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JP5109131B2 - 膀胱癌を診断する方法 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、膀胱癌を検出および診断する方法、ならびに膀胱癌および膀胱癌転移を治療および予防する方法に関する。本発明はまた、膀胱癌に関連する遺伝子およびポリペプチドに関する。
本出願は、2005年2月10日に出願した米国仮特許出願第60/652,318号および2005年7月27日に出願した米国仮特許出願第60/703,225号の恩典を主張し、これらの内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
発明の背景
膀胱癌はヒト集団において2番目に多く見られる泌尿生殖器腫瘍であり、全世界で毎年、およそ261,000件の新たな症例が発生している。その約1/3は、診断時に浸潤性疾患または転移性疾患となっている可能性が高い(Parkin DM, et al., (1999) CA Cancer J Clin; 49:33-64(非特許文献1))。根治的膀胱切除術は、局所的であるが筋層浸潤性膀胱癌を有する患者を治療するための「最も標準的な治療法」であるとみなされているが、そのような患者の約50%は膀胱切除術後2年以内に転移を発症し、その後その疾患により死亡する(Sternberg CN., (1995) Ann Oncol; 6:113-26(非特許文献2))。
微小転移を治療するため、およびより大きな新生物の切除可能性を改善するため、筋層浸潤性膀胱癌には、通常ネオアジュバント化学療法が処方される(Fagg SL, et al., (1984) Br J Urol; 56:296-300(非特許文献3)、Raghavan D, et al., (1984) Med J Aust; 140:276-8(非特許文献4))。メトトレキセート、ビンブラスチン、ドキソルビシン、およびシスプラチンを含む治療法(M-VAC)を行った後に根治的膀胱切除術を行うと、根治的膀胱切除術のみを行うよりも残存する癌を除去できる可能性が高くなり、したがって局所進行膀胱癌患者の生存率が改善される((2003) Lancet; 361:1927-34(非特許文献5)、Grossman HB, et al., (2003) N Engl J Med; 349:859-66(非特許文献6))。いくつかの臨床試験において、薬物による手術前の病期低下が有意な延命効果を有することが示された(Grossman HB, et al., (2003) N Engl J Med; 349:859-66(非特許文献6)、Splinter TA,et al., (1992) J Urol; 147:606-8(非特許文献7))；さらに、ネオアジュバント化学療法に好反応を示す患者は、膀胱機能を維持し、生活の質の改善を享受できる。しかしながら、M-VACなどの化学療法に対する個々の患者の反応を予測する方法は未だ存在せず、患者によっては、陽性効果に関して何ら利点を得ることなしに薬物の副作用に苦しむことになり、患者の健康状態が悪化した際に、さらなる治療の機会を失ってしまう場合も多い。したがって、膀胱癌患者用の新規薬物を開発するための分子標的を同定することは非常に重要である。最近のいくつかの研究から、ヒト腫瘍においてcDNAマイクロアレイ解析により作成された遺伝子発現情報が、従来の組織病理学的方法では明らかにされなかった明確な腫瘍分類を同定する分子表現型解析を提供し得ることが実証されている(Armstrong, S. A, et al., (2002) Nat Genet, 30: 41-47(非特許文献8)；Golub, T. R, et al., (1999) Science, 286: 531-537(非特許文献9)；Hofmann, W. K et al., (2002) Lancet, 359: 481-486(非特許文献10))。さらに、いくつかの研究から、新たな癌関連遺伝子を同定する上でこの方法が有効であることが実証されている。このような情報は、新生物疾患に関する臨床的戦略を改善する可能性において見込みがある。
Parkin DM, et al., (1999) CA Cancer J Clin; 49:33-64 Sternberg CN., (1995) Ann Oncol; 6:113-26 Fagg SL, et al., (1984) Br J Urol; 56:296-300 Raghavan D, et al., (1984) Med J Aust; 140:276-8 (2003) Lancet; 361:1927-34 Grossman HB, et al., (2003) N Engl J Med; 349:859-66 Splinter TA,et al., (1992) J Urol; 147:606-8 Armstrong, S. A, et al., (2002) Nat Genet, 30: 41-47 Golub, T. R, et al., (1999) Science, 286: 531-537 Hofmann, W. K et al., (2002) Lancet, 359: 481-486
発明の概要
したがって、本明細書で報告する研究の中で、本発明者らは、解析用の純粋な癌細胞集団を得ることを目的とした腫瘍のレーザーマイクロビームマイクロダイセクション(LMM)と組み合わせて、転写要素27,648個からなるcDNAマイクロアレイにより、浸潤性膀胱癌症例33例から得られたゲノム全体の情報を用いて、新規分子標的を同定した。これらの結果から、このような情報が最終的に我々の目標である「個別化治療」につながり得ることが示唆される。
新規治療標的を開発することを目的として、膀胱癌に関連する詳細な分子機構を特徴づけるため、本発明者らは、レーザーマイクロビームマイクロダイセクション(LMM)とともに、遺伝子27,648個を提示するcDNAマイクロアレイを用いて、癌細胞33例の遺伝子発現プロファイルを解析した。膀胱癌と診断された患者の癌細胞と正常ヒト膀胱細胞(汎用対照として使用)の発現パターンを比較することにより、膀胱癌細胞において一般に上方制御される遺伝子394個が同定された。これら遺伝子のうち288個は、膀胱癌細胞において上方制御された、機能的に特徴づけられた遺伝子を表す；しかし、残りの遺伝子106個(EST 51個を含む)の機能は現在のところ不明である。さらに、遺伝子1272個が、膀胱癌細胞において一般に下方制御されると同定された。これらのうち1026個は、膀胱癌細胞において下方制御された、機能的に特徴づけられた遺伝子を表す；しかし、残りの246個(EST 119個を含む)の機能は現在のところ不明である。上方制御される代表的な遺伝子44個の半定量的RT-PCR実験に含まれた遺伝子から、本発明者らのマイクロアレイ解析の結果が支持された。したがって、本明細書におけるデータは、その産物が膀胱癌を治療するための分子標的となり得る候補遺伝子を見出すための有用な情報を提供すると考えられる。
本発明は、膀胱癌(BLC)と相関する遺伝子発現パターンの発見に基づく。膀胱癌において差次的に発現される遺伝子を、本明細書では「BLC核酸」または「BLCポリヌクレオチド」と総称し、対応するコードされたポリペプチドを「BLCポリペプチド」または「BLCタンパク質」と称する。
膀胱癌の発現プロファイルを通して、本発明者らは、膀胱癌細胞において有意に過剰発現される、それぞれC2093、B5860N、およびC6055と標示される2つの特異的な遺伝子を同定した。さらに本発明者らは、B5860NおよびC6055遺伝子の新規な転写変異体を単離した。さらに、siRNAによる膀胱癌細胞の処理がC2093、B5860N、およびC6055の発現を効率的に阻害し、膀胱癌の細胞/腫瘍増殖を抑制することが実証された。これらの知見から、C2093、B5860N、およびC6055が腫瘍細胞の増殖において重要な役割を果たし、したがって抗癌剤を開発するための有望な標的であることが示唆される。
C2093の全長mRNA配列は、1780アミノ酸のポリペプチド(SEQ ID NO:2)をコードする6319ヌクレオチド(SEQ ID NO:1)を含んでいた。B5860N遺伝子は、12エキソンおよび11エキソンからなり、それぞれB5860N V1(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4をコードする)およびB5860N V2(SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6をコードする)に対応する2つの異なる転写変異体を有する(図3b)。V1のエキソン8において、選択的変化が存在した；しかし、残りのエキソンは両変異体に共通していた。V2変異体にはV1のエキソン8はないが、最後のエキソン内に同じ終止コドンを生じる。B5860NV1およびB5860NV2変異体の全長cDNA配列は、それぞれ5318および4466ヌクレオチドからなる。これら変異体のORFは、それぞれのエキソン1において開始する。V1およびV2転写産物は、最終的にそれぞれ812および528アミノ酸のポリペプチドをコードする。したがって、本明細書で使用する「B5860N」という用語は、B5860NV1およびB5860NV2の転写産物のいずれかまたは両方を指す。つまり、本明細書の文脈において、B5860N遺伝子は少なくとも2つの転写変異体として発現され得ることが明らかになった。膀胱癌細胞株、ならびに膀胱、心臓、肺、肝臓、腎臓、脳、および膵臓を含む正常ヒト組織における各変異体の発現パターンをさらに確認するため、本発明者らはノーザンブロット解析を行った。結果として、いずれの変異体も膀胱癌細胞において高度に過剰発現されるが、しかし正常ヒト組織においては発現していないかまたは検出不能であることが見出された(図2f、下パネル)。特に、精巣でのみV2転写産物が発現していた。C6055遺伝子は、それぞれMGC34032(Genebank登録番号NM_152697、SEQ ID NO:134のポリペプチドをコードするSEQ ID NO:133)、Genbank登録番号AK128063(SEQ ID NO:136のポリペプチドをコードするSEQ ID NO:135)、C6055V1(SEQ ID NO:130のポリペプチドをコードするSEQ ID NO:129)、およびC6055V2(SEQ ID NO:132のポリペプチドをコードするSEQ ID NO:131)に対応する、24、25、22、および22エキソンからなる4つの異なるスプライシング変異体を有する(図3c)。MGC34032のエキソン1、2、3、および24において選択的変化が存在し、その他の残りのエキソンは4つの転写産物に共通していた。C6055V1およびC6055V2転写産物にはMGC34032のエキソン1、2、および3はなく、最後のエキソン内に同じ終止コドンを生じる。さらに、C6055V1、C6055V2、およびGenbank登録番号AK128063転写産物は、MGC34032とは異なるエキソン24を有する。Genbank登録番号AK128063は、エキソン4aとして新たなエキソンを有する。特に、C6055V1およびC6055V2転写産物のORFはそれぞれのエキソン4において開始し、C6055V1およびC6055V2転写産物は同じORFを有することが示唆される。MGC34032、Genbank登録番号AK128063、C6055V1、およびC6055V2転写産物の全長cDNA配列は、それぞれ2302、3947、3851、および3819ヌクレオチドからなる。MGC34032、Genbank登録番号AK128063、C6055V1、およびC6055V2転写産物は最終的に、それぞれ719、587、675、および675アミノ酸をコードする。したがって、本明細書で使用する「C6055」という用語は、MGC34032、Genbank登録番号AK128063、C6055V1、およびC6055V2の転写産物の1つまたは複数を指す。つまり、本明細書の文脈において、C6055遺伝子は少なくとも4つの転写変異体として発現され得ることが明らかになった。膀胱癌細胞株、ならびに膀胱、心臓、肺、肝臓、腎臓、脳、精巣、膵臓を含む正常ヒト組織における各変異体の発現パターンをさらに確認するため、本発明者らはノーザンブロット解析を行った。その結果、およそ3.9 kbの転写産物がいくつかの膀胱癌細胞(HT-1376、SW780、およびRT4)において高度に過剰発現していたが、正常ヒト組織においては発現していないかまたは検出不能であった(図2g)。加えて、7.5 kbの転写産物がHT1376細胞においてのみ特異的に発現していたが、この転写産物の全mRNA配列はまだ同定されていない。さらに、プローブとしてこれらの転写産物に共通な領域を用いてノーザンブロット解析を行った場合、正常精巣においてのみ、MGC34032に対応する2.3 kb転写産物が検出された(図2h)。そのため、本発明者らは、C6055V1遺伝子産物の機能解析をさらに行う。
多くの抗癌剤は、癌細胞のみならず正常に増殖している細胞に対しても有害である。しかし、C2093、B5860N、およびC6055の正常発現は精巣に限定されているため、C2093、B5860N、およびC6055の発現を抑制する物質は他の器官には悪影響を及ぼさないと考えられ、このため好都合なことに、膀胱癌の治療または予防に使用され得る。
したがって本発明は、膀胱癌の診断マーカーの候補、ならびに膀胱癌診断のための新たな戦略および有効な抗癌剤を開発するための有望な潜在的標的となる新たな転写変異体、B5860NV1を提供する。さらに本発明は、この遺伝子によってコードされるポリペプチド、ならびにそれを産生および使用するための方法も提供する。より具体的には、本発明は、膀胱癌細胞において発現が上昇する新規ヒトポリペプチド、B5860NV1、またはその機能的同等物を提供する。
好ましい態様において、B5860NV1ポリペプチドは、SEQ ID NO:3のオープンリーディングフレームによってコードされる811アミノ酸(SEQ ID NO:4)タンパク質を含む。本出願はまた、B5860NV1タンパク質またはその機能的同等物をコードする範囲で、B5860NV1ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部、またはSEQ ID NO:3に記載の配列と少なくとも15%、より好ましくは少なくとも25%相補的なポリヌクレオチド配列によりコードされる単離されたタンパク質を提供する。このようなポリヌクレオチドの例は、SEQ ID NO:3の配列によってコードされるB5860NV1の変性および対立遺伝子変異体である。
本明細書で用いる場合、単離された遺伝子とは、その構造が任意の天然ポリヌクレオチドの構造と同一でなく、別個の遺伝子3つを上回ってまたがる天然ゲノムポリヌクレオチドの任意の断片の構造とも同一でないポリヌクレオチドのことである。このため、この用語には、例えば(a) 天然に存在する生物のゲノム中の天然ゲノムDNA分子の部分配列を有するDNA；(b) 結果として生じる分子が任意の天然ベクターまたはゲノムDNAとも同一でないような様式で、ベクター中または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組み込まれたポリヌクレオチド；(c) cDNA、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により生成された断片、または制限断片などの独立した分子；および(d) ハイブリッド遺伝子、すなわち、融合ポリペプチドをコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列が含まれる。
したがって1つの局面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたはその断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3に示されるヌクレオチド配列と少なくとも60%同一であるヌクレオチド配列を含む。より好ましくは、単離された核酸分子は、SEQ ID NO:3に示されるヌクレオチド配列と少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上同一である。単離されたポリヌクレオチドが参照配列、例えばSEQ ID NO:3よりも長いかまたはそれと同等の長さである場合には、参照配列の全長との比較が行われる。単離されたポリヌクレオチドが参照配列よりも短い、例えばSEQ ID NO:3よりも短い場合には、同じ長さ(相同性の算出に必要な任意のループを除外して)の参照配列のセグメントに対して比較が行われる。
本発明はまた、B5860NV1タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を用いて宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換を行い、そのポリヌクレオチド配列を発現させることにより、タンパク質を産生する方法を提供する。さらに本発明は、B5860NV1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、およびB5860NV1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する宿主細胞を提供する。このようなベクターおよび宿主細胞は、B5860NV1タンパク質の産生に用いられ得る。
B5860NV1タンパク質を特異的に認識する結合剤もまた、本出願によって提供される。例えば、結合剤は、B5860NV1タンパク質に対して産生された抗体であってよい。または、結合剤は、タンパク質に特異的なリガンド、またはタンパク質と特異的に結合する合成ポリペプチドであってよい(例えば、WO2004/044011を参照されたい)。B5860NV1遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチド(例えば、アンチセンスDNA)、リボザイム、およびsiRNA(低分子干渉RNA)もまた提供される。
したがって、本発明は、組織試料などの患者由来の生体試料におけるBLC関連遺伝子の発現レベルを決定することにより、対象における膀胱癌の素因を診断または判定する方法を提供する。「BLC関連遺伝子」という用語は、正常細胞と比較してBLC細胞において発現レベルが異なることを特徴とする遺伝子を指す。正常細胞とは、膀胱組織から得られた細胞である。本発明の文脈において、BLC関連遺伝子とは表4〜5に列挙される遺伝子(すなわち、BLC番号1〜1666の遺伝子)である。遺伝子の発現レベルがその遺伝子の正常対照レベルと比較して変化していること、例えば上昇または低下していることにより、対象がBLCに罹患しているかまたはBLCを発症するリスクがあることが示される。
本発明の文脈において、「対照レベル」という語句は、対照試料で検出されるタンパク質発現レベルを指し、これには正常対照レベルおよび膀胱癌対照レベルの両方が含まれる。対照レベルは、単一の参照集団に由来する単一の発現パターンであっても、または複数の発現パターンに由来する値であってもよい。例えば、対照レベルは、以前に試験した細胞による発現パターンのデータベースから得ることができる。「正常対照レベル」とは、正常で健康な個体において、または膀胱癌に罹患していないことが判明している個体の集団において検出される遺伝子の発現レベルを指す。正常個体とは、膀胱癌の臨床症状がない個体のことである。これに対して、「BLC対照レベル」とは、BLCに罹患した集団で認められるBLC関連遺伝子の発現プロファイルを指す。
被験試料において検出される、表4に列挙された1つまたは複数のBLC関連遺伝子(すなわち、BLC番号1〜394の過剰発現または上方制御遺伝子)の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇していることにより、(試料を採取した)対象がBLCに罹患しているかまたはBLCを発症するリスクがあることが示される。対照的に、被験試料において検出される、表5に列挙された1つまたは複数のBLC関連遺伝子(すなわち、BLC番号395〜1666の低発現または下方制御遺伝子)の発現レベルが正常対照レベルと比較して低下していることにより、対象がBLCに罹患しているかまたはBLCを発症するリスクがあることが示される。
または、試料における一連のBLC関連遺伝子の発現を、同様の一連の遺伝子のBLC対照レベルと比較することもできる。試料の発現とBLC対照の発現が類似していることにより、(試料を採取した)対象がBLCに罹患しているかまたはBLCを発症するリスクがあることが示される。
本発明によれば、遺伝子発現レベルは、遺伝子の発現が対照レベルと比較して少なくとも10%、好ましくは少なくとも25%、より好ましくは50%またはそれ以上上昇または低下している場合に「変化している」とみなされる。または、発現レベルは、遺伝子発現が対照レベルと比較して少なくとも0.1倍、少なくとも0.2倍、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、または少なくとも10倍もしくはそれ以上上昇または低下している場合に、「上昇している」または「低下している」とみなされる。発現は、患者由来の組織試料の遺伝子転写産物に対するBLC関連遺伝子プローブのハイブリダイゼーションを、例えばアレイにおいて検出することにより決定される。
本発明の文脈において、患者由来の組織試料とは、被験対象から、例えばBLCを有することが判明しているかまたはその疑いがある患者から得られた任意の組織であってよい。例えば、組織は上皮細胞を含み得る。より具体的には、組織は膀胱腺癌に由来する上皮細胞であってよい。
本発明はさらに、対象からの生体試料におけるC2093、B5860N、またはC6055遺伝子の発現レベルを決定する段階、その遺伝子の発現レベルを正常試料における発現レベルと比較する段階、試料におけるC2093、B5860N、またはC6055遺伝子の高い発現レベルにより、対象が膀胱癌に罹患しているかまたは膀胱癌を発症するリスクがあることが示されるとして定義する段階を含む、膀胱癌を診断する方法を提供する。
本発明はまた、表4〜5に列挙されたBLC関連遺伝子の2つまたはそれ以上の遺伝子発現レベルを含む、BLC参照発現プロファイルを提供する。または、BLC参照発現プロファイルは、表4に列挙されたBLC関連遺伝子または表5に列挙されたBLC関連遺伝子の2つまたはそれ以上の発現レベルを含み得る。
本発明はさらに、BLC関連遺伝子を発現する被験細胞を被験化合物と接触させ、BLC関連遺伝子の発現レベルまたはその遺伝子産物の活性を決定することにより、BLC関連遺伝子、例えば表4〜5に列挙されたBLC関連遺伝子の発現または活性を阻害または増強する物質を同定する方法を提供する。被験細胞は、膀胱癌から得られた上皮細胞などの上皮細胞であってよい。上方制御されるBLC関連遺伝子の発現レベルまたはその遺伝子産物の活性が、その遺伝子または遺伝子産物の正常対照レベルまたは活性と比較して低下していることにより、被験物質がBLC関連遺伝子の阻害剤であり、BLCの症状、例えば表4に列挙された1つまたは複数のBLC関連遺伝子の発現を軽減するために使用され得ることが示される。または、下方制御されるBLC関連遺伝子の発現レベルまたはその遺伝子産物の活性が、その遺伝子または遺伝子産物の正常対照レベルまたは活性と比較して上昇していることにより、被験物質がBLC関連遺伝子の発現または機能の増強剤であり、BLCの症状、例えば表5に列挙された1つまたは複数のBLC関連遺伝子の低発現を軽減するために使用され得ることが示される。
さらに、膀胱癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法が本発明により提供される。本方法は、C2093、B5860N、またはC6055ポリペプチドを被験化合物と接触させる段階、およびC2093、B5860N、もしくはC6055ポリペプチドに結合するか、またはそれらの生物活性を変化させる被験化合物を選択する段階を含む。
本発明はさらに、膀胱癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、被験化合物を、C2093、B5860N、もしくはC6055ポリペプチドを発現する細胞、またはレポーター遺伝子の上流にC2093、B5860N、もしくはC6055の転写制御領域を含むベクターを導入した細胞と接触させる段階、およびC2093、B5860N、もしくはC6055ポリペプチドまたはレポーター遺伝子産物の発現レベルまたは活性を抑制する被験化合物を選択する段階を含む方法を提供する。
本発明はまた、1つまたは複数のBLC核酸またはBLCポリペプチドに結合する検出試薬を含むキットを提供する。1つまたは複数のBLC核酸に結合する核酸のアレイもまた提供される。
本発明の治療法には、アンチセンス組成物を対象に投与する段階を含む、対象におけるBLCを治療または予防する方法が含まれる。本発明の文脈において、アンチセンス組成物は特定の標的遺伝子の発現を低下させる。例えば、アンチセンス組成物は、表4に列挙された上方制御されるBLC関連遺伝子からなる群より選択されるBLC関連遺伝子配列に相補的なヌクレオチドを含み得る。または、本方法は、低分子干渉RNA(siRNA)組成物を対象に投与する段階を含み得る。本発明の文脈において、siRNA組成物は、表4に列挙されたBLC関連遺伝子からなる群より選択されるBLC核酸の発現を低下させる。さらなる別の方法では、対象におけるBLCの治療または予防は、リボザイム組成物を対象に投与することによって行われてもよい。本発明の文脈において、核酸特異的リボザイム組成物は、表4に列挙されたBLC関連遺伝子からなる群より選択されるBLC核酸の発現を低下させる。したがって、本発明において、表4に列挙されたBLC関連遺伝子は膀胱癌の好ましい治療標的である。他の治療法には、表5に列挙された下方制御されるBLC関連遺伝子の1つもしくは複数の発現、または表5に列挙されたBLC関連遺伝子の1つもしくは複数によってコードされるポリペプチドの活性を上昇させる化合物を対象に投与する方法が含まれる。
本発明はさらに、本発明によって提供される薬学的組成物を用いて、膀胱癌を治療または予防する方法を提供する。加えて、本発明は、C2093、B5860N、またはC6055ポリペプチドを投与する段階を含む、癌を治療または予防する方法を提供する。C2093、B5860N、またはC6055ポリペプチドを投与することにより、抗腫瘍免疫が誘導されると考えられる。したがって、本発明はまた、抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、C2093、B5860N、またはC6055ポリペプチドを投与する段階を含む方法、ならびにC2093、B5860N、またはC6055ポリペプチドを含む、癌を治療または予防するための薬学的組成物を提供する。
本発明はまた、ワクチンおよびワクチン接種方法を含む。例えば、対象におけるBLCを治療または予防する方法は、表4に列挙されたBLC関連遺伝子からなる群より選択される核酸によってコードされるポリペプチド、またはそのようなポリペプチドの免疫学的活性断片を含むワクチンを対象に投与する段階を含んでもよい。本発明の文脈において、免疫学的活性断片とは、全長の天然タンパク質よりも長さは短いものの、全長タンパク質によって誘導される免疫応答に類似した免疫応答を誘導するポリペプチドのことである。例えば、免疫学的活性断片は、少なくとも8残基長であって、T細胞またはB細胞などの免疫細胞を刺激し得るべきである。免疫細胞の刺激は、細胞増殖、サイトカイン(例えば、IL-2)の産生、または抗体の産生を検出することによって測定することができる。
本発明はまた、膀胱癌を治療または予防するための薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、例えば抗癌剤であってよい。薬学的組成物は、それぞれSEQ ID NO:1、3、5、129、131、133、および135に示され記載されるC2093、B5860N、またはC6055ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンスS-オリゴヌクレオチド、siRNA分子、またはリボザイムの少なくとも一部を含み得る。適切なsiRNAは、SEQ ID NO:21、25、または144の配列を標的とする。したがって、本発明のsiRNAは、SEQ ID NO:21、25、または144から選択されるヌクレオチド配列を含む。これは、好ましくは、本発明に従って膀胱癌を治療または予防するための標的として選択され得る。薬学的組成物はまた、膀胱癌などの細胞増殖性疾患を治療または予防するための化合物をスクリーニングする本方法によって選択される化合物を含む組成物であってもよい。
薬学的組成物の作用過程は、膀胱癌細胞などの癌細胞の増殖を阻害するものであることが望ましい。薬学的組成物は、ヒトおよび家畜哺乳動物を含む哺乳動物に適用され得る。特記しない限り、本明細書で使用する専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載する方法および材料と類似した、またはそれらと同等である方法および材料を、本発明の実施または試行において使用することも可能であるが、適切な方法および材料は本明細書において以下に記載するものである。本明細書において引用した出版物、特許出願、特許、および他の参考文献はすべて、その全文が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾する場合には、本明細書が定義も含め調整する。さらに、材料、方法、および実施例は例証のためのものに過ぎず、制限を意図するものではない。
本明細書に記載する方法の1つの利点は、膀胱癌の明白な臨床症状が検出される前に疾患が同定されることである。本発明のその他の特徴および利点は、添付の図面および実施例ならびに本明細書に添付する特許請求の範囲と併せて以下の詳細な説明を読むことによって、より十分に明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
本明細書で用いる「1つの(a、an)」、および「その(the)」という語は、特記しない限り「少なくとも1つの」を意味する。
一般に膀胱癌細胞は、高度の炎症反応を伴い、種々の細胞成分を含む固形腫瘤(solid mass)として存在する。そのため、以前に公表されたマイクロアレイデータは、不均一なプロファイルを反映している可能性が高い。
これらの問題点を視野に入れて、本発明者らは、レーザーマイクロビームマイクロダイセクション(LMM)の方法により膀胱癌細胞の精製された集団を調製し、遺伝子27,648個を提示するcDNAマイクロアレイを用いて、BLC 33例のゲノム全体の遺伝子発現プロファイルを解析した。これらのデータは、膀胱癌発症に関する重要な情報を提供するのみならず、その産物が診断マーカーおよび/または膀胱癌患者を治療するための分子標的となり得る候補遺伝子の同定を容易にし、臨床的に意義のある情報を提供するはずである。
本発明は、上皮細胞とBLC患者の癌腫とにおいて、複数の核酸の発現パターンの変化を発見したことに一部基づく。遺伝子発現の差は、包括的なcDNAマイクロアレイシステムを用いて同定した。
レーザーマイクロダイセクションとともに、遺伝子27,648個を提示するcDNAマイクロアレイを用いて、BLC 33例からの癌細胞の遺伝子発現プロファイルを解析した。レーザーマイクロダイセクションにより純粋に選択された、BLCと診断された患者の癌細胞と正常腺管上皮細胞との発現パターンを比較することにより、遺伝子394個(表4に示される)が、BLC細胞において一般に上方制御されると同定された。同様に、遺伝子1272個(表5に示される)が、BLC細胞において一般に下方制御されると同定された。さらに、患者の血清または喀痰において癌関連タンパク質を検出する可能性を有する候補分子マーカーの選択を行い、ヒトBLCにおいてシグナル抑制戦略を開発するためのいくつかの潜在的標的を発見した。その中でも、表4および5は、BLCと正常組織との間で発現が変化する遺伝子のリストを提供する。
本明細書において同定された差次的に発現される遺伝子は、BLCのマーカーとして、およびその発現がBLCの症状を治療または軽減するために変更され得るBLC遺伝子標的として、診断上有用である。BLC患者においてその発現レベルが調節を受ける(すなわち、上昇または低下する)遺伝子を表4〜5にまとめ、本明細書ではこれらを「BLC関連遺伝子」、「BLC核酸」、または「BLCポリヌクレオチド」と総称し、対応するコードされたポリペプチドを「BLCポリペプチド」または「BLCタンパク質」と称する。特記しない限り、「BLC」という用語は、本明細書に開示する配列(例えば、表4〜5に列挙されたBLC関連遺伝子)のいずれかを指す。以前に記載されている遺伝子は、データベース登録番号とともに示す。
細胞試料における種々の遺伝子の発現を測定することにより、BLCを診断することができる。同様に、種々の物質に応じてこれら遺伝子の発現を測定することにより、BLCを治療するための物質を同定することができる。
本発明は、表4〜5に列挙されたBLC関連遺伝子の少なくとも1つからすべてまでの発現を決定する(例えば、測定する)ことを含む。既知配列に関するGenBank(商標)データベース登録項目によって提供される配列情報を用いて、当業者に周知の技法によりBLC関連遺伝子を検出および測定することができる。例えば、BLC関連遺伝子に対応する配列データベース登録項目内の配列を用いて、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション解析においてBLC関連遺伝子に対応するRNA配列を検出するためのプローブを構築することができる。プローブは典型的に、参照配列の少なくとも10、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100、または少なくとも200ヌクレオチドを含む。別の例としては、これらの配列を用いて、例えば、逆転写に基づくポリメラーゼ連鎖反応法のような増幅に基づく検出法において、1つまたは複数のBLC核酸を特異的に増幅するためのプライマーを構築することができる。
次いで、被験細胞集団、例えば患者由来の組織試料における1つまたは複数のBLC関連遺伝子の発現レベルを、参照集団における同じ遺伝子の発現レベルと比較する。参照細胞集団は、比較するパラメータが既知である1つまたは複数の細胞、すなわち膀胱腺癌細胞(例えば、BLC細胞)または正常膀胱腺上皮細胞(例えば、非BLC細胞)を含む。
被験細胞集団における遺伝子発現のパターンが、参照細胞集団と比較してBLCまたはそれに対する素因を示すか否かは、参照細胞集団の組成に依存する。例えば、参照細胞集団が非BLC細胞から構成される場合、被験細胞集団と参照細胞集団の間の遺伝子発現パターンの類似性により、被験細胞集団が非BLCであることが示される。反対に、参照細胞集団がBLC細胞から構成される場合、被験細胞集団と参照細胞集団の間の遺伝子発現プロファイルの類似性により、被験細胞集団がBLC細胞を含むことが示される。
被験細胞集団におけるBLCマーカー遺伝子の発現レベルは、それが参照細胞集団における対応するBLCマーカー遺伝子の発現レベルと、1.1倍を上回る、1.5倍を上回る、2.0倍を上回る、5.0倍を上回る、または10.0倍を上回る場合、「変化している」とみなされる。
