JP4989493B2 - 分子内プローブによる核酸配列の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、核酸配列を検出する方法に関する。また、本発明は、核酸の解析方法、特に遺伝子の解析方法に関する。

1988年に、ライゲース酵素の特異性を用いた核酸の変異を検出する方法がサイエンス誌に発表された（Landegren, Science, 26;241(4869):1077-80,(1988)）。この方法は、それまで使われていたPCRによる変異検出方法、即ち、変異に相補な配列を３’端にもつプライマー（即ち、Sequence Specific Primer）を用いたPCRによる変異検出方法よりも、反応条件の設定が容易である。このため、当該方法の工程に続いて耐熱性リガーゼを用いるLCR（即ち、Ligase Chain Reaction）や、BaranyらによるLDR（即ち、Ligase Detection Reaction）などの方法が、当該方法を発展させた方法として開発されている（特表２０００−５１１０６０号公報）。また、ライゲースによる分子認識は、変異に相補な塩基を３’端に有する２つのプローブの連結によって行われる。そして特にこの方法は、1塩基変異の検出に用いられることが多い。

ヒトのSNP（即ち、Single Nucleotide Polymorphism；1塩基多型）は、数百塩基に1つ程度の頻度で見られる遺伝子多型である。この変異は、コーディングリージョン、ノンコーディングリージョンを問わず、広くゲノム上に散在しており、塩基の置換のみならず挿入（インサーション）や欠失（デリション）としても見られる。また、ヒトゲノムの大きさは30億塩基対であるから、1000塩基に1カ所の頻度であっても300万のSNPが存在することになる。このような膨大な数のSNPの中から医学的に有用なものを見つけることは容易ではない。今のところ1つの薬剤や疾病の感受性と関係のあるSNPセットは、この約300万カ所のうち、多くて数百カ所、或いは数十カ所程度であると考えられている。例えばロシュ社は、薬剤代謝蛋白であるシトクロームP450のSNPタイピング用マイクロアレイを提供している。このアレイの場合では、遺伝子CYP2D6については29カ所、遺伝子CYP2C19については2カ所のアレルがタイピングできるように設計されており、合計31カ所のアレルについてのタイピングがなされる。このようなことからも、診断を行うために、何万カ所、または何千カ所のアレルをタイピングする必要はなさそうである。即ち、現実的には、数十カ所、多くて百数十カ所程度のSNPのタイピングが必要であろうと考えられる。

しかしながら、この程度のタイピングを行うにしても、従来のサンガー法を使うとすれば、反応のための試薬や装置に掛かるコストが高く、その上、1回の反応でほぼ1変異しか検出できない。また、反応の特異性やシグナルが低い場合には、結果として得られる波形から必ずしもSNPが読みとれるとも限らない。このような状況では、上述のようなタイピングを行うためには、サンガー法では、検出しようとする対象の数が多すぎる。当該タイピングのためのそのほかの方法としては、例えば、実験手順のよりシンプルなSSCP（即ち、Single Strand Conformation Polymorphism）法、SSP-PCR（即ち、Sequence Specific Primers -PCR）法、蛍光TaqManプローブによるリアルタイムPCR法などの適用が考えられる。しかしながら、これらの方法であっても、実用化には問題が残る。即ち、SNP検査を実用化するには、多くのSNPの型を安価に決定できる方法が求められている。現在、世界中で、取り分け、ポリメラーゼの分子認識を利用した方法や、先に述べたリガーゼの分子認識を利用した方法を基本にした方法の開発が盛んに行われている。

例えば、リガーゼを用いた分子認識を利用するユニークな方法として、アフィメトリックス(Affymetrix)社のMIP（即ち、Molecular Inversion Probe）法がある(特表２００４−５２８０１６号公報)。この方法は、閉環プローブとギャップライゲーション法により、プローブ合成コストを下げ、反応効率を高めたタグによるマルチプレックスタイピング法（Hardenbol, P. et al., Nat. Biotechnol. 21, 673-678 (2003)、Hardenbol, P. et al., Genome Res. 15, 269-675 (2005)）である。また、PCRに代わる核酸増幅方法として魅力的なYale大のLizardiの開発したRCA（即ち、Rolling Circle Amplification）法は、環状になったDNAをプライマーから鎖置換型のポリメラーゼにより連続的に合成し続ける方法である（特表２００１−５１９１７２号公報）。この増幅法のテンプレートは環状でなければならない。従って、それに応じて1本鎖プローブの末端が標的にハイブリダイズし、リガーゼにより閉環されるような南京錠プローブ（即ち、padlock probe）が開発され、これによる検出法が出願されている（特表２００２−５０３９４８号公報）。日本においては、アイシンコスモスが3重鎖形成や、特異的なハイブリダイゼーションを促進するタンパク質RecAを併用した南京錠プローブ法を出願している（特開平９−２２００９９号公報）。また南京錠プローブはRCA法に限らず、他の方法にも利用されている（特表２００１−５１４４８３号公報、特許第３０８５４０９号公報、特許第３５９０６３３号公報）。

南京錠プローブによるゲノム核酸の変異検出においては、PCRなどで増幅した核酸試料またはゲノム核酸そのものを含む反応液に対して、プローブ核酸を大過剰に加えて連結反応を行う。このような反応を行うためには、PCR用のプライマーの他に、検出用のプローブを合成する必要がある。また、プローブ核酸を大過剰に加えることによって、非特異な反応も起き易くなる。更に、検出対象配列の付近で核酸が2次構造をとるような場合には、南京錠プローブが対象にハイブリダイズする効率が低下し、そのために検出が達成されないことがある。

何れの上述した従来の方法であっても、例えば、プローブの連結反応によって核酸を検出するときには、核酸試料に対して大過剰のプローブ核酸を加えなくてはならない。従って、そのためにコストがかかり、非特異反応も起きやすい。

本発明の１つの目的は、非特異反応が生じにくく、大過剰のプローブ核酸を加えなくてもよく、低コストで実行することの可能な核酸配列を検出するための手段を提供することである。

以上の目的を達するための手段は以下の通りである。即ち、
（１） 以下を具備する核酸配列検出方法；
（ａ）核酸試料を準備すること；
（ｂ）前記核酸試料に含まれる当該検出部位の３’側に位置する第1の核酸配列に相補的な配列を含む第1の分子内検出配列と、当該検出部位の５’側に位置する第2の核酸配列に相補的な配列を含む第２の分子内検出配列を準備すること、ここで、第1の分子内検出配列の３’端と第2の分子内検出配列の５’端の少なくとも一方が核酸と結合が可能なように修飾されている；
（ｃ）前記核酸試料をテンプレートに３’末端に第1の分子内検出配列を、５’末端に第2の分子内検出配列を付与した当該検出部位の配列を含む検出鎖を合成すること；
（ｄ）前記検出鎖について、第1の核酸配列と第1の分子内検出配列との間、および第２の核酸配列と第２の分子内検出配列との間の２箇所で分子内ハイブリダイズがなされること；
（ｅ）第1の分子内検出配列の３’端と第２の分子内検出配列の５’端を直接または間接的に連結すること；
（ｆ）（ｅ）の連結することにより環状構造体を得ること；
（ｇ）前記環状構造体を検出する、または前記環状構造体の連結の有無の検出を行うこと。

（２） （１）に記載の核酸配列検出方法であって、（ｄ）における分子内ハイブリダイゼーションによって、ダンベル構造体が形成され、（ｅ）における連結が、当該ダンベル構造体の５’端と３’端の連結が、ライゲーションおよびギャップライゲーションからなる群より選択される手段により行われる方法。

（３） （２）に記載の核酸配列検出方法であって、前記ダンベル構造体の形成と（ｅ）における連結が、予め設定された熱サイクリング条件下での熱サイクリングの実施と共に行われる方法。

（４） （１）〜（３）の何れか１項に記載の核酸配列検出方法であって、（ｃ）の付与することが、少なくとも一組のプライマーを用いたＰＣＲおよびギャップライゲーション、並びに制限酵素切断に続く少なくとも一組のアダプターを用いたアダプタライゲーションからなる群より選択された手段により行われる方法。

（５） （１）〜（４）の何れか１項に記載の核酸配列検出方法であって、（ｆ）の環状構造体を得ることの後に、更に、閉館しなかった核酸を酵素により消化することを具備する方法。

（６） （１）〜（５）の何れか１項に記載の核酸配列検出方法であって、（ｇ）における目的の核酸配列の検出を行うことが、ＤＮＡマイクロアレイ、蛍光ビーズ、電気泳動および質量分析からなる群より選択された手段により、当該環状構造体を検出することによって行われる方法。

（７） （１）〜（５）の何れか１項に記載の核酸配列検出方法であって、（ｇ）における目的の核酸配列の検出を行うことが、当該環状構造体の連結部の形成を検出可能なプライマーを用いる伸長反応を利用して得られた増幅産物を検出することによって当該環状構造を検出することにより行われる方法。

（８） （１）〜（７）の何れか１項に記載の核酸配列検出方法であって、前記第２の分子内検出配列の５’端がリン酸化されている方法。

（９） （１）〜（８）の何れか１項に記載の核酸配列検出方法であって、前記第２の分子内検出配列の３’端にプライマー配列が含まれ、第１の分子内検出配列の５’端がリン酸化されている方法。

（１０） （１）〜（９）の何れか１項に記載の核酸配列検出方法であって、（ｆ）の連結が化学的結合および生化学的結合からなる群より選択される手段により達成される方法。

（１１） （１０）に記載の核酸配列検出方法であって、前記化学的結合が、光により媒介される反応を介して行われる方法。

（１２） （１０）に記載の核酸配列検出方法であって、前記生化学的結合が、酵素により媒介される反応を介して行われる方法。

（１３） （１）〜（１２）の何れか１項に記載の核酸配列検出方法であって、当該第1の分子内検出配列が、当該３’側に位置する第1の核酸配列に相補的な配列に加えて更に、当該検出部位における検出対象に関する情報を反映するように予め設計されて割り当てられたタグ配列を含む、および／または当該第２の分子内検出配列が、当該検出部位の５’側に位置する第２の核酸配列に相補的な配列に加えて更に、当該検出部位における検出対象に関する情報を反映するように予め設計されて割り当てられたタグ配列を含む方法。

（１４） （１）〜（１３）の何れか１項に記載の核酸配列検出方法であって、当該核酸配列検出が、ＳＮＰ検出、発現計測、メチル化検出、並びに欠失、挿入、置換およびマイクロサテライトの検出からなる群より選択される方法。

（１５） 核酸試料に含まれる検出部位よりも３’側に位置する第1の核酸配列に相補的な配列を含む第1の分子内検出配列と、当該検出部位よりも５’側に位置する第2の核酸配列に相補的な配列を含む第２の分子内検出配列と、ここで、第1の分子内検出配列の３’端の核酸と第2の分子内検出配列の５’端核酸の少なくとも一方が、互いに結合可能なように修飾されている分子内検出配列。

（１６） （１）〜（１５）の何れか１項に記載の方法に用いる、酵素と、核酸と、基質とバッファ、検出用マイクロアレイの何れか、もしくは全てからなる試薬を含む検出キット。

本発明の更なる目的は、反応効率および検出感度が高く、少量の検体で容易に検出を行える核酸の解析方法を提供することである。

以上の目的を達するための手段は以下の通りである。即ち、
（１）核酸の変異を解析する方法であって、以下を具備する方法：
（ａ）被検核酸に相補な複製鎖を合成し、複製鎖上に検出する変異に相補なまたは変異の周辺に相補な配列を複製鎖の両末端に付加すること、
ここで、これら相補な配列は異なり、複製鎖上において変異に対してそれが存在する末端と変異の間、または末端と変異の間で変異も含む位置にハイブリダイズするように位置が選ばれており；
（ｂ）１本鎖の複製鎖に、少なくとも２ヶ所の屈曲部分をもつ分子内構造を形成させること；
（ｃ）解析しようとする変異が存在したとき、核酸モノマー、または変異に相違な核酸を介して、または直接に、前記構造をなす複製鎖の末端同士が、酸素反応または化学反応により共有結合で連結されて閉環核酸分子を形成すること；
（ｄ）前記閉環核酸分子の連結された部分を含む配列、またはその相補鎖配列、または両方の配列を合成すること；および
（ｅ）合成した前記閉環核酸分子の連結された部分を含む配列、またはその相補鎖配列の存在を検出することで核酸の変異を解析すること。

（２）前項（１）に記載の核酸の変異を解析する方法であって、以下を具備する方法：
（ａ）被検核酸を、増幅可能な条件下で第１の増幅を行うこと、
ここで、使用されるプライマーは、前記被検核酸の当該変異の配列を含む配列を増幅するための第１のプライマーと第２のプライマーからなり、
第1のプライマーは、被検核酸のうちの検出されるべき変異を含み得る、第２のプライマーの伸長鎖となる第２の１本鎖の当該変異の３’側の配列と、または当該変異を含む３’側の配列と相同な配列からなる第1のプローブ配列を当該第１のプライマーの５’端側に含み、更に第２の1本鎖における当該変異部位に対して、第２の１本鎖において前記第1のプローブ配列と対応する配列より３’側の一部の配列に相補な配列からなる第1のプライミング配列を当該第1のプライマーの３’端に含み；および
第2のプライマーは、第1のプライマーの伸長鎖となる第１の１本鎖の当該変異の３’側の配列の一部と相同な配列からなる第2のプローブ配列を当該第２のプライマーの５’端側に含み、更に、第１の１本鎖の当該変異部位に対して、第１の１本鎖において前記第２のプローブ配列と対応する配列より３’側の一部の配列に相補な配列からなる第２のプライミング配列を当該第２のプライマーの３’端に含み、更に第２のプライマーの５’端末はリン酸化されている：
（ｂ）第1の増幅により得られた第１の増幅産物を１本鎖化すること；
（ｃ）前記１本鎖化した第１の増幅産物に分子内構造を形成させて、閉環反応し、閉環核酸分子を得ること；
（ｄ）得られた閉環核酸分子を、増幅可能な条件下で、第２の増幅を行い、当該閉環核酸分子に含まれる検出されるべき変異と、同閉環核酸分子に含まれる少なくとも前記第１および第２のプローブ配列に由来する配列とを、同時に含む第２の増幅産物を得ること；および
（ｅ）得られた第２の増幅産物を検出して、当該被検核酸における検出されるべき変異を解析すること。

（３）前項（２）に記載の核酸の変異を解析する方法であって、前記（ａ）の第1の増幅の後に、第１の増幅産物の３’末端に付加された塩基を除去してその末端を平滑化することを、更に具備する方法。

（４）前項（１）から（３）の何れか１項に記載の方法であって、更に、前記閉環核酸分子以外の直鎖核酸分子の完全分解または部分分解をすることを具備する方法。

（５）前項（１）から（４）の何れか１項に記載の方法であって、更に、第１のプライマーおよび第２のプライマーが、それらの前記プライミング配列とプローブ配列の間に、識別および／または増幅のために利用可能な人工設計配列を有する方法。

（６）前項（１）から（５）の何れか1項に記載の方法であって、第１のプライマーおよび第２のプライマーがそれらの前記プライミング配列とプローブ配列の間に人工設計配列を有し、前記人工設計配列が、検出しようとする変異に対応する、または共通化した１または１種類以上の配列であり、変異部位毎に第２のプライマーがあり、当該変異部位の変異種の第１のプライマーであり、それらプライマーが異なる人工設計配列を備え、複数の変異を同時に検出し解析する方法。

（７）前項（１）から（６）の何れか１項に記載の方法であって、第１のプライマーおよび第２のプライマーがそれらの前記プライミング配列とプローブ配列の間に人工設計配列を有し、これらを用いて第１の増幅を行い、得られた第1の増幅産物について第２の増幅を行った後に、前記プローブ配列および人工設計配列を検出し、それによって得られた情報を基に核酸の変異を解析する方法。

（８）前項（１）から（７）の何れか１項に記載の方法であって、第１の増幅産物に含まれる当該検出されるべき変異を含む１本鎖核酸において、当該変異部位またはそれに隣接する位置に対して、前記１本鎖核酸の３’と５’末端が分子内でハイブリダイズすることによって分子内構造が形成され、その末端環のギャップまたはニックが、その分子内構造における当該変異部位の隣接部、または当該変異部位を含む変異部位付近の位置に存在する方法。

（９）前項（８）に記載の方法であって、前記分子内構造の当該変異部位と隣接塩基の間にニックが存在し、そこにリガーゼを作用させることによって閉環核酸分子が形成される方法。

（１０）前項（８）に記載の方法であって、前記分子内構造にギャップがあり、ポリメラーゼによる相補鎖合成とリガーゼによる連結によって閉環核酸分子が形成される方法。

（１１）前項（１）から（８）の何れか１項に記載の方法であって、前記ギャップが、前記第１の鎖の当該変異部位と変異部位に隣接する配列の相補配列、または当該変異部位の相補配列とからなるギャップ配列からなり、前記第１のプライマーが、前記第１の１本鎖の当該変異部位の５’側に存在する連続する配列の一部と相補な配列からなる第１のプローブ配列を当該第１のプライマーの５’端側に含み、前記第２のプライマーが、前記第２の１本鎖における当該変異部位に対応する部位の５’側に近接して連続する配列の一部と相補的な第２のプローブ配列を当該第２のプライマーの５’側に含み、前記第１および第２のプライマーを用いて第１の増幅を行った後、前記ギャップ配列の塩基配列を有しその５’末端がリン酸化された核酸断片の存在下で、リガーゼを作用させることによって閉環核酸分子が形成される方法。

（１２）前項（１１）に記載の方法であって、当該検出されるべき変異が一塩基変異である方法。

（１３）前項（１）から（９）の何れか１項に記載の方法であって、ここで検出する変異が一塩基変異であり、前記第1のプライマーが、前記第１の1本鎖の当該変異塩基および当該変異塩基の３’側に存在する連続する配列の一部と相同な配列からなる第1のプローブ配列を当該第１のプライマーの５’端側に含み、前記第２のプライマーが、前記第２の１本鎖における当該変塩基の３’側に隣接する配列の一部と相同な第２のプローブ配列を当該第２のプライマーの５’側に含む方法。

（１４）前項（１）から（１３）の何れか１項に記載の方法であって、更に、以下を具備する方法：
前記第２の増幅において使用される第１のプライマーが、識別可能な第１の化学標識物質を有し、第２のプライマーが識別可能な第２の化学標識物質を有すること；
得られた第２の増幅産物を、前記第１の化学標識物質に対する抗体を具備する第１の粒子と、前記第２の化学標識物質に対する抗体を具備する第２の粒子と反応させること；
前記反応によって生じる粒子の凝集を検出して、当該被検核酸における検出されるべき変異を解析すること。

（１５）前項（１）から（１３）の何れか１項に記載の方法であって、更に以下を具備する方法：
前記第２の増幅において、予め蛍光色素標識された第１および／または第２のプライマーを用いること；
得られた第２の増幅産物を、当該第２の増幅産物を捕捉するためのプローブを具備する核酸マイクロアレイに対して、ハイブリダイズさせること；および
前記核酸マイクロアレイ上で前記蛍光色素標識由来の蛍光色素を検出して、当該被検核酸における検出されるべき変異を解析すること。

（１６）前項（６）から（１５）の何れか１項に記載の方法であって、更に以下を具備する方法；
同一変異部位で観察される得る変異型と、識別可能な複数の蛍光色素とを対応付けるように、予め、前記人工設計配列の選択を行うこと；
前記人工設計配列の配列設計が、同一変異部位で観察され得る複数の変異型を有する変異核酸が、予め用意されたマイクロアレイに固定された同一のプローブにハイブリダイズするように反応されること；および
上記のように選択され設計され、且つ蛍光色素により標識された人工設計配列を、核酸マイクロアレイ上で多色検出して、当該被検核酸における検出されるべき変異を解析すること。

（１７）前項（６）から（１５）の何れか１項に記載の方法であって、更に以下を具備する方法：
前記第２の増幅において、予め蛍光色素標識された第１および／または第２のプライマーを用いること；
得られた第２増幅産物を、蛍光で識別可能な粒子であり、且つ粒子毎に１種類の人工設計配列を捕捉するためのプローブを有する蛍光粒子とハイブリダイズすること；
前記蛍光粒子と当該第２増幅産物からの蛍光に関する情報を基に当該被検核酸における検出されるべき変異を解析すること。

