JP5252339B2 - Method for measuring PAD4 and anti-PAD4 antibody and method for detecting rheumatoid arthritis - Google Patents
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Description
本発明は、抗PAD4モノクローナル抗体を利用したPAD4の測定方法及び該モノクローナル抗体を利用したサンドイッチ法による抗PAD4抗体の測定方法、並びに関節リウマチの検出方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring PAD4 using an anti-PAD4 monoclonal antibody, a method for measuring anti-PAD4 antibody by a sandwich method using the monoclonal antibody, and a method for detecting rheumatoid arthritis.
関節リウマチの血清学的診断法は、リウマチ因子の測定が最も信頼された測定法であったが、近年では、環状化シトルリン化ペプチドに対する自己抗体(抗CCP抗体)の測定がリウマチ因子測定を上回る効果的な方法であるとされている(非特許文献1)。関節リウマチは有用な治療法が開発され、より早期に診断することが重要とされている。CCP抗体の測定は現状では最も早期に診断できる測定法であるが、早期診断という観点からはまだ十分な方法とは言えない。 The serological diagnostic method for rheumatoid arthritis was the most reliable method for measuring rheumatoid factor, but in recent years, the measurement of autoantibodies against cyclized citrullinated peptides (anti-CCP antibody) exceeds that of rheumatoid factor. It is said that it is an effective method (nonpatent literature 1). For rheumatoid arthritis, useful treatments have been developed and it is important to diagnose them at an earlier stage. Although measurement of CCP antibodies is the measurement method that can be diagnosed earliest at present, it is not yet a sufficient method from the viewpoint of early diagnosis.
タンパク質のシトルリン化反応は、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ(PAD)という酵素により構成アミノ酸のアルギニンがシトルリンに変換される反応である。PADには5種類のアイソフォームが存在し(1型、2型、3型、4型/5型及び6型)、生体内における組織分布や基質特異性等がそれぞれ異なっている。関節リウマチ患者において検出されるCCP自己抗体は、シトルリン化した蛋白(責任蛋白は明らかでない)に対して患者体内で作られると考えられるが、関節リウマチに関与する蛋白シトルリン化は4型PAD(PAD4)により行われていると考えられている。より早期診断を考えると、CCP自己抗体より早期に血中に現れる可能性が高い血中PAD4、或いは抗PAD4自己抗体は、関節リウマチの早期診断を可能にすると考えられる。 Protein citrullination is a reaction in which the constituent amino acid arginine is converted to citrulline by an enzyme called peptidylarginine deiminase (PAD). There are 5 types of isoforms in PAD (type 1, type 2, type 3, type 4/5 type and type 6), and the tissue distribution and substrate specificity in the living body are different. CCP autoantibodies detected in patients with rheumatoid arthritis are thought to be produced in the patient's body against citrullinated proteins (responsible proteins are not known), but protein citrullination involved in rheumatoid arthritis is type 4 PAD (PAD4 ). Considering earlier diagnosis, it is considered that blood PAD4 or anti-PAD4 autoantibody, which is likely to appear in blood earlier than CCP autoantibodies, enables early diagnosis of rheumatoid arthritis.
しかしながら、血中に存在するPAD4タンパク質は存在量が少ないため、精製して得ることはできず、関節リウマチ診断に好ましく用いることができる抗PAD4抗体及び血中PAD4測定方法を確立することは困難である。 However, since the amount of PAD4 protein present in the blood is small, it cannot be purified and it is difficult to establish an anti-PAD4 antibody and a method for measuring blood PAD4 that can be preferably used for rheumatoid arthritis diagnosis. is there.
抗PAD4自己抗体の測定による関節リウマチの診断方法としては、非特許文献2に記載の方法が公知である。しかしながら、非特許文献2の方法では、PAD4抗原を直接固相に結合させて免疫測定を行なっている。かかる方法では、固相化したPAD4の立体構造が変化するおそれがあり、また、抗原の精製度を高めないと非特異反応が生じ易くなるため、精度の高い測定は困難である。 As a method for diagnosing rheumatoid arthritis by measuring anti-PAD4 autoantibodies, the method described in Non-Patent Document 2 is known. However, in the method of Non-Patent Document 2, immunoassay is performed by directly binding PAD4 antigen to a solid phase. In such a method, there is a possibility that the three-dimensional structure of the immobilized PAD4 may change, and a non-specific reaction is likely to occur unless the purity of the antigen is increased, so that highly accurate measurement is difficult.
本発明は、関節リウマチを高精度に検出するために有用な、血中のPAD4でも精度よく検出することができる手段を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide means useful for detecting rheumatoid arthritis with high accuracy and capable of accurately detecting even PAD4 in blood.
本願発明者らは、鋭意研究の結果、PAD4を検出可能なモノクローナル抗体を確立し、該モノクローナル抗体を用いて被検試料中のPAD4を免疫測定するに際し、カルシウムイオンキレート剤の添加等により試料中のカルシウムイオンを除去すると、カルシウムイオンを多く含む血清等の試料においてもPAD4を正確に測定できることを見出した。また、抗PAD4自己抗体を測定するに際し、該モノクローナル抗体を固相に結合させてサンドイッチ法による免疫測定を行なうことで、抗原PAD4自体を直接固相化するよりも精度良く該自己抗体を測定することができることを見出した。そして、これらの測定方法を適宜組み合わせることにより、関節リウマチを高精度に検出可能であることを見出し、本願発明を完成した。 As a result of earnest research, the inventors of the present application established a monoclonal antibody capable of detecting PAD4, and when immunoassay of PAD4 in a test sample using the monoclonal antibody was performed, the calcium ion chelating agent was added to the sample. It was found that PAD4 can be accurately measured even in samples such as serum containing a lot of calcium ions by removing calcium ions. Also, when measuring anti-PAD4 autoantibodies, the monoclonal antibodies are bound to a solid phase and immunoassay is performed by a sandwich method to measure the autoantibodies with higher accuracy than directly immobilizing the antigen PAD4 itself. I found that I can do it. And it discovered that rheumatoid arthritis could be detected with high precision by combining these measuring methods as appropriate, and completed the present invention.
すなわち、本発明は、カルシウムイオンのキレート剤と接触させた被検試料について、PAD4と抗原抗体反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いた免疫測定を行ない、前記被検試料中に含まれ得るPAD4を測定することを含む、被検試料中のPAD4の測定方法を提供する。また、本発明は、生体から得た被検試料に対して、上記本発明のPAD4の測定方法を行なうことにより測定される、前記被検試料中のPAD4の存在量を指標とする、関節リウマチの検出方法を提供する。
That is, the present invention performs immunoassay on a test sample brought into contact with a calcium ion chelating agent using a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that reacts with PAD4 in an antigen-antibody, and is contained in the test sample. Provided is a method for measuring PAD4 in a test sample, comprising measuring the obtained PAD4. The present invention also provides rheumatoid arthritis using as an index the amount of PAD4 present in the test sample, which is measured by performing the PAD4 measurement method of the present invention on a test sample obtained from a living body. Provide a detection method.
本発明により、PAD4及び抗PAD4自己抗体を高精度に測定できる測定方法が提供された。本発明のPAD4測定方法によれば、PAD4を精度よく測定することができ、特に血清・血漿試料中のPAD4をも高精度に測定することができる。また、本発明の抗PAD4自己抗体測定方法によれば、PAD4抗原を特異抗体を介して固相に結合させて用いるため、PAD4抗原を直接固相化する方法よりも、固相上のPAD4抗原の立体構造を好ましく維持することができ、さらに、PAD4抗原に混入している夾雑物による悪影響も回避することができるので、抗PAD4自己抗体を高精度に測定することが可能になる。さらに、これらの測定方法を適宜組み合わせて行なうことにより、関節リウマチの診断を高精度に行なうことが可能になった。従来、環状化シトルリン化ペプチドに対する自己抗体(抗CCP抗体)を測定する方法が最も早期に関節リウマチを診断できる方法であるとされているが、該環状化シトルリン化ペプチドの生成に関与している酵素はPAD4であるため、PAD4や抗PAD4自己抗体を測定すれば、抗CCP抗体の測定による診断よりもさらに早期に関節リウマチを診断することができると考えられる。すなわち、PAD4と抗PAD4自己抗体の測定を適宜組み合わせて行なう本発明の検出方法によれば、関節リウマチを従来法よりも早期に検出することが可能になる。 The present invention provides a measurement method capable of measuring PAD4 and anti-PAD4 autoantibodies with high accuracy. According to the PAD4 measurement method of the present invention, PAD4 can be measured with high accuracy, and in particular, PAD4 in serum and plasma samples can also be measured with high accuracy. Further, according to the anti-PAD4 autoantibody measurement method of the present invention, since the PAD4 antigen is used by binding to the solid phase via a specific antibody, the PAD4 antigen on the solid phase is used rather than the method of directly immobilizing the PAD4 antigen. Thus, the three-dimensional structure can be preferably maintained, and further, adverse effects due to contaminants mixed in the PAD4 antigen can be avoided, so that anti-PAD4 autoantibodies can be measured with high accuracy. Furthermore, by appropriately combining these measurement methods, it has become possible to diagnose rheumatoid arthritis with high accuracy. Conventionally, the method of measuring autoantibodies against cyclized citrullinated peptides (anti-CCP antibodies) is said to be the earliest method for diagnosing rheumatoid arthritis, but is involved in the production of cyclized citrullinated peptides. Since the enzyme is PAD4, it is considered that rheumatoid arthritis can be diagnosed earlier than the diagnosis by measurement of anti-CCP antibody by measuring PAD4 or anti-PAD4 autoantibodies. That is, according to the detection method of the present invention in which measurement of PAD4 and anti-PAD4 autoantibodies is appropriately combined, rheumatoid arthritis can be detected earlier than the conventional method.
