JP5211559B2

JP5211559B2 - 熱安定性を有する変異型ビリルビンオキシダーゼ

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Publication number: JP5211559B2
Application number: JP2007160964A
Authority: JP
Inventors: 英之汲田; 裕一戸木田; 義夫後藤
Original assignee: Sony Corp
Current assignee: Sony Corp
Priority date: 2006-12-07
Filing date: 2007-06-19
Publication date: 2013-06-12
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Description

本発明は、熱安定性を有する変異型ビリルビンオキシダーゼに関する。より詳しくは、酵素活性に加えて耐熱性の程度が所定レベル以上の変異型ビリルビンオキシダーゼに関する。

「酵素」は、生命の維持に係わる多くの反応を生体内の温和な条件下で円滑に進める生体内触媒である。この酵素は、生体内で代謝回転し、生体内で必要に応じて生産されて、その触媒機能を発揮する。

現在、この酵素を生体外で利用する技術が、既に実用化されたり、あるいは実用化に向けた検討が行われたりしている。例えば、有用物質の生産、エネルギー関連物質の生産、測定又は分析、環境保全、医療などの様々な技術分野において、酵素の利用技術が進展している。比較的近年では、燃料電池の一種である酵素電池（例えば、特許文献１参照）、酵素電極、酵素センサー（酵素反応を利用して化学物質を計測するセンサー）などの技術も提案されている。

この酵素の化学的本体はタンパク質であるので、酵素は、熱やｐＨの程度によって変性する性質を有する。このため、酵素は、金属触媒などの他の化学的触媒に比べて生体外での安定性が低い。従って、酵素を生体外で利用する場合は、環境の変化に対して酵素をより安定的に働かせて、その活性を持続させるようにすることが重要である。

酵素を生体外で利用する場合、酵素自体の性質や機能を人工的に改変させる方法や酵素の働く場所の環境を工夫する方法などのアプローチが採用されることになる。前者の方法では、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を人工的に変化させ、この変化させた遺伝子を大腸菌等の生物の中で発現させることによって人工的に変異したタンパク質を作製し、そして、利用目的にあった機能や性質を備える変異型タンパク質を選別（スクリーニング）することが一般的に行われている（例えば、特許文献２参照）。

ここで、「ビリルビンオキシダーゼ（Bilirubin oxidase）」は、ビリルビンをビリベルジンに酸化する反応を触媒する酵素であり、マルチ銅オキシダーゼ（複数の銅イオンを活性中心に持つ酵素の総称）に属する酵素の一種である。この酵素は、従来から臨床検査の場面における肝機能等の検査試薬（血清中のビリルビンの測定試薬）として広く使用されているが、近年では、上記酵素電池のカソード（Cathode、正極）側において、酸素の電気化学的４電子還元反応を実現する触媒としても注目されている。

このビリルビンオキシダーゼを生体外での利用の期待が高まっている中で、熱安定性のより優れた同酵素を追究する技術（例えば、特許文献３参照）、同酵素の酵素活性をより長期にわたって安定的に持続させるための技術も提案されている（特許文献４参照）。
特開２００４−７１５５９号公報。特開２００４−２９８１８５号公報。特開２００６−６８００３号公報。特開２０００−８３６６１号公報。

ビリルビンオキシダーゼの生体外利用を踏まえると、その熱安定性をさらに向上させる必要がある。しかし、このビリルビンオキシダーゼは、６０℃、１時間の熱処理により酵素活性が２０％以下にまで低下してしまうという問題を抱えており、例えば、酵素電池の分野において、利用される酵素群の中では最も熱安定性が低く、また、負極側の酵素（例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ）に比べて著しく熱安定性が低いため、酵素電池の実用化の大きな障害となっている。また、このビリルビンオキシダーゼを同じマルチ銅オキシダーゼであるラッカーゼに代替するという選択枝もあるが、このラッカーゼも耐熱性に問題がある上に、室温、中性ｐＨ領域で酵素活性がビリルビンオキシダーゼと比較して著しく低いという問題がある。

