグナルとして目視的に、又は検出機器を用いて検出、判定できる。
前記サンドイッチ型免疫複合体形成反応を充分に完了させるため、又は試料中の着色物質による測定への影響や検出対象物と結合していない標識粒子による測定への影響を回避するため、メンブレンにおける判定部は、前記コンジュゲートパッドとの連結端及び前記吸収パッドとの連結端からある程度離れた位置（例えば、前記メンブレンの中程など）に設けておくことが好ましい。
前記抗体固定化部（判定部）（４１及び６１）における抗体固定化量は特に制限ないが、形状がライン状の場合、単位長さ（ｃｍ）当たり０．１μｇ〜５μｇが好ましい。固定化方法としては、抗体溶液を塗布、滴下又は噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。
前述の抗体固定化後に、非特異的吸着による測定への影響を防止するために前記メンブレン全体をいわゆるブロッキング処理を施しておいてもよい。ブロッキング処理としては、例えば、アルブミン、カゼイン、ポリビニルアルコール等のブロッキング剤を含有する緩衝液中に適当な時間浸漬した後乾燥する方法等が挙げられる。市販の前記ブロッキング剤としては、例えば、スキムミルク（ＤＩＦＣＯ社製）、４％ブロックエース（明治乳業社製）などが挙げられる。
本発明において、第１の検出対象物に対する標識粒子のみを捕捉し、第１の検出対象物に対する標識粒子が第２のメンブレン６に入り込まないようにするために、標識粒子捕捉部４３を設ける。
本発明において、第１の検出対象物のコントロール部４２及び第２の検出対象物のコントロール部６２をそれぞれ設けることが好ましい。第１の検出対象物のコントロール部４２は、第１の検出対象物に対する標識粒子が第１のメンブレンを移動していることを確認するために設ける。第２の検出対象物のコントロール部６２は、第２の検出対象物に対する標識粒子が第２のメンブレンを移動していることを確認するために設ける。
ここで、第１の検出対象物のコントロール部４２及び第２の検出対象物のコントロール部は、それぞれ第１の検出対象物に対する標識粒子及び第２の検出対象物に対する標識粒子に表面修飾された、検体に含まれる検出対象物を認識する物質と結合する抗体が固定化されてなる。例えば、標識粒子にマウスＩｇＧが表面修飾されている場合は、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体が固定化された抗体固定化部をコントロール部として用いることができる。
メンブレンを毛細管現象で移動し、コントロール部まで達した標識粒子は、コントロール部においてメンブレンに固定化された抗体に捕捉される。従って、コントロール部から前記標識粒子に由来する発色又は蛍光等の標識が検出されれば、標識粒子がコントロール部まで移動したことが確認できる。逆に、コントロール部から前記標識粒子に由来する発色又は蛍光等の標識が検出されない場合は、何らかの原因で標識粒子がメンブレンを移動していないことを意味している。こういった場合は、検出部が標識粒子で標識されていなくても陰性と判定するのではなく、判定不能と評価する。このように評価することで、陽性の検体であるのに標識粒子がメンブレンをうまく移動しないために判定部が標識されない場合を、陰性と判定してしまう誤判定を防げる。
メンブレンを毛細管現象で移動し、コントロール部まで達した標識粒子は、コントロール部においてメンブレンに固定化された抗体に捕捉される。従って、コントロール部から前記標識粒子に由来する発色又は蛍光等の標識が検出されれば、標識粒子がコントロール部まで移動したことが確認できる。逆に、コントロール部から前記標識粒子に由来する発色又は蛍光等の標識が検出されない場合は、何らかの原因で標識粒子がメンブレンを移動していないことを意味している。こういった場合は、検出部が標識粒子で標識されていなくても陰性と判定するのではなく、判定不能と評価する。このように評価することで、陽性の検体であるのに標識粒子がメンブレンをうまく移動しないために判定部が標識されない場合を、陰性と判定してしまう誤判定を防げる。
コントロール部の形状としては、局所的に標識粒子を捕捉する抗体が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円形状、帯状等が挙げられるが、ライン状であることが好ましく、幅０．３〜１．０ｍｍのライン状であることがより好ましい。また、抗体の固定量は、形状がライン状の場合、単位長さ（ｃｍ）当たり０．１μｇ〜５μｇが好ましい。
４）吸収パッド７
本発明のイムノクロマト法用テストストリップに吸収パッド７を設けることが好ましい。吸収パッド７は、毛細管現象でメンブレンを移動してきた試料液体および標識粒子を吸収し、常に一定の流れを生じさせるための構成部材である。
本発明のイムノクロマト法用テストストリップに吸収パッド７を設けることが好ましい。吸収パッド７は、毛細管現象でメンブレンを移動してきた試料液体および標識粒子を吸収し、常に一定の流れを生じさせるための構成部材である。
５）バッキングシート８
本発明のイムノクロマト法用テストストリップにバッキングシート８を設けることが好ましい。バッキングシート８は、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、メンブレン、吸収パッドの各部材を安定に固定するための構成部材である。バッキングシート８は、粘着剤付きバッキングシートであることが好ましい。
本発明のイムノクロマト法用テストストリップにバッキングシート８を設けることが好ましい。バッキングシート８は、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、メンブレン、吸収パッドの各部材を安定に固定するための構成部材である。バッキングシート８は、粘着剤付きバッキングシートであることが好ましい。
これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、イムノクロマト法用テストストリップに用いられる通常の部材が使用できる。
サンプルパッドおよびコンジュゲートパッドとしてはＧｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のガラスファイバーのパッドが好ましく、メンブレンとしてはＨｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０メンブレン（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のニトロセルロースメンブレンが好ましく、吸収パッドとしてはＣｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のセルロースメンブレンが好ましい。
前記粘着剤付きバッキングシートとしては、ＡＲ９０２０（商品名、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）等が挙げられる。
サンプルパッドおよびコンジュゲートパッドとしてはＧｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のガラスファイバーのパッドが好ましく、メンブレンとしてはＨｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０メンブレン（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のニトロセルロースメンブレンが好ましく、吸収パッドとしてはＣｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のセルロースメンブレンが好ましい。
前記粘着剤付きバッキングシートとしては、ＡＲ９０２０（商品名、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）等が挙げられる。
本発明のイムノクロマト法用テストストリップの作製法としては特に制限はない。検体に含まれる検出対象物が２種の場合、サンプルパッド、第１のコンジュゲートパッド、第１のメンブレン、第２のコンジュゲートパッド、第２のメンブレン、吸収パッドの並び順に、各部材間で毛細管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端を隣接する部材と１〜２ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート上に）貼付することで作製することができる。
本発明のイムノクロマト法用テストストリップにおいて、検出対象物を検出するための抗体固定化部を有するメンブレンに対する、標識粒子の透過率が３％以下、より好ましくは１％以下、さらに好ましくは０．５％以下であることが好ましい。標識粒子の透過率をこのような範囲とすることで、第２のメンブレンに入り込んだ第１の検出対象物に対する標識粒子が、第２のメンブレンの判定部の抗体と非特異的に吸着することで生じる擬陽性を防ぐことができる。また、標識粒子として蛍光物質を含有する粒子を用いた場合、標識粒子がメンブレンに吸着や結合することで生じるバックグラウンドを低減させ、抗体固定化部の発色をよりはっきりと認識することができる。
本明細書における「透過率」とは、使用前のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップのコンジュゲートパッドに保持されている標識粒子のうち、試料滴下部に試料を滴下してラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを使用した際にメンブレンを流れきった標識粒子の割合である。透過率は、使用前のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップのコンジュゲートパッドから抽出された標識粒子の蛍光強度に対する、ラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを使用後のメンブレンの下流側の部材から抽出された標識粒子の蛍光強度の比から求めることができる。標識粒子の透過率を３％以下にする方法としては、第１のメンブレンにおける第１の検出対象物の判定部及び第１の検出対象物のコントロール部の下流側に第１の検出対象物に対する標識粒子を捕捉するための抗体固定化部を設け、第１の検出対象物に対する標識粒子を捕捉する方法が挙げられる。
本明細書における「透過率」とは、使用前のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップのコンジュゲートパッドに保持されている標識粒子のうち、試料滴下部に試料を滴下してラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを使用した際にメンブレンを流れきった標識粒子の割合である。透過率は、使用前のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップのコンジュゲートパッドから抽出された標識粒子の蛍光強度に対する、ラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを使用後のメンブレンの下流側の部材から抽出された標識粒子の蛍光強度の比から求めることができる。標識粒子の透過率を３％以下にする方法としては、第１のメンブレンにおける第１の検出対象物の判定部及び第１の検出対象物のコントロール部の下流側に第１の検出対象物に対する標識粒子を捕捉するための抗体固定化部を設け、第１の検出対象物に対する標識粒子を捕捉する方法が挙げられる。