本発明のPAD4の測定方法は、PAD4と抗原抗体反応する抗PAD4モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いた免疫測定により行なわれる。該抗PAD4モノクローナル抗体は、PAD4への特異性が高く、他のタンパク質とは実質的に抗原抗体反応しないものである。「実質的に抗原抗体反応しない」とは、検出可能なレベルで抗原抗体反応しないか、又は抗原抗体反応を起こしても、その反応の程度が、PAD4との抗原抗体反応よりも明らかに弱く、PAD4と抗原抗体反応していないことが当業者にとって明瞭な程度にしか反応しないことを意味する。 The method for measuring PAD4 of the present invention is performed by immunoassay using an anti-PAD4 monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof that reacts with PAD4 as an antigen antibody. The anti-PAD4 monoclonal antibody has high specificity for PAD4 and does not substantially react with other proteins for antigen-antibody reaction. “Substantially no antigen-antibody reaction” means that no antigen-antibody reaction occurs at a detectable level, or even if an antigen-antibody reaction occurs, the degree of the reaction is clearly weaker than the antigen-antibody reaction with PAD4, The absence of antigen-antibody reaction with PAD4 means that it reacts only to a degree that is obvious to those skilled in the art.
本発明のPAD4測定方法では、被検試料とカルシウムイオンのキレート剤とを接触させる。例えば、被検試料にキレート剤を添加した後に免疫測定を行なうことができる。抗体固定化固相を用いて免疫測定を行う場合には、該固相に被検試料とキレート剤とを別個に添加することにより両者を接触させてもよいが、あらかじめ被検試料にキレート剤を添加して用いることが好ましい。下記実施例に記載される通り、血清又は血漿試料にEDTA(エチレンジアミン四酢酸)を添加しないで免疫測定を行なうと、正常な測定値を得ることができない。この原因としては次のことが考えられる。すなわち、スクリーニング工程において、Ca2+非存在下でPAD4タンパク質を用いると、Ca2+非存在下のPAD4タンパク質の立体構造を認識する抗体がスクリーニングされる。一方で、血清又は血漿試料中に存在するPAD4は高濃度のCa2+存在下にある。そのため、上記した方法により作製した抗PAD4モノクローナル抗体は、高濃度のCa2+存在下でPAD4がとる立体構造を適切に認識できないものと考えられる。よって、EDTA等のカルシウムキレート剤を血清又は血漿試料に添加してCa2+を除去することで、PAD4をCa2+非存在下の構造に戻すことができ、これにより上記抗PAD4モノクローナル抗体が適切に認識できるようになるものと考えられる。キレート剤としては、カルシウムイオンをキレートできるものであれば特に限定されず、他の金属イオンもキレートできるものであってもよい。具体例としては、例えばEDTA(エチレンジアミン四酢酸)、EGTA等が挙げられる。キレート剤の使用濃度は、1〜10mM程度、好ましくは3〜7mM程度であれば、試料中のPAD4を好ましい精度で測定することができる。 In the PAD4 measurement method of the present invention, a test sample is brought into contact with a calcium ion chelating agent. For example, immunoassay can be performed after adding a chelating agent to the test sample. When immunoassay is performed using an antibody-immobilized solid phase, a test sample and a chelating agent may be added separately to the solid phase, but the chelating agent may be added to the test sample in advance. It is preferable to add and use. As described in the Examples below, when an immunoassay is performed without adding EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) to a serum or plasma sample, a normal measurement value cannot be obtained. The following can be considered as the cause. That is, in the screening process, the use of PAD4 protein in Ca 2+ absence recognizes the conformation of PAD4 protein Ca 2+ absence antibody is screened. On the other hand, PAD4 present in serum or plasma samples is in the presence of high concentrations of Ca 2+ . Therefore, it is considered that the anti-PAD4 monoclonal antibody prepared by the above-mentioned method cannot properly recognize the three-dimensional structure taken by PAD4 in the presence of a high concentration of Ca 2+ . Therefore, by adding a calcium chelating agent such as EDTA to a serum or plasma sample and removing Ca 2+ , PAD4 can be returned to the structure in the absence of Ca 2+ , thereby allowing the anti-PAD4 monoclonal antibody to It will be able to recognize properly. The chelating agent is not particularly limited as long as it can chelate calcium ions, and may be capable of chelating other metal ions. Specific examples include EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), EGTA, and the like. When the concentration of the chelating agent used is about 1 to 10 mM, preferably about 3 to 7 mM, PAD4 in the sample can be measured with preferable accuracy.
本発明の方法で用いられる抗PAD4モノクローナル抗体は、例えば、公知の遺伝子工学的手法により作製又は公知のペプチド合成機により合成したPAD4タンパク質を免疫原として用いて、周知のハイブリドーマ法により作製することができる。すなわち、PAD4組換えタンパク質を調製し、これを免疫原として用いて動物(ヒトを除く)を免疫し、該動物から抗体産生細胞を得てミエローマ細胞等の不死化細胞と融合させることによりハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマから、所望の反応性(PAD4に対する特異的な反応性)を有する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、スクリーニングしたハイブリドーマから抗体を回収することにより、抗PAD4モノクローナル抗体を得ることができる。 The anti-PAD4 monoclonal antibody used in the method of the present invention can be prepared, for example, by a known hybridoma method using a PAD4 protein prepared by a known genetic engineering technique or synthesized by a known peptide synthesizer as an immunogen. it can. That is, a PAD4 recombinant protein is prepared, and this is used as an immunogen to immunize animals (excluding humans), and antibody-producing cells are obtained from the animals and fused with immortalized cells such as myeloma cells. An anti-PAD4 monoclonal antibody can be obtained by preparing a hybridoma that produces an antibody having a desired reactivity (specific reactivity to PAD4) from the hybridoma and recovering the antibody from the screened hybridoma it can.
PAD4を遺伝子工学的手法により作製する方法としては、例えば、PAD4を発現している組織又は細胞から抽出した全RNAから、PAD4遺伝子のcDNAをRT-PCRにより調製し、該cDNAを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でPAD4を発現させてPAD4組換えタンパク質を得る方法が挙げられる。PAD4の遺伝子配列及びアミノ酸配列は、NCBIのGenBankにアクセッション番号AB017919で登録されている通り公知であり、それぞれ本願配列表の配列番号1及び2に記載されているので、当業者であれば、これらの配列情報をもとに容易にPAD4組換えタンパク質を調製することができる。なお、この分野において、PAD4はPAD5と呼ばれることもある。RNAの抽出、RT-PCR、ベクターへのcDNAの組み込み、ベクターの宿主細胞への導入は周知の方法により行なうことができる。また、用いるベクターや宿主細胞も周知であり、種々のものが市販されている。 As a method for producing PAD4 by genetic engineering techniques, for example, cDNA of PAD4 gene is prepared by RT-PCR from total RNA extracted from tissues or cells expressing PAD4, and the cDNA is incorporated into an expression vector. And a method of introducing PAD4 into the host cell and expressing PAD4 in the host cell to obtain a PAD4 recombinant protein. The gene sequence and amino acid sequence of PAD4 are known as registered under accession number AB017919 in NCBI GenBank, and are described in SEQ ID NOS: 1 and 2, respectively. A PAD4 recombinant protein can be easily prepared based on these sequence information. In this field, PAD4 is sometimes called PAD5. RNA extraction, RT-PCR, cDNA integration into a vector, and introduction of a vector into a host cell can be performed by well-known methods. Further, vectors and host cells to be used are well known, and various types are commercially available.
調製したPAD4タンパク質については、免疫原として用いる前に、任意で酵素活性を確認してもよい。酵素活性を発揮できるPAD4タンパク質であれば、生体内で産生されるPAD4タンパク質と同等の立体構造を有し得るので、抗PAD4抗体作製のための免疫原として効果が高いものと考えられる。調製したPAD4組換えタンパク質の酵素活性は、例えば、下記実施例に詳述されるように、ベンゾイル−L−アルギニンエチルエステル(BAEE)を基質として用いて、10mM〜30mM程度のカルシウムイオンの存在下、37℃〜55℃程度で所定の時間(例えば1時間程度)酵素反応を行ない、公知の比色定量用試薬を用いて吸光度を測定することにより確認することができる。特に限定されないが、通常、0.01U/ml程度以上の活性が確認できれば、酵素活性を有するPAD4であると評価することができる。 The prepared PAD4 protein may optionally be checked for enzyme activity prior to use as an immunogen. A PAD4 protein that can exhibit enzymatic activity can have a three-dimensional structure equivalent to that of a PAD4 protein produced in vivo, and thus is considered to be highly effective as an immunogen for producing an anti-PAD4 antibody. The enzyme activity of the prepared PAD4 recombinant protein is, for example, in the presence of about 10 mM to 30 mM calcium ion using benzoyl-L-arginine ethyl ester (BAEE) as a substrate, as detailed in the Examples below. It can be confirmed by performing an enzyme reaction at a temperature of about 37 ° C. to 55 ° C. for a predetermined time (for example, about 1 hour) and measuring the absorbance using a known colorimetric reagent. Although it is not particularly limited, it can be evaluated that it is PAD4 having enzyme activity if activity of about 0.01 U / ml or more can be confirmed.
