JP4975966B2

JP4975966B2 - ケトンまたは関連する官能基を含むポリマー試薬

Info

Publication number: JP4975966B2
Application number: JP2004564925A
Authority: JP
Inventors: ピー．マクマヌス，サミュエル; コズロブスキ，アントニ; シェン，シャオミン; シー．クック，ダニエル
Original assignee: ネクターセラピューティクス
Priority date: 2002-12-31
Filing date: 2003-12-31
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2023-12-31
Also published as: JP2006516295A; US7208145B2; AU2003303519B2; US8865149B2; CA2509248A1; EP1581260B1; US20070166277A1; EP1581260A2; KR20050096115A; US20050031576A1; WO2004060406A2; AU2003303519C1; AU2003303519A1; WO2004060406A3; CN1744918A; KR101090784B1; MXPA05007165A

Description

概して本発明は、ケトンまたは関連する官能基を含む新規ポリマー試薬に関し、該関連する官能基は、例えばケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール、及びジチオケタールなどを含む。さらに、本発明は、本明細書に記載のポリマー試薬の活性作用物質のような他の物質への結合により形成される複合体に関する。さらに、本発明は、ポリマー試薬の合成方法、ポリマー試薬を他の物質へ複合化させる方法、ポリマー試薬を含む組成物などに関する。

科学者及び臨床家は、患者への送達に好適な形態の活性作用物質の開発の試みにおいて多くの挑戦に直面する。例えば、ポリペプチドである活性作用物質は、しばしば経口よりも注射によって送達される。この方法によって、ポリペプチドは胃のタンパク分解性の環境に露出されることなく、体循環中へ導入される。しかしながら、ポリペプチドの注射は、いくつかの欠点を有する。例えば、多くのポリペプチドが比較的短い半減期を有することによって反復注射を必要とし、反復注射はしばしば不便であり且つ痛みを伴う。さらに、いくつかのポリペプチドは１つ以上の免疫応答を誘発することができ、その結果、患者の免疫系は活性化して該ポリペプチドを分解または不活性化するかも知れない。したがって、ポリペプチド及び他の活性作用物質の送達は、これらの作用物質が注射によって投与されたとしても、しばしば問題を有する。

注射によって活性作用物質を送達することにおける問題への対処においていくつかの成功が収められた。例えば、活性作用物質を水溶性のポリマーに複合化させることにより、免疫原性及び抗原性の減少したポリマー‐活性作用物質複合体が得られた。さらにインビボでの腎臓を介するクリアランスの減少及び／又は酵素的分解の減少の結果として、これらの複合体はしばしばそれらの未複合化対応物に比べて非常に長い半減期を有する。より長い半減期を有することにより、該複合体が必要とする投薬頻度はより少なくなり、それによって痛みを伴う注射及び不便な医療従事者訪問の総回数を減少させる。さらに、部分的にのみ可溶性の活性作用物質は、水溶性ポリマーと複合化させられた場合にしばしば、顕著な水溶性の増加を示す。

報告されたその安全性並びにその局所的及び内服使用の両方についてのFDAによる認可により、ポリ（エチレングリコール）は、活性作用物質に複合化された。活性作用物質がポリ（エチレングリコール）ポリマー又は「PEG」に複合化される場合、複合化された活性物質は、便宜上、「ペグ化（PEGylated）」されたと称される。ペグ化活性作用物質の商業的成功は、それらの価値を証明している。商業的に入手可能なペグ化ポリペプチドの例は、PEGASYS（登録商標）ペグ化インターフェロンアルファ‐２ａ（Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ）、PEG-INTRON（登録商標）ペグ化インターフェロンアルファ‐２ｂ（Schering Corp., Kennilworth, NJ）、SOMAVERT（登録商標）ペグ化ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト、及びNEULASTA（登録商標）ペグ‐フィルグラスチム（Amgen Inc., Thousand Oaks, CA）を含む。ジステアロイルホスファチジルエタノラミン（Zalipsky(1993)Bioconjug. Chem. 4(4):296-299）及びフルオロウラシル（Ouchi et al. (1992) Drug Des. Discov. 9(1):93-105）のようなペグ化小分子も調製されている。

これらの成功にもかかわらず、ポリマーの活性作用物質への複合化はいまだ挑戦的なものである。特に、複合化反応は比較的不正確であるため、生成物の比較的分散した混合物が生じる。例えば、複合化反応はしばしば、一置換された、二置換された、そして多置換された複合体形態の混合物として生じる。さらに、活性作用物質の異なる結合部位が結合の異なる配置を生じうる限りは、可能な異なる複合体形態の数は増加する。例えば、ポリマーへの３つの異なる結合部位を有する一置換された活性作用物質は、３つの異なる形態を有することができ、それぞれの形態は３つの異なる結合部位の一つに結合した単一のポリマーを有する。各複合体形態が独特の薬力学及び薬物動態プロファイルを有しうることを認識することは、治療剤としての使用に適したポリマー‐活性作用物質複合体を提供することに関する複雑性を強調するのみである。したがって、所望の複合体をより予想可能に形成できるように、「部位特異的な」ポリマー試薬を提供することが望まれる。

複合化反応における或る程度の選択性は、ポリマー試薬上に存在する特別な官能基の存在に基づいて達成される。例えば、アルデヒド誘導体を有するポリ（エチレングリコール）誘導体（下記に示す）は、例えばポリペプチドの一級アミンとの還元的アミノ化反応を行う。

結果として、典型的には複合化は、ポリペプチドの比較的反応性であり且つ容易にアクセス可能な一級アミン基とポリマー試薬のアルデヒドとの間でのみ起こるので、或る程度の選択性が達成される。しかしながら、（多くの一級アミンを含むリジン残基を有するポリペプチドなどの）多数の比較的反応性の一級アミン基を有するポリペプチドについては、それにもかかわらず、複合化反応は複合体形態の比較的多分散の混合物を生じる。

アルデヒド誘導体を有するポリマー試薬の代替物を提供するために、本発明はケトン又は関連する官能基（例えば、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール、及びジチオケタールなど）を含むポリマー試薬を提供する。

様々な状況において使用される、ケトン又は関連する官能基を含むポリマーが他で記載された。しかしながら、典型的には、記載されたポリマーは複合体形成には不適である。

例えば、PCT国際特許出願公開第WO/96/33156号は、ベンゾフェノン及び関連する芳香族部分のポリ（アルキレングリコール）誘導体を記載する。該誘導体は、光開始剤として有用であると記載されている。しかしながら、芳香環は、活性作用物質への複合化に有用なポリマー試薬にはないことが好ましく、それは、芳香環部分の疎水性の性質が望ましくない水溶性の低下を生じさせるからである。さらに、複合体中に含まれる芳香環は、インビボにおいてアレンオキシド中間体に代謝されることができ、それがタンパク質、DNA、及びRNA上の求核基に共有結合することができ、それによって細胞毒性を生じさせる。Daly et al.(1979) Experientia 28(10):1129-1149を参照のこと。

米国特許第5,149,806号は、Michaelドナーとして有用な炭素酸を記載する。記載された構造の一つが以下に提供される：

これらのような構造が複合化反応に使用可能であるとしても、プロピレンオキシドポリマーは、インビボ投与に許容可能な複合体を提供するための適切な水溶性を有さない。

他の先に記載されたポリマー試薬も同様の欠点を有する。

したがって、本分野においては、なかでも他の物質との複合体を提供するのに有用なポリマー試薬を提供する必要が依然として存在する。本発明は、なかでもケトン又は（例えば、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール、及びジチオケタールなどの）関連する官能基を含む、新規ポリマー試薬を提供することによって、本分野におけるこれらの必要性に取り組む。

発明の要約
したがって、官能基及び水溶性のポリマー部分を含むポリマー試薬を提供することが本発明の主要目的であり、ここで、該官能基は該水溶性のポリマー部分に１つ以上の原子を介して結合しており、該官能基はケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール、及びジチオケタールから成る群から選ばれる。

該水溶性ポリマー部分が２，２００超の分子量を有する、ポリマー試薬を提供することが、本発明の他の目的である。

該官能基が、ケトン、ケトンハイドレート、ヘミケタール、及びケタールから成る群から選ばれる、ポリマー試薬を提供することは、本発明のさらなる目的である。

該水溶性ポリマー部分がポリ（エチレングリコール）である、ポリマー試薬を提供することは、本発明のなおさらなる目的である。

本明細書に記載のポリマー試薬の製造方法を提供することは、本発明のさらなる目的である。

ある物質と本明細書に記載のポリマー試薬の複合体を提供することは、本発明のなおさらなる目的である。

該物質が活性作用物質である、複合体を提供することは、本発明の他の目的である。

本明細書に記載のポリマー‐活性作用物質複合体を含む医薬組成物を提供することは、本発明の他の目的である。

本明細書に記載のポリマー複合体の投与方法を提供することは、本発明のさらなる目的である。

本発明のさらなる目的、利点及び新規な特徴は、以下の説明において示され、そして部分的には以下の記載によって当業者に明らかとなり、又は本発明の実施によって理解されるであろう。

そして、本発明の１の実施態様においては、官能基及び水溶性ポリマー部分を含むポリマー試薬が提供される。官能基及び水溶性ポリマー部分は、直接的な共有結合又は１つ以上の原子を介して、のいずれかによって結合されている。官能基は、ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール、及びジチオケタールから成る群から選ばれる。中でも、ポリマー試薬は他の物質（例えば、活性作用物質）とともにポリマー含有複合体を形成することができる。

他の実施態様においては、官能基及び２，２００超の平均分子量を有する水溶性ポリマー部分を含むポリマー試薬が提供され、ここで、該官能基は直接的な共有結合又は１つ以上の原子を介して、のいずれかにより水溶性ポリマー部分に結合しており、さらに、（ａ）該官能基は、ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール、及びジチオケタールから成る群から選ばれ、そして（ｂ）該ポリマー試薬は、以下の：芳香族部分；プロリン残基；炭素数８以上の飽和炭化水素鎖、環状ジエノン；及び-ONH₂基のそれぞれを有さず、但し、該ポリマー試薬は以下の：

のいずれでもない。

本発明の他の実施態様においては、官能基及び水溶性ポリマー部分を含むポリマー試薬が提供され、ここで、該官能基は直接的な共有結合又は１つ以上の原子を介して、のいずれかにより該水溶性ポリマー部分に結合しており、さらに、（ａ）該官能基はチオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、及びジチオケタールから成る群から選ばれ、そして（ｂ）該ポリマー試薬は炭素数８以上の飽和炭化水素鎖を有さない。

本発明のさらに他の実施態様においては、官能基及び水溶性ポリマー部分を含むポリマー試薬が提供され、ここで、官能基は環状構造の部分であり、さらに該環状構造は直接的な共有結合又は１つ以上の原子を介して、のいずれかにより該水溶性ポリマー部分に結合しており、該官能基は、ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれ、そしてさらに該ポリマー試薬は環状ジエノンを有さない。

以下においてさらに詳細に説明されるとおり、本発明のポリマー試薬は多くの異なる形態を包含する。例えば、ポリマー試薬は単官能性であることができる。本発明に包含される例示的な単官能性ポリマー試薬は、以下の式：

｛式中、
POLY¹は、-O-R⁷として定義される末端を有する水溶性ポリマー部分であり；
（ａ）は、ゼロ又は１のいずれかであり；
（ｂ）は、ゼロ又は１のいずれかであり；
Ｘ¹は、存在する場合にはスペーサー部分であり；
ＥＷ¹は、存在する場合には電子吸引基であり；
（Z）は、０又は１、２、３、４、５、６、又は７などの正の整数であり；
各R²は、存在する場合には、独立してH又は有機ラジカル、例えばH又は芳香族を含まない有機ラジカルであり；
各R³は、存在する場合には、独立してH又は有機ラジカル、例えばH又は芳香族を含まない有機ラジカルであり；
R⁷は、H又は有機ラジカル、例えばH又は芳香族を含まない有機ラジカルであり；
FGは、ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基であり；
R¹は、芳香族を含まない有機ラジカルなどの有機ラジカルであり；そしてさらに、
以下の式：

により表される部分は場合により１つ以上の二重結合を含む。｝
により表される構造を含むが、但し、該ポリマー試薬は、以下の：

のいずれでもない。

本発明のポリマー試薬は、（同じであるか又は異なる）２つの官能基を含む、二官能性ポリマー試薬の形態で提供されることもできる。本発明に包含される例示的な二官能性ポリマー試薬は、以下の式II：

｛式中、
POLY¹は、水溶性ポリマー部分であり；
（ａ）は、ゼロ又は１のいずれかであり；
（ｂ）は、ゼロ又は１のいずれかであり；
（ｃ）は、ゼロ又は１のいずれかであり；
（ｄ）は、ゼロ又は１のいずれかであり；
Ｘ¹は、存在する場合にはスペーサー部分であり；
Ｘ²は、存在する場合にはスペーサー部分であり；
ＥＷ¹は、存在する場合には電子吸引基であり；
ＥＷ²は、存在する場合には電子吸引基であり；
（Z）は、０又は１、２、３、４、５、６、又は７などの正の整数であり；
（Y）は、０又は１、２、３、４、５、６、又は７などの正の整数であり；
各R²は、存在する場合には、独立してH又は有機ラジカル、例えばH又は芳香族を含まない有機ラジカルであり；
各R³は、存在する場合には、独立してH又は有機ラジカル、例えばH又は芳香族を含まない有機ラジカルであり；
各R⁴は、存在する場合には、独立してH又は有機ラジカル、例えばH又は芳香族を含まない有機ラジカルであり；
各R⁵は、存在する場合には、独立してH又は有機ラジカル、例えばH又は芳香族を含まない有機ラジカルであり；
-FG-R¹は、（i）R¹として定義される末端を有する、ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基であり、ここで、R¹は有機ラジカルである、又は（ii）ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基がその部分である、非ジエノン環状構造のいずれかであり；
-FG-R⁶は、（i）R⁶として定義される末端を有する、ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基であり、ここで、R⁶は有機ラジカルである、又は（ii）ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基がその部分である、非ジエノン環状構造のいずれかである。｝
により表される構造を含み、場合により、式II中の以下の部分：

及び

のそれぞれは、１つ以上の二重結合を有する。

なお他の実施態様においては、本発明は（同じであるか又は異なる）２つ以上の水溶性ポリマー部分及びケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基を含むポリマー試薬を提供する。例えば、ポリマー試薬は、第一水溶性ポリマー部分、第二水溶性ポリマー部分、及びケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基を含み、ここで、第一及び第二水溶性ポリマー部分のそれぞれは直接的な共有結合又は１つ以上の原子を介して、のいずれかにより上記官能基に結合しており、そしてさらにここで、上記官能基がケトン、ケトンハイドレート、ヘミケタール又はケタールである場合には：（ａ）該ポリマー試薬は芳香族部分を含まないか；又は（ｂ）該ポリマー試薬中の各水溶性ポリマー部分は、１０００ダルトン以上の平均分子量を有する。以下においてさらに詳細に説明されるとおり、２つの水溶性ポリマー部分を含む本明細書中に記載のポリマー試薬は、直線的且つ「Ｖ」字形であることができ、該文字の各直線部分が水溶性ポリマー部分を含む原子の単鎖を１つ含み、そして各鎖が官能基の炭素原子に結合している。２つ以上の水溶性ポリマー部分を含む非直線形態のポリマー試薬も同様に提供される。

本発明の他の実施態様においては、ポリマー試薬を含む組成物が提供される。好ましくは、該ポリマー試薬組成物は酸化による副産物を含まないか又は実質的に含まない。例示的なポリマー試薬組成物は、以下の式：

｛式中、
（ａ）は、ゼロ又は１のいずれかであり；
（ｂ）は、ゼロ又は１のいずれかであり；
Ｘ¹は、存在する場合には、スペーサー部分であり；
ＥＷ¹は、存在する場合には、電子吸引基であり；
（Z）は、０又は１、２、３、４、５、６、又は７などの正の整数であり；
各R²は、存在する場合には、独立してH又は有機ラジカル、例えばH又は芳香族を含まない有機ラジカルであり；
各R³は、存在する場合には、独立してH又は有機ラジカル、例えばH又は芳香族を含まない有機ラジカルであり；
（ｍ）は、例えば、１１〜約３０００の正の整数である。｝
により表される構造からなるポリマー試薬を含み、ここで、該組成物は酸化による副産物を実質的に含まない。好ましくは、該組成物はまた、β‐ケトエステル、

及び

のケタール誘導体も含まない。

本発明はまた、ポリマー試薬の製造方法も提供する。したがって、本発明の他の実施態様においては、以下のステップ：
（i）重合を開始するのに適した少なくとも１つの活性陰イオン性部位及び官能基又はその保護された形態を含む前駆体分子を提供し、ここで、該官能基は、ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれ；
（ii）上記前駆体分子中の陰イオン性部位及び重合可能な反応性モノマーを接触させて、それにより、該反応性モノマーの該前駆体分子への重合を開始し；
（iii）上記前駆体分子にさらなる反応性モノマーを添加して、１つ以上のポリマー鎖を形成し；
（iv）上記１つ以上のポリマー鎖が所望の長さに到達するまで、上記添加を継続させ；
（v）上記反応を停止し、それによって上記官能基又はその保護された形態を含むポリマー試薬を得て；そして
（vi）場合により、上記官能基が保護された形態である場合に、該官能基を脱保護する；
を含む方法が提供される。

ポリマー試薬を形成するための他の方法が提供され、該方法は以下のステップ：
（i）保護された二級アルコールまたはチオール及び重合を開始するのに好適な少なくとも１つの陰イオン性部位を含む、前駆体分子を提供し；
（ii）上記前駆体分子の上記陰イオン性部位を、重合可能な反応性モノマーと接触させて、それにより該反応性モノマーの該前駆体分子への重合を開始し；
（iii）上記前駆体分子にさらなる反応性モノマーを添加して、１つ以上のポリマー鎖を形成し；
（iv）上記１つ以上のポリマー鎖が所望の長さに到達するまで、上記添加を継続させ；
（v）上記反応を停止し、それによって保護された二級アルコール又はチオールを含む中間体を得て；
（vi）該中間体の上記保護された二級アルコール又はチオールを脱保護して、保護されない二級アルコール又はチオールを形成し；
（vii）上記保護されない二級アルコール又はチオールを酸化して、上記前駆体分子が二級アルコールを含む場合にはケトンを、上記前駆体分子が二級チオールを含む場合にはチオンを含む、ポリマー試薬を提供し；そして
(viii)場合により、上記ケトン又はチオンをさらに修飾して、ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基を得る；
を含む。

本発明の他の実施態様においては、以下のステップ：
（i）少なくとも１つのイソシアネート部分及び官能基又はその保護された形態を含む前駆体分子を提供し、ここで、該官能基は、ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれ；そして
（ii）好適な反応条件下において、上記前駆体分子と少なくとも１つの水酸基を有する水溶性ポリマー部分を接触させて、それにより、上記官能基またはその保護された形態を含むポリマー試薬を形成し；そして
（iii）場合により、上記官能基が保護された形態である場合には、該官能基を脱保護する；
を含む方法が提供される。

ポリマー試薬を提供するための本発明の他の実施態様においては、以下のステップ：
（i）少なくとも１つの利用可能な求核性基を有する水溶性ポリマー部分を提供し；
（ii）少なくとも１つの活性化基及び官能基又はその保護された形態を含む前駆体分子を提供し、ここで、該官能基が、ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれ；
（iii）好適な反応条件下において、上記前駆体分子を上記水溶性ポリマー部分と接触させて、それにより、上記官能基又はその保護された形態を含むポリマー試薬を形成し；そして
（iv）場合により、上記官能基が保護された形態である場合には、該官能基を脱保護する；
を含む方法が記載される。

ポリマー試薬を製造するためのなお他の実施態様においては、以下のステップ：
（i）少なくとも１つの利用可能な脱離基を有する水溶性ポリマー部分を提供し；
（ii）少なくとも１つの求核性基及び官能基またはその保護された形態を含む前駆体分子を提供し、ここで、該官能基が、ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれ；
（iii）好適な反応条件下において、上記水溶性ポリマー部分と上記前駆体分子を接触させ、それにより、上記官能基又はその保護された形態を含むポリマー試薬を形成し；そして
（iv）場合により、上記官能基が保護された形態である場合には、該官能基を脱保護する；
を含む方法が提供される。

本発明のさらに他の実施態様においては、ポリマー試薬の製造方法であって、ここで、該方法が、少なくとも１つのアルコキシドイオン又はチオレートイオンを有する水溶性ポリマー部分を、少なくとも１つの脱離基及び官能基又はその保護された形態を含む前駆体分子と反応させるステップを含み、それによって、ポリマー試薬を提供し、ここで、該官能基が、ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる、前記方法が提供される。

本発明のさらに他の実施態様においては、複合体を提供するのに好適な条件下において、本明細書中に提供されるポリマー試薬を活性作用物質と接触させるステップを含む、複合体の製造方法が提供される。

本発明のさらに他の実施態様においては、本発明の複合体を医薬賦形剤とともに含む医薬製剤が提供される。該医薬製剤は、すべてのタイプの製剤、特に懸濁液及び溶液並びに再構成可能な散剤などの注射に適した製剤を包含する。

なお他の実施態様においては、ポリマー‐活性作用物質複合体が提供される。したがって、例えば、本発明は活性作用物質の窒素と二級炭素原子の間の共有結合を含む複合体を提供し、ここで、該二級炭素原子は、１つ以上の原子を介して水溶性ポリマー部分に結合し、該１つ以上の原子は二級炭素に対してベータ位のカルボニル部分を含まない。

本発明のさらなる実施態様においては、本明細書に記載の複合体を患者に投与するステップを含む、複合体の投与方法が提供される。該複合体はしばしば、医薬製剤の一部分として提供される。複合体を投与するためのいかなるアプローチも使用されることができ、本発明はこの点で制限されるものではない。しかしながら、複合体は注射によって投与されることが好ましい。

発明の詳細な説明
Ｉ．定義及び摘要
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特別なポリマー、合成技術、活性作用物質などに限定されるものではなく、そのようなものとして変化してもよいことは理解されるべきである。

本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、単数形である「一つの」、及び「その」は、前後関係において明らかにそうでないと命じられない限り、複数の対象を含むことは注意しなければならない。したがって、例えば、「ポリマー試薬」への言及は、単一のポリマー試薬並びに２つ以上の同一又は異なるポリマー試薬を含み、「複合体」への言及は、単一の複合体並びに２つ以上の同一又は異なる複合体を含み、「賦形剤」への言及は、単一の賦形剤並びに２つ以上の同一又は異なる賦形剤を含む。

本発明を説明しそして権利請求するにおいて、以下の用語法が以下に記載する定義に従って使用されるであろう。

本明細書中で使用される「PEG」「ポリエチレングリコール」及び「ポリ（エチレングリコール）」は、任意の水溶性ポリ（エチレングリコール）を包含することを意味する。典型的には、本発明に従って使用されるためのPEGは、以下の構造、「-O(CH₂CH₂O)_m-」、ここで（ｍ）は２〜４０００である、を含む。本明細書において使用されるとおり、PEGは、末端の酸素が置換されているか否かによって、「‐CH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)_m‐CH₂CH₂-」及び「‐(CH₂CH₂O)_m‐」も含む。PEGがさらに（以下においてより詳細に説明される）スペーサー部分を含む場合、スペーサー部分を含む原子群は、水溶性ポリマー部分に共有結合している場合には酸素−酸素結合（すなわち、「‐O‐O‐」又はペルオキシド結合）を形成しない。明細書及び特許請求の範囲の全体にわたって、「PEG」という用語が多様な末端又は「エンドキャッピング」基などを有する構造を含むことは覚えておくべきである。「PEG」という用語はまた、大多数、すなわち、５０％超の‐CH₂CH₂O‐繰り返しサブユニットをを含むことも意味する。特別な形態に関しては、PEGは多様な分子量の任意の数、並びに「分岐した」「直線の」「フォーク型」「多官能性の」などの任意の構造又は幾何学をとることができることが以下において詳細に記載される。

「エンドキャップされた」及び「末端がキャップされた」という用語は、エンドキャッピング部分を有するポリマーの末端またはエンドポイントを指すために、本明細書において交換可能に使用される。典型的には、必然的ではないが、エンドキャッピング部分は、水酸基又はC_1-20アルコキシ基、より好ましくはC_1-10アルコキシ基、及びさらに好ましくはC_1-5アルコキシ基を含む。したがって、エンドキャッピング部分の例は、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ及びベンジロキシ）、並びにアリール、ヘテロアリール、シクロ、ヘテロシクロ、などを含む。さらに、先に記載のそれぞれの飽和、不飽和、置換及び非置換形態も含まれる。さらに、エンドキャッピング基はシランであることもできる。エンドキャッピング基はまた、検出可能な標識を有利に含むこともできる。ポリマーが検出可能な標識を含むエンドキャッピング基を有する場合、ポリマー及び／又はポリマーが結合する（活性作用物質などの）部分の量及び位置は、好適な検出器を使用して決定されることができる。そのような標識は、非制限的に蛍光、化学発光、酵素標識に使用される分子、色素（例えば、染料）、金属イオン、放射性分子、などを含む。好適な検出器は、光度計、フィルム、分光光度計、などを含む。エンドキャッピング基はまた、有利にリン脂質を含むことができる。ポリマーがリン脂質を含むエンドキャッピング基を有する場合、（同様にエンドキャップされたポリマーを含む組織化された構造を形成することができるような）独自の性質がポリマーに付与される。例示的なリン脂質は、非制限的に、ホスファチジルコリンと呼ばれるリン脂質のクラスから選ばれるものを含む。具体的なリン脂質は、非制限的にジラウロイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステロイルホスファチジルコリン、ベヘノイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン及びレシチンから成る群から選ばれるものを含む。

「非天然の」は、それがそっくりそのまま自然には見出されないポリマーを意味する。しかしながら、非天然のポリマーは、ポリマー構造全体が自然には見出されないとしても、１つ以上のサブユニット又はサブユニットの部分であって天然のものを含むことができる。