そこで、本発明は、ビリルビンオキシダーゼの生体外での広範な利用可能性を視野に入れ、ビリルビンオキシダーゼの酵素活性やその耐熱性の程度が所定レベル以上の変異型ビリルビンオキシダーゼを提供することを主な目的とする。

本発明では、不完全糸状菌Myrothecium verrucaria（以下、M. verrucaria）由来ビリルビンオキシダーゼの配列番号１の野生型アミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が、耐熱性を向上し得るように欠失、置換、付加若しくは挿入されている変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ、より好適には、例えば、変性温度Ｔ_ｍ値が７２℃以上である変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼである。さらには、６０℃、１時間加熱処理後の残存酵素活性率（residual activity）が２０％以上である変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼである。例えば、配列番号２〜４５及び５７〜６７のアミノ酸配列を有する変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼを提供する。なお、前記不完全糸状菌は、例えば、M. verrucaria ＮＢＲＣ（ＩＦＯ）６１１３株を採用することができる。また、変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼを酵母Pichia methanolicaを宿主として発現させると、大量発現が可能である。

ここで、配列番号２に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは、配列番号１の野生型アミノ酸配列のＮ末端から４９番目のグルタミンがリジンに置換されている（以下、略記号Q49K）。同様に、配列番号３に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは７２番目のグルタミンがグルタミン酸に置換されており（Q72E）、配列番号４に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは８１番目のバリンがロイシンに置換されており（V81L）、配列番号５に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは１２１番目のチロシンがセリンに置換されており（Y121S）、配列番号６に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは１４７番目のアルギニンがプロリンに置換されており（R147P）、配列番号７に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは１８５番目のアラニンがセリンに置換されており（A185S）、配列番号８に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは２１０番目のプロリンがロイシンに置換されており（P210L）、配列番号９に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは２２５番目のフェニルアラニンがバリンに置換されており（F225V）、配列番号１０に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは２５８番目のグリシンがバリンに置換されており（G258V）、配列番号１１に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは２６４番目のアラニンがバリンに置換されており（A264V）、配列番号１２に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは３２２番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換されており（D322N）、配列番号１３に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは３３５番目のアスパラギンがセリンに置換されており（N335S）、配列番号１４に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは３５６番目のアルギニンがロイシンに置換されており（R356L）、配列番号１５に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは３５９番目のプロリンがセリンに置換されており（P359S）、配列番号１６に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは３７０番目のアスパラギン酸がチロシンに置換されており（D370Y）、配列番号１７に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは３７１番目のバリンがアラニンに置換されており（V371A）、配列番号１８に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは４２３番目のプロリンがロイシンに置換されており（P423L）、配列番号１９に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは４６８番目のメチオニンがバリンに置換されており（M468V）、配列番号２０に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは４７６番目のロイシンがプロリンに置換されており（L476P）、配列番号２１に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは５１３番目のバリンがロイシンに置換されている（V513L）。また、配列番号５７に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは１０３番目のアラニンがプロリンに置換されており（A103P）、配列番号５８に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは２７０番目のチロシンがアスパラギン酸に置換されており（Y270D）、配列番号５９に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは２９９番目のセリンがアスパラギンに置換されており（S299N）、配列番号６０に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは３８１番目のバリンがロイシンに置換されており（V381L）、配列番号６１に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは４１８番目のアラニンがスレオニンに置換されており（A418T）、配列番号６２に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは４３７番目のアルギニンがヒスチジンに置換されている（R437H）。