免疫した動物から得た抗体産生細胞と不死化細胞との融合方法や、ハイブリドーマのスクリーニング方法、ハイブリドーマからの抗体の回収方法は、この分野において周知の常法により行なうことができる。 Methods for fusing antibody-producing cells and immortalized cells obtained from immunized animals, methods for screening hybridomas, and methods for recovering antibodies from hybridomas can be performed by conventional methods well known in the art.
また、抗PAD4モノクローナル抗体と同様に、対応抗原たるPAD4との結合性を有するその抗体断片(本発明において「抗原結合性断片」という)を免疫測定に用いることができることは、この分野において周知のとおりである。従って、本発明のPAD4の測定方法においても、抗PAD4モノクローナル抗体のみならず、その抗原結合性断片を用いることができる。抗原結合性断片の例としては、例えば免疫グロブリンのFab断片やF(ab')2断片が挙げられる。これらの断片は、周知の通り、モノクローナル抗体をパパインやペプシンのようなタンパク分解酵素で処理することにより得ることができる。なお、抗原結合性断片は、Fab断片やF(ab')2断片に限定されるものではなく、対応抗原との結合性を維持しているいかなる断片であってもよく、遺伝子工学的手法により調製されたものであってもよい。また、例えば、遺伝子工学的手法により、一本鎖可変領域 (scFv : single chain fragment of variable region) を大腸菌内で発現させた抗体を用いることもできる。scFvの作製方法も周知であり、上記の通りに作製したハイブリドーマのmRNAを抽出し、一本鎖cDNAを調製し、免疫グロブリンH鎖及びL鎖に特異的なプライマーを用いてPCRを行なって免疫グロブリンH鎖遺伝子及びL鎖遺伝子を増幅し、これらをリンカーで連結し、適切な制限酵素部位を付与してプラスミドベクターに導入し、それで大腸菌を形質転換し、大腸菌からscFvを回収することによりscFvを作製することができる。このようなscFvも本発明で言う「抗原結合性断片」に包含される。 It is well known in the art that an antibody fragment (referred to as “antigen-binding fragment” in the present invention) having binding ability to PAD4, which is a corresponding antigen, can be used for immunoassay as well as an anti-PAD4 monoclonal antibody. It is as follows. Therefore, not only the anti-PAD4 monoclonal antibody but also its antigen-binding fragment can be used in the PAD4 measurement method of the present invention. Examples of antigen-binding fragments include, for example, immunoglobulin Fab fragments and F (ab ′) 2 fragments. As is well known, these fragments can be obtained by treating a monoclonal antibody with a proteolytic enzyme such as papain or pepsin. The antigen-binding fragment is not limited to the Fab fragment or the F (ab ′) 2 fragment, and may be any fragment that maintains the binding property with the corresponding antigen. It may be prepared. In addition, for example, an antibody in which a single chain fragment of variable region (scFv) is expressed in E. coli can be used by genetic engineering techniques. The method for producing scFv is also well known. The hybridoma mRNA produced as described above is extracted, single-stranded cDNA is prepared, and PCR is performed using primers specific to immunoglobulin H chain and L chain. ScFv by amplifying globulin H chain gene and L chain gene, ligating them with a linker, adding an appropriate restriction enzyme site and introducing it into a plasmid vector, transforming E. coli, and recovering scFv from E. coli Can be produced. Such scFv is also included in the “antigen-binding fragment” referred to in the present invention.
免疫測定方法自体はこの分野において周知であり、本発明のPAD4測定方法においては、周知のいずれの免疫測定方法をも採用することができる。すなわち、反応形式に基づき分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法等があり、標識に基づき分類すると、酵素免疫分析、放射免疫分析、蛍光免疫分析等があるが、これらのいずれもが本発明で言う「免疫測定」に包含され、本発明の測定方法に採用することができる。 The immunoassay method itself is well known in this field, and any known immunoassay method can be adopted in the PAD4 measurement method of the present invention. That is, when classified based on the reaction format, there are a sandwich method, a competitive method, an agglutination method, and the like, and when classified based on a label, there are an enzyme immunoassay, a radioimmunoassay, a fluorescence immunoassay, etc. And can be employed in the measurement method of the present invention.
本発明のPAD4測定方法において、サンドイッチ法によりPAD4を免疫測定する場合には、固相化する抗PAD4抗体と標識抗体として用いる抗PAD4抗体のいずれか一方にモノクローナル抗体を用い、他方をポリクローナル抗体としてもよい。ただし、測定精度を高める観点からは、両者をモノクローナル抗体とすることが好ましい。固相化抗体と標識抗体とは、周知の通り、互いに異なるエピトープを認識するものでなければならず、両者をモノクローナル抗体とするときに特に問題となるが、モノクローナル抗体の組み合わせが好ましいかどうかは、実際に免疫測定を行なってみることで容易に調べることができる。所望により、抗体の認識部位の同定を行なって、異なるエピトープを認識するかどうかを調べてもよい。抗体の認識部位の同定は、この分野で周知の常法により行なうことができる。簡潔に説明すると、例えば、対応抗原であるPAD4タンパク質をトリプシン等のようなタンパク質分解酵素により部分消化し、認識部位を調べるべき抗体を結合させたアフィニティーカラムに部分消化物溶液を通じて消化物を結合させ、次いで結合した消化物を溶出させて常法の質量分析を行なうことにより、抗体の認識部位を同定することができる。 In the PAD4 measurement method of the present invention, when PAD4 is immunoassay by the sandwich method, a monoclonal antibody is used as one of the anti-PAD4 antibody to be immobilized and the anti-PAD4 antibody used as a labeled antibody, and the other is used as a polyclonal antibody. Also good. However, from the viewpoint of improving measurement accuracy, it is preferable to use both antibodies as monoclonal antibodies. As is well known, the solid-phased antibody and the labeled antibody must recognize different epitopes from each other, which is particularly problematic when both are used as monoclonal antibodies. It can be easily examined by actually performing an immunoassay. If desired, the recognition site of the antibody may be identified to see if it recognizes a different epitope. Identification of the recognition site of the antibody can be performed by a conventional method well known in this field. Briefly, for example, the corresponding antigen PAD4 protein is partially digested with a proteolytic enzyme such as trypsin, and the digest is bound to the affinity column to which the antibody to be examined for binding is bound through the partially digested solution. Then, the bound digest is eluted and subjected to mass spectrometry in the usual manner, whereby the recognition site of the antibody can be identified.
本発明のPAD4測定方法において用いられる被検試料は、ヒト等の哺乳動物から採取される生体由来成分であり、好ましくは血清又は血漿である。 The test sample used in the PAD4 measurement method of the present invention is a biological component collected from a mammal such as a human, preferably serum or plasma.
本発明はまた、抗PAD4モノクローナル抗体を利用したサンドイッチ法の免疫測定により、被検試料中の抗PAD4自己抗体を測定する方法を提供する。ここでいう「自己抗体」とは、生体内で発現したPAD4タンパク質に対して産生される抗体のことをいい、健常な生体内でPAD4に対して誘導される抗体のみならず、関節リウマチ等の疾患によりPAD4タンパク質の発現量が増大している生体内において、該高発現しているPAD4タンパク質に対して誘導される抗体も包含する。なお、上記した通り、抗PAD4モノクローナル抗体の抗原結合性断片も、該抗体と同様に免疫測定に用いることができるため、本発明の抗PAD4自己抗体の測定方法においても抗原結合性断片を用いることができる。以下、本発明の説明において、「抗原結合性断片」への言及は省略する場合があるが、本発明の範囲から抗原結合性断片を除外することを意図するものではなく、免疫測定で用いられるモノクローナル抗体にはその抗原結合性断片も包含されるものとする。 The present invention also provides a method for measuring anti-PAD4 autoantibodies in a test sample by sandwich immunoassay using anti-PAD4 monoclonal antibodies. As used herein, “autoantibody” refers to an antibody produced against PAD4 protein expressed in vivo, and includes not only antibodies induced against PAD4 in a healthy organism, but also rheumatoid arthritis, etc. An antibody induced against the highly expressed PAD4 protein in a living body in which the expression level of the PAD4 protein is increased due to a disease is also included. As described above, since the antigen-binding fragment of an anti-PAD4 monoclonal antibody can be used for immunoassay in the same manner as the antibody, the antigen-binding fragment should also be used in the method for measuring an anti-PAD4 autoantibody of the present invention. Can do. Hereinafter, in the description of the present invention, reference to “antigen-binding fragment” may be omitted, but it is not intended to exclude the antigen-binding fragment from the scope of the present invention, and is used in immunoassays. Monoclonal antibodies also include antigen-binding fragments thereof.
