JP5065273B2 - Ｈｌａ−ａ２４分子結合性ｋｉｆ由来ペプチド - Google Patents
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Description
本発明は、HLA-A24陽性グリオーマ患者に対する特異的免疫療法に有用なKIF由来ペプチドに関する。
悪性グリオーマ患者の予後および生存率は、効果的な併用療法が開発されているにもかかわらずここ10年以上それほど改善されていない（非特許文献１、２）。それゆえ新しい治療法を開発する必要があり、特異的免疫療法はその選択肢の1つである。腫瘍免疫における近年の進歩により、いくつかの癌抗原および細胞傷害性T細胞に認識されるそれらのエピトープペプチドが同定されている（非特許文献３）。グリオーマ関連抗原およびそれらに由来するペプチドもまた報告されているが、その数は非常に限られている（非特許文献４−６）。
Karpeh MS, Kelsen DP, Tepper JE (2001) Cancer of the stomach. In: Devita VT Jr. editor. Cancer: principles ＆ practice of oncology. 6th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; p. 1092-1121 Stewart LA (2002) Chemotherapy in adult high-grade glioma: s systematic review and meta-analysis of individual patient data from 12 randomized trials. Lancet 359: 1011-1018 Renkvist N, Castelli C, Robbins PF, Parmiani G (2001) A listing of human tumor antigens recognized by T cells. Cancer Immuno Immunother 50: 3-15 Liu G, Ying H, Zeng G, Wheeler CJ, Black KL, Yu JS (2004) HER-2, gp100, and MAGE-1 are expressed in human glioblastoma and recognized by cytotoxic T cells. Cancer Res 64: 4980-4986 Murayama K, Kobayashi T, Imaizumi T, Mastunaga K, Kurimoto T, Shigemori M, Shichijo S, Itoh K (2000) Expression of the SART3 tumor-rejection antigen in brain tumors and induction of cytotoxic T lymphocytes by its peptides. J Immunother 23: 511-518 Tsuda N, Nonaka Y, Shichijo S, Yamada A, Ito M, Maeda Y, Harada M, Kamura T, Itoh K (2002) UDP-Gal: bGlcNAc b1, 3-galactosyltransferase, polypeptide 3 (GALT3) is a tumour antigen recognized by HLA-A2-restricted cytotoxic T lymphocytes from patients with brain tumour. Br J Cancer 87: 1006-1012
Karpeh MS, Kelsen DP, Tepper JE (2001) Cancer of the stomach. In: Devita VT Jr. editor. Cancer: principles ＆ practice of oncology. 6th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; p. 1092-1121 Stewart LA (2002) Chemotherapy in adult high-grade glioma: s systematic review and meta-analysis of individual patient data from 12 randomized trials. Lancet 359: 1011-1018 Renkvist N, Castelli C, Robbins PF, Parmiani G (2001) A listing of human tumor antigens recognized by T cells. Cancer Immuno Immunother 50: 3-15 Liu G, Ying H, Zeng G, Wheeler CJ, Black KL, Yu JS (2004) HER-2, gp100, and MAGE-1 are expressed in human glioblastoma and recognized by cytotoxic T cells. Cancer Res 64: 4980-4986 Murayama K, Kobayashi T, Imaizumi T, Mastunaga K, Kurimoto T, Shigemori M, Shichijo S, Itoh K (2000) Expression of the SART3 tumor-rejection antigen in brain tumors and induction of cytotoxic T lymphocytes by its peptides. J Immunother 23: 511-518 Tsuda N, Nonaka Y, Shichijo S, Yamada A, Ito M, Maeda Y, Harada M, Kamura T, Itoh K (2002) UDP-Gal: bGlcNAc b1, 3-galactosyltransferase, polypeptide 3 (GALT3) is a tumour antigen recognized by HLA-A2-restricted cytotoxic T lymphocytes from patients with brain tumour. Br J Cancer 87: 1006-1012