また、配列番号２２に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは、配列番号１の野生型アミノ酸配列のＮ末端から４９番目のグルタミンがリジンに、３７１番目のバリンがアラニンに置換されている（以下、略記号Q49K/V371A）。同様に、配列番号２３に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは７２番目のグルタミンがグルタミン酸に、２１０番目のプロリンがロイシンに置換されており（Q72E/P210L）、配列番号２４に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは７２番目のグルタミンがグルタミン酸に、２６４番目のアラニンがバリンに置換されており（Q72E/A264V）、配列番号２５に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは８１番目のバリンがロイシンに、１４７番目のアルギニンがプロリンに置換されており（V81L/R147P）、配列番号２６に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは８１番目のバリンがロイシンに、４２３番目のプロリンがロイシンに置換されており（V81L/P423L）、配列番号２７に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは１２１番目のチロシンがセリンに、４７６番目のロイシンがプロリンに置換されており（Y121S/L476P）、配列番号２８に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは１８５番目のアラニンがセリンに、２５８番目のグリシンがバリンに置換されており（A185S/G258V）、配列番号２９に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは２１０番目のプロリンがロイシンに、２６４番目のアラニンがバリンに置換されており（P210L/A264V）、配列番号３０に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは２２５番目のフェニルアラニンがバリンに、３２２番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換されており（F225V/D322N）、配列番号３１に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは２２５番目のフェニルアラニンがバリンに、４７６番目のロイシンがプロリンに置換されており（F225V/L476P）、配列番号３２に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは２６４番目のアラニンがバリンに、３５６番目のアルギニンがロイシンに置換されており（A264V/R356L）、配列番号３３に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは２６４番目のアラニンがバリンに、４７６番目のロイシンがプロリンに置換されており（A264V/L476P）、配列番号３４に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは３２２番目のアスパラギン酸がアスパラギンに、４６８番目のメチオニンがバリンに置換されており（D322N/M468V）、配列番号３５に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは３３５番目のアスパラギンがセリンに、４２３番目のプロリンがロイシンに置換されており（N335S/P423L）、配列番号３６に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは３５６番目のアルギニンがロイシンに、４７６番目のロイシンがプロリンに置換されており（R356L/L476P）、配列番号３７に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは３７１番目のバリンがアラニンに、５１３番目のバリンがロイシンに置換されている（V371A/V513L）。

さらに、配列番号３８に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは、配列番号１の野生型アミノ酸配列のＮ末端から４９番目のグルタミンがリジンに、３７１番目のバリンがアラニンに、５１３番目のバリンがロイシンに置換されている（以下、略記号Q49K/V371A/V513L）。同様に、配列番号３９に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは７２番目のグルタミンがグルタミン酸に、２１０番目のプロリンがロイシンに、２６４番目のアラニンがバリンに置換されており（Q72E/P210L/A264V）、配列番号４０に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは８１番目のバリンがロイシンに、３３５番目のアスパラギンがセリンに、４２３番目のプロリンがロイシンに置換されており（V81L/N335S/P423L）、配列番号４１に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは１２１番目のチロシンがセリンに、３７０番目のアスパラギン酸がチロシンに、４７６番目のロイシンがプロリンに置換されており（Y121S/D370Y/L476P）、配列番号４２に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは１８５番目のアラニンがセリンに、２６４番目のアラニンがバリンに、４７６番目のロイシンがプロリンに置換されており（A185S/A264V/L476P）、配列番号４３に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは２２５番目のフェニルアラニンがバリンに、３２２番目のアスパラギン酸がアスパラギンに、４６８番目のメチオニンがバリンに置換されており（F225V/D322N/M468V）、配列番号４４に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは２２５番目のフェニルアラニンがバリンに、３７０番目のアスパラギン酸がチロシンに、４７６番目のロイシンがプロリンに置換されており（F225V/D370Y/L476P）、配列番号４５に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは２６４番目のアラニンがバリンに、３５６番目のアルギニンがロイシンに、４７６番目のロイシンがプロリンに置換されている（A264V/R356L/L476P）。また、配列番号６３に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは２６４番目のアラニンがバリンに、２９９番目のセリンがアスパラギンに、４７６番目のロイシンがプロリンに置換されており（A264V/S299N/L476P）、配列番号６４に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは２６４番目のアラニンがバリンに、３８１番目のバリンがロイシンに、４７６番目のロイシンがプロリンに置換されており（A264V/V381L/L476P）、配列番号６５に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは２６４番目のアラニンがバリンに、４１８番目のアラニンがスレオニンに、４７６番目のロイシンがプロリンに置換されており（A264V/A418T/L476P）、配列番号６６に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは２６４番目のアラニンがバリンに、４３７番目のアルギニンがヒスチジンに、４７６番目のロイシンがプロリンに置換されている（A264V/R437H/L476P）。さらに、配列番号６７に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは１０３番目のアラニンがプロリンに、２６４番目のアラニンがバリンに、２７０番目のチロシンがアスパラギン酸に、４７６番目のロイシンがプロリンに置換されている（A103P/A264V/Y270D/L476P）。

