JP5364973B2 - 生理活性物質の固定化方法 - Google Patents

Description

本発明は、生理活性物質の固定化方法に関する。

遺伝子活性の評価や疾患プロセス、薬物効果の生物学的プロセスを含む生物学的プロセスを解読するための試みは、伝統的に、ゲノミクスに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供する。プロテオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、蛋白質レベルでの発現を検出し、定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、蛋白質の翻訳後修飾、蛋白質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象の研究を含む。

膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究はますます迅速高効率（ハイスループット）化が求められている。この目的の分子アレイとしてＤＮＡチップが実用化されてきた。一方、生体機能において最も複雑で多様性の高い蛋白質の検出に関しては、プロテインチップが提唱され、最近研究が進められている。プロテインチップとは、蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ（微小な基板や粒子）表面に固定化したものを総称する。

しかし、現状のプロテインチップは一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされている為、ガラス基板や粒子において蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する検討がなされている（例えば、特許文献１参照）。

プロテインチップのシグナル検出において、信号対雑音比を低下させる原因として検出対象物質の基板への非特異的な吸着（たとえば、非特許文献１参照）が挙げられる。

固定化する方法としては各種の方法が実施されている。その一つは蛋白質の物理的吸着による固定化の方法である。この方法では、基材表面が蛋白質を吸着しやすいために、蛋白質を固定化した後に抗原や２次抗体の非特異的吸着を防止するため、吸着防止剤のコーティングが行われているが、これらの非特異的吸着防止能は十分でない。また１次抗体を固定化した後に吸着防止剤をコーティングするため固定化した蛋白質の上にコーティングされてしまい、２次抗体と反応できないという問題があった。このため、１次抗体の固定化後、吸着防止剤をコーティングすることなく、生理活性物質の非特異的吸着量の少ないバイオアッセイ用基材が求められている。

特開２００１−１１６７５０号公報 「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、2000年、p.57

本発明の目的は、蛋白質など生理活性物質の非特異吸着性が低い基体表面に対し、生理活性物質を固定化する方法を提供することである。

本発明は、以下の通りである。
（１）生理活性物質結合基を含有する化合物がホスホリルコリン基またはアルキレングリコール残基を有する高分子化合物であり、該高分子化合物を有している基体表面に、生理活性物質を濃度が０．８Ｍ以上１．４Ｍ以下であるリン酸塩溶液に溶解した溶液を接触させることにより、前記生理活性物質を前記基体表面に固定化、該生理活性物質が抗体であることすることを特徴とする生理活性物質の固定化方法。
（２）前記生理活性物質結合基がｐ−ニトロフェニルエステル基である（１）記載の生理活性物質の固定化方法。
（３）前記基体がプラスチックである（１）〜（２）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
（４）前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィン、ポリオレフィン、又はポリスチレンである
（３）記載の生理活性物質の固定化方法。
（５）前記基体がガラスである（１）〜（２）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
（６）前記基体の形状がスライド状、９６穴プレート状、３８４穴プレート状、１５３６穴プレート状、マイクロ流路、ビーズ、チューブ、又は容器である（１）〜（５）いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。

本発明によれば、蛋白質など生理活性物質の非特異吸着性が低い基体表面に対し、生理活性物質を固定化することが可能となる。

本発明は、生理活性物質をリン酸塩溶液に溶解した溶液を、生理活性物質結合基を含有する化合物を有している基体表面に接触させることにより、前記生理活性物質を前記基体表面に固定化することを特徴とする生理活性物質の固定化方法である。

本発明に用いる生理活性物質結合基を含有する化合物としては、生理活性物質結合成分を構成単位に有する高分子化合物であることが好ましい。この高分子化合物は例えば、生理活性物質結合成分を有する単量体、架橋成分を有する単量体、及びマトリックス成分を有する単量体を共重合して得られる。また、生理活性物質結合成分を有する単量体、アルキル基を有する単量体、及びマトリックス成分を有する単量体を共重合して得られる。