本発明のPAD4自己抗体の測定方法は、PAD4抗原を固定化した固相を用いたサンドイッチ法による免疫測定により行なわれる。ここで、PAD4自己抗体の捕捉に用いるPAD4抗原は、固相に直接固定化されず、抗PAD4モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を介して固相に固定化される。すなわち、該測定方法では、固相化した抗PAD4モノクローナル抗体等にPAD4抗原を結合させて固相を調製し、該固相を用いたサンドイッチ法による免疫測定によりPAD4自己抗体の測定が行なわれる。 The method for measuring PAD4 autoantibodies of the present invention is performed by immunoassay by a sandwich method using a solid phase on which PAD4 antigen is immobilized. Here, the PAD4 antigen used for capturing the PAD4 autoantibody is not directly immobilized on the solid phase, but is immobilized on the solid phase via an anti-PAD4 monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof. That is, in this measurement method, a PAD4 antigen is bound to a solid-phased anti-PAD4 monoclonal antibody or the like to prepare a solid phase, and PAD4 autoantibody is measured by an immunoassay by a sandwich method using the solid phase.
ここで、「PAD4抗原」とは、試料中の抗PAD4自己抗体と抗原抗体反応により結合できるPAD4タンパク質若しくはその断片、又はこれらと一定以上の相同性を有するポリペプチド(以下、該ポリペプチドを便宜的に「修飾ポリペプチド」という)のことを意味する。後述するとおり、PAD4の断片であっても、免疫測定の抗原として使用可能である。また、一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換され、欠失され、挿入され又は付加された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。該修飾ポリペプチドは、PAD4タンパク質(配列番号2)又はその断片のアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上の相同性を有する。あるいはまた、該修飾ポリペプチドとしては、PAD4タンパク質(配列番号2)又はその断片のアミノ酸配列において、1ないし数個のアミノ酸が置換され、欠失され、挿入され及び/又は付加されたものも好ましい。 As used herein, “PAD4 antigen” refers to a PAD4 protein or fragment thereof that can bind to an anti-PAD4 autoantibody in a sample by an antigen-antibody reaction, or a polypeptide having a certain degree of homology thereto (hereinafter referred to as the polypeptide for convenience). (Referred to as "modified polypeptide"). As will be described later, even a fragment of PAD4 can be used as an antigen for immunoassay. In general, a protein antigen has almost the same antigenicity as the original protein even when a small number of amino acid residues in the amino acid sequence of the protein are substituted, deleted, inserted, or added. It is well known to those skilled in the art that The modified polypeptide has a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further preferably 98% or more with the amino acid sequence of the PAD4 protein (SEQ ID NO: 2) or a fragment thereof. Alternatively, the modified polypeptide is also preferably one in which one to several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of the PAD4 protein (SEQ ID NO: 2) or a fragment thereof. .
上記PAD4抗原は、市販のPAD4タンパク質精製品であってもよく、また、公知の遺伝子工学的手法(上述)により作製したPAD4組換えタンパク質であってもよい。遺伝子工学的手法により作製されたPAD4には、通常、多少の宿主細胞成分(例えば大腸菌成分)が混入してしまっているが、ヒトは大腸菌成分に対する抗体をもっているため、かかる大腸菌成分の混入はヒト由来試料を測定する場合にバックグラウンドを高める原因となる。上記の通り、モノクローナル抗体を介して間接的にPAD4抗原を固定化した固相を用いることにより、大腸菌成分の混入によるバックグラウンドの上昇を抑え、PAD4自己抗体の測定精度を高めることができる。また、PAD4抗原を直接固相に結合させると立体構造が変化してしまう可能性があり、PAD4の立体構造を認識する自己抗体を測定しにくくなるおそれがあるが、抗体を介してPAD4抗原を固相に固定化すると、PAD4の立体構造を維持できる可能性が高いので、PAD4自己抗体の測定精度を高めることができる。実際に、下記実施例に記載される通り、PAD4抗原を直接固相化した場合よりも、モノクローナル抗体を介して固相に固定化した方が、PAD4自己抗体の測定精度が向上する。 The PAD4 antigen may be a commercially available PAD4 protein purified product, or may be a PAD4 recombinant protein produced by a known genetic engineering technique (described above). PAD4 produced by genetic engineering techniques usually contains some host cell components (for example, E. coli components), but humans have antibodies against E. coli components, so contamination of these E. coli components is not human. It becomes a cause which raises background when measuring a derived sample. As described above, by using a solid phase in which PAD4 antigen is indirectly immobilized via a monoclonal antibody, an increase in background due to contamination with E. coli components can be suppressed, and the measurement accuracy of PAD4 autoantibodies can be improved. In addition, if the PAD4 antigen is directly bound to the solid phase, the three-dimensional structure may change, which may make it difficult to measure autoantibodies that recognize the three-dimensional structure of PAD4. When immobilized on a solid phase, there is a high possibility that the three-dimensional structure of PAD4 can be maintained, so that the measurement accuracy of PAD4 autoantibodies can be increased. Actually, as described in Examples below, the measurement accuracy of PAD4 autoantibodies is improved by immobilizing PAD4 antigen on a solid phase via a monoclonal antibody, rather than directly immobilizing PAD4 antigen.
上記PAD4抗原は、PAD4タンパク質(配列番号2)の全長から成るものに限定されず、その断片であってもよい。測定すべきPAD4自己抗体は、PAD4タンパク質上の複数の部位を認識する抗体の集合体、すなわちポリクローナル抗体であるから、PAD4タンパク質断片であっても、該ポリクローナル抗体中には該断片を認識できる抗体が含まれ得る。従って、PAD4断片もまた、固相とPAD4抗原とを連結する抗PAD4モノクローナル抗体との結合性を有する限り、PAD4全長タンパク質と同様に、被検試料中のPAD4自己抗体の測定に用いることができ、本発明の範囲に包含される。該PAD4断片は、配列番号2中の連続する7アミノ酸残基以上、好ましくは10アミノ酸残基以上から成り、且つ、上記抗PAD4モノクローナル抗体及び被検試料中のPAD4自己抗体と抗原抗体反応する断片である。なお、約7アミノ酸残基以上のタンパク質断片であれば抗原性を発揮することがこの分野において知られている。ただし、アミノ酸残基の数があまりに少ないと、試料中に存在する、測定対象外の抗体とも交差反応してしまう可能性が高くなる。従って、測定精度を高める観点からは、PAD4抗原のアミノ酸残基数は好ましくは30以上、より好ましくは100以上、さらには300以上、500以上等とすることが好ましく、配列番号2の全長から成るPAD4抗原が最も好ましい。 The PAD4 antigen is not limited to one consisting of the full length of the PAD4 protein (SEQ ID NO: 2), and may be a fragment thereof. Since the PAD4 autoantibody to be measured is a collection of antibodies that recognize a plurality of sites on the PAD4 protein, that is, a polyclonal antibody, even if it is a PAD4 protein fragment, an antibody that can recognize the fragment in the polyclonal antibody Can be included. Therefore, PAD4 fragments can also be used to measure PAD4 autoantibodies in test samples, as with PAD4 full-length proteins, as long as they have binding properties to anti-PAD4 monoclonal antibodies that link the solid phase and PAD4 antigen. Are included within the scope of the present invention. The PAD4 fragment comprises a sequence of 7 amino acid residues or more, preferably 10 amino acid residues or more in SEQ ID NO: 2, and is a fragment that undergoes an antigen-antibody reaction with the anti-PAD4 monoclonal antibody and the PAD4 autoantibody in the test sample. It is. It is known in this field that a protein fragment having about 7 amino acid residues or more exhibits antigenicity. However, if the number of amino acid residues is too small, there is a high possibility of cross-reacting with a non-measurement antibody present in the sample. Therefore, from the viewpoint of improving measurement accuracy, the number of amino acid residues of the PAD4 antigen is preferably 30 or more, more preferably 100 or more, further preferably 300 or more, 500 or more, and the like. PAD4 antigen is most preferred.
本発明の抗PAD4自己抗体測定方法に用いられる固相としては、通常のサンドイッチ法による免疫測定で用いられるいかなる固相であっても用いることができ、特に限定されない。例えば、市販のELISAプレート等を好ましく用いることができる。 The solid phase used in the anti-PAD4 autoantibody measurement method of the present invention can be any solid phase used in immunoassay by the usual sandwich method, and is not particularly limited. For example, a commercially available ELISA plate can be preferably used.
本発明の抗PAD4自己抗体測定方法において用いられる被検試料は、ヒト等の哺乳動物から採取される生体由来成分であり、好ましくは血清又は血漿である。 The test sample used in the anti-PAD4 autoantibody measurement method of the present invention is a biological component collected from a mammal such as a human, preferably serum or plasma.