なお、本発明において、「加熱処理後の残存酵素活性率（residual activity）」は、「酵素活性残存率」、あるいは「酵素活性維持率」と称してもよく、酵素に対して所定の加熱処理を施したときに、その前後で活性がどのように変化するかを表した値である。すなわち、加熱処理の前後において、同一条件で酵素活性測定を行い、加熱処理後の活性値が処理前に比べてどれだけ存在するかを百分率で表した値である。本発明において基準とする「加熱処理」の条件は、緩衝液中６０℃での１時間静置処理であり、この加熱処理前
後における、前記酵素活性値の比を百分率で表している。

また、本発明における「変性温度Ｔ_ｍ」とは、示差走査マイクロカロリメトリーの測定によって求めた値である。この測定における標品としての酵素溶液の昇温速度は１時間当たり６０℃で行った。

本発明に係る変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは、加熱処理後においても酵素活性を所定レベル以上維持することができる。

次に、本発明の具体的実施例について、実験結果に基づき説明する。

（実施例１）：M. verrucaria由来ＢＯのｃＤＮＡクローニング
１-１：M. verrucariaの培養及びメッセンジャーＲＮＡの単離
本実施例で使用したM. verrucaria NBRC(IFO)6113株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部から分譲を受けた。入手した乾燥菌体を、復水液（ポリペプトン：0.5％、酵母エキス：0.3％、MgSO₄・7H₂O：0.1％）に懸濁させ、この懸濁液をポテトデキストロース寒天（PDA）プレート（ポテトデキストロース：2.4％、アガロース：1.5％）に接種した。これを５〜７日間、室温で培養を行ったところ、PDAプレートの表面は白色の菌糸により覆われた。これをスパチュラでかき集めて-80℃で保存した。菌体の収量はPDAプレート１枚（直径９cm）当たり50〜60 mg（湿重量）であった。

メッセンジャーＲＮＡ（以下、ｍＲＮＡ）は、トータルＲＮＡ（mRNA、リボソームRNA、転移RNAの混合物）として抽出した。約100 mgのM. verrucariaの凍結菌体粉末から100μｇ（UV吸収により定量）のトータルＲＮＡが得られ、その１／４量を次の逆転写PCRの一反応分の鋳型RNAとして用いた。

１-２：逆転写PCRによるＢＯ遺伝子断片の作製。
逆転写PCRは、OneStep RT-PCR Kit（キアゲン）を用いて、上記トータルＲＮＡを鋳型として行った。逆転写PCRに用いるPCRプライマーは、既報のＢＯのcDNAの塩基配列を基に、以下の「表１」に示すように設計した。

得られたPCR産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、1700bp付近に強いバンドが確認できた。この1700bpというサイズから目的のＢＯ遺伝子を含む増幅断片であると推察されたので、この断片をアガロースゲルスラブより切り出して、次の工程に用いた。

１-３：pYES2/CTベクターへのＢＯ遺伝子断片の組み込み
得られた1700bpの増幅断片は制限酵素HindIII、XbaIにより消化した後、同酵素で消化したpYES2/CTプラスミドベクター（インビトロジェン）と連結した。この際、制限酵素処理によるpYES2/CTベクターの5’突出末端の脱リン酸化処理にはCalf intestine由来アルカリフォスファターゼ（タカラバイオ）を、挿入断片とpYES2/CTベクターの連結反応にはT4 DNAリガーゼ（タカラバイオ）をそれぞれ用いた。

