JP5068121B2 - 顕微鏡および三次元情報取得方法 - Google Patents

Description

本発明は、光透過性の試料へ照射光を照射して、焦点面の光により試料の観察を行う顕微鏡および三次元情報取得方法に関し、特に試料内部のすべての厚さ方向に合焦した情報を高速に得ることができる顕微鏡および三次元情報取得方法に関する。

現在、顕微鏡の一つとして知られている共焦点走査顕微鏡は、試料上の収束光点を走査（スキャン）して、試料からの透過光、反射光あるいは蛍光などの光を結像させて画像を得ることによって試料を観察するために用いられている。このような共焦点走査顕微鏡は、例えば生物関連やバイオテクノロジー関連などの技術分野において、生きた細胞の形態観察や生理反応観察、あるいは光透過性の物質（透過物質）の内層面の体積観察などに多用されている。また、共焦点走査顕微鏡は、特にＺ軸上（深さ方向）の分解能が極めて高いため、光透過性の試料の三次元情報の取得や上述した以外の用途などにも用いられている。

図４は、試料の三次元情報を取得するために用いられる従来の共焦点走査顕微鏡の例を説明するための構成図である。図４に示すように、従来の共焦点走査顕微鏡１００は、試料が内在する透明基板１３０と、この透明基板１３０における焦点面１３１からの透過光、反射光あるいは蛍光に基づき試料の画像を取得する画像光学系１０１と、この画像光学系１０１から出射される光を焦点面１３１に結像する対物レンズ１２０とを備えて構成されている。

この共焦点走査顕微鏡１００における画像光学系１０１は、例えば光源１０２と、コリメータレンズ１０３と、偏光板１０４と、ピンホール１０５と、偏光ビームスプリッタ１０６とを備えている。また、画像光学系１０１は、結像レンズ１０７と、１／４λ板１０８と、ピンホール１０９と、リレーレンズ１１０と、ＣＣＤ素子１１１とを備えている。

このように構成された従来の共焦点走査顕微鏡１００では、透明基板１３０における試料の体積を走査する場合に、試料が画像光学系１０１の視界内に存するときは、画像光学系１０１を深さ方向に動かして試料の画像を取得する。また、試料が画像光学系１０１の視界外にわたって存する場合は、例えば透明基板１３０を図中矢印Ｘ，Ｙ方向およびＺ方向の三次元的な別々の運動軸上にて動かしたり、画像光学系１０１をＺ方向に動かしたりして、試料の画像を取得する。

このため、特に試料が画像光学系１０１の視界よりも大きな領域にわたって存する場合には、画像光学系１０１や透明基板１３０をＺ方向に沿って動かした後に次の視界分透明基板１３０をＸ，Ｙ方向に動かし、再度Ｚ方向に沿って画像光学系１０１や透明基板１３０を動かすことを繰り返すことが必要とされ、図中破線Ａで示すような非連続動作的な運動が要求される場合がある。なお、このような運動によると、試料の焦点の品質は、透明基板１３０の走査深度により左右される。

この他、三次元的な別々の運動軸上での運動を必要とするものとして、例えば下記特許文献１に開示されている共焦点走査顕微鏡によれば、光源として連続スペクトルよりなる白色光を用いるとともに、試料となる透過物質をレンズの焦点位置から離れた位置に配置している。そして、試料が視界外に存するときには試料を移動させるとともにピンホールを光軸上で移動させて、透過物質の分散特性とレンズの色収差とを利用して、透過物質の三次元形状や構造を光の波長別情報として検出することが行われる。

特開平９−１１３２４０号公報

このように、上述した従来の共焦点走査顕微鏡や特許文献１に記載の共焦点走査顕微鏡は、三次元的な別々の運動軸上での運動により試料の三次元情報を測定することができるので、特に光透過性の試料における体積観察などに好適な構成を実現することができる。また、上記特許文献１に記載の共焦点走査顕微鏡では、ピンホールを透過した光の試料を通過した際の光路長に応じて変化する波長別パターンを測定することによって、試料の三次元情報を光の波長ごとに実時間で測定することができるので、光透過性の試料の三次元情報を実時間で容易に検出することができる構成とされている。