本発明のイムノクロマト法用テストストリップの幅は、０．５〜２ｍｍ、より好ましくは０．５〜１ｍｍであることが好ましい。イムノクロマト法用テストストリップでは、一定量のサンプル液がテストストリップ内を毛細管現象で透過する必要がある。そのため、必要なサンプル液の量はメンブレンの面積に比例する。ストリップの幅を狭くすることで、メンブレンの面積が小さくなり、使用する検体量を減らすことが可能となる。例えば、本発明によれば、添加する検出対象物を含む試料の体積を例えば、５〜４０μＬ、好ましくは５〜２０μＬとすることができる。さらに、イムノクロマト法用テストストリップの幅を狭くすることで、イムノクロマト法用テストストリップの製造コストを低減することができる。
本発明における標識粒子は、蛍光物質を含有するシリカナノ粒子（本明細書において、「蛍光シリカナノ粒子」ともいう）であることが好ましい。検出対象物を検出するための抗体固定化部に集積された金ナノ粒子や着色ラテックス粒子を目視で判定するよりも、検出対象物を検出するための抗体固定化部に集積された蛍光シリカナノ粒子の蛍光を検出し、判定する方法の方が高感度であり、幅の狭いテストストリップであっても、精度良く判定することが可能になるからである。
本発明において用いることができる蛍光シリカ粒子は特に制限はなく、任意のいかなる調製方法によって得られたシリカ粒子であってもよい。例えば、Journal of Colloid and Interface Science，159，150-157（1993）に記載のゾル−ゲル法で調製されるシリカ粒子、ＷＯ２００７／０７４７２２号パンフレット記載の方法で調製される蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子等が挙げられる。
具体的には、前記蛍光シリカナノ粒子は、蛍光物質とシラン化合物とを反応させ、共有結合、イオン結合その他化学的に結合もしくは吸着させて得られた生成物に１種又は２種以上のシラン化合物を縮重合させることにより調製することができる。又は、シランカップリング剤を反応させて縮重合を行い、縮重合生成物を蛍光物質の表面に共有結合、イオン結合その他化学的に結合もしくは吸着させることにより調製することができる。さらには、蛍光物質とシラン化合物とを混合し、蛍光物質の表面に共有結合、イオン結合その他化学的に結合もしくは吸着したシラン化合物を起点とし順次シラン化合物の縮重合を行うことにより調製することもできる。
前記蛍光シリカナノ粒子の好ましい調製方法の態様としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する蛍光物質と、前記活性基と反応する反応性置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１種又は２種以上のシラン化合物を重合させることにより調製することができる。
前記蛍光シリカナノ粒子は、例えば、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を行なうことにより調製することができる。
（ａ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル等の活性エステル基を有する蛍光物質（１）とアミノ基を有するシランカップリング剤（２）とを反応させて、蛍光物質−シランカップリング剤複合化合物（３）を生成する工程
（ｂ）前記（ａ）で得られた蛍光物質−シランカップリング剤複合化合物（３）を、シリカ化合物（４）と塩基性条件下で重合させて蛍光シリカナノ粒子（５）を形成する工程
前記工程（ａ）で用いるＮＨＳエステル基を有する蛍光物質（１）は、カルボジイミドによるカルボキシル基の活性化と、それに引き続くＮＨＳとのエステル化反応によって調製できる。但し、商業的に市販のものを入手することも可能である。
（ａ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル等の活性エステル基を有する蛍光物質（１）とアミノ基を有するシランカップリング剤（２）とを反応させて、蛍光物質−シランカップリング剤複合化合物（３）を生成する工程
（ｂ）前記（ａ）で得られた蛍光物質−シランカップリング剤複合化合物（３）を、シリカ化合物（４）と塩基性条件下で重合させて蛍光シリカナノ粒子（５）を形成する工程
前記工程（ａ）で用いるＮＨＳエステル基を有する蛍光物質（１）は、カルボジイミドによるカルボキシル基の活性化と、それに引き続くＮＨＳとのエステル化反応によって調製できる。但し、商業的に市販のものを入手することも可能である。
前記蛍光物質（１）と前記シランカップリング剤（２）との反応は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）やＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）等の溶媒に溶解した後、室温（例えば、２５℃）条件下で攪拌しながら反応することによって行うことができる。
反応に用いる前記蛍光物質（１）とシランカップリング剤（２）との割合は特に制限されないが、前記蛍光物質（１）：前記シランカップリング剤（２）＝１：０．５〜２（モル比）の割合が好ましく、１：０．８〜１．２（モル比）の割合がより好ましい。
反応に用いる前記蛍光物質（１）とシランカップリング剤（２）との割合は特に制限されないが、前記蛍光物質（１）：前記シランカップリング剤（２）＝１：０．５〜２（モル比）の割合が好ましく、１：０．８〜１．２（モル比）の割合がより好ましい。
前記蛍光物質は特に制限はないが、汎用の検出器（例えば、ＡＥ−６９３１ＦＸＣＦ プリントグラフ（商品名、ＡＴＴＯ社製））による検出およびデータの互換性の観点から、青色蛍光（４４０〜４９０ｎｍ）、黄色蛍光（５４０〜５９０ｎｍ）、オレンジ色蛍光（５９０〜６２０ｎｍ）又は赤色蛍光（６２０〜７４０ｎｍ）である蛍光物質が好ましい。前記活性基を有する蛍光物質の具体例として、ＤＹ５５０−ＮＨＳエステル、ＤＹ５５５−ＮＨＳエステル、ＤＹ６３０−ＮＨＳエステル、ＤＹ６３５−ＮＨＳエステル（いずれも商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ社製）、５−ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステル、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６−ＮＨＳエステル、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５−ＮＨＳエステル、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３−ＮＨＳエステル、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７−ＮＨＳエステル（いずれも商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｏｙｓｔｅｒ６４３−ＮＨＳエステル、Ｏｙｓｔｅｒ６５６−ＮＨＳエステル（いずれも商品名、Ｄｅｎｏｖｏ Ｂｉｏｌａｂｅｌｓ社製）、５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン・スクシンイミジルエステル（商品名、ｅｍｐ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光物質を挙げることができる。
前記蛍光物質の活性基と反応する反応性置換基を有するシランカップリング剤の具体例として、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル-トリエトキシシラン、Ｎ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。
斯くして、蛍光物質（１）のカルボニル基等の活性基と、シランカップリング剤（２）のアミノ基等の前記活性基と反応する反応性置換基とが、アミド結合（−ＮＨＣＯ−）等を形成して、蛍光物質−シランカップリング剤複合化合物（３）が得られる。すなわち、前記蛍光物質−シランカップリング剤複合化合物（３）は、アミド結合等を介して蛍光物質とシリカ成分が結合している。
次いで工程（ｂ）で、前記前記蛍光物質−シランカップリング剤複合化合物（３）をシリカ化合物（４）と反応させる。前記前記シラン化合物（４）としては、特に制限はないが、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、γ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ−メルカプトプロピルトリエトキシシラン、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、３−イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。中でも、ＴＥＯＳ、ＭＰＳ又はＡＰＳが好ましい。
蛍光物質−シランカップリング剤複合化合物（３）とシリカ化合物（４）の割合は、特に制限はないが、蛍光物質−シランカップリング剤複合化合物（３）１モルに対するシリカ化合物（４）のモル比として、５０〜４００００が好ましく、１００〜２０００がより好ましく、１５０〜１０００がさらに好ましい。
この反応は、アルコール、水及びアンモニアの存在下で行うのが好ましい。ここでアルコールとしてはメタノール、エタノール、プロパノール等の炭素数１〜３の低級アルコールを挙げることができる。
かかる反応系における水とアルコールの割合は、特に制限されないが、好ましくは水１容量部に対してアルコールを０．５〜２０容量部、より好ましくは２〜１６容量部、さらに好ましくは４〜１０容量部の範囲である。アンモニアの量も特に制限されないが、アンモニアの濃度が３０〜１０００ｍＭが好ましく、６０〜５００ｍＭがより好ましく、８０〜２００ｍＭがさらに好ましい。
この反応は室温で行うことができ、また攪拌しながら行うことが好ましい。通常、数十分〜数十時間の反応で、本発明の蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子（５）を調製することができる。
なお、前記工程（ｂ）において、使用するシリカ化合物（４）の濃度を調整したり、反応時間を調整することにより、調製する蛍光シリカナノ粒子の大きさ（直径）を適宜調節することができる。使用するシリカ化合物（４）の濃度を低くしたり、また反応時間を短くすることにより、より小さな蛍光シリカナノ粒子を調製することができる(例えば、Blaaderenet al.，“Synthesis and Characterization of Monodisperse Colloidal Organo-silica Spheres”，J．Colloid and Interface Science，156，1-18，1993参照)。一方、工程（ｂ）を複数回、繰り返し行えば、より大きな蛍光シリカナノ粒子を調製することができる。このように、得られる蛍光シリカナノ粒子の粒径（直径）を、所望の大きさに、例えばｎｍオーダーからμｍオーダーへと自在に調整することができる。具体的には、３〜３０ｎｍといった微小な大きさを有する蛍光シリカナノ粒子を調製することが可能である。また必要に応じて、その後の処理により希望する粒子径分布となるように調整することもでき、斯くして所望の粒子径分布範囲にある蛍光シリカナノ粒子を得ることができる。