ここで得られる反応産物によりE. coli TOP10株（インビトロジェン）を形質転換して、LB/Amp寒天平板培地（組成は表２参照）に接種した。一晩培養後、アンピシリンに対する薬剤耐性を有する形質転換体のコロニーが得られた。これを3mlのLB/Amp培地で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドベクターを単離した。

得られたプラスミドベクターのＢＯ遺伝子を含む挿入部分の塩基配列を調べたところ、配列番号４８であった。

配列番号４８に示した塩基配列は１７１９ｂｐであり、５７２残基分のアミノ酸に相当する。一方、成熟型のM. verrucaria由来ＢＯは、５３４残基のアミノ酸から構成される（配列番号１）。ここで、この差分にあたる３８残基のアミノ酸はＮ末端側に存在し、そのC末端側に存在するタンパク質の分泌を司るシグナルペプチドである。この部分は翻訳後、分泌に際して切断される。

１−４:AAA配列の挿入
次に、１-３で作製したプラスミドベクターに対して、組換えタンパク質の発現量を増加させるように、その塩基配列の一部に改良を施した。具体的には、開始コドン(ATG)より上流側（5’-側）の3塩基を以下のように変更した。

この3塩基の変更には、以下の表４に示すPCRプライマーを用いて、Quick-change Mutagenesis Kit（ストラタジーン）によって行った。詳細な実験手順は付属のマニュアルに従った。

塩基配列の確認は、変更箇所を含むＢＯ遺伝子の全領域において行い、設計したとおりに変更されていることを確認した。以降、配列変更後のプラスミドベクターを「pYES2/CT-BOベクター」と称する。

（実施例２）：S. cerevisiaeによる組換えＢＯの分泌発現系の構築
２−１：pYES2/CT-BOベクターによるS. cerevisiaeの形質転換。
次に、上記pYES2/CT-BOベクターを用いて、S. cerevisiaeの形質転換を行った。S. cerevisiaeは、pYES2/CTベクターと共に市販されているINVSc1株（インビトロジェン）を用いた。ここでは、酢酸リチウム法によりS. cerevisiaeの形質転換を行った。詳細な実験手順はpYES2/CTベクターに付属のマニュアルを参考にした。形質転換酵母の選択には、SCGlu寒天平板培地(組成は表５を参照)を用いた。

２−２：組換えＢＯの分泌発現。
pYES2/CT-BOベクターによるS. cerevisiaeの形質転換体のコロニーを15 ml のSCGlu液体培地に接種し、14〜20時間、30℃で震とう培養を行った。得られた菌体は一旦、遠心分離（1500×g、室温、10分）により沈澱させた。

ここで、SCGlu液体培地を捨てた後、得られた菌体はSCGal培地（組成は表６を参照）50 mlに濁度（OD₆₀₀）が約0.5になるように加えた。これを10−14時間、25℃で震盪培養を行った。培養後は遠心分離により菌体を除き、残りの培養液を5 ml程度まで濃縮して、20 mM リン酸Naバッファー（pH 7.4）に対して透析を行った。

組換えＢＯの精製は、Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィー（His-trap HP（1 ml）、アマシャムバイオサイエンス）により行った。精製の方法は付属のマニュアルに従った。得られた精製後の組換えBOはSDS-PAGE等により純度１００%であることを確認した。これの収量は１Ｌ培養に換算するとそれぞれ0.36 mgであった。

（実施例３）：分子進化工学的手法による組換えＢＯの耐熱化スクリーニング
次に、分子進化工学的手法による組換えＢＯの耐熱化スクリーニングを行った。具体的には、Error-prone PCRを用いたランダム変異の挿入、変異体のＢＯ遺伝子ライブラリの作製、変異体遺伝子ライブラリによるS. cerevisiaeの形質転換、96ウェルプレートを用いた耐熱化スクリーニングを行った。

３-１：Error-prone PCRを用いたランダム変異の挿入。
pYES2/CT-BOベクターを鋳型としてError-prone PCRによるランダム変異の挿入を行った。ここで用いるN末端側のPCRプライマーは開始コドンより２１８塩基対下流に存在する唯一のBglIIサイト（AGATCT）を含むように設計した。また、C末端側はXbaIサイト（TCTAGA）を含むよう以下のように設計した（表７参照）。