しかしながら、従来の共焦点走査顕微鏡を含めた一般的な顕微鏡では、例えば透明基板の屈折率ｎが１．５程度の場合では、試料の厚さ方向にて合焦するポイントが皆無であるため、対物レンズなどにより補正を行ったり画像処理により補正を行って試料の画像を取得する必要がある。また、試料の観察状況によっては、深さ方向に沿った運動や三次元的な別々の運動軸上での運動が必要となるとともに、上記特許文献１に記載の共焦点走査顕微鏡では、試料とは別にピンホールを光軸上で動かす必要があり、結果的に三次元的な運動が必要となる。このため、共焦点走査顕微鏡の走査機構が依然複雑な動作を必要とすることに変わりはなく、高速に試料内部のすべての厚さ方向に合焦した情報を得て試料の体積観察を行うことができないという問題がある。

また、これらの共焦点走査顕微鏡や一般的な顕微鏡では、常に焦点面が試料の水平断面と平行に形成される構造であるため、Ｚ方向のある走査深さに対してのみ焦点面が最適な状態で形成されるに止まり、試料体積全体（試料内部全体）にわたって合焦した（すなわち、試料の厚さ方向のすべてにわたって合焦した）鮮明な画像情報に基づく三次元情報を得ることができないという問題がある。

そこで、本発明は、このような問題を解決するものであって、試料の厚さ方向に沿った運動が不要で高速に試料内部のすべての厚さ方向に合焦した情報を得て試料の体積観察を行うことができる顕微鏡および三次元情報取得方法を提供することを目的とする。

本発明に係る顕微鏡は、試料に照射光を照射してその焦点面の光により光透過性の試料を観察する顕微鏡であって、透明基板に支持された前記試料に対して、前記照射光をその光軸が前記透明基板に対して所定の傾斜を持つように照射して、前記焦点面の光を読み取って前記試料の三次元情報を取得する画像光学系と、前記透明基板の屈折率と同等の屈折率を有し、前記透明基板に支持された前記試料に対して、前記画像光学系からの前記照射光の光軸に対して直交する前記焦点面が形成されるように楔形に設けられた楔形補正領域とを備えたことを特徴とする。

上記構成によれば、照射光の光軸が、透明基板に対して所定の傾斜を持つように照射され、楔形補正領域によって、この光軸と直交する試料に対する焦点面が形成される。このため、透明基板における試料に対して、試料の厚さ方向に沿った画像光学系などの運動が不要で、高速に試料内部のすべての厚さ方向に合焦した情報を得ることができる。これにより、試料の体積観察や三次元情報の取得を容易に行うことができる。

また、本発明に係る顕微鏡において、前記楔形補正領域は、前記透明基板上の前記画像光学系側に配置され、該画像光学系からの前記照射光の入射面が前記焦点面と平行となるとともに、前記透明基板への前記照射光の出射面が前記透明基板の面と平行となる楔形に形成された光透過性を有する楔形補正板からなる。

また、本発明に係る顕微鏡において、前記透明基板は、二次元的な移動方向へ移動可能に配置され、前記画像光学系は、前記試料への照射光の照射時に相対移動可能に構成されている。

また、本発明に係る顕微鏡において、前記画像光学系は、前記透明基板が前記移動方向へ移動しない場合に、該移動方向と同じ方向および前記焦点面と平行な方向のいずれかに相対移動可能に構成されている。

また、前記楔形補正板は、前記透明基板の面上に、当該透明基板と相対移動可能に配置されている。

また、前記楔形補正板は、前記画像光学系が前記焦点面と平行な方向に移動する場合に、前記透明基板と相対移動しないように配置される。

また、本発明に係る顕微鏡において、前記画像光学系は、前記試料への照射光の照射時に、前記照射光を照射しつつ前記平行な方向へ移動することによって、前記照射光の焦点の移動軌跡により形成される前記焦点面における前記試料の三次元情報を取得する。

また、本発明に係る顕微鏡において、前記画像光学系と前記透明基板を挟んで反対側に配置され、前記照射光の光軸と平行な光軸の照明光を照射する照明系と、前記楔形補正領域と前記照射光の光軸に対して前記透明基板を挟んで対称となるように設けられ、かつ前記透明基板の屈折率と同等の屈折率を有し、前記照明系からの前記照明光の光軸に対して前記焦点面が直交する配置となるように楔形に設けられた副楔形補正領域をさらに備えて構成されていてもよい。