前記蛍光シリカナノ粒子の平均粒径は２０〜６００ｎｍであることが好ましく、１００〜３００ｎｍであることがより好ましい。粒径が小さすぎると、抗体固定化部に集積される蛍光シリカ粒子の蛍光強度が低下し、十分な感度が得られない。逆に粒径が大きすぎると、メンブレンが目詰まりし、蛍光シリカナノ粒子のメンブレン透過性が著しく低下し十分な感度が得られない。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した１００個のシリカナノ粒子の合計の投影面積からシリカナノ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択したシリカナノ粒子の個数（１００個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
本発明で用いることができる蛍光シリカナノ粒子は単分散であることが好ましく、粒度分布の変動係数、いわゆるＣＶ値、は１５％以下が好ましく、１０％以下がより好ましく、８％以下がさらに好ましい。
本発明で用いることができる蛍光シリカナノ粒子は単分散であることが好ましく、粒度分布の変動係数、いわゆるＣＶ値、は１５％以下が好ましく、１０％以下がより好ましく、８％以下がさらに好ましい。
本発明で用いる標識粒子は、球状、もしくは、球状に近い蛍光シリカ粒子であることが好ましい。球状に近い蛍光シリカ粒子とは、具体的には粒子の長軸と短軸の比が２以下の形状の粒子を指す。
所望の平均粒径のシリカ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収することで可能である。限外ろ過膜などの常法を利用して共存イオンや共存する不要物を除いて精製してもよい。
本発明において、前記蛍光物質は、前記蛍光シリカナノ粒子中において固定化された状態にある。蛍光物質に関して特に制限はなく、有機分子、無機化合物、半導体粒子等である。
蛍光物質を蛍光シリカナノ粒子内に固定し、包含させると、前記蛍光物質がシリカナノ粒子内に分散して存在しているので、遊離の蛍光色素化合物よりも感度を上げることができる。すなわち、遊離の蛍光物質よりも輝度を増加させることができる。
また、本発明の蛍光シリカナノ粒子は、自己消光を起こすことなく、多くの蛍光物質をシリカナノ粒子内に固定し、包含させることができる。このため、微小な領域でも使用可能な、高感度な標識が可能である。
蛍光物質を蛍光シリカナノ粒子内に固定し、包含させると、前記蛍光物質がシリカナノ粒子内に分散して存在しているので、遊離の蛍光色素化合物よりも感度を上げることができる。すなわち、遊離の蛍光物質よりも輝度を増加させることができる。
また、本発明の蛍光シリカナノ粒子は、自己消光を起こすことなく、多くの蛍光物質をシリカナノ粒子内に固定し、包含させることができる。このため、微小な領域でも使用可能な、高感度な標識が可能である。
前記蛍光シリカナノ粒子に対する蛍光物質の濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、４０〜８０ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。ここで、「前記蛍光シリカナノ粒子に対する蛍光物質の濃度」とは、蛍光物質のモル数を、前記蛍光シリカナノ粒子の体積で割ったものである。蛍光物質のモル数は、前記蛍光シリカナノ粒子の吸光度もしくは蛍光強度から求めたものであり、また前記蛍光シリカナノ粒子の体積は、前記蛍光シリカナノ粒子分散液から前記蛍光シリカナノ粒子を遠心分離または限外ろ過によって回収し、乾燥させ、質量を求め、シリカ粒子の密度を２．３ｇ／ｃｍ３として求めたものである。
次に、蛍光シリカナノ粒子の表面修飾について説明する。
シリカは、一般に、化学的に不活性であると共に、その修飾が容易であることが知られている。本発明における蛍光シリカナノ粒子もまた、容易に所望の分子を表面に結合させることが可能であり、またその表面をメソポーラスや平滑状にすることもできる。
シリカは、一般に、化学的に不活性であると共に、その修飾が容易であることが知られている。本発明における蛍光シリカナノ粒子もまた、容易に所望の分子を表面に結合させることが可能であり、またその表面をメソポーラスや平滑状にすることもできる。
前記蛍光シリカナノ粒子の表面修飾について、具体的には、上記工程（ｂ）で用いるシリカ化合物（４）の種類に応じて、所望の分子と結合可能なアクセプター基を表面に有する蛍光シリカナノ粒子とすることができる。前記アクセプター基として、アミノ基、水酸基、チオール基、カルボキシル基、マレイミド基、スクシンイミジルエステル基等が挙げられる。
反応に用いるシリカ化合物（４）と、それによって得られる蛍光シリカナノ粒子の表面に形成されたアクセプター基との関係を表１に示す。
反応に用いるシリカ化合物（４）と、それによって得られる蛍光シリカナノ粒子の表面に形成されたアクセプター基との関係を表１に示す。
なお、蛍光シリカナノ粒子（５）について、反応に使用したシリカ化合物（４）によって表面に導入されるアクセプター基とは異なるアクセプター基を導入したい場合には、前記蛍光シリカナノ粒子（５）を、さらに工程（ｂ）で使用したシリカ化合物（４）とは異なるシリカ化合物で処理することにより達成できる。この処理は、工程（ｂ）で使用したシリカ化合物（４）とは異なるシリカ化合物を用いて、上記工程（ｂ）と同様な操作を行うことにより実施することができる。
前記蛍光シリカナノ粒子をイムノクロマト法に用いるためには、検体に含まれる検出対象物を認識する物質（例えば、抗体、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの生体分子）で表面修飾されていることが好ましい。前記標識粒子として、検体を認識する物質で表面修飾された前記蛍光シリカナノ粒子を用いる場合には、前記蛍光シリカナノ粒子が発する蛍光を検出することにより高感度検出ないしは定量が可能である。
前記蛍光シリカナノ粒子群の表面を所望の生体分子等で修飾させる方法として特に制限はないが、下記（ｉ）〜（iii）の例が挙げられる。
（ｉ）ＭＰＳ等を用いて調製したチオール基を表面に有する蛍光シリカナノ粒子は、ジスルフィド結合、チオエステル結合、またはチオール置換反応を介した結合を介して、その表面を生体分子等で修飾することができる。
（ii）特に前記生体分子等がアミノ基を有する場合には、蛍光シリカナノ粒子が有するチオール基と、前記生体分子等が有するアミノ基とをスクシンイミジル−トランス−４−（Ｎ−マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）等の架橋剤を用いて結合することもできる。
（iii）ＡＰＳ等を用いて調製したアミノ基を表面に有する蛍光シリカナノ粒子は、前述と同様に、このアミノ基と生体分子等が有するチオール基とをＳＭＣＣ、ＥＭＣＳ等の架橋剤を用いて結合することができる。また、このアミノ基と生体分子等が有するアミノ基とをグルタルアルデヒド等の架橋剤で結合することもできる。さらに、アミド結合やチオウレア結合を介して、その表面を生体分子等で修飾することもできる。
（ｉ）ＭＰＳ等を用いて調製したチオール基を表面に有する蛍光シリカナノ粒子は、ジスルフィド結合、チオエステル結合、またはチオール置換反応を介した結合を介して、その表面を生体分子等で修飾することができる。
（ii）特に前記生体分子等がアミノ基を有する場合には、蛍光シリカナノ粒子が有するチオール基と、前記生体分子等が有するアミノ基とをスクシンイミジル−トランス−４−（Ｎ−マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）等の架橋剤を用いて結合することもできる。
（iii）ＡＰＳ等を用いて調製したアミノ基を表面に有する蛍光シリカナノ粒子は、前述と同様に、このアミノ基と生体分子等が有するチオール基とをＳＭＣＣ、ＥＭＣＳ等の架橋剤を用いて結合することができる。また、このアミノ基と生体分子等が有するアミノ基とをグルタルアルデヒド等の架橋剤で結合することもできる。さらに、アミド結合やチオウレア結合を介して、その表面を生体分子等で修飾することもできる。
本発明において、前記蛍光シリカナノ粒子は、標的生体分子で直接修飾してもよいが、前記蛍光シリカナノ粒子を修飾した所望の分子〔例えば、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖鎖、受容体、ペプチド等〕が、更にそれ自体がアクセプター分子となって、例えば抗原−抗体反応、ビオチン−アビジン反応、塩基配列の相補性を利用したハイブリダイゼーションなどの特異的な分子認識反応を利用して、標的生体分子に特異的に結合させることが好ましい。ここで、分子認識反応とは、（１）ＤＮＡ分子間又はＤＮＡ−ＲＮＡ分子間のハイブリダイゼーション、（２）抗原抗体反応、（３）酵素（受容体）−基質（リガンド）間の反応など、生体分子間の特異的相互作用に由来する反応をいう。
本発明において、前記蛍光シリカナノ粒子を所望の生体分子等で表面修飾した後に、ブロッキング処理することが好ましい。
所望の生体分子で表面修飾した前記蛍光シリカナノ粒子の表面には、生体分子やメンブレンと非特異的に吸着しやすい部分が存在する。これは、所望の生体分子等で表面修飾した際に、蛍光シリカナノ粒子表面の生体分子等と結合しやすい部分が、前記所望の生体分子等で完全に被覆されていないことが原因であると考えられる。このような非特異的な吸着が起こりやすい部分が蛍光シリカナノ粒子表面に存在すると、陰性の検体であっても蛍光シリカナノ粒子が抗体固定化部（判定部）においてメンブレンあるいは固定化抗体と非特異的に吸着し擬陽性の原因になったり、毛細管現象で蛍光シリカナノ粒子がメンブレンを移動する際に蛍光シリカナノ粒子がメンブレンに非特異的に吸着してバックグランドが上昇し、感度が低下する原因になる。こういった現象を防ぐために、蛍光シリカナノ粒子を所望の生体分子等で修飾した後に、適当な高分子を加えて蛍光シリカナノ粒子表面をブロッキング処理することが好ましい。
ブロッキング処理に用いることができる高分子としては特に制限はないが、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ポリビニルアルコールなどの親水性の高分子や、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、カゼインなどのタンパク質、アルギン酸、デキストラン、ヒアルロン酸などの多糖が挙げられる。本発明において、蛍光シリカナノ粒子にブロッキング処理を行う場合、前記高分子を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
所望の生体分子で表面修飾した前記蛍光シリカナノ粒子の表面には、生体分子やメンブレンと非特異的に吸着しやすい部分が存在する。これは、所望の生体分子等で表面修飾した際に、蛍光シリカナノ粒子表面の生体分子等と結合しやすい部分が、前記所望の生体分子等で完全に被覆されていないことが原因であると考えられる。このような非特異的な吸着が起こりやすい部分が蛍光シリカナノ粒子表面に存在すると、陰性の検体であっても蛍光シリカナノ粒子が抗体固定化部（判定部）においてメンブレンあるいは固定化抗体と非特異的に吸着し擬陽性の原因になったり、毛細管現象で蛍光シリカナノ粒子がメンブレンを移動する際に蛍光シリカナノ粒子がメンブレンに非特異的に吸着してバックグランドが上昇し、感度が低下する原因になる。こういった現象を防ぐために、蛍光シリカナノ粒子を所望の生体分子等で修飾した後に、適当な高分子を加えて蛍光シリカナノ粒子表面をブロッキング処理することが好ましい。