（１８）前項（１７）に記載の方法であって、前記蛍光粒子が蛍光色素を含むビーズおよび量子ドットまたは複数種類の量子ドットを含むビーズからなる群より選択される方法。

（１９）核酸変異を解析する方法であって、以下を具備する方法；
（ａ）被検核酸を、増幅可能な条件下で第１の増幅を行うこと、
ここで、使用されるプライマーは、前記被検核酸に当該変異の配列を含む配列を増幅するための第１のプライマーと第２のプライマーからなり；
第1のプライマーは、被検核酸のうちの検出されるべき変異を含み得る、第２のプライマーの伸長鎖となる第２の1本鎖の当該変異の３’側の配列、または当該変異を含む３’側の配列と相同な配列からなる第1のプローブ配列を当該第１のプライマーの５’端側に含み、更に第２の1本鎖における当該変異部位に対して、第２の１本鎖において前記第１のプローブ配列と対応する配列より３’側の一部の配列に相補な配列からなる第1のプライミング配列を当該第１のプライマーの３’端に含み；および
第2のプライマーは、第1のプライマーの伸長鎖となる第１の１本鎖の当該変異の３’側の配列の一部と相同な配列からなる第2のプローブ配列を当該第２のプライマーの５’端側に含み、更に第１の１本鎖の当該変異部位に対して、第１の１本鎖において前記第２のプローブ配列と相同な配列より３’側の一部の配列に相補な配列からなる第2のプライミング配列を当該第２のプライマーの３’端に含み、更に第２のプライマーの５’端末がリン酸化されている；
（ｂ）第1の増幅により得られた第１の増幅産物を１本鎖化すること；
（ｃ）前記１本鎖化した第１の増幅産物に分子内構造を形成させて、閉環反応し閉環核酸分子を得ること；
（ｄ）得られた閉環核酸分子と非閉環直鎖核酸分子のコンホーメーションの相違を検出することによって、当該被検核酸における検出されるべき変異を解析すること。

（２０）前項（１９）に記載の方法であって、前記閉環核酸分子と非閉環直鎖核酸分子のコンホーメーションの相違の検出が電気泳動法によって行われる方法。

（２１）前項（１）から（２０）の何れか1項に記載の方法であって、前記増幅法がＰＣＲ法である方法。

（２２）前項（２１）に記載の方法であって、第２の増幅法が非対称ＰＣＲである方法。

（２３）前項（１）から（２２）の何れか１項に記載の方法を実施するためのアッセイキットであって、プライマーセット、酵素、基質、緩衝剤、標識物質、プローブおよび／または核酸マイクロアレイを具備するアッセイキット。

（２４）前項（２３）に記載のアッセイキットであって、更に蛍光粒子を具備するアッセイキット。

本発明の更なる目的は、プローブの連結反応により核酸を検出するとき、被検核酸に対して大過剰のプローブ核酸を加える必要のない方法を提供することである。

以上の目的を達するための手段は以下の通りである。即ち、
（１） 以下を具備する核酸配列検出方法；
（ａ）核酸試料を準備すること；
（ｂ）前記核酸試料に含まれる当該検出部位の３’側に位置する第1の核酸配列に相補的な配列を含みかつその５’側に第1の核酸配列よりも３’側にハイブリダイズするプライマー配列を含む第１の検出鎖合成核酸と、当該検出部位の５’側に位置する第２の核酸配列に相補的な配列を含みかつその３’側に相補鎖合成阻害構造を含み、更にその３’側に第２の核酸配列よりも５’側にハイブリダイズするオリゴ核酸配列を含む第２の検出鎖合成核酸を準備すること、
ここで、第１の検出鎖合成核酸の５’端の核酸と第２の検出鎖合成核酸の５’端の核酸の少なくとも一方が、核酸と結合が可能なように修飾されている；
（ｃ）第１の検出鎖合成核酸のプライマー配列と第２の検出鎖合成核酸のオリゴ核酸配列とを前記核酸試料にハイブリダイズさせ、第２の検出鎖合成核酸で相補鎖の伸長反応をし、第１の検出鎖合成核酸の５’端で連結反応することにより、検出鎖を合成すること；
（ｄ）前記検出鎖について、第1の核酸配列と第1の検出鎖合成核酸との間、および第２の核酸配列と第２の検出鎖合成核酸との間の2箇所で分子内ハイブリダイズがなされること；
（ｅ）検出鎖の第1の検出鎖合成核酸の３’端と第２の検出鎖合成核酸の５’端を連結閉環することによって環状構造体を得ること；
（ｆ）前記環状構造体の連結部を含む配列を増幅すること；
（ｇ）（ｆ）の増幅により得られた増幅産物を検出することによって、前記核酸試料における検出部位の配列の検出を行うこと：
（２） （１）に記載の核酸配列検出方法であって、（ｅ）における連結閉環が、ライゲーションおよびギャップライゲーションからなる群より選択される手段により行われる方法。

（３） （２）に記載の方法であって、分子内ハイブリダイゼーションと連結閉環する工程が、予め設定された熱サイクリング条件下での熱サイクリングの実施と共に行われる方法：
（４） （１）〜（３）の何れか１項に記載の方法であって、更に、前記連結閉環した後に、連結閉環していない核酸を消化することを具備する方法：
（５） （１）〜（４）の何れか１項に記載の方法であって、（ｆ）の増幅工程が連結部を含んだ産物を生成するＰＣＲである方法：
（６） （１）〜（４）の何れか１項に記載の方法であって、（ｆ）の増幅工程が連結部を含んだ産物を生成する、ＲＮＡポリメラーゼのインビトロ転写によるＲＮＡ合成である方法：
（７） （１）〜（６）の何れか１項に記載の方法であって、前記結合可能なような修飾が、核酸のリン酸化である方法：
（８） （１）〜（７）の何れか１項に記載の方法であって、（ｇ）の工程が増幅産物とＤＮＡマクロアレイとのハイブリダイゼーションを検出することで行われる方法。

（９） （１）〜（７）の何れか１項に記載の方法であって、（ｇ）の工程が増幅産物とのハイブリダイゼーションと、検出可能な標識を備えた核酸のその増幅産物へのハイブリダイゼーションと、その検出可能な標識を検出して間接的に増幅産物を検出することで行われる方法：
（１０） （１）〜（９）の何れか１項の方法に用いる検出キットであって、酵素と、核酸と、基質と、バッファ、検出用マイクロアレイの何れか、もしくは全てからなる試薬を含む検出キット：
である。

図１は、本発明の概要を示す図である。 図２は、本発明の１態様を示す図である。 図３は、本発明の１態様を示す図である。 図４は、本発明の１態様を示す図である。 図５は、本発明の１態様を示す図である。 図６は、本発明の１態様を示す図である。 図７は、本発明の１態様を示す図である。 図８は、本発明の１態様を示す図である。 図９は、本発明の１態様を示す図である。 図１０は、本発明の１態様を示す図である。 図１１は、本発明の１態様を示す図である。 図１２は、本発明の１態様を示す図である。 図１３は、本発明の１態様を示す図である。 図１４は、本発明の１態様を示す図である。 図１５は、本発明の１態様の例を示す図である。 図１６は、本発明の１態様の例を示す図である。 図１７は、本発明の１態様の例を示す図である。 図１８は、本発明の１態様の例を示す図である。 図１９は、本発明の１態様の例を示す図である。 図２０は、本発明の１態様の例を示す図である。 図２１は、本発明の１態様の例を示す図である。 図２２は、本発明の１態様の例を示す図である。 図２３は、本発明の１態様の例を示す図である。 図２４は、本発明の１態様の例を示す図である。 図２５は、本発明の１態様の例を示す図である。 図２６は、本発明の１態様の例を示す図である。 図２７は、本発明の１態様の例を示す図である。 図２８は、本発明の１態様を示す模式図である。 図２９は、本発明の１態様を示す模式図である。 図３０は、本発明の１態様を示す模式図である。 図３１は、本発明の１態様を示す模式図である。 図３２は、本発明の１態様を示す模式図である。 図３３は、タイピング結果を示すグラフである。

Ｉ．分子内配列検出反応を利用する核酸配列検出方法
１．用語の説明
ここで使用される「核酸」の語は、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、mRNA、全RNA、hnRNA、合成RNAを含む全てのDNA及びRNAを意味するものとする。

ここで使用される「遺伝子」の語には、ゲノムに含まれるコーディングリージョンおよびノンコーディングリージョンの両方が含まれるものとする。

また、本発明の１態様に従うと、核酸配列検出方法が提供されるが、検出される核酸は、目的とする特定の配列、または何れかの遺伝子変異に関連する核酸であればよい。また、本発明に従う核酸配列検出方法では、これに限定されるものではないが、例えば、遺伝子の変異などの解析および／または検出および／または発現解析することが可能であってよい。また、本発明の方法に従うと、遺伝子変異解析に限らず、あらゆる核酸の解析および／または検出に好ましく利用されてよい。

ここで使用される「変異」の語は、これに限定するものではないが、SNPおよびマイクロサテライト配列などの繰り返し配列などを含む遺伝子多型、塩基の挿入、欠失および／または置換、並びにそれらの組み合わせ、ゲノムのメチル化などを示す。

ここで使用される「検出部位よりも５’側」および「検出部位の３’側」とは、当該変異部位およびその５’側または３’側の数塩基、例えば、１、２、３、４および５塩基などを指してもよく、更に、当該変異部位を除く当該変異部位よりも５’側または３’側の数塩基、例えば、１、２、３、４および５塩基などを指してもよいが、塩基の数は上記に限るものではなく、或いは６、７、８、９または１０塩基などであってもよい。また更に、検出部位に含まれる核酸配列、例えば、当該変異部位などを含んでもよく、当該部位の当該変異部位のみが含まれてもよい。

ここで使用される「第1の分子内検出配列の３’端と第2の分子内検出配列の５’端の少なくとも一方が核酸と結合が可能なように修飾されている」または「互いに結合可能なように修飾されている」とは、核酸の３’末端と５’末端を、それ自体公知の化学的または生化学的な手段によって結合することが可能なように修飾されていることをいう。これに限定されるものではないが、例えば、そのような結合可能な修飾は、５’へのリン酸基の付与、または特許３７５３９４２号にあるような、５位炭素に置換ビニル基をもった光感受性のあるピリミジン塩基の５’末端への付与である。後者は、光化学反応により可逆的な核酸の連結が可能である。

ここで使用される「検出鎖」とは、核酸試料の３’端および５’端にそれぞれ「分子内検出配列」が結合された配列をいう。当該検出鎖は、本発明に従って、分子内反応を生ずる核酸分子である。

２．発明の概要
本発明に従うと、次のような工程を含む核酸配列検出方法が提供される：
（１）検出鎖の合成反応
（２）分子内検出反応
（３）直鎖消化反応
（４）増幅反応
（５）検出反応
である。

本発明に従う検出鎖の合成は、核酸試料の３’および５’端に分子内検出配列を結合する反応である。

本発明に従う分子内検出反応とは、分子内検出配列に含まれる検出部位の３’および５’側に位置する配列に相補的な配列と、当該３’および５’側の配列を分子内ハイブリダイズする反応と、その後の環状構造体を合成する反応である。

本発明に従う直鎖消化反応は、任意の反応であり、行っても行わずともよいが、行った方が最終的により安定した結果を得ることが可能である。この直鎖消化反応は、環状構造体を形成しなかった分子内検出配列や試料に含まれる核酸を消化する反応である。

本発明に従う、増幅反応は、任意の反応であり、当該環状構造体自体を検出する場合、例えば、電気泳動および質量分析法などにより検出する場合には行わずともよい。他の場合、例えば、連結部位の付近を増幅することにより、当該環状構造を形成するための連結が達成されたか否かを検出する場合には、当該連結部位の付近を増幅すればよい。この場合、当該連結部位の相補配列である検出部位の配列は、増幅されないことが望ましい。そのために、当該環状構造を任意に切断してから増幅を行ってもよい。

本発明の１態様に従うと、以下を具備する核酸配列検出方法；即ち、
（ａ）核酸試料を準備すること；
（ｂ）前記核酸試料に含まれる当該検出部位よりも５’側に位置する第1の核酸配列に相補的な配列を含む第1の分子内検出配列と、当該検出部位よりも３’側に位置する第2の核酸配列に相補的な配列を含む第２の分子内検出配列を準備すること、ここで、第1の分子内検出配列の５’端の核酸と第2の分子内検出配列の３’端核酸の少なくとも一方が、互いに結合可能なように修飾されている；
（ｃ）前記核酸試料の５’末端に第1の分子内検出配列を、３’末端に第２の分子内検出配列を付与することにより、検出鎖を得ること；
（ｄ）前記検出鎖について、第1の核酸配列と第１の分子内検出配列との間、および第２の核酸配列と第２の分子内検出配列との間の２箇所で分子内ハイブリダイズがなされること；
（ｅ）第１の分子内検出配列の５’端と第２の分子内検出配列の３’端を連結すること；
（ｆ）（ｅ）の連結することにより環状構造体を得ること；
（ｇ）前記環状構造体から、前記核酸試料における目的の核酸配列の検出を行うこと；
を具備する方法が提供される。

このような本発明に従う１態様について、図１を用いて説明する。まず、検出しようとする検出部位２を含む核酸試料１を準備する（図１、１Ａ）。

次に、核酸試料１に対して、第１の分子内検出配列５および第２の分子内検出配列６を付与し（図１、１Ｂ）、検出鎖７を得る（図１、１Ｃ）。ここで、第１の分子内検出配列５は、当該被検部位２の３’側に位置する第１の核酸配列３に相補的な核酸を含む。また、第２の分子内検出配列６は、当該被検部位２の５’側に位置する第２の核酸配列４に相補的な核酸を含む。当該付与は、これに限定されるものではないが、例えば、少なくとも一組のプライマーを用いたＰＣＲ、片鎖ギャップライゲーション、並びに少なくとも一組のアダプターを用いたアダプタライゲーションなどにより行ってよい。ここで、第1の核酸配列３に相補的な第1の分子内検出配列５は、検出鎖７における第1の核酸配列３の３’側にある３’側末端に付与される。第１の核酸配列３の最も３’側にある塩基に相補的な塩基は第１の分子内検出配列５の最も５’側に存在する。第１の核酸配列３の最も５’側にある塩基に相補的な塩基は第１の分子内検出配列５の最も３’側に存在する。同様に、第２の核酸配列４に相補的な第２の分子内検出配列６は、検出鎖７における第２の核酸配列４よりも５’側にある５’側末端に付与される。また、第２の核酸配列４の最も５’側にある塩基に相補的な塩基は第２の分子内検出配列６の最も３’側に存在し、第２の核酸配列４の最も３’側にある塩基に相補的な塩基は第２の分子内検出配列６の最も５’側に存在する。即ち、第１の核酸配列３と第１の分子内検出配列５は各々の３’と５’側がひっくり返ってハイブリダイズする。第２の核酸配列４と第２の分子内検出配列６の同様に各々の３’と５’側がひっくり返ってハイブリダイズする。

得られた当該検出鎖７は、当該第１の分子内検出配列５と第２の分子内検出配列６を付与されたことにより、被検部位２の３’側に位置する第１の核酸配列３と被検部位２の５’側に位置する第２の核酸配列４の２箇所で分子内ハイブリダイゼーションが生じる（図１、１Ｄ）。それによってダンベル様の形状が形成される。

次に、第１の分子内検出配列５の３’端と第２の分子内検出配列６の５’端が連結され、閉環構造体９が形成される（図１、１Ｆ）。この連結は、被検部位２に応じて、達成されたり、達成されなかったりする。即ち、検出しようとする被検部位２が当該反応系に存在する場合には、当該連結が達成され、当該反応系に存在しない場合には、当該連結は達成されない。或いは、例えば、ＳＮＰの検出する場合には、当該被検部位２の塩基の種類が所望の遺伝子型を形成する種類の塩基である場合には連結が達成され、他の種類の塩基が存在する場合には当該連結が達成されない。また、このような連結は、第1の分子内検出配列５の５’端の核酸と第2の分子内検出配列６の３’端核酸の少なくとも一方が、互いに結合可能なように修飾されているために達成される。また、このような連結は、５’端または３’端の核酸の伸長を含んでもよく、伸長を含まなくともよい。言い換えると、当該連結は、ライゲーションにより行われてもよく、ギャップライゲーションにより行われてもよい。

閉環構造体９は、それが属する当該反応系において、加熱したとき連結部１１と被検部位２との間の２重鎖核酸が熱変性して解離し、分子内２重鎖を形成していない環状構造体１０になる(図１、１Ｈ)。

このような環状構造体１０の検出および／または定量は、反応生成物を電気泳動および／または質量分析に供することにより行ってもよく、また、当該連結部１１を挟み込むような伸長産物または増幅産物を形成可能なプライマー対１２ａおよび１２ｂを用いる反応により形成し、得られた伸長産物または増幅産物を検出および／または定量することにより行ってもよい。また、環状構造体１０を形成した後に、環状構造体１０以外の核酸を酵素によって消化してもよい。それによって、環状構造体１０の検出および／または定量をより容易に且つ正確に行ない得る。

当該伸長産物または増幅産物の検出および／または定量は、そのような検出および／または定量が可能なそれ自身公知の何れの手段を用いて行ってもよい。例えば、当該伸長産物または増幅産物に特異的に結合可能なプローブを用いてもよく、当該プローブはマイクロアレイまたは蛍光ビーズなどに結合されたものを使用してもよい。また、前記プライマーに標識を付しておいてもよい。

図１中、核酸試料１は1本鎖として記載されているが、２本鎖として準備されてもよい。しかしながら、最終的に環状構造体となるのは、当該２本鎖のうちの何れか一方であり、どちらの核酸鎖が利用されるかは、第１および第２の分子内検出配列の設計に依存する。

また、図１の１Ｂ（即ち、検出鎖の形成時）から１Ｈ（即ち、環状構造体の形成）までの工程を行うと同時に、または図１の１Ｃの後（即ち、検出鎖が形成された後）から１Ｈまでの工程を行うと同時に、熱サイクリングを行ってもよい。ここでいう「熱サイクリング」とは、反応系の温度を任意の温度間で上げ下げすることをいい、これによって、より適切な分子内ハイブリダイゼーションを得ることが可能になる。ＰＣＲ増幅をした核酸で分子内反応をするときに、２本鎖核酸を熱変性し1本鎖化することによって、２本鎖を周期的に確実に熱変性する段階を入れることができ、２本鎖の再会合による分子内反応の阻害を防いで分子内ハイブリダイゼーションを進めることができるので有利である。

ここで使用される「分子内検出配列」とは、本発明に従う検出鎖の両端に存在し、当該検出鎖上において検出の実施者が検出しようとする配列と相補な配列を有する。当該分子内検出配列は、必要に応じて相補鎖合成のためのプライマーであってもよく、ライゲーションを行うためのプローブは配列として機能してもよい。また更に、当該検出鎖は、検出部位の配列の上流と下流にハイブリダイズ（即ち、分子内ハイブリダイズ）して相補鎖を形成してそれによって分子内構造を合成する部分として分子内検出配列を含み、これはギャップライゲーションをして当該検出鎖を含む２重鎖を合成するものであったり、または検出鎖を合成するためのプライマーであってもよく、更に、それ自身が連結配列であってもよい。また、分子内検出配列は、プライマーや連結配列の他に更なる所望の配列または任意の配列を有してもよい。

任意の配列は、人工的に設計された人工設計配列であってもよい。ここで使用される「人工設計配列」とは、人工的に設計された核酸配列を指示する。人工設計配列は、特に、使用者の目的に合わせて任意に、また何かを目的として意図的に設計してよい。例えば、本発明に使用される人工設計配列は、識別および／または伸長のために利用可能してよい。

本発明に従い核酸試料の両末端にプローブ配列が存在するように設計する方法により、プローブを別に合成し、大量に投入しなくて済み、且つ分子内反応を利用する方法であるために被検部位と各プローブとのハイブリ効率が高い。従って、プローブ合成のコストを減らし、および大量に投入することでの非特異反応を回避することができることが利点である。

また、本発明に従うと、核酸試料の両末端にプローブ配列が存在することにより、核酸試料の形成する２次構造よりもより安定なハイブリッドを形成することが可能であるので、従来のようにプローブを別途用意して、核酸試料とハイブリダイズさせる方法では、しばしば核酸試料の反応阻害性の２次構造による阻害がおきるために検出できない配列があった。このような反応阻害性２次構造に比べてより安定な構造を分子内ハイブリダイゼーションによって形成することで、これまで検出できなかった配列の検出を可能にしたり、検出効率を上げることが可能である。

本発明に従うと、最初の増幅反応のときに分子内ハイブリダイゼーションのためのプローブが付加されるので、ＰＣＲ増幅のかかった核酸のみで連結反応が起こるが、ＰＣＲ増幅が起きた上で、更に閉環反応が起きなければ検出シグナルが出ないので、従来の別途プローブを加える方法に比べて非特異な連結反応が起きにくいという利点がある。

３．第１の態様
（１）ＰＣＲにより検出鎖を合成する方法
図２および図３を用いて、本発明に従うＰＣＲにより検出鎖を合成する方法の例を説明する。

図２を参照されたい。この方法で用いる第１の分子内検出配列２１は、第１のプライマー配列２３と検出部位の５’側の配列に隣接する配列に相補的な配列である第１の分子内検出プローブ配列２４とを有する。第２の分子内検出配列２２は、第２のプライマー配列２５と、検出部位の５’側の配列に隣接する配列に相補的な配列である第２の分子内検出プローブ配列２６を有し、更にその５’末端はリン酸化されている。

図３を参照されたい。核酸試料３１は第１の１本酸核酸３１ａと第２の１本鎖核酸３１ｂからなる２本鎖である。核酸試料３１は、第１の検出部位３２ａと第２の検出部位３２ｂを有する。

第１のプライマー配列２３と第２のプライマー配列２５がそれぞれに核酸試料３１の適切な場所に結合する。即ち、この場合には、第１のプライマー配列２３は、第１の核酸試料３１ａの検出部位３２ａよりも３’側に結合する。同様に、第２のプライマー配列２５は、第２の核酸試料３１ｂの適切な場所に、この場合には、第２の核酸試料３１ｂの検出部位３２ｂよりも３’側に結合する。