本発明に使用する生理活性物質結合成分を有する単量体は、特に構造を限定しないが、一般式［１］（式中R_２は水素原子またはメチル基を示し、Ｙは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基またはアルキル基を示す。Ｗは生理活性物質結合基を示す）で表される（メタ）アクリル基とＷが炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基の連鎖またはアルキル基の連鎖を介して結合した化合物であることが好ましい。アルキレンオキシ基Ｙの繰り返し数ｑは１〜２０の整数であり、繰り返し数２以上２０以下の場合は、繰り返されるアルキレンオキシ基の炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。

生理活性物質結合基Ｗとしては、ｐ−ニトロフェニルエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、コハク酸イミドエステル基、フタル酸イミドエステル基、5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミドエステル基、アルデヒド基、アミノ基、エポキシ基、等が挙げられるが、ｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基がより低いｐＨにて生理活性物質を固定化できるため好ましい。

本発明に用いる架橋成分を有する単量体としては、架橋可能な官能基を有するもので、架橋可能な官能基の反応が高分子化合物合成中に進行しないものであれば特に制限されるものではない。
架橋可能な官能基としては、例えば加水分解によりシラノール基を生成する官能基やグリシジル基などが用いられるが、より低温で架橋できることから加水分解によりシラノール基を生成する官能基が好ましい。

本発明に用いる架橋成分を有する単量体は、一般式［２］で表される単量体（式中Ｒ_３は水素原子またはメチル基を示し、Ｚは炭素数１〜２０のアルキル基を示す。ただし、Ｚはなくても構わない。Ａ_１、Ａ_２、Ａ_３の内、少なくとも１個は加水分解可能基であり、その他はアルキル基を示す）であることが好ましい。

一般式［２］で表される加水分解によりシラノール基を生成する官能基を有する単量体は、（メタ）アクリル基と加水分解によりシラノール基を生成する官能基が炭素数１〜２０のアルキル鎖を介して、または直接結合した化合物である。加水分解によりシラノール基を生成する官能基とは、水と接触すると容易に加水分解を受けシラノール基を生成する基であり、例えば、ハロゲン化シリル基、アルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基等を挙げることができる。なかでもアルコキシシリル基がシラノール基を生成し易い点から好ましい。

アルコキシシリル基を含有する単量体としては、例えば、３−（メタ）アクリロキシプロペニルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルビス（トリメチルシロキシ）メチルシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリス（メトキシエトキシ）シラン、８−（メタ）アクリロキシオクタニルトリメトキシシラン、１１−（メタ）アクリロキシウンデニルトリメトキシシラン等の（メタ）アクリロキシアルキルシラン化合物等を挙げることができる。なかでも３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシランがホスホリルコリン基を有する単量体との共重合性が優れている点、入手が容易である点等から好ましい。これらのアルコキシシリル基を有する単量体は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。

本発明に用いるマトリックス成分を有する単量体は特に構造を限定しないが、一般式［３］で表される（メタ）アクリル基結合した化合物であることが好ましい。（式中Ｒ₁は水素原子またはメチル基を示し、Xはホスホリルコリン基を有する基又はアルキレングリコール残基を有する基を示す）。

一般式［３］でホスホリルコリン基を有する単量体としては、例えば２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン等を挙げられるが、入手性から２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。

一般式［３］においてアルキレングリコール残基は、例えばアルキレングリコール残基Ｔの繰り返しからなる基であり、繰り返し数は、１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。繰り返し数２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Ｔの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
アルキレングリコール残基Ｔの炭素数は１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、更に好ましくは２〜４であり、より更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。

アルキレングリコール残基を有する単量体としては、例えばメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート等の水酸基の一置換エステルの（メタ）アクリレート類、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール （メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール （メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール （メタ）アクリレート等が挙げられるが、入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。

本発明に使用するアルキル基を有する単量体としては、メタクリル酸の炭素数１〜１５のアルキルエステルが好ましく用いられ、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−プロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルメタクリレート 、シクロヘキシルメタクリレートなどを挙げることができ、これらのアルキル基を有する単量体の１種または２種以上を用いることができる。