被験細胞集団と参照細胞集団との間の差次的な遺伝子発現は、対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子に対して標準化することができる。例えば、対照核酸は、細胞の癌性または非癌性状態に応じて差がないことが知られている核酸である。対照核酸の発現レベルは、被験集団および参照集団におけるシグナルレベルを標準化するのに用いることができる。例示的な対照遺伝子に、例えば、β-アクチン、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、およびリボソームタンパク質P1が含まれるがそれらに限定されない。
被験細胞集団は複数の参照細胞集団と比較することができる。複数の参照集団のそれぞれは、公知のパラメータが異なってもよい。したがって、被験細胞集団を、例えばBLC細胞を含むことが判明している第1の参照細胞集団、ならびに例えば非BLC細胞(例えば正常細胞)を含むことが判明している第2の参照集団と比較してもよい。被験細胞は、BLC細胞を含むことが判明しているかまたはBLC細胞を含むことが疑われる対象からの組織型または細胞試料中に含まれてもよい。
被験細胞は、好ましくは体組織または体液、例えば、生体液(例えば、血液、痰、または尿など)から得られる。例えば、被験細胞を膀胱組織から精製してもよい。好ましくは、被験細胞集団は上皮細胞を含む。上皮細胞は、好ましくは膀胱腺癌であることが判明しているか、または疑われる組織由来である。
参照細胞集団における細胞は、被験細胞の組織型と類似した組織型に由来すべきである。任意で、参照細胞集団は細胞株、例えば、BLC細胞株(すなわち、陽性対照)または正常非BLC細胞株(すなわち、陰性対照)である。または、対照細胞集団は、測定されるパラメータまたは条件に関して公知である細胞由来の分子情報のデータベースに由来していてもよい。
対象は好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシが含まれるが、それらに限定されない。
本明細書に開示した遺伝子の発現は、当技術分野で公知の方法を用いて、タンパク質または核酸レベルで決定することができる。例えば、これらの核酸配列の1つまたは複数を特異的に認識するプローブを使用して、ノーザンハイブリダイゼーション分析により、遺伝子発現を決定することができる。または、例えば差次的に発現される遺伝子配列に特異的なプライマーを使用して、逆転写に基づくPCRアッセイにより遺伝子発現を測定してもよい。発現はまた、タンパク質レベルで、すなわち本明細書に記載の遺伝子によってコードされるポリペプチドのレベルまたはその生物活性を測定することによって決定してもよい。そのような方法は当技術分野において周知であり、例えば、遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体を利用した免疫測定法が含まれるが、これに限定されない。遺伝子によってコードされるタンパク質の生物活性は、当技術分野において一般に周知である。
膀胱癌の機序を明らかにし、このような腫瘍を治療および/または予防するための新規診断マーカーおよび/または薬物標的を同定するため、本発明者らは、ゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイとレーザーマイクロビームマイクロダイセクションを併用して、膀胱癌における遺伝子の発現プロファイルを解析した。結果として、膀胱癌細胞において特異的に過剰発現されるC2093、B5860N、およびC6055が同定された。さらに、低分子干渉RNA(siRNA)によりC2093、B5860N、またはC6055遺伝子の発現を抑制すると、癌細胞の増殖が有意に阻害された。これらの知見から、C2093、B5860N、および/またはC6055が癌細胞に発癌活性をもたらすこと、ならびにこれらのタンパク質の1つまたは複数の活性を阻害することは、膀胱癌などの増殖性疾患を治療および予防するための有望な戦略となり得ることが示唆される。
B5860N
本発明により、類似の配列を有するcDNAが同定され、これはB5860Nの変異体をコードするものである。長い方の変異体のcDNAは5318ヌクレオチドからなり、2436ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む(SEQ ID NO:3)。既知のB5860Nのオープンリーディングフレームは1584ヌクレオチドからなり、527アミノ酸-タンパク質をコードする(Genebank登録番号NM_017779)。したがって、5318ヌクレオチドからなる長い方の変異体は本発明にとって新規である。さらに、527アミノ酸-タンパク質をコードするB5860N cDNAの既知配列は、3338ヌクレオチドからなる。しかし本発明では、4466ヌクレオチドからなるB5860Nの全長cDNAが単離された。この短い方の変異体のヌクレオチド配列は、既知ヌクレオチド配列と比較して3'-UTRの新規配列を含むが、それらによってコードされるアミノ酸配列はいずれも同一であった。本明細書では、既知の527アミノ酸-タンパク質をコードする短い方の変異体、および新規の811アミノ酸-タンパク質をコードする長い方の変異体の転写産物を、それぞれB5860NV2およびB5860NV1と記載する。B5860NV1およびB5860NV2のヌクレオチド配列、ならびにそれらによってコードされるアミノ酸配列を、以下のSEQ ID NOに記載する。
ヌクレオチド配列 アミノ酸配列
B5860NV1 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4
B5860NV2 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6
したがって本発明は、長い方の変異体B5860NV1によってコードされる実質的に純粋なポリペプチドを提供し、これにはSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびB5860NV1タンパク質をコードする範囲で、その機能的同等物が含まれる。B5860NV1と機能的に同等なポリペプチドの例には、例えば、ヒトB5860NV1タンパク質に対応する他の生物の相同タンパク質、およびヒトB5860NV1タンパク質の変異体が含まれる。
C6055
本発明により、類似の配列を有するcDNAが同定され、これはC6055の変異体をコードするものである。NCBIのデータベースによれば、C6055は24エキソンからなり、MGC34032と称され、染色体1p31.3に位置する。C6055はデータベース上のMGC34032の最後のエキソン(エキソン24)内に含まれないため、本発明者らは、膀胱癌細胞株、SW780を鋳型として用いて、ESTウォーキング、ならびに5'RACEおよび3'RACE実験としてRT-PCRを行い、C6055の全cDNA配列を得た(材料および方法を参照されたい)。その結果、本発明者らは、2つの新規転写産物、C6055V1およびC6055V2を見出した。最終的に、この遺伝子は、それぞれMGC34032、Genbank登録番号AK128063、C6055V1、およびC6055V2に対応する、24、25、22、および22エキソンからなる4つの異なるスプライシング変異体を有する(図3c)。MGC34032のエキソン1、2、3、4、および24において選択的スプライシングが存在し、その他の残りのエキソンは4つの転写産物に共通していた。C6055V1およびC6055V2転写産物にはMGC34032のエキソン1、2、および3はなく、最後のエキソン内に同じ終止コドンを生じる。特に、C6055V1およびC6055V2転写産物のORFはそれぞれのエキソン4において開始し、C6055V1およびC6055V2転写産物は同じORFを有することが示される。MGC34032、Genbank登録番号AK128063、C6055V1、およびC6055V2転写産物の全長cDNA配列は、それぞれ2302、3947、3851、および3819ヌクレオチドからなる。MGC34032、Genbank登録番号AK128063、C6055V1、およびC6055V2転写産物は最終的に、それぞれ719、587、675、および675アミノ酸をコードする。C6055V1およびC6055V2のヌクレオチド配列、ならびにそれらによってコードされるアミノ酸配列を、以下のSEQ ID NOに記載する。
ヌクレオチド配列 アミノ酸配列
C6055V1 SEQ ID NO:129 SEQ ID NO:130
C6055V2 SEQ ID NO:131 SEQ ID NO:132
したがって本発明は、長い方の変異体C6055V1またはC6055V2によってコードされる実質的に純粋なポリペプチドを提供し、これにはSEQ ID NO:130またはSEQ ID NO:132のアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびGenbank登録番号AK128063タンパク質をコードする範囲で、それらの機能的同等物が含まれる。C6055V1またはC6055V2と機能的に同等なポリペプチドの例には、例えば、ヒトC6055V1またはC6055V2タンパク質に対応する他の生物の相同タンパク質、およびヒトC6055V1またはC6055V2タンパク質の変異体が含まれる。
本発明において、「機能的に同等な」という用語は、対象ポリペプチドが、B5860NV1タンパク質のように細胞増殖を促進する活性、および癌細胞に発癌活性を付与する活性を有することを意味する。対象ポリペプチドが細胞増殖活性を有するか否かは、対象ポリペプチドをコードするDNAを細胞に導入し、それぞれのポリペプチドを発現させ、細胞増殖の促進またはコロニー形成活性の上昇を検出することによって判定され得る。このような細胞には、例えば、NIH3T3、COS7、およびHEK293が含まれる。
所与のタンパク質と機能的に同等なポリペプチドを調製する方法は当業者に周知であり、これにはタンパク質に変異を導入する公知の方法が含まれる。例えば、当業者は、ヒトB5860NV1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドを、このタンパク質のアミノ酸配列に部位特異的突然変異誘発法により適切な変異を導入することによって調製することができる(Hashimoto-Gotoh et al., (1995) Gene 152:271-5；Zoller and Smith, (1983) Methods Enzymol 100: 468-500；Kramer et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:9441-56；Kramer and Fritz, (1987) Methods Enzymol 154: 350-67；Kunkel, (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82: 488-92；Kunkel, (1991) Methods Enzymol;204:125-39)。アミノ酸変異は自然界でも起こり得る。本発明のポリペプチドには、得られる変異ポリペプチドがヒトB5860NV1タンパク質と機能的に同等であるという前提で、1つまたは複数のアミノ酸が変異したヒトB5860NV1タンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。本発明において、変異の数は一般に全アミノ酸の35%以下、好ましくは30%以下、さらにより好ましくは25%、20%、10%、5%、2%、または1%以下である。具体的には、そのような変異体において変異させるアミノ酸の数は一般に200もしくは100アミノ酸またはそれ未満、典型的には10アミノ酸またはそれ未満、好ましくは6アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは3アミノ酸またはそれ未満である。
ある特定のアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質である変異タンパク質または改変タンパク質は、当初の生物活性を保持することが知られている(Mark et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6；Zoller and Smith, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-500；Dalbadie-McFarland et al., (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13)。そのためには、変異させるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の特性が保存される別のアミノ酸に変異させることが好ましい(保存的アミノ酸置換として知られる過程)。アミノ酸側鎖の特性の例には、疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、および以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖がある：脂肪族側鎖(G、A、V、L、I、P)；水酸基含有側鎖(S、T、Y)；硫黄原子含有側鎖(C、M)；カルボン酸およびアミド含有側鎖(D、N、E、Q)；塩基含有側鎖(R、K、H)；ならびに芳香族含有側鎖(H、F、Y、W)。括弧内の文字はアミノ酸の一文字コードを示すことに留意されたい。
ヒトB5860NV1タンパク質のアミノ酸配列に1つまたは複数のアミノ酸残基が付加されたポリペプチドの一例は、ヒトB5860NV1タンパク質を含む融合タンパク質である。ヒトB5860NV1タンパク質と他のペプチドまたはタンパク質との融合物である融合タンパク質は、本発明に含まれる。融合タンパク質は、本発明のヒトB5860NV1タンパク質をコードするDNAを他のペプチドまたはタンパク質をコードするDNAとフレームが合致するように連結し、この融合DNAを発現ベクターに挿入して、それを宿主において発現させるといった当業者に周知の技法によって作製することができる。本発明のタンパク質と融合させ得るペプチドまたはタンパク質に関する制限はない。
本発明のタンパク質と融合させるペプチドとして用いられ得る既知ペプチドには、例えば、FLAG(Hopp et al., (1988) Biotechnology 6: 1204-10)、6個のHis(ヒスチジン)残基を含む6×His、10×His、インフルエンザ凝集素(HA)、ヒトc-myc断片、VSP-GP断片、p18HIV断片、T7タグ、HSVタグ、Eタグ、SV40T抗原断片、lckタグ、α-チューブリン断片、Bタグ、プロテインC断片などが含まれる。本発明のタンパク質と融合させ得るタンパク質の例には、GST(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)、インフルエンザ凝集素(HA)、免疫グロブリン定常領域、β-ガラクトシダーゼ、MBP(マルトース結合タンパク質)などがある。
融合タンパク質は、上記の融合ペプチドまたはタンパク質をコードする市販のDNAと、本発明のポリペプチドをコードするDNAを融合させ、調製された融合DNAを発現させることによって調製することができる。
または、当技術分野において公知である方法を用いて、例えばハイブリダイゼーション技法を用いて、機能的に同等なポリペプチドを単離することができる(Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning 2nd ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press)。当業者は、ヒトB5860NV1タンパク質をコードするDNA配列(すなわち、SEQ ID NO:3)の全体または一部と高い相同性を有するDNAを容易に単離して、単離されたDNAからヒトB5860NV1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドを単離することができる。本発明のポリペプチドには、ヒトB5860NV1タンパク質をコードするDNA配列の全体または一部とハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつヒトB5860NV1タンパク質と機能的に同等であるポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドには、ヒト由来のタンパク質に対応する哺乳動物相同体(例えば、サル、ラット、ウサギ、およびウシ遺伝子によってコードされるポリペプチド)が含まれる。ヒトB5860NV1タンパク質をコードするDNAと相同性の高いcDNAを動物から単離する際には、精巣由来の組織または膀胱癌組織を用いることが特に好ましい。
ヒトB5860NV1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者によって慣行的に選択され得る。例えば、ハイブリダイゼーションは、「Rapid-hyb緩衝液」(Amersham LIFE SCIENCE)を用いて68℃でプレハイブリダイゼーションを30分間またはそれ以上行い、標識プローブを添加した上で、68℃で1時間またはそれ以上加温することにより行うことができる。それに続く洗浄段階は、例えば低ストリンジェント条件下で行い得る。低ストリンジェント条件は、例えば、42℃、2× SSC、0.1% SDS、または好ましくは50℃、2× SSC、0.1% SDSである。より好ましくは、高ストリンジェント条件を用いる。高ストリンジェント条件は、例えば、室温で2× SSC、0.01% SDS中での20分間の洗浄を3回行った後に、37℃で1× SSC、0.1% SDS中での20分間の洗浄を3回行い、50℃で1× SSC、0.1% SDS中での20分間の洗浄を2回行うことである。しかし、温度および塩濃度などのいくつかの要因はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼし得るため、当業者は必要なストリンジェンシーを得るためにこれらの要因を適切に選択することができる。
ハイブリダイゼーションの代わりに、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を利用して、タンパク質をコードするDNA(SEQ ID NO:3)の配列情報に基づいて合成したプライマーを用いて、ヒトB5860NV1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードするDNAを単離することもできる。
上記のハイブリダイゼーション法または遺伝子増幅法により単離されたDNAによってコードされる、ヒトB5860NV1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドは、通常、ヒトB5860NV1タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有する。本明細書で使用する「高い相同性」という用語は典型的に、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列と参照配列との間の40%またはそれ以上、好ましくは60%またはそれ以上、より好ましくは80%またはそれ以上、さらにより好ましくは85%、90%、93%、95%、98%、99%またはそれ以上の相同性を指す。相同性パーセント(同一性パーセントとも称される)は典型的に、最適に整列させた2つの配列間で決定される。比較のために配列を整列させる方法は、当技術分野において周知である。配列の最適な整列化および比較は、例えば「Wilbur and Lipman, (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30」中のアルゴリズムを用いて行うことができる。
本発明のポリペプチドは、これを産生させるために用いる細胞もしくは宿主または利用する精製法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態に差異があってもよい。それでもなお、このようなポリペプチドは、本発明のヒトB5860NV1タンパク質の機能と同等な機能を有する限り、本発明の範囲内に含まれる。
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いて、組換えタンパク質または天然タンパク質として調製することができる。組換えタンパク質は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするDNA(例えば、SEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を含むDNA)を適切な発現ベクターに挿入し、このベクターを適切な宿主細胞に導入し、抽出物を得て、この抽出物をクロマトグラフィー、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、または本発明のタンパク質に対する抗体を固定したカラムを利用するアフィニティークロマトグラフィーに供して、または前述のカラムを2つ以上組み合わせてポリペプチドを精製することによって、調製することができる。
また、本発明のポリペプチドを宿主細胞(例えば、動物細胞および大腸菌(E. coli))において、グルタチオン-S-トランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、または複数のヒスチジンが付加された組換えタンパク質として発現させる場合には、発現された組換えタンパク質は、グルタチオンカラムまたはニッケルカラムを用いて精製することができる。または、本発明のポリペプチドをc-myc、複数のヒスチジン、またはFLAGによってタグ付けされたタンパク質として発現させる場合には、これは、それぞれc-myc、His、またはFLAGに対する抗体を用いて検出および精製することができる。
融合タンパク質の精製後に、融合タンパク質を必要に応じてトロンビンまたは第Xa因子で切断することにより、目的のポリペプチド以外の領域を除くことも可能である。
天然タンパク質は、当業者に公知の方法によって、例えば後述するB5860NV1タンパク質に結合する抗体を結合させたアフィニティーカラムを、本発明のポリペプチドを発現する組織または細胞の抽出物と接触させることによって、単離することができる。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。
本発明はまた、本発明のポリペプチドの部分ペプチドを包含する。好ましくは、本発明の部分ペプチドは、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列の304〜588位から選択されるアミノ酸配列またはその一部を含む。304〜588位に及ぶアミノ酸配列は、B5860NV2と比較してB5860NV1に特異的な領域である。部分ペプチドは本発明のポリペプチドに特異的なアミノ酸配列を有し、少なくとも7アミノ酸、好ましくは8アミノ酸またはそれ以上、より好ましくは9アミノ酸またはそれ以上からなる。部分ペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドに対する抗体の調製、本発明のポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング、および本発明のポリペプチドの阻害剤のスクリーニングに使用することができる。
本発明の部分ペプチドは、遺伝子操作により、ペプチド合成の公知の方法により、または本発明のポリペプチドを適切なペプチダーゼで消化することにより生成され得る。ペプチド合成には、例えば、固相合成または液相合成を使用することができる。
本発明はさらに、上記のB5860NV1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、上記のように本発明のポリペプチドのインビボもしくはインビトロ産生に使用することができ、または本発明のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子異常に起因する疾患の遺伝子治療に適用することができる。本発明のポリペプチドをコードする限り、mRNA、RNA、cDNA、ゲノムDNA、化学合成されたポリヌクレオチドを含む、本発明のポリヌクレオチドの任意の形態を使用することができる。本発明のポリヌクレオチドには、結果として得られるDNAが本発明のポリペプチドをコードする限り、所与のヌクレオチド配列およびその変性配列を含むDNAが含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法で調製することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを発現する細胞からcDNAライブラリーを調製し、本発明のDNA(例えば、SEQ ID NO:3)の部分配列をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行うことにより、調製することができる。cDNAライブラリーは、例えば、Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている方法により調製することができる。または、市販のcDNAライブラリーを使用することも可能である。cDNAライブラリーはまた、本発明のポリペプチドを発現する細胞からRNAを抽出し、本発明のDNAの配列(例えば、SEQ ID NO:3)に基づいてオリゴDNAを合成し、このオリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、本発明のタンパク質をコードするcDNAを増幅することにより、調製することもできる。
加えて、得られたcDNAのヌクレオチドの配列を決定することにより、cDNAによってコードされる翻訳領域を慣行的に決定することができ、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を容易に得ることができる。さらに、得られたcDNAまたはその一部をプローブとして用いて、ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムDNAを単離することができる。
より具体的には、本発明の対象ポリペプチドが発現している細胞、組織、もしくは器官(例えば、精巣)、または膀胱癌細胞株から、mRNAを最初に調製し得る。mRNAの単離には、公知の方法を用いることができる。例えば、全RNAを、グアニジン超遠心(Chirgwin et al., (1979) Biochemistry 18:5294-9)またはAGPC法(Chomczynski and Sacchi, (1987) Anal. Biochem 162:156-9)により調製し得る。さらに、mRNA精製キット(Pharmacia)などを用いて、全RNAからmRNAを精製し得る。または、QuickPrep mRNA精製キット(Pharmacia)によりmRNAを直接精製することもできる。
得られたmRNAを基に、逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。cDNAは、AMV逆転写酵素第一鎖cDNA合成キット(生化学工業)などの市販のキットを用いて合成することができる。または、cDNAは、本明細書に記載のプライマーなどを用いる5'-RACE法(Frohman et al., (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 8998-9002；Belyavsky et al., (1989) Nucleic Acids Res 17: 2919-32)、5'-Ampli FINDER RACEキット(Clontech)、およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、合成および増幅することもできる。
所望のDNA断片をPCR産物から調製し、ベクターDNAと連結する。このような組換えベクターを用いて大腸菌などを形質転換し、選択されたコロニーから所望の組換えベクターを調製する。所望のDNAのヌクレオチド配列は、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法などの従来法で確認することができる。
本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、発現に用いようとする宿主におけるコドンの使用頻度を考慮することで、より効率的に発現されるように設計することができる(Grantham et al., (1981) Nucleic Acids Res 9: 43-74)。本発明のポリヌクレオチドの配列は、市販のキットまたは従来法により変更することができる。例えば、配列は、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドもしくは適切なポリヌクレオチド断片の挿入、リンカーの付加、または開始コドン(ATG)および/もしくは終止コドン(TAA、TGA、またはTAG)の挿入によって変更することができる。
具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を含むDNAを包含する。
さらに本発明は、SEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記の本発明のB5860NV1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。当業者であれば、適切にストリンジェントな条件を適切に選択することができる。例えば、低ストリンジェント条件を使用することができる。より好ましくは、高ストリンジェント条件を使用することができる。これらの条件は、上記の条件と同じである。上記のハイブリダイズするDNAは、好ましくはcDNAまたは染色体DNAである。
本発明はまた、ヒトB5860NV1タンパク質をコードするポリヌクレオチド(SEQ ID NO:3)またはその相補鎖と相補的であり、かつ少なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、SEQ ID NO:3の988〜1842位に及ぶヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは好ましくは、本発明のB5860NV1ポリペプチドをコードするDNAと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。本明細書で用いる「特異的にハイブリダイズする」という用語は、通常のハイブリダイゼーション条件下で、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、他のタンパク質をコードするDNAとの間に有意なクロスハイブリダイゼーションが起こらないことを意味する。このようなポリヌクレオチドには、本発明のポリペプチドをコードするDNAまたはその相補鎖と特異的にハイブリダイズするプローブ、プライマー、ヌクレオチド、およびヌクレオチド誘導体(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイム)が含まれる。さらに、このようなポリヌクレオチドは、DNAチップの調製に利用することができる。
ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが導入されたベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明のベクターは、宿主細胞中に本発明のポリヌクレオチド、特にDNAを保存するため、本発明のポリペプチドを発現させるため、または遺伝子治療のために本発明のポリヌクレオチドを投与するために有用である。
大腸菌が宿主細胞であり、ベクターを大腸菌(例えば、JM109、DH5α、HB101、またはXL1Blue)内で増幅して大量に生成する場合、ベクターは、大腸菌内で増幅するための「複製起点」、および形質転換された大腸菌を選択するためのマーカー遺伝子(例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤によって選択される薬剤耐性遺伝子)を有する必要がある。例えば、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどを使用することができる。さらに、pGEM-T、pDIRECT、およびpT7もまた上記ベクターと同様に、cDNAのサブクローニングおよび抽出に使用することができる。ベクターを本発明のタンパク質の産生に使用する場合には、発現ベクターが特に有用である。例えば、大腸菌で発現させる発現ベクターは、大腸菌で増幅するために上記の特徴を有する必要がある。JM109、DH5α、HB101、またはXL1 Blueなどの大腸菌を宿主細胞として使用する場合、ベクターは、大腸菌で所望の遺伝子を効率的に発現し得るプロモーター、例えば、lacZプロモーター(Ward et al., (1989) Nature 341: 544-6；(1992) FASEB J 6: 2422-7)、araBプロモーター(Better et al., (1988) Science 240: 1041-3)、T7プロモーターなどを有する必要がある。この点に関して、例えば、pGEX-5X-1(Pharmacia)、「QIAexpressシステム」(Qiagen)、pEGFP、およびpET(この場合、宿主は好ましくはT7 RNAポリメラーゼを発現するBL21である)を上記ベクターの代わりに使用することができる。さらにベクターは、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列を含んでもよい。ポリペプチドを大腸菌のペリプラズムに分泌させる例示的なシグナル配列は、pelBシグナル配列(Lei et al., (1987)J Bacteriol 169: 4379-83)である。ベクターを標的宿主細胞に導入する手段には、例えば塩化カルシウム法およびエレクトロポレーション法が含まれる。
大腸菌に加えて、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター(例えば、pcDNA3(Invitrogen)、およびpEF-BOS(Mizushima S and Nagata S, (1990) Nucleic Acids Res 18(17): 5322)、pEF、pCDM8)、昆虫細胞由来の発現ベクター(例えば「Bac-to-BACバキュロウイルス発現系」(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、植物由来の発現ベクター(例えば、pMH1、pMH2)、動物ウイルス由来の発現ベクター(例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw)、レトロウイルス由来の発現ベクター(例えば、pZIpneo)、酵母由来の発現ベクター(例えば、「ピキア(Pichia)発現キット」(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)、および枯草菌(Bacillus subtilis)由来の発現ベクター(例えば、pPL608、pKTH50)を、本発明のポリペプチドの産生に使用することができる。