本発明は、グリオーマ患者に対する特異的免疫療法に有用な、グリオーマ関連抗原由来ペプチドを提供することを目的とする。
本発明は、KIF由来ペプチドであって、HLA-A24分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるペプチドを提供する。具体的には、本発明は、配列番号３または１５に示すアミノ酸配列からなるペプチドまたはその誘導体を提供する。また本発明は、本発明のペプチドまたは誘導体をコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクターを提供する。
本発明はまた、本発明のペプチド、誘導体、またはベクターを含むグリオーマを処置または予防するための医薬組成物、特に癌ワクチンである該医薬組成物、を提供する。
さらに、本発明は、HLA-A24分子陽性グリオーマ患者より採取された末梢血単核細胞を本発明のペプチドまたは誘導体と接触させることを含む、グリオーマ反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。
また、本発明は、HLA-A24分子陽性グリオーマ患者に由来する抗原提示能を有する細胞に、本発明のペプチドまたは誘導体を取り込ませること、または本発明のベクターを導入することを含む、KIF由来ペプチドまたはその誘導体とHLA-A24分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製する方法を提供する。
本発明はさらに、本発明のペプチド、誘導体またはベクターをグリオーマ患者に投与することを含む、グリオーマを処置または予防する方法、特に配列番号３または１５に示すアミノ酸配列からなるペプチドを癌ワクチンとしてグリオーマ患者に投与することを含む、グリオーマを処置または予防する方法を提供する。
本発明はさらに、グリオーマを処置または予防するための医薬組成物の製造のための本発明のペプチド、誘導体またはベクターの使用、特に、グリオーマを処置または予防するための配列番号３または１５に示すアミノ酸配列からなるペプチドの癌ワクチンの製造のための使用を提供する。
本発明により、HLA-A24陽性癌患者においてグリオーマ細胞を傷害しうるCTLを誘導することができるKIF由来ペプチドが提供された。本発明のKIF由来ペプチドは、HLA-A24陽性グリオーマ患者に対する特異的免疫療法を可能とする。
本発明において「KIF由来ペプチド」または「KIFペプチド」とは、キネシンスーパーファミリータンパク質であるKIF1C、KIF3C、またはKIF21Bのアミノ酸配列の一部からなるペプチド断片を意味する。KIF1C、KIF3C、およびKIF21Bのアミノ酸配列は、Genebankにおいて開示されている（それぞれNM_006612、NM_002254、およびXM_371332）。
「HLA-A24分子に結合できる」とは、ペプチドがHLA-A24分子と複合体を形成し細胞表面に提示されうることを意味する。一般にHLA分子に結合するペプチドは、HLAの型に依存する規則性あるアミノ酸配列を有する。その規則性あるアミノ酸配列は、結合モチーフと呼ばれる。HLA-A24分子に対する結合モチーフとは、N末端から第２番目のアミノ酸がチロシンまたはフェニルアラニンであり、C末端アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンである配列をいう。HLA-A24分子結合モチーフを有するペプチドのHLA-A24分子に対する結合は、Bioinformatics and Molecular Analysis Section（NIH, Bethesda, MD）等のコンピューター解析により決定することができる（Parker KC, et al., J. Immunol., 152: 163-175, 1994）。
ペプチドが「細胞性免疫に認識される」とは、そのペプチドが特異的なCTLに認識される、言い換えればペプチド特異的CTLを誘導する能力を有することを意味する。ペプチド特異的CTLを誘導する能力を有するか否かは、例えば、ペプチドで刺激した末梢血単核細胞（PBMC）が対応ペプチドをパルスした抗原提示細胞に反応してインターフェロン（IFN）-γのようなサイトカインを産生するか否かをELISA法等で測定して調べることができる。また、誘導されたCTLの細胞傷害活性は、51Cr放出試験等により確認することができる。CTLによる認識性を考慮すると、本発明のペプチドのアミノ酸残基数は８〜１４個の範囲内であることが好ましく、より好ましくは８〜１１個、特に好ましくは９または１０個である。
ペプチドが「液性免疫に認識される」とは、そのペプチドに特異的なIgGが生体内に存在すること、つまりはペプチド特異的IgGが血漿から検出されることを意味する。細胞性免疫と液性免疫の両方に認識されるペプチドは、免疫原性が高くCTL誘導能に優れると期待されるため、本発明のペプチドとして好ましい。血漿中の特異的IgGは、常套的なELISA法等によって測定することができる。
本発明のペプチドとして特に好ましいのは、IYCERVRDLL（KIF1C 149-158、配列番号３）またはKYKAMESKL（KIF3C 512-520、配列番号１５）のアミノ酸配列からなるペプチドである。
本発明において、KIF由来ペプチドの誘導体とは、KIF由来ペプチドのアミノ酸配列において１または２個のアミノ酸の置換、欠失および／または付加が導入されたアミノ酸配列からなり、かつHLA-A24分子に結合でき、細胞性免疫に認識されるペプチドを意味する。誘導体が所望の性質を有するか否かは、前述の方法により調べることができる。
アミノ酸の置換は、ペプチドの性質を変化させない観点から、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノおよび芳香族アミノ酸等）の間で行うことが好ましい。アミノ酸の欠失および付加は、誘導体のアミノ酸残基数が８〜１１個となるように行うことが好ましい。
また、アミノ酸の置換、欠失および／または付加は、HLA分子結合モチーフ上許容されるものが好ましい。すなわち、アミノ酸の置換、欠失および／または付加は、誘導体のアミノ酸配列のN末端から第２番目のアミノ酸がチロシンまたはフェニルアラニンであり、C末端アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンとなるように行うことが好ましい。