本発明に使用する高分子化合物の合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、少なくとも生理活性物質結合成分を有する単量体、架橋成分を有する単量体およびマトリックス成分を有する単量体を含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。また、生理活性物質結合成分を有する単量体、アルキル基を有する単量体およびマトリックス成分を有する単量体を含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。

溶媒としてはそれぞれの単量体が溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。プラスチック基材に該高分子化合物を塗布する場合は、エタノール、メタノールが基材を変性させないため好ましい。

重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，
２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。

本発明に使用する高分子化合物の化学構造は、各単量体が共重合されたものであれば、その結合方式がランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。

本発明に使用する高分子化合物の分子量は、高分子化合物と未反応の単量体との分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。

基体表面への高分子化合物の被覆は、例えば有機溶剤に高分子化合物を０．００１〜１０重量％濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で基体表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。その後、架橋可能な官能基に応じた任意の方法で高分子の主鎖同士を架橋させる。架橋可能な官能基が加水分解によりシラノール基を生成する官能基の場合の高分子化合物の被覆については、有機溶剤中に水を含有させた混合溶液を用いてもよい。含有される水により加水分解が生じ、該合成高分子中にシラノール基が生成し、さらに加熱することにより主鎖同士が結合され、高分子化合物が不溶になる。

含水量が少ないとシラノール基の生成が不十分で、架橋結合が弱くなる。一方、含水量が多くなると高分子化合物が溶媒に不溶となる恐れがある。理論上加水分解によりシラノール基を生成するのに必要な水が含有されていれば十分であるが、溶液の調製の容易さを考えると、含水量が約０．０１〜１５重量％程度のものが好ましい。

有機溶剤としてはエタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン等の単独溶媒またはこれらの混合溶剤が使用される。中でも、エタノール、メタノールがプラスチック基体を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。また、溶液中で高分子化合物を加水分解させる場合にも、水と任意の割合で混ざるので好ましい。

本発明の高分子化合物を溶解した溶液を基体表面に塗布した後、乾燥させる工程において、高分子化合物中のシラノール基は、他の高分子化合物中のシラノール基、水酸基、アミノ基等と脱水縮合して架橋を形成する。さらに基体表面に水酸基、カルボニル基、アミノ基などがある場合も同様に脱水縮合し、基体表面と化学的に結合することができる。シラノール基の脱水縮合により形成される共有結合は加水分解されにくい性質があるので、基体表面に被覆された高分子化合物は容易に溶解したり、基体から脱離してしまうことはない。シラノール基の脱水縮合は加熱処理により促進される。高分子化合物が熱により変成されない温度範囲内、例えば、６０〜１２０℃で５分間〜２４時間加熱処理するのが好ましい。

本発明に使用する基体の素材は、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができるが、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックが好ましく、熱可塑性樹脂がより好ましい。

熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、たとえばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。

基体表面と表面に被覆される高分子化合物との密着性を高めるために、基体表面を活性化することが好ましい。活性化する手段としては酸素雰囲気下、アルゴン雰囲気下、窒素雰囲気下、空気雰囲気下などの条件下でプラズマ処理する方法、ArF、KrFなどのエキシマレーザーで処理する方法があるが、酸素雰囲気下でプラズマ処理する方法が好ましい。

高分子化合物を基体に塗布することで容易に基体に生理活性物質の非特異的吸着を抑制された生理活性物質固定化基体を作製できる。さらに該高分子化合物を架橋することで、基体上の高分子化合物に不溶性を付与することができる。これらのことより、該高分子化合物を塗布した基体はエライザ用プレート、プロテインチップ用基板に好適に用いることができる。

本発明の固定化方法を使用して各種の生理活性物質を固定化することができる。固定化する生理活性物質は核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、抗原、レクチン、糖タンパク、糖鎖などがある。