その後、核酸伸長が可能な条件下で、好ましくは核酸増幅が可能な条件下で反応が進行され、検出鎖３３ａと、それに相補な一本鎖３３ｂを含む２本鎖３３が得られる。５’末端がリン酸化された検出鎖３３ａは、次に、一本鎖とされ、分子内ハイブリダイゼーションが生じ、検出部位の塩基が使用した分子内検出プローブと一致する場合には、ライゲーションが生じて環状構造体が形成される。

ここで、本発明に従って使用される第１および第２の分子内検出プローブの長さは、５塩基〜３０塩基であればよく、好ましくは１０塩基〜２０塩基であればよく、更に、通常のリガーゼおよび耐熱性のリガーゼによる連結反応に適した３０℃〜６０℃までの温度でハイブリッドを形成するものであればよい。また、第１のプライマー配列の相補鎖は、当該検出鎖の検出部位の配列よりも下流にハイブリダイズするように配列を選択することが必要である。当該第１および第２のプライマー配列の長さは、約１５塩基〜約６０塩基が適切であり、また、耐熱性ポリメラーゼを使ったＰＣＲ反応のアニーリング温度に適切な４０℃〜７２℃の範囲でハイブリッドを形成するものであればよい。また、第２のプライマーには、ＳＮＰ塩基に隣接する検出しようとする配列、即ち、検出部位の配列、と相補的な分子内検出プローブ配列を５’端に備えており、更に、その５’末端はリン酸化されている。第１のプライマー配列は、検出鎖における検出部位のＳＮＰに隣接する上流の配列と同一の配列を備えている。

本明細書における「核酸伸長が可能な条件下」とは、それ自体公知の核酸伸長が可能な何れの条件でもよいが、伸長反応を実施するに当たり、適切、より適切または最も適切な条件の選択は、本発明の実施者によって自由に選択されてよい。例えば、核酸伸長が可能な条件とは、本発明に従う適切なプライマーと、それ自身公知の何れかの核酸伸長用の酵素類、反応液の塩濃度バランスなどを調節するためのそれ自身公知の何れかのバッファ成分およびｄＮＴＰ混合物などを含み、且つ、伸長に適切な反応温度が維持された環境であればよい。また、ここで使用される「伸長」とは、それ自身当業者に公知の何れの伸長方法であってもよく、更に、伸長を繰り返す増幅方法であってもよく、例えば、ＰＣＲおよびアシンメトリックＰＣＲなどの増幅方法であってもよい。

（２）合成した検出鎖を用いてライゲーションでＳＮＰを検出する方法
更に詳しく、上記の内分子検出配列を用いたＳＮＰ検出方法の例について説明する。この例では、ヒドゲノムからＳＮＰを本発明に従って検出する場合について説明する。

例えば図１にある第１の内分子検出配列５および第２の内分子検出配列６を用いて行う例を示す。これらの第１および第２の内分子検出配列５および６に含まれるプライマー配列の長さは３０塩基程度の長さにし、第１の分子内検出プローブ配列２４および第２の分子内検出プローブ配列２６は、各々１５塩基程度にする。このように当該プライマー配列と当該分子内検出プローブ配列長さを変えることによってハイブリッドの安定度に差がつき、ＰＣＲ中に、第１の分子内検出プローブ配列２４や第２の分子内検出プローブ配列２６が、それらに相補的な配列に対してハイブリダイズしてＰＣＲが阻害されることが少なくなる。更に、第１の内分子検出配列２１の第１の分子内検出プローブ配列２４には、検出鎖上のＳＮＰとＳＮＰの３’側の配列を選択して割り当てる。また、第２の内分子検出配列６の第２の分子内検出プローブ配列２６には、検出鎖上のＳＮＰの５’側の配列に相補な配列を選択して割り当てる。第１の内分子検出配列２１のプライマー配列２３は、検出鎖の相補鎖上のＳＮＰよりも５’側の配列を選び割り当てる。第１の内分子検出配列２２のプライマー配列２５には検出鎖のＳＮＰよりも５’側の配列を選び割り当てる。また更に第２の内分子検出配列２２の５’端がリン酸修飾されている。

これら、第１および第２の内分子検出配列を用いて、ヒトの遺伝子であれば、１０ｎｇから数十ｎｇ程度のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを実施する。ＰＣＲには通常用いられるＴａｑポリメラーゼを使用してもよいが、これに限定するものではなく、耐熱性酵素であれば、それ自身公知の何れの酵素を使用してもよい。３０〜４０サイクル程度のＰＣＲによって、図３にあるような両末端に検出配列を備え、検出鎖の５’端にリン酸基をもつ増幅産物が得られる（図３）。

次の分子内検出反応では、例えば、耐熱性リガーゼ、Ｔａｑリガーゼなどを用いると比較的高温で反応することができる。閉環産物内で標的配列に対して特異的な反応が保証できるならば、非特異なハイブリッド形成がおきやすい低温であっても、反応温度を低く選び、耐熱性でないＴ４リガーゼ等を使用してもよい。分子内検出反応を行うために、先の工程のＰＣＲ反応液からＰＣＲ産物を採取し、リガーゼ反応に適したバッファに混合する。その後、幅広い温度制御ができるＰＣＲサーマルサイクラなどにより反応を進める。熱サイクルは、最初に２本鎖を変性し、検出鎖」を１本鎖にする９５℃程度の高温過程から始まり（図４(４Ａ)）、図４の（４Ｂ）に記載するような分子内構造を形成させ、（４Ｃ）に示すようにアニーリングとリガーゼによる連結反応を行う。

ここで、アニーリングと連結の温度を異なるように設定してもよく、ＰＣＲのように変性工程を含めた熱サイクルを数サイクルから数十サイクル繰り返してもよい。また、温度をサイクルが進む毎に変更する熱サイクルにしてもよい。この工程により、リガーゼによるミスマッチハイブリッドの識別を利用することによって、高い精度を得ることができる。

ここで、図５（５Ａ）に示すように、検出鎖が３’末端にＳＮＰ塩基と相補な塩基を持たない場合、当該検出鎖は、リガーゼにより連結されることはない。それに対して、図５（５Ｂ）に示すように当該部分が相補であれば、当該検出鎖はリガーゼにより連結されて末端の露出のない閉環構造となり、環状構造体が形成される。

分子内反応に続き、必要に応じて、反応液に残るプライマーやゲノムＤＮＡ、未反応の検出鎖や検出鎖の相補鎖などを分解する直鎖消化反応を行ってもよい。ここでは、先の分子内検出反応液に、エキソヌクレアーゼＩまたはＩＩＩなどの核酸消化酵素を入れ、必要に応じてバッファ成分、例えば、塩濃度、変性剤の添加、ｐＨ値など、を調整して一定温度で分解反応する。当該直鎖分解が終了した後、念のため９５℃で１０分程度処理により、使用したヌクレアーゼなどの酵素を失活してもよい。

次に、図６に記載するように第１のプライマー６１と第２のプライマー６２を用いて環状構造体６３についてＰＣＲを行う。ここで、第１のプライマー６１は、第１のプライマー配列２３の相補鎖、第２のプライマー６２は、第２のプライマー配列２５の相補鎖であってもよい。このようにすると、目的とするＳＮＰが存在する場合には、分子内反応が起きて閉環されているので、増幅産物が得られる。ここでは、直鎖分解が済んだ、閉環を含む反応液の一部をとり、通常のＰＣＲ増幅を行えばよい。また、ここで使用されるプライマーは閉環の連結部を含む増幅産物を得られるように設計すればよい。例えば、得られやすい増幅産物は、約１０００塩基以下の長さであり、そのような増幅産物が得られるように他の任意の配列を選択してもよい。この増幅の工程を実時間ＰＣＲ装置で行う場合には、次の検出工程を省略してもよい。

最後に、期待する長さのＰＣＲ産物が得られたかを検出するために、例えば、電気泳動し、目的のＳＮＰが存在するか否かを判定してもよい。このＰＣＲ産物を確認するためには、先のＰＣＲを定量的ＰＣＲにしてもよい。電気泳動ゲルは、通常のスラブゲルであってもよく、キャピラリ電気泳動であってもよい。ゲルの材料は、アガロースであっても、ポリアクリルアミドなど、それ自身公知の何れの電気泳動用のゲルを使用してよい。また、分子ふるい効果のある電気泳動に適したマトリックスであればいずれでも使用してよい。ＤＮＡを染色するためにエチジウムブロミドおよびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなどの蛍光を発するインターカレータを使用することも好ましい。

４．第２の態様
ギャップライゲーションによる検出鎖合成
本発明に従うと、以下のような検出鎖を合成するための分子内検出配列を使用してよい。図７に示すような第１の分子内検出配列（７Ａ）および第２の分子内検出配列（７Ｂ）は、ライゲーションによりＳＮＰを分子内検出するために必要であってよい。分子内検出配列７１は、プライマーとして使用し、分子内検出配列７２はプライマーの下流にあってポリメラーゼによる相補鎖合成の終結点でリガーゼにより連結される核酸である。何れも検出鎖の一部をなす。分子内検出配列７１は、５’端に分子内検出プローブ配列７４を備える。この配列は、プライマー７１により合成される検出鎖上のＳＮＰに隣接する上流側の検出部位の配列と相補的であり、５’端がリン酸化されている。また、３’端のプライマー配列７３は、検出鎖の検出部位の配列の上流に位置する配列である。このプライマー配列７３の長さは、約１５塩基〜約６０塩基程度が適切であり、耐熱性ポリメラーゼを使ったＰＣＲ反応のアニーリング温度に適切な４０℃〜７２℃の範囲でハイブリッドを形成するものであればよい。分子内検出配列７２は、３’端に分子内検出プローブ配列７５を備えており、これは検出鎖の検出する配列の下流の配列と同一である。また、その５’端はリン酸化されている。

本発明に従う、片鎖のみを合成する方法の場合、両端に検出用プローブを備えた核酸(図１１（１１Ａ）)が1本鎖で生成する(図１１（１１Ｂ）)。それによって、ＰＣＲ増幅で被検配列を含む核酸の両端に検出用プローブを埋め込んだときにように生成する核酸が２本鎖でなく、分子内ハイブリダイゼーションをするときに核酸の再会合による阻害がおきないので有利である。

５．第３の態様
（１）ギャップライゲーションによる検出鎖合成
更なる本発明に従うと、以下のような検出鎖を合成するための分子内検出配列を使用してよい。例として以下の分子内検出配列を、１塩基多型の検出する場合に用いる場合を説明する。図８を参照されたい。上記のギャップライゲーションによる検出鎖合成（１）の場合、即ち、ライゲーションで分子内検出反応を行う場合と異なり、第２の分子内検出配列７５（図７（７Ｂ））に相当する配列として３’端にＳＮＰ塩基と相補な塩基を備えた分子内検出変異プライマー配列８５（図８（８Ｂ））を備える。また、第１の分子内検出配列７４（図７（７Ａ））に相当する配列は、この例では、検出鎖上でＳＮＰよりも下流にある配列に相補的な下流連結配列８４であればよい。それぞれの配列は、ポリメラーゼによる伸長反応を行うのに適切な３０℃〜７２℃以下の反応液中で安定なハイブリッドを形成するような長さ、例えば、約１５塩基〜約４０塩基程度にすればよい。

ＰＣＲ以外の方法でも検出鎖を合成することができる。先に図１０（Ｂ）にあるような構造をもつ核酸1と核酸2を準備し、検体のＤＮＡ、例えばヒトゲノムＤＮＡとハイブリダイズさせる。検体DNAは、例えばヒトゲノムであれば４００ｎｇ程度で、ＰＣＲで検出鎖をするよりもずっと多めにするのが適当である。また、核酸１、２の量は反応温度や検体ＤＮＡ量にもよるが、検体ＤＮＡ分子1に対して等量もしくは1倍以上の量比で存在すればよい。これら核酸１、２の濃度は等量であっても良いし、違っていても良い。

ギャップライゲーションによる検出鎖合成は、ポリメラーゼによる核酸１をプライマーとした相補鎖合成と、その相補鎖の３’末端と核酸２のリガーゼによる連結反応からなる。この反応が同時に進むように両方の酵素を同時に反応液に入れておいても良いし、最初にポリメラーゼを入れ、ポリメラーゼ反応後にリガーゼを入れてもよい。また、反応温度は検体がゲノムＤＮＡであった場合、９５℃で変性後４℃に急冷してハイブリダイゼーションが起きやすいようにする変性工程を入れても良い。ポリメラーゼにはKlenowフラグメント、Taqポリメラーゼなど鎖置換活性がないポリメラーゼが適当である。ポリメラーゼ伸長反応の温度は、ポリメラーゼの至適温度と、核酸１、２の融解温度（Tm）により適当に選ぶ。例えばポリメラーゼにKlenowフラグメントを用いるときは３７℃程度にし、核酸１が安定に特異的にハイブリッドを形成するようＴｍを設計する。リガーゼによる連結反応の温度は、リガーゼの至適温度と核酸２のＴｍにより適当に選び、適切なのはリガーゼの至適温度範囲内であって、Ｔｍから５〜１０℃高い温度であろう。反応時間はリガーゼの失活の恐れがあるので、一般的に９０分以内にしておくことが好ましい。

（２）ギャップライゲーション閉環によるＳＮＰの検出
ＭＩＰ法（特表２００４−５２８０１６）の閉環反応のように反応液を４つの容器に４分割し、それぞれの容器に含まれる液に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＴＴＰの何れかを単独で添加する（図９（９Ｂ））。これにより、ポリメラーゼにより取り込まれる塩基を１種類に限定した状態でギャップライゲーションが行える（図９（９Ｃ））。このとき、分子内検出プライマー配列は、末端にＳＮＰ塩基を含まず、ＳＮＰの隣接塩基までの配列にすればよい。このときの配列の長さもギャップライゲーションによるプライマー、連結配列の長さと同様に、ポリメラーゼによる伸長反応を行うのに適切な３０℃〜７２℃以下の反応液中で安定なハイブリッドを形成するような長さ、例えば、約１５塩基〜約４０塩基程度にすればよい。

何れの配列も反応温度で安定な２次構造をとらないように、市販のＶｉｓｕａｌ ＯＭＰ（ＤＮＡ ｓｏｆｔｗａｒｅ社）またはＷｅｂ上で公開されているＶｉｅｎｎａ Ｐａｃｋａｇｅ（ウィーン大学理論化学研究所、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｂｉｕｎｉｖｉｅａｃａｔ／ＲＮＡ／）などの構造計算ソフトウェアで構造を算出し、反応が進むように配列を選ぶ必要がある。また、単に検出したい変異の周辺の配列からプライマーや連結配列を選ぶのではなく、遺伝子に特異的な配列を選択し、複数の箇所にハイブリダイズして反応効率が低下しないようにしてもよい。このためには、例えば、タプル法（特許第３６１０３０３号）やＢＬＡＳＴ（ＡＬＴＳＣＨＵＬ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）による検索などで遺伝子特異配列を選抜することができる。このような手段は、本発明に従う他の態様においても利用することができる。

また更に、検出鎖を合成し、分子内検出するための各種核酸の構造は、１反応の中で１つの配列以上で検出することも可能である。即ち、１反応液中で複数の配列を検出するために人工配列を検出鎖に取り込ませ、この人工配列で検出する配列を見分ける方法である。このような方法も、本発明の何れの態様において使用してよい。

本発明に従うと、この人工配列を利用するための配列順序は容易に決定可能である。本明細書に記載の種々の検出用核酸を検出鎖を合成するための配列(例えば、プライマーまたは連結配列)と分子内反応をするための配列（即ち、分子内検出プローブ配列など）に分類する。このような分類をしたとき、検出鎖を合成するための配列と、分子内反応を行うための配列の間に人工配列を配置すればよい。これら人工配列は、その検出用核酸にユニークな配列にしてよい。ただし、ＳＮＰ検出に用いる第２の分子内検出プローブ配列は最大４種類、通常、２種類でよく、検出時に工夫をすることにより、検出するＳＮＰの位置に関わらず２種類の人工配列をそれぞれの変異に割り当てればよい。もしも２種類のアレルのあるＳＮＰをｎ個（ここでｎ≧２である）、例えば１００箇所同時に検出する必要がある場合には、第２の分子内検出プローブ配列（即ち、分子内検出変異プローブ配列、図中、ＡＳＯとも記す）は２種類、第１の分子内検出プローブ配列用の人工配列（即ち、分子内検出共通プローブ配列、図中、ＬＳＯとも記す）はｎ種類、例えば１００種類準備し、ｎ＋2種類（例えば１０２種類）の人工配列で検出することが可能である。また或いは、もしも４種類のアレルのあるＳＮＰをｎ個同時に検出する場合には、４種類のアレルとｎ種類の当該人工配列を準備すればよく、即ち、例えば１００箇所のＳＮＰを同時に検出する必要がある場合には、１０４種類の人工配列で目的のＳＮＰを検出することが可能である。

さらに、増幅用共通配列として人工配列を利用してもよい。このときには、図１０のように核酸１に、更にもう１つの人工配列を導入してもよい。先にあげた例のように２種類のアレルのある１００箇所のＳＮＰを検出するとき、上流プライマー側の人工配列は共通プライマー配列として１種類に限定し、ＬＳＯ側の人工配列はＳＮＰの位置に対応して１００種類使ってもよい。一方、核酸２の人工配列はアレルの数の２種類あればよい。こうすれば、共通プライマー配列とアレルの２種類のプライマーにより分子内検出反応で連結された配列をＰＣＲ増幅することができ、ＳＮＰごとに変異を見分けることが可能である。

このような手段も本発明の何れのギャップライゲーションによる検出鎖合成の態様において利用してよく、核酸１を第１の分子内検出配列として、核酸２を第２の分子内検出配列として使用してよい。

本発明に従う、片鎖のみを合成する方法の場合、両端に検出用プローブを備えた核酸(図１１（１１Ａ）)が1本鎖で生成する(図１１（１１Ｂ）)。それによって、ＰＣＲ増幅で被検配列を含む核酸の両端に検出用プローブを埋め込んだときにように生成する核酸が２本鎖でなく、分子内ハイブリダイゼーションをするときに核酸の再会合による阻害がおきないので有利である。

６．第４の態様
アダプターライゲーション
図１３は、制限酵素断片へのアダプター連結による検出鎖の合成に使うアダプター構造を示している。例では、５’端突出型の切断端をもつ制限酵素１１１および１１２で消化した場合について示している。アダプター１０１、１０２は、それぞれ大部分が２本鎖であり、一部が１本鎖である。ここでは、検出鎖の５’端を含むアダプターをアダプター２と称す。このとき、アダプター１０１は完全な２本鎖の分子内検出プローブ配列を備え、制限酵素１による切断端にハイブリダイズして２本鎖を形成するアダプタ配列を備えている。特に、分子内検出プローブ配列に相補な配列の５’端はリン酸化されておらず、アダプター配列の５’はリン酸化されている。一方、アダプター２はアダプター１と同様な構造を持つが、制限酵素２の切断端にハイブリダイズするアダプター配列を備え、検出鎖の５’端となる末端がリン酸化されている。アダプター側の５’端はリン酸化していてもよいし、していなくてもよい。ここで、ＳＮＰを分子内検出する場合には検出鎖の３’となる分子内検出プローブの３’末端に検出するＳＮＰ塩基に相補な塩基が来るように配列を選び、検出鎖の５’端となる分子内検出プローブ配列は検出する配列のＳＮＰ塩基の上流側に相補的な配列を備えていることが好ましい。

図１３に示したアダプターを用いてアダプターライゲーションを行う例を図１４に示す。

まず、被検試料１４１に対して、制限酵素１と制限酵素２を反応させる。それにより、被検試料１４１は、制限酵素１によって１４２ａの部位で切断され、制限酵素２により１４２ｂで切断される。その後、制限酵素１による切断部位にアダプター１を、制限酵素２による切断部位にアダプター２を結合させる。それぞれの結合によりアダプター１は部位１４３ａとなり、アダプター２は部位１４３ｂを形成する。これらのうち、５’末端がリン酸化されている方の一本鎖１４４ｂが分子内構造を形成し、環状構造体１４５が得られる。この環状構造体１４５をそれ自身公知の何れかの手段により検出すればよい。

制限酵素１と２の選び方により、標的とするＳＮＰを含む制限酵素断片の両端が制限酵素１のみ、もしくは制限酵素２のみによる切断端になることがある。また、制限酵素１と２の位置関係が意図したものと逆になる場合があるので制限酵素の選択には注意を要する。

７．第５の態様
電気泳動による検出方法
これまで挙げた何れかの態様により、標的配列の存在に応じて閉環核酸が得られたとする。この閉環核酸を電気泳動により検出する態様を説明する。一般的に環状核酸、プラスミドなどは、同じ分子量の直鎖ＤＮＡと並行してゲル電気泳動したとき、泳動度が直鎖のものよりも大きくなる。この性質を用いれば、閉環核酸が生じたかをゲル電気泳動により判定することができる。