この場合、前記副楔形補正領域は、前記透明基板上の前記照明系側に配置され、該照明系からの前記照明光の入射面が前記焦点面と平行となるとともに、前記透明基板への前記照明光の出射面が前記透明基板の面と平行となる楔形に形成された光透過性を有する副楔形補正板からなる。

また、本発明に係る顕微鏡において、前記楔形補正領域および前記副楔形補正領域は、前記試料を包含する液体層により構成されていてもよい。

本発明に係る三次元情報取得方法は、試料に照射光を照射してその焦点面の光により光透過性の試料の三次元情報を取得する三次元情報取得方法であって、透明基板の屈折率と同等の屈折率を有し、前記透明基板に支持された前記試料に対して、前記画像光学系からの前記照射光の光軸が前記透明基板に対して所定の傾斜を持つとともに該光軸に対して直交する前記焦点面が形成されるような楔形の楔形補正領域を設け、前記画像光学系から前記照射光を前記楔形補正領域を介して照射して前記焦点面の光を読み取って前記試料の三次元情報を取得することを特徴とする。

上記構成によれば、透明基板に支持された試料に対して、画像光学系からの照射光の光軸が透明基板に対して所定の傾斜を持つとともにこの光軸に対して直交する焦点面が形成されるような楔形補正領域を設けた上で、照射光を楔形補正領域を介して照射して焦点面の光を読み取って試料の三次元情報を取得する。このため、透明基板における試料に対して、試料の厚さ方向に沿った運動が不要で、高速に試料内部のすべての厚さ方向に合焦した情報を得て試料の三次元情報を取得することができる。

また、本発明に係る三次元情報取得方法において、前記透明基板は、二次元的な移動方向に移動可能に配置され、前記画像光学系は、前記試料への照射光の照射時に、前記移動方向と同じ方向および前記焦点面と平行な方向へ移動可能に構成され、前記試料が前記画像光学系の視界外にわたって存する場合は、前記焦点面の光を前記画像光学系を前記平行な方向に動かすことにより読み取って前記試料の三次元情報を取得するとともに、前記透明基板を前記移動方向に所定量動かして再度前記画像光学系を動かし、前記試料の三次元情報を取得する構成とされていてもよい。

以上のように本発明によれば、試料の厚さ方向に沿った運動が不要で高速に試料内部のすべての厚さ方向に合焦した情報を得て、試料の体積観察や三次元情報の取得を容易に行うことができる顕微鏡および三次元情報取得方法を提供することができる。

以下に、本発明に係る顕微鏡および三次元情報取得方法の実施の形態について添付の図面に基づいて説明する。

図１は、本発明の一実施形態に係る顕微鏡の例を示す構成図である。図１に示すように、顕微鏡１は、例えば細胞などの光透過性の試料が内在する透明基板３０と、この透明基板３０に照射された照射光による焦点面３１の光を読み取って試料の画像に基づく三次元情報を取得する画像光学系１０と、この画像光学系１０から透明基板３０に向けて照射される光を焦点面３１に結像する対物レンズ２１と、透明基板３０の上面３２上の画像光学系１０側に配置される楔形補正領域としての楔形補正板４０とを備えて構成されている。

なお、この顕微鏡１においては、画像光学系１０は、例えば光軸１０ａが透明基板３０の図中矢印Ｘ，Ｙ方向の二次元的な移動方向と平行な上面３２に対して角度θ１の傾斜を持つとともに、透明基板３０において形成される焦点面３１が透明基板３０の上面３２に対して角度θ２を持つように配置されている。また、画像光学系１０は、例えば光軸１０ａが透明基板３０の上面３２と斜交する焦点面３１に対して垂直となる（直交する）ように配置されている。

また、図示は省略するが、画像光学系１０の光軸１０ａが鉛直方向に配置されるとともに、透明基板３０の上面３２がこの光軸１０ａに対して所定の傾斜を持つように配置されてもよい。この場合、後述する楔形補正板４０の光の入射面４１は鉛直方向と直交する平行方向に沿って配置され、透明基板３０は、傾斜状態のまま図中矢印Ｘ，Ｙ方向の移動方向に移動可能に配置される。

