JP4825645B2 - Ｄｎａの抽出方法 - Google Patents

Description

本発明は、複数のウェルを備えるウェルプレートを用いて実施されるＤＮＡの抽出方法に関する。

近年、種々の目的で生物からＤＡＮを抽出することが行われている。そのときに、検体の数が多数であれば、ウェルプレートが使用される。ウェルプレートを用いて行うＤＮＡ抽出技術は、多数提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
特開２００２−３６９６８２公報（図１）

特許文献１を次図に基づいて説明する。
図６は従来のウェルプレートの斜視図であり、ウェルプレート１００は、矩形の基板１０１に、８個×１２列＝９６個のウェル１０２を備えた試験具である。これで、９２個の検体を処理することができる。

特許文献１の段落番号［００３８］第５行〜第６行に「２）楊枝で各ウェルに大腸菌が形成したコロニーをピックし殖菌する。」との記載がある。検体（大腸菌）が単一種類であれば、取扱いに注意を払う必要は殆ど無いが、検体が複数の種類で構成される場合には次に述べるような問題が発生する。

図７は植物の先端部を処理するときの説明図であり、Ａ種の植物１０３の先端部１０４と、Ｂ種の植物１０５の先端部１０６と、Ｃ種の植物１０７の先端部１０８とを処理対象とする。そして、先端部１０４を植物１０３から切断し、ウェル１１１に入れる。同様に、先端部１０６を植物１０５から切断し、ウェル１１２に入れ、先端部１０８を植物１０７から切断し、ウェル１１３に入れる。そして、ウェル１１１〜１１３へリン酸バッファなどの試薬を入れ、シェイクしてＤＮＡを分離し、抽出する。

図７での作業は、人手で行う。人為的ミスはある確率で発生するため、先端部１０４をウェル１１２やウェル１１３に入れることはあり得る。仮に、投入ミスであっても、事後にその事実を発見することは困難である。そこで、このような人為的ミスの発生を防ぐ方法が求められる。

本発明は、ウェルへの投入ミスを解消することができるＤＮＡの抽出方法を提供することを課題とする。

請求項１に係る発明は、複数のウェルを備える第１のウェルプレートと、この第１のウェルプレートと同形であるが、ウェルの底が抜けている第２のウェルプレートと、この第２のウェルプレートの下面に沿って摺動させるカッタープレートと、前記第２のウェルプレートの上下面を塞ぐ第１蓋及び第２の蓋とを準備するステップと、
前記第１のウェルプレートのウェルに各々種を入れて、これらの種を発芽、成長させるステップと、
前記第１のウェルプレートに前記第２のウェルプレートを、上下のウェルが連通するようにして載せ、成長した植物の先端部が第２のウェルプレートまで延びたら、第１のウェルプレートと第２のウェルプレートとの間に前記カッタープレートを挿入して、植物の先端部をカッタープレートの上に載せるステップと、
前記第２のウェルプレートの上面に前記第１の蓋を被せてひっくり返し、前記第１の蓋が底板になった状態で第２のウェルプレートのウェルに試薬を入れるステップと、
前記第２のウェルプレートの上面を第２の蓋で塞ぎ、第１の蓋及び第２の蓋で上下面が塞がれた第２のウェルプレートをシェイクすることで、試薬中に植物のＤＮＡを抽出するステップと、からなることを特徴とするＤＮＡの抽出方法である。

請求項２に係る発明は、試薬を入れるステップで、植物の撹拌、粉砕を促すためにビーズを、試薬と共にウェルに入れることを特徴とする。

請求項３に係る発明は、試薬を入れるステップで、第２のウェルプレートのウェルに対応する孔が設けられている多孔プレートと、この多孔プレートの下面を塞ぐシャッタプレートとからなるビーズプレートを用い、孔に１個ずつ前記ビーズを入れ、ビーズプレートを第２のウェルプレートに載せ、シャッタプレートを引き抜くことで、第２のウェルプレートのウェルにビーズを入れることを特徴とする。