また、本発明の方法により得られた環状核酸の部分配列を増幅してその部分配列を検出する場合を示す。第３の態様の（２）に従って説明すれば、第２の分子内検出プローブ配列に隣接して配置する人工配列プライマーに蛍光色素を標識し、第１の分子内検出プローブに隣接して配置した人工配列プライマーとで閉環部をはさむような配列の向きにし、ＰＣＲ増幅を行えば、閉環していれば増幅産物が得られる。例えばこの第１の分子内検出プローブに隣接するプライマーの５’側に、検出したいＳＮＰの位置と長さが対応するように追加の配列を数塩基、好ましくはＳＮＰ位置ごとに５塩基程度の違いのあるテール配列を付けておく。更に、好ましくは第２の分子内検出プローブ側のプライマーの蛍光標識はアレルごとに色素を変えておくのがよい。また、共通の色素にしてプライマーの長さをテール配列の付加により変えておいてもよい。こうして得られた蛍光標識済みＰＣＲ産物を、アプライド・バイオシステムズ社のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒなどの短鎖を精密に見分けることができる電気泳動装置を使って電気泳動すれば、ＳＮＰ位置に対応した分子量でアレルに応じて蛍光の色の違うピークが得られ、タイピング結果を読み取ることができる。

８．第６の態様
質量分析による検出方法
質量分析により本発明の検出を行うには、次のような手段を用いる。第３の態様の（２）に従って説明すれば、第２の分子内検出プローブ配列に隣接して配置する人工配列のプライマーと、第１の分子内検出プローブ配列に隣接して配置する人工配列のプライマーで閉環したときにＰＣＲ産物が得られるように増幅し、このＰＣＲ産物を質量分析機で検出する。例えばシーケノム社のｉＰＬＥＸシステムなどが核酸の質量分析に適している。

このＰＣＲ産物はＳＮＰ周辺の配列を含むため、質量分析のピーク位置は予想できない。このために質量分析機で予めどの位置にピークが現れるかを調べておく。更に、ＳＮＰとアレルごとに、質量ピークが異なるようにプライマーの長さをテール配列を付加して調整し、ＳＮＰごとに大まかにピーク位置が異なり、アレルは少しだけ異なるようにする。こうすれば、容易に質量分析によって本発明の検出ができる。

９．第７の態様
更に本発明の態様に従うと、核酸配列検出用キットが提供される。当該キットは、核酸試料に含まれる検出部位よりも３’側に位置する第1の核酸配列に相補的な配列を含む第1の分子内検出配列と、当該検出部位よりも５’側に位置する第2の核酸配列に相補的な配列を含む第２の分子内検出配列と、（ここで、第1の分子内検出配列の３’端の核酸と第2の分子内検出配列の５’端核酸の少なくとも一方が、互いに結合可能なように修飾されている）のうちの第１の分子内検出配列および／または第1の分子内検出配列を少なくとも含めばよく、更に所望のＰＣＲ、ライゲーション反応、核酸消化反応および／またはハイブリダイゼーション反応などのためのバッファ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ポリメラーゼおよび／またはリガーゼなどの酵素、３８４穴マイクロプレート、９６穴マイクロプレートおよび／またはエッペンドルフチューブなどの反応容器、マイクロアレイなどの検出デバイスなどを含んでもよい。

また、更なる本発明の態様に従うと、核酸配列検出方法のみならず、本発明に従う環状構造体の製造方法も本発明に含まれる。

本発明の態様により、非特異反応が生じにくく、且つ低コストで実行することの可能な核酸配列を検出するための手段を提供された。

II．遺伝子変異解析
本発明の更なる態様に従うと、また、遺伝子変異解析方法も提供される。

現在のところ1つの薬剤や疾病の感受性と関係のあるSNPセットは先に挙げた約300万カ所のうち、多くて数百カ所、数十カ所程度であると考えられる。例えばロシュ社の提供している薬剤感受性関連蛋白であるシトクロームP450のSNPタイピング用マイクロアレイでは遺伝子CYP2D6は29カ所、CYP2C19は2カ所のアレルをタイピングできるようになっており、合計31カ所を調べることができる。このように、診断では、何万カ所、何千カ所をタイピングする必要はなさそうではあるが、数十カ所、多くて百数十カ所程度のSNPのタイピングは必要になるであろうと考えられている。これだけのタイピングにサンガー法を適用するには数が多い。従って、ほかのより実験手順のシンプルな方法、例えばSSCP（Single Strand Conformation Polymorphism）法、SSP-PCR（Sequence Specific Primers -PCR）法、蛍光TaqManプローブによるリアルタイムPCR解析法、等が使用される。これらの方法は、1本の反応チューブ内で1つのSNPのアレルが存在するか否かを調べる、いわゆる「モノプレックス」の検出方法である。モノプレックス法では反応容器をSNPの数だけ準備し、それぞれに検体のゲノムDNAを入れる必要がある。従って、同時に処理できる検体数が限られ、試薬量も検体のゲノムDNAが多く必要である。

これらモノプレックス法に対して、90年代後半から提案されてきたのがマルチプレックス法である。先に挙げたロシュ社のシトクロームP450蛋白質のSNP検出用マイクロアレイも、1本の反応容器で反応し検出する点ではマルチプレックス法と呼ぶことができる。しかしながら、ロッシュ社の他に、より複雑で検出の柔軟性が高い方法が提案されてきた。

そのような方法の１例は、マルチプレックス法である。この方法は、天然の遺伝子配列を人工の配列に変換し、変換された当該人工設計配列の識別および／または検出を利用する方法である。マルチプレックス法の鍵となるのは、タグと呼ばれる人工設計配列部分である。この方法では、複数の遺伝子を予め割り当てられた通りに、1対1対応でタグに変換して、それによって同一の溶液内で複数の遺伝子が検出される。従って、対象となる遺伝子の検出は、変換されたタグの検出によって達成される。そのために当該タグの設計には2つのことが重要である。まず第1には、それぞれのタグが、独立に反応し、互いにクロスハイブリダイゼーションしないことである。第2には、同一溶液で同時に反応するために使用されるタグの融解温度（即ち、Tm値）が揃うことである。タグを利用する検出は、個々の遺伝子配列を相補的プローブを利用して検出する場合と異なり、検出段階ではいつも同じ一連のタグを利用できる。従って、これは検出対象の遺伝子が変わっても、同一の検出手法および／または検出デバイスを使える柔軟性のある技術である。

このような方法として例えば、コーネル大学のバラニーらはLDR（Ligase Detection Reaction）なる方法を開発した。この方法では、リガーゼを使ったSNP検出方法とジップコードと呼ばれるタグへの遺伝子の変換技術が組み合わされる。その結果、同一の反応液内で複数のSNPが検出される。これはABI社の検出キットSNPlexとして商品化されている。（特表2000-511060号公報、特表2001-519648号公報、特表2004-526402号公報）
また、オーキッド・セルマーク(Orchid Cellmark)社は、1反応液中で検出反応し、マイクロプレートの底に配置したマイクロアレイで48種類のアレルを見分けるSNP-ITという方法を提供している（特許第3175110号明細書、特表2002-508664号公報）。

現在もっとも成功を収めていると思われるのは、イルミナ(Illumina)社の提供する方法である。この方法は、ポリメラーゼ伸長反応とリガーゼの連結反応を行ってSNPを検出した後で、目的とする核酸配列をジップコード配列に変換し、マイクロアレイと同様なシステムである独自の検出デバイス(Bead Arrayと称される)を用いることにより、最大で約1500種類のジップコード配列を同時に検出する方法である（特表2002-519637号公報、特表2003-521252号公報）。

TM・バイオサイエンス(TM Bioscience)社は、ルミネックス(Luminex)社の蛍光で色分けしたビーズを利用して検出するマルチプレックス反応キットを提供している(特表2004-522440号公報、特表2004-526433号公報)。これは、研究用途の遺伝病検出キットとして提供されている。

このような技術において、遺伝子のタグへの変換反応は重要である。現在、当該変換に使用される反応には、リガーゼ連結反応（OLA：Oligonucleotide Ligation Assay）や、ポリメラーゼによる1塩基伸長などがある。それぞれの方法において、ミスマッチハイブリッドを識別する酵素の能力を最大限に生かしている。リガーゼ反応では、連結するプローブの3’末端にSNPの塩基が配置されるようにプローブ配列が設定される（Luo、J. et al, Nucl. Acids Res. 24, 3071-78 (1996)）。

パーレル(Parallele)社は、MIP（Molecular Inversion Probe）法を提供している。これは、閉環プローブとギャップライゲーション法とを利用し、プローブ合成コストを下げ、反応効率を高めたタグを用いることによるマルチプレックスタイピング法である（Hardenbol, P. et al., Nat. Biotechnol. 21, 673-678 (2003)、Hardenbol, P. et al., Genome Res. 15, 269-675 (2005)）。

DNAコンピューティングは、多くのマルチプレックス法の開発と商品化が進む中で、遺伝子検出に大きな変化をもたらしつつある技術である。このDNAコンピューティングは1994年に南カリフォルニア大学のエーデルマンが最初に提案したものである。それはDNAの反応により電子計算機が苦手とする組み合わせ問題を解いた実験の論文である。この論文はDNAを使って計算ができ、問題によっては電子計算機を上回る速度とはるかに少ないエネルギーで計算できることを示した。しかしそれだけでなくこの論文以降のDNA計算研究の成果は、遺伝子検査の視点から見れば誤差の少ない、すなわちクロスハイブリダイゼーションしにくい、反応性の揃った、すなわちTmの揃った人工設計配列を設計する技術の発展、DNAそのもので計算することから遺伝子で演算する発想につながっている。

DNAコンピューティング技術の遺伝子解析への応用をいち早く発想した日本の陶山らは、特許第3103806号明細書、国際公開第WO01/025481号パンフレットにあるように、それまでのDNAコンピューティング技術の検討の中から得られた人工設計配列の有用性に注目して、天然の遺伝子配列を特性の揃った人工設計配列に変換して検出するマルチプレックス法を提案した。さらに引き続き特開2002-181813号公報にあるように遺伝子と対応づけられて抽出された人工設計配列の論理演算、すなわち遺伝子の論理演算による遺伝子解析や疾患関連SNPの組み合わせを電子計算機を使わずに見つける方法を提案した。同時期に特開2002-318992号公報にあるようにDNAコンピュータのハイブリッドアーキテクチャと、遺伝子発現計測に応用した場合の形態、実験方法をも提案している。陶山らの提案したマルチプレックス検出用プローブは、アンカープローブ、アダプタプローブと呼ばれる2つのプローブからなり、発現計測ではアダプタプローブ側に人工設計配列とそれを増幅するためのプライミング配列が集中して配置されており、先に挙げたマルチプレックス法のためのプローブ構造と違い、遺伝子配列をプライマー間に含まないために人工設計配列毎の増幅特性の差がほとんどない特長をそなえている。

これらの先駆的研究に続いてアメリカのミルズは、遺伝子発現計測にDNAコンピューティング技術が使える可能性を示している（Mills, Trends Biotechnol. vol. 20 : pp.137-40（2002））。イスラエルのシャピオらは、がん細胞内でのDNAコンピューティングによる論理演算を利用して、疾患を診断し、診断結果に応じて遺伝子治療を行うための基礎的な実験結果を示している（Shapiro, et al., Nature. vol. 429: pp.423-9. (2004)）。

以上の技術動向から、低コストに多数の項目を1度に検査できるマルチプレックス法はますます重要性を増しており、世界的に低コスト化、時間短縮、高感度化、項目数の増加を目指して研究開発が進められている。

１．分子内連結反応を利用する遺伝子解析方法
（１）．用語の説明
ここで使用される「遺伝子」の語には、ゲノムに含まれるコーディングリージョンおよびノンコーディングリージョンの両方が含まれるものとする。また、本発明は、遺伝子変異などを解析および／または検出する方法を提供するものであるが、遺伝子変異解析に限らず、あらゆる核酸の解析および／または検出に好ましく利用されてよい。

ここで使用される「核酸」の語は、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、mRNA、全RNA、hnRNA、合成RNAを含む全てのDNA及びRNAを意味するものとする。

ここで使用される「変異」の語は、SNPおよびマイクロサテライト配列などの繰り返し配列などを含む遺伝子多型、塩基の挿入、欠失および／または置換、並びにそれらの組み合わせなどを示す。

本明細書における「核酸増幅が可能な条件下」とは、それ自体公知の核酸増幅が可能な何れの条件でもよいが、増幅反応を実施するに当たり、適切、より適切または最も適切な条件の選択は、本発明の実施者によって自由に選択されてよい。例えば、核酸増幅が可能な条件とは、本発明に従う適切なプライマーと、それ自身公知の何れかの核酸増幅用の酵素類、反応液の塩濃度バランスなどを調節するためのそれ自身公知の何れかのバッファ成分およびdNTP混合物などを含み、且つ、増幅に適切な反応温度が維持された環境であればよい。

ここで使用される「増幅」とは、それ自身当業者に公知の何れの増幅方法であってもよく、例えば、PCRおよびアシンメトリックPCRなどの増幅方法を示す。

ここで使用される「プライミング配列」とは、目的とする核酸にハイブリダイズし、核酸増幅の可能な条件下で、３’方向に核酸を伸長するためにプライマー３’端に配置され利用される配列である。

ここで使用される「人工設計配列」とは、人工的に設計された核酸配列を指示する。人工設計配列は、特に、使用者の目的に合わせて任意に、また何かを目的として意図的に設計してよい。例えば、本発明に使用される人工設計配列は、識別および／または増幅のために利用可能してよい。

ここで使用される「当該変異の３’側」とは、当該変異部位のみを指してもよく、当該変異部位およびその３’側の数塩基、例えば、１、２、３、４および５塩基などを指してもよく、更に、当該変異部位を除く当該変異部位よりも３’側の数塩基、例えば、１、２、３、４および５塩基などを指してもよいが、塩基の数は上記に限るものではなく、或いは６、７、８、９または１０塩基などであってもよい。また、後述するプローブ配列の長さを考慮することも可能である。

（２）．概要
本発明の概要は、図１５から図１７に示した１態様を例に説明することができる。

図１５(Ａ)を参照されたい。まず、検出の対象となる被検核酸と検出されるべき変異に応じた２のプライマー、即ち、第１のオリゴプライマー２０１と第２のオリゴプライマー２０２を用意する（図１５(Ａ)）（本明細書においては「オリゴプライマー」を単に「プライマー」とも記す）。最初に、これらの２つのプライマーを用いて検出されるべき変異を含む被検核酸の一部分を増幅する。この増幅は、第1の増幅である。例えば、当該増幅はＰＣＲによって行ってもよく、その場合、この増幅は１次ＰＣＲとも称されてもよい。

（ｉ）被検核酸
図１５(Ｂ)を参照されたい。この態様において、被検核酸２１２は２本鎖の核酸である。これは第２の１本鎖核酸２１２ａと第１の１本鎖核酸２１２ｂを含む。第２の１本鎖核酸２１２ｂは、検出されるべき変異２１３ｂを含む。第１の１本鎖核酸２１２ａは、検出されるべき変異２１３ｂに相補な核酸２１３ａを含む。

本態様に従うと、解析の対象となるのは検出されるべき変異核酸２１３ｂである。従って、最終的な変異に関する解析結果および変異の有無などの情報は、検出されるべき変異核酸２１３ｂに関するものである。

被検核酸は、ゲノム核酸であっても、何れかの遺伝子に由来する核酸であっても、人工的に合成され核酸であってもよい。核酸の定義は上述した通りである。

ここにおいては、例として２本鎖の核酸からなる被検核酸に関する解析法について説明するが、本発明においては、当該被検核酸は１本鎖であってもよい。何故ならば、第１の増幅で例えばＰＣＲを実施したとき、被検核酸が、例えば、１本鎖であっても、最初の熱サイクルで第１または第２のプライマーのプライミング配列から存在しない側の鎖も合成されるからである。それによって、最初から２本鎖の被検核酸があったように反応することができるのである。

（ii）第１のオリゴプライマー
図１５(Ｂ)を参照されたい。第１のオリゴプライマー２０１は、第２の１本鎖核酸２１２ａの一部分の連続した配列にハイブリダイズするよう設計される。即ち、第１のオリゴプライマー２０１の一部分が第２の１本鎖核酸２１２ａの一部分に相補になるように設計されている。

詳細は図１５(Ａ)を参照されたい。本態様において、第１のオリゴプライマー２０１は４つの部分からなる。最も３’端側に、第１のプライミング配列２０４（図中、上部に横線を付した「primer1」と記す）が含まれる。第１のプライミング配列２０４は、第２の１本鎖核酸の一部分に相補であり、ハイブリダイズした後、適切な条件下でプライマーの役割を果たす。

第１のプライミング配列２０４の隣に並ぶ配列の最も５’側には第１のプローブ配列２０７（図中、上部に横線を付した「ＡＳＯ」と記す）を配置した。本態様では、第１のプローブ配列２０７の最も５’端には、検出されるべき核酸である核酸２１３ｂに相同なヌクレオチド２０３が含まれる。この第１のプローブ配列２０７の存在により、検出および／または解析しようとする変異に関する情報を後述する人工設計配列に反映することが可能となる。

人工設計配列は、本態様で用いられる第１のオリゴプライマー２０１の場合、２種類配置した。第１の人工設計配列２０６（図中、上部に横線を付した「ＭＴ」と記す）は、第１のプローブ配列２０７の３’側に隣接するように配置した。第２の人工設計配列２０５（図中、上部に横線を付した「ＡＴ」と記す）は、第１のプライミング配列２０４の５’側に隣接して配置した。

人工設計配列「ＡＴ」、「ＭＴ」および「ＡＳＯ」の用語についての詳しい説明並びに使用意図および機能についての詳細は後述するのでここでは省略する。

プローブ配列２０７の長さは、特に限定するものではないが、１０塩基から３０塩基であり、好ましくは１５塩基から２５塩基である。

第１の人工設計配列２０６および第２の人工設計配列２０５は、被検変異部位２１３ｂに関する情報を担わせるために人工的に設計された配列である。例えば、少なくとも何れか１を被検変異部位２１３ｂの遺伝子変異に対応した配列としてもよく、或いは、少なくとも何れか１に検出時に識別可能なタグとしての役割を持たせてもよい。また、変異の位置に関する情報を担わせるために人工的に設計された配列としてもよい。人工設計配列の長さは、５塩基から３０塩基であり、好ましくは１０塩基から２５塩基である。また、１つのオリゴプライマーに含まれる複数の人工設計配列の長さは同じでもよく、異なっていてもよい。

また、この例では、第１のオリゴプライマーに含まれる人工設計配列を２、プローブ配列を１としたが、これに限定するものではなく、人工設計配列を１以上としても、或いは人工設計配列を含ませずにプローブ配列のみ含ませてもよい。１つのオリゴプライマーに含まれる複数の人工設計配列およびプローブ配列の長さは同じでもよく、異なっていてもよい。

図１５(Ｂ)を参照されたい。第１のプライミング配列２０４は、第１の１本鎖核酸２１２ａ中の一部の配列に相補であって、互いにハイブリダイズするが、その位置は、第１の１本鎖核酸の当該変異部位２１３ａよりも３’側である。１次ＰＣＲ増幅において、第１の１本鎖核酸２１２ａと第１のオリゴプライマー２０１は、第１のプライミング配列２０４の部分のみがハイブリダイズする。

（iii）第２のオリゴプライマー
図１５（Ｂ）を参照されたい。第２のオリゴプライマー２０２は、第２の１本鎖核酸２１２ｂにハイブリダイズするように設計されている。

図１５（Ａ）を参照されたい。第２のオリゴプライマー２０２の５’端はリン酸化２１１されている。５’端に配置される配列は、第２のプローブ配列２１０である、その３’側には人工設計配列２０９（図１５(Ａ)中では「ＬＴ」と記載される）、更にその３’側には第２のプライミング配列２０８が含まれる。「ＬＴ」の用語の詳細については後述する。

図１５(Ｂ)を参照されたい。当該第２のプローブ配列２１０は、第２の１本鎖核酸２１２ｂ上で変異部位２１３ｂの３’側に隣接する一部の配列と相同な配列である。プローブ配列の長さは、特に限定するものではないが、１０塩基から３０塩基であり、好ましくは１５塩基から２５塩基である。

人工設計配列２０９は、被検変異部位２１３ｂに関する情報を担わせるために人工的に設計された配列である。例えば、変異の位置に関する情報を担わせるために人工的に設計された配列としてもよい。或いは、被検変異部位２１３ｂの遺伝子変異に対応した配列としてもよく、検出時に識別可能なタグとしての役割を持たせてもよい。また、人工設計配列の長さは、５塩基から３０塩基でよく、好ましくは１０塩基から２５塩基である。

また、この例では、第２のオリゴプライマーに含まれる人工設計配列を１、プローブ配列を１としたが、これに限定するものではなく、人工設計配列を１以上としても、或いは人工設計配列を含ませずにプローブ配列のみ含ませてもよい。１つのオリゴプライマーに含まれる複数の人工設計配列およびプローブ配列の長さは同じでもよく、異なっていてもよい。

図１５(Ｂ)を参照されたい。第２のプライミング配列２０８は、第２の１本鎖核酸２１２ｂ中の一部の連続する配列に相補であって、互いにハイブリダイズする。その位置は、第２の１本鎖核酸の当該変異部位２１３ｂよりも３’側である。１次ＰＣＲ増幅において、第２の１本鎖核酸２１２ｂと第２のオリゴプライマー２０２は、第２のプライミング配列２０８の部分のみでハイブリダイズし、当該核酸鎖を伸長して増幅を行う。