そして、透明基板３０は、（Ａ）上述した平行状態あるいは傾斜状態のいずれにおいても、例えば上述した図中矢印Ｘ，Ｙ方向の二次元的な移動方向に移動可能に配置され、画像光学系１０および対物レンズ２１は、（Ｂ）試料への照射光の照射時に、例えばこの移動方向と同じ方向（すなわち、Ｘ，Ｙ方向）および（Ｃ）焦点面３１と平行な方向（すなわち、Ｘ’方向）へ移動可能に構成されている。なお、「移動可能に」とは「移動することができる」の意であるため、試料の観察状況や顕微鏡１の使用状況如何によっては画像光学系１０および対物レンズ２１、透明基板３０、楔形補正板４０などの各構成部は、当然に移動しなくてもよい場合があることを含むものである。

具体的には、本例の顕微鏡１にて観察される試料は、その種類によって、（１）試料が画像光学系１０の視界内のみに存する場合、（２）試料が画像光学系１０の少なくとも視界外に存する場合、（３）試料が画像光学系１０の視界外に存し、かつＸ，Ｙ方向にわたって存する場合、（４）試料がＸ，Ｙ方向にわたって存する場合、などが考えられる。

例えば、一つ例を挙げると、上記（２）の試料が画像光学系１０の少なくとも視界外に存する場合には、焦点面３１が画像光学系１０の視界（視野）よりも長い（大きい）場合（すなわち、試料の厚みが大きい場合）などが該当する。このようなときは、試料の全部の断面を観察しようとすると、例えば画像光学系１０を図中矢印Ｘ’方向へ移動させることとなる。

そして、試料と透明基板３０、画像光学系１０および対物レンズ２１の移動との関係（移動の種類）を考慮すると、試料が上記（１）の状態のときはこれらの移動はなしで、試料が上記（２）の状態のときは上記（Ｃ）の移動が行われる。また、試料が上記（３）の状態のときは上記（Ｃ）の移動と上記（Ａ）あるいは（Ｂ）の移動が行われ、試料が上記（４）の状態のときは上記（Ａ）あるいは（Ｂ）の移動が行われる。

また、楔形補正板４０は、光透過性を有し、画像光学系１０からの光の入射面４１が焦点面３１と平行となるとともに、透明基板３０への光の出射面４２が透明基板３０の上面３２と平行となる楔形の形状で形成され、透明基板３０と同等の屈折率ｎを有する固体物質により構成されている。この楔形補正板４０は、楔形に成形された光透過性部材に液体を充填したものであってもよく、入射面４１の傾斜角度は任意に調整できるものであるとよい。

そして、楔形補正板４０の代わりに楔形補正領域が液体層により構成されている場合は、図示は省略するが、例えば試料が載置された透明基板３０と対物レンズ２１との間を液体層で浸して、透明基板３０の上面３２と対物レンズ２１の出射面との配置関係が楔形となるように構成してもよい。その他、楔形補正領域は、液浸された対物レンズ２１で直接楔形に試料を挟んだ構成のものや、複数の透明基板３０で試料を液体層とともに楔形となるように支持したもの、あるいは液浸された対物レンズ２１と透明基板３０とで試料を直接楔形に挟んだ構成のものなどが挙げられる。

なお、楔形補正板４０の屈折率ｎは、透明基板３０の屈折率と同一であることが望ましい。この屈折率ｎは、例えば１．４〜１．６程度が好ましく、この程度に設定すれば、実用上十分に試料の画像を得ることができる。

この楔形補正板４０は、透明基板３０、画像光学系１０および対物レンズ２１と、例えば（ａ）連動して移動可能に、（ｂ）連動しないように移動可能に、または（ｃ）移動しないように配置される。上記（ａ）の場合は、画像光学系１０および対物レンズ２１のＸ，Ｙ方向への運動に伴い、透明基板３０に照射される光の照射可能領域を含むように透明基板３０と相対移動可能に配置される。

また、上記（ｂ）の場合は、（ｂ−１）透明基板３０の移動方向へ移動可能に、（ｂ−２）画像光学系１０および対物レンズ２１のＸ，Ｙ方向に移動可能に、または（ｂ−３）Ｘ’方向へ移動可能に配置される。そして、これらに上述した移動の種類の組み合わせを考慮すると、楔形補正板４０は、上記（Ａ）の移動のときは上記（ｃ）の移動しない状態となり、上記（Ｂ）の移動のときは上記（ａ）の移動が行われ、上記（Ｃ）の移動のときは上記（ｃ）の移動しない状態となる。