本発明に特に好適な誘導体は、配列番号３のアミノ酸配列のN末端から第２番目のアミノ酸をフェニルアラニンで置換し、および／またはC末端アミノ酸をイソロイシンまたはフェニルアラニンで置換したアミノ酸配列からなる誘導体、および配列番号１５のアミノ酸配列のN末端から第２番目のアミノ酸をフェニルアラニンで置換し、および／またはC末端アミノ酸をイソロイシンまたはフェニルアラニンで置換したアミノ酸配列からなる誘導体である。
本発明のペプチドおよび誘導体を構成するアミノ酸は、天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログであってよく、アミノ酸アナログとしては、アミノ酸のN-アシル化物、O-アシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等が挙げられる。本発明のペプチドおよび誘導体は、機能を著しく損なわない限りにおいてその構成アミノ酸またはカルボキシル基などが修飾されていてもよい。修飾は、N末端や遊離のアミノ基にホルミル基、アセチル基、t-ブトキシカルボニル基等を結合するものや、C末端や遊離のカルボキシル基にメチル基、エチル基、t-ブチル基、ベンジル基等を結合するものが挙げられる。
本発明のペプチドおよび誘導体は、通常のペプチド合成により製造することができる。そのような方法として、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York，1966； The Proteins, Vol2, Academic Press Inc.,New York, 1976；ペプチド合成、丸善（株）、1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）、1985；医薬品の開発続 第十四巻・ペプチド合成、広川書店、1991）などに記載されている方法が挙げられる。
本発明のペプチドおよび誘導体は、本発明のペプチドまたは誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチドが細胞内で断片化されることで生じる場合もある。本発明は、そのような態様で本発明のペプチドまたは誘導体を利用することも包含する。本発明のペプチドまたは誘導体を提供できる限り、ポリペプチドのアミノ酸残基数およびアミノ酸配列は任意である。
この度、本発明者らは、KIF1C、KIF3C、およびKIF21Bが悪性グリオーマ組織において高発現していることを発見した。グリオーマとは、神経細胞を支持するグリア細胞が腫瘍に変化したものをいう。本発明のペプチドおよび誘導体は、HLA-A24分子陽性グリオーマ細胞を特異的に傷害するCTLを効率的に誘導し増殖させることができ、グリオーマ患者の治療に有用である。
本発明は、本発明のペプチドまたは誘導体を含む、グリオーマを処置または予防するための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、１種類のペプチドまたは誘導体を含むものであってもよく、２種類以上のペプチドおよび／または誘導体を組み合わせて含んでも良い。癌患者のCTLは相異なる癌抗原ペプチドを認識する細胞の集合なので、複数種類のペプチドおよび／また誘導体を組み合わせて使用するとさらに効果的である。本発明のペプチド以外の癌抗原ペプチドと組み合わせても良い。
本発明の医薬組成物は、ペプチドまたは誘導体に加えて、医薬上許容される担体などを含むことができる。担体としては、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が使用できる。本発明の医薬組成物は、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤などであってもよい。また、免疫応答が効果的に成立するように、従来からワクチン投与に用いられることが知られているアジュバントとともに投与することもできる。投与方法は、例えば皮内投与または皮下投与などである。
本発明の医薬組成物は、癌ワクチンとして使用可能である。投与量は、疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常医薬組成物中のペプチドまたは誘導体の量は、０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ、より一層好ましくは０．１〜５ｍｇまたは０．５〜３ｍｇである。これを数日、数週または数ヶ月に１回、１〜３年間継続して投与することが好ましい。
本発明は、本発明のペプチドまたは誘導体をコードする核酸分子および前記核酸分子を含むベクターを提供する。本発明の核酸分子を含むベクターは、抗原提示細胞に導入されると本発明のペプチドまたは誘導体を発現し、それらをHLA分子との複合体として細胞表面に提示させる。この抗原提示細胞は、ペプチド特異的にグリオーマ細胞を傷害するCTLを効率的に増殖させることができる。
本発明の核酸分子を組み込むベクターとしては、各種プラスミドおよびウィルスベクター、例えばアデノウィルス、アデノ関連ウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等が挙げられる（Liu M, Acres B, Balloul JM, Bizouarne N, Paul S, Slos P, Squiban P. Gene-based vaccines and immunotherapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A 101 Suppl, 14567-71, 2004）。ベクターの調製方法は当業界にて周知である（Molecular Cloning: A laboraroy manual, 2nd edn. New York, Cold Spring Harbor Laboratory）。
本発明のベクターは、患者体内の抗原提示細胞において本発明のペプチドまたは誘導体を発現させるため患者に投与することができる。あるいは、患者体外において例えば患者由来の樹状細胞に本発明のベクターを導入し、本発明のペプチドまたは誘導体を発現させた細胞を患者に戻しても良い。これら方法は当業界において周知である（Hrouda D, Dalgleish AG. Gene therapy for prostate cancer. Gene Ther 3: 845-52, 1996）。
本発明のベクターを患者に投与する場合、投与量は疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により変化するが、例えばDNA量として、0.1μg〜100mg、好ましくは1μg〜50mgである。投与方法には、静脈注射、皮下投与、皮内投与等が挙げられる。