（iv）１次ＰＣＲ増幅
前述した第１のオリゴプライマー２０１と第２のオリゴプライマー２０２を用いて、被検核酸２１２を、核酸増幅が可能な条件下で１次ＰＣＲ増幅する。その結果得られる１次ＰＣＲ増幅産物２２０を図１６に示す。１次ＰＣＲ増幅産物２２０には、５’端がリン酸化された核酸である第２の１本鎖核酸２２２と、当該リン酸化を含まない核酸である第１の１本鎖核酸２２１とが含まれる（図１６）。

（v）分子内ハイブリダイゼーション
前記（iv）で得られた１次ＰＣＲ増幅産物２２０を１本鎖に変性する(図１７(Ａ))。２本鎖から１本鎖への変性は、それ自身公知の何れの従来の方法を用いてもよい。当該変性の後に適切な条件下でリガーゼ等の酵素を用いて連結反応を行うと、分子内ハイブリダイゼーションが達成される。

このとき、１次ＰＣＲ増幅産物の変性により生じた第１の１本鎖核酸２２１は、５’端がリン酸化されていないため、分子内ハイブリダイゼーションが維持されず、そのままの直鎖の形態で存在する(図１７(Ｂ))。一方、５’端がリン酸化された第２の１本鎖核酸２２２は、５’端および３’端が変異部位塩基２３１へと湾曲し、当該変異部位塩基２３１と相補塩基２３２の間、プローブ配列２０７とその相補鎖２２６の間、および第２のプローブ配列２１０とその相補鎖２３０の間でハイブリダイズが生じ、更にリガーゼによって核酸２３２と第２のプローブ配列２１０の間にあるニックが連結されて分子内構造が形成され、第２の１本酸核酸２２２は閉環産物となる。これにより、閉環核酸分子が得られる(図１７(Ｃ))。

（vi）２次ＰＣＲ増幅
続いて、前述で得られた閉環産物となった第２の２本鎖核酸２２２の領域２３３について、人工設計配列２０９および人工設計配列２０５の相補鎖である人工設計配列２３４をプライマーとして用いて、核酸増幅が可能な条件下で２次ＰＣＲ増幅を行う。このとき、使用されるプライマーの何れかまたは両方に対して識別可能な標識物質を付与してもよい。例えば、人工設計配列２３４を標識化プライマーとして使用してもよい。

（vii）検出
前記増幅により得られた２次ＰＣＲ増幅産物２３５に含まれる検出されるべき変異である被検変異部位２３１に関する情報を識別可能な標識物質２４１を検出することにより得ることが可能である。例えば、２次ＰＣＲ増幅産物２３５に含まれる何れかのプローブ配列または何れかの人工設計配列に相補なプローブにより回収して標識物質２４１を検出して被検変異部位２３１に関する情報を得てもよい。それにより検出されるべき変異に関する解析を行うことが可能となる。

基本的な１態様を例に上述で説明した通り、本発明に従う方法では、１次ＰＣＲ増幅、分子内ハイブリダイゼーション、２次ＰＣＲ増幅および検出および／または解析を行うことが特徴である。このような本発明の態様により、反応効率および検出感度が高く、少量の検体で容易に検出を行える核酸解析方法が提供される。

図１８に、本発明において好ましく使用されるオリゴプライマーセットを記載した。上述の方法で使用されるオリゴプライマーは図１８(A)の第１のオリゴプライマー２０１と第２のオリゴプライマー２０２である。本発明の１態様においては、第１のオリゴプライマーの５’端に被検変異部位塩基に相補な塩基を含まないものを使用してもよい。その例は、第１のオリゴプライマー２４３および２４５などである（図１８(Ｂ)および（Ｃ））。その場合の当該プローブ配列は、図中、上部に横線を付した「ＬＳＯ１」と記した。この用語の説明は後述でおこなう。

また、上述の例では第１のオリゴプライマー２０１には人工設計配列２０５および２０６が含まれていたが人工設計配列は１つだけでも、含まなくてもよい。人工設計配列を１つ含む例は、第１のオリゴプライマー２４８である（図１８(Ｄ)）。含まない例は第１のオリゴプライマー２５０に示される。また、第２のオリゴプライマー２０２、２４４、２４６および２４９の例では人工設計配列が１含まれているが（図中、「ＬＴ」と記す。用語の詳細は後述する）、人工設計配列は必ずしも含まれなくてもよい。その例は第２のオリゴプライマー２５１として示した。また、オリゴプライマーは、識別可能な標識物質やハプテンを有してもよく、それにより検出を有利に行ってもよい。その例は図１８(Ｅ)の第１のプライマー２５０と第２のプライマー２５１に示した。

（viii）複製鎖
ここで使用される「複製鎖」とは、被検核酸の相補鎖、または被検核酸の相補鎖の相補鎖を合成することで得られる核酸をいう。図２の被検核酸を鋳型に合成された核酸２２１や２２２をいう。

（ix）分子内構造
ここで記載される「分子内構造」とは、ひとつの核酸分子の中で、２重鎖のハイブリッドを部分的にとっている構造をいう。２次構造とも呼ばれている。

（x）核酸モノマー
重合反応により、ポリヌクレオチドを形成する能力をもつ、デオキシアデノシン５’−トリホスフェイト、デオキシシチジン５’−トリホスフェイト、デオキシグアノシン５’−トリホスフェイト、デオキシチミジン５’−トリホスフェイト、デオキシウリジン５’−トリホスフェイト、アデノシン５’−トリホスフェイト、シチジン５’−トリホスフェイト、グアノシン５’−トリホスフェイト、チミジン５’−トリホスフェイト、ウリジン５’−トリホスフェイトなどを指示する。しかしながらこれに限定するものではなく、その他、人工的に合成された塩基などを備えて酵素の基質となり得る類似物質などをも含んでよい。

（xi）末端
核酸の末端状態には、リン酸が５’端末についたもの、ないもの、３’末端にＯＨ基が出ているものなどがある。その他、核酸分子の末端の糖鎖や塩基に化学活性基があって、共有結合をなし得る状態にあるものも指示する。本明細書では、当該各「末端」を単に「端」とも記す。

以下に、更に詳しく本発明の好ましい実施の形態を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではないと理解されるべきである。

２．実施形態の例
（１）． １塩基変異(SNP)を検出する態様
（１−１）． ライゲーション反応により変異を検出するための態様の例
以下、ヒト細胞を処理して得られたサンプルＤＮＡを用いたＳＮＰ検出反応を説明する。この態様では、検出に用いるプライマーとして図１５(Ａ)に示した２つのプライマーを使用する。本形態では、第１のオリゴプライマー２０１をＡＳＯ（即ち、Allele Specific Oligonucleotide）プライマー、第２のオリゴプライマー２０２をＬＳＯ（即ち、Locus Specific Oligonucleotide）プライマーと呼ぶ(図１５(Ａ))。また、本例においては、検出されるべき変異である、検出されるべき核酸２１３ｂとして被検ＳＮＰ２１３ｂが選択される。また、プローブ配列２０７および２１０はそれぞれＡＳＯ２０７およびＬＳＯ２１０、人工設計配列２０６、２０５および２０９は、それぞれＭＴ２０６、ＡＴ２０５およびＬＴ２０９を使用する。

図１５(Ｂ)を参照されたい。ＬＳＯプライマー２０１は被検ＳＮＰ２１３ｂと同じ鎖上にある。なお、ＬＳＯプライマー２０１の５’端はリン酸化修飾されている。図ではＳＮＰ２１３ｂの被検出鎖２１２ｂの相補鎖上の配列名の上に横線を引いている。リン酸化修飾は、それ自体公知の何れの手段を使用してもよい。また、核酸をあらわす矢印は５’端から３’端への向きで記している。プライミング配列２０４および２０８は、ゲノムの配列から選択し、ＡＳＯ２０７およびＬＳＯ２１０の部分はＳＮＰ２１３ｂとＳＮＰ２１３ｂに隣接する配列に相補、もしくはミスマッチ塩基を入れてほぼ相補なように選んでよい。

ミスマッチ塩基を入れる場合は、例えば３’末端から４塩基離れた位置や、７塩基離れた位置の塩基をミスマッチになるように改変すればよく、好ましくは７塩基離れた位置、識別能が上がらなければ４塩基離れた位置に入れればよい。この３’端からの位置や、ミスマッチの個数、どのミスマッチの塩基にするかは任意に決めればよく、適当にミスマッチを入れて核酸ハイブリッド安定性を下げることにより変異を誤ることなく検出することが可能になる。また、ミスマッチの塩基に変えるだけでなく、イノシンなど人工塩基にすることも有効な手段である。

ＳＮＰ２１３ｂの塩基はＡＳＯ２０７の５’末端に配置される。

ここで、「ＡＴ」はAmplification Tagの略であり、増幅プライマーの配列に用いる。ＭＴは「Mutation Tag」の略であり、遺伝子変異に対応した配列になっている。「ＬＴ」はLocus Tagの略であり、変異の位置と対応した配列になっている。

原則としてＭＴ２０６配列はＡＳＯ２０７配列に対応させて定め、ＬＴ２０９配列はＬＳＯ２１０配列に対応させて定める。ただし、場合によっては、すべてのＭＴ２０６配列がＡＳＯ２０７配列ごとに違う配列になるように設定すればＬＴ２０９配列は共通の配列であってもかまわない。また、ＬＴ２０９配列を変異の位置ごとに違うようにすれば、ＭＴ２０６配列は各変異位置での変異の種類、ＳＮＰで言うとアレル数だけ用意して変異と対応させて決めればよい。

以下、図１９のスキームに従って、本態様のプロトコールを簡単に説明する。まず、５’端がリン酸化された第２のプライマーとしてのＬＳＯプライマー２０２を用意する(図１９(A))。

最初の1次ＰＣＲにおいて、第１のプライマーとしてのＡＳＯプライマー２０１とＬＳＯプライマー２０２を用いて標的ＳＮＰ配列２１３ｂを含む被検核酸としてのゲノム断片２１２に関して増幅反応を行う(図１９(B))。これらＡＳＯプライマー２０１やＬＳＯプライマー２０２の増幅および／または検出対象のＳＮＰ２１３ｂは1箇所で設定してもよく、複数個所で設定してもよい。ただし、１セットのプライマーは1箇所のＳＮＰを検出するのに使うので、検出しようとするゲノム上の1箇所のＳＮＰを含むようにその位置を定める。従って、複数箇所設定する場合には、複数のプライマーセットが必要になる。

この増幅で得られた産物は図１６の構造を有する1次ＰＣＲ増幅産物２２０となる。図１９(B)中では「ＰＣＲ産物２２０」と記載される。また、図１９(B)のＡＳＯプライマー２０１に含まれるタグ２５２の部分は、図１５(A)で記載されるプローブ配列２０７、人工設計配列２０６および２０５の部分に相当し、タグとしての役割を果たしている。同様にＬＳＯプライマー２０２に含まれるタグ２５３は、図１５(A)で記載されるプローブ配列２１０および人工設計配列２０９の部分に相当し、タグとしての役割を果たしている。

この1次ＰＣＲの次に、平滑化反応を行い、１次ＰＣＲ増幅産物２２０の３’末端に付加されているａを削除するための操作を行う(図１９(C))。ここでは、１次ＰＣＲ増幅産物２２０から突出した核酸のヌクレオチドを除く。そのためには、３’から５’への向きのエクソヌクレアーゼ活性のある酵素ならば何を使ってもよい。当該1次ＰＣＲにおいて強いプルーフリーディング活性をもつポリメラーゼを用いる場合には、この過程、即ち、平滑化反応は省略することができる。

次に、平滑化反応の済んだ１次ＰＣＲ産物２５４で分子内連結反応をおこなう(図１９(Ｄ))。ここでＰＣＲ産物内にＡＳＯ、ＬＳＯに対応する配列がある場合に連結反応が生じ、図１９(Ｄ)の構造の分子２２２ができる。ここで、必ずしも産物内にあるＳＮＰアレルと増幅に使ったＡＳＯが対応関係にあるとは限らないことに注意しておく。塩基選択性を高めるために高温で連結反応をおこなうため、Ｔａｑライゲースなど耐熱菌のライゲース酵素を用いてライゲーションを行う。または同様な高温下で光反応性の塩基を使って合成したプローブによる光連結にしてもよい。ここで連結反応が起きれば両末端にあるプローブがつながって閉環し図１９(Ｄ)のようなダンベル状の分子２２２になり、標的のＳＮＰがない場合は直鎖状のまま閉環しない核酸２２１として溶液中に存在することになる。

こうして得られた反応液はタグ配列を増幅する２次ＰＣＲの前に、１次ＰＣＲで用いた未反応のＡＳＯプライマー２０１とＬＳＯプライマー２０２、未反応直鎖分子である核酸２２１の一部を消化する消化反応にかける。この工程は残留した直鎖状分子である核酸２２１を部分的にも消化することで、ＰＣＲでのミスプライミングや複雑な配列構造を原因とする予測不可能な産物ができるのを防ぐ。また、消化酵素は核酸の1本鎖末端から消化するので、未反応の１次ＰＣＲ産物の末端に存在するＳＮＰ検出プローブであるＡＳＯ２０７、ＬＳＯ２１０の配列やタグから分解されるので都合がよい。ただし、原理上はこの工程は不要であり、やってもやらなくてもよい。

本発明では東洋紡のＫＯＤポリメラーゼのエクソヌクレアーゼ活性を用いて消化してもよいが、1本鎖核酸に対するエクソヌクレアーゼ活性があるならばどんな酵素を用いてもよい。また、これに代わり、超音波処理して、閉環したＤＮＡを直鎖化したり、塩濃度の低い溶液中で高温にさらして切断することで、ＰＣＲを阻害する複雑な２次構造が生じにくいように長鎖ＤＮＡを断片化する操作をしてもよい。

図１９(Ｅ)を参照されたい。２次ＰＣＲ増幅は、閉環核酸２５５のＡＴ、ＬＴではさまれる部分を増幅する。ここではＡＴか、ＬＴに化学標識しておくことでタグに検出標識をすれば、タグの増幅または増幅と同時に1本鎖化が行える。例えばＡＴ、ＬＴプライマー量を同一にすれば通常のＰＣＲ増幅となる。また、ＰＣＲ増幅するときに検出用標識をつけた側のプライマー量をもう一方のプライマーよりも多くしてアシンメトリック（即ち、非対称）ＰＣＲしてもよい。もしもアシンメトリックＰＣＲした場合には図１９(Ｆ)のような産物２３５が得られる。ここで、図１９(Ｆ)は核酸マイクロアレイ２５６のプローブ固相部２５７に固相化プローブ２５８を使用した例を示した。固相化プローブ２５８に標識物質を付された産物２３５がハイブリダイズした後に標識物質を測定すればよい。しかし、後述するように、これに限定されるものではない。

２次ＰＣＲで1本鎖の検出タグを増幅生成した場合、反応が終わった時点で検出反応に入ってもよい。もしも、2重鎖の検出タグを増幅した場合は検出反応までに1本鎖へ変性する操作を入れる。これは、次の方法によって実現できる。例えば、検出しない側の検出タグ鎖を合成する側のプライマーの５’端にビオチンを標識しておく。こうすれば２次ＰＣＲ反応でのＰＣＲ増幅後、ビオチンで被覆した磁気ビーズや、多穴プレートのウェルにてビオチン化２重鎖タグは溶液から分離される。分離した２重鎖は低い塩濃度のバッファ中で９５℃に加熱したり、ＮａＯＨ水溶液などのアルカリにより変性して標識したタグを１本鎖化して溶液中に分離する。このほか、検出の直前に９５℃に加熱して、氷中にて急冷してから検出反応する方法もある。

検出用標識としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ、ＴＡＭＲＡのような核酸標識に適した蛍光色素、蛍光色素を含むビーズ、量子ドット、複数の量子ドットを含むビーズ、化学発光検出で使われるＤＩＧ（ジゴキシゲニン）およびビオチンなどが考えられる。しかしながら、これらに限定されるものではなく、ハイブリダイズしたタグを検出するためのＤＮＡなどの核酸に標識できる物質であればどんなものでもよい。

最後の検出反応では、２次ＰＣＲ以降に得られた１本鎖の標識をしたタグをその配列ごとに定量する。このための検出には例えばスライドグラス上に微小なプローブスポットを固定した核酸マイクロアレイ５６(図５(Ｆ)を参照されたい)や、Luminex社の蛍光で識別可能なビーズ、Illumina社のファイバ端にビーズを吸着したビーズアレイなどの使用が考えられる。

また、特開平11-75812にあるキャピラリアレイや、なども溶液中にある多種のタグをプローブを用いて検出するのに好適な検出デバイスである。これら検出デバイス上にもしくは２次ＰＣＲ反応後の変性過程を経た１本鎖標識タグをハイブリダイズさせ、ウォッシングで非特異ハイブリッドを除いた後、タグに施した標識を検出する操作、例えば化学発光反応や、蛍光色素の標識ならばマイクロアレイスキャナや、ＣＣＤカメラによる画像検出、フローサイトメーターによる蛍光ビーズの検出などを使って検出することが考えられる。

これらの検出データから、対応する標識タグの量を出し、それ応じてＳＮＰのどちらのアリルのホモ接合なのか、ヘテロ接合なのかをソフトウェアで判断したり、タイピング結果として電子にファイル化したり、データ記録媒体に記録したり、グラフ化して表示したり、紙に印刷してもよい。

プライマーに用いるＡＴ、ＬＴ、ＭＴなどのタグを構成する配列としては、特開2002-318992にあるような正規直交配列を基本単位に選ぶのが適当である。この正規直交配列は2重鎖をなすときの融解温度(Tm)が一定範囲に収まっており（即ち、正規性である）、相補鎖以外のどの2つの配列をハイブリダイズしても、また、どの２つの配列の連結によって得られる新たな配列とも安定なハイブリッドを形成しない（即ち、直交性である）ように配列を設計してある。望ましくは、さらに検出対象のゲノム配列、遺伝子配列とも安定なハイブリッドを形成しない正規直交配列を選択して使用する。

タグの長さはそれぞれの反応、即ち、ＰＣＲやアシンメトリックＰＣＲ、ハイブリダイゼーション反応で反応を実施するアニーリング温度付近にＴｍをもつ塩基組成、長さを選べばよい。望ましくは１５塩基から３５塩基程度で、合成しても精製コストがかかりにくいような長さがよい。また、最適反応温度としては４０℃以上で、ＰＣＲに一般的に使用される耐熱菌のポリメラーゼの至適温度の７２℃以下がよい。

（１−２）． 相補鎖合成とライゲーション反応の組み合わせ（即ち、ギャップライゲーション）により変異を検出するための態様の例
上記（１−１）で記したライゲーション反応などを用いず、ギャップライゲーションと呼ばれる相補鎖合成とライゲーション反応の組み合わせによって閉環反応を実施する１例を示す。

このギャップライゲーションのためには、図２０のような２のプライマー、即ち、第1のプライマー２４３と第２のプライマー２４４が必要である。これら構造はライゲーションによる検出とは異なる。即ち、図１５(Ａ)の第1のプライマー２０１では５’末端にＳＮＰ塩基に対応する塩基２０３を有するＡＳＯ配列２０７を有していたのに対して、図２０の第1のプライマー２４３では、配列の末端の塩基２０３を除いた、ＬＳＯ１と呼ばれる配列を第１のプローブ配列として配置する。一方、第２のプライマー２４４では、ＬＳＯと呼んでいた配列をＬＳＯ２と呼び第２のプローブ配列として配置する。第１のプライマー２４３および第２のプライマー２４４とも、その他の配列、即ち、人工設計配列であるＭＴ、ＡＴおよびＬＴ、並びに第１のプライミング配列および第２のプライミング配列は、上述の（１−１）と同様の配列を用いる。

この反応では１次ＰＣＲ後に残留しているｄＮＴＰを除く工程が必要とされる。この工程は、１次ＰＣＲ増幅の後、または平滑化反応後にｄＮＴＰを除くためのそれ自身公知の何れかの手段により実施してよい。例えばフィルタによるＰＣＲ産物の回収や、第１のプライマーとしてのＬＳＯ１プライマー２４３か第２のプライマーとしてのＬＳＯ２プライマー２４４の何れかの標識物質を磁気ビーズなどにとらえる反応をおこなうことで実現してもよい。このときの当該プライマーの標識物質とは、ビオチンなどの互いに選択的に結合可能な物質の一方であればよく、それ自身公知の手段によりプライマー合成の際に付与することが可能である。

次に、ギャップライゲーション反応を行うために、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＴＴＰの何れか１種類だけが含まれる反応チューブを用意する。前述の通り１次ＰＣＲ増幅と平滑化反応を完了したサンプル溶液を、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＴＴＰの何れか１種類だけが入った反応チューブに分割する。それぞれの反応チューブにさらにポリメラーゼ、ライゲースを加える。次に、温度変化によって、図２１に示すような閉環のために1塩基足りないダンベル様構造を有する核酸２７１を取らせる。このときの温度変化は、例えば、環状ハイブリッドが生じるような温度変化であればよく、反応溶液の塩濃度にも寄るが、例えば９５℃から６５℃への温度変化が好ましい。