ベクターをCHO、COS、またはNIH3T3細胞などの動物細胞で発現させるためには、ベクターはこのような細胞における発現に必要なプロモーター、例えば、SV40プロモーター(Mulligan et al., (1979) Nature 277: 108)、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター(Mizushima et al., (1990) Nucleic Acids Res 18: 5322)、CMVプロモーターなど、および好ましくは形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子(例えば、薬剤(例えば、ネオマイシン、G418)によって選択される薬剤耐性遺伝子)を有する必要がある。これらの特徴を有する公知のベクターの例には、例えばpMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、およびpOP13が含まれる。
ポリペプチドの産生
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドを産生する方法を提供する。ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターを保有する宿主細胞を培養することによって調製し得る。必要に応じて、細胞内で遺伝子を安定に発現させると同時に遺伝子のコピー数を増幅するための方法を使用することができる。例えば、核酸合成経路が欠失したCHO細胞に、相補的なDHFR遺伝子を含むベクター(例えば、pCHO I)を導入し、次にこのベクターをメトトレキセート(MTX)により増幅することができる。さらに、遺伝子の一過性発現の場合には、SV40の複製起点を含むベクター(pcDなど)で、染色体上にSV40 T抗原発現遺伝子を含むCOS細胞を形質転換する方法が用いられ得る。
上記のように得られる本発明のポリペプチドは、宿主細胞の内部または外部(培地など)から単離して、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。所与のポリペプチドに関して本明細書で用いる「実質的に純粋な」という用語は、ポリペプチドが他の生物学的高分子を実質的に含まないことを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、乾燥重量で少なくとも75%(例えば、少なくとも80%、85%、95%、または99%)純粋である。純度は、任意の適切な標準的な方法により、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC解析により測定することができる。ポリペプチドを単離および精製する方法は、いかなる特定の方法にも制限されない。実際に、任意の標準的な方法を使用することができる。
例えば、カラムクロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動、透析、および再結晶を適切に選択し、組み合わせて、ポリペプチドを単離および精製することができる。
クロマトグラフィーの例には、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどがある(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak et al., (1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press)。これらのクロマトグラフィーは、HPLCおよびFPLCなどの液体クロマトグラフィーによって実施することができる。したがって本発明は、上記の方法で調製された高純度のポリペプチドを提供する。
本発明のポリペプチドは、精製前および/または精製後に適切なタンパク質修飾酵素で処理することにより、任意に修飾するかまたは部分的に欠失させることができる。有用なタンパク質修飾酵素には、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどがあるが、これらに限定されない。
膀胱癌の診断
本発明の文脈において、BLCは、被験細胞集団(すなわち、患者由来の生体試料)からの1つまたは複数のBLC核酸の発現レベルを測定することにより診断される。好ましくは、被験細胞集団は、上皮細胞、例えば膀胱組織から得られた細胞を含む。遺伝子発現は、血液または他の体液(尿など)から測定することもできる。タンパク質レベルを測定するために、他の生体試料を使用することも可能である。例えば、診断しようとする対象由来の血液または血清中のタンパク質レベルを、免疫測定法または他の従来の生物学的アッセイ法により測定することができる。
1つまたは複数のBLC関連遺伝子、例えば、表4〜5に列挙された遺伝子の発現を、被験細胞または生体試料において決定し、アッセイした1つまたは複数のBLC関連遺伝子に関連する正常対照発現レベルと比較する。正常対照レベルとは、BLCに罹患していないことが判明している集団で典型的に認められるBLC関連遺伝子の発現プロファイルのことである。患者由来の組織試料における1つまたは複数のBLC関連遺伝子の発現レベルに変化(例えば、上昇または低下)があることにより、対象がBLCに罹患しているかまたはBLCを発症するリスクがあることが示される。例えば、被験集団における、表4に列挙された1つまたは複数の上方制御されるBLC関連遺伝子の発現が正常対照レベルと比較して上昇していることにより、その対象がBLCに罹患しているかまたはBLCを発症するリスクを有することが示される。逆に、被験集団における、表5に列挙された1つまたは複数の下方制御されるBLC関連遺伝子の発現が正常対照レベルと比較して低下していることにより、その対象がBLCに罹患しているかまたはBLCを発症するリスクを有することが示される。
被験集団におけるBLC関連遺伝子の1つまたは複数が、正常対照レベルと比較して変化していることにより、その対象がBLCに罹患しているかまたはBLCを発症するリスクがあることが示される。例えば、一連のBLC関連遺伝子(表4〜5に列挙された遺伝子)の少なくとも1%、少なくとも5%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%またはそれ以上が変化していることにより、その対象がBLCに罹患しているかまたはBLCを発症するリスクがあることが示される。
さらに本発明は、本発明の遺伝子の発現レベルを診断マーカーとして使用して、膀胱癌などの細胞増殖性疾患を診断する方法も提供する。この診断法は、(a) C2093、B5860N、およびC6055遺伝子の1つまたは複数の発現レベルを検出する段階、ならびに(b) 発現レベルの上昇を膀胱癌と関連づける段階を含む。本発明の文脈において、B5860N遺伝子の転写産物にはB5860NV1およびB5860NV2が含まれる。本発明の文脈において、C6055遺伝子の転写産物には、MGC34032、Genbank登録番号AK128063、C6055V1、およびC6055V2が含まれる。
生体試料におけるC2093、B5860N、またはC6055遺伝子の発現レベルは、C2093、B5860N、またはC6055遺伝子に対応するmRNA、またはそれら遺伝子によってコードされるタンパク質を定量することによって評価することができる。mRNAの定量法は当業者に公知である。例えば、C2093、B5860N、またはC6055遺伝子に対応するmRNAのレベルは、ノーザンブロッティングまたはRT-PCRによって評価し得る。C2093遺伝子の全長ヌクレオチド配列はSEQ ID NO:1に示した。または、B5860N遺伝子転写産物の2つの変異体型の全長ヌクレオチド配列もSEQ ID NO:3および5に示した。または、C6055遺伝子転写産物の4つの変異体型の全長ヌクレオチド配列もSEQ ID NO:129、131、133、および135に示した。したがって、当業者であれば誰もが、C2093、B5860N、またはC6055遺伝子を定量するためのプローブまたはプライマーのヌクレオチド配列を設計することができる。
また、C2093、B5860N、またはC6055遺伝子の発現レベルは、それら遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または量に基づいて解析することもできる。C2093、B5860N、またはC6055タンパク質の量を決定する方法は以下に示す。例えば、免疫測定法は、生体材料におけるタンパク質の決定に有用である。マーカー遺伝子(すなわち、C2093、B5860N、またはC6055遺伝子)が膀胱癌患者の試料中で発現されている限りは、任意の生体材料をタンパク質またはその活性を決定するための生体試料として使用することができる。例えば、本発明の文脈において、膀胱組織は好ましい生体試料である。しかし、血液および尿などの体液もまた解析が可能である。一方、C2093、B5860N、またはC6055遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を決定するためには、解析しようとするタンパク質の活性に応じて適した方法が選択され得る。
生体試料中のC2093、B5860N、またはC6055遺伝子の発現レベルを評価し、正常試料(例えば、非罹患対象に由来する試料)における発現レベルと比較する。このような比較によって標的遺伝子の発現レベルが正常試料における発現レベルよりも高いことが示された場合には、その対象は膀胱癌に罹患していると判断される。正常対象および診断しようとする対象の生体試料におけるC2093、B5860N、またはC6055遺伝子の発現レベルは、同時に決定することができる。または、あらかじめ対照群から採取しておいた試料の遺伝子発現レベルを解析して得られた結果に基づき、統計学的方法によって発現レベルの正常範囲を決定することもできる。対象の試料を比較して得られた結果を正常範囲と比較する；その結果が正常範囲に入らない場合、対象は膀胱癌に罹患しているか、または膀胱癌を発症するリスクを有すると判断される。
本発明においては、膀胱癌などの細胞増殖性疾患を診断するための診断薬も提供する。本発明の診断薬は、C2093、B5860N、もしくはC6055遺伝子転写産物、またはそれらによってコードされるポリペプチドに結合する化合物を含む。好ましくは、SEQ ID NO:1、3、5、129、131、133、および135からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはSEQ ID NO2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体をこのような化合物として使用し得る。
BLC関連遺伝子の発現を阻害または増強する物質の同定
BLC関連遺伝子の発現またはその遺伝子産物の活性を阻害する物質は、BLCに関連した上方制御遺伝子を発現する被験細胞集団を被験物質と接触させ、次いでBLC関連遺伝子の発現レベルまたはその遺伝子産物の活性を決定することにより同定することができる。物質の存在下におけるBLC関連遺伝子の発現レベルまたはその遺伝子産物の活性レベルが、被験物質の非存在下における発現または活性レベルと比較して低下していることにより、その物質がBLCに関連した上方制御遺伝子の阻害剤であり、BLCの阻害に有用であることが示される。
または、BLCに関連した下方制御遺伝子の発現またはその遺伝子産物の活性を増強する物質は、BLC関連遺伝子を発現する被験細胞集団を被験物質と接触させ、次いでBLCに関連した下方制御遺伝子の発現レベルまたは活性を決定することにより同定することができる。BLC関連遺伝子の発現レベルまたはその遺伝子産物の活性レベルが、被験物質の非存在下における発現または活性レベルと比較して上昇していることにより、被験物質がBLCに関連した下方制御遺伝子の発現またはその遺伝子産物の活性を増大させることが示される。
被験細胞集団は、BLC関連遺伝子を発現する任意の細胞であり得る。例えば、被験細胞集団は、膀胱組織由来の細胞のような上皮細胞を含み得る。さらに、被験細胞は癌細胞由来の不死化細胞株であってもよい。または、被験細胞は、BLC関連遺伝子をトランスフェクトした細胞、またはレポーター遺伝子と機能的に連結したBLC関連遺伝子由来の制御配列(例えば、プロモーター配列)をトランスフェクトした細胞であってもよい。
対象におけるBLC治療の有効性の評価
本明細書において同定されたBLC関連遺伝子の差次的発現により、BLCの治療過程をモニターすることも可能になる。本方法において、BLCに対する治療を受ける対象から被験細胞集団が提供される。必要に応じて、例えば、治療前、治療中、および/または治療後といった様々な時点で被験細胞集団を対象から入手する。次いで、当該細胞集団における1つまたは複数のBLC関連遺伝子の発現を決定し、BLC状態が判明している細胞を含む参照細胞集団と比較する。本発明の文脈において、参照細胞は、関心対象の治療に曝露されてはならない。
参照細胞集団がBLC細胞を含まない場合、被験細胞集団および参照細胞集団におけるBLC関連遺伝子の発現に類似性があることが、関心対象の治療が有効であることを示す。しかしながら、被験集団と正常対照参照細胞集団におけるBLC関連遺伝子の発現の差は、あまり好ましくない臨床効果または予後を示す。同様に、参照細胞集団がBLC細胞を含む場合、被験細胞集団および参照細胞集団におけるBLC関連遺伝子の発現の差が、関心対象の治療が有効であることを示すが、被験集団および膀胱癌対照参照細胞集団におけるBLC関連遺伝子の発現の類似性は、臨床効果または予後があまり好ましくないことを示す。
さらに、治療後に採取された対象由来生物試料において決定される1つまたは複数のBLC関連遺伝子の発現レベル(すなわち、治療後レベル)を、治療を開始する前に採取された対象由来生物試料において決定される1つまたは複数のBLC関連遺伝子の発現レベル(すなわち、治療前レベル)と比較することができる。BLC関連遺伝子が上方制御される遺伝子である場合、治療後試料における発現レベルの低下は、関心対象の治療が有効であることを示し、一方、治療後試料における発現レベルの上昇または維持は、臨床効果または予後があまり好ましくないことを示す。逆に、BLC関連遺伝子が下方制御される遺伝子である場合、治療後試料における発現レベルが上昇していることにより、関心対象の治療が有効であることが示され、治療後試料における発現レベルが低下しているかまたは維持されていることにより、臨床効果または予後があまり好ましくないことが示される。
本明細書で用いる場合、「有効な」という用語は、治療が、対象における、病理学的に上方制御される遺伝子の発現低下、病理学的に下方制御される遺伝子の発現上昇、または膀胱腺癌の大きさ、波及度、もしくは転移能の低下をもたらすことを示す。関心対象の治療が予防的に適用される場合、「有効な」という用語は、治療が膀胱腫瘍の形成を遅延もしくは防止する、または臨床的なBLCの症状を遅延、予防、もしくは軽減することを示す。膀胱腫瘍の評価は、標準的な臨床プロトコールを用いて行うことができる。さらに、有効性を、BLCの診断または治療のための任意の公知の方法と関連して判定することもできる。例えば、BLCを、症候性の異常、例えば、体重減少、腹痛、背部痛、食欲不振、悪心、嘔吐、および全身倦怠感、衰弱、および黄疸を特定することによって診断することができる。
膀胱癌を診断する本方法は、対象における膀胱癌の治療の有効性を評価するために適用することができる。本方法に従って、被験細胞集団などの生体試料を、膀胱癌の治療を受けている対象から採取する。評価の方法は、膀胱癌を診断する従来法に従って行い得る。
必要に応じて、治療前、治療中、または治療後の様々な時点で生体試料を対象から採取する。次いで、生体試料におけるC2093、B5860N、またはC6055遺伝子の発現レベルを決定し、例えば膀胱癌の状態が判明している細胞(すなわち、癌細胞または非癌細胞)を含む参照細胞集団に由来する対照レベルと比較する。対照レベルは、治療に曝露されていない生体試料において決定される。対照レベルが癌細胞を含まない生体試料に由来する場合、対象由来の生体試料中の発現レベルと対照レベルが類似していることにより、治療が有効であることが示される。対象由来の生体試料中のC2093、B5860N、またはC6055遺伝子の発現レベルと対照レベルに差があれば、臨床効果または予後があまり好ましくないことが示される。
「有効な」という用語は、治療が、対象における病理学的に上方制御される遺伝子(例えば、C2093、B5860N、およびC6055遺伝子)の発現低下、または膀胱癌細胞の大きさ、波及度、もしくは増殖能の低下をもたらすことを指す。治療を予防的に適用する場合、「有効な」とは、治療によって膀胱癌の発生が遅延するかまたは防止されることを示す。膀胱癌の評価は、標準的な臨床プロトコールを用いて行い得る。さらに、治療の有効性は、膀胱癌を診断または治療するための任意の公知の方法に則して決定され得る。さらに、膀胱癌を診断する本方法は、被験細胞集団などの患者由来の生体試料におけるC2093、B5860N、またはC6055遺伝子の発現レベルを対照レベルと比較することにより、膀胱癌患者の予後を評価するためにも適用することもできる。または、患者由来の生体試料におけるC2093、B5860N、またはC6055遺伝子の発現レベルを一連の病期にわたって測定し、患者の予後を評価することも可能である。
C2093、B5860N、またはC6055遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇していることにより、予後があまり好ましくないことが示される。C2093、B5860N、またはC6055遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して類似していることにより、患者の予後がより好ましいことが示される。
特定の個体に対する適切なBLC治療のための治療剤の選択
個体の遺伝子構成の差によって、個体が様々な薬物を代謝する相対的能力に差が生じ得る。対象において代謝されて抗BLC剤として作用する物質は、対象の細胞において、癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンから非癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンへの変化を誘導することによって顕在化し得る。したがって、物質が対象においてBLCの適切な阻害剤であるかどうかを決定するために、本明細書に開示する差次的に発現されるBLC関連遺伝子によって、治療効果があるかまたは予防効果があると推定されるBLC阻害剤を、選択された対象由来の被験細胞集団において調べることができる。
特定の対象にとって適切であるBLCの阻害剤を同定するには、対象からの被験細胞集団を治療剤に曝露して、表4〜5に列挙されたBLC関連遺伝子の1つまたは複数の発現を決定する。
本発明の方法の文脈において、被験細胞集団は、BLC関連遺伝子を発現するBLC細胞を含む。好ましくは、被験細胞は上皮細胞である。例えば、被験細胞集団を候補物質の存在下でインキュベートし、被験細胞集団の遺伝子発現パターンを測定して、1つまたは複数の参照プロファイル、例えばBLC参照発現プロファイルまたは非BLC参照発現プロファイルと比較し得る。
BLCを含む参照細胞集団と比較して、被験細胞集団において表4に列挙されたBLC関連遺伝子の1つもしくは複数の発現が低下するか、または表5に列挙されたBLC関連遺伝子の1つもしくは複数の発現が上昇することにより、物質が治療効果を発揮する可能性を有することが示される。
本発明の文脈において、被験物質は任意の化合物または組成物であってよい。例示的な被験物質には免疫調節剤が含まれるが、これに限定されない。
治療剤を同定するためのスクリーニングアッセイ
本明細書に開示した差次的に発現されるBLC関連遺伝子を、BLCを治療するための候補治療剤を同定するために用いることもできる。本発明の方法は、候補治療剤をスクリーニングして、候補治療剤が、BLC状態に特徴的な表4〜5に列挙された1つまたは複数のBLC関連遺伝子の発現プロファイルを、非BLC状態に特徴的な遺伝子発現パターンへと変換させ得るかどうかを判定する段階を含む。
本方法では、細胞を1つの被験物質または複数の被験物質(逐次的にまたは組み合わせて)に曝露し、細胞における表4〜5に列挙された1つまたは複数のBLC関連遺伝子の発現を測定する。被験集団でアッセイしたBLC関連遺伝子の発現プロファイルを、被験物質に曝露していない参照細胞集団における同じBLC関連遺伝子の発現レベルと比較する。
低発現遺伝子の発現を促進し得るか、または過剰発現遺伝子の発現を抑制し得る物質は、臨床的に有益である可能性がある。このような物質は、動物または被験対象において、膀胱腺癌増殖を防止する能力に関してさらに試験することができる。
さらなる態様において、本発明は、BLCの治療における潜在的標的に作用する候補物質をスクリーニングする方法を提供する。上に詳述したように、マーカー遺伝子の発現レベルまたはそれらの遺伝子産物の活性を調節することにより、BLCの発症および進行を調節することができる。したがって、BLCの治療における潜在的標的に作用する候補物質を、このような発現レベルおよび活性を癌性状態または非癌性状態の指標として用いるスクリーニング法によって同定することができる。本発明の文脈において、このようなスクリーニングは例えば以下の段階を含み得る：
a) 被験化合物を、表4または5に列挙された遺伝子からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
b) ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階；および
c) ポリペプチドに結合する被験化合物を選択する段階。
または、本発明のスクリーニング法は以下の段階を含み得る：
a) 候補化合物を、表4または5に列挙された遺伝子からなる群より選択される1つまたは複数のマーカー遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；および
b) 表4に列挙された遺伝子からなる群より選択される1つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを低下させるか、または表5に列挙された遺伝子からなる群より選択される1つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを上昇させる候補化合物を選択する段階。
マーカー遺伝子を発現する細胞には、例えばBLCから樹立された細胞株が含まれる；このような細胞は、本発明の上記のスクリーニングに用いることができる。
または、本発明のスクリーニング法は以下の段階を含み得る：
a) 被験化合物を、表4または5に列挙された遺伝子からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
b) 段階(a)のポリペプチドの生物活性を検出する段階；および
c) 被験化合物の非存在下で検出される生物活性と比較して、表4に列挙された遺伝子からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物活性を抑制するか、または被験化合物の非存在下で検出される生物活性と比較して、表5に列挙された遺伝子からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物活性を増強する化合物を選択する段階。
本発明のスクリーニング法に使用するタンパク質は、マーカー遺伝子のヌクレオチド配列を用いて組換えタンパク質として得ることができる。マーカー遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質に関する情報に基づき、当業者は、タンパク質の任意の生物活性をスクリーニングの指標として選択し、選択した生物活性に関するアッセイのために適した任意の測定法を選択することができる。
または、本発明のスクリーニング法は以下の段階を含み得る：
a) 候補化合物を、表4または5に列挙された遺伝子からなる群より選択される1つまたは複数のマーカー遺伝子の転写制御領域およびその転写制御領域の調節下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる段階；
b) レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階；ならびに
c) 被験化合物の非存在下で検出される発現レベルまたは活性と比較して、マーカー遺伝子が表4に列挙された遺伝子からなる群より選択される上方制御されるマーカー遺伝子である場合に、レポーター遺伝子の発現レベルもしくは活性を低下させるか、またはマーカー遺伝子が表5に列挙された遺伝子からなる群より選択される下方制御されるマーカー遺伝子である場合に、レポーター遺伝子の発現レベルもしくは活性を増強する候補化合物を選択する段階。
適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野において周知である。本発明のスクリーニング法に適したレポーター構築物は、マーカー遺伝子の転写制御領域を用いて調製することができる。マーカー遺伝子の転写制御領域が当業者に公知である場合には、その公知配列情報を用いてレポーター構築物を調製することができる。マーカー遺伝子の転写制御領域が未知である場合には、マーカー遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づいて、転写制御領域を含むヌクレオチド部分をゲノムライブラリーから単離することができる。
C2093、B5860N、もしくはC6055遺伝子および/またはこれらの遺伝子によってコードされるタンパク質、またはこれらの遺伝子の転写制御領域を用いて、遺伝子の発現または遺伝子によってコードされるポリペプチドの生物活性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。このような化合物は、膀胱癌を治療または予防するための薬剤として用いられる。
したがって、本発明は、本発明のポリペプチドを用いて、膀胱癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。本スクリーニング法の1つの態様は、(a) 被験化合物を、C2093、B5860N、もしくはC6055によってコードされるポリペプチド、またはそれらの同等物と接触させる段階、(b) ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階、および(c) ポリペプチドに結合する化合物を選択する段階を含む。本発明において、C2093、B5860N、もしくはC6055によってコードされるポリペプチド、またはそれらの同等物は、以下からなる群より選択され得る：
(1) SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(2) SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはこのような配列と少なくとも約80%の相同性を有する配列を含むポリペプチド；ならびに
(3) SEQ ID NO:1、3、5、129、131、133、および135からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、SEQ ID NO2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するポリペプチド。
スクリーニングに使用する本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチドであっても、または天然由来のタンパク質であってもよく、またはそれらの部分ペプチドであってもよい。被験化合物と接触させる本発明のポリペプチドは、例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であってもよい。
例えば本発明のC2093、B5860N、またはC6055によってコードされるポリペプチドを用いて、本発明のポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により、具体的には以下の方法で行うことができる。pSV2neo、pcDNA I、pcDNA3.1、pCAGGS、およびpCD8といった外来遺伝子用の発現ベクターに遺伝子を挿入することにより、本発明のポリペプチドをコードするC2093、B5860N、またはC6055遺伝子を宿主(例えば、動物)細胞などで発現させる。発現に使用するプロモーターは一般に使用され得る任意のプロモーターであってよく、これには、例えばSV40初期プロモーター(Rigby, Williamson (ed.), (1982) Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141)、EF-αプロモーター(Kim et al., Gene 91: 217-23 (1990))、CAGプロモーター(Niwa et al., (1991) Gene 108: 193-9)、RSV LTRプロモーター(Cullen, (1987) Methods in Enzymology 152: 684-704)、SRαプロモーター(Takebe et al., (1988) Mol Cell Biol 8: 466-72)、CMV最初期プロモーター(Seed and Aruffo, (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9)、SV40後期プロモーター(Gheysen and Fiers, (1982) J Mol Appl Genet 1: 385-94)、アデノウイルス後期プロモーター(Kaufman et al., (1989) Mol Cell Biol 9: 946-58)、HSV TKプロモーターなどが含まれる。外来遺伝子を発現させるための宿主細胞への遺伝子の導入は任意の方法に従って行うことができ、これには例えばエレクトロポレーション法(Chu et al., (1987) Nucleic Acids Res 15: 1311-26)、リン酸カルシウム法(Chen and Okayama, (1987) Mol Cell Biol 7: 2745-52)、DEAEデキストラン法(Lopata et al., (1984) Nucleic Acids Res 12: 5707-17；Sussman and Milman, (1984) Mol Cell Biol 4: 1641-3)、リポフェクチン法(Derijard B, et al., (1994) Cell 76: 1025-37；Lamb et al., (1993) Nature Genetics 5: 22-30：Rabindran et al., (1993) Science 259: 230-4)などがある。本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドは、特異性が判明しているモノクローナル抗体のエピトープを本発明のポリペプチドのN末端またはC末端に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位(エピトープ)を含む融合タンパク質として発現させることができる。市販のエピトープ-抗体系を用いることもできる(Experimental Medicine 13: 85-90 (1995))。マルチクローニング部位を用いることにより、例えばβ-ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)などとの融合タンパク質を発現し得るベクターが市販されている。
融合によって本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドの性質を変えないように、数個〜十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープのみを導入することによって調製された融合タンパク質も報告されている。ポリヒスチジン(Hisタグ)、インフルエンザ凝集素HA、ヒトc-myc、FLAG、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV-GP)、T7遺伝子10タンパク質(T7タグ)、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質(HSVタグ)、Eタグ(モノクローナルファージ上のエピトープ)などのエピトープ、およびそれらを認識するモノクローナル抗体を、本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ-抗体系として用いることができる(Experimental Medicine 13: 85-90 (1995))。
免疫沈降では、適切な界面活性剤を用いて調製した細胞溶解物にこれらの抗体を添加することにより、免疫複合体を形成させる。免疫複合体は、本発明のスクリーニングに使用するポリペプチド、そのポリペプチドとの結合能を含むポリペプチド、および抗体からなる。上記のエピトープに対する抗体を用いることに加えて、本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドに対する抗体を用いて免疫沈降を行うこともでき、これらの抗体は上記の通りに調製することができる。
抗体がマウスIgG抗体である場合、免疫複合体は、例えばプロテインAセファロースまたはプロテインGセファロースによって沈降させることができる。本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドをGSTなどのエピトープとの融合タンパク質として調製する場合には、これらのエピトープと特異的に結合する物質、例えばグルタチオン-セファロース4Bなどを用いて、本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドに対する抗体を用いる場合と同じ様式で免疫複合体を形成させることができる。免疫沈降は、例えば、文献(Harlow and Lane, (1988) Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York)中の方法に基づいてまたは従って行い得る。
SDS-PAGEは免疫沈降したタンパク質の解析に一般に用いられており、結合したタンパク質は、適切な濃度のゲルを用いてタンパク質の分子量によって解析することができる。本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドに結合したタンパク質をクマシー染色または銀染色などの一般的な染色法によって検出することは困難であるため、タンパク質の検出感度は、放射性同位体である35S-メチオニンまたは35S-システインを含む培養液中で細胞を培養し、細胞内のタンパク質を標識した上でタンパク質を検出することによって改善することができる。タンパク質の分子量が明らかになった時点で、標的タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲルから直接精製して、その配列を決定することができる。