請求項１に係る発明では、第１のウェルプレートに種を播き、発芽育成させる。第２のウェルプレートを重ね、植物の先端部が第２のウェルプレートへ進入したら、切断する。植物の先端部は第２のウェルプレートに移る。この第２のウェルプレートに試薬を入れてＤＮＡの抽出を行う。第１のウェルプレートと第２のウェルプレートは同形又はほぼ同形である。
第１のウェルプレートの番地と同一である第２のウェルセルプレートのウェルへ植物の先端部が移るため、所定の番地のウェルへ先端部を確実に入れることができる。すなわち、ウェルへの投入ミスを未然に防止することができる。

請求項２に係る発明では、ウェルへ植物の先端部及び試薬と共にビーズを投入する。そして、シェークする。ビーズが植物の先端部の分離、細分化を促すため、短い時間でＤＮＡを抽出することができる。

請求項３に係る発明では、ビーズプレートを用いることで、一度に多数個のビーズをウェルへ投入することができ、ビーズ投入に要する時間を大幅に短縮することができる。

本発明を実施するための最良の形態を添付図に基づいて以下に説明する。なお、図面は符号の向きに見るものとする。
図１は本発明に係るウェルプレートの斜視図、図２は本発明に係るウェルプレートの断面図、図３は本発明に係るウェルプレートの底面図である。

第１のウェルプレート１１及び第２のウェルプレート１２は、図２に示されるように、筐体１３に上下が開放された筒状の複数のウェル１４を備え、底１５に、対向する一対の溝１６、１６を備えた樹脂成形品である。樹脂は、ウェル１４内の植物に外部から光を当てることができるように透明樹脂を使用する。

なお、第１のウェルプレート１１は、ウェル１４に底があってもよい。しかし、実験具の種類を増やしたくないので、本実施例では、第１のウェルプレート１１及び第２のウェルプレート１２は同一品とする。

一対の溝１６、１６へは、図３に示されるように、メッシュ板１８、カッタープレート１９又は第１，第２の蓋２１、２２を交互に差し込むことができる。
そして、立方体形状の筐体１３は、図１に示されるように、上面２３に「１」〜「１２」及び「Ａ」〜「Ｈ」の文字を備えている。そこで、ウェル１４には、例えば（１−Ａ）番地のごとく、個々に番地を付すことにする。

次に、ビーズプレート２５について、その構造例を説明する。
図４は本発明に係るビーズプレートの斜視図であり、ビーズプレート２５は、多数個（この例では９６個）のビーズ２６を一度の操作でウェル１４へ入れることができる治具であり、第２のウェルプレート１２のウェルに対応する孔２７が設けられている多孔プレート２８と、この多孔プレート２８の下面を塞ぐシャッタプレート２９とからなる。
孔２７に１個ずつビーズ２６を入れ、ビーズプレート２５を第２のウェルプレート１２に載せ、シャッタプレート２９を引き抜くことで、ウェルにビーズ２６を入れることができる。

以上に説明した第１，第２のウェルプレート１１、１２及びビーズプレート２５を用いて実施するＤＮＡ抽出作業を次に説明する。
図５は本発明に係るＤＮＡの抽出方法を説明するフロー図である。このフローに入る当たり、第１のウェルプレート１１（図１）と、この第１のウェルプレート１１と同形であるが、ウェルの底が抜けている第２のウェルプレート１２（図２）と、この第２のウェルプレート１２の下面に沿って摺動させるカッタープレート１９（図３）と、第２のウェルプレート１２の上下面を塞ぐ第１の蓋２１及び第２の蓋２２（図３）と、ビーズプレート２５（図４）とを準備する。

次に、図５（ａ）に示されるように、第１のウェルプレート１１の底をメッシュ板１８で塞ぐ。メッシュ板１８のメッシュ（網目）は、水や空気は通すが、種３０Ａ、３０Ｂ（位置を特定するために，Ａ，Ｂなどのアルファベットを添える。以下同様）は通さない大きさとする。そして、ウェル１４Ａ、１４Ｂに種３０Ａ、３０Ｂを入れる。

次に、（ｂ）に示されるように、第１のウェルプレート１１に第２のウェルプレート１２を重ね、第１のウェルプレート１１を、水槽３１の水３２に浸す。この水３２は養分が溶かし込んであり、温度調節が施された、管理された水である。そして、ランプ３３で管理された照度の光線を種３０Ａ、３０Ｂに加える。これで、いわゆる水耕栽培が開始される。