この後、問題となるＳＮＰ配列２７２に相補な塩基が反応液中にあればポリメラーゼによる相補鎖の1塩基だけの伸長がおきる。その結果図２２の構造を有する核酸２８１ができる。

次に伸長された塩基とリン酸修飾されたＬＳＯ２の５’端とがライゲースにより連結される。以降の反応はギャップライゲーション前に分けた４つのチューブごとに進める。ただし、２次ＰＣＲ増幅のときに入れる標識の種類をＡ、Ｃ、ＧおよびＴごとに異なるものにするのであれば、４つのチューブの反応液を再び1液に合わせて検出してもよい。

（１−３）． ２箇所以上のギャップを連結するライゲーション反応を用いて検出する態様
図２３のようにプローブを３つに分けることでも検出が可能である。（１−２）に記載したようなギャップライゲーション法で検出する場合には、第1のプライマーの５’からＳＮＰ塩基を除いた。ここに示すこの例では、問題となるＳＮＰ塩基とそれに隣接する塩基も含め、３塩基を独立したプローブとして間隙配列２４７（図中では「ASO」と記す）とする。

またＳＮＰによりいろいろな配列があるために、ＳＮＰはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの４種類、ＳＮＰの両側の塩基はミクスチャ塩基として合成し、５’端をリン酸修飾する。ミクスチャ塩基にせずともイノシンのようなユニバーサル塩基を用いてもよい。上述した（１−２）のギャップライゲーション法に比べて、第1のプライマー２４５におけるプローブ配列であるＬＳＯ１配列、および第２のプライマー２４６におけるプローブ配列であるＬＳＯ２配列は、ともにＳＮＰ側の塩基が１個ずつ減った配列である。また、第２のプライマー２４６のＬＳＯ２配列の５’端はリン酸化修飾されている（図２３）。

まず、第1のプライマーであるＬＳＯ１プライマー２４５と第２のプライマーであるＬＳＯ２プライマー２４６を用いて1次ＰＣＲ増幅する。通常のライゲーションにより閉環する場合と同様に反応を進める。ライゲーションによる閉環反応の前に、目的とするSNPに相当する部位がＡ、Ｃ、ＧまたはＴである間隙配列であるＡＳＯ配列２４７を、反応チューブ４本それぞれに予め入れておく。それぞれの反応チューブに、ライゲーションによる閉環反応前の反応液を前記反応チューブ４本に分割して添加する。これらチューブでは間隙配列であるＡＳＯ２４７が短いため、比較的低温、例えば、３７℃でライゲーション反応を行ってよい。リガーゼとしては、この温度で活性の高いそれ自身公知の何れのリガーゼを用いてもよい。更に、これ以降は、上述したギャップライゲーションと同様に検出反応まで進めればよい。図２４は目的とするＳＮＰを検出し閉環した状態の核酸分子３００を示す。

（１−４）． タグの構造を簡略化したＡＳＯプライマー、ＬＳＯプライマーを用いる形態の例
図２５に示すように、人工設計配列であるＡＴを含まない第１のプライマーとしてのＡＳＯプライマー２４８と第２のプライマーとしてのＬＳＯプライマー２４９を用いる例を示す。

更に図２６を用いて本態様の１例を説明する。本例に従う方法では、例えば、図１５に示す第1のプライマー２０１などのようにアレル特異的なＡＳＯ側（即ち、第１のプライマー１）のタグ配列(即ち、プライミング配列以外の配列、「ＡＳＯ」、「ＭＴ」および「AT」配列)のうち、１つの人工設計配列であるＡＴ配列を省略した第1のプライマー２４８を使用する(図２６（Ａ）)。図２６（Ａ）に示した第１のプライマー２４８と第２のプライマー２４９を用いて被検核酸に対して１次ＰＣＲ増幅を行う(図２６（Ａ）)。

２次ＰＣＲ増幅のプライマーとして使用するＭＴ配列は目的とするＳＮＰのアレル２種類に合わせて、２種類設定する。２次ＰＣＲ増幅の際には、２種類のＭＴ配列は、それぞれプライマーとして使用されるが、種類ごとに異なる蛍光標識を付与され、第1のＭＴプライマー３０１および第２のＭＴプライマー３０２として用意される(図２６（Ｂ）)。プローブ配列であるＬＳＯと隣接する人工設計配列であるＬＴは、目的とするＳＮＰごとに異なるような配列となるように設定する。このように２次ＰＣＲ増幅では、プライマーとして、ＭＴ配列を２種類、ＬＴ配列は検出するＳＮＰの箇所の数だけ準備する。

次に、これらを２次ＰＣＲ増幅反応させる(図２６（Ｂ）)。図２６（Ｃ）に示すように、ここでできた２次ＰＣＲ産物３０３および３０４は、例えばマイクロアレイ３０５で検出するとき、ＬＴ配列の相補鎖を検出するようにプローブ３０６の配列を決めておけば、マイクロアレイ３０５の同一スポット３０７上での蛍光強度の違いにより、アレル量比を比較することができる。また、この形態に従う方法によって第1のプライマーであるＡＳＯプライマーの長さを短縮することが可能になる。

（１−５）． タグ配列核酸でなくタグ標識物質を用いる態様
図２７のような識別可能な化学物質、例えば、ビオチンやハプテンを核酸の末端でない場所に標識として付与した第1のプライマーとしてのＡＳＯプライマー２５０、および第２のプライマーとしてのＬＳＯプライマー２５１を使用しても本発明の方法に従う好ましい態様を提供することが可能である。上述のような第１のプライマー２５０および第２のプライマー２５１は、それ自身公知の何れの従来技術を使用しても準備することが可能である。

また、第１のプローブ配列であるＡＳＯと第１のプライミング配列(図２７中、「primer1」と記す)、および第２のプローブ配列であるＬＳＯと第２のプライミング配列(図２７中「primer2」と記す)の配列の間には、例えばリンカー分子や、塩基Ａ(即ち、アデニン)などの連続したスペーサー配列を入れてもよい。

このようなＡＳＯプライマー２５０およびＬＳＯプライマー２５１を用いて１次ＰＣＲ増幅を行い、更に、例えばライゲーションにより閉環分子を形成させる。この場合の閉環反応はアレルの検出と核酸の保護を目的とする。閉環反応に続き、消化反応を行うことにより直鎖分子は消化され、両端に化学標識のある直鎖核酸は消失する。

こうして閉環した分子をストレプトアビジンで被覆したラテックスビーズと、抗ハプテン抗体を被覆したラテックスビーズと混合すると標的のアレルが存在したときにラテックスビーズがそれぞれ閉環分子に結合し、ビーズが凝集する。一方、直鎖分子はエクソヌクレアーゼ処理することで分解されているのでビーズの凝集はおこらない。こうして特定のアレルの存在を検出することができる。

ほかには、複数のアレルを検出できるように同一のSNP箇所でもASOプライマーにつける化学標識物質を変えて反応し、例えば、あるアレルを検出するASOプライマーはビオチン、別のアレルを検出するものにはＤＩＧ（ジゴキシゲニン）を標識して反応する。その結果２種類の閉環分子が得られる可能性があるが、それぞれ別のビーズ懸濁液、抗ＤＩＧ抗体を被覆したビーズと抗ハプテン抗体を被覆したビーズの液、ストレプトアビジン被覆ビーズと抗ハプテン抗体を被覆したビーズの液に分けてビーズの凝集が起きるかどうかでＳＮＰを検出することができる。

さらに、このような標識をしたときの別のビーズ検出方法として磁気ビーズを用いた検出方法を示す。まず閉環分子を生成したあと、反応溶液を抗ハプテン抗体被覆の磁気ビーズと反応させる。このときハプテン標識のある核酸が磁気ビーズに捕獲されＢ／Ｆ分離により溶液中からビーズが回収される。ビーズとストレプトアビジンと蛍光色素標識した抗ハプテン抗体を混ぜ、Ｂ／Ｆ分離をしながら特異的に抗体が結合するようにしてビーズからの蛍光を計測することでアレルの存在を検出することができる。Ｂ／Ｆ分離した磁気ビーズ上の核酸を検出するのには蛍光以外に化学発光で検出する方法も考えられるし、吸光を検出場合も考えられる。

ほかにはＡＳＯプライマー、ＬＳＯプライマーには標識をせず、２次ＰＣＲのときに使用するＭＴプライマーとＬＴプライマーに異なる識別可能な化学標識、例えば、ＭＴプライマーにはビオチン、ＬＴプライマーにはハプテンなどを標識してもよい。この場合、２次ＰＣＲ増幅はアシンメトリックでなく通常のＰＣＲを行うことにより、２重鎖のタグ増幅物を得る。これを先に述べたようなストレプトアビジン被覆のラテックスビーズと抗ハプテン抗体被覆のラテックスビーズにより凝集させ、それを検出することにより目的の検出が達成される。

（１−６）． 1色の蛍光で検出する態様
複数種類の蛍光色素を用いないでＳＮＰアレルを検出することもできる。たとえば、上述した（１−１）の方法でＭＴ配列をＡＳＯ配列に対応させてすべて異なるように設計し、検出をマイクロアレイで検出する。当該マイクロアレイには、ＭＴ配列を検出するようなプローブを固定しておく。これにより２次ＰＣＲ増幅で使用するＭＴプライマーに１色の蛍光色素を付与するだけで、アレルごとの異なるスポットに蛍光が検出される。その結果、どのアレルが存在するのかを検出することが可能である。

（１−７）． 検出に関する態様
本発明の態様において使用することが可能な幾つかの検出に関する手段の例を以下に説明するが、本発明がこれらに限定されるものではない。上述したように、本発明の１態様に従うと、プライマーにより検体核酸を第1の増幅をすると同時に増幅産物末端に分子内検出用のプローブ配列を埋め込むことが可能となる。それによって、変異が存在する場合に、プローブ部分にハイブリダイズが生じ、その結果、得られる増幅産物が内部構造を可能にして、その後に酵素によって閉環される。従って、次に、閉環部分を含む増幅産物が得られるような第２の増幅、例えば、ＰＣＲを行って得られた増幅産物を検出すれば、求めようとする核酸の変異を検出することが可能になる。

例えば、検体核酸中の複数の変異を同時に検出するために人工設計配列、タグを用い、このタグをハイブリダイゼーションで検出すれば、１または複数種類の変異の存在を判定することが可能である。

本発明の態様に従って当該変異の検出に使用可能な手段について更に記す。まず、検出手段には、単一の変異の有無を検出する方法と、複数の変異の有無を検出する方法がある。単一の変異の有無を検出する方法には、ゲル電気泳動やビーズの凝集を利用する方法を挙げることができる。また、複数の変異の有無を検出する方法には、マイクロアレイ、ビーズの凝集、およびそれ自体識別可能なビーズを使用する方法などが挙げられる。

ゲル電気泳動を用いた場合には、次の方法を使用してもよい。本発明に従う方法に従って形成した閉環した核酸分子と、直鎖状の形態を維持した核酸分子とでは泳動度が異なる。即ち、一般的に、閉環した分子の方が泳動度が大きくなるので、見かけの分子量が小さくなる。例えば、ある変異を検出したがどうかを調べるときにゲル電気泳動すると、閉環分子が含まれている場合には、泳動度の大きいバンドが検出される。泳動度を容易に比較できるように、参照用に分子量マーカーや、実際に閉環した核酸分子、直鎖状の核酸分子などを同時に電気泳動すれば、より明確に変異の存在を検出することが可能である。

マイクロアレイを使用して検出する場合の１例を説明する。マイクロアレイは、人工設計配列に相補な核酸プローブを、スライドガラスやマルチウェルディッシュを含むディッシュなどの支持体上に微小なスポットとして多数固定して作ることが可能である。当該固定された核酸プローブへのハイブリダイズの有無を検出することにより変異の存在を検出することができる。例えば、本発明の第２の増幅において使用するプライマーに、予め識別可能な化学物質を標識すればよい。その結果、第２の増幅産物には人工設計配列が備わっているので、それをマイクロアレイの相補なプローブへハイブリダイズさせ、当該プライマーを介して第２の増幅産物に標識された化学物質を検出すればよい。マイクロアレイを使用することにより、どの人工設計配列が存在するのか、即ち、どの変異が存在するかを複数種類について簡便に検出することが可能である。このような例では、蛍光色素を標識して蛍光検出するのが手軽である。しかしながら、これに限定されるものではなく、化学発光、発色などのその他の識別可能な手段を利用してもよい。必要な感度やプローブ配置の密度に応じて、実施者がよりよい手段を選択すればよい。

また、マイクロアレイに類似した手段としてルミネックス社から入手可能な蛍光ビーズシステムを本発明に従って利用してもよい。当該蛍光ビーズは、２種類の蛍光色素がそれぞれ１０段階の濃度で含まれる。従って、蛍光検出を行うことにより１００種類のビーズが識別可能である。例えば、これらの蛍光ビーズの種類毎に、本発明に従う人工設計配列のプローブを固定する。次に、本発明の第２の増幅段階で得られる増幅産物を蛍光色素などで標識した上で、前記蛍光ビーズのプローブとハイブリダイズさせ、フローサイトメーターと同様な機構で１つ１つの蛍光ビーズを蛍光検出し、それぞれの蛍光ビーズに人工設計配列がハイブリダイズしているか否かで変異の存在を検出することが可能である。

また、量子ドットのような蛍光で識別可能な半導体粒子を本発明の態様に従って検出に利用してもよい。量子ドットとは、半導体微粒子である。これは、有機系色素には見られない多様な特性を示す蛍光物質であり、当業者にそれ自身公知の何れの材料を用いてもよく、それ自身公知の何れの方法によって製造したものを本発明の態様において使用してよい。例えば、量子ドットを用いる場合には、まず、量子ドットにプローブを固定し、各粒子を互いに重ならないように平板の上に展開し、粒子の種類と粒子上にハイブリダイズする人工設計配列を検出すればよい。しかしながら、本発明の検出手段はこれらに限定されるものではなく、従来公知の何れの検出方法を利用してもよい。

（２）. 挿入(Insertion)および欠失(Deletion)による変異を検出する形態の例
被検核酸における変異が、挿入または欠失の何れかであるのかを検出する場合の例を説明する。例えば、ゲノムへの挿入または欠失変異を検出するためには、上述した（1−3）で説明した通り、第1のプライマー、第２のプライマーおよび間隙配列を使用して、２箇所以上でライゲーションする手段を使用すればよい。間隙配列であるＡＳＯは、挿入配列そのものを検出するための配列として設計する。例えば、挿入配列がＴＴＴＴＡＡＡＡであって、挿入変異の場合の配列が同様の向きでＴＴＴＡＴＧＣＡＡＡＡであれば間隙配列であるＡＳＯは、５’端から挿入部配列ＣＧＴＡＴＴＴとすればよい。

また、欠失型の場合、第１のプライマーであるＬＳＯ１および第２のプライマーであるＬＳＯ２がそのまま、直接に連結されるように配列を設定すればよい。

（１−３）と同様に、第１のプライマーであるＬＳＯ１と第２のプライマーであるＬＳＯ２を用いて１次ＰＣＲ増幅を行う。ライゲーション直前に、挿入型を検出するための反応チューブと、欠失型を検出するための反応チューブにそれぞれ、前記１次ＰＣＲ増幅後の反応液を分割して添加する。このとき、挿入型を検出するための反応チューブには間隙配列ＡＳＯを入れておき、欠失型を検出するための反応チューブには間隙配列ＡＳＯは入れておかない。その後、それぞれのチューブごとに通常のライゲーション反応による閉環反応を行う。更にそれぞれのチューブごとに、上述したギャップライゲーションと同様に検出反応を行い、挿入型か欠失型を決定する。

また、反応液を検出時に混ぜてもよく、その場合、単純に２次ＰＣＲ増幅で生成したＰＣＲ産物を電気泳動すればよい。仮に、長い断片が検出されれば挿入型と判定し、短い断片が検出されれば欠失型と判定することも可能である。

（３）． ゲノムのメチル化を検出する態様
本発明の１態様に従えば、ゲノムＤＮＡのメチル化を検出することも可能である。この場合、最初にシトシンを特異的にウラシルに転化する亜硫酸水素処理を行うことが必要である。これによりメチル化されていないシトシンはウラシルに変化し、メチル化されているシトシンはそのままの状態、即ち、シトシンのままで維持される。転化されたウラシルを検出するように、または転化されずに維持されたシトシンを検出するように上述の（1−1）で使用される第1のプライマーおよび第２のプライマーを設計し、上述を（１−１）に記載された通りに反応を行い検出を達成すればよい。

或いは、上述の（１−２）で使用した第１のプライマーおよび第２のプライマーを使用し、且つ、ｄＴＴＰの入った反応チューブを用いて伸長連結を実施することによって、その結果から、非メチル化シトシンの存在を検出することも可能である。

更に、上述の（１−３）で使用した第1のプライマー、第２のプライマーおよび第３プライマーを使用することにより検出してもよい。その場合、特定のＣｐＧアイランドに相補なASO、即ち間隙配列を準備して検出および反応し、閉環分子が作られるかどうかを検出することでメチル化が検出されてもよい。或いは、上述した何れの態様の例を利用することによっても目的とするメチル化を検出することが可能である。

（４）． 繰り返し配列の繰り返し回数を検出する形態の例
繰り返し配列の繰り返しの回数を検出するためには、従来ではサンガー法が使用されるが、本発明の方法に従っても、繰り返し配列の繰り返しの回数を検出することが可能である。上述した（１−２）のギャップライゲーション法を応用し、繰り返し配列を挟み込むように第1のプローブ配列であるＬＳＯ１および第２のプローブ配列であるＬＳＯ２の配列を定め第1のプライマーおよび第２のプライマーを設計し、１次ＰＣＲ増幅を行う。次に、繰り返し配列を構成する塩基のモノマーを含む反応チューブを準備する。これに１次ＰＣＲ増幅産物を加え、相補鎖合成とライゲーション反応をすることにより閉環分子を得る。これをＭＴおよびＬＴプライマーを用いて２次ＰＣＲ増幅する。得られた２次ＰＣＲ産物を適切な電気泳動に供することによって、長さを判定することによって繰り返し配列の繰り返しの回数を決定することが可能である。

（５）． 発現遺伝子計測をする態様
本発明の態様に従うと、細胞内で発現している遺伝子がそれぞれどれくらい発現しているかを検出することも可能である。以下にそのような検出を行うための形態の例を示す。

まず、細胞からｍＲＮＡを抽出し逆転写酵素でｃＤＮＡ合成を行う。各検出したい遺伝子の変異が少ないエクソンを検出するようにプローブ配列としてのＡＳＯおよびＬＳＯの位置を設定する。

発現計測の場合ＳＮＰを考慮する必要はないが、ＡＳＯおよびＬＳＯとprimer1およびprimer2の配列は対象遺伝子に対して特異性が高いように選択することが好ましい。以下、他の変異を検出するのと同様に上述した（１−１）に記載した方法と同様に検出を行えばよい。

この場合、蛍光標識は１つのサンプルに１色とし、サンプルを変える際に異なる蛍光標識を与え、これらを同一のマイクロアレイ上で同時検出すれば、発現量比を求めることができる。

（６）．効果
以上説明してきたような本発明の１態様に従う方法によると、被検核酸のＰＣＲ増幅産物の分子内反応により検出反応を行うことが可能である。従って、検出用プローブをＰＣＲ増幅後に加える必要がない。従って、ＰＣＲ産物の両末端をプローブとして機能させることが可能になる。従来では、オリゴプローブ２つ、被検核酸および酵素の４体反応として実行されている検出方法が、本発明に従うと、被検核酸の増幅断片と酵素の２体反応にまで減らすことが可能となった。それにより反応効率は著しく向上し、微量核酸から検出できるようになった。従って、反応工程の短縮やコストダウンが期待される。

また、以上のような本発明に従うと、最終的被検遺伝子のＤＮＡ配列を人工設計配列に置き換えて検出することが可能である。それにより、常に同じ検出デバイス、例えば、ユニバーサルチップと呼ばれるデバイスを利用して検出できる。これにより、如何なる型の遺伝子変異を検出する場合であっても、検出デバイスの配列やフォーマットを変更する必要がなくなる。また、人工設計配列で区別がつくため、複数の項目の検査ができるようになる。

また、本発明の１側面に従うと、最初のＰＣＲ、即ち、１次ＰＣＲ増幅の後、閉環反応の前に２重鎖末端平滑化酵素を作用させる平滑化反応を行う。これは、２重鎖末端を平滑化できる酵素を作用させ、Ｔａｑポリメラーゼによって付加されたｄＡＴＰを除き、１次ＰＣＲ増幅産物を末端平滑化することが可能になる。これにより、ライゲーション反応や、1塩基伸長反応とライゲーション反応を組み合わせて閉環するときなど、閉環反応の効率の低下を防ぐことが可能になり、検出感度および特異性が向上される。

本発明の１側面に従うと、閉環反応の後２次ＰＣＲ増幅反応の前に核酸消化酵素によってクリーンアップ反応を行う。これにより、目的の産物である閉環した核酸以外の異常な分子間反応でできた核酸や、プライマーの残りなどの不必要な1本鎖核酸などが消化される。その結果、増幅反応で不要な産物が生じることがなく、偽陽性シグナルを低下することが可能になる。