ポリペプチドを使用して本発明のポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、例えばウェスト-ウェスタンブロット解析(Skolnik et al., (1991) Cell 65: 83-90)を用いることができる。具体的には、本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドに結合するタンパク質は、本発明のポリペプチドに結合するタンパク質を発現すると予想される細胞、組織、器官(例えば、精巣などの組織）、または培養細胞(例えば、HT1197、UMUC3、J82、HT1376、SW780、RT4 PC3、DU145、またはHT1376)から、ファージベクター(例えば、ZAP)を用いてcDNAライブラリーを調製し、LB-アガロース上でタンパク質を発現させ、発現したタンパク質をフィルター上に固定し、精製および標識がなされた本発明のポリペプチドを上記のフィルターと反応させ、本発明のポリペプチドに結合したタンパク質を発現するプラークを標識により検出することによって得ることができる。本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの結合を利用することにより、または本発明のスクリーニングに使用するポリペプチド、または本発明のポリペプチドに融合させたペプチドもしくはポリペプチド(例えば、GST)に特異的に結合する抗体を利用することにより標識し得る。放射性同位体または蛍光などを使用する方法を用いてもよい。
または、本発明のスクリーニング法の別の態様においては、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用することができる(「MATCHMAKERツーハイブリッドシステム」、「哺乳動物MATCHMAKERツーハイブリッドアッセイキット」、「MATCHMAKERワンハイブリッドシステム」(Clontech)；「HybriZAPツーハイブリッドベクターシステム」(Stratagene)；参考文献「Dalton and Treisman, (1992) Cell 68: 597-612」、「Fields and Sternglanz, (1994) Trends Genet 10: 286-92」)。
ツーハイブリッドシステムでは、本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドをSRF結合領域またはGAL4結合領域と融合させて、酵母細胞で発現させる。本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドに結合するタンパク質を発現すると予想される細胞から、ライブラリーが発現した際にVP16またはGAL4転写活性化領域と融合するように、cDNAライブラリーを調製する。続いてcDNAライブラリーを上記の酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリーに由来するcDNAを単離する(本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドに結合するタンパク質が酵母細胞で発現された場合、この2つの結合によってレポーター遺伝子が活性化され、陽性クローンが検出されるようになる)。cDNAによってコードされるタンパク質は、上記のようにして単離したcDNAを大腸菌に導入してタンパク質を発現させることによって調製することができる。
レポーター遺伝子としては、HIS3遺伝子のほかに、例えばAde2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などを用いることができる。
本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドに結合する化合物を、アフィニティークロマトグラフィーを用いてスクリーニングすることもできる。例えば、本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドをアフィニティーカラムの担体上に固定化し、本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドに結合し得るタンパク質を含む被験化合物をカラムに供す。本明細書における被験化合物は、例えば細胞抽出物、細胞溶解物などであってよい。被験化合物のローディング後にカラムを洗浄し、本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドに結合した化合物を調製することができる。
被験化合物がタンパク質である場合には、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析して、その配列に基づいてオリゴDNAを合成し、そのオリゴDNAをプローブとして用いてcDNAライブラリーをスクリーニングして、対象タンパク質をコードするDNAを取得する。表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーを、結合した化合物を検出または定量するための手段として本発明において用いることができる。このようなバイオセンサーを用いると、ごく微量のポリペプチドのみを用いて、標識を行わずに、本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドと被験化合物との相互作用を表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することができる(例えば、BIAcore、Pharmacia)。このため、BIAcoreなどのバイオセンサーを用いて、本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドと被験化合物との結合を評価することが可能である。
本発明のスクリーニングに使用する固定化されたポリペプチドを合成化合物、または天然物バンク、またはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーに曝露した際に結合する分子をスクリーニングする方法、および本発明のスクリーニングに使用するタンパク質に結合するタンパク質のみならず化合物(アゴニストおよびアンタゴニストを含む)も単離するための、コンビナトリアルケミストリー法に基づくハイスループットを用いたスクリーニング方法(Wrighton et al., (1996) Science 273: 458-64；Verdine, (1996) Nature 384: 11-13；Hogan, (1996) Nature 384: 17-9)は当業者に周知である。
または本発明は、以下のような段階を含む、C2093、B5860N、もしくはC6055によってコードされる本発明のポリペプチド、またはこれらの同等物を用いて、膀胱癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する：
(a) 被験化合物をポリペプチドまたはその同等物と接触させる段階；
(b) 段階(a)のポリペプチドまたはその同等物の生物活性を検出する段階；および
(c) ポリペプチドまたはその同等物の生物活性を、被験化合物の非存在下で検出される生物活性と比較して抑制する化合物を選択する段階。
本発明のC2093、B5860N、およびC6055タンパク質は膀胱癌細胞の細胞増殖を促進する活性を有するため、この活性を指標として用いて、この活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。
C2093、B5860N、またはC6055タンパク質の生物活性を含む限り、任意のポリペプチドをスクリーニングに使用することができる。このような生物活性には、ヒトC2093、B5860N、またはC6055タンパク質の細胞増殖活性が含まれる。例えば、ヒトC2093、B5860N、またはC6055タンパク質を用いることができ、これらのタンパク質と機能的に同等なポリペプチドを用いることもできる。このようなポリペプチドは、細胞によって内因的にまたは外因的に発現させてもよい。
このスクリーニングによって単離された化合物は、本発明のC2093、B5860N、またはC6055ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの候補である。「アゴニスト」という用語は、本発明のポリペプチドとの結合によってその機能を活性化する分子を指す。同様に、「アンタゴニスト」という用語は、本発明のポリペプチドとの結合によってその機能を阻害する分子を指す。さらに、このスクリーニングによって「アンタゴニスト」として単離された化合物は、本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドと分子(DNAおよびタンパク質を含む)とのインビボ相互作用を阻害する化合物の候補でもある。
本方法において検出しようとする生物活性が細胞増殖である場合には、実施例に記載されるように、例えば、本発明のスクリーニングに使用するポリペプチドを発現する細胞を調製し、この細胞を被験化合物の存在下で培養して、細胞増殖の速度を決定し、細胞周期などを測定し、さらにはコロニー形成活性を測定することにより、それを検出することができる。
さらなる態様において、本発明は、膀胱癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。上に詳述した通り、C2093、B5860N、および/またはC6055遺伝子の発現レベルを調節することにより、膀胱癌の発症および進行を調節することができる。したがって、膀胱癌の治療または予防に用いられ得る化合物は、C2093、B5860N、またはC6055の発現レベルを指標として用いるスクリーニングによって同定することができる。本発明の文脈において、このようなスクリーニングは例えば以下の段階を含み得る：
a) 被験化合物を、C2093、B5860N、またはC6055遺伝子の1つまたは複数を発現する細胞と接触させる段階；および
b) C2093、B5860N、またはC6055遺伝子の1つまたは複数の発現レベルを、被験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して低下させる化合物を選択する段階。
C2093、B5860N、またはC6055遺伝子の1つまたは複数のうちの少なくとも1つを発現する細胞には、例えば、膀胱癌から樹立された細胞株が含まれる；このような細胞を、本発明の上記のスクリーニングに用いることができる(例えば、HT1197、UMUC3、J82、HT1376、SW780、RT4、およびHT1376)。発現レベルは、当業者に周知の方法によって評価することができる。本スクリーニング方法において、C2093、B5860N、またはC6055遺伝子の発現レベルを低下させる化合物は、膀胱癌の治療または予防に用いる候補物質として選択され得る。
または、本発明のスクリーニング方法は以下の段階を含み得る：
a) 被験化合物を、C2093、B5860N、またはC6055である1つまたは複数のマーカー遺伝子の転写制御領域およびその転写制御領域の調節下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる段階；
b) レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階；および
c) レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を、被験化合物の非存在下で検出される発現レベルまたは活性と比較して低下させる化合物を選択する段階。
適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野において周知である。スクリーニングに必要なレポーター構築物は、マーカー遺伝子の転写制御領域を用いて調製することができる。マーカー遺伝子の転写制御領域が当業者に公知である場合には、その公知配列情報を用いてレポーター構築物を調製することができる。マーカー遺伝子の転写制御領域が未知である場合には、マーカー遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づいて、転写制御領域を含むヌクレオチド部分をゲノムライブラリーから単離し得る。
タンパク質の結合に用い得る支持体の例には、アガロース、セルロース、およびデキストランなどの不溶性多糖類、ならびにポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびシリコンなどの合成樹脂が含まれる。上記の材料から調製された市販のビーズおよびプレート(例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップなど)を用い得ることが好ましい。ビーズを用いる場合には、それらをカラムに充填してもよい。
タンパク質の支持体への結合は、化学的結合および物理的吸着などの慣行的方法に従って行うことができる。または、タンパク質は、タンパク質を特異的に認識する抗体を介して支持体に結合させてもよい。さらに、アビジンおよびビオチンを用いて、タンパク質を支持体に結合させることもできる。タンパク質間の結合は、緩衝液がタンパク質間の結合を阻害しない限りは、例えばこれらに限定されないがリン酸緩衝液およびTris緩衝液などの緩衝液中で行われる。
本発明において、表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーを、結合したタンパク質を検出または定量するための手段として用いることもできる。このようなバイオセンサーを用いると、ごく微量のポリペプチドのみを用いて、標識を行わずに、タンパク質間の相互作用を表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することができる(例えば、BIAcore、Pharmacia)。
または、C2093、B5860N、またはC6055ポリペプチドを標識し、結合したタンパク質の標識を用いて、結合したタンパク質を検出または測定することもできる。具体的には、タンパク質の一方をあらかじめ標識した後に、標識したタンパク質を被験化合物の存在下でもう一方のタンパク質と接触させ、次いで洗浄後に結合したタンパク質を標識によって検出または測定する。
本方法におけるタンパク質の標識には、放射性同位体(例えば、3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I)、酵素(例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ)、蛍光物質(例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン)、およびビオチン/アビジンなどの標識物質を用いることができる。タンパク質を放射性同位体で標識する場合には、検出または測定は液体シンチレーションによって行い得る。または、酵素で標識したタンパク質は、酵素の基質を添加して、呈色などの基質の酵素的変化を吸光光度計で検出することにより、検出または測定し得る。さらに、蛍光物質を標識として用いる場合には、蛍光光度計を用いて結合したタンパク質を検出または測定し得る。
本スクリーニングに抗体を用いる場合には、抗体を上記の標識物質のいずれかで標識し、標識物質に基づいて検出または測定することが好ましい。または、C2093、B5860N、またはC6055ポリペプチドに対する抗体を一次抗体として使用して、標識物質で標識した二次抗体によって検出してもよい。さらに、本発明のスクリーニングにおいてタンパク質に結合した抗体は、プロテインGまたはプロテインAカラムを用いて検出または測定することもできる。
細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物の産物、海洋生物からの抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物、および天然化合物を含むがこれらに限定されない任意の被験化合物を、本発明のスクリーニング法に用いることができる。本発明の被験化合物は、(1) 生物学的ライブラリー、(2) 空間的にアドレス指定が可能な並行した固相または液相ライブラリー、(3) デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、(4) 「1ビーズ1化合物」ライブラリー法、および(5) アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を含む、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における任意の多くの方法で入手することもできる。アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、他の4つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の低分子ライブラリーに適用可能である(Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67)。分子ライブラリーを合成する方法の例は、当技術分野において見い出すことができる(DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13；Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6；Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85；Cho et al. (1993) Science 261: 1303-5；Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059；Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061；Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233-51)。化合物のライブラリーは、溶液中に提示してもよく(Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412-21を参照されたい)、またはビーズ(Lam (1991) Nature 354: 82-4)、チップ(Fodor (1993) Nature 364: 555-6)、細菌(米国特許第5,223,409号)、胞子(米国特許第5,571,698号；同第5,403,484号、および同第5,223,409号)、プラスミド(Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-9)、もしくはファージ(Scott and Smith (1990) Science 249: 386-90；Delvin (1990) Science 249: 404-6；Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-82；Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-10；米国特許出願第2002103360号)上に提示してもよい。
本スクリーニングによって単離された化合物は、マーカー遺伝子の発現またはマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を阻害する薬物を開発するための候補となり、膀胱癌の治療または予防に適用することができる。
さらに、マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を阻害する化合物の構造の一部が、付加、欠失、および/または置換によって変換された化合物もまた、本発明のスクリーニング法によって得られる化合物に含まれる。
本発明の方法によって単離された化合物を、ヒトおよび他の哺乳動物、例えばこれらに限定されないがマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーの薬剤として投与する場合、単離された化合物は直接投与することもできるし、または公知の薬学的調製法を用いて剤形に製剤化することもできる。本発明の意図する薬学的組成物および調製物、ならびにこれらを作製および使用する方法については、以下で詳述する。
膀胱癌を有する対象の予後の評価
本発明はまた、被験細胞集団における1つまたは複数のBLC関連遺伝子の発現を、全病期にわたる患者から得られた参照細胞集団における同じBLC関連遺伝子の発現と比較する段階を含む、BLCを有する対象の予後を評価する方法を提供する。被験細胞集団および参照細胞集団における1つまたは複数のBLC関連遺伝子の遺伝子発現を比較することにより、または対象から得られた被験細胞集団の経時的な遺伝子発現のパターンを比較することにより、対象の予後を評価することができる
例えば、表4に列挙したような上方制御されるBLC関連遺伝子の1つもしくは複数の発現が正常対照と比較して上昇すること、または表5に列挙したような下方制御されるBLC遺伝子の1つもしくは複数の発現が正常対照と比較して低下することは、予後があまり好ましくないことを示す。逆に、表4〜5に列挙されたBLC関連遺伝子の1つまたは複数の発現が正常対照と比較して類似していることは、対象の予後がより好ましいことを示す。好ましくは、表4および5に列挙された遺伝子からなる群より選択される1つまたは複数の遺伝子の遺伝子の発現プロファイルを比較することにより、対象の予後を評価し得る。
キット
本発明はまた、BLC検出試薬、例えば、BLC核酸の一部に相補的なオリゴヌクレオチド配列のような、1つまたは複数のBLC核酸に特異的に結合するかもしくはこれを同定する核酸、またはBLC核酸によってコードされる1つまたは複数のタンパク質に結合する抗体を含む。検出試薬は、キットの形態で共に包装され得る。例えば、検出試薬、例えば核酸または抗体(固相マトリクスに結合してあるか、またはそれらをマトリクスに結合させるための試薬とは個別に包装される)、対照試薬(陽性および/または陰性)、および/または検出可能な標識は、個別の容器に包装され得る。アッセイを行うための説明書(例えば、書面、テープ、VCR、CD-ROMなど)もまた、キットに含まれ得る。キットのアッセイ形式は、当技術分野においていずれも公知であるノーザンハイブリダイゼーションまたはサンドイッチELISAであり得る。
例えば、BLC検出用試薬を多孔性ストリップのような固体マトリックス上に固定し、少なくとも1つのBLC検出部位を形成してもよい。多孔性ストリップの測定領域または検出領域は、それぞれが1つの核酸を含む複数の部位を含んでもよい。試験ストリップは、陰性対照部位および/または陽性対照部位を含む場合もある。または、対照部位を検査ストリップとは別のストリップ上に配置してもよい。任意で、異なる検出部位が異なる量の固定化核酸を含んでもよく、すなわち、第1の検出部位でより多く、以後の部位でより少なく含んでもよい。被験試料を添加すると、検出可能なシグナルを呈している部位の数により、試料中に存在するBLC量の定量的指標が得られる。検出部位は任意の適した検出可能な形態として構成することができ、典型的に検査ストリップの幅全体にわたる棒状またはドット状の形態にある。
または、キットは、1つまたは複数の核酸を含む核酸基質アレイを含み得る。アレイ上の核酸は、表4〜5に列挙されたBLC関連遺伝子によって示される1つまたは複数の核酸配列を特異的に同定する。表4〜5に列挙されたBLC関連遺伝子によって示される核酸の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40、または50個もしくはそれ以上の発現は、アレイテストストリップまたはチップへの結合レベルによって同定され得る。基質アレイは、例えば、参照によりその全内容が全体として本明細書に組み入れられる米国特許第5,744,305号に記載される「チップ」などの固体基質上に存在し得る。
アレイおよび複数性
本発明はまた、1つまたは複数の核酸を含む核酸基質アレイを含む。アレイ上の核酸は、表4〜5に列挙されたBLC関連遺伝子によって示される1つまたは複数の核酸配列に特異的に対応する。表4〜5に列挙されたBLC関連遺伝子によって示される核酸の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40、または50個もしくはそれ以上の発現レベルは、アレイに結合する核酸を検出することによって同定され得る。
本発明はまた、単離された複数の核酸(すなわち、2つまたはそれ以上の核酸の混合物)を含む。核酸は液相または固相中に存在し得、例えばニトロセルロース膜などの固体支持体上に固定化されていてもよい。複数性には、表4〜5に列挙されたBLC関連遺伝子によって示される核酸の1つまたは複数が含まれる。様々な態様において、複数性には、表4〜5に列挙されたBLC関連遺伝子によって示される核酸の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40、または50個もしくはそれ以上が含まれる。
膀胱癌を阻害する方法
本発明はさらに、表4に列挙された上方制御されるBLC関連遺伝子の1つまたは複数の発現(またはその遺伝子産物の活性)を低下させるか、または表5に列挙された下方制御されるBLC関連遺伝子の1つまたは複数の発現(またはその遺伝子産物の活性)を上昇させることにより、対象におけるBLCの症状を治療または軽減する方法を提供する。適切な治療用化合物を、BLCに罹患しているかまたはBLCを発症するリスク(またはそれに対する感受性)を有する対象に対して、予防的または治療的に投与することができる。このような対象は、標準的な臨床的方法を用いて、または表4〜5に列挙されたBLC関連遺伝子の1つもしくは複数の異常な発現レベルもしくはその遺伝子産物の異常な活性を検出することにより、同定することができる。本発明の文脈において、適切な治療剤には、例えば細胞周期制御および細胞増殖の阻害剤が含まれる。
本発明の治療法は、BLC細胞が由来する同じ組織種の正常細胞と比較して、BLC細胞において発現が低下している1つまたは複数の遺伝子(「下方制御される」または「低発現される」遺伝子)または遺伝子産物の発現、活性、またはその両者を上昇させる段階を含む。これらの方法では、対象において低発現される(下方制御される)遺伝子の1つまたは複数の量を上昇させる化合物の有効量で対象を治療する。投与は全身投与または局所投与であり得る。適切な治療用化合物には、低発現される遺伝子のポリペプチド産物、その生物活性断片、および低発現される遺伝子をコードし、かつBLC細胞における発現を可能にする発現調節エレメントを有する核酸；例えば、BLC細胞にとって内因性であるこのような遺伝子の発現レベルを上昇させる物質(すなわち、低発現される1つまたは複数の遺伝子の発現を上方制御するもの)が含まれる。このような化合物の投与は、対象の膀胱癌細胞における異常に低発現された1つまたは複数の遺伝子の影響に対抗し、対象の臨床状態を改善する。
または、本発明の治療法は、膀胱癌細胞において発現が異常に上昇している1つまたは複数の遺伝子(「上方制御される」または「過剰発現される」遺伝子)または遺伝子産物の発現、活性、またはその両者を低下させる段階を含む。発現は、当技術分野で公知の任意のいくつかの方法によって阻害することができる。例えば、過剰発現される1つまたは複数の遺伝子の発現を阻害するかまたはそれに拮抗する核酸、例えば、過剰発現される1つまたは複数の遺伝子の発現を妨害するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子干渉RNAを対象に投与することによって、発現を阻害することができる。
さらなる別の態様において、本治療法は、C2093、B5860N、またはC6055遺伝子の発現または機能を低下させる段階を含む。これらの方法では、対象を、対象において過剰発現される遺伝子(すなわち、C2093、B5860N、またはC6055遺伝子)の1つまたは複数の発現および/または活性を低下させる化合物の有効量で治療する。投与は全身投与または局所投与であり得る。治療用化合物には、膀胱癌細胞に内因的に存在するこのような遺伝子の発現レベルを低下させる化合物(すなわち、過剰発現される遺伝子の発現を下方制御する化合物)が含まれる。このような治療用化合物の投与は、対象の細胞における異常に過剰発現された遺伝子の影響に対抗し、対象の臨床状態を改善する。このような化合物は、上記の本発明のスクリーニング法によって得ることができる。
C2093、B5860N、またはC6055遺伝子の発現はまた、遺伝子の発現を阻害するかまたはそれに拮抗する核酸を対象に投与する段階を含む、当技術分野において公知のいくつかの方法のいずれかで阻害することもできる。遺伝子の発現を妨害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、またはリボザイムを、遺伝子の発現を阻害するために使用することができる。
上記のように、C2093、B5860N、またはC6055遺伝子のヌクレオチド配列に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、C2093、B5860N、またはC6055遺伝子の発現レベルを低下させることができる。具体的には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、C2093、B5860N、もしくはC6055遺伝子、またはこれらに対応するmRNAのいずれかと結合することにより作用し得、それによって遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、および/または遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を阻害し、最終的にC2093、B5860N、またはC6055タンパク質の機能を阻害する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその誘導体は、誘導体に対して不活性である適切な基剤と混合することでリニメント剤または湿布剤などの外用剤にして、本発明の膀胱癌を治療または予防する方法で使用することができる。
過剰発現される遺伝子の1つまたは複数の遺伝子産物を阻害する核酸には、C2093、B5860N、またはC6055遺伝子をコードするヌクレオチド配列のセンス鎖核酸とアンチセンス鎖核酸の組み合わせを含む低分子干渉RNA(siRNA)もまた含まれる。本発明の治療または予防においては、細胞にsiRNAを導入する標準的な技術が用いられ得るが、これにはDNAがRNA転写の鋳型となる技術が含まれる。siRNAは、例えばヘアピンのように、標的遺伝子からの単一の転写産物がセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を有するように構築される。
アンチセンスポリヌクレオチド、低分子干渉RNA、およびリボザイム
上記のように、表4に列挙されたBLC関連遺伝子のヌクレオチド配列に対応するアンチセンス核酸を用いて、遺伝子の発現レベルを低下させることができる。膀胱癌において上方制御される、表4に列挙されたBLC関連遺伝子に対応するアンチセンス核酸は、膀胱癌の治療に有用である。具体的には、本発明のアンチセンス核酸は、表4に列挙されたBLC関連遺伝子またはそれらに対応するmRNAと結合することによって作用し得、それによって遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、および/または表4に列挙されたBLC関連遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を阻害し、それによってタンパク質の機能を阻害する。
本発明は、SEQ ID NO:3のヌクレオチド配列内の任意の部位とハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。具体的には、本発明は、SEQ ID NO:3の988〜1842、すなわちB5860NV1配列に特異的な領域のヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドを提供する。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、SEQ ID NO:3のヌクレオチド配列の少なくとも約15個の連続したヌクレオチドに対するものである。上記の少なくとも15個の連続したヌクレオチドにおいて開始コドンを含む、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、さらにより好ましい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体または修飾産物を、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることもできる。そのような修飾産物の例には、メチル-ホスホネート型またはエチル-ホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾物、ホスホロチオエート修飾物、およびホスホロアミデート修飾物が含まれる。
本明細書で用いる「アンチセンス核酸」という用語は、標的配列に完全に相補的なヌクレオチド、およびアンチセンス核酸が標的配列に特異的にハイブリダイズし得る限り、1つまたは複数のヌクレオチドのミスマッチを有するヌクレオチドの両方を包含する。例えば、本発明のアンチセンス核酸には、少なくとも15個の連続したヌクレオチドの範囲にわたって、少なくとも約70％またはそれ以上、好ましくは少なくとも約80％またはそれ以上、より好ましくは少なくとも約90％またはそれ以上、さらにより好ましくは少なくとも約95％またはそれ以上の相同性を有するポリヌクレオチドが含まれる。相同性の決定には、当技術分野において公知のアルゴリズムを使用することができる。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体または修飾産物を、本発明でアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることもできる。そのような修飾産物の例には、メチル-ホスホネート型またはエチル-ホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾物、ホスホロチオエート修飾物、およびホスホロアミデート修飾物が含まれるが、これらに限定されない。
このようなアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするDNAを単離もしくは検出するためのプローブとして、または増幅に使用するためのプライマーとして有用である。
本発明のアンチセンス核酸は、BLC関連マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質を産生する細胞に対して、そのタンパク質をコードするDNAまたはmRNAと結合し、それらの転写または翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、かつタンパク質の発現を阻害することによって作用し、その結果タンパク質の機能を阻害する。