ブロッキング処理に用いることができる高分子としては特に制限はないが、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ポリビニルアルコールなどの親水性の高分子や、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、カゼインなどのタンパク質、アルギン酸、デキストラン、ヒアルロン酸などの多糖が挙げられる。本発明において、蛍光シリカナノ粒子にブロッキング処理を行う場合、前記高分子を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップは、手技の習熟していない一般需要者でも操作し易くし、かつＰＯＣＴの観点から、テストストリップの検出ラインを目視にて観察する観察窓のプラスチック材料等でハウジング（ケーシング）されていることが好ましい。例えば、特開２０００−３５６６３８等に記載されているハウジング等が挙げられる。
次に、本発明の検出対象物の検出方法又は定量方法について説明する。
本発明の検出対象物の検出方法又は定量方法は、本発明のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップの試料添加用部材に検体を添加し、前記検体に含まれる２種以上の検出対象物を一度で検出または定量する。
本発明のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップの試料添加用部材に添加することができる検体としては特に制限はないが、鼻腔吸引液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、唾液、全血、血清、血漿、食品粉砕物、尿、糞便などが挙げられる。
本発明の検出対象物の検出方法又は定量方法は、本発明のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップの試料添加用部材に検体を添加し、前記検体に含まれる２種以上の検出対象物を一度で検出または定量する。
本発明のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップの試料添加用部材に添加することができる検体としては特に制限はないが、鼻腔吸引液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、唾液、全血、血清、血漿、食品粉砕物、尿、糞便などが挙げられる。
本発明の検出対象物の検出方法又は定量方法により検出又は定量することができる検出対象物としては、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、生理活性有機化合物等が挙げられる。より具体的には、Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質、Ａ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素、Ａ型インフルエンザウイルスノイラミダーゼ、Ａ型インフルエンザウイルス膜タンパク質、Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質、Ｂ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素、Ｂ型インフルエンザウイルスノイラミダーゼ、Ｂ型インフルエンザウイルス膜タンパク質、イムノグロブリンＥ、食物アレルギー物質、細菌性毒素などが挙げられる。
前記標識粒子と前記検体に含まれる検出対象物を認識する物質を結合させるために、静電的引力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等によって前記検体に含まれる検出対象物を認識する物質を、前記標識粒子に吸着させても良いし、架橋剤や縮合剤によって化学結合で結合させても良い。また、前記標識粒子表面にＭＰＳ（γ−メルカプトプロピルトリエトキシシラン）等のチオール基を有するシランカップリング剤を用いてチオール基を導入し、前記検体に含まれる検出対象物を認識する物質のチオール基とＳ−Ｓ結合によって結合させても良い。例えば、本発明の検出対象物の検出方法又は定量方法によりＡ型インフルエンザウイルスを検出する場合、標識粒子表面をマウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体、またはマウス抗Ａ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素モノクローナル抗体、またはマウス抗Ａ型インフルエンザウイルスノイラミダーゼモノクローナル抗体、またはマウス抗Ａ型インフルエンザウイルス膜タンパク質モノクローナル抗体で修飾することが好ましく、Ｂ型インフルエンザウイルスを検出する場合、標識粒子表面をマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体、またはマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス赤血球凝集素モノクローナル抗体、またはマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルスノイラミダーゼモノクローナル抗体、またはマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス膜タンパク質モノクローナル抗体で修飾することが好ましい。
また、前記標識粒子表面の生体分子（例えば、抗体、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ）などの前記検体に含まれる検出対象物を認識する物質を結合したときに標識粒子が凝集する場合は、予め、前記標識粒子表面に交互吸着法によって表面処理を施しておいても良い。交互吸着法とは、電荷を有する基板や粒子の表面に電荷を持った高分子を静電的引力で吸着させることで、基板や粒子の表面に高分子の薄膜を形成する手法である。前記標識粒子の表面に交互吸着処理を行うことにより粒子表面に電荷を付与できるため、粒子間に静電的反発力が生じ、分散性が向上する。また、粒子に結合した高分子は排除体積を持つことから、立体反発力の効果によっても分散性が向上する。
次に、本発明のイムノクロマト法用蛍光検出システムについて説明する。
本発明のイムノクロマト法用蛍光検出システムは、本発明のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを有する。本発明のイムノクロマト法用蛍光検出システムに用いるテストストリップはバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。さらに、励起光源、及び励起光を透過せず、蛍光を透過する光学フィルタを有することが好ましい。
本発明のイムノクロマト法用蛍光検出システムは、本発明のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを有する。本発明のイムノクロマト法用蛍光検出システムに用いるテストストリップはバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。さらに、励起光源、及び励起光を透過せず、蛍光を透過する光学フィルタを有することが好ましい。
本発明の蛍光検出システムにおいて、前記励起光源の波長に特に制限はなく、波長２００ｎｍ〜７００ｎｍの励起光を発することが好ましい。前記励起光源としては、水銀ランプ、ハロゲンランプ又はキセノンランプ、青色ＬＥＤ、緑色ＬＥＤが挙げられる。
また、本発明の蛍光検出システムにおいて光源がランプまたは発光ダイオードの場合は、前記励起光源から特定の波長の光のみを透過するためのフィルタを備えていることがより好ましい。さらに、本発明の蛍光検出システムは、前記蛍光を受光する電荷結合素子もしくは光電子増倍管もしくはフォトダイオードを備えることが特に好ましく、これにより目視では確認できない強度ないしは波長の蛍光も検出でき、さらにはその蛍光強度を測定できることから検体の定量もでき、高感度検出及び定量が可能となる。
また、本発明の蛍光検出システムにおいて光源がランプまたは発光ダイオードの場合は、前記励起光源から特定の波長の光のみを透過するためのフィルタを備えていることがより好ましい。さらに、本発明の蛍光検出システムは、前記蛍光を受光する電荷結合素子もしくは光電子増倍管もしくはフォトダイオードを備えることが特に好ましく、これにより目視では確認できない強度ないしは波長の蛍光も検出でき、さらにはその蛍光強度を測定できることから検体の定量もでき、高感度検出及び定量が可能となる。
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
（１）標識シリカナノ粒子の調製
５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇスクシンイミジルエステル（商品名、ＨｉＬｙｔｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）３．０ｍｇを１ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ここに１．３μｌのＡＰＳを加え、室温（２３℃）で１時間反応を行った。
得られた反応液４００μＬにエタノール１２８ｍｌ、ＴＥＯＳ（テトラエトキシシラン）６００μＬ、蒸留水２８．８ｍｌ、２８質量％アンモニア水４００μＬを加え、室温で２４時間反応させ、ＴＥＯＳを重合し付加した。
反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ粒子に蒸留水を４ｍｌ加え、粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、標識シリカナノ粒子分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去し、平均粒径１７２ｎｍのシリカナノ粒子１４９．２ｍｇを得た。収率約９２％。
５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇスクシンイミジルエステル（商品名、ＨｉＬｙｔｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）３．０ｍｇを１ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ここに１．３μｌのＡＰＳを加え、室温（２３℃）で１時間反応を行った。
得られた反応液４００μＬにエタノール１２８ｍｌ、ＴＥＯＳ（テトラエトキシシラン）６００μＬ、蒸留水２８．８ｍｌ、２８質量％アンモニア水４００μＬを加え、室温で２４時間反応させ、ＴＥＯＳを重合し付加した。
反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ粒子に蒸留水を４ｍｌ加え、粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、標識シリカナノ粒子分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去し、平均粒径１７２ｎｍのシリカナノ粒子１４９．２ｍｇを得た。収率約９２％。