更に、本発明の１側面に従うと、タグ配列を、識別可能な化学物質、例えば、ハプテンとビオチンなどで置き換えたプローブを使用すれば、抗ハプテン抗体で被覆したラテックスビーズと、ストレプトアビジンで被覆したラテックスビーズの凝集によって容易に検出を行うことが可能である。即ち、標的の配列があった場合にはラテックスビーズが凝集するので、目視または簡易な吸光検出により目的とする検出が達成される。

本発明に従う検出方法の用途および使用される場所には次のものが考えられる。例えばヒト遺伝子型と疾患の関連性の解明、薬剤感受性の検出、対象生物をヒトから別の生物に変えての遺伝子多型の分子生物学的な解析などの研究用途がある。これら研究は大学、企業等の研究所、研究室で行われるであろう。また、遺伝子と特定の疾患との関連性、罹患リスクや、薬剤感受性が明らかにされた時点で、病院の検査センターでの治療方法を選択するための検査や人間ドックでの予防のための診断、副作用の小さい抗ガン剤の選択のための薬剤感受性検査等、医療用に使えると考えられる。また、本発明に従う検出方法は、DNAコンピューティングに利用されてもよい。

本発明の方法を実現するための形態としては、ユーザー自ら方法を実施するための研究用、診断用遺伝子多型検出試薬キットおよび自動的に処理する自動反応装置による実施、ユーザーや被検者に代わっての受託研究、検査センターでの診断等の実施が考えられる。

また、本方法の実施に当たって反応の組み合わせは、随意に変えられる。例えば細胞を株化して大量培養したり、末梢血を多めに取得したりすることで本方法に必要なヒトゲノムDNAを大量に調製することにより、直接ゲノムDNAから検出反応を始めることができる。また、これに代わって、少量のゲノムDNAを取得し、鎖置換ポリメラーゼとランダムプライマーを用いたWGA法（Whole Genome Amplification ）で、非特異的にゲノムDNAを増幅したサンプルから検出反応を始めてもよい。また、PCR法や、マルチプレックスPCR法、アシンメトリックPCR法のようなプライマーを用いて特定の配列を増幅したものから検出反応を始めてもよい。そのほかの酵素的に増幅する方法によりそれぞれ得られたサンプルは、2重鎖サンプルの場合は、95℃まで加熱してから4℃に急冷して1本鎖化したり、塩濃度の低い溶液中で95℃まで加熱し断片化する、また、超音波で断片化する、制限酵素で切断する等の1本鎖化、検出に支障がない程度の断片化操作を加えてから検出操作してもよい。

本発明の態様により、非特異反応が生じにくく、且つ低コストで実行することの可能な核酸配列を検出するための手段を提供された。

III．相補鎖合成阻害構造を利用する方法
本発明に従う核酸配列検出方法の１例を図２８を用いて説明する。この例では、一塩基多型（以下、「ＳＮＰ」と記す）の検出のために設定した検出部位４１２を含む核酸鎖４０１について、本発明に従う検出方法を行う方法を説明する。

ここで核酸鎖４０１は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、合成ＲＮＡを含む全てのＤＮＡ及びＲＮＡなどの何れであってもよい。

核酸鎖４０１は、何れの生物由来の核酸であってもよい。本発明に従う方法に使用される核酸鎖４０１はそれ自身公知の何れの方法により調製されたものであってよい。ここで、「核酸鎖」は「核酸試料」とも称され、本明細書においては「核酸鎖」の語と「核酸試料」の語は交換可能に使用されてよい。

１．片鎖ギャップライゲーション合成
第１の検出鎖合成核酸４０２は、当該検出部位４１２の３’側の一部の配列に相同な配列４１３と第１のタグ４０４とプライマー配列４０３を含む。プライマー配列４０３は、核酸鎖４０１の検出部位４１２の３’側の配列、即ち、検出部位４１２よりも３’側の配列に相補な配列であればよい。

第２の検出鎖合成核酸４０５は、当該検出部位４１２の５’側の一部の配列に相同な配列４１４と第２のタグ４０８と、タグ４０８の５’側に隣接する相補鎖合成阻害構造４０７を含み、更にその５’側に検出部位４１２の５’側に相補なオリゴ核酸配列４０６を含む。

反応は、まず、核酸鎖４０１と第１の検出鎖合成核酸４０２および第２の検出鎖合成核酸４０５とのハイブリダイゼーションから始まる（図２８（１））。

次に、第１の検出鎖合成核酸４０２が５’側から３’側へと、伸長可能な条件下で伸張される（図２８（２））。ここで「伸長可能な条件下」とは、当該第1の検出鎖合成核酸が伸長するのに適切な環境であればよく、また、そのための酵素および伸長に必要な基質が含まれる条件下であればよい。それらの条件は、それ自身当業者に公知の環境および／または条件を利用すればよい。

次に、伸長された第１の検出鎖合成核酸４０２の３’端と第２の検出鎖合成核酸４０５の５’端が連結される（図２８（３））。本例では、第２の検出鎖合成核酸４０５の５’端がリン酸化されており、それにより、リガーゼによって連結される例を示した。しかしながら、本発明の方法に従うと当該リン酸化とリガーゼの組み合わせに限るものではなく、第１の検出鎖合成核酸４０２の３’の核酸と第２の検出鎖合成核酸４０５の５’端の核酸の少なくとも一方が、互いに結合可能なように修飾されていればよい。従って、例えば、リン酸化の他には、特許３７５３９４２号の光反応性ピリミジン塩基など、それ自身公知の手段で修飾されていればよいが、これに限定されるものではない。

次に、変性し、１本鎖を得る（図２８（４））。変性手段は、それ自身公知の何れの変性手段を用いてもよい。例えば、そのような変性手段は、加熱、アルカリ変性、希釈による塩濃度低下などであるが、これに限定されるものではない。

検出鎖４１０は、分子内ハイブリダイズが得られるように設計されている。従って、上記で変性されて得られた１本鎖は、閉環反応によりダンベル形態４２１となる（図２８（５））。更にこれは、分子の安定化のために環状構造体４２２になる（図２８（５））。

また更に、閉環反応の後に、任意に１本鎖核酸を消化してもよい。それにより、その後の検出および／または操作において高い検出感度および／または高い操作性が得られるので好ましい（図２８（６））。図２８（２）の伸長反応時に所望の伸長が得られなかった核酸は、この消化反応により消化される。

得られた環状構造体をこのまま電気泳動で検出してもよく、質量分析により検出してもよい。そのような検出を行う場合には、第２の検出鎖合成核酸４０２に含まれる相補鎖合成阻害構造４０７は含まれなくてもよい。

また、上記の例ではＳＮＰを検出するための方法を記したが、検出しようとする対象は、ＳＮＰ以外の変異、欠失、挿入、置換、反復配列の検出、メチル化検出、遺伝子発現計測などであってもよく、また、変異以外の任意の配列を検出対象としてもよい。当該検出部位は、検出しようとする対象の配列を含んでもよく、検出しようとする対象の配列からなってもよい。

上記の態様により、大過剰のプローブが不要な経済的な検出を行うことが可能である。

相補鎖合成阻害構造が効果を示すのは、以下のような検出を行う場合である。ここで、「相補鎖合成阻害構造」とは、例えば、ポリメラーゼがＤＮＡの塩基として認識し相補鎖を合成しない構造であればよく、例えばグライナー・バイオワン社が提供しているＳｐａｃｅｒ９リンカによる修飾や、自然界に存在しない人工塩基、塩基のないヌクレオチドなどであればよい。

２．検出手段
本発明の更なる態様に従うと、本発明の検出方法は、形成された環状構造体から、連結部分を含む核酸断片を得て、それを検出することにより実施してもよい。

そのためには、まず、当該環状構造体から連結部分を含む核酸断片を得る工程を行う。以下の手段により得られた「核酸断片」は、何れも「増幅産物」とも称される。

（１）非対称ＰＣＲ
当該核酸断片を得るためには、これに限定されるものではないが、例えば、非対称ＰＣＲを利用することが可能である。

図２９を参照されたい。図２９（７）−Ａでは、当該環状構造体４２２に対して、第１のプライマー４２５と識別可能な標識を付与された第２のプライマー４２３とを用いて非対称ＰＣＲを行う方法が記載されている。第１のプライマー４２５は、当該環状構造体４２２の検出部位４１２の３’側の配列に相補な配列を有する。第２のプライマー４２３はその３’端に識別可能な標識を付与されており、当該環状構造体４２２の検出部位４１２の５’側の配列に相補な配列ある。

これらの第３プライマー４２５および第２のプライマー４２３と、環状構造体４２２を適切な条件下で非対称ＰＣＲに供する。その結果、識別可能な標識を有する増幅産物４２７が得られる。これに限定するものではないが、例えばそのような適切な条件は、非標識側プライマーの濃度が１に対して標識側プライマー濃度を１０にすることであり、例えば、文献Ｋｉｎｊｏ Ｍ． ｅｔ ａｌ．“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９８ Ｏｃｔ；２５（４）：７０６−１２， ７１４−５、またはＷｅｂサイト（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｍａｎｕａｌ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｃｂ．ｕｃｔ．ａｃ．ｚａ／ｐｃｒｃｏｎｄ．ｈｔｍ）に記載される通りである。

（２）インビトロ転写反応
また、当該核酸断片を得るためには、これに限定されるものではないが、例えば、Ｔ７プロモーターを使ったインビトロ転写を利用してもよい。

図２９（７）−Ｂ（ｉ）は、当該環状構造体の第１の検出鎖合成核酸をそのタグの部分にＴ７プロモーターが挿入されるように設計されればよい。そのような環状構造体４２２を適切なインビトロ転写が得られるような条件下でＤＮＡ２本鎖を形成することと、変性して１本鎖にすることとを繰り返すことにより、所望の核酸断片を得ることが可能である。適切なインビトロ転写が得られるような条件は、それ自身当業者に公知の何れの条件であってもよい。

図２９（７）−Ｂ（ｉｉ）は、上記の図２９（７）−Ｂ（ｉ）と同様に、当該環状構造体の第１の検出鎖合成核酸を、そのタグの部分の５’側に隣接してＴ７プロモーターが挿入されるように設計されればよい。そのような環状構造体４２２を適切なインビトロ転写が得られるような適切な条件下で、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡインビトロ転写を行えばよい。この手段の場合、変性操作が不要であるので、連続して、増幅産物を得ることが可能である。また、ほぼ直線的に増幅するのでＳＮＰなどの変異でヘテロアレルを検出したときに正しくタイピングできる。また、これに限定するものではないが、例えばそのような適切な条件は、例えば文献（Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｊ．，Ｅｂｅｒｗｉｎｅ ＪＨ.，“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ａ Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ｍＲＮＡ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ “Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９６ Ｄｅｃ；１０（３）：２８３−８）に記載される通りである。

このように、タグとプライマー配列の間に相補鎖合成阻害構造があることにより、阻害箇所で相補鎖の合成が止まるので、環状構造体の存在を他の核酸に反映するときに、不要な長鎖産物ができないので好ましい。

また、タグとプライマー配列の間に相補鎖合成阻害構造があることにより、阻害箇所で相補鎖の合成が止まる。このように、相補鎖合成が途中で止まるため、Ｔ７プロモーターを利用したインビトロ転写によるタグ増幅をするときに必要最小限の長さの産物が得られる。

（３）検出
上述のような手段により得られた増幅産物は、次のように検出することが可能である。例えば、図３０（８）−Ａに記載するように、マイクロアレイ４４９の基板４５０に固定化されたプローブ４４８に対して、識別可能な標識を付した増幅産物をハイブリダイズし、当該標識を検出することにより、目的とする検出部位の存在を検出することが可能である。また、このとき、配列に応じて異なる第２の識別可能な標識を付した増幅産物を形成し、同様なマイクロアレイ４４９にて検出を行ってもよい。マイクロアレイの製造方法および使用方法は、それ自身当業者に公知である何れの手段を利用してもよい。

識別可能な標識は、それ自身当業者に公知の何れの標識物質を用いてもよく、これらに限定するものではないが、蛍光物質、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光たんぱく質、化学発光のためのＨＲＰなどであればよい。

また、蛍光ビーズを用いて検出をおこなってもよい。例えば、そのような方法は、文献（Ｄｕｎｂａｒ ＳＡ．，“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＭＡＰ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ，ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”，Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．２００６ Ｊａｎ；３６３（１−２）：７１−８２．Ｅｐｕｂ ２００５ Ａｕｇ １５．）のように行えばよい。

また、インビトロ転写産物を検出する場合には、例えば、図３０（８）−Ｂの方法を使用してもよい。これに限定するものではないが、マイクロアレイ４５９の基板４５６に固定化した第１のプローブ４５８にインビトロ転写産物４５７をハイブリダイズする。更に、上述したような識別可能な標識を付与した第２のプローブをインビトロ転写産物４５７の１本鎖の部分、例えば、タグの部分にハイブリダイズする。その後、当該識別可能な標識を検出することにより、検出部位の存在を検出することが可能である。

３．アダプターライゲーション
また、本発明の１態様に従うと、制限酵素とアダプターを利用するアダプターライゲーションを用いる以外は、上述の片鎖ギャップライゲーションと同様の原理および検出手段を利用する核酸配列検出を行うことが可能である。

図３１を参照されたい。アダプターライゲーションに使用するアダプターは、第１のアダプター４７０と第２のアダプター４７１である。第１のアダプターは、第１の制限酵素の切断部分に結合することが可能なように修飾されている。ここでは、２本鎖のうちの一方の５’側がリン酸化されている。第２のアダプターは、第２の制限酵素の切断部分に結合することが可能なように修飾されており、且つ相補鎖合成阻害構造を含んでもよい。第２のアダプターは検出鎖の５’端を含む側のアダプターである。２本鎖部分の５’端が結合可能に修飾されている。この例ではリン酸化されている。また、１本鎖部分の５’端も結合可能に修飾されている。同様に、この例ではリン酸化されている。

ここでは、結合可能な修飾としてリン酸化が利用されているが、上述した通り、結合可能な修飾はこれに限られるものではなく、特許３７５３９４２号に記述された光感受性ピリミジン塩基などであってもよい。

これら２つのアダプターを用いて環状構造体を得るための反応を説明する。図３２を参照されたい。アダプターライゲーションの場合、核酸鎖または核酸試料は２本鎖の核酸であればよい。核酸の種類、調製方法は、上述した通りである。

例えば、検出部位４８０をＳＮＰとした場合、まず、４８１の矢印の位置が第１の酵素で消化され、４８２の矢印の位置が第２の酵素で消化される。次に、各々の切断部分に第１の酵素の消化部位には第１のアダプター４７０が結合し、第２の酵素の消化部位には第２のアダプター４７１が結合する。得られた２本鎖を変性し、その後、結合前に、部分１本鎖の５’側にリン酸が結合していた方の１本鎖（「検出鎖」とも称する）４８３がダンベル形態４８４になり、これが環状構造体となる。

検出は、上述した何れの検出方法を使用してもよい。また、相補鎖合成阻害構造が必ずしもある必要はなく、当該相補鎖合成阻害構造がない場合は、電気泳動または質量分析を行って、当該環状構造体を検出すればよい。

また、当該環状構造体を形成した後、または、ダンベル形態を形成した後に、所望の酵素により消化を行うことにより不要な１本鎖核酸を消化してもよい。これにより、その後の検出および／または操作において高い検出感度および／または高い操作性が得られるので好ましい。

タグとプライマー配列の間に相補鎖合成阻害構造があることにより、阻害箇所で相補鎖の合成が止まるので、環状構造体の存在を他の核酸に反映するときに、不要な長鎖産物ができないので好ましい。

また、タグとプライマー配列の間に相補鎖合成阻害構造があることにより、阻害箇所で相補鎖の合成が止まる。このように、相補鎖合成が途中で止まるため、T7プロモーターを利用したインビトロ転写によるタグ増幅をするときに必要最小限の長さの産物が得られる。

以上の本発明により、ランニングコストの低い、非特異反応の起きにくい核酸配列検出方法が提供された。

また、更に、片鎖ギャップライゲーションからダンベル形成、ギャップライゲーションとの間において熱サイクリングを行ってもよい。それにより、より多くのダンベル分子の形成が可能である。

即ち、検出鎖の形成時から環状構造体の形成までの工程を行うと同時に、または検出鎖が形成された後から環状構造体の形成までの工程を行うと同時に、熱サイクリングを行ってもよい。ここでいう「熱サイクリング」とは、反応系の温度を任意の温度間で上げ下げすることをいい、これによって、より適切な分子内ハイブリダイゼーションを得ることが可能になる。片鎖ギャップライゲーション合成をした核酸で分子内反応をするときに、２本鎖核酸を熱変性し1本鎖化することによって、２本鎖を周期的に確実に熱変性する段階を入れることができ、２本鎖の再会合による分子内反応の阻害を防いで分子内ハイブリダイゼーションを進めることができるので有利である。

４．キット
本発明の更なる態様に従うと、本発明の核酸配列検出方法に用いる核酸試料に含まれる当該検出部位よりも３’側に位置する第1の核酸配列に相補的な配列を含む第1の検出鎖合成核酸と、当該検出部位よりも５’側に位置する第2の核酸配列に相補的な配列を含み且つその５’側に相補鎖合成阻害構造を含み更にその５’側にタグ配列を含む第２の検出鎖合成核酸と、酵素と、核酸と、基質とバッファとからなる試薬を含む検出キットも提供される。また、当該プライマーを具備し、他の構成要素を任意に含む検出キットも提供される。

これらのキットにより、本発明に従う核酸配列検出方法が簡便に行うことが可能である。

５．その他の態様
本発明に従う検出方法は、更に次のような（１）〜（１６）に記載するような態様であってもよい。

（１） 以下を具備する核酸配列検出方法；
（ａ）検出鎖を得ること；
（ｂ）適切な分子内ハイブリダイズが得られる条件下で前記検出鎖について分子内ハイブリダイゼーションを行うこと；
（ｃ）前記分子内ハイブリダイズを行った検出鎖を連結閉環すること；
（ｄ）前記連結閉環により得られた得られた環状構造体を検出することにより、目的とする変異部位および／または検出部位についての情報を得ること。

（２） 前記（１）に記載の方法であって、
（ａ）の検出鎖を得ることが以下を具備し；
（i）被検核酸を１本鎖核酸試料とすること；
（ii）第1の検出鎖合成核酸と第2の検出鎖合成核酸を準備すること、
ここで、第1の検出鎖合成核酸は、前記１本鎖核酸試料に含まれる検出部位の３’側に位置する第1の核酸配列に相補的なプライマー配列と、その５’側に連結された前記1本鎖核酸試料の変異部位よりも３’側の検出部位の配列に相同な第１の配列とを含み、
ここで、第2の検出鎖合成核酸は、前記１本鎖核酸試料に含まれる検出部位の５’側に位置する第２の核酸配列に相補的なオリゴ核酸配列と、その３’側に連結された相補鎖合成阻害構造と、その３’側に連結された前記１本鎖核酸試料の変異部位とそれよりも５’側の検出部位の配列に相同な第２の配列とを含み、
前記第１の検出鎖合成核酸の３’端と第２の検出鎖合成核酸の５’端は、互いに結合可能なように、少なくとも何れかが修飾されている；
（iii）前記（i）で準備された核酸試料と、前記（ii）で準備された第１の検出鎖合成核酸と第２の検出鎖合成核酸とをハイブリダイズすること；
（iv）第１の検出鎖合成核酸を適切な伸長が得られる条件下で伸長すること；
（v）伸長された第１の検出鎖合成核酸の３’端と第２の検出鎖合成核酸の５’端を結合することにより検出鎖を得ること；
前記（ｂ）のハイブリダイゼーションを行うことが、（v）で得られた検出鎖について、当該検出鎖に含まれる第１の配列と第２の配列を用いて自己分子内ハイブリダイズさせることであり；
前記（ｃ）の連結閉環することが、第１の配列の５’端と第２の配列の３’端を連結閉環することによって環状構造体を得ることである；
方法
（３）前記（２）に記載の方法であって、前記変異部位および／または検出部位についての情報を得ることが、以下のことにより行われる方法；
（i）前記環状構造体の検出配列を含む連結部の両側の配列を相補鎖合成阻害構造まで増幅すること；
（ii）（i）の増幅により得られた増幅産物を検出することによって、前記核酸試料における目的の核酸配列の検出を行うこと。

（４） 前記（２）または（３）の何れか１項に記載の核酸配列検出方法であって、前記第1の検出鎖合成核酸が、更に、前記プライマー配列と、前記第１の配列との間に第１のタグ配列を含み；および前記第2の検出鎖合成核酸が、更に、前記相補鎖合成阻害構造と、前記第２の配列との間に第２のタグ配列を含む方法。

（５） 前記（２）〜（４）の何れか１項に記載の方法であって、更に、前記連結閉環した後に、連結閉環していない核酸を消化することを具備する方法。

（６） 前記（２）〜（５）の何れか１項に記載の方法であって、前記結合可能なような修飾が、第２の検出鎖合成核酸の前記オリゴ核酸配列の５’端をリン酸化する修飾である方法。