（ｃ）に示されるように、種３０Ａ、３０Ｂが発芽し、成長し、植物３４Ａの先端部３５Ａ及び植物３４Ｂの先端部３５Ｂが第２のウェルプレート１２へ進入したら、第１のウェルプレート１１と第２のウェルプレート１２との間にカッタープレート１９を挿入する。

（ｄ）に示されるように、先端部３５Ａ、３５Ｂはカッタープレート１９の上に残る。すなわち、先端部３５Ａ、３５Ｂは第２のウェルプレート１２のウェル１４Ａ、１４Ｂに残される。この状態で、第２のウェルプレート１２の上面に第１の蓋２１を被せる。そして、（ｅ）に示されるように、第２のウェルプレート１２をひっくり返す。この結果、ウェル１４Ａが図右、ウェル１４Ｂが図左になる。次に、カッタープレート１９を除く。

次に、（ｆ）に示されるように、第１の蓋２１で底を形成した第２のウェルプレート１２のウェル１４Ａ、１４Ｂへリン酸バッファなどの試薬３６を注ぐとともに、ビーズ２６、２６を入れる。ビーズ２６、２６は図４で説明したビーズプレート２５を用いて一度に入れる。

次に、（ｇ）に示されるように、第２のウェルプレート１２の溝１６、１６に第２の蓋２２をセットする。これで、第２のウェルプレート１２は第１、第２の蓋２１、２２で上下面が蜜に塞がれたことになる。この状態で、第２のウェルプレート１２をシェイクする。このシェイクにより、植物の先端部は試薬中に分離する。

所定のシェイクが終了すると、（ｈ）に示されるように、ＤＮＡ用液３７Ａ、３７Ｂが得られる。そして、第２の蓋２２が下になるようにする。第２のウェルプレート１２には（ａ）に示される第１のウェルプレート１１と同一の番地が付されている。
この結果、第２のウェルプレート１２のウェル１４Ａには、（ａ）での種３０Ａから得られたＤＮＡ用液３７Ａが存在し、第２のウェルプレート１２のウェル１４Ｂには、（ａ）での種３０Ｂから得られたＤＮＡ用液３７Ｂが存在する。
すなわち、本発明によれば、植物の先端部３５Ａ、３５Ｂ（（ｃ）参照）を、誤った番地のウェルへ入れる心配は皆無である。

一方、第１のウェルプレート１１は、（Ｄ）に示されるように、植物３４Ａ、３４Ｂが残っている。そこで、新しい第２のウェルプレート１２を載せ、（Ｅ）に示されるように成長を促す。次に、（ｃ）へ飛んで、カッタープレート１９で先端部３５Ａ、３５Ｂを切断すれば、また、ＤＮＡ用液が得られる。したがって、同一の種３０Ａ、３０Ｂから多数回ＤＮＡ用液が得られる。

以上に述べたＤＮＡの抽出方法は、次のようにまとめることができる。
複数のウェル１４Ａ、１４Ｂを備える第１のウェルプレート１１と、この第１のウェルプレート１１と同形であるが、ウェル１４Ａ、１４Ｂの底が抜けている第２のウェルプレート１２と、この第２のウェルプレート１２の下面に沿って摺動させるカッタープレート１９と、第２のウェルプレート１２の上下面を塞ぐ第１蓋２１及び第２の蓋２２とを準備するステップと、
前記第１のウェルプレート１１のウェル１４Ａ、１４Ｂに各々種３０Ａ、３０Ｂを入れて、これらの種３０Ａ、３０Ｂを発芽、成長させるステップと、
前記第１のウェルプレート３１に前記第２のウェルプレート１２を、上下のウェル１４Ａ、１４Ｂが連通するようにして載せ、成長した植物３４Ａ、３４Ｂの先端部３５Ａ、３５Ｂが第２のウェルプレート１２まで延びたら、第１のウェルプレート１１と第２のウェルプレート１２との間に前記カッタープレート１９を挿入して、植物３４Ａ、３４Ｂの先端部３５Ａ、３５Ｂをカッタープレート１９の上に載せるステップと、
前記第２のウェルプレート１２の上面２３に前記第１の蓋２１を被せてひっくり返し、前記第１の蓋２１が底板になった状態で第２のウェルプレート１２のウェル１４Ａ、１４Ｂに試薬３６を入れるステップと、
前記第２のウェルプレート１２の上面２３を第２の蓋２２で塞ぎ、第１の蓋２１及び第２の蓋２２で上下面が塞がれた第２のウェルプレート１２をシェイクすることで、試薬中に植物のＤＮＡを抽出するステップと、からなることを特徴とする。