「水溶性ポリマー部分」及び「水溶性ポリマー」中における「水溶性」という用語は、室温で水に溶解性である任意の部分又はポリマーである。典型的には、水溶性ポリマー又は部分は、ろ過後の同じ溶液の少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９５％の光を透過する。重量に基づけば、水溶性ポリマー又はその部分は、好ましくは少なくとも約３５（重量）％が水に溶解性であり、より好ましくは少なくとも約５０（重量）％が水に溶解性であり、なおさらに好ましくは約７０（重量）％が水に溶解性であり、そしてなおさらに好ましくは約８５（重量）％が水に溶解性である。しかしながら、最も好ましくは、水溶性ポリマー又は部分は、約９５（重量）％が水に溶解性であるか又は完全に水溶性である。

PEGのような本発明の水溶性の非天然ポリマーとの関係においては、「名目上の平均分子量」は、典型的にはサイズ排除クロマトグラフィー、光散乱技術、又は1,2,4‐トリクロロベンゼン中での固有速度測定によって決定される、ポリマー集団の平均分子量をさす。本発明のポリマーは、典型的には多分散であり、好ましくは約１．２未満、より好ましくは約１．１５未満、なお好ましくは約１．１０未満、さらにより好ましくは約１．０５未満、そして最も好ましくは約１．０３未満の低い多分散値をを有する。

水溶性の非天然のポリマーとの関係において、「チオール誘導体」は、チオール基（‐SH）、チオレート（‐S^-）、又は保護されたチオール、すなわち保護された形態のチオール基である末端を少なくとも一つ有するポリマーを意味する。典型的なチオール保護基は、チオエーテル、チオエステル、又はジスルフィドを含む。チオールのための例示的な保護基は、Greene, T., and Wuts, Peter G.M. "PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS," Chapter 6, 3^rd Edition, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999中に見出されることができる。

「活性な」及び「活性化された」という用語は、特別な官能基とともに使用された場合、他の分子上の求電子試薬又は求核試薬と容易に反応する反応性の官能基を意味する。これは、反応するために強力な触媒又は高度に実施不可能な反応条件を必要とする基（すなわち、「不活性な」基）とは対照的である。

「保護された」及び「保護基」という用語は、一定の反応条件下における分子中の特別な化学反応性の官能基の反応を阻止又は遮断する分子（すなわち、保護基）の存在を意味する。保護基は、保護される化学反応性の基のタイプ並びに使用される反応条件及び存在する場合には、分子中のさらなる反応性基又は保護基の存在によって変化する。当業者に知られた保護基は、Greene, T., and Wuts, Peter G.M. "PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS," Chapter 6, 3^rd Edition, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999中に見出されることができる。

本明細書において使用される、「官能基」という用語又はその任意の同義語は、それらの保護された形態も包含することを意味する。

構造、構造式、分子などを説明するにあたっての「有機ラジカル」は、炭素を含む部分であって、炭素原子が結合点を提供するものを意味する。例示的な有機ラジカルは、（低級アルキルなどの）アルキル、（ヘテロアルキル及び鎖置換へテロアルキルを含む）置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換へテロアリール、ヘテロシクリシル、置換ヘテロシクリシル、などを含む。

構造、構造式、分子などの説明するにあたっての「芳香族を含まない有機ラジカル」は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換へテロアリール、及び任意の芳香族基、例えばアリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換へテロアリールなど、を含むアルキル又は他の基以外の、任意の上記の「有機ラジカル」を意味する。

「アルキル」は、典型的には約１〜１５原子の長さの炭化水素鎖を意味する。そのような炭化水素鎖は、好ましくは、しかし必然的にではないが、飽和しており、そして典型的には直鎖が好ましいが、分岐鎖又は直鎖である。例示的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、１‐メチルブチル、１‐エチルプロピル、３‐メチルペンチル、などを含む。本明細書中で使用されるとおり、「アルキル」は、シクロアルキル並びにシクロアルキレン含有アルキルを含む。

「低級アルキル」は、１〜６個の炭素原子を含み、そして直鎖又は分岐鎖であることができる、メチル、エチル、n−ブチル、ｉ−ブチル、及びｔ−ブチルで例示されるアルキル基を意味する。

「シクロアルキル」は、飽和又は不飽和の環状炭素鎖であり、架橋された、融合された、又はスピロ環状化合物を含み、好ましくは３〜約１２個の炭素原子、より好ましくは３〜約８個の炭素原子からなる。

「シクロアルキレン」は、環システム中の任意の２つの炭素において鎖を結合することによって、アルキル鎖に挿入されるシクロアルキル基を意味する。

「アルコキシ」は、‐Ｏ‐Ｒ基、ここでＲがアルキル又は置換アルキル、好ましくはＣ_1-6アルキルである、を意味する（例えば、メトキシ、エトキシ、プロピロキシなど）。

本明細書中で使用される「アルケニル」は、エテニル、ｎ−プロペニル、イソプロペニル、n-ブテニル、イソブテニル、オクテニル、デセニル、テトラデセニルなどの、分岐した又は分岐しない、２〜１５原子の長さの炭化水素鎖であって、少なくとも１つの二重結合を含むものを意味する。

本明細書中で使用される「アルキニル」という用語は、エチニル、プロピニル、ブチニル、オクチニル、デシニル、などを含む、分岐した又は分岐しない、２〜１５原子の長さの炭化水素基を意味する。

「アリール」は、それぞれが５又は６個のコア炭素原子を有する、１つ以上の芳香環を意味する。アリールは、ナフチル中でのように融合され又はビフェニル中でのように融合されないことができる、複数のアリール環を含む。アリール環はまた、１つ以上の環状炭化水素、ヘテロアリール、又はヘテロ環と融合され、又はされないことができる。本明細書中で使用されるとおり、「アリール」は、ヘテロアリールを含む。

「ヘテロアリール」は、１〜４個のヘテロ原子を含むアリール基であり、ヘテロアリール環中の各へテロ原子は、好ましくはイオウ、酸素又は窒素原子である。ヘテロアリール環はまた、１つ以上の炭化水素環、ヘテロ環、アリール又はヘテロアリール環と融合されることができる。

「ヘテロシクリシル」又は「ヘテロ環」は、５〜１２原子、好ましくは５〜７原子の１つ以上の環から成る基であって、不飽和又は芳香族の特徴を有するか又は有さず、そして少なくとも１つの炭素でない環の原子を有する基を意味する。好ましいヘテロ原子は、イオウ、酸素及び窒素を含む。

「置換アルキル」などにおける「置換された」という用語は、１つ以上の非干渉性の置換基で置換された分子（例えば、アルキル基）を意味し、該置換基は、非制限的に以下の：シクロプロピル、シクロブチルなどのＣ_3-8シクロアルキル；フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などのハロ；シアノ；アルコキシ；低級フェニル；置換フェニルなどである。「置換アリール」は、１つ以上の非干渉性の基を置換基として有するアリールである。フェニル環上の置換のためには、置換基は任意の配向（すなわち、オルト、メタ、又はパラ）をとることができる。

「置換ヘテロアリール」は、１つ以上の非干渉性の基を置換基として有するヘテロアリールである。

「置換ヘテロシクリシル」は、非干渉性の置換基から形成された側鎖を１つ以上有するヘテロシクリシル基である。

「非干渉性の置換基」は、分子中にある場合、典型的には該分子中に含まれる他の官能基と反応性でない基である。

「求電子試薬」とは、イオン性であることができ、求電子中心、すなわち電子を求め、求核試薬と反応することができる中心を有するイオン又は原子、或いは原子団を意味する。

「求核試薬」とは、イオン性であることができ、求核中心、すなわち求電子中心を求めているか又は求電子試薬と反応することができる、イオン又は原子或いは原子団を意味する。

「生理学的に切断可能な」又は「加水分解可能な」又は「分解可能な」結合とは、生理学的条件下で水と反応する（すなわち、加水分解される）比較的弱い結合である。好ましいのは、pH８及び２５℃における加水分解による半減期が約３０分未満である結合である。水中で加水分解される結合は、２つの中心原子を連結している結合の一般的なタイプだけでなく、これらの中心原子に結合している置換基にも依存する傾向がある。加水分解に対して不安定な又は弱い結合の適切なものは、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アシロキシアルキルエーテル、イミン、及びオリゴヌクレオチド結合などを非制限的に含む。

「酵素的に分解可能な結合」は、１つ以上の酵素による分解を受ける結合を意味する。

「加水分解に対して安定な」結合は、水中で実質的に安定な、すなわち、生理学的条件下で長期間にわたるかなりの程度まで加水分解しない化学的結合、典型的には共有結合を意味する。加水分解に対して安定な結合は、以下の：炭素‐炭素結合（例えば、脂肪族鎖）、エーテル、アミド、ウレタンなどを非制限的に含む。一般に、加水分解に対して安定な結合は、生理学的条件下で１日あたり約１〜２％未満の加水分解率を示すものである。代表的な化学結合の加水分解率は、ほとんどの標準的な化学の教科書に見出すことができる。

本明細書中に記載の「活性作用物質」は、インビボ又はインビトロで実証されることのできる、しばしば有益ななんらかの薬理学的効果を提供する、任意の作用物質、薬物、化合物、組成物、又は混合物を含む。これは、食品、栄養補助食品、ペプチド、栄養素、薬剤によって栄養を高めた食品、薬物、ワクチン、抗体、ビタミン、及び他の有益な作用物質である。本明細書において使用されるとおり、これらの用語は、局所的又は全身的な効果を患者にもたらす生理学的又は薬理学的活性を有する任意の物質をさらに含む。

「薬剤として許容可能な賦形剤又は担体」は、場合により本発明の組成物に含まれることができ、そして患者に顕著に有害な毒性学的効果を起こさない賦形剤を意味する。「薬理学的有効量」、「生理学的有効量」及び「治療的有効量」は、本明細書において交換可能に使用され、血流中又は標的組織中において所望のレベルの活性作用物質を提供するのに必要とされるポリマー‐作用物質複合体の量を意味する。正確な量は、特別な薬物又は治療剤、治療用組成物の成分及び物性、意図される患者個体群、個々の患者について考慮されるべき事項などの数多くの因子に依存しており、本明細書中に提供された情報に基づいて当業者によって容易に決定されることができる。

「多官能性」とは、３つ以上の官能基をその中に含むポリマーを意味するが、該官能基は同じでも異なっていてもよい。本発明の多官能性ポリマー試薬は、典型的には約３〜１００個、又は３〜５０個、又は３〜２５個、又は３〜１５個、の官能基、又は３〜１０個の官能基、又は３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の官能基をポリマー骨格中に含むであろう。

本明細書中に記載された塩基性又は酸性の反応物は、電気的に中性の、荷電した形態、及び対応するそれらの塩形態を含む。

「患者」という用語は、活性作用物質の投与によって予防又は治療可能な状態にある又はそれにかかりやすい、ヒト及び動物の両方を含む生きた生物体を意味する。

「任意の」又は「任意に」は、その後に記載される状況が起こるかも又は起こらないかも知れず、したがって、その状況が発生する場合及び発生しない場合を含む記載である。

本明細書中に記載されたポリマー試薬は、水溶性ポリマー部分及び官能基を含む。該官能基は以下の：ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる。官能基は、共有結合によって直接水溶性ポリマー部分に結合されることができる。しかしながら、より典型的には、該官能基は１つ以上の原子を介して水溶性ポリマー部分に結合している。したがって、その最も基本的な形態においては、本明細書中に記載のポリマー試薬は、以下の：
POLY------FG
というコア構造を共有し、ここで、POLYは水溶性ポリマー部分、FGは以下の：ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基、そして破線は、直接的な共有結合又は官能基を水溶性ポリマー部分に結合させる１つ以上の原子を表す。以下においてより詳述されるように、本明細書中に記載のポリマー試薬はより複雑な構造を有することができる。

理論にとらわれることを望まないにもかかわらず、ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール又はジチオケタールを有するポリマー試薬は、アルデヒドなどを有するポリマーよりも、他の物質（例えば、活性作用物質）への複合化における使用のためにより選択的である。本明細書に記載のポリマー試薬の高い選択性に寄与する因子としては、官能基に関連した相対的安定性である。より安定である結果、ポリマー試薬の官能基は、相対的により反応性の部分とのみ反応する傾向があり、それによってより高度な選択性を提供する。

ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールのアルデヒドなどの他の官能基に比べて高い安定性は、２つの効果：電子的効果及び立体効果の関数であると考えられている。電子的効果に関しては、官能基における密集は、反応中に起こるいかなるイオン化又は「過剰の荷電」の負荷をも「共有」する能力を効果的に官能基に提供する。したがって、例えば、カルボニル基の炭素のいずれかの側に結合している2つの炭素原子を有するケトンは、ただ一つの炭素しか持たない対応するアルデヒドよりもカルボニル部分に関連した電子に富む環境をよりよく吸収することができる。

立体効果に関しては、アルデヒド及びケトンの両方のカルボニル基への求核付加は、カルボニル基の炭素をsp²混成軌道からsp³混成軌道へ変化させる。しかしながら、第二の、そしてケトンに関連した比較的大きな炭素原子の存在は、比較的嵩高い活性作用物質のsp²混成軌道のカルボニル炭素へのアプローチを遅くし、そして、アルデヒドに関連する比較的小さな水素に比べて形成するsp³混成軌道の炭素をかなり多く立体的に押し出す。結果として、電子的及び立体的効果の組み合わせは、ケトン及び関連する官能基の初期エネルギー状態を低下させることによって（すなわち、安定化されたカルボニル炭素、電子的効果を提供することによって）そして遷移状態のエネルギーを上昇させることによって（すなわち、SP²混成からSP³混成への変化、立体効果）、それらの活性化エネルギーを増加させる。したがって、ケトン及び関連する官能基は比較的より安定であり、これによってより反応性が低い。

しかしながら、驚くべきことに、ケトン‐、ケトンハイドレート‐、チオン‐、モノチオハイドレート‐、ジチオハイドレート‐、ヘミケタール‐、モノチオヘミケタール‐、ジチオヘミケタール‐、ケタール‐及びジチオケタール‐含有ポリマー試薬の増加した安定性が有益であることがわかった。例えば、活性作用物質は、いくつかのアミン基を有し、そのそれぞれはポリマー試薬上に存在するカルボニル部分に対する独自の反応性を有している。比較的反応性の低いケトンを有するポリマー試薬を提供することによって、活性作用物質上の立体的障害が最も低く且つ最も反応性の高いアミンとケトンのカルボニル部分との間でより優先的に複合化が起こり、それによって異なる複合体形態の数が減少する。

本明細書中に記載されるポリマー試薬の他の利点は、官能基が（直線的であることができる）２つのポリマー鎖の間にあることができ、それによって、活性作用物質、表面又は他の部分に直接結合した単一の原子を介して２つのポリマー鎖を結合させる能力を提供することである。先に記載した分岐したポリマー試薬は、複合化のための反応性の基（例えば、アルデヒド）を有するスペーサー部分及び2つのポリマー鎖を連結する働きをする離れた異なる枝分かれ原子を含む。こうして、水溶性ポリマー部分が活性作用物質に比較的近づくことができ、それによって水溶性ポリマー部分が複合体から切断されたときに活性作用物質に残される小さな「突出した」基を減少させるか又は完全に除去する。

II. ポリマー試薬の特徴
A.官能基（「FG」）
先に述べたとおり、本発明のポリマー試薬は、ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基と結合している。各官能基（「FG」）の構造を以下に示す。構造中、Rはアルキルなどの有機ラジカルを表し、そして「官能基の炭素」はアスタリスクで示す。

示してはいないが、指定された官能基を提供するために、官能基の炭素のそれぞれの側に炭素原子が結合されなくてはならない。

有利なことには、上記の官能基はしばしば相互に容易に変換する。したがって、例えば、ケトンのいくつか又はすべては水の付加によってケトンハイドレートに変換されることができる。さらに、水の存在下においては、一般にケトンは対応するハイドレートと平衡な状態で存在する。これは、近位に電子吸引基を有するケトンにおいては特に真実である。平衡によって、ケトンを含む系の中の水分含量が減少するにつれて、ケトンハイドレート種の量が減少する。したがって、系の中の水分量を制御することによって、２つの形態（例えば、ケトン及びケトンハイドレート）の量（又は比率）に影響を及ぼすことが可能である。電子吸引基及び電子供与基の存在又は不存在、並びに近位の立体障害のような他の因子もまた、２つの形態の量及び比率に影響する。チオン及びモノチオハイドレート形態もまた、同様に提供されることができる。

有用なことには、ここに記載したポリマー試薬を使用する複合化反応はしばしば官能基の溶媒和状態の制御にかかわりなく進行することができる。例えば、ポリマー試薬の優勢な種がケトンであるかケトンハイドレートであるかにかかわりなく複合化条件下でその一方、他方、又は両方を使うか否かに違いはなく、ポリマー‐活性作用物質複合体が得られる。理論にとらわれることを望まない一方、（対応するケトンと平衡状態にある）ケトンハイドレートが使用されることができ、それは、ケトン種が活性作用物質との複合化反応の間に除去されると、平衡によってさらなるケトンハイドレート種が対応するケトンへ変換するためである。一連の反応を図１に示す。そこに示されるように、２つの平衡反応：ポリマー試薬中のケトン及びケトンハイドレートの間の平衡並びにカルビノールアミン及び対応するイミンを形成する活性作用物質上のアミン基を含む縮合プロセス、が含まれる。したがって、複合化がケトンを介して進行する一方、対応するケトンハイドレート形態の使用もまた所望の複合体の形成をもたらす。またさらに、理論にとらわれることを望まない一方、（対応するケトン形態に比べた）ハイドレート形態の高い安定性は、活性作用物質への複合化におけるケトン形態の高い反応性に対応している。

さらに、ケトンはアルコール付加を通してヘミケタールに変換されることができる。ここでも、ケトンを含む系へのアルコール量が減少するとヘミケタール種の量が減少する。こうして、上記の反応に類似の平衡反応においては、ケトンを含む系へアルコールを追加すること及びヘミケタールを含む系からアルコールを除去してケトンを供給することによって、ヘミケタールを供給することが可能である。さらに、酸触媒の存在下においては、さらなる量のアルコールはヘミケタールをケタールに変換する。さらに、酸触媒の存在下、ケトンはHO‐CH₂CH₂‐OHなどのジオール付加によって直接的にケタールに変換することができる。有益なことに、これらのそして他のケタールはしばしばケトン保護基として働く。

図２は、ケトン官能基を有するポリマー試薬からのケタール、及びケタール官能基を有するポリマー試薬からの複合体の形成を略図に表す。図２においては、ケトン官能基を有するポリマー試薬は、最初に反応性のヘミケタール中間体に、そしてケタール（この図においては、ジメチルケタール）に変換されることができる。図２はまた、一連の平衡を通して、ケタールがアミン含有活性作用物質との複合化反応にどのように直接利用されうるかを例解する。

同様の方法で、チオンは、イオウ（例えば、硫化水素）を含む環境においてチオンを溶媒和させることによって、（時にはジチオソルベートと称される）ジチオハイドレートに変換されることができる。チオンはまた、チオールの存在下でジチオヘミケタールに、過剰のチオール存在下でジチオケタールに変換されることができる。ケトンに類似した方法で、HS‐CH₂CH₂‐SHなどのジチオールの付加によって、チオンは直接的にジチオケタールに変換されることができる。ジチオケタールはしばしば、チオン保護基としても働く。

一定の官能基を他の官能基へ変換する例示的な方法が提供されているにもかかわらず、ポリマー試薬は官能基が形成される方法にのみに限定されない。当業者には、本明細書中に記載されている官能基を提供するための他のアプローチは既知である。さらに、いかなる一定の官能基についての言及も該官能基自体並びにその保護された形態の両方を包含する。

B.水溶性ポリマー部分（「POLY」、例えば、「POLY¹」、「POLY²」など）

本発明のポリマー試薬はまた、少なくとも１つの水溶性ポリマー部分を含む。非ペプチド性で水溶性であり、２〜約３００の末端を有する水溶性ポリマー部分は、本発明において特に有用である。好適な水溶性ポリマー部分の例は、ポリ（エチレングリコール）（「PEG」）、エチレングリコール及びプロピレングリコールの水溶性のコポリマーなどのポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α‐ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、米国特許第５，６２９，３８４号に記載されたようなポリ（N‐アクリロイルモルホリン）並びにそれらのコポリマー、テルポリマー、そしてそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。本発明の目的のためには、ポリ（プロピレングリコール）は、水溶性ポリマー部分として作用するためには、水溶性が不十分である。結論として、本明細書中に記載の水溶性ポリマー部分はプロピレンモノマーを含まないことが好ましい。

しかしながら、該水溶性ポリマー部分は必然的にではないが、ポリ（エチレングリコール）（「PEG」）又はその誘導体であることが好ましい。しかしながら、関連するポリマーもまた、本発明の実施における使用に好適であり、この点で「PEG」又は「ポリ（エチレングリコール）」という用語は、排他的でなく包括的であることを意図されることは理解されなくてはならない。結論として、「PEG」という用語は、アルコキシPEG,二官能性PEG、フォーク型PEG、分岐型PEG、ペンダントPEG、又は分解可能な結合を含むPEGを含む、直鎖、分岐鎖、又は多岐の形態のポリ（エチレングリコール）を含み、以下にさらに完全に記載される。

本発明において有用な１つの形態において、以下の遊離の又は非結合のPEGは各末端において水酸基で終端する直鎖ポリマーであり：
HO-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_m' -CH₂CH₂-OH
ここで、（ｍ’）は典型的には０〜約４０００の範囲である。

上記のポリマー、アルファ‐、オメガ‐ジヒドロキシポリ（エチレングリコール）、は、OH‐PEG‐OHという簡単な形で表されることができ、ここで、‐PEG‐という記号は以下の構造単位を表すことができ：
‐CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_m'-CH₂CH₂-
ここで、（ｍ’）は上記の定義のとおりである。

本発明において有用な他のタイプのPEGは、メトキシ‐PEG-OH、又はすなわちｍPEGであり、ここで、１つの末端は比較的不活性のメトキシ基であるが、他の末端は水酸基である。ｍPEGの構造を以下に示す。
CH₃O-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_m'-CH₂CH₂-OH
ここで、（ｍ’）は上記のとおりである。

米国特許第５，９３２，４６２号に記載されたような多岐の又は分岐ＰＥＧ分子もまた、ＰＥＧポリマーとして使用されることができる。例えば、ＰＥＧは以下の式：

｛式中、
Poly a及びpoly bは、(同じか又は異なる）メトキシポリ（エチレングリコール）のようなPEG骨格であり；
R”は、H、メチル又はPEG骨格のような非反応性の部分であり；そして、
P及びQは、非反応性の結合である。｝
により表される構造を有することができる。好ましい実施態様において、分岐PEGポリマーは、メトキシポリ（エチレングリコール）二置換リジンである。

これらのポリマーは、直鎖、又は（分岐鎖、フォーク型などの）上記の形態のいずれであることもできる。

さらに、ＰＥＧはフォーク型ＰＥＧを含むことができる。フォーク型ＰＥＧの例は、以下の式：

｛式中、
Ｘは、スペーサー部分であり；且つ
各Ｚは、定義された長さの原子鎖によってＣＨに連結された活性化末端基である。｝
によって表される。ＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０５３３３号は、本発明において使用することのできる多様なフォーク型ＰＥＧを開示する。Ｚ官能基を分岐した炭素原子に連結している原子鎖は、テザリング基として働き、例えば、アルキル鎖、エーテル鎖、エステル鎖、アミド鎖及びそれらの組み合わせを含むことができる。

ＰＥＧポリマーは、ＰＥＧ鎖の末端よりもＰＥＧの長さにそって共有結合した、カルボキシル基のような反応性基を有するペンダントＰＥＧ分子を含むことができる。ペンダント反応性基は、直接に又はアルキレン基などのスペーサー部分を介してＰＥＧに結合されることができる。

上記の形態のＰＥＧに加えて、ポリマーは、上記のポリマーのいずれかを含むポリマー中の１つ以上の弱い又は分解可能な結合によって調製されることもできる。例えば、ＰＥＧは、ポリマー中の加水分解されるエステル結合により調製されることができる。以下に示すように、この加水分解は、ポリマーをより低分子量の断片に切断する。

ポリマー骨格内の分解可能な結合として有用な、加水分解により分解可能な他の結合は、以下の：炭酸結合；アミン及びアルデヒドの反応から生じるイミン結合（例えば、Ouchi et al. (1997) Polymer Preprints 38(1):582-3)；アルコールをリン酸基と反応させることなどによって形成される、リン酸エステル結合；典型的には、ヒドラジド及びアルデヒドの間の反応によって形成される、ヒドラゾン結合；典型的には、アルデヒドとアルコールの間の反応によって形成される、アセタール結合；例えば、蟻酸及びアルコールの間の反応によって形成される、オルトエステル結合；例えば、ＰＥＧのようなポリマーの末端におけるアミン基と他のPEG鎖のカルボキシル基によって形成される、アミド結合；例えば、末端イソシアネート基を有するＰＥＧ及びＰＥＧアルコールの反応から形成される、ウレタン結合；例えば、ＰＥＧのようなポリマーの末端におけるアミン基とペプチドのカルボキシル基とのにより形成される、ペプチド結合；並びに、例えば、ポリマー末端におけるホスホラミダイト基とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基によって形成される、オリゴヌクレオチド結合を含む。

当業者は、ポリ（エチレングリコール）又はＰＥＧが、上記のＰＥＧ形態のすべてを表すか又は含むことを理解する。

水溶性ポリマー部分の名目上の平均分子量は、異なることができ、名目上の平均分子量は、以下の値の１つ以上を満たすであろう：１００ダルトン超；４００ダルトン超；５００ダルトン超；７５０ダルトン超；９００ダルトン超；１，０００ダルトン超；１，４００ダルトン超；１，５００ダルトン超；１，９００ダルトン超；２，０００ダルトン超；２，２００ダルトン超；２，５００ダルトン超；３，０００ダルトン超；４，０００ダルトン超；４，９００ダルトン超；５，０００ダルトン超；６，０００ダルトン超；７，０００ダルトン超；７，５００ダルトン超；９，０００ダルトン超；１０，０００ダルトン超；１１，０００ダルトン超；１４，０００ダルトン超；１５，０００ダルトン超；１６，０００ダルトン超；１９，０００ダルトン超；２０，０００ダルトン超；２１，０００ダルトン超；２２，０００ダルトン超；２５，０００ダルトン超；そして、３０，０００ダルトン超。本発明において有用ないかなる水溶性ポリマー部分の分子量の最大限界も約３００，０００ダルトン未満であることは理解される。