図２は、得られた標識シリカナノ粒子のＳＥＭ写真像を示す図である。図中、白く見える球形状物質が、得られた標識シリカナノ粒子である。
（２）Ａ型インフルエンザウイルス検出用コンジュゲートパッドの作製
遠心管に５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）７００μＬと前記５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ含有シリカナノ粒子分散液（１０ｍｇ／ｍＬ）２００μＬを加えて軽く撹拌した。遠心管にマウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体（商品名：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ＮＰ、ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１００μＬ（１０μｇ／ｍＬ）加え、室温で１時間混合し、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を前記シリカナノ粒子に吸着させた。これに１％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量２００００、和光純薬工業社製）１００μＬ加え軽く撹拌し、更に１０％ＢＳＡを１００μＬ加え軽く撹拌した。
混合液を１２０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を取り除き、沈殿にリン酸バッファー（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２），０．０５％ＰＥＧ２０，０００、１％ＢＳＡ， ０．１％ＮａＮ３）１ｍＬ加え、遠心分離し、上清を取り除き、沈殿にさらにもう一度リン酸バッファー（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）、０．０５％ＰＥＧ２０，０００、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）を１ｍＬ加え、遠心分離し、上清を取り除いた。得られた沈殿にリン酸バッファー（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ ７．２）、０．０５％ＰＥＧ２０，０００、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）を１０．６７ｍＬ加え、沈殿を分散さ、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を吸着させてなるシリカナノ粒子の分散液（１８７．５μｇ／ｍＬ）を得た。
Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（商品名：ＧＦＣＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）(８×１５０ｍｍ)に、前記マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を吸着させてなるシリカナノ粒子の分散液０．８ｍＬを均等に塗布した。デシケーター内で室温下、一夜減圧乾燥し、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を吸着させてなるシリカナノ粒子を含有してなるコンジュゲートパッド１４３を作製した。
遠心管に５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）７００μＬと前記５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ含有シリカナノ粒子分散液（１０ｍｇ／ｍＬ）２００μＬを加えて軽く撹拌した。遠心管にマウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体（商品名：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ＮＰ、ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１００μＬ（１０μｇ／ｍＬ）加え、室温で１時間混合し、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を前記シリカナノ粒子に吸着させた。これに１％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量２００００、和光純薬工業社製）１００μＬ加え軽く撹拌し、更に１０％ＢＳＡを１００μＬ加え軽く撹拌した。
混合液を１２０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を取り除き、沈殿にリン酸バッファー（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２），０．０５％ＰＥＧ２０，０００、１％ＢＳＡ， ０．１％ＮａＮ３）１ｍＬ加え、遠心分離し、上清を取り除き、沈殿にさらにもう一度リン酸バッファー（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）、０．０５％ＰＥＧ２０，０００、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）を１ｍＬ加え、遠心分離し、上清を取り除いた。得られた沈殿にリン酸バッファー（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ ７．２）、０．０５％ＰＥＧ２０，０００、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）を１０．６７ｍＬ加え、沈殿を分散さ、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を吸着させてなるシリカナノ粒子の分散液（１８７．５μｇ／ｍＬ）を得た。
Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（商品名：ＧＦＣＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）(８×１５０ｍｍ)に、前記マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を吸着させてなるシリカナノ粒子の分散液０．８ｍＬを均等に塗布した。デシケーター内で室温下、一夜減圧乾燥し、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を吸着させてなるシリカナノ粒子を含有してなるコンジュゲートパッド１４３を作製した。
（３）Ｂ型インフルエンザウイルス検出用コンジュゲートパッドの作製
Ｂ型インフルエンザウイルス検出用のコンジュゲートパッド１４５は、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体の代わりにマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体（商品名：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ ＮＡ、ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いたこと以外は、Ａ型インフルエンザウイルス検出用のコンジュゲートパッドと同じ方法で作製した。
Ｂ型インフルエンザウイルス検出用のコンジュゲートパッド１４５は、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体の代わりにマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体（商品名：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ ＮＡ、ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いたこと以外は、Ａ型インフルエンザウイルス検出用のコンジュゲートパッドと同じ方法で作製した。
（４）Ａ型インフルエンザウイルス検出用抗体固定化メンブレンの作製
メンブレン（丈２５ｍｍ、商品名Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０ メンブレン、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）の端から約８ｍｍの位置に幅約１ｍｍのテストライン（抗体固定化部）としてマウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体が０．５ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、Ａ型インフルエンザウイルス用抗体固定化部１４８を設けた。
続いて、メンブレンの端から約１２ｍｍの位置に幅約１ｍｍのコントロールラインとして抗ＩｇＧ抗体（Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が０．５ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）シュガー・フリー）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、コントロールライン１４９を設けた。
続いて、メンブレンの端から約１６ｍｍの位置に幅約２ｍｍの標識粒子捕捉部として、抗ＩｇＧ抗体（Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が１０．０ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）シュガー・フリー）を１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、５０℃で３０分乾燥させ、標識粒子捕捉部１５０を設けた。
メンブレン（丈２５ｍｍ、商品名Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０ メンブレン、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）の端から約８ｍｍの位置に幅約１ｍｍのテストライン（抗体固定化部）としてマウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体が０．５ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、Ａ型インフルエンザウイルス用抗体固定化部１４８を設けた。
続いて、メンブレンの端から約１２ｍｍの位置に幅約１ｍｍのコントロールラインとして抗ＩｇＧ抗体（Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が０．５ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）シュガー・フリー）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、コントロールライン１４９を設けた。