これらのプライマーを用いて、GeneMorph PCR Mutagenesis Kit（ストラタジーン）によりError-prone PCRを行った。反応条件は同キットに付属のマニュアルを参考にして設定した。

得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動によって分析したところ、約15 00bpのPCR断片を得ることができた。得られたPCR産物の収量から計算される変異の頻度は、1000bp当たり1.5 箇所であった。計算方法は同キットに付属のマニュアルを参照した。

３−２：変異体のＢＯ遺伝子ライブラリの作製。
上記３-１で作製した、ランダムに変異が挿入されたＢＯ遺伝子断片は、１−３で示した方法と同様の方法でpYES2/CT-BOベクターのBglII-XbaIサイトへの組み込み、E. coliTOP10株の形質転換を行った。ここでは約6600個の形質転換体のコロニー、即ち、約6600種の変異体遺伝子を含むプラスミドのライブラリを得た。

３-３：変異体BO遺伝子ライブラリによるS. cerevisiaeの形質転換。
上記３−２で示した方法によって、変異体遺伝子ライブラリによるS. cerevisiae INVSc1株（インビトロジェン）の形質転換を行った。S. cerevisiae INVSc1のコンピテントセルは、酢酸リチウム法によって作製した。得られた形質転換体のライブラリに対して96ウェルプレートを用いた耐熱化スクリーニングを行う。

３-４：96ウェルプレートを用いた耐熱化スクリーニング実験。
SCGlu培地を96ウェルプレートに150mlずつ分注する。上記で作製した形質転換酵母ライブラリのコロニーを個々のウェルに１つずつ接種した。これを20〜23時間、27℃で震盪培養を行った。この培養後、それぞれのウェルの濁度は目視によるとほぼ一定となった。

この段階で一度96ウェルプレートごと遠心分離（1500×g, 20℃, 10分）を行い、菌体を一旦沈殿させた。それぞれのウェルの底に沈澱した菌体をかき乱さないように、SCGlu培地を完全に取り除いた。ここへSCGal培地を180 ml分注して、さらに8時間、27℃で震盪培養を行った。この培養後、再び遠心分離（1500×g, 20℃, 10分）を行い、菌体を沈澱させた。この上澄み液100 mlを別の新しい96ウェルプレートに移し変えた。ここで熱処理を行う場合は、この96ウェルプレート上のサンプル溶液をセロファンテープでシールした後、80℃のドライオーブンで15分間放置した。熱処理後は5分間、氷浴上で急冷した後、室温で15分放置した。これに等量の20 mM ABTS溶液（100 mM Tris-HCl pH 8.0）を混合した。ウェル内の溶液がABTSの反応に伴って緑色に呈色する様子を反応開始1時間後まで観察した。比較とした野生型に比較してABTSの呈色が強いものをピックアップして、それに相当する菌体を20%グリセロールストックとして-80℃で保存した。

図１に耐熱化スクリーニングの一例を示す。図１は、反応開始１時間後のABTSの呈色の様子を示している。中央の２列（左から６，７列目）のすべては比較としての野生型の組換えＢＯであり、６列目は他のウェルと同様に熱処理を行ったものである。７列目は野生型の組換えＢＯの熱処理のない場合の比較である。

図１によると、四角囲い部分のウェルが6列目の野生型のどれよりも強くABTSが呈色していることがわかる。これらのウェルでは、野生型組換えBOに比較して熱安定性が向上した変異体BOが発現していると考えられる。

本実施例では３−４で示した耐熱化スクリーニングを96ウェルプレートで50枚、計4000検体について行い、耐熱化変異体ＢＯを発現したと考えられる形質転換酵母を２６個選出した。

得られた２６個の形質転換酵母からプラスミドベクターを抽出し、ＢＯ遺伝子領域の塩基配列の解析を行った結果、以下の２６種の変異がＢＯ遺伝子に挿入されていることが判明した。すなわち、上述した略記号Q49K, Q72E, V81L, Y121S, R147P, A185S, P210L, F225V, G258V, A264V, D322N, N335S, R356L, P359S, D370Y, V371A, P423L, M468V, L476P, V513L, A103P, Y270D, S299N, V381L, A418T, R437Hの変異が確認された。