本発明に使用するリン酸塩溶液は、各種リン酸塩が０．１Ｍ以上４．０Ｍ以下で溶解していることが好ましい。より好ましくは０．６Ｍ以上２．４Ｍ以下、もっとも好ましくは０．８Ｍ以上１．４Ｍ以下である。濃度が下限値未満では生理活性物質が十分に固定化できずシグナルが検出されないという問題が発生する恐れがあり、濃度が上限値を超えると生理活性物質が変性を起こし生理活性物質が特異的な反応を起こさず機能しないという問題が発生する恐れがある。

本発明に使用するリン酸塩は、特に限定されるものではないが、リン酸アルミニウム、リン酸アンモニウム、リン酸カリウムリン酸ナトリウム、リン酸インジウム、リン酸サマリウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素カルシウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素アンモニウム、リン酸水素バリウム、リン酸二アンモニウム、リン酸二カリウムリン酸二水素２−アミノエチル、リン酸二水素アンモニウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素マンガン、リン酸二水素リチウム、リン酸二バリウム、リン酸ヒドロキシアンモニウム、リン酸尿素、リン酸リチウム、リン酸ジフェニル、リン酸トリエチル、リン酸トリオクチル、リン酸トリフェニル、リン酸トリブチル、リン酸トリメチル、リン酸ホウ素、リン酸マグネシウム、などが挙げられる。特に好ましくはリン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウムである。

前記リン酸塩溶液に、生理活性物質を溶解した溶液を基体に接触させることにより、容易に生理活性物質を固定化できる。

生理活性物質を溶解した溶液を基体表面に接触させる方法は、基体の形状にさまざまであるが、たとえば９６穴プレートの場合は溶液をそれぞれのウェルに分注するだけでよい。スライド形状の場合は点着により接触することが好ましい。

（ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の合成）
０．０１molのポリエチレングリコールモノメタクリレート（Ｂｌｅｎｍｅｒ ＰＥ−２００（ｎ＝４） 日本油脂(株)製）を２０ｍLのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作成しておいた０．０１molのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Aldrich製）と０．０１molのトリエチルアミン（和光純薬(株)製）及びクロロホルム２０ｍLの均一溶液をゆっくりと滴下した。−３０℃にて１ｈｒ反応させた後、室温でさらに２ｈｒ溶液を攪拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）を得た。得られたモノマーを重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、エチレングリコール残基が４．５単位含まれていることを確認した。

（高分子化合物の合成例１）
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）、ブチルメタアクリレート（ＢＭＡ）、ＭＥＯＮＰをそれぞれ順に０．２５ｍｏｌ／Ｌ、０．７０ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌになるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにＡＩＢＮを０．００２ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で３時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテルとクロロホルムの混合溶媒中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を１Ｈ―ＮＭＲで測定し、１．４６および１．６５ｐｐｍ付近に現れるＢＭＡのメチレンに帰属されるピーク、３．３４ｐｐｍ付近に現れるＭＰＣのトリメチルに帰属されるピーク、７．６および８．４ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。

（高分子化合物の合成例２）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（PEGMA平均Mn＝約１１００ Aldrich製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ GELEST，INC.製）をそれぞれ順に０．４５ｍｏｌ／Ｌ、０．０２５ｍｏｌ／Ｌ、０．０２５ｍｏｌ／Ｌ、になるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ 和光純薬(株)製）を０．００２ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で１時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１６ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．３５ｐｐｍ付近に現れるPEGMAの末端メトキシ基に帰属されるピーク、７．６および８．４ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。

（基板の作製）
飽和環状ポリオレフィン樹脂を96穴プレート形状（1ウェルの寸法：底面直径６．４ｍｍ×高さ１１ｍｍ）に加工して固定基板を作成した。酸素雰囲気下のプラズマ処理によって基板表面に酸化処理を施した。この固定基板を高分子化合物の合成例１、２にて得られた高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液に浸漬後、６５℃で４時間加熱乾燥することにより、合成例１および２で合成された高分子化合物層を導入した。合成例１の高分子化合物にて作製された基板を基板１、合成例２の高分子化合物にて作製された基板を基板２とする。