本発明のCTL誘導方法は、HLA-A24分子陽性グリオーマ細胞を傷害するCTLを誘導するものである。CTLについて「グリオーマ反応性」とは、グリオーマ細胞上の癌抗原ペプチドとHLA分子との複合体を認識し、その細胞を傷害する能力を有することを意味する。CTLの誘導は、例えば、HLA-A24陽性グリオーマ患者から採取されたPBMCを、in vitroで本発明のペプチドまたは誘導体の存在下培養することにより行う。本発明のCTL誘導方法は、PBMCを採取した患者の体内に誘導したCTLを戻して癌細胞を傷害する養子免疫療法に有用である。
本発明のCTL誘導キットは、前記CTL誘導方法を実施するために用いられる。本発明のキットは、本発明のペプチドおよび誘導体を１または２種類以上含み、さらに適当な緩衝液や培地などを含む場合もある。
本発明の抗原提示細胞調製方法は、HLA-A24分子陽性グリオーマ細胞を傷害するCTLを誘導しうる抗原提示細胞を調製するものである。本発明の抗原提示細胞調製方法は、例えば、HLA-A24陽性グリオーマ患者由来の抗原提示能を有する細胞を本発明のペプチドまたは誘導体とともに培養し、そのペプチドまたは誘導体をHLA-A24分子に結合および提示させるにより行う。あるいはそのようなペプチドを発現可能なベクターを、HLA-A24陽性グリオーマ患者由来の抗原提示能を有する細胞に導入し発現させてもよい。抗原提示能を有する細胞は、例えば樹状細胞である。患者由来の樹状細胞は、例えば、患者より採取したPBMCから培養プレート接着細胞を分離し、その細胞をIL-4およびGM-CSFの存在下で約１週間培養することで得られる。本発明の方法により調製された抗原提示細胞は、その細胞表面に提示するペプチドまたは誘導体とHLA-A24分子との複合体を特異的に認識するCTLを誘導することができ、グリオーマ患者に投与された場合患者体内でグリオーマ反応性CTLの誘導を促進することができる。
本発明の抗原提示細胞調製キットは、前記抗原提示細胞調製方法を行うために用いられる。本発明のキットは、本発明のペプチドおよび／または誘導体を１または２種類以上含み、さらに適当な緩衝液や培地などを含む場合もある。
本発明はさらに、本発明のペプチド、誘導体、またはベクターを患者に投与することを含む、グリオーマを処置または予防する方法を提供する。また本発明は、グリオーマを処置または予防するための医薬を製造するための本発明のペプチド、誘導体、またはベクターの使用を提供する。
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれら実施例により制限されるものではない。
1. 材料および方法
1.1 サンプルおよびcDNAマイクロアレイ
サンプルは、手術を受けた52人のグリオーマ患者から得た。本試験は新潟大学倫理委員会の承認を受け、全ての患者から書面による同意を得た。患者は、WHOグレード分類(Kleihues et al, J Neuropathol Exp Neurol 61: 215-225, 2002)によると、グレードIIが16人、グレードIIIが14人、グレードIVが22人であった。遺伝子解析は、AgilentのcDNAマイクロアレイ (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)を用いて行った。全RNA (20μg)を、Agilent direct-label cDNA synthesis kit (Agilent Technologies)を用いて、製造元の説明にしたがい逆転写した。標識化cDNAをQIAquick PCR Purification column (Qiagen, Valencia, CA, USA)により精製し、真空遠心分離により濃縮した。cDNAをハイブリダイゼーションバッファーに懸濁し、Agilent human 1 cDNA microarray (Agilent Technologies)にAgilentのプロトコールにしたがい17時間65℃にてハイブリダイズさせた。2チャンネルcDNAアレイにおいてグリオーマサンプルをランダムに組み合わせることで誤ったグループ間の差が生じないように、各サンプルを個別に標識し、相補色素で標識した正常脳サンプルと共にハイブリダイズした。正常脳サンプルは、各コントロールサンプルから等量のRNAをプールし、各サンプルについて標識することにより得た。さらに、各サンプルについて、シアニン色素スイッチハイブリダイゼーションを行った。正常脳サンプルは、Clontech (Tokyo, Japan)より購入した。チップを5% SSC/0.1% SDS溶液にて洗浄した後、蛍光強度をレーザースキャナーで測定し、Feature Extraction Software (ver. A.4.0.45; Agilent Technologies)を用いて製造元の説明にしたがい解析した。全部で12,729遺伝子を解析した。
1.1 サンプルおよびcDNAマイクロアレイ
サンプルは、手術を受けた52人のグリオーマ患者から得た。本試験は新潟大学倫理委員会の承認を受け、全ての患者から書面による同意を得た。患者は、WHOグレード分類(Kleihues et al, J Neuropathol Exp Neurol 61: 215-225, 2002)によると、グレードIIが16人、グレードIIIが14人、グレードIVが22人であった。遺伝子解析は、AgilentのcDNAマイクロアレイ (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)を用いて行った。全RNA (20μg)を、Agilent direct-label cDNA synthesis kit (Agilent Technologies)を用いて、製造元の説明にしたがい逆転写した。標識化cDNAをQIAquick PCR Purification column (Qiagen, Valencia, CA, USA)により精製し、真空遠心分離により濃縮した。cDNAをハイブリダイゼーションバッファーに懸濁し、Agilent human 1 cDNA microarray (Agilent Technologies)にAgilentのプロトコールにしたがい17時間65℃にてハイブリダイズさせた。2チャンネルcDNAアレイにおいてグリオーマサンプルをランダムに組み合わせることで誤ったグループ間の差が生じないように、各サンプルを個別に標識し、相補色素で標識した正常脳サンプルと共にハイブリダイズした。正常脳サンプルは、各コントロールサンプルから等量のRNAをプールし、各サンプルについて標識することにより得た。さらに、各サンプルについて、シアニン色素スイッチハイブリダイゼーションを行った。正常脳サンプルは、Clontech (Tokyo, Japan)より購入した。チップを5% SSC/0.1% SDS溶液にて洗浄した後、蛍光強度をレーザースキャナーで測定し、Feature Extraction Software (ver. A.4.0.45; Agilent Technologies)を用いて製造元の説明にしたがい解析した。全部で12,729遺伝子を解析した。