続いて、メンブレンの端から約１６ｍｍの位置に幅約２ｍｍの標識粒子捕捉部として、抗ＩｇＧ抗体（Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が１０．０ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）シュガー・フリー）を１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、５０℃で３０分乾燥させ、標識粒子捕捉部１５０を設けた。
次に、ブロッキング処理として前記メンブレン全体をブロッキングバッファー中に室温で３０分浸した。
メンブレン洗浄／安定バッファーに移し室温で３０分以上静置した。メンブレンを引き上げ、ペーパータオル上に置いて室温で一夜乾燥させて、Ａ型インフルエンザウイルス検出用抗体固定化メンブレン１４４を作製した。
メンブレン洗浄／安定バッファーに移し室温で３０分以上静置した。メンブレンを引き上げ、ペーパータオル上に置いて室温で一夜乾燥させて、Ａ型インフルエンザウイルス検出用抗体固定化メンブレン１４４を作製した。
（５）Ｂ型インフルエンザウイルス検出用抗体固定化メンブレンの作製
Ｂ型インフルエンザウイルス検出用抗体固定化メンブレン１４６は、マウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体と抗ＩｇＧ抗体を用いて、Ａ型インフルエンザウイルス検出用抗体固定化メンブレンと同じ方法で、Ｂ型インフルエンザウイルス用抗体固定化部１５１及びコントロールライン１５２のみを塗布して作製した。
Ｂ型インフルエンザウイルス検出用抗体固定化メンブレン１４６は、マウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体と抗ＩｇＧ抗体を用いて、Ａ型インフルエンザウイルス検出用抗体固定化メンブレンと同じ方法で、Ｂ型インフルエンザウイルス用抗体固定化部１５１及びコントロールライン１５２のみを塗布して作製した。
（６）テストストリップの作製
前記得られた２種類のメンブレン１４４及び１４６、前記得られた２種類のコンジュゲートパッド１４３及び１４５、サンプルパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）１４２、吸収パッド（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ（ＣＦＳＰ）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）１４７をバッキングシート（商品名ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上で直列連結し、１．５ｍｍ幅、長さ９０ｍｍのストリップ状に切断し、図４に示した構成のテストストリップ１４１を得た。
なお、各構成部材は、図１（ｂ）に示すように、各々その両端を隣接する部材と２ｍｍ程度重ね合わせて貼付した。
前記得られた２種類のメンブレン１４４及び１４６、前記得られた２種類のコンジュゲートパッド１４３及び１４５、サンプルパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）１４２、吸収パッド（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ（ＣＦＳＰ）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）１４７をバッキングシート（商品名ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上で直列連結し、１．５ｍｍ幅、長さ９０ｍｍのストリップ状に切断し、図４に示した構成のテストストリップ１４１を得た。
なお、各構成部材は、図１（ｂ）に示すように、各々その両端を隣接する部材と２ｍｍ程度重ね合わせて貼付した。
（７）Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスの検出
前記テストストリップを２本用意し、一方のテストストリップのサンプルパッドにはＡ型インフルエンザウイルスを５×１０２ＦＦＵ／ｍＬ含む液を３０μＬ滴下し、１０分間静置した。もう一方のテストストリップのサンプルパッドにはＢ型インフルエンザウイルスを５×１０２ＦＦＵ／ｍＬ含む液を３０μＬ滴下し、１０分間静置した。
前記テストストリップの蛍光の画像をＡＥ−６９３５ＧＳ ＶＩＳＩＲＡＹＳ−ＧＳ（製品名、アトー株式会社製）を用いて取得した。得られた画像を、画像解析ソフトＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ３（製品名、アトー株式会社製）で解析した。
その結果、Ａ型インフルエンザウイルスを含む液を滴下したテストストリップでは、Ａ型インフルエンザウイルス検出用の抗体固定化メンブレンのテストラインとコントロールおよびＢ型インフルエンザウイルス検出用の抗体固定化メンブレンのコントロールラインの蛍光が確認され、Ｂ型インフルエンザウイルスを含む液を滴下したテストストリップでは、Ａ型インフルエンザウイルス検出用の抗体固定化メンブレンのコントロールラインおよびＢ型インフルエンザウイルス検出用の抗体固定化メンブレンのテストラインとコントロールラインの発色が確認された。
前記テストストリップを２本用意し、一方のテストストリップのサンプルパッドにはＡ型インフルエンザウイルスを５×１０２ＦＦＵ／ｍＬ含む液を３０μＬ滴下し、１０分間静置した。もう一方のテストストリップのサンプルパッドにはＢ型インフルエンザウイルスを５×１０２ＦＦＵ／ｍＬ含む液を３０μＬ滴下し、１０分間静置した。
前記テストストリップの蛍光の画像をＡＥ−６９３５ＧＳ ＶＩＳＩＲＡＹＳ−ＧＳ（製品名、アトー株式会社製）を用いて取得した。得られた画像を、画像解析ソフトＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ３（製品名、アトー株式会社製）で解析した。
その結果、Ａ型インフルエンザウイルスを含む液を滴下したテストストリップでは、Ａ型インフルエンザウイルス検出用の抗体固定化メンブレンのテストラインとコントロールおよびＢ型インフルエンザウイルス検出用の抗体固定化メンブレンのコントロールラインの蛍光が確認され、Ｂ型インフルエンザウイルスを含む液を滴下したテストストリップでは、Ａ型インフルエンザウイルス検出用の抗体固定化メンブレンのコントロールラインおよびＢ型インフルエンザウイルス検出用の抗体固定化メンブレンのテストラインとコントロールラインの発色が確認された。
（８）標識粒子透過率の評価
前記（４）で作製した標識粒子捕捉部を有するＡ型インフルエンザウイルス検出用の抗体固定化メンブレン、前記（２）で作製したＡ型インフルエンザウイルス検出用のコンジュゲートパッド、サンプルパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、吸収パッドをバッキングシート（商品名ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上で直列連結し、１．５ｍｍ幅、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、テストストリップを得た。尚、吸収パッドはＣｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ（ＣＦＳＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）の代わりにＧｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いた。
前記（４）で作製した標識粒子捕捉部を有するＡ型インフルエンザウイルス検出用の抗体固定化メンブレン、前記（２）で作製したＡ型インフルエンザウイルス検出用のコンジュゲートパッド、サンプルパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、吸収パッドをバッキングシート（商品名ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上で直列連結し、１．５ｍｍ幅、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、テストストリップを得た。尚、吸収パッドはＣｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ（ＣＦＳＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）の代わりにＧｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いた。
このように作製したテストストリップにリン酸緩衝液（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）３０μＬ滴下し、静置した。
１時間後、テストストリップから吸収パッドのみを分離し、リン酸緩衝液（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）３ｍｌに浸し、１時間振とう処理した。１時間後、液を回収し（抽出液１）、蛍光分光光度計ＦＰ−６５００（商品名、日本分光社製）で５３０ｎｍの励起波長を照射した際の、５５５ｎｍの蛍光強度を測定した。
１時間後、テストストリップから吸収パッドのみを分離し、リン酸緩衝液（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）３ｍｌに浸し、１時間振とう処理した。１時間後、液を回収し（抽出液１）、蛍光分光光度計ＦＰ−６５００（商品名、日本分光社製）で５３０ｎｍの励起波長を照射した際の、５５５ｎｍの蛍光強度を測定した。
続いて、リン酸緩衝液を滴下する前のテストストリップからコンジュゲートパッドのみを分離し、リン酸緩衝液（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）３ｍｌに浸し、１時間振とう処理した。１時間後、液を回収し（抽出液２）、蛍光分光光度計ＦＰ−６５００（商品名、日本分光社製）で励起波長５３０ｎｍとし、５５５ｎｍの蛍光強度を測定した。
標識粒子捕捉部を有するＡ型インフルエンザウイルス検出用抗体固定化メンブレン１４４のテストストリップの吸収パッド抽出液の蛍光強度と、リン酸緩衝液を滴下する前のテストストリップのコンジュゲートパッド抽出液の蛍光強度の比から粒子の透過率を求めた。その結果を表２に示す。
標識粒子捕捉部を有するＡ型インフルエンザウイルス検出用抗体固定化メンブレン１４４のテストストリップの吸収パッド抽出液の蛍光強度と、リン酸緩衝液を滴下する前のテストストリップのコンジュゲートパッド抽出液の蛍光強度の比から粒子の透過率を求めた。その結果を表２に示す。
表２において、抽出液１の蛍光強度はＡ型インフルエンザウイルス検出用抗体固定化メンブレン１４４を透過した蛍光シリカ粒子の蛍光強度を示している。また、抽出液２の蛍光強度はＡ型インフルエンザウイルス検出用抗体固定化メンブレン１４４に入り込んだ粒子の全量の蛍光強度を示している。従って、抽出液１の蛍光強度を、抽出液２の蛍光強度で割った値が、本テストストリップのメンブレンの透過率であり、透過率が０．６％であることがわかる。