したがって、このような構成によれば、顕微鏡１における透明基板３０の試料に対する光軸方向の深さ（すなわち、Ｚ軸方向の深度）は、上述したＸ’方向への運動やＸ，Ｙ方向への運動の間中一定に保たれる構造を実現することができる。なお、試料に対する光軸方向深度は、顕微鏡１の視界（画像取得可能範囲）および画像光学系１０の傾斜度合いにより可変させることができる。また、画像光学系１０の傾斜度合いは、楔形補正板４０の楔角度（入射面４１および出射面４２間で形成される角度）に対応して決定することができる。

なお、この顕微鏡１の画像光学系１０としては、一般的なあらゆる顕微鏡（特に、あらゆる方式の共焦点走査顕微鏡）における画像光学系を適用することができる。すなわち、例えば透過光、反射光あるいは蛍光を用いることができる共焦点走査顕微鏡や、蛍光レーザ走査型共焦点顕微鏡、ニポウディスク方式やＤＭＤ方式を採用した共焦点走査顕微鏡など、すべての顕微鏡の画像光学系を用いることができる。

このような前提の下、一例として本例の画像光学系１０は、例えば光源１１と、コリメータレンズ１２と、偏光板１３と、ピンホール１４と、偏光ビームスプリッタ１５とを備えている。また、画像光学系１０は、結像レンズ１６と、１／４λ板１７と、ピンホール１８と、リレーレンズ１９と、ＣＣＤ素子２０とを備えている。

光源１１は、例えば照射光としてのレーザ光を出力するレーザダイオードなどにより構成され、試料に照射される励起光であるレーザ光を所定の周波数で出力する。コリメータレンズ１２は、光源１１からのレーザ光を平行光にする。偏光板１３は、コリメータレンズ１２を通過したレーザ光を一つの方向に振動する直線偏光に変える。そして、ピンホール１４は、このコリメータレンズ１２を通って平行光になった位置（結像レンズ１６の焦点距離の位置）に配置される。

偏光ビームスプリッタ１５は、偏光板１３を通して入射した光をその偏光成分により分離して、Ｐ偏光成分を透過させるとともにＳ偏光成分を反射させるものである。この偏光ビームスプリッタ１５と偏光板１３、および１／４λ板１７を使用していることにより、明るさ不足の改善や顕微鏡の構成要素の表面からの反射光による干渉効果などを低減することができ、鮮明に試料を観察することが可能となる。

この偏光ビームスプリッタ１５により反射された光は、結像レンズ１６および１／４λ板１７を通って円偏光に変換され、対物レンズ２１により楔形補正板４０を通して透明基板３０に照射され、透明基板３０の上面３２に対して斜めに形成された焦点面３１に結像される。

そして、透明基板３０の焦点面３１からの戻り光は、再び楔形補正板４０、対物レンズ２１、１／４λ板１７および結像レンズ１６を通って直線偏光に変換された後、偏光ビームスプリッタ１５を透過してピンホール１８に導かれる。

ピンホール１８は、ＣＣＤ素子２０にて焦点位置のみの情報を得るために、焦点以外からの反射光を除去する役割を担う。リレーレンズ１９は、ピンホール１８を通過した光をＣＣＤ素子２０上に結像する。ＣＣＤ素子２０は、ピンホール１９を通って撮像面に結像された光を受光して試料の三次元情報を取得する。このような試料の三次元情報の取得に際しては、試料が画像光学系１０の視界外に存する場合には、焦点面３１に沿って図示しない駆動系により画像光学系１０および対物レンズ２１をＸ，Ｙ方向あるいはＸ’方向に移動させることにより行われる。

そして、例えば試料が上記（３）の画像光学系１０の視界外に存し、かつＸ，Ｙ方向にわたって存する場合には、焦点面３１に沿った運動が透明基板３０を移動方向に一つの視界分移動させることにより再度継続され、これによって試料のすべての厚さ方向に合焦した情報に基づく三次元情報を焦点深度を変えずに容易に取得することができる。なお、画像光学系１０は、上述したように、通常の顕微鏡、共焦点顕微鏡および干渉顕微鏡などのあらゆる構成を採用することができる。