1.2 細胞株
本研究では、以下のグリオーマ細胞株を使用した：KNS-81（JCRB Cell Bank, IFO 50359）、KALS-1（JCRB Cell Bank, IFO 50434）、KINGS-1（久留米大学脳神経外科）、Becher、およびNo. 11（JCRB Cell Bank, IFO 50369）。C1R-A24は、HLA-A*2402を発現するC1R リンパ腫の亜細胞株である (熊本大学滝口雅文先生より供与）。
本研究では、以下のグリオーマ細胞株を使用した：KNS-81（JCRB Cell Bank, IFO 50359）、KALS-1（JCRB Cell Bank, IFO 50434）、KINGS-1（久留米大学脳神経外科）、Becher、およびNo. 11（JCRB Cell Bank, IFO 50369）。C1R-A24は、HLA-A*2402を発現するC1R リンパ腫の亜細胞株である (熊本大学滝口雅文先生より供与）。
1.3 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)
全RNAは、RNAzol（商標）B (Tel-Test Inc., Friendswood, TX, USA)を用いて癌細胞株から単離した。cDNAは、SuperScript（商標）Preamplification System for First-Strand cDNA Synthesis (Invitrogen)を用いて調製し、以下のプライマーを用いて増幅した。
PCRは、TaqDNAポリメラーゼを用いて、DNAサーマルサイクラー (iCycler, Bio-Rad laboratories, Hercules, CA, USA)において95℃30秒、60℃30秒、72℃30秒、30サイクルにて行った。PCR産物は、2%アガロースゲルにおける電気泳動により分離した。
全RNAは、RNAzol（商標）B (Tel-Test Inc., Friendswood, TX, USA)を用いて癌細胞株から単離した。cDNAは、SuperScript（商標）Preamplification System for First-Strand cDNA Synthesis (Invitrogen)を用いて調製し、以下のプライマーを用いて増幅した。
1.4 抗ペプチド抗体の測定
抗ペプチド抗体（IgG）のレベルは、Luminex（商標）法により既報のように測定した（Komatsu N et al, Scand J Clin Invest 2004;64:1-11）。詳細には、血漿を、ペプチドを結合したカラーコードビーズ（Luminex Corp., Austin, TX, USA)（25μl）と、プレートシェーカー上にて室温で2時間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を真空分岐装置で洗浄し、ビオチン化ヤギ抗ヒトIgG（BA-3080, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)（100μl）と1時間室温で反応させた。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン標識PE（100μL）（S-866, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA）を各ウェルに加え、プレートシェーカー上にて室温で30分インキュベートした。結合したビーズを3回洗浄し、続いてTween-PBS（100μl）を各ウェルに添加した。その後、各サンプル50μlをLuminex（商標）法により調べた。
抗ペプチド抗体（IgG）のレベルは、Luminex（商標）法により既報のように測定した（Komatsu N et al, Scand J Clin Invest 2004;64:1-11）。詳細には、血漿を、ペプチドを結合したカラーコードビーズ（Luminex Corp., Austin, TX, USA)（25μl）と、プレートシェーカー上にて室温で2時間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を真空分岐装置で洗浄し、ビオチン化ヤギ抗ヒトIgG（BA-3080, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)（100μl）と1時間室温で反応させた。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン標識PE（100μL）（S-866, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA）を各ウェルに加え、プレートシェーカー上にて室温で30分インキュベートした。結合したビーズを3回洗浄し、続いてTween-PBS（100μl）を各ウェルに添加した。その後、各サンプル50μlをLuminex（商標）法により調べた。
1.5 PBMCからのペプチド特異的CTLの誘導
純度＞90%のペプチドを、Hokkaido System Science (Sapporo, Japan)より購入した。インフルエンザ (Flu) ウイルス由来ペプチド（RFYIQMCTEL（配列番号２６））、EBウイルス由来ペプチド（TYGPVFMCL（配列番号２７））、およびHIV由来ペプチド（RYLRQQLLGI（配列番号２８））を、HLA-A24アレルに結合するコントロールとして使用した。ペプチド反応性CTLは、既報の方法に一部変更を加えて検出した（Hida N et al, Cancer Immunol Immunother 2002;51:219-28）。96ウェルマイクロカルチャープレート（Nunc, Roskilde, Denmark）において、PBMCを各ペプチド（10μl/ml）と4ウェル一組にてインキュベートした。本培養液は45% RPMI 1640、45% AIM-V培地（Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA）、10% FCS、100 U/ml インターロイキン-2（IL-2）および0.1mM MEM 非必須アミノ酸溶液（Life Technologies）より構成された。培養15日目に、培養細胞を4つのウェルに分けた。2つのウェルは対応ペプチドをパルスしたC1R-A24細胞について使用し、他の2つのウェルはHIVペプチドをパルスしたC1R-A24細胞と培養した。18時間インキュベートした後上清を回収し、IFN-γ産生を酵素結合免疫測定法（ELISA）により測定した。ペプチド反応性CTLの誘導は、両側スチューデントt検定によりP＜0.05であり、かつHIVペプチドと比較したIFN-γ産生の差が100 pg/mlを超える場合に陽性と判断した。