本発明のアンチセンス核酸は、核酸に対して不活性の適切な基剤と混合することにより、リニメント剤または湿布剤などの外用製剤の形にすることができる。
同様に、必要に応じて、賦形剤、等張剤、溶解補助剤、安定剤、保存料、鎮痛薬などを添加することにより、本発明のアンチセンス核酸を、例えば錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻薬、および凍結乾燥製剤へと製剤化することもできる。これらは以下の公知の方法によって調製することができる。
本発明のアンチセンス核酸は、罹患部位に直接適用することにより、またはそれが罹患部位に到達するように血管内に注入することにより、患者に投与することができる。アンチセンスを含む溶媒を使用することで、持続性および膜透過性を高めることもできる。その例には、リポソーム、ポリ-L-リジン、脂質、コレステロール、リポフェクチンまたはこれらの誘導体が含まれるがそれらに限定されない。
本発明のアンチセンス核酸誘導体の用量は、患者の状態に応じて適切に調節され、所望の量で用いることができる。例えば0.1 mg/kg〜100 mg/kg、好ましくは0.1 mg/kg〜50 mg/kgの用量範囲で投与することができる。
本発明のアンチセンス核酸は、本発明のタンパク質の発現を阻害し、そのため、本発明のタンパク質の生物活性を抑制するのに有用である。さらに、本発明のアンチセンス核酸を含む発現阻害剤も、本発明のタンパク質の生物活性を阻害し得るため、有用である。
本発明の方法は、上方制御される、例えば、細胞の悪性形質転換に起因して上方制御されるBLC関連遺伝子の細胞内の発現を変化させるために用いることができる。標的細胞において、siRNAが、表4に列挙されたBLC関連遺伝子の1つに対応する転写産物に結合することにより、細胞によるタンパク質産生が減少する。オリゴヌクレオチドの長さは少なくとも10ヌクレオチドであり、天然転写産物と同じ長さであってもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、75、50、25ヌクレオチド長、またはそれ未満である。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは約19〜25ヌクレオチド長である。
本発明のアンチセンス核酸には、修飾オリゴヌクレオチドが含まれる。例えば、チオエート化オリゴヌクレオチドを用いて、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を付与することができる。
同様に、マーカー遺伝子に対するsiRNAを用いて、マーカー遺伝子の発現レベルを低下させることができる。本明細書において「siRNA」という用語は、標的mRNAの翻訳を妨げる二本鎖RNA分子を指す。細胞にsiRNAを導入する標準的な技法が用いられ得るが、これにはDNAがRNA転写の鋳型となる技法が含まれる。本発明の文脈において、siRNAは、表4に列挙されたBLC関連遺伝子などの上方制御されるマーカー遺伝子に対するセンス核酸配列およびアンチセンス核酸配列を含む。siRNAは、例えばヘアピンのように、単一の転写産物が標的遺伝子由来のセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を有するように構築される。
表4に列挙したようなBLC関連遺伝子のsiRNAは、標的mRNAにハイブリダイズし、その結果、通常一本鎖mRNA転写産物と会合し、それによって翻訳およびひいてはタンパク質の発現を妨害することにより、表4に列挙されたBLC関連遺伝子によってコードされるポリペプチドの産生を減少させるかまたは阻害する。したがって、本発明のsiRNA分子は、ストリンジェントな条件下で表4に列挙されたmRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする能力により定義され得る。本発明の目的において、「ハイブリダイズする」または「特異的にハイブリダイズする」という用語は、2つの核酸分子が「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」下でハイブリダイズする能力を指すために交換可能に用いられる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、上記で説明されたが、典型的には核酸の複雑な混合物中で核酸分子がその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列には検出可能な程度にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、種々の状況によって異なる。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、特定の配列について、規定のイオン強度pHでの融解温度(Tm)よりも約5〜10℃低くなるように選択される。Tmとは、標的に相補的なプローブの50％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする(規定のイオン強度、pH、および核酸濃度における)温度である(標的配列が過剰に存在する場合、Tmでは、プローブの50％が平衡状態で占有されている)。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションに関して、陽性シグナルとは、バックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下であり得る：50％ホルムアミド、5×SSC、および1％ SDS中での42℃におけるインキュベーション、または5×SSC、1％ SDS中での65℃におけるインキュベーション、0.2×SSCおよび0.1％ SDS中での50℃における洗浄を伴う。
本発明の文脈において、siRNAは好ましくは、500、200、100、50、もしくは25ヌクレオチド長またはそれ未満である。より好ましくは、siRNAは約19〜約25ヌクレオチド長である。siRNAの阻害活性を増強する目的で、ヌクレオチド「u」を標的配列のアンチセンス鎖の3'末端に付加することができる。付加する「u」の数は、少なくとも約2個、一般的には約2〜約10個、好ましくは約2〜約5個である。付加された「u」は、siRNAのアンチセンス鎖の3'末端において一本鎖を形成する。
表4に列挙したようなBLC関連遺伝子のsiRNAは、mRNA転写産物と結合し得る形態で、細胞内に直接導入することができる。これらの態様において、本発明のsiRNA分子は典型的には、アンチセンス分子に関して上記のように修飾される。その他の修飾もまた可能であり、例えば、コレステロール結合siRNAは薬理学的特性を改善することが示されている。Song et al. Nature Med. 9：347-51(2003)。または、siRNAをコードするDNAを、ベクターに含めて送達することもできる。
ベクターは、例えば、BLC関連遺伝子標的配列を、その配列に隣接する機能的に連結された制御配列を有する発現ベクター中に、両鎖の発現が(DNA分子の転写により)可能になるような様式でクローニングすることによって作製してもよい(Lee, N.S., et al.,(2002) Nature Biotechnology 20：500-5)。BLC関連遺伝子のmRNAに対するアンチセンス鎖であるRNA分子を第1のプロモーター(例えば、クローニングされたDNAの3'側にあるプロモーター配列)によって転写させ、BLC関連遺伝子のmRNAに対してセンス鎖であるRNA分子を第2のプロモーター(例えば、クローニングされたDNAの5'側にあるプロモーター配列)によって転写させる。センス鎖とアンチセンス鎖はインビボでハイブリダイズして、BLC関連遺伝子をサイレンシングするためのsiRNA構築物を生じる。または、2つの構築物を利用して、siRNA構築物のセンス鎖およびアンチセンス鎖を作製することもできる。クローニングされたBLC関連遺伝子は、単一の転写産物が標的遺伝子由来のセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を有する、例えばヘアピンなどの二次構造を有する構築物をコードすることも可能である。
ヘアピンループ構造を形成させる目的で、任意のヌクレオチド配列からなるループ配列をセンス配列とアンチセンス配列との間に配置することができる。したがって、本発明はまた、一般式5'-[A]-[B]-[A']-3'(式中、[A]は、表4に列挙されたmRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする配列に対応するリボヌクレオチド配列である)を有するsiRNAを提供する。好ましい態様において、[A]は表4から選択された遺伝子の配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、[B]は約3〜約23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり、[A']は[A]の相補配列からなるリボヌクレオチド配列である。領域[A]は[A']とハイブリダイズし、次いで領域[B]からなるループが形成される。ループ配列は、好ましくは3〜23ヌクレオチド長であり得る。ループ配列は、例えば、以下の配列からなる群より選択され得る(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)。さらに、23ヌクレオチドからなるループ配列もまた、活性siRNAを提供する(Jacque, J.-M., et al.,(2002) Nature 418：435-8)。
CCC、CCACC、またはCCACACC：Jacque, J. M, et al.,(2002) Nature, 418：435-8。
UUCG：Lee, N.S., et al.,(2002) Nature Biotechnology 20：500-5。Fruscoloni, P., et al.,(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(4)：1639-44。
UUCAAGAGA：Dykxhoorn, D. M., et al.,(2002) Nature Reviews Molecular Cell Biology 4：457-67。
例えば、ヘアピン構造を有する本発明の好ましいsiRNAを以下に示す。以下の構造においてループ配列は、CCC、UUCG、CCACC、CCACACC、およびUUCAAGAGAからなる群より選択され得る。好ましいループ配列は、UUCAAGAGA(DNAでは「ttcaagaga」)である。
適切なsiRNAのヌクレオチド配列は、Ambionのウェブサイト(http://www.ambion.com/techlib/ misc/siRNA_finder.html)から入手可能なsiRNA設計コンピュータープログラムを用いて設計することができる。コンピュータープログラムは、以下のプロトコールに基づいてsiRNA合成のためのヌクレオチド配列を選択する。
siRNA標的部位の選択
1．対象となる転写物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列を求めて下流にスキャンする。潜在的なsiRNA標的部位として、個々のAAおよび3'側に隣接する19ヌクレオチドの出現を記録する。Tuschl, et al.(1999)Genes Dev 13(24):3191-7においては、5'および3'非翻訳領域(UTR)および開始コドン近傍(75塩基以内)の領域が、調節タンパク質結合部位により富んでいる可能性があることから、これらに対してsiRNAを設計しないことを推奨している。UTR-結合タンパク質および/または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害し得る。
2．潜在的な標的部位をヒトゲノムデータベースと比較し、他のコード配列に対して有意な相同性をもついかなる標的配列も検討対象から除く。相同性検索は、NCBIのサーバー上(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)にあるBLASTを用いて実施することができる。
3．合成に適した標的配列を選択する。アンビオンでは、好ましくは、評価すべき遺伝子の長さに沿っていくつかの標的配列を選択することができる。
BLC関連遺伝子に隣接する調節配列は、それらの発現が独立に、または時間的もしくは空間的様式で調節されることが可能なように、同一の場合もあれば異なる場合もある。siRNAは、BLC関連遺伝子の鋳型をそれぞれ、例えば核内低分子RNA(snRNA)U6由来のRNAポリメラーゼIII転写単位またはヒトH1 RNAプロモーターを含むベクター中にクローニングすることにより、細胞内で転写される。ベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション促進剤を使用することができる。FuGENE(Rochediagnostices)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)、およびNucleofector(和光純薬工業)は、トランスフェクション促進剤として有用である。
C2093、B5860N、またはC6055 mRNAの様々な部分のオリゴヌクレオチドおよびそれらの様々な部分に相補的なオリゴヌクレオチドを、標準的な方法に従って、腫瘍細胞において(例えば、HT1197、UMUC3、J82、HT1376、SW780、RT4、またはHT1376膀胱癌細胞株を用いて)C2093、B5860N、またはC6055の産生を減少させる能力についてインビトロで試験した。候補siRNA組成物と接触させた細胞におけるC2093、B5860N、またはC6055転写産物の産物が、候補組成物の非存在下で培養した細胞と比較して減少していることを、C2093、B5860N、もしくはC6055特異的抗体を用いて、または他の検出戦略を用いて検出する。インビトロでの細胞に基づくアッセイまたは無細胞アッセイにおいてC2093、B5860N、またはC6055の産生を減少させる配列を、次いで細胞増殖に対する阻害効果に関して試験する。インビトロでの細胞に基づくアッセイにおいて細胞増殖を阻害する配列をラットまたはマウスにおいてインビボで試験し、C2093、B5860N、またはC6055産生の減少、および悪性新生物を有する動物における腫瘍細胞増殖の減少を確認する。
本発明には、標的配列、例えば、SEQ ID NO:1のヌクレオチド2543〜2561(SEQ ID NO:21)、SEQ ID NO:3のヌクレオチド2491〜2509、もしくはSEQ ID NO:5のヌクレオチド1639〜1657(SEQ ID NO:25)、またはSEQ ID NO:129のヌクレオチド1905〜1923、SEQ ID NO:131のヌクレオチド1873〜1891、SEQ ID NO:133のヌクレオチド1921〜1939、もしくはSEQ ID NO:135のヌクレオチド2001〜2019(SEQ ID NO:144)の核酸配列を含む二本鎖分子もまた含まれる。本発明において、センス鎖がSEQ ID NO:21、25、または144に対応するリボヌクレオチド配列を含み、かつアンチセンス鎖がそのようなセンス鎖に相補的なリボヌクレオチド配列を含み、そのようなセンス鎖とそのようなアンチセンス鎖が相互にハイブリダイズして二本鎖分子を形成する、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子は、C2093、B5860N、またはC6055遺伝子を発現する細胞に導入した場合に、そのような遺伝子の発現を阻害する。本発明において、単離された核酸がRNAまたはその誘導体である場合には、ヌクレオチド配列において塩基「t」は「u」と置換される必要がある。本明細書で使用する「相補的な」という用語は、核酸分子のヌクレオチド単位間のWatson CrickまたはHoogsteen塩基対形成を指し、「結合」という用語は、2つの核酸もしくは化合物、または関連する核酸もしくは化合物、またはこれらの組み合わせの間での物理的または化学的相互作用を意味する。
相補的な核酸配列は適切な条件下でハイブリダイズして、ミスマッチをほとんど含まない安定した二重鎖を形成する。さらに、本発明の単離されたヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖ヌクレオチドまたはヘアピンループ構造を形成し得る。好ましい態様において、このような二重鎖は、10個の一致ごとにミスマッチを2つ以上含まない。二重鎖の鎖が完全に相補的である特に好ましい態様においては、そのような二重鎖はミスマッチを含まない。核酸分子は、(SEQ ID NO:1に関して)6319ヌクレオチド長未満、(SEQ ID NO:3に関して)5318ヌクレオチド長未満、(SEQ ID NO:129に関して)3851ヌクレオチド長未満、(SEQ ID NO:131に関して)3819ヌクレオチド長未満、(SEQ ID NO:133に関して)3851ヌクレオチド長未満、または(SEQ ID NO:135に関して)3819ヌクレオチド長未満である。例えば、核酸分子は、500、200、75ヌクレオチド長、またはそれ未満である。本発明には、本明細書に記載する核酸の1つまたは複数を含むベクター、およびそのベクターを含む細胞もまた含まれる。本発明の単離された核酸は、C2093、B5860N、もしくはC6055に対するsiRNA、またはsiRNAをコードするDNAに有用である。核酸をsiRNAまたはそれをコードするDNAに使用する場合、センス鎖は好ましくは約19ヌクレオチドよりも長く、より好ましくは約21ヌクレオチドよりも長い。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAは、本発明のポリペプチドの発現を阻害し、そのため本発明のポリペプチドの生物活性を抑制するのに有用である。同様に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含む発現阻害剤は、それらが本発明のポリペプチドの生物活性を阻害し得るという点で有用である。
したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含む組成物は、膀胱癌の治療に有用である。さらに、siRNAの阻害活性を増強する目的で、ヌクレオチド「u」を標的配列のアンチセンス鎖の3'末端に付加することもできる。付加する「u」の数は、少なくとも約2個、一般的には約2〜約10個、好ましくは約2〜約5個である。付加した「u」は、siRNAのアンチセンス鎖の3'末端において一本鎖を形成する。
同様に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含む発現阻害剤は、それらが本発明のポリペプチドの生物活性を阻害できるという点において有用である。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含む組成物は、膀胱癌のような細胞増殖性疾患を治療するのに有用である。
さらに、本発明は、本発明のC2093、B5860N、またはC6055ポリペプチドの発現を阻害するリボザイムを提供する。
一般に、リボザイムは大型リボザイムと小型リボザイムに分類される。大型リボザイムは、核酸のリン酸エステル結合を切断する酵素として知られている。大型リボザイムとの反応後、反応した部位は5'リン酸基および3'ヒドロキシル基からなる。大型リボザイムはさらに、(1)グアノシンによる5'スプライス部位でのエステル交換反応を触媒するI群イントロンRNA；(2)投げ縄構造を介した2段階反応による自己スプライシングを触媒するII群イントロンRNA；および(3)加水分解によりtRNA前駆体を5'部位で切断するリボヌクレアーゼPのRNA成分に分類される。一方、小型リボザイムは大型リボザイムと比較してサイズが小さく(約40 bp)、RNAを切断して5'ヒドロキシル基および2'-3'環状リン酸を生じる。ハンマーヘッド型リボザイム(Koizumi et al.,(1988) FEBS Lett 228：228-30)およびヘアピン型リボザイム(Buzayan,(1986) Nature 323：349-53；Kikuchi and Sasaki,(1991) Nucleic Acids Res 19：6751-5)は小型リボザイムに含まれる。リボザイムを設計および構築する方法は、当技術分野において公知である(Koizumi et al.,(1988) FEBS Lett 228：228-30；Koizumi et al.,(1989) Nucleic Acids Res 17：7059-71；Kikuchi and Sasaki,(1991) Nucleic Acids Res 19：6751-5を参照されたい)。したがって、本発明のポリペプチドの発現を阻害するリボザイムを、それらの配列情報(SEQ ID NO：1、3、5、129、131、133、または135)およびこれらの従来の方法に基づいて構築することも可能である。
C2093、B5860N、またはC6055転写産物に対するリボザイムは、過剰発現されるC2093、B5860N、またはC6055タンパク質の発現を阻害し、このタンパク質の生物活性を抑制し得る。したがって、これらのリボザイムは膀胱癌の治療または予防に有用である。
抗体
または、BLCにおいて過剰発現される遺伝子の1つまたは複数の遺伝子産物の機能は、遺伝子産物に結合するか、または別の方法で遺伝子産物の機能を阻害する化合物を投与することによって阻害することができる。例えば、化合物は、1つまたは複数の過剰発現される遺伝子産物に結合する抗体である。
本発明は、抗体、特に上方制御されるマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体、またはそのような抗体の断片の使用に言及する。本明細書で使用する「抗体」という用語は、抗体を合成するために用いた抗原(すなわち、上方制御されるマーカーの遺伝子産物)またはそれに近縁の抗原とのみ相互作用する(すなわち、結合する)、特異的構造を有する免疫グロブリン分子を指す。
本発明は、本発明のポリペプチドに結合する抗体を提供する。具体的には、本発明は、B5860NV1特異的配列であるSEQ ID NO:4の304〜588のアミノ酸配列を含む抗原決定基に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの任意の形態で使用され得、これにはウサギなどの動物を本発明のポリペプチドで免疫することによって得られる抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組換えによって作製されたヒト化抗体が含まれる。
抗体を得るための抗原として用いられる本発明のポリペプチドは、任意の動物種に由来し得るが、好ましくはヒト、マウス、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のポリペプチドは、本明細書に開示するヌクレオチドまたはアミノ酸配列から得ることができる。
本発明によれば、免疫抗原として用いるポリペプチドは、完全なタンパク質であってもまたはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。部分ペプチドは、例えば、B5860NV1特異的配列(SEQ ID NO:4の304〜588位)から選択される部分アミノ酸配列を含んでもよい。
本明細書では、抗体を、本発明のポリペプチドの全長または断片のいずれかと反応するタンパク質として定義する。
本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする遺伝子を既知の発現ベクターに挿入し、次いでこのベクターを用いて本明細書に記載する宿主細胞を形質転換することができる。所望のポリペプチドまたはその断片を、任意の標準的な方法によって宿主細胞の内部または外部から回収し、後にこれを抗原として用いることができる。または、ポリペプチドを発現する細胞全体もしくはその溶解物、または化学合成したポリペプチドを抗原として用いてもよい。
任意の哺乳動物を抗原で免疫することができるが、細胞融合に用いる親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、齧歯目(Rodentia)、ウサギ目(Lagomorpha)、または霊長目(Primate)の動物が用いられる。齧歯目の動物には、例えば、マウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長目の動物には、例えば、カニクイザル(Macaca fascicularis)、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目(Catarrhini)(旧世界サル)のサルが含まれる。
動物を抗原で免疫する方法は、当技術分野で公知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物を免疫するための標準的な方法である。より具体的には、抗原を適切な量のリン酸緩衝食塩水(PBS)、生理食塩水などで希釈し、懸濁させる。必要に応じて、抗原懸濁液を、フロイント完全アジュバントなどの適量の標準的アジュバントと混合し、乳化した後、哺乳動物に投与し得る。その後、適量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を、4〜21日ごとに数回投与することが好ましい。免疫化に適切な担体を用いてもよい。上記のように免疫した後、血清を、所望の抗体の量の増加に関して標準的方法で調べる。
本発明のポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加に関して調べた免疫後の哺乳動物から血液を採取し、任意の従来法によって血液から血清を分離することによって調製することができる。ポリクローナル抗体にはポリクローナル抗体を含む血清が含まれ、ポリクローナル抗体を含む画分を血清から単離することもできる。免疫グロブリンGまたはMは、本発明のポリペプチドのみを認識する画分から、例えば、本発明のポリペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いた上で、この画分をプロテインAまたはプロテインGカラムを用いてさらに精製して、調製することができる。
モノクローナル抗体を調製するには、抗原で免疫した哺乳動物から免疫細胞を収集し、上記の通りに血清中の所望の抗体のレベル上昇について確かめた上で、細胞融合に供する。細胞融合に用いる免疫細胞は、脾臓から取得することが好ましい。上記の免疫細胞と融合させるもう一方の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、より好ましくは薬物による融合細胞の選択のための特性を獲得した骨髄腫細胞が含まれる。
上記の免疫細胞および骨髄腫細胞は、既知の方法、例えば、Milstein et al. (Galfre and Milstein, (1981) Methods Enzymol 73: 3-46)の方法に従って融合させることができる。
細胞融合によって結果として得られたハイブリドーマは、それらをHAT培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地)などの標準的な選択培地中で培養することによって選択し得る。細胞培養は典型的に、HAT培地中で、所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞(非融合細胞)が死滅するのに十分な期間である、数日間から数週間にわたって続けられる。その後、標準的な限界希釈を行い、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングする。
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫する上記の方法に加えて、EBウイルスに感染したリンパ球などのヒトリンパ球を、ポリペプチド、ポリペプチド発現細胞、またはそれらの溶解物でインビトロにおいて免疫することもできる。続いて、免疫後のリンパ球を、無限に分裂し得るU266などのヒト由来の骨髄腫細胞と融合させ、ポリペプチドに結合し得る所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる(特開昭63-17688号)。
続いて得られたハイブリドーマをマウスの腹腔内に移植し、腹水を抽出する。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインAもしくはプロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のポリペプチドを結合させたアフィニティーカラムにより精製することができる。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの精製および検出のためだけでなく、本発明のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても用いられ得る。さらに、この抗体を、本発明のポリペプチドに関連した疾患の抗体療法に適用することもできる。得られた抗体を人体に対して投与する場合には(抗体療法)、免疫原性を抑えるためにヒト抗体またはヒト化抗体が好ましい。
例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物を、ポリペプチド、ポリペプチド発現細胞、またはそれらの溶解物から選択される抗原で免疫することができる。次いで、抗体産生細胞を動物から採取し、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得、そのハイブリドーマからポリペプチドに対するヒト抗体を調製することができる(WO92-03918、WO94-02602、WO94-25585、WO96-33735、およびWO96-34096を参照されたい)。
または、免疫したリンパ球のような、抗体を産生する免疫細胞を癌遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体の調製に用いることもできる。
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技術を用いて組換えにより調製することもできる(例えば、MacMillan Publishers LTDにより英国で刊行された、Borrebaeck and Larrick, (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodiesを参照されたい)。例えば、抗体をコードするDNAを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入し、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製した組換え抗体も提供する。
さらに、本発明の抗体は、1つまたは複数の本発明のポリペプチドによってコードされるタンパク質に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Fab、F(ab')2、Fv、またはHおよびL鎖由来のFv断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Fv(scFv)であってもよい(Huston et al., (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83)。より具体的には、抗体断片は、抗体をパパインやペプシンなどの酵素で処理することにより作製することができる。または、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞で発現させることができる(例えばCo et al., (1994) J Immunol 152：2968-76.；Better and Horwitz, (1989) Methods Enzymol 178：476-96；Pluckthun and Skerra, (1989) Methods Enzymol. 178：497-515；Lamoyi, (1986) Methods Enzymol 121：652-63；Rousseaux et al., (1986) Methods Enzymol 121：663-9；Bird and Walker, (1991) Trends Biotechnol 9：132-7を参照されたい)。
抗体は、例えばポリエチレングリコール(PEG)などの様々な分子との結合によって修飾することができる。本発明は、そのような修飾抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することにより得られる。これらの修飾法は、当技術分野で慣例的である。
または、本発明の抗体は、非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域との間のキメラ抗体、または非ヒト抗体に由来する相補性決定領域(CDR)、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域(FR)および定常領域を含むヒト化抗体として得られてもよい。そのような抗体は、公知の技術によって調製することができる。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列の代わりに、齧歯類のCDRまたはCDR配列を用いることによって行われ得る(例えば、Verhoeyen et al., (1988) Science 239：1534-6を参照されたい)。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的にヒト可変ドメインの全長より短い領域が、非ヒト種由来の対応する配列によって置き換えられたキメラ抗体である。
ヒトフレームワーク領域および定常領域に加えてヒト可変領域をも含む完全ヒト抗体を用いることもできる。このような抗体は、当技術分野で公知のさまざまな技術を用いて作製することができる。例えば、インビトロ法は、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用を含む(例えば、Hoogenboom & Winter, (1992) J. Mol. Biol. 227：381-8)。同様に、ヒト免疫グロブリン座位を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することによってヒト抗体を作製することもできる。このアプローチは例えば、米国特許第6,150,584号、第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号に記載されている。