このような構成の顕微鏡１によれば、画像光学系１０の光軸１０ａおよび透明基板３０における焦点面３１が所定の傾斜を持って構成されている。また、楔形補正板４０が透明基板３０と同等の屈折率ｎを有して構成されている。このため、従来の共焦点顕微鏡のように光軸に沿って透明基板に形成される焦点面を深さ方向に動かしたり画像光学系を深さ方向に動かしたり、あるいは対物レンズや画像処理によって補正をしたりして試料の情報を得ることなく（すなわち、画像光学系１０などの上下運動を伴わずに）、高速に試料内部のすべての厚さ方向に合焦した情報を得て試料の体積観察を行うことができる。

また、試料が上記（２）の画像光学系１０の少なくとも視界外に存する場合であっても、画像光学系１０および対物レンズ２１や透明基板３０などの移動は、上述したように二次元的に行えばよいだけであり、同様に高速な試料の体積観察や分布観察、三次元情報の取得などを容易に行うことができる。

また、この顕微鏡１によれば、画像光学系１０を垂直あるいは傾斜させて楔形補正板４０を透明基板３０の上面３２上に配置するという簡単な構成により、従来のような透明基板３０や画像光学系１０などの上下運動を伴わずに試料内部のすべての厚さ方向に合焦した情報に基づく三次元情報を得ることができるため、装置全体の小型化や軽量化を実現しつつ低コスト化を図ることが可能となる。

特に、この顕微鏡１により得られる試料の焦点面３１における画像は、焦点面３１が試料に対して斜めに形成されるため、例えば試料がＸ，Ｙ方向に長く丸棒状の外形を有している場合は、斜めにスライスして楕円状に切り取ったような画像となる。したがって、透明基板３０のＸ，Ｙ方向に画像光学系１０の視界内に収まる複数の試料が存している場合などに、これらの試料の分布状態などを画像光学系１０の光軸に沿った運動を伴わなくても情報として得ることができ、立体的／空間的な試料の位置関係などを容易に把握可能となる。

図２は、本発明の他の実施形態に係る顕微鏡の例を示す構成図である。なお、以降において、既に説明した部分と重複する箇所には同一の符号を付して説明を省略する。図２に示すように、この顕微鏡１Ａは、上述した顕微鏡１とは、レーザ光の光軸１０ａと平行な光軸の照明光（透過光）を照射する照明系６０と、この照明系６０側の透明基板３０の下面３３上に配置された副楔形補正領域としての副楔形補正板５０とを備えた構成となっている点が相違している。

照明系６０は、画像光学系１０と透明基板３０を挟んで反対側に配置され、例えば光源６１と、コリメータレンズ６３とを備えて構成されている。副楔形補正板５０は、楔形補正板４０とレーザ光の光軸１０ａに対して透明基板３０を挟んで対称となるように配置され、楔形補正板４０と同様に透明基板３０と同等の屈折率ｎを有する固体物質、あるいは上述したような構成の液体層により構成されている。

副楔形補正板５０は、照明系６０の光源６１からの照明光の入射面５１が焦点面３１と平行となるとともに、透明基板３０への照明光の出射面５２が透明基板３０の下面３３と平行となる楔形の形状で形成されている。なお、この副楔形補正板５０は、試料観察を光源６１からの透過光によって行うときの照明系６０の照明光の歪みを最小限に抑えるために用いられるが、必須の構成ではなく必ずしも配置されていなくてもよい。その他の構成については、上述した顕微鏡１と同様であるため、ここでは説明を省略する。

このように構成された顕微鏡１Ａによれば、上述した顕微鏡１と同様の効果、すなわち、試料内部のすべての厚さ方向に合焦した情報を得て試料の三次元情報を容易に取得することができるとともに、透明基板３０の裏側照明システムを実現することができる。

図３は、本発明の一実施形態に係る顕微鏡１を用いた試料の三次元情報取得工程の例を示すフローチャートである。なお、ここでは、説明を簡単にするため、本発明に特に関わる処理以外は、説明を省略している場合があるものとする。図３に示すように、まず、試料が支持された透明基板３０の画像光学系１０側の上面３２上に、楔形補正板４０を配置する（ステップＳ１）。次に、透明基板３０の上面３２に対して所定の傾斜を持って配置された画像光学系１０の光源１１からレーザ光を出射して、対物レンズ２１および楔形補正板４０を通して所定の傾斜でレーザ光を透明基板３０に照射する（ステップＳ２）。

