JP4930544B2 - 細胞培養用担体の製造方法 - Google Patents
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Description
細胞接着性領域と細胞非接着性領域とを含む表面を備える細胞培養用担体の製造方法であって、支持体の表面に官能基を導入する、官能基導入工程と、前記官能基と反応して共有結合を形成可能な結合性基とヒドロキシル基とを有する親水性化合物を、前記官能基に、前記官能基と前記結合性基との結合を介して結合させる、親水性化合物結合工程と、前記結合された親水性化合物上のヒドロキシル基に環状酸無水物を開環ハーフエステル化反応させることによりカルボキシル基を形成する、カルボキシル基形成工程と前記カルボキシル基形成工程において形成されたカルボキシル基を活性カルボニル基に変換する、活性化工程と、前記活性化工程において活性カルボニル基が形成された支持体表面のうちの一部の領域に、活性カルボニル基と反応して共有結合を形成可能な官能基を有する細胞親和性物質を接触させ、該一部の領域内の活性カルボニル基と該細胞親和性物質の官能基との反応により共有結合を形成させて、該一部の領域に該細胞親和性物質を固定化する、細胞親和性物質固定化工程と、前記細胞親和性物質固定化工程の後に、前記支持体表面に、活性カルボニル基と反応して共有結合を形成可能な官能基を有する低分子化合物を接触させ、該表面上に残存する活性カルボニル基と該低分子化合物の官能基との反応により共有結合を形成させて、該活性カルボニル基を、該低分子化合物を含む基に置換する、ブロッキング工程とを含むことを特徴とする、細胞培養用担体の製造方法。
前記細胞親和性物質固定化工程が、前記一部の領域に応じた形状の上面を有する凸部を備え、少なくとも該上面に前記細胞親和性物質が付着されたスタンプを用意し、前記凸部の上面を、活性カルボニル基が形成された支持体表面に当接させて、前記細胞親和性物質を前記一部の領域に接触させる工程を含む、(1)記載の方法。
前記支持体に導入される官能基がエポキシ基、アルデヒド基およびアミノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする(1)または(2)記載の方法。
前記官能基導入工程が、前記官能基を有するシランカップリング剤をゾル−ゲル法により支持体の表面に適用する工程を含む、(3)記載の方法。
前記親水性化合物が、エチレングリコール、エチレングリコールの重合体、および、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体からなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(1)〜(5)のいずれかに記載の方法により製造された、細胞接着性領域と細胞非接着性領域とを含む表面を備える細胞培養用担体。
細胞接着性領域と細胞非接着性領域とを含む表面を備える細胞培養用担体であって、表面に官能基を有する支持体と、前記官能基と反応して共有結合を形成可能な結合性基とヒドロキシル基とを有する親水性化合物と、2つのカルボン酸基を有するカルボン酸化合物と、カルボン酸基と共有結合を形成可能な官能基を有する細胞親和性物質と、カルボン酸基と共有結合を形成可能な官能基を有する低分子化合物とにより形成された、(a)細胞接着性領域においては、前記支持体上の官能基と前記親水性化合物の結合性基との間に結合が形成されており、前記親水性化合物成分のヒドロキシル基と前記カルボン酸化合物の一方のカルボン酸基との間でエステル結合が形成されており、前記カルボン酸化合物の他方のカルボン酸基と前記細胞親和性物質の官能基との間で共有結合が形成されており、(b)細胞非接着性領域においては、前記支持体上の官能基と前記親水性化合物の結合性基との間に結合が形成されており、前記親水性化合物成分のヒドロキシル基と前記カルボン酸化合物の一方のカルボン酸基との間でエステル結合が形成されており、前記カルボン酸化合物の他方のカルボン酸基と前記低分子化合物の官能基との間で共有結合が形成されていることを特徴とする、細胞培養用担体。
本発明において「官能基導入工程」とは、支持体の表面に官能基を導入する工程である。