水溶性ポリマー部分の名目上の平均分子量も、名目上の平均分子量の範囲内の値として表されることができる。例示的な範囲は、以下の：約１００ダルトン〜約１００，０００ダルトン；約５００ダルトン〜約８０，０００ダルトン；約１，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトン；約２，０００ダルトン〜約２５，０００ダルトン；そして約５，０００ダルトン〜約２０，０００ダルトンを含む。

水溶性ポリマー部分の例示的な名目上の平均分子量は、以下の：約１００ダルトン、約２００ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、約６００ダルトン、約７００ダルトン、約７５０ダルトン、約８００ダルトン、約９００ダルトン、約１，０００ダルトン、約２，０００ダルトン、約２，２００ダルトン、約２，５００ダルトン、約３，０００ダルトン、約４，０００ダルトン、約４，４００ダルトン、約５，０００ダルトン、約６，０００ダルトン、約７，０００ダルトン、約７，５００ダルトン、約８，０００ダルトン、約９，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約１１，０００ダルトン、約１２，０００ダルトン、約１３，０００ダルトン、約１４，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン、約２２，５００ダルトン、約２５，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、及び約７５，０００ダルトンを含む。

「-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-」に相当する構造が提供可能であるＰＥＧに関しては、（ｍ）に関して好ましい値は以下の：約３〜約３，０００；約１０〜約３，０００；約１５〜約３，０００；約２０〜約３，０００；約２５〜約３，０００；約３０〜約３，０００；約４０〜約３，０００；約５０〜約３，０００；約５５〜約３，０００；約７５〜約３，０００；約１００〜約３，０００；そして約２２５〜約３，０００を含む。

本明細書中で使用されるとおり、「水溶性ポリマー部分」という用語は、生物適合性であり且つ非免疫原性であり、そして特に、生物適合性及び非免疫原性でないいかなる水溶性ポリマー部分も排除する水溶性ポリマー部分を含む。生物適合性に関しては、ある物質を単独で又は（患者への投与などのように）生体組織と関連して（活性作用物質などの）他の物質とともに使用することに関連する有益な効果が、医師などの臨床家による評価としていかなる有害な効果よりも勝っている場合、その物質は生物適合性であると考えられる。非免疫原性に関しては、或る物質のインビボでの意図された使用が（抗体の形成などの）望ましくない免疫応答を起こさない場合、又は免疫応答を起こすが、臨床家による評価で臨床的に顕著又は重要であるとはみなされない場合、その物質は、非免疫原性であると考えられる。本明細書に記載の水溶性ポリマー部分並びに複合体は、生物適合性且つ非免疫原性であることが好ましい。本明細書において使用されるとおり、「水溶性ポリマー部分」という用語は、１つ以上のケトン部分を含むモノマーからなる水溶性ポリマー部分をも除外する。

当業者は、実質的に水溶性のポリマー部分に関する上記の検討が、決して完全なものではなく、例示のためのみであり、そして、上記の性質を有するすべてのポリマー物質が考慮されることを認識するであろう。本明細書中で使用されるとおり、「水溶性ポリマー部分」という用語は、一般に、水溶性のポリマー部分及び官能基を含むことのできる分子全体を指す。一般に、ポリマー試薬、前駆体分子、複合体などのより大きな分子構造の一部分を論じることにあたって、「水溶性ポリマー部分」という用語を使用することは差し控えられる。

Ｃ．１つ以上の原子を介する結合
ポリマー試薬の（官能基、活性作用物質、水溶性ポリマー部分などの）各部分及び本明細書に記載の他の構造は、直接的な共有結合を介して互いに直接的に結合されることができる。しかしながら、より典型的には、各部分は、各部分をつないで一緒にして全体として統一されたものとする１つ以上の原子を介して結合する。

ポリマー試薬の様々な部分および本明細書に記載の他の構造がそれを介する好ましい原子は、炭素、窒素、酸素、及び／又はイオウ原子から成る原子鎖を含む。この原子鎖に結合されるのは、炭素、窒素、酸素、イオウ、及び水素などの１つ以上の他の原子であることができる。その鎖は、短くそして２〜５個の少ない原子を含むことができる。例えば、１０個、１５個又はそれを超える個数の長さの原子の鎖である、より長い鎖もまた考慮される。したがって、非常に多数の異なる原子の組み合わせが本明細書に記載の分子の部分に結合することができる。しかしながら、典型的には、ポリマー試薬のさまざまな部分と本明細書に記載の他の分子との連結に関係するのは、３つの異なる原子群であり、以下の：炭素鎖；電子吸引基；及びスペーサー部分である。それぞれについて順次検討する。

（ｉ）炭素鎖

場合により、１つ以上の炭素鎖がポリマー試薬（並びに対応する複合体、ポリマー試薬を形成するための前駆体分子など）に含まれる。必然的にではないが、典型的には、炭素鎖はポリマー試薬の官能基のすぐ隣に位置する。しかしながら、炭素鎖がないにもかかわらず、（例えば、スペーサー部分、有機ラジカル、電子吸引基などからの）炭素原子は、官能基の炭素のそれぞれの側に結合されなければならない。

炭素鎖が存在する場合、炭素鎖は、ポリマー試薬全体が水溶性である限り、いくつの炭素を有することもできる。しかしながら、典型的には、炭素鎖中には１、２、３、４、５、６、又は７個の炭素がある。好ましくは、ポリマー試薬（並びに対応する複合体、ポリマー試薬を形成するための前駆体分子など）は、炭素数８以上の炭化水素鎖を含まないであろう。したがって、本明細書中で構造的に定義される多様な炭素鎖に関しては、（ｚ）、（ｙ）及び（ｘ）のそれぞれは、独立して０、１、２、３、４、５、６、及び７のような正の整数、１〜７の正の整数、２〜７の正の整数などであることができる。

その４価の性質によって、炭素鎖中の各炭素はそれに結合する２つの基を有する。本明細書中で構造的に定義されるとおり、これらの基は、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁸、及びＲ⁹と名づけられた。これらの基のそれぞれは、存在する場合、独立して水素又は有機ラジカルのいずれかである。存在する場合、好ましい形態はＲ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁸、及びＲ⁹のそれぞれが水素であることを含む。

Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁸、及びＲ⁹のいずれもが独立してそこから選ばれることのできる例示的な部分のクラスは、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、及び置換アリールを含む。以下においてさらに説明するが、芳香族部分はないことが好ましい。R²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁸、及びＲ⁹のいずれもが独立してそこから選ばれることのできる特別な部分は、H、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、及びビニルを含む。さらに、R²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁸、及びＲ⁹のうちの２つが結合して環系を形成することができ、これは一定の炭素鎖の原子を架橋することができる。

他の例示的な形態は、炭素鎖中で官能基の炭素に対してアルファ位にある炭素に結合する（低級アルキルなどの）有機ラジカルを有するものとして、炭素鎖を定義することを含む。この位置にそのような有機基が存在することは、ポリマー試薬の選択性を増大させるため、有利である。理論にとらわれることを望まない一方、有機ラジカルの立体効果が、該官能基が反応するのに必要な活性化エネルギーををさらに増加させると考えられる。α炭素とβ炭素を有する（末端にメチル基を有するケトンに結合した）例示的な炭素鎖を以下に示す。ここでは、メチル基はα炭素に結合し、炭素鎖中の他のすべての置換基は水素である。

有機ラジカルが官能基の炭素に対してα位の炭素に結合している場合、官能基の炭素に対してβ位にある原子は、電子吸引基であるか又はその部分である。したがって、酸素原子が電子吸引基として使用される例示的な配置が以下に提供される。

上記の構造は酸素を電子吸引基として使用するが、（カルボニルなどの）酸素以外の電子吸引基も使用されることができる。

官能基の炭素に対してα位にある炭素が（メチルなどの）有機ラジカルを構成する場合、得られるポリマー試薬は、キラル中心を含むことができる。しかしながら、１つ以上のキラル中心を含むいずれの化合物又は構造に関しても本明細書においては特別なキラリティーは明示されない。したがって、この検討は、本明細書中に記載されたいかなる光学活性化合物の異性体として純粋な形態、並びにそのラセミ混合物を含むエナンチオマー混合物をも包含する。

場合により、２つ以上の炭素が炭素鎖中に存在するとき、該炭素鎖は炭素‐炭素二重結合を含むことができる。そのような不飽和基は、以下に示すようなα‐β不飽和ケトンのβ炭素への求核基の共役付加を提供するポリマー試薬の能力のような、反応のさらなる可能性を与えることができる。

α‐β不飽和ケトンは、しばしばエノンと呼ばれる。したがって、炭素鎖のいずれの位置においても１つ以上の炭素‐炭素二重結合が含まれることができる一方、二重結合が存在する場合、該二重結合は官能基の炭素に対してα及びβ位置にある末端の炭素（例えば、カルボニル炭素）の間に配置されることが好ましい。しかしながら、以下において検討されるように、エノンは本明細書中に記載のポリマー試薬中にないことが好ましい。

（ｉｉ）電子吸引基（「ＥＷ，」、例えば、「ＥＷ¹，」「ＥＷ²，」「ＥＷ³，」）
場合により、電子吸引基がポリマー試薬（又は対応する前駆体分子、複合体など）内に位置し、大きな分子の多様な部分どうしを連結する働きをする原子を含むことができる。電子吸引基は、電気陰性の原子を含み、及びある場合には亢進された電子吸引効果を生じる電子吸引基中のいくつかの原子の間に共役作用を有する、原子又は原子群である。電子は電子吸引基の電気陰性の原子に引き寄せられ、それによって近傍の官能基の化学に影響を及ぼす。官能基の炭素の隣の（すなわち、「α」）又はそれから２〜６原子離れた電子吸引基の存在は、電子を引き寄せることによってこの炭素を効果的に不安定化し、それによって官能基全体の反応性を増大させる。したがって、例えば、電子吸引基がケトン基の近くにあることは、還元的アミノ化反応及び求核付加が起こる他の反応においてアミンに対するその反応性を増加させるであろう。

しかしながら、電子吸引基の存在及び／又は位置が官能基を過度に反応性のものとしないことによって、例えば複合化反応の間の相対的選択性を提供する能力を抑制しないことが望ましい。当業者は、いかなる一定の電子吸引基並びに該電子吸引基の位置が官能基を過度に反応性とするか否かを見極めることができる。例えば、本明細書中で論じられる複合化技術は、それぞれが異なる電子吸引基を有し、及び／又は電子吸引基を官能基の炭素から異なる距離に有する、異なるポリマー試薬を使用して実施されることができる。これまで証明されたような所望の反応性を提供するそのようなポリマー試薬は、例えば、タンパク質への単一の複合化に対して過剰に反応性でない。

いかなる電子吸引基も含まれることができ、本発明はこの点で制限されない。一般に、電子吸引基は、−O−、‐NH‐、‐NHC(O)‐、‐C(O)NH‐、‐OC(O)‐、‐OC(O)‐、‐OC(O)‐NH‐、‐NH‐OC(O)‐、‐C(O)‐、‐C(S)‐及び‐C(OR)H‐を含み、ここで、ORは、アルコキシ又はヒドロキシ置換基である。そして、構造に関しては、「EW¹」と名づけられた電子吸引基は、‐O‐、‐NH‐、‐NHC(O)‐、‐C(O)NH‐、‐OC(O)‐、‐OC(O)‐、‐OC(O)‐NH‐、‐NH‐OC(O)‐、‐C(O)‐、‐C(S)‐、及び‐C(OR)H‐から成る群から選ばれることが好ましく、ここで、ORは、アルコキシ又はヒドロキシ置換基であり、一方、「EW²」及び「EW³」と名づけられた電子吸引基はそれぞれ、独立して、‐O‐、‐NH‐、‐NHC(O)‐、‐C(O)NH‐、‐OC(O)‐、‐OC(O)‐、‐OC(O)‐NH‐、‐NH‐OC(O)‐、‐C(O)‐、‐C(S)‐、及び‐C(OR)H‐から成る群から選ばれることが好ましく、ここで、ORは、アルコキシ又はヒドロキシ置換基である。好ましい電子吸引基は、単独又はアミド若しくはカーバメートの部分としての‐C(O)‐である。特別に好ましい電子吸引基は‐O‐である。

（ｉｉｉ）スペーサー部分（「Ｘ，」例えば、「Ｘ¹，」「Ｘ²，」「Ｘ³，」「Ｘ⁴，」「Ｘ⁵，」など）
場合により、本明細書中に提供されるポリマー試薬（並びに対応する前駆体分子、複合体、など）は、スペーサー部分を含む。Ｘ¹及びＸ⁴と名づけられたいかなるスペーサー部分にも適する例示的な部分は、以下の：

からなる群から独立して選ばれるものである。

Ｘ²、Ｘ³及びＸ⁵と名づけられたいかなるスペーサー部分にも適する例示的な部分は、以下の：

から成る群から独立して選ばれるものを含む。

上記のいずれにおいても、１，３‐又は１，４‐シクロへキシレンなどの単純なシクロアルキレン基がいかなる２つ、３つ、又は４つの炭素を含むアルキレン基も置換することができる。

しかしながら、本開示の目的のためには、一連の原子が水溶性ポリマー部分のすぐ隣にあるが、該一連の原子が他のモノマーであって、提案されたスペーサー部分がポリマー鎖の単なる延長を表すような場合、該一連の原子はスペーサー部分ではない。例えば、部分構造「POLY‐Ｘ‐」及びPOLYが「CH₃O(CH₂CH₂O)m‐」であり、ここで、（ｍ）が２〜４０００であり、Ｘがスペーサー部分として定義される場合、該スペーサー部分は「‐CH₂CH₂O‐」として定義されることはできない。なぜなら、そのような定義は単にポリマーの延長を表すからである。しかしながら、そのような場合、許容可能なスペーサー部分は、「‐CH₂CH₂‐」として定義されることができる。

Ｄ．他の特徴
上記の特徴に加えて、ポリマー試薬（並びに対応する前駆体分子及び複合体）は、他の任意の特徴を有することができる。

例えば、ポリマー試薬（並びに該ポリマー試薬中に存在する有機ラジカル）全体は芳香族部分を持たないことが好ましい。本明細書中で使用されるように、物質がそれ自身で閉じたπ電子の共役系を全く含まないとき、該物質は芳香族部分を有さない。芳香族部分の典型的なものは、以下の式：

で表されるベンゼン構造を含む。芳香族構造の存在は、そのような構造が水溶性を低下させそしてインビボで有害な効果を生じるために、望ましくない。同じ理由によって、ポリマー試薬は（Ｆ，Ｃl、Br及びIなどの）ハロゲン原子もその構造中に含まないことが望ましい。しかしながら、保護基が芳香族又はハロゲン原子を含む、ポリマー試薬の製造方法のような一定の環境においては、ハロゲン原子又は芳香族部分のいずれかの存在は正当化されることができる。さらに、ハロゲンのイオン化形態も塩の形成に有用であることができ、それらは典型的には適当な量においては有害でない。本明細書において使用されるとおり、ハロゲン原子を含まないポリマー試薬は、該ポリマー試薬（又はそれから形成される複合体）がハロゲン対イオンを含む塩形態にある場合を含まない。

さらに、ポリマー試薬は環状ジエノンを有さないことが好ましい。本明細書中で使用されるとおり、環状ジエノンは、カルボニル炭素が環状構造の一部をなし、カルボニル炭素の一方の側のα、β炭素が二重結合を有するケトンである。模式図的には、環状ジエノンのコア構造は一般に以下の式：

により表される。

ポリマー試薬中に存在しない例示的な環状ジエノンは以下の式：

により表されるものを含む。ポリマー試薬中のそのような二重のα，β‐不飽和構造の存在は、求核試薬の共役付加を生じることができる。しかしながら、複合化へのこのアプローチは、例えば、ケトンを介する還元的アミノ化と同様の選択性を有することができない。結論として、ポリマー試薬は環状ジエノンを含まないことが好ましい。さらに、ポリマー試薬がエノン（すなわち、α，β‐不飽和ケトン）も含まないことも同様に好ましい。しかしながら、他の複合化アプローチが望まれる場合、エノンは存在することができる。

さらに、ポリマー試薬は、選択性を干渉することのできる他の反応性基を含まないことも好ましい。例えば、ポリマー試薬は、末端オキシラミン基（すなわち、‐ONH₂）を含まないことが好ましい。さらに、ポリマー試薬は、末端ヒドラジン基（すなわち、‐NHNH₂）も含まないことが好ましい。

いくつかの場合には、本発明のポリマー試薬は一定の形態にはない。したがって、ポリマー試薬は、例えば以下の形態：

及びこれらのいずれのケタール誘導体の形態にもない。「mw」がエチレンオキシド部分の平均分子量を表し、モノマーの隣に付された「１〜５０」のような範囲が、該部分が１回以上５０回以下のモノマーの繰り返しを示すことは理解されるであろう。

Ｅ．構造的に定義されたポリマー試薬
以下においてさらに詳述されるように、本発明のポリマー試薬は、多数の形態で提供されることができる。

いくつかの場合には、ポリマー試薬は直線の形態であり、単一の水溶性ポリマー部分及び単一の官能基を含む。例示的なこの形態のポリマー試薬は、以下の式：

｛式中、
POLY¹は、‐O‐R⁷として定義される末端を有する、水溶性ポリマー部分であり；
（ａ）は、ゼロ又は１であり；
（ｂ）は、ゼロ又は１であり；
Ｘ¹は、存在する場合には、スペーサー部分であり；
ＥＷ¹は、存在する場合には、電子吸引基であり；
（ｚ）は、２〜７の整数であり；
各Ｒ²は、独立してＨ又は芳香族を含まない有機ラジカルであり；
各Ｒ³は、独立してＨ又は芳香族を含まない有機ラジカルであり；
Ｒ⁷はＨ又は芳香族を含まない有機ラジカルであり；
ＦＧは、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから選ばれる官能基であり；そして
Ｒ¹は、芳香族を含まない有機ラジカルであり；
そしてさらに、以下の：

により表される部分は、場合により１つ以上の二重結合をふくむ。｝
により表される構造を含む。但し、該ポリマー試薬は、以下の：

のいずれでもない。

直線状の配置及びケトンを有する例示的なポリマー試薬は、以下の式：

｛式中、
Ｒ⁷、POLY¹、X¹、EW¹、R¹、R²、R³、（a）、（ｂ）及び（ｚ）は、式Iに関して先に定義したとおりである。｝
によりあらわされる構造を有する。

対応するケタールは、以下の式：

｛式中、
Ｒ⁷、POLY¹、X¹、EW¹、R²、R³、（a）、（ｂ）、（ｚ）及びR¹は、式Iに関して先に定義したとおりであり、さらに、R¹⁰が（好ましくは非芳香族の）有機ラジカルであり、R¹¹が（好ましくは非芳香族の）有機ラジカルであるか、又はR¹⁰及びR¹¹は、結合して（好ましくは、非芳香族の、例えばエチレン又は置換エチレンのようなアルキレンである）環状ケタールを形成する。｝
により表される構造を有する。

直線状の配置及びケトンハイドレートを有する例示的なポリマー試薬は、以下の式：

｛式中、
Ｒ⁷、POLY¹、X¹、EW¹、R²、R³、R¹、（a）、（ｂ）及び（ｚ）は、式Iに関して先に定義したとおりである。｝
により表される構造を有する。

この形態のポリマー試薬のより具体的な（しかし、非制限的な）例は、以下の式：

｛式中、
（ｍ）は約３〜約３０００である。｝
により表される化合物からなる群から選ばれるものを含む。

本発明の直線状のポリマー試薬の他の例は、炭素を含む官能基及び水溶性ポリマー部分からなるポリマー試薬であり、ここで、上記炭素を含む官能基の炭素が、環状構造の一部であり、さらに、ここで、該環状構造が水溶性ポリマー部分に、直接的な共有結合又はスペーサー部分のいずれかを介して結合しており、ここで、該官能基が、ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール、及びジチオケタールからなる群から選ばれる。

環状構造に関しては、いかなる非芳香族環も使用されることができ、そして本発明はこの点に関して制限されない。例示的な環状構造は、以下の：

、及びそれらのオキサ及びアザ形態、並びに上記のいずれかのジオキサ及びジアザ形態を含む。

１つ以上のヘテロ原子が環状構造中に存在する場合、少なくとも１つのヘテロ原子が官能基の炭素のα又はβ位に位置することが好ましい。ヘテロ原子がβ位に位置する、例示的なヘテロ原子を含む環状構造は、以下の：

を含む。

環状構造中のいかなる炭素も官能基の炭素であることができるにもかかわらず、官能基の炭素の例示的な位置は、アスタリスクで印をつけたものであった。

分岐した生成物を形成するために活性エステルポリマーと反応するのに有用な環状構造のジアザ形態は、以下の：

を含む。

また、環状構造中のいかなる炭素も、官能基の炭素であることができ、ここで、官能基は、ケトン、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール、及びジチオケタールからなる群から選ばれる。

ケトンを含む環状構造中にヘテロ原子を有するポリマー試薬の例を以下の式II：

｛式中、
POLY¹は、‐O‐R⁷として定義される末端を有する、水溶性ポリマー部分であり；
（ａ）は、ゼロ又は１であり；
（ｂ）は、ゼロ又は１であり；
Ｘ¹は、存在する場合には、スペーサー部分であり；
ＥＷ¹は、存在する場合には、電子吸引基であり；
（ｚ）は、０又は正の整数であり；
各Ｒ²は、存在する場合には、独立してＨ又は有機ラジカルであり；
各Ｒ³は、存在する場合には、独立してＨ又は有機ラジカルであり；
Ｒ⁷はＨ又は有機ラジカルである。｝
により表す。式II中の環状構造は、ピペリドニル環部分を含む。

対応するケタール誘導体は、以下の式：

｛式中、
Ｒ⁷、POLY¹、X¹、EW¹、R²、R³、（a）、（ｂ）及び（ｚ）は、式IIに関して先に定義したとおりであり、さらに、R¹⁰が（好ましくは非芳香族の）有機ラジカルであり、R¹¹が（好ましくは非芳香族の）有機ラジカルであるか、又はR¹⁰及びR¹¹は、結合して（好ましくは、非芳香族の、例えばエチレン又は置換エチレンのようなアルキレンである）環状ケタールを形成する。｝
により表される構造を有する。

｛式中、
Ｒ⁷、POLY¹、X¹、EW¹、R²、R³、（a）、（ｂ）及び（ｚ）は、式IIに関して先に定義したとおりである。｝
により表される構造を有する。

官能基を含む環状構造がポリマー試薬中に存在する場合、該環状構造が直接的に電子吸引基又はスペーサー部分に結合していることが特に好ましい。したがって、例えば、式II、IIa、及びIIbのそれぞれに関しては、（ｚ）がゼロであることが好ましい。さらに、電子吸引基（EW¹）がカルボニルであることが特に好ましい。したがって、この形態をとる好ましいポリマー試薬は、以下の式：

｛式中、
式IIc、IId、及びIIeのそれぞれに関して、（ａ）、R⁷、POLY¹、及びX¹は、式IIに関して先に定義したとおりであり、そしてR¹⁰及びR¹¹は式IIaに関して先に定義したとおりである。｝
により表される構造に包含される。

この形態の例示的なポリマー試薬は、以下の式：

｛式中、
（ｍ）は、約３〜約３０００である。｝
により表されるものを含むが、これらに限定されない。

いくつかの場合には、ポリマー試薬は直線状の形態であり、単一の水溶性ポリマー部分及び１つ以上の官能基を含む。この形態の例示的なポリマー試薬は、以下の式：

｛式中、
POLY¹は、２，２００超の分子量を有する、水溶性ポリマー部分であり；
（ａ）は、ゼロ又は１であり；
（ｂ）は、ゼロ又は１であり；
（ｃ）は、ゼロ又は１であり；
（ｄ）は、ゼロ又は１であり；
Ｘ¹は、存在する場合には、スペーサー部分であり；
Ｘ²は、存在する場合には、スペーサー部分であり；
ＥＷ¹は、存在する場合には、電子吸引基であり；
ＥＷ²は、存在する場合には、電子吸引基であり；
（ｚ）は、ゼロ又は１〜７の正の整数であり；
（ｙ）は、ゼロ又は１〜７の正の整数であり；
各Ｒ²は、存在する場合には、独立してＨ又は有機ラジカルであり；
各Ｒ³は、存在する場合には、独立してＨ又は有機ラジカルであり；
各Ｒ⁴は、存在する場合には、独立してＨ又は有機ラジカルであり；
各Ｒ⁵は、存在する場合には、独立してＨ又は有機ラジカルであり；
FG‐Ｒ¹は、（ｉ）Ｒ¹として定義された末端を有する、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基であり、ここで、R¹は有機ラジカルであるか、又は（ｉｉ）ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基が環状構造の一部分である、非ジエノン環状構造であり；そして、
FG‐Ｒ⁶は、（ｉ）Ｒ⁶として定義された末端を有する、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基であり、ここで、R⁶は有機ラジカルであるか、又は（ｉｉ）ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基が環状構造の一部分である、非ジエノン環状構造である。｝
により表される構造を含む。

この形態の特別に好ましいポリマー試薬は、以下の式：

｛式中、
POLY¹、（a）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、X¹、Ｘ²、EW¹、EW²、（ｚ）、（ｙ）、Ｒ¹、R²、R³、R⁴、R⁵、及びＲ⁶は、式（III）に関して先に定義したとおりである。｝
により表される構造を含む。

式（IIIa）の対応するケタールを含む様式は、以下の式：

｛式中、
POLY¹、（a）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、X¹、Ｘ²、EW¹、EW²、（ｚ）、（ｙ）、Ｒ¹、R²、R³、R⁴、R⁵、及びＲ⁶は、式（III）に関して先に定義したとおりであり、そしてさらにR¹⁰が（好ましくは非芳香族の）有機ラジカルであり、R¹¹が（好ましくは非芳香族の）有機ラジカルであり、R¹²が（好ましくは非芳香族の）有機ラジカルであり、R¹³が（好ましくは非芳香族の）有機ラジカルであるか、又はR¹⁰及びR¹¹は、結合して（好ましくは、非芳香族の、例えばエチレン又は置換エチレンのようなアルキレンである）環状ケタールを形成し、かつR¹²及びR¹³は、結合して（好ましくは、非芳香族の、例えばエチレン又は置換エチレンのようなアルキレンである）環状ケタールを形成する。｝
により表される構造を含む。