（実施例４）：耐熱化変異体のPichia methanolicaによる大量発現
以下では、耐熱化スクリーニングによって発見した２６種の耐熱化変異体候補を大量に発現するために、新たに酵母Pichia methanolica(以下、P. methanolica)を用いた組換えＢＯの分泌発現系の構築を行い、野生型および耐熱化変異体候補の大量発現を試みた。

４−１：pMETaB-BOベクターの作製及びそれによるP. methanolicaの形質転換
まず、P. methanolica の発現系で用いる発現ベクターの作製を行った。ここで用いるpMETaBベクター（インビトロジェン）にはS. cerevisiae由来の分泌シグナル：α因子が含まれるので、その下流に成熟ＢＯに相当する遺伝子を挿入した。成熟ＢＯ遺伝子領域のPCRによる増幅には、鋳型としてpYES2/CT-BOベクターを、プライマーとして以下の「表８」に示すものを用いて行った。

得られた1500bpの増幅断片は制限酵素EcoRI、SpeIにより消化した後、同酵素で消化したpMETaBベクターと連結した。この連結反応の際、１−３で示した処理と同様の処理を反応物に施した。作製したＢＯ遺伝子領域を含むpMETaBベクター（以降、pMETaB-BOベクターとする）は、挿入したＢＯ遺伝子部分の塩基配列の確認を行った。変異体ＢＯの場合は、ここで作成したpMETaB-BOベクターに対してQuickChange Mutagenesis Kits（インビトロジェン）により変異を挿入した。以降の操作は野生型、変異体に関わらずすべて同様に行った。

上記の野生型及び２６種の耐熱化変異体候補のpMETaB-BOベクターに加え、２６種の耐熱化変異体候補の２つまたは３つまたは４つを組み合わせた多重変異体のpMETaB-BOベクターも同様に作製し、塩基配列の確認を行った。

作製したすべてのpMETaB-BOベクターによるP. methanolicaの形質転換を行った。P. methanolicaは、PMAD11株（インビトロジェン）を用いた。形質転換はpMETaBベクターに付属のマニュアルに記載された方法に従って行った。形質転換酵母の選択はMD寒天平板培地（組成は表９を参照）により行った。この反応のコンピテンシーは、いずれも〜10/1μgDNAであり、マニュアルに記載の値とほぼ一致した。

４−２：P. methanolicaによる組換えＢＯの大量発現
形質転換後5〜7日で得られたMD培地上の形質転換酵母のコロニーは3 mLのBMDY培地（組成は表１０を参照）で一晩培養した。得られた培養液の一部を再度、MD寒天平板培地に展開した。この２〜３日後に得られる白色の精製コロニーは、次項の大量発現に用いた。

次に、P. methanolicaによる組換えＢＯの大量発現作業に移行した。形質転換酵母の精製コロニーを５０ｍLのBMDY液体培地に接種して、一晩、30℃で震とう培養を行った。このときOD₆₀₀は2〜5となった。ここで、得られた菌体を一旦遠心分離（1500×g、室温、10分）により沈澱させ、BMDY液体培地を除いた後、菌体のみをBMMY液体培地（組成は表１１を参照）50〜100 mlに懸濁した。これを24時間、27℃で震とう培養を行った。その後、終濃度0.5%メタノールを添加して、さらに24時間、同条件で培養を行った。これを96時間ま
で行った後、遠心分離により菌体を除き、残りの培養液を5〜10 ml程度まで濃縮して、50 mM Tris-HClバッファー（pH 7.6）に対して透析を行った。

４−３．組換えＢＯの精製
続いて、アニオン交換クロマトグラフィーによる組換えＢＯの精製を行った。前工程で調製した組換えＢＯを含む粗製液は、アニオン交換カラム（HiTrap Q HP；ベッド体積：5 ml；GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて精製を行った。精製条件は既報（Biochemistry, 38, 3034-3042(1999)）を参考にして行った。