（実験１）：１次抗体の固定化とリン酸塩濃度の関係を調べた。
《実施例１、２》
（固定化溶液の調整）
１．２Ｍのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液中に一次抗体である抗マウスＩｇＧ２ａが１．２μｇ／ｍｌになるように調製された溶液を作製した。

（固定化処理）
工程１
作製した固定化溶液を基板１（実験例１）又は基板２（実施例２）に１００ｕｌ／ウェルの割合で分注し、室温で４時間静置した。固定化反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄した。

工程２
その後、基板を０．１ｍｏｌ／リットルのエタノールアミン（和光純薬製、鹿特級）、０．１ｍｏｌ／リットルのトリスバッファ（ＳＩＧＭＡ製）水溶液（ｐＨ９．５）に１時間浸漬することにより残りのＭＥＯＮＰ部を失活させた。

工程３（抗原抗体反応１）
ＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を１リットル中９．６ｇを溶解したバッファ）で１０％に希釈したＦＢＳ（子牛血清）溶液を作製した。この溶液中に抗原であるマウス IgG2aを添加し２０ｎｍｏｌ／リットルとした溶液を作製した。この溶液をＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を１リットル中９．６ｇを溶解したバッファ）で１０％に希釈したＦＢＳ（子牛血清）で１倍、２倍、３倍、４倍希釈溶液を作製した。これらの希釈溶液および抗原であるマウス IgG2aを含まない１０％ＦＢＳ溶液を３７℃にて２時間、基板と接触させることにより抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄した。

工程４（抗原抗体反応２）
洗浄後、二次抗体であるＨＲＰ標識抗マウス IgG2aをＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を１リットル中９．６ｇを溶解したバッファ）に添加することにより２０ｎｍｏｌ／リットルの溶液を作製した。この溶液と基板とを３７℃にて２時間、抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄した。

工程５（発色）
最後にＨＲＰ発色試薬である、ＴＭＢＺ発色キット（秋田住友ベーク製）を用いて発色反応を行った。

発色反応を行った。基板について４５０ｎｍの吸光量測定を行った。吸光量の測定には、ＴＥＣＡＮ社製プレートリーダーを用いた。
シグナル強度の結果を表２示す。

《比較例１、２》
（固定化溶液の調整）
１．２Ｍのホウ酸（和光純薬製：０２７−０２１９１）水溶液中(pH8.5)に一次抗体である抗マウスＩｇＧ２ａが１．２μｇ／ｍｌになるように調製された溶液を作製した。
以下実施例１、２と同様な工程により評価した。結果を表２に示す。

《比較例３，４》
（固定化溶液の調整）
１．２Ｍのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液のかわりに０．０５Mのリン酸水素二カリウム水溶液を用いた以外は実施例１，２と同様に操作した。結果を表2に示す。

実施例１、２および比較例１、２を比較することにより、リン酸塩溶液を使用した実施例１、２が抗原の量に応じたシグナルが検出できたため１次抗体を固定化できることが確認できた。また比較例３，４よりリン酸塩濃度が高いほうがよる高いシグナルが得られることが確認できた。

Claims (6)

1. 生理活性物質結合基を含有する化合物がホスホリルコリン基またはアルキレングリコール残基を有する高分子化合物であり、該高分子化合物を有している基体表面に、生理活性物質を濃度が０．８Ｍ以上１．４Ｍ以下であるリン酸塩溶液に溶解した溶液を接触させることにより、前記生理活性物質を前記基体表面に固定化、該生理活性物質が抗体であることすることを特徴とする生理活性物質の固定化方法。
2. 前記生理活性物質結合基がｐ−ニトロフェニルエステル基である請求項１記載の生理活性物質の固定化方法。
3. 前記基体がプラスチックである請求項１〜２いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
4. 前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィン、ポリオレフィン、又はポリスチレンである請求項３記載の生理活性物質の固定化方法。
5. 前記基体がガラスである請求項１〜２いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。
6. 前記基体の形状がスライド状、９６穴プレート状、３８４穴プレート状、１５３６穴プレート状、マイクロ流路、ビーズ、チューブ、又は容器である請求項１〜５いずれか記載の生理活性物質の固定化方法。