本発明はさらに、上記した本発明のPAD4測定方法及び抗PAD4自己抗体測定方法の少なくともいずれか一方を利用した関節リウマチの検出方法を提供する。該検出方法では、生体から得た被検試料に対し、PAD4測定と抗PAD4自己抗体測定の少なくともいずれか一方を行ない、PAD4及び/又は抗PAD4自己抗体の試料中存在量を指標として、上記生体が関節リウマチであるか否かを判断する。関節リウマチ患者では、下記実施例に記載される通り、PAD4及び/又は抗PAD4自己抗体が健常者よりも有意に多く存在するので、PAD4及び/又は抗PAD4自己抗体の測定により関節リウマチの検出が可能である。検出の精度を高める観点からは、1ないし複数の健常者試料についてPAD4及び/又は抗PAD4自己抗体を測定して健常者基準値を取得し、対象生体の測定値を該健常者基準値と比較することが好ましい。さらに検出精度を高めたい場合には、関節リウマチを罹患していることがわかっている多数の患者から得た試料についてPAD4及び/又は抗PAD4自己抗体量を調べて関節リウマチ患者基準値を取得し、対象生体の測定値を健常者基準値及び関節リウマチ患者基準値の双方と比較してもよい。上記基準値は、例えば、各試料におけるPAD4及び/又は抗PAD4自己抗体量を数値化し、その平均値を算出することによって定めることができる。なお、健常者基準値と関節リウマチ患者基準値は、予め多数の健常者及び関節リウマチ患者についてPAD4及び/又は抗PAD4自己抗体量を調べて定めておくことができる。そのため、本発明の関節リウマチ検出方法で基準値との比較を行なう場合には、予め定めた基準値を用いてもよい。 The present invention further provides a method for detecting rheumatoid arthritis using at least one of the above-described PAD4 measurement method and anti-PAD4 autoantibody measurement method of the present invention. In the detection method, at least one of PAD4 measurement and anti-PAD4 autoantibody measurement is performed on a test sample obtained from a living body, and the amount of PAD4 and / or anti-PAD4 autoantibody present in the sample is used as an index. To determine whether or not rheumatoid arthritis. In patients with rheumatoid arthritis, as described in the Examples below, PAD4 and / or anti-PAD4 autoantibodies are significantly more present than in healthy subjects, so measurement of PAD4 and / or anti-PAD4 autoantibodies can detect rheumatoid arthritis. Is possible. From the viewpoint of improving detection accuracy, PAD4 and / or anti-PAD4 autoantibodies are measured for one or a plurality of healthy subject samples to obtain healthy subject reference values, and the measured values of the target organism are compared with the normal subject reference values. It is preferable to do. In order to further improve the detection accuracy, RAD is determined for patients with rheumatoid arthritis by examining the amount of PAD4 and / or anti-PAD4 autoantibodies for samples obtained from a large number of patients known to have rheumatoid arthritis. The measured value of the target living body may be compared with both the healthy subject reference value and the rheumatoid arthritis patient reference value. The reference value can be determined, for example, by quantifying the amount of PAD4 and / or anti-PAD4 autoantibody in each sample and calculating the average value. In addition, the healthy subject reference value and the rheumatoid arthritis patient reference value can be determined in advance by examining the amount of PAD4 and / or anti-PAD4 autoantibodies for a large number of healthy subjects and rheumatoid arthritis patients. Therefore, a predetermined reference value may be used when comparing with a reference value by the rheumatoid arthritis detection method of the present invention.
本発明の関節リウマチ検出方法では、1つの被検試料に対し、必ずしもPAD4測定と抗PAD4自己抗体測定の双方を行なう必要はなく、いずれか一方のみでも関節リウマチを検出できる。具体的には、下記実施例に記載される通り、関節リウマチ患者はPAD4自己抗体を持っている者と持っていない者の2種類に分けることができ、PAD4自己抗体を持っていない患者ではPAD4が高値を示す。従って、被検試料に対し、PAD4測定と抗PAD4自己抗体測定のいずれか一方を行ない、その結果、健常者基準値よりも有意に高い測定値が得られれば、必ずしも他方の測定を実施する必要はなく、該生体は関節リウマチであると判断することができる。いずれか一方の測定の結果、健常者基準値よりも有意に高い測定値が得られなかった場合には、他方の測定を行うことにより、該生体が関節リウマチであるか否かを判断することができる。例えば、まずPAD4自己抗体の測定を行ない、自己抗体測定値が健常者基準値よりも高ければ、その時点で該生体は関節リウマチであると判断できる。自己抗体測定値が健常者基準値よりも有意に高くない場合には、該試料についてPAD4測定を行なう。健常者基準値よりもPAD4測定値が有意に高ければ、該生体は関節リウマチを罹患していると判断される。PAD4測定値も健常者基準値より高くない場合には、該生体は関節リウマチを罹患していないと判断することができる。これとは逆に、まずPAD4の測定を行ない、その結果に応じてPAD4自己抗体の測定を行なってもよい。また、1つの被検試料について、PAD4測定及び抗PAD4自己抗体測定の両者を同時に又は順次に行なってもよい。被検試料が複数ある場合には、いずれか一方の測定を行ない、関節リウマチであると判断できなかった試料について、もう一方の測定を行なうこととしてもよいし、また、全ての被検試料について、2つの測定を同時に又は順次に行なってもよい。 In the rheumatoid arthritis detection method of the present invention, it is not always necessary to perform both PAD4 measurement and anti-PAD4 autoantibody measurement for one test sample, and rheumatoid arthritis can be detected by only one of them. Specifically, as described in the Examples below, rheumatoid arthritis patients can be divided into two types: those with PAD4 autoantibodies and those without PAD4 autoantibodies. Indicates a high price. Therefore, if either one of PAD4 measurement or anti-PAD4 autoantibody measurement is performed on the test sample, and the measurement value is significantly higher than the reference value for healthy subjects, the other measurement must be performed. However, it can be determined that the living body has rheumatoid arthritis. As a result of either one of the measurements, if a measurement value significantly higher than the healthy person reference value is not obtained, the other measurement is performed to determine whether or not the living body has rheumatoid arthritis. Can do. For example, first, PAD4 autoantibody is measured, and if the autoantibody measurement value is higher than the normal standard value, it can be determined that the living body has rheumatoid arthritis at that time. When the autoantibody measurement value is not significantly higher than the healthy subject reference value, PAD4 measurement is performed on the sample. If the PAD4 measurement value is significantly higher than the healthy subject reference value, the living body is judged to have rheumatoid arthritis. When the measured value of PAD4 is not higher than the normal value, it can be determined that the living body does not suffer from rheumatoid arthritis. On the contrary, PAD4 may be measured first, and PAD4 autoantibody may be measured according to the result. Further, for one test sample, both PAD4 measurement and anti-PAD4 autoantibody measurement may be performed simultaneously or sequentially. When there are multiple test samples, one of the measurements may be performed, and the other measurement may be performed for a sample that cannot be determined to be rheumatoid arthritis, or for all the test samples Two measurements may be performed simultaneously or sequentially.
関節リウマチの検出方法に用いられる被検試料も、上記2つの本発明の測定方法と同様に、ヒト等の哺乳動物から採取される生体由来成分であり、好ましくは血清又は血漿である。 The test sample used in the method for detecting rheumatoid arthritis is also a biological component collected from mammals such as humans, and preferably serum or plasma, as in the two measurement methods of the present invention.
本発明はまた、上記した本発明のPAD4測定方法を実施するためのキットを提供する。PAD4測定キットは、上記した抗PAD4モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む。該抗体又はその抗原結合性断片は、公知の免疫測定用プレート等の固相に結合させた形態であってもよい。その他、該キットは、各種免疫測定に必要な周知の試薬類等をさらに含み得る。 The present invention also provides a kit for carrying out the above-described PAD4 measurement method of the present invention. The PAD4 measurement kit includes the above-described anti-PAD4 monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof. The antibody or antigen-binding fragment thereof may be in a form bound to a solid phase such as a known immunoassay plate. In addition, the kit may further contain known reagents necessary for various immunoassays.
同様に、本発明は、上記本発明の抗PAD4抗体測定方法を実施するためのキットを提供する。抗PAD4自己抗体測定キットは、上記した抗PAD4モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と、上記PAD4抗原を含む。該モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、公知の免疫測定用プレート等の固相に結合させた形態であってもよく、さらに、該PAD4抗原は、固相化させた該抗体等に結合させた形態であってもよい。その他、該キットは、各種免疫測定に必要な周知の試薬類等をさらに含み得る。 Similarly, the present invention provides a kit for carrying out the above-described method for measuring an anti-PAD4 antibody of the present invention. The anti-PAD4 autoantibody measurement kit includes the above-described anti-PAD4 monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof and the PAD4 antigen. The monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof may be in a form bound to a solid phase such as a known immunoassay plate, and further, the PAD4 antigen is bound to the immobilized antibody or the like. The form may be sufficient. In addition, the kit may further contain known reagents necessary for various immunoassays.
これらのキットは、本発明の関節リウマチ検出方法を実施するために用いることもできる。すなわち、本発明は、上記PAD4測定キット及び/又は上記抗PAD4自己抗体測定キットから成る関節リウマチ検出キットをも提供する。本発明の関節リウマチ検出方法において、PAD4の測定と抗PAD4自己抗体の測定の両者を行う場合には、関節リウマチ測定キットは上記PAD4測定キット及び上記抗PAD4自己抗体測定キットから成るが、この場合、関節リウマチ測定キットにおいて、PAD4測定キットと抗PAD4自己抗体測定キットが明瞭に区別できる形態で含まれていなくともよい。具体的には、例えば、上記した2つの測定キット中に含まれる抗PAD4モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、PAD4測定用の抗体等と抗PAD4自己抗体測定用の抗体等とに分けられていてもよいし、1つの容器に一括して含まれていてもよい。 These kits can also be used to carry out the rheumatoid arthritis detection method of the present invention. That is, the present invention also provides a rheumatoid arthritis detection kit comprising the PAD4 measurement kit and / or the anti-PAD4 autoantibody measurement kit. In the rheumatoid arthritis detection method of the present invention, when both PAD4 measurement and anti-PAD4 autoantibody measurement are performed, the rheumatoid arthritis measurement kit comprises the PAD4 measurement kit and the anti-PAD4 autoantibody measurement kit. In the rheumatoid arthritis measurement kit, the PAD4 measurement kit and the anti-PAD4 autoantibody measurement kit may not be included in a form that can be clearly distinguished. Specifically, for example, the anti-PAD4 monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof contained in the two measurement kits described above is divided into an antibody for measuring PAD4 and the like and an antibody for measuring anti-PAD4 autoantibody and the like. It may be included in one container.