R1、R2、R3は互いに独立にメチル、メトキシまたはエトキシを示し、ただしR1、R2およびR3のうち少なくとも1つはメトキシまたはエトキシであり、Eはエポキシ基を含有する基、例えば3−グリシドキシプロピル基または2−(3,4−エポキシシクロヘキシル)エチル基である)で表されるものが使用できる。具体的には3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、3−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、3−グリシドキシプロピルメチルジメトキシシラン、3−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、3−グリシドキシプロピルジメチルエトキシシラン、2−(3,4−エポキシシクロヘキシル)エチルトリメトキシシラン、および2−(3,4−エポキシシクロヘキシル)エチルトリエトキシシランが挙げられる。
本発明において「親水性化合物結合工程」とは、前記手順により支持体表面上に導入された官能基と反応して共有結合を形成可能な結合性基とヒドロキシル基とを有する親水性化合物を、前記官能基に、前記官能基と前記結合性基との結合を介して結合させる工程である。
支持体表面に導入されたエポキシ基に、2個のヒドロキシル基を有する親水性化合物を結合させる場合には、1つのエポキシ基に対し1つの親水性化合物が結合する。
支持体表面に導入されたアルデヒド基に、2個のヒドロキシル基を有する親水性化合物を結合させる場合には、1つのアルデヒド基に対し2つの親水性化合物が結合する。
本発明において「カルボキシル基形成工程」とは、前記親水性化合物結合工程により結合された親水性化合物上のヒドロキシル基(結合性基がヒドロキシル基である場合には、前記親水性化合物結合工程における反応に供されない方のヒドロキシル基を指す)に環状酸無水物を開環ハーフエステル化反応させることにより、環状酸無水物に由来するカルボキシル基を形成する工程である。
本発明において「活性化工程」とは、前記カルボキシル基形成工程において形成されたカルボキシル基を活性カルボニル基に変換する工程である。
本発明において「細胞親和性物質固定化工程」とは、活性化工程において活性カルボニル基が形成された支持体表面のうちの一部の領域に、活性カルボニル基と反応して共有結合を形成可能な官能基を有する細胞親和性物質を接触させ、該一部の領域内の活性カルボニル基と該細胞親和性物質の官能基との反応により共有結合を形成させて、該一部の領域に該細胞親和性物質を固定化する工程である。この工程において選択的に細胞親和性物質が固定化された領域が、細胞培養用担体における細胞接着性領域を構成する。
本発明において「ブロッキング工程」とは、細胞親和性物質固定化工程を行った後に、支持体表面に、活性カルボニル基と反応して共有結合を形成可能な官能基を有する低分子化合物を接触させ、該表面上に残存する活性カルボニル基と該低分子化合物の官能基との反応により共有結合を形成させて、残存する活性カルボニル基を、該低分子化合物を含む基(通常は、該低分子化合物が結合したカルボニル基)に置換する工程である。本発明の工程では、担体表面のうち、細胞親和性物質が固定化されていない領域に残存する活性カルボニル基が低分子化合物を含む基に置換され、細胞非接着性領域が形成される。
本実施例は、図3に示す実施形態の例であって、ガラス表面にエポキシ基を導入する工程、前記エポキシ基にポリエチレングリコール(PEG)を結合させる工程、前記PEGの自由末端に存在するヒドロキシル基に無水コハク酸(SuA)を反応させ、カルボキシル基を形成する工程、前記カルボキシル基を活性エステル基に変換する工程、前記活性エステル基にゼラチンをμCP法によって位置選択的に固定化する工程、未反応の活性エステル基をジグリコールアミン(DGA)でブロッキングする工程、からなる。以下、具体的な手順を説明する。
本実施例は、図4に示す実施形態の例であって、ガラス表面にアルデヒド基を導入する工程、前記アルデヒド基にPEGを共有結合させる工程、前記PEGの自由末端に存在するヒドロキシル基に無水コハク酸を反応させ、カルボキシル基を形成する工程、前記カルボキシル基を活性エステル基に変換する工程、前記活性エステル基にゼラチンをμCP法によって位置選択的に固定化する工程、未反応の活性エステル基をDGAでブロッキングする工程、からなる。以下、具体的な手順を説明する。