上記のようにして得られた抗体は、均一になるまで精製してもよい。例えば、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って、抗体の分離および精製を行うことができる。例えば、これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動を適切に選択しかつ組み合わせて使用することにより、抗体を分離および単離することができる(Antibodies：A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane,(1988) Cold Spring Harbor Laboratory)。プロテインAカラムおよびプロテインGカラムをアフィニティーカラムとして使用することができる。用いられる例示的なプロテインAカラムには、例えば、ハイパーD、POROS、およびセファロースF.F(Sepharose F.F)(Pharmacia)が含まれる。
例示的なクロマトグラフィーには、アフィニティークロマトグラフィーを除いて、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどが含まれる(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.,(1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press)。クロマトグラフィー手順は、HPLCおよびFPLCなどの液相クロマトグラフィーによって行うことができる。
本発明の抗体の抗原結合活性を測定するために、例えば、吸光度測定、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)、酵素免疫アッセイ法(EIA)、放射免疫アッセイ法(RIA)、および/または免疫蛍光検査法を用いてもよい。ELISAの場合、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のポリペプチドをプレートに添加し、次いで抗体産生細胞の培養上清または精製抗体といった所望の抗体を含む試料を添加する。続いて、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。続いて洗浄後に、p-ニトロフェニルリン酸などの酵素基質をプレートに添加し、吸光度を測定して試料の抗原結合活性を評価する。抗体の結合活性を評価するには、C末端断片またはN末端断片といったポリペプチドの断片を抗原として使用することもできる。本発明の抗体の活性評価には、BIAcore(Pharmacia)を用いてもよい。
本発明の抗体を本発明のポリペプチドが含まれると考えられる試料に対して曝露し、抗体とポリペプチドによって形成される免疫複合体を検出または測定することにより、上記の方法によって本発明のポリペプチドの検出または測定が可能になる。
本発明によるポリペプチドの検出または測定の方法は、ポリペプチドを特異的に検出または測定することができるため、ポリペプチドを使用する種々の実験において有用である。
癌細胞において起こる特定の分子変化を対象にした癌治療は、進行性乳癌治療のためのトラスツズマブ(ハーセプチン)、慢性骨髄性白血病のためのメシル酸イマチニブ(グリーベック)、非小細胞肺癌(NSCLC)のためのゲフィチニブ(イレッサ)、B細胞リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫のためのリツキシマブ(抗CD20 mAb)などの抗癌剤の臨床開発および規制認可により確認されている(Ciardiello F and Tortora G.(2001) Clin Cancer Res.；7(10)：2958-70. Review.；Slamon DJ, et al.,(2001) N Engl J Med.；344(11)：783-92.；Rehwald U, et al.,(2003) Blood.；101(2)：420-4.；Fang G,et al.,(2000). Blood, 96, 2246-53)。これらの薬物は、形質転換した細胞のみを標的とすることから、臨床的に有効であり、従来の抗癌剤より許容性が良好である。したがって、そのような薬物は、癌患者の生存および生活の質を改善するのみならず、分子標的癌治療の考え方が正当であることを証明している。さらに、標的化薬物は、標準的な化学療法と併用して用いた場合、その有効性を増強することができる(Gianni L. (2002). Oncology, 63 Suppl 1, 47-56.; Klejman A, et al., (2002) Oncogene, 21, 5868-76)。したがって、将来の癌治療はおそらく、血管新生および浸潤性のような腫瘍細胞の異なる特徴をねらった標的特異的薬剤と従来の薬剤の併用を含むであろう。
これらの調節方法は、エクスビボもしくはインビトロで行うこともでき(例えば、細胞を物質とともに培養することにより)、またはインビボで行うこともできる(例えば、物質を対象に投与することにより)。本方法は、タンパク質、もしくはタンパク質の組み合わせ、または核酸分子、もしくは核酸分子の組み合わせを、差次的に発現される遺伝子の異常な発現またはそれらの遺伝子産物の異常な活性を相殺する治療法として投与する段階を含む。
遺伝子および遺伝子産物の発現レベルまたは生物活性がそれぞれ(疾患または障害に罹患していない対象と比較して)上昇していることによって特徴付けられる疾患および障害は、過剰発現される一つまたは複数の遺伝子の活性に拮抗する(すなわち、それを低下させるまたは阻害する)治療薬によって治療され得る可能性がある。活性に拮抗する治療薬は、治療的または予防的に投与することができる。
したがって、本発明の文脈において利用し得る治療薬には、例えば以下のものが含まれる：(i) 過剰発現または低発現される1つまたは複数の遺伝子のポリペプチド、またはその類似体、誘導体、断片、もしくは相同体；(ii) 過剰発現される遺伝子または遺伝子産物に対する抗体；(iii) 過剰発現または低発現される1つまたは複数の遺伝子をコードする核酸；(iv) アンチセンス核酸、または「機能不全」である核酸(すなわち、1つまたは複数の過剰発現される遺伝子の核酸内への異種挿入による)；(v) 低分子干渉RNA(siRNA)；または(vi) 調節因子(すなわち、阻害剤、過剰発現または低発現されるポリペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させるアゴニストおよびアンタゴニスト)。機能不全アンチセンス分子は、相同組換えによってポリペプチドの内因性機能を「ノックアウト」するために利用される(例えば、Capecchi, (1989) Science 244: 1288-92を参照されたい)。
生物活性の低下(疾患または障害に罹患していない対象と比較して)によって特徴づけられる疾患および障害は、活性を上昇させる(すなわち、それに対するアゴニストである)治療薬によって治療することができる。活性を上方制御する治療薬は、治療的または予防的に投与することができる。利用し得る治療薬には、ポリペプチド(またはその類似体、誘導体、断片、もしくは相同体)、または生物学的利用能を高めるアゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
レベルの上昇または低下は、ペプチドおよび/またはRNAを定量することによって、患者の組織試料を得て(例えば、生検組織から)、これをRNAまたはペプチドレベル、発現されたペプチドの構造および/または活性(またはその発現が変化している遺伝子のmRNA)に関してインビトロでアッセイすることによって、容易に検出することができる。当技術分野において周知である方法には、免疫学的分析(例えば、ウェスタンブロット解析、免疫沈降後のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学等)、および/またはmRNAの発現を検出するハイブリダイゼーション分析(例えば、ノーザン分析、ドットブロット、インサイチューハイブリダイゼーション等)が含まれるがこれらに限定されない。
予防的投与は、疾患または障害の出現が妨げられるか、またはその進行が遅れるように、疾患の明瞭な臨床症状が現れる前に行う。本発明の治療方法は、細胞を、差次的に発現される遺伝子の遺伝子産物の活性のうち一つまたは複数を調節する物質と接触させる段階を含んでもよい。タンパク質活性を調節する物質の例には、核酸、タンパク質、このようなタンパク質の天然の同族リガンド、ペプチド、ペプチド模倣物およびその他の低分子が含まれるが、これらに限定されない。例えば、適した物質は、1つまたは複数の差次的に低発現される遺伝子の1つまたは複数のタンパク質活性を活性化し得る。
膀胱癌に対するワクチン接種
本発明はまた、表4に列挙されたBLC関連遺伝子(すなわち上方制御遺伝子)からなる群より選択される核酸によってコードされるポリペプチド、そのようなポリペプチドの免疫学的活性断片、またはそのようなポリペプチドもしくはその断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを対象に投与する段階を含む、対象における膀胱癌を治療または予防する方法に関する。ポリペプチドの投与により、対象において抗腫瘍免疫が誘導される。抗腫瘍免疫を誘導するため、表4に列挙されたBLC関連遺伝子からなる群より選択される核酸によってコードされるポリペプチド、そのようなポリペプチドの免疫学的活性断片、またはそのようなポリペプチドもしくはその断片をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する。ポリペプチドまたはその免疫学的活性断片は、BLCに対するワクチンとして有用である。場合によっては、タンパク質またはその断片は、T細胞受容体(TCR)に結合させた形態、またはマクロファージ、樹状細胞(DC)、もしくはB細胞などの抗原提示細胞(APC)により提示させた形態で投与してもよい。DCは抗原提示能が強いため、APCの中でもDCを用いることが最も好ましい。
本発明において、BLCに対するワクチンとは、動物に接種すると抗腫瘍免疫を誘導する能力を有する物質を指す。本発明によると、表4に列挙されたBLC関連遺伝子によってコードされるポリペプチドまたはその断片は、表4に列挙されたBLC関連遺伝子を発現するBLC細胞に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導する可能性があるHLA-A24またはHLA-A*0201拘束性エピトープであることが示唆された。このように、本発明はまた、ポリペプチドを用いて抗腫瘍免疫を誘導する方法も含む。一般に抗腫瘍免疫は、以下のような免疫応答を含む：
-腫瘍に対する細胞傷害性リンパ球の誘導、
-腫瘍を認識する抗体の誘導、および
-抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。
したがって、あるタンパク質が、動物への接種時にこれらの免疫応答のいずれか一つを誘導する場合、そのタンパク質は、抗腫瘍免疫誘導効果を有すると決定される。タンパク質による抗腫瘍免疫の誘導は、そのタンパク質に対する宿主における免疫系の応答をインビボまたはインビトロで観察することで検出できる。
例えば、細胞傷害性Tリンパ球の誘導を検出する方法は周知である。特に、生体内に入る外来物質は、抗原提示細胞(APC)の作用によってT細胞およびB細胞に提示される。APCによって提示された抗原に対して抗原特異的に応答するT細胞は、抗原による刺激によって細胞障害性T細胞(または細胞障害性Tリンパ球；CTL)に分化した後増殖する(これはT細胞の活性化と呼ばれる)。したがって、あるペプチドによるCTL誘導は、APCによるT細胞へのペプチドの提示およびCTLの誘導を検出することによって評価することができる。さらに、APCは、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、マクロファージ、好酸球、およびNK細胞を活性化する効果を有する。CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞も同様に抗腫瘍免疫において重要であることから、ペプチドの抗腫瘍免疫誘導作用は、これらの細胞の活性化効果を指標として用いて評価することができる。
APCとして樹状細胞(DC)を用いてCTLの誘導作用を評価する方法は、当技術分野で周知である。DCは、APCの中でも最も強力なCTL誘導作用を有する代表的なAPCである。この方法では、被験ポリペプチドをまずDCに接触させて、このDCをT細胞に接触させる。DCとの接触後に対象細胞に対して細胞傷害作用を有するT細胞が検出されることは、被験ポリペプチドが、細胞傷害性T細胞を誘導する活性を有することを示す。腫瘍に対するCTLの活性は、例えば51Cr標識腫瘍細胞の溶解を指標として用いて検出することができる。または3H-チミジンの取り込み活性、またはLDH(ラクトースデヒドロゲナーゼ)の放出を指標として用いることで、腫瘍細胞の損傷度を評価する方法も周知である。
DCとは別に、末梢血単核球(PBMC)も同様にAPCとして用いてもよい。CTLの誘導は、GM-CSFおよびIL-4の存在下でPBMCを培養することによって増強されることが報告されている。同様に、CTLは、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)およびIL-7の存在下でPBMCを培養することによって誘導されることが示されている。
これらの方法によってCTL誘導活性を有することが確認された被験ポリペプチドは、DC活性化効果およびその後のCTL誘導活性を有するポリペプチドであるとみなされる。したがって、腫瘍細胞に対してCTLを誘導するポリペプチドは、腫瘍に対するワクチンとして有用である。さらに、ポリペプチドに接触させることによって腫瘍に対するCTLの誘導能を獲得したAPCは、腫瘍に対するワクチンとして有用である。さらに、APCによるポリペプチド抗原の提示により細胞傷害性を獲得したCTLも、腫瘍に対するワクチンとして用いることができる。APCおよびCTLによる抗腫瘍免疫を用いるそのような腫瘍の治療法は、細胞免疫療法と呼ばれる。
一般的に、細胞免疫療法のためにポリペプチドを用いる場合、CTL誘導効率は、異なる構造を有する複数のポリペプチドを組み合わせて、それらをDCに接触させることによって増加することが知られている。したがって、DCをタンパク質断片によって刺激する場合、複数のタイプの断片の混合物を用いることが有利である。
または、ポリペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導は、腫瘍に対する抗体産生の誘導を観察することで確認できる。例えば、ポリペプチドに対する抗体が、そのポリペプチドで免疫した実験動物において誘導される場合、かつ腫瘍細胞の増殖がそれらの抗体によって抑制される場合、ポリペプチドは、抗腫瘍免疫の誘導能を有するとみなすことができる。
抗腫瘍免疫は本発明のワクチンを投与することによって誘導され、抗腫瘍免疫の誘導によって、BLCを治療および予防することができる。癌の治療または癌の発症の予防には、癌性細胞の増殖の阻害、癌の退縮、および癌の発生抑制のような段階のいずれかが含まれる。癌を有する個体の死亡率および疾病率の低下、血液中の腫瘍マーカーのレベルの低下、癌に伴う検出可能な症状の軽減等も同様に、癌の治療または予防に含まれる。このような治療および予防効果は、好ましくは統計的に有意である。例えば、細胞増殖疾患に対するワクチンの治療または予防効果を、ワクチン投与を行わない対照と比較する観察において、5％またはそれ未満は有意水準である。例えば、スチューデントt-検定、マン-ホイットニーのU検定、またはANOVAを統計解析に用いてもよい。
免疫学的活性を有する上記のタンパク質またはそのタンパク質をコードするベクターをアジュバントと併用してもよい。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と同時に(または連続的に)投与した場合、タンパク質に対する免疫応答を増強する化合物を意味する。例示的アジュバントには、コレラ毒素、サルモネラ毒素、ミョウバン等が含まれるがこれらに限定されない。さらに本発明のワクチンは、薬学的に許容される担体を適切に組み合わせることができる。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩液、リン酸緩衝液、培養液等が含まれるが、それらに限定されない。さらに、ワクチンは必要に応じて、安定化剤、懸濁剤、保存剤、界面活性剤等を含んでもよい。ワクチンは、全身または局所投与され得る。ワクチン投与は、1回投与によって行ってもよく、または複数回投与によって追加刺激してもよい。
本発明のワクチンとしてAPCまたはCTLを用いる場合、腫瘍を例えばエクスビボ法によって治療または予防することができる。より具体的には、治療または予防を受ける対象のPBMCを採取し、細胞をエクスビボでポリペプチドに接触させ、APCまたはCTLの誘導後、細胞を対象に投与してもよい。APCはまた、ポリペプチドをコードするベクターをエクスビボでPBMCに導入することによって誘導することができる。インビトロで誘導されたAPCまたはCTLは、投与前にクローニングすることができる。標的細胞を破壊する高い活性を有する細胞をクローン化して増やすことで、細胞免疫療法を、より効果的に実施することができる。さらに、このようにして単離されたAPCおよびCTLを、細胞が由来する個体に対してのみならず、他の個体由来の類似のタイプの腫瘍に対する細胞免疫療法のために用いてもよい。
さらに、本発明のポリペプチドの薬学的有効量を含む、癌のような細胞増殖疾患を治療または予防するための薬学的組成物が提供される。薬学的組成物は、抗腫瘍免疫を惹起するために用いてもよい。
C2093、B5860N、またはC6055の正常発現は精巣に限定されている。したがって、この遺伝子の抑制は、他の器官に悪影響を及ぼさないと考えられる。そのため、C2093、B5860N、またはC6055ポリペプチドは、細胞増殖性疾患、特に膀胱癌の治療に好ましい。さらに、癌細胞で特異的に発現されるタンパク質のペプチド断片は癌に対する免疫応答を誘導することが判明しているため、C2093、B5860N、またはC6055のペプチド断片を、膀胱癌などの細胞増殖性疾患を治療または予防するための薬学的組成物中に用いることもできる。本発明においては、ポリペプチドまたはその断片は抗腫瘍免疫を誘導するのに十分な用量で投与され、これは0.1 mg〜10 mg、好ましくは0.3 mg〜5 mg、より好ましくは0.8 mg〜1.5 mgの範囲内にある。投与は繰り返し行う。抗腫瘍免疫を誘導するには、例えば、1 mgのペプチドまたはその断片を、2週間ごとに4回投与してもよい。
さらに、C2093、B5860N、もしくはC6055、またはそれらの断片をコードするポリヌクレオチドを、抗腫瘍免疫を生じるために使用することができる。そのようなポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込み、治療しようとする対象においてC2093、B5860N、もしくはC6055、またはそれらの断片を発現させ得る。したがって、本発明は、抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、C2093、B5860N、もしくはC6055、またはそれらの断片をコードするポリヌクレオチドを、膀胱癌などの細胞増殖性疾患に罹患しているか、またはそのような疾患を発症するリスクを有する対象に投与する方法を包含する。
BLCまたは悪性BLCを阻害するための薬学的組成物
本発明は、本発明のスクリーニング法によって選択された任意の化合物を含む、膀胱癌を治療または予防するための組成物を提供する。
本発明のスクリーニング法によって単離された化合物を、細胞増殖性疾患(例えば、膀胱癌)を治療するために、ヒトまたは他の哺乳動物、例えば以下に限定されないがマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、チンパンジーに薬剤として投与する場合には、単離された化合物を直接投与してもよく、または公知の薬剤調製法を用いて剤形に製剤化してもよい。例えば、必要に応じて、薬物は、糖衣錠、カプセル剤、エリキシル剤、およびマイクロカプセルとして経口摂取されるか、または水もしくは任意の他の薬学的に許容される液体との滅菌溶液もしくは懸濁液の注射剤形で非経口摂取され得る。例えば、化合物は、薬学的に許容される担体または媒体、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、着香剤、賦形剤、溶剤、保存剤、結合剤などと共に、一般的に許容される投薬実施に必要な単位投与剤形で混合することができる。これらの調製物に含まれる有効成分の量によって、指示範囲内の適した用量を得ることができる。
錠剤およびカプセル剤に混合することができる添加剤の例には、結合剤、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、およびアラビアゴム；賦形剤、例えば結晶セルロース；膨張剤、例えばコーンスターチ、ゼラチン、およびアルギン酸；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；甘味剤、例えばショ糖、乳糖、またはサッカリン；ならびに着香剤、例えばペパーミント、アカモノ(Gaultheria adenothrix)油、およびチェリーが含まれるがこれらに限定されない。単位投与剤形がカプセル剤である場合には、油などの液体担体を上記の成分にさらに含めることもできる。注射用滅菌組成物は、注射用蒸留水などの溶剤を用いて、通常の投薬実施に従って製剤化することができる。
生理食塩水、グルコース、ならびにD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、および塩化ナトリウムなどの補助剤を含む他の等張液を、注射用水溶液として用いることができる。これらは、アルコール、具体的にはエタノール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールなどの多価アルコール、Polysorbate 80(商標)およびHCO-50などの非イオン性界面活性剤といった適切な可溶化剤と共に用いることができる。ゴマ油または大豆油は、可溶化剤としての安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと共に使用することができ、かつ緩衝液、例えばリン酸緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液；鎮痛剤、例えば塩酸プロカイン；安定化剤、例えばベンジルアルコール、フェノール；ならびに抗酸化剤と共に製剤化することのできる油性液体の例である。調製された注射剤は、適したアンプルに充填してもよい。
当業者に周知の方法を用いて、本発明の薬学的化合物を患者に、例えば動脈内、静脈内、または経皮注射として投与することができ、また鼻腔内、筋肉内、または経口投与として投与することもできる。投与の用量および方法は、患者の体重および年齢ならびに投与法に応じて変化するが、当業者はそれらを日常的に選択することができる。化合物がDNAによってコードされ得る場合には、DNAを遺伝子治療用のベクターに挿入し、治療を行うためにベクターを投与することができる。投与の用量および方法は、患者の体重、年齢、および症状に応じて変化するが、これらのパラメータの選択および最適化は、当業者の権限の範囲内である。
本発明の文脈において、適切な薬学的製剤には、経口、直腸内、鼻腔内、局所(口腔内および舌下を含む)、膣内、もしくは非経口(筋肉内、皮下、および静脈内を含む)投与に適した製剤、または吸入もしくは吹入による投与に適した製剤が含まれる。好ましくは、投与は静脈内である。製剤は任意で、個別の用量単位に包装される。
経口投与に適した薬学的製剤には、それぞれが活性成分の規定量を含むカプセル剤、カシェ剤、または錠剤が含まれる。適切な製剤にはまた、粉剤、顆粒剤、溶液、懸濁液、および乳液が含まれる。活性成分は、任意でボーラス、舐剤、またはペーストとして投与される。経口投与用の錠剤およびカプセル剤は、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、および/または湿潤剤のような通常の賦形剤を含んでもよい。錠剤は、任意で1つもしくは複数の製剤成分を用いて、圧縮または成形により作製することができる。圧縮錠は、粉剤または顆粒剤のような流動状の活性成分を、任意で結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、潤滑剤、表面活性剤、および/または分散剤と混合して、適した機械において圧縮することによって調製してもよい。成形錠剤は、不活性液体希釈剤によって湿らせた粉末化合物の混合物を適した機械において成形することによって作製してもよい。錠剤は、当技術分野で周知の方法にしたがってコーティングすることができる。経口液体調製物は、例えば、水性もしくは油性懸濁液、溶液、乳液、シロップ剤、もしくはエリキシル剤の形であってもよく、または使用前に水もしくは他の適した溶剤で構成するための乾燥製品として提供してもよい。そのような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性溶剤(食用油が含まれてもよい)、および/または保存剤のような通常の添加剤を含んでもよい。錠剤は任意で、活性成分の徐放または制御放出を提供するように調製してもよい。錠剤の包装は、月に1回服用される1個の錠剤を含む場合がある。
非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、制菌剤および対象とするレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を任意で含む水性および非水性滅菌注射剤、ならびに懸濁剤および/または濃化剤を含む水性および非水性滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量または複数回用量で容器、例えば密封アンプルおよびバイアルに入れてもよく、滅菌液体担体、例えば生理食塩液、注射用水を使用直前に加えるだけでよい凍結乾燥状態で保存してもよい。または、製剤を持続注入用とすることができる。即時調合注射溶液および懸濁液は、既に説明した種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
直腸投与用の適切な製剤には、カカオバターまたはポリエチレングリコールのような標準的な担体を含む坐剤が含まれる。口内への、例えば口腔内または舌下への局所投与用の適切な製剤には、ショ糖およびアカシアまたはトラガカントのような着香基剤に活性成分を含むトローチ剤、ならびにゼラチンとグリセリンまたはショ糖とアカシアのような基剤に活性成分を含む香錠が含まれる。鼻腔内投与の場合、本発明の化合物を液体スプレー、もしくは分散性の粉末として、または点鼻剤の形態で用いてもよい。点鼻剤は、一つまたは複数の分散剤、溶解剤、および/または懸濁剤も含む水性または非水性基剤によって製剤化してもよい。
吸入による投与の場合、吸入器、ネブライザー、加圧パックまたは他のエアロゾル噴霧を送達するための都合のよい手段によって化合物を都合よく送達することができる。加圧容器は、適切な噴霧剤(ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、炭酸ガス、または他の適切なガス)を含む場合がある。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、一定量を送達するバルブを提供することで決定することができる。
または、吸入もしくは吹入による投与の場合、化合物は、乾燥粉末組成物、例えば化合物と、乳糖またはデンプンのような適した粉末基剤との粉末混合物の形状をとってもよい。粉末組成物は、単位投与剤形、例えば、粉末が吸入器または吹入器を利用して投与され得るカプセル剤、カートリッジ、ゼラチンまたはブリスターパックの形としてもよい。
他の製剤には、治療剤を放出する埋め込み可能装置および接着パッチが含まれる。
望ましい場合、活性成分が徐放性となるように適合した上記の製剤を使用することができる。薬学的組成物はまた、抗菌剤、免疫抑制剤、および/または保存剤のような他の活性成分を含んでもよい。
上記で特に言及した成分の他に、本発明の製剤には、当該製剤のタイプに関して当技術分野において通常の他の物質が含まれていてもよいと理解すべきである。例えば経口投与に適した製剤は着香料を含んでいてもよい。
例えば、症状によって多少の差はあるものの、本発明のポリペプチドと結合してその活性を制御する化合物の用量は、標準的な成人(体重60 kg)に経口投与する場合、一般に約0.1 mg〜約100 mg/日、好ましくは約1.0 mg〜約50 mg/日、およびより好ましくは約1.0 mg〜約20 mg/日である。
標準的な成人(体重60 kg)に注射剤形で非経口投与する場合には、患者、標的器官、症状、および投与方法によって多少の差はあるものの、約0.01 mg〜約30 mg/日、好ましくは約0.1〜約20 mg/日、より好ましくは約0.1〜約10 mg/日の用量を静脈内注射することが都合がよい。同様に他の動物の場合においても、体重60 kgに換算した量を投与することが可能である。
好ましい単位投与製剤は、下記に引用するように、活性成分またはその適当な分画の有効量を含む。
上記の条件のそれぞれに関して、組成物、例えばポリペプチドおよび有機化合物は、約0.1〜約250 mg/kg/日の用量範囲で経口または注射によって投与され得る。成人の用量範囲は一般に、約5 mg〜約17.5 g/日であり、好ましくは約5 mg〜約10 g/日であり、最も好ましくは約100 mg〜約3 g/日である。個別の単位で提供される錠剤または他の単位投与剤型は、同一単位量を複数回投与した量で有効性を示すような単位量、例えば約5 mg〜約500 mg、より典型的には約100 mg〜約500 mgを含む量を都合よく含んでもよい。
使用される用量は、対象の年齢および性別、治療する正確な疾患、およびその重症度を含む、いくつかの因子に依存する。投与経路も、条件および重症度によって変動する場合がある。いずれにしても、適切で最適な投与量は、当業者により、上述した要因を考慮した上で慣行的に計算され得る。
さらに、本発明は、C2093、B5860N、またはC6055遺伝子の発現を阻害する有効成分を含む、膀胱癌を治療または予防するための薬学的組成物を提供する。このような有効成分には、C2093、B5860N、もしくはC6055遺伝子に対するアンチセンスポリヌクレオチド、siRNA、もしくはリボザイム、またはアンチセンスポリヌクレオチド、siRNA、もしくはリボザイムの発現ベクターなどの誘導体が含まれる。
siRNAのヌクレオチド配列もまた、上記と同じ様式で設計することができる。さらに、C2093、B5860N、またはC6055 mRNAの様々な部分のオリゴヌクレオチドおよびそれらの様々な部分に相補的なオリゴヌクレオチドを、上記と同じ様式で選択することもできる。哺乳動物細胞において発現を阻害するC2093、B5860N、またはC6055 siRNAオリゴヌクレオチドの例には、それぞれSEQ ID NO:21、25、および144を含む標的配列が含まれる。SEQ ID NO:25の標的配列は、2つのB5860N転写産物、B5860NV1およびB5860NV2の間で共有されている。そのため、センス鎖としてSEQ ID NO:25を含むsiRNAは、B5860NV1およびB5860NV2転写産物の両方の発現を阻害し得る。SEQ ID NO:144の標的配列は、4つのC6055転写産物、MGC34032、Genbank登録番号AK128063、C6055V1、および6055V2の間で共有されている。そのため、センス鎖としてSEQ ID NO:144を含むsiRNAは、MGC34032、Genbank登録番号AK128063、C6055V1、および6055V2転写産物のすべての発現を阻害し得る。本発明おいて、核酸配列がRNAまたはその誘導体である場合には、ヌクレオチド配列において塩基「t」は「u」と置換される必要がある。
siRNAは、mRNA転写産物に結合し得る形態で細胞内に直接導入される。または、C2093、B5860N、またはC6055に対するsiRNAを使用するのと同様の様式で、siRNAをコードするDNAをベクター内に含む。さらに、ヘアピンループ構造を形成させる目的で、任意のヌクレオチド配列からなるループ配列を、センス配列とアンチセンス配列との間に配置することができる。したがって、本発明はまた、一般式5'-[A]-[B]-[A']-3'を有するsiRNAを提供する。上記のように、本式中、
[A]は、C2093、B5860N、またはC6055のmRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、
[B]は、約3〜約23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり、かつ
[A']は、[A]の相補配列からなるリボヌクレオチド配列である。
本発明のsiRNAでは、阻害活性を増強する目的で、ヌクレオチド「u」を[A']の3'末端に付加することもできる。付加する「u」の数は、少なくとも約2個、一般的には約2〜約10個、好ましくは約2〜約5個である。さらに、23ヌクレオチドからなるループ配列によっても、活性のあるsiRNAが提供される(Jacque, J.-M., et al., (2002) Nature 418: 435-438)。例えば、本発明のヘアピン構造を有する好ましいsiRNAは、以下に示すものである。以下の構造おいて、ループ配列は、CCC、UUCG、CCACC、CCACACC、およびUUCAAGAGAからなる群より選択され得る。好ましいループ配列は、UUCAAGAGA(DNAでは「ttcaagaga」)である。本発明の文脈での使用に適した例示的なヘアピンsiRNAには、以下のものが含まれる：
C2093-siRNAに関して(GTGAAGAAGTGCGACCGAA/SEQ ID NO:21の標的配列に関して)
5'-gugaagaagugcgaccgaa-[B]-uucggucgcacuucuucac-3'(SEQ ID NO:24)、
B5860N-siRNAに関して(CCAAAGTTCCGTAGTCTAA/SEQ ID NO:25の標的配列に関して)
5'-ccaaaguuccguagucuaa-[B]-uuagacuacggaacuuugg-3'(SEQ ID NO:28)および
C6055-siRNAに関して(GTTGCAGTTACAGATGAAG/SEQ ID NO:144の標的配列に関して)
5'-gttgcagttacagatgaag-[B]-cttcatctgtaactgcaac-3'(SEQ ID NO:147)。
これらの有効成分は、誘導体に対して不活性である適切な基剤と混合することにより、リニメント剤または湿布剤などの外用剤にすることができる。同様に、必要に応じて、賦形剤、等張剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤、鎮痛剤などを添加することにより、これらを、例えば錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤、および凍結乾燥剤に製剤化することもできる。これらは従来法に従って調製可能である。