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
1. ヒト4型ペプチジルアルギニンデイミナーゼ(PAD4)組換えタンパク質の作製
PAD4遺伝子(配列番号1)は、レチノイン酸処理したヒト白血病細胞HL60から抽出した全RNAを用いて、RT-PCR法により単離した。すなわち、上記全RNAからoligo-dTプライマーによりcDNAを合成し、該cDNAを鋳型として、pENTR-hPAD4-F 5'-CACCATGGCCCAGGGGACATTGA-3' (23 mer)(配列番号3)とpENTR-hPAD4-R 5'-CCGAATTCGCGGCCGCGAGCTCTTGCTTGCCACAC-3' (35 mer)(配列番号4)をプライマーとして用いてPCRを行ない(94℃−1分、55℃−1分、72℃−2分を30サイクル、Taqポリメラーゼ(インビトロジェン社)及び添付のバッファーを使用)、PAD4 cDNAを増幅した。得られたPAD4 cDNAをGateway Technology(インビトロジェン社)を用いてpENRT/D-TOPO ベクター(インビトロジェン社)に挿入した。次に、PAD4組換えタンパク質を作製するため、PAD4遺伝子をN末端に6個のヒスチジン(6×His)配列を持つpDEST17ベクター(インビトロジェン社)に組み換え、大腸菌BL21-AIを用いて6×His-PAD4として組換えタンパク質を作製した。6×His-PAD4組換えタンパク質はNi-NTA アガロースビーズ(Qiagen)を用いて電気泳動による単一のバンド(分子量約74 kDa)が得られるレベルにまで精製した(図1)。また、PAD4組換えタンパク質の酵素活性は、benzoyl-L-arginine ethyl ester (BAEE)を基質にして測定した。即ち、PAD4組換えタンパク質と200 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM CaCl2, 10 mM DTT, 20 mM BAEEを25 μlずつ混合し、50℃で1時間反応させた。1時間後、5 M過塩素酸を12.5 μl加えて反応を停止し、氷上に20分間放置した。反応液50μlに比色定量用試薬(0.0416% FeCl3・6H2O:H2SO4:H2PO4(50:25:20)と0.5% ジアセチルモノオキシム, 0.01% チオセミルバジドを2 : 1で混合)950 μlを加え、煮沸水浴で5分間反応後、530 nmで吸光度を測定した。PAD4活性は、約10 U/mlであった。
1. Preparation of human type 4 peptidylarginine deiminase (PAD4) recombinant protein
The PAD4 gene (SEQ ID NO: 1) was isolated by RT-PCR using total RNA extracted from retinoic acid-treated human leukemia cells HL60. That is, cDNA was synthesized from the above total RNA using an oligo-dT primer, and pENTR-hPAD4-F 5′-CACCATGGCCCAGGGGACATTGA-3 ′ (23 mer) (SEQ ID NO: 3) and pENTR-hPAD4-R 5 using the cDNA as a template. PCR was performed using '-CCGAATTCGCGGCCGCGAGCTCTTGCTTGCCACAC-3' (35 mer) (SEQ ID NO: 4) as a primer (94 ° C-1 min, 55 ° C-1 min, 72 ° C-2 min 30 cycles, Taq polymerase (Invitrogen) ) And the attached buffer), PAD4 cDNA was amplified. The obtained PAD4 cDNA was inserted into the pENRT / D-TOPO vector (Invitrogen) using Gateway Technology (Invitrogen). Next, in order to prepare a PAD4 recombinant protein, the PAD4 gene was recombined into a pDEST17 vector (Invitrogen) having 6 histidine (6 × His) sequences at the N-terminus, and 6 × His− using E. coli BL21-AI. A recombinant protein was prepared as PAD4. The 6 × His-PAD4 recombinant protein was purified to a level at which a single band (molecular weight of about 74 kDa) was obtained by electrophoresis using Ni-NTA agarose beads (Qiagen) (FIG. 1). In addition, the enzyme activity of the PAD4 recombinant protein was measured using benzoyl-L-arginine ethyl ester (BAEE) as a substrate. That is, 25 μl each of PAD4 recombinant protein, 200 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM CaCl 2 , 10 mM DTT, and 20 mM BAEE were mixed and reacted at 50 ° C. for 1 hour. After 1 hour, 12.5 μl of 5 M perchloric acid was added to stop the reaction and left on ice for 20 minutes. Add 50 μl of the reaction solution to the colorimetric reagent (0.0416% FeCl 3 · 6H 2 O: H 2 SO 4 : H 2 PO 4 (50:25:20), 0.5% diacetyl monooxime, 0.01% thiosemilubazide in 2: 1 Mixing) 950 μl was added, and after 5 minutes of reaction in a boiling water bath, the absorbance was measured at 530 nm. PAD4 activity was approximately 10 U / ml.
2. 抗PAD4モノクローナル抗体の樹立
抗PAD4モノクローナル抗体は、上記1.で示したPAD4組換えタンパク質をBALB/Cマウスのフットパットに免疫し、所属リンパ節リンパ球とミエローマ細胞を融合することにより作製した。即ち、BALB/Cマウスに対し、フロイント完全アジュバントでエマルジョン化したPAD4組換えタンパク質を25〜50μg/マウスでフットパットに初回免疫を行い、3週間後、リコンビナントPAD4(25〜50μg/マウス)のみを追加免疫した。3日後、マウス後ろ肢リンパ節からリンパ球を取り出し、前もってRPMI-1640培地で培養していたマウスミエローマ細胞(P3U1)と脾細胞を1:3の比率で混合し、PEG(ベーリンガー社製)を用い細胞融合を行った。融合した細胞はHAT培地に浮遊した後、96well培養プレートに分注し、37℃ CO2インキュベータで培養した。
2. Establishment of anti-PAD4 monoclonal antibody Anti-PAD4 monoclonal antibody is prepared by immunizing the footpad of BALB / C mouse with the PAD4 recombinant protein shown in 1 above and fusing the lymph node lymphocytes with myeloma cells. did. Namely, BALB / C mice were first immunized with 25-50 μg / mouse of PAD4 recombinant protein emulsified with Freund's complete adjuvant, and after 3 weeks, only recombinant PAD4 (25-50 μg / mouse) Boosted. Three days later, lymphocytes were removed from the mouse hind limb lymph nodes, mixed with mouse myeloma cells (P3U1) and spleen cells previously cultured in RPMI-1640 medium at a ratio of 1: 3, and PEG (Boehringer) was added. Cell fusion was performed. The fused cells were suspended in a HAT medium, dispensed into a 96-well culture plate, and cultured in a 37 ° C. CO 2 incubator.
PAD4特異抗体産生細胞のスクリーニングは抗原固相ELISA法にて行った。即ち、上記1.で示したPAD4組換えタンパク質を96well ELISAプレート(ファルコン社製)に1μg/mlの濃度で50μl/well分注し、4℃で一晩放置することにより吸着させた。1%スキムミルク(Difco社製)でブロッキングした後、洗浄Buffer(0.05% Tween20を含むPBS)で3回洗浄し、細胞融合を行ったプレートの培養上清50μlを加え、37℃で1時間反応させた。同様に、洗浄Bufferで3回洗浄後、POD標識抗マウスイムノグロブリン抗体(DACO社製)を加え、さらに37℃で1時間反応させた。洗浄Bufferで4回洗浄後、基質ABTS(和光純薬社製)を加え発色の見られるwellを選択した。この様にして抗PAD4抗体産生細胞のwellを選択した。最終的にPAD4-541抗体産生細胞とPAD4-543抗体産生細胞を確立し、これらの細胞から産生される抗体をELISA系の検討に用いた。 Screening for PAD4-specific antibody-producing cells was performed by antigen solid-phase ELISA. That is, 50 μl / well of the PAD4 recombinant protein shown in 1. above was dispensed to a 96-well ELISA plate (Falcon) at a concentration of 1 μg / ml and allowed to stand overnight at 4 ° C. After blocking with 1% skim milk (Difco), wash 3 times with Wash Buffer (PBS containing 0.05% Tween 20), add 50 μl of the culture supernatant of the cell-fused plate, and react at 37 ° C for 1 hour. It was. Similarly, after washing 3 times with Wash Buffer, POD-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (DACO) was added, and further reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing 4 times with Wash Buffer, substrate ABTS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and wells showing color development were selected. In this way, wells of anti-PAD4 antibody-producing cells were selected. Finally, PAD4-541 antibody-producing cells and PAD4-543 antibody-producing cells were established, and the antibodies produced from these cells were used for examination of the ELISA system.