（９）同一メンブレンに二本のテストラインを有するメンブレンを用いたテストストリップの作成
遠心管に５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）７００μＬと前記５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ含有シリカナノ粒子分散液（１０ｍｇ／ｍＬ）２００μＬを加えて軽く撹拌した。遠心管にマウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体（商品名：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ＮＰ、ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１００μＬ（１０μｇ／ｍＬ）加え、室温で１時間混合し、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を前記シリカナノ粒子に吸着させた。これに１％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量２００００、和光純薬工業社製）を１００μＬ加え軽く撹拌し、更に１０％ＢＳＡを１００μＬ加え軽く撹拌した。
混合液を１２０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を取り除き、沈殿にリン酸バッファー（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２），０．０５％ＰＥＧ２０，０００，１％ＢＳＡ，０．１％ＮａＮ３）を１ｍＬ加え、遠心分離し、上清を取り除き、沈殿にさらにもう一度リン酸バッファー（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２），０．０５％ＰＥＧ２０，０００，１％ＢＳＡ，０．１％ＮａＮ３）を１ｍＬ加え、遠心分離し、上清を取り除いた。得られた沈殿にリン酸バッファー（１０ｍM ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２），０．０５％ＰＥＧ２０，０００，１％ＢＳＡ，０．１％ＮａＮ３）５．３３ｍＬ加え、沈殿を分散さ、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を吸着させてなるシリカナノ粒子の分散液（３７５μｇ／ｍＬ）を得た。
遠心管に５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）７００μＬと前記５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ含有シリカナノ粒子分散液（１０ｍｇ／ｍＬ）２００μＬを加えて軽く撹拌した。遠心管にマウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体（商品名：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ＮＰ、ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１００μＬ（１０μｇ／ｍＬ）加え、室温で１時間混合し、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を前記シリカナノ粒子に吸着させた。これに１％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量２００００、和光純薬工業社製）を１００μＬ加え軽く撹拌し、更に１０％ＢＳＡを１００μＬ加え軽く撹拌した。
混合液を１２０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を取り除き、沈殿にリン酸バッファー（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２），０．０５％ＰＥＧ２０，０００，１％ＢＳＡ，０．１％ＮａＮ３）を１ｍＬ加え、遠心分離し、上清を取り除き、沈殿にさらにもう一度リン酸バッファー（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２），０．０５％ＰＥＧ２０，０００，１％ＢＳＡ，０．１％ＮａＮ３）を１ｍＬ加え、遠心分離し、上清を取り除いた。得られた沈殿にリン酸バッファー（１０ｍM ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２），０．０５％ＰＥＧ２０，０００，１％ＢＳＡ，０．１％ＮａＮ３）５．３３ｍＬ加え、沈殿を分散さ、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を吸着させてなるシリカナノ粒子の分散液（３７５μｇ／ｍＬ）を得た。
続いて、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体の代わりにマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体（商品名：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ ＮＡ、ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いたこと以外は同様の方法で、マウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を吸着させてなるシリカナノ粒子の分散液（３７５μｇ／ｍＬ）を得た。
続いて、前記、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を吸着させてなるシリカナノ粒子の分散液（３７５μｇ／ｍＬ）１ｍＬと、前記マウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を吸着させてなるシリカナノ粒子の分散液（３７５μｇ／ｍＬ）１ｍＬを混合し、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を吸着させてなるシリカナノ粒子とマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を吸着させてなるシリカナノ粒子の混合分散液を得た。
Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）(８×１５０ｍｍ)に、前記混合分散液０．８ｍＬを均等に塗布した。デシケーター内で室温下、一夜減圧乾燥し、マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を吸着させてなるシリカナノ粒子とマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を吸着させてなるシリカナノ粒子を含有してなるコンジュゲートパッド１３３を作製した。
メンブレン１３４（丈２５ｍｍ、商品名Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０ メンブレン、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）の端から約８ｍｍの位置にＡ型インフルエンザウイルス用のテストラインとしてマウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体が０．５ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、Ａ型インフルエンザウイルス用抗体固定化部１３６を設けた。
続いて、前記メンブレン１３４の端から約１２ｍｍの位置にＢ型インフルエンザウイルス用のテストラインとしてマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体が０．５ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、Ｂ型インフルエンザウイルス用抗体固定化部１３７を設けた。
続いて、前記メンブレン１３４の端から約１６ｍｍの位置に幅約１ｍｍのコントロールラインとして抗ＩｇＧ抗体（Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が０．５ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）シュガー・フリー）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、５０℃で３０分乾燥させた。
続いて、前記メンブレン１３４の端から約１２ｍｍの位置にＢ型インフルエンザウイルス用のテストラインとしてマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体が０．５ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、Ｂ型インフルエンザウイルス用抗体固定化部１３７を設けた。
続いて、前記メンブレン１３４の端から約１６ｍｍの位置に幅約１ｍｍのコントロールラインとして抗ＩｇＧ抗体（Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が０．５ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）シュガー・フリー）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、５０℃で３０分乾燥させた。
次に、ブロッキング処理として前記メンブレン１３４全体をブロッキングバッファー中に室温で３０分浸した。
メンブレン洗浄／安定バッファーに移し室温で３０分以上静置した。メンブレンを引き上げ、ペーパータオル上に置いて室温で一夜乾燥させて、同一メンブレンに二本のテストラインを有する抗体固定化メンブレンを作製した。
メンブレン洗浄／安定バッファーに移し室温で３０分以上静置した。メンブレンを引き上げ、ペーパータオル上に置いて室温で一夜乾燥させて、同一メンブレンに二本のテストラインを有する抗体固定化メンブレンを作製した。
上記、同一メンブレンに二本のテストラインを有する抗体固定化メンブレン１３４と、上記マウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を吸着させてなるシリカナノ粒子とマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を吸着させてなるシリカナノ粒子を含有してなるコンジュゲートパッド１３３、サンプルパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）１３２、吸収パッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）１３５をバッキングシート（商品名ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上で組み立て、１．５ｍｍ幅、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、テストストリップ１３１を得た。