式IIIの対応するケトンハイドレートは、以下の式：

式IIIによるポリマー試薬の例示的な形態は、以下の式：

｛式中、（ｍ）は、約５５〜約３０００である。｝
により表されるものを含む。

有利にケトン基又はその一つの形態を含むことができる試薬の他のクラスは、ヘテロ二官能性ポリマー試薬である。最も有用なのは、異なる型の生体分子と反応するようなものである。例えば、或るものはタンパク質又はポリペプチド中のアミン基と反応するケトン及び異なるタンパク質又はポリペプチド中のアミン基と反応するマレイミド官能基を有することができる。上記のヘテロ二官能性ポリマー試薬の例示的な形態を以下に示す：

｛式中、
（ｍ）は、約３〜約３０００である。｝

ポリマー試薬の１つの官能基が、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる、様々なヘテロ二官能性形態は、本発明の範囲に包含される。

有利には、本発明のポリマー試薬は、１つ以上の水溶性ポリマー部分を含む。しばしばそのようなポリマー試薬は便利に「分岐の」と呼ばれる。以下においてさらに詳細に記載されるように、分岐は、上記のポリマーの官能基の炭素又は官能基の炭素以外のところで発生する。官能基の炭素において発生した分岐は、直線的及び分岐したポリマー試薬を提供し、それによって「V」配置を提供する。官能基の炭素以外のところで発生した分岐は、典型的には非直線的であり、得られるポリマー試薬はしばしば「Y」という字の形態をしている。

例示的な分岐したポリマー試薬（直線的又はその他）は、第一水溶性ポリマー部分、第二水溶性ポリマー部分、及びケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基からなり、ここで、第一および第二水溶性ポリマー部分は、直接的な共有結合又は１つ以上の原子を介して、のいずれかにより、官能基に結合しており、さらにここで、該官能基がケトン、ケトンハイドレート、ヘミケタール、又はケタールである場合には：（ａ）ポリマー試薬は芳香族部分を含まないか；又は（ｂ）ポリマー試薬中の各水溶性ポリマー部分は、１０００ダルトン以上の平均分子量を有する。

したがって、例えば、本発明の分岐したポリマー試薬は、以下の式：

｛式中、
POLY¹は、第一水溶性ポリマー部分であり；
POLY²は、第二水溶性ポリマー部分であり；
（ａ）は、ゼロ又は１であり；
（ｂ）は、ゼロ又は１であり；
（ｅ）は、ゼロ又は１であり；
（ｆ）は、ゼロ又は１であり；
Ｘ¹は、存在する場合には、スペーサー部分であり；
Ｘ³は、存在する場合には、スペーサー部分であり；
ＥＷ¹は、存在する場合には、電子吸引基であり；
ＥＷ³は、存在する場合には、電子吸引基であり；
（ｚ）は、ゼロ又は１〜７の正の整数であり；
（ｘ）は、ゼロ又は１〜７の正の整数であり；
各Ｒ²は、存在する場合には、独立してＨ又は有機ラジカルであり；
各Ｒ³は、存在する場合には、独立してＨ又は有機ラジカルであり；
各Ｒ⁸は、存在する場合には、独立してＨ又は有機ラジカルであり；
各Ｒ⁹は、存在する場合には、独立してＨ又は有機ラジカルであり；そして、
ＦＧは、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基である。｝
により表されるものを含む。

式ＩＶのケトンを含むポリマー試薬は、以下の式：

｛式中、
POLY¹、POLY²、（a）、（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｚ）、（ｘ）、X¹、EW¹、EW³、及びＸ³は、式IVに関して先に定義したとおりである。｝
により表される構造を含む。

式IVのケタールを含む様式は、以下の式：

｛式中、
POLY¹、POLY²、（a）、（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｚ）、（ｘ）、X¹、EW¹、EW³、及びＸ³は、式IVに関して先に定義したとおりであり、さらにここで、R¹⁰が（好ましくは非芳香族の）有機ラジカルであり、R¹¹が（好ましくは非芳香族の）有機ラジカルであるか、又はR¹⁰及びR¹¹は、結合して（好ましくは、非芳香族の、例えばエチレン又は置換エチレンのようなアルキレンである）環状ケタールを形成する。｝
により表される構造を含む。

官能基がケトンハイドレートである、例示的な式IVのポリマー試薬は、以下の式：

｛式中、
POLY¹、POLY²、（a）、（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｚ）、（ｘ）、X¹、EW¹、EW³、及びＸ³は、先に定義したとおりである。｝
により表される構造を含む。

式IV、IVa、IVb及びIVcのポリマー試薬から明らかなように、官能基の炭素は、2つの水溶性ポリマー部分のそれぞれが究極的に結合する分岐点としての役割を果たす。これによって、ポリマー試薬は、「V」という字に似た形態又はその平らになった形態を有する。各水溶性ポリマー部分もまた、さらに分岐し、それによってポリマー試薬に４つ以上のさらなる水溶性ポリマー部分を提供する。

分岐したポリマー試薬の官能基の炭素はまた、以下の式：

｛式中、
（ｍ）は、約３〜約３０００であり、（ａ）は、ゼロ又は１であり、（ｅ）は、ゼロ又は１であり、Ｘ¹は、存在する場合には、スペーサー部分であり、そしてＸ³は、存在する場合にはスペーサー部分である。｝
により表される、より複雑な部分の一部分であることができる。上記の３，７‐ジアザ‐ビシクロ‐［３．３．１］ノナン‐９‐オン以外のジアザ環状構造もまた、分岐に好適な部分を提供することができる。

本発明の分岐したポリマー試薬の形態のいくつかの場合には、官能基の炭素以外の部分は、分岐部分としての役割を果たす。しかしながら、そのような場合、分岐部位は少なくとも３つの結合部位、それぞれの官能基への（直接的又は１つ以上の原子を介してのいずれかで）連結を提供する１つの結合部位、第一水溶性ポリマー部分、及び第二水溶性ポリマー部分を提供しなくてはならない。

本発明の分岐したポリマー試薬を提供する好ましい分岐部分は、以下の式：

｛式中、
POLY¹及びPOLY²のそれぞれは、（同じか又は異なる）水溶性ポリマー部分であり、Ｒ”は、Ｈ、メチルのような非反応性の部分、又は水溶性のポリマー部分であり；そしてＸ⁴及びＸ⁵のそれぞれは、（同じか又は異なる）スペーサー部分である。｝
により表される構造を含む。

好ましい分岐部分は、以下の式：

｛式中、
各場合において、POLY¹及びPOLY²は、先に定義したとおりであり、（ｄ）はゼロ、１、２又は３であり、（ｅ）は、ゼロ、１、２、又は３である。｝
よりあらわされるものから成る群から選ばれる。

このタイプの分岐した構造の例は、以下の式：

｛式中、
POLY¹は、第一水溶性ポリマー部分であり；
POLY²は、第二水溶性ポリマー部分であり；
（ａ）は、ゼロ又は１であり；
（ｂ）は、ゼロ又は１であり；
Ｘ¹は、存在する場合には、スペーサー部分であり；
Ｘ⁴は、スペーサー部分であり；
Ｘ⁵は、スペーサー部分であり；
ＥＷ¹は、存在する場合には、電子吸引基であり；
（ｚ）は、ゼロ又は１〜７の正の整数であり；
各Ｒ²は、存在する場合には、独立してＨ又は有機ラジカルであり；
各Ｒ³は、存在する場合には、独立してＨ又は有機ラジカルであり；
Ｒ¹⁵は、Ｈ又は非干渉性有機ラジカルであり；そして、
ＦＧ‐Ｒ¹⁴は、（ｉ）Ｒ¹⁴として定義される末端を有する、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基であり、ここで、Ｒ¹⁴は有機ラジカルであるか、又は（ｉｉ）環状構造であって、ここで、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基が該環状構造の一部である、のいずれかである。｝
により表される構造からなる。

いくつかの場合には、ＦＧ‐Ｒ¹⁴は、Ｒ¹⁴として定義される末端を有する、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基を表し、ここで、Ｒ¹⁴は有機ラジカルである。したがって、ＦＧ‐Ｒ¹⁴(並びに、ＦＧ‐Ｒ¹及びＦＧ‐Ｒ⁶)の例示的な形態は、以下の式：

により表されるものを含む。

他の場合には、ＦＧ‐Ｒ¹⁴は、環状構造であって、ここで、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基が該環状構造の一部である。

上記環状構造がピペリドニル構造である場合の例示的なポリマー試薬は、以下の式：

｛式中、
各場合において、POLY¹、POLY²、R²、R³、Ｘ¹、Ｘ⁴、Ｘ⁵、（a）、EW¹及び（ｂ）は、式Ｖに関して先に定義したとおりである。｝
により表される構造を含む。

本明細書において、水溶性ポリマー部分として使用するために好適な分岐したポリマーの例は、米国特許第５，９３２，４６２号に記載され、そして二置換リジン残基に基づく。リジンに基づく分岐したポリマーの２つの具体例は、以下の式：

により表される、エステルを含む様式及び、以下の式：

により表される、アミドを含む様式のものを含む。

したがって、ポリマー試薬は、例えば式Vに関して、各POLY¹及びPOLY²をPEG に置換し、そして分岐部分としてアミドを含む、リジンに基づく分岐した構造を使用することによって生じる、以下の式：

｛式中、
（ａ）、（ｂ）、（ｚ）、Ｘ¹、EW¹、R²、R³、Ｘ¹⁴、ＦＧのそれぞれは、式Ｖに関して先に定義したとおりであり、そして（ｍ）は、３〜約３０００である。｝
により表される構造に包含される。

さらに、ポリマー試薬は、式ＩＶに関して、各POLY¹及びPOLY²をPEG に置換し、そして分岐部分としてアミドを含む、リジンに基づく分岐した構造を使用することによって生じる、以下の式：

｛式中、
R²、R³、R⁸、R⁹、（ａ）、（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｚ）、Ｘ¹、EW¹、ＦＧ、EW³、及びＸ³のそれぞれは、先に定義したとおりであり、そして（ｍ）は、３〜約３０００である。｝
により表される構造に包含される。

２つ以上の水溶性ポリマー部分を含むポリマー試薬は、比較的長い単一のポリマーを使用することを必要とせずに高分子量種を提供する点で有益である。したがって、例えば、２つの水溶性ポリマー部分を含むポリマー試薬であって、各部分が約５，０００ダルトンの名目上の平均分子量を有するものは、全体で約１０，０００ダルトンの分子量を有するであろう。

２つ以上の水溶性部分を含むポリマー誘導体から形成される複合体の送達においては、それぞれの水溶性ポリマー部分はインビボで切断されることができる。１つ以上の水溶性ポリマー部分が複合体から切断されるため、結果として生じる複合体のより小さなサイズは、体からの複合体のクリアランスを改善する。水溶性ポリマー部分の分子量（すなわち、サイズ）及び／又はポリマー試薬中の切断可能な結合を選択することによって、複合体のクリアランスプロファイルを調節することができる。当業者は、水溶性ポリマー部分の適切な分子量並びに切断可能な結合を、日常の実験に基づいて決定することができ、例えば、異なる重量の水溶性ポリマー部分及び切断可能な結合を有する多様なポリマー試薬を調製し、各ポリマー試薬を活性作用物質と複合化し、各複合体を患者に投与し、そして（定期的に血液又は尿をサンプリングするなどして）クリアランスプロファイルを得ることができる。その後、（対応する複合体に基づいて）どのポリマー試薬が所望のクリアランスプロファイルを提供するかを決定することができる。

ポリマー試薬は他の形態をとることもできる。例えば、ポリマー試薬は直接的な共有結合又は１つ以上の原子を介して、のいずれかにより、水溶性ポリマー部分に結合する官能基を含むことができ、ここで、（ａ）上記官能基は、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれ、そして（ｂ）上記ポリマー試薬は、８個以上の炭素原子を含む飽和炭化水素部分を有さない。上記官能基が、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、及びジチオケタールからなる群から選ばれることが好ましい。

本発明のポリマー試薬は、組成物の形態で提供されることができる。典型的には、組成物は２つ以上の同じ又は異なるポリマー試薬及び１つ以上の任意の成分を含む。いくつかの場合には、組成物のすべての望ましくない成分を除去することができないかもしれない一方、本明細書中に記載のポリマー試薬の組成物は望ましくない成分を含まないか又は実質的に含まないことが好ましい。望ましくない成分の例は当業者に知られているであろうし、該組成物及び／又はポリマー試薬の意図された用途にしばしば依存する。しかしながら、具体的な例は典型的には、患者に投与された場合に害を及ぼす（すなわち、有毒である）不純物、成分、先の合成ステップから残留している未反応物質などを含む。

好ましくは、組成物は、副産物を実質的に含まないか又は好ましくは全く含まない。組成物はしばしば、望ましくない酸化による副産物を除去するためのクロマトグラフィーなどによる精製によって、酸化による副産物を実質的に含まないか又は全く含まないようにさせられることができる。他のアプローチは、酸化ステップを使用することなく、ポリマー試薬及び組成物に含まれるいかなる他の成分をも提供することである。さらに、大気中の酸素と組成物又はそのいかなる成分をも反応させず、それによって組成物中の酸化による副産物の生成に備えることに注意しなければならない。このことにおいて、酸化による副産物を実質的に含まない組成物は、少なくとも（重量で）７５％の酸化による副産物を含まず、より好ましくは少なくとも（重量で）８５％の酸化による副産物を含まず、さらにより好ましくは少なくとも（重量で）９０％の酸化による副産物を含まず、なおより好ましくは少なくとも（重量で）９５％の酸化による副産物を含まず、なおさらにより好ましくは少なくとも（重量で）９８％の酸化による副産物を含まず、少なくとも（重量で）９９．９％の酸化による副産物を含まないことが最も好ましい。

他の問題のなかでも、酸化による副産物は、ポリマー試薬組成物を複合化反応における試薬としての使用に適さないものとする可能性がある。例えば、酸化による副産物は、PEGのような水溶性ポリマー部分の切断された部分であることができ、それは、水溶性ポリマー部分が酸化条件に曝されている場合に起こりうる。さらに、酸化による副産物は、酸化剤自体であることができ、それは合成ステップによっては完全に除去できないものであった。該酸化剤は、組成物の生成物を酸化し続けることができ、それによって、望ましくない水溶性ポリマー部分の鎖の切断を開始する。したがって、酸化による副産物は、本明細書に記載の組成物中にはないことが望ましい。

したがって、本発明は、直接的な共有結合又は１つ以上の原子を介して、のいずれかにより、水溶性ポリマー部分に結合した官能基を含むポリマー試薬を含み、酸化による副産物を実質的に含まないポリマー組成物をも包含する。

酸化による副産物を実質的に含まない組成物の（必須ではないが）成分であることのできるポリマー試薬の例は、以下の式：

｛式中、
（ａ）は、ゼロ又は１であり；
（ｂ）は、ゼロ又は１であり；
Ｘ¹は、存在する場合には、スペーサー部分であり；
EW¹は、存在する場合には、電子吸引基であり；
（ｚ）は、１〜７であり；
各R²は、独立してH又は芳香族を含まない有機ラジカルであり；
各R³は、独立してH又は芳香族を含まない有機ラジカルであり；
（ｍ）は、３から約３０００、より好ましくは、１１から約３０００である。｝
により表される構造を含み、ここで、上記組成物は、以下の式：

により表される酸化による副産物、β‐ケトエステル、及び以下の式：

により表されるβ‐ケトエステルのケタール誘導体を実質的に含まない。

ここで検討されるケトン以外の官能基（すなわち、ケトンハイドレート、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール、及びジチオケタール）は、式VI中のケトン官能基と置換されることができる。

ＩＩＩ．ポリマー試薬の製造方法
ポリマー試薬の多様な製造方法について検討する前に、該方法は時には保護された形態の官能基の使用に頼ることを指摘しておかなければならない。ケタールのようないくつかの官能基は、保護を必要としない。さらに、いくつかの官能基は、本明細書に記載のポリマー試薬と結合した他の官能基の保護された形態としての役割を果たす（例えば、ケタールはしばしばケトンの保護された形態としての役割をはたす）。当業者は、本明細書に記載のポリマー試薬と結合した各官能基に関する好適な保護された形態を知っている。例えば、ケトンの保護された形態はケタール（環状又はジエーテル型のいずれでも）を含む。ケタールは、酸触媒の存在下、ケトンをアルコール、ジオール、チオール、又はジチオールと反応させることによって形成されることができる。このようにして形成されたケタール（並びに他のケタール）は、酸加水分解によってケトンに変換されることができる。他の保護された形態並びに本明細書で検討される多様な官能基の保護及び脱保護は、上記のGreeneらの文献中に提供されている。

ポリマー試薬を製造するための多様なステップは、好適な溶媒中で実施される。当業者は、いかなる所定の反応ステップに適したいかなる具体的な溶媒も決定することができる。しかしながら、しばしば溶媒は非極性溶媒又は極性非プロトン性溶媒であることが好ましい。非極性溶媒の非制限的な例は、ベンゼン、キシレン、ジオキサン、テトラヒドロフラン（THF）、ｔ−ブチルアルコール、及びトルエンを含む。特別に好ましい非極性溶媒は、トルエン、キシレン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、及びｔ−ブチルアルコールを含む。例示的な極性非プロトン性溶媒は、DMSO（ジメチルスルホキシド）、HMPA（ヘキサメチルホスホラミド）、DMF（ジメチルホルムアミド）、DMA（ジメチルアセタミド）、及びNMP（N-メチルピロリジノン）を含むが、これらに限定されない。

本発明のポリマー試薬は、多様な経路を使用して合成されることができる。１つの方法に関して検討される一般的な技術は、しばしば他の方法において検討される同様の技術に当てはまることは注意するべきである。結局、所定の方法に関するいかなる特別な技術についての検討もその方法に限られるものではなく、したがってその技術を利用するそれぞれの方法に当てはまる。

いくつかの経路においては、ポリマー試薬は重合アプローチを介して形成される。したがって、例えば、ポリマー試薬は以下のステップ：
（ｉ）重合を開始するのに適した少なくとも１つの活性陰イオン性部位及び官能基又はその保護された形態を含む前駆体分子を提供し、ここで、該官能基は、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれ；
（ｉｉ）上記前駆体分子の該陰イオン性部位を重合可能な反応性モノマーと接触させ、それによって該反応性モノマーの該前駆体分子への重合化を開始し；
（ｉｉｉ）追加の反応性モノマーを上記前駆体分子に添加して、１つ以上のポリマー鎖を形成し；
（ｉｖ）所望の長さの１つ以上のポリマー鎖ができるまで、上記の添加を継続させ；
（ｖ）上記反応を停止させ、それによって該官能基又はその保護された形態を含むポリマー試薬を得て；
（ｖｉ）場合により該官能基が保護された形態であるときには、該官能基を脱保護する；
を含む方法によって形成されることができる。

陰イオン性部位は、重合化のための開始部位としての役割を果たしそして典型的には、必然的にではないがアルコキシド部分である。アルコキシド部分は、対応するアルコールを脱プロトン性塩基に与え、それによって該アルコールから水素原子を除去して所望のアルコキシド部分を得ることによって有利に入手される。

式ＩＶに対応するポリマー試薬を形成するために、以下の式：

｛式中、
（ａ）、（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｘ）、（ｚ）、ＥＷ¹、ＥＷ³、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁸、及びＲ⁹は式ＩＶに関して先に定義したとおりであり、さらに、pFGは、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基又はその保護された形態である。｝
により表される構造を含む前駆体分子が使用されることができる。

式Iに対応するポリマー試薬は、上記前駆体分子が以下の式：

｛式中、
（ａ）、（ｂ）、（ｚ）、ＥＷ¹、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は、式Ｉに関して（発明の要約のセクションにおいて）先に定義されたとおりであり、そしてさらに、pFGは、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基又はその保護された形態である。｝
により表される構造を含む、このアプローチを含む方法によって形成されることができる。

式VIIaに対応するジオールが使用されるか又は式VIIbに対応するアルコールが使用される場合（ここで、水素原子が各アルコキシド部分に結合している）、アルコキシド開始部位を得るためには、（例えば、上記アルコールを脱プロトン性塩基とともに処理する等の）水素を除去する追加のステップが必要である。さらに、チオレート（すなわち、‐S^-）がアルコキシド部分の代わりに使用されることができる。そしてそのような場合、重合化に好適な必要なイオン性部位を提供するために、対応するチオール又はジチオールは塩基中に入れられことができる。

このアプローチにおいて前駆体分子として使用されるのに好適な具体的分子は、以下の式：

により表されるものを含む。前駆体分子としての使用に好適なこれらのそして他の分子は、商業的に（上記の形態又はそれらの対応するアルコール形態で）入手可能であり及び／又は慣用技術を使用して合成されることができる。

重合化に好適な（陰イオン性部位などの）開始部位を前駆体分子に提供したら、このアプローチにおける次のステップは、前駆体分子の開始部位に重合化可能な反応性モノマーを接触させ、それによって反応性モノマーの前駆体分子への重合を開始するステップを含む。いかなる反応性モノマーも、生じたポリマー鎖が水溶性である限り、ポリマー鎖を「成長」させるために使用されることができる。しかしながら、反応性モノマーがエチレンオキシドであり、これによってポリ（エチレンオキシド）鎖を提供することは特に好ましい。これらのそして他の重合化技術は当業者に知られており、例えば、Odian, Chap.7, Principles of Polymerization, 3^rd Ed.、McGraw-Hill, 1991に示されている。

重合化が開始したら、１つ以上のポリマー鎖を形成するために、追加の反応性モノマーが前駆体分子に添加される。反応性モノマーを添加することは、１つ以上のポリマー鎖が「成長」することを効果的に可能とする。ポリマー鎖の成長は、所望の分子量が達成されるまで継続され、そのときに反応が終了する。終了は当業者に知られた多くの方法のいずれでおこなうこともできる。たとえば、反応媒質の中和は、ポリマー鎖の成長を停止させる。さらに、特別な重量又は量の反応性モノマーを添加し、すべての反応性モノマーが消費されるまで重合化をすすめることは、一定のそして決定可能な分子量を有するポリマー鎖を生じる。結果として、官能基又はその保護された形態を含むポリマー鎖が得られる。

場合により、そしてエンドキャッピングステップを実施する前に、（疎水性又は親水性のいずれかの）求電子性の反応性ポリマーがポリマー鎖に添加されることができる。

エトキシル化経路のさらなる利益は、それが、他のポリマーを含む多様な部分により生きたポリマー末端（すなわち、さらなるモノマーが付加可能なポリマー末端）をキャッピングすることを可能とすることである。これは、異なる性質のポリマーの生成を可能とする。したがって、既に形成された水溶性ポリマー部分を疎水性ポリマーでキャップし、そして親水性及び疎水性の領域を有する最終的なポリマーを生成することが可能である。多くの適用においてより重要なことは、求電子的に反応性のPEG誘導体を添加し、それによって鎖を延長し、一方では同時に加水分解によって切断可能な部分を付加できることである。後者の点は、体からの望ましくないクリアランスプロファイルを有するかもしれない薬理学的活性を有するタンパク質、のような活性作用物質の薬物送達に関して重要である。この鎖伸長キャッピングの一般化された例は、炭酸塩、ウレタン又は同様の官能基結合を与える一置換PEG誘導体を生きたポリマーと反応させることを含む。しかしながら、ポリマーの結合は、水溶性でも免疫原性でもないポリマー複合体を生じてはならない。

ポリマー試薬中の水溶性ポリマー部分が形成されたら、場合により、エンドキャッピングのための基が慣用技術によって付加される。例えば、（メチルハライド、又はメチルｐ‐トルエンスルホン酸などの）アルキルハライドが、ポリマー鎖の露出された末端（官能基又はその保護された形態の末端又はそれから遠位の末端）と反応させられることができる。さらに、１つ以上のポリマー鎖が追加のポリマーでキャッピングされることができる。

場合により、ポリマー試薬が官能基の保護された形態を有するとき、該官能基は既知の方法によって除去されることができる。例えば、（環状又はジエーテル型の）ケタール部分は加水分解を行うことによって除去可能である。ここでも、他の保護基の除去方法については、上記のGreeneらの文献を参照のこと。

中心の官能基、水溶性ポリマー部分をその各側に有する官能基を含むポリマー試薬を提供するためのこのエトキシル化に基づくアプローチの利益は、分子量の制御及びキャッピングステップにおけるフレキシビリティである。例えば、重合により平均分子量５，０００ダルトンの生きたポリマーを得て、メチル化試薬を添加することによって末端の水酸基をキャッピングすることができる。これにより、平均分子量約５，０００ダルトンで安定な（比較的非反応性の）末端基を有するがポリマー誘導体のおよそ中心に官能性部分を有する、ポリマーが生じる。さらに、鎖伸長剤で生きたポリマーをキャッピングしてより分子量を大きくするか、又はベンジルのような官能基として反応性のエーテル基でキャッピングして末端基の化学的修飾能力を導くことのできる除去可能な基を与えることができる。

ポリマー試薬の製造のための重合化に基づく他のアプローチは、保護された二級アルコールの使用を含む。特別には、このアプローチの方法は、以下のステップ：
（ｉ）保護された二級アルコール又はチオール及び重合化の開始に好適な少なくとも１つの陰イオン性部位を含む前駆体分子を提供し；
（ｉｉ）該前駆体分子の該陰イオン性部位を、重合化可能な反応性モノマーと接触させて、それにより、該反応性モノマーの該前駆体分子への重合化を開始し；
（ｉｉｉ）上記前駆体分子に追加の反応性モノマーを添加して、１つ以上のポリマー分子を形成し；
（ｉｖ）所望の長さの１つ以上のポリマー鎖に達するまで上記接触を継続させ；
（ｖ）上記反応を停止させ、それにより、保護された二級アルコール又はチオールを含む中間体を得て；
（ｖｉ）上記中間体の上記保護された二級アルコール又はチオールを脱保護して、保護されない二級アルコール又はチオールを形成し；
（ｖｉｉ）上記保護されない二級アルコール又はチオールを酸化して、上記前駆体分子が二級アルコールを含むときにはケトンを、又は上記前駆体分子が二級チオールを含むときにはチオンを含むポリマー試薬を提供し；
（ｖｉｉｉ）場合により、上記ケトン又はチオンをさらに修飾して、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基を得ること；
を含む。