（７） 前記（１）に記載の方法であって、
（ａ）の検出鎖を得ることが以下を具備し；
（i）２本鎖核酸試料を準備すること；
（ii）前記２本鎖核酸試料を第１の制限酵素および第２の制限酵素により切断すること；
（iii）第１の制限酵素切断部に第１のアダプターを付与し、第２の制限酵素切断部に第２のアダプターを付与すること；
ここで、第１のアダプターは、第１の制限酵素切断部に結合するために一方の１本鎖の５’端がリン酸化されているアダプター末端と、分子内ハイブリダイゼーションを行うために、第１の鎖の当該核酸試料の３’端側には検出部の３’側に相補的な配列を有し、
ここで、第２のアダプターは、第２の制限酵素切断部に結合するために一方の１本鎖の５’端がリン酸化されているアダプター末端と、当該一方の１本鎖に相補鎖合成阻害構造を含み、前記鎖のリン酸化されている５’端側の配列が、当該核酸試料の検出部の５’側の配列に相補な配列である；
（iv）前記（iii）で得られた２本鎖から検出鎖を得る；
方法。

（８） 前記（１）〜（７）の何れか１項に記載の方法であって、前記連結閉環した後に、連結閉環していない核酸を消化することを具備する方法。

（９） 前記（１）〜（８）の何れか１項に記載の方法であって、更に、前記（ｃ）の連結閉環することで得られた環状構造体について、少なくともその一部を増幅することを具備する方法。

（１０） 前記（９）に記載の方法であって、前記増幅することがＲＮＡポリメラーゼのインビトロ転写によるＲＮＡ合成である方法。

（１１） 前記（１）〜（１０）の何れか１項に記載の方法であって、分子内ハイブリダイゼーションと連結閉環する工程で、反応温度を周期的に変更する熱サイクリングを複数回おこなう方法。

（１２） 前記（７）または（８）の何れか１項に記載の方法であって、（ｄ）の工程が増幅産物とＤＮＡマイクロアレイとのハイブリダイゼーションを検出することで行われる方法。

（１３） 前記（１）に記載の方法であって、（ｄ）の工程が増幅産物とのハイブリダイゼーションと、検出可能な標識をそなえた核酸のその増幅産物へのハイブリダイゼーションと、その検出可能な標識を検出して間接的に増幅産物を検出することで行われる方法。

（１４） 前記（７）または（８）の何れか１項に記載の方法であって、（ｄ）の工程が増幅産物の質量分析で行われる方法。

（１５） 前記（７）または（８）の何れか１項に記載の方法であって、（ｄ）の工程が増幅産物の電気泳動で行われる方法。

（１６） 前記（１）〜（１５）の何れか１項の方法に用いる検出キットであって、酵素と、基質と、バッファ、検出用マイクロアレイの何れか、または全てからなる試薬を含む検出キット。

本発明の態様により、プローブの連結反応により核酸を検出するとき、被検核酸に対して大過剰のプローブ核酸を加える必要がなく、それにより低コストで実行することが可能であり、且つ非特異反応が起きにくい方法が提供される。

［実施例１］
SNPタイピングをするためのプロトコルの１例を次に示し、このプロトコルで検出した結果を示す。

以下、実施内容を説明する。

１．プローブ、プライミング配列設計
検出対象とするSNPの塩基配列は、東大医科学研究所の整備した日本人のSNPのデータベースJSNP（http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index_ja.html）から得た。SNPのアクセション番号は、IMS-JST164838であり、当該SNP#3の周辺配列を表１に示す。

これを以降、簡単にSNP003と呼ぶことにする。検出したサンプルは（財）ヒューマンサイエンス振興財団のヒューマンサイエンス研究資源バンクが頒布（http://www.jhsf.or.jp/bank/psc.html）しているヒト抹消血細胞を株化したものから抽出したヒトゲノムDNAである。

サンプルはPSCDA0503, PSCDA0328, PSCDA0719, PSCDA0785, PSCDA0415, PSCDA0716, PSCDA0693, PSCDA0117なる番号で、8検体を検出した。表２は、サンプルのサンガー法によるシーケンシング結果であり、このシーケンシングにはアプライド・バイオシステムズ社のPRISM 3100Genetic Analyzerを用い、三井情報開発のシーケンサー出力波形解析ソフトウェア波平を使用して各SNPのアレルを決定した。

以下、それぞれのゲノムサンプルを処理した方法について記す。

２．検出実験
（１）プローブのリン酸化
1次PCRのLSOプライマーをリン酸化する。検出に用いる鎖上のASOプライマーの5’端のリン酸化は3の反応でライゲーションもしくはギャップライゲーションを用いるときいずれにも必要である。次の反応液を準備して反応をおこなった。

T4 polynucleotide kinase（タカラバイオ） 20 units
T4PK用バッファ（〃） 1x（最終濃度）
LSOプライマー 5μM（最終濃度）
ATP 1mM（最終濃度）
全液量（足りない液は超純水で補充） 50μL。

温度条件（MJリサーチ社 PTC-200を使用）
1. 37℃ 60分
2. 95℃ 15分
3. 10℃ hold。

以上により、ASOプライマーのリン酸化が完了した。

（２）1次PCR
実施例の検出では最初に、ゲノムDNA 5ngから標的のSNPを含む領域をPCRにて増幅した。この操作は次の手順でおこなった。

このPCR反応に用いる溶液の組成は次のとおりであり、プライミング配列は表３のとおりである。

プライミング配列は米国DNA ソフトウェア社のVisual OMPを用いて設計した。マルチプレックスPCRをおこなう。必要なSNPの数だけのASOプライマー、LSOプライマーのミクスチャにする。ここでは、SNP003の周辺配列の増幅をおこなう。

PrimeStar（タカラバイオ） 0.025U/μL（最終濃度）
PrimeStar buffer（〃） 1x（最終濃度）
dNTP 200μM each
テンプレート 5ng /10μL
ASOプライマー 0.1μM each
LSOプライマー 0.2μM
全液量（足りない液は超純水で補充）10μL。

温度サイクル（MJリサーチ社 PTC-200を使用）
1. 98℃ 10秒
2. 68℃ 60秒 (1, 2を5サイクル)
3. 98℃ 10秒
4. 72℃ 90秒 (3, 4を40サイクル)
5. 10℃ hold。

以上により、ゲノム増幅液10μlが得られた。

２．ライゲーション
PCR産物の一部をとり、閉環ライゲーション反応をおこなう。この実施例では1のPCRで末端にアデニン塩基を付加することが少ないポリメラーゼを用いているので平滑化反応を省略する。平滑化反応をする場合は、1本鎖核酸の3’→5’向きのエクソヌクレアーゼ活性があり、2重鎖に対しては活性のない酵素による平滑化反応がよい。

閉環のライゲーションは次の液を作製し、実施する。

Taq ligase（New England Biolab） 4U
Taq ligase buffer（〃） 1x（最終濃度）
1st PCR 産物 1μL
超純水 最終液量に達するまで
全液量（足りない液は超純水で補充） 10μL。

温度条件（MJリサーチ社 PTC-200を使用）
1. 95℃ 60秒
2. 65℃ 60分
3. 10℃ hold。

これにより、対応するSNPアレルを検出したLSOプライマー、ASOプライマーは分子内で閉環され、そうでないものは1本鎖のままで存在する。

３．消化反応
ライゲーション反応をしないで直鎖分子のままの核酸を分解する。エクソヌクレアーゼ活性のある東洋紡のKODポリメラーゼを使い、高温で分解処理をおこなった。反応液の組成は次のとおりである。

Ligation産物 2.5μL
KOD polymerase（東洋紡） 0.2μL/ 10μL
KOD buffer #2 （〃） 1x（最終濃度）
全液量（足りない液は超純水で補充） 10μL。

1本鎖構造をとらせるため、十分な高温にて反応を実施する。

温度条件（MJリサーチ社 PTC-200を使用）
1. 74℃ 30分
2. 10℃ hold。

以上により、大半の1本鎖核酸の末端が分解された。

４．2次PCR
それぞれCy3、Cy5で蛍光標識した2種類のMT（rは相補鎖の意味）とLTをプライマーとして使い、PCRする。PCRは閉環分子だけで起きる。溶液の組成は次のとおりであった。プライマー量は蛍光色素を修飾した側を10倍にして非対称PCRになるようにしている。

Titanium Taq（Becton Dickinson） 1x（最終濃度）
PrimeStar buffer（タカラバイオ） 1x（最終濃度）
dNTP 200μM each
平滑化産物 1μL
LT プライマー 0.01μM（最終濃度）
Cy3-rMT, Cy5-rMT’プライマー 0.1μM each（最終濃度）
全液量（足りない液は超純水で補充） 20μL。

温度サイクルは次のとおりである。

温度サイクル（MJリサーチ社 PTC-200を使用）
1. 95℃ 60秒
2. 98℃ 10秒
3. 55℃ 240秒 (2, 3を30サイクル)
4. 10℃ hold。

以上により、ゲノムのSNPアレルに対応したタグが増幅された。

５．検出
次のハイブリダイゼーション液を作りマイクロアレイにてハイブリダイゼーション検出する。マイクロアレイは日立のSP-BIOを用いて、タカラバイオの基材ハッブルスライドに点着して製作した。プローブは表３にあるように選択し、Cy3, Cy5の蛍光強度を比較することでタイピングできる。

検出には、キャピラリアレイ（特開平11-75812）を用いた。キャピラリアレイはDNAマイクロアレイに似たハイブリダイゼーションで核酸を検出するデバイスであり、溝状の流路に沿ってプローブをスポットした。今回使ったキャピラリアレイは1本の溝の中にタグ検出用のプローブが固定してあるもので、溝の容量は20μlであった。キャピラリはシリコンゴムの板に形成されており、プローブを直線状にスポットしたスライドガラスにシリコンゴムの粘着性を利用して貼り付けるものである。この溝の両端には溝の反対側の面に貫通する穴があけてあり、溝のある面をスライドガラス側に貼り付けても、それら貫通穴から試料液を注入・抜き取り出来るようになっている。これに各サンプルの2次PCRまで完了した溶液を注入し、ハイブリダイゼーションした。

フォルムアミド 15%（最終濃度）
O.5xSSC+0.1%SDS
EDTA 1mM
2次PCR産物 10μL
全液量 20μL。

キャピラリアレイを遮光し、37℃に暖めたホットプレート上に置き、60分間ハイブリダイゼーションをおこなった。続いて洗いは次の手順でおこなった。

１）ピペットでハイブリダイゼーション液を抜き取る
２）乾燥を防ぐためただちに1×SSCと0.2%SDSを成分とするウォッシング液を20 μl注入する
３）スライドガラスからシリコンゴム製の溝を外す
４）スライドガラスを1×SSCと0.2%SDSを成分とするウォッシング液中にて室温下で5分振盪する
５）続いて0.1×SSCにて室温下で10分スライドガラスを振盪洗浄する
６）エアスプレーまたは、遠心機にてスライドガラスを乾燥させる。

以上の手順でハイブリダイゼーション反応を終了し、つづいてマイクロアレイスキャナ、Axon社のGenePix 4000Bで検出した。取得した蛍光イメージは装置に付属のソフトウェアで解析し、各アレルの溶液中の存在量を検出した。蛍光強度をプロットし8サンプルのタイピング結果を散布図で示したのが図３３である。本発明のタイピング結果は事前におこなったサンガー法によるシーケンスと一致し、本発明が有効な検出方法であることが示せた。

Claims (19)

1. 以下を具備する核酸配列検出方法；
   （ａ）核酸試料を準備すること；
   （ｂ）前記核酸試料に含まれる当該検出部位の３’側に位置する第1の核酸配列に相補的な配列を含む第１の分子内検出プローブと、当該検出部位の５’側に位置する第2の核酸配列に相補的な配列を含む第２の分子内検出プローブを準備すること、ここで、前記第１の分子内検出プローブの３’端と前記第２の分子内検出プローブの５’端の少なくとも一方が核酸と結合が可能なように修飾されている；
   （ｃ）前記核酸試料をテンプレートにして、３’末端に前記第１の分子内検出プローブを、５’末端に前記第２の分子内検出プローブを付与した当該検出部位の配列を含む検出鎖を合成すること；
   （ｄ）前記検出鎖について、前記第1の核酸配列と前記第１の分子内検出プローブとの間、および前記第２の核酸配列と前記第２の分子内検出プローブとの間の２箇所で分子内ハイブリダイズがなされること；
   （ｅ）前記核酸試料において目的の核酸配列が存在するときに、前記第１の分子内検出プローブの３’端と前記第２の分子内検出プローブの５’端が直接または間接的に連結すること；
   （ｆ）（ｅ）の連結することにより環状構造体を得ること；
   （ｇ）前記環状構造体から、前記核酸試料における目的の核酸配列の検出を行うこと。
2. 請求項１に記載の核酸配列検出方法であって、前記（ｄ）のハイブリダイズによって、ダンベル構造体が形成され、前記ダンベル構造体の形成と前記（ｅ）における連結が、予め設定された熱サイクリング条件下での熱サイクリングの実施と共に行われる方法。
3. 請求項１または２に記載の核酸配列検出方法であって、前記（ｆ）の環状構造体を得ることの後に、更に、閉環しなかった核酸を酵素により消化することを具備する方法。
4. 請求項１〜３の何れか１項に記載の核酸配列検出方法であって、前記（ｇ）における目的の核酸配列の検出を行うことが、ＤＮＡマイクロアレイ、蛍光ビーズ、電気泳動および質量分析からなる群より選択された手段により、当該環状構造体を検出することによって行われる方法。
5. 請求項１〜４の何れか１項に記載の核酸配列検出方法であって、前記（ｇ）における目的の核酸配列の検出を行うことが、当該環状構造体の連結部の形成を検出可能なプライマーを用いる伸長反応を利用して得られた増幅産物を検出することによって当該環状構造を検出することにより行われる方法。
6. 請求項１〜５の何れか１項に記載の核酸配列検出方法であって、前記第２の分子内検出プローブの５’端がリン酸化されている方法。
7. 請求項１〜６の何れか１項に記載の核酸配列検出方法であって、当該第１の分子内検出プローブが、当該第１の分子内検出プローブの３’側に位置する前記第1の核酸配列に相補的な配列に加えて更に、当該検出部位における検出対象に関する情報を反映するように予め設計されて割り当てられたタグ配列を含む、および／または当該第２の分子内検出プローブが、当該検出部位の５’側に位置する前記第２の核酸配列に相補的な配列に加えて更に、当該検出部位における検出対象に関する情報を反映するように予め設計されて割り当てられたタグ配列を含む方法。
8. 請求項１〜７の何れか１項に記載の核酸配列検出方法であって、当該核酸配列検出が、ＳＮＰ検出、遺伝子発現計測、メチル化検出、並びに欠失、挿入、置換およびマイクロサテライトの検出からなる群より選択される方法のために行われる方法。
9. 核酸の変異を解析する方法であって、以下を具備する方法：
   （ａ）被検核酸に相補な複製鎖を合成し、前記複製鎖上の検出されるべき変異部位とその周辺に相補な、または前記変異部位の周辺に相補な第１の分子内検出プローブ及び第２の分子内検出プローブを複製鎖の両末端に付加すること、
   ここで、前記両末端に付加された前記第１及び前記第２の分子内検出プローブにおいて、前記第１または前記第２の分子内検出プローブの配列が、前記複製鎖上における変異部位の配列に相補的な配列を含む配列である；
   （ｂ）前記複製鎖に、２カ所でハイブリダイズがなされてダンベル構造体が形成されること、
   ここで、その１か所は、前記変異部位およびその周辺と前記第１の分子内検出プローブとの間、または前記変異部位の周辺と前記第１の分子内検出プローブとの間であり、
   もう１か所が、前記変異部位およびその周辺と前記第２の分子内検出プローブとの間、または前記変異部位の周辺と、前記第２の分子内検出プローブとの間である；
   （ｃ）解析しようとする変異部位に特定の塩基配列が存在したときに、核酸モノマー、または変異に相補な核酸を介して、または直接に、前記構造をなす複製鎖の末端同士が、酸素反応または化学反応により共有結合で連結されて閉環核酸分子を形成すること；
   （ｄ）前記閉環核酸分子の連結された部分を含む配列、またはその相補鎖配列、または両方の配列を合成すること；および
   （ｅ）前記合成された前記閉環核酸分子の連結された部分を含む配列、またはその相補鎖配列の存在を検出することで核酸の変異を解析すること。
10. 請求項９に記載の方法であって、更に、前記閉環核酸分子以外の直鎖核酸分子の完全分解または部分分解をすることを具備する方法。
11. 請求項９または１０に記載の方法であって、前記（ａ）の付加が、第1のプライマーと第２のプライマーを用いた増幅反応により行われ、
    前記第1のプライマーは、当該第１の分子内検出プローブを、前記被検核酸に含まれる当該変異部位の３’側に位置する第１の核酸配列に相補的な配列として当該第１のプライマーの５’端側に含み、更に当該検出核酸における第１の分子内検出プローブに対応する配列よりも３’側の一部の配列に相補な配列からなる第１のプライミング配列を当該第１のプライマーの３’端に含み、
    第２のプライマーは、当該第２の分子内検出用プローブを、前記被検核酸に含まれる当該変異部位に対応する部位の３’側に位置する第２の核酸配列に相補的な配列として第２のプライマーの５’端側に含み、更に当該検出核酸における第２の分子内検出プローブに対応する配列よりも３’端の一部の配列に相補的な配列からなる第２のプライミング配列を当該第２のプライマーの３’端に含み、
    更に、前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーが、それらのそれぞれの前記プライミング配列と前記第１または第２の分子内検出プローブ配列との間に、識別および／または増幅のために利用可能なタグ配列を有する方法。
12. 請求項９〜１１の何れか1項に記載の方法であって、前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーが、それらのそれぞれの前記プライミング配列と前記第１または第２の分子内検出プローブ配列との間にタグ配列を有し、前記タグ配列が、検出しようとする変異に対応する、または共通化した１または１種類以上の配列であり、前記第２のプライマーは、当該変異部位に対応して複数の互いに異なるタグ配列を有し、前記第１のプライマーは、当該変異部位の変異種に対応して複数の互いに異なるタグ配列を有し、且つ第１のプライマーと第２のプライマーのタグ配列が互いに異なることにより、変異が同時に検出され解析される方法。
13. 請求項１１または１２に記載の方法であって、前記増幅反応により得られる産物に含まれる当該検出されるべき変異を含む１本鎖核酸において、当該変異部位またはそれに隣接する位置に対して、前記１本鎖核酸の３’と５’末端が分子内でハイブリダイズすることによって分子内構造が形成され、その末端環のギャップまたはニックが、その分子内構造における当該変異部位の隣接部、または当該変異部位を含む変異部位付近の位置に存在する方法。
14. 請求項１３に記載の方法であって、前記分子内構造の当該変異部位と隣接塩基の間にニックが存在し、そこにリガーゼを作用させることによって閉環核酸分子が形成される方法。
15. 請求項１３に記載の方法であって、前記分子内構造にギャップがあり、ポリメラーゼによる相補鎖合成とリガーゼによる連結によって閉環核酸分子が形成される方法。
16. 請求項１１〜１３の何れか１項に記載の方法であって、前記ギャップが、前記増幅反応により得られる産物に含まれる当該検出されるべき変異を含む１本鎖核酸において、当該変異部位と当該変異部位に隣接する配列の相補配列、または当該変異部位の相補配列とからなるギャップ配列からなり、前記第１のプライマーが、前記検出されるべき変異を含む１本鎖核酸における当該当該変異部位の５’側に存在する連続する配列の一部と相補な配列からなる第１のプローブ配列を当該第１のプライマーの５’端側に含み、前記第２のプライマーが、前記増幅反応により得られる産物に含まれる当該変異部位に対応する部位の５’側に近接して連続する配列の一部と相補的な第２のプローブ配列を当該第２のプライマーの５’側に含み、前記第１および第２のプライマーを用いて第１の増幅を行った後、前記ギャップ配列の塩基配列を有しその５’末端がリン酸化された核酸断片の存在下で、リガーゼを作用させることによって閉環核酸分子が形成される方法。
17. 請求項１６に記載の方法であって、当該検出されるべき変異が一塩基変異である方法。
18. 請求項１２〜１７の何れか１項に記載の方法であって、更に第２の増幅反応を含み、以下を具備する方法：
    前記第２の増幅において、予め蛍光色素標識された第１および／または第２のプライマーを用いること；
    当該得られた第２の増幅産物を、当該第２の増幅産物を捕捉するためのプローブを具備する核酸マイクロアレイに対して、ハイブリダイズさせること；および
    前記核酸マイクロアレイ上で前記蛍光色素標識由来の蛍光色素を検出して、当該被検核酸における検出されるべき変異を解析すること。
19. 請求項１２〜１８の何れか１項に記載の方法であって、前記第１のプライマーに含まれる、当該変異部位の変異種に対応して複数の互いに異なるタグ配列が、識別可能な複数の蛍光色素により標識され、
    更に以下を具備する方法；
    同一変異部位で観察され得る変異型と、前記識別可能な複数の蛍光色素とを対応付けるように、予め、前記タグ配列の選択を行うこと；
    前記タグ配列の配列設計が、同一変異部位で観察され得る複数の変異型を有する変異核酸が、予め用意されたマイクロアレイに固定された同一のプローブにハイブリダイズするように反応されること；および
    上記のように選択され設計され、且つ蛍光色素により標識された当該タグ配列を、当該核酸マイクロアレイ上で多色検出して、当該被検核酸における検出されるべき変異を解析すること。

Images