次に、疎水クロマトグラフィーによる組換えＢＯの精製を行った。疎水クロマトグラフィーに使用したカラムはToyopearl Butyl-650 Mカラム（100 ml；22 mm x 20 cm；東ソー）である。精製条件は既報（Biochemistry, 44, 7004-7012(2005)）を参考にして行った。精製後に得られた組換えＢＯ（A264V）のUV-visスペクトルを図２に示す。

図２に示したA264Vのスペクトルパターンは既報（Protein Expression Purif., 41, 77-83 (2005)）のP. pastrisによる組換えＢＯのそれに完全に一致していた。

P. methanolicaによる大量培養の最終的な収量は、最大で11.7 mg / 1L培養であった。

４−４：耐熱性の評価。
次に、P. methanolicaによる組換えＢＯ及び市販品のＢＯ(アマノエンザイム)の耐熱性の評価を行った。耐熱性の評価は加熱処理後の残存活性率の比較によって行った。ＢＯ活性測定はABTSを基質として用い、反応進行に伴う730 nmの吸光度変化（ABTSの反応物の増加に由来する）を追跡した。測定条件は「表１２」のとおりとした。なお、ＢＯ濃度は活性測定の際、730 nmの吸光度変化が1分間当たり0.01 〜 0.2 程度となるように調製した。反応はABTSを含むリン酸緩衝液（2980 〜 2995μＬ）に酵素溶液（5〜20μＬ）を加えることで開始した。

P. methanolicaで発現させた計２６種の耐熱化ＢＯ変異体候補（Q49K, Q72E, V81L, Y121S, R147P, A185S, P210L, F225V, G258V, A264V, D322N, N335S, R356L, P359S, D370Y, V371A, P423L, M468V, L476P, V513L, A103P, Y270D, S299N, V381L, A418T, R437H）及びこれらの２つまたは３つまたは４つを組み合わせた多重変異体について、耐熱性実験を行った。各酵素溶液の熱処理は氷浴中の500 mlチューブに分注した150 mlの酵素溶液（100 mM リン酸Kバッファー(pH 6.0)）を60℃に設定したヒートブロック上にすばやく移動させ、一定時間放置後、再び氷浴中にすばやく戻すという方法を採用した。この耐熱化確認実験の結果を表１３にまとめた。

４−５：変性温度の測定
耐熱性の評価を行った５５種の耐熱化ＢＯ変異体の変性温度Ｔ_ｍを示差走査マイクロカロリメトリー（以下、ＤＳＣ：Differenctial scanning calorimetryと略す）により測定した。ＤＳＣはMicroCal社の
VP-DSCを用いた。酵素溶液は2.0〜2.5 mg/mlとし、昇温は１時間に６０℃の速度で行った。この結果を活性の耐熱化確認実験と共に表１３にまとめた。

本発明に係る変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは、例えば、酵素を固定化した電極を用いる燃料電池、特に、該酵素電池のカソード（Cathode、正極）側において、酸素の電気化学的４電子還元反応を実現する触媒として利用できる。

耐熱化スクリーニングの一例を示し、ABTSの発色の様子を示している図（反応開始１時間）である。変異型組換えＢＯのUV-visスペクトルを示す図である。

Claims

不完全糸状菌Myrothecium verrucaria由来ビリルビンオキシダーゼの配列番号１の野生型アミノ酸配列において、少なくとも２つ以上のアミノ酸残基が置換された配列番号２２〜４５、６３〜６７のいずれかに示されるアミノ酸配列からなり、
変性温度Ｔｍ値が７５℃以上であり、６０℃、１時間加熱処理後の残存酵素活性率（residual activity）が５０％以上である変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
前記不完全糸状菌は、Myrothecium verrucariaＮＢＲＣ（ＩＦＯ）６１１３株であることを特徴とする請求項１記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
酵母Pichia methanolicaを宿主として発現させたことを特徴とする請求項１記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。