したがって、重合化技術を含む、ステップ（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）に関しては、上記で検討したのと同じ重合化技術が同様に当てはまる。上記のように、陰イオン性部位は、重合化の開始部位としてはたらき、そして典型的には、必然的にではないが、アルコキシド部分である。アルコキシド部分は、対応するアルコールを脱プロトン化塩基に与え、それにより、水素原子をアルコールから除去して所望のアルコキシド部分を生じることにより、有利に得られる。

このアプローチを使用して式ＩＶの分岐したポリマー試薬を形成するためには、前駆体分子は以下の式：

｛式中、
（ａ）、（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｘ）、（ｚ）、Ｘ¹、Ｘ³、ＥＷ¹、ＥＷ³、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁸、及びＲ⁹は、式ＩＶに関して先に定義したとおりであり、そしてさらにＹは、酸素又はイオウであり、「pg」は、Yが酸素である場合には二級アルコールのための保護基であり、Yがイオウである場合には二級チオールのための保護基である。｝
により表される構造を含むであろう。

式Iに対応するポリマー試薬は、このアプローチを含む方法によって形成されることができ、ここで、前駆体分子は以下の式：

｛式中、
（ａ）、（ｂ）、（ｚ）、Ｘ¹、ＥＷ¹、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は、式Ｉに関して（発明の要約のセクションで）先に定義したとおりであり、そしてさらに、ここで、Ｙは、酸素又はイオウであり、「pg」は、Yが酸素である場合には二級アルコールのための保護基であり、Yがイオウである場合には二級チオールのための保護基である。｝
により表される構造を含む。

先に示唆したとおり、前駆体分子は、保護された二級アルコール又はチオールを含む。二級アルコール又はチオールを保護するために好適ないかなる当業者に知られた保護基も使用されることができ、そして例えば、ベンジルエーテル、メトキシメチルエーテル（MOM）、メチルチオメチルエーテル（MTM）、テトラヒドロピラニルエーテル（THP）、４‐メトキシテトラヒドロピラニルエーテル、テトラヒドロフラニルエーテル、１‐エトキシエチルエーテル、１‐メチル‐１‐メトキシエチルエーテル、２‐（フェニルセレニル）エチルエーテル、アリルエーテル、ｏ‐ニトロベンジルエーテル、トリフェニルメチルエーテル、α‐ナフチルジフェニルメチルエーテル、ｐ‐メトキシフェニルジフェニルメチルエーテル、９‐（９‐フェニル‐１０‐オキソ）アンスリルエーテル（トリチロン）、イソプロピルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（TBDMS）、トリベンジルシリルエーテル、及びトリイソプロピルシリルエーテルを含む。この方法で使用されるのに特別に好ましい保護基は、ベンジルエーテルである。

このアプローチにおいて前駆体分子として使用されるのに適した具体的な（対応するアルコールの形態の）分子は、以下の式：

｛式中、
Ｙは、酸素又はイオウであり、「pg」は、Yが酸素である場合には二級アルコールのための保護基であり、Yがイオウである場合にはチオールのための保護基である。｝
により表される、一つの保護基を有するグリセロールを含む。

一つの保護基を有するグリセロールで特別に好ましいのは、以下の式：

により表される、２‐ベンジルオキシ‐１，３‐プロパンジオールである。これらのそして他の、一つの保護基を有するグリセロールは、Sigma(St,Louis, MO)などの商業的な供給者から入手可能であり及び／又は慣用技術を使用して合成されることができる。

場合によりさらに求電子性ポリマーを結合し及び場合により水溶性ポリマー部分の末端をアルキル化するとともに、水溶性ポリマー部分が形成されたら、上記方法は、保護された二級アルコール又はチオールを脱保護して保護されない二級アルコール又はチオールを形成することを含む。保護基は、当業者に知られた方法を使用して除去されることができる。例えば、脱保護ステップは、中間体をH₂及びパラジウム、酸化パラジウム、ニッケル、プラチナ、又は鉛のような金属触媒に露出することによって行われることができる。

脱保護ステップの後は、上記方法は、酸化ステップを実施することを含み、これは、いかなる慣用方法によって実施することもでき、そして本発明はこの点で限定的でない。好適な酸化技術の例は、中間体を、KMnO₄、MnO₂、K₂Cr₂O₇、CrO₃,ピリジニウムクロロクロメート、ピリジニウムフルオロクロメート、ピリジニウムジクロメート、RuO₄、RuCl₃、テトラ‐ｎ‐プロピルアンモニウムペルウレテネート、ジメチルスルホキシド、Ｎ‐クロロサクシニミド、Ag₂CO₃、Ag₂O、及びDes-Martinペルヨージナン試薬から成る群から選ばれる酸化剤に接触させて酸化することを含む。

本発明のポリマー試薬を形成するための他のアプローチは、重合化アプローチに基づくものではない。本発明のポリマー試薬を提供するための一つの非重合化アプローチにおいては、該方法は、（ｉ）少なくとも１つのイソシアネート部分及び官能基又はその保護された形態を含む前駆体を提供し、ここで、上記官能基は、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれ；そして（ｉｉ）好適な反応条件下、上記前駆体分子と少なくとも１つの水酸基又はアミン基を有する水溶性ポリマー部分とを接触させて、それにより、上記官能基又はその保護された形態を含むポリマー試薬を形成し；そして（ｉｉｉ）場合により、上記官能基が保護された形態のときは、該官能基を脱保護すること；を含む。

この第三のアプローチにおいては、少なくとも１つのイソシアネート部分及び官能基又はその保護された形態を含む、多数の前駆体分子が使用されることができる。

このアプローチを用いて式ＩＶの分岐したポリマー試薬を形成するためには、反応は、以下の：（ａ）以下の式：

｛式中、
（ａ）、（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｘ）、（ｚ）、Ｘ¹、Ｘ³、ＥＷ¹、ＥＷ³、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁸、及びＲ⁹が、式ＩＶに関して先に定義したとおりであり、そしてさらに、pFGが官能基又はその保護された形態であり、ここで、該官能基は、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる。｝
により表される構造を含む前駆体分子；と、（ｂ）１つの末端水酸基を有する水溶性ポリマー部分とを接触させることを含むであろう。

水溶性ポリマー部分は、少なくとも２：１のモル比でイソシアネート前駆体分子に添加されるであろう。しかしながら、過剰の水溶性ポリマー部分が存在することが好ましい。

このアプローチを使用して式Iのポリマー試薬を形成するためには、反応は、以下の：（ａ）以下の式：

｛式中、
（ａ）、（ｂ）、（ｚ）、X¹、ＥＷ¹、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は式Ｉに関して（発明の要約のセクションにおいて）先に定義したとおりであり、そしてさらに、pFGは官能基又はその保護された形態であり、該官能基は、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる。｝
により表される構造を含む前駆体分子；と（ｂ）１つの末端水酸基又はアミン基を有する水溶性ポリマー部分とを接触させることを含むであろう。

水溶性ポリマー部分は、少なくとも１：１の水溶性ポリマー部分対イソシアネート前駆体分子のモル比で、添加されるであろう。しかしながら、過剰のイソシアネート前駆体分子が存在することが好ましい。

ホモ二置換性ポリマー試薬を形成するためには、反応は、以下の：（ａ）式IXbの前駆体分子；と（ｂ）２つの末端水酸基を有する水溶性ポリマー部分とを接触させることを含むであろう。典型的には、水溶性ポリマー部分のイソシアネート前駆体分子に対するモル比は、１：２以下である。

ポリマー試薬の調製のための第四のアプローチにおいては、以下のステップ：（ｉ）少なくとも１つの利用可能な求核性基を有する水溶性ポリマー部分を提供し；（ｉｉ）少なくとも１つの活性化基及び官能基又はその保護された形態を含む前駆体分子を提供し、ここで、該官能基は、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれ；（ｉｉｉ）好適な反応条件下、上記前駆体分子と上記水溶性ポリマー部分を接触させ、それにより、上記官能基又はその保護された形態を含むポリマー試薬を形成し；そして（ｉｖ）場合により、上記官能基が保護された形態のときには、該官能基を脱保護すること；を含む方法が提供される。

少なくとも１つの利用可能な求電子性基を有する水溶性ポリマー部分は、求核性基で終端するいかなるポリマーであることもできる。そのようなポリマーは、制限されることなく以下の：末端アミンを有するポリマー（例えば、Nektar Therapeutics, Huntsville, ALなどから入手可能なアミン末端を有するＰＥＧ）を含む。前駆体分子の活性化基は、その用語が当業者によって理解されているとおりのいかなる好適な活性化基であることもできるが、活性化基は（フルオライド、クロライド、ヨーダイドなどの）ハライド、及びN‐サクシニミジルから成る群から選ばれる活性化基が好ましい。

式IVの分岐したポリマー試薬は、少なくとも１つの利用可能な求核性基を有する水溶性ポリマー部分；と以下の式：

｛式中、
（ａ）、（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｘ）、（ｚ）、Ｘ¹、Ｘ³、ＥＷ¹、ＥＷ³、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁸、及びＲ⁹は、式ＩＶに関して先に定義したとおりであり、そしてさらに各ACは、活性化基であり、そしてpFGは、官能基又はその保護された形態であり、ここで、該官能基は、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる。｝
により表される構造を含む、前駆体分子を接触させることによって、このアプローチを使用して形成されることができる。

水溶性ポリマー部分は、少なくとも２：１のモル比で前駆体分子に添加される。しかしながら、過剰の水溶性ポリマー部分が存在することが好ましい。

式Iのポリマー試薬もまた、このアプローチを使用して調製されることができる。したがって、少なくとも１つの利用可能な求核性基を有する水溶性ポリマー部分が、以下の式：

｛式中、
（ａ）、（ｂ）、（ｚ）、Ｘ¹、ＥＷ¹、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は、式Ｉに関して（発明の要約のセクションにおいて）先に定義したとおりであり、そしてさらに、そしてさらにACは、活性化基であり、そしてpFGは、官能基又はその保護された形態であり、ここで、該官能基は、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる。｝
により表される構造を含む前駆体分子と接触させられる。少なくとも１つの利用可能な求核性基を有する水溶性ポリマー部分は、少なくとも１：１の水溶性ポリマー部分対前駆体分子のモル比に等しい量で添加される。しかしながら、過剰の水溶性ポリマー部分が存在することが好ましい。

ホモ二置換性ポリマー試薬もまた、少なくとも２つの利用可能な求核性基を有する水溶性ポリマー部分と式Xbに対応する構造を有する前駆体分子とを反応させることによって調製されることができる。この場合、水溶性ポリマー部分対前駆体分子のモル比は、典型的には、１：２以下であり、そして典型的には、過剰の前駆体分子が存在する。

ポリマー試薬を製造するための第五のアプローチは以下のステップ：
（ｉ）少なくとも１つの利用可能な脱離基を有する水溶性ポリマー部分を提供し；
（ｉｉ）少なくとも１つの求核性基及び官能基又はその保護された形態を含む前駆体分子を提供し、ここで、該官能基は、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれ；
（ｉｉｉ）好適な反応条件下、上記前駆体分子と上記水溶性ポリマー部分を接触させ、それにより、該官能基又はその保護された形態を含むポリマー試薬を形成し；そして
（ｉｖ）場合により、上記官能基が保護された形態であるときは、該官能基を脱保護すること；
を含む。

水溶性ポリマー部分上の好ましい脱離基は、一級（例えば、一級ハロ）のものを含むが、二級の脱離基もまた使用されることができる。好適な脱離基の例は、ハロゲン及びスルホン酸エステルを含む。ハロゲンの中でも、ブロモ、クロロ、及びヨードが好ましく、ブロモ及びクロロが特に好ましい。スルホン酸エステルに関しては、メタンスルホネート（「Ms」と略される）、トリフルオロメタンスルホネート、トリクロロメタンスルホネート、２，２，２，‐トリフルオロエタンスルホネート、２，２，２，‐トリフクロロエタンスルホネート、ノナフルオロブタンスルホネート、ｐ−ブロモベンゼンスルホネート、ｐ−ニトロベンゼンスルホネート、及びｐ−トルエンスルホネートが特に好ましいが、他のスルホン酸エステル及び当業者に知られた同様の構成の脱離基もまた、使用されることができる。

中でも、求核性基を有する前駆対分子に関しては、該求核性基は、水溶性ポリマー部分を結合した脱離基と反応することのできるいかなる好適な求核性基であることもできる。典型的には、求核性基は、それぞれ対応するアルコール又はチオールの形態から水素を除去したことに由来するアルコキシド（R‐O^-）又はチオレート（R‐S^-）である。したがって、式VIIa及びVIIbに対応する構造を含む前駆体分子が使用可能である。先に示唆したとおり、アルコキシド部分の具体的な例は、以下の式：

により表されるものを含む。

本発明のポリマー試薬を提供するための第六のアプローチにおいては、少なくとも１つのアルコキシドイオン又はチオレートイオンを有する水溶性ポリマー部分を、少なくとも１つの脱離基及び官能基又はその保護された形態を含む前駆体分子と反応させるステップを含む方法が提供され、それにより、ポリマー試薬が提供される。ここで、該官能基は、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる。

少なくとも１つのアルコキシドイオン又はチオレートイオンを有する水溶性ポリマー部分は、少なくとも１つの水酸基又はチオール基を有する水溶性ポリマー部分を好適な塩基の存在下、結合させることによって便利に調製される。したがって、塩基は、POLY-OHをPOLY-O^-に、POLY-SHをPOLY-S^-に変換する。さらに、今やアルコキシド又はチオレート部分を有する水溶性ポリマーは、今度はS_N2反応メカニズムを介して好適な脱離基を含む前駆体分子と反応すると考えられる。当業者は理解するであろうとおり、このアプローチはWilliamsonエーテル合成に相当し、そして、Williamsonエーテル合成において一般に使用される原理及び技術はここにも同様に適用可能である。

アルコキシド及びチオレートを形成するために好適な塩基の非制限的な例は、ナトリウム、水酸化ナトリウム、カリウム、水酸化カリウム、ナトリウムハイドライド、カリウムハイドライド、ナトリウムメトキシド、カリウムメトキシド、ナトリウムtert-ブトキシド、カリウムtert-ブトキシド、炭酸ナトリウム、及び炭酸カリウムを含む。しかしながら、このステップにしたがって使用されるのに好ましい塩基は、ナトリウム、カリウム、ナトリウムハイドライド、カリウムハイドライド、ナトリウムメトキシド、カリウムメトキシド、ナトリウムtert-ブトキシド及びカリウムtert-ブトキシドから成る群から選ばれるものを含む。

さらに、少なくとも１つのアルコキシド又はチオレートを有する水溶性ポリマー部分は、先に記載した重合化反応を介して便利に提供されることができる。水溶性ポリマー部分を提供するためのこのアプローチにおいては、水溶性ポリマー部分は少なくとも１つのアルコキシド又はチオレートイオンを有することが好ましい。

一般に、しかし必然的にではないが、過剰の前駆体分子が少なくとも１つのアルコキシド又はチオレートイオンを有する水溶性ポリマーと反応することが可能である。典型的には前駆体分子の量は、水溶性ポリマー部分の利用可能な水酸基及び／又はチオレート基の数に少なくとも等しいモル数である。ヘテロ官能性ポリマー種（すなわち、２つ以上の異なる末端官能基を有する種）は、非化学量論的な量の前駆体分子を使用することによって調製されることができる。すなわち、ヘテロ官能性種は、水溶性ポリマー部分上の利用可能な水酸基又はチオレート基の総モル数が前駆体分子の総モル数を超える場合に形成される。

アルコキシド部分を有する水溶性ポリマー部分は、重合化プロセスを介して合成されることができる。例えば、ナトリウム２‐メトキシエタノレート（Na⁺：^-OCH₂CH₂OCH₃）のようなアルコキシド塩は、エチレンオキシドの重合化を開始することができる。ポリマー鎖に最終的に添加されるモノマーは、（エチレンオキシドの場合の）アルコキシドのような反応性基を残し、そしてポリマー鎖は上記のように前駆体分子と反応させられることができる。

（例えば、少なくとも１つのアルコキシドイオン又はチオレートイオンを有する水溶性ポリマーをそれぞれ提供するために）少なくとも１つの水酸基又はチオール基を有する水溶性ポリマーが使用されることができる。一つの水酸基又はチオール基のみを有する水溶性ポリマーが使用可能であるにもかかわらず、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又はそれを超える水酸基又はチオール部分を有するポリマーが使用可能である。有利には、水溶性ポリマー部分上の水酸基及び／又はチオール部分の数が増加するにつれて、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタール部分を提供するために利用可能な部位の数は増加する。水溶性ポリマー部分と結合した水酸基及び／又はチオール部分の数の上限の非制限的な例は、５００、１００、８０及び４０を含む。

ＩＶ．複合体
本明細書中に記載されたポリマー試薬は、生理活性物質又は表面との複合化に有用である。本明細書に記載のポリマー試薬との反応に好適な例示的な基は、（リジン残基の側鎖からの一級アミンなどの）一級アミン基、（セリン又はトレオニン残基の側鎖からの一級アルコールなどの）アルコール、ヒドラジン及びヒドラジドである。さらなる官能基は、ケトン（及び関連する官能基）と反応性であり、活性作用物質などの他の分子上に存在する場合に、複合化反応に使用されることができる。本明細書に記載のポリマー試薬との反応に好適な基は、当業者に知られている。したがって、本発明は、複合化条件下で、活性作用物質を、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基を含むポリマー試薬と接触させるステップを含む複合体製造方法を提供する。複合化反応において使用される好ましいポリマー試薬は、（式Ｉ、II、III、IV、V及びVIのポリマー試薬などの）本明細書に記載のものを含む。

好適な複合化条件は、時間、温度、pH、試薬の濃度、試薬の官能基、活性作用物質上の利用可能な官能基、溶媒などのポリマー試薬と活性作用物質との複合化を行うのに十分な条件である。当業者に知られているとおり、中でも特別な条件は、活性作用物質、所望の複合化の型、反応混合物中の他の物質の存在、などに依存する。いかなる特別な場合においても、複合化を行うのに十分な条件は、本明細書の開示を読み、関連する文献を参照し、及び／又は日常の実験を通して、当業者によって決定されることができる。

例示的な複合化条件は、複合化反応を約４〜約１０のpH、そして例えば、約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０において実施することを含む。反応は、約５分〜約７２時間、好ましくは約３０分〜約４８時間、そしてより好ましくは約４時間〜約２４時間で進行することが可能である。複合化が起こることのできる温度は、典型的には、必然的にではないが、約０℃〜約４０℃、そしてしばしば室温以下の範囲である。複合化反応は、しばしばリン酸緩衝液、酢酸ナトリウム、又は類似の系を使用して実施される。

試薬の濃度に関しては、典型的には、過剰のポリマー試薬が活性作用物質と併合させられる。しかしながら、いくつかの場合には、活性作用物質の反応性基に対して化学量論的な量のポリマー試薬上の反応性基を有することが好ましい。したがって、例えば、２つのケトン基を有する２モルのポリマー試薬が活性作用物質の１モルごとに併合される。ポリマー試薬対活性作用物質の例示的な比は、約１：１（ポリマー試薬：活性作用物質）、１．５：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、８：１、又は１０：１を含む。複合化反応は、さらなる複合化反応が実質的に起こらなくなるまで進行させられ、それは、一般に、時間に沿って反応の進行をモニターすることによって決定されることができる。

反応の進行は、いろいろな時点で反応混合物から一定量を取り出し、SDS-PAGE又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリー或いは他の好適な分析法によって反応混合物を分析することによってモニターされることができる。形成された複合体の量又は複合化せずに残っているポリマーの量に関してプラトーに達したら、反応は完了したと推定される。典型的には、複合化反応には、数分〜数時間（例えば、５分〜２４時間以上）のいずれかの時間がかかる。得られた生成物の混合物は、好ましくは、しかし必然的にではなく精製されて過剰のポリマー試薬、未複合化反応物（例えば、活性作用物質）、及び複数の複合化をした望ましくない種から分離される。そして、得られた複合体は、MALDI、毛細管電気泳動、ゲル電気泳動、及び／又はクロマトグラフィーのような分析法を使用してさらに特徴付けされることができる。

本発明の他の実施態様においては、ポリマー‐活性作用物質複合体の製造のための方法が提供される。ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる官能基を使用するいかなる複合化方法も使用可能である。ポリマー‐活性作用物質複合体の製造のための好ましい複合化アプローチは、還元的アミノ化である。理論にとらわれることを望まない一方、還元的アミノ化アプローチは、アミン含有活性作用物質のポリマー試薬の官能基への求核付加を含むと考えられ、ここで、該官能基は、ケトン、ケトンハイドレード、チオン、モノチオハイドレート、ジチオハイドレート、ヘミケタール、モノチオヘミケタール、ジチオヘミケタール、ケタール及びジチオケタールから成る群から選ばれる。還元的アミノ化に関しては、ポリマー視試薬の好ましい官能基は、ケトン、ケトンハイドレード、及びケタールを含む。当業者は、還元的アミノ化技術に精通している。

すなわち、そして理論にとらわれることを望まずに、（活性作用物質がアミンを有しそしてポリマー試薬がケトンを含む）例示的な還元的アミノ化は、最初にカルビノールアミン中間体を介して進行する。そして、該カルビノールアミンは脱水素化（縮合）してイミンを生じる。今度は、イミンが好適な還元剤を使用して還元されて、ポリマー‐活性作用物質複合体を形成する。例示的な還元剤は、シアノボロハイドライドナトリウムである。いくつかの場合には、HClの存在下における亜鉛、ボロハイドライドナトリウム、アルコール性KOHの存在下におけるペンタカルボニル鉄、金属触媒の存在下における水素（H₂）及び蟻酸のような還元剤が使用可能である。反応は模式的に図３に示される。

活性作用物質及びポリマー試薬の間の結合の特に注目すべきは、以下の：活性作用物質のアミンはポリマー試薬の二級炭素原子に結合されていることである。したがって、本発明の他の実施態様においては、活性作用物質の窒素原子とポリマー試薬由来の二級炭素原子の間の共有結合を含む複合体が提供される。二級炭素原子は、直接的に２つの他の炭素（R’及びR”として図３に表される）に結合している炭素原子である。複合体の残りの部分に関しては、二級炭素原子は、直接的に又は１つ以上の原子を介する、のいずれかによって水溶性ポリマー部分に結合している。したがって、二級炭素原子は、（図３においてR’で表される）第一炭素原子及び（図３においてR”で表される）第二炭素原子に結合され、ここで、少なくとも１つの第一炭素原子又は第二炭素原子が、直接的に又は１つ以上の原子を介して、のいずれかにより、水溶性ポリマー部分に結合している。

複合体を形成するために使用されるポリマー試薬に依存して、（活性作用物質からの窒素以外の）二級炭素に結合する原子は変化するであろう。いくつかの場合においては、メチル基が二級炭素（すなわち、二級炭素原子に結合している第一炭素又は二級炭素のひとつはメチルである）に結合されている。他の場合においては、水溶性ポリマー部分は、二級炭素原子に結合した２つの炭素原子のうちのそれぞれに結合されており（すなわち、第一炭素原子と第二炭素原子は、二級炭素原子に結合されている）、それにより、二級炭素原子を介して連結された、ポリマーを含む２つの「アーム」を提供する。これらの場合において、複合体は、直接的に又は１つ以上の原子を介して、のいずれかによって二級炭素原子に結合された第二水溶性ポリマー部分を含む。なおさらに他の場合においては、式Ｖで表されるポリマー試薬が活性作用物質に複合化される場合のように、水溶性ポリマー部分自体が分岐していることができる。

還元的アミノ化に関しては、複合体は、二級炭素原子に結合した水酸基部分を含まないことが好ましい。該水酸基部分は、例えば、α，β‐不飽和カルボニルのカルボニルへの求核試薬の直接的な付加（又は「１，２付加」）により生じることができる。さらに、複合体は、二級炭素原子の隣の炭素に結合したカルボニルを含まない（すなわち、二級炭素原子に対してβ位のカルボニルを含まない）ことが好ましい。該カルボニルは、共役付加（又は「１，４付加」）によって生じることができる。

図３に示すように、一級アミンを含む活性作用物質（例えば、タンパク質のリジン側鎖からの一級アミン、たんぱく質のＮ‐末端アミン、など）からの窒素は複合体を形成するために使用された。還元的アミノ化を介する複合化は、活性作用物質が二級アミンを含む場合にも起こることができる。この場合、得られる複合体は、（ポリマー試薬由来の）二級炭素に連結された（活性作用物質由来の）三級アミンを含む。

ポリマー試薬を活性作用物質に複合化するための他のアプローチも使用されることができる。例えば、（α，β-不飽和ケトンなどの）α，β‐不飽和官能基を有するポリマー試薬は、官能基への直接的付加（又は「１，２付加」）を介する求核付加によって（アミンなどの）求核試薬が反応することができる、直接的付加に参加することができる。さらに、これらのポリマー試薬は、求核試薬がβ炭素に結合されるようになり、そしてα炭素が溶媒又は求核試薬の共役酸からのプロトンを受容する、共役付加（又は「１，４付加」）に参加することができる。試薬の構造は、反応がどのように起こるかを大いに支配するであろう。ビニル炭素上にあり、そして他のα炭素上では立体的に障害されたα，β‐不飽和ケトンによる共役付加（「１，４付加」）は、普及することが期待される。

その形成において使用されたアプローチにかかわりなく、ポリマー‐活性作用物質複合体は、異なる複合化種を獲得／単離するために精製されることができる。或いは、そして、より好ましくは、複合体の形成に使用される（約２０，０００ダルトン未満、より好ましくは約１０，０００ダルトン未満の）低分子量のポリマー試薬のためには、生成物の混合物は活性作用物質ごとに水溶性ポリマー部分の分配を得るために精製されることができる。例えば、生成物の混合物は、（タンパク質などの）活性作用物質ごとに平均して１〜５のＰＥＧ、典型的には（タンパク質などの）活性作用物質ごとに平均約３のＰＥＧを得るために精製されることができる。最終的な複合化反応混合物の精製のための方法は、例えば、使用されるポリマー試薬の分子量、特別な活性作用物質、所望の投薬計画、及び残留活性、並びに個々の複合体のインビボにおける性質などを含む多数の因子に依存するであろう。