第１のウェルプレート１１の番地と同一である第２のウェルセルプレート１２のウェル１４Ａ、１４Ｂへ植物３４Ａ、３４Ｂの先端部３５Ａ、３５Ｂが移るため、ウェル１４Ａ、１４Ｂへの投入ミスを未然に防止することができる。この結果、実験の信頼性を高めることができる。

又、図３を参照すれば、ウェルプレートに、メッシュ板で底を形成すれば水耕栽培が可能となり、上下のウェルプレート間にカッタプレートを差し込めば植物の先端をカットすることができ、蓋を差し込めば底を形成することができる。すなわち、ウェルプレートの形態を容易に変更することができる。

尚、本発明は、稲科植物のＤＮＡの抽出に好適であるが、葉野菜など他の植物のＤＮＡの抽出に適用することは差し支えない。

本発明は、稲科植物のＤＮＡの抽出に好適である。

本発明に係るウェルプレートの斜視図である。 本発明に係るウェルプレートの断面図である。 本発明に係るウェルプレートの底面図である。 本発明に係るビーズプレートの斜視図である。 本発明に係るＤＮＡの抽出方法を説明するフロー図である。 従来のウェルプレートの斜視図である。 植物の先端部を処理するときの説明図である。

符号の説明

１１…第１のウェルプレート、１２…第２のウェルプレート、１３…筐体、１４、１４Ａ、１４Ｂ…ウェル、１９…カッタープレート、２１…第１の蓋、２２…第２の蓋、２３…ウェルプレートの上面、２５…ビーズプレート、２６…ビーズ、２７…孔、２８…多孔プレート、２９…シャッタプレート、３０Ａ、３０Ｂ…種、３４Ａ、３４Ｂ…植物、３５Ａ、３５Ｂ…植物の先端部、３６…試薬、３７Ａ、３７Ｂ…ＤＮＡ用液。

Claims (3)

1. 複数のウェルを備える第１のウェルプレートと、この第１のウェルプレートと同形であるが、ウェルの底が抜けている第２のウェルプレートと、この第２のウェルプレートの下面に沿って摺動させるカッタープレートと、前記第２のウェルプレートの上下面を塞ぐ第１蓋及び第２の蓋とを準備するステップと、
   前記第１のウェルプレートのウェルに各々種を入れて、これらの種を発芽、成長させるステップと、
   前記第１のウェルプレートに前記第２のウェルプレートを、上下のウェルが連通するようにして載せ、成長した植物の先端部が第２のウェルプレートまで延びたら、第１のウェルプレートと第２のウェルプレートとの間に前記カッタープレートを挿入して、植物の先端部をカッタープレートの上に載せるステップと、
   前記第２のウェルプレートの上面に前記第１の蓋を被せてひっくり返し、前記第１の蓋が底板になった状態で第２のウェルプレートのウェルに試薬を入れるステップと、
   前記第２のウェルプレートの上面を第２の蓋で塞ぎ、第１の蓋及び第２の蓋で上下面が塞がれた第２のウェルプレートをシェイクすることで、試薬中に植物のＤＮＡを抽出するステップと、からなることを特徴とするＤＮＡの抽出方法。
2. 前記試薬を入れるステップでは、植物の撹拌、粉砕を促すためにビーズを、試薬と共にウェルに入れることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡの抽出方法。
3. 前記試薬を入れるステップでは、前記第２のウェルプレートのウェルに対応する孔が設けられている多孔プレートと、この多孔プレートの下面を塞ぐシャッタプレートとからなるビーズプレートを用い、前記孔に１個ずつ前記ビーズを入れ、ビーズプレートを第２のウェルプレートに載せ、前記シャッタプレートを引き抜くことで、第２のウェルプレートのウェルに前記ビーズを入れることを特徴とする請求項２記載のＤＮＡの抽出方法。

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