有効成分は、罹患部位に直接適用することにより、またはそれが罹患部位に到達するように血管内に注入することにより、患者に投与される。持続性および膜透過性を高めるために、封入剤を用いることもできる。封入剤の例には、リポソーム、ポリ-L-リジン、脂質、コレステロール、リポフェクチン、またはこれらの誘導体が含まれる。
本発明のこのような組成物の投与量は、患者の状態に応じて適切に調整することができ、所望の量を用いることができる。例えば、0.1〜100 mg/kg、好ましくは0.1〜50 mg/kgの用量範囲を投与することができる。本発明の別の態様は、C2093、B5860N、もしくはC6055遺伝子によってコードされるポリペプチドに対する抗体、またはそのようなポリペプチドに結合する抗体の断片を含む、膀胱癌を治療または予防するための組成物である。
症状によって多少の差はあるものの、膀胱癌を治療または予防するための抗体またはその断片の用量は、標準的な成人(体重60 kg)に経口投与する場合、約0.1 mg〜約100 mg/日、好ましくは約1.0 mg〜約50 mg/日、およびより好ましくは約1.0 mg〜約20 mg/日である。
標準的な成人(体重60 kg)に注射剤形で非経口投与する場合には、患者の状態、疾患の症状、および投与方法によって多少の差はあるものの、約0.01 mg〜約30 mg/日、好ましくは約0.1〜約20 mg/日、およびより好ましくは約0.1〜約10 mg/日の用量を静脈内注射することが都合がよい。同様に他の動物の場合においても、体重60 kgに換算した量を投与することが可能である。
本発明の局面を以下の実施例に記載するが、これらは、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を制限するものではない。以下の実施例は、BLC細胞において差次的に発現される遺伝子の同定および特徴づけを説明する。特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載する方法および材料と類似した、またはそれらと同等である方法および材料を、本発明の実施または試行において使用することも可能であるが、適切な方法および材料は以下に記載するものである。本明細書において引用した特許、特許出願、および出版物はいずれも、参照により組み入れられる。
実施例
材料および方法
患者、細胞株、組織試料、およびネオアジュバント化学療法
ヒト膀胱癌細胞株HT1197、UMUC3、J82、HT1376、SW780、およびRT4はATCCから入手した。全ての細胞は適切な培地；すなわち、HT1197、UMUC3、J82、およびHT1376に関しては、0.1 mM必須アミノ酸(Roche)、1 mMピルビン酸ナトリウム(Roche)、0.01 mg/mlインスリン(Sigma)を含むEMEM(Sigma、ミズーリ州、セントルイス)；HBL100、COS7に関してはダルベッコー修飾イーグル培地(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)；RT-4に関してはマッコイ5a(sigma)；SW 780に関してはL-15中で培養した。各培地には、10%ウシ胎児血清(Cansera)および1%抗菌/抗真菌溶液(Sigma)を添加した。SW 780細胞は、CO2を含まない加湿空気の雰囲気中において37℃で維持した。他の細胞株は、5% CO2を含む加湿空気の雰囲気中において37℃で維持した。
外科切除された膀胱癌からの組織試料および対応する臨床情報は、各患者が書面によるインフォームドコンセントを提出した後に取得した。膀胱の移行上皮癌であると組織学的に確認された全部で33例の癌試料(女性9名、男性24名；年齢不詳である1名(BC01025)を除き、年齢中央値66.5歳、53〜77歳の範囲)(表1)を、本研究用に選択した。UICC TNM分類に従って、臨床病期を判断した。前もって放射線療法を受けることなく根治的膀胱切除術を受けたと予想される、結節転移のないT2aN0M0〜T3bN0M0の患者のみを登録した。参加者は、ECOG病期(PS)が≦2であると判定され、腎機能、肝機能、および血液機能に重篤な異常がないことが必要である。
（表１）試験した患者
Figure 0005109131
ネオアジュバント化学療法を行う前の生検時に、各患者から3〜5片の癌組織を採取した。これらの試料を直ちにTissueTek OCT媒体(サクラ、日本、東京)中に包埋し、凍結して-80℃で保存した。クライオスタット(サクラ、日本、東京)を用いて凍結組織を8μm切片になるようにスライスし、次いで組織学的検査のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。パルス紫外線ナロービーム焦点レーザーを用いるEZ-カットシステム(SL Microtest GmbH、ドイツ)を製造業者の手順に従って使用して、本発明者らの実験用に膀胱癌細胞を選択的に濃縮した。胸部X線、腹部および骨盤のコンピュータ断層撮影(CT)および磁気共鳴画像法(MRI)により全患者を検査し、リンパ節転移も遠隔転移もないことを確認した。
RNAの抽出およびT7に基づくRNA増幅
以前に記載されている通りに、マイクロダイセクションした癌細胞の各集団から全RNAを抽出した(Kitahara O, et al., (2001) Cancer Res; 61:3544-9)。RNAの質を保証するため、各症例の残存組織から抽出した全RNAを変性アガロースゲルで電気泳動し、リボソームRNAバンドの存在により質を確認した。全RNAの抽出およびT7に基づくRNA増幅は、RNeasy Microキット(QIAGEN、米国、カリフォルニア州、バレンシア)を使用したこと以外は以前に記載されている通りに実施した(Okabe H, et al., (2001) Cancer Res; 61:2129-37)。2ラウンドのRNA増幅後に、各試料に関して30〜100μgの増幅RNA(aRNA)が得られた。対照として、正常ヒト膀胱ポリ(A)+ RNA(BD Bioscience、カリフォルニア州、パロアルト)を同様に増幅した。鋳型として全RNAを使用するかまたはaRNAを使用するかにかかわらず、マイクロアレイによるデータがRT-PCRによる結果と一致することを、本発明者らは半定量的RT-PCR実験により先に確認しているため(Kitahara O, et al., (2001) Cancer Res; 61:3544-9)、この方法によって増幅されたRNAは、元のRNA供給源における比率を正確に反映している。
cDNAマイクロアレイ
スライドグラス上にスポットするcDNAを得るため、以前に記載されている通りに各遺伝子についてRT-PCRを行った(Kitahara O, et al., (2001) Cancer Res; 61:3544-9)。高密度Microarray Spotter Lucidea(GE Healthcare、Amersham Biosciences、英国 バッキンガムシャー)を用いて、PCR産物を7型スライドガラス(GE Healthcare、Amersham Biosciences)上にスポットした；遺伝子9,216個を1枚のスライド上に二つ組でスポットした。異なる3組のスライド(全体で遺伝子スポット27,648個)を調製して、そのそれぞれに同じハウスキーピング遺伝子52個および陰性対照遺伝子2個を同様にスポットした。cDNAプローブは、以前に記載されている方法でaRNAから調製した(Okabe H, et al., (2001) Cancer Res; 61:2129-37)。ハイブリダイゼーション実験のため、各癌組織および対照に由来する増幅RNA(aRNA)9.0μgを、それぞれCy5-dCTPおよびCy3-dCTP(GE Healthcare、Amersham Biosciences)の存在下で逆転写した。ハイブリダイゼーション、洗浄、およびシグナルの検出は、以前に記載されている通りに実施した(Okabe H, et al., (2001) Cancer Res; 61:2129-37)。
シグナルの定量
スポット27,648個からCy3およびCy5のシグナル強度を定量し、ArrayVisionソフトウェア(Imaging Research, Inc.、カナダ、オンタリオ州、セントキャサリンズ)を用いて、バックグラウンドを置換してシグナルを解析した。次に、各標的スポットのCy5(腫瘍)およびCy3(対照)の蛍光強度を、ハウスキーピング遺伝子52個の平均Cy5/Cy3比が1となるように調整した。低いシグナル強度に由来するデータは信頼性が低いことから、以前に記載されている通りに各スライドにおいてカットオフ値を決定し(Ono K, et al., (2000) Cancer Res; 60:5007-11)、Cy3およびCy5色素がいずれもカットオフより低いシグナル強度を生じる場合には、さらなる解析から遺伝子を除外した(Saito-Hisaminato A, et al., (2002) DNA Res; 9:35-45)。他の遺伝子に関しては、Cy3またはCy5シグナル強度の一方がカットオフ値よりも低い場合、Cy5/Cy3比が極端に高いかまたは低い測定値を提供して、偽予測遺伝子が選択されることになるため、各試料の生データを用いて相対的発現比としてCy5/Cy3を計算する以前の方法を修正した。そのようなバイアスを低減するため、Cy3またはCy5シグナル強度の一方がカットオフ値よりも低い場合には、各カットオフ値の半分に加えて各試料のCy5およびCy3シグナル強度を用いて、Cy5/Cy3比を計算した。
膀胱癌において上方制御または下方制御される遺伝子の同定
以下の基準に従って、膀胱癌に共通して上方制御または下方制御される遺伝子を同定および解析した。まず、50%を超える症例についてその相対的発現比を計算することができ、かつ50%を超える症例においてその発現が上方制御または下方制御される遺伝子を選択した。さらに、35〜50%の症例について相対的発現比を計算することができる場合には、80%の症例で上方制御または下方制御される遺伝子も評価した。各遺伝子の相対的発現比(Cy5/Cy3強度比)を、以下のような4つのカテゴリーの1つに分類した：(1) 上方制御される(発現比は5.0より大きい)；(2) 下方制御される(発現比は0.2未満)；(3) 発現に変化なし(発現比は0.2〜5.0)；および(4) 発現されない(またはわずかに発現されるが、検出のカットオフレベル未満である)。これらのカテゴリーを用いて、発現比の変化が試料間で共通していると同時に、特定のサブグループに特異的である一組の遺伝子を検出した。膀胱癌細胞において一般に上方制御または下方制御される候補遺伝子を検出するため、遺伝子27,648個の全体的な発現パターンをスクリーニングして、5.0よりも大きいかまたは0.2より小さい発現比を有する遺伝子を選択した。腫瘍細胞で上方制御されると考えられる全部で394個の遺伝子のうち、情報のある膀胱癌症例の50%を超える症例において発現比が5.0を超え、正常ヒト組織の発現プロファイルを介して心臓、肺、肝臓、および腎臓を含む正常器官において低い発現を示すという理由で、施設内同定番号C2093、B5860N、およびC6055を有する遺伝子に注目した。
半定量的RT-PCR
上方制御された遺伝子44個を選択して、半定量的RT-PCR実験を適用することによりそれらの発現レベルを調べた。各試料からのaRNAのアリコート3μgを、ランダムプライマー(Roche)およびSuperscript II(Invitrogen)を用いて逆転写し、一本鎖cDNAを得た。各cDNA混合物を希釈し、次いで標的DNAまたはGAPDH特異的反応用に調製した同じプライマーセットを用いてPCR増幅した。図1aのRT-PCRに使用したプライマー配列を表2に記載する。図1bおよび1cのRT-PCRに使用したPCRプライマー配列は以下の通りである：
C2093用の
5'-TGCTGGTTCAGAACGAACTATG-3' (SEQ ID NO:9)および
5'-TCCTCGTGGCTAATGAAAGC-3' (SEQ ID NO:10)、
B5860N V1およびV2の共通配列用の
5'-GCTACAAGTAAAGAGGGGATGG-3' (SEQ ID NO:11)および
5'-GGACAGAAAGGTAAGTCAGTGGG-3' (SEQ ID NO:12)。
GAPDHの発現を内部対照とした。PCR反応は、産物強度が増幅の直線相の範囲内に入るように、サイクル数を最適化した(表2)。
（表２）図1aのRT-PCR用のプライマー配列
Figure 0005109131
Figure 0005109131
Figure 0005109131
ノーザンブロット解析
ノーザンブロットを、それぞれRT-PCRにより調製したA0576N、C2093、C5509、B5860N、F1653、B9838、およびC6055の[α32P]-dCTP標識増幅産物とハイブリダイズさせた(表3)。C6055の特異的プローブは、以下のようなプライマーセットを用いてPCRにより調製した：
C6055のマイクロアレイプローブ用の
5'-CCCCAGTTGAGAGTTTGCTC-3' (SEQ ID NO:137)および
5'-CTGTCATGTGCTCATGTGAGTTT-3' (SEQ ID NO:53)、
C6055の4つの転写産物間の共通領域用の
5'-TGACATCGGGATTCAGACTAA-3' (SEQ ID NO:138)および
5'-AAAGATGCTGGTCCTTGTGC-3' (SEQ ID NO:139)。
製造業者の説明書に従ってTRIzol試薬(Invitrogen)を使用し、すべての膀胱癌細胞株および凍結外科標本から全RNAを抽出した。DNase I(ニッポンジーン、日本、大阪)で処理した後、製造業者の説明書に従ってMicro-FastTrack(Invitrogen)を用いてmRNAを単離した。各mRNAとともに正常成人ヒト心臓、肺、肝臓、腎臓、脳、膵臓、精巣、および膀胱から単離されたポリA(+) RNA(Clontech、カリフォルニア州、パロアルト)のアリコート1μgを1%変性アガロースゲルで分離し、ナイロン膜に転写した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄は、供給業者の推奨に従って行った。ブロットのオートラジオグラフィーは、増感スクリーンを用いて-80℃で14日間行った。
（表３）RT-PCRによるノーザンプローブ作製用のプライマー配列
Figure 0005109131
5'RACEおよび3'RACE
B5860NおよびC6055の5'末端および3'末端の配列を、SMART(商標) RACE cDNA増幅キット(Clontech)を用いて、cDNA末端の5'迅速増幅(5'RACE)およびcDNA末端の3'迅速増幅(3'RACE)を行うことにより決定した。増幅用に膀胱癌細胞株、SW780細胞からcDNA鋳型を合成し、5'RACE用のB5860N特異的リバースプライマー
5'-CATTTTCTGATCCCCACCTCCCTTTG-3' (SEQ ID NO:14)
、C6055特異的リバースプライマー
C6055_GSP1; 5'-GATCCAAATGCTAGGGATCCTGTGTG-3' (SEQ ID NO:140)および
C6055_NGSP1; 5'-CCTGTGTGATATCGTATGGCTCGTCCA-3' (SEQ ID NO:141)、
ならびに3'RACE用のB5860N特異的フォワードプライマー
5'-AGAGGGGATGGGGAAGGTGTTGC-3' (SEQ ID NO:15)、
ならびにキット中に供給されるAP1プライマーを用いてPCRを行った。
発現ベクターの構築
C2093、B5860N、およびC6055 cDNAの全コード配列を、KOD-Plus DNAポリメラーゼ(東洋紡、日本、大阪)を使用して以下のプライマーでPCRすることにより増幅した：
C2093-フォワード、
5'-ATAAGAATGCGGCCGCAATGGAATCTAATTTTAATCAAGAGG-3' (SEQ ID NO:16)(下線はNotI部位を示す)および
C2093-リバース、
5'-ATAAGAATGCGGCCGCTTTGGCTGTTTTTGTTCGA-3' (SEQ ID NO:17)(下線はNotI部位を示す)、
B5860NV1-フォワード、
5'-ATAAGAATGCGGCCGCTATGGAGAGTCAGGGTGTGC-3’(SEQ ID NO:18)(下線はNotI部位を示す)および
B5860NV1-リバース、
5'-CCGCTCGAGTCTTAGACTACGGAACTTTGGT-3' (SEQ ID NO:19)(下線はXhoI部位を示す)、
B5860NV2-フォワード、
5'-GGAATTCATGGAGAGTCAGGGTGTG-3' (SEQ ID NO:20)(下線はEcoRI部位を示す)および
B5860NV2-リバース、
5'-CCGCTCGAGTCTTAGACTACGGAACTTTGGT-3' (SEQ ID NO:19)(下線はXhoI部位を示す)、
C6055-フォワード、
5'-AGAATTCATGATCTTCCTACTGTGTATTATTGGC-3' (SEQ ID NO:142)(下線はEcoRI部位を示す)および
C6055-リバース、
5'-TATCTCGAGCTGCTTCCTAGTTTGTGGATTTTC-3' (SEQ ID NO:143)(下線はXhoI部位を示す)。PCR産物を、pCAGGSnHA発現ベクターのそれぞれEcoRIおよびXhoI、ならびにNotI部位に挿入した。これらの構築物は、DNAの配列決定により確認した。
ウェスタンブロッティング解析
FuGENE 6トランスフェクション試薬(Roche)を製造業者の説明書に従って使用して、COS7細胞にそれぞれ1μgのpCAGGS-C2093-HA、pCAGGS-B5860NV1-HA、pCAGGS-B5860NV2-HA、またはpCAGGS-C6055-HAを一過的にトランスフェクトした。細胞溶解液を10% SDSポリアクリルアミドゲル(pCAGGS-C2093-HA、pCAGGS-B5860NV1-HA、pCAGGS-B5860NV2-HAトランスフェクト細胞に関して)または7.5% SDSポリアクリルアミドゲル(pCAGGS-C6055-HAトランスフェクト細胞に関して)で分離し、ニトロセルロース膜に転写し、次いで1/1000希釈の一次抗体としてのマウス抗HA抗体(Roche)と共にインキュベートした。二次抗体としてのヒツジ抗マウスIgG-HRP(Amersham Biosciences)と共にインキュベートした後、ECLキット(Amersham Biosciences)を用いてシグナルを可視化した。
膀胱癌細胞における外因性C2093、B5860N、およびC6055タンパク質を検出するための免疫細胞化学染色
外因性C2093、B5860NV1およびB5860NV2、またはC6055の細胞内局在を調べるため、COS7細胞を全3つの構築物のためにウェル当たり1×105細胞で播種した。24時間後、FuGENE 6トランスフェクション試薬(Roche)を製造業者の説明書に従って用いて、COS7細胞にそれぞれ1μgのpCAGGS-C2093-HA、pCAGGS-B5860NV1-HA、pCAGGS-B5860NV2-HA、またはpCAGGS-C6055-HAを一過的にトランスフェクトした。次いで、細胞は15分間4%パラホルムアルデヒドを含むPBSを用いて固定され、4℃で2.5分間0.1% Triton X-100を含むPBSを用いて透過性を与えられた。続いて、細胞を4℃で12時間3% BSAのPBS溶液で被覆し、非特異的ハイブリダイゼーションをブロッキングした。次に、トランスフェクトして構築した各COS7細胞を、1/1000希釈のマウス抗HA抗体(Roche)と共にインキュベートした。PBSで洗浄した後、いずれのトランスフェクト細胞も、1/3000希釈のAlexa488結合抗マウス二次抗体(Molecular Probe)により染色した。4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸(DAPI)で核を対比染色した。TCS SP2 AOBS顕微鏡(ライカ、日本、東京)下で蛍光像を取得した。
同期化およびフローサイトメトリー解析
FuGENE 6(Roche)を供給業者の手順に従って用いて、HeLa細胞(1×106細胞)に8μgのpCAGGS-C2093-HA、またはpCAGGS-B5860NV1-HA、pCAGGS-B5860NV2-HAをトランスフェクトする。トランスフェクションの24時間後、アフィディコリン(1 ng/ml)をさらに16時間作用させて、細胞をG1期で停止させる。新鮮な培地で3回洗浄することにより細胞周期を解除し、示した時点で細胞を回収する。細胞を分裂期で停止させるには、細胞をノコダゾール(250 ng/ml)と共に16時間インキュベートしてから、これを回収する。
FACS解析のため、同期化した接着細胞および脱離細胞のアリコート400 mlを混合し、4℃、70%エタノールで固定した。PBS(-)で2回洗浄した後、RNase I 1 mgを含むPBS 1 mlと共に細胞を37℃で30分間インキュベートした。次いで、細胞をヨウ化プロピジウム(PI) 50 mgを含むPBS 1 ml中で染色した。細胞周期の各画分の割合は、フローサイトメーター(FACScalibur；Becton Dickinson、カリフォルニア州、サンディエゴ)で少なくとも10000個の細胞から決定した。
psiU6X3.0を用いたC2093、B5860N、およびC6055特異的siRNA発現ベクターの構築
以前の報告(WO2004/076623)に従ってpsiU6BX siRNA発現ベクターを用いて、ベクターに基づくRNAiシステムを確立した。psiU6BXベクターのBbsI部位に二本鎖オリゴヌクレオチドをクローニングすることにより、C2093(psiU6BX-C2093)、B5860N(psiU6BX-B5860N)、C6055(psiU6BX-C6055)に対するsiRNA発現ベクター、および対照プラスミド、psiU6BX-EGFP、psiU6BX-SCRを調製した。二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を以下に示す。
標的配列、GTGAAGAAGTGCGACCGAA (SEQ ID NO:21)に対するC2093si#3
センス(SEQ ID NO:22)：
5'-CACCGTGAAGAAGTGCGACCGAATTCAAGAGATTCGGTCGCACTTCTTCAC-3'
アンチセンス(SEQ ID NO:23)：
5'-AAAAGTGAAGAAGTGCGACCGAATCTCTTGAATTCGGTCGCACTTCTTCAC-3'
標的配列、CCAAAGTTCCGTAGTCTAA (SEQ ID NO:25)に対するB5860Nsi#3
センス(SEQ ID NO:26)：
5'-CACCCCAAAGTTCCGTAGTCTAATTCAAGAGATTAGACTACGGAACTTTGG-3'
アンチセンス(SEQ ID NO:27)：
5'-AAAACCAAAGTTCCGTAGTCTAATCTCTTGAATTAGACTACGGAACTTTGG-3'
標的配列、GTTGCAGTTACAGATGAAG (SEQ ID NO:144)に対するC6055si-08
センス(SEQ ID NO:145)：
5'-CACCGTTGCAGTTACAGATGAAGTTCAAGAGACTTCATCTGTAACTGCAAC-3'
アンチセンス(SEQ ID NO:146)：
5'-AAAAGTTGCAGTTACAGATGAAGTCTCTTGAACTTCATCTGTAACTGCAAC-3'
標的配列、GAAGCAGCACGACTTCTTC (SEQ ID NO:29)に対するsiRNA対照(SiEGFP)
センス(SEQ ID NO:30)：
5'-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'
アンチセンス(SEQ ID NO:31)：
5'-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'
標的配列、GCGCGCTTTGTAGGATTCG(SEQ ID NO:33)に対するsiRNA対照(SiSCR)
センス(SEQ ID NO:34)：
5'-CACCGCGCGCTTTGTAGGATTCGTTCAAGAGACGAATCCTACAAAGCGCGC-3'
アンチセンス(SEQ ID NO:35)：
5'-AAAAGCGCGCTTTGTAGGATTCGTCTCTTGAACGAATCCTACAAAGCGCGC-3'
これらのsiRNA発現ベクターは、以下のようなヌクレオチド配列からなるヘアピン構造を有するsiRNAを発現する：
C2093 si#3：GTGAAGAAGTGCGACCGAATTCAAGAGATTCGGTCGCACTTCTTCAC (SEQ ID NO:24)、
B5860N si#3：CCAAAGTTCCGTAGTCTAATTCAAGAGATTAGACTACGGAACTTTGG (SEQ ID NO:28)、
C6055 si-08 GTTGCAGTTACAGATGAAGTTCAAGAGACTTCATCTGTAACTGCAAC (SEQ ID NO:147)、
EGFP対照：GAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC (SEQ ID NO:32)、および
SCR対照：GCGCGCTTTGTAGGATTCGTTCAAGAGACGAATCCTACAAAGCGCGC (SEQ ID NO:36)。
C2093、B5860N、およびC6055の遺伝子サイレンシング効果
ヒト膀胱癌細胞株、C2093およびB5860Nに関するUMUC3およびJ82、またはC6055に関するSW780を10cmディッシュにプレーティングし(1×106細胞/ディッシュ)、C2093およびB5860Nに関してはFuGENE6(Roche)およびLipofectamine2000(Invitrogen)試薬、またはC6055に関してはNucleofector(Amaxa)試薬をそれぞれ供給業者の推奨に従って使用して、陰性対照としてのpsiU6BX-EGFPおよびpsiU6BX-SCR、psiU6BX-C2093、psiU6BX-B5860N、またはpsiU6BX-C6055をトランスフェクトした。各構築物のトランスフェクションの6日後に全RNAを細胞から抽出し、次いで上記のC2093、B5860N、およびC6055の共通領域の特異的プライマーを用いる半定量的RT-PCRにより、siRNAのノックダウン効果を確認した。内部対照としてのGAPDHおよびACTBのプライマーは以下の通りである：
GAPDH
5'-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3' (SEQ ID NO:7)および
5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3' (SEQ ID NO:8)、
ACTB
5'-CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3’(SEQ ID NO:148)
5'-TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3’(SEQ ID NO:149)。
さらに、UMUC3、J82、およびSW780細胞株を用いた、siRNAを発現するトランスフェクタントを、それぞれ0.6、1.0、および0.3 mg/mlのネオマイシンを含む選択培地中で21、28、および24日間培養した。4%パラホルムアルデヒドで固定した後、トランスフェクト細胞をギムザ液で染色して、コロニー形成を評価した。細胞生存度を定量するためにMTTアッセイを行った。ネオマイシンを含む培地中でそれぞれ21日間および28日間培養した後、MTT溶液(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)(Sigma)を0.5 mg/mlの濃度で添加した。37℃で2.5時間または1.5時間インキュベートした後、酸-SDS(0.01N HCl/10% SDS)を添加した；紺青色の結晶を溶解させるために、この懸濁液を激しく混合し、次いで37℃で一晩インキュベートした。570 nmでの吸光度をMicroplate Reader 550(BioRad)で測定した。
C2093-siRNAによる多核細胞の観察
FuGENE6(Roche)を用いてUMUC3細胞に陰性対照としてのsi-EGFPおよびsi-C2093をトランスフェクトした後、培養して、トランスフェクションの7日後にそれらの細胞形態を顕微鏡で観察した。C2093タンパク質発現の抑制をさらに確認するため、標準的な手順に従って抗C2093抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。
抗C2093抗体および抗B5860N抗体
COOH末端においてHisタグを含むC2093(1612〜1780 a.a.)(SEQ ID NO:150)、およびB5860NV2(337〜527 a.a.)またはB5860NV1(621-811 a.a.)(SEQ ID NO:151)の部分断片を発現するプラスミドを、それぞれpET21ベクターを用いて調製した。組換えタンパク質を大腸菌、BL21コドン-プラス株(Stratagene、カリフォルニア州、ラホーヤ)で発現させ、Ni-NTA樹脂およびTALONを用いて供給業者の手順に従って精製した。これらのタンパク質をウサギに接種した。標準的手順に従って、免疫血清をアフィニティーカラムで精製した。アフィニティー精製した抗C2093抗体および抗B5860N抗体を、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、および免疫染色に使用した。
膀胱癌細胞における内因性C2093およびB5860Nタンパク質を検出するための免疫細胞化学染色
内因性C2093またはB5860Nの細胞内局在を調べるため、C2093またはB5860Nを内因的に発現するUMUC3細胞をそれぞれウェル当たり1×105細胞で播種した。24時間後、細胞は15分間4%パラホルムアルデヒドを含むPBSを用いて固定され、4℃で2分間0.1% Triton X-100を含むPBSを用いて透過性を与えられた。続いて、細胞を4℃で12時間3% BSAのPBS溶液で被覆し、非特異的ハイブリダイゼーションをブロッキングした。次に、UMUC3細胞を、1/100希釈のアフィニティー精製した抗C2093抗体または抗B5860N抗体と共にインキュベートした。4',6'-ジアミジン-2'-フェニルインドール二塩酸(DAPI)で核を対比染色した。PBSで洗浄した後、UMUC3細胞を1/1000希釈のAlexa488結合抗ウサギ二次抗体(Moleculrar Probe)により染色した。共焦点顕微鏡(ライカ、日本、東京)下で蛍光像を取得した。
正常組織または膀胱癌組織における内因性C2093およびB5860Nタンパク質を検出するための免疫組織化学染色
パラフィン包埋された正常成人ヒト組織(BioChain、カリフォルニア州、ヘイワード)および外科的膀胱癌標本のスライドを、それぞれ切片を脱パラフィン処理し、抗C2093抗体を用いて高pHを有する抗原回復溶液(DAKO)中で電子レンジにより80℃で5分間加熱するか、または切片を脱パラフィン処理し、抗B5860N抗体を用いて高pHを有する抗原回復溶液(DAKO)中で108℃で15分間オートクレーブした後に、ENVISION+キット/HRP(DakoCytomation、デンマーク、グロストラップ)を用いて染色した。内因性のペルオキシダーゼおよびタンパク質をブロッキングした後、これらの切片を、1/20希釈のアフィニティー精製した抗C2093抗体または抗B5860N抗体と共にインキュベートした。ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ免疫グロブリン(Envisionキット、Dako Cytomation、カリフォルニア州、カーピンテリア)を用いて、免疫検出を行った。最終的に、反応物を3,3 V-ジアミノベンジン(Dako)で発色させ、細胞はヘマトキシリンで対比染色した。
結果
膀胱癌の正確な発現プロファイルを得るため、LMMを用いて膀胱癌細胞のみを収集した。この手順によって選択された癌細胞の比率は、顕微鏡による可視化で判定してほぼ100%であると推定された(データは示していない)。
発現比が5.0を超える上方制御遺伝子394個が同定された(表4)。これらの遺伝子には、膀胱癌細胞において過剰発現される、機能的に特徴づけられた遺伝子288個が含まれ、その他の106個(EST 51個を含む)は現時点では未知であった。これらの上方制御される要素には、シグナル伝達経路、癌遺伝子、細胞周期、ならびに細胞接着および細胞骨格に関与する重要な遺伝子が含まれていた。一方で、発現比が0.2よりも低い下方制御遺伝子1272個が同定された(表5)。これらの下方制御遺伝子には、膀胱癌細胞において下方制御される、機能的に特徴づけられた遺伝子1026個が含まれ、その他の246個(EST 119個を含む)は未知であった。
膀胱癌において上方制御されるこれらの遺伝子の発現パターンを確認するため、膀胱癌細胞株、ならびに正常膀胱および正常移行細胞を含む正常ヒト組織を用いて、半定量的RT-PCR解析を行った。情報のある全症例の大部分において発現が過剰発現された上方制御遺伝子44個の発現レベル比を比較したところ、その結果は、試験した症例の大多数においてマイクロアレイ解析の結果と非常に類似していた(図1)。特に、B5860N、B0811、C2093、F6022、F4976、D5491、F0411、D7746、A0576N、F1653、C2210、C7757、およびD7443はまた、正常重要器官において発現を示さなかった。これらのデータから、膀胱癌細胞において一般に上方制御される遺伝子を同定するための本発明者らの戦略の信頼性が検証された。
これらの上方制御遺伝子、A0576N、C2093、C5509、B5860N、F1653、B9838、およびC6055の発現パターンをさらに調べるため、表3に記載の各プライマーセットを用いてRT-PCRにより調製したA0576N、C2093、C5509、B5860N、F1653、B9838、およびC6055の各[α32P]-dCTP標識増幅産物をそれぞれのプローブとして用いて、膀胱癌細胞株でノーザンブロット解析を行った(図2)。それらはいずれも、やはり、膀胱癌細胞株において正常膀胱における発現よりも非常に高い発現を示した。特に、A0576N、C2093、B5860N、B9838、およびC6055は膀胱癌細胞株において特異的に過剰発現され、正常膀胱を含む正常ヒト組織では発現されていなかった。以上のことから、これらの特異的に過剰発現される遺伝子が分子標的療法の良好な候補となり得ることが示唆される。
（表４）膀胱癌において上方制御される遺伝子
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（表５）膀胱癌において下方制御される遺伝子
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膀胱癌細胞で上方制御される遺伝子としてのC2093、B5860N、およびC6055の同定