所望により、ゲルろ過クロマトグラフィーを使用して、異なる分子量を有する複合体が単離されることができる。すなわち、（たとえば、１−mer、2‐mer、３‐merなどの、ここで、「１‐mer」は、活性作用物質に対して１つのポリマー試薬を示し、「２‐mer」は、活性作用物質に対して２つのポリマー試薬を示す）異なる数のポリマー対活性作用物質の比率を、それらの異なる分子量（ここで、相違は本質的に水溶性ポリマー部分の分子量に対応する）に基づいて分画するために、ゲルろ過クロマトグラフィーが使用される。例えば、１００，０００ダルトンのタンパク質が無作為に平均分子量約２０，０００ダルトンのケトン含有PEGに複合化される、例示的反応においては、得られる反応混合物は、（約１００，０００ダルトンの分子量の）非修飾タンパク質、（約１２０．０００ダルトンの分子量の）モノペグ化タンパク質、（約１４０，０００ダルトンの分子量の）ジペグ化タンパク質などを含むことができる。

このアプローチがPEGと分子量の異なる他のポリマー‐活性作用物質複合体を分離するために使用される一方、このアプローチはタンパク質中に異なるポリマー結合部位を有する位置異性体を分離するのには一般に有効でない。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーは、回収されたPEG-mer組成物のそれぞれが活性作用物質内の異なる反応性アミノ基（例えば、リジン残基）に結合したPEGを含むことができるにもかかわらず、PEG１-mer、2-mer、3-merなどの混合物をお互いに分離するのに使用されることができる。

この型の分離を実施するのに好適なゲルろ過カラムは、Amersham Biosciences(Piscataway, NJ)から入手可能なSuperdex(商標)及びSephadex（商標）を含む。特別なカラムの選択は、所望の分画範囲に依存するであろう。溶出は一般的に、リン酸、酢酸などの好適な緩衝液を使用して実施される。集められた画分は、例えば、（ｉ）タンパク質含量に関する２８０nmにおける吸光度（ＯＤ）、（ｉｉ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質分析、（ｉｉｉ）PEG含量に関するヨード試験（Sims et al.(1980) Anal. Biochem, 107:60-63）（ｉｖ）その後にヨウ化バリウム染色が続くドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS PAGE）などの多くの異なる方法によって分析されることができる。

位置異性体の分離は、逆相‐高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）C18カラム（Amersham Biosciences 又はVydac）を使用する逆相クロマトグラフィー又はAmersham Biosciencesから入手可能なSepharose（商標）イオン交換カラムを使用するイオン交換クロマトグラフィーによって実施される。いずれのアプローチも、同じ分子量を有するポリマー‐活性作用物質異性体（位置異性体）を分離するために使用されることができる。

本明細書に記載のポリマー試薬は、共有結合又は非共有結合によって膜、化学的分離及び精製表面、固相支持体、金、チタニウム、タンタラム、ニオビウム、アルミニウム、スチールなどの金属表面、及びそれらの酸化物、酸化シリコン、（タンパク質、ポリペプチドなどの）高分子、並びに低分子を含む多くの物体に結合されることができる。さらに、ポリマー試薬は、生化学センサー、生物電子工学スイッチ及びゲートにも使用されることができる。ポリマー試薬は、ポリマーコートされた表面及びポリマー移植片の製造のためのペプチド合成のキャリアとしても使用されることができ、アフィニティー分配のためのポリマー‐リガンド結合体の調製のため、架橋又は非架橋ヒドロゲルの調製のため、並びにバイオリアクターのためのポリマー‐補助因子付加物の調製のためにも使用されることができる。

本明細書中で示されるポリマー試薬への結合に使用されるための生理活性物質は、以下の1つ以上であることができる。好適な作用物質は、例えば、催眠剤及び鎮静剤、精神賦活剤、トランキライザー、呼吸器系の薬物、抗痙攣薬、筋肉弛緩剤、抗パーキンソン剤（ドパミンアンタゴニスト）、鎮痛薬、抗炎症剤、抗不安薬、食欲抑制剤、抗偏頭痛薬、筋肉収縮剤、抗感染剤（抗生物質、抗ウイルス剤、抗菌剤、ワクチン）、抗関節炎剤、抗マラリア剤、制吐剤、抗てんかん剤、気管支拡張剤、サイトカイン、成長因子、抗癌剤、抗血栓剤、抗高血圧剤、冠血管薬、抗不整脈薬、抗酸化剤、抗喘息薬、避妊薬を含むホルモン剤、交感神経模倣薬、利尿薬、脂質制御剤、抗アンドロゲン剤、駆虫薬、抗凝固剤、新生物、抗腫瘍剤、血糖降下剤、栄養剤及び補助剤、成長補助剤、抗胃腸炎剤、ワクチン、抗体、診断薬並びに対照薬から選ばれることができる。

より特別には、活性作用物質は、低分子（好ましくは不溶性の低分子）、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、ポリサッカライド、ステロイド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂肪、電解質などを含むがこれらに限られない、数多くの構造上のクラスに分類されることができる。好ましくは、本明細書に記載のポリマーに結合する活性作用物質は、天然アミノ基、或いは本明細書に記載のポリマーに複合化するのに好適な少なくとも１つの反応性アミノ基を有する。

共有結合に好適な活性作用物質の例は、アスパラギナーゼ、アムドキソビル（DAPD）、アンチド（antide）、ベカプレルミン（becaplermin）、カルシトニン、シアノビリン、デニロイキンジフチトックス、エリスロポエチン（EPO）、（PCT国際特許出願公開第WO96/40749号に記載の１０〜４０アミノ酸の長さで特別なコア配列を含むペプチドなどの）EPOアンタゴニスト、ドルナーゼアルファ、赤血球新生刺激性タンパク質（NESP）、第V因子、第VII因子、第VIIa因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XII因子、第XIII因子、フォンウイルブランド因子などの凝固系因子；セレダーゼ（ceredase）、セレチーム（cerezyme）、アルファ‐グルコシダーゼ、コラーゲン、シクロスポリン、アルファデフェンシン(alpha defensin)、ベータデフェンシン、エキセジン‐４（exedin‐４）、顆粒球コロニー刺激因子（GCSF）、トロンボポエチン（TPO）、アルファ‐１プロテイナーゼインヒビター、エルカトニン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GMCSF）、フィブリノーゲン、フィルグラスチム、成長ホルモン、ヒト成長ホルモン（ｈGH）、成長ホルモン放出ホルモン（GHRH）、GRO‐ベータ、GRO‐ベータ抗体、骨形成タンパク質‐２、骨形成タンパク質‐６、OP‐１などの骨形成タンパク質；酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、CD-40リガンド、ヘパリン、ヒト血清アルブミン、低分子量ヘパリン（LMWH）、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロンオメガ、インターフェロンタウ、コンセンサスインターフェロンなどのインターフェロン；インターロイキン‐１受容体、インターロイキン‐２、インターロイキン‐２融合タンパク質、インターロイキン‐１受容体アンタゴニスト、インターロイキン‐３、インターロイキン‐４、インターロイキン‐４受容体、インターロイキン‐６、インターロイキン‐８、インターロイキン‐１２、インターロイキン‐１３受容体、インターロイキン‐１７受容体のようなインターロイキン及びインターロイキン受容体；ラクトフェリン及びラクトフェリン断片、黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH）、インスリン、プロインスリン、（米国特許第５，９２２、６７５号に記載されたようなモノアシル化インスリンなどの）インスリンアナログ、アミリン、C-ペプチド、ソマトスタチン、オクテオチドを含むソマトスタチンアナログ、バソプレシン、卵胞刺激ホルモン（FSH）、インフルエンザワクチン、インスリン様成長因子（IGF）、インスリントロピン、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、アルテプラーゼ、ウロキナーゼ、レテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、パミテプラーゼ、ラノテプラーゼ及びテネテプラーゼなどのプラスミノーゲンアクチベーター；神経成長因子（NGF）、オステオプロテゲリン、血小板由来成長因子、組織成長因子、トランスフォーミング成長因子‐１、血管内皮細胞成長因子、白血病阻害因子、ケラチノサイト成長因子（KGF）、グリア成長因子（GGF）、T細胞受容体、CD分子／抗原、腫瘍壊死因子（TNF）、単球化学誘引タンパク質‐１、内皮細胞成長因子、副甲状腺ホルモン（PTH）、グルカゴン様ペプチド、ソマトトロピン、チモシンアルファ１、ラスブリカーゼ（rasburicase）、チモシンアルファ1IIb/IIIaインヒビター、チモシンベータ１０、チモシンベータ９、チモシンベータ４、アルファ‐１アンジトリプシン、ホスホジエステラーゼ（PDE）化合物、VLA-4（ベリーレイト抗原‐４）、VLA‐４阻害剤、ビスホスポナーテ（bisphosponate）、呼吸器合胞体ウイルス抗体、嚢胞線維症膜貫通制御（CFTR）遺伝子、デオキシリボヌクレアーゼ（Dnase）、細菌／透過性増加タンパク質（BPI）、及び抗‐CMV抗体を含むがこれらに限定されない。例示的なモノクローナル抗体は、エタネルセプト（etanercept）（IgG1のFc部分に連結したヒト７５ｋDTNF受容体の細胞外リガンド結合部分からなる2量体融合タンパク質）、アブシキシマブ（abciximab）、アダリムマブ（adalimumab）、アフェリモマブ（afelimomab）、アレンツズマブ（alemtuzumab）、B‐リンパ球抗体、アトリズマブ（atlizumab）、バシリキシマブ（basiliximab）、ベバシズマブ（bevacizumab）、ビシロマブ（biciromab）、ベルチリムマブ（bertilimumab）、CDP-571、CDP-860、CDP-870、セツキシマブ（cetuximab）、クレノリキシマブ（clenoliximab）、ダクリズマブ（daclizumab）、エクリズマブ（eculizumab）、エドレコロマブ（edrecolomab）、エファリズマブ（efalizumab）、エプラツズマブ（epratuzumab）、フォントリズマブ（fontolizumab）、ガビリモマブ（gavilimomab）、ゲンツズマブオゾガミシン（gemtuzumab ozogamicin）、イブリツモマブチウキセタン（iburitumomab tiuxetan）、インフリキシマブ（infliximab）、イノリモマブ（inolimomab）、ケリキシマブ（keliximab）、ラベツズマブ（labetuzumab）、レルデリムマブ（lerdelimumab）、オリズマブ（olizumab）、放射線標識ｌｙｍ−１、メテリムマブ（metelimumab）、メポリズマブ（mepolizumab）、ミツモマブ（mitumomab）、ムロモナード（muromomad）‐CD3、ネバクマブ（nebcumab）、ナタリズマブ（natalizumab）、オヅリモマブ（odulimomab）、オマリズマブ（omalizumab）、オレゴボマブ（oregovomab）、パリビズマブ（palivizumab）、ペンツモマブ（pemtumomab）、ペキセリズマブ（pexelizumab）、rhuMAb‐VEGF、リツキシマブ（rituximab）、サツモマブペンデチド（satumomab pendetide）、セビルマブ（sevirumab）、シプリズマブ（siplizumab）、トシツモマブ（tositumomab）、I¹³¹トシツモマブ、トラツズマブ（trastuzumab）、ツビルマブ（tuvirumab）、ビシリズマブ（visilizumab）、タクリン（tacrine）、メマンチン（memantine）、リバスチグミン（rivastigmine）、ガランタミン（galantamine）、ドネペジル（donepezil）、レヴェチラセタム（levetiracetam）、レパグリニド（repaglinide）、アトルバスタチン（astorvastatin）、アレファセプト（alefacept）、バルデナフィル（vardenafil）、シルデナフィル（sildenafil）、及びバラシクロビル（valacyclovir）を含む。

共有結合に好適なさらなる作用物質は、アデフォビル（adefovir）、アロセトロン（alosetron）、アミフォスチン（amifostine）、アミオダロン（amiodarone）、アミノカプロン酸、アミノ馬尿酸ナトリウム、アミノグルテチミド、アミノレブリン酸、アミノサリチル酸、アムサクリン（amsacrine）、アナグレリド（anagrelide）、アナストロゾール（anastrozole）、アリピプラゾール（aripiprazole）、アスパラギナーゼ、アンスラサイクリン、ベキサロテン（bexarotene）、ビカルタミド（bicalutamide）、ブレオマイシン、ブセレリン（buserelin）、ブスルファン（busulfan）、カベルゴリン（cabergoline）、カペシタビン（capecitabine）、カルボプラスチン、カルムスチン、クロルアンブシン（chlorambucin）、シラスタチン（cilastatin）ナトリウム、シスプラチン、クラドリビン（cladribine）、クロドロネート（clodoronate）、シクロホスファミド、シプロテロン（cyproterone）、シタラビン（cytarabine）、カンプトテシン、１３−シスレチノイン酸、オールトランスレチノイン酸；ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デフェロキサミン、デキサメタゾン、ジクロフェナック、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキシルビシン、ズタステリド（dutasteride）、エピルビシン、エストラムスチン（estramustine）、エトポシド、エキセメスタン（exemestane）、エゼチミブ（ezetimibe）、フェキソフェナジン、フルダラビン、フルドロコルチゾン（fludrocortisone）、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、フォンダパリヌクス(fondaprinux)、フルベストラント（fluvestrant）、ガンマ‐ヒドロキシブチレート、ゲンシタビン、エピネフリン、L-ドーパ、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ（imatinib）、イリノテカン、イトラコナゾール、ゴセレリン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミソール、リシノプリル（lisinopril）、ロボチロキシン（lovothyroxine）ナトリウム、ロムスチン、メクロレタミン（mechlorethamine）、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、二酒石酸メタラミノール、メトトレキセート、メトクロプラミド、メキシルチン（mexiletine）、マイトマイシン、マイトタン、マイトキサントロン、ナロキソン、ニコチン、ニルタミド、ニチシノン（nitisinone）、オクトレオチド（octreotide）、オキサリプラチン（oxaliplatin）、パミドロネート（pamidronate）、ペントスタチン、ピルカマイシン、ポルフィマー（porfimer）、プレドニソン、プロカルバジン、プロクロルペラジン、オンダンセトロン、パロノセトロン、オキサリプラチン、ラルチトレキセド（raltitrexed）、シロリムス（sirolimus）、ストレプトゾシン、タクロリムス（tacrolimus）、ピメクロリムス（pimecrolimus）、タモキシフェン、テガセロド(tegaserod)、テモゾロミド(temozolomide)、テニポシド、テストステロン、テトラヒドロカンナビノール、サリドマイド、チオグアニン、チオテーパ、トポテカン、トレプロスチニル、トレチノイン、バルデコキシブ、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリコナゾール、ドラセトロン（dolasetron）、グラニセトロン；フォルモテロール（formoterol）、フルチカソン（fluticasone）、ロイプロリド、ミダゾラン（midazolam）、アルプラゾラン（alprazolam）、アンフォテリシンB、ポドフィロトキシン、抗ウイルスヌクレオシド、アロイルヒドラゾン、スマトリプタン（sumatriptan）、エレトリプタン（eletriptan）、エリスロマイシン、オレアンドマイシン、トロルアンドマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、ダベルシン、アジスロマイシン、フルリスロマイシン、ジリスロマイシン、ジョサマイシン、スピロマイシン、ミデカマイシン、ロラタジン、デスロラタジン、ロイコマイシン、ミオカマイシン、ロキタマイシン、アンダジスロマイシン、及びスウィノリドＡのようなマクロライド；シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、トロバフロキサシン、アラトロフロキサシン、モキシフロキシシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、グレパフロキサシン、ガチフロキサシン、ロメフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、ペフロキサシン、アミフロキサシン、フレロキサシン、トスフロキサシン、プルリフロキサシン、イルロキサシン、パズフロキサシン、クリナフロキサシン、及びシタフロキサシンのようなフルオロキノロン；ゲンタマイシン、ネチルミシン、パラメシン、トブラマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン及びストレプトマイシン、バンコマイシン、テイコプラニン、ランポラニン、ミデプラニン、コリスチン、ダプトマイシン、グラミシジン、コリスチメテートのようなアミノグリコシド；ポリミキシンＢ，カプレオマイシン、バシトラシン、ペネムのようなポリミキシン；ペニシリンＧ，ペニシリンＶのようなペニシリナーゼ感受性物質を含むペニシリン；メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フロキサシリン、ナフシリンのようなペニシリナーゼ抵抗性物質；アンピシリン、アモキシシリン、及びヘタシリン、シリン並びにガラムピシリンのようなグラム陰性細菌活性物質；カルベニシリン、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン及びピペラシリンのような抗シュードモナルペニシリン；セフポドキシム、セフプロジル、セフトブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セファロシン、セファピリン、セファレキシン、セフラドリン、セフォキシチン、セファマンドール、セファゾリン、セファロリジン、セファクロール、セファドロキシル、セファログリシン、セフロキシム、セフォラニド、セフォタキシム、セファトリジン、セファセトリル、セフェピム、セフィキシム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォテタン、セフメタゾール、セフタジジム、ロラカルベフ及びモキサラクタム、アズトレオナムなどのモノバクタムのようなセファロスポリン；並びにイミペネム、メロペネム、及びエルタペネムのようなカルバペネム、ペンタミジンイセチオネート、硫酸アルブテロール、リドカイン、硫酸メタプロテレノール、ベクロメタソンジプレピオネート、トリアンシノロンアセタミド、ブデソニドアセトニド、フルチカソン、イプラトロピウムブロマイド、フルニソリド、クロモリンナトリウム、及び酒石酸エルゴタミン；パクリタキセルのようなタキサン；ＳＮ−３８及びチルフォスチンを含むが、これらに限定されない。

本明細書に記載のポリマーに結合するための好ましい低分子は、少なくとも１つの天然のアミノ基を有するものである。このような好ましい分子は、アミノ馬尿酸ナトリウム、アンフォテリシンＢ，ドキソルビシン、アミノカプロン酸、アミノレブリン酸、アミノサリチル酸、二酒石酸メタラミノール、パミドロネート二ナトリウム、ダウノルビシン、レボチロキシンナトリウム、リシノプリル、シラスラチンナトリウム、メキシレチン、セファレキシン、デフェロキサミン及びアミフォスチンを含む。

本明細書に記載のポリマーに結合するための好ましいペプチド又はタンパク質は、ＥＰＯ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、コンセンサスＩＦＮ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ｈＧＨ、インスリン、ＦＳＨ、及びＰＴＨを含む。

上記の例示的な生理活性物質は、適用可能であれば、それらのアナログ、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、異性体及び薬剤として許容可能な塩形態を包含することを意図される。ペプチド及びタンパク質に関しては、本発明は、それらの合成の、組換えの、天然の、グリコシル化、そして非グリコシル化形態並びにそれらの生理活性断片を包含することを意図される。さらに、「活性作用物質」という用語は、複合化する前の活性作用物質並びに複合化後の活性作用物質「残基」を包含することを意図される。

Ｖ．医薬製剤
本発明は、本明細書中に提供される複合体と医薬賦形剤を含む医薬製剤も含む。一般に、複合体自体は、固体の形態（例えば、沈殿）であり、それは固体又は液体のいずれかの好適な医薬賦形剤と併合される。

例示的な賦形剤は、限定されることなく、炭化水素、無機塩、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基及びそれらの組み合わせから成る群から選ばれるものを含む。

糖、アルジトール、アルドン酸のような糖誘導体、エステル化糖、及び／又は糖ポリマーは、賦形剤として存在することができる。具体的な炭化水素賦形剤は、例えば以下の：フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどのようなモノサッカライド；ラクトース、シュークロース、トレハロース、セロビオースなどのジサッカライド；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、でんぷんなどのようなポリサッカライド；マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトールなどのようなアルジトールを含む。

賦形剤は、無機塩又はクエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、及びそれらの組み合わせのような緩衝剤も含むことができる。

製剤は、微生物の増殖を防止し、又は阻止するために抗菌剤を含むこともできる。本発明に関して好適な抗菌剤の非制限的な例は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメルソール、及びそれらの組み合わせを含む。

製剤中には抗酸化剤も存在することができる。抗酸化剤は、酸化を防止するために使用され、それによって複合体又は製剤の他の成分の劣化を防止する。本発明において使用されるための好適な抗酸化剤は、例えば、アスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸ナトリウム、スルホン酸ホルムアルデヒドナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム、およびそれらの組み合わせを含む。

界面活性剤も賦形剤として存在することができる。例示的な界面活性剤は、以下の：「Tween２０」および「Tween８０」のようなポリソルベート、およびF６８およびF８８のような（どちらもBASF、Mount Olive, New Jerseyから入手可能である）プルロニック；ソルビン酸エステル；レシチンおよび他のホルファチジルコリン、（リポソーム形態でないことが好ましいが）ホスファチジルエタノラミンのようなリン脂質、脂肪酸および脂肪エステルのような脂質；コレステロールのようなステロイド；およびEDTA、亜鉛のようなキレート剤および他の好適なカチオンを含む。

酸又は塩基は賦形剤として製剤中に存在することができる。使用可能な酸の非制限的な例は、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、蟻酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、およびそれらの組み合わせから成る群から選ばれる酸を含む。使用可能な塩基の非制限的な例は、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、蟻酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、およびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる塩基を含む。

医薬製剤は、すべての型の製剤、及び特別には再構成可能な散剤並びに懸濁液および溶液などの、注射に適したものを包含する。組成物中の複合体（すなわち、活性作用物質及び本明細書に記載のポリマーの間に形成される複合体）の量は、多くの因子に依存して変化するであろうが、該組成物が単位用量の容器（例えば、バイアル）中に貯蔵される場合に治療的有効用量であることが最適である。さらに、医薬製剤は、シリンジ中に入れられることができる。治療的有効量は、どの量が臨床的に好ましいエンドポイントを生じるかを決定するために、増加する量の複合体を繰り返し投与することにより、実験によって決定されることができる。

組成物中のいかなる個々の賦形剤の量も賦形剤の活性及び組成物の特別な必要性に依存して変化するであろう。典型的には、いかなる個々の賦形剤の最適量も日常の実験、すなわち、（低用量から高用量の）可変量の賦形剤組成物を調製し、安定性及び他のパラメーターを調べ、そして顕著な有害効果を伴わずに最適な成績が達成される範囲を決定すること、を通して決定される。

しかしながら、一般的には、賦形剤は、重量で約１％〜約９９％、好ましくは重量で約５％〜９８％、より好ましくは重量で約１５％〜９５％の量で組成物中に存在し、重量で３０％未満の濃度であることが最も好ましい。

上記医薬賦形剤は他の賦形剤とともに"Remington:The Science & Practice of Pharmacy" 19^th ed., Williams & Williams, (1995), the "Physician's Desk Reference", 52^nded., Medical Economics, Montvale, NJ(1998),及びKibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000中に記載されている。

本発明の医薬製剤は、典型的には、しかし必然的にではないが、注射を介して投与され、したがって一般に投与の直前には液体溶液又は懸濁液である。医薬製剤はまた、シロップ、クリーム、軟膏、錠剤、散剤、などの他の形態をとることもできる。肺内、直腸内、経皮、経粘膜、経口、くも膜下腔内、皮下、動脈内などの他の投与様式も含まれる。

先に記載したとおり、複合体は、静脈内注射によって腸管外に注射、又はより好ましくないが、筋肉内又は経皮注射によって投与されることができる。腸管外投与に好適な剤型は、すぐに注射可能な懸濁液、ビヒクルと使用前に併合するための乾燥不溶性組成物、そして中でも、使用前に希釈するためのエマルジョン及び液体濃縮物を含む。

ｖｉ．投与方法
本発明は、本明細書中に提供された複合体を、該複合体による治療に応答性の状態を患う患者に投与する方法も提供する。該方法は、一般に、（好ましくは医薬製剤の一部として提供される）治療的有効量の複合体を注射によって投与することを含む。投与方法は、上記特別な複合体の投与によって治療され又は予防されるいかなる状態を治療するためにも使用されることができる。当業者は、具体的な複合体がどの状態を効果的に治療することができるかを理解している。投与される実際の用量は、対象の年齢、体重、及び一般的な状態並びに治療される状態の重篤度、健康管理者の判定、及び投与される複合体によって変化するであろう。治療的有効量は当業者に知られており及び／又は適切な参考テキスト及び文献に記載されている。一般に、治療的有効量は、約０．００１mg〜１００mg、好ましくは０．０１mg／日〜７５mg／日の用量、そしてより好ましくは０．１０mg／日〜５０mg／日の用量の範囲である。

（ここでも、好ましくは医薬製剤の一部分として提供される）いかなる複合体の単位用量も医師の判断、患者のニーズなどに依存する多様な投薬スケジュールで投与されることができる。具体的な投薬スケジュールを当業者は知っているであろうし、又は日常の方法を使用して実験により決定されることができる。例示的な投薬スケジュールは、制限されることなく、１日５回の投与、1日４回、1日３回、1日２回、1日１回、一週間に３回、一週間に２回、一週間に１回、一月に１回、そしてそれらのいかなる組み合わせも含む。いったん臨床のエンドポイントが達成されたら、組成物の投薬は停止される。

本発明の複合体を投与することの利益は、個々の水溶性ポリマー部分が切断可能であることである。そのような結果は、ポリマーの大きさによって、体からのクリアランスが潜在的に問題である場合に有益である。最適には、ウレタン、アミド、カーボネート又はエステルを含む結合のような生理的に切断可能及び／又は酵素的に分解可能な結合を使用することを通じて各水溶性ポリマー部分の切断は容易化される。こうして、（個々の水溶性ポリマー部分の切断を介する）複合体のクリアランスは、ポリマー分子の大きさ及び所望のクリアランスの性質を与えるであろう官能基の型を選択することによって、調節されることができる。当業者は、ポリマーの適切な分子サイズ並びに切断可能な官能基を決定することができる。例えば、当業者は、日常の実験を使用して、最初に異なるポリマー重量及び切断可能な官能基を有する多様なポリマー誘導体を調製し、そして（定期的な血液又は尿のサンプリングなどによって）クリアランスプロファイルを得ることにより、適切な分子サイズ及び切断可能な官能基を決定することができる。いったん、各被検複合体について一連のクリアランスプロファイルが得られたら、好適な複合体が同定されることができる。

本発明が、その好ましい具体的実施態様とともに記載される一方、上記の記載並びにそれに続く実施例は例示を意図するものであって、本発明の範囲を限定するものでないことは理解されるべきである。本発明の範囲内の他の側面、利益及び改変は本発明の属する分野の当業者に明らかとなるであろう。

ＶＩＩ．実験
本発明の実施においては特記されない限り、当業者の範囲内の有機合成などの慣用技術を採用する。そのような技術は、文献において完全に説明される。例えば、上記のJ. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992)を参照のこと。