純度＞90%のペプチドを、Hokkaido System Science (Sapporo, Japan)より購入した。インフルエンザ (Flu) ウイルス由来ペプチド（RFYIQMCTEL（配列番号２６））、EBウイルス由来ペプチド（TYGPVFMCL（配列番号２７））、およびHIV由来ペプチド（RYLRQQLLGI（配列番号２８））を、HLA-A24アレルに結合するコントロールとして使用した。ペプチド反応性CTLは、既報の方法に一部変更を加えて検出した（Hida N et al, Cancer Immunol Immunother 2002;51:219-28）。96ウェルマイクロカルチャープレート（Nunc, Roskilde, Denmark）において、PBMCを各ペプチド（10μl/ml）と4ウェル一組にてインキュベートした。本培養液は45% RPMI 1640、45% AIM-V培地（Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA）、10% FCS、100 U/ml インターロイキン-2（IL-2）および0.1mM MEM 非必須アミノ酸溶液（Life Technologies）より構成された。培養15日目に、培養細胞を4つのウェルに分けた。2つのウェルは対応ペプチドをパルスしたC1R-A24細胞について使用し、他の2つのウェルはHIVペプチドをパルスしたC1R-A24細胞と培養した。18時間インキュベートした後上清を回収し、IFN-γ産生を酵素結合免疫測定法（ELISA）により測定した。ペプチド反応性CTLの誘導は、両側スチューデントt検定によりP＜0.05であり、かつHIVペプチドと比較したIFN-γ産生の差が100 pg/mlを超える場合に陽性と判断した。
1.6 細胞傷害性試験
No. 11（HLA-A24陰性）およびKNS-81（HLA-A24陽性）に対するペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性は、標準的6時間51Cr放出試験により測定した。HLA-A24陽性健常人由来のフィトヘマグルチニン（PHA）活性化T細胞（T芽球様細胞）を陰性対照細胞として使用した。PBMCをIL-2 (100 units /ml)の存在下に各KIFペプチド(10μg/ml)により3日毎に15日間刺激し、続いてIL-2のみでさらに15日間培養した。CD8-positive isolation kit (Dynal, Oslo, Norway）によりCD8陽性T細胞を単離した後、丸底96ウェルプレートにおいて各ウェルにつき2000個の51Cr標識細胞を、エフェクター細胞とともに培養した。特異的51Cr放出は、以下の式により計算した：特異的溶解（％）＝（被験サンプルの放出−自然放出）x 100/（最大放出−自然放出）。エフェクター細胞なしでインキュベートしたサンプルの上清を用いて自然放出を決定し、次いで1% Triton X（Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan）とインキュベートしたサンプルの上清から最大放出を決定した。一部の実験では、抗HLA クラスI mAb (W6/32, マウス IgG2a) （BioLegend, Camino Santa Fe, SanDiego, CA, USA)、抗HLA クラスII（HLA-DR） mAb (L243, マウス IgG2a) （ATCC＃ HB-55)、および抗CD14 mAb (JML-H14, マウス IgG2a) （久留米大学免疫学講座にて樹立）を培養開始時に添加した。ペプチド刺激PBMCの特異性は、コールド阻害試験によって確認した。HIVペプチドまたは対応ペプチドのいずれかを事前にパルスした20,000個の非標識C1R-A24細胞を、コールド標的細胞として使用した。非標識C1R-A24細胞は、ホット対コールド比10:1にて添加した。
No. 11（HLA-A24陰性）およびKNS-81（HLA-A24陽性）に対するペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性は、標準的6時間51Cr放出試験により測定した。HLA-A24陽性健常人由来のフィトヘマグルチニン（PHA）活性化T細胞（T芽球様細胞）を陰性対照細胞として使用した。PBMCをIL-2 (100 units /ml)の存在下に各KIFペプチド(10μg/ml)により3日毎に15日間刺激し、続いてIL-2のみでさらに15日間培養した。CD8-positive isolation kit (Dynal, Oslo, Norway）によりCD8陽性T細胞を単離した後、丸底96ウェルプレートにおいて各ウェルにつき2000個の51Cr標識細胞を、エフェクター細胞とともに培養した。特異的51Cr放出は、以下の式により計算した：特異的溶解（％）＝（被験サンプルの放出−自然放出）x 100/（最大放出−自然放出）。エフェクター細胞なしでインキュベートしたサンプルの上清を用いて自然放出を決定し、次いで1% Triton X（Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan）とインキュベートしたサンプルの上清から最大放出を決定した。一部の実験では、抗HLA クラスI mAb (W6/32, マウス IgG2a) （BioLegend, Camino Santa Fe, SanDiego, CA, USA)、抗HLA クラスII（HLA-DR） mAb (L243, マウス IgG2a) （ATCC＃ HB-55)、および抗CD14 mAb (JML-H14, マウス IgG2a) （久留米大学免疫学講座にて樹立）を培養開始時に添加した。ペプチド刺激PBMCの特異性は、コールド阻害試験によって確認した。HIVペプチドまたは対応ペプチドのいずれかを事前にパルスした20,000個の非標識C1R-A24細胞を、コールド標的細胞として使用した。非標識C1R-A24細胞は、ホット対コールド比10:1にて添加した。