3. PAD4測定サンドイッチELISA系の確立
PAD4組換えタンパク質を抗原としてサンドイッチELISA系を確立した。即ち、NUNC社製ELISAプレート(POLYSORB) にPAD4-541抗体を10μg/mlの濃度にPBS 7.4で希釈し、100μl/wellづつ入れ、4 ℃で一晩放置し吸着させた。次に5%スキムミルク含有トリス緩衝液(pH 7.4)を200μl/well入れ、37℃で5時間放置しMaskingを行った。洗浄緩衝液(0.05%Tween20含有PBS 7.4)で3回洗浄後、PAD4組換えタンパク質を1%BSA-PBSで10ng/mlに調整し、100μg/well入れ、37℃で1時間反応させた。特異性を確認するため、PAD1、2、3についても組換えタンパク質を作製して20ng/mlに調整後、同様に反応させた。洗浄緩衝液で3回洗浄、アルカリフォスファターゼ(ALP)標識PAD4-543抗体を100μl/well入れ、37℃で1時間反応させた。洗浄緩衝液で充分洗浄し、基質PNPPを100μl/well入れ室温で37℃、2時間放置後、405nmの波長を測定した。その結果、図2に示すように、固相抗体及び標識抗体の抗原であるPAD4を反応させた時のみ吸光度が高く(hPAD-4)、一方で、PAD4と約60%のアミノ酸相同性を持つ他のPADファミリーであるPAD1, PAD2, PAD3は、上記固相抗体と標識抗体の組み合わせではほとんど結合しないことが確認された(hPAD-1、hPAD-2、およびhPAD-3)。このように、本固相抗体と標識抗体の組合せで、PAD4組換えタンパク質が特異的に測定できることが確認された。
3. Establishment of PAD4 measurement sandwich ELISA system
A sandwich ELISA system was established using PAD4 recombinant protein as an antigen. Specifically, PAD4-541 antibody was diluted with PBS 7.4 to a concentration of 10 μg / ml on an ELISA plate (POLYSORB) manufactured by NUNC, and 100 μl / well was added and allowed to stand overnight at 4 ° C. for adsorption. Next, 200 μl / well of 5% skim milk-containing Tris buffer (pH 7.4) was added and left at 37 ° C. for 5 hours for masking. After washing 3 times with a washing buffer solution (PBS 7.4 containing 0.05% Tween20), the PAD4 recombinant protein was adjusted to 10 ng / ml with 1% BSA-PBS, added at 100 μg / well, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. In order to confirm the specificity, a recombinant protein was prepared for PAD1, 2 and 3 and adjusted to 20 ng / ml and reacted in the same manner. After washing 3 times with a washing buffer, 100 μl / well of alkaline phosphatase (ALP) -labeled PAD4-543 antibody was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After thoroughly washing with a washing buffer, 100 μl / well of the substrate PNPP was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours at 37 ° C., and then the wavelength of 405 nm was measured. As a result, as shown in FIG. 2, the absorbance is high only when PAD4, which is an antigen of the solid phase antibody and the labeled antibody, is reacted (hPAD-4), while it has about 60% amino acid homology with PAD4. It was confirmed that the other PAD families, PAD1, PAD2, and PAD3, hardly bind with the combination of the solid phase antibody and the labeled antibody (hPAD-1, hPAD-2, and hPAD-3). Thus, it was confirmed that the PAD4 recombinant protein can be specifically measured by the combination of the solid phase antibody and the labeled antibody.
4. 血中のPAD4測定とEDTA添加
血清/血漿中のPAD4測定を上記3.で確立したサンドイッチELISA測定系で行った。
4. Measurement of PAD4 in blood and addition of EDTA PAD4 in serum / plasma was measured by the sandwich ELISA measurement system established in 3 above.
まず、上記3.のPAD4組換えタンパク質の代わりに、健常者血清又は血漿を、ウシ血清及び無関係なモノクローナル抗体を含有したPBS(pH 7.4)で3倍希釈したものをサンプルとして用いてELISAを行ったところ、明確な値が得られなかった。そこで、上記サンプルに一定量(5 ng/ml)のPAD4組換えタンパク質を添加したもの(Hu. Serum-1及び2)を用いて同様に測定を行なった。コントロールサンプルとして、PBSのみ又はウシ血清アルブミン(BSA)と無関係なモノクローナル抗体を含有したPBSに一定量(5 ng/ml)のPAD4組換えタンパク質を添加したものを調製し、同様に測定した。 First, instead of the PAD4 recombinant protein of 3. above, ELISA was performed using a sample obtained by diluting healthy subject serum or plasma three times with PBS containing bovine serum and an irrelevant monoclonal antibody (pH 7.4). As a result, a clear value was not obtained. Therefore, the same measurement was performed using the above samples (Hu. Serum-1 and 2) to which a certain amount (5 ng / ml) of PAD4 recombinant protein was added. As a control sample, PBS alone or a PBS containing a monoclonal antibody unrelated to bovine serum albumin (BSA) to which a fixed amount (5 ng / ml) of PAD4 recombinant protein was added was prepared and measured in the same manner.
その結果、図3(a)に示すように、血清/血漿にPAD4組換えタンパク質を添加したサンプルでは、その反応が阻害され、適切な測定値が得られなかった。これに対して、血清/血漿サンプルにEDTAを5mMの終濃度で添加した場合、その反応阻害は解消され、コントロールと同程度の適切な測定値が得られた(図3(b))。これはPAD4がCa2+要求性酵素であることによると考えられる。免疫原やスクリーニングに用いたPAD4組換えタンパク質はCa2+非存在下で用いているが、血中PAD4は高濃度のCa2+存在下にあるため立体構造が異なっていると考えられる。従って、EDTAによりCa2+を除去しCa2+非存在下の構造に戻す必要があると考えられる。 As a result, as shown in FIG. 3 (a), in the sample in which the PAD4 recombinant protein was added to the serum / plasma, the reaction was inhibited and an appropriate measurement value could not be obtained. On the other hand, when EDTA was added to the serum / plasma sample at a final concentration of 5 mM, the reaction inhibition was eliminated, and an appropriate measurement value similar to that of the control was obtained (FIG. 3 (b)). This is probably because PAD4 is a Ca 2+ -requiring enzyme. The PAD4 recombinant protein used for immunogens and screening is used in the absence of Ca 2+, but blood PAD4 is thought to have a different steric structure because it is in the presence of a high concentration of Ca 2+ . Therefore, it is considered necessary to remove Ca 2+ by EDTA and return to the structure in the absence of Ca 2+ .
5. 関節リウマチ患者血清/血漿でのPAD4の測定
関節リウマチ患者23例、健常者10例の血清/血漿中におけるPAD4の測定を上記3.および上記4.で確立したサンドイッチELISA測定系で行った。即ち、上記3.のPAD4組換えタンパク質の代わりに、関節リウマチ患者および健常者の血清又は血漿を、ウシ血清及び無関係なモノクローナル抗体を含有したPBS(pH 7.4)でそれぞれ3倍希釈し、且つ、終濃度5mMのEDTAを添加したものをサンプルとしてELISAを行った。
5. Measurement of PAD4 in serum / plasma of patients with rheumatoid arthritis Measurement of PAD4 in serum / plasma of 23 patients with rheumatoid arthritis and 10 healthy subjects was performed using the sandwich ELISA measurement system established in 3 and 4 above. . That is, instead of the PAD4 recombinant protein of 3. above, the serum or plasma of rheumatoid arthritis patients and healthy subjects is diluted 3-fold with PBS (pH 7.4) containing bovine serum and an irrelevant monoclonal antibody, and ELISA was performed using a sample to which EDTA having a final concentration of 5 mM was added.
その結果、図4に示すように、関節リウマチ患者23例中13例が健常者M+2SD(0.20ng/ml)以上の高値を示した。また、関節リウマチ患者23例中9例がPAD4の値が0であった。一方、健常者には0値は認められなかった。CRP(C反応性蛋白), ESR30(30分間赤血球沈降速度), ESR60(60分間赤血球沈降速度), RF(リウマチ因子), MMP-3, 抗GAL抗核抗体, 抗CCP抗体, C3(補体), C4(補体), WBC(白血球), Hb(ヘモグロビン), Plt(血小板)など他の臨床検査項目との相関性を調べたが、PAD4と有意な相関を示すものは無かった。また、抗CCP抗体以外これら測定項目が有意に関節リウマチ患者を確定するデータも得られなかった。従って、上記3.と上記4.で示したPAD4 ELISA系は既存の臨床検査項目では検出できないほど高感度に、そして特異的に関節リウマチの診断が可能であることが示された。 As a result, as shown in FIG. 4, 13 out of 23 patients with rheumatoid arthritis showed a high value of M + 2SD (0.20 ng / ml) or higher in healthy subjects. Nine of 23 patients with rheumatoid arthritis had a PAD4 value of zero. On the other hand, 0 values were not observed in healthy subjects. CRP (C-reactive protein), ESR30 (30 minute erythrocyte sedimentation rate), ESR60 (60 minute erythrocyte sedimentation rate), RF (rheumatic factor), MMP-3, anti-GAL antinuclear antibody, anti-CCP antibody, C3 (complement) ), C4 (complement), WBC (leukocyte), Hb (hemoglobin), Plt (platelet) and other clinical laboratory items were examined, but none showed significant correlation with PAD4. In addition, data other than anti-CCP antibodies that significantly determined these rheumatoid arthritis patients could not be obtained. Therefore, it was shown that the PAD4 ELISA system shown in the above 3 and 4 is so sensitive that it cannot be detected by existing clinical test items, and that it can specifically diagnose rheumatoid arthritis.