以下の実施例においては、（量、温度などの）数に関する正確性を保障するための努力が払われたが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特記されない限り、温度は摂氏であり、圧力は海面大気圧又はその付近の値である。特記されない限り、すべての試薬は商業的に入手した。特記されない限り、すべての分子量は平均分子量であり、ダルトン（「Da」）の単位で表される。以下の略語は本明細書中で使用される：
DCC−ジシクロヘキシルカルボジイミド
HOBT−１‐ヒドロキシベンゾトリアゾール
MALDI-TOF−マトリックス支援レーザー脱離／イオン化‐飛行時間型
SDS-PAGE−ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動
K−例えば、（２K）のように、分子量を説明する前後関係においては、１，０００を示す。
NMR−核磁気共鳴法

実施例１
ｍPEG（２K Da）‐メチルケトン
方法A：αエーテル結合を有するｍPEG（２K Da）‐メチルケトン

ｍPEG(２K Da)-2‐ヒドロキシプロパンの形成
共沸により乾燥されたmPEG_2Kメシレート（ｍPEG_2KOM、Nektar Therapeutics, 2g, 1ミリモル）の５０mLの無水トルエン溶液に、１，２‐プロパンジオール（1.522g、２０ミリモル）及び水素化ナトリウム（鉱油中６０％、０．８００ｇ、２０ミリモル）を添加した。窒素雰囲気下、反応混合物を８０℃で２０時間攪拌した。不溶性の沈殿をろ過して除き、ろ液を真空下乾燥するまで濃縮した。粗生成物を３ｍLのジクロロメタンに溶解し、１００ｍLのイソプロピルアルコール‐ジエチルエーテル（１：１）混合物で沈殿させた。最終生成物を真空ろ過を使用して集め、そして真空下、一夜乾燥させた。収量：１．４ｇ。NMR（ｄ₆‐DMSO）：１．０１ppm（ｄ，−CH₃，３H）、３．２４ppm（ｓ，‐OCH₃，３H）、３．５１ppm（ｓ，ポリマー骨格）、４．５４ppm（ｄ，‐OH，１H）。

ｍPEG(２K Da)‐メチルケトンの形成
５ｍLの無水ジクロロメタン中の分子ふるい４A(０．５ｇ)、炭酸カリウム（０．３４ｇ，２．４６ミリモル）、及びN‐クロロサクシニミド（０．０３７ｇ，０．２７７ミリモル）の懸濁液へ、攪拌しながら、ｍPEG(２K Da)-2‐ヒドロキシプロパン（０．５ｇ，０．２５ミリモル）及びN‐tert‐ブチルベンゼンスルフェナミド（０．００９ｇ，０．０５０ミリモル）を０℃で順次添加した。反応混合物を同じ温度で２時間攪拌した。次に、減圧下で溶媒を蒸発させて乾燥させた。残渣を２０ｍLの水に溶解し、１０％のH₃PO₄でpHを４．５に調節し、所望の生成物をジクロロメタン（２０ｍL×２）で抽出した。抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮し、そして２０ｍLのイソプロピルアルコールとジエチルエーテル（１：１）の混合物で沈殿させた。沈殿した生成物を真空ろ過によって集め、真空下一夜乾燥させた。収量：０．３５ｇ。NMR（ｄ₆‐DMSO）：２．０４ppm（ｓ，−CH₃，３H）、３．２４ppm（ｓ，‐OCH₃，３H）、３．５１ppm（ｓ，ポリマー骨格）、４．１１ppm（ｓ，‐OCH₂(C=O)-，２H）。

条件によって、ケトンは可変量のケトン及びケトンハイドレートで存在する。ケトン及びケトンハイドレートは、水の存在下で平衡にあり、どちらも（単独又は組み合わせて）ポリマー‐活性作用物質複合体を形成するために使用されることができる。

リゾチームのペグ化
リゾチーム（３．０mg）を１ｍLの２０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．５）に溶解し、mPEG（2K Da）‐メチルケトン（８．４mg，２０倍モル過剰）を添加した。１５分後、NaCNBH₃の０．１５９M溶液（６６μL、５０倍モル過剰）を添加し、そして溶液を室温で17時間攪拌した。SDS-PAGEによる反応混合物の分析は、ペグ化リゾチームが形成されたことを示した。

この実施例は異なる大きさのポリマーを使用して数回繰り返した。最初に、異なる大きさのmPEGメシレートをmPEG_2Kメシレート代わりに使用して異なる大きさの多様なmPEGメチルケトンを提供した。具体的には、以下の異なる大きさのmPEGメシレートを使用した：mPEG_5Kメシレート；mPEG_10Kメシレート；及びmPEG_20Kメシレート。いったん多様な異なる大きさのmPEGメチルケトンが形成されたら、それぞれを上記の方法を用いてリゾチームに複合化させる。mPEG_2Kメチルケトンについて得られたのと同様の結果が得られた。

ｍPEG(５K Da)‐メチルケトン
方法B：αエーテル結合を有するｍPEG(５K Da)‐メチルケトン
エチル２‐ベンジルオキシラクテートの形成

エチルラクテート（８．９０ｇ，７５ミリモル）、ベンジル２，２，２‐トリクロロアセチミデート（２２．７ｇ、９０ミリモル）、無水シクロヘキサン（１００mL）及び無水ジクロロメタン（５０mL）の混合物を攪拌しながら、ここへ徐々にトリフルオロメタンスルホン酸（１．０mL）を添加した。アルゴン雰囲気下、混合物を室温で一夜攪拌した。混合物をろ過し、ろ液を炭酸水素ナトリウムの飽和溶液（２５０mL）、そして水（２５０mL）で洗浄した。そして、溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下、ロータリエバポレーターを使用して蒸留した。残渣を真空分留にかけ、９．６ｇの無色の生成物を得た。NMR（CDCl₃）：１．２１ppm（ｔ，−CH₂CH₃，３H）、１．３２ppm（ｄ，‐CH₂‐，３H）、４．１３ppm（m，‐CH‐及び−CH₂CH₃，３H）、４．５０ppm（ｍ，‐CH₂‐，２H）７．３２ppm（ｍ，５H）。

２‐ベンジルオキシ‐１‐プロパノールの形成
無水テトラヒドロフラン（５６mＬ）中の水素化リチウムアルミニウム溶液（１．０６ｇ、２８ミリモル）を攪拌しながら、ここへ室温、アルゴン雰囲気下で、無水テトラヒドロフラン（３０mＬ）中のエチル‐２‐ベンジルオキシラクテート（９．５ｇ、４５．６ミリモル）の溶液を滴下して３０分の間に添加した。次に、混合物を６０℃で３時間攪拌した。３０℃に冷却後、新たに調製した硫酸ナトリウムの飽和溶液（１０mＬ）をゆっくりと添加した。混合物をろ過し、そして溶液を減圧蒸留した。残渣をジクロロメタン（１００mＬ）に溶解し、そしてその溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸留した。残渣を真空分留にかけ、６．２ｇの無色の液体生成物を得た。NMR（ｄ₆‐DMSO）：１．９０ppm（ｄ，−CH₃，３H）、３．２０〜３．５０ppm（bm，‐CH‐及び，‐CH₂‐，３H）、４．５３ppm（ｓ，‐CH₂‐，２H）、４．６３ppm（ｔ，‐OH，１H）、７．３３ppm（ｍ，５H）。

ｍPEG(５K Da)‐メシレートの形成
トルエン（１５０mL）中のｍPEG(５K Da)‐OH（２５．０ｇ、５ミリモル）の溶液を共沸によって乾燥させ、減圧下、トルエンを蒸留して除去した。乾燥されたｍPEG(５K Da)‐OHを無水トルエン（１５０mＬ）及び無水ジクロロメタン（３０mL）の混合物に溶解した。次に、トリエチルアミン（０．９mL、６．５ミリモル）及びメタンスルホニルクロライド（０．４５mL、５．８ミリモル）を添加し、混合物を窒素雰囲気下、室温で一夜攪拌した。溶媒を減圧下、蒸留により除去した。その後、残渣をジクロロメタン（４０mL）に溶解し、６５０mLのイソプロピルアルコールを添加した。混合物を０℃で３０分間攪拌し、沈殿した生成物をろ過により除去し、真空乾燥させて、２２gのメシレート誘導体を得て、NMRにより、１００％置換されたことが示された。

ｍPEG(５K Da)‐ベンジルオキシプロパンの形成

トルエン（１５０mL）中のｍPEG(５K Da)‐メシレート（１５ｇ、３ミリモル）の溶液を共沸によって乾燥させ、減圧下、トルエンを蒸留して除去した。乾燥されたｍPEG(５K Da)‐メシレートを無水トルエン（１５０mL）に溶解し、２−ベンジルオキシ‐１‐プロパノール（１．５ｇ、９ミリモル）そして水素化ナトリウム（鉱油中６０％分散、０．３６ｇ、９ミリモル）を添加し、反応混合物を窒素雰囲気下、８５℃で一夜攪拌した。室温に冷却後、混合物をろ過し、そして溶媒を減圧下、蒸留して除去した。残渣をジクロロメタン（２０mL）に溶解し、３５０mLのイソプロピルアルコールで０〜５℃において沈殿させた。沈殿した生成物をろ過して除き、減圧乾燥した。収量：１２．７ｇ。NMR（ｄ₆‐DMSO）：１．１０ppm（ｄ，−CH₃，３H）、３．２４ppm（ｓ，‐OCH₃，，３H）、３．５１ppm（ｓ，ポリマー骨格）、４．５３ppm（ｓ，‐CH₂‐，２H）、７．３３ppm（ｍ，５H）。

ｍPEG(５K Da)‐２‐ヒドロキシプロパンの形成

ｍPEG(５K Da)‐２‐ベンジルオキシプロパン（８．８ｇ）、エチルアルコール（１２０mL）及びパラジウム（活性炭素上１０％、０．８ｇ）の混合物を４５psiの水素下で一夜水素化した。混合物をろ過し、そして溶媒を減圧下で蒸留して除去した。粗生成物をジクロロメタン（１５mＬ）に溶解し、そして０〜５℃において３００mＬのイソプロピルアルコールで沈殿させた。沈殿した生成物をろ過して除き、減圧乾燥した。収量：６．１ｇ。NMR（ｄ₆‐DMSO）：１．０１ppm（ｄ，−CH₃，３H）、３．２４ppm（ｓ，‐OCH₃，，３H）、３．５１ppm（ｓ，ポリマー骨格）、４．５４ppm（ｄ，‐OH，１H）。

ｍPEG(５K Da)‐メチルケトンの形成

ｍPEG(５K Da)‐２‐ヒドロキシプロパン（４．０ｇ）をジクロロメタン（２０mＬ）中のDess-Martinパーヨージナン（０．４４ｇ）の溶液に添加し、混合物を室温で６時間攪拌した。次に、溶媒を減圧蒸留により除去した。残渣を温かいイソプロピルアルコール（１００mＬ）に溶解し、エチルエーテル（５０mＬ）を添加した。混合物を１５分間攪拌した。沈殿した生成物をろ過して除き、減圧下乾燥させた。収量：３．２ｇ。NMR（ｄ₆‐DMSO）：２．０４ppm（ｓ，−CH₃，３H）、３．２４ppm（ｓ，‐OCH₃，，３H）、３．５１ppm（ｓ，ポリマー骨格）、４．１１ppm（ｓ，‐OCH₂(C=O)-，２H）。

リゾチームのペグ化
リゾチーム（３．０ｇ）を１mＬの２０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．５）に溶解し、ｍPEG(５K Da)‐メチルケトン（７．５mg）を添加した。１５分後、NaCNBH₃の０．１M溶液（４２μl）を添加し、溶液を室温で１８時間攪拌した。SDS-PAGEによる反応混合物の分析は、ペグ化リゾチームが形成されたことを示した。

この実施例は、ことなるサイズのポリマーを使用して数回繰り返す。最初に、異なるサイズのmPEGメシレートをmPEG_5kメシレートの代わりに使用して、異なるサイズの多様なmPEGメチルケトンを提供する。具体的には、以下の異なるサイズのmPEGメシレートを使用する：mPEG_2Kメシレート；mPEG_10Kメシレート；及びmPEG_20Kメシレート。いったん多様な異なる大きさのmPEGメチルケトンが形成されたら、それぞれを上記の方法を用いてリゾチームに複合化させる。mPEG_5Kメチルケトンについて得られたのと同様の結果が得られた。

実施例３
ｍPEG(５K Da)‐ピペリドン及びその対応するケトンハイドレート

mPEG‐ピペリドンの形成
ジクロロメタン（２０mL）中のｍPEG(５K Da)‐プロピオン酸のサクシニミジルエステル（Nektar Therapetics, mPEG_5k-SPA, １．０ｇ、２ミリモル）の溶液に、トリエチルアミン（０．０８４mＬ、６ミリモル）及び４‐ピペリドンモノハイドレートハイドロクロライド（０．０７７ｇ、５ミリモル）を添加した。窒素雰囲気下、反応混合物を室温で一夜攪拌した。不溶性の沈殿をろ過し、ろ液を乾燥するまで蒸発させた。粗生成物をジクロロメタンに溶解し、イソプロピルアルコールで沈殿させた。最終的な生成物を真空ろ過により集め、真空下、一夜乾燥させた。収量：０．８８ｇ。NMR（ｄ₆‐DMSO）：２．３２ppm（ｔ，−CH₂‐C(OH)₂‐CH₂‐）、２．４２ppm（ｔ，‐CH2‐C(OH)₂CH₂‐）、２．６６ppm（ｔ，‐OCH₂CH₂CON‐）、３．２４ppm（ｓ，‐OCH₃）、３．５１ppm（ｓ，ポリマー骨格）。

リゾチームのペグ化
タンパク質リゾチームをモデルとして、あるポリマー試薬のタンパク質との複合体を形成する能力を実証する。リゾチームは、６個のリジン残基を有する１２９アミノ酸の分泌酵素であり、リジン残基のそれぞれはアミン残基で終端する側鎖を有する。アミン残基は本発明のポリマー試薬のための潜在的な結合部位である。

トリ卵白からのリゾチーム（３mg、Sigma, St. Louis, MO, 製品番号L-6876）を１mＬの２０mＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．５、J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）に溶解した。実施例３のmPEG_5k‐ケトン(２１mg、リゾチームに対して２０倍モル過剰)をリゾチーム溶液に添加した。バイアルを低速に設定したRoto Mix（商標）オービタルシェーカー（Thermolyne Corp., Dubuque, IA）にバイアルを置き、反応を室温で進行させた。１５分後、０．０６６ｍLの１５９mM NaCNBH₃（たとえば、Aldrich, St. Louis, MO, 製品番号15,615-9）を添加した。この量のNaCNBH₃は、リゾチームに対して５０倍モル過剰を表す。アリコート（２０μL）を一定の間隔をおいて（１７時間及び４１時間）反応混合物から引き出し、１０％トリス‐HClReadyゲル（商標）プレキャストゲルに基づくプレキャストゲル電気泳動システム（どちらもBio-Rad Laboratories, Hercules CAから入手可能）を使用するSDS-PAGE及びOmniFLEX（登録商標）MALDI-TOFマススペクトロメーター（Bruker Daltonics, Inc., Bellerica, MA）を使用するMALDI-TOFマススペクトロメトリーによって分析した。SDS-PAGE分析は、１、２、及び３個のPEG分子が結合したリゾチームのPEG誘導体の存在を示した。MALDI-TOFマススペクトロメトリーは、分子量がおよそ５０００Da異なる、１９，６６０Da、２５，０６９Da，及び３０，５６８Daに３つのリゾチームのペグ化誘導体のピークを示す。MALDI-TOFによる未修飾リゾチームの分子量は、１４，１９８Daである。

この実施例は、異なるサイズのポリマーを使用して数回繰り返す。最初に、異なるサイズのmPEG−SPAをmPEG_5k‐SPAの代わりに使用して、異なるサイズの多様なmPEGピペリドンを提供する。具体的には、以下の異なるサイズのmPEGメシレートを使用する：mPEG_2Kメシレート；mPEG_10Kメシレート；及びmPEG_20Kメシレート。いったん多様な異なる大きさのmPEGピペリドンが形成されたら、それぞれを上記の方法を用いてリゾチームに複合化させる。mPEG_5K‐ピペリドンについて得られたのと同様の結果が得られた。

実施例４
mPEGメチルケトン
方法C：βカルバミド基を有するmＰＥＧ(5ＫＤａ)メチルケトン

レブリン酸（０．０７ｇ、６ミリモル）を無水ジクロロメタン（２０mL）に溶解する。次に、mPEG(５K Da)‐アミン（Nektar Therapeutics、２．０ｇ、４ミリモル）、トリエチルアミン（０．０２８mL、２ミリモル）、１‐ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．０２７ｇ、２ミリモル）、及び1，３‐ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．１２ｇ、６ミリモル）を添加した。反応混合物を窒素雰囲気下、室温で一夜攪拌した。不溶性の沈殿をろ過により除き、ろ液を乾燥するまで蒸発させた。粗生成物をジクロロメタンに溶解し、そしてイソプロピルアルコール（５０mL）で沈殿させた。最終的な生成物を真空ろ過によって集め、真空下で一夜乾燥させた。収量：１．７２ｇ。NMR（ｄ₆‐DMSO）：２．２８ppm（ｔ，−NH‐COCH₂CH₂COCH₃、２H）、２．３２ppm（ｓ，‐CH₃、３H）、２．６２ppm（ｔ，NH‐COCH₂CH₂COCH₃，2H）、３．１６ppm（ｑ，‐CH₂CH₂NH-CO‐，2H）、３．２４ppm（ｓ，‐OCH₃，３H）、３．５１ppm（ｓ，ポリマー骨格）、７．８７ppm（ｔ、‐NH‐CO‐CH₂‐，1H）。

リゾチームのペグ化
リゾチーム（３．０mg）を１mLの２０mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH７．５)に溶解し、この実施例から調製したmPEG(5Ｋ Da)ケトン（２１mg、２０倍過剰）を添加した。１５分間攪拌後、０．１５９MのNaCNBH₃（６６μL、５０倍モル過剰）を添加し、そして溶液を室温で２０時間攪拌した。SDS-PAGEによる反応混合物を分析は、ペグ化リゾチームが形成されたことを示した。

この実施例は、異なるサイズのポリマーを使用して数回繰り返す。最初に、異なるサイズのmPEG−アミンをmPEG_5k‐アミンの代わりに使用して、βカルバミド基を有する異なるサイズの多様なmPEGメチルケトンを提供する。具体的には、以下の異なるサイズのmPEG-アミンを使用する：mPEG_2K-アミン；mPEG_10K-アミン；及びmPEG_20K-アミン。いったんβカルバミドを有する多様な異なる大きさのmPEGメチルケトンが形成されたら、それぞれを上記の方法を用いてリゾチームに複合化させる。βカルバミド基を有するmPEG_5K‐メチルケトンについて得られたのと同様の結果が得られた。

実施例５
エトキシル化を介するPEG２ケトン（リンカーを有さないPEG２ケトン）：PEG2(6K Da)ケトン
２‐ベンジルオキシ‐１，３‐ビス（ω‐ヒドロキシポリ（エチレングリコール））プロパン

Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)から入手可能な2‐ベンジルオキシグリセロールをエトキシル化して２‐ベンジルオキシ‐１，３‐ビス（ω‐ヒドロキシポリ（エチレングリコール））プロパン、MW=６K Daを形成した。上記の構造中の変数（ｍ）は、３，０００ダルトンの重量のポリマーを提供するための数であり、それにより基本的に６，０００ダルトンの総重量を提供する。生成物のNMR分析により、その構造を確認し、HPLC及びGPC分析によりその純度及び分子量を確認した。このポリマーは以下に示す反応スキームによって形成されるケトンのための原料として使用した。

２‐ベンジルオキシ‐１，３‐ビス（ω‐ヒドロキシポリ（エチレングリコール））プロパン、MW=６K Daのメチル化

４００mLのトルエン中の２‐ベンジルオキシ‐１，３‐ビス（ω‐ヒドロキシポリ（エチレングリコール））プロパン、MW=６K Da（１０ｇ、１．６７ミリモル）を、減圧下でトルエンを蒸留して除くことによって共沸により乾燥した。残渣を７００mLの無水トルエンに再溶解した。その溶液にカリウムtert-ブトキシド（tert−ブタノール中１．０M溶液、１６mＬ、１６．７ミリモル）およびメチルp-トルエンスルホン酸（３．５mL、２３．３ミリモル）を添加した。反応混合物を窒素雰囲気下、４５℃で一夜攪拌した。混合物をろ過し、減圧下、ろ液を乾燥するまで蒸発させた。残渣を５００mLのH₂Oに溶解し、NaCl（５０ｇ）を添加し、そして溶液のpHを７．５に調節した。生成物をジクロロメタン（２５０mL×２）で抽出した。抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下で濃縮して生成物をイソプロピルアルコールとジエチルエーテルの混合物（７：３、５００mL）で沈殿させた。次に、生成物を真空下、一夜乾燥させた。収量：７．８ｇ。NMR（ｄ₆‐DMSO）：３．２４ppm（ｓ，‐OCH₃，６H）、３．５１ppm（ｓ，ポリマー骨格）、４．６１ppm（ｓ，‐OCH₂C₆H₅，２H）、７．３３ppm（ｍ，‐OCH₂C₆H₅，5H）。

２‐ヒドロキシ‐１，３‐ビス（ω‐ヒドロキシポリ（エチレングリコール））プロパンの形成

２‐ベンジルオキシ‐１，３‐ビス（ω‐ヒドロキシポリ（エチレングリコール））プロパン、MW=6K Da（５．０ｇ、０．８３ミリモル）を１００mＬのエチルアルコールに溶解し、そして、Pd(OH)₂（活性炭上５％、０．２５ｇ）及びシクロヘキサン（０．８４mL、８．３ミリモル）を添加した。懸濁液を２時間還流した。触媒をろ過し、乾燥するまでろ液を蒸発させた。残渣をジクロロメタン（５mＬ）に溶解、３００mLのジエチルエーテルで沈殿させた。最終的な生成物を真空ろ過によって集め、真空下、一夜乾燥させた。収量：４．６ｇ。NMR（ｄ₆‐DMSO）：３．２４ppm（ｓ，‐OCH₃，６H）、３．５１ppm（ｓ，ポリマー骨格）、４．７６ppm（ｄ，‐CH-OH，１H）。

mPEG2‐(６K Da)-ケトンの形成

ジクロロメタン(２０mL)中のDess-Martinパーヨージナンの溶液を攪拌しながら、ここへ２‐ヒドロキシ‐１，３‐ビス（ω‐メトキシポリ（エチレングリコール））プロパン、MW=6K Da（４．０ｇ、０．６７ミリモル）を添加した。反応混合物を室温で６時間攪拌した。その後、それを濃縮し、生成物をイソプロピルアルコールとジエチルエーテルの混合物（２：１、３００mL）で沈殿させた。沈殿を真空ろ過により集め、真空下、一夜乾燥させた。収量：３．８ｇ。NMR（ｄ₆‐DMSO）：３．２４ppm（ｓ，‐OCH₃，６H）、３．５１ppm（ｓ，ポリマー骨格）、４．２２ppm（ｓ，‐O-CH₂-C=O，４H）。

リゾチームのペグ化
リゾチーム（３．０mg）を１mLの２０mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH７．５)に溶解し、mPEG2‐(６Ｋ Da)ケトン（２５mg、２０倍過剰）を添加した。１５分間攪拌後、０．１５９MのNaCNBH₃（１０５μL、５０倍モル過剰）を添加し、そして溶液を室温で２０時間攪拌した。SDS-PAGEによる反応混合物を分析は、ペグ化リゾチームが形成されたことを示した。

この実施例は、異なるサイズのmPEG2‐(６Ｋ Da)ケトンを使用して数回繰り返す。以下の異なるサイズのmPEG2‐(６Ｋ Da)ケトンを使用する：mPEG2‐(１０Ｋ Da)‐ケトン；mPEG2‐(２０Ｋ Da)‐ケトン；及びmPEG2‐(４０Ｋ Da)‐ケトン。それぞれの場合において、mPEG2‐(６Ｋ Da)‐ケトンについて得られたのと同様の結果が得られた。

実施例６
mPEG2‐(４０Ｋ Da)‐ピペリドン及びその水和物
mPEG2‐(４０Ｋ Da)‐ピペリドン及びその水和物の形成

ジクロロメタン（２００mL）中のPEG2‐(４０K Da)酸のサクシニミジルエステル（Nektar Therapeutics, １０g、０．２５ミリモル）の溶液に、トリエチルアミン（０．１００ml、０．７２ミリモル）及び４‐ピペリドンモノハイドレートハイドロクロライド（０．１００ｇ、０．６５ミリモル）を添加した。窒素雰囲気下、反応混合物を室温で一夜攪拌した。次に、溶媒を減圧下、蒸留して除いた。残渣をジクロロメタンに溶解し、イソプロピルアルコールとエチルエーテルの混合物で沈殿させた。生成物を真空ろ過により集め、真空下、一夜乾燥させた。収量：９．５ｇ。NMR（ｄ₆‐DMSO）：２．３３ppm及び２．４３ppm（ｔ，‐CH₂-C(OH)₂-CH₂-，4H）、３．２４ppm（ｓ，‐OCH₃，６H）、３．５１ppm（ｓ，ポリマー骨格）、４．３６ppm（ｍ，‐CH₂OCONH-，４H）、７．１８ppm（ｔ，−NH-リジン，１H）、８．０４ppm（ｄ，-NH-リジン，１H）。

上記のスキームにより示すとおり、ケトンは可変量のケトン及びケトンハイドレートで存在する。ケトン及びケトンハイドレートは、水の存在下で平衡にあり、どちらも（単独又は組み合わせて）ポリマー‐活性作用物質複合体を形成するために使用されることができる。
リゾチームのペグ化
リゾチーム（３．０mg）を１mLの２０mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH７．５)に溶解し、PEG２(40Ｋ Da)‐ピペリドン（１６８mg、２０倍過剰）を添加した。１５分間攪拌後、０．１５９MのNaCNBH₃（６６μL、５０倍モル過剰）を添加し、そして溶液を室温で２０時間攪拌した。SDS-PAGEによる反応混合物を分析は、ペグ化リゾチームが形成されたことを示した。