そして、例えば上記（２）の試料が画像光学系１０の少なくとも視界外に存する場合には、上述した移動の種類を考慮して、レーザ光を照射したまま画像光学系１０および対物レンズ２１を焦点面３１と平行な方向（図１，２中Ｘ’方向）に移動させたり、画像光学系１０および対物レンズ２１を移動させずに透明基板３０を二次元的な移動方向（図１，２中Ｘ，Ｙ方向）に移動させたり、透明基板３０を移動させずに画像光学系１０および対物レンズ２１をこの移動方向に移動させたりして、透明基板３０の焦点面３１における反射光を画像光学系１０のＣＣＤ素子２０により読み取って、試料内部のすべての厚さ方向に合焦した情報に基づく試料の三次元情報を取得し（ステップＳ３）、三次元情報の取得を終了するか否かを判断して（ステップＳ４）、終了する場合は（ステップＳ４のＹ）、本フローチャートによる一連の三次元情報取得工程を終了する。

一方、終了しない場合であって（ステップＳ４のＮ）、例えば上記（３）の試料が画像光学系１０の視界外に存し、かつＸ，Ｙ方向にわたって存する場合には、透明基板３０を移動方向（図１，２中Ｘ，Ｙ方向）に移動させて（ステップＳ５）、上記ステップＳ３に移行して画像光学系１０および対物レンズ２１をＸ’方向に移動させたり、透明基板３０をＸ，Ｙ方向に移動させたり、画像光学系１０および対物レンズ２１をＸ，Ｙ方向に移動させたりして試料の三次元情報を取得し、以降の処理を繰り返す。

なお、上記（１）の試料が画像光学系１０の視界内のみに存する場合には、上記Ｘ’方向やＸ，Ｙ方向への運動は不要であることは上述した通りである。また、画像光学系１０などや透明基板３０を、例えば画像光学系１０の視界内において、視界ごとに移動させないで（すなわち、一画面分移動させないで）、細かなピッチで移動させて試料を観察した場合は、図１あるいは図２に破線で示すようなスライス面が沢山取れ、試料の内部をより詳しく観察することが可能となる。

このような試料の三次元情報取得工程によれば、試料を支持する透明基板３０の上面３２上に楔形補正板４０を配置した上で、レーザ光がその光軸１０ａと焦点面３１とが透明基板３０の上面３２に対してそれぞれ所定の傾斜を持つように楔形補正板４０を介して照射して、試料の三次元情報を取得することができる。また、例えば上記（２）の試料が画像光学系１０の視界外に存する場合には、例えば透明基板３０を移動方向に動かしたり、画像光学系１０などをＸ，Ｙ方向あるいはＸ’方向に動かしたりするだけで、同様に試料の三次元情報を取得することができる。このため、透明基板３０における試料の厚さ方向に沿った運動が不要で、高速に試料内部のすべての厚さ方向に合焦した情報を得て試料の三次元情報を容易に取得することができる。

以上述べたように、本発明の実施形態に係る顕微鏡１，１Ａおよび三次元情報取得方法によれば、試料内部のすべての厚さ方向に合焦した情報を試料の厚さ方向に沿った運動を不要にしつつ高速かつ容易に得て試料の体積観察や三次元情報の取得を行うことができる。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡の例を示す構成図である。 本発明の他の実施形態に係る顕微鏡の例を示す構成図である。 本発明の一実施形態に係る顕微鏡を用いた試料の三次元情報取得工程の例を示すフローチャートである。 従来の共焦点走査顕微鏡の例を説明するための構成図である。

符号の説明

１，１Ａ…顕微鏡、１０…画像光学系、１１…光源、１２…コリメータレンズ、１３…偏光板、１４…ピンホール、１５…偏光ビームスプリッタ、１６…結像レンズ、１７…１／４λ板、１８…ピンホール、１９…リレーレンズ、２０…ＣＣＤ素子、２１…対物レンズ、３０…透明基板、３１…焦点面、３２…上面、３３…下面、４０…楔形補正板、５０…副楔形補正板、６０…照明系。

Claims (12)