2. 結果
2.1 グリオーマ組織および正常組織における3種類のKIF遺伝子のmRNA発現
52人のグリオーマ患者から得たサンプルをAgilentのcDNAマイクロアレイにより解析した。36人の悪性グリオーマ組織の蛍光強度を16人の正常グリオーマ組織および正常脳組織の蛍光強度と比較した。ここでは全部で12,729遺伝子を解析し、17種類の遺伝子が、悪性グリオーマ組織において、良性グリオーマ組織および脳、副腎、骨髄、大腸、肝臓、胎児肝臓、心臓、腎臓、肺、乳腺、前立腺、唾液腺、筋肉、腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、気管支、甲状腺、および子宮を含む一連の正常組織においてよりも高度に発現していることがわかった。これら17種類の遺伝子には、3種類のKIF遺伝子、KIF1C、KIF3C、およびKIF21B遺伝子が含まれ、本研究ではこれらに焦点をあてた。
2.1 グリオーマ組織および正常組織における3種類のKIF遺伝子のmRNA発現
52人のグリオーマ患者から得たサンプルをAgilentのcDNAマイクロアレイにより解析した。36人の悪性グリオーマ組織の蛍光強度を16人の正常グリオーマ組織および正常脳組織の蛍光強度と比較した。ここでは全部で12,729遺伝子を解析し、17種類の遺伝子が、悪性グリオーマ組織において、良性グリオーマ組織および脳、副腎、骨髄、大腸、肝臓、胎児肝臓、心臓、腎臓、肺、乳腺、前立腺、唾液腺、筋肉、腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、気管支、甲状腺、および子宮を含む一連の正常組織においてよりも高度に発現していることがわかった。これら17種類の遺伝子には、3種類のKIF遺伝子、KIF1C、KIF3C、およびKIF21B遺伝子が含まれ、本研究ではこれらに焦点をあてた。
はじめに、これら遺伝子のmRNA発現をRT-PCRにより調べた（図１Ａ）。3種類の遺伝子のmRNA発現はいずれも、5種類のグリオーマ細胞株のうち4種類において検出された。3種類の遺伝子のmRNA発現はまた、PHA活性化T細胞（図１Ａ）およびいくつかの正常組織においても検出された（図１Ｂ）。KIF1C遺伝子のmRNAは、他の2種類のKIF遺伝子よりも正常組織において広範に発現していた。KIF3C遺伝子のmRNAは、脾臓、心臓、および精巣において検出された。KIF21B遺伝子のmRNA発現は、肺、脳、精巣、および胸腺において検出された。
2.2 KIF由来ペプチドに反応するIgGの検出
次に、これら3種類のKIFの免疫原性を調べた。3種類のKIFに由来する25種類のペプチド（KIF1C由来ペプチド8種類、KIF3C由来ペプチド11種類、およびKIF21B由来ペプチド6種類）を、HLA-A24分子に対する結合モチーフに基づき調製した (Parker KC et al, J Immunol 152: 163-175, 2004）。
) (表１)。
次に、これら3種類のKIFの免疫原性を調べた。3種類のKIFに由来する25種類のペプチド（KIF1C由来ペプチド8種類、KIF3C由来ペプチド11種類、およびKIF21B由来ペプチド6種類）を、HLA-A24分子に対する結合モチーフに基づき調製した (Parker KC et al, J Immunol 152: 163-175, 2004）。
) (表１)。
既報のように、CTL誘導性ペプチドに反応するIgGが各種の癌の患者の血漿において検出可能であること(Nakatsura T et al, Eur J Immunol 32: 826-836, 2002)、およびペプチドワクチン投与を受けた患者の臨床応答がIgGレベルとよく一致すること(Mine T et al, Clin Cancer Res 10: 929-937, 2004；Yajima N et al, Clin Cacer Res 11: 5900-5911, 2005)から、次にそれらKIF由来ペプチドがグリオーマ患者のIgGに認識されうるかについて調べた。対応ペプチドに反応するIgGは、1:100希釈血漿の免疫蛍光強度がペプチドなしのコントロールサンプルの蛍光強度の1.25倍を超える場合に有意と判断した。KIF1Cペプチドのこの結果を表２に示す。8種類のペプチドのうち、3種類のKIF1Cペプチド、KIF1C 149-157、KIF1C 149-158、およびKIF1C 340-348は、他の5種類のペプチドよりもグリオーマ患者の血漿中のIgGにより認識される頻度が高かった。同様の結果が健常人のサンプルでも得られた。同じアッセイを、11種類のKIF3C由来ペプチドおよび6種類のKIF21B由来ペプチドについても行い、結果を表３にまとめた。3種類のKIF3C由来ペプチド、KIF3C 458-467、KIF3C 512-520、およびKIF3C 702-710、並びに2種類のKIF21B由来ペプチド、KIF21B 220-228およびKIF21B 621-630が、グリオーマ患者および健常人の血漿中のIgGに認識される頻度が他のペプチドよりも高かった。これら知見に基づき、以下の実験では、この8種類のKIF由来ペプチド(KIF1C由来ペプチド3種類、KIF3C由来ペプチド3種類、およびKIF21B遺伝子由来ペプチド2種類)に焦点をあてた。
2.3 グリオーマ患者PBMCからのKIFペプチド反応性CTLの誘導
次に、グリオーマ患者においてIgGに認識される頻度の高い8種類のKIFペプチドが、HLA-A24陽性グリオーマ患者のPBMCからペプチド反応性CTLを誘導する能力を有するかについて調べた。PBMCをin vitroで各ペプチドまたはコントロールペプチドで刺激し、対応ペプチドをパルスしたC1R-A24細胞に応答するIFN-γ産生について調べた（表４）。ペプチド反応性CTLの誘導は、P＜0.05であり、かつコントロールのHIVペプチドと比較したIFN-γ産生の差が100 pg/mlを超える場合に陽性と判断した。陽性の結果を太字の斜体で示す。8種類のペプチドはいずれも、HLA-A24陽性グリオーマ患者10人のうち3または4人のPBMCから対応ペプチド反応性CTLを誘導した。これに対して、KIF1C 149-158 ペプチドのみが5人のHLA-A24陽性健常人うち1人においてペプチド反応性CTLを誘導し、他の7種類のKIFペプチドは5人の健常人のいずれにおいてもペプチド反応性CTLを誘導できなかった（データ非提示）。