6. 関節リウマチ患者血清/血漿でのPAD4自己抗体の測定
関節リウマチ患者23例中9例でPAD4値が0を示した原因を明らかにするため、関節リウマチ患者の血清/血漿中でのPAD4自己抗体の有無を調べた。
6. Measurement of PAD4 autoantibodies in rheumatoid arthritis patients serum / plasma In order to clarify the cause of PAD4 value being zero in 9 of 23 rheumatoid arthritis patients, PAD4 self in serum / plasma of rheumatoid arthritis patients The presence or absence of antibodies was examined.
PAD4自己抗体の有無を調べるため、PAD4組換えタンパク質を抗原としてサンドイッチELISA系を確立した。即ち、NUNC社製ELISAプレート(POLYSORB) にPAD4を2.5 μg/mlの濃度にPBS 7.4で希釈し、100μl/1wellづつ入れ、4 ℃で一晩放置し吸着させた。次に5%スキムミルク(Difco社製)含有トリス緩衝液(pH 7.4)を200μl/well入れ、37℃で5時間放置しMaskingを行った。洗浄緩衝液(0.05%Tween20含有PBS 7.4)で3回洗浄後、関節リウマチ患者の血清/血漿をウシ血清アルブミン含有-PBSで50倍希釈し、100μl/well入れ、37℃で1時間反応させた。洗浄緩衝液で3回洗浄、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(POD)標識ヒトIgG抗体(DAKO社製)を100μl/well入れ、37℃で1時間反応させた。洗浄緩衝液で充分洗浄し、基質ABTSを100μl /well入れ37℃で30分放置後、405nmの波長を測定した。上記5.で示したPAD4値が0値を示した関節リウマチ患者7例と健常者32例の測定結果を図5に示した。関節リウマチ患者7例中6例でPAD4自己抗体の存在が示唆された。そこで、ELISA反応時、関節リウマチ患者の血漿に予めPAD4組換えタンパク質を加えインキュベートしたところ、6例中5例で発色の阻害が確認され、自己抗体の存在が確認された。従って、PAD4自己抗体の測定系が特異的であることも確認できた。 In order to examine the presence of PAD4 autoantibodies, a sandwich ELISA system was established using PAD4 recombinant protein as an antigen. That is, PAD4 was diluted with PBS 7.4 to a concentration of 2.5 μg / ml on an ELISA plate (POLYSORB) manufactured by NUNC, and 100 μl / well was added and allowed to stand overnight at 4 ° C. for adsorption. Next, 200 μl / well of 5% skim milk (Difco) -containing Tris buffer (pH 7.4) was added and left at 37 ° C. for 5 hours for masking. After washing 3 times with a washing buffer (PBS 7.4 containing 0.05% Tween20), serum / plasma of patients with rheumatoid arthritis was diluted 50-fold with bovine serum albumin-containing PBS and added at 100 μl / well and reacted at 37 ° C. for 1 hour. . After washing 3 times with a washing buffer, 100 μl / well of horseradish peroxidase (POD) labeled human IgG antibody (manufactured by DAKO) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After thoroughly washing with a washing buffer, 100 μl / well of substrate ABTS was added and allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes, and then a wavelength of 405 nm was measured. FIG. 5 shows the measurement results of 7 patients with rheumatoid arthritis and the 32 healthy subjects whose PAD4 values shown in 5 above were 0. The presence of PAD4 autoantibodies was suggested in 6 out of 7 patients with rheumatoid arthritis. Therefore, when ELISA reaction was performed, PAD4 recombinant protein was added in advance to the plasma of patients with rheumatoid arthritis and incubated. In 5 of 6 cases, inhibition of color development was confirmed, and the presence of autoantibodies was confirmed. Therefore, it was also confirmed that the PAD4 autoantibody measurement system was specific.
PAD4自己抗体はウエスタンブロット法でも確認した。すなわち、PAD4組換えタンパク質を電気泳動し、PVDF膜(ミリポア社)に転写した。ELISAでPAD4自己抗体陽性を示した関節リウマチ患者5例と健常者5例の血清/血漿をPBSで200倍希釈し、PVDF膜にふりかけ、抗原抗体反応を行わせた。抗体陽性コントロールとしてPAD4-541抗体を用いた。二次抗体にはHRP標識ヒトIgG抗体を用い、ECL化学発光(アマシャムファルマシア社)によりバンドを検出した。その後、PVDF膜はCBB(クマシーブリリアントブルー)染色を行った。その結果、ELISAでPAD4自己抗体陽性を示した関節リウマチ患者5例の全てでバンドが確認され、該5例のリウマチ患者は全て自己抗体が存在することが確認できた。一方、ELISAでPAD4陰性であった健常者5例では自己抗体は存在しなかった。従って、関節リウマチ患者ではPAD4自己抗体を持っている人と持っていない人の2種類に分けることが出来ることが示された。PAD4自己抗体を持っていない関節リウマチ患者は上記5.で示したように血清/血漿中のPAD4が高値を示した。 PAD4 autoantibodies were also confirmed by Western blotting. That is, the PAD4 recombinant protein was electrophoresed and transferred to a PVDF membrane (Millipore). Serum / plasma of 5 patients with rheumatoid arthritis and 5 healthy subjects who showed positive PAD4 autoantibodies by ELISA was diluted 200-fold with PBS and sprinkled on PVDF membrane to cause antigen-antibody reaction. PAD4-541 antibody was used as an antibody positive control. The HRP-labeled human IgG antibody was used as the secondary antibody, and the band was detected by ECL chemiluminescence (Amersham Pharmacia). Thereafter, the PVDF membrane was stained with CBB (Coomassie Brilliant Blue). As a result, a band was confirmed in all 5 patients with rheumatoid arthritis who showed positive PAD4 autoantibodies by ELISA, and it was confirmed that all 5 rheumatoid patients had autoantibodies. On the other hand, no autoantibodies were present in 5 healthy subjects who were PAD4 negative by ELISA. Therefore, it was shown that patients with rheumatoid arthritis can be divided into two types: those who have PAD4 autoantibodies and those who do not. Rheumatoid arthritis patients who did not have PAD4 autoantibodies showed high levels of PAD4 in serum / plasma as shown in Section 5 above.
以上のように、(1)血清/血漿中PAD4自己抗体の有無の測定、(2)血清/血漿中PAD4値の測定の2種類のELISA測定系を組み合わせることにより、87%以上の確率で関節リウマチの診断が可能である。 As described above, joints have a probability of 87% or more by combining two types of ELISA measurement systems: (1) measurement of presence / absence of PAD4 autoantibodies in serum / plasma and (2) measurement of PAD4 levels in serum / plasma. Diagnosis of rheumatism is possible.
7. PAD4-541固相プレートを用いたPAD4自己抗体の検出法
次に、バックグラウンドの低減等のため上記6.のPAD4自己抗体を検出する方法を改良した。上記6.では抗原を直接固相化するのに対し、改良法はMabで抗原を間接的に捕らえることに特徴がある。即ち、抗PAD4MabであるPAD4−541を、96well ELISAプレート(NUNC社製poly sorp)に10μg/mlの濃度で100μl/well分注し、4℃で一晩放置することにより吸着させた。1%スキムミルクでブロッキングした後、洗浄Buffer(0.05% Tween20を含むPBS)で3回洗浄し、組み換えPAD4(0.2μg/ml)100μl/wellを加え、37℃で1時間反応させた。同様に、洗浄Bufferで3回洗浄後、新たに追加した検体を含め34例のリウマチ患者血漿を1%BSA含有PBS7.4で100倍希釈し100μl/well加え37℃、1時間反応させた。次に、洗浄Bufferで3回洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識標識抗ヒトIgG抗体(Zymet社製)を加え、さらに37℃で1時間反応させた。洗浄Bufferで4 回洗浄後、基質pNPPを加え37℃、1時間放置後405nmの吸光度を測定した。その結果、下記表1に示すように、本自己抗体測定法(PAD541固相サンドイッチELISA法)は上記6.で示した直接抗原固相法に比較し高い陽性率を示すことが確認された。
7. Detection method of PAD4 autoantibodies using PAD4-541 solid phase plate Next, the method for detecting PAD4 autoantibodies described in 6. above was improved in order to reduce the background. In the above 6., the antigen is directly immobilized, whereas the improved method is characterized in that the antigen is indirectly captured by Mab. That is, PAD4-541, an anti-PAD4Mab, was adsorbed by dispensing 100 μl / well at a concentration of 10 μg / ml in a 96-well ELISA plate (poly sorp manufactured by NUNC) and leaving it overnight at 4 ° C. After blocking with 1% skim milk, the plate was washed 3 times with Wash Buffer (PBS containing 0.05% Tween 20), 100 μl / well of recombinant PAD4 (0.2 μg / ml) was added, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Similarly, after washing with Wash Buffer three times, 34 patients' rheumatism patient plasma including newly added specimens were diluted 100-fold with 1% BSA-containing PBS 7.4 and added at 100 μl / well and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Next, after washing 3 times with Wash Buffer, alkaline phosphatase-labeled anti-human IgG antibody (manufactured by Zymet) was added, and further reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing 4 times with Wash Buffer, the substrate pNPP was added and allowed to stand at 37 ° C for 1 hour, and the absorbance at 405 nm was measured. As a result, as shown in Table 1 below, it was confirmed that this autoantibody measurement method (PAD541 solid phase sandwich ELISA method) showed a higher positive rate than the direct antigen solid phase method described in 6. above.
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