1. 試料に照射光を照射してその焦点面の光により光透過性の試料を観察する顕微鏡であって、
   透明基板に支持された前記試料に対して、前記照射光をその光軸が前記透明基板に対して所定の傾斜を持つように照射して、前記焦点面の光を読み取って前記試料の三次元情報を取得する画像光学系と、
   前記透明基板の屈折率と同等の屈折率を有し、前記透明基板に支持された前記試料に対して、前記画像光学系からの前記照射光の光軸に対して直交する前記焦点面が形成されるように楔形に設けられた楔形補正領域とを備えた
   ことを特徴とする顕微鏡。
2. 前記楔形補正領域は、前記透明基板上の前記画像光学系側に配置され、該画像光学系からの前記照射光の入射面が前記焦点面と平行となるとともに、前記透明基板への前記照射光の出射面が前記透明基板の面と平行となる楔形に形成された光透過性を有する楔形補正板からなることを特徴とする請求項１記載の顕微鏡。
3. 前記透明基板は、二次元的な移動方向へ移動可能に配置され、
   前記画像光学系は、前記試料への照射光の照射時に相対移動可能に構成されていることを特徴とする請求項１または２記載の顕微鏡。
4. 前記画像光学系は、前記透明基板が前記移動方向へ移動しない場合に、該移動方向と同じ方向および前記焦点面と平行な方向のいずれかに相対移動可能に構成されていることを特徴とする請求項３記載の顕微鏡。
5. 前記楔形補正板は、前記透明基板の面上に、当該透明基板と相対移動可能に配置されていることを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項記載の顕微鏡。
6. 前記楔形補正板は、前記画像光学系が前記焦点面と平行な方向に移動する場合に、前記透明基板と相対移動しないように配置されることを特徴とする請求項４または５記載の顕微鏡。
7. 前記画像光学系は、前記試料への照射光の照射時に、前記照射光を照射しつつ前記平行な方向へ移動することによって、前記照射光の焦点の移動軌跡により形成される前記焦点面における前記試料の三次元情報を取得することを特徴とする請求項３〜６のいずれか１項記載の顕微鏡。
8. 前記画像光学系と前記透明基板を挟んで反対側に配置され、前記照射光の光軸と平行な光軸の照明光を照射する照明系と、
   前記楔形補正領域と前記照射光の光軸に対して前記透明基板を挟んで対称となるように設けられ、かつ前記透明基板の屈折率と同等の屈折率を有し、前記照明系からの前記照明光の光軸に対して前記焦点面が直交する配置となるように楔形に設けられた副楔形補正領域をさらに備えたことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載の顕微鏡。
9. 前記副楔形補正領域は、前記透明基板上の前記照明系側に配置され、該照明系からの前記照明光の入射面が前記焦点面と平行となるとともに、前記透明基板への前記照明光の出射面が前記透明基板の面と平行となる楔形に形成された光透過性を有する副楔形補正板からなることを特徴とする請求項８記載の顕微鏡。
10. 前記楔形補正領域および前記副楔形補正領域は、前記試料を包含する液体層により構成されていることを特徴とする請求項８または９記載の顕微鏡。
11. 試料に照射光を照射してその焦点面の光により光透過性の試料の三次元情報を取得する三次元情報取得方法であって、
    透明基板の屈折率と同等の屈折率を有し、前記透明基板に支持された前記試料に対して、前記画像光学系からの前記照射光の光軸が前記透明基板に対して所定の傾斜を持つとともに該光軸に対して直交する前記焦点面が形成されるような楔形の楔形補正領域を設け、
    前記画像光学系から前記照射光を前記楔形補正領域を介して照射して前記焦点面の光を読み取って前記試料の三次元情報を取得する
    ことを特徴とする三次元情報取得方法。
12. 前記透明基板は、二次元的な移動方向に移動可能に配置され、前記画像光学系は、前記試料への照射光の照射時に、前記移動方向と同じ方向および前記焦点面と平行な方向へ移動可能に配置され、前記試料が前記画像光学系の視界外にわたって存する場合は、前記焦点面の光を前記画像光学系を前記平行な方向に動かすことにより読み取って前記試料の三次元情報を取得するとともに、前記透明基板を前記移動方向に所定量動かして再度前記画像光学系を動かし、前記試料の三次元情報を取得することを特徴とする請求項１１記載の三次元情報取得方法。

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