（１０）バックグラウンドの評価
前記（９）で作成した同一メンブレンに二本のテストラインを有するメンブレンを用いたテストストリップの、図３に示すａの部分の蛍光強度を、蛍光プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用い、励起波長を５３０ｎｍ、蛍光波長を５５５ｎｍとして測定した。その結果、蛍光強度は６５７であった。
続いて、前記同一メンブレンに二本のテストラインを有するメンブレンを用いたテストストリップのサンプルパッドにＢ型インフルエンザウイルスを５×１０２ＦＦＵ／ｍＬ含む液を３０μＬ滴下し、１時間静置した。
続いて、図３に示すａの部分のバックグラウンド蛍光強度を、蛍光プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用い、励起波長を５３０ｎｍ、蛍光波長を５５５ｎｍとして測定した。その結果、蛍光強度は１８４０であった。
前記（９）で作成した同一メンブレンに二本のテストラインを有するメンブレンを用いたテストストリップの、図３に示すａの部分の蛍光強度を、蛍光プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用い、励起波長を５３０ｎｍ、蛍光波長を５５５ｎｍとして測定した。その結果、蛍光強度は６５７であった。
続いて、前記同一メンブレンに二本のテストラインを有するメンブレンを用いたテストストリップのサンプルパッドにＢ型インフルエンザウイルスを５×１０２ＦＦＵ／ｍＬ含む液を３０μＬ滴下し、１時間静置した。
続いて、図３に示すａの部分のバックグラウンド蛍光強度を、蛍光プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用い、励起波長を５３０ｎｍ、蛍光波長を５５５ｎｍとして測定した。その結果、蛍光強度は１８４０であった。
次に、前記（６）で作製した、直列型のテストストリップの、図４に示すａおよびｂの部分の蛍光強度を、蛍光プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用い、励起波長を５３０ｎｍ、蛍光波長を５５５ｎｍとして測定した。その結果、ａの部分の蛍光強度は６５１、ｂの部分の蛍光強度は６４８であった。
続いて、前記（６）で作成したテストストリップのサンプルパッドにＢ型インフルエンザウイルスを５×１０２ＦＦＵ／ｍＬ含む液を３０μＬ滴下し、１時間静置した。
続いて、図４に示すテストストリップのａおよびｂの部分のバックグラウンド蛍光強度を、蛍光プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用い、励起波長を５３０ｎｍ、波長５５５ｎｍの蛍光を測定することで測定した。その結果、ａの部分の蛍光強度は１１８９、ｂの部分の蛍光強度は１２０４であった。
続いて、前記（６）で作成したテストストリップのサンプルパッドにＢ型インフルエンザウイルスを５×１０２ＦＦＵ／ｍＬ含む液を３０μＬ滴下し、１時間静置した。
続いて、図４に示すテストストリップのａおよびｂの部分のバックグラウンド蛍光強度を、蛍光プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用い、励起波長を５３０ｎｍ、波長５５５ｎｍの蛍光を測定することで測定した。その結果、ａの部分の蛍光強度は１１８９、ｂの部分の蛍光強度は１２０４であった。
以上の評価結果を表３にまとめる。この結果から、同一メンブレンに二本のテストラインを有するメンブレンを用いたテストストリップに比べ、実施例１の方法で作製した直列型のテストストリップは、吸着した粒子の蛍光強度が半分程度であり、ラインの判定に適しているといえる。
１ テストストリップ
２ サンプルパッド
３ コンジュゲートパッド
４ メンブレン
５ コンジュゲートパッド
６ メンブレン
７ 吸収パッド
８ バッキングシート
４１ 第１の検出対象物の判定部
４２ 第１の検出対象物のコントロール部
４３ 標識粒子捕捉部
６１ 第２の検出対象物の判定部
６２ 第２の検出対象物のコントロール部
１３１ テストストリップ
１３２ サンプルパッド
１３３ コンジュゲートパッド
１３４ メンブレン
１３５ 吸収パッド
１３６ Ａ型インフルエンザウイルス用抗体固定化部
１３７ Ｂ型インフルエンザウイルス用抗体固定化部
１４１ テストストリップ
１４２ サンプルパッド
１４３ コンジュゲートパッド
１４４ Ａ型インフルエンザウイルス検出用抗体固定化メンブレン
１４５ コンジュゲートパッド
１４６ Ｂ型インフルエンザウイルス用抗体固定化メンブレン
１４７ 吸収パッド
１４８ Ａ型インフルエンザウイルス用抗体固定化部
１４９ コントロールライン
１５０ 標識粒子捕捉部
１５１ Ｂ型インフルエンザウイルス用抗体固定化部
１５２ コントロールライン
２ サンプルパッド
３ コンジュゲートパッド
４ メンブレン
５ コンジュゲートパッド
６ メンブレン
７ 吸収パッド
８ バッキングシート
４１ 第１の検出対象物の判定部
４２ 第１の検出対象物のコントロール部
４３ 標識粒子捕捉部
６１ 第２の検出対象物の判定部
６２ 第２の検出対象物のコントロール部
１３１ テストストリップ
１３２ サンプルパッド
１３３ コンジュゲートパッド
１３４ メンブレン
１３５ 吸収パッド
１３６ Ａ型インフルエンザウイルス用抗体固定化部
１３７ Ｂ型インフルエンザウイルス用抗体固定化部
１４１ テストストリップ
１４２ サンプルパッド
１４３ コンジュゲートパッド
１４４ Ａ型インフルエンザウイルス検出用抗体固定化メンブレン
１４５ コンジュゲートパッド
１４６ Ｂ型インフルエンザウイルス用抗体固定化メンブレン
１４７ 吸収パッド
１４８ Ａ型インフルエンザウイルス用抗体固定化部
１４９ コントロールライン
１５０ 標識粒子捕捉部
１５１ Ｂ型インフルエンザウイルス用抗体固定化部
１５２ コントロールライン
Claims (8)
- 検体に含まれる少なくとも２種の検出対象物を一度で検出又は定量するラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップであって、
試料添加用部材、
第１の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッド、
前記第１の検出対象物に対する標識粒子が流れる方向に対して、第１の検出対象物を検出するための抗体固定化部及び第１の検出対象物に対する標識粒子を捕捉するための抗体固定化部を順次設けた、第１のメンブレン、
第２の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッド、
第２の検出対象物を検出するための抗体固定化部を有する第２のメンブレン、及び
吸収パッド
をこの順に直列連結して有し、
第１の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドと、第２の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドとを分離し、第１の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドの下流側且つ第２の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドの上流側で、第２の検出対象物に対する標識粒子が固定化されたイムノクロマト法用コンジュゲートパッドの直前に第１の検出対象物に対する標識粒子を捕捉する抗体固定化部を設けた、ラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップ。 - 前記第１の検出対象物に対する標識粒子及び前記第２の検出対象物に対する標識粒子がそれぞれ平均粒径２０〜６００ｎｍのシリカナノ粒子であり、前記第１の検出対象物を検出するための抗体固定化部及び第１の検出対象物に対する標識粒子を捕捉するための抗体固定化部を設けた第１のメンブレンに対する、前記第１の検出対象物に対する標識粒子の透過率が３％以下であることを特徴とする、請求項１に記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップ。
- 前記第１の検出対象物に対する標識粒子及び前記第２の検出対象物に対する標識粒子がそれぞれ蛍光シリカナノ粒子であることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップ。
- 前記テストストリップの幅が０．５ｍｍ〜２ｍｍであり、前記試料添加用部材に添加する検出対象物を含む試料の体積が５〜４０μＬであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップ。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップの試料添加用部材に検体を添加し、前記検体に含まれる２種の検出対象物を一回の検査で検出又は定量することを特徴とする、ラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを用いた検出対象物の検出方法又は定量方法。
- 前記検出対象物がＡ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスであることを特徴とする、請求項５記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを用いた検出対象物の検出方法又は定量方法。
- 前記ラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップにおける第１の検出対象物に対する標識粒子及び第２の検出対象物に対する標識粒子がそれぞれ蛍光物質を含有する平均粒径２０〜６００ｎｍのシリカナノ粒子であり、第１の検出対象物を検出するための抗体固定化部及び第２の検出対象物を検出するための抗体固定化部に集積される前記シリカナノ粒子に励起光源を照射し、前記シリカナノ粒子が発する蛍光を電荷結合素子もしくは光電子増倍管で受光または目視で蛍光を確認することで、検体に含まれる検出対象物を検出または定量することを特徴とする、請求項５又は６記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを用いた検出対象物の検出方法又は定量方法。
- 請求項１〜４のいずれか１項記載のラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップの試料添加用部材に検体を添加し、前記検体に含まれる２種の検出対象物を一回の検査で検出又は定量するラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを用いた検出対象物の検出方法又は定量方法であって、前記第１の検出対象物に対する標識粒子及び前記第２の検出対象物に対する標識粒子がそれぞれ蛍光シリカナノ粒子であり、さらに第１の検出対象物及び第２の検出対象物を検出するための抗体固定化部における蛍光測定の際の蛍光バックグランド強度を低下させる、ラテラルフロー型イムノクロマト法用テストストリップを用いた検出対象物の検出方法又は定量方法。
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