膀胱癌患者33名からの癌細胞の遺伝子発現プロファイルを、ヒト遺伝子27,648個を提示するcDNAマイクロアレイを用いて解析したところ、膀胱癌細胞において一般に上方制御される遺伝子394個が同定された。これらのうち、施設内コードC2093(M期リンタンパク質1(MPHOSPH1)(Genebank登録NM_016195(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2をコードする))を示す)、B5860N(DEPドメイン含有1(DEPDC1)(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4をコードする)を示す)、およびC6055(MGC34032仮想タンパク質、(Genebank登録NM_152697 SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134をコードする)を示す)を有する遺伝子に注目した。C2093、B5860N、およびC6055遺伝子の発現は、発現データを得ることができた膀胱癌症例それぞれ25例のうち24例、20例のうち17例、および32例のうち21例で上昇していた。上方制御されたこれらの遺伝子の発現を確認するため、半定量的RT-PCR解析を行い、膀胱癌試料と正常膀胱癌細胞を含む正常ヒト組織との間で発現レベルを比較した。まず、C2093が、正常膀胱細胞、ならびに肺、心臓、肝臓、および腎臓を含む正常ヒト組織と比較して、臨床膀胱癌試料21例中17例において発現上昇を示したことが見出された(図1aおよびb)。さらに、この遺伝子は、6つの膀胱癌細胞株のいずれにおいても同様に過剰発現されていた(図1b)。次いで、B5860Nが、正常ヒト組織、特に正常膀胱mRNAと比較して、臨床膀胱癌試料21例中20例において発現上昇を示し(図1aおよびc)、試験した6つの膀胱癌細胞株のいずれにおいても過剰発現されていた(図1c)ことが見出された。
これらの遺伝子の発現パターンをさらに調べるため、C2093、B5860N、およびC6055のcDNA断片をプローブとして用いて、複数のヒト組織および膀胱癌細胞株でノーザンブロット解析を行った(材料および方法を参照されたい)。C2093は、精巣以外の正常ヒト組織では発現していないかまたは検出不能であったが(図2e；上パネル)、膀胱癌細胞株のすべてにおいて驚くほど過剰発現されていた(図2e；下パネル)。B5860Nも同様に精巣のみで発現され(図2f、上パネル)、一方、他の正常組織、特に正常ヒト膀胱と比較して、膀胱癌細胞株のすべてにおいて有意に過剰発現されていた(図2f、下パネル)。C6055もまた、正常ヒト組織では発現していないかまたは検出不能であったが(図2g；上パネル)、6つの膀胱癌細胞株のうち3つにおいて過剰発現されていた(図2g；下パネル)。したがって、膀胱癌特異的に発現される転写産物に注目した。
C2093、B5860N、およびC6055のゲノム構造
当初、データベースにおいてC2093が全長ではなかったため、C2093、B5860N、およびC6055の全cDNA配列を得ることを目的として、膀胱癌細胞株、SW780を鋳型として使用し、ESTウォーキング、ならびに5'RACEおよび3'RACE実験としてRT-PCRを行った(材料および方法を参照されたい)。C2093は31エキソンからなり、M期リンタンパク質1(MPHOSPH1)を示し、染色体10q23.31に位置する。C2093の全長mRNA配列は6319ヌクレオチドを含んでおり、1780アミノ酸をコードする。この転写産物のORFは、それぞれのエキソン1において開始する。
B5860Nは、DEPドメイン含有1(DEPDC1)を示し、染色体1p31.2に位置する。この遺伝子はまた、それぞれB5860N V1(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4をコードする)およびB5860N V2(SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6をコードする)に対応する、12エキソンおよび11エキソンからなる2つの異なる転写変異体を有する(図3b)。V1のエキソン8において選択的変化が存在していたが、その他の残りのエキソンは両変異体に共通していた。V2変異体にはV1のエキソン8はないが、最後のエキソン内に同じ終止コドンを生じる。B5860NV1およびB5860NV2変異体の全長cDNA配列は、それぞれ5318および4466ヌクレオチドからなる。これら変異体のORFは、それぞれのエキソン1において開始する。V1およびV2転写産物は最終的に、それぞれ811アミノ酸および527アミノ酸をコードする。膀胱癌細胞株、ならびに膀胱、心臓、肺、肝臓、腎臓、脳、膵臓を含む正常ヒト組織における各変異体の発現パターンをさらに確認するため、ノーザンブロット解析を行った。結果として、いずれの変異体も膀胱癌細胞において高度に過剰発現されるが、精巣を除く正常ヒト組織では発現していないかまたは検出不能であることが見出された(図2f、下パネル)。特に、V2転写産物は精巣でのみ発現されていた。したがって、B5860Nの両変異体の機能解析をさらに行った。
NCBIのデータベースによれば、C6055は24エキソンからなり、MGC34032と称され、染色体1p31.3に位置する。C6055はデータベース上のMGC34032の最後のエキソン(エキソン24)内に含まれないため、本発明者らは、膀胱癌細胞株、SW780を鋳型として用いて、ESTウォーキングおよび5'RACE実験としてRT-PCRを行い、C6055の全cDNA配列を得た(材料および方法を参照されたい)。その結果、本発明者らは、2つの新規転写産物、C6055V1(SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130をコードする)およびC6055V2(SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132をコードする)を見出した。最終的に、この遺伝子は、24、25、22、および22エキソンからなる4つの異なるスプライシング変異体を有し、それぞれMGC34032、Genbank登録番号AK128063、C6055V1、およびC6055V2が対応する(図3c)。MGC34032のエキソン1、2、3、4、および24において選択的スプライシングが存在し、その他の残りのエキソンは4つの転写産物に共通していた。C6055V1およびC6055V2転写産物にはMGC34032のエキソン1、2、および3はなく、最後のエキソン内に同じ終止コドンを生じる。特に、C6055V1およびC6055V2転写産物のORFはそれぞれのエキソン4において開始し、C6055V1およびC6055V2転写産物は同じORFを有することを示している。MGC34032、Genbank登録番号AK128063、C6055V1、およびC6055V2転写産物の全長cDNA配列は、それぞれ2302、3947、3851、および3819ヌクレオチドからなる。MGC34032、Genbank登録番号AK128063、C6055V1、およびC6055V2転写産物は最終的に、それぞれ719、587、675、および675アミノ酸をコードする。膀胱癌細胞株、ならびに膀胱、心臓、肺、肝臓、腎臓、脳、精巣、膵臓を含む正常ヒト組織における各変異体の発現パターンをさらに確認するため、マイクロアレイ用のcDNA断片C6055をプローブとして用いてノーザンブロット解析を行った。その結果、およそ3.9 kbの転写産物がいくつかの膀胱癌細胞(HT-1376、SW780、およびRT4)において高度に過剰発現されていたが、正常ヒト組織においては発現していないかまたは検出不能であった(図2g上パネル)。加えて、7.5 kbの転写産物がHT1376細胞においてのみ特異的に発現されていたが、この転写産物の全mRNA配列はまだ同定されていない。さらに、プローブとしてこれらの転写産物に共通な領域を用いてノーザンブロット解析を行った場合、正常精巣においてのみ、MGC34032に対応する2.3 kbの転写産物が検出された(図2g中段および下パネル)。そのため、本発明者らは、C6055V1遺伝子産物の機能解析をさらに行う。
C2093、B5860N、およびC6055の細胞内局在
C2093、B5860N、およびC6055の特性をさらに調べるため、これらの遺伝子産物の細胞内局在をCOS7細胞において調べた。最初に、C2093タンパク質を発現するプラスミド(pCAGGS-C2093-HA)をCOS7細胞に一過的にトランスフェクトしたところ、210 KDa-C2093タンパク質が、ウェスタンブロット解析により予想される大きさで認められた(図4a)。免疫細胞化学染色により、外因性C2093はCOS7細胞において主に核器官に局在することが明らかになったが、いくつかの細胞では染色体の周囲に蓄積するのが観察された(図4b)。そのため、アフィディコリンを用いて細胞を同期化し、細胞周期の進行におけるC2093タンパク質の局在について調べた。顕著なことには、このタンパク質はG1/G0期およびS期には核に位置し、特にG2/M期には染色体の周囲に蓄積していた(図4c)。
次に、B5860NV1またはV2タンパク質を発現するプラスミド(pCAGGS-B5860NV1-HAまたはpCAGGS-B5860NV2-HA)をそれぞれCOS7に一過的にトランスフェクトしたところ、外因性B5860NV1およびV2タンパク質は、トランスフェクションの24時間後および48時間後に、ウェスタンブロット解析によりそれぞれ予想される大きさで認められた(図4d、V1；左パネル、V2右パネル)。さらに免疫細胞化学染色により、B5860NV1は細胞質に局在するが(図4e、上パネル)、いくつかの細胞では核器官にも認められること(図4e、下パネル)、およびB5860NV2は主に細胞質に局在し(図4f、上パネル)、いくつかの細胞では細胞膜下にも認められること(図4f、下パネル)が明らかになった。そのため、アフィディコリンを用いて細胞を同期化し、細胞周期の進行におけるB5860NV1およびV2タンパク質の局在について調べた。B5860NV1タンパク質はG1/G0期およびS期には核に位置していたが、G2/M期には細胞膜下に局在しており(図4g)、B5860NV2タンパク質はG2/M期に細胞膜下に位置していた(図4h)。さらに、B5860NV1およびV2タンパク質を発現する両プラスミドをCOS7に一過的に同時トランスフェクトした場合、B5860NV1タンパク質は核および細胞質器官に位置すること、ならびにB5860NV2は核に位置し、G2/M期に細胞膜下に移行することが認められた(図4i)。
さらに内因性C2093の細胞内局在を決定するため、細胞周期の進行過程における局在を、アフィニティー精製した抗C2093抗体を用いて免疫細胞化学的解析により調べた。内因性C2093タンパク質は間期には核に局在していたが、分裂前期、分裂中期、および分裂後期(前期)には細胞質に局在し、特に分裂後期(後期)には中央体に位置し、次いで分裂終期には収縮環の近傍に位置していた(図4j)。したがって、C2093は細胞質分裂において重要な役割を果たす可能性がある。
次に、C2093と同様に、膀胱癌細胞における内因性B5860Nを細胞周期の進行過程において調べるため、アフィニティー精製したB5860Nポリクローナル抗体を用いて免疫細胞化学的解析を行った。内因性B5860Nタンパク質は間期には主として核に局在していたが、M期には細胞質に局在していた(図4k)。
SMARTおよびSOSUIコンピュータ予測により、予測されるC6055タンパク質が、8、9、または10番目の膜貫通ドメインを含むことが判明した。この予測を確かめるため、この遺伝子産物の細胞内局在を、トランスフェクションの36時間後および60時間後のCOS7細胞において調べた。まず、C6055タンパク質を発現するプラスミド(pCAGGS-C6055-HA)をCOS7細胞に一過的にトランスフェクトし、抗HAタグ抗体を用いてウェスタンブロット解析を行った。結果から、C6055タンパク質の予想される大きさに相当する67 KDaのバンド、およびさらなる75 KDaのバンドが示された(図4l)。75 KDaのバンドが、リン酸化またはグリコシル化によって修飾されたC6055の形態を表すのかどうかを検証するため、免疫ブロッティングの前に、細胞抽出物をλ-ホスファターゼ、O-グリコシダーゼ、またはN-グリコシダーゼ、およびO-グリコシダーゼで処理した。ホスファターゼおよびO-グリコシダーゼ処理後に75 kDaのバンドは消失しなかったが、O-グリコシダーゼ処理後には消失したことから、C6055タンパク質が生細胞でのみO-グリコシル化されることが示唆された(図4m)。C6055タンパク質の細胞内局在を調べるため、C6055をトランスフェクトしたCOS7細胞で蛍光免疫組織化学染色を行った。結果から、36時間の時点では細胞質におけるC6055の局在が認められたが、60時間の時点では外因性C6055はCOS7細胞において主に細胞膜に局在することが明らかになった(図4n)。
C2093、B5860N、およびC6055の発現を低下させるように設計された低分子干渉RNA(siRNA)の増殖阻害効果
C2093、B5860N、およびC6055の増殖促進の機能を評価するため、哺乳動物ベクターに基づくRNA干渉(RNAi)法により、C2093、B5860N、およびC6055を過剰発現することが示されている膀胱癌細胞株、J82、UMUC3、およびSW780で内因性のC2093、B5860N、およびC6055の発現をノックダウンした(材料および方法を参照されたい)。C2093、B5860N、およびC6055の発現レベルを、半定量的RT-PCR実験により調べた。図5〜7に示したように、C2093、B5860N、およびC6055特異的siRNAは、対照siRNA構築物(psiU6BX-EGFPおよびSCR)と比較して、それぞれの遺伝子の発現を有意に抑制した(図5a、5d、6a、7a)。C2093、B5860N、およびC6055特異的siRNAによる細胞増殖阻害を確かめるため、コロニー形成アッセイおよびMTTアッセイをそれぞれ実施した。C2093-si3構築物を導入するとJ82およびUMUC3細胞の増殖が抑制され(図5 b、c、e、f)、B5860N-si3構築物によりJ82細胞の増殖が抑制され(図6b、c)、およびC6055-si-08構築物によりSW780細胞の増殖が抑制され(図7b、c)、上記の発現低下の結果と一致した。結果はそれぞれ、3回の独立した実験により検証した。これらの知見から、C2093、B5860N、およびC6055が膀胱癌の細胞増殖において重要な機能を有することが示唆される。
特に、細胞質分裂におけるC2093の機能をさらに解明するため、C2093-siRNAを膀胱癌細胞株UMUC3細胞にトランスフェクトし、次いでトランスフェクションの7日後に顕微鏡検査により細胞形態を観察した。C2093タンパク質の発現がC2093-siRNAによりノックダウンされることが確認され(図8b)、siRNAをトランスフェクトした細胞において多核細胞が認められ(図8a、c)、これによりsi-C2093のノックダウン細胞が細胞質分裂できなかったことが示唆される。
臨床試料におけるC2093およびB6850Nタンパク質の発現
外科切除した浸潤性膀胱癌組織および正常膀胱組織の切片、ならびに種々の正常組織(腎臓、心臓、肺、および肝臓)それぞれにおいて、C2093またはB5860Nの免疫組織化学的解析を行った。膀胱癌組織でのみ、両タンパク質に対する強い染色が認められ(図9a、b)、正常膀胱組織ではC2093の染色は検出されなかった(図9a)。
考察
本報告では、ゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイを用いた膀胱癌の正確な発現プロファイルを介して、正常ヒト組織と比較して膀胱癌細胞において有意に過剰発現される新規遺伝子、C2093、B5860N、およびC6055が同定された。
B5860Nタンパク質は免疫化学染色により中間径繊維として細胞質に局在することが認められ、B5860Nが細胞間相互作用の重要な役割を果たしている可能性が示唆された。
さらに、膀胱癌細胞をsiRNAで処理することにより、全3つの標的遺伝子、C2093、B5860N、およびC6055の発現が効率的に阻害され、膀胱癌の細胞/腫瘍増殖が有意に抑制されることが実証された。これらの知見から、C2093、B5860N、およびC6055は腫瘍細胞増殖において重要な役割を担い、抗癌剤を開発するための有望な標的となり得ることが示唆される。
産業上の利用可能性
レーザーキャプチャーダイセクションとゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイの組み合わせによって得られた、本明細書に記載の膀胱癌の遺伝子発現解析により、癌の予防および治療の標的として特異的遺伝子が同定された。差次的に発現されるこれら遺伝子の一部の発現に基づいて、本発明は、膀胱癌を同定および検出するための分子診断マーカーを提供する。
本明細書に記載した方法はまた、膀胱癌の予防、診断、および治療のさらなる分子標的の同定に有用である。本明細書において報告したデータは、膀胱癌の包括的な理解を深め、新規診断戦略の開発を促し、治療薬および予防薬の分子標的を同定するための手がかりを提供する。このような情報は膀胱腫瘍形成のより深い理解に寄与し、膀胱癌の診断、治療、および最終的には予防に向けた新規戦略を開発するための指標を提供する。
ヒト遺伝子C2093、B5860N、およびC6055の発現は、非癌性膀胱組織と比較して膀胱癌において著しく上昇している。したがって、これらの遺伝子は膀胱癌の診断マーカーとして有用であり、これらによってコードされるタンパク質は膀胱癌の診断アッセイに有用である。
本発明者らはまた、C2093、B5860N、またはC6055タンパク質の発現が細胞増殖を促進するが、C2093、B5860N、またはC6055遺伝子に対応する低分子干渉RNAによって細胞増殖が抑制されることを示した。これらの知見により、C2093、B5860N、およびC6055タンパク質が発癌活性を促進することが示される。したがって、これらの癌タンパク質はそれぞれ、抗癌薬を開発するための有用な標的である。例えば、C2093、B5860N、もしくはC6055の発現を遮断するか、またはその活性を妨げる物質は、抗癌剤として、特に膀胱癌治療のための抗癌剤として治療上有用である。そのような物質の例には、C2093、B5860N、またはC6055遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA、およびリボザイム、ならびにC2093、B5860N、またはC6055を認識する抗体が含まれる。
本明細書において引用した特許、特許出願、および出版物はすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
さらに、本発明をその特定の態様に言及して詳細に説明してきたが、上記の説明は、例示的かつ説明的な性質のものであって、本発明およびその好ましい態様を例示することを意図していることが理解されるべきである。当業者は、日常的な実験を通して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、そこで様々な変更および修正がなされ得ることを容易に理解すると考えられる。したがって、本発明は上記の説明によって規定されるのではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物によって規定されることが意図される。
図1aは、増幅RNAから調製したcDNAを用いる半定量的RT-PCRによって調べた代表的な遺伝子44個およびGAPDHの発現を示すDNAアガロースゲルの写真である。最初の10レーンは、種々の膀胱癌患者における遺伝子発現レベルを示す。次の2レーンは、正常個体由来の膀胱；正常移行細胞および全体における遺伝子発現レベルを示す。次の4レーンは、正常ヒト組織；心臓、肺、肝臓、および腎臓における遺伝子発現レベルを示す。図1bおよびcは、膀胱癌患者21名による腫瘍細胞(1001、1009、1010、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022、1023、1024、2003、2014、3001、5001、5002)(上および中段パネル)、膀胱癌細胞株(HT1197、UMUC3、J82、HT1376、SW780、およびRT4)(下パネル)、および正常ヒト組織(正常一括；正常膀胱、TC；マイクロダイセクションした移行細胞、心臓、肺、肝臓、腎臓)における(b) C2093および(c) B5860Nを示す。 A0576N(a)、C5509(b)、F1653(c)、B9838(d)、C2093(e)、B5860N(f)、C6055(g、h) DNA断片を各プローブとして使用した、膀胱癌細胞株および正常膀胱を含む正常ヒト組織でのノーザンブロット解析の結果を示す。 (a) C2093、(b) B5860N、および(c) C6055のゲノム構造を示す。B5860Nは、V1およびV2と称する2つの異なる変異体を有する。C6055は、MGC34032、Genbank登録番号AK128063、C6055V1、およびC6055V2と称する4つの異なる変異体を有する。 C2093、B5860N、およびC6055の外因性発現および細胞内局在を示す。(a) トランスフェクションの24時間後および48時間後における、ウェスタンブロットによるC2093タンパク質の外因性発現、(b) C2093タンパク質の細胞内局在、(c) C2093の細胞周期依存的局在、(d) トランスフェクションの24時間後および48時間後における、ウェスタンブロット解析によるB5860N V1(左パネル)およびB5860N V2(右パネル)タンパク質の外因性発現、(e) B5860N V1および(f) B5860N V2タンパク質の細胞内局在、(g) B5860N V1タンパク質および(h) B5860N V2の細胞周期依存的局在、(i) B5860N V1およびB5860N V2のCOS7細胞への同時トランスフェクション、(j) 細胞周期の進行過程におけるC2093の細胞内局在、(k) 細胞周期の進行過程におけるB5860Nの細胞内局在、(l) トランスフェクションの36時間後における、ウェスタンブロットによるC6055タンパク質の発現、(m) C6055タンパク質の翻訳後修飾 (n) 外因性C6055タンパク質の細胞内局在を示す。 膀胱癌細胞における、C2093の発現を低下させるように設計した低分子干渉RNA(siRNA)の増殖阻害効果を示す。(a) 膀胱癌細胞株、UMUC3細胞におけるC2093の内因性発現の抑制を示す半定量的RT-PCRを示す。GAPDHを内部対照として使用した。EGFP；対照としてのEGFP配列、およびSCR；対照としてのスクランブル配列(材料および方法を参照されたい)。 (b) UMUC3細胞における、C2093のノックダウンによるコロニー数の減少を実証するコロニー形成アッセイを示す。(c) UMUC3細胞における、C2093のノックダウンによるコロニー数の減少を実証するMTTアッセイを示す。(d) 膀胱癌細胞株、J82細胞におけるC2093の内因性発現の抑制を示す半定量的RT-PCRを示す。GAPDHを内部対照として使用した。(e) J82細胞における、C2093のノックダウンによるコロニー数の減少を実証するコロニー形成アッセイを示す。(f) J82細胞における、C2093のノックダウンによるコロニー数の減少を実証するMTTアッセイを示す。 膀胱癌細胞における、B5860Nの発現を低下させるように設計した低分子干渉RNA(siRNA)の増殖阻害効果を示す。(a) 膀胱癌細胞株、J82細胞におけるB5860Nの内因性発現の抑制を示す半定量的RT-PCRを示す。GAPDHを内部対照として使用した。EGFP；対照としてのEGFP配列、およびSCR；対照としてのスクランブル配列(材料および方法を参照されたい)。(b) J82細胞における、B5860Nのノックダウンによるコロニー数の減少を実証するコロニー形成アッセイを示す。(c) J82細胞における、B5860Nのノックダウンによるコロニー数の減少を実証するMTTアッセイを示す。 膀胱癌細胞における、C6055の発現を低下させるように設計した低分子干渉RNA(siRNA)の増殖阻害効果を示す。(a) 膀胱癌細胞株、SW780細胞におけるC6055の内因性発現の抑制を示す半定量的RT-PCRを示す。ACTBを内部対照として使用した。SCR；対照としてのスクランブル配列(材料および方法を参照されたい)。 (b) SW780細胞における、C6055のノックダウンによるコロニー数の減少を実証するコロニー形成アッセイを示す。(c) SW780細胞における、C6055のノックダウンによるコロニー数の減少を実証するMTTアッセイを示す。 (a) C2093-siRNAの処理による多核細胞を示す。(b) 抗C2093抗体を用いたウェスタンブロット解析を示す。(c) 顕微鏡検査による細胞形態を示す。 (a) 膀胱癌組織切片におけるC2093の発現を示す(右パネル×200；左パネル×100)、(b) 膀胱癌組織切片におけるB5860Nの発現を示す(右パネル×200；左パネル×100)、正常膀胱組織(下パネル)。

Claims (23)

  1. 膀胱癌細胞を検出する方法であって、以下の段階を含む方法：
    (a) 膀胱癌細胞を含むことが疑われる対象から採取された細胞試料における、SEQ ID NO:4および6からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
    (b) 発現レベルの上昇によって膀胱癌細胞を含むことが示される段階。
  2. 発現レベルが以下からなる群より選択される段階のいずれか1つによって検出される、請求項１記載の方法：
    (a) SEQ ID NO:3または5に対応する塩基配列を含むmRNAを検出する段階；および
    (b) SEQ ID NO:4または6のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出する段階。
  3. 膀胱癌を治療または予防するための化合物の候補をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法：
    (a) 被験化合物を、以下からなる群より選択されるポリペプチドと接触させる段階：
    (1) SEQ ID NO:4または6のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    (2) SEQ ID NO:4または6のアミノ酸配列、または該配列と少なくとも80%の相同性を有する配列を含みSEQ ID NO:4または6のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な細胞増殖活性を有するポリペプチド；および
    (3) SEQ ID NO:3または5のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、SEQ ID NO:4または6のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な細胞増殖活性を有するポリペプチド；
    (b) ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階；ならびに
    (c) ポリペプチドに結合する化合物を選択する段階。
  4. 膀胱癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法：
    (a) 被験化合物を、以下からなる群より選択されるポリペプチドを発現する細胞と接触させる段階：
    (1) SEQ ID NO:4または6のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    (2) SEQ ID NO:4または6のアミノ酸配列、または該配列と少なくとも80%の相同性を有する配列を含みSEQ ID NO:4または6のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な細胞増殖活性を有するポリペプチド；および
    (3) SEQ ID NO:3または5のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、SEQ ID NO:4または6のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な細胞増殖活性を有するポリペプチド；
    (b) 段階(a)のポリペプチドの細胞増殖活性を検出する段階；ならびに
    (c) 被験化合物の非存在下で検出される細胞増殖活性と比較して、ポリペプチドの細胞増殖活性を抑制する化合物を選択する段階。
  5. 膀胱癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法：
    (a) 被験化合物を、SEQ ID NO:3または5のヌクレオチド配列を含む1つまたは複数のポリヌクレオチドを発現する細胞と接触させる段階；および
    (b) 被験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して、SEQ ID NO:3または5のヌクレオチド配列を含む1つまたは複数のポリヌクレオチドの発現レベルを低下させる化合物を選択する段階。
  6. 細胞が膀胱癌細胞である、請求項４または５記載の方法。
  7. 膀胱癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法：
    (a) 被験化合物を、SEQ ID NO:3または5のヌクレオチド配列のいずれかを含むマーカー遺伝子の転写制御領域およびその転写制御領域の調節下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる段階；
    (b) 該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階；および
    (c) 被験化合物の非存在下で検出される該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる化合物を選択する段階。
  8. 膀胱癌を治療または予防するための組成物であって、当該組成物は活性成分としてのSEQ ID NO:3または5の塩基配列からなるポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含み、その産生を減少させるアンチセンスポリヌクレオチドまたは低分子干渉RNAの薬学的有効量および薬学的に許容される担体を含む組成物。
  9. 低分子干渉RNAが標的配列としてSEQ ID NO:25のヌクレオチド配列を含み、かつ25ヌクレオチド長、またはそれ未満の長さからなる、請求項８記載の組成物。
  10. siRNAが一般式5'-[A]-[B]-[A']-3'を有し、
    式中、[A]はSEQ ID NO:25のヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、
    [B]は3〜23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり、かつ
    [A']は[A]の相補配列からなるリボヌクレオチド配列である、
    請求項９記載の組成物。
  11. 組成物がトランスフェクション促進剤を含む、請求項８記載の組成物。
  12. SEQ ID NO:3または5の塩基配列からなるポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含み、その産生を減少させるアンチセンスポリヌクレオチドまたは低分子干渉RNAの膀胱癌を治療または予防するための医薬組成物の製造における使用。
  13. siRNAが標的配列としてSEQ ID NO:25のヌクレオチド配列を含み、かつ25ヌクレオチド長、またはそれ未満の長さからなる、請求項１２記載の使用。
  14. siRNAが一般式5'-[A]-[B]-[A']-3'を有し、
    式中、[A]はSEQ ID NO:25のヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、
    [B]は3〜23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり、かつ
    [A']は[A]の相補配列からなるリボヌクレオチド配列である、
    請求項１３記載の使用。
  15. 組成物がトランスフェクション促進剤を含む、請求項１２記載の使用。
  16. 膀胱癌を診断するための診断薬であって、SEQ ID NO: 3または5の塩基配列からなるポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはSEQ ID NO: 4または6のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む診断薬。
  17. センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、センス鎖がSEQ ID NO:25に対応するリボヌクレオチド配列を含み、かつアンチセンス鎖が該センス鎖と相補的なリボヌクレオチド配列を含み、該センス鎖と該アンチセンス鎖が相互にハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、SEQ ID NO:3または5のヌクレオチド配列からなる遺伝子の少なくともいずれか1つを発現する細胞に導入した場合に、該遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子であって、前記センス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ25ヌクレオチド長、またはそれ未満の二本鎖分子。
  18. センス鎖が、SEQ ID NO:3または5のヌクレオチド配列のいずれか1つに由来する19〜25個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１７記載の二本鎖分子。
  19. センス鎖がSEQ ID NO:25に対応するリボヌクレオチド配列からなる、請求項１７記載の二本鎖分子。
  20. 単一のリボヌクレオチド転写産物がセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、請求項１７記載の二本鎖分子であって、該センス鎖と該アンチセンス鎖を連結する一本鎖リボヌクレオチド配列をさらに含む二本鎖分子。
  21. 請求項１７記載の二本鎖分子をコードするベクター。
  22. 二次構造を有する転写産物をコードする請求項２１記載のベクターであって、転写産物がセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むベクター。
  23. 転写産物が、センス鎖とアンチセンス鎖を連結する一本鎖リボヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２２記載のベクター。
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