次に、グリオーマ患者においてIgGに認識される頻度の高い8種類のKIFペプチドが、HLA-A24陽性グリオーマ患者のPBMCからペプチド反応性CTLを誘導する能力を有するかについて調べた。PBMCをin vitroで各ペプチドまたはコントロールペプチドで刺激し、対応ペプチドをパルスしたC1R-A24細胞に応答するIFN-γ産生について調べた（表４）。ペプチド反応性CTLの誘導は、P＜0.05であり、かつコントロールのHIVペプチドと比較したIFN-γ産生の差が100 pg/mlを超える場合に陽性と判断した。陽性の結果を太字の斜体で示す。8種類のペプチドはいずれも、HLA-A24陽性グリオーマ患者10人のうち3または4人のPBMCから対応ペプチド反応性CTLを誘導した。これに対して、KIF1C 149-158 ペプチドのみが5人のHLA-A24陽性健常人うち1人においてペプチド反応性CTLを誘導し、他の7種類のKIFペプチドは5人の健常人のいずれにおいてもペプチド反応性CTLを誘導できなかった（データ非提示）。
2.4 HLA-A24陽性グリオーマ患者からのグリオーマ反応性CTLの誘導
これらKIFペプチドがHLA-A24拘束性のグリオーマ反応性CTLを誘導できるか否かを調べることが重要であった。このため、HLA-A24陽性グリオーマ患者由来のPBMCを8種類のKIFペプチドの各々で刺激し、ペプチド反応性CTLがグリオーマ細胞に対して細胞傷害性を示しうるかについて検討した。8種類のKIFペプチドのうち、KIF1C 149-158およびKIF3C 512-520 ペプチドが、HLA-A24陽性グリオーマ患者のPBMCから効率的にグリオーマ反応性CTLを誘導した（図２）。KIF1C 149-158またはKIF3C 512-520 ペプチドのいずれかでin vitro において刺激した患者3および5由来のPBMCは、HLA-A24陽性KNS-81細胞に対して、HLA-A24陰性No. 11細胞およびHLA-A24陽性T芽球様細胞に対してよりも高レベルの細胞傷害性を示した。
これらKIFペプチドがHLA-A24拘束性のグリオーマ反応性CTLを誘導できるか否かを調べることが重要であった。このため、HLA-A24陽性グリオーマ患者由来のPBMCを8種類のKIFペプチドの各々で刺激し、ペプチド反応性CTLがグリオーマ細胞に対して細胞傷害性を示しうるかについて検討した。8種類のKIFペプチドのうち、KIF1C 149-158およびKIF3C 512-520 ペプチドが、HLA-A24陽性グリオーマ患者のPBMCから効率的にグリオーマ反応性CTLを誘導した（図２）。KIF1C 149-158またはKIF3C 512-520 ペプチドのいずれかでin vitro において刺激した患者3および5由来のPBMCは、HLA-A24陽性KNS-81細胞に対して、HLA-A24陰性No. 11細胞およびHLA-A24陽性T芽球様細胞に対してよりも高レベルの細胞傷害性を示した。
2.5 グリオーマ細胞に対するKIFペプチド特異的CD8陽性T細胞に依存する細胞傷害性
さらに、ペプチド刺激PBMCの細胞傷害性に関与する細胞を同定することを試みた。精製CD8陽性T細胞を以下の実験に使用した。図３Ａに示すように、HLA-A24陽性グリオーマ患者からKIF1C 149-158およびKIF3C 512-520 ペプチドにより誘導されたCD8陽性T細胞のKNS-81に対する細胞傷害性は、抗HLAクラスI mAbの添加により有意に阻害されたが、抗HLAクラスII (HLA-DR)または抗CD14 mAb（アイソタイプ適合コントロール）の添加によっては阻害されなかった。さらに、細胞傷害性は、対応KIFペプチドをパルスした非標識C1R-A24細胞の添加により有意に阻害されたが、HIVペプチドをパルスしたC1R-A24細胞の添加によっては阻害されなかった（図３Ｂ）。これらをまとめると、KIF1C 149-158およびKIF3C 512-520 ペプチド刺激PBMCのKNS-81細胞に対する細胞傷害性は、対応ペプチド特異的CD8陽性T細胞に起因するといえる。
さらに、ペプチド刺激PBMCの細胞傷害性に関与する細胞を同定することを試みた。精製CD8陽性T細胞を以下の実験に使用した。図３Ａに示すように、HLA-A24陽性グリオーマ患者からKIF1C 149-158およびKIF3C 512-520 ペプチドにより誘導されたCD8陽性T細胞のKNS-81に対する細胞傷害性は、抗HLAクラスI mAbの添加により有意に阻害されたが、抗HLAクラスII (HLA-DR)または抗CD14 mAb（アイソタイプ適合コントロール）の添加によっては阻害されなかった。さらに、細胞傷害性は、対応KIFペプチドをパルスした非標識C1R-A24細胞の添加により有意に阻害されたが、HIVペプチドをパルスしたC1R-A24細胞の添加によっては阻害されなかった（図３Ｂ）。これらをまとめると、KIF1C 149-158およびKIF3C 512-520 ペプチド刺激PBMCのKNS-81細胞に対する細胞傷害性は、対応ペプチド特異的CD8陽性T細胞に起因するといえる。
3. まとめ
以上の結果は、KIF由来ペプチド、特にKIF1C 149-158およびKIF3C 512-520 ペプチドが、グリオーマ患者に対する癌ワクチンとして有用であることを示す。
以上の結果は、KIF由来ペプチド、特にKIF1C 149-158およびKIF3C 512-520 ペプチドが、グリオーマ患者に対する癌ワクチンとして有用であることを示す。
Claims (6)
- 配列番号３または１５に示すアミノ酸配列からなるペプチド。
- 請求項１記載のペプチドを含む、グリオーマを処置または予防するための医薬組成物。
- 請求項1記載のペプチドを含む、癌ワクチンである請求項２記載の医薬組成物。
- HLA-A24陽性グリオーマ患者より採取された末梢血単核細胞を請求項１記載のペプチドと接触させることを含む、グリオーマ反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法。
- 請求項１に記載のペプチドを含む、グリオーマ反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するためのキット。
- 請求項１記載のペプチドを含む、KIF由来ペプチドとHLA-A24分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するためのキット。
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