実施例７
PEG2ケトン：２つのαアミノリンカーを有するmPEG2（40K Da）‐ケトン

アセトニトリル（５０ml）中のmPEG（20K Da）カルボン酸（１２ｇ、０．６ミリモル）の溶液中へ１，３‐ジアミノアセトンジヒドロクロライドモノハイドレート（０．０５４ｇ、０．３ミリモル）及び４‐（ジメチルアミノ）ピリジン（０．９０９ｇ）を添加した。窒素雰囲気下、反応混合物を室温で４８時間攪拌した。次に、溶媒を減圧下で蒸留して除いた。残渣をジクロロメタンに溶解し、イソプロピルアルコール及びエチルエーテルの混合物で沈殿させた。最終的な生成物を真空ろ過により集め、真空下、一夜乾燥させた。収量：９．５ｇ。NMR（ｄ₆‐DMSO）：３．２４ppm（ｓ，‐OCH₃，６H）、３．５１ppm（ｓ，ポリマー骨格）、４．００ppm（ｓ，‐OCH₂CONH-，４H）、４．２９ppm（ｄ，−NH-CH₂(C=O)CH₂-NH-，２H）、６．６８ppm（ｔ，-NH-CH₂(C=O)CH₂-NH-，２H）。

実施例８
mPEG(５K Da)メチルケトン、方法A：αアミノリンカーを有するmPEG(５K Da)‐メチルケトン

アセトニトリル（１００ml）中のmPEG（５K Da）カルボン酸（１０ｇ、２ミリモル）のサクシニミジルエステルの溶液中へ１‐アミノ‐２‐プロパノール（０．９ｇ、１２ミリモル）及び４‐（ジメチルアミノ）ピリジン（１．５ｇ）を添加した。窒素雰囲気下、反応混合物を室温で一夜攪拌した。次に、溶媒を減圧下で蒸留によって除いた。残渣を２００mlの蒸留水に溶解した。NaCl（３０ｇ）を添加し、生成物をジクロロメタン（８０及び４０mL）で抽出した。抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した。その後、生成物をイソプロピルアルコール及びエチルエーテルの混合物で沈殿させ、真空ろ過により集め、真空下、一夜乾燥させた。収量：９．５ｇ。

上記の生成物（７．０ｇ、１．４ミリモル）をジクロロメタン（７０mL）に溶解し、Dess-Martin パーヨージナン（１．１７ｇ）を添加した。窒素雰囲気下、反応混合物を室温で一夜攪拌した。次に、反応混合物を１５％−NaCl溶液（２００mL）で洗浄し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして減圧濃縮した。その後、生成物をイソプロピルアルコールとエチルエーテルの混合物で沈殿させ、６．２ｇの白色固体を減圧下の乾燥後に得た。NMR（ｄ₆‐DMSO）：２．０８ppm（ｓ，-CH₃，３H）、３．２４ppm（ｓ，‐OCH₃，３H）、３．５１ppm（ｓ，ポリマー骨格）、３．９４ppm（ｓ，‐OCH₂CONH-，２H）、３．９７ppm（ｄ，−NH-CH₂(C=O)-，２H）、７．９８ppm（ｔ，-NH-CH₂(C=O)-，１H）。

実施例９
（αエーテル結合を有する）PEG(5K Da)‐α‐ヒドロキシ‐ω‐２‐プロパノンジエチルケタール
エチルピルベートジエチルケタールの形成
エチルピルベート（１３．９２ｇ、０．１２０モル）、トリエチルオルトホルメート（１９．４４ｇ、０．１３１モル）、エチルアルコール（９．０ｇ）、及びｐ−トルエンスルホン酸モノハイドレート（０．０４３２ｇ、０．００２２７モル）を窒素雰囲気下、４５℃で一夜攪拌した。次に、室温に冷却後、Na₂CO₃（１．２０ｇ）を添加し、混合物を１５分間攪拌した。反応混合物をろ過し、エチルアルコール及び残留するトリエチルオルトホルメートを減圧下、蒸留して除いた。残渣を真空分留にかけ、１８．２ｇの純粋なエチルピルベートジエチルケタールを得た。NMR（ｄ₆‐DMSO）：１．２７ppm（ｔ，-CH₃，エチル（ケタール）、６H）、１．３４ppm（ｔ，‐CH₃，エチル（エステル），３H）、１．４０ppm（ｓ，−CH₃-C-COO−，３H）、３．４５ppm（ｑ，‐OCH₂CH₃，（ケタール），４H）、４．２９ppm（ｑ，−OCH₂CH₃，（エステル），２H）。

２，２‐ジエトキシプロパン‐１‐オルの形成
エチルエーテル（６０mL）中のエチルピルベートジエチルケタール（１６．０ｇ、０．０８４モル）の溶液を３０分間、滴下してエチルエーテル（１５０mL）中の水素化リチウムアルミニウム（１．９０ｇ、０．０５０モル）に攪拌しながら添加した。次に混合物を窒素雰囲気下、室温で１時間攪拌した。硫酸ナトリウムの飽和溶液（２０mL）を添加し、そして混合物を１５分間、撹拌した。そして混合物をろ過し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を蒸留により除去した。残渣を真空分留にかけ、９．５ｇの純粋な２，２‐ジエトキシプロパン‐１‐オルを得た。NMR（ｄ₆‐DMSO）：１．１７ppm（ｔ，-CH₃，エチル（ケタール）、６H）、１．３１ppm（ｓ，‐CH₃-C=CH₂OH，３H）、３．３７ppm（ｑ，‐OCH₂CH₃，（ケタール），４H）、３．８６ppm（ｄ，-CH₂OH，２H）、４．４５ppm（ｔ，−OH，１H）。

PEG(5K Da)- α‐ヒドロキシ‐ω‐２‐プロパノンジエチルケタール

２，２‐ジエトキシプロパン‐１‐オル（０．３６６ｇ、０．００２４７モル）、THF(２００mL)，及びナフタレンカリウム0.3モル／L-テトラヒドロフラン（THF）溶液（２０mL、０．００６モル）をガラスの反応容器に添加して、窒素雰囲気下、３時間攪拌した。この溶液にエチレンオキシド（１２．６ｇ、０．２８６モル）を添加し、反応混合物を室温で４８時間攪拌した。次に、混合物を窒素パージして、０．１Mリン酸緩衝液（pH＝８、１５０ml）を添加した。THF層を分離し、捨てた。ナフタレンを溶液からエチルエーテル抽出によって除去した。生成物をジクロロメタン（３×１００mＬ）で残渣から抽出した。抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、約５０mLに濃縮した。次に、エチルエーテル（３００mL）を添加し、混合物を０℃で１５分間攪拌した。沈殿した生成物をろ過して除き、減圧下で乾燥させた。上記の構造中の変数（ｍ）は、５，０００ダルトンの重量のポリマーを与える数である。収量１１．７ｇ。NMR（ｄ₆‐DMSO）：１．１７ppm（ｔ，-CH₃，エチル（ケタール）、６H）、１．３１ppm（ｓ，‐CH₃-C-CH₂O-，３H）、３．５１ppm（ｓ，ポリマー骨格）、４．５７ppm（ｔ，−OH，１H）。

リゾチームのペグ化
リゾチーム（３．０mg）を１mLの２０mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH５．０)に溶解し、PEG(５Ｋ Da)‐α‐ヒドロキシ‐ω‐２‐プロパノンジエチルケタール（２１mg、２０倍過剰）を添加した。１５分間攪拌後、０．１５９MのNaCNBH₃（６６μL、５０倍モル過剰）を添加し、そして溶液を室温で２０時間攪拌した。SDS-PAGEによる反応混合物の分析は、ペグ化リゾチームが形成されたことを示した。

この実施例は、異なるサイズのmPEG(５Ｋ Da)‐α‐ヒドロキシ‐ω‐２‐プロパノンジエチルケタールを使用して数回繰り返す。以下の異なるサイズのmPEG(５Ｋ Da)‐α‐ヒドロキシ‐ω‐２‐プロパノンジエチルケタールを使用する：mPEG(２Ｋ Da)‐α‐ヒドロキシ‐ω‐２‐プロパノンジエチルケタール；mPEG(10Ｋ Da)‐α‐ヒドロキシ‐ω‐２‐プロパノンジエチルケタール；mPEG(20Ｋ Da)‐α‐ヒドロキシ‐ω‐２‐プロパノンジエチルケタール；及びmPEG(40Ｋ Da)‐α‐ヒドロキシ‐ω‐２‐プロパノンジエチルケタール。それぞれの場合において、mPEG(５Ｋ Da)‐α‐ヒドロキシ‐ω‐２‐プロパノンジエチルケタールについて得られたのと同様の結果が得られた。

実施例１０
ポリマー‐EPO複合体‐ランダムにペグ化されたEPOの調製
（E.coli、チャイニーズハムスター卵母細胞のような哺乳動物細胞、又は他の供給源により産生された）組替えエリスロポエチン、「EPO」を（実施例２において記載されたように調製された）mPEG（５K）−メチルケトンと結合させる。

EPO（２ｍｇ以下）を１mlの５０mMリン酸緩衝液（pH７．６）に溶解し、mPEG(5K)‐メチルケトンをEPOモル濃度の５倍で添加する。還元剤、NaCNBH₃を添加し、そして溶液を室温で２４時間攪拌して、mPEG(5K)‐メチルケトン試薬をアミン結合を介してタンパク質に結合させる。

ペグ化の程度を決定するために、反応混合物をSDS-PAGEで分析する。１‐mer、２‐merなどのペグ化の程度を、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化‐飛行時間型（MALDI-TOF）マススペクトロメトリーによって確認する。未処置及びモノペグ化種について表されたピークは、およそ５，０００ダルトン違っている。得られた反応混合物は、天然及びモノペグ化タンパク質の混合物を含んでいる。PEG試薬のタンパク質に対する比率が増加すると、ポリペグ化の程度が増加する、すなわち、２−mer、３−merなどの形成が増加する。

上記のことは、ペグ化EPO生成物の分布を得るための、本発明を例解するタンパク質のランダムなペグ化を実証する。所望により、反応混合物は、個々の異性体を単離するために、以下に説明されるようにさらに分離されることができる。

異なる分子量を有するPEG複合体は、ゲルろ過クロマトグラフィーによって分離される。異なるPEG複合体（１-mer、２‐mer、３‐merなど）はそれらの異なる分子量(この場合には、約５，０００ダルトンずつ変化する)に基づいて分画される。具体的には、分離は、観察された分子量範囲内の生成物の効果的な分離に適した一連のカラム系、たとえば、Superdex（商標）２００カラム（Amersham Biosciences）、を使用して実施される。生成物は１０mlの酢酸緩衝液を用いて１．５ｍｌ／分の流速で溶出される。集めた画分（１ml）を２８０nmにおける吸光度によってタンパク質含量を、そしてヨード試験によってPEG含量（Sims et al. (1980) Anal. Biochem. 107:60-63）を分析する。さらに、結果は、SDS PAGEゲルに流し、そしてヨウ化バリウムで染色することによって可視化することができる。溶出されたピークに相当する画分を集め、膜を用いる限外濾過によって濃縮し、そして凍結乾燥する。この方法により、同じ分子量を有する複合体の分離／精製を行うが、同じ分子量を有するが、異なるペグ化部位を有する複合体（すなわち、位置異性体）の分離はできない。

位置異性体の分離は、RP-HPLC C18カラム（Amersham Biosciences 又はVydac）を使用する逆相クロマトグラフィーによって実施することができる。この方法は、同じ分子量を有するPEG-生体分子異性体を分離するために有効である。逆相クロマトグラフィーは、RP-HPLC C18調製用カラムを使用し、そして水／０．０５％TFA（溶出液A）及びアセトニトリル／０．０５％TFA（溶出液B）のグラディエントによって行う。

溶出されたピークに相当する画分を集め、蒸発させてアセトニトリルとTFAを除去し、続いて溶媒を除去して、それぞれの位置のPEG異性体を単離する。

実施例１１
ポリマー‐EPO複合体‐N末端がペグ化されたEPOの調製
（E.coli、チャイニーズハムスター卵母細胞のような哺乳動物細胞、又は他の供給源により産生された）組替えエリスロポエチン、「EPO」を（実施例２において記載されたように調製された）mPEG（５K）−メチルケトンと結合させる。

EPO（２ｍｇ以下）を１mlの０．１mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH５）に溶解し、mPEG(5K)‐メチルケトンをEPOモル濃度の５倍で添加する。還元剤、NaCNBH₃を添加し、そして溶液を４℃で２４時間攪拌して、mPEG(5K)‐メチルケトン試薬をアミン結合を介してタンパク質に結合させる。

ペグ化の程度を決定するために、反応混合物をSDS-PAGEで分析する。１‐mer、２‐merなどのペグ化の程度を、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化‐飛行時間型（MALDI-TOF）マススペクトロメトリーによって確認する。天然及びモノペグ化種について表されたピークは、およそ５，０００ダルトン違っている。得られた反応混合物は、未処置及びモノペグ化タンパク質の混合物を含んでいる。モノペグ化種をカラムクロマトグラフィーにより精製して、遊離のEPO及びより分子量の大きな種を除去する。

N-末端ペグ化の確認を、ペプチドマッピングにより行う。PEG：タンパク質の比率が増加すると、ペグ化の程度が増加し、ポリペグ化タンパク質が生じる。

上記のことは、圧倒的にN末端が１回ペグ化されたタンパク質を得るための、本発明の例解的なタンパク質のペグ化を実証する。

実施例１２
GCSFのN−末端のペグ化
（E.coli、チャイニーズハムスター卵母細胞のような哺乳動物細胞、又は他の供給源により産生された）組替え顆粒球コロニー刺激因子、「GCSF」を（実施例８において記載されたように調製された）mPEG（５K）−メチルケトンと結合させる。

GCSF（２ｍｇ以下）を１mlの０．１mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH５）に溶解し、（実施例２からの）mPEG(5K)‐メチルケトンをGCSFモル濃度の５倍で添加する。還元剤、NaCNBH₃を添加し、そして溶液を４℃で２４時間攪拌して、mPEG(5K)‐メチルケトン試薬をアミン結合を介してタンパク質に結合させる。

ペグ化の程度を決定するために、反応混合物をSDS-PAGEで分析する。１‐mer、２‐merなどのペグ化の程度を、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化‐飛行時間型（MALDI-TOF）マススペクトロメトリーによって確認する。天然及びモノペグ化種について表されたピークは、およそ５，０００ダルトン違っている。得られた反応混合物は、主に未処置及びモノペグ化GCSFの混合物を含んでいる。モノペグ化種をカラムクロマトグラフィーにより精製して、遊離のGCSF及びより分子量の大きな種を除去する。N-末端ペグ化の確認を、ペプチドマッピングにより行う。PEG：タンパク質の比率が増加すると、ペグ化の程度が増加し、ポリペグ化タンパク質が生じる。

実施例１３
インターフェロンαのN−末端ペグ化
（E.coli、チャイニーズハムスター卵母細胞のような哺乳動物細胞、又は他の供給源により産生された）組替えインターフェロン‐アルファ、「IFN-α」（実施例８において記載されたように調製された）mPEG（５K Da）−メチルケトンと結合させる。

IFN‐α（２ｍｇ以下）を１mlの０．１mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH５）に溶解し、（実施例２からの）mPEG(5K)‐メチルケトンをIFN- αモル濃度の５倍で添加する。還元剤、NaCNBH₃を添加し、そして溶液を４℃で２４時間攪拌して、mPEG(5K Da)‐メチルケトン試薬をアミン結合を介してタンパク質に結合させる。

ペグ化の程度を決定するために、反応混合物をSDS-PAGEで分析する。１‐mer、２‐merなどのペグ化の程度を、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化‐飛行時間型（MALDI-TOF）マススペクトロメトリーによって確認する。未処置及びモノペグ化種について表されたピークは、およそ５，０００ダルトン違っている。得られた反応混合物は、主に天然及びモノペグ化タンパク質の混合物を含んでいる。モノペグ化種をカラムクロマトグラフィーにより精製して、遊離のIFN‐α及びより分子量の大きな種を除去する。N-末端ペグ化の確認を、ペプチドマッピングにより行う。PEG：タンパク質の比率が増加すると、ペグ化の程度が増加し、ポリペグ化IFN‐αが生じる。

実施例１４
ヒト成長ホルモンのN‐末端ペグ化
E.coli、チャイニーズハムスター卵母細胞のような哺乳動物細胞、又は他の供給源により産生された）組替えヒト成長ホルモン、「ｈGH」（実施例７において記載されたように調製された）mPEG２（４０K Da）−ケトンと結合させる。

ｈGH（２ｍｇ以下）を１mlの０．１mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH５）に溶解し、mPEG２(40K Da)‐ケトンをｈGH濃度の５倍で添加する。５〜２０倍モル過剰の還元剤、NaCNBH₃を添加し、そして溶液を４℃で２４時間攪拌して、mPEG２(40K Da)‐ケトン試薬をアミン結合を介してタンパク質に結合させる。

ペグ化の程度を決定するために、反応の進行をSDS-PAGE又はMALDI-TOFで分析する。１‐mer、２‐merなどのペグ化の程度を、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化‐飛行時間型（MALDI-TOF）マススペクトロメトリーによって確認する。未処置及びモノペグ化種について表されたピークは、およそ４０，０００ダルトン違っている。得られた反応混合物は、主に天然及びモノペグ化タンパク質の混合物を含んでいる。モノペグ化種をカラムクロマトグラフィーにより精製して、遊離のｈGH及びより分子量の大きな種を除去する。N-末端ペグ化の確認を、ペプチドマッピングにより行う。mPEG２（40K Da）‐ケトン：タンパク質の比率が増加すると、ペグ化の程度が増加し、ポリペグ化ｈGHが生じる。

実施例１５
インターフェロンβのN‐末端ペグ化
E.coli、チャイニーズハムスター卵母細胞のような哺乳動物細胞、又は他の供給源により産生された）組替えインターフェロンβ、「IFN‐β」（実施例７において記載されたように調製された）mPEG２（４０K Da）−ケトンと結合させる。

IFN-β（２ｍｇ以下）を１mlの０．１mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH５）に溶解し、mPEG２(40K Da)‐ケトンをIFN- βモル濃度の５倍で添加する。５〜２０倍モル過剰の還元剤、NaCNBH₃を添加し、そして溶液を４℃で２４時間攪拌して、mPEG２(40K Da)‐ケトン試薬をアミン結合を介してタンパク質に結合させる。

ペグ化の程度を決定するために、反応の進行をSDS-PAGE又はMALDI-TOFで分析する。１‐mer、２‐merなどのペグ化の程度を、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化‐飛行時間型（MALDI-TOF）マススペクトロメトリーによって確認する。未処置及びモノペグ化種について表されたピークは、およそ４０，０００ダルトン違っている。得られた反応混合物は、主に天然及びモノペグ化タンパク質の混合物を含んでいる。モノペグ化種をカラムクロマトグラフィーにより精製して、遊離のIFN-β及びより分子量の大きな種を除去する。N-末端ペグ化の確認を、ペプチドマッピングにより行う。mPEG２（40K Da）‐ケトン：タンパク質の比率が増加すると、ペグ化の程度が増加し、ポリペグ化IFN-βが生じる。

実施例１６
FSHのN‐末端ペグ化
E.coli、チャイニーズハムスター卵母細胞のような哺乳動物細胞、又は他の供給源により産生された）組替え卵胞刺激ホルモン、「FSH」（実施例７において記載されたように調製された）mPEG２（４０K Da）−ケトンと結合させる。

FSH（２ｍｇ以下）を１mlの０．１mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH５）に溶解し、mPEG２(40K Da)‐ケトンをFSH濃度の５倍で添加する。５〜２０倍モル過剰の還元剤、NaCNBH₃を添加し、そして溶液を４℃で２４時間攪拌して、mPEG２(40K Da)‐ケトン試薬をアミン結合を介してタンパク質に結合させる。

ペグ化の程度を決定するために、反応の進行をSDS-PAGE又はMALDI-TOFで分析する。１‐mer、２‐merなどのペグ化の程度を、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化‐飛行時間型（MALDI-TOF）マススペクトロメトリーによって確認する。未処置及びモノペグ化種について表されたピークは、およそ４０，０００ダルトン違っている。得られた反応混合物は、主に天然及びモノペグ化タンパク質の混合物を含んでいる。モノペグ化種をカラムクロマトグラフィーにより精製して、遊離のFSH及びより分子量の大きな種を除去する。N-末端ペグ化の確認を、ペプチドマッピングにより行う。mPEG２（40K Da）‐ケトン：タンパク質の比率が増加すると、ペグ化の程度が増加し、ポリペグ化FSHが生じる。

実施例１７
hＧＨのN‐末端ペグ化
E.coli、チャイニーズハムスター卵母細胞のような哺乳動物細胞、又は他の供給源により産生された）ヒト成長ホルモン、「ｈＧＨ」（実施例９において記載されたように調製された）PEG（５K Da）−ジエチルケタールと結合させる。

ｈＧＨ（２ｍｇ以下）を１mlの０．１mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH５）に溶解し、PEG(５K Da)‐ジエチルケタールをｈＧＨモル濃度の５倍で添加する。５〜２０倍モル過剰の還元剤、NaCNBH₃を添加し、そして溶液を４℃で２４時間攪拌して、PEG (５K Da)‐ジエチルケタール試薬をアミン結合を介してタンパク質に結合させる。

ペグ化の程度を決定するために、反応の進行をSDS-PAGE又はMALDI-TOFで分析する。１‐mer、２‐merなどのペグ化の程度を、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化‐飛行時間型（MALDI-TOF）マススペクトロメトリーによって確認する。天然及びモノペグ化種について表されたピークは、およそ５，０００ダルトン違っている。得られた反応混合物は、特にPEG（５K）‐ジエチルケタール試薬により、主に未処置及びモノペグ化タンパク質の混合物を含んでいる。モノペグ化種をカラムクロマトグラフィーにより精製して、遊離のｈＧＨ及びより分子量の大きな種を除去する。N-末端ペグ化の確認を、ペプチドマッピングにより行う。

実施例１８
アンフォテリシンBのペグ化
低分子、アンフォテリシンBのアミノ基を、mPEG（2K Da）‐メチルケトンを結合することによって修飾する。

蒸留水中のアンフォテリシンB HClの溶液に、０．１Mリン酸緩衝液pH６．５に溶解したmPEG（2K Da）‐メチルケトン（実施例１）を２倍モル過剰で添加する。この混合物にpH６．５のリン酸緩衝液中のNaCNBH₃を（１．５〜１０倍モル過剰で）添加し、得られた溶液をアルゴン雰囲気下、室温で一夜攪拌する。

反応混合物のアリコートを、いろいろな時間間隔で取り出し、反応の進行を¹H NMRでよりモニターする。完了後、反応混合物をさらに水を加えることによって希釈し、NaClを加えて飽和させる。生成物をジクロロメタンで抽出し、そして併合した有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥剤を除去するためにろ過し、溶媒をロータリーエバポレーションによって蒸発させる。ジエチルエーテルを添加することによって生成物を沈殿させ、そして真空下で一夜乾燥させる。回収された生成物をゲル透過クロマトグラフィーによって分析し、複合化の程度を決定する。

粗生成物をPoros 50 HS陽イオン交換樹脂（PerSeptive BioSystems, Framingham, MA）を使用する陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製する。カラムを蒸留水で洗浄後、生成物を１N NaCl溶液で溶出させる。抽出物を含む複合体を併合し、生成物をジクロロメタンで抽出する。有機溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、そして溶媒をロータリーエバポレーションによって蒸発させる。精製された複合体をジエチルエーテルを添加することによって精製する。

所望により、Betasil C18カラム（Keystone Scientific）を使用する逆相HPLCクロマトグラフィーによって生成物をさらに精製する。

図１は、複合化反応における、ケトン官能基を有するポリマー試薬とその水和物の間の平衡を例解する代表的な模式図である。カルビノールアミン及び対応するイミンの間の縮合を代表する二番目の平衡も示される。図２は、ケトン官能基を有するポリマー試薬からのケタール及びケタール官能基を有するポリマー試薬からの複合体の形成を例解する代表的な模式図である。図３は、本発明による複合化方法の代表的な模式図である。

Claims

以下の式：

｛式中、
ＰＯＬＹ¹が、-Ｏ-Ｒ⁷として規定される末端を有する-ＣＨ₂ＣＨ₂-(ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_m-ＯＣＨ₂ＣＨ₂-であり；
(ａ)が、０又は１であり；
(ｂ)が、０又は１であり；
Ｘ¹が存在する場合、スペーサー部分であり；
ＥＷ¹が存在する場合、電子吸引性の基であり；
(ｚ)が、０であるか、又は正の整数であり；
Ｒ²が存在する場合、各場合において、独立してＨ又は有機ラジカルであり；
Ｒ³が存在する場合、各場合において、独立してＨ又は有機ラジカルであり；
Ｒ⁷がＨ又は有機ラジカルであり；そして
(ｍ)が３〜３０００である。｝
により表されるものからなる群から選ばれる、ポリマー試薬。
R⁷が、９個以下の炭素原子を含む非芳香族有機ラジカルである、請求項１に記載のポリマー試薬。
R⁷が、H又はメチルである、請求項１に記載のポリマー試薬。
ハロゲン原子を有さない、請求項１に記載のポリマー試薬。
芳香族部分を有さない、請求項１に記載のポリマー試薬。
エノンを有さない、請求項１に記載のポリマー試薬。
(ｚ)がゼロであり、(ｂ)が、１であり、そして、ＥＷ^１が、-Ｏ-、-ＮＨ-、-ＮＨＣ(Ｏ)-、-Ｃ(Ｏ)ＮＨ-、-ＯＣ(Ｏ)-、-ＯＣ(Ｏ)-、-ＯＣ(Ｏ)-ＮＨ-、-ＮＨ-ＯＣ(Ｏ)-、-Ｃ(Ｏ)-、-Ｃ(Ｓ)-、及び-Ｃ(ＯＲ)Ｈ-から成る群から選ばれ、ここで、ＯＲはアルコキシ又はヒドロキシ置換基である、請求項１に記載のポリマー試薬。
EW¹が-C(O)-である、請求項７に記載のポリマー試薬。
以下の式：

｛式中、(ｍ)は３〜３０００である。｝
により表されるものから成る群から選ばれる、請求項１に記載のポリマー試薬。