特許文献2に記載された方法に従って細胞培養用担体を製造し、得られる細胞パターンについて本発明と比較した。以下にその具体的な手順を説明する。
Claims (6)
- 細胞接着性領域と細胞非接着性領域とを含む表面を備える細胞培養用担体の製造方法であって、
支持体の表面に官能基を導入する、官能基導入工程と、
前記官能基と反応して共有結合を形成可能な結合性基を一端に有し、ヒドロキシル基を他端に有する鎖状構造の親水性化合物を、前記官能基に、前記官能基と前記結合性基との結合を介して結合させる、親水性化合物結合工程と、
前記結合された親水性化合物上のヒドロキシル基に環状酸無水物を開環ハーフエステル化反応させることによりカルボキシル基を形成する、カルボキシル基形成工程と、
前記カルボキシル基形成工程において形成されたカルボキシル基を活性カルボニル基に変換する、活性化工程と、
前記活性化工程において活性カルボニル基が形成された支持体表面のうちの一部の領域に、活性カルボニル基と反応して共有結合を形成可能な官能基を有する細胞親和性物質を接触させ、該一部の領域内の活性カルボニル基と該細胞親和性物質の官能基との反応により共有結合を形成させて、該一部の領域に該細胞親和性物質を固定化する、細胞親和性物質固定化工程と、
前記細胞親和性物質固定化工程の後に、前記支持体表面に、活性カルボニル基と反応して共有結合を形成可能な官能基を有する炭素数が6以下である低分子化合物を接触させ、該表面上に残存する活性カルボニル基と該低分子化合物の官能基との反応により共有結合を形成させて、該活性カルボニル基を、該低分子化合物を含む基に置換する、ブロッキング工程と
を含むことを特徴とする、細胞培養用担体の製造方法。 - 前記細胞親和性物質固定化工程が、前記一部の領域に応じた形状の上面を有する凸部を備え、少なくとも該上面に前記細胞親和性物質が付着されたスタンプを用意し、前記凸部の上面を、活性カルボニル基が形成された支持体表面に当接させて、前記細胞親和性物質を前記一部の領域に接触させる工程を含む、請求項1記載の方法。
- 前記支持体に導入される官能基がエポキシ基、アルデヒド基およびアミノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- 前記官能基導入工程が、前記官能基を有するシランカップリング剤をゾル−ゲル法により支持体の表面に適用する工程を含む、請求項3記載の方法。
- 前記親水性化合物が、エチレングリコール、エチレングリコールの重合体、および、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体からなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 細胞接着性領域と細胞非接着性領域とを含む表面を備える細胞培養用担体であって、
表面に官能基を有する支持体と、
前記官能基と反応して共有結合を形成可能な結合性基を一端に有し、ヒドロキシル基を他端に有する鎖状構造の親水性化合物と、
2つのカルボン酸基を有するカルボン酸化合物と、
カルボン酸基と共有結合を形成可能な官能基を有する細胞親和性物質と、
カルボン酸基と共有結合を形成可能な官能基を有する炭素数が6以下である低分子化合物と
により形成された、
(a)細胞接着性領域においては、前記支持体上の官能基と前記親水性化合物の結合性基との間に結合が形成されており、前記親水性化合物成分のヒドロキシル基と前記カルボン酸化合物の一方のカルボン酸基との間でエステル結合が形成されており、前記カルボン酸化合物の他方のカルボン酸基と前記細胞親和性物質の官能基との間で共有結合が形成されており、
(b)細胞非接着性領域においては、前記支持体上の官能基と前記親水性化合物の結合性基との間に結合が形成されており、前記親水性化合物成分のヒドロキシル基と前記カルボン酸化合物の一方のカルボン酸基との間でエステル結合が形成されており、前記カルボン酸化合物の他方のカルボン酸基と前記低分子化合物の官能基との間で共有結合が形成されている
ことを特徴とする、細胞培養用担体。
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